TY - JOUR A1 - Schmidt, Stefanie A1 - Denk, Sarah A1 - Wiegering, Armin T1 - Targeting protein synthesis in colorectal cancer JF - Cancers N2 - Under physiological conditions, protein synthesis controls cell growth and survival and is strictly regulated. Deregulation of protein synthesis is a frequent event in cancer. The majority of mutations found in colorectal cancer (CRC), including alterations in the WNT pathway as well as activation of RAS/MAPK and PI3K/AKT and, subsequently, mTOR signaling, lead to deregulation of the translational machinery. Besides mutations in upstream signaling pathways, deregulation of global protein synthesis occurs through additional mechanisms including altered expression or activity of initiation and elongation factors (e.g., eIF4F, eIF2α/eIF2B, eEF2) as well as upregulation of components involved in ribosome biogenesis and factors that control the adaptation of translation in response to stress (e.g., GCN2). Therefore, influencing mechanisms that control mRNA translation may open a therapeutic window for CRC. Over the last decade, several potential therapeutic strategies targeting these alterations have been investigated and have shown promising results in cell lines, intestinal organoids, and mouse models. Despite these encouraging in vitro results, patients have not clinically benefited from those advances so far. In this review, we outline the mechanisms that lead to deregulated mRNA translation in CRC and highlight recent progress that has been made in developing therapeutic strategies that target these mechanisms for tumor therapy. KW - colorectal cancer KW - protein synthesis KW - translation initiation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206014 SN - 2072-6694 VL - 12 IS - 5 ER - TY - JOUR A1 - Kann, Simone A1 - Kunz, Meik A1 - Hansen, Jessica A1 - Sievertsen, Jürgen A1 - Crespo, Jose J. A1 - Loperena, Aristides A1 - Arriens, Sandra A1 - Dandekar, Thomas T1 - Chagas disease: detection of Trypanosoma cruzi by a new, high-specific real time PCR JF - Journal of Clinical Medicine N2 - Background: Chagas disease (CD) is a major burden in Latin America, expanding also to non-endemic countries. A gold standard to detect the CD causing pathogen Trypanosoma cruzi is currently not available. Existing real time polymerase chain reactions (RT-PCRs) lack sensitivity and/or specificity. We present a new, highly specific RT-PCR for the diagnosis and monitoring of CD. Material and Methods: We analyzed 352 serum samples from Indigenous people living in high endemic CD areas of Colombia using three leading RT-PCRs (k-DNA-, TCZ-, 18S rRNA-PCR), the newly developed one (NDO-PCR), a Rapid Test/enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA), and immunofluorescence. Eighty-seven PCR-products were verified by sequence analysis after plasmid vector preparation. Results: The NDO-PCR showed the highest sensitivity (92.3%), specificity (100%), and accuracy (94.3%) for T. cruzi detection in the 87 sequenced samples. Sensitivities and specificities of the kDNA-PCR were 89.2%/22.7%, 20.5%/100% for TCZ-PCR, and 1.5%/100% for the 18S rRNA-PCR. The kDNA-PCR revealed a 77.3% false positive rate, mostly due to cross-reactions with T. rangeli (NDO-PCR 0%). TCZ- and 18S rRNA-PCR showed a false negative rate of 79.5% and 98.5% (NDO-PCR 7.7%), respectively. Conclusions: The NDO-PCR demonstrated the highest specificity, sensitivity, and accuracy compared to leading PCRs. Together with serologic tests, it can be considered as a reliable tool for CD detection and can improve CD management significantly. KW - Chagas disease KW - Chagas diagnosis KW - Chagas monitoring KW - Chagas real time PCR KW - Trypanosoma cruzi Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205746 SN - 2077-0383 VL - 9 IS - 5 ER - TY - JOUR A1 - Grund-Mueller, Nils A1 - Ruedenauer, Fabian A. A1 - Spaethe, Johannes A1 - Leonhardt, Sara D. T1 - Adding amino acids to a sucrose diet is not sufficient to support longevity of adult bumble bees JF - Insects N2 - Dietary macro-nutrients (i.e., carbohydrates, protein, and fat) are important for bee larval development and, thus, colony health and fitness. To which extent different diets (varying in macro-nutrient composition) affect adult bees and whether they can thrive on nectar as the sole amino acid source has, however, been little investigated. We investigated how diets varying in protein concentration and overall nutrient composition affected consumption, longevity, and breeding behavior of the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris (Hymenoptera: Apidae). Queenless micro-colonies were fed either natural nutrient sources (pollen), nearly pure protein (i.e., the milk protein casein), or sucrose solutions with low and with high essential amino acid content in concentrations as can be found in nectar. We observed micro-colonies for 110 days. We found that longevity was highest for pure pollen and lowest for pure sucrose solution and sucrose solution supplemented with amino acids in concentrations as found in the nectar of several plant species. Adding higher concentrations of amino acids to sucrose solution did only slightly increase longevity compared to sucrose alone. Consequently, sucrose solution with the applied concentrations and proportions of amino acids or other protein sources (e.g., casein) alone did not meet the nutritional needs of healthy adult bumble bees. In fact, longevity was highest and reproduction only successful in micro-colonies fed pollen. These results indicate that, in addition to carbohydrates and protein, adult bumble bees, like larvae, need further nutrients (e.g., lipids and micro-nutrients) for their well-being. An appropriate nutritional composition seemed to be best provided by floral pollen, suggesting that pollen is an essential dietary component not only for larvae but also for adult bees. KW - nutrition KW - nutrients KW - foraging KW - pollen KW - resources KW - adult bees Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203866 SN - 2075-4450 VL - 11 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Grubbs, Kirk J. A1 - Surup, Frank A1 - Biedermann, Peter H. W. A1 - McDonald, Bradon R. A1 - Klassen, Jonathan L. A1 - Carlson, Caitlin M. A1 - Clardy, Jon A1 - Currie, Cameron R. T1 - Cycloheximide-Producing Streptomyces Associated With Xyleborinus saxesenii and Xyleborus affinis Fungus-Farming Ambrosia Beetles JF - Frontiers in Microbiology N2 - Symbiotic microbes help a myriad of insects acquire nutrients. Recent work suggests that insects also frequently associate with actinobacterial symbionts that produce molecules to help defend against parasites and predators. Here we explore a potential association between Actinobacteria and two species of fungus-farming ambrosia beetles, Xyleborinus saxesenii and Xyleborus affinis. We isolated and identified actinobacterial and fungal symbionts from laboratory reared nests, and characterized small molecules produced by the putative actinobacterial symbionts. One 16S rRNA phylotype of Streptomyces (XylebKG-1) was abundantly and consistently isolated from the galleries and adults of X. saxesenii and X. affinis nests. In addition to Raffaelea sulphurea, the symbiont that X. saxesenii cultivates, we also repeatedly isolated a strain of Nectria sp. that is an antagonist of this mutualism. Inhibition bioassays between Streptomyces griseus XylebKG-1 and the fungal symbionts from X. saxesenii revealed strong inhibitory activity of the actinobacterium toward the fungal antagonist Nectria sp. but not the fungal mutualist R. sulphurea. Bioassay guided HPLC fractionation of S. griseus XylebKG-1 culture extracts, followed by NMR and mass spectrometry, identified cycloheximide as the compound responsible for the observed growth inhibition. A biosynthetic gene cluster putatively encoding cycloheximide was also identified in S. griseus XylebKG-1. The consistent isolation of a single 16S phylotype of Streptomyces from two species of ambrosia beetles, and our finding that a representative isolate of this phylotype produces cycloheximide, which inhibits a parasite of the system but not the cultivated fungus, suggests that these actinobacteria may play defensive roles within these systems. KW - symbiosis KW - mutualism KW - insect fungal interactions KW - antimicrobial KW - Insect symbiois Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212449 VL - 11 ER - TY - JOUR A1 - Fathy, Moustafa A1 - Okabe, Motonori A1 - Othman, Eman M. A1 - Saad Eldien, Heba M. A1 - Yoshida, Toshiko T1 - Preconditioning of adipose-derived mesenchymal stem-like cells with eugenol potentiates their migration and proliferation in vitro and therapeutic abilities in rat hepatic fibrosis JF - Molecules N2 - Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic abilities in various disorders, including hepatic fibrosis. They may be affected with different culture conditions. This study investigated, on molecular basics, the effect of pretreatment with eugenol on the characteristics of adipose tissue-derived MSCs (ASCs) in vitro and the implication of eugenol preconditioning on the in vivo therapeutic abilities of ASCs against CCl\(_4\)-induced hepatic fibrosis in rats. The effect of eugenol on ASCs was assessed using viability, scratch migration and sphere formation assays. Expressions of genes and proteins were estimated by immunofluorescence or qRT-PCR. For the in vivo investigations, rats were divided into four groups: the normal control group, fibrotic (CCl\(_4\)) group, CCl\(_4\)+ASCs group and CCl\(_4\) + eugenol-preconditioned ASCs (CCl\(_4\)+E-ASCs) group. Eugenol affected the viability of ASCs in a concentration- and time-dependent manner. Eugenol improved their self-renewal, proliferation and migration abilities and significantly increased their expression of c-Met, reduced expression 1 (Rex1), octamer-binding transcription factor 4 (Oct4) and nanog genes. Furthermore, E-ASCs showed more of a homing ability than ASCs and improved the serum levels of ALT, AST, albumin, total bilirubin and hyaluronic acid more efficient than ASCs in treating CCl\(_4\)-induced hepatic fibrosis, which was confirmed with histopathology. More interestingly, compared to the CCl\(_4\)+ASCs group, CCl\(_4\)+E-ASCs group showed a lower expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), cluster of differentiation 163 (CD163) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) genes and higher expression of matrix metalloproteinase (MMP)-9 and MMP-13 genes. This study, for the first time, revealed that eugenol significantly improved the self-renewal, migration and proliferation characteristics of ASCs, in vitro. In addition, we demonstrated that eugenol-preconditioning significantly enhanced the therapeutic abilities of the injected ASCs against CCl\(_4\)-induced hepatic fibrosis. KW - adipose tissue-derived MSCs KW - eugenol KW - migration KW - self-renewal KW - hepatic fibrosis KW - CCl\(_4\) Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203662 SN - 1420-3049 VL - 25 IS - 9 ER - TY - JOUR A1 - Biltueva, Larisa S. A1 - Prokopov, Dmitry Yu. A1 - Romanenko, Svetlana A. A1 - Interesova, Elena A. A1 - Schartl, Manfred A1 - Trifonov, Vladimir A. T1 - Chromosome distribution of highly conserved tandemly arranged repetitive DNAs in the Siberian sturgeon (Acipenser baerii) JF - Genes N2 - Polyploid genomes present a challenge for cytogenetic and genomic studies, due to the high number of similar size chromosomes and the simultaneous presence of hardly distinguishable paralogous elements. The karyotype of the Siberian sturgeon (Acipenser baerii) contains around 250 chromosomes and is remarkable for the presence of paralogs from two rounds of whole-genome duplications (WGD). In this study, we applied the sterlet-derived acipenserid satDNA-based whole chromosome-specific probes to analyze the Siberian sturgeon karyotype. We demonstrate that the last genome duplication event in the Siberian sturgeon was accompanied by the simultaneous expansion of several repetitive DNA families. Some of the repetitive probes serve as good cytogenetic markers distinguishing paralogous chromosomes and detecting ancestral syntenic regions, which underwent fusions and fissions. The tendency of minisatellite specificity for chromosome size groups previously observed in the sterlet genome is also visible in the Siberian sturgeon. We provide an initial physical chromosome map of the Siberian sturgeon genome supported by molecular markers. The application of these data will facilitate genomic studies in other recent polyploid sturgeon species. KW - Acipenser baerii KW - sturgeon karyotype KW - whole-genome duplication KW - paralogs KW - polyploidy KW - acipenserid minisatellite KW - satellite DNA KW - tandem repeats Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219371 SN - 2073-4425 VL - 11 IS - 11 ER - TY - THES A1 - Thelen, David T1 - Erstellung eines genregulatorischen Netzwerkes zur Simulation der Entstehung von Zahnhartsubstanz T1 - Construction of a gene regulatory network to simulate the formation of dental hard tissue N2 - In this dissertation, the author describes the creation of a basic bioinformatic model of human enamel maturation. Supported by the interactions found in the KEGG Pathway database, we were able to establish a gene regulatory network (GRN) that focuses primarily on the signal transduction pathways apoptosis, cell cycle, hedgehog signaling pathway, MAP kinase pathway, mTOR signaling pathway, Notch signaling pathway, TGF-β signaling pathway and Wnt signaling pathway. We extended this through further verified interactions and implicated the tooth-specific genes AMELX, AMELY, AMBN, ENAM and DSPP. In the subsequent simulation of the network by the simulation tool Jimena, six stable states could be identified. These are examined in more detail and juxtaposed with results of a GEO dataset. The long-term goal is to draw conclusions about the odontogenesis of humans through consistent optimization of the bioinformatics network. N2 - In dieser Dissertation beschreibt der Autor die Erstellung eines grundlegenden bioinformatischen Modelles der menschlichen Zahnschmelzreifung. Mithilfe der KEGG Pathway-Datenbank wurde ein genregulatorisches Netzwerk (GRN) erstellt, welches maßgeblich auf den Signaltransduktionswegen Apoptose, Zellzyklus, Hedgehog-Signalweg, MAP-Kinase-Weg, mTOR-Signalweg Notch-Signalweg Signalweg, TGF-β-Signalweg und Wnt-Signalweg basiert. Im Weiteren wurde dieses Netzwerk durch zahlreiche verifizierte Wechselwirkungen erweitert und die zahnspezifischen Gene AMELX, AMELY, AMBN, ENAM und DSPP implementiert. In der anschließenden Simulation des Netzwerks mit dem Simulations-Tool Jimena konnten sechs stabile Zustände identifiziert werden. Diese wurden genauer untersucht und den Erkenntnissen eines GEO-Datensatzes gegenübergestellt. Langfristiges Ziel ist es, durch konsequente Optimierung des bioinformatischen Netzwerks Rückschlüsse auf die Odontogenese des Menschen zu ziehen. KW - Universität Würzburg. Lehrstuhl für Bioinformatik KW - Boolesches Netz KW - Zahnentwicklung KW - Amelogenese KW - Genregulation KW - genregulatorisches Netzwerk Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204068 ER - TY - JOUR A1 - Koch, Rebecca-Diana A1 - Hörner, Eva-Maria A1 - Münch, Nadine A1 - Maier, Elke A1 - Kozjak-Pavlovic, Vera T1 - Modulation of Host Cell Death and Lysis Are Required for the Release of Simkania negevensis JF - Frontiers in Cellular and Infection Microbiology N2 - Simkania negevensis is a Chlamydia-like bacterium and emerging pathogen of the respiratory tract. It is an obligate intracellular bacterium with a biphasic developmental cycle, which replicates in a wide range of host cells. The life cycle of S. negevensis has been shown to proceed for more than 12 days, but little is known about the mechanisms that mediate the cellular release of these bacteria. This study focuses on the investigation of host cell exit by S. negevensis and its connection to host cell death modulation. We show that Simkania-infected epithelial HeLa as well as macrophage-like THP-1 cells reduce in number during the course of infection. At the same time, the infectivity of the cell culture supernatant increases, starting at the day 3 for HeLa and day 4 for THP-1 cells and reaching maximum at day 5 post infection. This correlates with the ability of S. negevensis to block TNFα-, but not staurosporin-induced cell death up to 3 days post infection, after which cell death is boosted by the presence of bacteria. Mitochondrial permeabilization through Bax and Bak is not essential for host cell lysis and release of S. negevensis. The inhibition of caspases by Z-VAD-FMK, caspase 1 by Ac-YVAD-CMK, and proteases significantly reduces the number of released infectious particles. In addition, the inhibition of myosin II by blebbistatin also strongly affects Simkania release, pointing to a possible double mechanism of exit through host cell lysis and potentially extrusion. KW - exit KW - release KW - cell death KW - caspases Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-215158 SN - 2235-2988 VL - 10 ER - TY - JOUR A1 - Hardulak, Laura A. A1 - Morinière, Jérôme A1 - Hausmann, Axel A1 - Hendrich, Lars A1 - Schmidt, Stefan A1 - Doczkal, Dieter A1 - Müller, Jörg A1 - Hebert, Paul D. N. A1 - Haszprunar, Gerhard T1 - DNA metabarcoding for biodiversity monitoring in a national park: Screening for invasive and pest species JF - Molecular Ecology Resources N2 - DNA metabarcoding was utilized for a large‐scale, multiyear assessment of biodiversity in Malaise trap collections from the Bavarian Forest National Park (Germany, Bavaria). Principal component analysis of read count‐based biodiversities revealed clustering in concordance with whether collection sites were located inside or outside of the National Park. Jaccard distance matrices of the presences of barcode index numbers (BINs) at collection sites in the two survey years (2016 and 2018) were significantly correlated. Overall similar patterns in the presence of total arthropod BINs, as well as BINs belonging to four major arthropod orders across the study area, were observed in both survey years, and are also comparable with results of a previous study based on DNA barcoding of Sanger‐sequenced specimens. A custom reference sequence library was assembled from publicly available data to screen for pest or invasive arthropods among the specimens or from the preservative ethanol. A single 98.6% match to the invasive bark beetle Ips duplicatus was detected in an ethanol sample. This species has not previously been detected in the National Park. KW - biodiversity KW - DNA barcoding KW - invasive species KW - metabarcoding KW - monitoring KW - pest species Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217812 VL - 20 IS - 6 SP - 1542 EP - 1557 ER - TY - THES A1 - Beliu, Gerti T1 - Bioorthogonale Tetrazin-Farbstoffe für die Lebendzell-Markierung und hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie T1 - Bioorthogonal tetrazine-dyes for live-cell labeling and super-resolution fluorescence microscopy N2 - Der genetische Code beschreibt die Ver- und Entschlüsselung der Erb-information für das universelle Prinzip der Proteinbiosynthese aus einzelnen Aminosäuren. Durch Erweiterung des genetischen Codes lassen sich unna-türliche Aminosäuren (uAA) mit einzigartigen biophysikalischen Eigenschaf-ten ortsspezifisch in Proteine einführen und ermöglichen die spezifische Ma-nipulation von Proteinen. Die Click-Reaktion zwischen der unnatürlichen Aminosäure TCO*-Lysin und Tetrazin besitzt eine außergewöhnliche Reaktionskinetik (≥800 M-1s-1) und ermöglicht eine spezifische und bioorthogonale Markierung von Bio- ¬molekülen unter physiologischen Bedingungen. Im Fokus dieser Arbeit stand zunächst die Markierung von Membran- ¬rezeptoren durch Click-Chemie in lebenden Zellen sowie die Untersuchung der Wechselwirkung 22 bekannter und neuartiger Tetrazin-Farbstoff- Konjugate. Darüber hinaus wurde die Anwendbarkeit von bioorthogonalen Click-Reaktionen für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Durch Erweiterung des genetischen Codes in Proteine aus der Klasse der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluR), TNF-Rezeptoren oder Mikrotubu-li-assoziierten Proteinen (MAP) wurde ortspezifisch die unnatürliche Amino-säure TCO*-Lysin eingeführt und dadurch die Fluoreszenzmarkierung durch Tetrazin-Farbstoffe ermöglicht. Die direkte chemische Kopplung von TCO an Liganden wie Phalloidin und Docetaxel, welche spezifisch das Aktin-Zytoskelett bzw. Mikrotubuli-Filamente binden können, ermöglichte zudem die Click-Färbungen von fixierten und lebenden Zellen ohne genetische Ver-änderungen der Zielproteine. Des Weiteren wurden die spektroskopischen Eigenschaften von 22 Tetrazin-Farbstoffen, verteilt über den gesamten sichtbaren Wellenlängenbereich, untersucht. Ein charakteristisches Kennzeichen der Click-Reaktion mit Tet-razin-Farbstoffen ist dabei ihre Fluorogenität. Das Tetrazin fungiert nicht nur als reaktive Gruppe während der Click-Reaktion mit Alkenen, sondern führt in vielen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten zur Fluoreszenzlöschung. Während bei grün-absorbierenden Farbstoffe vor allem FRET-basierte Löschprozesse dominieren, konnte photoinduzierter Elektronentransfer (PET) vom angeregten Farbstoff zum Tetrazin als Hauptlöschmechanismus bei rot-absorbierenden Oxazin- und Rhodamin-Derivaten identifiziert werden. Die effiziente und spezifische Markierung aller untersuchten Tetrazin- Farbstoffe ermöglichte die Visualisierung von Aktin-Filamenten, Mikrotubuli und Membranrezeptoren sowohl durch konventionelle Fluoreszenzmikrosko-pie als auch durch hochauflösende Verfahren, wie z.B. dSTORM, auf Ein-zelmolekülebene. Die unterschiedliche Zellpermeabilität von Tetrazin-Farbstoffen kann dabei vorteilhaft für die spezifische intra- und extrazelluläre Markierung von Proteinen in fixierten und lebenden Zellen genutzt werden. N2 - The genetic code describes the encoding and decoding of genetic infor-mation for the universal principle of protein biosynthesis from individual amino acids. By expanding the genetic code, unnatural amino acids (uAA) with unique biophysical properties can be introduced site-specifically into pro-teins and enable the selective manipulation of proteins. The click reaction of the unnatural amino acid TCO*-lysine and tetrazine has an extraordinary reaction kinetic (≥800 M-1s-1) enabling the specific and bioorthogonal labeling of biomolecules under physiological conditions. The main focus of this work was the labeling of membrane receptors by click chemistry in living cells and the investigation of the interaction of 22 known and novel tetrazine dye conjugates. In addition, the applicability of bioorthogonal click reactions for high-resolution fluorescence microscopy was investigated. For this purpose, the unnatural amino acid TCO*-lysine was introduced site-specifically via genetic code expansion into proteins from the class of iono-tropic glutamate receptors (iGluR), TNF receptors or microtubule- associated proteins (MAP), thereby enabling fluorescence labeling with tetrazine dyes. The direct chemical coupling of TCO to ligands such as phalloidin and docetaxel, which can specifically bind the actin cytoskeleton or microtubule filaments, allowed click staining of fixed and living cells without genetic modifications of the target proteins. Furthermore, the spectroscopic properties of 22 tetrazine dyes spanning the entire visible wavelength range were investigated. A hallmark of the click reaction using tetrazine dyes is their fluorogenicity. Thus, the tetrazine not only functions as a reactive group during the click reaction with alkenes, but also leads to fluorescence quenching in many tetrazine-dye conjugates. While FRET-based quenching processes dominate in green-absorbing dyes, photoinduced electron transfer (PET) from excited dye to tetrazine has been identified as the main quenching mechanism in red-absorbing oxazine and rhodamine derivatives. The efficient and specific labeling of all investigated tetrazine dyes facilitates the visualization of actin filaments, microtubules and membrane receptors by conventional fluorescence microscopy as well as by super-resolution microscopy techniques, e.g. dSTORM, also at single molecule level. The different cell permeability of tetrazine dyes can be used advantageously for the specific intra- and extracellular labeling of proteins in fixed and living cells. KW - Hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie KW - Tetrazin Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189628 ER - TY - JOUR A1 - Biedermann, Peter H. W. T1 - Cooperative Breeding in the Ambrosia Beetle Xyleborus affinis and Management of Its Fungal Symbionts JF - Frontiers in Ecology and Evolution N2 - Fungus-farming is known from attine ants, macrotermites, and ambrosia beetles (Scolytinae, Platypodinae). Farming ant and termite societies are superorganismal and grow fungal cultivars in monocultures. Social organization of ambrosia beetle groups and their farming systems are poorly studied, because of their enigmatic life within tunnel systems inside of wood. Ambrosia beetle-fungus symbioses evolved many times independently in both the beetles and their fungal cultivars. Observations suggest that there is evolutionary convergence between these lineages, but also a high variation in the degree of sociality and the modes of fungiculture. Using a laboratory observation technique, I here tried to give insights into the social system and fungus symbiosis of the sugar-cane borer, Xyleborus affinis Eichhoff (Scolytinae: Curculionidae), a currently poorly studied ambrosia beetle. The study revealed a cooperatively breeding system characterized by delayed dispersal of adult daughters, alloparental brood care by larvae and adults, and about half of the totipotent adult daughters laying eggs within the natal nest. Most interesting, there was a tendency of egg-laying females to engage more commonly in mutually beneficial behaviors than non-egg-layers. Fungus gardens covering gallery walls composed of five different filamentous fungi. A Raffaelea isolate was predominant and together with an unidentified fungus likely served as the main food for adults and larvae. Three isolates, a Mucor, a Fusarium and a Phaeoacremonium isolate were most abundant in the oldest gallery part close to the entrance; Mucor, Fusarium and the Raffaelea isolate in diseased individuals. Additionally, there was correlative evidence for some fungal isoaltes influencing beetle feeding and hygienic behaviors. Overall, X. affinis is now the second ambrosia beetle that can be classified as a cooperative breeder with division of labor among and between adults and larvae. KW - cooperative breeding KW - bark beetle KW - insect agriculture KW - symbiosis KW - fungus community KW - social behavior KW - fungus-farming KW - mutualism Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-215662 SN - 2296-701X VL - 8 ER - TY - JOUR A1 - Solger, Franziska A1 - Kunz, Tobias C. A1 - Fink, Julian A1 - Paprotka, Kerstin A1 - Pfister, Pauline A1 - Hagen, Franziska A1 - Schumacher, Fabian A1 - Kleuser, Burkhard A1 - Seibel, Jürgen A1 - Rudel, Thomas T1 - A Role of Sphingosine in the Intracellular Survival of Neisseria gonorrhoeae JF - Frontiers in Cellular and Infection Microbiology N2 - Obligate human pathogenic Neisseria gonorrhoeae are the second most frequent bacterial cause of sexually transmitted diseases. These bacteria invade different mucosal tissues and occasionally disseminate into the bloodstream. Invasion into epithelial cells requires the activation of host cell receptors by the formation of ceramide-rich platforms. Here, we investigated the role of sphingosine in the invasion and intracellular survival of gonococci. Sphingosine exhibited an anti-gonococcal activity in vitro. We used specific sphingosine analogs and click chemistry to visualize sphingosine in infected cells. Sphingosine localized to the membrane of intracellular gonococci. Inhibitor studies and the application of a sphingosine derivative indicated that increased sphingosine levels reduced the intracellular survival of gonococci. We demonstrate here, that sphingosine can target intracellular bacteria and may therefore exert a direct bactericidal effect inside cells. KW - sphingosine KW - sphingolipids KW - sphingosine kinases KW - invasion KW - survival KW - click chemistry Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204111 SN - 2235-2988 VL - 10 ER - TY - THES A1 - Stelzner, Kathrin T1 - Identification of factors involved in Staphylococcus aureus- induced host cell death T1 - Identifizierung von Faktoren, die am Staphylococcus aureus-induzierten Wirtszelltod beteiligt sind N2 - Staphylococcus aureus is a Gram-positive commensal bacterium, that asymptomatically colonizes human skin and mucosal surfaces. Upon opportune conditions, such as immunodeficiency or breached barriers of the host, it can cause a plethora of infections ranging from local, superficial infections to life-threatening diseases. Despite being regarded as an extracellular pathogen, S. aureus can invade and survive within non-phagocytic and phagocytic cells. Eventually, the pathogen escapes from the host cell resulting in killing of the host cell, which is associated with tissue destruction and spread of infection. However, the exact molecular mechanisms underlying S. aureus-induced host cell death remain to be elucidated. In the present work, a genome-wide haploid genetic screen was performed to identify host cell genes crucial for S. aureus intracellular cytotoxicity. A mutant library of the haploid cell line HAP1 was infected