TY - THES A1 - Engert, Jonas T1 - Untersuchung neuronaler Stammzellen des Colliculus inferior der Ratte im zeitlichen Verlauf T1 - Analysis of neural stem cells of the rat inferior colliculus in the course of time N2 - Neural stem cells (NSCs) have been recently identified in the inferior colliculus (IC). These cells are of particular interest, as no casual therapeutic options for impaired neural structures exist. This research project aims to evaluate the neurogenic potential in the rat IC from early postnatal days until adulthood. The IC of rats from postnatal day 6 up to 48 was examined by neurosphere assays and histological sections. In free-floating IC cell cultures, neurospheres formed from animals from early postnatal to adulthood. The amount of generated neurospheres decreased in older ages and increased with the number of cell line passages. Cells in the neurospheres and the histological sections stained positively with NSC markers (Doublecortin, Sox-2, Musashi-1, Nestin, and Atoh1). Dissociated single cells from the neurospheres differentiated and were stained positively for the neural lineage markers β-III-tubulin, glial fibrillary acidic protein, and myelin basic protein. In addition, NSC markers (Doublecortin, Sox-2, CDK5R1, and Ascl-1) were investigated by qRT-PCR. In conclusion, a neurogenic potential in the rat IC was detected and evaluated from early postnatal days until adulthood. The identification of NSCs in the rat IC and their age-specific characteristics contribute to a better understanding of the development and the plasticity of the auditory pathway and might be activated for therapeutic use. N2 - Neuronale Stammzellen wurden kürzlich im unteren Colliculus inferior (CI) identifiziert. Diese Zellen sind von besonderem Interesse, da es keine therapeutischen Optionen für geschädigte neuronale Strukturen gibt. Ziel dieses Forschungsprojekts ist es, das neurogene Potenzial im CI der Ratte von den ersten postnatalen Tagen bis zum Erwachsenenalter zu untersuchen. Der CI von Ratten vom 6. bis zum 48. postnatalen Tag wurde mit Neurosphären-Assays und histologischen Schnitten untersucht. In frei schwimmenden CI-Zellkulturen bildeten sich Neurosphären bei Tieren vom frühen postnatalen Alter bis zum Erwachsenenalter. Die Menge der gebildeten Neurosphären nahm im höheren Alter ab und stieg mit der Anzahl der Zelllinienpassagen. Die Zellen in den Neurosphären und die histologischen Schnitte zeigten eine positive Färbung mit neuronalen Stammzell-Markern (Doublecortin, Sox-2, Musashi-1, Nestin und Atoh1). Dissoziierte Einzelzellen aus den Neurosphären differenzierten und wurden positiv für die neuralen Abstammungsmarker β-III-Tubulin, GFAP und MBP angefärbt. Darüber hinaus wurden neuronalen Stammzell-Marker (Doublecortin, Sox-2, CDK5R1 und Ascl-1) mittels qRT-PCR untersucht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein neurogenes Potenzial im CI der Ratte von den frühen postnatalen Tagen bis zum Erwachsenenalter nachgewiesen und bewertet wurde. Die Identifizierung von neuronalen Stammzellen im CI der Ratte und ihre altersspezifischen Merkmale tragen zu einem besseren Verständnis der Entwicklung und der Plastizität der Hörbahn bei und könnten für eine therapeutische Nutzung aktiviert werden. KW - Colliculus inferior KW - Neurogenesis KW - Stem cells KW - Neuronale Stammzellen KW - Neural Stem cells KW - Colliculus inferior KW - Adulte Neurogenese KW - Hörbahn KW - Inferior colliculus KW - adult neurogenesis KW - auditory pathway Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-282642 ER - TY - THES A1 - Wagner, Julia T1 - Untersuchung von Rezeptoren und G-Proteinen mittels Einzelmolekülfluoreszenztechniken T1 - Investigation of receptors and G-proteins using single molecule fluorescence techniques N2 - In dieser Arbeit wurden Einzelmolekültechniken zur Untersuchung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und G-Proteinen in der Zellmembran lebender Zellen etabliert und angewendet. GPCR stellen die größte Familie membrangebundener Rezeptoren dar und leiten Signale über heterotrimere G-Proteine in das Zellinnere weiter. Auch wenn jüngst sowohl inaktive, als auch aktive Konformationen von GPCR und G-Proteinen mittels Röntgenstrukturanalyse aufgelöst werden konnten, sind die Dynamiken ihrer Aktivierung und Deaktivierung bisher nur bruchstückhaft bekannt. In der Vergangenheit wurden die Schritte der Signalkaskade, beginnend mit der Bindung des Rezeptorliganden bis hin zur Bildung von sekundären Botenstoffen, erfolgreich mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Techniken aufgeklärt. Diesen experimentell bestimmten Aktivierungszeiten stehen Daten aus Modellierungsstudien gegenüber, die sehr viel schnellere Konformationsänderungen vorhersagen, welche bereits in Studien mittels Kernspinresonanzspektroskopie nachgewiesen werden konnten. Folglich ist anzunehmen, dass die Zeitdomäne, innerhalb der die Aktivierung der GPCR stattfindet, sehr breit gefächert ist. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diese mehrere Größenordnungen umfassenden Zeitskalen der GPCR-Aktivierung, welche in der Literatur beschrieben werden, mittels bildgebender Einzelmolekülverfolgung (SPT) und Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) zu untersuchen. Beide Verfahren liefern durch Einzelmolekülspuren oder Korrelationskurven eine Art Fingerabdruck des dynamischen Verhaltens des untersuchten Systems, was jeweils mit Vor- und Nachteilen verbunden ist. Die Stärke der Techniken zeigte sich bei dem vorliegenden Projekt vor allem in ihrer Kombination: Die klassische FCS bietet die Möglichkeit, Dynamiken über einen weiten Zeitraum von Mikrosekunden bis Sekunden auszuwerten, allerdings nur innerhalb eines kleinen, optisch definierten Detektionsvolumens. Die bildgebende Einzelmolekülverfolgung liefert hingegen ein großes Sichtfeld und ermöglicht somit die parallele Analyse vieler Einzelmolekülereignisse über die Zelle verteilt, jedoch auf Kosten der Zeitauflösung. Durch die Anwendung von SPT und FCS konnte in dieser Arbeit ein Zeitbereich der Rezeptor- (und G-Protein-) Dynamiken von Mikrosekunden bis Sekunden gefunden und diskutiert werden. Um die selektive Anregung der Plasmamembran zu gewährleisten, wurde die Interne Totalreflexionsfluoreszenzanregung verwendet. Diese eignet sich ideal als Grundlage für die spätere Analyse mittels SPT und FCS, welche komplementär nutzbar sind und mit dem gleichen zellulären Assay und unter Verwendung der gleichen Fluoreszenzmarker betrieben werden können. Die Studie am Beispiel der α2A- und β2-adrenergen Rezeptoren sowie des Gαi1-Proteins demonstrierte das enorme Potential dieser Einzelmolekültechniken für die Untersuchung von GPCR und skizziert die Komplexität deren Dynamik, wie sie auch durch neueste Modellierungsstudien vorhergesagt wird. N2 - In this work single molecule techniques for the investigation of G-protein coupled-receptors (GPCR) and G-proteins in living cells were established and applied. GPCR constitute the largest family of membrane bound receptors and transduce extracellular stimuli via heterotrimeric G-proteins. Very recently inactive as well as active conformations of GPCR and G-proteins have been deduced from X-ray crystallography. Nevertheless, only little is known about the dynamics of receptor activation and deactivation. Techniques based on Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) have allowed for the study of the GPCR signaling cascade from ligand binding up to second messenger generation. However, the reported activation times based on such FRET investigations seem to contradict data from molecular modelling studies which predict much faster conformational changes and are supported by recent Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy data. Thus, the timescale of GPCR activation remains actively debated, and is quite likely widely spread. One objective of this work was to experimentally probe this orders-of-magnitude broad time scale for GPCR activation reported in the literature using Single Particle Tracking (SPT) and Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). By directly probing the dynamic behavior via both single particle traces and correlation curves, the advantages and disadvantages offered by each technique can be compensated. In combination SPT and FCS pool forces: Classical FCS allows evaluating dynamics within a broad time domain from the microsecond to the second range. The compromised small ‘field of observation’ comes with the advantage of high temporal resolution. By contrast, SPT allows parallel analysis of many single receptor or G-protein events distributed over at least the dimension of a single cell, however with lower temporal resolution. In this study the application of FCS and SPT allowed for the detection of receptor (and G-protein) dynamics. Selective illumination of the plasma membrane was achieved by using Total Internal Reflection Fluorescence. Data was subsequently analyzed by SPT as well as FCS, both methods working with the same cellular assay as well as fluorescent probes. Exemplarily investigating the α2A- and β2-adrenergic receptor as well as the Gαi1-protein, uncovers a wide timescale of receptor dynamics from microseconds to seconds, closing the gap between times that already could have been solved with other fluorescent techniques such as FRET. This study reveals the enormous potential of single molecule methods for the investigation of GPCR and delineates the complexity of GPCR dynamics as recently predicted by molecular modelling. KW - G-Protein-gekoppelte Rezeptoren KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - single particle tracking Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118281 ER - TY - THES A1 - Leinweber, Jonas T1 - Untersuchung zur pathophysiologischen Rolle und therapeutischen Relevanz der neuen Inhibitoren der plasmatischen Blutgerinnung Agaphelin und Ixolaris im experimentellen Schlaganfallmodell der Maus T1 - Characterization of the pathophysiological role and therapeutic relevance of the new inhibitors of plasmatic blood coagulation Agaphelin and Ixolaris in the model of ischemic stroke in mice N2 - Beim ischämischen Schlaganfall führt ein thrombotischer Verschluss von gehirnversorgenden Arterien zu einer akuten Durchblutungsstörung, mit der Folge von neurologischen Defiziten. Primäres Therapieziel ist es, diese Blutgerinnsel aufzulösen, um die Sauerstoffversorgung des Gehirns wiederherzustellen und den ischämischen Hirnschaden zu begrenzen. Dazu stehen die intravenösen Thrombolyse mit rt-PA (rekombinanter Gewebe-Plasminogen-Aktivator) sowie die endovaskuläre mechanische Thrombektomie zur Verfügung. Häufig kann ein Schlaganfall, trotz erfolgreicher Rekanalisation der Gefäße, zu einer weiteren Größenzunahme des Infarktes und neurologischen Defiziten bei den Patienten führen. Diese Größenzunahme beruht zum einen auf einem sich entwickelnden Hirnödem und zum anderen auf entzündlichen Prozessen. Zahlreiche Hinweise deuten darauf hin, dass der Schlaganfall ein Zusammenspiel aus thrombotischen und entzündlichen Ereignissen ist, ein Phänomen, das als Thromboinflammation bezeichnet wird. Aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten ist die Entwicklung neuer Therapieansätze für den ischämischen Schlaganfall besonders wichtig. Agaphelin und Ixolaris sind Proteine aus den Speicheldrüsen von Hämatophagen, für welche in früheren Studien eine starke antithrombotische Wirkung bei gleichzeitig geringem Blutungsrisiko nachgewiesen wurde. Diese möglichen antithrombotischen Effekte wurden in dieser Studie im Hinblick auf ihre Wirksamkeit und Sicherheit im Mausmodell der zerebralen Ischämie untersucht. Die Behandlung der Mäuse mit Agaphelin 1 Stunde nach transienter Okklusion der Arteria cerebri media (tMCAO) führte zu kleineren Schlaganfallvolumina und geringeren neurologischen Defiziten an Tag 1 nach dem Schlaganfall. Die Mortalität der Mäuse war bis Tag 7 deutlich gesunken. Aus klinischer Sicht ist ebenfalls relevant, dass der starke antithrombotische Effekt von Agaphelin im Mausmodell nicht mit einem erhöhten Risiko für intrazerebrale Blutungen einherging. Diesem protektiven Effekt von Agaphelin lagen eine verminderte intrazerebrale Thrombusbildung, eine abgeschwächte Entzündungsantwort und eine Stabilisierung der Blut-Hirn-Schranke sowie eine Reduzierung der Apoptose zugrunde. Nach der Gabe von Ixolaris 1 Stunde nach tMCAO waren zwar signifikant geringere Infarktgrößen messbar, diese führten allerdings nicht zu einer Verbesserung der neurologischen Defizite. Zudem verursachte die Gabe von Ixolaris schon 24 Stunden nach tMCAO erhebliche intrazerebrale Blutungen und auch die Mortalität der Mäuse war zu diesem Zeitpunkt bereits erhöht. Aufgrund dieser massiven Nebenwirkungen scheint Ixolaris kein geeigneter Kandidat für eine humane Anwendung zu sein. Bei Agaphelin hingegen könnte es sich um einen vielversprechenden Kandidaten für die Behandlung des ischämischen Schlaganfalls handeln. Vor einer möglichen Testung von Agaphelin in klinischen Studien, sind weitere translationale Untersuchungen notwendig, um ein noch präziseres Verständnis für die Wirksamkeit und Sicherheit von Agaphelin zu gewinnen. Insgesamt stellt die Hemmung thromboinflammatorischer Prozesse, ohne eine Erhöhung der Blutungskomplikationen, eine vielversprechende Option zur Behandlung des ischämischen Schlaganfalls dar. N2 - Thrombotic occlusion of cerebral vessels is an important process in pathogenesis of ischemic stroke resulting in lack of blood supply of the brain and neurological deficits. In order to restore the oxygenation of the brain and to limit brain injury, recanalization of the occluded vessels is the therapeutic main goal of stroke treatment. So far, the only proven pharmacological intervention for thrombolysis is the recombinant tissue-type plasminogen activator. For recanalization of larger arteries endovascular thrombectomy was established as a mechanic intervention. Nevertheless, despite successful recanalization ischemic brain damage and neurological deficits evolve. Increased size of infarct lesions develop due to brain edema and inflammatory processes. Moreover, there is evidence that inflammation and thrombosis are linked, which has led to the concept of thromboinflammation. Due to the limited treatment strategies in stroke management, the development of new therapeutic approaches for ischemic stroke is particularly important. Recent studies have shown that the hematophagous salivary gland proteins Agaphelin and Ixolaris exhibit multiple antithrombotic effects without promoting a risk of bleeding. To investigate the potentially safe antithrombotic effects, Agaphelin and Ixolaris were tested in a mouse model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO). Treatment of mice with Agaphelin 1 hour after tMCAO resulted in smaller infarct volumes and an improved neurological function on day one after stroke. Up to seven days after stroke the mortality rate was significantly reduced. This protective effect was due to reduced local thrombus formation, a reduced inflammatory response and less severe blood-brain-barrier damage as well as reduced apoptosis. Moreover, it is important to mention, that the strong protective effect of Agaphelin was not linked to an increased risk of intracerebral bleeding. Treatment of mice with Ixolaris one hour after tMCAO leads to significantly smaller infarct sizes. However, neurologic deficits did not improve after treatment with Ixolaris. Furthermore, risk of intracerebral bleeding and mortality rates were significantly increased 24 hours after treatment with Ixolaris. Due to these severe side effects, Ixolaris does not seem to be an appropriate candidate for human therapy. Nevertheless, Agaphelin appears to be a promising component for ischemic stroke treatment, but further translational studies should be performed before testing Agaphelin in clinical stroke trials. Overall, the inhibition of thromboinflammatory effects without increased bleeding reflects a promising option for successful ischemic stroke treatment. KW - Schlaganfall KW - antithrombotic KW - inflammation KW - stroke KW - Agaphelin KW - Ixolaris KW - Thromboinflammation KW - Experimenteller Schlaganfall Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-252921 ER - TY - THES A1 - Jürgens, Constantin Johannes Sebastian T1 - Untersuchungen zum antiproliferativen Potential von Stoffwechselinhibitoren bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen T1 - Investigations on antiproliferative potential of metabolism inhibibitors in the presence of tumor physiological concentrations of oxygen N2 - Das Ziel der Arbeit war zu untersuchen, ob der Stoffwechsel kolorektaler Karzi-nomzellen geeignete Targetstrukturen für mögliche therapeutische Ansätze aufweist. In Krebszellen induziert sowohl der Warburg-Effekt bei Normoxie als auch die anaerobe Glykolyse bei Hypoxie eine massive Bildung von Laktat. Wird die Krebszelle dauerhaft daran gehindert, die für die Glykolyse notwendi-gen Reduktionsäquivalente NADH+H+ mit Hilfe der Laktatdehydrogenase zu reoxidieren und/oder Laktat über die Transporter MCT1 und MCT4 nach außen zu schleusen, dann löst diese Kombination aus Mangelsituation und intrazellulärer Ansäuerung den apoptotischen Zelltod aus. Für die Situation in vivo ist entscheidend, dass auch Zellen von Normalgeweben zwar Laktat in Hypoxie bilden, dies jedoch keine vorherrschende physiologische Situation darstellt. Die Hemmstoffe Natriumoxamat (NaOx) für die Laktatdehydrogenase und α-Cyano-4-Hydroxycinnamat (αCHC) für MCT1 und MCT4 wurden an den sechs humanen kolorektalen Karzinomzelllinien Colo741, HCT116, HT29, LS174T, SW620 und WiDr untersucht. Zusätzlich wurde der Glukoseverbrauch und die Laktatbildung bestimmt und die Funktion der Atmungskette überprüft. Die IC50-Werte für 5-FU, NaOx und αCHC wurden bestimmt und danach NaOx in einer Konzentration von 40x10-3 mol/L, αCHC in einer Konzentration von 2x10-3 mol/L und 5-FU in einer Konzentration von 5x10-6 mol/L eingesetzt. Die Zellen wurden bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen von 5 % und 1 % Sauerstoff für bis zu 120 Stunden inkubiert. Die Funktion der Atmungskette in den Mitochondrien der kolorektalen Karzi-nomzellen wurde u. a. durch Bestimmung wichtiger Kenngrößen wie dem P:O Quotienten und des respiratorischen Kontrollindex (RKI) nachgewiesen. Fünf der sechs Karzinomzelllinien wiesen im Vergleich zur Kontrollzelllinie J774 einen verringerten P:O-Quotienten und respiratorischen Kontrollindex (RKI) auf, was darauf hindeutet, dass die Funktion der Mitochondrien dieser Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen zwar verringert war, aber nicht vollständig aufgehoben. Dieses Ergebnis stützt die allgemein akzeptierte Auffassung, dass die meisten Tumore über funktionelle Mitochondrien verfügen. Durch die Analyse des Glukosestoffwechsels wurden die sechs kolorektalen Zelllinien, die einen unterschiedlich stark ausgeprägten glykolytischen Phänotyp aufwiesen, nach der Stärke der Laktatbildung bei 5 % Sauerstoff in drei Kategorien eingeordnet. Zudem wurde für jede der sechs Zelllinien die Expression von LDH-A, LDH-B sowie MCT-1 und MCT-4 auf Proteinebene nachgewiesen. Wesentliches Ziel der Untersuchungen war die Überprüfung des antiprolife-rativen Potentials der beiden Inhibitoren NaOx und αCHC einzeln oder in Kombination mit 5-FU bei den tumorspezifischen Sauerstoffkonzentrationen von 5 % und 1 %. Die Kombination aus NaOx und αCHC induzierte bei 1 % Sauerstoff nach 9 Tagen in Kultur zytotoxische Effekte und war damit so wirksam wie 5x10-6 mol/L 5-FU. Die Zugabe von 5-FU zur Kombination aus NaOx und αCHC führte zu keiner Steigerung des zelltoxischen Effektes. Die beiden Inhibitoren NaOx und αCHC waren für SW620 Zellen weniger wirksam als für Zellen der anderen fünf Zelllinien. Das mehr „oxidative“ Profil von SW620 Zellen (bester P:O-Quotient, geringste Laktatbildung bei 5 % und 1 % Sauerstoff; zudem die höchsten IC50-Werte für NaOx und αCHC) könnte erklären, warum die beiden Stoffwechselinhibitoren, die einen glykolytischen Phänotyp (starke Bildung von Laktat) erfordern, für SW620 Zellen von geringerer Wirksamkeit waren. Für die Hemmstoffe NaOx und αCHC wurden zytostatische bzw. zytotoxische Effekte in kolorektalen Karzinomzellen gezeigt. Dies deutet darauf hin, dass Krebszellen auf einen ungehinderten glykolytischen Stoffwechsel angewiesen sind. Für beide Hemmstoffe wurde ebenfalls gezeigt, dass sie auch bei tumorre-levanten Sauerstoffkonzentrationen von 5 % und 1 % wirksam sind. N2 - The aim of the thesis was to investigate whether the metabolism of colorectal carcinoma cells can provide suitable target structures for possible therapeutic approaches. Both the Warburg effect, in the case of normoxia, and anaerobic glycolysis, in the case of hypoxia, induce a massive production of lactate in cancer cells. If a cancer cell can be permanently prevented from reoxidising reduction equivalents NADH+H+ with the help of lactate dehydrogenase, which is necessary for glycolysis, and/or the removal of lactate via the transporters MCT1 and MCT4 can be inhibited, then this combination of a deficiency and intracellular acidification results in the apoptotic death. As far as the in vivo situation is concerned, it is crucial that cells from normal tissue also produce lactate in hypoxia, but that this does not constitute a predominant physiological situation. Sodium oxamate (NaOx), an inhibitor for the lactate dehydrogenase and α-cyano-4-hydroxy cinnamate (αCHC), an inhibitor for MCT 1 and MCT 4 were examined in the six human colorectal carcinoma cell lines Colo741, HCT116, HT29, LS174T, SW620 and WiDr. In addition, glucose consumption and lactate production were determined as well as the function of the respiratory chain. The half maximal inhibitory concentration (IC50) for 5-FU, NaOx, and αCHC was determined and NaOx was used in a concentration of 40x10-3 mol/L, αCHC in a concentration of 2x10-3 mol/L and 5-FU in a concentration von 5x10-6 mol/L. The cells were incubated for up to 120 hours at tumour physiological concentrations of oxygen of 5% and 1%. The respiratory chain function in the mitochondria of colorectal carcinoma cells was verified by determining the P:O quotient and the respiratory control index (RCI), two important parameters for respiratory chain function. Five of the six carcinoma cell lines showed a reduced P:O quotient