TY - THES A1 - Pfeiffer, Marion Verena T1 - Die Rolle von CRAF bei der adulten hippocampalen Neurogenese T1 - The role of CRAF in adult hippocampal neurogenesis N2 - Der gyrus dentatus im Hippocampus ist die primäre Zielregion kortikaler Afferenzen des Enthorinalen Cortex. Im Laufe seiner Entwicklung erlangt der gyrus dentatus durch die Etablierung einer neurogenen Nische (tertiäre Matrix) die Fähigkeit fortwährender postnataler Neurogenese. Diese wird durch eine Vielzahl von Mediatoren wie Transkriptionsfaktoren gesteuert, die die Proliferation und Zelldifferenzierung, aber auch das Überleben der hippocampalen neuralen Vorläuferzellen (NPCs, neural progenitor cells) kontrollieren. In Säugetieren steuern die homologen RAF Kinasen ARAF, BRAF und CRAF die mitogene Kaskade, die bei der adulten Neurogenese von elementarer Bedeutung ist. In dieser Studie wurde untersucht ob die Nullmutation von CRAF eine Auswirkung auf die postnatale und adulte hippocampale Neurogenese hat. Unsere Analysen von BRAF- und CRAF-defizienten Mäusen zeigen in der frühen Embryonalentwicklung gemeinsame Funktionen beider Kinasen, weshalb das Fehlen einer Kinase bis zu bestimmten embryonalen Entwicklungszeitpunkten durch die jeweils andere Kinase kompensiert werden kann. Letalitätsstudien zeigen jedoch, dass BRAF und CRAF bei späteren Entwicklungsstadien jeweils unabhängig für das Überleben von Tieren relevant sind. CRAF Nullmutanten werden nicht nach der erwarteten Mendelschen Frequenz geboren und nahezu 70% der Tiere sterben bereits kurz nach der Geburt. Die maximale beobachtete Lebenserwartung adulter CRAFko Tiere lag bei postnatal Tag 55. CRAFko Mäuse haben eine reduzierte Körpergröße, veränderte Hautfarbe und einen eye-open-at-birth-Phänotyp. Verhaltensexperimente in unserer Arbeitsgruppe zeigten an heterozygoten CRAF Mäusen einen Einfluss von CRAF auf das Angst - und Lernverhalten, was einen Einfluss von CRAF auf die Neurogenese-vermittelte hippocampale Funktion andeutete. Tatsächlich konnte hier die Expression von CRAF im postnatalen Gehirn von Mäusen immunhistologisch wie auch proteinbiochemisch nachgewiesen werden. Im Hippocampus zeigte sich, dass ein Funktionsverlust von CRAF zu einer erhöhten Anzahl mitotisch aktiver NPCs führt, die massive Zellzyklusveränderungen aufweisen. Zudem wurde eine fehlerhafte Reorganisation der tertiären Matrix beobachtet. NPCs CRAF-defizienter Tiere befinden sich vermehrt im Hilus und bleiben in der Entwicklung zu reifen Körnerzellen im D Zell-Vorläuferstadium stecken. Weitere Analysen zeigen, dass diese fehlplatzierten NPCs teilweise über apoptotische Signalwege eliminiert werden. Als Resultat dieser Entwicklungsstörung ist der gyrus dentatus CRAF-defizienter Tiere verkleinert und es kann eine verlangsamte neuronale Differenzierung NPC-abgeleiteter Neurone beobachtet werden. Diese Befunde zeigen erstmals einen CRAF-spezifischen Einfluss auf die Regulation elementarer, zellulärer Eigenschaften neuronaler Vorläuferzellen des Hippocampus. N2 - The hippocampal dentate gyrus is the primary target region of cortical afferents originating in the entorhinal cortex. During its evolutionary development, the dentate gyrus has achieved the ability of continuous postnatal neurogenesis by establishing a neurogenic niche (tertiary matrix). This process is regulated by multiple mediators such as transcription factors that control proliferation, cell differentiation and survival of hippocampal neural precursor cells (NPCs). Mammals express three homologous RAF kinases ARAF, BRAF and CRAF which regulate the mitogenic cascade, an essential element of adult neurogenesis. In this study we analysed if the nullmutation of CRAF interferes with postnatal and adult hippocampal neurogenesis. Our analysis of BRAF and CRAF-deficient mice reveals common functions of both kinases during early embryogenesis. In this developmental phase, lack of one kinase may be compensated by the other kinase. This phenomenon ends at later embryonic developmental stages. Lethality studies show independent roles of BRAF and CRAF in survival during later developmental stages. CRAF null-mutants are not born in mendelian frequency and almost 70% of all CRAF mutants die within a short time window after birth. The oldest analysed CRAFko mice survived until postnatal day P55. CRAFko mice show a decreased body size, altered skin colour and possess an eye-open-at-birth-phenotype. Previous behavioural experiments by our group revealed the influence of CRAF in anxiety-like behaviour and specific learning paradigms, indicating an effect of CRAF on neurogenesis-dependent hippocampal functions. Indeed, this study confirmed the expression of CRAF with immunohistological and biochemical methods in postnatal mouse brain tissue. In the hippocampus, the loss-of-function mutation of CRAF leads to increased numbers of mitotically activated NPCs which exhibit drastic cell-cycle abnormalities. In addition, CRAF-deficient mice carry malformations in the organisation of their tertiary matrix. NPCs of CRAF-deficient mice are mainly located in the hilus where their maturation towards the neuronal lineage persists in the D-cell stage. A detailed analysis shows that these misplaced NPCs are - at least partially - eliminated by apoptosis. Due to this developmental defect the dentate gyrus of CRAF-deficient mice is smaller and the neuronal differentiation of NPC-derived neurons is delayed. These results show for the first time a CRAF-specific effect on the regulation of basic cellular functions of neuronal precursors in the hippocampus. KW - Hippocampus KW - Neurogenese KW - adulte Neurogenese KW - RAF Kinasen Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98220 ER - TY - THES A1 - Meister, Jonas T1 - Wertigkeit operativer Stimmangleichung bei Mann-zu-Frau-Transsexualismus – Evaluation der Glottoplastik nach Wendler modifiziert durch Hagen T1 - Value of phonosurgical intervention in male-to-female transsexualism – Evaluation of the Wendler-glottoplasty modified by Hagen N2 - Transsexualität ist gekennzeichnet durch die dauerhafte Gewissheit, in einem Körper des falschen Geschlechts geboren worden zu sein. Bei Mann-zu-Frau-Transsexualität ist die Stimme ein oft unterschätzter Bestandteil der ganzheitlichen Therapie. Kann mit konservativer Therapie kein zufriedenstellend weiblicher Stimmklang erreicht werden, ist Phonochirurgie die Methode der Wahl. In Würzburg wird hierzu die Glottoplastik nach Wendler modifiziert durch Hagen angewendet. An der vorliegenden Studie zur Qualitätsüberprüfung des operativen Verfahrens nahmen insgesamt 21 auf diese Art operierte Patientinnen teil, von denen 18 zu einer Nachuntersuchung in Würzburg erschienen und 3 die zugsandten Fragebögen ausfüllten. Erwartet wurden eine Anhebung der mittleren Sprechstimmlage sowie eine Veränderung weiterer objektiver Stimmparameter. Mit einer angehobenen Sprechstimmlage wurde auch eine höhere Zufriedenheit der Patientinnen mit ihrer Stimme vermutet. Nach Erfahrungsberichten vieler Patientinnen blieben Probleme beim Telefonieren jedoch weiterhin bestehen. Diese für den subjektiven Therapieerfolg sehr wichtige Situation wurde mit einer Perzeptionsstudie gezielt untersucht. Insgesamt zeigte sich die Operation als risikoarme und effektive Therapieoption, um die mittlere Sprechstimmlage anzuheben. So lag die mittlere Sprechstimmlage der Patientinnen postoperativ im Median bei 170 Hz und somit im ausschließlich weiblichen Stimmlagenbereich. Die Anhebung der mittleren Sprechstimmlage ging mit einem leichten Verlust des Dynamikumfangs einher, der jedoch nur von ca. einem Drittel der Patientinnen als störend empfunden wurde. Zur subjektiven Erfolgskontrolle wurden Daten aus den standardisierten Fragebögen „Voice Handicap Index“ sowie „Fragebogen zur Lebenszufriedenheit“ und dem eigenen „Würzburger Fragebogen“ erhoben und ausgewertet. Die Ergebnisse dieser Fragebögen zeigten, abweichend von den guten objektiven Messwerten, deutliche Einschränkungen gegenüber einer stimmgesunden Vergleichsgruppe aus der Literatur. Diese Defizite betrafen sowohl die stimmbezogenen Fragengebiete des Voice Handicap Index, als auch die allgemeine Lebenszufriedenheit. Dennoch gaben die Patientinnen an, durch die Stimmoperation ein selbstsichereres Auftreten gegenüber fremden Personen gewonnen zu haben. Die subjektive Stimmzufriedenheit korrelierte sowohl mit der mittleren Sprechstimmlage als auch mit der Selbsteinschätzung der Weiblichkeit der Stimme. Bei Frequenz- und Dynamikumfang zeigten sich starke Differenzen zwischen objektiven Messergebnissen und subjektiver Zufriedenheit. Für die Perzeptionsstudie zur Telefonsituation wurden von 18 Patientinnen sowie jeweils im Alter gepaarten männlichen und weiblichen Kontrollsprechern identische Sprachaufnahmen angefertigt und in der Frequenz entsprechend der Übertragungs-bandbreite am Telefon bearbeitet. Diese Stimmproben wurden 50 männlichen und 50 weiblichen zufällig ausgewählten Laienjuroren zur Bewertung hinsichtlich des Sprechergeschlechts vorgespielt. Gemessen wurde neben dem Urteil männlich oder weiblich auch die Zeitspanne von Beginn der Wiedergabe bis zur Urteilseingabe. Ungefähr 40 % der transsexuellen Patientinnen wurden mehrheitlich, also in über 50 % der Urteile als weiblich bewertet. Die Urteilszeit lag für die Sprachproben der transsexuellen Patientinnen signifikant über der Urteilszeit für männliche und weibliche Kontrollsprecher. Bezogen auf die Juroren zeigten sich Unterschiede zwischen männlicher und weiblicher Jurorengruppe: Männer ordneten die Sprachproben häufiger einem weiblichen Sprecher zu. Weibliche Juroren fällten ihr Urteil hingegen signifikant schneller als männliche Juroren. Es zeigte sich eine positive Korrelation der Geschlechtszuordnung mit der mittleren Sprechstimmlage. Die unabhängig von der Sprechstimmlage deutlich verlängerte Urteilszeit für transsexuelle Sprecherinnen zeigte jedoch, dass neben der mittleren Sprechstimmlage auch noch andere Faktoren die Geschlechtszuordnung beeinflussen. Dementsprechend existierte keine klare Grenzfrequenz, oberhalb derer Stimmen regelhaft als weiblich wahrgenommen wurden. Auch in einem in der Literatur mehrfach als ausschließlich weiblich definierten Sprechbereich wurden die Stimmen einzelner Patientinnen mehrheitlich als männlich wahrgenommen. Es konnte kein Zusammenhang der Formantfrequenzen F1 – F3 mit der Geschlechtszuordnung gefunden werden. Zusammenfassend zeigten diese aus objektiven Stimmdaten, Eigen- und Fremd-bewertung bestehenden Ergebnisse, dass durch alleinige Operation zwar eine höhere Stimmlage, jedoch kein vollständig weiblicher Stimmklang erreicht wurde. Deswegen muss die Phonochirurgie zukünftig stärker in ein umfassendes Behandlungskonzept aus logopädischem Stimmtraining, Übungen für eine weibliche Gestik und Mimik sowie Alltagstraining eingebunden werden. Hierzu wurde in dieser Arbeit ein neuer Behandlungsalgorithmus für die Univ.-HNO-Klinik Würzburg erstellt. N2 - Transsexualism is a problem of gender identity with the individual being firmly convinced that his or her psychological gender is the opposite of his or her anatomic gender. After long and burdensome therapy consisting of medical and psychological treatments transgender persons obviously wish to be accepted in the society with their new gender role. The voice as a secondary sexual characteristic is an important factor of gender perception. In cases for which conservative voice therapy is unable to produce satisfactory results, surgery may be offered. In Würzburg, Wendler’s glottoplasty modified by Hagen is the preferred treatement. In this study, objective and subjective therapy success of 21 male-to-female-transgender persons after glottoplasty was investigated. Expected was an elevation of the fundamental frequency range and other objective voice parameters as well as a higher subjective voice satisfaction correlating with the higher frequency. Because many patients reported ongoing problems in everyday life, especially using the telephone to communicate, this situation was investigated in a perception test with 18 transgender speakers as well as 18 male and 18 control speakers. Altogether, Wendler’s glottoplasty modified by Hagen is an effective and low-risk method of raising the vocal pitch of male-to-female transgender persons. The fundamental frequency was elevated into the typical female fundamental frequency range. Furthermore an elevation of the lower frequency limit was shown without a reduction of the frequency range. About one third of the population feels affected by the restricted dynamic range. This change of the vocal pitch is seen as part of the voice feminization by some of the patients. The dysphonia severity index as a marker for voice quality was unchanged. Subjective satisfaction with the voice showed a strong correlation with the individual elevation of the pitch. Most of the patients stated to be more self-confident because of the voice therapy. However, elevated Scores of the Voice Handicap Index indicated that in everyday life transgender persons continue to feel handicapped because of their voice. Another indicator for the lack of social acceptance and integration is the reduced general life satisfaction in the Life Satisfaction Questionnaire, especially in the domain “friends, acquaintances, relatives”. But could these problems in everyday-life be objectified in the telephone test? In the perception study, speech samples were recorded of 18 MtF after Wendler’s glottoplasty, 18 male and 18 female persons. After adaption of the frequency to the limited frequency transmission on the telephone (300 – 3400 Hz) the speech samples were judged by 50 male and 50 female listeners. Parameters were the decision “male” or “female” and the decision time. The formant frequencies F1 – F3 for the vowel /a/ were extracted and compared between the speaker groups. About 40% of the transgender speakers were perceived as female by the majority of listeners. A correlation between fundamental frequency and perceptions as female could be shown. The decision time needed was longer for MtF than for male or female speakers. Female listeners decided significantly faster than male listeners. Female listeners perceived the MtF more often as male speaker. For the MtF, the perception as female correlated with their individual voice satisfaction. Comparing the formant frequencies of male and MtF speakers, F2 was higher for MtF, but there was no correlation between the formant frequencies and the gender perception of the judges. In summary this results shows, that phonosurgical intervention alone can elevate the vocal pitch but the voice is not necessarily perceived to be more female. Besides fundamental frequency many more parameters influences gender perception of a voice, for example the used freqeuency range, intonation, prosody, gesture, vocabulary and much more. So in future, phonosurgery has to be integrated in a multi-disciplinary therapy concept consisting of conservative and phonosurgical voice therapy, training of gestures and facial expression as well as every-day-life-training. To improve this comprehensive voice treatment, a new therapy algorithm for the University Hospital of Wuerzburg, Department of Otorhinolaryngology, Plastic, Aesthetic and Reconstructive Head and Neck Surgery, Würzburg, is presented in this thesis. KW - Transsexualismus KW - Stimmbandchirurgie KW - Kehlkopfchirurgie KW - Stimmerhöhung KW - Phonochirurgie KW - Glottoplastik Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159201 ER - TY - THES A1 - Fröhlich, Monika Gabriele T1 - Die Bedeutung von CD28 vermittelter Kostimulation für CD8 T-Zell-Gedächtnisreaktionen T1 - The role of CD28 costimulation for CD8 T-cell memory responses N2 - Immunologische Gedächtnisreaktionen sind die Grundlage um wiederkehrende Erreger schnell und effizient zu bekämpfen und um einen Impfschutz zu generieren. Das zellvermittelte Gedächtnis wird unter anderem durch CD8 Gedächtnis-T-Zellen aufgebaut, welche vor allem im Kontext von Immunreaktionen gegen intrazellulärer Erreger vonnöten sind, um bei Reinfektion mit den Erregerstämmen einen schnellen Schutz zu gewährleisten. Ein detailliertes Wissen über die Generierung, Kontrolle und Reaktivierung der Gedächtniszellen ist nützlich, um Gedächtnisreaktionen verstehen und lenken zu können. Durch die Entdeckung des TZR und CD28 wurden Meilensteine für das Verständnis der T-Zellaktivierung gelegt und die Grundlage geschaffen, CD8 Gedächtnisreaktionen zu verstehen. Auch wenn für primäre Immunreaktionen die „2-Signal-Theorie“ lange als erwiesen gilt, so blieb die Rolle der Kostimulation für Gedächtnisreaktionen lange umstritten. In dieser Arbeit wurden verschiedene methodische Herangehensweisen verwendet, mit denen durchgehend die Bedeutung von CD28 vermittelter Kostimulation für immunologische CD8 T-Zell-Gedächtnisreaktionen nachgewiesen wurde. CD28 blockierende Antikörper und CD28 induzierbar deletierbare Mauslinien wurden im Modellinfektionssystem mit Ovalbumin produzierenden Listeria monocytogenes zur Analyse der Primär- und Sekundärantworten verwendet. Mit diesen Methoden konnte eine Beeinträchtigung der Expansion von CD8 Gedächtniszellen in Abwesenheit von CD28 bewiesen werden. Weiterhin werden Effektorfunktionen wie Degranulation und Produktion von IFN-γ während der Sekundärinfektion in Abwesenheit von Kostimulation eingeschränkt. Mit Hilfe von Experimenten, bei denen CD28 suffizienten Mäusen eine geringe Anzahl an naiven, antigenspezifischen, CD28 deletierbaren CD8 T-Zellen transferiert wurden, wurde die Bedeutung der Kostimulation für die Expansion von Gedächtniszellen bestätigt, jedoch konnte überraschenderweise auch ein Anstieg der Effektorfunktionen in Abwesenheit von CD28 sowohl während der Primär- als auch der Sekundärantwort dokumentiert werden. Diese zur globalen Blockade bzw. Deletion widersprüchlichen Ergebnisse lassen eine Beteiligung anderer CD28 abhängiger Zelltypen an der Induktion der Effektorfunktionen der CD8 T-Zellen plausibel erscheinen, wie zum Beispiel Einflüsse von T-Helferzellen, welche die Effektorfunktionen positiv verstärken, solange sie selbst Kostimulationssignale empfangen können. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich Gedächtniszellen an den CD28 defizienten Phänotyp – eine CD28 intakte immunologische Umgebung vorausgesetzt – adaptieren können, wenn ausreichend Zeit nach Deletion und vor Sekundärinfektion verstreichen konnte. N2 - Immunological memory is of vital importance for the fight against reoccurring pathogens and to protect organisms from infections. Important players are CD8 memory T-cells that are created mainly during intracellular infections to boost rapid cellular defenses upon reinfection. The understanding of the generation, control and reactivation of these memory cells is crucial to comprehend and regulate mechanisms of memory immune reactions. The discovery of the TCR and of the costimulator CD28 depict important milestones towards the understanding of activation of memory cells – and naive cells, of course. The paradigm of the two signal theory in the activation of naive T-cells has long been accepted but the role of CD28 mediated costimulation in secondary CD8 T-cell responses remains controversial. Several methodological approaches to investigate the impact of costimulation on memory CD8 T-cells were used in this work, all proving the importance of CD28 to mount robust memory responses. CD28 blocking antibodies and also inducibly CD28 deleting mice were used in both primary and secondary infections with Ovalbumin-producing Listeria monocytogenes to establish an impaired clonal expansion of CD8 memory T-cells in the absence of CD28 function. Furthermore, effector functions such as degranulation and IFN-γ production were reduced during the secondary immune response. Specific deletion of CD28 in CD8 cells in mice that were seeded with a naturally occuring number of antigen specific, CD28 deletable naive CD8 T-cells provided evidence for the importance of costimulatory signals for the clonal expansion but also revealed an increase of effector functions in the absence of CD28 both in the primary and in the secondary response. These findings suggest a participation of other CD28 responsive cells such as T-helper cells by supporting CD28 deleted effector cells to exert their effector functions under the terms of CD28 sufficiency in the other parts of the immune system. Furthermore, I found that the progeny of primed CD8 T-cells can adapt to the CD28 deficient phenotype if given sufficient time before reactivation. KW - Antigen CD28 KW - Antigen CD8 KW - CD8 Gedächtnisreaktionen KW - CD28 KW - Kostimulation KW - CD8 Effektorfunktionen Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158791 ER - TY - THES A1 - Selle, Martina T1 - Interaktionen zwischen sekretierten Proteinen von Staphylococcus aureus und der Immunantwort des Wirtes T1 - Interaction of secreted proteins of Staphylococcus aureus and host immune response N2 - Staphylococcus aureus ist ein grampositives Bakterium, welches häufig als kommensaler Besiedler auf der Nasen- und Rachenschleimhaut von Säugetieren vorkommt. Darüber hinaus besitzt dieser fakultativ pathogene Mikroorganismus die Fähigkeit schwer zu behandelnde Krankenhausinfektionen auszulösen. Aufgrund der weiten Verbreitung von Antibiotikaresistenzen und dem Mangel an effektiven Therapien, verursachen S. aureus Infektionen jährlich enorme Kosten für das Gesundheitssystem. S. aureus wird meist von der Nase zum primären Infektionsort übertragen, wodurch zunächst sehr häufig Wund- und Weichteilinfektionen hervor gerufen werden. Von diesem primären Infektionsort ausgehend, kann der Erreger tiefer liegende Gewebsschichten infizieren oder sich über den Blutstrom im gesamten Organismus ausbreiten. Das Spektrum an Krankheitsbildern reicht von leichten Abszessen der Haut bis zu schweren, lebensbedrohlichen Erkrankungen wie Pneumonien und akuter Sepsis. Für die erfolgreiche Kolonisierung und Infektion des Wirtes exprimiert S. aureus eine Vielzahl unterschiedlicher Virulenzfaktoren. Die wohl größte Gruppe an Virulenzfaktoren umfasst die Proteine, die an der Immunevasion und der Umgehung von verschiedenen Abwehrstrategien des Immunsystems beteiligt sind. Das bisherige Wissen über die Interaktion von S. aureus mit dem Immunsystem des Wirtes und die zugrunde liegenden Pathogenitätsmechanismen ist bisher limitiert. Um neue Erkenntnisse über die Interaktion von Wirt und Pathogen zu erlangen, wurden im Rahmen dieser Arbeit bislang unbekannte sekretierte und Oberflächen-assoziierte Proteine von S. aureus funktionell charakterisiert. Die Funktion der ausgewählten Proteine wurde in vitro hinsichtlich Einfluss auf Komponenten des Immunsystems, Adhäsion an Wirtsfaktoren und Invasion in eukaryotische Zellen untersucht. Mit Hilfe der vorangegangenen in-vitro-Charakterisierung der putativen Virulenzfaktoren, konnte für die cytoplasmatische Adenylosuccinat-Synthase PurA eine neuartige Funktion identifiziert werden. PurA ist bekannt als essentielles Enzym der de novo Purin-Synthese. In dieser Arbeit wurde nun gezeigt, dass PurA zudem an der Immunevasion beteiligt ist. Durch die Bindung des humanen Faktor H des Komplementsystems schützt PurA S. aureus vor der lytischen Aktivität des Komplementsystems und verhindert die Opsonisierung des Pathogens. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde PurA detailliert charakterisiert. In Bindungsstudien mit rekombinantem Faktor H und PurA wurde eine direkte Interaktion beider Proteine nachgewiesen, wobei Faktor H mit dem N-terminalen Bereich von PurA interagiert. Weiterhin konnte PurA durch Immunfluoreszenz und FACS-Analysen auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden, wo es wahrscheinlich mit der Zellwand assoziiert vorliegt. Dort rekrutiert es Faktor H an die bakterielle Oberfläche und verhindert das Fortschreiten der Komplement-Kaskade und damit die Lyse des Pathogens. Aufgrund der Multifunktionalität zählt PurA somit zur Gruppe der Moonlighting Proteine. Des Weiteren wurde die Rolle von PurA im Infektionsgeschehen in zwei unabhängigen Tiermodellen untersucht. In beiden Modellen wurde ein signifikant reduziertes Virulenzpotential der ΔpurA-Mutante beobachtet. Zukünftig soll geklärt werden, ob die verminderte Virulenz in der fehlenden Komplementevasion oder im Defekt in der Purin-Synthese begründet ist. Aufgrund der sehr starken Attenuation in allen untersuchten Infektionsmodellen sollte PurA als potentielles Target für eine Therapie von S. aureus Infektionen weiter charakterisiert werden. Im Ergebnis dieser Arbeit wurde demnach mit PurA ein neues Moonlighting Protein identifiziert, das als Inhibitor des Komplementsystems wesentlich zur Immunevasion von S. aureus beiträgt. Für das bessere Verständnis der humoralen S. aureus-spezifischen Immunantwort, Unterschieden in der Antikörperantwort und der gebildeten Antikörperspezifitäten wurde weiterhin das während der Kolonisierung und Infektion gebildete S. aureus-spezifische Antikörperprofil untersucht. Dazu wurden Plasmen von humanen nasalen Trägern und Nicht-Trägern sowie murine Seren von infizierten Tieren untersucht. Insbesondere wurde das Pathogen-spezifische Antikörperprofil in unterschiedlichen Infektionsmodellen mit Hilfe eines Proteinarrays analysiert, der im Rahmen dieser Arbeit in einer Kooperation mit der Firma Alere Technologies (Jena, Deutschland) und universitären Forschergruppen der Universitäten Greifswald, Münster und Jena mitentwickelt wurde. Die Antikörperprofile von intramuskulär und intravenös infizierten Tieren resultierten in jeweils spezifischen Antikörperprofilen. Diese Ergebnisse deuten auf einen Zusammenhang zwischen der Art der Infektion und der gebildeten Antikörperspezifitäten hin. Wahrscheinlich beruht dies auf einer gewebespezifischen Genexpression als Anpassung an die individuellen Bedürfnisse im Wirtsorganismus. Das ausgebildete Antikörperprofil gibt somit einen Einblick in das Expressionsmuster von Virulenzfaktoren von S. aureus unter in vivo Bedingungen und trägt damit zum Verständnis der komplexen Interaktion von Pathogen und Wirt bei. Diese Untersuchungen ergänzen zudem die bisherigen Kenntnisse über die Anpassung der humoralen Immunantwort an eine asymptomatische Kolonisierung im Gegensatz zu einer akuten Infektion durch S. aureus. Darüber hinaus können die gewonnenen Ergebnisse für diagnostische Zwecke und zur Identifikation von neuen Zielstrukturen für eine Vakzin-Entwicklung genutzt werden. N2 - S. aureus is a gram-positive bacterium that is prevalent in animals. It is part of the commensal nasal and respiratory flora. Moreover, it has the ability to transform into a pathogenic micro-organism, thereby eliciting different diseases including hospital-associated infections. S. aureus is transmitted via direct contact from nasal mucosa to the site of infection where it may provoke skin and soft tissue infections. Due to the rapid development of resistance to antibiotics and a current lack of effective treatment options, S. aureus infections cause enormous costs for the health-care system. Starting from the primary site of infection, S. aureus invades into deeper tissues and into the bloodstream during the course of the infection. This leads to a dissemination of the pathogen in the body and is associated with a broad spectrum of diseases including skin abscesses, pneumonia or even acute septicaemia. The pathogen S. aureus produces a multitude of virulence factors that help to colonize and infect the human host. Probably the most extensive group habours proteins involved in immune evasion and circumvent different host defence mechanisms. Understanding of the interaction between S. aureus and the host immune response and the underlying pathogenicity mechanism is still limited. As a part of this work, the interaction of novel secreted and surface-associated proteins of S. aureus with the host immune response was investigated in order to expand the knowledge of host pathogen interactions. Therefore, the function of thus far uncharacterized extracellular proteins of S. aureus was investigated in vitro in relation to influence on components of the immune system, adhesion to host factors and invasion in eukaryotic cells. By using results from previous in vitro characterization of putative virulence factors, a novel function of cytoplasmic adenylosuccinate synthetase PurA was identified. Beside the catalytic reaction during de novo purine synthesis, PurA is independently involved in immune evasion. By binding human complement regulators such as factor H, it protects the bacteria from the lytic activity of the human complement system and prevents the opsonization of the pathogen. The progression of the complement cascade on the bacterial surface is prevented by recruiting complement FH. On the basis of these findings, the moonlighting protein PurA was therefore characterized in detail. In this, the binding between both interaction partners FH and PurA was analysed first. Moreover, it was shown that the cytosolic protein PurA is also associated with the bacterial cell wall. Besides the in vitro characterization of PurA, the impact of the multitasking protein of S. aureus on virulence was investigated in vivo. Therefore ΔpurA deletion mutants were studied regarding their virulence potential in the alternative animal model Galleria mellonella as well as in mice. Due to the reduced virulence of ΔpurA deletion mutants in all investigated animal models, PurA was suggested as a potential target for antibiotic treatment during S. aureus infection. In summary, the moonlighting protein PurA enlarges the spectrum of immune evasion strategies used by S. aureus with a complement system inhibitor. For better understanding of the pathogen-specific humoral immune response, the differences in antibody response and specificities were investigated in human plasma of nasal carriers and non-carriers as well as in murine sera of infected animals. Moreover, the anti-S. aureus antibody profile developed during infection was characterized depending on the type of infection by using a protein array that was co-developed in cooperation with the company Alere technologies (Jena, Germany) and university research groups from Greifswald, Münster and Jena. The results of the differentially infected mice indicated a relationship between developed antibody specificities and type of infection which is likely due to differential gene expression as an adaptation to individual requirements in the host environment. The results give insights into the expression pattern of virulence factors of S. aureus under in vivo conditions contributing to the understanding of the highly complex interaction between pathogen and host. Moreover, these findings supplement the current experience in the adaptations of the humoral immune response to asymptomatic colonization and acute infection. The results gained from this study can be used as a diagnostic tool or for target identification in the development of vaccine. KW - Staphylococcus aureus KW - Komplement KW - Virulenzfaktor KW - Antikörper-Antwort Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128031 ER - TY - THES A1 - Quenzer, Anne T1 - Der antiproliferative Effekt des Multidrug resistance-Protein 1 (MRP1)-Inhibitors Reversan und der Laktatdehydrogenase (LDH)-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin an kolorektalen Karzinomzellen bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen T1 - Antiproliferative effects of multidrug resistance protein 1 (MRP1) inhibitor Reversan and lactate dehydrogenase (LDH) inhibitors Natriumoxamat and Galloflavin in human colorectal cells exposed to oxygen levels characteristic for tumor oxygenation N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit waren pharmakologische Untersuchungen zum antiproliferativen Effekt der beiden Laktatdehydrogenase (LDH)-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin sowie des MRP1-Inhibitors Reversan einzeln und in Kombination bei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen in vitro zu untersuchen. Zusätzlich wurde der antiproliferative Effekt der drei Inhibitoren mit dem antiproliferativen Effekt von 5-FU verglichen. Das Konzept zu dieser Arbeit basiert auf Gemeinsamkeiten zwischen LDH und MRP1 in malignen Zellen. Eine ist, dass beide Moleküle von zahlreichen Tumoren überexprimiert werden. Weiter sind beide an der Ausbildung von Chemoresistenz beteiligt und beide werden auch in Hypoxie exprimiert. Zudem wird das für die Funktion von MRP1 notwendige ATP in malignen Zellen hauptsächlich mit der hyperaktiven Glykoloyse gebildet, deren Stoffumsatz auch von der LDH-Aktivität abhängig ist. Eine kombinierte Inhibition beider Zielstrukturen scheint somit geeignet zu sein, um die Proliferation maligner Zellen gezielt zu hemmen. Da in großen Teilen solider Tumoren hypoxische bzw. anoxische Bedingungen vorherrschen, wurde die Wirksamkeit der drei Inhibitoren auch bei 5 % und 1 % Sauerstoff, die als tumorphysiologisch gelten, untersucht. Die wichtigsten Ergebnisse aus dieser Arbeit sind, dass die beiden LDH-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin und der MRP1-Inhibitor Reversan einen antiproliferativen Effekt bei kolorektalen Karzinomzellen auslösen, der auch für tumorphysiologische Sauerstoffkonzentrationen nachzuweisen war. So verringerte sich durch Natriumoxamat bzw. Galloflavin der Anteil vitaler Zellen um bis zu 45 % und durch Reversan um bis zu 60 % bei 5 % und 1 % Sauerstoff im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Auch unterschiedliche Kombination aus Natriumoxamat, Galloflavin und Reversan führten zu einer Steigerung des antiproliferativen Effektes, der auch immer bei tumorphysiologischen Konzentrationen nachzuweisen war. Den stärksten antiproli-ferativen Effekt wies die Dreifachkombination aus Galloflavin, Natriumoxamat und Reversan auf. So verringerte sich der Anteil vitaler Zellen bei 1 % Sauerstoff durch diese Kombination auf bis zu 28 % bei vier der fünf kolorektalen Karzinomzelllinien. Die Dreifachkombination wies einen gleichstarken bzw. stärkeren antiproliferativen Effekt auf als das Chemotherapeutikum 5-FU und zwar ebenfalls bei 5 % und 1 % Sauerstoff. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zum antiproliferativen Effekt von Natriumoxamat, Galloflavin (beides LDH-Inhibitoren) und Reversan (MRP1-Inhibitor) in vitro lassen den Schluss zu, dass das Konzept der Arbeit, einen antiproliferativen Effekt auch bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen zu induzieren, grundsätzlich bestätigt wurde. Auch löste die gemeinsame Hemmung von LDH und MRP1 einen teilweise stärkeren antiproliferativen Effekt aus als 5-FU. Weitere Untersuchungen sind aber ohne Frage nötig, um die molekularen Interaktion zwischen LDH und MRP1 sowie ihrer Inhibition im Detail zu verstehen. N2 - The aim of the present study was to investigate the antiproliferative effect of the two lactate dehydrogenase (LDH) inhibitors sodium oxamate and galloflavin and the MRP1 inhibitor reversan at different oxygen concentrations in vitro. The inhibitors were used individually and in combination. In addition, the antiproliferative effect of the three inhibitors was compared with the antiproliferative effect of 5-FU. The concept of this study is based on similarities between LDH and MRP1 in malignant cells: their overexpression by numerous tumors; their contribution to chemoresistance and their expression in hypoxia. In addition, the ATP necessary for the function of MRP1 is mainly formed in malignant cells by an increased turnover of the hyperactive glycolysis, which also depends on the LDH activity. Thus, a combined inhibition of both targets appears to inhibit tumor cell proliferation effectively. Since hypoxic or anoxic conditions prevail in large parts of solid tumors, the efficacy of the three inhibitors was also investigated at 5% and 1% oxygen, which are considered to be physiological for solid tumors. The most important results of the study are that both sodium oxamate and galloflavin, as well as reversan trigger an antiproliferative effect in colorectal carcinoma cells, even in the presence of tumor physiological oxygen concentrations. For example, the pro-portion of viable cells decreased up to 45% with sodium oxamate or galloflavin and up to 60% with reversan, even at 5% and 1% oxygen compared to untreated control cells. Different combinations of sodium oxamate, galloflavin and reversan resulted in en-hanced antiproliferative effects, which were also demonstrated at tumor physiological oxygen concentrations. The strongest antiproliferative effects were observed with the triple combination of galloflavin, sodium oxamate and reversan. In this combination, the proportion of viable cells decreased to 28% at 1% oxygenation in four of the five colorectal carcinoma cell lines. The triple combination caused an antiproliferative effect that was equal to or even more potent than the antiproliferative effect of the chemotherapeutic agent 5-FU also at 5% and 1% oxygen. The results of this study on the antiproliferative effect of sodium oxamate, galloflavin (both LDH inhibitors) and reversan (MRP1 inhibitor) in vitro seems to confirm the aim of the study, which was to induce an antiproliferative effect even in tumor physiologi-cal oxygen concentrations. In part, the combined inhibition of LDH and MRP1 caused a stronger antiproliferative effect than 5-FU. However, further investigations are neces-sary to comprehend the molecular interaction between LDH and MRP1 as well as its inhibition in detail. KW - Lactatdehydrogenase KW - 5-FU KW - Multidrug-Resistance-Related Proteine KW - Inhibition KW - Metabolismus KW - Tumorzellen KW - Tumormetabolismus KW - Chemoresistenz KW - tumorspezifische Therapie KW - Intratumorale Heterogenität Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156051 ER - TY - THES A1 - Lagler, Charlotte T1 - Analyse von BMP2 und BMP2-Derivaten der TGF-β-Familie als potentielles Therapeutikum im Multiplen Myelom T1 - Analysis of BMP2 and BMP2 derivatives of the TGF-β-family as a potential therapeutic agent in multiple myeloma N2 - Diese Dissertation analysiert BMP2 und BMP2-Derivate als neue therapeutische Strategien für die Behandlung des Multiplen Myeloms (MM). Das MM ist eine maligne neoplastische Erkrankung des Knochenmarks mit Plasmazellvermehrung und erhöhten Leveln an Aktivin A im Blutserum, wobei eines der Hauptsymptome das Auftreten von schmerzvollen Osteolysen ist. In den letzten Jahren rückte Aktivin-A als interessantes Target zur Behandlung des Multiplen Myeloms in den Vordergrund. Die Reduzierung der Aktivin-A Level durch decoy-Rezeptoren führte zu einer signifikanten Verbesserung der Osteolysen und einem reduzierten Proliferationsverhalten der neoplastischen B-Zellen, sowohl im Tierexperiment als auch in Studien der klinischen Phase II. Die Aktivin-A-Antagonisierung ist somit ein neuer und vielversprechender Ansatz in der Therapie des Multiplen Myeloms. Das Bone Morphogenetic Protein 2 ist aufgrund seiner molekularen und biologischen Eigenschaften ein interessantes Target für die Therapie des Multiplen Myeloms. Es ist auf molekularer Ebene ein Aktivin-A-Antagonist, besitzt aber auch osteoinduktives Potential und apoptotische bzw. anti-proliferative Eigenschaften auf neoplastische B-Zellen. Da die in der Literatur bereits beschriebenen, durch Mitglieder der TGF-β-Familie induzierten Apoptosemechanismen, noch nicht genauer untersucht waren, wurde in dieser Arbeit die BMP2-induzierte Apoptose in 10 unterschiedlichen humanen MM-Zellen analysiert. Erstens konnte dabei nachgewiesen werden, dass 7 von 10 Zelllinien nicht BMP2-responsiv waren. Eine genauere Untersuchung ergab, dass neben der Expression spezifischer BMP-Rezeptoren auch die Expression von inhibitorischen Smad-Proteinen über die BMP2-Responsivität entscheidet. Zweitens zeigte die genauere Analyse der Apoptosemechanismen, dass entgegen der in der Literatur publizierten Ergebnisse, BMP2 keine apoptotische Wirkung auf die von uns untersuchten Zelllinien hat. Mehrere verschieden durchgeführte Experimente, u.a. die Verwendung von spezifischen Inhibitoren des programmierten Zelltodes, unterstützen dieses Ergebnis und klassifizieren BMP2 als einen rein anti-proliferativen Faktor. Der letzte Teil der Arbeit befasst sich mit der Analyse von potentiellen Aktivin-A-Antagonisten in Form verschiedener BMP2- und GDF5-Derivate und inwiefern sie sich zum Einsatz in der Therapie des Multiplen Myeloms eignen. Die unterschiedlichen Eigenschaften der einzelnen Mutanten wurden in verschiedenen Zellsystemen getestet. So konnte aufgezeigt werden, dass neben einer erhöhten biologischen Aktivität in Form eines gesteigerten osteoinduktiven und anti-proliferativen Potentials auf neoplastische B-Zellen (Superagonisten), sich die verschiedenen Derivate als Super-Antagonisten zu Aktivin A eignen und damit unterschiedlichen Ansprüchen der adjuvanten Therapie im Multiplen Myelom gerecht werden. N2 - This dissertation analyses BMP2 and BMP2 derivatives as new therapeutic agents in multiple myeloma (MM). MM is a malignant neoplastic disease of bone marrow with plasmatic cell proliferation and increased Activin-A-level in blood serum. A particular symptom of this disease is the occurrence of painful osteolysis. In the last few years Activin A has become an important target for the treatment of multiple myeloma. Reducing Activin A levels by decoy receptors led to a significant improvement in osteolysis and reduced proliferation behavior of neoplastic B cells, both in animal experiments and clinical phase II trials. Activin A antagonization is thus a new and promising approach in the treatment of multiple myeloma. Bone Morphogenetic Protein 2 is a promising prospect for the treatment of multiple myeloma due to its molecular and biological properties. It is an Activin-A-antagonist at the molecular level, but also has osteoinductive potential and apoptotic or anti-proliferative properties on neoplastic B cells as already described in literature. Since the apoptotic mechanisms, which members of the TGF-β family induced in MM-cells, have not yet been investigated in detail, the BMP2-induced apoptosis was analyzed in 10 different human MM cells. Firstly it was shown that 7 out of 10 cell lines were not responsive to BMP2. A more detailed analysis revealed that, besides the expression of specific BMP receptors, the expression of inhibitory Smad proteins determines BMP responsiveness. Secondly the more precise analysis of the apoptotic mechanisms revealed that, contrary to the results published in the literature, BMP2 has no apoptotic effect on the cell lines we have examined. Several different experiments, e.g. the use of specific inhibitors of programmed cell death, support this result and classify BMP2 as a purely anti-proliferative factor. The last part of this research deals with the analysis of potential Activin-A-antagonists in form of different BMP2 and GDF5 derivatives and how they are suitable for use in the therapy of multiple myeloma. The different properties of the individual mutants were tested in diverse cell systems. The results demonstrate that in addition to increased biological activity in form of increased osteoinductive and anti-proliferative potential on neoplastic B cells (superagonist), the various derivatives are suitable as super-antagonist to Activin A and cope with different requirements of adjuvant therapy in context of multiple myeloma. KW - BMP KW - Plasmozytom KW - BMP2 KW - Multiples Myelom Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155553 ER - TY - THES A1 - Faist, Hanna T1 - Bedeutung und Charakterisierung der bakteriellen Flora in Vitis vinifera mit und ohne Wurzelhalsgallen T1 - Significance and characterization of the bacterial community in Vitis vinifera with and without crown galls N2 - Am Rebstock werden in der Natur von Agrobacterium vitis, dem Auslöser Wurzelhalsgallenerkrankung, charakteristische Wurzelhalsgallentumore induziert. Virulente Vertreter der Gattung der Agrobacteria schleusen bakterielle DNA in das pflanzliche Genom ein, wodurch die Pflanze Tumore produziert. Die Wurzelhalsgallenerkrankung wird seit einem Jahrhundert als ein Beispiel der Pflanzen-Pathogen-Interaktion untersucht. Die Rolle der bakteriellen Flora im Zusammenhang mit der Wurzelhalsgallenerkrankung beim Rebstock wurde bisher kaum betrachtet. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich die endophytische mikrobielle Zusammensetzung von Rebstöcken mit und ohne Wurzelhalsgalle analysiert. Es werden Proben von drei Zeitpunkten einer Wachstumsperiode (Frühling, Sommer und Herbst) und von den Organen der Rebstöcke (Wurzeln, Pfropfstelle und einjährige Triebe) sowie dem Boden in einer Weinanlage bei Himmelstadt in Unterfranken genommen. Die Bakterienflora dieser Umweltproben wird mit kultivierungsabhängigen (Isolierung von Bakterien) und kultivierungsunabhängigen (Hochdurchsatzsequenzierungen) Methoden untersucht. Zudem werden i) die Virulenz der verschiedenen Agrobacterium-Isolate in Tumorassays bestimmt, ii) synthetische Bakteriengemeinschaften von in vitro kultivierten Weinpflänzchen mit Wurzelhalsgallen analysiert, iii) die Genome von einem virulenten und einem nicht-virulenten Agrobacteria-Isolat aus der Wurzelhalsgalle verglichen, iv) erste Interaktionsstudien auf festen Nährmedien durchgeführt und v) virulente Agrobacteria mittels bildgebender Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) in Wurzelhalsgallen lokalisiert. Die Rebstöcke dieser Studie haben eine organspezifische Bakterienflora, die innerhalb einer Wachstumsperiode variiert. Nur die Bakterienflora der Pfropfstelle (mit oder ohne Wurzelhalsgalle) aber nicht die des Bodens, der Wurzeln, und der einjährigen Triebe unterscheidet sich strukturell zwischen gesunden und erkrankten Rebstöcken. Mikroskopisch konnten virulente Agrobacteria punktuell in Interzellularen, sklerenchymatischen Geweben und assoziiert mit Leitgefäßen nachgewiesen werden. Dadurch ist ausreichend Lebensraum vorhanden, der zusätzlich von tumorspezifischen Bakterien besiedelt werden kann. Im Gegensatz zur gesunden Pfropfstelle ist in der Wurzelhalsgalle eine saisonal stabile Kernmikroflora, bestehend aus Vertreter von A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria und Burkholderiales, vorhanden. Diese Bakterien werden überwiegend aus dem Boden rekrutiert und profitieren von der Nährstoffsituation in der Wurzelhalsgalle. Wurzelhalsgallen enthalten Opine, die nur von der transformierten Pflanzenzelle produziert werden. Interessanterweise hat in dieser Arbeit ein Agrobacterium-Isolat Gene, die zum Opinkatabolismus beitragen und ein Pseudomonas-Isolat kann Opine als einzige Kohlenstoffquelle nutzen. Trotzdem sind beide Isolate weder virulent noch verdrängen sie die virulenten A. vitis, die ebenso Opine nutzen, aus der Wurzelhalsgalle. In synthetischen Bakteriengemeinschaften an in vitro kultivierten Weinpflänzchen konnte gezeigt werden, dass diese und weitere tumorspezifischen Bakterien, neben A. vitis, nicht essentiell zur Entstehung der Wurzelhalsgalle nötig sind aber unterschiedliche Funktionen in der Wurzelhalsgalle übernehmen. Ein Serratia-Isolat hemmt das Wachstum von A. vitis auf festen Nährmedium, andere fördern oder hemmen das Wachstum der Wurzelhalsgalle. Nach Studien in der Literatur erhöhen weitere Bakterien die Resistenz des Rebstocks gegenüber biotischem und abiotischem Stress. Zusammengefasst identifizierten und isolierte ich in dieser Studie unter 150 unterschiedlichen Bakterien in der Wurzelhalsgalle jene Bakterien, die neben A. vitis von der neuen ökologischen Nische profitieren und somit wahrscheinlich Opportunisten mit unterschiedlichen Funktionen sind. In Folge von multiplen Interaktionen in der Wurzelhalsgalle entsteht ein ökologisches Gleichgewicht zwischen den opportunistischen Bakterien, der Wurzelhalsgalle und dem Rebstock, das den Fortbestand des Rebstocks mit Wurzelhalsgalle ermöglicht. N2 - In nature, Agrobacterium vitis is known for the ability to introduce bacterial DNA into the grapevine genome, thereby causing crown gall disease. This plant disease has been studied for a century as a model for plant-pathogen interaction, while the role of the plant microbiota in disease development is not well understood. My study contributes to the understanding of the microbial ecology in crown galls of grapevine, combining culture-dependent with culture-independent high-throughput sequencing techniques. I analysed the structure of the endophytic microbiota by collecting different samples (soil, roots, graft unions and canes) of diseased and non-diseased grapevines from one vine-yard in Franconia, Bavaria, Germany during one growing season (spring, summer, autumn). The characterization of the grapevine-associated bacterial microbiota was completed by (i) detecting the virulence of diverse agrobacterial isolates using a tumour growth assay with in vitro cultivated grapevine plantlets, (ii) microbial analysis of synthetic communities of in vitro cultivated grapevine plantlets with crown galls, (iii) genome sequencing of a virulent and a non-virulent agrobacterial isolate, (iv) in vitro interaction studies on solid medium with bacterial isolates and (v) localisation of virulent A. vitis using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) in tumour tissues. Grapevine plants of this study have an organ-specific bacterial community that varies during one growing season. Healthy and diseased grapevine plants differed in the struc-ture of the bacterial community only in the graft union (with or without a crown gall), but not in the soil, root and one-year old cane. Microscopy revealed that virulent Agrobacteria mainly accumulate in defined spots of sclerenchymatous tissue, intercellular space and tissues associated with vessels. Therefore, there is unoccupied living space in a crown gall, which can be additionally colonized by tumour-specific bacteria. A season-independent stable core bacteria exists in grapevine crown galls in contrast to healthy graft unions, consisting of OTUs assigned to A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria and Burkholderiales. These bacteria are predominantly recruited from the soil and most likely profit from special nutrients in the crown gall. The crown gall contains opines, exclusively produced by transformed plant cells. Curiously individual isolates of Agrobacteria and Pseudo-monas of this study that are non-virulent do not outcompete virulent A. vitis in the crown gall but harbour, like A. vitis, genes involved in octopin-catabolism or use opines in liquid cultures as a sole nutrient source. Although synthetic bacterial communities revealed that the tumour-specific bacteria are not required for crown gall induction us-ing in vitro grown grapevine plantlets, they may have different functions in crown gall persistence. A Serratia-isolate inhibits the growth of A. vitis on solid medium, others reduce or support crown gall development, while some, according to literature, increase resistance of the grapevine plant against biotic and abiotic stresses. Taken together, among the 150 bacteria found in the crown galls, I identified and isolated bacteria in addition to A. vitis that profit from the new ecological niche suggesting an opportunistic lifestyle with different ecological functions. An ecological equilibrium in a bacterial community that balances crown gall growth will support the existence of grapevine plants with a crown gall in vineyards. KW - Wurzelhalsgalle KW - DNA Barcoding KW - Agrobacterium vitis KW - Weinrebe KW - Angewandte Mikrobiologie KW - bakterielle Flora KW - Holobiont KW - Mikrobiota Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154359 ER - TY - THES A1 - Hollmann, Claudia Beate T1 - Einfluss der sauren Sphingomyelinase auf anti-virale T-Zellantworten im Masernvirus-Infektionsmodell T1 - Role of the acid sphingomyelinase in anti-viral T cell responses in a measles virus infection model N2 - Die saure Sphingomyelinase (Asm), ein Enzym des Sphingolipidmetabolismus, spaltet