with the pathogen and cells surviving the infection were selected. Twelve genes were identified, which were significantly enriched when compared to an infection with a non-cytotoxic S. aureus strain. Additionally, characteristics of regulated cell death pathways and the role of Ca2+ signaling in S. aureus-infected cells were investigated. Live cell imaging of Ca2+ reporter cell lines was used to analyze single cells. S. aureus-induced host cell death exhibited morphological features of apoptosis and activation of caspases was detected. Cellular H2O2 levels were elevated during S. aureus intracellular infection. Further, intracellular S. aureus provoked cytosolic Ca2+ overload in epithelial cells. This resulted from Ca2+ release from endoplasmic reticulum and Ca2+ influx via the plasma membrane and led to mitochondrial Ca2+ overload. The final step of S. aureus-induced cell death was plasma membrane permeabilization, a typical feature of necrotic cell death. In order to identify bacterial virulence factors implicated in S. aureus-induced host cell killing, the cytotoxicity of selected mutants was investigated. Intracellular S. aureus employs the bacterial cysteine protease staphopain A to activate an apoptosis-like cell death characterized by cell contraction and membrane bleb formation. Phagosomal escape represents a prerequisite staphopain A-induced cell death, whereas bacterial intracellular replication is dispensable. Moreover, staphopain A contributed to efficient colonization of the lung in a murine pneumonia model. In conclusion, this work identified at least two independent cell death pathways activated by intracellular S. aureus. While initially staphopain A mediates S. aureus-induced host cell killing, cytosolic Ca2+-overload follows later and leads to the final demise of the host cell. N2 - Staphylococcus aureus ist ein Gram-positives, kommensales Bakterium, welches menschliche Haut- und Schleimhautoberflächen asymptomatisch kolonisiert. Unter günstigen Bedingungen, wie z. B. Immunschwäche oder verletzten Barrieren des Wirtes, kann es eine Vielzahl von Infektionen verursachen, die von lokalen, oberflächlichen Infektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Krankheiten reichen. Obwohl S. aureus als extrazellulärer Erreger angesehen wird, kann das Bakterium von nicht-phagozytischen und phagozytischen Zellen aufgenommen werden und dort überleben. Schließlich bricht das Pathogen aus der Wirtszelle aus und die damit einhergehende Tötung der Wirtszelle wird mit Gewebezerstörung und Ausbreitung der Infektion in Verbindung gebracht. Die genauen molekularen Mechanismen, die dem S. aureus induzierten Wirtszelltod zugrunde liegen, müssen jedoch noch geklärt werden. In dieser Arbeit wurde ein genomweiter haploid genetischer Screen durchgeführt, um Wirtszellgene zu identifizieren, die für die intrazelluläre Zytotoxizität von S. aureus entscheidend sind. Eine Mutantenbibliothek der haploiden Zelllinie HAP1 wurde mit dem Erreger infiziert und die Zellen, die die Infektion überlebten, wurden selektiert. Dabei wurden zwölf Gene identifiziert, die signifikant angereichert waren gegenüber einer Infektion mit einem nicht-zytotoxischen S. aureus Stamm. Des Weiteren wurden Eigenschaften regulierter Zelltod-Signalwege und die Rolle der Ca2+-Signalübertragung in S. aureus infizierten Zellen untersucht. Lebendzellbildgebung von Ca2+-Reporterzelllinien wurde zur Analyse von einzelnen Zellen eingesetzt. Der S. aureus induzierte Wirtszelltod wies morphologische Merkmale von Apoptose auf und die Aktivierung von Caspasen wurde nachgewiesen. Der zelluläre H2O2-Spiegel wurde durch die intrazelluläre Infektion mit S. aureus erhöht. Zusätzlich rief der intrazelluläre S. aureus eine zytosolische Ca2+-Überbelastung in Epithelzellen hervor. Dies resultierte aus der Ca2+-Freisetzung vom endoplasmatischen Retikulum und dem Einstrom von Ca2+ über die Plasmamembran und führte zu einer mitochondrialen Ca2+-Überbelastung. Der finale Schritt des durch S. aureus induzierten Zelltods war die Permeabilisierung der Plasmamembran, ein typisches Merkmal des nekrotischen Zelltods. Um bakterielle Virulenzfaktoren zu identifizieren, die am S. aureus-induzierten Wirtszelltod beteiligt sind, wurde die Zytotoxizität von ausgewählten Mutanten untersucht. Der intrazelluläre S. aureus nutzt die bakterielle Cysteinprotease Staphopain A, um einen Apoptose-artigen Zelltod zu aktivieren, der durch Zellkontraktion und Blasenbildung der Membran gekennzeichnet ist. Der phagosomale Ausbruch stellt eine Voraussetzung für den Staphopain A-induzierten Zelltod da, während die intrazelluläre Replikation der Bakterien nicht notwendig ist. Darüber hinaus trug Staphopain A zu einer effizienten Kolonisation der Lunge in einem murinen Pneumonie-Modell bei. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit mindestens zwei unabhängige Zelltod-Signalwege identifiziert hat, die durch den intrazellulären S. aureus aktiviert werden. Während zunächst Staphopain A den Tod der Wirtszelle einleitet, folgt später die zytosolische Ca2+-Überlastung und führt zum endgültigen Untergang der Wirtszelle. KW - Staphylococcus aureus KW - Zelltod KW - Wirtszelle KW - cell death KW - host cell Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188991 N1 - Zusatzmaterial (Videos) befinden sich auch auf einer CD in der gedruckten Ausgabe ER - TY - THES A1 - Hartlieb, Heiko T1 - Functional analysis of Mushroom body miniature’s RGG-box and its role in neuroblast proliferation in Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse der RGG-Box von Mushroom body miniature und deren Rolle in der Neuroblastenproliferation in Drosophila melanogaster N2 - Development of the central nervous system in Drosophila melanogaster relies on neural stem cells called neuroblasts. Neuroblasts divide asymmetrically to give rise to a new neuroblast as well as a small daughter cell which eventually generates neurons or glia cells. Between each division, neuroblasts have to re-grow to be able to divide again. In previous studies, it was shown that neuroblast proliferation, cell size and the number of progeny cells is negatively affected in larvae carrying a P-element induced disruption of the gene mushroom body miniature (mbm). This mbm null mutation called mbmSH1819 is homozygously lethal during pupation. It was furthermore shown that the nucleolar protein Mbm plays a role in the processing of ribosomal RNA (rRNA) as well as the translocation of ribosomal protein S6 (RpS6) in neuroblasts and that it is a transcriptional target of Myc. Therefore, it was suggested that Mbm might regulate neuroblast proliferation through a role in ribosome biogenesis. In the present study, it was attempted to further elucidate these proposed roles of Mbm and to identify the protein domains that are important for those functions. Mbm contains an arginine/glycine rich region in which a di-RG as well as a di-RGG motif could be found. Together, these two motifs were defined as Mbm’s RGG-box. RGG-boxes can be found in many proteins of different families and they can either promote or inhibit protein-RNA as well as protein-protein interactions. Therefore, Mbm’s RGG-box is a likely candidate for a domain involved in rRNA binding and RpS6 translocation. It could be shown by deletion of the RGG-box, that MbmdRGG is unable to fully rescue survivability and neuroblast cell size defects of the null mutation mbmSH1819. Furthermore, Mbm does indeed rely on its RGG-box for the binding of rRNA in vitro and in mbmdRGG as well as mbmSH1819 mutants RpS6 is partially delocalized. Mbm itself also seems to depend on the RGG-box for correct localization since MbmdRGG is partially delocalized to the nucleus. Interestingly, protein synthesis rates are increased in mbmdRGG mutants, possibly induced by an increase in TOR expression. Therefore, Mbm might possess a promoting function in TOR signaling in certain conditions, which is regulated by its RGG-box. Moreover, RGG-boxes often rely on methylation by protein arginine methyltransferases (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) to fulfill their functions. Mbm might be symmetrically dimethylated within its RGG-box, but the results are very equivocal. In any case, Dart1 and Dart5 do not seem to be capable of Mbm methylation. Additionally, Mbm contains two C2HC type zinc-finger motifs, which could be involved in rRNA binding. In an earlier study, it was shown that the mutation of the zinc-fingers, mbmZnF, does not lead to changes in neuroblast cell size, but that MbmZnF is delocalized to the cytoplasm. In the present study, mbmZnF mutants were included in most experiments. The results, however, are puzzling since mbmZnF mutant larvae exhibit an even lower viability than the mbm null mutants and MbmZnF shows stronger binding to rRNA than wild-type Mbm. This suggests an unspecific interaction of MbmZnF with either another protein, DNA or RNA, possibly leading to a dominant negative effect by disturbing other interaction partners. Therefore, it is difficult to draw conclusions about the zinc-fingers’ functions. In summary, this study provides further evidence that Mbm is involved in neuroblast proliferation as well as the regulation of ribosome biogenesis and that Mbm relies on its RGG-box to fulfill its functions. N2 - Die Entwicklung des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster beruht auf neuronalen Stammzellen genannt Neuroblasten. Neuroblasten teilen sich asymmetrisch und bringen dabei sowohl einen neuen Neuroblasten als auch eine kleinere Tochterzelle hervor, die wiederum letztlich Neuronen oder Gliazellen generiert. Zwischen jeder Zellteilung müssen die Neuroblasten wieder auf ihre ursprüngliche Größe wachsen, sodass sie zur erneuten Teilung in der Lage sind. In vorhergehenden Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl die Proliferation der Neuroblasten, deren Zellgröße als auch die Anzahl ihrer Tocherzellen reduziert ist in Larven, die eine P-Element-induzierte Unterbrechung des Gens mushroom body miniature (mbm) tragen. Diese mbm-Nullmutation, genannt mbmSH1819, ist homozygot letal während des Puppenstadiums. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass das nucleoläre Protein Mbm eine Rolle in der Prozessierung ribosomaler RNA (rRNA), sowie der Translokation des ribosomalen Proteins S6 (RpS6) in Neuroblasten erfüllt und dass seine Transkription durch Myc reguliert wird. Daher wurde geschlussfolgert, dass Mbm die Proliferation von Neuroblasten durch eine Funktion in der Ribosomenbiogenese regulieren könnte. In der vorliegenden Studie wurde das Ziel verfolgt, weitere Hinweise auf diese möglichen Funktionen von Mbm zu finden und die Proteindomänen zu identifizieren, die dafür benötigt werden. Mbm beinhaltet einen Arginin/Glycin-reichen Abschnitt, der ein di-RG sowie ein di-RGG Motiv enthält. Diese beiden Motive wurden zusammen zu Mbms RGG-Box definiert. RGG-Boxen finden sich in vielen Proteinen verschiedener Familien und sie können sich sowohl verstärkend als auch inhibierend auf Protein-RNA- sowie Protein-Protein-Interaktionen auswirken. Somit stellt Mbms RGG-Box einen vielversprechenden Kandidaten dar für eine Proteindomäne, die in die rRNA-Bindung sowie die Translokation von RpS6 involviert ist. Es konnte gezeigt werden, dass Mbm mit deletierter RGG-Box (MbmdRGG) nicht in der Lage ist, die Überlebensfähigkeit und die Neuroblastengröße der Nullmutation mbmSH1819 vollständig zu retten. Des Weiteren benötigt Mbm die RGG-Box, um rRNA in vitro zu binden und in mbmdRGG sowie mbmSH1819 Mutanten konnte eine partielle Delokalisation von RpS6 beobachtet werden. Die korrekte Lokalisation von Mbm selbst scheint auch von der RGG-Box abzuhängen, da MbmdRGG teilweise in den Nukleus delokalisiert ist. Interessanterweise ist außerdem die Proteinsyntheserate in mbmdRGG Mutanten erhöht, was möglicherweise in einer Erhöhung der TOR-Expression begründet ist. Somit könnte Mbm unter bestimmten Bedingungen eine verstärkende Funktion im TOR-Signalweg erfüllen, die durch seine eigene RGG-Box reguliert wird. Des Weiteren sind RGG-Boxen hinsichtlich ihrer Funktion häufig von der Methylierung durch Protein-Arginin-Methyltransferasen (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) abhängig. Mbm könnte innerhalb seiner RGG-Box symmetrisch dimethyliert sein, allerdings sind die Ergebnisse in dieser Hinsicht sehr zweifelhaft. Jedenfalls scheinen Dart1 und Dart5 nicht imstande zu sein, Mbm zu methylieren. Außerdem beinhaltet Mbm zwei Zink-Finger-Motive des C2HC-Typs, die in die Bindung von rRNA involviert sein könnten. Eine vorhergehende Studie konnte zeigen, dass die Mutation der Zink-Finger, mbmZnF, zwar nicht zu einer Veränderung der Neuroblastengröße führt, allerdings, dass MbmZnF ins Zytoplasma delokalisiert vorliegt. In der vorliegenden Studie wurden die mbmZnF Mutanten in die meisten Experimente mit einbezogen. Allerdings sind die Ergebnisse rätselhaft, da mbmZnF-mutierte Larven sogar eine geringere Überlebensrate zeigen als die mbm Nullmutanten und da MbmZnF eine stärkere Bindungsaffinität zu rRNA zeigt als wildtypisches Mbm. Dies weist auf eine unspezifische Interaktion zwischen MbmZnF und einem anderen Protein, RNA oder DNA hin, was einen dominant-negativen Effekt auslösen könnte, indem andere Interaktionspartner gestört werden. Somit gestaltet es sich schwierig, Schlussfolgerungen zur Funktion der Zink-Finger zu ziehen. Zusammengefasst liefert die vorliegende Studie weitere Anhaltspunkte, dass Mbm in der Neuroblastenproliferation sowie der Regulation der Ribosomenbiogenese involviert ist und dass Mbm seine RGG-Box benötigt, um seine Funktionen zu erfüllen. KW - Taufliege KW - Neuroblast KW - Gehirn KW - Entwicklung KW - Drosophila melanogaster KW - brain development KW - neuroblast proliferation KW - mushroom body miniature KW - Gehirnentwicklung KW - Neuroblastenproliferation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199674 ER - TY - THES A1 - Lehmann, Julian T1 - Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie beleuchtet den Oligomerisierungsstatus pflanzlicher Membranproteine T1 - Super-resolution microscopy elucidates the stoichiometry of plant membrane proteins N2 - SLAC/SLAH Anionenkanäle, die zur Familie der langsamen Anionenkanäle gehören, repräsentieren Schlüsselproteine in der pflanzlichen Stressantwort. Neben ihrer Aufgabe in Stresssituationen, ist eine Untergruppe der Kanäle für die Beladung der Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid in der Stele der Pflanzenwurzeln verantwortlich. Biophysikalische und pflanzenphysiologische Studien stellten heraus, dass vor Allem der Anionenkanal SLAH3 für die Beladung der Xylem Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid verantwortlich ist. Ihm zur Seite gestellt werden noch die elektrisch inaktiven Homologe SLAH1 und SLAH4 in der Wurzel exprimiert. Sie steuern die Aktivität von SLAH3 durch die Assemblierung zu SLAH1/SLAH3 oder SLAH3/SLAH4 Heteromeren. Neben der Kontrolle durch Heteromerisierungsereignisse, werden SLAH3 Homomere sehr spezifisch und schnell durch zytosolische Ansäuerung aktiviert. Obwohl bereits die Kristallstruktur des bakteriellen Homologs HiTehA zu pflanzlichen SLAC/SLAH Anionenkanälen bekannt ist, welche HiTehA als Trimer charakterisiert, sind die Stöchiometrie und der Polymerisierungsgrad der pflanzlichen SLAC/SLAHs bisher noch unbekannt. Die Fluoreszenzmikroskopie umfasst viele etablierte Anwendungsmethoden, wie die konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM), Techniken mit verbesserter Auflösung, wie die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) und hochauflösende Methoden, welche durch die Lokalisationsmikroskopie (z.B. dSTORM und PALM) oder die Expansionsmikroskopie (ExM) vertreten werden. Diese unterschiedlichen Mikroskopie-methoden ermöglichen neue Einblicke in die Organisation von Proteinen in biologischen Systemen, die bis auf die molekulare Ebene hinunterreichen. Insbesondere im Bereich der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie sind im Gegensatz zu tierischen Frage-stellungen bisher jedoch nur wenige Untersuchungen in pflanzlichen Geweben durchgeführt worden. Die Lokalisationsmikroskopie ermöglicht die Quantifizierung einzelner Moleküle in nativen Systemen und lässt überdies Rückschlüsse auf den Polymerisierungsgrad von Proteinen zu. Da Poly- und Heteromerisierung von Proteinen oftmals mit der Funktionalität eines entsprechenden Proteins einhergeht, wie es bei den SLAC/SLAH Anionenkanälen der Fall ist, wurden in dieser Arbeit PALM Messungen zur Untersuchung des Polymerisierungsgrades und Interaktionsmuster der Anionenkanäle angewendet. Ferner wurden Expressionsmuster der SLAC/SLAHs untersucht und zudem Mikroskopieanwendungen im Pflanzengewebe etabliert und verbessert. In Bezug auf die Mikroskopieanwendungen konnten wir in Arabidopsis thaliana (At) Wurzeln die polare Verteilung von PIN Proteinen mittels SIM bestätigen und die gruppierte Verteilung in der Plasmamembran am Zellpol auflösen. In Wurzel-querschnitten war es möglich, Zellwände zu vermessen, den Aufbau der Pflanzenwurzel mit den verschiedenen Zelltypen zu rekonstruieren und diesen in Zusammenhang mit Zellwanddicken zu bringen. Anhand dieser Aufnahmen ließ sich die Auflösungsgrenze eines SIM-Mikroskops bestimmen, weshalb diese Probe als Modellstruktur für Auflösungsanalysen, zur Kontrolle für die korrekte Bildverarbeitung bei hochauflösender Bildgebung und andere Fragestellungen empfohlen werden kann. Für die Expansionsmikroskopie in pflanzlichen Proben konnten ein enzym- und ein denaturierungsbasiertes Präparationsprotokoll etabliert werden. Dabei wurden ganze At Setzlinge, Wurzelabschnitte und Blattstücke gefärbt, expandiert und mit zwei bis drei Mal verbesserter Auflösung bildlich dargestellt. In diesem Zusammenhang waren Aufnahmen ganzer Wurzel- und Blattproben mit beeindruckender Eindringtiefe und extrem geringem Hintergrundsignal möglich. Zudem wurden die Daten kritisch betrachtet, Probleme aufgezeigt, gewebespezifische Veränderungen dargestellt und limitierende Faktoren für die ExM in Pflanzenproben thematisiert. Im Fokus dieser Arbeit stand die Untersuchung der SLAC/SLAH Proteine. SLAH2 wird in den Wurzeln vornehmlich in Endodermis- und Perizykelzellen exprimiert, was anhand verschiedener At SLAH2 YFP Mutanten untersucht werden konnte. Dies unterstützt die Annahme, dass SLAH2 bei der Beladung der Leitgefäße mit Nitrat maßgeblich beteiligt ist. Es ist denkbar, dass SLAH2 ebenfalls eine wachstumsbeeinflussende Funktion über die Regulation von Nitratkonzentrationen zugeschrieben werden kann. Darauf deuten vor allem die verstärkte Expression von SLAH2 im Bereich der Seitenwurzeln und die heterogene Expression in der Elongations-, Differenzierungs- und meristematischen Zone hin. Die Membranständigkeit von SLAH4 konnte nachgewiesen werden und FRET FLIM Untersuchungen zeigten eine hohe Affinität von SLAH4 zu SLAH3, was die beiden Homologe als Interaktionspartner identifiziert. Für die Bestimmung des Oligomerisierungsgrades mittels PALM wurden die pflanzlichen Anionenkanäle in tierischen COS7-Zellen exprimiert. Die elektrophysiologische Funktionalität der mEOS2-SLAC/SLAH-Konstrukte wurde mit Hilfe von Patch-Clamp-Versuchen in COS7-Zellen überprüft. Um Expressionslevel, Membranständigkeit und die Verteilung über die Membran der SLAC/SLAHs zu verifizieren, wurden dSTORM-Aufnahmen herangezogen Schließlich ermöglichten PALM-Aufnahmen die Bestimmung des Polymerisierungs-grades der SLAC/SLAH Anionenkanäle, die stöchiometrischen Veränderungen bei Heteromerisierung von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 und auch der Einfluss einer zytosolischer Ansäuerung auf den Polymerisierungsgrad von SLAH3 Homomeren. Zudem weisen die Oligomerisierungsanalysen von SLAH3 Mutanten darauf hin, dass die Aminosäuren Histidin His330 und His454 entscheidend an der pH sensitiven Regulierung von SLAH3 beteiligt sind. Durch die erhobenen Daten konnten also entscheidende, neue Erkenntnisse über die Regulationsmechanismen von pflanzlichen Anionenkanälen auf molekularer Ebene gewonnen werden: Unter Standardbedingungen liegen SLAC1, SLAH2 und SLAH3 hauptsächlich als Dimer vor. Auf eine zytosolische Ansäuerung reagiert ausschließlich SLAH3 mit einer signifikanten stöchiometrischen Veränderung und liegt im aktiven Zustand vor Allem als Monomer vor. Der Oligomerisierungsgrad von SLAC1 und SLAH2 bleibt hingegen bei einer zytosolischen Ansäuerung unverändert. Ferner kommt es bei der Interaktion von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 zur Formierung eines Heterodimers, welches unbeeinflusst durch den zytosolischen pH bleibt. Im Gegensatz dazu bleiben die elektrisch inaktiven Untereinheiten SLAH1 und SLAH4 monomerisch und assemblieren ganz spezifisch nur mit SLAH3. Die hochauflösende Fluoreszenz-mikroskopie, insbesondere PALM erlaubt es also Heteromerisierungsereignisse und Änderungen im Poylmerisierungsgrad von Membranproteinen wie den SLAC/SLAHs auf molekularer Ebene zu untersuchen und lässt so Rückschlüsse auf physiologische Ereignisse zu. N2 - Anion channels of the slow anion channel family (SLAC/SLAH) are general master switches of plant stress responses. In addition a subgroup of channels load the vascular tissue in roots with nitrate and chloride. The activity of the main nitrate and chloride loading anion channel, SLAH3, is controlled by heteromerization with the electro-physiologically silent subunits SLAH1 and SLAH4 or alternatively by cytosolic acidification. Although the crystal structure of a bacterial homologue (HiTehA) of plant SLAC/SLAH anion channels is already known and suggests a trimeric structure, the stoichiometry and the multimerization level of the plant anion channel counterparts are still undiscovered. Fluorescence microscopy encompasses numerous well-established application methods like confocal laser scanning microscopy (CLSM), high resolution techniques like structured illumination microscopy (SIM) and super resolution microscopy represented by single molecule localization microscopy (e.g. dSTORM and PALM) or recently upcoming methods like expansion microscopy (ExM). These different application methods open new fields of insight into the biological organization of proteins, even down to the molecular level. In comparison to faunal studies, very little floral enquiries have been conducted, especially in the super resolution-sector. Single-molecule localization microscopy enables individual molecules to be quantified in the native environment and therefore allows conclusions regarding protein stoichiometry. As protein stoichiometry often involves cellular function of the corresponding protein, we used PALM applications and single molecule counting strategies to analyze the stoichiometric distribution of anion channel complexes. Moreover, in this study, expression patterns of the SLAC/SLAH proteins were investigated and different microscopic applications on plant specific issues could be improved and established. Referring to microscopic applications, we confirmed the polar orientation of PIN proteins via SIM and succeeded in resolving the clustered distribution in the plasma membrane at the cellular pole. Besides we were also able to measure cellwall dimensions of root cross sections from Arabidopsis thaliana seedlings and therefore succeeded in concluding the root architecture, designating the various cell types within the root, comparing them with cellwall thickness and evaluating resolution limits of the SIM microscope. Due to these reasons, this specimen can be recommended as a model structure for resolution analyses, control measurements regarding tissue-intactness after image processing for super-resolution images, or further questions. We turned out to establish two different protocols for ExM-studies in plants. One is based on enzymatic digestion and the other one on denaturation. We were able to label, expand and image whole At-seedlings, root- and leaf segments and thereby improved the resolution 2 3 fold. In this regard we managed to comprehensively depict the intact structure of leaves and roots with impressive penetration depth and extremely low background. We also examined our data and identified tissue-specific changes, discuss problems and possible limits of ExM in plants. The major part of this work was the investigation of SLAC/SLAH proteins. The expression of SLAH2 in roots is mainly located in endodermal and pericycle cells which was observed in various At-SLAH2-YFP mutants. Thus, strengthening the hypothesis, that SLAH2 has a major role in loading the vascular tissue with nitrate. The heterogeneous expression levels of SLAH2 in the meristematic-, elongation- and differentiation zone and moreover the upregulation in areas of lateral root formation also suggests that SLAH2 has an effect on plant growth by regulating nitrate levels. SLAH4 is located in the plasma membrane and FRET FLIM measurements showed a high affinity to SLAH3, validating the two homologues as interaction partners. For PALM-stoichiometry analyses, the plant anion channels were expressed in mammalian COS7-cells, in order to avoid endogenous falsification of the stoichiometries, as well as impractical reasons of PALM imaging in plant tissue. Hence, checking the electrophysiological functionality of mEOS2-SLAC/SLAH constructs via patch-clamp measurements. dSTORM-measurements were used to verify expression levels, correct membrane-association and the distribution of the SLAC/SLAHs in COS7 cells. We determined the multimerization level of SLAC/SLAHs upon cytosolic acidification and monitor stoichiometric changes upon heteromerization of SLAH3 with SLAH1 and SLAH4. On the basis of our data the following valuable new insights into the regulation mechanisms of plant anion channels were revealed: under control conditions, SLAC1, SLAH2 and SLAH3 are mainly depicted as dimers. Upon cytosolic acidification with NaOAc the stoichiometries of SLAC1 and SLAH2 remained unchanged, whereas the amount of dimeric SLAH3 is significantly reduced and shifts to a mainly monomeric distribution. It could also be assessed that SLAH3 interacts with SLAH1 or SLAH4, thereby forming a heterodimer, which is barely separable by acidification. In contrast, for SLAH1 and SLAH4 no affinity was observed. Moreover, the stoichiometries of different SLAH3-mutants indicated a crucial role of the amino acids histidin His330 and His454 in the pH-sensitive regulation of SLAH3. Hence, super-resolution micrsocopy, especially PALM allows the quantification of polymerization- and heteromerization-levels of proteins like the SLAC/SLAH anion-channels on the molecular level and therefore enabling physiological conclusions. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Membranproteine KW - Oligomerisation KW - Superresolution microscopy KW - SLAC/SLAH KW - PALM stoichiometry Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211762 ER - TY - JOUR A1 - Lichthardt, Sven A1 - Wagner, Johanna A1 - Löb, Stefan A1 - Matthes, Niels A1 - Kastner, Caroline A1 - Anger, Friedrich A1 - Germer, Christoph-Thomas A1 - Wiegering, Armin T1 - Pathological complete response due to a prolonged time interval between preoperative chemoradiation and surgery in locally advanced rectal cancer: analysis from the German StuDoQ|Rectalcarcinoma registry JF - BMC Cancer N2 - Background Preoperative chemoradiotherapy is the recommended standard of care for patients with local advanced rectal cancer. However, it remains unclear, whether a prolonged time interval to surgery results in an increased perioperative morbidity, reduced TME quality or better pathological response. Aim of this study was to determine the time interval for best pathological response and perioperative outcome compared to current recommended interval of 6 to 8 weeks. Methods This is a retrospective analysis of the German StuDoQ|Rectalcarcinoma registry. Patients were grouped for the time intervals of "less than 6 weeks", "6 to 8 weeks", "8 to 10 weeks" and "more than 10 weeks". Primary endpoint was pathological response, secondary endpoint TME quality and complications according to Clavien-Dindo classification. Results Due to our inclusion criteria (preoperative chemoradiation, surgery in curative intention, M0), 1.809 of 9.560 patients were suitable for analysis. We observed a trend for increased rates of pathological complete response (pCR: ypT0ypN0) and pathological good response (pGR: ypT0-1ypN0) for groups with a prolonged time interval which was not significant. Ultimately, it led to a steady state of pCR (16.5%) and pGR (22.6%) in "8 to 10" and "more than 10" weeks. We were not able to observe any differences between the subgroups in perioperative morbidity, proportion of rectal extirpation (for cancer of the lower third) or difference in TME quality. Conclusion A prolonged time interval between neoadjuvant chemoradiation can be performed, as the rate of pCR seems to be increased without influencing perioperative morbidity. KW - Rectal cancer KW - Surgery KW - Radiochemotherapy KW - Time interval Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229334 VL - 20 IS - 1 ER - TY - THES A1 - Seibold, Marcel T1 - Funktionelle Charakterisierung des Ras family small GTP binding protein RAL im Multiplen Myelom T1 - Functional characterization of the Ras family small GTP binding protein RAL in multiple myeloma N2 - Die monoklonale Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark ist charakteristisch für das multiple Myelom (MM) und kann bei Erkrankten zu Störungen in der Hämatopoese sowie zu Knochenläsionen und Niereninsuffizienz führen. Die Weiterentwicklung und der Einsatz neuer Therapieoptionen konnten das Überleben von MM-Patienten zwar erheblich verbessern, jedoch gilt diese Krankheit weiterhin als unheilbar. Onkogene Mutationen und das Knochenmarkmikromilieu führen in MM-Zellen zur Entstehung eines onkogenen Signalnetzwerks, das das Wachstum und Überleben der Zellen aufrechterhält. Mutationen der GTPase RAS treten bei bis zu 50 % der MM-Patienten auf und tragen zum Überleben von MM-Zellen bei. Trotz der Häufigkeit und Bedeutsamkeit von onkogenem RAS, auch in anderen Tumorentitäten, ist die GTPase nach wie vor therapeutisch nicht angreifbar. Die GTPase RAL aus der Familie der RAS-GTPasen wird als Downstream-Effektor von RAS angesehen, der damit ebenfalls zur Aufrechterhaltung des Tumorzellüberlebens beitragen könnte. In einigen Tumorentitäten konnte bisher gezeigt werden, dass eine Überexpression von RAL in den Tumorzellen vorliegt und die Proliferation und Apoptose von Tumorzellen durch RAL beeinflusst wird. Daher stellte sich die Frage, ob RAL im MM ebenfalls das Überleben von Tumorzellen beeinflusst und ob eine direkte Verbindung zwischen onkogenem RAS und RAL besteht. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle von RAL sowie dessen Zusammenhang mit onkogenem RAS im MM untersucht. Hierbei konnte eine Überexpression von RAL in MM-Zellen im Vergleich zu MGUS oder normalen Plasmazellen beobachtet werden. In Knockdown-Analysen wurde gezeigt, dass RAL überlebensnotwendig für MM-Zellen ist. Dabei wurde in Western Blot-Analysen festgestellt, dass diese Überlebenseffekte unabhängig von MAPK/ERK-Signaling vermittelt werden. Es konnte teilweise jedoch eine Abhängigkeit von der AKT-Aktivität beobachtet werden. Da RAL-Knockdown Einfluss auf das Überleben von MM-Zellen hat, wurde eine pharmakologische Inhibition von RAL durch den Inhibitor RBC8 untersucht. RBC8 zeigte in höheren Dosen nur bei einem Teil der MM-Zelllinien eine Wirkung auf das Zellüberleben sowie auf die RAL-Aktivierung. Die Weiterentwicklung potenter RAL-Inhibitoren ist daher für eine klinische Translation einer RAL-Inhibition von großer Bedeutung. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen onkogenem RAS und der RAL-Aktivierung wurden RAL-Pulldown-Analysen nach Knockdown von onkogenem RAS durchgeführt. In diesen Experimenten wurde keine Abhängigkeit der RAL-Aktivierung von onkogenem RAS festgestellt. Darüber hinaus zeigten Genexpressionsanalysen nach RAS- bzw. RAL-Knockdown unterschiedliche Genexpressionsprofile. In Massenspektrometrie-Analysen wurden mögliche Effektoren, die mit RAL an der Beeinflussung des Zellüberlebens beteiligt sein könnten, untersucht. Hierbei wurden die Komponenten des Exozyst-Komplexes EXO84 und SEC5 als Interaktionspartner von RAL identifiziert. Nachdem gezeigt wurde, dass RAL ausschlaggebend für das Überleben von MM-Zellen ist, wurde eine Kombination von RAL-Knockdown mit klinisch relevanten Wirkstoffen analysiert. Diese zeigte bei der Kombination mit PI3K oder AKT-Inhibitoren verstärkte Effekte auf das Zellüberleben der MM-Zellen. Zusammenfassend wurde die Bedeutung von RAL für das Überleben von Tumorzellen im MM gezeigt und RAL als potentielles therapeutisches Target im MM beschrieben, welches unabhängig von onkogenem RAS reguliert wird. N2 - Multiple myeloma (MM) is a hematologic neoplasia which is characterized by monoclonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow leading to hematopoetic failure, bone lesions and renal failure. Although continuous development of existing therapeutics and new therapeutic options vastly improved MM patient survival, MM still remains an incurable disease. Oncogenic mutations and the bone marrow microenvironment contribute to a signaling network which sustains MM cell proliferation and survival. Within this network mutations of the RAS oncogene account for up to 50 % of MM patients. Despite its prevalence and importance not only in MM, RAS still remains undruggable. The GTPase-family Member RAL is considered as a RAS effector which might also influence maintainance of tumor cell survival. In several tumor entities RAL is overexpressed in tumor cells and influences proliferation and apoptosis. Therefore, in MM RAL might also be controlled by oncogenic RAS and mediate cell survival of tumor cells. In this work, RAL’s functional role as well as the potential interconnection with oncogenic RAS was investigated. In MM cells RAL is ovexpressed compared to non-malignant MGUS or plasma cells. Knockdown analyses showed that RAL is essential for MM cell survival. These survival effects are transferred independently of MAPK/ERK signaling as shown by Western Blot analysis. However, to some extent RAL influenced MM cell survival dependently of AKT activity. Because RAL knockdown had a significant effect on MM cell survival a pharmacological inhibition was tested using the inhibitor RBC8. In a portion of MM cell lines RBC8 exerts effects on cell survival. But the effects of RBC8 on RAL activation were only visible at higher concentrations as shown by pulldown assays. Thus, subsequent development of potent RAL inhibitors is of major importance for clinical translation. To investigate whether RAL is directly activated by oncogenic RAS, RAL pulldown assays were performed after knockdown of oncogenic RAS. Strikingly, there was no direct connection between the presence of oncogenic RAS and RAL activation. Furthermore, gene expression profiles after RAS or RAL knockdown showed differing expression signatures. Potential effectors of RAL which might also influence MM cell survival were investigated in mass spectrometric analyses where the exocyst complex components EXO84 and SEC5 were identified as RAL interaction partners. Since RAL is of importance for MM cell survival, RAL knockdown was combined with clinically relevant agents. There was an enhanced induction of apoptosis upon combination of PI3K or AKT inhibitors with RAL knockdown. Taken together, the influence of RAL as a crucial mediator of MM cell survival was shown in this work. Therefore, RAL represents a potential therapeutic target which is regulated independently of oncogenic RAS. KW - Kleine GTP-bindende Proteine KW - Signaltransduktion KW - Plasmozytom KW - RAL KW - Multiples Myelom KW - Zellüberleben KW - Knochenmark Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208003 ER - TY - THES A1 - Spindler, Marie-Christin T1 - Molecular architecture of meiotic multiprotein complexes T1 - Molekulare Architektur meiotischer Multiproteinkomplexe N2 - Sexually reproducing organisms depend on meiosis for the generation of haploid, genetically diverse gametes to maintain genome stability and the potential to adapt to changing environments. Haploidization is achieved through two successive rounds of cell division after a single initial pre-meiotic DNA replication. Meiosis I segregates the homologous chromosomes, followed by the segregation of the sister chromatids in meiosis II. Genetic diversity is achieved through the process of recombination that de-scribes the exchange of genetic material between the maternal and paternal homolog. Recombination and the initial steps of haploidization are executed already early on in prophase I. Both essential processes depend on a variety of multiprotein complexes, such as the linker of nucleo- and cytoplasm (LINC) complex and the synaptonemal complex (SC). The structure of multiprotein complexes is adjusted according to their function, environment, and the forces they are subjected to. Coiled-coil domains typical in load-bearing proteins characterize the meiotic mechanotransducing LINC complexes. SCs resemble ladder-like structures that are highly conserved amongst eukaryotes, while the primary sequence of the proteins that form the complex display very little if any sequence homology. Despite the apparent significance of the structure to their function, little quantitative and topological data existed on the LINC complexes and the SC within their morphological context prior to the present work. Here, the molecular architecture of the meiotic telomere attachment site where LINC complexes reside and the SC have been analyzed in depth, mainly on the basis of electron microscope tomography derived 3D models complemented by super-resolution light microscopic acquisitions of the respective protein components. N2 - Sich sexuell fortpflanzende Organismen sind auf die Meiose angewiesen, um haploide, genetisch vielfältige Keimzellen zu erzeugen, die die Stabilität des Genoms und die Fähigkeit zur Anpassung an sich verändernde Umgebungen erhalten. Die Haploidisierung wird durch zwei aufeinanderfolgende Runden der Zellteilung nach einer einzigen anfänglichen prä-meiotischen DNA Replikation erreicht. In der Meiose I werden die homologen Chromosomen getrennt, gefolgt von der Trennung der Schwesterchromatiden während der Meiose II. Genetische Diversität wird durch den Prozess der Rekombination erreicht, der den Austausch von genetischem Material zwischen den mütterlichen und väterlichen Homologen beschreibt. Die Rekombination und die ersten Schritte der Haploidisierung werden bereits früh in der Prophase I durchgeführt. Beide essentiellen Prozesse hängen von einer Vielzahl von Multiproteinkomplexen ab, wie z.B. dem Linker of Nucleo- and Cytoplasm (LINC)-Komplex und dem synaptonemalen Komplex (SC). Die Struktur von Multiproteinkomplexen wird je nach ihrer Funktion, ihrer Umgebung und den Kräften, denen sie ausgesetzt sind, angepasst. Coiled-coil-Domänen, die für tragende Proteine typisch sind, charakterisieren die meiotischen, mechanotransduzierenden LINC-Komplexe. SCs ähneln leiterähnlichen Strukturen, die unter Eukaryonten hoch konserviert sind, während die Primärsequenz der Proteine, die den Komplex bilden, sehr wenig bis gar keine Sequenzhomologie aufweist. Trotz der offensichtlichen Bedeutung der Struktur für ihre Funktion gab es vor der vorliegenden Arbeit nur wenige quantitative und topologische Daten über die LINC Komplexe und den SC in ihrem morphologischen Kontext. Hier wurde die molekulare Architektur der Telomeranheftungsstellen, an denen sich die LINC-Komplexe befinden, und die des SCs eingehend analysiert, hauptsächlich auf der Grundlage von auf der Elektronenmikroskop-Tomographie basierenden 3D-Modellen, ergänzt durch hochauflösende lichtmikroskopische Aufnahmen der jeweiligen Proteinkomponenten. KW - Meiose KW - Meiosis Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212105 ER - TY - THES A1 - Lu, Yunzhi T1 - Kinetics of mouse and human muscle type nicotinic receptor channels T1 - Kinetik muriner und humaner nikotinischer Rezeptorkanäle vom Muskeltyp N2 - Acetylcholine (ACh) mediates transmission at vertebrate neuromuscular junctions and many other synapses. The postsynaptic ACh receptors at neuromuscular junctions are of the nicotinic subtype (nAChRs). They are among the best studied receptor channels and often serve as models or receptor prototypes. Despite a wealth of information on muscle type nAChRs so far little is known about species specific functional differences. In this work, mouse and human adult muscle type nAChRs are investigated. Cell attached recordings in the HEK293T heterologous expression system provided evidence that the ACh affinity of recombinant mouse and human adult muscle type nAChRs are different. To clarify this, I compared these receptors in outside-out patches employing a system for fast agonist application. Thus, the individual membrane patches with receptors can be exposed to various ligand concentrations. In response to 10 and 30 µM ACh normalized peak currents (î) were significantly larger and current rise-time (tr) shorter in human than in mouse receptors. Analyzing dose-response curves of î and tr and fitting them with a two-step equivalent binding-site kinetic mechanism revealed a two-fold higher ACh association rate constant in human compared to mouse receptors. Furthermore, human nAChRs were blocked faster in outside-out patches by superfusion of 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) than mouse nAChRs. Finally, human nAChRs in outside-out patches showed higher affinity at 3 µM ACh than chimeric receptors consisting of mouse α- and human β-, γ- and ε-subunits. The higher affinity of human than mouse receptors for ACh and α-Bgtx is thus at least in part due to sequence difference in their α-subunits. N2 - Acetylcholin (ACh) vermittelt Erregungsübertragung an neuromuskulären synaptischen Kontakten (neuromuscular junction, NMJ) von Wirbeltieren und vielen anderen Synapsen. Die postsynaptischen ACh-Rezeptoren an der NMJ sind vom nikotinischen Subtyp (nAChRs). Als Teil der am besten erforschten Kanalrezeptoren dienen sie oft als Modelle oder auch Prototypen für Rezeptoren. Trotz einer Fülle an Informationen über nAChRs des Muskeltyps ist bis heute recht wenig über artenspezifischen funktionellen Unterschiede bekannt. Diese Studie befasst sich daher mit der Untersuchung von nAChRs des Muskeltyps in erwachsenen Mäusen und Menschen. Aufzeichnungen mit sogenannten Cell-attached Patches im heterologen Expressionssystem HEK293T-Zellen lieferten Beweise dafür, dass die ACh-Affinität von rekombinanten erwachsenen Maus- und menschlichen nAChRs vom Muskeltyp unterschiedlich sind. Um diesem nachzugehen, habe ich diese Rezeptoren in Outside-out Patches mit Hilfe eines schnellen Piezogetriebenen Applikationssystems verglichen. Dieses System bietet den Vorteil, dass einzelne Membran-Patches mit Rezeptoren unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen ausgesetzt werden können. Als Reaktion auf 10 und 30 µM ACh waren die normalisierten Stromamplituden (î) und Stromanstiegszeiten (tr) der menschlichen Rezeptoren signifikant höher als die der Mausrezeptoren. Die Analyse der Dosis-Wirkungskurven von î und tr sowie die Anpassung eines quantitativen zweistufigen kinetischen Modells mit zwei äquivalenten Bindestellen an die Datensätze zeigten eine zweifach höhere Assoziationsrate für ACh bei menschlichen Rezeptoren, verglichen mit der von Mausrezeptoren. Zudem wurden menschliche nAChRs in Outside-Out-Patches schneller als Mausrezeptoren durch Superfusion mit 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) blockiert, was für eine höhere Affinität auch für α-Bgtx spricht. Schließlich wiesen die menschlichen nAChRs in Outside-Out-Patches bei 3 µM ACh eine höhere Affinität als chimäre Rezeptoren aus Maus α- und menschlichen β-, γ- and ε-Untereinheiten auf. Die höhere Affinität der menschlichen Rezeptoren zu ACh und α-Bgtx im Vergleich zu Mausrezeptoren basiert somit zumindest in Teilen auf Sequenzdifferenzen ihrer α-Einheitenen. KW - nicotinic acetylcholine receptor KW - affinity KW - kinetic mechanism KW - Nicotinischer Acetylcholinrezeptor KW - Muskelzelle KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192688 ER - TY - THES A1 - Becker, Mira Caroline T1 - Principles of olfactory-visual integration to form a common percept in honeybees T1 - Prinzipien der olfaktorisch-visuellen Integration des Lernverhaltens der Honigbienen N2 - The honeybee is a well studied and important organism in neuroethology. The possibility to train them with a classical conditioning paradigm and their miniature brain provide a perfect requisite to investigate the neuronal principles of learning and memory. Honeybees use visual and olfactory cues to detect flowers during their foraging trips. Hence, the reward association of a nectar source is a multi-modal construct, which has at least two major components - olfactory and visual cues. It is still an open question, how both sensory components are converged in the mushroom body, which represent the multi-modal integration centre of the honeybee brain. The main goal of this study, is to investigate the processing of multiple modalities and how a reward association is formed. This includes, how and wether both sensory modalities interfere during learning. Thus, in this study stimulation with UV, blue and green light was used to evoke distinct photoreceptor activities in the compound eye. Furthermore, three different odours (Geraniol, Citronellol and Farnesol) were used. These stimuli were tested in three different experimental series. The first experiment involved classical differential conditioning of the single modalities - odour and colour. Honeybees showed high learning performances in differentiating olfactory stimuli and also reliable responses for visual conditioning. Furthermore, a temporal discrepancy in the stimulus length for best learning in the olfatcoty and visual cues was found. In the second series, it was tested how multi-modal compounds are perceived. This includes, unique cues (configural processing) or the sum of the single components of a compound (elemen- tal processing). This was tested by combining single odour components with monochromatic light in a positive (PP) and negative patterning (NP) experiment. During PP, the olfactory- visual compound was rewarded, whereas the single components were unrewarded. In contrast, during NP the single components were reinforced, but the compound was not. In addition, the ability to distinguish between two different light stimuli presented as a part of an olfactory-visual compound with the same odour component during acquisition was tested. In a memory test, the light stimuli were presented again as a compound and in addition as the single components. The results revealed that bees used elemental processing with compounds containing green and blue light. In contrast, when UV light was presented the bees used configural processing. Finally, a third experiment was conducted at the neuronal level. Multi-unit recordings were established to provide a suitable method to analyse extrinsic neurons at the mushroom body output region, the so called ventral lobe of the pedunculus. Here, three different odours (Geran- iol, Farnesol and Citronellol), two colours (green and blue) and two combined stimuli (colour + odour) were chosen as stimuli, to search for possible variations in processing stimuli with different modalities. Two units could be detected that responded mainly to visual stimuli. N2 - Die Honigbiene ist ein gut untersuchter und wichtiger Organismus für die neuroethologische Forschung. Die Möglichkeit sie auf klassische Weise zu Konditionieren und ihr relativ kleines Gehirn macht sie zum idealen Untersuchungs-Gegenstand um die neuronalen Prinzipien des Lernens und der Gedächtnisbildung zu erforschen. Während des Furagierens nutzen Honigbi- enen beides: visuelle und olfaktorische Merkmale der Futterplanzen. Daher ist die Belohnungs- Assoziation mit der Nektar-Belohnung ein multi-modales Konstrukt, welches aus mindestens zwei Hauptkomponenten, den olfaktorischen und den visuellen Reizen, besteht. In dieser Arbeit soll untersucht werden, wie olfaktorische und visuelle Reize verarbeitet wer- den und wie sie im Pilzkörper, dem multi-modalen Integrationszentrum des Bienengehirnes, konvergieren. Wie beide sensorischen Modalitäten integriert werden um eine gemeingültige Belohnungs-Assoziation zu bilden, ist immer noch eine offene Frage. Weiterhin ist unklar ob und wie sie miteinander interferieren. Die hier dargestellten Studien nutzen Stimulationen mit UV, blauem und grünem Licht um unterschiedliche Photorezeptor Aktivitäten im Komplexauge auszulösen. Des Weiteren wurden drei verschiedene Duftkomponenten (Geraniol, Citronellol und Farnesol) verwendet. Diese Stimuli wurden in drei verschiedenen Experiment-Reihen gestestet. Das erste Experiment umfasste die klassische differentielle Konditionierung der Einzelmodalitäten (Duft und Farbe). Honigbienen zeigten eine hohe Lernfähigkeit bei der Unterscheidung zweier olfaktorischer Reize sowie eine solide Lern-Leistung während der Konditionierung mit Licht. Im zweiten Experiment wurde getestet, ob ein zusammengesetzter Reiz aus beiden Modalitäten als Summe der einzelnen Elemente (elementare Verarbeitung) oder als unikaler Reiz (konfigu- rale Verarbeitung) wahrgenommen wird. Hierbei wurde monochromatisches Licht und einzelne Duftkomponenten in positive patterning- (PP) und negative patterning-Experimenten (NP) getestet. Beim PP, wurde der zusammengesetzte Reiz belohnt, wohingegen die Einzelkom- ponenten unbelohnt blieben. Dagegen wurden beim NP nur die Einzelkomponenten belohnt, aber nicht ihre Kombination. Außerdem wurde der Frage nachgegangen, ob die Fähigkeit zur Differenzierung unterschiedlich ist, wenn zwei verschiedene Lichtreize teil einer olfaktorisch- visuellen Kombination sind, oder nicht. Interessanterweise zeigten die Verhaltensleistungen einen prominenten Fall von konfiguraler Verarbeitung, allerdings nur wenn UV-Licht ein El- ement der olfaktorisch-visuellen Zusammensetzung war. Die Ergebnisse der Experimente mit blauem oder grünem Licht hingegen, unterstützen die Theorie einer elementaren Verarbeitung. Abschließend wurde mittels elektrophysiologischer multi-unit-Aufnahmen eine passende Meth- ode etabliert, um die extrinsischen Neurone des Pilzkörpersausganges zu analysieren. Hierbei wurden drei verschiedene Düfte und zwei Farben sowie zwei Kombinationen aus Farbe und Duft getestet, um mögliche Variationen der multimodalen Reiz-Verarbeitung zu untersuchen. Zwei neuronale Einheiten (units) wurden gefunden, welche hauptsächlich auf Lichtreize antworteten. KW - honeybees KW - learning and behaviour KW - multi-modal stimuli Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199190 ER - TY - THES A1 - Horn [née Bunz], Melanie T1 - The impact of Drosophila melanogaster`s endogenous clock on fitness: Influence of day length, humidity and food composition T1 - Auswirkungen von Drosophila melanogaster`s Innerer Uhr auf die Fitness: Einfluss von Tageslänge, Luftfeuchtigkeit und Ernährung N2 - We are living in a system that underlies permanent environmental changes due to the rotation of our planet. These changes are rhythmic with the most prominent one having a period of about 24 hours, but also shorter and longer rhythms characterize our environment. To cope with the ever-changing environmental conditions, it is thought to be beneficial if an organism can track and anticipate these changes. The so called endogenous clocks enable this and might provide a fitness advantage. To investigate and unravel the mechanism of endogenous clocks Chronobiologists have used different model organisms. In this thesis Drosophila melanogaster was used as model organism with its about 150 clock neurons representing the main endogenous clock of the fly in the central brain. The molecular mechanisms and the interlocked feedback loops with the main circadian key players like period, timeless, clock or cycle are under investigation since the 1970s and are characterized quite well so far. But the impact of a functional endogenous clock in combination with diverse factors and the resulting fitness advantages were analysed in only a few studies and remains for the most part unknown. Therefore the aim of this thesis was to unravel the impact of Drosophila melanogaster`s endogenous clock on the fitness of the fly. To achieve this goal different factors – like day length, humidity and food composition – were analyzed in wild type CS and three different period mutants, namely perL, perS and per01, that carry a point mutation altering or abolishing the free-running period of the fruit fly as well as a second arrhythmic strain, clkAR. In competition assay experiments wild type and clock mutant flies competed for up to 63 generations under a normal 24 hour rhythm with 12 hours light/day and 12 hours darkness/night (LD12:12) or T-cycles with 19 or 29 hours, according to the mutants free-running period, or constant light (LL) in case of the arrhythmic mutant as well as under natural-like outdoor conditions in two consecutive years. Overall the wild type CS strain was outcompeting the clock mutant strains independent of the environmental conditions. As the perL fly strain elongated their free-running period, the competition experiments were repeated with naturally cantonized new fly strains. With these experiments it could be shown that the genetic background of the fly strains – which are kept for decades in the lab, with backcrosses every few years – is very important and influences the fitness of flies. But also the day length impacts the fitness of the flies, enabling them to persist in higher percentage in a population under competition. Further factors that might influence the survival in a competing population were investigated, like e.g. mating preferences and locomotor activity of homo- and heterozygous females or sperm number of males transferred per mating. But these factors can still not explain the results in total and play no or only minor roles and show the complexity of the whole system with still unknown characteristics. Furthermore populations of flies were recorded to see if the flies exhibit a common locomotor activity pattern or not and indeed a population activity pattern could be recorded for the first time and social contact as a Zeitgeber could be verified for Drosophila melanogaster. In addition humidity and its impact on the flies´ fitness as well as a potential Zeitgeber was examined in this thesis. The flies experienced different relative humidities for eclosion and wing expansion and humidity cycle phase shifting experiments were performed to address these two different questions of fitness impact and potential Zeitgeber. The fruit fly usually ecloses in the morning hours when the relative humidity is quite high and the general assumption was that they do so to prevent desiccation. The results of this thesis were quite clear and demonstrate that the relative humidity has no great effect on the fitness of the flies according to successful eclosion or wing expansion and that temperature might be the more important factor. In the humidity cycle phase shifting experiments it could be revealed that relative humidity cannot act as a Zeitgeber for Drosophila melanogaster, but it influences and therefore masks the activity of flies by allowing or surpressing activity at specific relative humidity values. As final experiments the lifespan of wild type and clock mutant flies was investigated under different day length and with different food qualities to unravel the impact of these factors on the fitness and therefore survival of the flies on the long run. As expected the flies with nutrient-poor minimum medium died earlier than on the nutrient-rich maximum medium, but a small effect of day length could also be seen with flies living slightly longer when they experience environmental day length conditions resembling their free-running period. The experiments also showed a fitness advantage of the wild type fly strain against the clock mutant strains for long term, but not short term (about the first 2-3 weeks). As a conclusion it can be said that genetic variation is important to be able to adapt to changing environmental conditions and to optimize fitness and therefore survival. Having a functional endogenous clock with a free-running period of about 24 hours provides fitness advantages for the fruit fly, at least under competition. The whole system is very complex and many factors – known and unknown ones – play a role in this system by interacting on different levels, e.g. physiology, metabolism and/or behavior. N2 - Wir leben in einem System, welches durch die Erdrotation permanenten Veränderungen der Umwelt unterliegt. Diese Veränderungen sind rhythmischer Natur, wobei die wichtigste Veränderung einen Rhythmus von circa 24 Stunden aufweist. Aber auch kürzere und längere Rhythmen charakterisieren unsere Umwelt. Um mit den permanenten Veränderungen klar zu kommen geht man davon aus, dass es von Vorteil ist wenn ein Organismus die Veränderungen wahrnehmen und vorausahnen kann. Die sogenannten Inneren Uhren ermöglichen dies und stellen möglicherweise einen Fitness Vorteil dar. Um den Mechanismus von Inneren Uhren zu untersuchen und aufzudecken benutzen Chronobiologen verschiedene Modellorganismen. In dieser Arbeit wurde Drosophila melanogaster, mit ihren etwa 150 Uhrneuronen welche die Innere Uhr im Zentralen Nervensystem darstellen, als Modellorganismus verwendet. Der molekulare Mechanismus und die ineinandergreifenden Rückkopplungsschleifen mit den Hauptakteuren period, timeless, clock und cycle werden seit den 1970ern erforscht und wurden bisher recht gut charakterisiert. Aber der Einfluss einer funktionellen Inneren Uhr in Kombination mit diversen Faktoren und die daraus resultierenden Fitness Vorteile wurden in nur wenigen Studien untersucht und bleiben zu großen Teilen unbekannt. Deshalb war es das Ziel dieser Arbeit den Einfluss von Drosophilas Innere Uhr auf die Fitness der Taufliege aufzudecken. Um dieses Ziel zu erreichen wurden verschiedene Faktoren – wie z.B. Tageslänge, Luftfeuchtigkeit und Futterqualität – in Wildtyp CS und drei verschiedenen period Mutanten – namentlich perL, perS und per01, welche alle eine Punktmutation tragen, welche die Freilauf-Periodenlänge verändert oder zu Arrhythmizität führt – sowie einem weiteren arrhythmischen Fliegenstamm, clkAR, untersucht. In Konkurrenzversuchen konkurrierten Wildtyp und Uhrmutanten über bis zu 63 Generationen unter normalen 24 Stunden Rhythmen mit jeweils 12 Stunden Licht/Tag und 12 Stunden Dunkelheit/Nacht oder unter T-Zyklen mit 19 oder 29 Stunden, entsprechend der Freilauf-Periodenlänge der Mutanten, oder Dauerlicht (LL) im Falle der arrhythmischen Mutante, sowie unter naturähnlichen Bedingungen im Feldversuch in zwei aufeinanderfolgenden Jahren. Im Gesamten war der Wildtyp den Uhrmutanten überlegen, unabhängig von den Umweltbedingungen. Da die perL Mutanten Ihre Freilauf-Periodenlänge deutlich verlängerten, wurden die Konkurrenzexperimente mit auf natürlicher Weise mit dem Wildtyp CS rückgekreuzten Fliegenstämmen wiederholt. Mit diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass der genetische Hintergrund der Fliegenstämme – welche teils für Jahrzehnte im Labor gehalten und nur wenige Male rückgekreuzt werden – sehr wichtig ist und die Fitness der Fliegen beeinflusst. Aber auch die Länge der Tage (19 h, 24 h oder 29 h) beeinflusst die Fitness der Fliegen und ermöglicht es Ihnen in höherem Anteil in einer Population unter Konkurrenz zu bestehen. Weitere Faktoren, welche das Überleben unter Konkurrenz möglicherweise beeinflussen können, wie z.B. eine Paarungspräferenz und Laufaktivität von homo- und heterozygoten Weibchen oder die Anzahl an Spermien, die pro Paarung übertragen werden, wurden untersucht. Diese Faktoren allein konnten jedoch die Ergebnisse der Konkurrenzversuche nicht erklären und spielen dabei keine oder nur geringfügige Rollen und stellen ein Beispiel für die Komplexität des ganzen Systems mit noch weiteren unbekannten Faktoren dar. Im Weiteren wurde das Laufverhalten von ganzen Fliegenpopulationen aufgezeichnet, um zu erforschen, ob eine Fliegenpopulation einen gemeinsamen Freilauf an Laufaktivität aufweist oder nicht. Und tatsächlich konnte zum ersten Mal das Laufverhalten von ganzen Populationen aufgezeichnet werden und Sozialer Kontakt als Zeitgeber für Drosophila melanogaster bestätigt werden. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit relative Luftfeuchtigkeit und deren Auswirkung auf die Fitness der Fliegen, als auch als potentieller Zeitgeber untersucht. Die Fliegen wurden zum Schlupf und zur Entfaltung der Flügel unterschiedlichen Luftfeuchtigkeiten ausgesetzt und es wurden Phasenverschiebungsversuche mit Luftfeuchtigkeitszyklen durchgeführt, um diese zwei verschiedenen Fragen nach Fitness und potentiellem Zeitgeber zu beantworten. Die Fruchtfliege schlüpft normalerweise in den Morgenstunden, wenn die Luftfeuchtigkeit relativ hoch ist, weshalb im Allgemeinen angenommen wird, dass dies zu diesem Zeitpunkt des Tages geschieht, um eine Austrocknung zu verhindern. Die Ergebnisse dieser Arbeit waren sehr eindeutig und demonstrierten, dass die relative Luftfeuchtigkeit keinen großen Einfluss auf die Fitness der Fliegen in Bezug auf den Schlupferfolg und korrektes Entfalten der Flügel hat und dass die Temperatur wohl eher der ausschlaggebende Faktor sein könnte. In den Phasenverschiebungsversuchen mit Luftfeuchtigkeitszyklen konnte aufgedeckt werden, dass relative Luftfeuchtigkeit keinen Zeitgeber für Drosophila melanogaster darstellt, aber die Laufaktivität der Fliegen beeinflusst und maskiert, indem das Laufverhalten bei bestimmten relativen Luftfeuchtigkeiten zugelassen oder unterdrückt wird. Außerdem wurde die Lebenserwartung der Wildtyp und Uhrmutanten Fliegenstämme unter verschiedenen Tageslängen und mit unterschiedlicher Futterqualität untersucht, um den Einfluss dieser Faktoren auf die Fitness und somit das Überleben der Fliegen auf Dauer zu charakterisieren. Wie erwartet starben die Fliegen auf dem nährstoffarmen Minimalmedium früher als auf dem nährstoffreichen Maximalmedium, aber es konnte auch ein kleiner Effekt der Tageslänge gezeigt werden. Hierbei lebten die Fliegen etwas länger, wenn die Tageslänge die Freilauf-Periodenlänge der Fliegen widerspiegelte. Diese Versuche zeigten auch einen Fitness Vorteil der Wildtyp Fliegen gegenüber der Uhrmutanten auf lange Sicht, jedoch nicht zu Beginn (in den ersten ca. 2-3 Wochen). Abschließend kann zusammengefasst werden, dass genetische Variation wichtig ist, um sich an Veränderungen in der Umwelt anzupassen und die eigene Fitness und somit Überleben zu steigern. Eine funktionelle Innere Uhr mit einer Periodenlänge von etwa 24 Stunden zu besitzen stellt einen Fitness Vorteil für die Fliegen dar, zumindest unter Konkurrenzbedingungen. Das ganze System ist sehr komplex und viele Faktoren – bekannte und noch unbekannte – spielen eine Rolle in diesem System, welches auf verschiedenen Ebenen interagiert, wie z.B. auf physiologischer, metabolistischer oder auf der Verhaltensebene. KW - Taufliege KW - Drosophila KW - Biologische Uhr KW - Tageslänge KW - Luftfeuchtigkeit KW - Drosophila melanogaster KW - Fitness Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211415 ER - TY - JOUR A1 - Götz, Ralph A1 - Panzer, Sabine A1 - Trinks, Nora A1 - Eilts, Janna A1 - Wagener, Johannes A1 - Turrà, David A1 - Di Pietro, Antonio A1 - Sauer, Markus A1 - Terpitz, Ulrich T1 - Expansion Microscopy for Cell Biology Analysis in Fungi JF - Frontiers in Microbiology N2 - Super-resolution microscopy has evolved as a powerful method for subdiffraction-resolution fluorescence imaging of cells and cellular organelles, but requires sophisticated and expensive installations. Expansion microscopy (ExM), which is based on the physical expansion of the cellular structure of interest, provides a cheap alternative to bypass the diffraction limit and enable super-resolution imaging on a conventional fluorescence microscope. While ExM has shown impressive results for the magnified visualization of proteins and RNAs in cells and tissues, it has not yet been applied in fungi, mainly due to their complex cell wall. Here we developed a method that enables reliable isotropic expansion of ascomycetes and basidiomycetes upon treatment with cell wall degrading enzymes. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) and structured illumination microscopy (SIM) images of 4.5-fold expanded sporidia of Ustilago maydis expressing fluorescent fungal rhodopsins and hyphae of Fusarium oxysporum or Aspergillus fumigatus expressing either histone H1-mCherry together with Lifeact-sGFP or mRFP targeted to mitochondria, revealed details of subcellular structures with an estimated spatial resolution of around 30 nm. ExM is thus well suited for cell biology studies in fungi on conventional fluorescence microscopes. KW - Expansion microscopy KW - fluorescence microscopy KW - fungi KW - sporidia KW - hyphae Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202569 SN - 1664-302X VL - 11 ER - TY - JOUR A1 - Vikuk, Veronika A1 - Fuchs, Benjamin A1 - Krischke, Markus A1 - Mueller, Martin J. A1 - Rueb, Selina A1 - Krauss, Jochen T1 - Alkaloid Concentrations of Lolium perenne Infected with Epichloë festucae var. lolii with Different Detection Methods—A Re-Evaluation of Intoxication Risk in Germany? JF - Journal of Fungi N2 - Mycotoxins in agriculturally used plants can cause intoxication in animals and can lead to severe financial losses for farmers. The endophytic fungus Epichloë festucae var. lolii living symbiotically within the cool season grass species Lolium perenne can produce vertebrate and invertebrate toxic alkaloids. Hence, an exact quantitation of alkaloid concentrations is essential to determine intoxication risk for animals. Many studies use different methods to detect alkaloid concentrations, which complicates the comparability. In this study, we showed that alkaloid concentrations of individual plants exceeded toxicity thresholds on real world grasslands in Germany, but not on the population level. Alkaloid concentrations on five German grasslands with high alkaloid levels peaked in summer but were also below toxicity thresholds on population level. Furthermore, we showed that alkaloid concentrations follow the same seasonal trend, regardless of whether plant fresh or dry weight was used, in the field and in a common garden study. However, alkaloid concentrations were around three times higher when detected with dry weight. Finally, we showed that alkaloid concentrations can additionally be biased to different alkaloid detection methods. We highlight that toxicity risks should be analyzed using plant dry weight, but concentration trends of fresh weight are reliable. KW - Epichloë KW - Lolium perenne KW - toxicity KW - grasslands KW - HPLC/UPLC methods KW - endophyte KW - plant fresh/dry weight KW - alkaloid detection methods KW - mycotoxins KW - phenology Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213171 SN - 2309-608X VL - 6 IS - 3 ER - TY - JOUR A1 - Osman, Mohamed A1 - Stigloher, Christian A1 - Mueller, Martin J. A1 - Waller, Frank T1 - An improved growth medium for enhanced inoculum production of the plant growth-promoting fungus Serendipita indica JF - Plant Methods N2 - Background The plant endophytic fungus Serendipita indica colonizes roots of a wide range of plant species and can enhance growth and stress resistance of these plants. Due to its ease of axenic cultivation and its broad host plant range including the model plant Arabidopsis thaliana and numerous crop plants, it is widely used as a model fungus to study beneficial fungus-root interactions. In addition, it was suggested to be utilized for commercial applications, e.g. to enhance yield in barley and other species. To produce inoculum, S. indica is mostly cultivated in a complex Hill-Kafer medium (CM medium), however, growth in this medium is slow, and yield of chlamydospores, which are often used for plant root inoculation, is relatively low. Results We tested and optimized a simple vegetable juice-based medium for an enhanced yield of fungal inoculum. The described vegetable juice (VJ) medium is based on commercially available vegetable juice and is easy to prepare. VJ medium was superior to the currently used CM medium with respect to biomass production in liquid medium and hyphal growth on agar plates. Using solid VJ medium supplemented with sucrose (VJS), a high amount of chlamydospores developed already after 8 days of cultivation, producing significantly more spores than on CM medium. Use of VJ medium is not restricted to S. indica, as it also supported growth of two pathogenic fungi often used in plant pathology experiments: the ascomycete Fusarium graminearum, the causal agent of Fusarium head blight disease on wheat and barley, and Verticillium longisporum, the causal agent of verticillium wilt. Conclusions The described VJ medium is recommended for streamlined and efficient production of inoculum for the plant endophytic fungus Serendipita indica and might prove superior for the propagation of other fungi for research purposes. KW - Serendipita indica KW - Plant root endophyte KW - Inoculum production KW - Complex medium KW - Aspergillus medium KW - Vegetable juice KW - Plant growth promotion Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229186 VL - 16 ER - TY - JOUR A1 - Shityakov, Sergey A1 - Bencurova, Elena A1 - Förster, Carola A1 - Dandekar, Thomas T1 - Modeling of shotgun sequencing of DNA plasmids using experimental and theoretical approaches JF - BMC Bioinformatics N2 - Background Processing and analysis of DNA sequences obtained from next-generation sequencing (NGS) face some difficulties in terms of the correct prediction of DNA sequencing outcomes without the implementation of bioinformatics approaches. However, algorithms based on NGS perform inefficiently due to the generation of long DNA fragments, the difficulty of assembling them and the complexity of the used genomes. On the other hand, the Sanger DNA sequencing method is still considered to be the most reliable; it is a reliable choice for virtual modeling to build all possible consensus sequences from smaller DNA fragments. Results In silico and in vitro experiments were conducted: (1) to implement and test our novel sequencing algorithm, using the standard cloning vectors of different length and (2) to validate experimentally virtual shotgun sequencing using the PCR technique with the number of cycles from 1 to 9 for each reaction. Conclusions We applied a novel algorithm based on Sanger methodology to correctly predict and emphasize the performance of DNA sequencing techniques as well as in de novo DNA sequencing and its further application in synthetic biology. We demonstrate the statistical significance of our results. KW - Shotgun method KW - Sanger sequencing KW - Virtual sequencing KW - Polymerase chain reaction KW - Gene expression vectors KW - Synthetic biology Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229169 VL - 2020 ER - TY - JOUR A1 - Seitz, Nicola A1 - vanEngelsdorp, Dennis A1 - Leonhardt, Sara D. T1 - Are native and non‐native pollinator friendly plants equally valuable for native wild bee communities? JF - Ecology and Evolution N2 - Bees rely on floral pollen and nectar for food. Therefore, pollinator friendly plantings are often used to enrich habitats in bee conservation efforts. As part of these plantings, non‐native plants may provide valuable floral resources, but their effects on native bee communities have not been assessed in direct comparison with native pollinator friendly plantings. In this study, we performed a common garden experiment by seeding mixes of 20 native and 20 non‐native pollinator friendly plant species at separate neighboring plots at three sites in Maryland, USA, and recorded flower visitors for 2 years. A total of 3,744 bees (120 species) were collected. Bee abundance and species richness were either similar across plant types (midseason and for abundance also late season) or lower at native than at non‐native plots (early season and for richness also late season). The overall bee community composition differed significantly between native and non‐native plots, with 11 and 23 bee species being found exclusively at one plot type or the other, respectively. Additionally, some species were more abundant at native plant plots, while others were more abundant at non‐natives. Native plants hosted more specialized plant–bee visitation networks than non‐native plants. Three species out of the five most abundant bee species were more specialized when foraging on native plants than on non‐native plants. Overall, visitation networks were more specialized in the early season than in late seasons. Our findings suggest that non‐native plants can benefit native pollinators, but may alter foraging patterns, bee community assemblage, and bee–plant network structures. KW - bee conservation KW - common garden experiment KW - exotic plants KW - non‐native plants KW - plant–bee visitation networks KW - pollinator friendly plants KW - wild bees Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218439 VL - 10 IS - 23 ER - TY - THES A1 - Vikuk, Veronika T1 - Epichloë endophyte-grass symbioses in Germany – Infection rates, alkaloid concentrations and possible intoxication risks T1 - Epichloë Endophyt-Gras Symbiosen in Deutschland – Infektionsraten, Alkaloidkonzentrationen und mögliche Vergiftungsrisiken N2 - Endophytes live in partial symbiosis inside a plant and have been detected in all tested plants. They belong to the group of fungi or bacteria and their ecological function is mostly unknown. The fungal endophytes of the genus Epichloë belong to a special group of endophytes. Epichloë endophytes live symbiotically inside cool season grass species and some of them are able to produce alkaloids toxic to vertebrates and insects. Their symbiosis is seen as mutualistic for the following reasons: the fungus provides the plant herbivore resistance by producing alkaloids, and it increases the plant’s drought tolerance as well as its biomass production. In return, the grass provides the fungus shelter, nutrients and dispersal. Epichloë endophytes are host specific and the ability to produce alkaloids differs between species. In order to estimate intoxication risks in grasslands, it is necessary to detect infection rates of different grass species with Epichloë endophytes, and to determine the genotypes and chemotypes of the Epichloë species as well as the produced alkaloid concentrations. Factors like land-use intensity or season may have an influence on infection rates and alkaloid concentrations. Also, different methodological approaches may lead to different results. In this doctoral thesis my general aim was to evaluate intoxication risks in German grasslands caused by Epichloë endophytes. For that I investigated infection rates of different grass species and the genotypes and chemotypes of their Epichloë endophytes in German grasslands (Chapter II). Furthermore, I compared alkaloid concentrations detected with dry and fresh plant weight and different analytical methods. I also detected possible changes on the influence of season or land-use intensity (Chapter III). Additionally, I examined infections with Epichloë endophytes and alkaloid concentrations in commercially available grass seed mixtures and determined how that influences the intoxication risk of grazing animals in Europe (Chapter IV). It is of agricultural interest to estimate intoxication risks for grazing livestock on German grasslands due to Epichloë infected grass species. Therefore, it is important to investigate which grasses are infected with the Epichloë endophyte, if the endophytes have the ability to produce vertebrate and invertebrate toxic alkaloids and if the alkaloids are indeed produced. I showed that Epichloë festucae var. lolii infecting agriculturally important Lolium perenne lacked the starting gene for ergovaline biosynthesis. Hence, vertebrate toxic ergovaline was not detected in the majority of the collected L. perenne plants. The detection of alkaloid concentrations is an important tool to estimate intoxication risk for vertebrates, but also invertebrates. My studies showed that the usage of dry plant material is crucial to quantify the correct alkaloid concentrations, and that alkaloid concentrations can vary depending on the detection method. Hence, the usage of validated, similar detection methods is important to be able to compare alkaloid concentrations from different studies. Nevertheless, the trends of seasonal changes and the influence of land-use intensity stayed the same, regardless if dry or fresh plant weight was used. Also, alkaloid concentrations were below toxicity thresholds on population level, regardless of the method used. Two commercially available forage grass and two commercially available turf grass seed mixtures were infected with Epichloë endopyhtes and alkaloids were detected. This might contribute to the spreading of Epichloë endopyhtes in Germany, therefore seed mixtures should be tested for Epichloë infections. My results indicate that the intoxication risk is generally low in Germany at the moment, although that might change due to climate change, an increase of monocultural land-use, or the seeding of Epichloë infected grass seeds. N2 - Endophyten leben, zumindest zeitweise, symbiontisch in Pflanzen und sind bisher in allen untersuchten Pflanzen nachgewiesen worden. Es handelt sich dabei um Pilze oder Bakterien und ihre ökologische Funktion ist meistens unbekannt. Eine spezielle Gruppe der Endophyten sind Pilzendophyten der Gattung Epichloë. Diese leben symbiontisch innerhalb von kaltgemäßigten Grasarten und einige sind in der Lage vertebraten- und/oder insektentoxische Alkaloide herzustellen. Die Symbiose wird meist als mutualistisch bezeichnet, weil der Pilz der Pflanze einen Herbivorenschutz durch die Produktion der Alkaloide und eine gesteigerte Trockenresistenz und Biomassesteigerung bietet. Das Gras hingegen bietet dem Pilz Unterkunft, Nährstoffe und Verbreitung. Epichloë Endophyten sind wirtsspezifisch und die Fähigkeit Alkaloide zu produzieren schwankt zwischen den Arten. Um das Vergiftungsrisiko im Grünland einzuschätzen, ist es nötig Infektionsraten verschiedener Grasarten mit Epichloë Endophyten, die Geno- und Chemotypen der Epichloë Arten, und die produzierten Alkaloidkonzentrationen zu bestimmen. Faktoren wie Landnutzungsintensität oder die Jahreszeit können Infektionsraten und Alkaloidkonzentrationen beeinflussen. Ebenso können Alkaloidkonzentrationen von methodischen Faktoren abhängen. In dieser Doktorarbeit habe ich Infektionsraten verschiedener Grasarten in Deutschland und die Geno- und Chemotypen ihrer Epichloë Endophyten untersucht (Kapitel II). Außerdem habe ich Alkaloidkonzentrationen mit Frisch- bzw. Trockengewicht gemessen und mit verschiedenen analytischen Methoden verglichen, um mögliche Änderungen beim Einfluss von Jahreszeiten oder der Landnutzungsintensität zu detektieren. Des Weiteren habe ich das Vergiftungsrisiko auf deutschen Grasflächen abgeschätzt (Kapitel III). Zusätzlich habe ich kommerziell erhältliche Grassaatgutmischungen auf Epichloë Infektionen und Alkaloidgehalt untersucht und habe versucht einzuschätzen, wie sich das auf das Vergiftungsrisiko von Weidevieh in Europa auswirkt (Kapitel IV). Die Einschätzung von Vergiftungsrisiken für Weidevieh aufgrund von Epichloë infizierten Grasarten auf deutschen Graslandflächen ist von landwirtschaftlichem Interesse. Deshalb ist es wichtig zu untersuchen, welche Grasarten mit Epichloë Endophyten infiziert sind, ob der Endophyt in der Lage ist vertebraten- oder insektentoxische Alkaloide zu produzieren und ob diese tatsächlich produziert werden. Ich konnte zeigen, dass Epichloë festucae var. lolii, welches das landwirtschaflich wichtige Lolium perenne infiziert, das Startgen für die Ergovalinbiosynthese fehlt. Deshalb wurde das vertebraten-toxische Ergovalin in der Mehrheit der gesammelten L. perenne Pflanzen nicht nachgewiesen. Die Detektion von Alkaloidkonzentrationen ist ein wichtiges Werkzeug, um das Vergiftungsrisiko für Vertebraten aber auch Invertebraten einschätzen zu können. Ich konnte zeigen, dass die Verwendung von trockenem Pflanzenmaterial essenziell ist, um korrekte Alkaloidkonzentrationen zu quantifizieren und dass Alkaloidkonzentrationen in Abhängigkeit von der Detektionsmethode schwanken können. Deshalb ist die Verwendung von validierten, ähnlichen Detektionsmethoden wichtig, um die Alkaloidkonzentrationen von verschiedenen Studien vergleichen zu können. Dennoch blieben die jahreszeitlichen Trends und der Einfluss von Landnutzungsintensität gleich, egal ob Trocken- oder Frischgewicht der Pflanze verwendet wurde und Alkaloidkonzentrationen lagen unter der Toxizitätsschwelle auf Populationsebene. Ich konnte außerdem zeigen, dass zwei kommerziell erwerbliche Futtergrasmischungen, sowie zwei Rasengrasmischungen mit Epichloë Endophyten infiziert waren und auch Alkaloide detektiert werden konnten. Das könnte zu einer weiteren Ausbreitung von Epichloë-Endophyten in Deutschland beitragen, weshalb Saatgutmischungen auf Epichloë Infektionen getestet werden sollten. Meine Ergebnisse zeigen, dass das Vergiftungsrisiko in Deutschland im Moment generell eher niedrig ist. Allerdings kann sich das auf Grund von Klimawandel, zunehmenden Monokulturen in der Landnutzung, aber auch der Aussaat von Epichloë infiziertem Saatgut ändern. KW - Endophytische Pilze KW - HPLC-MS KW - Deutsches Weidelgras KW - Weidegräser KW - Alkaloide KW - intoxication risk KW - alkaloid concentrations KW - Epichloe endophytes KW - cool-season grass species KW - infection rates Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213895 ER - TY - JOUR A1 - Bowler, Diana E. A1 - Bjorkman, Anne D. A1 - Dornelas, Maria A1 - Myers‐Smith, Isla H. A1 - Navarro, Laetitia M. A1 - Niamir, Aidin A1 - Supp, Sarah R. A1 - Waldock, Conor A1 - Winter, Marten A1 - Vellend, Mark A1 - Blowes, Shane A. A1 - Böhning‐Gaese, Katrin A1 - Bruelheide, Helge A1 - Elahi, Robin A1 - Antão, Laura H. A1 - Hines, Jes A1 - Isbell, Forest A1 - Jones, Holly P. A1 - Magurran, Anne E. A1 - Cabral, Juliano Sarmento A1 - Bates, Amanda E. T1 - Mapping human pressures on biodiversity across the planet uncovers anthropogenic threat complexes JF - People and Nature N2 - Climate change and other anthropogenic drivers of biodiversity change are unequally distributed across the world. Overlap in the distributions of different drivers have important implications for biodiversity change attribution and the potential for interactive effects. However, the spatial relationships among different drivers and whether they differ between the terrestrial and marine realm has yet to be examined. We compiled global gridded datasets on climate change, land‐use, resource exploitation, pollution, alien species potential and human population density. We used multivariate statistics to examine the spatial relationships among the drivers and to characterize the typical combinations of drivers experienced by different regions of the world. We found stronger positive correlations among drivers in the terrestrial than in the marine realm, leading to areas with high intensities of multiple drivers on land. Climate change tended to be negatively correlated with other drivers in the terrestrial realm (e.g. in the tundra and boreal forest with high climate change but low human use and pollution), whereas the opposite was true in the marine realm (e.g. in the Indo‐Pacific with high climate change and high fishing). We show that different regions of the world can be defined by Anthropogenic Threat Complexes (ATCs), distinguished by different sets of drivers with varying intensities. We identify 11 ATCs that can be used to test hypotheses about patterns of biodiversity and ecosystem change, especially about the joint effects of multiple drivers. Our global analysis highlights the broad conservation priorities needed to mitigate the impacts of anthropogenic change, with different priorities emerging on land and in the ocean, and in different parts of the world. KW - Anthropocene KW - biodiversity threats KW - direct drivers KW - global change Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213634 VL - 2 IS - 2 SP - 380 EP - 394 ER - TY - JOUR A1 - Gupta, Shishir K. A1 - Srivastava, Mugdha A1 - Osmanoglu, Oezge A1 - Dandekar, Thomas T1 - Genome-wide inference of the Camponotus floridanus protein-protein interaction network using homologous mapping and interacting domain profile pairs JF - Scientific Reports N2 - Apart from some model organisms, the interactome of most organisms is largely unidentified. High-throughput experimental techniques to determine protein-protein interactions (PPIs) are resource intensive and highly susceptible to noise. Computational methods of PPI determination can accelerate biological discovery by identifying the most promising interacting pairs of proteins and by assessing the reliability of identified PPIs. Here we present a first in-depth study describing a global view of the ant Camponotus floridanus interactome. Although several ant genomes have been sequenced in the last eight years, studies exploring and investigating PPIs in ants are lacking. Our study attempts to fill this gap and the presented interactome will also serve as a template for determining PPIs in other ants in future. Our C. floridanus interactome covers 51,866 non-redundant PPIs among 6,274 proteins, including 20,544 interactions supported by domain-domain interactions (DDIs), 13,640 interactions supported by DDIs and subcellular localization, and 10,834 high confidence interactions mediated by 3,289 proteins. These interactions involve and cover 30.6% of the entire C. floridanus proteome. KW - interaction map KW - drosophila KW - identification KW - evolutionary KW - reliability KW - annotation KW - database KW - target KW - cycle Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229406 VL - 10 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - De Lira, Maria Nathalia A1 - Raman, Sudha Janaki A1 - Schulze, Almut A1 - Schneider-Schaulies, Sibylle A1 - Avota, Elita T1 - Neutral Sphingomyelinase-2 (NSM 2) Controls T Cell Metabolic Homeostasis and Reprogramming During Activation JF - Frontiers in Molecular Biosciences N2 - Neutral sphingomyelinase-2 (NSM2) is a member of a superfamily of enzymes responsible for conversion of sphingomyelin into phosphocholine and ceramide at the cytosolic leaflet of the plasma membrane. Upon specific ablation of NSM2, T cells proved to be hyper-responsive to CD3/CD28 co-stimulation, indicating that the enzyme acts to dampen early overshooting activation of these cells. It remained unclear whether hyper-reactivity of NSM2-deficient T cells is supported by a deregulated metabolic activity in these cells. Here, we demonstrate that ablation of NSM2 activity affects metabolism of the quiescent CD4\(^+\) T cells which accumulate ATP in mitochondria and increase basal glycolytic activity. This supports enhanced production of total ATP and metabolic switch early after TCR/CD28 stimulation. Most interestingly, increased metabolic activity in resting NSM2-deficient T cells does not support sustained response upon stimulation. While elevated under steady-state conditions in NSM2-deficient CD4\(^+\) T cells, the mTORC1 pathway regulating mitochondria size, oxidative phosphorylation, and ATP production is impaired after 24 h of stimulation. Taken together, the absence of NSM2 promotes a hyperactive metabolic state in unstimulated CD4\(^+\) T cells yet fails to support sustained T cell responses upon antigenic stimulation. KW - neutral sphingomyelinase-2 KW - T cell receptor KW - Seahorse XF KW - oxidative phosphorylation KW - ATP-adenosine triphosphate KW - Mitochondria Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211311 SN - 2296-889X VL - 7 ER - TY - JOUR A1 - Vogel, Sebastian A1 - Gossner, Martin M. A1 - Mergner, Ulrich A1 - Müller, Jörg A1 - Thorn, Simon T1 - Optimizing enrichment of deadwood for biodiversity by varying sun exposure and tree species: An experimental approach JF - Journal of Applied Ecology N2 - The enrichment of deadwood is essential for the conservation of saproxylic biodiversity in managed forests. However, existing strategies focus on a cost‐intensive increase of deadwood amount, while largely neglecting increasing deadwood diversity. Deadwood objects, that is logs and branches, from six tree species were experimentally sun exposed, canopy shaded and artificially shaded for 4 years, after which the alpha‐, beta‐ and gamma‐diversity of saproxylic beetles, wood‐inhabiting fungi and spiders were analysed. Analyses of beta‐diversity included the spatial distance between exposed deadwood objects. A random‐drawing procedure