and respiratory control index (RCI), when compared to control cell line J774. These results indicate that the mitochondria of these cells were malfunctioning, but not fully defective. This finding supports the generally accepted view that most tumours possess functional mitochondria. By analysing the glucose metabolism of the six colorectal cell lines, which showed varying degrees of glycolytic phenotype,these cells were ranked into three categories according to the amount of lactate production at 5% oxygen. Moreover, the expression of LDH-A, LDH-B and MCT-1 and MCT-4 at protein level was confirmed for each of the six cell lines. The main focus of the work was to verify the antiproliferative potential of the two inhibitors NaOx and αCHC alone and in combination with 5-FU in the presence of tumour-specific oxygen concentrations of 5% and 1%. At 1% oxygen the combination of NaOx and αCHC induced cytotoxic effects after 9 days of culture, making it as effective as 5x10-6 mol/L 5-FU. The addition of 5-FU to the combination of NaOx and αCHC did not increase the cell-toxic effect. NaOx and αCHC were less effective for SW620 cells then in the other five cell lines. The more "oxidative" profile of SW620 cells (best P:O quotient, least amount of lactate production at 5% and 1% oxygen, and the highest IC50 values for NaOx and αCHC) might explain why the two metabolism inhibitors, which require a glycolytic phenotype (strong lactate production) were less effective in SW620 cells. Cytostatic or cytotoxic effects of the inhibitors NaOx and αCHC were demon-strated in colorectal carcinoma cells. This indicates that cancer cells are de-pendent on a functioning glycolytic metabolism. Both inhibitors were also effective in the presence of tumour-relevant oxygen concentrations of 5% and 1%. KW - Tumorzelle KW - Tumorhypoxie KW - Stoffwechselinhibitoren KW - Natriumoxamat KW - alfa-cyano-4-hydroxycinnamat KW - kolorektale Karzinomzelllinien KW - Warburg-Effekt KW - Sauerstoffkonzentration KW - Stoffwechsel KW - Inhibitor KW - Lactatdehydrogenase KW - Warburg, Otto Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140061 ER - TY - THES A1 - Knop, Juna-Lisa T1 - Untersuchungen zur Bedeutung von Spaltprodukten des vaskulär endothelialen (VE-) Cadherin als Auslöser für die Schrankenstörung des Gefäßendothels T1 - Characterisation of the endothelial barrier-disruptive effects of soluble vascular endothelial (sVE-) cadherin N2 - Ein Schlüsselereignis, welches dem prognosebestimmenden Organversagen bei systemi-schen Entzündungsprozessen und Sepsis vorangeht, ist die Entwicklung einer mikrovas-kulären endothelialen Schrankenstörung. Das vaskuläre endotheliale (VE-) Cadherin als mechanischer Stabilisator der Endothelbarriere spielt dabei eine wichtige Rolle. In der Inflammation werden Spaltprodukte von VE-Cadherin (sVE-Cadherin) gebildet. Ge-genstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Hypothese ob diese Spalt-produkte selbst an der Störung der endothelialen Barrierefunktion beteiligt sind. Es wurde hierfür humanes sVE-Cadherin bestehend aus den extrazellulären Domänen EC1-5 (sVE-CadherinEC1-5) generiert. In Messungen des transendothelialen elektrischen Widerstands (TER), mit Immunfluoreszenzfärbungen und Western Blot Analysen wird gezeigt, dass sVE-Cadherin dosisabhängig die Barriere Integrität in primären humanen dermalen Endothelzellen stört. Dies führt zu einer Reduktion von VE-Cadherin und den assoziierten Proteinen α-, γ- und δ-Catenin und ZO-1, die nach der Applikation von sVE-Cadherin an den Zellgrenzen reduziert sind. Die Interaktion zwischen VE-PTP und VE-Cadherin wird durch sVE-CadherinEC1-5 reduziert. Durch pharmakologische Hem-mung der Phosphataseaktivität von VE-PTP mittels AKB9778 wird der durch sVE-CadherinEC1-5-induzierte Verlust der Endothelbarriere aufgehoben. Dagegen zeigt die direkte Aktivierung von Tie-2 mittels Angiopoetin-1 keinen protektiven Effekt auf die durch sVE-CadherinEC1-5 gestörte Endothelbarriere. Weitere Analysen zeigen eine erhöh-te Expression von GEF-H1 durch sVE-CadherinEC1-5. Diese ist ebenfalls durch AKB9778 hemmbar. Zusätzlich zu diesen Untersuchungen wurden die Konstrukte EC1-4 und EC3-5 in ver-schiedene Vektoren kloniert, um zu bestimmen, ob die extrazelluläre Domäne 5 von VE-Cadherin die dominante Rolle bei den sVE-Cadherin-vermittelten Effekten spielt. Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen zum ersten Mal, dass sVE-CadherinEC1-5 unabhängig von proinflammatorischen Auslösern über die Aktivierung des VE-PTP/RhoA-Signalweges den Zusammenbruch der Endothelbarriere mitversursacht. Dies stellt einen neuen pathophysiologischer Mechanismus dar, der zum Gesamtverständnis der entzündungsinduzierten Barriereveränderungen des Endothels beiträgt. N2 - A key prognostic event preceding organ failure in sepsis and systemic inflammatory pro-cesses is dysfunction of the microvascular endothelial barrier. The transmembrane pro-tein vascular endothelial (VE-) cadherin is an important prerequisite to stabilize endothe-lial barrier. VE-cadherin is cleaved under inflammatory conditions which results in the release of soluble VE-cadherin (sVE-cadherin). The main hypothesis of this thesis is to investigate whether sVE-cadherin itself directly disrupts the endothelial barrier in the absence of proinflammatory stimuli. Human sVE-cadherin consisting of extracellular domains EC1-5 (sVE-cadherinEC1-5) was generated and applied onto primary human dermal endothelial cells (HDMECs) for structural and functional analysis. Measurements of transendothelial electrical resistance (TER) and 4 kDa FITC-dectran flux revealed that sVE-cadherinEC1-5 dose-dependently disrupts endothelial barrier integrity. This was confirmed by immunostaining and im-munoblotting analysis which showed that sVE-cadherinEC1-5 treatment reduced overall levels of VE-cadherin and the associated proteins α-, γ- and δ-catenin and ZO-1 as well as their distribution at the cell border of HDMECs. sVE-cadherinEC1-5 treatment reduced the interaction between the phosphatase VE-PTP and VE-cadherin. Accordingly, phar-macological inhibition of VE-PTP using AKB9778 reversed sVE-cadherinEC1-5-induced endothelial barrier loss. Further analysis showed that the increased expression of GEF-H1 by sVE-cadherinEC1-5 is also attenuated by AKB9778. In addition to these studies, the constructs EC1-4 and EC3-5 were cloned into different vectors to determine wheth-er the extracellular domain 5 of VE-cadherin plays the dominant role in sVE-cadherin-mediated effects. In summary, these studies show for the first time that sVE-cadherinEC1-5 actively con-tributes to breakdown of the endothelial barrier independently of proinflammatory stim-uli via activation of the VE-PTP/RhoA signaling pathway. This represents a new patho-physiological mechanism that adds to the understanding of inflammation-induced endo-thelial barrier changes. KW - Endothel KW - Sepsis KW - Cadherine KW - Proteintyrosinphosphatase KW - Rho-Kinasen KW - VE-Cadherin KW - VE-PTP KW - RhoA KW - ve-cadherin Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-344687 ER - TY - THES A1 - von Hayn, Kathrin T1 - Untersuchungen zur Ca2+-abhängigen Regulation von cAMP in intakten vaskulären Myocyten T1 - Analysis of the Ca2+-dependent regulation of cAMP in intact vascular smooth muscle cells N2 - Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben können und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellulären Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgelöst. Durch eine zusätzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten darüber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. Während ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen Rückgang der intrazellulären cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die Überexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivitäts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen Rückgang der Cyclaseaktivität nach Zugabe von 2 und 5 μM freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte Änderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so lässt sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte Rückgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei für die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells könnten in Zukunft cAMP-Änderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, für den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgeführt und agonistinduzierte cAMP-Änderungen beobachtet werden. N2 - Regulation of smooth muscle tone is crucially determined by the antangonistic second messengers cAMP and Ca2+. One aim of this work was to investigate, if these two mediators can also affect each other directly and which enzymes take part in these processes. For observing cAMP signals in living cells with a temporally high resolution, we used the fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based cAMP sensor Epac1-camps. For monitoring changes in intracellular Ca2+, cells were labeled with Fura-2. Rises in intracellular Ca2+ were achieved by activation of on vascular smooth muscle cells (VSMCs) endogenously expressed Gq-coupled P2Y6 receptors with uridine diphosphate (UDP). Additional, in-vitro calibration of the Epac1-camps allowed the calculation of absolute cAMP concentrations in single living cells. An increase of Ca2+ concentrations in non-prestimulated VSMCs did not significantly influence intracellular cAMP concentrations. Activation of purinergic receptors of isoproterenol-prestimulated cells with UDP provoked a clear decrease of intracellular cAMP concentrations. This effect was blocked by the complexation of Ca2+ with BAPTA-AM as well as by overexpression of Ca2+-insensitive AC4. Furthermore, adenylyl cyclase activity assays in the presence of 2 and 5 μM free Ca2+ in VSMC membranes showed a decline in cyclase activity. Inhibition of PDE1, the only Ca2+-dependent phosphodiesterase (PDE), with the selective PDE1 inhibitor 8-methoxymethy-IBMX, in contrast, had no effect on UDP-evoked changes in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. Finally, knockdown of Ca2+-inhibitable AC5 and 6 with siRNA significantly inhibited the UDP-evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. To merge all these results, one can draw the following conclusion: The purinergically evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs is caused by an inhibition of AC5 and 6 which is mediated by Ca2+. This mechanism interlinks two essential antagonistic signaling pathways for the regulation of smooth muscle tone. An additional part of this work was to develop a transgenic mouse model, which expresses smooth-muscle-specifically Epac1-camps. In the future, these animals could provide the possibility to observe cAMP signals in intact tissues or even in living animals. With the help of the Cre-loxP recombination system, we achieved to generate such a smooth-muscle-specific transgene. Afterwards FRET measurements in isolated vascular smooth muscle cells of these animals were possible and we were also able to observe agonist-induced cAMP changes in these isolated cells. KW - Glatte Muskulatur KW - Cyclo-AMP KW - Calcium KW - Calcium KW - cAMP KW - vaskuläre glatte Muskelzellen KW - FRET KW - calcium KW - cAMP KW - vascular smooth muscle cells KW - FRET Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47709 ER - TY - THES A1 - Hopp-Krämer, Sarah T1 - Untersuchungen zur Pathophysiologie und therapeutischer Relevanz des Blutgerinnungsfaktors XII nach experimentellem Schädel-Hirn-Trauma T1 - Studies on the pathophysiology and therapeutic relevance of the coagulation factor XII following experimental traumatic brain injury N2 - Das Schädel-Hirn-Trauma (SHT) entsteht durch äußere Gewalteinwirkung auf den Kopf und verursacht mechanisch eine Schädigung des Hirngewebes. Zusätzlich tragen sekundäre Pathomechanismen, wie Entzündungsprozesse und die Schädigung der Blut-Hirn-Schranke (BHS), dazu bei, dass sich das initial geschädigte Läsionsareal im Laufe der Zeit vergrößert. Vor allem bei jungen Erwachsenen ist das SHT eine der häufigsten Ursachen für bleibende Behinderungen und Todesfälle. Aufgrund der schweren Auswirkungen des SHT und der bislang fehlenden Therapieoptionen ist die Identifizierung neuer Zielstrukturen für eine kausale Therapie von größter Bedeutung. Ausgehend von tierexperimentellen Studien ist das Kallikrein-Kinin-System (KKS) ein besonders erfolgversprechender Angriffspunkt zur Behandlung des SHT. Die Aktivierung des KKS über den Gerinnungsfaktor XII (FXII) und die darauf folgende Bildung von Bradykinin sind mit dem Entstehen von Hirnödemen und Entzündungsreaktionen assoziiert. Vorangegangene Studien haben weiterhin die Frage aufgeworfen, ob und in welchem Maße thrombotische Prozesse einen Einfluss auf die Pathophysiologie und die sekundären Hirnschädigungen nach SHT haben. Da FXII sowohl das KKS als auch die intrinsische plasmatische Gerinnungskaskade initiiert und somit zur Fibrinbildung beiträgt, stand FXII im Mittelpunkt der Untersuchungen dieser Dissertation. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Fragen, (I) inwiefern FXII eine Rolle bei der sekundären Hirnschädigung nach Trauma spielt und (II) ob thrombotische Prozesse ein pathophysiologisches Merkmal nach Trauma darstellen. In zwei unterschiedlichen Trauma-Modellen wurden FXII-defiziente Tiere und mit einem spezifischen Inhibitor des aktivierten FXII (FXIIa) behandelte Tiere gegen Kontrolltiere nach SHT verglichen. Die Analyse der funktionellen Ausfallerscheinungen und des Ausmaßes an neuronaler Degeneration zeigte, dass FXII-Defizienz und FXIIa-Inhibition vor den Auswirkungen eines SHT schützen. Als zugrundeliegende Mechanismen wurden die Reduktion von thrombotisch verschlossenen Gefäßen in der Mikrovaskulatur des Gehirns sowie der Schutz vor BHS-Störungen und verringerte inflammatorische Prozesse identifiziert. Weiterhin wurde festgestellt, dass eine Blockade der intrinsischen Gerinnungskaskade über FXII keine intrazerebralen Blutungen auslöst. In Gewebeproben von Patienten mit SHT wurde gezeigt, dass Thrombozytenaggregate auch im klinischen Verlauf auftreten und sich somit die tierexperimentellen Befunde auf die humane Situation übertragen lassen. Insgesamt tragen die Ergebnisse dazu bei, die komplexen und vielfältigen Pathomechanismen nach SHT besser zu verstehen und vor allem die Relevanz thrombo-inflammatorischer Prozesse nach SHT aufzuzeigen. Die gezielte Blockade des FXII(a) könnte als therapeutisches Prinzip zur Abschwächung der Sekundärschaden nach SHT geeignet sein. N2 - Traumatic brain injury (TBI) is the result of an outside force causing mechanical disruption of the brain tissue. In addition, delayed pathogenic events, like inflammatory processes and blood-brain barrier damage occur, which collectively exacerbate the injury. In young adults, TBI is one of the main reasons for permanent disability and death. Because of its severe consequences and the lack of causal treatment, the identification of novel therapeutic options is of utmost importance. Based on animal studies, the kallikrein-kinin-system (KKS) is a very promising target to treat secondary injury processes following TBI. The activation of the KKS via coagulation factor XII (FXII) and the subsequent formation of bradykinin are tightly associated with the development of brain edema and inflammation. Recent studies have raised the question to what extent thrombotic processes might influence the pathophysiology and secondary injury processes following TBI. As FXII is not only the starting point of the KKS, but also the initiator of the intrinsic coagulation cascade which leads to fibrin formation, FXII was the center of interest for this dissertation. The work presented here deals with the issue, (I) whether FXII plays a role in the development and aggravation of secondary injury processes after trauma and (II) if thrombotic processes display a pathophysiological feature in TBI. In two different models of brain trauma, FXII-deficient mice and mice treated with a specific inhibitor of activated FXII (FXIIa) were compared to their respective control groups after trauma induction. The analyses of the functional outcome and the amount of neurodegenerative processes showed a distinct amelioration in favor of the genetically modified and treated animals. As underlying mechanisms, the reduction of thrombotic vessels in the brain microvasculature and additionally, protection from blood-brain barrier damages and less inflammation were identified. Moreover, it was observed that interference with the intrinsic coagulation cascade via FXII does not lead to the formation of intracerebral bleedings. The evaluation of human brain tissue surgically obtained following TBI demonstrated that platelet aggregates occur regularly in the course of brain trauma and that they seem to contribute to the secondary injury processes and the ischemia-like injury pattern. Taken together, the results contribute to the understanding of the highly complex and heterogeneous pathomechanisms following TBI, especially concerning thrombo-inflammatory processes. The targeted pharmacological blocking of FXII(a) could be a useful therapeutic principle in the treatment of TBI-associated pathologic processes. KW - Schädel-Hirn-Trauma KW - Blutgerinnungsfaktor XII KW - Pathophysiologie KW - Kallikrein-Kinin-System KW - Intrinsische Gerinnungskaskade Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144421 ER - TY - THES A1 - Bergmann, Anna T1 - Untersuchungen zur Verwertung proteinhaltiger Substrate als mögliche Virulenzdeterminante des humanpathogenen Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus T1 - Studies on utilisation of proteinaceous substrates as potential virulence determinant of the human pathogen Aspergillus fumigatus N2 - Die asexuellen Sporen von Aspergillus fumigatus sind ubiquitär verbreitete Luftkeime. Als Saprophyt ist dieser opportunistisch humanpathogene Pilz darauf spezialisiert, polymere Substanzen aus dem umgebenden Milieu zu zersetzen, um daraus die von ihm benötigten Nährstoffe zu generieren und aufzunehmen. Die Fähigkeit, verschiedene Stickstoff- und Kohlenstoffquellen zu verwerten, trägt dabei zu seiner Virulenz bei und hierbei scheint die extrazelluläre Proteolyse eine wichtige Rolle zu spielen. Sekretierte Proteasen, die das umgebende Gewebe während einer Infektion mit A. fumigatus erschließen, könnten somit zu dessen Pathogenität beitragen. Dementsprechend sollte im Rahmen dieser Arbeit die Bedeutung einer Regulation der extrazellulären proteolytischen Aktivität von A. fumigatus für dessen Virulenz untersucht werden. Dies geschah durch Untersuchungen eines konservierten Transkriptionsfaktors, PrtT. Dabei stellte sich heraus, dass PrtT die Expression der drei Hauptproteasen von A. fumigatus, Alp, Mep und Pep stark beeinflusst, in einem murinen Tiermodell der pulmonaren Aspergillose scheint dieser Regulator jedoch keine Rolle für die Pathogenität von A. fumigatus zu spielen. Um einen weiteren Aspekt des pilzlichen Aminosäurestoffwechsels zu beleuchten, wurde die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren als mögliche Virulenzdeterminate untersucht. Für den Menschen sind diese Aminosäuren essentiell, weshalb dieser Syntheseweg ein mögliches Ziel für antimykotische Substanzen darstellen könnte. Es konnten mehrere für A. fumigatus essentielle Komponenten des Shikimatweges identifiziert werden, des Weiteren wurden Deletionsmutanten in den Genen aroC und trpA, die für die Chorismatmutase bzw. Anthranilatsynthase der Biosynthese von Phenylalanin und Tyrosin bzw. Tryptophan kodieren, erzeugt und phänotypisch charakterisiert. Deren Untersuchung in einem alternativen Tiermodell der Aspergillose zeigte eine deutlich attenuierte Virulenz. Diese Ergebnisse verdeutlichen, wie wichtig die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren für das Wachstum von A. fumigatus ist, und dass ein Eingriff in diesen Syntheseweg eine lohnende Strategie zur Entwicklung neuer Antimykotika sein könnte. Die hier präsentierten Ergebnisse unterstreichen die für den Schimmelpilz A. fumigatus typische Redundanz bezüglich extrazellulärer proteolytischer Enzyme und dass diese nur bedingt hinsichtlich ihres Virulenzbeitrags untersucht werden können. Im Gegensatz hierzu lassen sich bestimmte Stoffwechselwege, die oftmals durch einzigartige Genprodukte katalysiert werden, unter Umständen besser als unspezifische aber vielversprechende Virulenzdeterminanten identifizieren. N2 - The air-borne spores of Aspergillus fumigatus are ubiquitously distributed. As a saprophyte, this fungus is well adapted to feed from the environment by degradation of polymeric substances and uptake of breakdown products. The nutritional versatility has to be regarded as virulence determinant in the development of pulmonary aspergillosis. Secreted proteolytic activities that degrade the surrounding lung tissue during infection may contribute to pathogenicity. Until now, knowledge on the regulation of the expression and secretion of proteases by A. fumigatus is scarce. Therefore, the role of extracellular proteolytic activity for pathogenicity of A. fumigatus was examined by characterisation of a global regulatory factor, PrtT, that acts on expression of secreted proteases. It could be shown that PrtT regulates the transcription of the major secreted proteases Alp, Mep and Pep. When tested in a leukopenic mouse model, the deletant strain is not attenuated in virulence, suggesting that the PrtT transcription factor - and accordingly extracellular proteolysis - supports virulence of this opportunistic pathogen only to a limited extent. To gain insight into the fungal biosynthesis pathway of amino acids, the aromatic amino acid biosynthesis was investigated concerning the aspect of a virulence determinant. In contrast to mammals, fungi are able for de novo synthesis of the aromatic amino acids. Therefore it might be a usable target for antifungal therapy since such pathway does not exist in humans. Some genes of the shikimate pathway could be shown to be essential for the survival of A. fumigatus. Virulence tests of strains with deletion of the genes aroC or trpA which encodes for the chorismate mutase and anthranilate synthase respectively, showed attenuated virulence of both strains. These results clarify the stringent necessity of the aromatic amino acid biosynthesis for the survival of A. fumigatus, concluding this biosynthesis pathway as a usable target for antimycotic substances. The results of this work emphasise the redundancy of extracellular proteolytic activities. In contrast specific pathways which are mostly catalysed by unique gene products may be identified as virulence determinant rather than unspecific factors. KW - Aspergillus fumigatus KW - Proteasen KW - Proteolyse KW - Posttranskriptionelle Regulation KW - Biosynthese der aromatischen Aminosäuren KW - Aspergillus fumigatus KW - Proteases KW - Proteolysis KW - posttranscriptional regulation KW - aromatic amino acid biosynthesis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67333 ER - TY - THES A1 - Nerreter, Thomas T1 - Untersuchungen über den Einfluss des Tyrosinkinaseinhibitors Dasatinib auf die Funktion von T-Zellen und aus Monozyten generierten Dendritischen Zellen T1 - Studies on the effect of the tyrosine-kinase inhibitor dasatinib on function of T cells and monocyte-derived dendritc cells N2 - Kinasen der SRC-Familie (SFKs) sind sowohl in Wachstum und Metastasierung von Tumor- und Leukämiezellen als auch an prominenter Stelle in vielgestaltige Signalwege aller Immunzellen involviert. Eine Hemmung von SFKs ist damit ein vielversprechendes Mittel zur Therapie maligner Erkrankungen, kann aber darüber hinaus auch sehr effektiv zur Immunmodulation genutzt werden. Für den zur Therapie von CML und AML zugelassenen Tyrosinkinaseinhibitor (TKI) Dasatinib (Handelsname Sprycel®), für den unter anderem SFKs die Hauptziele darstellen, wurden, neben der antitumoralen Wirkung, sowohl immunsuppressive als auch immunstimulierende Effekte beschrieben. Aus diesem Grund könnte Dasatinib ein für die Modulation von Immunantworten sehr interessantes Hilfsmittel darstellen. In der vorliegenden Arbeit werden die hemmenden und fördernden Einflüsse von Dasatinib auf zwei Typen von Immunzellen genauer untersucht, um so die Auswirkungen einer Dasatinib-Behandlung auf Zellen des Immunsystems besser zu verstehen und sich das immunmodulatorische Potenzial von Dasatinib besser nutzbar machen zu können. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung möglicher kombinatorischer Effekte zwischen Dasatinib und dem Glucocorticoid Dexamethason auf verschiedene Subsets von T-Zellen vor dem Hintergrund eines potentiellen Einsatzes der Kombination bei der allogenen Hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) zur Separation von Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekten und der Graft-versus-host Disease (GvHD). Während keine kombinatorischen Effekte bei der Aktivierung von T-Zellen auftraten, ergaben sich bei der Untersuchung des Einflusses auf die Proliferation besonders in CD8+ T-Zellen additive Effekte durch die Kombination. Die Proliferation naiver T-Zell-Subsets wurde bereits durch die beiden Einzelsubstanzen alleine stark gehemmt. Dagegen waren Memory T-Zell-Subsets deutlich unempfindlicher, allerdings konnte durch eine Kombination von Dexamethason und Dasatinib auch die Proliferation dieser Memory Subsets effektiv gehemmt werden. Hierbei zeigten sich bei CD8+ Memory Subsets die deutlichsten synergistischen Effekte. Da eine Kombination in stärkerem Maße auch CD8+ gegenüber CD4+ Memory Subsets hemmt und diese Subsets unterschiedliche Rollen in der Induktion von GvL-Effekten und der Auslösung einer GvHD zu spielen scheinen, ist eine Steigerung der GvL-Effektivität durch die Medikamenten-Kombination bei gleichzeitiger Minimierung eines GvHD-Risikos in Zusammenhang mit anderen publizierten Ergebnissen durchaus denkbar. Weil eine starke Hemmung von virus-spezifischen T-Zellen nur bei sehr hohen Konzentrationen auftrat, ist zudem das Risiko einer Virus-Reaktivierung, die ein großes Problem bei einer HSCT darstellt, eher als gering einzuschätzen. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von Dasatinib auf aus Monozyten generierte Dendritische Zellen (moDCs) mit einem Fokus auf der Beeinflussung ihrer Migration. Während eine Behandlung mit Dasatinib nur sehr geringe Auswirkungen auf die Ausreifung der moDCs und die Expression von kostimulatorischen Molekülen hatte, führte eine Dasatinib-Behandlung zu einer Zeit- und Dosis-abhängigen Verringerung der Zytokinsekretion (IL-10 und IL-12). Im Gegensatz dazu hatte Dasatinib keinen Einfluss auf die phagozytotische Aktivität der moDCs und auf ihre Fähigkeit, Virus-spezifische T-Zell-Antworten auszulösen. Dasatinib zeigte dagegen einen deutlich steigernden Einfluss auf die Migration von moDCs gegen einen CCL19-Gradienten im Transwell-Assay, ohne die Expression des CCL19-Rezeptors CCR7 zu beeinflussen. Da ähnliche Migrations-steigernde Effekte auch bei einer Behandlung mit dem spezifischen SFK-Inhibitor SKI-1 auftraten, eine Behandlung mit Nilotinib, einem TKI der nicht auf SFKs wirkt, im Gegensatz dazu aber zu einer Hemmung der Migration führte, liegt es nahe dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über SFKs vermittelt wird. Dasatinib führte zu einer deutlichen Inhibierung der Phosphorylierung der inhibitorischen Immunrezeptoren Siglec-9 und Siglec-3 (CD33) ohne ihre Expressionslevel zu beeinflussen. Eine mit spezifischen Antikörpern durchgeführte Blockierung dieser Immunrezeptoren, deren ITIM-Domänen mutmaßlich von SFKs phosphoryliert werden, hatte eine deutliche Steigerung der Migration und eine verringerte Phosphorylierung von Siglec-9, Siglec-3 und SHP-2 zur Folge. Letztere ist eine Phosphatase, die nach Bindung an phosphorylierte ITIM-Domänen von Rezeptoren wie den Siglecs verschiedene Zielmoleküle dephosphoryliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über eine Hemmung von SFKs und daraus resultierend auf dem Wegfall eines inhibitorischen Signalwegs erfolgt. Diese Steigerung der Migration könnte in der Tumor-Therapie von großem Nutzen sein, da bei einer Vakzinierung mit autologen DCs, die mit Tumor-assoziierten Antigenen stimuliert wurden, die schlechte Einwanderung in die Lymphknoten eines der Hauptprobleme darstellt. Zur Überwindung dieses Problems könnte Dasatinib ein sehr effektives Hilfsmittel darstellen und die Therapie-Effizienz deutlich verbessern. Da Dasatinib aber auch eine ganze Reihe weiterer, sehr vielfältiger Einflüsse auf alle Arten von Immunzellen ausübt, scheint eine Verwendung spezifischer blockierender α-Siglec-Antikörper auf Grund geringerer Nebenwirkungen im Vergleich zu Dasatinib möglicherweise sogar noch deutlich besser geeignet zu sein, das Migrationsverhaltens Dendritischer Zellen positiv zu beeinflussen. Die Verwendung gegen Siglec-Rezeptoren gerichteter Antikörper als Adjuvantien könnte somit zu einem erfolgreicheren Einsatz der Vakzination mit Dendritischen Zellen in der Tumor-Therapie führen. N2 - SRC-family kinases (SFKs) are involved in growth and metastasis of tumor and leukemic cells as well as in manifold signaling pathways at prominent position in all types of immune cells. Inhibition of SFKs thereby represents a promising tool for the therapy of malignant diseases but can also be used quite effectively for immunomodulation. Besides its antitumoral activity, immune-suppressive as well as immune-stimulatory effects have been described for the tyrosine kinase inhibitor (TKI) dasatinib (trademark Sprycel®) which is approved for the treatment of CML and AML. Therefore the use of dasatinib could be a very interesting method for the modulation of immune responses. The present paper aimes to scrutinize the inhibitory and promoting effects of dasatinib on two types of immune cells to gain a better insight into the consequences of a dasatinib treatment in immune cells and to take advantage of the immunomodulatory potential of dasatinib. The first part of the paper deals with the investigation of potential combinatory effects between dasatinib and the glucocorticoid dexamethasone on various T cell subsets in the context of a potential use of the combination in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to dissect Graft-versus-leukemia (GvL) effects and Graft-versus-host Disease. While no combinatory effects regarding T cell activation occurred, the investigation of the influence on T cell proliferation revealed significant additive effects of the combination especially in CD8+ T cells. The proliferation of naïve T cell subsets was inhibited already by use of the single agents. In contrast, memory T cell subsets proved to be much more insensitive, but their proliferation was effectively hampered by a combination of dasatinib and dexamethasone whereas the most pronounced synergistic effects occurred in CD8+ memory subsets. Since the combination more potently inhibits also CD8+ in comparison to CD4+ Memory subsets and since these subsets seem to fulfill diverging roles in mediation of GvL effects and induction of GvHD, an increase in GvL efficacy by the drug combination while concurrently reducing the risk of a GvHD is conceivable, especially when including other published results. Moreover, as a potent inhibition of virus-specific T cells only occurred at very high concentrations, the risk of viral reactivations, which represent a major problem with HSCT, could be considered as rather marginal. The second part of the paper addresses the influence of dasatinib on monocyte-derived dendritic cells (moDCs) with a special focus on its influence on their migration. While dasatinib treatment exhibited only negligible effects on moDCs’ maturation and expression of costimulatory molecules, dasatinib led to a time- and dose-dependent reduction in cytokine secretion (IL-10 and IL-12). In contrast, dasatinib had no influence on phagocytotic activity of moDCs and on their ability to induce virus-specific T cell responses. Notably Dasatinib had a pronounced beneficial effect on migration of moDCs towards a CCL-19 gradient in a transwell assay without altering the expression of the CCL19 receptor CCR7. Since comparable migration-enhancing effects also occurred in presence of the specific SFK-inhibitor SKI-1 while the use of nilotinib, a TKI not inhibiting SFKs, in contrast led to an inhibition of migration, it can be assumed that dasatinib mediates its migration-enhancing effects via an inhibition of SFKs. Dasatinib treatment led to a dramatic decrease in phosphorylation of the inhibitory immunoreceptors Siglec-9 and Siglec-3 (CD33) without altering their expression levels. The use of specific antibodies for blocking of these immunoreceptors, whose ITIM domains are thought to be phosphorylated by SFKs, led to a powerful increase in migration and diminished phosphorylation of Siglec-9, Siglec-3 and SHP-2. The latter is a phosphatase which dephosphorylates target molecules after binding phosphorylated ITIM domains of receptors like the Siglecs. This paper’s results suggest that dasatinib mediates its migration-enhancing effects via inhibition of SFKs resulting in omission of an inhibitory signaling pathway. This enhancement of migratory capacity could be very useful in anti-tumor therapy as limited migration to the lymph nodes is one of the major problems when vaccinating with autologous dendritic cells that were stimulated with tumor-associated antigens. Dasatinib could be a potent mediator to overcome this problem and could lead to an improvement in the efficacy of therapy. Since dasatinib in addition also affects a broad range of processes in all immune cells, the use of specific α-Siglec blocking antibodies seems to be the more appropriate attempt to positively influence the migratory behavior of dendritic cells due to fewer side effects in comparison to dasatinib. Utilization of antibodies that target siglec receptors as adjuvants could lead to a more successful use of a vaccination with dendritic cells in tumor therapy. KW - Protein-Tyrosin-Kinasen KW - Dexamethason KW - T-Lymphozyt KW - Dendritische Zelle KW - Tyrosinkinaseinhibitor Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99477 ER - TY - THES A1 - Röhrig, Florian T1 - Verbesserung der Medikamenteneinbringung in solide Tumoren durch Modifikation der extrazellulären Matrix T1 - Improving drug delivery into solid tumors by modification of the extracellular matrix N2 - Bei der Behandlung solider Tumoren spielen systemisch verabreichte Chemotherapeutika eine wich- tige Rolle. Allerdings akkumulieren diese Therapeutika besser in normalem Gewebe als in Tumoren. Als Ursache für diesen unzureichenden Transport von Medikamenten in den Tumor wurde bisher vor allem die dysfunktionale Tumorvaskulatur diskutiert. Diese befindet sich in einem chaotischen und unreifen Zustand ohne ausreichende Bedeckung der Gefäße mit stabilisierenden Perizyten. Aus dem Zustand der Vaskulatur resultierend erreichen Medikamente den Tumor nur in geringem Ausmaß und werden dort heterogen verteilt. Als Grund für den Zustand der Vaskulatur wur- de ein großer Überschuss an pro-angiogenetischen Faktoren im Tumor ausgemacht. Durch eine anti-angiogenetische Behandlung konnte in präklinischen Modellen für einen gewissen Zeitraum die Tumorvaskulatur „normalisiert“ werden. Dies zeichnete sich vor allem durch Veränderung von zwei wichtigen Parametern für die Medikamenteneinbringung aus: zum Einen kommt es zu einer Reduktion der Gefäßdichte. Zum Anderen zu einer Reifung der Blutgefäße. In einem Teil von Pati- enten scheint dabei der Effekt der Gefäßverbesserung zu überwiegen und es kann eine verbesserte Perfusion detektiert werden. Mutmaßlich führt dies auch zu einer verbesserten Einbringung von Therapeutika in den Tumor und so zu einer erhöhten Effizienz der Therapie. In einem weiteren Teil der Patienten scheint jedoch der Effekt der Gefäßreduktion zu überwiegen und die detektierte Perfusion im Tumor wird durch die Behandlung verringert. Das in dieser Arbeit verwendete MT6-Fibrosarkom-Modell reagierte auf eine anti-angiogenetische Therapie nicht mit einer sonst in murinen Modellen beobachteten Wachstumsreduktion. Die- se ermöglichte eine so bisher nicht mögliche Untersuchung der sekundären Effekte einer anti- angiogenetischen Therapie wie die Medikamenteneinbringung in den Tumor. Die Vaskulatur in MT6-Tumoren zeigte dabei nach einer anti-angiogenetischen Vorbehandlung, die erwarteten Merk-male einer „normalisierten“ Vaskulatur wie eine Reduktion der Gefäßdichte bei gleichzeitiger Rei- fung der verbleibenden Gefäße. Dies führte jedoch nicht zu einer verbesserten Effizienz einer subsequenten Chemotherapie. Durch Vergleich mit einem weiteren Tumor-Modell, dem 4T1-Modell für ein metastasierendes Mammakarzinom, konnten signifikante Unterschiede im Gefäßbild beider Modelle ausgeschlossen werden. Durch mikroskopische Methoden konnte dabei beobachtet werden, dass die Diffusion von Medikamenten aus den Blutgefäßen des MT6-Modells im Vergleich zum 4T1-Modell verringert war. Weitere Untersuchungen deuten auf eine Differenz in der Qualität der extrazellulären Matrix der verwendeten Tumor-Modelle. Durch mRNA-Expressionsanalysen konnte die Enzymfamilie der Lysyloxidasen als mögliche Ursache für diesen Diffusionsunterschied identi- fiziert werden. Lysyloxidasen katalysieren vor allem die Quervernetzung von Proteinen der Extra- zellulärmatrix. Im Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Quervernetzung von Matrixproteinen durch Lysyloxidasen ursächlich für die Diffusions-Inhibierung kleiner Moleküle wie das Chemo- therapeutikum Doxorubicin sein kann. Durch spezifische Inhibition der Lysyloxidasen mittels des Inhibitors βAPN konnte diese Diffusions-Inhibition sowohl in vitro als auch im MT6-Tumor-Modell nahezu vollständig verhindert werden. Die hohe Aktivität von Lysyloxidasen im MT6-Modell stell- te allerdings kein Alleinstellungsmerkmal dieses Modells dar. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Lysyloxidasen in einer Vielzahl von murinen und humanen Tumorzelllinien überexprimiert wird. Die Inhibition von Lysyloxidasen durch βAPN konnte dabei in allen unter- suchten Modellen die Einbringung von Medikamenten in den Tumor erhöhen und könnte so eine sinnvolle adjuvante Maßnahme zur Verbesserung bestehender Chemotherapien darstellen. N2 - Systemically administered chemotherapeutics play a major role in in the treatment of so- lid tumors. However, these chemotherapeutics accumulate better in healthy tissue than in tumors. The reason for this insufficient transport of drugs into the tumor could be the dysfunctional tumor vasculature, which is in a chaotic and immature state without an adequate vessel coverage by stabilizing pericytes. As a result of this vasculature, only small amounts of drugs reach the tumor and are further just heterogeneously distributed. A great abundance of pro-angiogenic factors in the tumor was believed to cause this insufficient vasculature. In pre-clinical models, „normalization“ of the tumor vasculature could be achieved with anti-angiogenic therapy for a certain period of time. This was characterized by changes in two important parameters for drug administration: on the one hand reduction of vessel density, on the other hand maturation of blood vessels. In one part of patients, the effect of vessel normalization seems to be predominant leading to improved perfusion. Presumably, this leads to improved administration of chemotherapeu- tics into the tumor and therefore to a more efficient therapy. In another part of patients, the effect of vessel reduction seems to be predominant and the detectable perfusion in the tumor is decreased. The MT6 fibrosarcoma model, which was used in this work, did not respond to the anti-angiogenic therapy with an inhibition of tumor growth as usually observed in murine models. This observation enabled a so far not possible investigation of the secondary effects of an anti-angiogenic therapy, such as drug transport into the tumor. After the anti-angiogenic pre-treatment, the vasculature of MT6 tumors indicated the expected characteristics of a „normalized“ vasculature, such as reduction of vessel density and simultaneous maturation of remaining vessels. However, this did not lead to improved efficacy of subsequently administered chemotherapy. Comparison with another tumor model, the 4T1 model for metastasizing mamma carcinoma, did not reveal signifi- cant differences in the vessel pattern. Observation with microscopic methods indicated a reduced diffusion of drugs from the blood vessels of the MT6 model compared to those of the 4T1 model. Further investigations showed differences in the quality of the extracel- lular matrix of both used tumor models. mRNA expression analyses revealed the family of lysyl oxidases as a putative cause for the differences in diffusion. Lysyloxidases catalyze primarily the cross-linking of proteins of the extracellular matrix. Moreover, it was shown that the cross-linking of matrix proteins by lysyl oxidases is causative for the inhibition of diffusion of small molecules such as the chemotherapeutic doxorubicin. A specific inhibi- tion of lysyl oxidases with the inhibitor βAPN could almost entirely prevent the inhibition of diffusion in vitro and in the MT6 model. However, the high activity of lysyl oxidases in the MT6 model is not a unique feature of this model. Further investigations showed, that lysyl oxidases are over expressed in many human and murine tumor cell lines. In all investigated models, inhibition of lysyl oxidases with βAPN improved drug transport into the tumor and βAPN could therefore be a reasonable adjuvant therapy to improve the efficacy of already existing chemotherapeutics. KW - Lysin-Oxidase KW - Tumor KW - Angiogenese KW - Chemotherapie KW - extrazelluläre Matrix KW - Lysyloxidasen KW - Tumor KW - extrazelluläre Matrix KW - Lysyl oxidases KW - Tumour KW - extracellular matrix Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117381 ER - TY - THES A1 - Stangl, Stephanie T1 - Versorgung von Patientinnen und Patienten mit Brustkrebs in einer überwiegend ländlich geprägten Region T1 - Provision of breast cancer care in a mainly rural area N2 - Für die Diagnose und Therapie von Brustkrebs existiert die nationale evidenz- und konsensbasierte S3-Leitlinie. Die klinischen Krebsregister stellen sektor- und facharztübergreifende Diagnose- und Therapiedaten zur Qualitätssicherung bereit. Bislang fehlen jedoch Daten bezüglich patient-reported outcome measures (PROMs). Aufgrund des demographischen Wandels werden Brustkrebserkrankungen vor allem in ländlichen Regionen weiter zunehmen, weshalb Versorgungsstrukturen für alle Patientinnen erreichbar sein sollten. Es wurde ein patientenorientiertes Registerkonzept (Breast Cancer Care for patients with metastatic disease (BRE-4-MED)) für den metastasierten Brustkrebs entwickelt und hinsichtlich vordefinierter Machbarkeitskriterien pilotiert. An der BRE-4-MED-Pilotstudie nahmen 31 Patientinnen (96.8% weiblich) teil. Die bayernweite Erreichbarkeit zu brustkrebsspezifischen Versorgungsstrukturen wurde mithilfe einer Geographic Information System (GIS)-Analyse untersucht. Anhand von Leitlinienempfehlungen und Ergebnissen der BRE-4-MED-Pilotstudie wurden relevante Versorgungsstrukturen identifiziert. Die Ergebnisse der Pilotstudie zeigen, dass die Integration von Primär- und Sekundärdaten aus verschiedenen Quellen in ein zentrales Studienregister machbar ist und die erforderlichen organisatorischen Prozesse (z. B. data linkage mit Krebsregister) funktionieren. Die Ergebnisse der Erreichbarkeitsanalyse verdeutlichen, dass es keine bayernweite Erreichbarkeit zu brustkrebsspezifischen Versorgungsstrukturen gibt. Am stärksten war dieser Zusammenhang in grenznahen Regionen ausgeprägt. Die vorliegende Arbeit zeigt Chancen für eine patientenorientierte, qualitätsgesicherte Brustkrebsversorgung unabhängig vom Wohnort auf. N2 - For the diagnosis and treatment of breast cancer evidence- and consensus-based recommendations are provided by the national S3-guideline. The comprehensive clinical cancer registries provide intersectoral and multispecialty data on diagnosis and therapy for quality assurance. However, information on patient-reported outcome measures (PROMs) are still lacking. With demographic change, breast cancer will continue to increase, especially in rural areas. Therefore, care structures should be accessible to all patients. A patient-centered registry concept (Breast Cancer Care for patients with metastatic disease (BRE-4-MED)) has been developed for metastatic breast cancer. The concept was tested in a pilot study utilizing predefined feasibility criteria. Bavaria-wide accessibility to breast cancer-specific care structures was studied