Sphingomyelin zu Ceramid und Phosopocholin. Aktiviert wird die Asm unter anderem durch Stimulation des CD28 Rezeptors. CD28 Signale werden auch für die Aktivierung von konventionellen T-Zellen (Tconv) und für die Kostimulation benötigt und sind essentiell für die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen (Treg) im Thymus und deren Erhalt in der Peripherie. Wir konnten zeigen, dass sich Tconv und Treg Zellen hinsichtlich der Asm unterscheiden. Treg haben eine höhere "basale" Asm Aktivität, widergespiegelt im höheren Ceramidgehalt und haben eine niedrigere Lipidordnung als Tconv Zellen. Die Abwesenheit der Asm in defizienten Mäusen bewirkt einen relativen Anstieg der Treg-Frequenz innerhalb der CD4+ T-Zellen. Außerdem führt die Asm-Defizienz in Treg Zellen zu einer erhöhten Umsatzrate des immunsupprimierenden Moleküls CTLA-4 und zu einer verstärkten Suppressivität von Treg Zellen aus Asm-/- Mäusen gegenüber Wildtyp Zellen. Ein Anstieg in der Treg-Frequenz, äquivalent zur genetischen Defizienz, kann auch durch Inhibition der Asm, d. h. durch Wirkstoffe wie Amitriptylin und Desipramin erreicht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibitorbehandlung die absolute Anzahl der Tconv Zellen selektiv verringert, da Treg Zellen gegenüber dem Asm Inhibitor-induzierten Zelltod resistenter sind. Mechanistisch erklärbar sind die Unterschiede gegenüber den proapoptotischen Inhibitoreffekten zwischen Tconv und Treg Zellen dadurch, dass Treg Zellen durch die Anwesenheit von IL-2 geschützt sind. In Abwesenheit von IL-2 sterben die Treg Zellen ebenfalls. Die gezielte Veränderung des Verhältnisses von Treg zu Tconv durch den Einsatz von Asm-inhibitorischen Medikamenten kann hilfreich bei der therapeutischen Behandlung von inflammatorischen- und Autoimmunerkrankungen sein. Inwiefern die Asm für die Funktion von T-Zellen in der anti-viralen Immunantwort entscheidend ist, wurde im Masernvirus-Infektionsmodell näher untersucht. In Asm-/- Mäusen und Amitriptylin-behandelten Mäusen konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit der Asm die Kontrolle der Masernvirusinfektion verschlechtert ist. Treg sind auch hier von entscheidender Bedeutung, da die Asm-abhängige, verstärkte Masernvirusinfektion bei Fehlen der Asm nur in Gegenwart von Treg auftritt. In der akuten Phase gibt es in Asm-/- Mäusen weniger masernvirusspezifische T-Zellen und dadurch eine verringerte Beseitigung der Viruslast. In der chronischen Phase ist die Anzahl masernvirusspezifischer T-Zellen zwischen WT und Asm-/- Mäusen vergleichbar. In Letzteren ist allerdings die Anzahl und Frequenz von T-Zellen im Gehirn infizierter Mäuse noch deutlich erhöht, was die verstärkte Maserninfektion widerspiegelt. Zusammenfassend zeigt sich, dass die Asm die Funktion von Treg moduliert und einen Einfluss auf das Verhältnis von Tconv und Treg zueinander hat. Im Masernvirus-Infektionsmodell kann die Veränderung des Tconv zu Treg Verhältnisses in Abwesenheit der Asm ursächlich für die verringerte Viruskontrolle sein. Die Asm Inhibitor-induzierte Treg-Aktivierung und die Beeinflussung des Treg zu Tconv Verhältnisses können wiederum für therapeutische Zwecke genutzt werden, wie beispielsweise bei Multipler Sklerose und Rheumatoider Arthritis. N2 - The acid sphingomyelinase (Asm), an enzyme of the sphingolipid metabolism, hydrolyses sphingomyelin into ceramide and phosphocholine. Besides other stimuli the Asm is activated by ligation of the costimulatory molecule CD28. CD28 signaling is necessary to activate conventional T-cells (Tconv) and is crucial for the differentiation and maintenance of thymus-derived regulatory T-cells (Treg). We could demonstrate that Tconv and Treg cells differ with respect to Asm activity. Treg cells have an increased "basal" Asm activity resulting in an elevated level of ceramide and show a decreased lipid order compared to Tconv cells. The absence of Asm leads to a relative increase in Treg frequency among CD4+ T-cells in Asmdeficient mice. Furthermore, the Asm deficiency results in an increased turnover rate of the immunosuppressive molecule CTLA-4 and strengthens the suppressive capacity of Treg cells from Asm-/- mice compared to wild type Treg cells. An increase of the Treg cell frequency, equivalent to that seen with genetic deficiency, can be achieved by drugs like amitriptyline and desipramine too. The inhibitor treatment selectively decreases the absolute numbers of Tconv cells as Treg cells are more resistant towards Asm inhibitor induced cell death. The mechanistic explanation for the difference concerning the proapotptotic effects of Asm inhibitors between Treg and Tconv cells is that Treg cells are protected by IL-2. In the absence of IL-2 Treg cells die too. Therapeutically shifting the balance of Treg and Tconv cells by Asminhibiting drugs can be beneficial in inflammatory and autoimmune diseases. Whether the Asm is necessary for the function of T-cells during anti-viral immune responses was investigated in a measles virus infection model. In Asm-/- mice and amitriptyline treated mice control of the measles virus was impaired. Treg cells are of critical relevance as the Asm dependent boost in measles infection was only visible in the presence of Treg cells. During the acute phase of infection less measles virus specific T-cells were present leading to a decreased clearance of virus from the brains of Asm-/- mice. In the chronic phase the number of measles virus specific Tcell was comparable between wt and Asm-/- mice. But in the latter the number and frequency of T-cells in brains of infected mice was increased, which mirrors the enhanced measles virus infection. In conclusion, the Asm modulates the function of Treg cells and influences the Treg- Tconv ratio. The changed Treg-Tconv ratio in the absence of Asm expression might be responsible for the reduced virus control in the measles virus infection model. Additionally, the Asm inhibitor induced Treg cell activation and its effects on the Treg- Tconv ratio can be used for therapeutical approaches in diseases like multiple sclerosis or rheumatoid arthritis. KW - saure Sphingomyelinase KW - Treg KW - Masernvirus KW - Sphingomyelin KW - Ceramid KW - acid sphingomyelinase KW - regulatory t cells KW - measles virus KW - ceramide Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153807 ER - TY - THES A1 - Hilbert, Fabian Michael T1 - Neue Methoden und Modelle für die diffusionsgewichtete Magnetresonanztomographie der Niere T1 - New methods and models for diffusion-weighted magnetic resonance imaging of the kidney N2 - Diffusionsgewichtete MR-Bilder sind ein wichtiger Bestandteil für die klinische Diagnostik verschiedener Pathologien, wie z.B. bei Schlaganfall oder Tumoren. Meistens wird ein mono-exponentielles Diffusionsmodell verwendet und über verschiedene Raumrichtungen gemittelt. Der Einfluss von Fluss auf das diffusionsgewichtete Signal und eine mögliche Richtungsabhängigkeit werden dabei vernachlässigt. Dabei machen Diffusionsmodelle, die mehr Eigenschaften des Signals abbilden, unter Umständen eine genauere Diagnostik möglich. Mit DTI wird die Richtungsabhängigkeit der Diffusion erfasst und bei IVIM wird der Beitrag von Fluss zum Signal berücksichtigt. Die Niere ist ein stark strukturiertes Organ und weist Anisotropie in der Diffusion auf. Außerdem ist die Niere ein sehr gut durchblutetes Organ. DTI und IVIM beschreiben also unabhängig voneinander zwei wichtige Aspekte des diffusionsgewichteten Signals in der Niere, ohne dass der Vorteil des jeweils anderen Modells Beachtung findet. In dieser Arbeit wurde das Modell IVOF zur umfassenden Beschreibung von Diffusionssignal vorgestellt, bei dem sowohl die Richtungsabhängigkeit der Diffusion, als auch das Signal der fließenden Spins und deren Richtungsabhängigkeit abgebildet wird. Die Vorteile von DTI und IVIM werden also in IVOF vereint und darüber hinaus auch die mögliche Anisotropie die Flusssignals berücksichtigt. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Modell das diffusionsgewichtete Signal in der menschlichen Niere besser beschreibt als die herkömmlichen Modelle (DTI und IVIM) und auch besser als eine Kombination von DTI und IVIM, bei der ein isotroper Flussanteil des Signals angenommen wird. Es wurde weiterhin gezeigt, dass selbst wenn der Flussanteil im verwendeten Diffusionsmodell berücksichtigt wird, der tatsächlich gemessene Flussanteil in der Niere von der Art der Messung, d.h. Bewegungsempfindlichkeit des Gradientenschemas abhängt. Das bedeutet, dass der mikroskopische Fluss in der Niere nicht, wie häufig angenommen, komplett zeitlich inkohärent ist. Bei Vergleichen von IVIM Studien an der Niere ist es deshalb notwendig, die Bewegungsempfindlichkeit der jeweiligen Gradientenschemata zu berücksichtigen. Wie groß das absolute Verhältnis von kohärent zu inkohärent fließendem Signal ist, konnte nicht festgestellt werden. Ebenso wenig konnte die absolute Flussgeschwindigkeit bzw. die Art des Flusses (Laminare Strömung, Pfropfenströmung, oder andere) ermittelt werden. TSE hat sich als vielversprechendes, artefaktfreies Verfahren für die Aufnahme diffusionsgewichteter Bilder der Niere gezeigt. Im Vergleich mit dem Standardverfahren EPI wurden ähnliche Werte der Parameter von DTI und IVIM gefunden. Abweichungen zwischen EPI und TSE sind vor allem durch die Unschärfe der TSE Bilder aufgrund von T2-Zerfall zu erklären. Bis zur klinischen Anwendbarkeit diffusionsgewichteter TSE Bilder bzw. Parameterkarten sind noch einige Weiterentwicklungen der Methode nötig. Vor allem sind schärfere TSE Bilder erstrebenswert und es sollten mehrere Schichten in einer klinisch vertretbaren Zeitspanne aufgenommen werden, ohne dass dabei die zulässigen SAR Grenzwerte überschritten werden. Bei allen Untersuchungen in dieser Arbeit handelt es sich um Machbarkeitsstudien. Daher wurden alle Messungen nur an erwachsenen, gesunden Probanden durchgeführt, um zu zeigen, dass das jeweilige vorgeschlagene Modell zu den Daten passt bzw. dass die vorgeschlagene Methode prinzipiell funktioniert. Bei welchen Pathologien die hier vorgeschlagenen Methoden und Modelle einen diagnostischen Nutzen haben, muss in zukünftigen Studien erforscht werden. Außerdem wurden keine b- Werte zwischen 0 und 200 s/mm2 aufgenommen, bei denen fließende Spins noch signifikant zum Signal beitragen. Betrachtet man die Ergebnisse der Diffusionsbildgebung mit verschiedenen m1 in dieser Arbeit, dann ist neben dem b-Wert auch die Bewegungsempfindlichkeit m1 nötig, um das Signal in diesem Bereich korrekt zu beschreiben. Alles in allem sollte der Beitrag von Fluss zum diffusionsgewichteten MR-Signal in der Niere immer berücksichtigt werden. Die vielfältigen Einflüsse, die unterschiedliche Parameter auf das Signal von Mikrofluss haben, wurden in dieser Arbeit untersucht und präsentieren weiterhin ein spannendes Feld für kommende Studien. Diffusionsgewichtete TSE Sequenzen sind auch für die klinische Diagnostik eine potentielle Alternative zu Artefakt-anfälligen EPI Sequenzen. Bis dahin sollten jedoch die Bildschärfe und Abdeckung der diffusionsgewichteten TSE Sequenz weiter verbessert werden. N2 - Diffusion-weighted magnetic resonance (MR) imaging plays an important role in clinical diagnosis of various pathologies, such as stroke or tumors. Oftentimes a mono-exponential diffusion model is used and multiple diffusion directions are averaged. The potential influence of flow and a possible anisotropy of the signal are then neglected. Diffusion models that take these properties of the signal into account may allow a more accurate diagnosis. Diffusion tensor imaging (DTI) captures the directional dependence of diffusion, while the Intravoxel Incoherent Motion (IVIM) model accounts for the contribution of flow to the signal. Kidneys are strongly structured organs and exhibit anisotropic diffusion. Furthermore, kidneys are well perfused organs. DTI and IVIM both describe independently two important features of the diffusion-weighted signal in the kidneys, but neglect the advantages of the other model. The here presented work introduces a comprehensive diffusion model named Intravoxel Oriented Flow (IVOF). IVOF includes the possibilities of anisotropic diffusion and of flow. This way IVOF combines the advantages of DTI and IVIM and furthermore, accredits the possibility of anisotropic flow signal. It was shown that this model fits diffusion-weighted signal in the human kidney better than the standard diffusion models DTI and IVIM. IVOF even performs better than a combination of DTI and IVIM with an isotropic flow fraction. Moreover, it was shown that the actually measured flow fraction of the diffusionweighted signal in the kidneys depends on the imaging protocol, i.e. on the first gradient moment m1 of the diffusion gradient scheme. This means that the microscopic flow in the kidneys is not completely temporally incoherent, in contrast to what is often assumed. Therefore, a comparison of renal IVIM studies needs to pay attention to the used gradient schemes and their respective m1. The absolute ratio of coherent to incoherent flow signal could not be determined in this work and is subject to future work. The flow profile (whether laminar flow, plug flow or other) and the mean flow velocity should also be investigated in further studies. Turbo-Spin-Echo (TSE) proofed to be an artifact-free and promising tool for acquiring diffusion-weighted images of the kidney. Similar DTI and IVIM parameters were found when images where acquired with TSE compared to Echo-Planar Imaging (EPI). Differences between parameters acquired with EPI and TSE may be explained by blurring in the TSE images, which is caused by T2 -decay. Before diffusion-weighted TSE images and parameter maps can be used for clinical diagnosis, some further improvements of the method are necessary. Sharper TSE images are preferable and multiple slices need to be acquired within a clinically reasonable scan time without exceeding specific absorption rate limits. All studies described in this work are feasibility studies. For this reason, all measurements were performed on healthy, adult volunteers to show that the proposed diffusion model fits the data or that the proposed acquisition method works in principle. The diagnostic value of the here proposed methods and models should be investigated in future studies. No b-values between 0 and 200 s/mm2 were acquired. In this range, the signal of flowing spins contributes significantly to the total signal. With regard to the results in this work concerning diffusion-weighted imaging with multiple first gradient moments it is likely that the b-value is not sufficient to describe the signal in this regime. The first gradient moment of the diffusion-weighting gradients may be crucial to describe the signal correctly. All in all it is important to always consider the contribution of flow to the diffusionweighted MR signal in the kidneys. Manifold influences of acquisition parameters to the signal of micro flow were presented in this work and provide an interesting field for further research. Diffusion-weighted TSE sequences are a potential alternative to artifact-prone EPI sequences. However, for clinical application of diffusion-weighted TSE blurring needs to be reduced and 3-dimensional coverage should be increased. KW - Diffusionsgewichtete Magnetresonanztomografie KW - Niere KW - Diffusion Tensor Imaging KW - Intravoxel Incoherent Motion KW - Kidney KW - Turbo Spin Echo Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141149 ER - TY - THES A1 - Hergovits [geb. Walter], Sabine T1 - Relevanz der gp130 Endozytose bei der Maturierung und Differenzierung dendritischer Zellen sowie Charakterisierung des molekularen Mechanismus der OSM-vermittelten Induktion antiviraler Gene T1 - Relevance of the IL-6 receptor gp130 endocytosis during dendritic cell maturation and activation as well as characterization of the molecular mechanism of OSM-mediated antiviral gene induction N2 - Interleukin-6 (IL-6)-Typ Zytokine, allen voran IL-6 und Oncostatin M (OSM), besitzen pleiotrope Eigenschaften und spielen eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl biologischer Prozesse. Als Akutphaseinduktoren sind IL-6 und OSM an der Initialisierung entzündlicher und immunologischer Prozesse beteiligt, können aber ebenso die Differenzierung und das Zellwachstum beeinflussen. Ihre biologische Wirkung vermitteln sie über die Bindung an einen multimeren Rezeptorkomplex. Dieser weist im Fall von IL-6 eine hexamere Struktur auf und besteht aus je zwei Molekülen des Glykoproteins 130 (gp130), des IL-6 α Rezeptors (IL-6R) und IL-6. Der Rezeptor von OSM hingegen ist ein Heterodimer und besteht aus gp130 und dem OSM Rezeptor (OSMR) oder aber aus gp130 und dem leukemia inhibitory factor (LIF) Rezeptor (LIFR). Die Zytokine der IL-6-Familie vermitteln die Induktion des Jak/STAT (Januskinase/signal transducer and activator of transcription), PI3K/Akt (Phosphoinositid-3-Kinasen/AKR thymoma oncogene homolog) und MAPK (mitogenaktivierte Proteinkinase) Signalwegs. Da eine unkontrollierte Aktivierung dieser Signalkaskaden jedoch zu chronisch entzündlichen Erkrankungen oder abnormen Zellwachstum führen kann, ist eine Regulation durch verschiedene Rückkopplungsmechanismen essentiell. Neben der Rekrutierung inhibitorisch wirkender Proteine, wie den Mitgliedern der SOCS (suppressors