was used to identify the combination of tree species and sun exposure that yielded the highest gamma‐diversity at a minimum of exposed deadwood amount. In sun‐exposed plots, species numbers in logs were higher than in shaded plots for all taxa, while in branches we observed the opposite for saproxylic beetles. Tree species affected the species numbers only of saproxylic beetles and wood‐inhabiting fungi. The beta‐diversity of saproxylic beetles and wood‐inhabiting fungi among logs was influenced by sun exposure and tree species, but beta‐diversity of spiders by sun exposure only. For all saproxylic taxa recorded in logs, differences between communities increased with increasing spatial distance. A combination of canopy‐shaded Carpinus logs and sun‐exposed Populus logs resulted in the highest species numbers of all investigated saproxylic taxa among all possible combinations of tree species and sun‐exposure treatments. Synthesis and applications. We recommend incorporating the enrichment of different tree species and particularly the variation in sun exposure into existing strategies of deadwood enrichment. Based on the results of our study, we suggest to combine the logs of softwood broadleaf tree species (e.g. Carpinus, Populus), hardwood broadleaf tree species (e.g. Quercus) and coniferous tree species (e.g. Pinus) under different conditions of sun exposure and distribute them spatially in a landscape to maximize the beneficial effects on overall diversity. KW - broadleaf tree species KW - deadwood enrichment KW - forest conservation KW - forest management KW - saproxylic beetles KW - spiders KW - sun exposure KW - wood‐inhabiting fungi Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-214614 VL - 57 IS - 10 SP - 2075 EP - 2085 ER - TY - JOUR A1 - Müller, Jörg A1 - Ulyshen, Mike A1 - Seibold, Sebastian A1 - Cadotte, Marc A1 - Chao, Anne A1 - Bässler, Claus A1 - Vogel, Sebastian A1 - Hagge, Jonas A1 - Weiß, Ingmar A1 - Baldrian, Petr A1 - Tláskal, Vojtěch A1 - Thorn, Simon T1 - Primary determinants of communities in deadwood vary among taxa but are regionally consistent JF - Oikos N2 - The evolutionary split between gymnosperms and angiosperms has far‐reaching implications for the current communities colonizing trees. The inherent characteristics of dead wood include its role as a spatially scattered habitat of plant tissue, transient in time. Thus, local assemblages in deadwood forming a food web in a necrobiome should be affected not only by dispersal ability but also by host tree identity, the decay stage and local abiotic conditions. However, experiments simultaneously manipulating these potential community drivers in deadwood are lacking. To disentangle the importance of spatial distance and microclimate, as well as host identity and decay stage as drivers of local assemblages, we conducted two consecutive experiments, a 2‐tree species and 6‐tree species experiment with 80 and 72 tree logs, respectively, located in canopy openings and under closed canopies of a montane and a lowland forest. We sampled saproxylic beetles, spiders, fungi and bacterial assemblages from logs. Variation partitioning for community metrics based on a unified framework of Hill numbers showed consistent results for both studies: host identity was most important for sporocarp‐detected fungal assemblages, decay stage and host tree for DNA‐detected fungal assemblages, microclimate and decay stage for beetles and spiders and decay stage for bacteria. Spatial distance was of minor importance for most taxa but showed the strongest effects for arthropods. The contrasting patterns among the taxa highlight the need for multi‐taxon analyses in identifying the importance of abiotic and biotic drivers of community composition. Moreover, the consistent finding of microclimate as the primary driver for saproxylic beetles compared to host identity shows, for the first time that existing evolutionary host adaptions can be outcompeted by local climate conditions in deadwood. KW - deadwood experiments KW - dispersal KW - forest management KW - habitat filter KW - wood-inhabiting fungi Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-228201 VL - 129 IS - 10 SP - 1579 EP - 1588 ER - TY - JOUR A1 - Schäbler, Stefan A1 - Amatobi, Kelechi M. A1 - Horn, Melanie A1 - Rieger, Dirk A1 - Helfrich‑Förster, Charlotte A1 - Mueller, Martin J. A1 - Wegener, Christian A1 - Fekete, Agnes T1 - Loss of function in the Drosophila clock gene period results in altered intermediary lipid metabolism and increased susceptibility to starvation JF - Cellular and Molecular Life Sciences N2 - The fruit fly Drosophila is a prime model in circadian research, but still little is known about its circadian regulation of metabolism. Daily rhythmicity in levels of several metabolites has been found, but knowledge about hydrophobic metabolites is limited. We here compared metabolite levels including lipids between period\(^{01}\) (per\(^{01}\)) clock mutants and Canton-S wildtype (WT\(_{CS}\)) flies in an isogenic and non-isogenic background using LC–MS. In the non-isogenic background, metabo-lites with differing levels comprised essential amino acids, kynurenines, pterinates, glycero(phospho)lipids, and fatty acid esters. Notably, detectable diacylglycerols (DAG) and acylcarnitines (AC), involved in lipid metabolism, showed lower levels in per\(^{01}\) mutants. Most of these differences disappeared in the isogenic background, yet the level differences for AC as well as DAG were consistent for fly bodies. AC levels were dependent on the time of day in WTCS in phase with food consumption under LD conditions, while DAGs showed weak daily oscillations. Two short-chain ACs continued to cycle even in constant darkness. per\(^{01}\) mutants in LD showed no or very weak diel AC oscillations out of phase with feeding activity. The low levels of DAGs and ACs in per\(^{01}\) did not correlate with lower total food consumption, body mass or weight. Clock mutant flies showed higher sensitivity to starvation independent of their background-dependent activity level. Our results suggest that neither feeding, energy storage nor mobilisation is significantly affected in per\(^{01}\) mutants, but point towards impaired mitochondrial activity, supported by upregulation of the mitochondrial stress marker 4EBP in the clock mutants KW - circadian rhythms KW - metabolomics KW - mitochondrial activity KW - tryptophan KW - acylcarnitine KW - feeding Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-232432 SN - 1420-682X VL - 77 ER - TY - JOUR A1 - Trinkl, Moritz A1 - Kaluza, Benjamin F. A1 - Wallace, Helen A1 - Heard, Tim A. A1 - Keller, Alexander A1 - Leonhardt, Sara D. T1 - Floral Species Richness Correlates with Changes in the Nutritional Quality of Larval Diets in a Stingless Bee JF - Insects N2 - Bees need food of appropriate nutritional quality to maintain their metabolic functions. They largely obtain all required nutrients from floral resources, i.e., pollen and nectar. However, the diversity, composition and nutritional quality of floral resources varies with the surrounding environment and can be strongly altered in human-impacted habitats. We investigated whether differences in plant species richness as found in the surrounding environment correlated with variation in the floral diversity and nutritional quality of larval provisions (i.e., mixtures of pollen, nectar and salivary secretions) composed by the mass-provisioning stingless bee Tetragonula carbonaria (Apidae: Meliponini). We found that the floral diversity of larval provisions increased with increasing plant species richness. The sucrose and fat (total fatty acid) content and the proportion and concentration of the omega-6 fatty acid linoleic acid decreased, whereas the proportion of the omega-3 fatty acid linolenic acid increased with increasing plant species richness. Protein (total amino acid) content and amino acid composition did not change. The protein to fat (P:F) ratio, known to affect bee foraging, increased on average by more than 40% from plantations to forests and gardens, while the omega-6:3 ratio, known to negatively affect cognitive performance, decreased with increasing plant species richness. Our results suggest that plant species richness may support T. carbonaria colonies by providing not only a continuous resource supply (as shown in a previous study), but also floral resources of high nutritional quality. KW - floral resources KW - plant-insect interactions KW - nutrition KW - biodiversity KW - bee decline Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200605 SN - 2075-4450 VL - 11 IS - 2 ER - TY - THES A1 - Vollmuth, Nadine T1 - Role of the proto-oncogene c-Myc in the development of Chlamydia trachomatis T1 - Die Rolle des proto-onkogenes c-Myc in der Entwicklung von Chlamydia trachomatis N2 - Chlamydia trachomatis, an obligate intracellular human pathogen, is the world’s leading cause of infection related blindness and the most common, bacterial sexually transmitted disease. In order to establish an optimal replicative niche, the pathogen extensively interferes with the physiology of the host cell. Chlamydia switches in its complex developmental cycle between the infectious non-replicative elementary bodies (EBs) and the non-infectious replicative reticulate bodies (RBs). The transformation to RBs, shortly after entering a host cell, is a crucial process in infection to start chlamydial replication. Currently it is unknown how the transition from EBs to RBs is initiated. In this thesis, we could show that, in an axenic media approach, L glutamine uptake by the pathogen is crucial to initiate the EB to RB transition. L-glutamine is converted to amino acids which are used by the bacteria to synthesize peptidoglycan. Peptidoglycan inturn is believed to function in separating dividing Chlamydia. The glutamine metabolism is reprogrammed in infected cells in a c-Myc-dependent manner, in order to accomplish the increased requirement for L-glutamine. Upon a chlamydial infection, the proto-oncogene c-Myc gets upregulated to promote host cell glutaminolysis via glutaminase GLS1 and the L-glutamine transporter SLC1A5/ASCT2. Interference with this metabolic reprogramming leads to limited growth of C. trachomatis. Besides the active infection, Chlamydia can persist over a long period of time within the host cell whereby chronic and recurrent infections establish. C. trachomatis acquire a persistent state during an immune attack in response to elevated interferon-γ (IFN-γ) levels. It has been shown that IFN-γ activates the catabolic depletion of L-tryptophan via indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), resulting in the formation of non-infectious atypical chlamydial forms. In this thesis, we could show that IFN-γ depletes the key metabolic regulator c-Myc, which has been demonstrated to be a prerequisite for chlamydial development and growth, in a STAT1-dependent manner. Moreover, metabolic analyses revealed that the pathogen de routs the host cell TCA cycle to enrich pyrimidine biosynthesis. Supplementing pyrimidines or a-ketoglutarate helps the bacteria to partially overcome the persistent state. Together, the results indicate a central role of c-Myc induced host glutamine metabolism reprogramming and L-glutamine for the development of C. trachomatis, which may provide a basis for anti-infectious strategies. Furthermore, they challenge the longstanding hypothesis of L-tryptophan shortage as the sole reason for IFN-γ induced persistence and suggest a pivotal role of c-Myc in the control of the C. trachomatis dormancy. N2 - Chlamydia trachomatis, ein obligat intrazellul¨ares humanes Pathogen, ist weltweit fu¨hrende Ursache fu¨r infektionsbedingte Erblindung und die h¨aufigste, bakterielle sexuell u¨bertragbare Krankheit. Um eine optimale Replikationsnische zu etablieren, interagiert das Pathogen in tensiv mit der Physiologie der Wirtszelle. Chlamydien wechseln in ihrem komplexen Entwick lungszyklus zwischen den infekti¨osen nicht replizierenden Elementark¨orperchen (EBs) und den nicht infekti¨osen replizierenden Retikulark¨orperchen (RBs), und diese Umwandlung in RBs kurz nach dem Eintritt in die Wirtszelle ist ein entscheidender Prozess in der Infektion, um die Replikation des Bakteriums einzuleiten. Derzeit ist noch nicht bekannt, wodurch diese Transformation von EBs zu RBs eingeleitet wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei einer zellfreien Kultivierung des Pathogens die Aufnahme von Glutamin durch den Erreger entscheidend ist, um den ¨Ubergang von EB zu RB zu initiieren. Vor kurzem wurde Peptidoglykan in den Septen von sich replizierenden Chlamydien nachgewiesen. Fu¨r die Syn these des Peptidoglykans nutzen die Bakterien das aufgenommene Glutamin. Der Glutamin metabolismus wird in infizierten Zellen c-Myc abh¨angig umprogrammiert, um den erh¨ohten Bedarf an Glutamin zu bew¨altigen. Bei einer Chlamydieninfektion wird das Proto-Onkogen c-Myc zur F¨orderung der Glutaminolyse der Wirtszelle u¨ber die Glutaminase GLS1 und den Glutamin Transporter SLC1A5/ASCT2 hochreguliert. Ein Eingreifen in diese metabolische Neuprogrammierung fu¨hrt zu einem reduzierten Wachstum von C. trachomatis. Neben der aktiven Infektion k¨onnen Chlamydien u¨ber einen sehr langen Zeitraum in der Wirtszelle persistieren, wodurch es zur Etablierung von chronischen und wiederkehrenden Infektionen kommt. C. trachomatis verf¨allt bei einem Immunangriff in Persistenz, wenn sie auf das freigesetzte Interferon-γ treffen. Es ist bekannt, dass Interferon-γ den Katabolismus von Tryptophan mittels indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) aktiviert, was zur Bildung von nicht infekti¨osen atypischen Chlamydienformen fu¨hrt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Interferon-γ den zentralen Stoffwechselregulator c-Myc, der sich fu¨r die Entwicklung und das Wachstum von Chlamydien als essentiell erwiesen hat, in Abh¨angigkeit von STAT1 herunter reguliert. Daru¨ber hinaus zeigte die Analyse des Metabolismus, dass das Pathogen den TCA Zyklus der Wirtszelle umleitet, um die Pyrimidinbiosynthese zu unterstu¨tzen. Die Zugabe von Pyrimidinen oder α-Ketoglutarat hilft den Bakterien den Status der Persistenz teilweise zu u¨berwinden. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse auf eine zentrale Rolle der c-Myc induzierten Umprogrammierung des Glutaminmetabolismus und des Glutamins selbst fu¨r die Entwicklung von C. trachomatis hin. Diese Befunde k¨onnten eine Basis fu¨r Strategien gegen eine Infektion darstellen. Weiterhin stellen sie die seit langem bestehende Hypothese des Trypotphanmangels als alleiniger Grund fu¨r die von Interferon-γ induzierte Persistenz in Frage und legen eine zentrale Rolle von c-Myc bei der Kontrolle der C. trachomatis Dormanz nahe. KW - Chlamydia trachomatis KW - Persistence KW - trachomatis KW - chlamydia Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203655 ER - TY - THES A1 - Gründl, Marco T1 - Biochemical characterization of the MMB-Hippo crosstalk and its physiological relevance for heart development T1 - Biochemische Charakterisierung des MMB-Hippo Signalweges und dessen physiologische Rolle in der Herzentwicklung N2 - The Myb-MuvB (MMB) complex plays an essential role in the time-dependent transcriptional activation of mitotic genes. Recently, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP, the transcriptional coactivator of the Hippo pathway, to coregulate a subset of mitotic genes (Pattschull et al., 2019). Several genetic studies have shown that the Hippo-YAP pathway is essential to drive cardiomyocyte proliferation during cardiac development (von Gise et al., 2012; Heallen et al., 2011; Xin et al., 2011). However, the exact mechanisms of how YAP activates proliferation of cardiomyocytes is not known. This doctoral thesis addresses the physiological role of the MMB-Hippo crosstalk within the heart and characterizes the YAP-B-MYB interaction with the overall aim to identify a potent inhibitor of YAP. The results reported in this thesis indicate that complete loss of the MMB scaffold protein LIN9 in heart progenitor cells results in thinning of ventricular walls, reduced cardiomyocyte proliferation and early embryonic lethality. Moreover, genetic experiments using mice deficient in SAV1, a core component of the Hippo pathway, and LIN9-deficient mice revealed that the correct function of the MMB complex is critical for proliferation of cardiomyocytes due to Hippo-deficiency. Whole genome transcriptome profiling as well as genome wide binding studies identified a subset of Hippo-regulated cell cycle genes as direct targets of MMB. By proximity ligation assay (PLA), YAP and B-MYB were discovered to interact in embryonal cardiomyocytes. Biochemical approaches, such as co-immunoprecipitation assays, GST-pulldown assays, and µSPOT-based peptide arrays were employed to characterize the YAP-B-MYB interaction. Here, a PY motif within the N-terminus of B-MYB was found to directly interact with the YAP WW-domains. Consequently, the YAP WW-domains were important for the ability of YAP to drive proliferation in cardiomyocytes and to activate MMB target genes in differentiated C2C12 cells. The biochemical information obtained from the interaction studies was utilized to develop a novel competitive inhibitor of YAP called MY-COMP (Myb-YAP competition). In MY-COMP, the protein fragment of B-MYB containing the YAP binding domain is fused to a nuclear localization signal. Co-immunoprecipitation studies as well as PLA revealed that the YAP-B-MYB interaction is robustly blocked by expression of MY-COMP. Adenoviral overexpression of MY-COMP in embryonal cardiomyocytes suppressed entry into mitosis and blocked the pro-proliferative function of YAP. Strikingly, characterization of the cellular phenotype showed that ectopic expression of MY-COMP led to growth defects, nuclear abnormalities and polyploidization in HeLa cells. Taken together, the results of this thesis reveal the mechanism of the crosstalk between the Hippo signaling pathway and the MMB complex in the heart and form the basis for interference with the oncogenic activity of the Hippo coactivator YAP. N2 - Der Myb-MuvB Komplex spielt eine essenzielle Rolle in der transkriptionellen Aktivierung von Zellzyklusgenen. Unser Labor hat kürzlich einen bis dahin unbekannten Mechanismus zwischen dem MMB-Komplex und Hippo-YAP Signalweg, der zur Aktivierung von Mitosegenen beiträgt, identifiziert. Der Hippo-YAP Signalweg ist beteiligt an der Gewebehomöostase und am Wachstum von Organen. So reguliert der Hippo-YAP Signalweg zum Beispiel während der Herzentwicklung die Proliferation von Herzmuskelzellen. Der exakte Mechanismus wie YAP die Zellteilung von Kardiomyozyten aktiviert, ist jedoch bisher nicht bekannt. In der vorliegenden Doktorarbeit wird das Zusammenspiel zwischen dem Hippo-Signalweg und dem MMB-Komplex im Herzen untersucht. Außerdem wird die Interaktion zwischen YAP und B-MYB biochemisch charakterisiert, um einen Inhibitor zu entwickeln, der die Aktivität von YAP vermindert. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass der Verlust der zentralen Untereinheit des MMB-Komplexes, LIN9, in Vorläuferzellen der Kardiomyozyten zu einer Reduktion der Herzwand sowie zu einer niedrigeren Proliferationsrate von Herzmuskelzellen und einer erhöhten Embryonalsterblichkeit führt. Außerdem wurde in genetischen Experimenten mit Hippo- und LIN9-defizienten Mäusen gezeigt, dass der MMB-Komplex wichtig für die Aktivierung der Proliferation in Hippo-defizienten Kardiomyozyten ist. Eine globale Analyse der Transkription und Chromatinbindung von YAP und LIN9 im Herzen zeigte, dass eine Untergruppe von Zellzyklusgenen, die nach Inaktivierung des Hippo-Signalwegs vermehrt exprimiert werden, gleichzeitig den MMB-Komplex am Promoter gebunden haben. Durch Interaktionsstudien konnte gezeigt werden, dass YAP und B-MYB in embryonalen Kardiomyozyten miteinander interagieren. Die Bindung der beiden Transkriptionsfaktoren wurde durch Co-Immunpräzipitation, GST-Pulldown-Analysen und Peptid-Arrays biochemisch untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass ein PY-Motiv im N-terminus von B-MYB direkt an die WW-Domänen von YAP bindet. Im Umkehrschluss wurde festgestellt, dass die WW-Domänen von YAP essenziell sind, um sowohl die Proliferation in Herzmuskelzellen als auch die Expression von Mitosegenen in differenzierten C2C12 Zellen zu aktivieren. Letztendlich wurden die Ergebnisse der Interaktionsstudie genutzt, um einen neuartigen kompetitiven Inhibitor von YAP zu entwickeln. Für MY-COMP (Myb-YAP Competition) wurde der Proteinabschnitt von B-MYB, der die YAP Bindedomäne enthält, mit einer Kernlokalisierungssequenz fusioniert. Bindestudien zeigten, dass MY-COMP die Interaktion zwischen YAP und B-MYB effektiv blockiert. Eine durch Adenoviren vermittelte Überexpression von MY-COMP in embryonalen Herzmuskelzellen resultierte in einer verminderten Anzahl von mitotischen Zellen. Somit wird durch Expression von MY-COMP, die proliferative Fähigkeit von YAP vermindert. Interessanterweise wurden in HeLa Zellen, die mit MY-COMP behandelt wurden, vermehrt Abnormalitäten der Zellkerne, polyploide Zellen sowie ein Wachstumsdefizit beobachtet. Zusammengefasst verdeutlichen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit die Bedeutung des Zusammenspiels zwischen dem MMB-Komplex und dem Hippo-YAP-Signalweg für die Herzentwicklung und bilden die Grundlage, für die effektive Inhibierung der onkogenen Eigenschaften des Hippo-Coaktivators YAP. KW - Zellzyklus KW - Heart development KW - Hippo pathway KW - Myb-MuvB complex KW - Cardiomyocyte Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213328 ER - TY - THES A1 - Rüdenauer, Fabian T1 - Nutrition facts of pollen: nutritional quality and how it affects reception and perception in bees T1 - Nährwertinformationen von Pollen: Nährstoffzusammensetzung und wie diese sich auf Rezeption und Perzeption von Bienen auswirkt N2 - Nutrients belong to the key elements enabling life and influencing an organism’s fitness. The intake of nutrients in the right amounts and ratios can increase fitness; strong deviations from the optimal intake target can decrease fitness. Hence, the ability to assess the nutritional profile of food would benefit animals. To achieve this, they need the according nutrient receptors, the ability to interpret the receptor information via perceptive mechanisms, and the ability to adjust their foraging behavior accordingly. Additionally, eventually existing correlations between the nutrient groups and single nutrient compounds in food could help them to achieve this adjustment. A prominent interaction between food and consumer is the interaction between flowering plants (angiosperms) and animal pollinators. Usually both of the interacting partners benefit from this mutualistic interaction. Plants are pollinated while pollinators get a (most of the times) nutritional reward in form of nectar and/or pollen. As similar interactions between plants and animals seem to have existed even before the emergence of angiosperms, these interactions between insects and angiosperms very likely have co-evolved right from their evolutionary origin. Therefore, insect pollinators with the ability to assess the nutritional profile may have shaped the nutritional profile of plant species depending on them for their reproduction via selection pressure. In Chapter I of this thesis the pollen nutritional profile of many plant species was analyzed in the context of their phylogeny and their dependence on insect pollinators. In addition, correlations between the nutrients were investigated. While the impact of phylogeny on the pollen protein content was little, the mutual outcome of both of the studies included in this chapter is that protein content of pollen is mostly influenced by the plant’s dependence on insect pollinators. Several correlations found between nutrients within and between the nutrient groups could additionally help the pollinators to assess the nutrient profile of pollen. An important prerequisite for this assessment would be that the pollinators are able to differentiate between pollen of different plant species. Therefore, in Chapter II it was investigated whether bees have this ability. Specifically, it was investigated whether honeybees are able to differentiate between pollen of two different, but closely related plant species and whether bumblebees prefer one out of three pollen mixes, when they were fed with only one of them as larvae. Honeybees indeed were able to differentiate between the pollen species and bumblebees preferred one of the pollen mixes to the pollen mix they were fed as larvae, possibly due to its nutritional content. Therefore, the basis for pollen nutrient assessment is given in bees. However, there also was a slight preference for the pollen fed as larvae compared to another non-preferred pollen mix, at least hinting at the retention of larval memory in adult bumblebees. Chapter III looks into nutrient perception of bumblebees more in detail. Here it was shown that they are principally able to perceive amino acids and differentiate between them as well as different concentrations of the same amino acid. However, they do not seem to be able to assess the amino acid content in pollen or do not focus on it, but instead seem to focus on fatty acids, for which they could not only perceive concentration differences, but also were able to differentiate between. These findings were supported by feeding experiments in which the bumblebees did not prefer any of the pollen diets containing less or more amino acids but preferred pollen with less fatty acids. In no choice feeding experiments, bumblebees receiving a diet with high fatty acid content accepted undereating other nutrients instead of overeating fat, leading to increased mortality and the inability to reproduce. Hence, the importance of fat in pollen needs to be looked into further. In conclusion, this thesis shows that the co-evolution of flowering plants and pollinating insects could be even more pronounced than thought before. Insects do not only pressure the plants to produce high quality nectar, but also pressure those plants depending on insect pollination to produce high quality pollen. The reason could be the insects’ ability to receive and perceive certain nutrients, which enables them to forage selectively leading to a higher reproductive success of plants with a pollinator-suitable nutritional pollen profile. N2 - Nährstoffe gehören zu den zentralen Elementen, die das Leben an sich ermöglichen und die Fitness eines Organismus beeinflussen können. Nährstoffaufnahme in den richtigen Mengen und Verhältnissen kann die Fitness verbessern, starke Abweichungen von der optimalen Aufnahme können sie verschlechtern. Deshalb könnten Tiere von der Fähigkeit profitieren das Nährstoffprofil von Nahrung bewerten zu können. Dafür benötigten sie jedoch die passenden Nährstoffrezeptoren, die Fähigkeit die Rezeptorinformationen durch perzeptive Mechanismen zu interpretieren und ihr Sammelverhalten daran anzupassen. Eine zusätzliche Hilfe dabei könnten Korrelationen zwischen sowohl den Nährstoffgruppen als auch einzelnen Nährstoffen bieten. Eine bekannte Interaktion zwischen Nahrung und Konsument ist die zwischen Blühpflanzen (Angiospermen) und tierischen Bestäubern. Normalerweise profitieren beide Interaktionspartner von dieser mutualistischen Interaktion. Pflanzen werden bestäubt, während die Bestäuber eine (zumeist) nahrhafte Belohnung in Form von Nektar und/oder Pollen erhalten. Da ähnliche Interaktionen zwischen Pflanzen und Tieren vermutlich schon vor dem Auftreten der Angiospermen existierten, könnte sich diese Interaktion, im Speziellen mit Insekten, direkt vom evolutiven Startpunkt der Angiospermen aus koevolviert haben. Deshalb ist es möglich, dass Bestäuber mit der Fähigkeit das Nährstoffprofil von Pollen bewerten zu können, dieses bei von ihnen abhängigen Pflanzen durch Selektionsdruck formen konnten. Im Kapitel I dieser Thesis wurde das Nährstoffprofil von Pollen vieler Pflanzenarten im Kontext ihrer Phylogenie und ihrer Abhängigkeit von Insekten als Bestäubern analysiert. Außerdem wurden Korrelationen zwischen den Nährstoffen untersucht. Während die Phylogenie nur einen geringen Einfluss auf den Proteingehalt von Pollen haben könnte, ist der gemeinsame Nenner der beiden Studien in diesem Kapitel, dass der Proteingehalt des Pollens hauptsächlich von der Abhängigkeit der Pflanzen von Bestäubern bestimmt wird. Es wurden zudem einige Korrelationen sowohl in als auch zwischen den Nährstoffgruppen gefunden, die den Bestäubern helfen könnten das Nährstoffprofil von Pollen bewerten zu können. Eine wichtige Grundvoraussetzung für diese Bewertung wäre, dass die Bestäuber überhaupt dazu in der Lage sind zwischen Pollen von unterschiedlichen Pflanzenarten zu unterscheiden. Dies wird in Kapitel II behandelt, in dem untersucht wurde ob Honigbienen in der Lage sind zwischen Pollen zweier nah verwandter Pflanzenarten zu unterscheiden und ob Hummeln eine von drei Pollenmischungen bevorzugen, wenn sie nur mit einer davon als Larve in Kontakt kamen. Honigbienen war es tatsächlich möglich zwischen den Pollenarten zu unterscheiden und Hummeln bevorzugten eine bestimmte Pollenmischung gegenüber der, die sie als Larve erhalten hatten, möglicherweise aufgrund eines vorteilhaften Nährstoffprofils. Die Grundlage zur Nährstoffbewertung scheint bei Bienen also gegeben zu sein. Allerdings hatten die Hummeln auch eine leichte Präferenz für die Pollenmischung, die sie als Larve erhalten hatten gegenüber der dritten, nicht bevorzugten Pollenmischung, was zumindest darauf hindeuten könnte, dass