using a Geographic Information System (GIS) analysis. Guideline recommendations and results of the BRE-4-MED pilot study were used to identify relevant care structures. Thirty-one patients (96.8% female) from four certified breast centers of Mainfranken participated. The results of the pilot study show that the integration of primary and secondary data from different sources into a central database is feasible and the underlying organizational processes (e.g., data linkage with the cancer registry, central follow-up survey) worked out. The results of the accessibility analysis show that women from urban regions had a higher chance of reaching selected care structures than women from rural regions. This relationship was most pronounced for border-close areas. This thesis highlights opportunities for patient-centered and quality-assured breast cancer care regardless of patients’ residence. KW - Brustkrebs KW - Klinischer Behandlungspfad KW - Patientenorientierte Medizin KW - Ländlicher Raum KW - Qualitätssicherung KW - Versorgungsqualität KW - Leitlinien KW - Patienten-orientierte Versorgung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-282474 ER - TY - THES A1 - Frömbling, Greta Eliza T1 - Verstärkung der Wirkung von TTFields auf Glioblastomzellen durch Inhibition des mitotischen Spindelkontrollpunktes T1 - Augmentation of the effects of TTFields on glioblastoma cells by mitotic checkpoint inhibition N2 - TTFields sind eine Therapieoption des GBM, welche als alternierende elektrische Felder den Aufbau des mitotischen Spindelapparates stören. Gleichzeitig überwacht der SAC, mit seiner Schlüsselkomponente der Kinase MPS1, eine korrekte Anheftung der Spindelfasern an die Kinetochore der Chromosomen. Eine Inhibition des SAC durch den Inhibitor MPS1-IN-3 in Kombination mit Vincristin führt zu einem synergistischen Effekt auf das Tumorwachstum in vitro und in vivo. Aus diesen Erkenntnissen folgerten wir die Hypothese, dass eine SAC-Inhibition die Wirkung von TTFields verstärken könnte. Um dies zu testen, wurden Zellen der Zelllinien U87 und GaMG über 72h mit TTFields, MPS1-IN-3 oder einer Kombination aus den beiden behandelt. Anschließend wurden die Zellen gezählt, es wurde eine Analyse des Zellzyklus vorgenommen und apoptotische Zellen wurden via TUNEL-Assay detektiert. Die Kombinationsbehandlung aus TTFields und MPS1-IN-3 führte zu einer Reduktion der Zellzahl (U87: -54,3% vs. TTFields, p=0,0046; -52,9% vs. MPS1-IN-3, p=0,0026; GaMG: -74,3% vs. TTFields, p=0,0373; -84% vs. MPS1-IN-3, p<0,00001). Nur 28,1% mehr Zellen als ausgesät waren bei der Zelllinie U87 zu finden (TTFields: 179,1%; MPS1-IN-3: 168,3%), während es bei GaMG-Zellen sogar 62% weniger Zellen als ausgesät waren. Im Zellzyklus zeigte sich eine Abnahme der Zellen von der G1-Phase (U87: -59,9% vs. TTFields, p=0,0007; -42,1% vs. IN-3, p=0,0426; GaMG: -45,1% vs. TTFields, p=0,0276; -51,6% vs. IN-3, p=0,0020), während es zu einem massiven Anstieg von toten Zellen kam (U87: 2,9fach vs. TTFields, p=0,0022; 2,2fach vs. IN-3, p=0,0046; GaMG: 5,6fach vs. TTFields, p=0,0078; 7,8fach vs. IN-3, p=0,0005). Diese Zellen ließen sich im TUNEL-Assay als durch Apoptose zu Grunde gegangene Zellen weiter identifizieren (U87: 5,4fach vs. TTFields, p=0,0489; 6,2fach vs. IN-3, p=0,0278; GaMG: 8,9fach vs. IN-3, p=0,0110). Diese Ergebnisse sind erste und wichtige Hinweise für eine Verstärkung der Wirkung von TTFields durch eine Inhibition des SAC und liefern eine gute Grundlage für weitere Forschung zur Verbesserung der Therapie des GBM. N2 - TTFields are -in addition to the standard therapy- approved for GBM therapy. TTFields are alternating electric fields at a low intensity, which cause disruption of the mitotic spindle fibers. Whether spindle fibers are properly attached to the kinetochores is surveilled by the SAC. An inhibition of the kinase MPS1, a key component of the SAC, in combination with Vincristine treatment, results in a synergistic effect on GBM growth in vitro an in vivo (Tannous, Kerami et al. 2013). We hypothesized that a combination of inhibition of SAC in combination with TTFields increases TTFields efficacy. Cells of the cell lines U87 and GaMG were treated either with TTFields alone, the inhibitor MPS1-IN-3 alone or in combination of both. After 72h cells were counted, an analysis of the cell cycle was performed and apoptotic cells were detected by using a TUNEL-Assay. The combined treatment of TTFields and inhibition of SAC led to a significant decrease of cells (U87: -54.3% vs. TTFields, p=0.0046; -52.9% vs. MPS1- IN-3, p=0.0026; GaMG: -74.3% vs. TTFields, p=0.0373; -84% vs. MPS1-IN-3, p<0.00001). U87 cells proliferated only by 28.1% compared to the cells seeded at the beginning, while cells of the GaMG cell line diminished by 62% compared to the number of cells seeded (TTFields: 179.1%; MPS1-IN-3: 168.3%). The cell cycle analysis showed -among other effects- a reduction of the cells in phase G1 (U87: - 59.9% vs. TTFields, p=0.0007; -42.1% vs. IN-3, p=0.0426; GaMG: -45.1% vs. TTFields, p=0.0276; -51.6% vs. IN-3, p=0.0020), and an increase of dead cells (U87: 2.9x vs. TTFields, p=0.0022; 2.2x vs. IN-3, p=0.0046; GaMG: 5.6x vs. TTFields, p=0.0078; 7.8x vs. IN-3, p=0.0005). Those dead cells were identified by the TUNEL- Assay as cells, which had undergone apoptosis (U87: 5.4x vs. TTFields, p=0.0489; 6.2x vs. IN-3, p=0.0278; GaMG: 8.9x vs. IN-3, p=0.0110). These results strengthen the hypothesis that TTFields’ efficacy is increased by a combined treatment with an inhibition of the SAC and provide a basis for further research to improve GBM therapy. KW - Tumortherapiefeld KW - TTF KW - Tumor Treating Fields KW - TT-Fields KW - Glioblastomtherapie KW - therapy of glioblastoma Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216863 ER - TY - THES A1 - Diebold, Mathias T1 - Virtuelles Screening und Entwicklung selektiver Liganden des Aurora-A – MYCN Komplexes und computergestützte Methoden zur Analyse und Design von PROTACs T1 - Virtual screening and development of selective ligands for the Aurora-A - MYCN complex and computational methods for analysis and design of PROTACs N2 - Die Interaktion des onkogenen Transkriptionsfaktors MYCN mit der Ser/Thr Kinase Aurora-A verhindert dessen Abbau über das Ubiquitin Proteasomsystem indem die Rekrutierung des SCF FbxW7 Komplexes verhindert wird. Die Kinase nimmt mit der Bindung an MYCN eine aktive Konformation ein und erhält somit die Fähigkeit zur Kinaseaktivität ohne die sonst notwendige Phosphorylierung von Thr288 oder die Anwesenheit eines Aktivators wie TPX2. Da hohe MYCN Konzentrationen Tumore wie Neuroblastome antreiben, ist die Störung der Komplexbildung mit Aurora-A eine valide Strategie zur Entwicklung von Chemotherapeutika. Einige Inhibitoren von Aurora-A wie Alisertib (MLN8237) sind in der Lage, eine Konformationsänderung in der Kinase zu verursachen, die mit der Bindung von MYCN inkompatibel ist und auf diese Weise den Abbau des Transkriptionsfaktors induziert. Da Aurora-A wichtige Funktionen in der Mitose übernimmt, könnte eine direkte Adressierung des Komplexes anstelle einer systemischen Inhibition der Kinase vielversprechender sein. Ziel des Projektes war die Identifizierung von Molekülen, die selektiv an das Interface des Aurora-A – MYCN Komplexes binden und weiter optimiert werden können, um einen gezielten Abbau des Transkriptionsfaktors über einen PROTAC Ansatz zu ermöglichen. Virtuelle Screenings und molekulardynamische Simulationen wurden durchgeführt, um kommerziell erhältliche Verbindungen zu identifizieren, welche mit einer Bindetasche des Komplexes interagieren, die nur zustande kommt, wenn beide Proteine miteinander interagieren. Aus einem ersten Set von zehn potentiellen Liganden wurde für vier eine selektive Interaktion mit dem Protein – Protein Komplex gegenüber Aurora-A oder MYCN alleine in STD-NMR Experimenten bestätigt. Zwei der Hits besaßen ein identisches Grundgerüst und wurden als Ausganspunkt für die Optimierung zu potenteren Liganden genutzt. Das Gerüst wurde fragmentweise vergrößert und in Richtung besserer in-silico Ergebnisse und Funktionalisierung zur Anbringung von E3-Ligase-Liganden optimiert. Neun dieser Liganden der zweiten Generation wurden synthetisiert. Um quantitative Bindungsdaten zu erhalten, wurde ein kovalent verknüpftes Aurora-A – MYCN Konstrukt entworfen. Die strukturelle und funktionale Integrität wurde in STD-NMR und BLI Experimenten mit bekannten Aurora-A Inhibitoren bestätigt, sowie in NMR-basierten ATPase Assays. Zusätzlich konnte die Kristallstruktur des Konstrukts gelöst und damit die Validität des Designs bestätigt werden. Quantitative Messungen der synthetisierten Moleküle identifizierten HD19S als Hit mit einer zehnfach höheren Affinität für das Aurora-A – MYCN Konstrukt im Vergleich zu der Kinase allein. Zusätzlich wurden in-silico Untersuchungen zu PROTACs der Aurora-A Kinase durchgeführt. Interaktionen zwischen Aurora-A, der E3-Ligase Cereblon und den Liganden wurden modelliert und für die Erklärung unterschiedlicher Aktivitäten der eingesetzten PROTACs verwendet. Zudem zeigte das aktivste PROTAC eine hohe Selektivität für Aurora-A gegenüber Aurora-B, obwohl die verwendete Erkennungseinheit (Alisertib) an beide Aurora-Proteine bindet. Dieser Umstand konnte durch energetische Analysen von molekulardynamischen Simulationen der ternären Komplexe erklärt werden. Optimierungsmöglichkeiten für eine effizientere Degradation von Aurora-A durch die PROTACs wurden basierend auf modifizierten Erkennungseinheiten und verbesserten Linkern untersucht. N2 - The association of the oncogenic transcription factor MYCN with the Ser/Thr kinase Aurora-A prevents its degradation via the ubiquitin proteasome system by preventing the SCF FbxW7 complex from binding. The kinase adopts an active conformation when bound to MYCN, enabling kinase activity without prior phosphorylation on Thr288 or the presence of an activator like TPX2, and therefore at inappropriate times during the cell cycle. As high levels of MYCN have been shown to drive cancers like neuroblastoma, disrupting the complex formation is thought to be a viable development strategy for chemotherapeutics. Several small-molecule inhibitors of Aurora-A, like Alisertib (MLN8237), are able to induce a conformational change in the kinase, preventing the formation of the protein – protein complex and therefore promoting MYCN degradation. However, since Aurora-A has important roles during mitosis targeting only the complex could be a more promising approach than the systemic inhibition of the kinase. This project aimed to identify small molecules which selectively bind at the Aurora-A – MYCN interface and can be further optimized to induce targeted degradation via a PROTAC approach. Virtual screenings and molecular dynamics simulations were performed to identify commercially available compounds which should bind to a pocket formed only when the two proteins come together. Of a first set of ten potential binders, four showed binding to the Aurora-A – MYCN complex but not the individual proteins in STD-NMR experiments. Two of these hit molecules contained the same scaffold and were used as a starting point for optimization towards more potent ligands. In a fragment-based fashion, the scaffold was grown to achieve better affinity in-silico and provide linkage points for functionalization such as the attachment of E3 ligase ligands to create PROTACs. Nine of these second-generation compounds were then synthesized. In order to obtain quantitative binding data a covalently linked Aurora-A – MYCN construct was designed. Its structural and functional validity was shown in STD-NMR and BLI experiments with known Aurora-A inhibitors and in NMR-based ATPase assays. In addition, a crystal structure of the construct was solved, validating the designed structure. Quantitative measurements with the synthesized compounds revealed a positive hit (HD19S) with a ten-fold higher affinity to the covalently linked AuroraA – MYCN as compared to Aurora-A alone. Additionally, effects of PROTACs designed to degrade Aurora-A were studied in-silico. Interactions between Aurora-A, the E3-ligase Cereblon and small molecules were modelled and successfully used to explain the differences in activities observed with different PROTACs. The most active PROTAC also showed a high selectivity for Aurora-A over Aurora-B, even though the recognition unit (Alisertib) can bind both family members. Through energetic analysis of molecular dynamics simulations of the ternary complexes, these differences could be explained. Optimizations for a more efficient degradation of Aurora-A by the PROTACs were examined by changing the recognition unit and improving linkers. KW - Arzneimitteldesign KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Vernetzung KW - Wirkstoffdesign KW - PROTAC KW - Proteolysis-Targeting-Chimera KW - Aurora-A KW - MYCN KW - Aurora-A-MYCN-Komplex Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317594 ER - TY - THES A1 - Gschwendtner, Kathrin M. T1 - Von den Genen zum Verhalten: Der Einfluss des COMT Val158Met Polymorphismus auf visuell-räumliche Aufmerksamkeitslenkung bei emotionalen Verarbeitungsprozessen T1 - From Genes to Behavior: The Impact of the COMT Val158Met Polymorphism on visual-spatial Attention Control in Emotional Processing N2 - Der Catechol-O-Methyltransferase (COMT) Val158Met Polymorphismus (rs4680) ist am Abbau von Dopamin und Noradrenalin im menschlichen Gehirn beteiligt. In bisherigen Studien konnte gezeigt werden, dass das Met-Allel mit einer erhöhten Reaktivität auf negative Stimuli assoziiert ist. Auf Basis der Tonischen/ Phasischen Dopaminhypothese wird postuliert, dass diese erhöhte Reaktivität auf negative Reize durch defizitäre Disengagementprozesse verursacht sein könnte. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, diese theoretische Annahme mithilfe von Blickbewegungsmessungen zu überprüfen und zu untersuchen, ob die erhöhte Reaktivität sich auch in verlängerten Disengagementlatenzen von negativen Reizen widerspiegelt. Es wurden dafür drei Studien durchgeführt, in denen eine adaptierte Version der emotionalen Antisakkadenaufgabe in Verbindung mit einer Blickbewegungsmessung eingesetzt wurde. In der zweiten Studie wurde zusätzlich eine EEG-Messung durchgeführt. Außerdem wurde in der dritten Studie die Aufmerksamkeitslokation manipuliert. In der ersten und zweiten Studie zeigte sich nicht wie erwartet ein linearer Effekt in Relation zum COMT Val158Met Polymorphismus, sondern ein Heterosiseffekt. Dieser Effekt zeigte sich nur in der einfacheren Prosakkadenbedingung. In der ersten Studie wurde der Heterosiseffekt bei negativen Reizen gefunden, wohingegen in der zweiten Studie der Heterosiseffekt nur in einer EEG- Komponente, der Early Posterior Negativity (EPN), aber sowohl bei positiven als auch negativen Reizen gefunden wurde. In der dritten Studie zeigte sich kein Genotypeffekt. Es wird vermutet, dass der COMT Effekt in der emotionalen Verarbeitung aufgabenspezifisch sein könnte und daher, neben linearen Zusammenhängen, unter bestimmten Umständen auch ein Heterosiseffekt auftreten kann. Die Ergebnisse sollten nicht auf eine männliche Stichprobe generalisiert werden, da in allen Studien lediglich weibliche Versuchspersonen teilnahmen. N2 - The catechol-O-methyltransferase (COMT) Val158Met polymorphism (rs4680) moderates dopamine and norepinephrine degradation in the prefrontal cortex. It has been shown that the Met-Allele is associated with an increased reactivity to negative stimuli. With regard to the tonic-phasic dopamine model it is hypothesized that this increased reactivity to negative stimuli derives from deficient disengagement from negative stimuli. The aim of this work was therefore to investigate whether this increased reactivity is reflected in prolonged disengagement from negative pictures. Three studies were conducted, in which an adapted version of the emotional antisaccade task in combination with Eye Tracking was used. This paradigm allows for varying task difficulty. In the second study additionally an EEG measurement was recorded. Furthermore, in the third study the location of the attention was manipulated. Unexpectedly, in the first and second study we did not find a linear effect in relation to the COMT polymorphism, but a heterosis effect. This effect was found only in the simpler Prosaccade condition. In the first study the heterosis effect was found for negative stimuli, whereas in the second study the heterosis effect was found for positive as well as negative stimuli in one EEG component, the Early Posterior Negativity (EPN). The third study yielded no Genotype effect. It is suggested that the COMT effect on emotional processing is task-specific and therefore besides linear effects a heterosis effect might also occur under certain circumstances. In all three studies, only female subjects participated. Therefore the results should not be generalized to a male sample. KW - Dopaminstoffwechsel KW - Polymorphismus KW - Elektroencephalographie KW - Blickbewegung KW - Noradrenalinstoffwechsel KW - Emotionsverarbeitung KW - emotional processing KW - attention KW - eyetracking KW - EEG KW - dopamine KW - Aufmerksamkeit Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83278 ER - TY - THES A1 - Meister, Jonas T1 - Wertigkeit operativer Stimmangleichung bei Mann-zu-Frau-Transsexualismus – Evaluation der Glottoplastik nach Wendler modifiziert durch Hagen T1 - Value of phonosurgical intervention in male-to-female transsexualism – Evaluation of the Wendler-glottoplasty modified by Hagen N2 - Transsexualität ist gekennzeichnet durch die dauerhafte Gewissheit, in einem Körper des falschen Geschlechts geboren worden zu sein. Bei Mann-zu-Frau-Transsexualität ist die Stimme ein oft unterschätzter Bestandteil der ganzheitlichen Therapie. Kann mit konservativer Therapie kein zufriedenstellend weiblicher Stimmklang erreicht werden, ist Phonochirurgie die Methode der Wahl. In Würzburg wird hierzu die Glottoplastik nach Wendler modifiziert durch Hagen angewendet. An der vorliegenden Studie zur Qualitätsüberprüfung des operativen Verfahrens nahmen insgesamt 21 auf diese Art operierte Patientinnen teil, von denen 18 zu einer Nachuntersuchung in Würzburg erschienen und 3 die zugsandten Fragebögen ausfüllten. Erwartet wurden eine Anhebung der mittleren Sprechstimmlage sowie eine Veränderung weiterer objektiver Stimmparameter. Mit einer angehobenen Sprechstimmlage wurde auch eine höhere Zufriedenheit der Patientinnen mit ihrer Stimme vermutet. Nach Erfahrungsberichten vieler Patientinnen blieben Probleme beim Telefonieren jedoch weiterhin bestehen. Diese für den subjektiven Therapieerfolg sehr wichtige Situation wurde mit einer Perzeptionsstudie gezielt untersucht. Insgesamt zeigte sich die Operation als risikoarme und effektive Therapieoption, um die mittlere Sprechstimmlage anzuheben. So lag die mittlere Sprechstimmlage der Patientinnen postoperativ im Median bei 170 Hz und somit im ausschließlich weiblichen Stimmlagenbereich. Die Anhebung der mittleren Sprechstimmlage ging mit einem leichten Verlust des Dynamikumfangs einher, der jedoch nur von ca. einem Drittel der Patientinnen als störend empfunden wurde. Zur subjektiven Erfolgskontrolle wurden Daten aus den standardisierten Fragebögen „Voice Handicap Index“ sowie „Fragebogen zur Lebenszufriedenheit“ und dem eigenen „Würzburger Fragebogen“ erhoben und ausgewertet. Die Ergebnisse dieser Fragebögen zeigten, abweichend von den guten objektiven Messwerten, deutliche Einschränkungen gegenüber einer stimmgesunden Vergleichsgruppe aus der Literatur. Diese Defizite betrafen sowohl die stimmbezogenen Fragengebiete des Voice Handicap Index, als auch die allgemeine Lebenszufriedenheit. Dennoch gaben die Patientinnen an, durch die Stimmoperation ein selbstsichereres Auftreten gegenüber fremden Personen gewonnen zu haben. Die subjektive Stimmzufriedenheit korrelierte sowohl mit der mittleren Sprechstimmlage als auch mit der Selbsteinschätzung der Weiblichkeit der Stimme. Bei Frequenz- und Dynamikumfang zeigten sich starke Differenzen zwischen objektiven Messergebnissen und subjektiver Zufriedenheit. Für die Perzeptionsstudie zur Telefonsituation wurden von 18 Patientinnen sowie jeweils im Alter gepaarten männlichen und weiblichen Kontrollsprechern identische Sprachaufnahmen angefertigt und in der Frequenz entsprechend der Übertragungs-bandbreite am Telefon bearbeitet. Diese Stimmproben wurden 50 männlichen und 50 weiblichen zufällig ausgewählten Laienjuroren zur Bewertung hinsichtlich des Sprechergeschlechts vorgespielt. Gemessen wurde neben dem Urteil männlich oder weiblich auch die Zeitspanne von Beginn der Wiedergabe bis zur Urteilseingabe. Ungefähr 40 % der transsexuellen Patientinnen wurden mehrheitlich, also in über 50 % der Urteile als weiblich bewertet. Die Urteilszeit lag für die Sprachproben der transsexuellen Patientinnen signifikant über der Urteilszeit für männliche und weibliche Kontrollsprecher. Bezogen auf die Juroren zeigten sich Unterschiede zwischen männlicher und weiblicher Jurorengruppe: Männer ordneten die Sprachproben häufiger einem weiblichen Sprecher zu. Weibliche Juroren fällten ihr Urteil hingegen signifikant schneller als männliche Juroren. Es zeigte sich eine positive Korrelation der Geschlechtszuordnung mit der mittleren Sprechstimmlage. Die unabhängig von der Sprechstimmlage deutlich verlängerte Urteilszeit für transsexuelle Sprecherinnen zeigte jedoch, dass neben der mittleren Sprechstimmlage auch noch andere Faktoren die Geschlechtszuordnung beeinflussen. Dementsprechend existierte keine klare Grenzfrequenz, oberhalb derer Stimmen regelhaft als weiblich wahrgenommen wurden. Auch in einem in der Literatur mehrfach als ausschließlich weiblich definierten Sprechbereich wurden die Stimmen einzelner Patientinnen mehrheitlich als männlich wahrgenommen. Es konnte kein Zusammenhang der Formantfrequenzen F1 – F3 mit der Geschlechtszuordnung gefunden werden. Zusammenfassend zeigten diese aus objektiven Stimmdaten, Eigen- und Fremd-bewertung bestehenden Ergebnisse, dass durch alleinige Operation zwar eine höhere Stimmlage, jedoch kein vollständig weiblicher Stimmklang erreicht wurde. Deswegen muss die Phonochirurgie zukünftig stärker in ein umfassendes Behandlungskonzept aus logopädischem Stimmtraining, Übungen für eine weibliche Gestik und Mimik sowie Alltagstraining eingebunden werden. Hierzu wurde in dieser Arbeit ein neuer Behandlungsalgorithmus für die Univ.