of cytokine signaling) Familie und Tyrosinphosphatasen, gilt die Rezeptorinternalisierung als regulierender Mechanismus. Der erste Teil der vorliegenden Dissertation geht der Fragestellung nach, wie die Expression des IL-6-Rezeptors während der Differenzierung und Maturierung dendritischer Zellen (DZ) reguliert ist und welche Relevanz die gp130-Internalisierung bei diesen Entwicklungsprozessen spielt. DZ gehören zu den professionellen antigenpräsentieren Zellen (APZ) und gelten als Bindeglied zwischen der angeborenen und adaptiven Immunantwort. Sie spielen insbesondere bei der Polarisation der T-Helferzellen (Th1, Th2, Th17, Treg) eine wichtige Rolle. DZ repräsentieren eine heterogene Zellpopulation, die auf Basis ihrer Entstehung, ihres Vorkommens und/oder ihrer Funktionen in verschiedene Subtypen unterteilt werden und sich u.a. durch die Expression bestimmter Oberflächenmarker unterscheiden lassen. Es ist bekannt, dass DZ sowohl gp130 als auch den IL-6R auf ihrer Oberfläche exprimieren, weshalb ihre Differenzierung und Maturierung durch IL-6 beeinflusst werden kann. Obwohl Studien der letzten Jahre bereits eindrucksvoll die Relevanz des IL-6-Signals für die DZ Entwicklung belegt haben, bleibt dessen Funktion für diese Prozesse bisher kontrovers diskutiert. Inwiefern eine veränderte Rezeptorexpression auf diesen Zellen Einfluss auf die biologische Wirkung von IL-6 nimmt, wurde bisher nicht untersucht und war daher Ziel der hier durchgeführten Experimente. Mit Hilfe GM-CSF-gereifter DZ aus murinem Knochenmark (KM-DZ) sowie steady state DZ aus peripheren lymphatischen Organen konnte gezeigt werden, dass die Expression von gp130 und IL-6R bereits während der DZ Differenzierung unterschiedlich reguliert ist. Konventionelle DZ (kDZ) aus Milz und Lymphknoten wiesen ein höheres Expressionsniveau für den IL-6-Rezeptor auf als plasmazytoide DZ (pDZ). Es wurde nachgewiesen, dass die gp130 Expression im Verlauf der DZ Differenzierung stetig zunimmt, während nahezu keine Veränderung für die Expression des IL-6R festzustellen war. In weiteren Experimenten konnte darüber hinaus belegt werden, dass die Reifung der DZ, induziert durch Lipopolysaccharid (LPS), Tumornekrosefaktor-α (TNFα) oder Choleratoxin (Ctx), zu einer Cross-Regulation von gp130 führt. Diese konnte im Fall von TNFα und Ctx auf eine vorübergehende Internalisierung des Rezeptors in Folge der Aktivierung der Serin-/Threonin-Kinase MK2 (MAPK-aktivierte Proteinkinase 2) zurückgeführt werden. Untersuchungen von KM-DZ aus der gp130 knockin Mauslinie gp130LLAA, die sich durch eine Punktmutation des beschriebenen Endozytose-Motivs des Rezeptors auszeichnet, führten zu dem Schluss, dass LPS gp130 über einen bisher noch nicht beschriebenen Mechanismus reguliert. Dieser vermittelt eine frühe Clathrin-abhängige Internalisierung von gp130 und führt schließlich zu einer langfristigen Inhibierung der gp130 Expression. Die Regulation der IL-6 Rezeptorexpression ist insofern von Bedeutung als dass vermutet werden kann, dass das IL-6/STAT3-Signal für die Aufrechterhaltung eines unreifen DZ Phänotyps wichtig ist. Ferner kann vermutet werden, dass die Limitierung der Responsivität gegenüber LIF (und vermutlich auch OSM) für die Differenzierung von DZ wichtig ist, da die Expression des LIFR über die Dauer der KM-DZ Differenzierung stark herunterreguliert wurde. Eine Expression des OSMR auf DZ wurde hingegen nicht nachgewiesen und steht demzufolge im Gegensatz zu bisher veröffentlichten Untersuchungen. Im Rahmen dieses ersten Projekts wurde ebenfalls untersucht, wie sich die veränderte gp130 Endozytose auf die Homöostase myeloider und lymphoider Zellen auswirkt. Bei den hierfür analysierten gp130LLAA Mäusen wurde eine geringfügige Verminderung der Frequenz und absoluten Zellzahl von kDZ in der Milz sowie eine Zunahme der Frequenz und absoluten Zellzahl von pDZ und Makrophagen in den inguinalen Lymphknoten nachgewiesen. Darüber hinaus wurde ein Anstieg in der Frequenz und absoluten Zellzahl von T-Zellen, jedoch eine Abnahme der B-Zellen in der Milz beobachtet. Im zweiten Teil der Dissertation sollte die OSM-vermittelte Induktion antiviraler Gene in primären humanen dermalen Fibroblasten (HDF) untersucht werden. Typ I Interferone (IFN) gelten als zentrale Zytokine der antiviralen Immunantwort. Studien der letzten Jahre haben gezeigt, dass eine Reihe proinflammatorischer Zytokine ebenso die antivirale Immunantwort beeinflussen können, indem sie u.a. die Expression der pattern recognition receptors (PRR) regulieren. PRR sind Teil des angeborenen Immunsystems und für die Erkennung von Pathogenen durch die Bindung an konservierte Pathogen-assoziierte molekulare Strukturen (PAMPs, Pathogen-associated molecular patterns) wichtig. Im zweiten Teilprojekt der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass OSM dazu in der Lage ist, die Induktion der im Zytoplasma lokalisierten PRR Retinoic acid inducible gene-I (RIG-I) und Melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA5) zu vermitteln. Mit Hilfe von RNA Interferenzstudien konnte nachgewiesen werden, dass die Expression dieser beiden RNA-Helikasen von der OSM-vermittelten STAT1 Aktivierung abhängig ist und über einen STAT3/SOCS3-abhängigen Mechanismus reguliert wird. Während die Blockade der STAT1 Expression zu einer Inhibierung der OSM-induzierten Expression der Helikasen führte, wurde durch den Verlust von STAT3 oder SOCS3 die Expression von RIG-I und MDA5, aufgrund einer stärkeren und länger anhaltenden STAT1-Phosphorylierung, signifikant erhöht. Zusätzlich konnte ein additiver Effekt zwischen der OSM- und IFNγ-vermittelten Helikasenexpression belegt werden. Dieses Resultat steht im Einklang mit vorhergehenden Veröffentlichungen, die einen Crosstalk zwischen OSM und Typ I IFN bei der antiviralen Abwehr gegen das Hepatitis C Virus beschreiben. N2 - Interleukin-6 (IL-6)-type cytokines, most notably IL-6 and Oncostatin M (OSM), have pleiotropic functions and play a major role in multiple biological processes. As inducers of the acute phase response, IL-6 and OSM are involved in the initiation of proinflammatory and immunological processes as well as in cell growth and differentiation. They mediate their biological function through binding to a multimeric receptor complex. The IL-6 receptor complex has a hexameric structure consisting of two molecules each of gp130, IL-6R and IL-6. In contrast, the OSM receptor complex has a heterodimeric structure consisting either of gp130 and the OSM receptor (OSMR) or gp130 and the leukemia inhibitory factor receptor (LIFR). IL-6-type cytokines induce the activation of the Jak/STAT (Janus kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription), PI3K/Akt (Phosphoinositid-3-kinase/AKR thymoma oncogene homolog) and MAPK (mitogen-activated kinase) pathway. Since uncontrolled activation of these pathways causes chronic inflammatory diseases or abnormal cell growth, regulation by distinct feedback mechanisms is very important. Besides recruitment of inhibitory proteins like members of the SOCS (suppressors of cytokine signaling) family and protein tyrosine phosphatases, receptor internalization is a common regulatory mechanism. One aim of the first part of this thesis was to investigate the regulation of the IL-6 receptor expression during dendritic cell (DC) differentiation/maturation and furthermore, to determine the relevance of gp130 internalization for these developmental processes. DCs are professional antigen presenting cells (APC) and known to act as a link between innate and adaptive immune response. Especially during the initiation of T cell polarization (Th1, Th2, Th17, Treg) they play an important role. DCs are a heterogeneous cell population, which can be classified by their origin and/or function and are distinguished (among other things) by their cell surface markers. DCs express both gp130 and IL-6R, therefore it has been assumed that DC differentiation and maturation is influenced by IL-6. Although several publications suggest that IL 6 signaling is of importance for DC development, its precise function for this process still remains unclear. How differential receptor expression may influence the biological function of IL-6 has not been studied so far and was the goal of the present study. By using GM-CSF-driven DCs from murine bone marrow (BMDC) as well as steady state DCs from peripheral organs, it was demonstrated that the expression of gp130 and IL-6R is differentially regulated during DC differentiation. Conventional DCs (cDCs) from spleen and lymph nodes showed a higher IL-6 receptor expression level than plasmacytoid DCs (pDCs) from these organs. While gp130 expression slowly increased over time in culture, no changes in IL-6R expression were observed in GM-CSF-driven BMDC differentiation. Furthermore, BMDC maturation induced by lipopolysaccharide (LPS), tumor necrosis factor-α (TNFα) or cholera toxin (Ctx) caused a cross-regulation of gp130 cell surface expression. In case of TNFα and Ctx this cross-regulation could be traced back to a transient receptor internalization induced by the serine/threonine-kinase MK2 (MAPK-activated protein kinase 2). Studies with the gp130 knockin mouse strain gp130LLAA, which is characterized by a point mutation of the internalization motif, revealed that the LPS-regulated gp130 expression depends on a so far unidentified mechanism. This mechanism induces an early clathrin-dependent gp130 internalization and furthermore leads to a long-term expression inhibition. This regulation of the IL-6 receptor expression is of importance, because it is assumed that the IL 6/STAT3-signal plays an important role to keep DCs in an immature state in absence of infection. Further data presented in this thesis indicate that limitation of the LIF response (and also OSM response) is necessary for DC differentiation, since expression of the LIFR was strongly downregulated in the course of GM-CSF-driven BMDC differentiation. In contrast to former studies, OSMR expression could not be confirmed. An additional aim of the first part of the thesis was to investigate how missing gp130 endocytosis influences the homeostasis of myeloid and lymphoid cells in mice. For this purpose, gp130LLAA mice were investigated and showed a slight decrease in frequency and absolute cell numbers of cDCs from spleen as well as an increase in frequency and absolute cells numbers of pDCs and macrophages from inguinal lymph nodes. Additionally, an increase in frequency and absolute cell number of T cells, but a decrease of B cells could be detected in spleen. The aim of the second part of this thesis was to investigate the OSM-mediated induction of antiviral gene expression in primary human dermal fibroblasts (HDF). Type I interferons (IFN) are key players in the antiviral response. Many studies over the last years revealed that several proinflammatory cytokines were able to influence the antiviral response by induction of the pattern recognition receptor (PRR) expression. PRRs belong to the innate immunity and play a pivotal role in detection of pathogens through binding to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). In the second part it was shown that OSM induces the expression of the PRR retinoic acid inducible gene-I (RIG-I) and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA5). By using RNA interference studies it was demonstrated that the expression of the RNA-helicases depends on the OSM-induced STAT1 activation and is mainly regulated by a STAT3/SOCS3-dependent mechanism. While knockdown of STAT1 inhibited OSM-induced helicase expression, loss of STAT3 or SOCS3 significantly enhanced the RIG-I and MDA5 expression through an increased and prolonged STAT1 phosphorylation. Moreover, it was shown that OSM and IFNγ had an additive effect on helicase expression. This result correlates well with former studies showing a crosstalk of OSM and IFNγ signaling in the antiviral response against Hepatitis C Virus. KW - gp130 KW - Endozytose KW - dendritische Zelle KW - OSM KW - antivirale Gene Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150562 ER - TY - THES A1 - Langlhofer, Georg T1 - Über die Bedeutung intrazellulärer Subdomänen des Glycinrezeptors für die Kanalfunktion T1 - Investigations into the relevance of glycine receptor intracellular subdomains to receptor channel function N2 - Der zur Familie der pentameren ligandengesteuerten Ionenkanäle zugehörige Glycinrezeptor (GlyR) ist ein wichtiger Vermittler synaptischer Inhibition im Zentralnervensystem von Säugetieren. GlyR-Mutationen führen zur neurologischen Bewegungsstörung Hyperekplexie. Aufgrund fehlender struktureller Daten ist die intrazelluläre Loop-Struktur zwischen den Transmembransegmenten 3 und 4 (TM3-4 Loop) eine weitgehend unerforschte Domäne des GlyR. Innerhalb dieser Domäne wurden Rezeptortrunkierungen sowie Punktmutationen identifiziert. Rezeptortrunkierung geht mit Funktionslosigkeit einher, welche jedoch durch Koexpression des fehlenden Sequenzabschnitts zum Teil wiederhergestellt werden kann. Innerhalb dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen trunkierten, funktionslosen GlyR und sukzessiv verkürzten Komplementationskonstrukten untersucht. Dabei wurden als Minimaldomänen für die Interaktion das C-terminalen basische Motive des TM3-4 Loops, die TM4 sowie der extrazelluläre C-Terminus identifiziert. Die Rückkreuzung transgener Mäuse, die das Komplementationskonstrukt iD-TM4 unter Kontrolle des GlyR-Promotors exprimierten, mit der oscillator-Maus spdot, die einen trunkierten GlyR exprimiert und 3 Wochen nach der Geburt verstirbt, hatte aufgrund fehlender Proteinexpression keinen Effekt auf die Letalität der Mutation. Des Weiteren wurde die Bedeutsamkeit der Integrität beider basischer Motive 316RFRRKRR322 und 385KKIDKISR392 im TM3-4 Loop in Kombination mit der Loop-Länge für die Funktionalität und das Desensitisierungsverhalten des humanen GlyRα1 anhand von chimären Rezeptoren identifiziert. Eine bisher unbekannte Patientenmutation P366L innerhalb des TM3-4 Loops wurde mit molekularbiologischen, biochemischen und elektrophysiologischen Methoden charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die mutierten Rezeptorkomplexe in vitro deutlich reduzierte Glycin-induzierte Maximalströme sowie eine beschleunigte Schließkinetik aufweisen. P366L hat im Gegensatz zu bereits charakterisierten Hyperekplexiemutationen innerhalb des TM3-4 Loops keinen Einfluss auf die Biogenese des Rezeptors. P366 ist Teil einer möglichen Poly-Prolin-Helix, die eine Erkennungssequenz für SH3-Domänen darstellt. Ein potenzieller Interaktionspartner des TM3-4 Loops des GlyRα1 ist Collybistin, welches eine wichtige Rolle bei der synaptischen Rezeptorintegration spielt und die Verbindung zum Zytoskelett vermittelt. An der inhibitorischen Synapse verursacht P366L durch die Reduzierung postsynaptischer Chloridströme, das beschleunigte Desensitisierungsverhalten des GlyRα1 sowie ein verändertes Interaktionsmotiv Störungen der glycinergen Transmission, die zur Ausprägung phänotypischer Symptome der Hyperekplexie führen. N2 - The glycine receptor (GlyR) belongs to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels and mediates synaptic inhibition in the central nervous system of mammals. GlyR mutations lead to the neuromotor disorder hyperekplexia. Due to the lack of structural data, the intracellular loop between transmembrane segments 3 and 4 (TM3-4 Loop) is considered as the most unexplored domain of the GlyR. Within this domain receptor truncations as well as point mutations have been identified. Receptor truncation correlates with non-functionality that can be partially restored by coexpression of the missing sequence. In this work, the interaction between a truncated non-functional GlyR and successively truncated complementation constructs was investigated. The C-terminal basic motif of the TM3-4 loop, the TM4 and the C-Terminus were identified as the minimal domain required for interaction. Backcrossing of a transgenic mouse line expressing the complementation construct iD-TM4 under the control of the GlyR promotor, with the oscillator mouse spdot expressing a truncated GlyR leading to death 3 weeks after birth, was unsuccessful and did not influence the lethality of the mutation, most probably due to the lack of transgene protein expression. In addition the importance of the integrity of both basic motifs 316RFRRKRR322 and 385KKIDKISR392 within the TM3-4 loop in combination with loop length were shown to be essential for functionality and desensitization behavior of the human GlyRα1 using chimeric receptors. An unknown TM3-4 loop mutation P366L was characterized using biomolecular, biochemical and electrophysiological approaches. It was demonstrated that mutated receptor complexes display remarkably reduced glycine-induced maximal currents in addition to accelerated channel closing kinetics in vitro. In contrast to previously analyzed hyperekplexia mutations within the TM3-4 loop, P366L exhibits no influence on receptor biogenesis. P366 is located in a sequence probably forming a poly-proline helix, which serves as a recognition sequence for SH3 domains. One prospective interaction partner is collybistin, which plays a major role in the process of synaptic receptor integration and connects the receptor complex to the cytoskeleton. At the site of the inhibitory synapse, P366L