Larvenerinnerungen bei erwachsenen Hummeln erhalten bleiben könnten. Kapitel III beschäftigt sich tiefergehend mit der Nährstoffwahrnehmung von Hummeln. Es wurde gezeigt, dass diese prinzipiell befähigt sind Aminosäuren wahrzunehmen als auch zwischen ihnen und verschiedenen Konzentrationen der gleichen Aminosäure zu unterscheiden. Allerdings scheinen sie entweder nicht in der Lage zu sein oder sich zumindest nicht darauf zu fokussieren den Aminosäuregehalt von Pollen zu bewerten, sondern sich eher auf Fettsäuren zu konzentrieren. Von diesen konnten sie nicht nur Konzentrationsunterschiede feststellen, sondern auch zwischen verschiedenen Fettsäuren im Pollen unterscheiden. Diese Ergebnisse wurden von denen in Fütterungsexperimenten gestützt, in denen die Hummeln gleiche Mengen von Pollen mit mehr oder weniger Aminosäuren aufnahmen, aber Pollen mit weniger Fettsäuren bevorzugten. In Experimenten, in denen die Hummeln keine Wahl hatten, nahmen die Hummeln mit einer Diät, die eine hohe Fettsäurekonzentration hatte, lieber in Kauf, dass sie zu wenig von den anderen Nährstoffen aufnahmen, als zu viel Fett, was zu einer erhöhten Mortalitätsrate und der Unfähigkeit sich zu reproduzieren führte. Deshalb sollten zukünftige Studien sich eingehender mit dem Fettsäuregehalt von Pollen beschäftigen. Zusammenfassend zeigt diese Thesis, dass die Koevolution von Pflanzen und bestäubenden Insekten ausgeprägter sein könnte, als bisher angenommen. Insekten setzen die Pflanzen nicht nur unter Druck qualitativ hochwertigen Nektar zu produzieren, sondern setzen vor allem auch die Pflanzen unter Druck, die von ihrer Bestäubung abhängig sind, qualitativ hochwertigen Pollen zu produzieren. Der Grund dafür könnte die Fähigkeit der Insekten sein, bestimmte Nährstoffe zu rezipieren und perzipieren und dann ihr Sammelverhalten so anzupassen, dass Pflanzen mit einem passenden Nährstoffprofil einen höheren Reproduktionserfolg haben. KW - Pollen KW - bumblebee*s KW - nutrients KW - nutrition KW - pollen KW - reception KW - perception KW - proboscis extension response KW - honeybee*s Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212548 ER - TY - THES A1 - Krimmer, Elena T1 - Agri-environment schemes and ecosystem services: The influence of different sown flower field characteristics on pollination, natural pest control and crop yield T1 - Agrarumweltmaßnahmen und Ökosystemdienstleistungen: der Einfluss unterschiedlicher Blühflächen Merkmale auf Bestäubung, natürliche Schädlingskontrolle und Erträge N2 - Insects are responsible for the major part of the ecosystem services pollination and natural pest control. If insects decline, these ecosystem services can not longer be reliably delivered. Agricultural intensification and the subsequent loss and fragmentation of habitats has among others been identified to cause insect decline. Ecological intensification aims to promote alternative and sustainable management practices in agricultural farming, for example to decrease the use of external inputs such as pesticides. Agri-environment schemes make amends for farmers if they integrate ecologically beneficial measures into their farming regime and can therefore promote ecological intensification. There is a wide variety of agri-environment schemes, but the implementation of sown flower fields on crop fields is often included. Flower fields offer foraging resources as well as nesting sites for many different insect species and should be able to support insect populations as well as to increase ecosystem services to adjacent fields. However, the potential of flower fields to exhibit these effects is depending on many factors. Among others, the age and size of the flower field can influence if and how different insects profit from the measure. Additionally, the complexity of the surrounding landscape and therefore the existing biodiversity is influencing the potential of flower fields to increase ecosystem services locally. The goal of this study is to disentangle to which degree these factors influence the ecosystem services pollination and natural pest control and if these factors interact with each other. Furthermore, it will be examined if and how flower fields and ecosystem services influence crop yield. Additional factors examined in this study are distance decay and pesticide use. The abundance of beneficial insects can decrease strongly with increasing distance to suitable habitats. Pesticide use in turn could abrogate positive effects of flower fields on beneficial insects. To examine these different aspects and to be able to make recommendations for flower field implementation, field experiments were conducted on differently composed sown flower fields and adjacent oilseed rape fields. Flower fields differed in their age and continuity as well as in their size. Additionally, flower and oilseed rape fields were chosen in landscapes with different amounts of semi-natural habitat. Oilseed rape fields adjacent to calcareous grasslands and conventional crop fields served as controls. Pollinator observations and pollen beetle and parasitism surveys were conducted in the oilseed rape fields. Additionally, different yield parameters of the oilseed rape plants were recorded. Observations were conducted and samples taken in increasing distance to the flower fields to examine distance decay functions. Spray windows were established to inspect the influence of pesticides on ecosystem services and crop yields. Linear mixed models were used for statistical analysis. The results show, that newly established flower fields with high amounts of flower cover are very attractive for pollinators. If the flower fields reached a certain size (> 1.5ha), the pollinators tended to stay in these fields and did not distribute into the surroundings. High amounts of semi-natural habitat in the surrounding landscape increased the value of small flower fields as starting points for pollinators and their subsequent spillover into crop fields. Additionally, high amounts of semi-natural habitat decreased the decay of pollinators with increasing distance to the flower fields. Based on these results, it can be recommended to establish many small flower fields in landscapes with high amounts of semi-natural habitat and large flower fields in landscapes with low amounts of semi-natural habitat. However, it is mentionable that flower fields are no substitute for perennial semi-natural habitats. These still must be actively conserved to increase pollination to crop fields. Furthermore, the lowest amount of pollen beetle infestation was found on oilseed rape fields adjacent to continuous flower fields aged older than 6 years. Flower fields and calcareous grasslands in general increased pollen beetle parasitism in adjacent oilseed rape fields compared to conventional crop fields. The threshold for effective natural pest control could only be reached in the pesticide free areas in the oilseed rape fields adjacent to continuous flower fields and calcareous grasslands. Parasitism and superparasitism declined with increasing distance to the adjacent fields in pesticide treated areas of the oilseed rape fields. However, they remained on a similar level in spray windows without pesticides. Large flower fields increased parasitism and superparasitism more than small flower fields. Flower fields generally have the potential to increase pollen beetle parasitism rates, but pesticides can abrogate these positive effects of flower fields on natural pest control. Last but not least, effects of flower fields and ecosystem services on oilseed rape yield were examined. No positive effects of pollination on oilseed rape yield could be found. Old and continuous flower fields increased natural pest control in oilseed rape fields, which in turn increased seed set and total seed weight of oilseed rape plants. The pesticide treatment had negative effects on natural pest control, but positive effects on crop yield. Pollination and natural pest control decreased with increasing distance to the field edge, but fruit set slightly increased. The quality of the field in terms of soil and climatic conditions did not influence the yield parameters examined in this study. Yield formation in oilseed rape plants is a complex process with many factors involved, and it is difficult to disentangle indirect effects of flower fields on yield. However, perennial flower fields can promote ecological intensification by increasing crop yield via natural pest control. This study contributes to a better understanding of the effects of differently composed flower fields on pollination, natural pest control and oilseed rape yield. N2 - Insekten sind für einen Großteil der Ökosystemdienstleistungen Bestäubung und natürliche Schädlingskontrolle zuständig. Schwinden die Insekten, so können diese Dienstleistungen nicht mehr zuverlässig gewährleistet werden. Als Ursachen für den Rückgang an Insekten wurde unter anderem die Intensivierung der Landwirtschaft und damit einhergehend der Verlust und die Fragmentierung von Lebensraum identifiziert. Ökologische Intensivierung hat das Ziel, alternative und nachhaltige Bewirtschaftungsmethoden in der Landwirtschaft zu fördern und beispielsweise den Einsatz von Spritzmitteln zu verringern. Agrarumweltmaßnahmen entschädigen Landwirte, wenn sie ökologisch wertvolle Maßnahmen in ihren Betrieb integrieren und können dadurch ökologische Intensivierung unterstützen. Die Bandbreite an Agrarumweltmaßnahmen ist groß, beinhaltet aber häufig das Anlegen von Blühflächen auf Ackerflächen. Blühflächen liefern Nahrungsressourcen und Lebensraum für eine Vielzahl von Insekten und sollten daher in der Lage sein Insektenpopulationen zu unterstützen und Ökosystemdienstleistungen auf angrenzenden Feldern zu verstärken. Jedoch ist das ökologische Potential von Blühflächen von einer Vielzahl von Faktoren abhängig. Unter anderem können das Alter und die Größe der Blühfläche entscheidend beeinflussen, inwiefern unterschiedliche Insektengruppen profitieren. Zusätzlich hat die Landschaftskomplexität der direkten Umgebung, und damit die potentiell vorhandene Biodiversität, großen Einfluss auf die Fähigkeit von Blühflächen Ökosystemdienstleistungen lokal zu erhöhen. In dieser Studie geht es darum zu entschlüsseln, wie sich diese verschiedenen Faktoren sich auf die beiden Ökosystemdienstleistungen Bestäubung und natürliche Schädlingskontrolle auswirken und ob sie sich gegenseitig beeinflussen. Zusätzlich soll untersucht werden, inwiefern Blühflächen und Ökosystemdienstleistungen Erträge beeinflussen können. Weitere in dieser Studie untersuchte Einflussfaktoren sind die Distanz zur Blühfläche und der Einsatz von Pestiziden. Die Abundanz von Nützlingen kann mit der Distanz zu geeigneten Habitaten stark abnehmen. Der Einsatz von Spritzmitteln wiederum könnte die positiven Einflüsse der Blühflächen auf Nützlinge aufheben. Um diese verschiedenen Aspekte zu untersuchen und letztendlich Empfehlung für die Etablierung von Blühflächen geben zu können, wurden Feldversuche auf Blühflächen mit unterschiedlicher Beschaffenheit und auf angrenzenden Rapsflächen durchgeführt. Die Blühflächen unterschieden sich hierbei in ihrem Alter und ihrer Kontinuität. Zusätzlich wurden Blühflächen mit unterschiedlicher Größe getestet. Außerdem wurden die Blühflächen und ihre benachbarten Rapsfelder so ausgewählt, dass sie sich in Landschaften mit unterschiedlichem Anteil an halbnatürlichen Habitaten befinden. Rapsflächen neben Kalkmagerrasen und Äckern mit konventionellen Feldfrüchten dienten als Kontrollflächen. Auf den Rapsflächen wurden Bestäuberbeobachtungen sowie Aufnahmen von Rapsglanzkäferbefall und deren Parasitierung durchgeführt. Zusätzlich wurden verschiedene Ertragsparameter von Raps aufgenommen. Die Untersuchungen fanden jeweils in unterschiedlichen Distanzen zur Blühfläche innerhalb des Rapsfeldes statt, um Distanz-Abnahme Funktionen zu untersuchen. Spritzfenster wurden etabliert, um den Einfluss von Pestiziden auf Ökosystemdienstleistungen und Erträge zu untersuchen. Für die statistische Auswertung wurden lineare gemischte Modelle verwendet. Die Ergebnisse haben zum einen gezeigt, dass frisch angelegte Blühflächen mit hoher Blütendeckung sehr attraktiv für Bestäuber sind. Jedoch blieben die Bestäuber in den Blühflächen, wenn diese eine gewisse Größe hatten (> 1.5ha) und verteilten sich nicht auf die umgebenden Flächen. Ein hoher Anteil an halbnatürlichen Habitaten in der umgebenden Landschaft erhöhte den Wert von kleinen Blühflächen als Ausgangspunkt für Bestäuber und ihren anschließenden Übergang auf Ackerflächen. Hohe Mengen an halbnatürlichen Habitaten verringerten außerdem den Rückgang der Bestäuber mit steigender Entfernung zur Blühfläche. Auf Grundlage dieser Ergenisse wäre es zu empfehlen, kleine Blühflächen in Landschaften mit viel halbnatürlichem Habitat und große Blühflächen in Landschaften mit wenig halbnatürlichem Habitat anzulegen. Außerdem ist anzumerken, dass Blühflächen keinen adequaten Ersatz für dauerhafte halbantürliche Habitate darstellen. Diese müssen weiterhin aktiv geschützt und erhalten werden, um Bestäubung auf Ackerflächen zu fördern. Des Weiteren wurde auf Rapsflächen neben kontinuierlichen Blühflächen mit einem Alter über 6 Jahre der niedrigste Befall mit Rapsglanzkäferlarven festgestellt. Blühflächen und Kalkmagerrasen erhöhten die Parasitierung von Rapsglanzkäfern in benachbarten Rapsflächen im Vergleich zu Rapsflächen die neben Ackerflächen liegen. Der Schwellenwert für eine effektive natürliche Schädlingskontrolle wurde nur in den pestizidfreien Bereichen in Rapsflächen neben kontinuierlichen Blühflächen und Kalkmagerasen erreicht. In mit Pestiziden behandelten Bereichen nahmen Parasitismus und Superparasitismus mit zunehmender Entfernung zum benachbarten Feld ab. In den Spritzfenstern ohne Pestizide blieben sie jedoch auf dem gleichen Niveau. Große Blühflächen erhöhten Parasitismus und Superparasitismus mehr als kleine. Insgesamt können Blühflächen die Parasitierungsraten von Rapsglanzkäfern auf Rapsflächen erhöhen, jedoch können Pestizide diese positiven Effekte aufheben. Zuletzt wurden die Effekte von Blühflächen und Ökosystemdienstleistungen auf den Rapsertrag untersucht. Hier stellte sich heraus, dass Bestäubung keine positiven Effekte auf den Rapsertrag hatte. Alte und kontinuierliche Blühflächen erhöhten die natürliche Schädlingskontrolle in den Rapsfeldern, welche wiederrum den Samenansatz und das absolute Samengewicht erhöhten. Die Behandlung mit Pestiziden hatte negative Asuwirkungen auf natürliche Schädlingskontrolle, aber positive Auswirkungen auf den Ertrag. Bestäubung und natürliche Schädlingskontrolle nahmen mit der zunehmenden Entfernung zum Feldrand ab, aber der Fruchtansatz nahm leicht zu. Die Feldqualität hatte keine Auswirkungen auf die im Modell untersuchten Rapsertrag Messwerte. Ertragsbildung bei Rapspflanzen ist ein komplexer Vorgang an dem viele Faktoren beteiligt sind. Mehrjährige Blühflächen können ökologische Intensivierung fördern indem sie den Ertrag durch natürliche Schädlingskontrolle erhöhen. Diese Studie leistet einen wertvollen Beitrag zum besseren Verständnis der Auswirkungen von unterschiedlich beschaffenen Blühflächen auf Bestäubung, natürliche Schädlingskontrolle und Rapsertrag. KW - Ökologie KW - Agrarumweltmaßnahmen KW - Ökosystemdienstleistung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206577 ER - TY - THES A1 - Schuster, Sarah T1 - Analysis of \(Trypanosoma\) \(brucei\) motility and the infection process in the tsetse fly vector T1 - Analyse der Motilität von \(Trypanosoma\) \(brucei\) und dem Infektionsprozess in der Tsetsefliege N2 - African trypanosomes are protist pathogens that are infective for a wide spectrum of mammalian hosts. Motility has been shown to be essential for their survival and represents an important virulence factor. Trypanosoma brucei is transmitted by the bite of the bloodsucking tsetse fly, the only vector for these parasites. The voyage through the fly is complex and requires several migration, proliferation and differentiation steps, which take place in a defined order and in specific fly tissues. The first part of this doctoral thesis deals with the establishment of the trypanosome tsetse system as a new model for microswimmer analysis. There is an increasing interdisciplinary interest in microbial motility, but a lack of accessible model systems. Therefore, this work introduces the first enclosed in vivo host parasite system that is suitable for analysis of diverse microswimmer types in specific microenvironments. Several methods were used and adapted to gain unprecedented insights into trypanosome motion, the fly´s interior architecture and the physical interaction between host and parasite. This work provides a detailed overview on trypanosome motile behavior as a function of development in diverse host surroundings. In additional, the potential use of artificial environments is shown. This can be used to partly abstract the complex fly architecture and analyze trypanosome motion in defined nature inspired geometries. In the second part of the thesis, the infection of the tsetse fly is under investigation. Two different trypanosome forms exist in the blood: proliferative slender cells and cell cycle arrested stumpy cells. Previous literature states that stumpy cells are pre adapted to survive inside the fly, whereas slender cells die shortly after ingestion. However, infection experiments in our laboratory showed that slender cells were also potentially infective. During this work, infections were set up so as to minimize the possibility of stumpy cells being ingested, corroborating the observation that slender cells are able to infect flies. Using live cell microscopy and fluorescent reporter cell lines, a comparative analysis of the early development following infection with either slender or stumpy cells was performed. The experiments showed, for the first time, the survival of slender trypanosomes and their direct differentiation to the procyclic midgut stage, contradicting the current view in the field of research. Therefore, we can shift perspectives in trypanosome biology by proposing a revised life cycle model of T. brucei, where both bloodstream stages are infective for the vector. N2 - Afrikanische Trypanosomen sind pathogene Protisten, die ein breites Spektrum von Säugetierwirten infizieren. Es wurde gezeigt, dass die Zellmotilität für das Überleben der Parasiten essenziell ist und einen wichtigen Virulenzfaktor darstellt. Trypanosoma brucei wird durch den Biss der blutsaugenden Tsetsefliege übertragen, dem einzigen Vektor für diese Parasiten. Der Entwicklungszyklus in der Fliege ist komplex und beinhaltet mehrere Migrations-, Proliferations- und Differenzierungsschritte, die in einer definierten Reihenfolge und in spezifischen Fliegenorganen stattfinden. Der erste Teil dieser Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Etablierung des Trypanosomen Tsetse Systems als ein neues Modell für Motilitätsanalysen. Es besteht ein wachsendes interdisziplinäres Interesse an mikrobieller Motilität, aber es fehlen zugängliche Mikroschwimmersysteme. Deswegen stellt diese Arbeit das erste abgeschlossene in vivo Wirt Parasit System vor, das für Analysen von verschiedenen Mikroschwimmertypen in spezifischen Umgebungen geeignet ist. Verschiedene Methoden wurden benutzt und adaptiert, um sowohl Einblicke in die Trypanosomenbewegung, die innere Fliegenarchitektur als auch die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Wirt und Parasit zu erhalten. Diese Arbeit bietet einen detaillierten Überblick über das motile Verhalten von Trypanosomen als Funktion der Entwicklung in diversen Wirtsumgebungen. Zusätzlich ist die potenzielle Nutzung von artifiziellen Umgebungen gezeigt. Diese können benutzt werden, um die komplexe Architektur der Fliege teilweise zu abstrahieren und die Trypanosomenbewegung in definierten und von der Nature inspirierten Geometrien zu analysieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Infektion der Fliege genauer betrachtet. Im Blut existieren zwei verschiedene Trypanosomenformen: proliferierende ‘slender’ und Zellzyklus arretierte ‘stumpy’ Zellen. Bisherige Literatur besagt, dass stumpy Zellen präadaptiert sind, um in der Fliege zu überleben, wohingegen slender Zellen kurz nach der Aufnahme sterben. Dennoch konnten Infektionsexperimente in unserem Labor zeigen, dass auch slender Zellen potenziell infektiös sind. Während dieser Arbeit wurden weitere Infektionen so durchgeführt, dass die Möglichkeit für die Aufnahme von stumpy Zellen minimiert wurde und die Infektionskapazität der slender Zellen bestätigt werden konnte. Durch Lebendzell Mikroskopie mit fluoreszenten Reporterzelllinien wurde eine vergleichende Analyse für die frühe Entwicklung von slender und stumpy Parasiten nach der Infektion durchgeführt. Die Experimente zeigten zum ersten Mal das Überleben von slender Trypanosomen in der Tsetsefliege und ihre direkte Differenzierung in das prozyklische Mitteldarmstadium. Sie widersprechen demnach der aktuellen Auffassung im Forschungsbereich. Demzufolge können wir von einem Perspektivwechsel in der Trypanosomenbiologie sprechen und schlagen einen revidierten Lebenszyklus für T. brucei vor, in dem beide Blutstromformen für den Vektor infektiös sind. KW - Motilität KW - Trypanosomen KW - Tsetsefliege KW - Parasit KW - tsetse fly KW - motility KW - trypanosome KW - vector-parasite interaction KW - microswimming Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192691 ER - TY - THES A1 - Heiby, Julia T1 - Insight into molecular mechanisms of folding and self-association of spider silk protein domains T1 - Einblicke in molekulare Mechanismen der Faltung und Selbstassoziation von Spinnenseidenproteindomänen N2 - Spider silk is a biomaterial of extraordinary toughness paired with elasticity. The assembly of silk proteins, so-called spidroins (from “spider” and “fibroin”), generates the silk threads we typically see in our garden or the corners of our houses. Although spider webs from different species vary considerably in geometry and size, many sections of spidroin sequences are conserved. Highly conserved regions, found in all spidroins, relate to the terminal domains of the protein, i.e., the N-terminal (NTD) and C-terminal domains (CTD). Both have an essential function in the silk fibre association and polymerisation. The NTD is a 14 kDa five-helix bundle, which self-associates via a pH-driven mechanism. This process is critical for starting the polymerisation of the fibre. However, detailed insights into how conserved this mechanism is in different species and the quantitative thermodynamic comparison between homologous NTDs was missing. For this reason, four homologous NTDs of the major ampullate gland (MaSp) from spider species Euprosthenops australis, Nephila clavipes, Latrodectus hesperus, and Latrodectus geometricus were investigated. I analysed and quantified equilibrium thermodynamics, kinetics of folding, and self-association. Methods involved dynamic light scattering (MALS), stopped-flow fluorescence and circular dichroism spectroscopy in combination with thermal and chemical denaturation experiments. The results showed conserved, cooperative two-state folding on a sub-millisecond time scale. All homologous NTDs showed a similarly fast association in the order of 10^9 M^−1 s^−1, while the resulting equilibrium dissociation constants were in the low nanomolar range. Electrostatic forces were found to be of great importance for protein association. Monomeric protein stability increased with salt concentration while enhancing its folding speed. However, due to Debye-Hückel effects, we found intermolecular electrostatics to be shielded, which reduced the NTDs association capacity significantly at high ionic strength. Altogether, the energetics and kinetics of the NTD dimerisation was conserved for all analysed homologs. Comparable to the NTD, the spider silks CTD is also a α-helix bundle, which covalently links two spidroins. The orientation of the domains predetermines the future fibre geometry. Here again, the detailed quantitative characterisation of the folding and dimerisation was missing. Therefore, the CTD from the E. australis was analysed in-depth. The protein folded via a three-state mechanism and was placed in the family of knotted proteins. By analysing the amino acid composition of the NTD of the MaSp1 of the Euprosthenops australis, we found an unusually high content of methionine residues (Met). To elucidate why this protein exhibits so many Met residues, I mutated all core Mets simultaneously to leucine (Leu). Results revealed a dramatically stabilised NTD, which now folded 50 times faster. After solving the tertiary structure of the mutant by NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy, the structure of the monomeric mutant was found to be identical with the wild-type protein. However, when probing the dimerisation of the NTD, I could show that the association capacity was substantially impaired for the mutant. Our findings lead to the conclusion that Met provides the NTD with enhanced conformational dynamics and thus mobilises the protein, which results in tightly associated dimers. In additional experiments, I first re-introduced new Met residues into the Met-depleted protein at sequence positions containing native Leu. Hence, the mutated NTD protein was provided with the same number of Leu, which were previously removed by mutation. However, the protein did not regain wild-type characteristics. The functionality was not restored, but its stability was decreased as expected. To probe our hypothesis gained from the MaSp NTD, I transferred the experiment to another protein, namely the Hsp90 chaperone. Therefore, I incorporated methionine residues in the protein, which resulted in a slight improvement of its function. Finally, trial experiments were performed aiming at the synthesis of shortened spidroin constructs containing less repetitive middle-segments than the wild-type protein. The objective was to study the findings of the terminal domains in the context of an intact spidroin. The synthesis of these engineered spidroins was challenging. Nevertheless, preliminary results encourage the assumption that the characteristics observed in the isolated domains hold true in the context of a full-length spidroin. N2 - Spinnenseide ist ein Biomaterial mit außergewöhnlicher Widerstandsfähigkeit welche gepaart ist mit Elastizität. Das Zusammenfügen von Seidenproteinen aus so ge-nannten Spidroinen (ein Kunstwort aus „Spinne“ und „Fibroin“) erzeugt die Seiden-fäden, die wir typischerweise in unseren Gärten oder in den Ecken unserer Häuser finden. Obwohl Spinnennetze von verschiedenen Spinnenarten in Geometrie und Größe stark variieren, sind große Teile der Spidroin-Sequenzen konserviert. Stark konservierte Bereiche, die in allen Spidroinen vorkommen, sind die endständigen Bereiche des Proteins, die N-terminale (NTD) und C-terminale Domäne (CTD) ge-nannt werden. Beide haben wichtige Funktionen in der Assoziation der Proteine im Spinnkanal und deren Polymerisation zur Ausbildung des Seidenfadens. Die NTD ist ein kleines 14 kDa Protein, bestehend aus einem Bündel aus fünf Helices, dessen Selbstorganisation pH-abhängig ist. Dieser Prozess leitet die Poly-merisation der Faser ein. Allerdings fehlten bis heute Informationen darüber, ob dieser Mechanismus bei homologen Domänen aus verschiedenen Spinnenarten konser¬viert ist, da kaum quantitative biophysikalische Daten vorhanden sind. Aus diesem Grund wurden vier homologe NTDs der Spinnenarten Euprosthenops australis, Nephila clavipes, Latrodectus hesperus und Latrodectus geometricus vergleichend untersucht und deren Gleichgewichts-Thermodynamik, die Kinetik der Faltung und die Selbstassoziation quantitativ analysiert. Dazu wurden Methoden wie dynamische Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS), Stopped-Flow Fluoreszenz-spektroskopie und Zirkulardichroismus in Kombination mit thermischen und chemischen Denaturierungs¬experimenten angewandt. Die Ergebnisse lieferten die Erkenntnis einer kooperativen Zwei-Zustands-Faltung, die auf einer Zeitskala von weniger als einer Millisekunde stattfand. Alle homologen NTDs zeigten eine schnelle Assoziationsratenkonstante in der Größenordnung von 10^9 M^-1 s^-1, während die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante für alle Homologe im nied¬rigen nano-molaren Bereich lag. Die Proteinassoziation wurde durch elektrostatische Kräfte gesteuert, wobei hohe Salzkonzentrationen die Stabilität des monomeren Proteins und dessen Faltungsgeschwindigkeit erhöhten. Die Assoziation zweier Domänen wurde jedoch durch Abschirmung intermolekularer elektrostatischer Kräfte, dem Debye-Hückel-Gesetz zufolge, reduziert. Die Energetik und Kinetik der NTD-Dimerisierung aller untersuchten Homologen erwies sich konserviert. Ebenso wie die NTD, ist auch die CTD der Spinnenseide ein α-helikales Bündel, welche jedoch zwei Spidroine kovalent miteinander verbindet. Die Orientierung der verknüpften Domäne bestimmt bereits die zukünftige Faserstruktur. Ähnlich wie bei der NTD, waren Faltung und Dimerisierung der CTD bisher nicht im Detail be-schrieben. Durch eine detaillierte Analyse der CTD der E. australis konnte gezeigt werden, dass das Protein sich in einem dreistufigen Mechanismus faltet und außerdem der Familie der geknoteten Proteine angehört. Bei genauerer Betrachtung der Aminosäurezusammensetzung der E. australis NTD konnte ein ungewöhnlich hoher Anteil der Aminosäure Methionin (Met) festge¬stellt werden. Um diesen überraschenden Sachverhalt zu verstehen, habe ich alle im Kern liegenden Met zu Leucin (Leu) mutiert. Die Ergebnisse zeigten eine extrem