-HNO-Klinik Würzburg erstellt. N2 - Transsexualism is a problem of gender identity with the individual being firmly convinced that his or her psychological gender is the opposite of his or her anatomic gender. After long and burdensome therapy consisting of medical and psychological treatments transgender persons obviously wish to be accepted in the society with their new gender role. The voice as a secondary sexual characteristic is an important factor of gender perception. In cases for which conservative voice therapy is unable to produce satisfactory results, surgery may be offered. In Würzburg, Wendler’s glottoplasty modified by Hagen is the preferred treatement. In this study, objective and subjective therapy success of 21 male-to-female-transgender persons after glottoplasty was investigated. Expected was an elevation of the fundamental frequency range and other objective voice parameters as well as a higher subjective voice satisfaction correlating with the higher frequency. Because many patients reported ongoing problems in everyday life, especially using the telephone to communicate, this situation was investigated in a perception test with 18 transgender speakers as well as 18 male and 18 control speakers. Altogether, Wendler’s glottoplasty modified by Hagen is an effective and low-risk method of raising the vocal pitch of male-to-female transgender persons. The fundamental frequency was elevated into the typical female fundamental frequency range. Furthermore an elevation of the lower frequency limit was shown without a reduction of the frequency range. About one third of the population feels affected by the restricted dynamic range. This change of the vocal pitch is seen as part of the voice feminization by some of the patients. The dysphonia severity index as a marker for voice quality was unchanged. Subjective satisfaction with the voice showed a strong correlation with the individual elevation of the pitch. Most of the patients stated to be more self-confident because of the voice therapy. However, elevated Scores of the Voice Handicap Index indicated that in everyday life transgender persons continue to feel handicapped because of their voice. Another indicator for the lack of social acceptance and integration is the reduced general life satisfaction in the Life Satisfaction Questionnaire, especially in the domain “friends, acquaintances, relatives”. But could these problems in everyday-life be objectified in the telephone test? In the perception study, speech samples were recorded of 18 MtF after Wendler’s glottoplasty, 18 male and 18 female persons. After adaption of the frequency to the limited frequency transmission on the telephone (300 – 3400 Hz) the speech samples were judged by 50 male and 50 female listeners. Parameters were the decision “male” or “female” and the decision time. The formant frequencies F1 – F3 for the vowel /a/ were extracted and compared between the speaker groups. About 40% of the transgender speakers were perceived as female by the majority of listeners. A correlation between fundamental frequency and perceptions as female could be shown. The decision time needed was longer for MtF than for male or female speakers. Female listeners decided significantly faster than male listeners. Female listeners perceived the MtF more often as male speaker. For the MtF, the perception as female correlated with their individual voice satisfaction. Comparing the formant frequencies of male and MtF speakers, F2 was higher for MtF, but there was no correlation between the formant frequencies and the gender perception of the judges. In summary this results shows, that phonosurgical intervention alone can elevate the vocal pitch but the voice is not necessarily perceived to be more female. Besides fundamental frequency many more parameters influences gender perception of a voice, for example the used freqeuency range, intonation, prosody, gesture, vocabulary and much more. So in future, phonosurgery has to be integrated in a multi-disciplinary therapy concept consisting of conservative and phonosurgical voice therapy, training of gestures and facial expression as well as every-day-life-training. To improve this comprehensive voice treatment, a new therapy algorithm for the University Hospital of Wuerzburg, Department of Otorhinolaryngology, Plastic, Aesthetic and Reconstructive Head and Neck Surgery, Würzburg, is presented in this thesis. KW - Transsexualismus KW - Stimmbandchirurgie KW - Kehlkopfchirurgie KW - Stimmerhöhung KW - Phonochirurgie KW - Glottoplastik Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159201 ER - TY - THES A1 - Koch, Thorsten Manfred T1 - Wirt – Pathogen Interaktion bei Hornhautinfektionen durch \(Fusarium\) spp. T1 - Host – Pathogen Interaction in Keratitis caused by \(Fusarium\) spp. N2 - Fusarium (F.)-Infektionen des Auges zeigen oft einen schwerwiegenden Verlauf und sind am häufigsten mit Spezies des Fusarium solani species complex assoziiert. Dabei sind das Tragen von weichen Kontaktlinsen sowie Traumata die wichtigsten prädisponierenden Faktoren. Vorangegangene Untersuchungen des Nationalen Referenzzentrums für invasive Pilzinfektionen hatten ergeben, dass Infektionen durch F. petroliphilum mit der Nutzung von Kontaktlinsen, Infektionen durch F. falciforme jedoch überwiegend traumaassoziiert uns vor allem aus tropischen und subtropischen Ländern bekannt sind. Das Ziel dieser Arbeit war es daher zu untersuchen, ob F. falcifomre und F. petroliphilum physiologische Merkmale aufweisen, die für die Unterschiede in den Risikofaktoren für Keratitiden durch die beiden Arten verantwortlich sein könnten. N2 - Fusarium (F.) - infections of the eye often show a severe course and are most frequentlyassociated with species (spp.) of the Fusarium solani species complex (van Diepeningen et al., 2014, Walther et al., 2017, Walther et al., 2018). Wearing soft contact lenses (CL) and trauma are the most important predisposing factors (Gaujoux et al., 2008, Thomas and Kaliamurthy, 2013, Ong et al., 2016, Bourcier et al., 2017). In previous studies of the National Reference Center for Invasive Fungal Infections it could be shown that infections caused by F. petroliphilum are associated with the use of CL, infections caused by F. falciforme, however, are predominantly trauma-associated and are mainly known from tropical and subtropical countries (Walther et al, 2018). This opposite behaviour of the spp. could be caused by differences in habitat and geographical distribution or by physiological differences such as germination rate, growth rate, tolerance to disinfectants, biofilm formation or cytotoxicity (Walther et al., 2018). Therefore, the aim of this study was to investigate whether F. falciforme and F. petroliphilum have physiological characteristics that could be responsible for the differences in the risk factors for keratitis between the two spp. For this purpose, the germination rate of the conidia and the length of the germ tubes of both Fusarium spp. was shown after staining of the conidia with fluorescein isothiocyanate and incubation at different incubation times in CL cleaning solutions at room temperature. A standardized approval test for CL cleaning solutions was carried out to investigate the behaviour of the conidia towards three different CL cleaning solutions that were available in Germany at the time of the investigations. Furthermore, the tolerance of the fungi to various CL cleaning solutions was examined in realistic conditions by incubating the conidia in CL cleaning solutions with CL overnight. The ability of biofilm formation was assessed by applying the conidia to CL from various manufacturers in Sabouraud-dextrose-broth and various CL cleaning solutions. The in vitro cytotoxicity of the conidia towards human corneal epithelial cells (HCE) was measured indirectly with the aid of a corneal epithelial cell model in aerobic and microaerophilic conditions via the lactate dehydrogenase release of HCE. Establishing a statement about the immune induction was possible due to the measurement of Interleukin-8 in the supernatants of the infection models. After the nightly incubation of the conidia in CL cleaning solutions, a lower germination rate was found for all F. petroliphilum isolates than for the F. falciforme isolates in one of the three cleaning solutions. It was remarkable that F. falciforme isolate 2015-96 was insensitive to this CL cleaning solution in this test setup. By contrast, the isolates did not show a different behaviour in the two other used CL cleaning solutions. It could be also shown that F. petroliphilum isolate 2014-79 germinates more frequently in one of the three tested cleaning solutions than F. falciforme, but at the same time the mycelium formation is effectively inhibited. All other isolates of both spp. behave similarly. After incubation the CL in CL cleaning solutions, no biofilm formation on the CL could be found in any of the two species in any of the test constellations, which could be due to the short incubation time or the inability of biofilm formation of the tested Fusarium spp. In the cytotoxicity and IL-8 experiments, no difference between the two spp. could be found. More realistic conditions in the test setup, such as e. g. a more realistic imitating of the effects of CL on corneal epithelial cells, could possibly reveal any differences. The natural pathogen reservoir could play the crucial role, why F. petroliphilum is more frequently associated of with corneal infections in CL users in moderate latitudes. A possible explanation could be that F. falciforme predominantly occurs in tropical areas and more often in the soil, whereas F. petroliphilum is more common in indoor areas. Another important result of my studies was that one of the tested CL cleaning solutions was proven to be ineffective against both Fusarium spp. Consequently, Fusarium would be able to get into the eyes of the CL wearer in large numbers through contamination of the CL in the cleaning vessel and trigger an infection. A further screening of CL cleaning solutions and the documentation of the cleaning solutions used by infected patients could show whether there is a connection between the occurrence of contact lens-associated eye infections and certain CL cleaning solutions. KW - Fusarium KW - Hornhautinfektionen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-347774 ER - TY - THES A1 - Schumann, Sarah T1 - Zeit- und Dosisabhängigkeit von DNA-Schäden induziert durch interne Bestrahlung mit unterschiedlichen Radionukliden T1 - Time and dose dependence of DNA damage induced by internal irradiation with various radionuclides N2 - In der Nuklearmedizin werden radioaktive Substanzen eingesetzt, um zu therapeutischen Zwecken gezielt bösartiges Gewebe zu zerstören oder in diagnostischen Anwendungen Stoffwechselvorgänge bildlich darzustellen. Die ionisierende Strahlung der eingesetzten Radionuklide kann jedoch auch DNA-Schäden in gesunden Zellen verursachen. DNA-Doppelstrangbrüche gehören dabei zu den kritischsten Läsionen, da sie schwer zu reparieren sind und eine fehlerhafte Reparatur zu Mutationen oder zum Zelltod führen kann. Während Radionuklidtherapien ist daher in Risikoorganen darauf zu achten, dass die deponierte Energie pro Masse, die Energiedosis, bestimmte Werte nicht überschreitet. Zu diesen Risikoorganen gehört auch das blutbildende System. Da eine Abschätzung der Energiedosis im Knochenmark häufig über die Bestimmung der Energiedosis im Blut als Surrogat erfolgt, ist deren Kenntnis von besonderem Interesse. In dieser Arbeit wurden daher Berechnungen der Energiedosis im Blut nach interner Bestrahlung durchgeführt und die Ergebnisse mit der Anzahl an strahlungsinduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen in PBMCs korreliert. Zur Quantifizierung der DNA-Schäden wurden die Biomarker \(\gamma\)-H2AX und 53BP1 verwendet, die nach Entstehung eines Doppelstrangbruchs um diesen akkumulieren und sich durch Immunfluoreszenzfärbung als mikroskopische Foci sichtbar machen und quantifizieren lassen. Dadurch ermöglicht der \(\gamma\)-H2AX+53BP1-Assay einen quantitativen Nachweis strahlungsinduzierter Doppelstrangbrüche. Somit konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Kenntnisse über die Dosisabhängigkeit von DNA-Schäden in PBMCs während interner Bestrahlung mit unterschiedlichen Radionukliden sowohl ex vivo als auch in vivo gewonnen werden. Ex-vivo-Untersuchungen haben den Vorteil, dass sie unter gleichbleibenden, gut definierten Bedingungen durchgeführt werden können und somit eine Analyse der Induktion von Doppelstrangbrüchen bei festgelegten Energiedosen und einer konstanten Bestrahlungsdauer erlauben. In dieser Arbeit wurden Blutproben von gesunden Versuchspersonen durch Zugabe von Radionukliden in bestimmten Aktivitätskonzentrationen eine Stunde lang intern bestrahlt. Für die Bestrahlung wurden die \(\alpha\)-Emitter \(^{223}\)Ra und \(^{224}\)Ra, die \(\beta\)\(^{-}\)-Emitter \(^{177}\)Lu und \(^{90}\)Y, der \(\beta\)\(^{+}\)-Emitter \(^{68}\)Ga und der \(\gamma\)-Emitter \(^{99m}\)Tc verwendet. Der untersuchte Energiedosisbereich lag zwischen 5 mGy und 136 mGy. Nach der Bestrahlung von Blutproben mit \(\beta\)- beziehungsweise \(\gamma\)-Emittern wurde beobachtet, dass die Anzahl der strahlungsinduzierten \(\gamma\)-H2AX+53BP1-Foci (RIF) in den PBMCs linear mit der Energiedosis im Blut ansteigt. Zudem zeigte sich, dass die Induktion der RIF unabhängig vom verwendeten Radionuklid und unabhängig von der Versuchsperson ist. Nach der Bestrahlung von Blutproben mit \(\alpha\)-Emittern waren zusätzlich zu den nach Expositionen mit \(\beta\)- beziehungsweise \(\gamma\)-Emittern beobachteten kleinen, runden Foci auch \(\gamma\)-H2AX+53BP1 enthaltende Spuren \(\alpha\)-Spuren) in den Zellkernen erkennbar, welche die Trajektorien der emittierten \(\alpha\)-Teilchen darstellten. Es konnte gezeigt werden, dass die Anzahl dieser \(\alpha\)-Spuren linear mit der Energiedosis im Blut zunimmt und damit ein geeigneter Parameter für die Biodosimetrie nach Expositionen mit \(\alpha\)-emittierenden Radionukliden ist. Auch in vivo wurde die Dosisabhängigkeit der DNA-Doppelstrangbrüche während der internen Bestrahlung durch Radionuklide mit unterschiedlichen Emissionseigenschaften untersucht. Aufgrund der neuen, vielversprechenden Entwicklungen von Radiopharmaka zur Therapie und Diagnostik des Prostatakarzinoms in den letzten Jahren wurden dafür Blutproben von Prostatakarzinom-Patienten während Therapie mit [\(^{177}\)Lu]Lu-PSMA I&T, während PET/CT-Diagnostik mit [\(^{68}\)Ga]Ga-PSMA I&T und während Therapie mit [\(^{223}\)Ra]RaCl\(_2\) untersucht. Während Therapie mit [\(^{177}\)Lu]Lu-PSMA I&T zeigte sich, dass die Anzahl der RIF in den ersten Stunden nach Therapiebeginn durch eine lineare Anpassungskurve angenähert werden kann, die mit der Energiedosis im Blut ansteigt, gefolgt von einem Rückgang der RIF zu späteren Zeitpunkten, der durch die DNA-Reparatur erklärt werden kann. Die gesamte Energiedosis im Blut lag im Mittel bei (109 \(\pm\) 28) mGy. Der linear dosisabhängige Anstieg der RIF zu Therapiebeginn gleicht der dosisabhängigen Induktion der RIF ex vivo nach Bestrahlung mit \(\beta\)- und \(\gamma\)-emittierenden Radionukliden und kann gut mit der entsprechenden Ex-vivo-Kalibrierkurve beschrieben werden. Zu späteren Zeitpunkten (48 h und 96 h nach Verabreichung) konnte in dieser Arbeit eine lineare Korrelation zwischen der Anzahl der noch verbleibenden RIF und der Dosisleistung nachgewiesen werden. Eine signifikante Korrelation der Anzahl der RIF 96 h nach Verabreichung mit dem PSA-Wert deutet zudem darauf hin, dass ein Zusammenhang mit klinischen Parametern besteht. Ein signifikanter Anstieg der \(\gamma\)-H2AX+53BP1-Foci konnte auch nach Verabreichung von [\(^{68}\)Ga]Ga-PSMA I&T für diagnostische PET/CT-Untersuchungen beobachtet werden, obwohl die Energiedosen im Blut bis zum PET/CT-Scan nur < 3 mGy betrugen. Im Vergleich zur Ex-vivo-Kalibrierkurve war die Steigung der linearen Anpassungskurve in vivo im Bereich < 3 mGy in dieser Studie etwa um ein Zehnfaches höher, was auf eine mögliche Hypersensitivität im Niedrigdosisbereich hindeuten könnte. Der Beitrag der CT zur Energiedosis im Blut konnte durch Ex-vivo-Experimente auf etwa 12 mGy abgeschätzt werden. Auch während Therapie mit [\(^{223}\)Ra]RaCl\(_2\) lagen die berechneten Energiedosen im Blut im Niedrigdosisbereich < 17 mGy. Trotzdem konnten in dieser Studie erstmalig \(\alpha\)-Spuren in vivo nach der Verabreichung eines \(\alpha\)-emittierenden Radionuklids quantifiziert werden, deren Anzahl 3 h und 4 h nach Verabreichung des Radiopharmakons signifikant erhöht war. Auch zu späten Zeitpunkten, bis vier Wochen nach Therapiebeginn, waren noch \(\alpha\)-Spuren nachweisbar, was auf eine unvollständige Reparatur der komplexen, durch die \(\alpha\)-Teilchen induzierten DNA-Schäden hinweisen könnte. Leider erlaubte die geringe Anzahl an Patienten und Datenpunkten keine zuverlässigen Korrelationen mit der Energiedosis oder mit klinischen Parametern. Nachdem in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass DNA-Schäden nach interner Bestrahlung mit \(\alpha\)-, \(\beta\)- und \(\gamma\)-emittierenden Radionukliden mit Hilfe des \(\gamma\)-H2AX+53BP1-Assays zuverlässig nachgewiesen und anhand der Schadensgeometrie unterschieden werden können, wäre es in Zukunft interessant, DNA-Schäden auch nach Bestrahlung mit Radionuklidgemischen zu untersuchen. Dies könnte sowohl im Hinblick auf den Nachweis von Inkorporationen bei Strahlenunfällen hilfreich sein als auch zu einem besseren Verständnis der Effekte bei Behandlungen mit Radionuklidgemischen beitragen, welche vielversprechende Möglichkeiten für nuklearmedizinische Therapien bieten. Zudem zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass insbesondere im für die Diagnostik relevanten Bereich sehr niedriger Energiedosen < 10 mGy weiterer Forschungsbedarf besteht. Durch die Untersuchung der dosisabhängigen Reparatur der durch interne Bestrahlung induzierten DNA-Schäden könnte beispielsweise analysiert werden, ob die Reparaturfähigkeit im Niedrigdosisbereich eingeschränkt ist. Außerdem wäre es gerade im Bereich niedriger Dosen von Interesse, zu untersuchen, inwiefern Beobachtungen ex vivo das Verhalten in vivo geeignet repräsentieren. Um die erhöhten statistischen Unsicherheiten im Niedrigdosisbereich zu reduzieren, könnten zukünftig Verbesserungen auf dem Gebiet der automatisierten Auswertung der \(\gamma\)-H2AX+53BP1 enthaltenden Foci und Spuren hilfreich sein. Weitere Ziele zukünftiger Forschungsvorhaben könnten gezielte Untersuchungen zu Korrelationen zwischen der dosisabhängigen Induktion und Reparatur von DNA-Schäden und klinischen Parametern sowie die Analyse von DNA-Schäden während mehrerer Therapiezyklen darstellen. In Zusammenhang mit der Analyse klinischer Parameter wäre es denkbar, dass biodosimetrische Auswertungen zukünftig auch zur personalisierten Therapieplanung oder auch zur Vorhersage des Therapieerfolgs dienen und somit langfristig zu einer Optimierung nuklearmedizinischer Therapien beitragen könnten. N2 - In nuclear medicine, radioactive substances are applied for therapeutic purposes to destroy malignant tissue, or in diagnostic applications to visualize metabolic processes. However, the ionizing radiation of the applied radionuclides can also cause DNA damage in healthy cells. Among these, DNA double-strand breaks belong to the most critical lesions because they are difficult to repair and misrepair can lead to mutations or cell death. Therefore, during radionuclide therapies, it is of great importance to ensure that the deposited energy per mass, the absorbed dose, does not exceed certain values in organs at risk. One of these organs at risk is the hematopoietic system. As the absorbed dose to the bone marrow is often estimated by determining the absorbed dose to the blood as a surrogate, knowledge of the latter is of particular interest. Therefore, in this thesis, calculations of the absorbed dose to the blood after internal irradiation were performed and the results were correlated with the number of radiation-induced DNA double-strand breaks in PBMCs. To quantify DNA damage, the biomarkers \(\gamma\)-H2AX and 53BP1 were used, which accumulate around a double-strand break after its formation and which can be visualized and quantified as microscopic foci by immunofluorescence staining. Consequently, the \(\gamma\)-H2AX+53BP1 assay allows a quantitative detection of radiation-induced double-strand breaks. Thus, by combining absorbed dose calculations with a quantitative analysis of DNA damage in PBMCs during internal irradiation with various radionuclides both ex vivo and in vivo, new knowledge was gained in the context of this work. Ex-vivo examinations have the advantage that they can be carried out under constant, well-defined conditions and thus allow an analysis of the induction of double-strand breaks at preset absorbed doses and a constant irradiation duration. In this work, blood samples from healthy test persons were internally irradiated for one hour by adding radionuclides at defined activity concentrations. For the irradiation, the \(\alpha\)-emitters \(^{223}\)Ra and \(^{224}\)Ra, the \(\beta\)\(^{-}\)-emitters \(^{177}\)Lu and \(^{90}\)Y, the \(\beta\)\(^{+}\)-emitter \(^{68}\)Ga and the \(\gamma\)-emitter \(^{99m}\)Tc were used. The absorbed dose ranged from 5 mGy to 136 mGy. After irradiating blood samples with \(\beta\)- and \(\gamma\)-emitters, it was observed that the number of radiation-induced \(\gamma\)-H2AX+53BP1 foci (RIF) in the PBMCs increases linearly with the absorbed dose to the blood. Furthermore, it was shown that the induction of RIF is independent of the radionuclide applied and the test person. After irradiating blood samples with \(\alpha\)-emitters, in addition to the small round foci observed after exposure to \(\beta\)- and \(\gamma\)-emitters, \(\gamma\)-H2AX+53BP1 containing tracks (\(\alpha\)-tracks) were visible in the nuclei, which represented the trajectories of the emitted \(\alpha\)-particles. It was shown that the number of these \(\alpha\)-tracks increases linearly with the absorbed dose to the blood and is, therefore, a suitable parameter for biodosimetry after exposure to \(\alpha\)-emitting radionuclides. The absorbed dose dependence of DNA double-strand breaks during internal irradiation with radionuclides with different emission properties was also investigated in vivo. Due to the promising new developments of radiopharmaceuticals for therapy and diagnostics of prostate cancer in recent years, blood samples from prostate cancer patients were examined during therapy with [\(^{177}\)Lu]Lu-PSMA I&T, during PET/CT diagnostics with [\(^{68}\)Ga]Ga-PSMA I&T and during therapy with [\(^{223}\)Ra]RaCl\(_2\). During therapy with [\(^{177}\)Lu]Lu-PSMA I&T, it was shown that the number of RIF in the first hours after therapy start can be approximated by a linear fitting curve, which increases with the absorbed dose to the blood, followed by a decrease in RIF at later time points, which can be explained by DNA repair. The total absorbed dose to the blood was (109 \(\pm\) 28) mGy on average. The linear absorbed dose-dependent increase in RIF at the beginning of therapy is similar to the absorbed dose-dependent induction of RIF ex vivo after irradiation with \(\beta\)- and \(\gamma\)-emitting radionuclides and can be well described with the corresponding ex-vivo calibration curve. At later time points (48 h and 96 h after administration), a linear correlation between the number of remaining RIF and the dose rate was demonstrated in this work. A significant correlation of the number of RIF 96 h after administration with PSA levels also suggests a link to clinical parameters. A significant increase in \(\gamma\)-H2AX+53BP1 foci was also observed after administration of [\(^{68}\)Ga]Ga-PSMA I&T for diagnostic PET/CT examinations, despite the fact that absorbed doses to the blood were only < 3 mGy by the time of the PET/CT scan. Compared to the ex-vivo calibration curve, the slope of the linear in-vivo fitting curve in the range < 3 mGy in this study was approximately ten times higher, which may indicate a possible hypersensitivity in the low dose range. The contribution of the CT to the absorbed dose to the blood was estimated at approximately 12 mGy by ex-vivo experiments. During therapy with [\(^{223}\)Ra]RaCl\(_2\), the calculated absorbed doses to the blood were also in the low dose range < 17 mGy. Nevertheless, this study was the first to quantify \(\alpha\)-tracks in vivo after the administration of an \(\alpha\)-emitting radionuclide, with a significantly increased number of \(\alpha\)-tracks 3 h and 4 h after administration of the radiopharmaceutical. Even at late time points, up to four weeks after therapy start, \(\alpha\)-tracks were still detectable, which could indicate incomplete repair of the complex DNA damage induced by \(\alpha\)-particles. Unfortunately, the small number of patients and data points did not allow reliable correlations with the absorbed dose or clinical parameters. In this thesis, it was shown that DNA damage after internal irradiation with \(\alpha\)-, \(\beta\)- and \(\gamma\)-emitting radionuclides can be reliably detected by applying the \(\gamma\)-H2AX+53BP1 assay and distinguished by damage geometry. For future work, it would be of interest to additionally investigate DNA damage after irradiation with mixtures of radionuclides. This could be helpful for the detection of incorporations after radiation accidents, and could also contribute to a better understanding of the effects of therapeutic applications of radionuclide mixtures, which offer promising opportunities for nuclear medicine therapies. Furthermore, the results of this work show that there is need for further research, especially in the very low dose range < 10 mGy, which is relevant for diagnostics. By investigating the absorbed dose-dependent repair of DNA damage induced by internal irradiation, for example, it could be analyzed whether the repair capability is limited in the low dose range. Particularly in the range of low doses, it would also be of interest to investigate to what extent observations ex vivo adequately represent the behavior in vivo. In order to reduce the increased statistical uncertainties in the low dose range, future improvements in the field of automated evaluation of \(\gamma\)-H2AX+53BP1 containing foci and tracks could be helpful. Further objectives of future research projects could be investigations focussing on correlations between the absorbed dose-dependent induction and repair of DNA damage and clinical parameters as well as an analysis of DNA damage over several therapy cycles. In the context of the analysis of clinical parameters, it is conceivable that biodosimetric assessments could enhance personalized treatment planning or the prediction of therapy success, thus contributing, in the long-term, to an optimization of nuclear medicine therapies. KW - Nuklearmedizin KW - Dosimetrie KW - Radionuklid KW - DNS-Doppelstrangbruch KW - Biomarker KW - Medizinphysik KW - gamma-H2AX KW - 53BP1 KW - nuclear medicine KW - dosimetry KW - radionuclide KW - DNA damage KW - medical physics Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-223904 ER - TY - THES A1 - Bonn, Maria Roswitha T1 - Zielstrukturen des serotonergen Systems in der laterobasalen Amygdala : Untersuchungen an Ratten und einem Mausmodell für emotionale Dysregulation T1 - Targets of the serotonergic system in the laterobasal amygdala : investigations in rats and a mouse model for emotional dysregulation N2 - Die Amygdala ist ein Kernkomplex, der dicht von serotonergen Afferenzen innerviert wird. Sowohl bei Tieren als auch beim Menschen spielen Interaktionen zwischen dem serotonergen System und der Amygdala bei der Verarbeitung von Reizen, die mit Angst oder Stress assoziiert sind, eine zentrale Rolle. Genetische Variationen im serotonergen System und/oder dauerhafter Stress können dazu führen, dass diese Verarbeitungsprozesse fehlerhaft ablaufen, wodurch Verhaltensanormalitäten bzw. die Entstehung psychiatrischer Erkrankungen begünstigt werden. Die Zielneurone der serotonergen Transmission in der Amygdala, die molekularen Mechanismen möglicher Interaktionen und strukturelle Konsequenzen der Störungen dieser Interaktionen sind jedoch bis zum heutigen Zeitpunkt noch nicht vollständig bekannt. Daher bestand ein Ziel der vorliegenden Arbeit darin, den Einfluss eines Ungleichgewichts im serotonergen System (5-Htt KO) sowie von wiederholtem, sozialem Stress auf die neuronale Morphologie der Amygdala zu analysieren und Zielneurone serotonerger Afferenzen zu identifizieren und zu charakterisieren, um die neuronalen Netzwerke der Emotionsverarbeitung besser verstehen zu können. Um vom 5-Htt–Genotyp abhängige und stressbedingte neuromorphologische Veränderungen zu untersuchen, wurden dreidimensionale Rekonstruktionen von Neuronen der laterobasalen Amygdala von männlichen, adulten Wildtyp (WT)- und 5-Htt KO-Mäusen angefertigt und bezüglich verschiedener morphologischer Parameter ausgewertet. An den Pyramidenzellen wurden nur geringfügige Veränderungen der dendritischen Komplexität, jedoch, im Vergleich zu WT-Mäusen, eine wesentliche Erhöhung der Dornendichte an spezifischen dendritischen Kompartimenten bei gestressten WT-Mäusen, sowie nicht gestressten und gestressten 5-Htt KO-Mäusen nachgewiesen. Im Vergleich zu nicht gestressten WT–Mäusen war die dendritische Dornendichte aller anderen Gruppen gleichermaßen erhöht. Die Sternzelle, zeigten bezüglich der untersuchten Parameter keine morphologischen Veränderungen auf. Eine besondere Subpopulation der Interneurone stellen die NeuropeptidY (NPY)–Neurone der laterobasalen Amygdala dar, da sie in diesen Nuclei anxiolytisch wirken. Es gibt nur wenige Anhaltspunkte darüber, durch welche Systeme NPY–Neurone moduliert werden. Da sowohl NPY–Neurone in der laterobasalen Amygdala als auch das serotonerge System an angstregulierenden Prozessen beteiligt sind, sollte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob es sich bei diesen Neuronen um Zielstrukturen des serotonergen Systems handelt. Mittels licht- und elektronenmikroskopischer Analysen wurden synaptische Kontakte zwischen serotonergen Afferenzen und NPY-immunreaktiven Neuronen in der laterobasalen Amygdala von Ratten verifiziert. Da der funktionelle Einfluss der serotonergen Innervation auf diese Zielneurone von deren Serotoninrezeptor (5-HTR)-Ausstattung abhängt, wurden Koexpressionsanalysen von NPY mRNA mit den mRNAs verschiedener 5-HTR durchgeführt. Die Analysen ergaben, dass NPY mRNA–reaktive Neurone in der laterobasalen Amygdala 5-HT1A und 5-HT2C, jedoch nicht 5-HT3 mRNA koexprimieren. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten Resultate liefern neue Erkenntnisse über den Einfluss des serotonergen Systems auf die laterobasale Amygdala von Mäusen und Ratten. Bei den Veränderungen der dendritischen Dornendichte nach sozialen Stresserfahrungen könnte es sich um neuroadaptive bzw. kompensatorische Mechanismen der Pyramidenzellen handeln, die WT-Mäusen eine Anpassung an sich ändernde, negative Umweltbedingungen ermöglicht. Die erhöhte Dornendichte könnte dabei die Ausbildung eines „emotionalen Gedächtnisses“ repräsentieren, das eine flexible Verhaltensantwort auf ein erneutes Auftauchen von Gefahr erlaubt. Eine solche Modulation der Erregbarkeit der laterobasalen Amygdala könnte beispielsweise über eine situationsentsprechende Hemmung des Outputs der Pyramidenzellen durch differentiell aktive inhibitorische Netzwerke erfolgen. Eine differentielle Aktivierung kann z. B. über unterschiedliche Rezeptorausstattungen, wie es in der Subpopulation der NPY–Neurone in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen wurde, erfolgen. Das erhöhte angstähnliche Verhalten der 5-Htt KO-Mäuse nach wiederholtem Stress könnte mit der Unfähigkeit zusammenhängen, in entsprechenden Situationen durch Neubildung von Dornen zu reagieren, da die Dornendichte bei diesen Tieren schon unter stressarmen Umweltbedingungen ihr Maximum erreicht hat. Sowohl Fehlfunktionen der neuronalen Plastizität als auch mögliche Fehlfunktionen der differentiellen Inhibierung der Pyramidenzellen durch Interneurone, die durch genetische Variationen und/oder Stress bedingt sein können, könnten eine „offene Tür“ repräsentieren, die zu manifesten Auffälligkeiten im Verhalten bei Tieren führt bzw. auch zur Entstehung bestimmter psychiatrischer Erkrankungen beim Menschen beiträgt. N2 - The amygdala is a heterogenous nuclear complex, which belongs to the limbic system and recieves a dense serotonergic innervation. In animals and in humans, interactions between the serotonergic system and the amygdala play a key role in emotional stimulus processing, especially for anxiety- and stress–related stimuli. Genetic variations within the serotonergic system and/or chronic stress can cause dysregulation of these mechanisms, which promote abnormal behavior and development of psychiatric disorders, respectively. Up to now, the target neurons of serotonergic neurotransmission in the amygdala, the molecular mechanisms of possible interactions and morphological consequences of dysregulation of these interactions are not investigated completely, yet. Thus, one aim of this thesis was to analyze the impact of an imbalance within the serotonergic system (serotonin transporter knock out, 5-Htt KO) and repeated social stress on neuronal morphology in the amygdala and to identify and characterize target neurons of serotonergic afferents. This will help to get a better understanding of the neuronal networks associated with emotional stimulus processing. To investigate 5-Htt genotype–dependent and stress–related neuromorphological changes, three-dimensional reconstructions of pyramidal cells and stellate interneurons of the laterobasal amygdala of male, adult wildtype (WT) and 5-HttKO mice were carried out and different morpholgical parameter were analyzed. Pyramidal cells displayed only subtle changes in dendritic complexity but a significant increase in spine density on specific dendritic compartments in stressed WT mice and naïve and stressed 5-HttKO mice, compared to naïve WT mice. In all groups, the increase in spine density was, compared to WT mice, similar. Stellate interneurons lacked detectable genotype–dependent and stress–related morphological differences. NeuropeptideY (NPY) neurons represent a unique and special interneuronal subpopulation in the laterobasal amygdala due to their anxiolytic effects in these nuclei. There is much information about the molecular effects of NPY via specific receptors and how NPY can regulate emotion–related states, especially anxiety–like behavior. However, only few indications are available, by which systems NPY neurons are modulated themselves. Since both NPY neurons in the laterobasal amygdala and the serotonergic system are involved in anxiety–regulating processes, the task of the second part of the present thesis was to investigate if these neurons were targets of the serotonergic system. Applying light and electron microscopic methods, perisomatic synaptic contacts between serotonergic afferents and NPY-immunoreactive neurons were identified in the laterobasal amygdala of rats. As the functional impact of the serotonergic innervation significantly depends on the serotonin receptor (5-HTR) equipment of the target neurons, coexpression of NPY mRNA and different 5-HTR mRNAs was studied. For this purpose, a novel variation of in situ hybridization, which allows specific coexpression analyses of NPY mRNA with low-abundant mRNAs, was developed and established. The results show that NPY mRNA–reactive neurons in the laterobasal amygdala coexpress 5-HT1A and 5-HT2C, but lack 5-HT3 mRNA. In the present thesis, detailed, new data on the impact of the serotonergic system on the laterobasal amygdala of mice and rats were obtained. The changes in dendritic spine density after repeated stress could represent neuroadaptive or compensatory mechanisms of these neurons, which enable WT mice to adapt to negative environmental changes. The increase in dendritic spine density could stand for the formation of an “emotional memory“ facilitating quick and flexible behavioral reactions upon re-appearing danger. This modulation of the laterobasal amygdala´s excitability could occur, for instance, via a specific inhibition of pyramidal output by differentially activated inhibitory networks. Such a differential activation can result from a variable receptor equipment, as shown for NPY neurons in the laterobasal amygdala in the present thesis. The increased anxiety–like behavior of 5-HttKO mice after repeated social stress could be due to the unability of these mice to further increase spine density in corresponding situations, since spine density already reached the maximum level in a low-stress environment. Both dysfunction of neuronal plasticity and possible dysfunction of the differential inhibition of pyramidal cells via interneurons presumably caused by genetic variations and/or stressful life events could represent an “open door“ facilitating abnormal behavior in animals or development of certain psychiatric disorders in humans. KW - Angst KW - Neuropeptid Y KW - Stress KW - Corpus amygdaloideum KW - Serotonerge Nervenzelle KW - Amygdala KW - serotonerges System KW - Anxiety KW - stress KW - amygdala KW - serotonergic system KW - neuropeptide Y Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69494 ER - TY - THES A1 - Schwab, Bernhard T1 - Zirkulierende microRNAs beim komplexen regionalen Schmerzsyndron T1 - Circulating microRNAs in complex regional pain syndrome N2 - CRPS ist eine anhaltende Schmerzerkrankung, die nach Verletzungen auftritt und mit einer variierenden Kombination von Symptomen aus den Bereichen Sensorik, Vasomotorik, Sudomotorik/Ödemen und Motorik verbunden ist. Die Physiologie des Krankheitsbildes ist nicht abschließend geklärt, allerdings wird eine komplexe Interaktion mehrerer Pathomechanismen als Ursache angenommen. Deshalb stellt das CRPS sowohl eine diagnostische als auch eine therapeutische Herausforderung dar. miRNAs sind kurze, einsträngige und nicht-codierende RNAs, die durch Inhibierung der Translation und Degradierung von mRNAs an der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression beteiligt sind. Sie werden auch von den Zellen durch Exosomen, Mikrovesikel, Lipoproteine und Apoptose freigesetzt, sodass sie in unterschiedlichen Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden können. Bei vielen Erkrankungen kann eine Dysregulation der miRNA-Expression festgestellt werden, weshalb großes Interesse daran besteht, sie als Biomarker oder für therapeutische Ansätze nutzbar zu machen. Die miRNAs miR-183, -21, -29b, -144, - 223 wurden bereits im Zusammenhang mit entzündlichen und neuropathischen Prozessen und der Dysruption von Immunobarrieren beschrieben. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob bei der Expression dieser miRNAs im Blut von CRPS-Patienten, Patienten mit einem komplikationslosen posttraumatischen Heilungsverlauf und von Kontrollen ohne ein vorangegangenes Trauma Unterschiede bestehen. Die Messungen erfolgten im Plasma, in Leukozyten und Exosomen, um dadurch auch die Regulation in den einzelnen Blutkomponenten vergleichen zu können. Tatsächlich fanden sich unterschiedliche miRNA-Expressionsprofile bei den verschiedenen Biomaterialien. Außerdem konnte bei einzelnen miRNAs ein Einfluss von Alter und Geschlecht auf die Expression nachgewiesen werden. Diese Beeinflussung war darüber hinaus auch abhängig vom untersuchten Biomaterial und vor allem bei den Exosomen besonders ausgeprägt. In den Exosomen ergab sich eine signifikante Hochregulation von miR-223-5p bei den FK im Vergleich mit den CRPS-Patienten. Bei der Zusammenfassung der Daten von CRPS und FK fand sich außerdem eine negative Korrelation zwischen der miR-223-5p-Expression und dem CSS, sodass ein erhöhtes Expressionsniveau mit einer milderen Krankheitsausbildung verbunden war. Hinsichtlich der traumanaiven Kontrollen war das Expressionsniveau der CRPS-Patienten hingegen unverändert. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass beim CRPS im Vergleich mit einem regelrechten Heilungsverlauf eine insuffiziente beziehungsweise ausbleibende posttraumatische Anpassung des miRNA-Spektrums vorliegt. Diese posttraumatische Regulation stellt eventuell eine wichtige Voraussetzung für den Ablauf eines komplikationslosen Heilungsprozesses dar. Für miR-223-5p wurde bereits mehrfach eine antiinflammatorische Wirkung durch die Regulation von proinflammatorischen Rezeptoren und die Beeinflussung der Differenzierung von Makrophagen beschrieben. Eine verminderte Expression könnte somit zu einer Disposition für überschießende Entzündungsreaktionen führen und dadurch zur Entwicklung von CRPS beitragen. Diese Ergebnisse weisen auf die Beteiligung zirkulierender und vor allem exosomaler miRNAs bei der Pathophysiologie des CRPS hin. Zur weiterführenden Abklärung der pathophysiologischen Relevanz von miR-223-5p sind jedoch zusätzliche Untersuchungen erforderlich. Dabei bleibt es zu prüfen, ob eine verminderte miR-223-5p-Expression mit verstärkten Entzündungsmarkern und einer verstärkten proinflammatorischen Differenzierung von Makrophagen verbunden ist. Eine Abklärung der Herkunft der Exosomen könnte dabei helfen, zwischen einer lokalen und einer systemischen Reaktion zu unterscheiden. Die Beantwortung dieser Fragen könnte zu einem besseren Verständnis beitragen, warum manche Patienten nach einem Extremitätentrauma ein CRPS entwickeln und keinen normalen Heilungsverlauf erfahren. N2 - CRPS is a lasting pain condition, which appears after an injury and manifests as a varying combination of sensoric, vasomotoric, sudomotoric/edema and motoric symptoms. The physiology of CRPS is not fully understood since there is a complex interaction of several possible underlying pathomechanisms. Therefore, CRPS presents a diagnostic as well as a therapeutic challenge. miRNAs are short, single-stranded, non-coding RNAs, which are involved in the posttranscriptional regulation of gene expression by inhibiting the trans- lation and causing the degradation of mRNA. They can be exported by the cells using exosomes, microvesicels, lipoproteins und apoptosis. Extracellular miRNAs can be found in several in different body fluids. Dysregulation of miRNA-expression has been found in several diseases, causing in an interest to utilize them as biomarkers or for therapeutic applications. The miRNAs miR-183, -21, -29b, -144 and -223 have been described in inflammatory und neuropathic processes as well as disruption of immunobarriers. This work investigated, if there is a difference in the expression of these miRNAs in the blood of CRPS patients, patients with a normal posttraumatic recovery und controls without trauma. miRNAs were measured in plasma, leukocytes and exosomes to additionally compare these blood components ... KW - miR-223-5p KW - Complex Regional Pain Syndrome KW - CRPS KW - microRNA Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266959 ER - TY - THES A1 - Götz, Silvia T1 - Zuo1 - ein neues G-Quadruplex-bindendes Protein in \(Saccharomyces\) \(cerevisiae\) T1 - Zuo1 - a novel G-quadruplex binding protein in \(Saccharomyces\) \(cerevisiae\) N2 - G-Quadruplex (G4)-Strukturen sind sehr stabile und polymorphe DNA und RNA Sekundärstrukturen mit einem konservierten Guanin-reichen Sequenzmotiv (G4-Motiv). Sie bestehen aus übereinander gestapelten planaren G-Quartetts, in denen je vier Guanine durch Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten werden. Da G4-Motive in Eukaryoten an bestimmten Stellen im Genom angereichert vorkommen, wird angenommen, dass die Funktion von G4-Strukturen darin besteht, biologische Prozesse positiv oder negativ zu regulieren. Aufgrund der hohen thermodynamischen Stabilität von G4 Strukturen ist davon auszugehen, dass Proteine in die Faltung, Stabilisierung und Entfaltung dieser Nukleinsäure-Strukturen regulatorisch involviert sind. Bis heute wurden viele Proteine in der Literatur beschrieben, die G4-Strukturen entwinden können. Jedoch konnten bisher nur wenige Proteine identifiziert werden, die in vivo die Faltung fördern oder G4-Strukturen stabilisieren. Durch Yeast One-Hybrid (Y1H)-Screenings habe ich Zuo1 als neues G4 bindendes Protein identifiziert. In vitro Analysen bestätigten diese Interaktion und es stellte sich heraus, dass Zuo1 G4-Strukturen stabilisiert. Übereinstimmend mit den in vitro Daten konnte gezeigt werden, dass Zuo1 signifikant an G4-Motive im Genom von Saccharomyces ceresivisiae bindet. Genomweit überlappen