stabilisierte NTD, welche sich nun 50-fach schneller faltete. Die Protein¬struktur der Mutante wurde in Lösung mittels NMR Spektroskopie ermittelt. Das Ergebnis lieferte deckungsgleiche Strukturen von Mutante und Wildtyp im monomeren Zustand. Allerdings zeigten NTD Dimerisierungs-Versuche, dass die Assoziations-fähigkeit der Mutante erheblich beeinträchtigt war. Untersuchungen der nativen Dynamik mittels NMR und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie zeigten, dass Met diese entscheidend verstärkt, was zu einem eng assoziierten Dimer führte. Im Versuch die Dynamik wieder künstlich herzustellen, habe ich neue Met in die Mutante eingeführt, auf Sequenzpositionen welche natürlicherweise Leu aufweisen. Somit wurde die ursprüngliche Anzahl an Met in der NTD wiederher¬gestellt, jedoch an anderen Positionen. Obwohl das Protein wie erwartet an Stabilität verlor, konnte dessen Funktionalität nicht wiederhergestellt werden. Um unsere Erkenntnisse auf andere Proteine zu übertragen, wurden Met Reste künstlich in ein Hsp90 Protein eingeführt. Es konnte eine leicht verbesserte Funktionalität des Proteins beobachtet werden. Schließlich wurde versucht, die für die CTD und NTD gewonnen Erkenntnisse auf intakte, jedoch verkürzte Spidroine zu übertragen. Dazu wurden Spidroine mit weniger repetitiven Mittelsegmenten mittels rekombinanten Methoden hergestellt. Die Synthese dieser Spidroine erwies sich als Herausforderung. Allerdings zeigten die vorläufigen Ergebnisse, dass eine Verallgemeinerung der Erkenntnisse der isolierten Domänen auf das Volllängen-Spidroin möglich ist. KW - Spinnenseide KW - Fluoreszenzspektroskopie KW - Terminale Domaine KW - Spider Silk KW - Fluorescence spectroscopy KW - Terminal domains Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193455 ER - TY - THES A1 - Markert, Sebastian Matthias T1 - Enriching the understanding of synaptic architecture from single synapses to networks with advanced imaging techniques T1 - Vertiefung des Verständnisses synaptischer Architektur von der einzelnen Synapse bis zum Netzwerk mit modernsten bildgebenden Verfahren N2 - Because of its complexity and intricacy, studying the nervous system is often challenging. Fortunately, the small nematode roundworm Caenorhabditis elegans is well established as a model system for basic neurobiological research. The C. elegans model is also the only organism with a supposedly complete connectome, an organism-wide map of synaptic connectivity resolved by electron microscopy, which provides some understanding of how the nervous system works as a whole. However, the number of available data-sets is small and the connectome contains errors and gaps. One example of this concerns electrical synapses. Electrical synapses are formed by gap junctions and difficult to map due to their often ambiguous morphology in electron micrographs, leading to misclassification or omission. On the other hand, chemical synapses are more easily mapped, but many aspects of their mode of operation remain elusive and their role in the C. elegans connectome is oversimplified. A comprehensive understanding of signal transduction of neurons between each other and other cells will be indispensable for a comprehensive understanding of the nervous system. In this thesis, I approach these challenges with a combination of advanced light and electron microscopy techniques. First, this thesis describes a strategy to increase synaptic specificity in connectomics. Specifically, I classify gap junctions with a high degree of confidence. To achieve this, I utilized array tomography (AT). In this thesis, AT is adapted for high-pressure freezing to optimize for structure preservation and for super-resolution light microscopy; in this manner, I aim to bridge the gap between light and electron microscopy resolutions. I call this adaptation super-resolution array tomography (srAT). The srAT approach made it possible to clearly identify and map gap junctions with high precision and accuracy. The results from this study showcased the feasibility of incorporating electrical synapses into connectomes in a systematic manner, and subsequent studies have used srAT for other models and questions. As mentioned above, the C. elegans connectomic model suffers from a shortage of datasets. For most larval stages, including the special dauer larval stage, connectome data is completely missing up to now. To obtain the first partial connectome data-set of the C. elegans dauer larva, we used focused ion-beam scanning electron microscopy (FIB-SEM). This technique offers an excellent axial resolution and is useful for acquiring large volumes for connectomics. Together with our collaborators, I acquired several data-sets which enable the analysis of dauer stage-specific “re-wiring” of the nervous system and thus offer valuable insights into connectome plasticity/variability. While chemical synapses are easy to map relative to electrical synapses, signal transduction via chemical transmitters requires a large number of different proteins and molecular processes acting in conjunction in a highly constricted space. Because of the small spatial scale of the synapse, investigating protein function requires very high resolution, which electron tomography provides. I analyzed electron tomograms of a worm-line with a mutant synaptic protein, the serine/threonine kinase SAD-1, and found remarkable alterations in several architectural features. My results confirm and re-contextualize previous findings and provide new insight into the functions of this protein at the chemical synapse. Finally, I investigated the effectiveness of our methods on “malfunctioning,” synapses, using an amyotrophic lateral sclerosis (ALS) model. In the putative synaptopathy ALS, the mechanisms of motor neuron death are mostly unknown. However, mutations in the gene FUS (Fused in Sarcoma) are one known cause of the disease. The expression of the mutated human FUS in C. elegans was recently shown to produce an ALS-like phenotype in the worms, rendering C. elegans an attractive disease model for ALS. Together with our collaboration partners, I applied both srAT and electron tomography methods to “ALS worms” and found effects on vesicle docking. These findings help to explain electrophysiological recordings that revealed a decrease in frequency of mini excitatory synaptic currents, but not amplitudes, in ALS worms compared to controls. In addition, synaptic endosomes appeared larger and contained electron-dense filaments in our tomograms. These results substantiate the idea that mutated FUS impairs vesicle docking and also offer new insights into further molecular mechanisms of disease development in FUS-dependent ALS. Furthermore, we demonstrated the broader applicability of our methods by successfully using them on cultured mouse motor neurons. Overall, using the C. elegans model and a combination of light and electron microscopy methods, this thesis helps to elucidate the structure and function of neuronal synapses, towards the aim of obtaining a comprehensive model of the nervous system. N2 - Das Nervensystem ist ein definierendes Merkmal aller Tiere, unter anderem verantwortlich für Sinneswahrnehmung, Bewegung und „höhere“ Hirnfunktionen. Wegen dessen Komplexität und Feingliedrigkeit stellt das Erforschen des Nervensystems oft eine Herausforderung dar. Jedoch ist der kleine Fadenwurm Caenorhabditis elegans als Modellsystem für neurobiologische Grundlagenforschung gut etabliert. Erbesitzt eines der kleinsten und unveränderlichsten bekannten Nervensysteme. C.elegans ist auch das einzige Modell, für das ein annähernd vollständiges Konnektom vorliegt, eine durch Elektronenmikroskopie erstellte Karte der synaptischen Verbindungen eines gesamten Organismus, die Einblicke in die Funktionsweise des Nervensystems als Ganzes erlaubt. Allerdings ist die Anzahl der verfügbaren Datensätze gering und das Konnektom enthält Fehler und Lücken. Davon sind beispielsweise elektrische Synapsen betroffen. Elektrische Synapsen werden von Gap Junctions gebildet und sind auf Grund ihrer oft uneindeutigen Morphologie in elektronenmikroskopischen Aufnahmen schwierig zu kartieren, was dazu führt, dass einige falsch klassifiziert oder übersehen werden. Chemische Synapsen sind dagegen einfacher zu kartieren, aber viele Aspekte ihrer Funktionsweise sind schwer zu erfassen und ihre Rolle im Konnektom von C.elegans ist daher zu vereinfacht dargestellt. Ein umfassendes Verständnis der Signaltransduktion von Neuronen untereinander und zu anderen Zellen wird Voraussetzung für ein vollständiges Erfassen des Nervensystems sein. In der vorliegenden Arbeit gehe ich diese Herausforderungen mithilfe einer Kombination aus modernsten licht- und elektronenmikroskopischen Verfahren an. Zunächst beschreibt diese Arbeit eine Strategie, um die synaptische Spezifität in der Konnektomik zu erhöhen, indem ich Gap Junctions mit einem hohen Maß an Genauigkeit klassifiziere. Um dies zu erreichen, nutzte ich array tomography (AT), eine Technik, die Licht- und Elektronenmikrokopie miteinander korreliert. In dieser Arbeit wird AT adaptiert für Hochdruckgefrierung, um die Strukturerhaltung zu optimieren, sowie für ultrahochauflösende Lichtmikroskopie; so wird die Kluft zwischen den Auflösungsbereichen von Licht- und Elektronenmikroskopie überbrückt. Diese Adaption nenne ich super-resolution array tomography (srAT). Der srATAnsatz machte es möglich, Gap Junctions mit hoher Präzision und Genauigkeit klar zu identifizieren. Für diese Arbeit konzentrierte ich mich dabei auf Gap Junctions des retrovesikulären Ganglions von C.elegans. Die Ergebnisse dieser Studie veranschaulichen, wie es möglich wäre, elektrische Synapsen systematisch in Konnektome aufzunehmen. Nachfolgende Studien haben srAT auch auf andere Modelle und Fragestellungen angewandt ... KW - Caenorhabditis elegans KW - Synapse KW - Elektronenmikroskopie KW - Myatrophische Lateralsklerose KW - connectomics KW - focused ion-beam scanning electron microscopy KW - super-resolution array tomography Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189935 ER - TY - THES A1 - Auer, Daniela T1 - Impact of the chlamydial deubiquitinase ChlaDUB1 on host cell defense T1 - Einfluss der chlamydiellen Deubiquitinase ChlaDUB1 auf die Wirtszellabwehr N2 - The human pathogen Chlamydia trachomatis is the main cause of sexually transmitted infections worldwide. The obligate intracellular bacteria are the causative agent of several diseases that reach from conjunctivitis causing trachoma and blindness as well as salpingitis and urethritis which can lead to infertility if left untreated. In order to gain genetically engineered Chlamydia that inducible knock down specific gene expression, the CRISPRi system was established in C. trachomatis. In a proof of principle experiment it was shown that C. trachomatis pCRISPRi:gCdu1III target ChlaDUB1 expression and reduce the protein amount up to 50 %. Knock-down of the DUB did not influence protein levels of anti-apoptotic Mcl-1 and did not make cells susceptible for apoptosis. However, reduced dCas9 protein size, bacterial growth impairment and off target effects interfering with the GFP signal, form obstacles in CRISPRi system in Chlamydia. For routinely use of the CRISPRi method in C. trachomatis further investigation is needed. Since the bacterial life cycle includes two morphological and functional distinct forms, it is essential for chlamydial spread to complete the development cycle and form infectious progeny. Therefore, Chlamydia has evolved strategies to evade the host immune system in order to stay undetected throughout the developmental cycle. The bacteria prevent host cell apoptosis via stabilization of anti-apoptotic proteins like Mcl-1, Survivin and HIF-1α and activate pro-survival pathways, inhibiting invasion of immune cells to the site of infection. The host cell itself can destroy intruders via cell specific defense systems that involve autophagy and recruitment of professional immune cells. In this thesis the role of the chlamydial deubiuqitinase ChlaDUB1 upon immune evasion was elucidated. With the mutant strain Ctr Tn-cdu1 that encodes for a truncated DUB due to transposon insertion, it was possible to identify ChlaDUB1 as a potent opponent of the autophagic system. Mutant inclusions were targeted by K48 and K63 chain ubiquitination. Subsequently the inclusion was recognized by autophagic receptors like p62, NBR1 and NDP52 that was reversed again by complementation with the active DUB. Xenophagy was promoted so far as LC3 positive phagosomes formed around the inclusion of Ctr Tn-cdu1, which did not fuse with the lysosome. The detected growth defect in human primary cells of Chlamydia missing the active DUB was not traced back to autophagy, but was due to impaired development and replication. It was possible to identify Ankib1, the E3 ligase, that ubiquitinates the chlamydial inclusion in a siRNA based screen. The activating enzyme Ube1 and the conjugating enzyme Ube2L3 are also essential in this process. Chlamydia have a reduced genome and depend on lipids and nutrients that are translocated from the host cell to the inclusion to proliferate. Recruitment of fragmented Golgi stacks to the inclusion surface was prevented when ChlaDUB1 was inactive, probably causing diminished bacterial growth. Additionally, the modification of the inclusion by Ankib1 and subsequent decoration by autophagic markers was not only present in human but also murine cells. Comparison of other Chlamydia strains and species revealed Ankib1 to be located at the proximity of the inclusion in C. trachomatis strains only but not in C. muridarum or C. pneumoniae, indicating that Ankib1 is specifically the E3 ligase of C. trachomatis. Moreover, the role of ChlaDUB1 in infected tissue was of interest, since ChlaDUB1 protein was also found in early EB stage and so might get in contact with invading immune cells after cell lysis. While bacteria spread and infect new host cells, Chlamydia can also infect immune cells. Infection of human neutrophils with Ctr Tn-cdu1 shows less bacterial survival and affirms the importance of the DUB for bacterial fitness in these cells. N2 - Chlamydia trachomatis ist weltweit der häufigste Auslöser von sexuell übertragenen Krankheiten. Das obligat intrazelluläre Bakterium manifestiert sich in diversen Krankheitsbildern, darunter Konjunktivitis, die zu einem Trachom oder sogar Erblindung führen kann und Salpingitis oder Urethritis, die unbehandelt unfruchtbar macht. Das CRISPRi System wurde in C. trachomatis etabliert, um genetisch veränderte Bakterien zu bekommen, in denen induzierbar die spezifische Genexpression herunter gefahren werden kann. Es wurde gezeigt, dass in C. trachomatis pCRISPRi:gCdu1III, einem Stamm, der mit der Genexpression von ChlaDUB1 interferiert, die Menge an ChlaDUB1 um bis zu 50 % reduziert ist. Die Sensitivität für Apoptose durch sinkende Mcl-1 Proteinmengen wurde dadurch jedoch nicht wieder hergestellt. Das verkürzte dCas9 Protein, vermindertes bakterielles Wachstum, sowie Effekte auf andere Genexpressionen, wie z.B. das GFP Signal zeigen die Problematik des CRISPRi Systems in C. trachomatis. Um CRISPRi als Routinemethode für genetische Transformation in Chlamydien zu etablieren, stehen noch weitere Untersuchungen an. Der Lebenszyklus von Chlamydien zeichnet sich durch zwei morphologisch und funktionell unterschiedliche Stadien aus, weshalb die Vollendung des Lebenszyklus und die Produktion infektiöser Partikel essenziell sind. Daher haben die Pathogene Strategien entwickelt, um dem Immunsystem des Wirts zu entgehen und sich unerkannt in der Zelle zu entwickeln. Die Bakterien verhindern Apoptose infizierter Zellen durch die Stabilisierung von anti-apoptotischen Proteinen wie Mcl-1, Survivin und HIF-1α und aktivieren Überlebens-Signalwege, die die Invasion von Immunzellen in das infizierte Gewebe unterdrücken. Die Wirtszelle selbst ist in der Lage bakterielle Eindringlinge durch die eigenen Abwehrmechanismen wie Autophagie und die Rekrutierung von professionellen Immunzellen zu zerstören. In dieser Arbeit wurde die Rolle der chlamydiellen Deubiquitinase ChlaDUB1 auf die Vermeidungsstrategien vor dem Immunsystem untersucht. Mit Hilfe der Mutante Ctr Tn-cdu1, die durch Insertion eines Transposons für eine verkürzte und inaktive Deubiquitinase codiert, konnte gezeigt werden, dass ChlaDUB1 ein Gegenspieler des Autophagiesystems ist. Die Inklusionen der Mutante wurden mit K48 und K63 Ubiquitinketten modifiziert, was die Rekrutierung von Autophagiemarkern wie p62, NBR1 und NDP52 zur Folge hatte. Die Rekomplementierung mit aktivem ChlaDUB1 Protein hob die Modifikation der Inklusion wieder auf. Jedoch wurde die Xenophagie so weit vorangetrieben, bis sich LC3 positive Phagosomen um die Inklusionen von Ctr Tn-cdu1 bildeten, die allerdings nicht mit dem Lysosom verschmolzen. Das beobachtete Wachstumsdefizit in Chlamydien, die keine funktionelle Deubiquitinase exprimieren, konnte nicht auf die Autophagie zurückgeführt werden, sondern war voraussichtlich aufgrund verlangsamter Entwicklung und Replikation entstanden. In einem siRNA basierten Experiment konnte die E3 Ligase Ankib1 für die Ubiquitinierung der Ctr Tn-cdu1 Inklusion identifiziert werden. Des Weiteren sind das Ubiquitin aktivierende Enzym Ube1 und das Ubiquitin konjugierende Enzym Ube2L3 essentiell für die Modifikation der Inklusion. Da Chlamydien ein reduziertes Genom haben und nicht für alle Enzyme selbst kodieren, sind sie auf Lipide und Metabolite der Wirtszelle für ihr Wachstum angewiesen. Die Rekrutierung der fragmentierten Glogi-Membranen zur Inklusionsoberfläche wurde durch inaktives ChlaDUB1 Protein verhindert, das wahrscheinlich die bakterielle Entwicklung negativ beeinflusst. Des Weiteren ubiquitinierte Ankib1 nicht nur Inklusionen in humanen, sondern auch in murinen Zellen, was auch hier die Bindung von Autophagiemarkern zur Folge hatte. Der Vergleich unter verschiedenen chlamydiellen Serotypen und Arten zeigte, dass Ankib1 nur an Inklusionen von C. trachomatis zu finden war, nicht aber für C. muridarum oder C. pneumoniae. Des Weitern wurde die Rolle von ChlaDUB1 in infiziertem Gewebe genauer betrachtet, da die Protease auch während frühen EB Phasen nachgewiesen wurde, in denen sie Kontakt zu immigrierenden Immunzellen haben könnte. Während der Zelllyse werden Bakterien frei gesetzt, die neue Wirtszellen, aber auch Immunzellen, infizieren können. Die Infektion von humanen Neutrophilen mit Ctr Tn-cdu1 zeigte vermindertes bakterielles Wachstum und verdeutlicht die Bedeutung von ChlaDUB1 für das Überleben in diesen Immunzellen. KW - Chlamydia KW - Golgi KW - ChlaDUB1 KW - Cdu1 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178462 ER - TY - THES A1 - da Cruz Güerisoli, Irene Maria T1 - Investigating the murine meiotic telomere complex TERB1-TERB2-MAJIN: spatial organization and evolutionary history T1 - Untersuchung des murinen meiotischen Telomer-Komplex TERB1-TERB2-MAJIN: spatiale Organisation und Evolutionsgeschichte N2 - Einess der faszinierenden Merkmale der meiotischen Prophase I sind die hochkonservierten kräftigen Bewegungen homologer Chromosomen. Diese Bewegungen sind entscheidend für den Erfolg von Schlüsselereignissen wie die Ausrichtung, Paarung und Rekombination der homologen Chromosomen. Mehrere bisher untersuchte Organismen, darunter Säugetiere, Würmer, Hefen und Pflanzen, erreichen diese Bewegungen, indem sie die Chromosomenenden an spezialisierten Stellen in der Kernhülle verankern. Diese Verankerung erfordert Telomer-Adapterproteine, die bisher in der Spalthefe und der Maus identifiziert wurden. Die meiosespezifischen Telomer-Adapterproteine der Maus, TERB1, TERB2 und MAJIN, sind an der Verankerung des ubiquitären Telomer-Shelterin-protein an den LINC-Komplex beteiligt, mit einem analogen Mechanismus, wie er die Spalthefe beschrieben wird. Obgleich die meiose-spezifischen TelomerAdapterproteine eine wesentliche Rolle spielen, ist der genaue Mechanismus der Verankerung der Telomere an die Kernhülle sowie ihre evolutionäre Geschichte bisher noch wenig verstanden. Das Hauptziel dieser Arbeit ist daher die Untersuchung der Organisation des meiosespezifischen TelomerAdapterkomplexes TERB1-TERB2-MAJIN der Maus und dessen Evolutionsgeschichte. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Organisation des TERB1-TERB2-MAJIN Komplexes mittels hochauflösender Mikroskopie (SIM), an Mausspermatozyten untersucht, sowie die Lokalisation in Bezug auf TRF1 des Telomer-ShelterinKomplexes und die telomerische DNA analysiert. In den Stadien Zygotän und Pachytän zeigten die Fluoreszenzsignale eine starke Überlappung der Verteilung der meiotischen Telomer-Komplex-Proteine, wobei die Organisation von TERB2 an den Chromosomenenden heterogener war als die von TERB1 und MAJIN. Außerdem konnte die TRF1-Lokalisation an den Enden der Lateralelemente (LEs) mit einer griffartigen Anordnung um die TERB1- und MAJIN-Signale im Zygotän- und Pachytän-Stadium gezeigt werden. Interessanterweise erwies sich die telomerische DNA als lateral verteilt und teilweise überlappend mit der zentralen Verteilung der meiotischen Telomer-Komplex-Proteine an den Enden der LEs. Die Kombination dieser Ergebnisse erlaubte die Beschreibung eines alternativen Modells der Verankerung der Telomer an die Kernhülle während der meiotischen Prophase I. Der zweite Teil dieser Arbeit analysiert die Evolutionsgeschichte der Mausproteine von TERB1, TERB2 und MAJIN. Die fehlende Übereinstimmung zwischen den Meiose-spezifische Telomer-Adapteproteinen der Maus und der Spalthefe hat die Frage nach dem evolutionsbedingten Ursprung dieses spezifischen Komplexes aufgeworfen. Um vermeintliche Orthologen der Mausproteinevon TERB1, TERB2 und MAJIN über Metazoen hinweg zu identifizieren, wurden computergestützte Verfahren und phylogenetische Analysen durchgeführt. Darüber hinaus wurden Expressionsstudien implementiert, um ihre potenzielle Funktion während der Meiose zu testen. Die Analysen haben ergeben, dass der Meiose-spezifische Telomer-Komplex der Maus sehr alt ist, da er bereits in den Eumetazoen entstand, was auf einen einzigen Ursprung hindeutet. Das Fehlen jeglicher Homologen des meiosespezifischen Telomerkomplexes in Nematoden und die einigen wenigen in Arthropoden nachgewiesenen Kandidaten, deuten darauf hin, dass die Telomer-Adapterproteine in diesen Abstammungslinien verloren/ersetzt oder stark diversifiziert worden sind. Bemerkenswerterweise zeigten Proteindomänen von TERB1, TERB2 und MAJIN, die an der Bildung des Komplexes sowie an der Interaktion mit dem Telomer-Shelterin-Protein und den LINC-Komplexen beteiligt sind, eine hohe Sequenzähnlichkeit über alle Kladen hinweg. Abschließend lieferte die Genexpression im Nesseltier Hydra vulgaris den Beweis, dass der TERB1-TERB2-MAJIN-Komplex selektiv in der Keimbahn exprimiert wird, was auf die Konservierung meiotischer Funktionen über die gesamte Metazoen-Evolution hinweg hindeutet. Zusammenfassend bietet diese Arbeit bedeutende neue Erkenntnisse hinsichtlich des Meiose-spezifischen Telomer-Adapterkomplex, seines Mechanismus zur Verankerung der Telomer an die Kernhülle und die Entschlüsselung seines Ursprungs in den Metazoen. N2 - One of the fascinating features of meiotic prophase I, is the highly conserved vigorous movements of homologous chromosomes. These movements are critical for the success of essential events as homologs alignment, synapsis and recombination. Several organisms studied so far, including mammals, worms, yeast and plants achieve these movements by anchoring the chromosome ends to specialized sites in the nuclear envelope (NE). This attachment requires telomere adaptor proteins which have to date been identified in fission yeast and mice. The mouse meiosis-specific telomere adaptor proteins TERB1, TERB2, and MAJIN are involved in the attachment of ubiquitous shelterin telomere to the LINC complex, in an analogous mechanism as those described in fission yeast. Despite the essential role of meiosis-specific telomere adaptor proteins, the precise mechanism of anchorage of telomeres to the nuclear envelope, as well as their evolutionary history, are still not well understood. Therefore, the main aim of this thesis is to investigate the organization of the mouse meiosis-specific telomere adaptor complex TERB1-TERB2-MAJIN and its evolutionary history. In the first part of this thesis high-resolution Structured Illumination Microscopy (SIM), indirect immunofluorescence and Telo-FISH on mouse spermatocytes were used to determine precisely how the telomere complex proteins are localized with relation to the shelterin telomeric TRF1 protein and telomeric DNA. During zygotene and pachytene stages staining patterns revealed extensively overlapping of meiotic telomere complex proteins distributions in which TERB2 organization is more heterogeneous than TERB1 and MAJIN at the chromosome ends. Further, TRF1 localization was shown at the side of lateral elements (LEs) ends with grasp-like distribution surrounding the TERB1 and MAJIN signals in zygotene and pachytene stages. Interestingly, telomeric DNA was shown to be laterally distributed and partially overlapping with the more central distribution displayed by meiotic telomere complex proteins of LEs ends. The combination of these results allowed to describe an alternative model of the telomere attachment to the NE during meiotic prophase I. The second part of this thesis, analyses mouse TERB1, TERB2, and MAJIN evolutionary history. The lack of similarity between mouse and fission yeast meiotic-specific telomere adaptor proteins has raised the question about the origin of this specific complex through evolution. To identify mouse TERB1, TERB2, and MAJIN putative orthologues, computational approaches and phylogenetic analyses were performed. Besides, to test their potential function during meiosis, expression studies were conducted. From these analyses, it was revealed that mouse meiosis-specific telomere complex is ancient, as it originated as early as eumetazoans pointing to a single origin. The absence of any homologs in Nematoda and only a few candidates detected in Arthropoda for meiosis-specific telomere complex, seemed, that these proteins have been lost/replaced or highly diversified in these lineages. Remarkably, TERB1, TERB2, and MAJIN protein domains involved in the formation of the complex as well as those required for the interaction with the telomere shelterin protein and the LINC complexes revealed high sequence similarity across all clades. Finally, gene expression in the cnidarian Hydra Vulgaris provided evidence that the TERB1-TERB2-MAJIN complex is selectively expressed in the germline suggesting conservation of meiotic functions across metazoan evolution. In summary, this thesis provides significant insights into the meiosis-specific telomere complex mechanism to engage telomeres to the nuclear envelope and the elucidation of its origin in metazoans. KW - meiosis KW - chromosomes telomere-led movement KW - TERB1-TERB2-MAJIN KW - SIM KW - Evolution Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-210562 ER - TY - THES A1 - Röschert, Isabelle T1 - Aurora-A prevents transcription-replication conflicts in MYCN-amplified neuroblastoma T1 - Aurora-A verhindert Transkriptions-Replikationskonflikte in MYCN-amplifizierten Neuroblastomen N2 - Neuroblastoma is the most abundant, solid, extracranial tumor in early childhood and the leading cause of cancer-related childhood deaths worldwide. Patients with high-risk neuroblastoma often show MYCN-amplification and elevated levels of Aurora-A. They have a low overall survival and despite multimodal therapy options a poor therapeutic prognosis. MYCN-amplified neuroblastoma cells depend on Aurora-A functionality. Aurora-A stabilizes MYCN and prevents it from proteasomal degradation by competing with the E3 ligase SCFFBXW7. Interaction between Aurora-A and MYCN can be observed only in S phase of the cell cycle and activation of Aurora-A can be induced by MYCN in vitro. These findings suggest the existence of a profound interconnection between Aurora-A and MYCN in S phase. Nevertheless, the details remain elusive and were investigated in this study. Fractionation experiments show that Aurora-A is recruited to chromatin in S phase in a MYCN-dependent manner. Albeit being unphosphorylated on the activating T288 residue, Aurora-A kinase activity was still present in S phase and several putative, novel targets were identified by phosphoproteomic analysis. Particularly, eight phosphosites dependent on MYCN-activated Aurora-A were identified. Additionally, phosphorylation of serine 10 on histone 3 was verified as a target of this complex in S phase. ChIP-sequencing experiments reveal that Aurora-A regulates transcription elongation as well as histone H3.3 variant incorporation in S phase. 