G4-Motive, an die Zuo1 bindet, mit Stellen, an denen die DNA Replikation zum Stillstand kommt und vermehrt DNA Schäden vorkommen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Zuo1 eine Funktion während der DNA Reparatur oder in Zusammenhang mit dem Vorankommen der DNA Replikationsgabel hat, indem G4-Strukturen stabilisiert werden. Diese Hypothese wird außerdem durch genetische Experimente gestützt, wonach in Abwesenheit von Zuo1 die Genominstabilität zunimmt. Aufgrund dieser Daten war es möglich ein Model zu entwickeln, bei dem Zuo1 während der S-Phase G4-Strukturen bindet und stabilisiert wodurch die DNA Replikation blockiert wird. Diese Interaktion findet neben Stellen schadhafter DNA statt und unterstützt somit DNA Reparatur-Prozesse wie beispielsweise die Nukleotidexzisionsreparatur. Als weiteres potentielles G4-bindendes Protein wurde Slx9 in Y1H-Screenings identifiziert. In vitro Experimente zeigten zwar, dass Slx9 mit höherer Affinität an G4-Strukturen bindet im Vergleich zu anderen getesteten DNA Konformationen, jedoch wurde in S. cerevisiae genomweit keine signifikante Bindung an G4-Motive festgestellt. N2 - G-quadruplex (G4) structures are stable and polymorphic DNA and RNA secondary structures with a conserved Guanine-rich sequence motif (G4 motif). They consist of stacked planar G quartets that are held together by hydrogen bondings between four guanines. Because G4 motifs are enriched at specific sites in eukaryotic genomes, G4 structures are suggested to act as functional tools in the cell to regulate biological processes in a positive or negative manner. Considering the high thermodynamic stability of G4 structures it has been suggested that proteins regulate the formation, stabilization, and unfolding of this nucleic acid based structure. Up to now many proteins that unwind G4 structures have been described in the literature. But so far only a few proteins were identified that support the formation or stabilize G4 structures in vivo. Using yeast one-hybrid screenings, I identified Zuo1 as a novel G4-binding protein. In vitro studies confirmed this interaction and revealed that Zuo1 stabilizes G4 structures. In agreement with in vitro data I could show that Zuo1 binds significantly to G4 motifs in the S. cerevisiae genome. Genome-wide G4 motifs which are bound by Zuo1 overlap sites where DNA replication stalls and DNA damage is elevated. These results suggest that Zuo1 functions during the control of DNA repair or DNA replication fork progression by stabilization of G4 structures. This hypothesis is further supported by genetic assays showing that in the absence of Zuo1 genome instability is increased. On the basis of these data we propose a model in which Zuo1 binds and stabilizes G4 structures during S phase and by this block DNA replication. This interaction takes place near DNA damage sites and supports DNA repair processes such as nucleotide excision repair. Additionally, Slx9 was identified in Y1H screenings as a potential G4-binding protein. In vitro analyses showed that Slx9 interacts with higher affinity with G4 structures compared to other tested DNA conformations. However, no significant overlap with G4 motifs could be observed genome-wide in S. cerevisiae. KW - Saccharomyces cerevisiae KW - DNS-Bindungsproteine KW - DNS-Reparatur KW - DNA secondary structure KW - DNA Sekundärstruktur KW - Sekundärstruktur KW - Bäckerhefe Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152158 ER - TY - THES A1 - Eberlein, Uta T1 - Zusammenhang zwischen physikalischer Dosimetrie und DNA Doppelstrangbrüchen in Lymphozyten nach Radionuklidtherapie T1 - Relationship between internal dosimetry and DNA double strand breaks in lymphocytes after radionuclide therapy N2 - In der nuklearmedizinischen Therapie werden Radiopharmaka meist systemisch verabreicht. Primär werden dafür, wegen der kurzen Reichweite, beta-Strahler eingesetzt. Als Folge davon verteilt sich das Radiopharmakon im Körper, reichert sich in Organen und Zielstrukturen an und bestrahlt somit den Körper intern, im Gegensatz zur externen Bestrahlung bei der Strahlentherapie. Das Verteilungsmuster der verabreichten Aktivität im Körper wird durch die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Radiopharmakons bestimmt. Außerdem sind die Aktivität und die Art der Anreicherung ausschlaggebend für die durch ionisierende Strahlung deponierte Energie im Körper, der Energiedosis. Gemeinsam haben externe und interne Bestrahlungsverfahren, dass der Patient ionisierender Strahlung ausgesetzt ist, die nicht nur die kranken Zellen zerstört, sondern auch gesunde Zellen schädigen kann. Dies geschieht durch direkte oder indirekte Wechselwirkung der Strahlung mit der DNA, die zur Schädigung der DNA-Struktur führt. Am häufigsten sind dabei Einzelstrangbrüche und Basenschäden. Die Doppelstrangbrüche sind im Vergleich zu Einzelstrangbrüchen und Basenschäden sehr selten aber sehr viel schädlicher für die Zelle, da die Reparatur komplizierter ist. Somit sind diese primär für den Zelltod oder für die Folgen nach fehlerhafter Reparatur verantwortlich. Eine sehr schnelle Antwort auf strahleninduzierte oder durch andere Stoffe, wie z.B. zytotoxische Substanzen, induzierte Doppelstrangbrüche ist die Phosphorylierung der Histon H2 Variante H2AX, die gamma-H2AX genannt wird. Zusätzlich reichert sich das Protein 53BP1 nach dem Erkennen eines Doppelstrangbruches durch Sensorproteine sofort am Chromatin, das den Doppelstrang umgibt, an. Damit ist 53BP1 ein weiterer Biomarker, der strahleninduzierte Doppelstrangbrüche sehr effektiv nachweisen kann und der auf sehr verlässliche Weise mit gamma-H2AX kolokalisiert. Mittels Immunfluoreszenzfärbung lassen sich gamma-H2AX und 53BP1 als umschriebene „Foci“, im Zellkern mikroskopisch darstellen und zählen. Unter der Annahme, dass ein Focus einem Doppelstrangbruch entspricht, kann die Anzahl der Foci im Zellkern als quantitativer Biomarker für DNA Doppelstrangbrüche und damit für die Strahlenexposition und Strahlenwirkung verwendet werden. Zudem zeigen Studien der Induktion von gamma-H2AX nach externer Bestrahlung von unterschiedlichen Gewebearten Linearität zwischen der Energiedosis und der Zahl der Foci im Zellkern. Weitere Studien beschäftigen sich mit den Auswirkungen externer Bestrahlung auf Patienten, aber nur wenige mit offenen radioaktiven Substanzen. Ziele dieser Arbeit waren daher: 1. Die Generierung einer bisher noch nicht beschriebenen in-vitro Kalibrierkurve nach interner Bestrahlung von Vollblut mit den in der Therapie eingesetzten beta-Strahlern. 2. Die gleichzeitige Bestimmung der physikalischen Dosis sowie der strahleninduzierten Anzahl der Foci in Lymphozyten, gewonnen aus Blutproben von Patienten nach Radiopeptidtherapie mit Lu-177 und Radioiodtherapie mit I-131. 3. Eine umfassende Beschreibung der Induktion und der Abnahme der Foci in den Lymphozyten aus den Blutproben der Patienten unter Einbeziehung der in-vitro Kalibrierung, um den dosis- und zeitabhängigen Verlauf der Anzahl der strahleninduzierten Foci zu bestimmen. Für die in-vitro Kalibrierung mit I-131 und Lu-177 wurden bei Probanden Blutproben gewonnen und mit unterschiedlichen Aktivitätskonzentrationen ergänzt. Das Ziel war, eine Energiedosis bis 100mGy zu erhalten. Das Ergebnis war, dass sich die Zahl der strahleninduzierten Foci in Abhängigkeit von der Energiedosis gut durch eine lineare Funktion beschreiben lässt, so wie es auch für die externe Bestrahlung bereits gezeigt wurde. Die Patientenstudien befassten sich mit dem Zusammenhang zwischen der im Blut deponierten Energiedosis und der Anzahl und dem zeitlichen Verlauf der induzierten Doppelstrangbrüche im peripheren Blut von Patienten unter Peptidrezeptor-Radionuklidtherapie mit Lu-177 DOTATATE/-TOC und Patienten unter Radioiodtherapie mit I-131 bei Ablationstherapien nach Operation eines differenzierten Schilddrüsenkarzinoms. Die durchschnittliche Anzahl induzierter DSB-Foci zeigte in den frühen Zeitpunkten einen linearen dosisabhängigen Anstieg. In den ersten Stunden nach Therapie stimmten die in-vitro Kalibrierung und die Zahl der strahleninduzierten Foci sowohl für Lu-177 als auch für I-131 für die Patientendaten gut überein. Die späteren Zeitpunkte werden durch eine Abnahme der Dosisrate und der Foci-Anzahl, bedingt durch Reparatur der DNA-Schäden, charakterisiert. Überstiegen die Blutdosiswerte in der ersten Stunde jedoch 20mGy (nur nach I-131-Gabe beobachtet), dann war die Induktion eines schnellen Reparaturprozesses festzustellen. Diese experimentellen Ergebnissen und Modellierungen beschreiben erstmalig die Dosisabhängigkeit und den zeitlichen Verlauf der in-vitro und in-vivo DNA-Schadensantwort nach Inkorporation von beta-emittierenden Radionukliden. N2 - In radionuclide therapy radiopharmaceuticals are administered mostly systemically. Primarily, beta-emitters are used because of their short range in tissue. As a result the radiopharmaceutical distributes within the human body and accumulates in organs and target structures. Thus, the body is irradiated internally, in contrast to external irradiation in radiotherapy. The pattern of the activity distribution within the human body is determined by the physical and chemical properties of the radiopharmaceutical. Furthermore, the amount of activity and its accumulation in organs or tissues is essential for the calculation of the absorbed dose which defines the energy deposited in the body by ionizing radiation. During internal or external irradiation, patients are exposed to ionizing radiation which does not only destroy the malignant cells but also damages healthy tissue and cells. This is mainly caused by direct and indirect interaction of the radiation with the DNA which damages the DNA structure. Most frequently, there are single strand breaks and base damages. DNA double strand breaks (DSBs) are rare; nevertheless, they are the most critical lesions for cells as repairing the damage is difficult. Unrepaired or misrepaired DNA could cause mutations, chromosomal aberrations or lead to cell death. The formation of a DNA DSB in nuclear chromatin results in the rapid phosphorylation of the histone H2 variant H2AX, then called gamma-H2AX. Furthermore, DSBs also recruit the damage sensor 53BP1 to the chromatin surrounding the DSBs, which leads to 53BP1 and gamma-H2AX co-localization in the chromatin surrounding a DSB. By immunofluorescence staining with gamma-H2AX and 53BP1 antibodies those biomarkers can be addressed by microscopically visible DNA damage protein foci, this is also known as the DNA damage focus assay. With progression of DSB repair, gamma-H2AX and 53BP1 foci disappear. It is assumed that one focus corresponds to one DSB. Therefore, the number of foci per cell can be used as a quantitative biomarker for DNA double strand breaks and hence for radiation exposure and radiation effects. Most studies dealing with the DNA damage focus assay performed in the last years were looking only on the effect of external irradiation after external radiation therapy or after diagnostic radiology procedures, but only few with the effects after administration of radiopharmaceuticals. Therefore, the aims of this thesis were: 1. To develop a method to generate an in-vitro calibration curve for the DSB focus assay after internal irradiation with beta-emitting radionuclides by creating a low dose and low dose-rate blood irradiation situation in-vitro, at dose-rates that are similar to the ones that have been observed in nuclear medicine patients. 2. To determine the absorbed dose and the number of radiation-induced foci in lymphocytes by sampling blood from patients after radiopeptide therapy with Lu-177 and radioiodine therapy with I-131. 3. To describe comprehensively the temporal and dose-dependent behavior of the DNA damage focus assay in radiation treatment-naive patients after their first radionuclide therapy using the results of the in-vitro calibration. For the in-vitro calibration with I-131 and Lu-177 blood samples For the in-vitro calibration with I-131 and Lu-177 blood samples were drawn from volunteers. Different activity concentrations were added to the samples for achieving absorbed doses up to 100mGy. As a result it was shown that the number of radiation-induced foci were linearly dependent of the absorbed dose. This is the same result that has been shown after external irradiation. The patient studies addressed the relationship between the absorbed dose to the blood and the number and temporal behavior of radiation-induced DNA double strand breaks in peripheral blood samples under radiopeptide therapy and under radioiodine therapy. The average number of radiation-induced foci showed a linear dose-response relationship within the first hours after administration of the radiopharmaceutical. The slope of the in-vitro calibration curve was in good agreement with the slopes of the linear functions fitted to the in-vivo data for Lu-177 and I-131. Later time points were characterized by a diminishing number of radiation-induced foci which was in accordance with the progression of DNA repair and the declining dose rates. Most patients treated with I-131 exceeded 20mGy in the first hour and in these patients the onset of a fast repair component was observed. With the experimental results and model calculations presented in this work, for the first time a dose-response relationship and a description of the time course of the in-vitro and in-vivo damage response after internal irradiation of beta-emitters could be established. KW - DNS-Doppelstrangbruch KW - gamma-H2AX KW - 53BP1 KW - DNA Doppelstrangbrüche KW - Dosimetrie KW - Medizinphysik KW - Radionuklidtherapie KW - Nuklearmedizin KW - DNA double strand breaks KW - dosimetry KW - medical physics KW - radionuclide therapy KW - nuclear medicine KW - Dosimetrie KW - Radionuklid KW - Therapie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120440 ER - TY - THES A1 - Taschik, Julia T1 - Zytokingenpolymorphismen bei Kindern mit akuter lymphatischer Leukämie T1 - Genetic cytokine polymorphism in children with acute lymphoblastic leukamie N2 - Die akute lymphatische Leukämie ist die häufigste maligne Erkrankung im Kindesalter. Trotz systematischer Erhebung und Auswertung von Daten im Rahmen der ALL-BFM-Studiengruppe und der damit verbundenen kontinuierlichen Verbesserung der Prognose hat man noch immer keine Ursache für eine ALL gefunden. Daher nimmt eine umfangreiche Risikostratifizierung eine zentrale Rolle in der Behandlungsplanung einer ALL ein. Basierend auf einer exakten Stratifizierung kann die Therapie risikoadaptiert und individualisiert werden, um eine Übertherapie zu vermeiden und letztlich die Heilungschancen zu verbessern. Pro- und antiinflammatorische Zytokine kommt in den komplexen Wirkungsmechanismen des Immunsystems eine Schlüsselrolle zu. Viele Infektions-, Auto-immun- oder Tumorerkrankungen werden durch das Produktionsprofil der Zyto-kine beeinflusst. Da genetisch determinierte Zytokingenpolymorphismen Krank-heitsverläufe beeinflussen und verändern, wurde untersucht, ob Zytokine einen Einfluss auf pädiatrische Patienten mit einer ALL haben. Im Zuge dieser Arbeit wurden 95 pädiatrische Patienten mit ALL auf Polymorphismen der Zytokine TNF-α, TGF-β1, IL-10, IL-6 und IFN-γ analysiert, die im Zeitraum vom 21.06.2004 bis zum 30.04.2014 an der Kinderklinik des Universitätsklinikums Würzburg behandelt wurden. Mittels DNA-Extraktion, sequenz-spezifischer PCR und Gelelektropherese wurden 35 Proben bei Erstdiagnose und 93 zum Zeitpunkt der Remission mit folgender zentralen Fragestellung untersucht: Gibt es genetische Risikofaktoren, die Einfluss auf • die Risikogruppe • die Art der Leukämie • die Genfrequenz • die Rezidivrate und • das Gesamtüberleben einer akuten lymphatische Leukämie im Kindesalter haben und sich zudem durch Einzelnukleotidpolymorphismen in pro- und antiinflammatorischen Zytokinen auszeichnen? Im Rahmen dieser Studie konnte festgestellt werden, dass das immunsuppressive Zytokin IL-10 einen Einfluss auf die Genfrequenz, die Risikogruppe, die Rezidivrate sowie die Prognose bei Kindern mit ALL hat. Patienten mit niedrigen Zytokinexpressionsraten (Genotypen ACC/ACC und ACC/ATA) wurden häufiger in der Hochrisikogruppe therapiert, hatten mehr Rezidive und eine schlechtere Prognose als Patienten mit hohen Zytokinexpressionsraten. Dar-über hinaus ist der Genotyp GCC/ACC signifikant häufiger bei ALL-Patienten anzutreffen als im gesunden Kollektiv. Beim immunsuppressiven IL-6 konnte festgestellt werden, dass der Genotyp C/C signifikant häufiger bei Patienten mit einer ALL auftritt als bei gesunden Patienten. Ferner zeigte sich, dass es so-wohl für IL-6 als auch für TNF-α eine Änderung des Genotyps zwischen Erstdiagnose und in Remission auftrat, die Hinweise auf einen blastenspezifischen „immune-escape“-Mechanismus geben. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass das immunmodulatorische Zytokin TGF-β1 einen Einfluss auf die Risikogruppe sowie die Rezidivrate hat. Patienten, die eine T/T Kombination am Codon 10 aufwiesen wurden häufiger im Hochrisikozweig therapiert als Patienten mit den Genotypen T/C oder C/C. Des Weiteren wurde demonstriert, dass Patienten mit einem C/C an Codon 25 häufiger an Rezidiven erkrankten als Patienten mit ei-nem G/C oder G/G. Für die TH1 Zytokine IFN-γ sowie TNF-α wurde kein Zusammenhang zwischen der Genfrequenz, der Risikogruppe, der Art der Leukämie, der Rezidivrate oder dem Gesamtüberleben gefunden. Auch wenn man bisher noch nicht genau weiß, wie Zytokingenpolymorphismen Einfluss auf pädiatrische ALL nehmen, wird anhand dieser Arbeit gezeigt, dass Zytokine einen Beitrag zur Pathogenese der ALL leisten und daher zukünftig für eine umfassendere Risikostratifizierung geeignet sind. Darüber hinaus können diese Ergebnisse dazu beitragen, dass Zytokine als biologische Marker etabliert werden, um eine weniger toxische immunmodulierende bzw. -suppressive Therapie zu gewährleisten. Dies führt dazu, dass eine Therapie anhand des Risikoprofils individuell und prognoseverbessernd abgestimmt werden kann. Je-doch wäre für eine nachfolgende Untersuchung eine größere multizentrische Stichprobe sowie eine prospektive Evaluation der Daten erstrebenswert. Gera-de bei hereditären Erkrankungen haben einzelne Gene nur einen geringen Einfluss auf das Gesamtrisiko, sodass größere Fallzahlen erforderlich wären, um auch schwache Effekte zu detektieren. N2 - Acute lymphoblastic leukaemia (ALL) is the most common malignant disease in childhood. Although survival rates in paediatric patients with ALL have greatly improved since effective drug combinations and risk-adapted therapy protocols were introduced, possible causes for ALL are yet to be determined. The incomplete information on the pathogenesis of ALL heightens the need for extensive risk stratification in order to develop and improve treatment methods. Exact stratification helps to continuously improve and develop risk-adapted and individual therapy approaches to minimise over- or under-treatment. Based on the empirical finding that cytokines play a decisive role in immune responses and that many autoimmune and malignant diseases are influenced by cytokine production, this study hypothesized that genetically determined cy-tokine gene polymorphisms might have an impact on children with ALL. 95 pediatric ALL patients were examined between June 2004 and April 2013 at the Children’s Hospital of the University of Würzburg with regard to cytokine gene polymorphisms in TNF-α, TGF-β1, IL-10, IL-6 and IFN-γ. Applying DNA extraction, sequence-specific PCR and gel electrophoresis, 35 samples at initial diagnosis and 93 samples in remission were obtained in order to find an answer to the following question: Are there any genetic risk factors, which influence the • risk group • type of leukaemia • gene frequency • relapse rate • overall survival with acute lymphoblastic leukaemia in childhood? Within the scope of this study the immunosuppressive IL-10 has an influence on gene frequency, risk group, relapse rate and overall survival. IL-10 high-producer-haplotypes were reduced in ALL-patients compared with healthy controls and resulted in a reduced relapse rate, a superior overall survival and resulted more often in the low risk group compared with IL-10 low producer haplotypes. By analysing immunosuppressive IL-6, it was demonstrated, that the genotype C/C is significantly more frequent in ALL-patients in comparison to healthy patients. Interestingly, with regard to IL-6 as well as to TNF-α genotypes a change in the genotype from initial diagnosis to remission was found in some patients, which may indicate a blast specific immune-escape mechanism. Moreover, the immune-modulatory cytokine TGF-β1 has an influence on risk group and relapse rate. Patients with a C/C in Codon 10 suffered more often from relapses than patients with G/C or G/G. TGF-β1 high producer haplotypes were correlated with a high initial blast-count (Codon 25 G/G) and were elevated in high-risk ALL-patients (Codon 10 T/T). For the TH1 cytokines IFN-γ and TNF-α no correlation between frequencies, risk group, type of leukaemia, re-lapse rate or overall survival could be found. Even though the mechanisms by which the cytokine polymorphisms influence the outcome of paediatric ALL remain to be determined, the data of the present study suggest an important contribution of cytokines to the pathogenesis of ALL and demonstrate their potential applicability in the clinical evaluation of prognosis in paediatric patients. Confirmatory studies correlating cytokine alleles with disease markers will support the concept of cytokine-mediated immune surveil-lance in humans as well as the importance of the genetic background of the patient for strong anti-tumour immunity and responses to therapy. These data can finally help to establish biomarkers for therapy stratification as well as immune-therapeutic tools in childhood ALL for a more risk-adapted therapy, in order to adapt the therapy intensity. However, for further studies an increase in sample size and a prospective multicentre evaluation would be desirable. Especially in hereditary diseases, single genes have only a small influence on the overall risk. That is why it is crucial to have a sufficiently high number of cases to detect even small effects. KW - Cytokine KW - Polymorphismus KW - Akute lymphatische Leukämie KW - Zytokingenpolymorphismus KW - akute