4sU-sequencing as well as immunoblotting demonstrated that Aurora-A activity impacts splicing. PLA measurements between the transcription and replication machinery revealed that Aurora-A prevents the formation of transcription-replication conflicts, which activate of kinase ATR. Aurora-A inhibitors are already used to treat neuroblastoma but display dose-limiting toxicity. To further improve Aurora-A based therapies, we investigated whether low doses of Aurora-A inhibitor combined with ATR inhibitor could increase the efficacy of the treatment albeit reducing toxicity. The study shows that the combination of both drugs leads to a reduction in cell growth as well as an increase in apoptosis in MYCN-amplified neuroblastoma cells, which is not observable in MYCN non-amplified neuroblastoma cells. This new approach was also tested by a collaboration partner in vivo resulting in a decrease in tumor burden, an increase in overall survival and a cure of 25% of TH-MYCN mice. These findings indicate indeed a therapeutic window for targeting MYCN-amplified neuroblastoma. N2 - Das Neuroblastom ist der häufigste, solide, extrakranielle Tumor der frühesten Kindheit und die häufigste mit Krebs verbundene Todesursache von Kleinkindern weltweit. Patienten mit geringerer Überlebenswahrscheinlichkeit und schlechterer Therapieprognose zeigen oft eine MYCN-Amplifikation und erhöhte Mengen von Aurora-A. Aurora-A ist eine Serin/Threonin-Protein Kinase, die wichtige mitotische Prozesse reguliert. Aurora-A stabilisiert MYCN und verhindert dadurch den proteasomalen Abbau von MYCN. Die Interaktion zwischen Aurora-A und MYCN ist S Phasen-spezifisch und MYCN ist in vitro in der Lage, durch seine Bindung Aurora-A zu aktivieren. Die Funktionen und Prozesse, die von Aurora-A in der S Phase reguliert werden, sind noch nicht hinreichend untersucht und daher Gegenstand dieser Dissertation. Zell-Fraktionierungen zeigen, dass Aurora-A in der S Phase in einer MYCN-abhängigen Weise an das Chromatin gebunden ist. Phosphoproteom-Analysen mittels Massenspektrometrie identifizierten zahlreiche neue Substrate von Aurora-A, sowie acht Substrate von MYCN-aktiviertem Aurora-A. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Histon 3 Serin 10 von Aurora-A in Abhängigkeit von MYCN in S Phase phosphoryliert wird. ChIP-Sequenzierungen zeigen, dass Aurora-A die Elongation der Transkription und den Einbau der Histone Variante H3.3 in S Phase beeinflusst. 4sU-Sequenzierung sowie Immunoblots zeigen einen Zusammenhang zwischen der Aktivität von Aurora-A und dem Spleißosom in der S Phase. Zusätzlich konnte mittels PLA nachgewiesen werden, dass Aurora-A die Entstehung von Transkriptions-Replikationskonflikten verhindert, die andernfalls die Kinase ATR aktivieren würden. Aurora-A Inhibitoren wurden unter anderem zur Therapie von Neuroblastomen eingesetzt, allerdings ist die Dosis des Aurora-A Inhibitors durch die hohe Toxizität limitiert, was die Effizienz der Therapie stark beeinträchtigt. Daher wurde untersucht, ob die gleichzeitige Gabe von geringeren Mengen Aurora-A Inhibitor in Kombination mit einem ATR Inhibitor zur Therapie geeignet ist. In vitro konnte gezeigt werden, dass die Kombination beider Inhibitoren das Zellwachstum reduziert und das MYCN-amplifizierte Zellen im Vergleich zu MYCN nicht-amplifizierten Zellen verstärkt durch Apoptose sterben. Durch einen Kollaborationspartner konnte die Kombination der beiden Inhibitoren an Mäusen getestet werden. Die mit der Kombination behandelten Mäuse, zeigen ein deutlich reduziertes Tumorwachstum, sowie längeres Überleben. Somit stellt diese Kombination ein therapeutisches Fenster dar und könnte zur Behandlung von Neuroblastompatienten genutzt werden. KW - Neuroblastom KW - Aurora-A KW - MYCN KW - neuroblastoma Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243037 ER - TY - THES A1 - Aydinli, Muharrem T1 - Software unterstützte Analyse von regulatorischen Elementen in Promotoren mittels AIModules T1 - Software backed Analysis of regulatory Elements of Promoters with AIModules N2 - Die Regulation der Genexpression steht am Anfang vieler zellbiologischer Prozesse wie beispielsweise dem Zellwachstum oder der Differenzierung. Gene werden an Promotoren transkribiert, wobei ein Promotor selbst aus vielen logischen Einheiten aufgebaut ist, den Transkriptionsfaktorbindestellen (TFBSs). Diese können sehr nah beieinander liegen, aber auch weit entfernt voneinander sein. Sie werden spezifisch von Transkriptionsfaktoren (TFs) gebunden, die die Transkritptionsrate z.B. verstärken (Enhancer) oder schwächen (Silencer) können. Zwei oder mehr dieser TFBSs mit bestimmtem Abstand werden als "Module" zusammengefasst, die über Spezies hinweg konserviert sein können. Typischerweise findet man Module in Zellen mit einem Zellkern. Spezies mit gemeinsamen Modulen können ein Hinweis auf die gemeinsame phylogenetische Abstammung darstellen, aber auch gemeinsame Funktionsmechanismen von TFs über Gene hinweg aufdecken. Heutzutage sind verschiedene Anwendungen verfügbar, mit denen nach TFBSs in DNA gesucht werden kann. Zum Zeitpunkt des Verfassens dieser Arbeit sind aber nur zwei kommerzielle Produkte bekannt, die nicht nur TFBSs, sondern auch Module erkennen. Deshalb stellen wir hier die freie und quelloffene Lösung "AIModules" vor, die diese Lücke füllt und einen Webservice zur Verfügung stellt, der es erlaubt nach TFBSs sowie nach Modulen auf DNA- und auf RNA-Abschnitten zu suchen. Für die Motivesuche werden entweder Matrizen aus der Jaspar Datenbank oder Matrizen vom Anwender verwendet. Darüberhinaus zeigen wir, dass unser Tool für die TF Suche nur Sekunden benötigt, wohingegen conTraV3 mindestens eine Stunde für dieselbe Analyse braucht. Zusätzlich kann der Anwender bei unserem Tool den Grad der Konserviertheit für TFs mit angeben und wir zeigen, dass wir mit unserer Lösung, die die Jaspar Datenbank heranzieht, mehr Module finden, als ein kommerziell verfügbares Produkt. Weiterhin kann mit unserer Lösung auch auf RNA-Sequenzen nach regulatorischen Motiven gesucht werden, wenn der Anwender die dafür nötigen Matrizen liefert. Wir zeigen dies am Beispiel von Polyadenylierungsstellen. Zusammenfassend stellen wir ein Werkzeug vor, das erstens frei und quelloffen ist und zweitens entweder auf Servern veröffentlicht werden kann oder On-Site auf einem Notebook läuft. Unser Tool erlaubt es Promotoren zu analysieren und nach konservierten Modulen sowie TFBSs in Genfamilien sowie nach regulatorischen Elementen in mRNA wie z.B. Polyadenylierungsstellen oder andere regulatorische Elemente wie beispielsweise Enhancern oder Silencern in genomischer DNA zu suchen. N2 - Regulation of gene expression is at the root of many processes in cellular biology such as cell growth and differentiation. Promotors are the starting points for the transcription of a gene. The promotor itself consists of transcription factor binding sites (TFBSs) which can be closely located or vastly apart. They are recognized and bound by transcription factors (TFs) which themselves can e.g. enhance or silence the transcribing process by the RNA polymerases. Two or more of those transcription factor binding sites within a certain range are called a "module". Typically, those are found in cells with a nucleus and they may be conserved throughout species. The knowledge of modules may indicate a phylogenetic relationship among species but may also provide insight into the concerted actions of TFs on different genes. Currently there are a number of tools available that can enable a user to find TFBSs on DNA. But at the time of assembling this thesis, there are only two commercial software products available, that can not only detect TFs but also modules. Therefore, we present a free and open source solution that fills this gap by providing a web service that searches for TFBSs and modules on DNA as well as RNA stretches, called "AIModules". For that, matrices from the Jaspar database or user input matrices are used for motif discovery. Additionally, we show that our tool does TF analysis in seconds, whereas tools like conTraV3 took at least an hour. Furthermore, for the module search the user can specify the degree of conservation of the TFs. We show that with our solution using the JASPAR database we find more modules than a commercially available tool. Moreover, with our application RNA stretches can also be searched for regulatory motifs if suitable matrices are provided. We illustrate this for polyadenylation sites. Thus, our solution is free and open source, and can be deployed on servers as well as provided on-site on a notebook. We provide a tool to analyze promotors and search for conserved modules as well as common TFBSs in gene families, search for regulatory elements in mRNA such as polyadenylation sites or other regulatory elements such as enhancers or silencers in genomic DNA. KW - Genregulation KW - Promotor KW - Transkriptionsfaktor KW - Modulsuche KW - RNA Motivsuche KW - Modul KW - Module search KW - RNA motiv serach KW - module search Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248025 ER - TY - THES A1 - Bögelein, Anna T1 - Einfluss systemischer Therapeutika auf die CXCR4-Expression von Myelomzellen T1 - Influence of therapeutic agents on CXCR4 expression of myeloma cells N2 - Im Zuge der Bemühungen um neue, tumorspezifische Therapieansätze für die Myelomerkrankung hat sich der C-X-C-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) aufgrund seiner zentralen Rolle in der Tumorgenese als vielversprechender Angriffspunkt hervorgetan. Im Sinne eines theranostischen Konzepts wird der Rezeptor mithilfe eines radioaktiv markierten Liganden quantifiziert und anschließend von rezeptorspezifischen Radiotherapeutika als Zielstruktur genutzt. Die CXCR4-Expression ist allerdings ein höchst dynamischer Prozess mit großer inter- und intraindividueller Heterogenität, der u.a. durch eine begleitende Chemotherapie beeinflusst werden kann. Ob sich therapieinduzierte Veränderungen der Rezeptorexpression gezielt nutzen lassen, um die CXCR4-Expression zu optimieren und so die Effektivität der CXCR4-gerichteten Strategien zu steigern, wurde bislang nicht untersucht. Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene, in der Myelomtherapie etablierte Substanzen sowohl einzeln als auch in Kombination hinsichtlich ihres Einflusses auf die CXCR4-Expression von MM-Zelllinien und primären MM-Zellen unter in vitro Bedingungen analysiert. In den durchgeführten Experimenten zeigte sich eine hohe Variabilität der CXCR4-Expression der MM-Zellen nach Therapieinduktion, die sich als substanz-, dosis- und zeitabhängig herausstellte. Die Ergebnisse bestätigten das große Potenzial der therapieinduzierten Modulation der CXCR4-Expression. Im weiteren Verlauf sind translationale Forschungsansätze gerechtfertigt, die die Übertragbarkeit der in vitro gewonnenen Ergebnisse auf die komplexen Vorgänge im lebenden Organismus überprüfen. Langfristiges Ziel ist der Entwurf eines patientenzentrierten, multimodalen Therapiekonzepts, welches das CXCR4-gerichtete theranostische Konzept mit einer individuell angepassten, medikamentösen MM-Therapie kombiniert. N2 - In the course of developing new tumor specific therapeutic approaches for non-yet curable myeloma disease C-X-C chemokine receptor 4 (CXCR4) has emerged as a promising target due to its crucial role in myeloma tumorigenesis. Within a theranostic concept CXCR4 is quantified using radioactively labeled ligands and afterwards targeted by receptor-specific radiopharmaceuticals. However, CXCR4 expression is a very dynamic process with a high inter- and intraindividual heterogeneity which can be influenced by concomitant chemotherapy. Whether therapy induced changes in receptor expression can be used to enhance CXCR4 expression and thus to improve efficacy of CXCR4-based theranostics has not been examined so far. In this context the present study evaluated the effect of several anti-myeloma drugs (bortezomib, cyclophosphamide, dexamethasone, doxorubicin, lenalidomide) on CXCR4 expression of different human myeloma cell lines as well as patient-derived CD138+ plasma cells under in vitro conditions. Findings disclosed a high variability of CXCR4 expression on myeloma cells after drug application which turned out to be substance-, dose- and time-dependent. The results confirmed the high potential of therapy-induced modulation of CXCR4 expression. In further course, translational research approaches are justified to verify the transferability of the in vitro findings to the complex macro- and microenvironment in vivo. Long-term goal is the development of a patient-centered, multimodal therapy concept which combines CXCR4 based theranostics with a personalized drug-based therapy. KW - Plasmozytom KW - In vitro KW - Multiples Myelom KW - Theranostik KW - CXCR4 KW - Gallium-68 Pentixafor Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-241746 ER - TY - JOUR A1 - Scheiner, Ricarda A1 - Lim, Kayun A1 - Meixner, Marina D. A1 - Gabel, Martin S. T1 - Comparing the appetitive learning performance of six European honeybee subspecies in a common apiary JF - Insects N2 - The Western honeybee (Apis mellifera L.) is one of the most widespread insects with numerous subspecies in its native range. How far adaptation to local habitats has affected the cognitive skills of the different subspecies is an intriguing question that we investigate in this study. Naturally mated queens of the following five subspecies from different parts of Europe were transferred to Southern Germany: A. m. iberiensis from Portugal, A. m. mellifera from Belgium, A. m. macedonica from Greece, A. m. ligustica from Italy, and A. m. ruttneri from Malta. We also included the local subspecies A. m. carnica in our study. New colonies were built up in a common apiary where the respective queens were introduced. Worker offspring from the different subspecies were compared in classical olfactory learning performance using the proboscis extension response. Prior to conditioning, we measured individual sucrose responsiveness to investigate whether possible differences in learning performances were due to differential responsiveness to the sugar water reward. Most subspecies did not differ in their appetitive learning performance. However, foragers of the Iberian honeybee, A. m. iberiensis, performed significantly more poorly, despite having a similar sucrose responsiveness. We discuss possible causes for the poor performance of the Iberian honeybees, which may have been shaped by adaptation to the local habitat. KW - adaptation KW - Apis mellifera KW - olfactory learning KW - proboscis extension response KW - sucrose responsiveness KW - genetic diversity Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-245180 SN - 2075-4450 VL - 12 IS - 9 ER - TY - INPR A1 - Dandekar, Thomas T1 - Our universe may have started by Qubit decoherence N2 - Our universe may have started by Qubit decoherence: In quantum computers, qubits have all their states undefined during calculation and become defined as output (“decoherence”). We study the transition from an uncontrolled, chaotic quantum vacuum (“before”) to a clearly interacting “real world”. In such a cosmology, the Big Bang singularity is replaced by a condensation event of interacting strings. This triggers a crystallization process. This avoids inflation, not fitting current observations: increasing long-range interactions limit growth and crystal symmetries ensure the same laws of nature and basic symmetries over the whole crystal. Tiny mis-arrangements provide nuclei of superclusters and galaxies and crystal structure allows arrangement of dark (halo regions) and normal matter (galaxy nuclei) for galaxy formation. Crystals come and go: an evolutionary cosmology is explored: entropic forces from the quantum soup “outside” of the crystal try to dissolve it. This corresponds to dark energy and leads to a “big rip” in 70 Gigayears. Selection for best growth and condensation events over generations of crystals favors multiple self-organizing processes within the crystal including life or even conscious observers in our universe. Philosophically this theory shows harmony with nature and replaces absurd perspectives of current cosmology. Independent of cosmology, we suggest that a “real world” (so our everyday macroscopic world) happens only inside a crystal. “Outside” there is wild quantum foam and superposition of all possibilities. In our crystallized world the vacuum no longer boils but is cooled down by the crystallization event, space-time exists and general relativity holds. Vacuum energy becomes 10**20 smaller, exactly as observed in our everyday world. We live in a “solid” state, within a crystal, the n quanta which build our world have all their different m states nicely separated. There are only nm states available for this local “multiverse”. The arrow of entropy for each edge of the crystal forms one fate, one world-line or clear development of our world, while layers of the crystal are different system states. Mathematical leads from loop quantum gravity (LQG) point to required interactions and potentials. Interaction potentials for strings or loop quanta of any dimension allow a solid, decoherent state of quanta challenging to calculate. However, if we introduce here the heuristic that any type of physical interaction of strings corresponds just to a type of calculation, there is already since 1898 the Hurwitz theorem showing that then only 1D, 2D, 4D and 8D (octonions) allow complex or hypercomplex number calculations. No other hypercomplex numbers and hence dimensions or symmetries are possible to allow calculations without yielding divisions by zero. However, the richest solution allowed by the Hurwitz theorem, octonions, is actually the observed symmetry of our universe, E8. Standard physics such as condensation, crystallization and magnetization but also solid-state physics and quantum computing allow us to show an initial mathematical treatment of our new theory by LQG to describe the cosmological state transformations by equations, and, most importantly, point out routes to parametrization of free parameters looking at testable phenomena, experiments and formulas that describe processes of crystallization, protein folding, magnetization, solid-state physics and quantum computing. This is presented here for LQG, for string theory it would be more elegant but was too demanding to be shown here. Note: While my previous Opus server preprint “A new cosmology of a crystallization process (decoherence) from the surrounding quantum soup provides heuristics to unify general relativity and quantum physics by solid state physics” (https://doi.org/10.25972/OPUS-23076) deals with the same topics and basic formulas, this new version is improved: clearer in title, better introduction, more stringent in its mathematics and improved discussion of the implications including quantum computing, hints for parametrization and connections to LQG and other current cosmological efforts. This 5th of June 2021 version is again an OPUS preprint, but this will next be edited for Archives https://arxiv.org. KW - cosmology KW - quantum computing KW - loop quantum gravity KW - qubit KW - decoherence KW - crystallization Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239181 ER - TY - THES A1 - Goos, Carina T1 - Nuclear periphery granules of trypanosomes - A characterization of composition and function T1 - Nuclear periphery granules in Trypanosomen - Eine Charakterisierung in Komposition und Funktion N2 - The nuclear envelope serves as important mRNA surveillance system. In yeast and humans, several control mechanisms act in parallel to prevent nuclear export of unprocessed mRNAs. However, trypanosomes lack homologues to most of the proteins involved. In addition, gene expression in trypanosomes relies almost completely on post-transcriptional regulation as they transcribe mRNAs as long polycistrons, which are subsequently processed into individual mRNA molecules by trans-splicing. As trans-splicing is not error-free, unspliced mRNAs may be recognized and prevented from reaching the cytoplasm by a yet unknown mechanism. When trans-splicing is inhibited in trypanosomes, the formation of a novel RNA granule type at the cytoplasmic periphery of the nucleus, so called nuclear periphery granules (NPGs) was previously observed. To identify potential regulators of nuclear export control, changes in protein localization which occur when trans-splicing is inhibited, were globally analyzed during this work. For this, trypanosome nuclei were purified under conditions maintaining NPG attachment to the nucleus, in the absence and presence of trans-splicing. Mass spectrometry analyses identified 128 proteins which are specifically enriched in nuclear preparations of cells inhibited for trans-splicing. Amongst them are proteins, which change their localization to the nucleus or to the nuclear pores as well as many proteins that move into NPGs. Some of these proteins are promising candidates for nuclear export control proteins, as the changes in localization (to the nucleus or nuclear pores) were specific to the accumulation of unspliced mRNAs. The NPG proteome almost exclusively contains proteins involved in mRNA metabolism, mostly unique to trypanosomes, notably major translation initiation factors were absent. These data indicate that NPGs are RNP complexes which have started or completed nuclear export, but not yet entered translation. As a byproduct of these proteomic studies, a high-quality dataset of the yet unknown T. brucei nuclear proteome is provided, closing an important gap in knowledge to study trypanosome biology, in particular nuclear related processes. NPGs were characterized in more detail by microscopy. The granules are cytoplasmic and present in at least two different trypanosome life cycle stages. There are at least two distinct granule subsets, with differences in protein composition. A closer analysis of NPGs by electron microscopy revealed that the granules are electron dense structures, which are connected to nuclear pores by string-like structures. In order to approach the function of NPGs, on the one hand, the hypothesis that NPGs might be related to perinuclear germ granules of adult gonads of C. elegans was tested: we found no relation between the two granule types. On the other hand, initial single molecule mRNA FISH experiments performed in trypanosomes showed no accumulation of unspliced transcripts in NPGs, arguing against an involvement of the granules in mRNA quality control. N2 - Die Kernhülle um den Zellkern dient als wichtiges mRNA-Überwachungssystem in Eukaryoten. Bei Hefen und Menschen wirken dabei beispielsweise mehrere Kontrollmechanismen parallel, um den Export von unverarbeiteten mRNAs aus dem Kern heraus zu verhindern. Trypanosomen fehlen jedoch Homologe zu den Meisten hierbei beteiligten Proteinen. Außerdem basiert Genexpression in Trypanosomen fast ausschließlich auf posttranskriptioneller Kontrolle, da die Parasiten mRNAs als lange Polycistrons transkribieren, die anschließend durch Transspleißen zu einzelnen mRNA-Molekülen verarbeitet werden. Da der Prozess des Transspleißen nicht fehlerfrei zu sein scheint, gibt es möglicherweise einen noch unbekannten Mechanismus, der nicht gespleißte mRNAs erkennt und diese daran hindert, das Zytoplasma zu erreichen. Unter Bedingungen, in denen Transspleißen in Trypanosomen blockiert ist, konnte eine neue Art von RNA-Granula an der zytoplasmatischen Peripherie des Zellkerns beobachtet werden, sogenannte Nuclear Periphery Granules (NPGs). Um potentielle Regulatoren einer Kontrolle des mRNA-Exports zu identifizieren, wurde während dieser Arbeit umfassend analysiert, inwieweit sich die Lokalisation von Proteinen ändert, wenn Transspleißen gehemmt wird. Zu diesem Zweck wurden Zellkerne von Trypanosomen unter Bedingungen aufgereinigt, bei denen die Bindung der NPGs an den Zellkern in Abwesenheit und Gegenwart von Transspleißen erhalten blieb. Mit Hilfe von massen-spektrometrischen Analysen konnten 128 Proteine identifiziert werden, die spezifisch in den Kernpräparaten von Zellen angereichert sind, in denen Transspleißen blockiert ist. Darunter befinden sich Proteine, die ihre Lokalisation in den Kern hinein oder zu den Kernporen hin verändern, sowie viele Proteine, die sich in NPGs bewegen. Einige dieser Proteine stellen vielversprechende Kandidaten für eine potenzielle Rolle in der Kernexportkontrolle dar, da die Veränderungen in der Lokalisation (zum Kern oder zu den Kernporen) spezifisch für die Akkumulation von nicht gespleißten mRNAs waren. Das hier erarbeitete NPG-Proteom enthält fast ausschließlich Proteine, die am mRNA-Metabolismus beteiligt sind und nur in Trypanosomen vorkommen. Insbesondere fehlen im NPG-Proteom wichtige Translationsinitiationsfaktoren. Die Daten zeigen, dass NPGs RNP-Komplexe sind, die den Export aus dem Zellkern bereits begonnen oder abgeschlossen haben, aber noch nicht mit dem Translationsprozess begonnen haben. Als Nebenprodukt dieser proteomischen Analyse, kann ein qualitativ hochwertiger Datensatz des noch unbekannten Kernproteoms von T. brucei bereitgestellt werden. Damit wird eine wichtige Wissenslücke bei der Forschung zur Trypanosomenbiologie, insbesondere zu nuklearen Prozessen geschlossen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden außerdem NPGs anhand mikroskopischer Untersuchungen detaillierter charakterisiert. Die Granula sind zytoplasmatisch und liegen in mindestens zwei verschiedenen Lebenszyklusstadien von Trypanosomen vor. Es gibt mindestens zwei Untergruppen der Granula mit Unterschieden in der Proteinzusammensetzung. Eine genauere elektronenmikroskopische Analyse ergab, dass es sich bei NPGs um elektronendichte Strukturen handelt, die durch fadenartige Strukturen mit den Kernporen verbunden sind. Um mehr über die potenzielle Funktion von NPGs herauszufinden, wurde zum einen die Hypothese untersucht, dass NPGs mit perinuklearen Keimgranula adulter Gonaden in C. elegans verwandt sind: Es konnte keine Beziehung zwischen den beiden Granulatypen gefunden werden. Zum anderen zeigten erste Experimente mittels Einzelmolekül-mRNA-FISH in Trypanosomen keine Akkumulation von ungespleißten Transkripten in NPGs, was gegen eine Beteiligung an mRNA-Qualitätskontrollmechanismen spricht. KW - Trypanosoma brucei KW - Kinetoplastida KW - Rnsstoffwechsel KW - Nuclear periphery granules KW - RNA granules KW - Nuclear export control KW - Trypanosomes Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-234368 ER - TY - THES A1 - Claßen, Alexandra T1 - The ERK-cascade in the pathophysiology of cardiac hypertrophy T1 - Die ERK-Kaskade in der Pathophysiologie der Herzhypertrophie N2 - ERK1/2 are known key players in the pathophysiology of heart failure, but the members of the ERK cascade, in particular Raf1, can also protect the heart from cell death and ischemic injury. An additional autophosphorylation (ERK1 at Thr208, ERK2 at Thr188) empowers ERK1/2 translocation to the nucleus and phosphorylation of nuclear targets which take part in the development of cardiac hypertrophy. Thereby, targeting this additional phosphorylation is a promising pharmacological approach. In this thesis, an in silico model of ERK cascade in the cardiomyocyte is introduced. The model is a semi-quantitive model and its behavior was tested with different softwares (SQUAD and CellNetAnalyzer). Different phosphorylation states of ERK1/2 as well as different stimuli can be reproduced. The different types of stimuli include hypertrophic as well as non-hypertrophic stimuli. With the introduced in-silico model time courses and synergistic as well as antagonistic receptor stimuli combinations can be predicted. The simulated time courses were experimentally validated. SQUAD was mainly used to make predictions about time courses and thresholds, whereas CNA was used to analyze steady states and feedback loops. Furthermore, new targets of ERK1/2 which partially contribute, also in the formation of cardiac hypertrophy, were identified and the most promising of them were illuminated. Important further targets are Caspase 8, GAB2, Mxi-2, SMAD2, FHL2 and SPIN90. Cardiomyocyte gene expression data sets were analyzed to verify involved components and to find further significantly altered genes after induced hypertrophy with TAC (transverse aortic constriction). Changes in the ultrastructure of the cardiomyocyte are the final result of induced hypertrophy. N2 - ERK1/2 sind bekannte Schlüsselfiguren bei der Entstehung der Herzinsuffizienz. Weitere Komponenten der ERK-Kaskade, insbesondere Raf1, können das Herz jedoch vor Zelltod und ischämischem Schaden schützen. Eine zusätzliche Autophosphorylierung von ERK1 an Thr208 bzw. von ERK2 an Thr188 ermöglicht ERK1/2 die Translokation zum Zellkern und befähigt ERK dort zur Phosphorylierung von nukleosolischen Zielproteinen, welche eine Herzmuskelhypertrophie auslösen. Daher erscheint diese zusätzliche Autophosphorylierung als eine vielversprechende pharmakologische Zielstruktur. In dieser Arbeit wird ein in-silico Modell der ERK-Kaskade im Kardiomyozyten präsentiert. Das Modell ist ein semi-quantitatives Modell und wurde mit den Programmen SQUAD und CellNetAnalyzer getestet. Verschiedene Phosphorylierungs-Zustände von ERK1/2 als auch verschiedene Stimuli (hypertrophe als auch nicht-hypertrophe) können mit dem Modell reproduziert werden. Mit dem präsentierten in-silico Modell können sowohl zeitliche Abläufe als auch synergistische und antagonistische Effekte vorhergesagt werden. Die simulierten zeitlichen Abläufe wurden durch in-vitro Experimente validiert. SQUAD wurde hauptsächlich für die Modellierung von zeitlichen Abläufen und Schwellenwerte genutzt, wohingegen CellNetAnalyzer vor allen Dingen zur Analyse von Fließgleichgewichten und Rückkopplungs-Mechanismen genutzt wurde. Darüberhinaus wurden Zielstrukturen von ERK1/2, welche zusätzlich an der Entstehung der Herzhypertrophie mitwirken, identifiziert. Diese umfassen unter anderem Caspase 8, GAB2, Mxi-2, SMAD2, FHL2 und SPIN90. Gen-Expressions-Datensätze von Kardiomyozyten nach TAC (transverse aortic constriction) wurden analysiert. Diese wurden mit den im Model vorhandenen Strukturen verglichen und signifikant veränderte Expressionslevel wurden identifiziert. Veränderungen der Ultrastruktur des Kardiomyozyten sind das Ergebnis der induzierten Hypertrophie. KW - Herzhypertrophie KW - Systembiologie KW - ERK-cascade KW - ERK-Kaskade KW - cardiac hypertrophy KW - in-silico model KW - In-silico Modell Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229664 ER -