lymphatische Leukämie bei Kindern KW - genetic cytokine polymorphism KW - acute lymphoblastic leukaemia KW - pediatric hematology oncology KW - Cancer biology KW - molecular biology of cytokines KW - Zytokin Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133312 ER - TY - THES A1 - Nuber, Susanne T1 - ß-Arrestin/Rezeptor-Interaktionen - Ein endogenes "Werkzeug" ligandenspezifischer Signaltransduktion T1 - ß-Arrestin/receptor-interactions - An endogenous "tool" of ligand-specific signal transduction N2 - Die Bedeutung der β-Arrestine als multifunktionelle Adapterproteine GPCR-vermittelter Signaltransduktion hat in den letzten Jahren immer mehr zugenommen. In der vorliegenden Arbeit lag der Schwerpunkt auf der Untersuchung der molekularen Basis und der Ligandenabhängigkeit sowohl der β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion als auch β-Arrestin- (un-)abhängiger Signaltransduktionsmechanismen. Im ersten Teil wurde der Einfluß potentieller Phosphorylierungsstellen im C-Terminus des β2AR bzw. im C-Terminus und der TM3 des P2Y1R auf die agonisteninduzierte β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion, Internalisierung und Desensibilisierung untersucht. Durch Mutationsanalysen konnten Ser 352/Thr 358 im distalen C-Terminus des P2Y1R als Schlüsselstellen der β-Arrestin-Translokation und Internalisierung identifiziert werden, während ein oder mehrere Phosphorylierungsstellen im proximalen P2Y1R C-Terminus die molekulare Grundlage der Rezeptordesensibilisierung darstellen. Darüber hinaus machte die Anwendung verschiedener PKC- oder CaMK-Inhibitoren sowie der Einsatz des PKC-Aktivators PMA deutlich, dass die P2Y1R-Desensibilisierung und β-Arrestin-Translokation durch unterschiedliche Kinasen kontrolliert werden. Zudem konnte mit Hilfe der FRET-Technik gezeigt werden, dass die Phosphorylierungsstellen zwischen den Positionen 355 und 364 im proximalen β2AR C-Terminus essentielle Bereiche der β-Arrestin-Translokation darstellen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Agonisten am β2-adrenergen Rezeptor bzw. dem P2Y2R auf ihre Fähigkeit hin untersucht verschiedene mit dem jeweiligen Rezeptor verknüpfte G-Protein- bzw. β-Arrestin-Funktionen in unterschiedlichem Ausmaß zu aktivieren („biased agonism“). Da eine solche ligandenselektive Aktivierung rezeptorvermittelter Signalwege bis dato nur mit synthetischen Liganden detailliert untersucht wurde, galt das besondere Interesse der Analyse der durch die endogenen Substanzen induzierten Signalmuster. Die Betrachtung der Noradrenalin- bzw. Adrenalin-induzierten β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion, β-Arrestin2-Translokation, Rezeptorinternalisierung, G-Protein-Aktivierung sowie cAMP-Produktion am β2AR machte deutlich, dass es sich beim Phänomen des „biased agonism“ um einen endogenen Mechanismus handelt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch zur Tokolyse eingesetzte β2AR-Agonisten spezifische Signalmuster induzieren. Die Beobachtung, dass UTP und ATP sowohl unterschiedliche β-Arrestin1/2-Translokationsals auch ERK-Aktivierungsmuster am P2Y2R induzieren bestärkte das Konzept des „biased agonism“ als endogenes Phänomen. Das ligandenabhängige β-Arrestin-Translokationsverhalten des P2Y2R ließ zudem die agonistenbedingte Zuteilung des Rezeptors zu den „Klasse A“ oder „Klasse B“ Rezeptoren zu. Die detaillierte Untersuchung agonisteninduzierter Rezeptor/Effektor-Interaktionen und Signalmuster dürfte helfen die Anwendung klinisch relevanter Substanzen zu optimieren. N2 - In recent years, the significance of β-arrestins as multifunctional adapter proteins of GPCR mediated signal transduction has steadily been increasing. In this thesis the main focus is to research the molecular basis and the ligand dependence of the β-arrestin recruitment as well as β-arrestin-(in-)dependent signal transduction mechanisms. In the first part, the influence of potential phosphorylation sites in the C-terminus of the β2AR or the C-terminus and the TM3 of the P2Y1R, respectively, on the agonist-induced β-arrestin2/receptor-interaction, receptor internalization and desensitization was examined. Using mutation analysis, Ser 352 and Thr 358 were identified as key points of the β-arrestin2 translocation and receptor internalization in the distal C-terminus of the P2Y1R. In contrast, one or more phosphorylation sites in the proximal P2Y1R C-terminus represent the molecular basis of receptor desensitization. In addition, the use of different PKC- or CaMK inhibitors and the application of the PKC activator PMA made it clear that the P2Y1R desensitization and β-arrestin translocation are controlled by different kinases. Using the FRET technique we were able to show that the phosphorylation sites between position 355 and 364 in the proximal C-terminus of the β2AR represent essential areas of the β-arrestin2 translocation. In the second part of the study at hand, agonists of the β2AR or the P2Y2R were examined with respect to their ability to activate distinct receptor associated G-protein or β-arrestin functions to varying degrees (“biased agonism”). Since this kind of ligandselective activation of receptor-mediated signaling pathways has only been studied in detail with synthetic ligands to this day, special interest in the analysis of the signaling pattern induced by the endogenous substances was taken. The analysis of norepinephrine- or epinephrine-induced β-arrestin/receptor interaction, β-arrestin translocation, receptor internalization, G-protein activation and cAMP production at the β2AR made clear that “biased agonism” is an endogenous phenomenon. Moreover, it has also been shown that β2AR agonists used for tocolysis induced a specific signaling pattern. The observation that UTP and ATP both induce different β-arrestin translocation as well as ERK activation patterns at the P2Y2R confirmed the concept of “biased agonism” as an endogenous phenomenon. The ligand dependent β-arrestin behavior of the P2Y2R also allowed the allocation of the receptor to the “class A” or “class B” receptors depending on the agonist used for stimulation. The detailed testing of agonist induced receptor/effector interactions and signaling pattern could help to optimize the application of clinically relevant substances. KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Adaptorproteine KW - Beta-Rezeptor KW - Noradrenalin KW - Adrenalin KW - Purinozeptor KW - ADP KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Konfokale Mikroskopie KW - biased agonism KW - functional selectivity Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53188 ER - TY - THES A1 - Langlhofer, Georg T1 - Über die Bedeutung intrazellulärer Subdomänen des Glycinrezeptors für die Kanalfunktion T1 - Investigations into the relevance of glycine receptor intracellular subdomains to receptor channel function N2 - Der zur Familie der pentameren ligandengesteuerten Ionenkanäle zugehörige Glycinrezeptor (GlyR) ist ein wichtiger Vermittler synaptischer Inhibition im Zentralnervensystem von Säugetieren. GlyR-Mutationen führen zur neurologischen Bewegungsstörung Hyperekplexie. Aufgrund fehlender struktureller Daten ist die intrazelluläre Loop-Struktur zwischen den Transmembransegmenten 3 und 4 (TM3-4 Loop) eine weitgehend unerforschte Domäne des GlyR. Innerhalb dieser Domäne wurden Rezeptortrunkierungen sowie Punktmutationen identifiziert. Rezeptortrunkierung geht mit Funktionslosigkeit einher, welche jedoch durch Koexpression des fehlenden Sequenzabschnitts zum Teil wiederhergestellt werden kann. Innerhalb dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen trunkierten, funktionslosen GlyR und sukzessiv verkürzten Komplementationskonstrukten untersucht. Dabei wurden als Minimaldomänen für die Interaktion das C-terminalen basische Motive des TM3-4 Loops, die TM4 sowie der extrazelluläre C-Terminus identifiziert. Die Rückkreuzung transgener Mäuse, die das Komplementationskonstrukt iD-TM4 unter Kontrolle des GlyR-Promotors exprimierten, mit der oscillator-Maus spdot, die einen trunkierten GlyR exprimiert und 3 Wochen nach der Geburt verstirbt, hatte aufgrund fehlender Proteinexpression keinen Effekt auf die Letalität der Mutation. Des Weiteren wurde die Bedeutsamkeit der Integrität beider basischer Motive 316RFRRKRR322 und 385KKIDKISR392 im TM3-4 Loop in Kombination mit der Loop-Länge für die Funktionalität und das Desensitisierungsverhalten des humanen GlyRα1 anhand von chimären Rezeptoren identifiziert. Eine bisher unbekannte Patientenmutation P366L innerhalb des TM3-4 Loops wurde mit molekularbiologischen, biochemischen und elektrophysiologischen Methoden charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die mutierten Rezeptorkomplexe in vitro deutlich reduzierte Glycin-induzierte Maximalströme sowie eine beschleunigte Schließkinetik aufweisen. P366L hat im Gegensatz zu bereits charakterisierten Hyperekplexiemutationen innerhalb des TM3-4 Loops keinen Einfluss auf die Biogenese des Rezeptors. P366 ist Teil einer möglichen Poly-Prolin-Helix, die eine Erkennungssequenz für SH3-Domänen darstellt. Ein potenzieller Interaktionspartner des TM3-4 Loops des GlyRα1 ist Collybistin, welches eine wichtige Rolle bei der synaptischen Rezeptorintegration spielt und die Verbindung zum Zytoskelett vermittelt. An der inhibitorischen Synapse verursacht P366L durch die Reduzierung postsynaptischer Chloridströme, das beschleunigte Desensitisierungsverhalten des GlyRα1 sowie ein verändertes Interaktionsmotiv Störungen der glycinergen Transmission, die zur Ausprägung phänotypischer Symptome der Hyperekplexie führen. N2 - The glycine receptor (GlyR) belongs to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels and mediates synaptic inhibition in the central nervous system of mammals. GlyR mutations lead to the neuromotor disorder hyperekplexia. Due to the lack of structural data, the intracellular loop between transmembrane segments 3 and 4 (TM3-4 Loop) is considered as the most unexplored domain of the GlyR. Within this domain receptor truncations as well as point mutations have been identified. Receptor truncation correlates with non-functionality that can be partially restored by coexpression of the missing sequence. In this work, the interaction between a truncated non-functional GlyR and successively truncated complementation constructs was investigated. The C-terminal basic motif of the TM3-4 loop, the TM4 and the C-Terminus were identified as the minimal domain required for interaction. Backcrossing of a transgenic mouse line expressing the complementation construct iD-TM4 under the control of the GlyR promotor, with the oscillator mouse spdot expressing a truncated GlyR leading to death 3 weeks after birth, was unsuccessful and did not influence the lethality of the mutation, most probably due to the lack of transgene protein expression. In addition the importance of the integrity of both basic motifs 316RFRRKRR322 and 385KKIDKISR392 within the TM3-4 loop in combination with loop length were shown to be essential for functionality and desensitization behavior of the human GlyRα1 using chimeric receptors. An unknown TM3-4 loop mutation P366L was characterized using biomolecular, biochemical and electrophysiological approaches. It was demonstrated that mutated receptor complexes display remarkably reduced glycine-induced maximal currents in addition to accelerated channel closing kinetics in vitro. In contrast to previously analyzed hyperekplexia mutations within the TM3-4 loop, P366L exhibits no influence on receptor biogenesis. P366 is located in a sequence probably forming a poly-proline helix, which serves as a recognition sequence for SH3 domains. One prospective interaction partner is collybistin, which plays a major role in the process of synaptic receptor integration and connects the receptor complex to the cytoskeleton. At the site of the inhibitory synapse, P366L causes reduced chloride currents, accelerated desensitization behavior of the GlyRα1 and an altered interaction motif leading to disturbed glycinergic neurotransmission that result in formation of phenotypic symptoms of hyperekplexia. KW - Glycinrezeptor KW - intrazelluläre Domäne KW - Hyperekplexie KW - intracellular domain KW - hyperekplexia KW - Bewegungsstörung KW - Synapse KW - Ionenkanal Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140249 ER - TY - THES A1 - Höfler, Dorina T1 - Überexpression der katalytischen Na\(^+\)/K\(^+\)-ATPase Untereinheit α2 und nicht α1 verzögert kardiales Remodeling nach acht Wochen Myokardinfarkt T1 - Increased expression of the catalytic Na\(^+\)/K\(^+\)-ATPase α2-isoform and not α1 reduces cardiac remodeling after eight weeks of myocardial infarction N2 - Die Herzinsuffizienz und damit einhergehend die beeinträchtigte kardiale Funktion bei chronischer Ischämie nach Myokardinfarkt (MI) wird mit niedrigerer Aktivität der Na+/K+-ATPase (NKA) in Zusammenhang gebracht. Die beiden Isoformen der katalytischen Untereinheit NKA-α1 und α2 unterscheiden sich teilweise in Lokalisation, Funktion und Interaktion mit dem NCX und weiterer Signalpartner. Das Ziel des Projekts war es herauszufinden, ob die Isoform NKA-α2 im Gegensatz zu NKA-α1 einen protektiven Effekt bei chronischer Ischämie nach einem Myokardinfarkt aufweist und was die Hintergründe hierfür sind. Hierfür wurden transgene Mäuse verwendet, die kardial entweder NKA-α1 oder NKA-α2 stark überexprimieren. Diese Mäuse wurden mit WT Mäuse verglichen. Ein Myokardinfarkt wurde mittels Legierung der LAD induziert und die Herzen nach acht Wochen entnommen. Um das Remodeling bei chronischer Ischämie in Mäusen zu untersuchen, wurden die Zellgröße (WGA Färbung) und der Anteil des fibrotisch umgebauten Gewebes (PSR Färbung) gemessen. TG α2 Tiere zeigten nach chronischer Ischämie einerseits weniger stark hypertrophierte Zellen, andererseits in der kritischen Borderzone zwischen vitalem Gewebe und infarziertem Bereich weniger Fibrose. Dies ging einher mit einem signifikant weniger starkem Verlust der linksventrikulären Verkürzungsfraktion nach MI, welche ein Parameter der kardialen Funktion ist. Das Level des oxidativen Stresses (ROS Detektion) änderte sich nach acht Wochen MI in TG α2 Tieren im Vergleich zu TG α1 und WT nicht. Nach acht Wochen MI zeigte sich die Expression der totalen NKA reduziert; v.a. TG α2 Tiere zeigten tendenziell sehr niedrige Expressionslevel der totalen NKA. Die geringere NKA Aktivität könnte mit der verbesserten kardialen Funktion zusammenhängen. Da jedoch nach MI in WT Mäusen die NKA-α2 verstärkt und NKA-α1 reduziert exprimiert wird, gehen wir davon aus, dass die Expression der NKA-α2 eine für die Zelle protektive Anpassung nach chronischer Ischämie ist, um sich vor Remodeling und damit einhergehendem Funktionsverlust zu schützen. Vermutlich wird NKA so lange auf geringerem Niveau exprimiert, bis die Natrium- und Calciumkonzentration so stark ansteigt, dass die Gefahr der Arrhythmie und die kardiale Dysfunktion zu groß wird. Der Vorteil der TG α2 Tiere entsteht vermutlich aus der Reduzierung der totalen NKA nach acht Wochen MI, um die Inotropie kompensatorisch hoch zu halten, bis spezifisch die Isoform NKA-α2 verstärkt exprimiert wird, um den Natriumüberhang und konsekutiv via NCX den Calciumüberhang zu reduzieren. Hinzu kommt, dass die Isoform NKA-α2 die prädominierende Isoform ist, die in der Mikrodomäne der T-Tubuli mit dem NCX agiert und für den Ausgleich des Natrium- und Calciumhaushalts nach MI sorgt. Die gesteigerte Expression des NCXs nach MI in TG α2 Tieren mit verbessertem Abtransport von Calcium könnte zu der reduzierten Entwicklung von Hypertrophie und Fibrosierung beitragen. Dies wiederum verhindert den Progress der dilatativen Herzinsuffizienz bei chronischer Ischämie und bringt somit einen protektiven Effekt auf die Prognose und die kardiale Funktion nach MI mit sich. N2 - An inhibited Na+/K+-ATPase (NKA) pump activity could result in impaired cardiac function and reactive remodeling particularly in heart failure associated with myocardial infarction (MI). There are two different catalytic NKA isoforms, NKA-α1 and NKA-α2, which exhibit different characteristics regarding their sodium affinity, localization, and association with the Na/Ca exchanger (NCX) and regulation by signaling partners. Aim of the present study was to determine whether the overexpression of NKA-α2 and not NKA-α1 affects functional deterioration and remodeling during MI and why this protective benefit occurs. Transgenic mice with a cardiac overexpression of NKA-α2 (TG α2) and NKA-α1 (TG α1) were subjected to chronic MI injury for eight weeks. MI was induced by the surgical ligation of the left coronary artery. Non-transgenic (wildtype, WT) littermates were used as controls. The analyses of hypertrophy (gravimetry, WGA staining) and fibrosis (Picrosirius red staining) showed less cardiac remodeling after MI in TG α2 mice. Elevated NKA α2 expression in transgenic mice protects against functional deterioration which was shown in preserved fractional shortening after MI. Although the expression of total NKA is decreased after chronic ischemia, the increased expression of NKA isoform α2 and not α1 could be a favorable alteration that protects from heart failure progression induced by MI injury. We assume that total NKA expression is depressed in chronic heart failure especially in TG α2 mice to increase natrium and calcium load in the cell. This triggers greater calcium transients and strengthens cardiomyocyte contractions and thus cardiac output. But it is also a risk factor that promotes arrhythmias. So, by specifically increasing the expression of isoform NKA-α2 and not NKA-α1 excessive sodium elevation, functional deterioration and adverse remodeling could be limited. Presumably, NKA-α2 is the predominant isoform that regulates calcium cycling and interacts with NCX in the microdomain of the t-tubules. TG α2 mice are therefore more capable of preserving calcium homeostasis and regulating excitation contraction-coupling after chronic MI. The expression of NCX after MI is very likely increased, thus NCX helps in reverse mode to reduce calcium load in heart failure. This also protects TG α2 from hypertrophy and adverse remodeling after chronic MI, which implements better outcome in terms of deterioration of heart failure and cardiac dysfunction. KW - Na+/K+-ATPase KW - Remodeling KW - Myokardinfarkt Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250773 ER - TY - THES A1 - Bruch, Dorothée Eva-Maria T1 - ‚\(Social\) \(Buffering\)‘. Die Rolle der Anwesenheit einer zweiten Person auf physiologische Angstreaktionen bei Männern T1 - ‘Social buffering’. The effect of social presence on physiological fear responses in men N2 - ‚Social Buffering‘ beschreibt den positiven Einfluss eines Artgenossen auf die Verarbeitung aversiver Reize. In Tierexperimenten zeigte sich, dass Tiere mit geringeren Anspannungsreaktionen reagieren, wenn ein weiteres Tier während der Präsentation von Angstreizen anwesend ist. Eine Untersuchung an einer weiblichen Stichprobe replizierte den Effekt am Menschen. Allerdings gibt es Hinweise auf mögliche Geschlechtsunterschiede. Da vergleichbare Experimente bei Männern fehlen, will sich diese Studie der Frage nähern, ob die reine Anwesenheit einer fremden männlichen Person im Stande ist, autonome Angstreaktionen bei Männern abzumildern. Dafür wurden 72 männliche, psychisch gesunde Probanden auf zwei Gruppen aufgeteilt, welche eine identische Stimulation mit angstinduzierenden und neutralen Tönen erhielten. Die Männer der Alleinbedingung wurden allein getestet (n allein = 36), die der Sozialbedingung zusammen mit einer fremden männlichen Person (n sozial = 36). Bei allen Probanden wurden die Hautleitfähigkeitsreaktionen (skin conductance response; SCR) während der Antizipation und der Darbietung der Töne erfasst. Außerdem wurden die Probanden nach ihrem Gefühlszustand befragt (Rating). Als relevante Persönlichkeitsdimensionen wurden anhand von Fragebögen die Angstsensitivität (ASI-3), die Ängstlichkeit als Trait (STAI trait), die Ängstlichkeit als State (STAI state) und der Eindruck des Probanden von der anwesenden männlichen Person erhoben. Die Ergebnisse zeigten keine signifikanten Unterschiede in den SCRs und Ratings bezüglich des angstinduzierenden Tones. Dieses Ergebnis legt nahe, dass bei der männlichen Stichprobe kein ‚Social Buffering‘-Effekt vorlag. Weiterhin waren die autonomen Reaktionen auf die Angstreize höher, je ähnlicher der Mann die fremde Person zu sich bewertete. Die möglichen Ursachen des fehlenden ‚Social-Buffering‘-Effekts werden unter Berücksichtigung von Geschlechtsunterschieden im Umgang mit Angst und sozialer Unterstützung diskutiert. N2 - Social buffering describes the positive influence of a conspecific on the processing of aversive stimuli. Animal experiments showed a decrease in autonomic responses to aversive events in the presence of a conspecific. Studies in humans have shown that the mere presence of an unknown individual can reduce skin conductance responses to fear-inducing sounds. However, this social buffering of fear has only been shown in female participants. Here we use the same set up to test if male participants show similar social buffering of fear. Male participants (n = 72) were presented with fear-inducing and neutral sounds. One group of participants experienced the sounds alone (alone condition; n alone = 36), while the others were tested together with a second male person that was merely physically present (social condition; n social = 36). We measured participants’ skin conductance responses (SCRs) and they rated their emotions while receiving the sounds (ratings). Moreover, anxiety sensitivity (ASI-3), trait anxiety (STAI trait), state anxiety (STAI state) and the impression of the male confederate present in the social condition were measured as relevant personality dimensions. The results showed no significant differences in SCRs or ratings to the fear-inducing sounds between the alone and the social condition. Moreover, the SCRs to the fear-inducing stimuli were the higher the more similar the men perceived the present person to themselves. Potential reasons for the lack of social buffering in males in presence of a male partner are discussed. KW - Geschlechtsunterschiede KW - Social buffering KW - Angstreaktionen KW - Skin conductance KW - Hautleitfähigkeit Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-282443 ER -