causes reduced chloride currents, accelerated desensitization behavior of the GlyRα1 and an altered interaction motif leading to disturbed glycinergic neurotransmission that result in formation of phenotypic symptoms of hyperekplexia. KW - Glycinrezeptor KW - intrazelluläre Domäne KW - Hyperekplexie KW - intracellular domain KW - hyperekplexia KW - Bewegungsstörung KW - Synapse KW - Ionenkanal Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140249 ER - TY - THES A1 - Kanis, Julia Birgit T1 - Elterliches Wissen, Selbsthilfe und psychotherapeutische Intervention bei nicht-organischen Schlafstörungen im Kleinkindalter T1 - Non-organic sleep disorders in infancy: An in-depth analysis of parental knowledge, self-help and psychotherapeutic intervention N2 - Für eine gesunde kindliche Entwicklung ist besonders in der frühen Kindheit guter Schlaf sehr wichtig. Gerade im Baby- und Kleinkindalter sind Schlafschwierigkeiten jedoch ein häufiges Phänomen. Vor allem Ein- und Durchschlafstörungen kommen vielfach vor, die nicht automatisch mit zunehmendem Alter eines Kindes remittieren. Sie können persistieren und zum Teil auch schwerwiegende Folgen für die kindliche Entwicklung haben. Nicht nur Hyperaktivität, Reizbarkeit und Aggressivität treten bei Kindern mit Schlafstörungen gehäuft auf, sondern auch Tagesmüdigkeit, Konzentrationsund Gedächtnisstörungen sowie kognitive Beeinträchtigungen können die Folge sein. Darüber hinaus können Depressionen, Angststörungen und Übergewicht langfristige Folgen von Schlafstörungen sein. Auch wirken sich die Schlafstörungen bei jungen Kindern negativ auf die Eltern aus. Daher ist es wichtig, Schlafprobleme im frühen Kindesalter zu erkennen, ernst zu nehmen und frühzeitig zu behandeln. Die vorliegende Arbeit besteht aus drei Teilen. Es wurden das elterliche Wissen über Schlaf im Kleinkindalter sowie eine Auswahl von Elternratgeberliteratur für kindliche Schlafprobleme untersucht. Ferner wurde das multimodale Elterntrainingsprogramm „Mini-KiSS“, ein Elterntraining für Kinder bis vier Jahren mit Schlafstörungen (Schlarb_2014), hinsichtlich seiner externen Validität betrachtet. Da Eltern diejenigen sind, die als erste mit den Schlafproblemen ihres Kindes konfrontiert sind, sollten sie kindliche Schlafstörungen als diese erkennen und auch einschätzen können, um ggf. weiterführende Maßnahme einzuleiten. Deshalb ist es wichtig, dass Eltern über den kindlichen Schlaf informiert sind. Um dieses elterliche Wissen über Schlaf von jungen Kindern zu erfassen, wurde ein Fragebogen entwickelt, in dem Anwendungs- und Faktenwissen über Schlaf im Baby- und Kleinkindalter erfragt wurden. Dieser wurde einer Online-Stichprobe (N = 1291) vorgelegt. Insgesamt verfügten die Eltern über ein gutes Wissen, sie beantworteten 65% der Fragen korrekt. Es zeigte sich jedoch ein Unterschied zwischen dem Anwendungswissen, wo die Eltern 72% korrekt beantworteten und dem Faktenwissen, wo die Eltern 61% der gestellten Fragen korrekt beantworteten. Allerdings wurden auch Unsicherheiten sowie Wissensdefizite deutlich, die noch genauer erfasst werden und denen künftig mit unverbindlichen Informations- und Beratungsangeboten begegnet werden sollte. Insbesondere bei den Interventionsmöglichkeiten zum Umgang mit einer Schlafproblematik im Kleinkindalter wurde ein Dissens deutlich, der sich auch in der nachfolgenden Analyse von Elternratgeberliteratur für Schlafschwierigkeiten widerspiegelte. Es wurden Literaturanalysen über Ratgeber für das Kindesalter einerseits und für das Baby- und Kleinkindalter andererseits durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Autoren entweder eine Position zum lerntheoretischen Ansatz der graduierten Extinktion bezogen und diese Methode empfohlen oder das Co-Sleeping, also das gemeinsame Schlafen von Eltern und Kind in einem Bett, favorisierten. Zudem wurde in der vorliegenden Arbeit das multimodale Elterntraining Mini-KiSS bezüglich der externen Validität im Langzeitverlauf erfolgreich überprüft. Das Elterntraining richtet sich an Eltern von Kindern im Alter von sechs Monaten bis vier Jahren mit Schlafstörungen und findet in Form von sechs aufeinanderfolgenden Elternabenden statt. Durch das Training kam es zu signifikanten Verbesserungen des kindlichen und mütterlichen Schlafes, diese bis zur Ein-Jahres-Katamnese stabil. Auch weitere mit problematischem kindlichem Schlafverhalten assoziierte Parameter, wie das allgemeine kindliche Problemverhalten sowie die elterliche Gesamtbelastung, konnten nachhaltig reduziert werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die Intervention sowohl auf das Kind als auch auf die Eltern positiv auswirkte, was auch anhand von objektiven Verfahren bestätigt werden konnte. Zusammengefasst leistet diese Arbeit somit mit der Befragung einer großen Online-Stichprobe zu frühkindlichem Schlaf, der literaturanalytischen Betrachtung ausgewählter Ratgeberliteratur sowie der erfolgreichen Prüfung der externen Validität des Mini-KiSS-Trainings einen wichtigen und richtungsweisenden Beitrag zur aktuellen Forschung im Bereich der nichtorganischen Schlafstörungen im Kleinkindalter. N2 - A good night’s sleep is highly important for the healthy development of children. Especially during infancy, many children suffer from sleep difficulties. Commonly, these children have problems falling asleep or sleeping through the night that do not automatically remit with age. They can persist and have severe consequences for the child. Hyperactivity, irritability and aggression do more often occur in children with sleep disorders as well as concentration deficits and memory disorders compared to children without sleep disorders. Long-term outcomes as depression, anxiety disorders and obesity are also possible outcomes of childhood sleep disorders. Besides, sleep disorders in young children do also have negative consequences for parents and parental health. Due to this, it is of high importance to be aware of sleep problems in childhood, to give attention to them and to have them treated properly. This work consists of three parts. First, parental sleep-related knowledge as well as second guidebooks on sleep in childhood were analyzed. Third, the multimodal parent education program “Mini-KiSS” (Schlarb_2014) was tested for long-term effects on both children and parents. As parents are the first to be directly affected by their child‘s sleep difficulties, it is of high importance for them to react properly in order to possibly take action. Little is known about the knowledge of German parents about sleep in children, and about how they react when faced with sleep problems of their children. Therefore, a preliminary, primarily descriptive demographic survey on applied and theoretical sleep-related knowledge was carried out (N = 1291). Taken together, the results showed a good parental knowledge on sleep. However, knowledge deficits as well as insecurities concerning certain topics could also be shown. In the future consulting services for information only and without responsibility for parents should be established. Especially concerning the debate on handling sleep problems in infancy a debate became clear which also applied to the following analysis of guidebooks on sleep disorders in early childhood. Guidebooks for both sleep problems in infancy and school-aged children were analyzed concerning different criteria. Results showed that authors stood in either for the extinction approach or for co-sleeping. In addition, the multimodal parent education program Mini-KiSS was tested successfully for external validity. The program is addressed to parents of infants aged six months to four years and consists of six sessions for parents. Results showed positive effects on both children and parents which could also be shown by means of objective data. Improvements of both maternal and infantile sleep remained stable up to one year after training. Moreover, further with problematic sleep associated parameters of both children and parents were significantly reduced up to the one-year follow up. Taken together, the presented work contributes both vitally and indicatory to current research in the field of non-organic sleep disorders in infancy with an encompassing demographic survey on sleep in infancy, the analysis of selectively picked guide books and furthermore, the efficient verification of the multimodal parent training Mini-KiSS. KW - Schlafstörung KW - Kinderschlaf KW - psychotherapeutische Intervention KW - Sleep in children KW - psychotherapeutic intervention KW - Kleinkind Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133432 ER - TY - THES A1 - Schürlein, Sebastian T1 - Entwicklung von Technologien zur Optimierung von Tissue Engineering Prozessen am Beispiel der Herstellung von kardialem Gewebe T1 - Development of technologies to optimize tissue engineering processes, documented on the example of the generation of cardiac tissue N2 - Kardiovaskuläre Erkrankungen, wie beispielsweise der Herzinfarkt, sind die häufigste Todesursache weltweit. Bei einem Herzinfarkt sterben Areale des Herzens aufgrund einer Unterversorgung mit Blut ab. Da das Herzmuskelgewebe ein sogenanntes terminal differenziertes Gewebe ist, kommt es zu keiner Regeneration des Gewebes, mit der Folge einer Herzinsuffizienz beziehungsweise dem Tod des Patienten. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit zu einer Herztransplantation stellt das Tissue Engineering dar. Mit Hilfe des Tissue Engineerings können dreidimensionale Gewebe aufgebaut und kultiviert werden, um auf diese Weise ein funktionelles Gewebe zu erhalten, durch welches das abgestorbene Gewebeareal des Herzens zukünftig auch ersetzt werden könnte. In der vorliegenden Arbeit wurden notwendige Technologien für den Aufbau von Geweben entwickelt sowie erste Versuche für die Erzeugung eines funktionellen Herzmuskelgewebes durchgeführt. Beim Aufbau von dreidimensionalen Geweben finden Trägerstrukturen Anwendung, die mit Zellen besiedelt werden. Solche Trägerstrukturen können aus biologischen oder synthetischen Polymeren hergestellt sein oder aus der extrazellulären Matrix eines dezellularisierten Gewebes bestehen. Für eine standardisierte Dezellularisierung von Geweben wurde eine computergesteuerte Pumpeneinheit, für die Herstellung von Nanofaserscaffolds eine Elektrospinninganlage entwickelt. Mit Hilfe der Dezellularisierungseinheit können komplexe Organe, wie ein Herz im Ganzen, reproduzierbar dezellularisiert werden. Untersuchungen der mittels Elektrospinning hergestellten Nanofaserscaffolds, welche als Alternative zu der dezellularisierten, natürlichen Matrix eingesetzt werden können, zeigten bei allen hergestellten Zusammensetzungen eine Orientierung der Zellen entlang der Fasern. Die Kultivierung von Zellmatrixkonstrukten erfolgt im Tissue Engineering häufig unter dynamischen Bedingungen. Hierfür wurde ein mobiler Stand Alone Inkubator mit der erforderlichen Peripherie für eine Kultur unter Perfusion des Gewebes entwickelt. Als Weiterentwicklung des Stand Alone Inkubators ist eine modulare Bioreaktorplattform, bestehend aus Wärmetauscher, Beutelpumpe und Gasaustauscher, aufgebaut worden. In dieses System kann über Standard Anschlüsse jegliche Art von Bioreaktor in das System eingebunden werden. Durch die Kompaktheit des Systems ist es möglich mehrere Ansätze parallel auf engem Raum durchzuführen. Die Funktion der Plattform, wurde in der vorliegenden Arbeit durch die Gewebekultur einer nativen porzinen Karotis nachgewiesen. Für den Aufbau des kardialen Gewebes dient die small intestinal submucosa ohne Serosa (SISser) als Trägerstruktur. Der Aufbau des Gewebekonstrukts erfolgte in verschiedenen Ansätzen unter Einsatz verschiedener Zellarten. Native, aus Herzbiopsien generierte Cardiosphere derived cells (CDCs) verteilten sich gleichmäßige über die Oberfläche der Matrix, jedoch konnten immunhistologisch keine spezifischen kardialen Marker bei den artifiziellen Geweben nachgewiesen werden. Zellmatrixkonstrukte aus einer Mono Kultur von Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) sowie einer Co Kultur dieser Kardiomyozyten mit mesenchymalen Stammzellen und Zellen aus einer Herzbiopsie zeigten nach wenigen Tagen in Kultur ein kontraktiles Verhalten. Immunhistologische Färbungen der beiden Gewebe bestätigten die Expression der spezifischen kardialen Marker, wie beispielsweise kardiales Troponin T, kardiales Troponin C und alpha Actinin. Die Kardiomyozyten der Mono Kultur sind jedoch nicht über die gesamte Matrixoberfläche verteilt, sondern bilden Aggregate. Bei der Co Kultur kann eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Matrix beobachtet werden. Der vielversprechendste Ansatz für den Aufbau eines Herzmuskelgewebes, welches als Implantat oder Testsystem eingesetzt werden kann, bildet nach den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, ein Konstrukt aus der SISser und der Co Kultur der Zellen. Allerdings muss die Zusammensetzung der Co Kultur sowie das Verhältnis der Zellzahlen optimiert werden. N2 - Cardiovascular diseases as myocardial infarction are the most frequent cause of death worldwide. During a myocardial infarction, areas of the heart are being damaged because of an insufficient nutrient supply. Heart tissue is a terminal differentiated tissue, this means that it can’t be regenerated by itself. The consequence of this characteristic is a heart insufficiency or the death of the patient. An alternative treatment to heart transplantation is promised by tissue engineering. By using the methods of tissue engineering, cells can be cultured on a scaffold to generate a mature tissue, which can be used to replace the damaged areas of the heart. In the present work systems for the generation of tissues have been developed and first experiments to build up a functional cardiac patch were performed. To generate three-dimensional tissues, scaffolds colonized with cells are necessary. These scaffolds can be produced with biological or synthetic polymers or even decellularized tissues can be used. A computer controlled decellularization platform was designed to ensure a standardized, reproducible decellularization of complex organs like hearts. Furthermore, an electrospinning device was developed for the production of nanofiber scaffolds. On such matrices, seeded cells grow along the fibers. Most cell-matrix-constructs are cultured under dynamic conditions in tissue engineering. A stand alone incubator system containing the required periphery to apply different culture conditions was developed. As further development a compact modular bioreactor platform consisting of a heat exchanger, a bag pump and a gas exchanger was established. All kinds of bioreactors can be enclosed to the system via standard Luer Lock Connectors. Due to the compactness of the system, it is possible to parallelize and run experiments easily on narrow space. The functionality of the platform was demonstrated by a tissue culture of a native porcine carotid artery. The small intestinal submucosa without serosa (SISser) was employed as matrix for the development of a functional cardiac patch. In different experiments diverse cell types were used to generate a cardiac construct. Cardiosphere derived cells (CDC) seeded on the SISser showed an equal distribution all over the surface of the matrix, but no expression of specific cardiac markers. Constructs consisting of a mono culture of induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes (CM iPS cells) or a co culture of CM iPS cells, mesenchymal stem cells and cells isolated form a heart biopsy showed a contraction of the whole matrix after a few days in culture. Furthermore, cardiac markers like cardiac troponin T, cardiac troponin C and alpha actinin could be observed by immunohistological staining. Regarding the morphology of the different tissues, the mono culture of the CM iPS cells formed agglomerates on the surface of the matrix whereas the co culture showed a well distribution of the cells all over the surface of the matrix. Consequently, the co culture on the SISser is the most promising approach for the development of a functional cardiac patch. However, the combination of cell types within the co culture and their ratio has to be optimized. KW - Tissue Engineering KW - Herzmuskel KW - Bioreaktorplattform KW - Elektrospinning KW - kardiales Tissue Engineering KW - kardiales Gewebe KW - bioreactor plattform KW - electrospinning KW - cardiac tissue engineering KW - Biomaterial KW - Gewebekultur Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142432 ER - TY - THES A1 - Mathes, Denise Sandra T1 - Die Rolle von T-Lymphozyten im myokardialen Reperfusionsschaden T1 - The role of T-cells in myocardial reperfusion injury N2 - Der Myokardinfarkt (MI) gehört nach wie vor zu den führenden Todesursachen weltweit. Eine Minimierung der Infarktgröße, die durch die Dauer der Ischämie bestimmt wird, ist wesentlich für das Überleben und die Lebensqualität des Myokardinfarkt-Patienten. Die Reperfusion stellt aktuell eine zentrale klinische Intervention dar, um den myokardialen Schaden einzugrenzen. Dennoch führt die Reperfusion per se zu zusätzlichem Schaden am Herzen. Somit ist die Erforschung neuer Strategien zur Minimierung des myokardialen Reperfusionsschadens international von Interesse. Die Pathophysiologie des myokardialen Reperfusionsschadens ist vielschichtig und einige Komponenten sind auch heute in ihrer Wirkweise noch nicht vollständig mechanistisch verstanden. Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle von CD4+ T-Zellen und insbesondere deren Subpopulation der regulatorischen T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden und stellt neue, auf T-Zellen abzielende, Therapien in Ergänzung zur myokardialen Reperfusion vor. Zunächst wurde eine Infiltration von T-Zellen in das Myokard nach Ischämie-Reperfusion (I/ R) untersucht. Nach der Ischämie-Reperfusion wurden infiltrierende CD4+ T-Zellen als quantitativ führend und aktiviert identifiziert und erwiesen sich in der Infarktgrößenbestimmung als relevante Mediatoren des Reperfusionsschadens. CD25+Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Treg) stellen eine Subpopulation von CD4+ T-Zellen mit immunsuppressiven Eigenschaften dar, die schnell und niederschwellig aktiviert werden können und kommen somit als zum Reperfusionsschaden beitragend in Frage. Mit Hilfe des DEREG (DEpletion of REGulatory T cells) -Mausmodells wurde gezeigt, dass regulatorische T-Zellen zum myokardialen Reperfusionsschaden beitragen; Treg-depletierte DEREG-Mäuse waren vor dem Reperfusionsschaden geschützt und zeigten kleinere Infarktgrößen als die Kontrolltiere. Zudem wurde mittels Transferexperimenten gezeigt, dass für den Treg-vermittelten Reperfusionsschaden die Anwesenheit von CD25- konventionellen T-Zellen (Tconv) erforderlich ist. Regulatorische T-Zellen stellen also einen in der vorliegenden Arbeit identifizierten potentiellen Angriffspunkt zur Reduktion des myokardialen Reperfusionsschadens dar. Anhand von T-Zell-Rezeptor transgenen OT-II Mäusen und MHC (Major Histocompatibility Complex) Klasse II Knockout (KO) Tieren wurde gezeigt, dass Autoantigenerkennung im myokardialen Reperfusionsschaden eine Rolle spielt. Zur vollen T-Zell-Aktivierung notwendig ist neben dem MHC Klasse II-Signalweg und Kostimulatoren auch das Moleküle CD154 (CD40L). Die Gabe eines inhibitorischen anti-CD154-Antikörpers reduzierte die Infarktgröße in Wildtyp-Tieren sigifikant. Der myokardiale Reperfusionsschaden kann neben Zellen der adaptiven Immunität auch durch Neutrophile Granulozyten, Plättchen oder Inflammation des Endothels verstärkt werden. Knockout Mäuse mit einer Defizienz an CD4+ T-Zellen verfügten über eine verbesserte Mikroperfusion. Mechanistisch war nach 24h Reperfusion die absolute Zellzahl an Neutrophilen Granulozyten im CD4 KO im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen unverändert; in Endothelzellen war die Regulation bestimmter Gene (VEGFα, TIMP-1 und Eng) nach I/ R im CD4 KO jedoch verändert. Zusammengefasst zeigt die vorliegende Arbeit eine zentrale Rolle der Antigen-Erkennung durch den T-Zell-Rezeptor zur Aktivierung von CD4+ T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden. In Anwesenheit von CD4+Foxp3+ T-Zellen ist der Reperfusionsschaden erhöht. Somit können CD4+Foxp3+ T-Zellen potentiell als Ziel für neuartige Therapien des Myokardinfarkts genutzt werden. N2 - Myocardial infarction (MI) is still one of the leading causes of mortality worldwide. Minimizing infarct size, which is determined by duration of ischemia, is of paramount importance for the rescue of myocardial tissue determining myocardial infarct size and prognosis. Currently, reperfusion is a central clinical intervention to curtail myocardial ischemia. However, reperfusion itself is leading to additional damage to the heart. Therefore, investigating new strategies to minimize myocardial reperfusion injury is of international interest. The pathophysiology of myocardial reperfusion injury is complex and some of its components are still mechanistically not completely understood. The present work determines the role of CD4+ T-cells and in particular their subset of regulatory T-cells in myocardial reperfusion injury, providing approaches for new T-cell directed therapies in addition to myocardial reperfusion. Initially, an infiltration of T-cells into the myocardium was investigated after ischemia-reperfusion (I/ R). After ischemia-reperfusion, infiltrating CD4+ T-cells were identified as leading in quantity and activated and turned out to be relevant mediators of reperfusion injury influencing infarct size. CD25+Foxp3+ regulatory T (reg)-cells are a subpopulation of CD4+ T-cells with immunosuppressive features, being activated quickly and at a low threshold, thereby possibly mediating reperfusion injury. With the help of the DEREG (DEpletion of REGulatory T-cells) mouse model, regulatory T-cells were identified as involved in myocardial reperfusion injury; Treg-depleted DEREG mice were protected from reperfusion injury showing smaller infarct sizes than control mice. Additionally, transfer experiments revealed that Treg-mediated reperfusion injury needs the presence of CD25- conventional T-cells (Tconv). That means that Tregs are a potential target identified in the present work to reduce myocardial reperfusion injury. With the help of T-cell receptor transgenic OT-II mice and MHC (major histocompatibility complex) class II knockout (KO) mice, it was shown that recognition of autoantigen plays a role in myocardial reperfusion injury. Next to MHC class II-signaling and costimulators also the molecule CD154 (CD40L) is required for full T-cell activation. An inhibitory anti-CD154 antibody significantly reduced infarct size in wildtype mice. Besides by cells of the adaptive immunity, myocardial reperfusion injury can also be intensified by neutrophils, platelets or inflammation of the endothelium. Knockout mice deficient in CD4+ T-cells revealed a better microperfusion. Mechanistically, after 24h of reperfusion, the absolute cell number of neutrophils was not altered in CD4 KO versus wildtype mice; however, in endothelial cells, the regulation of specific genes (VEGFα, TIMP-1 and Eng) was altered after I/ R. In summary, the present work shows a central role of recognition of antigen by the T-cell receptor for activation of CD4+ T cells in myocardial reperfusion injury. In the presence of CD4+Foxp3+ regulatory T-cells, myocardial reperfusion injury is enhanced. Hence, CD4+Foxp3+ regulatory T-cells might constitute a new potential target for the therapy of myocardial infarction. KW - Reperfusion KW - T-Lymphozyt KW - Foxp3+CD4+ regulatorische T-Zelle Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110802 ER - TY - THES A1 - Hopp-Krämer, Sarah T1 - Untersuchungen zur Pathophysiologie und therapeutischer Relevanz des Blutgerinnungsfaktors XII nach experimentellem Schädel-Hirn-Trauma T1 - Studies on the pathophysiology and therapeutic relevance of the coagulation factor XII following experimental traumatic brain injury N2 - Das Schädel-Hirn-Trauma (SHT) entsteht durch äußere Gewalteinwirkung auf den Kopf und verursacht mechanisch eine Schädigung des Hirngewebes. Zusätzlich tragen sekundäre Pathomechanismen, wie Entzündungsprozesse und die Schädigung der Blut-Hirn-Schranke (BHS), dazu bei, dass sich das initial geschädigte Läsionsareal im Laufe der Zeit vergrößert. Vor allem bei jungen Erwachsenen ist das SHT eine der häufigsten Ursachen für bleibende Behinderungen und Todesfälle. Aufgrund der schweren Auswirkungen des SHT und der bislang fehlenden Therapieoptionen ist die Identifizierung neuer Zielstrukturen für eine kausale Therapie von größter Bedeutung. Ausgehend von tierexperimentellen Studien ist das Kallikrein-Kinin-System (KKS) ein besonders erfolgversprechender Angriffspunkt zur Behandlung des SHT. Die Aktivierung des KKS über den Gerinnungsfaktor XII (FXII) und die darauf folgende Bildung von Bradykinin sind mit dem Entstehen von Hirnödemen und Entzündungsreaktionen assoziiert. Vorangegangene Studien haben weiterhin die Frage aufgeworfen, ob und in welchem Maße thrombotische Prozesse einen Einfluss auf die Pathophysiologie und die sekundären Hirnschädigungen nach SHT haben. Da FXII sowohl das KKS als auch die intrinsische plasmatische Gerinnungskaskade initiiert und somit zur Fibrinbildung beiträgt, stand FXII im Mittelpunkt der Untersuchungen dieser Dissertation. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Fragen, (I) inwiefern FXII eine Rolle bei der sekundären Hirnschädigung nach Trauma spielt und (II) ob thrombotische Prozesse ein pathophysiologisches Merkmal nach Trauma darstellen. In zwei unterschiedlichen Trauma-Modellen wurden FXII-defiziente Tiere und mit einem spezifischen Inhibitor des aktivierten FXII (FXIIa) behandelte Tiere gegen Kontrolltiere nach SHT verglichen. Die Analyse der funktionellen Ausfallerscheinungen und des Ausmaßes an neuronaler Degeneration zeigte, dass FXII-Defizienz und FXIIa-Inhibition vor den Auswirkungen eines SHT schützen. Als zugrundeliegende Mechanismen wurden die Reduktion von thrombotisch verschlossenen Gefäßen in der Mikrovaskulatur des Gehirns sowie der Schutz vor BHS-Störungen und verringerte inflammatorische Prozesse identifiziert. Weiterhin wurde festgestellt, dass eine Blockade der intrinsischen Gerinnungskaskade über FXII keine intrazerebralen Blutungen auslöst. In Gewebeproben von Patienten mit SHT wurde gezeigt, dass Thrombozytenaggregate auch im klinischen Verlauf auftreten und sich somit die tierexperimentellen Befunde auf die humane Situation übertragen lassen. Insgesamt tragen die Ergebnisse dazu bei, die komplexen und vielfältigen Pathomechanismen nach SHT besser zu verstehen und vor allem die Relevanz thrombo-inflammatorischer Prozesse nach SHT aufzuzeigen. Die gezielte Blockade des FXII(a) könnte als therapeutisches Prinzip zur Abschwächung der Sekundärschaden nach SHT geeignet sein. N2 - Traumatic brain injury (TBI) is the result of an outside force causing mechanical disruption of the brain tissue. In addition, delayed pathogenic events, like inflammatory processes and blood-brain barrier damage occur, which collectively exacerbate the injury. In young adults, TBI is one of the main reasons for permanent disability and death. Because of its severe consequences and the lack of causal treatment, the identification of novel therapeutic options is of utmost importance. Based on animal studies, the kallikrein-kinin-system (KKS) is a very promising target to treat secondary injury processes following TBI. The activation of the KKS via coagulation factor XII (FXII) and the subsequent formation of bradykinin are tightly associated with the development of brain edema and inflammation. Recent studies have raised the question to what extent thrombotic processes might influence the pathophysiology and secondary injury processes following TBI. As FXII is not only the starting point of the KKS, but also the initiator of the intrinsic coagulation cascade which leads to fibrin formation, FXII was the center of interest for this dissertation. The work presented here deals with the issue, (I) whether FXII plays a role in the development and aggravation of secondary injury processes after trauma and (II) if thrombotic processes display a pathophysiological feature in TBI. In two different models of brain trauma, FXII-deficient mice and mice treated with a specific inhibitor of activated FXII (FXIIa) were compared to their respective control groups after trauma induction. The analyses of the functional outcome and the amount of neurodegenerative processes showed a distinct amelioration in favor of the genetically modified and treated animals. As underlying mechanisms, the reduction of thrombotic vessels in the brain microvasculature and additionally, protection from blood-brain barrier damages and less inflammation were identified. Moreover, it was observed that interference with the intrinsic coagulation cascade via FXII does not lead to the formation of intracerebral bleedings. The evaluation of human brain tissue surgically obtained following TBI demonstrated that platelet aggregates occur regularly in the course of brain trauma and that they seem to contribute to the secondary injury processes and the ischemia-like injury pattern. Taken together, the results contribute to the understanding of the highly complex and heterogeneous pathomechanisms following TBI, especially concerning thrombo-inflammatory processes. The targeted pharmacological blocking of FXII(a) could be a useful therapeutic principle in the treatment of TBI-associated pathologic processes. KW - Schädel-Hirn-Trauma KW - Blutgerinnungsfaktor XII KW - Pathophysiologie KW - Kallikrein-Kinin-System KW - Intrinsische Gerinnungskaskade Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144421 ER - TY - THES A1 - Schmid, Evelyn T1 - Effekte des Raf Kinase Inhibitor Proteins (RKIP) auf β-adrenerge Signalwege, Herzfunktion und die Entwicklung der Herzinsuffizienz T1 - Effects of the Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) on β-adrenergic signalling, cardiac function and the development of heart failure N2 - Das Raf kinase inhibitor protein (RKIP) ist ein Kinaseregulator, der im Herzen eine Präferenz für die G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2 (GRK2) zeigt. Die Regulation erfolgt durch direkte Interaktion beider Proteine, wird durch eine PKC-Phosphorylierung an Serin 153 des RKIP induziert und inhibiert die GRK2-vermittelte Phosphorylierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die GRK2 desensitiviert GPCR und eine Hemmung der GRK2-Aktivität wirkt sich so positiv auf die Ansprechbarkeit von GPCR aus. Die \textbeta-adrenergen Rezeptoren (\textbeta AR) sind im Herzen maßgeblich an der Regulation der kardialen Kontraktilität beteiligt. Erste Zusammenhänge zwischen der RKIP-Expression und der kontraktilen Antwort von Kardiomyozyten wurden bereits in einer früheren Arbeit untersucht und bestätigt. Sie begründen die Fragestellung nach Effekten einer verstärkten RKIP-Expression auf \textbeta-adrenerge Rezeptorsignale, Herzfunktion und die Entwicklung der Herzinsuffizienz. Im Rahmen dieses Projektes konnten die Effekte des RKIP auf \textbeta-adrenerge Signalwege detaillierter beschrieben werden. Dabei erwies sich die inhibitorische Funktion auf die GRK2 als rezeptorspezifisch ohne Einfluss auf zytosolische Angriffspunkte der GRK2 zu nehmen. Verstärkte \textbeta-adrenerge Signale zeigten sich in neonatalen Kardiomyozyten an Hand der erhöhten cAMP-Level, PKA-Aktivität, sowie Kontraktionsrate und Relaxationsgeschwindigkeit nach \textbeta-adrenerger Stimulation. Im Einklang damit konnte eine erhöhte PKA- und CaMKII-Aktivität und eine positive Inotropie in transgenen Tieren, mit herzspezifischer Überexpression von RKIP, beobachtet werden. Durch Messung des Calcium-\textit{Cyclings} in Kardiomyozyten konnte der Phänotyp auf eine verbesserte Rückführung des Calciums, einer daraus resultierenden erhöhten Calciumbeladung des sarkoplasmatischen Retikulums und einem gesteigerten systolischen Calciumspiegel, zurückgeführt werden. Die Untersuchung der Phosphorylierung von Calciumkanälen, L-Typ-Calciumkanal und Ryanodin-Rezeptor 2, die den einwärtsgerichteten Calciumstrom vermitteln konnte ihre Beteiligung an der positiv inotropen Wirkung ausschließen. Neben dem kontraktilen Phänotyp konnten zusätzliche protektive Effekte beobachtet werden. In Modellen, die eine chronische \textbeta-adrenerge Stimulation imitieren, bzw. eine Nachlasterhöhung induzieren konnte eine Verringerung der interstitiellen Fibrose und der damit assoziierten Marker, gezeigt werden. Mit Hilfe von \textit{in vivo} EKG-Messungen konnte die Neigung zur Ausbildung von Arrhythmien untersucht werden. Auch im Hinblick auf die Anzahl der Extrasystolen waren RKIP-transgene Tiere geschützt. Infolge der Untersuchung der Phänotypen in Deletionshintergründen der einzelnen \textbeta AR-Subtypen (\textbeta\textsubscript{1}AR, \textbeta\textsubscript{2}AR) konnte die positive Inotropie mit den spezifischen Signalwegen des \textbeta\textsubscript{1}AR assoziiert und die protektiven Effekte gegenüber den Umbauprozessen und der Arrhythmieneigung dem \textbeta\textsubscript{2}-adrenergen Signalen zugeschrieben werden. Zusätzlich bestätigt sich eine besondere Rolle der G\textalpha\textsubscript{i}-Kopplung des \textbeta\textsubscript{2}AR, durch die er einen hemmenden Einfluss auf die \textbeta\textsubscript{1}AR-Singale nehmen kann. Die Untersuchung einiger Marker, die eine physiologische von einer pathologischen Hypertrophie unterscheiden, konnte das in den RKIP-transgenen Mäusen auftretende Wachstum der Kardiomyozyten als kompensatorische und physiologische Hypertrophie charakterisieren. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse auf eine ausgeglichene Aktivierung der beiden Rezeptoren hin, die sich gegenseitig regulieren und durch die Inhibition der GRK2 in ihrer Anregbarkeit erhalten bleiben. Mittels einer AAV9-vermittelten Gentherapie konnte das therapeutische Potential dieses Prinzips weiter bestätigt werden, da es die prominentesten Veränderungen während der Herzinsuffizienzentwicklung, wie die Verschlechterung der linksventrikulären Funktion, die Dilatation des linken Ventrikels, die Ausbildung von Lungenödemen und interstitieller Fibrose sowie die Expression von Herzinsuffizienz-assoziierten Genen, verhindern konnte. Auch konnten die Auswirkungen der Deletion des RKIP, die sich durch eine beschleunigte und gravierendere Herzinsuffizienzentwicklung auszeichnet, durch Reexpression von RKIP verhindert werden. Diese Arbeit kann somit zeigen, dass das RKIP eine ausgeglichene Verstärkung von \textbeta-adrenergen Signalwegen verursacht, die positiv inotrop und gleichzeitig protektiv wirkt. Dieses Wirkprinzip könnte ferner eine Strategie zur Erhöhung der Kontraktilität in der Herzinsuffizienz darstellen, die entgegen etablierter Theorien auf der Stimulation beider \textbeta AR basiert. N2 - The Raf kinase inhibitor protein (RKIP) is a kinase regulator with a preference for the G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) in the heart. The mechanism is a direct interaction of GRK2 and RKIP, which is triggered by a PKC-mediated phosphorylation at serine 153 of RKIP. By binding the GRK2, RKIP prevents the GRK2-mediated GPCR-phosphorylation and, thus, desensitisation of GPCR. As a result, inhibition of GRK2-activity positively affects the responsiveness of cardiac G protein-coupled receptors (GPCR). The GPCR primarly responsible for the regulation of the cardiac contractility are the \textbeta-adrenergic receptors (\textbeta AR). Previous work proved an interrelation of RKIP-expression and contractile response of cardiomyocytes and set a basis for the subject of this thesis, dealing with the effects of RKIP-expression on beta-adrenergic signalling, cardiac function and the development of heart failure. The work describes the impact of RKIP on \textbeta-adrenergic signaling in more detail. An important feature of the inhibitory function of RKIP on GRK2 is a specificity for receptor targets (\textbeta AR) with no, or only minor, impact on the cytosolic targets of the GRK2. RKIP also increases \textbeta-adrenergic signalling. This appears in neonatal cardiac myocytes through an increased cAMP-generation, PKA-activity, contractile action and relaxation velocity after \textbeta-adrenergic stimulation. Similarly, RKIP-transgenic mice, with heart specific RKIP-expression, showed higher PKA and CaMKII-activities as well as, a positive inotropy. Analysis of the calcium cycling in these cardiomyocytes provided an explanation for the hypercontractile phenotype: an enhanced calcium reuptake into the sarcoplasmatic reticulum (SR), the resulting higher calcium load of the SR and an increased calcium amplitude in the cytosol during the systole cause the augmented contractile force. Furthermore, it could be ruled out, that two inward rectifying channels - L-type calcium channnel and Ryanodin Receptor 2 contribute to the positve inotropy in RKIP-transgenic mice. Besides, the RKIP-expression had additional protective effects in heart failure development, which were investigated by desease models. Hypertrophy was induced by chronic \textbeta-adrenergic stimulation and heart failure by induction of pressure overload. Under these conditions, RKIP could reduce the development of interstitial fibrosis and the expression of associated marker genes. The occurence of arrhythmias, in particular ectopic beats, was assessed by the analysis of \textit{in vivo} ECG-traces. Rated by the number of ectopic beats RKIP-transgenic mice were also protected against the induction of arrhythmia. The analysis of RKIP-expression in \textbeta AR subtype-KOs (\textbeta\textsubscript{1}KO, \textbeta\textsubscript{2}KO) could relate the different effects of RKIP to the signalling pathways of either \textbeta\textsubscript{1}AR or \textbeta\textsubscript{2}AR. As a result, RKIP effects the positive inotropy through signals of the \textbeta\textsubscript{1}AR and the protection against heart failure-related remodelling processes and arrhythmia through signals of the \textbeta\textsubscript{2}AR. Additionally a major importance could be assigned to the G\textalpha\textsubscript{i} coupling of the \textbeta\textsubscript{2}AR. This capacity of the \textbeta\textsubscript{2}AR can counteract potentially maladaptive signalling of the \textbeta\textsubscript{1}AR. A monitored growth of cardiomyocytes of RKIP-transgenic mice was assessed in greater depth using different markers to differentiate physiological from pathological hypertrophy. Thereby the occurring hypertrophy was characterised as physiological and compensatory. Taken together, these results point towards a balanced activation of both \textbeta AR. They influence each other through downstream signals and are protected from desensitisation and loss of \textbeta-adrenergic responsivness through inhibition of the GRK2 by RKIP. To validate the therapeutic potential of this mode of action, an AAV9-mediated gene therapy was conducted. In this setting, RKIP was able to prevent, or strongly reduce the most prominent changes during heart failure development. Among these are the decline of the left ventricular function, dilation of the left ventricle, development of a pulmonary congestion, interstitial fibrosis and the expression of heart failure associated genes. Moreover, the consequences of RKIP deletion, which are reflected in an accelerated and deteriorated heart failure development, could be reversed by the reexpression of RKIP. This work shows, that RKIP induces an even activation of \textbeta-adrenergic signalling, which results in a positive inotropy with concomitant protective effects. RKIPs mode of action represents a strategy and bears the possibilty to enhance cardiac contractility in the failing heart by stimulation of both \textbeta AR, which is contrary to the common belief. KW - Herzinsuffizienz KW - Raf-Kinasen KW - Inhibition KW - Kinase signaling KW - Beta-Rezeptor KW - beta-adrenerge Signalwege KW - Protein Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142486 ER - TY - THES A1 - Horn, Anne T1 - Die Wirkung von Dopamin und Faktoren der dopaminergen Neurotransmission auf HIV-Infektion und Immunaktivierung: Fokus auf Dopamin-assoziierte Gene T1 - The impact of dopamine and factors influencing the dopaminergic neurotransmission on HIV infection and immune activation: focus on dopamine-associated genes N2 - HIV verursacht eine progressive Zerstörung des Immunsystems und führt zusätzlich durch Veränderungen im ZNS zu neurokognitiven Störungen (HIV-associated neurocognitive disorders, HAND). Die HIV-Infektion geht mit einer Dysfunktion von dopaminergen Signalwegen einher, die sich unter anderem in einer erhöhten Dopamin-Verfügbarkeit im Liquor von Therapie-naiven HIV-Patienten äußert. Der Grund für die Dysregulation der dopaminergen Signalwege in HIV-Patienten ist nicht geklärt. Aufgrund dessen war das Hauptziel dieser Arbeit die Identifizierung des pathogenetischen Mechanismus, der zu einer erhöhten Dopamin-Konzentration im Liquor von HIV-Patienten führt. Die primäre Hypothese war, dass die erhöhte Dopamin-Verfügbarkeit nicht durch das Virus selbst, sondern vielmehr durch die genetische Konstitution der HIV-Patienten hervorgerufen wird. Deshalb wurden Polymorphismen untersucht, die die dopaminerge Neurotransmission beeinflussen. Es wurde vermutet, dass a) verschiedene Genotypen dieser Polymorphismen in nicht-infizierten und HIV-infizierten Personen mit anderen Häufigkeiten auftreten, b) verschiedene Genotypen mit veränderten Dopamin-Verfügbarkeiten assoziiert sind, c) unterschiedliche Genotypen Auswirkungen auf Marker der Progression der HIV-Infektion haben und d) verschiedene Genotypen die Immunaktivierung beeinflussen. Dazu wurden in 190 HIV-infizierten und nicht-infizierten Teilnehmern unterschiedlicher Ethnien die Polymorphismen BDNF Val66Met, COMT Val108/158Met, DAT 3‘-UTR VNTR, DRD2 TaqIα, DRD3 Ser9Gly und DRD4 VNRT mit PCR, ggf. Restriktionsverdau und Agarose-Gelelektrophorese analysiert und die Expression des Dopamin-Transporters mit real time PCR bestimmt. Darüber hinaus wurden zur weiteren klinischen Charakterisierung die Immunmarker MCP-1, sCD14, suPAR und RANTES mit ELISA analysiert, da eine Erhöhung dieser Parameter mit einer beschleunigten HIV-Progression assoziiert ist. Die Bestimmung der T-Zell-Aktivierung (CD3/CD8/CD38/HLA-DR) wurde mit einer durchflusszytometrischen Analyse durchgeführt. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass HIV-Patienten hochsignifikant häufiger homozygot für das 10-repeat Allel des Dopamin-Transporter-Polymorphismus sind als nicht-infizierte Personen (57,1 % bzw. 26,8 %, p = 0,001, OR = 3,93, 95 % CI 1,72 – 8,96, direkte logistische Regression). HIV-Patienten und nicht-infizierte Personen mit diesem Genotyp weisen eine signifikant höhere Dopamin-Verfügbarkeit im Liquor auf als Personen mit dem 9/10-Genotyp (p = 0,03) und eine signifikant geringere Expression des Dopamin-Transporters auf PBMCs (p = 0,05). Der DAT 10/10-Genotyp ist im Gegensatz zu anderen Genotypen in HIV-Patienten jedoch weder mit unterschiedlichen CD4+-Zellzahlen und Viruslasten noch mit einer veränderten Häufigkeit von HAND verbunden. Zusätzlich weisen deutsche und südafrikanische nicht-infizierte und HIV-infizierte Personen mit dem DAT 10/10-Genotyp eine signifikant höhere MCP-1-Konzentration im Plasma auf als Personen mit anderen DAT-Genotypen (p = 0,0076). Keiner der Immunmarker ist mit der Dopamin-Verfügbarkeit assoziiert. Dennoch ist die Immunaktivierung in südafrikanischen HIV-Patienten im Vergleich zu nicht-infizierten Südafrikanern signifikant erhöht: HIV-Patienten zeigen im Vergleich zu nicht-infizierten Personen eine stärkere T-Zell-Aktivierung (p = 0,0001), eine erhöhte Plasma-Konzentration von MCP-1 (p = 0,0014), eine gesteigerte sCD14-Konzentration (p = 0,0004) und eine vermehrte suPAR-Konzentration im Plasma (p = 0,006). In der vorliegenden Arbeit konnte kein Nachweis erbracht werden, dass die erhöhte Immunaktivierung in den südafrikanischen HIV-Patienten durch die Koinfektion mit Echinoccocus oder durch genetische Polymorphismen bei Chemokinen hervorgerufen wird. Eine chronisch erhöhte Immunaktivierung stellt eine treibende Kraft für die Virusreplikation dar und kann letztendlich zu einer Erschöpfung des Immunsystems führen. Der 10/10-Genotyp des DAT VNTR könnte einen Risiko-Faktor für die HIV-Infektion darstellen, da dieser eine erhöhte Dopamin-Verfügbarkeit nach sich zieht. Dopamin aktiviert HIV in chronisch infizierten T-Lymphoblasten und führt zudem zu einer erhöhten Expression und Sezernierung von TNF-α, das wiederum die Expression von HIV induziert. Diese Ergebnisse untermauern den Zusammenhang von Dopamin und HIV. Es ist jedoch nicht völlig geklärt, ob die erhöhte Dopamin-Konzentration ausschließlich durch den Genotyp hervorgerufen oder auch durch die HIV-Infektion begünstigt wird. N2 - HIV infection has adverse effects on the immune system and also leads to a HIV-associated neurocognitive disorder (HAND) due to changes within the CNS. It is associated with a dysfunction of dopaminergic pathways which amongst others involves an increased dopamine availability within the cerebrospinal fluid (CSF) of therapy naïve HIV patients. The reason for the dysregulation of dopaminergic pathways has not been found yet. Therefore, the main goal of this work was the identification of the pathogenetic mechanism leading to an elevated dopamine availability. The primary hypothesis was that the higher dopamine availability is not caused by the virus itself but rather by the genetic background of HIV patients. That is why we analyzed genetic polymorphisms which influence the dopaminergic neurotransmission. We hypothesized that a) different genotypes of these polymorphisms occur with different frequencies in HIV infected and uninfected individuals, b) different genotypes are associated with changes in dopamine availability, c) different genotypes have an impact on markers of HIV disease progression and d) different genotypes influence immune activation. We analyzed the polymorphisms BDNF Val66Met, COMT Val108/158Met, DAT 3‘-UTR VNTR, DRD2 TaqIα, DRD3 Ser9Gly und DRD4 VNRT in 190 HIV infected and uninfected participants of different ethnicities by PCR, restriction digestion and agarose gel electrophoresis and the expression of the dopamine transporter by real time PCR. For further clinical characterization the immune markers MCP-1, RANTES, sCD14 and suPAR were measured by ELISA as they are associated with HIV disease progression. The analysis of T cell activation (CD3/CD8/CD38/HLA-DR) was performed using flow cytometry. We found that HIV patients are highly significantly more often homozygous for the 10-repeat allele of the dopamine transporter polymorphism than uninfected individuals (57.1 % and 26.8 %, respectively, p = 0.001, OR = 3.93, 95 % CI 1.72 – 8.96, direct logistic regression analysis). HIV patients and uninfected subjects with this genotype display a significantly higher dopamine availability in CSF compared to people with the 9/10 genotype (p = 0.03) and significantly decreased mRNA expression of the dopamine transporter on PBMCs (p = 0.05). However, the DAT 10/10 genotype compared to other genotypes is neither linked to a difference in CD4 T cell counts and viral loads nor to an altered frequency of HAND. Additionally, German and South African uninfected and HIV infected participants with the DAT 10/10 genotype show higher concentrations of MCP-1 in plasma (p = 0.0076). None of the immune markers is associated with dopamine availability. In contrast, immune activation is significantly higher in South African HIV patients compared to uninfected subjects. HIV patients display an augmented T cell activation (p = 0.0001), an elevated plasma concentration of MCP-1 (p = 0.0014), increased sCD14 plasma levels (p = 0.0004) and a higher suPAR concentration in plasma (p = 0.006) compared to uninfected participants. In this study, we could not provide evidence that the higher immune activation in South African HIV patients is due to the parasitic infection Echinococcus or due to genetic polymorphisms of chemokines. A chronically elevated immune activation represents a driving force for viral replication and can lead eventually to the exhaustion of the immune system. The 10/10 genotype of the DAT VNTR could be a risk factor for HIV infection as this genotype causes a higher dopamine availability. Dopamine activates HIV in chronically infected T lymphoblasts and leads to an enhanced expression and secretion of TNF-α which in turn results in an induction of HIV expression. These results emphasize the interaction of dopamine and HIV. However, it has not been completely elucidated whether the elevated dopamine availability is entirely associated with the genotype or it might be a consequence of HIV infection. KW - Dopamin KW - HIV KW - Polymorphismus KW - Dopamin-Transporter KW - HIV-assoziierte neurokognitive Störung (HAND) KW - Immunaktivierung KW - Liquor KW - Dopamine transporter KW - HIV-associated neurocognitive disorder (HAND) KW - Immune activation KW - Cerebrospinal fluid (CSF) Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107639 ER - TY - THES A1 - Jürgens, Constantin Johannes Sebastian T1 - Untersuchungen zum antiproliferativen Potential von Stoffwechselinhibitoren bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen T1 - Investigations on antiproliferative potential of metabolism inhibibitors in the presence of tumor physiological concentrations of oxygen N2 - Das Ziel der Arbeit war zu untersuchen, ob der Stoffwechsel kolorektaler Karzi-nomzellen geeignete Targetstrukturen für mögliche therapeutische Ansätze aufweist. In Krebszellen induziert sowohl der Warburg-Effekt bei Normoxie als auch die anaerobe Glykolyse bei Hypoxie eine massive Bildung von Laktat. Wird die Krebszelle dauerhaft daran gehindert, die für die Glykolyse notwendi-gen Reduktionsäquivalente NADH+H+ mit Hilfe der Laktatdehydrogenase zu reoxidieren und/oder Laktat über die Transporter MCT1 und MCT4 nach außen zu schleusen, dann löst diese Kombination aus Mangelsituation und intrazellulärer Ansäuerung den apoptotischen Zelltod aus. Für die Situation in vivo ist entscheidend, dass auch Zellen von Normalgeweben zwar Laktat in Hypoxie bilden, dies jedoch keine vorherrschende physiologische Situation darstellt. Die Hemmstoffe Natriumoxamat (NaOx) für die Laktatdehydrogenase und α-Cyano-4-Hydroxycinnamat (αCHC) für MCT1 und MCT4 wurden an den sechs humanen kolorektalen Karzinomzelllinien Colo741, HCT116, HT29, LS174T, SW620 und WiDr untersucht. Zusätzlich wurde der Glukoseverbrauch und die Laktatbildung bestimmt und die Funktion der Atmungskette überprüft. Die IC50-Werte für 5-FU, NaOx und αCHC wurden bestimmt und danach NaOx in einer Konzentration von 40x10-3 mol/L, αCHC in einer Konzentration von 2x10-3 mol/L und 5-FU in einer Konzentration von 5x10-6 mol/L eingesetzt. Die Zellen wurden bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen von 5 % und 1 % Sauerstoff für bis zu 120 Stunden inkubiert. Die Funktion der Atmungskette in den Mitochondrien der kolorektalen Karzi-nomzellen wurde u. a. durch Bestimmung wichtiger Kenngrößen wie dem P:O Quotienten und des respiratorischen Kontrollindex (RKI) nachgewiesen. Fünf der sechs Karzinomzelllinien wiesen im Vergleich zur Kontrollzelllinie J774 einen verringerten P:O-Quotienten und respiratorischen Kontrollindex (RKI) auf, was darauf hindeutet, dass die Funktion der Mitochondrien dieser Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen zwar verringert war, aber nicht vollständig aufgehoben. Dieses Ergebnis stützt die allgemein akzeptierte Auffassung, dass die meisten Tumore über funktionelle Mitochondrien verfügen. Durch die Analyse des Glukosestoffwechsels wurden die sechs kolorektalen Zelllinien, die einen unterschiedlich stark ausgeprägten glykolytischen Phänotyp aufwiesen, nach der Stärke der Laktatbildung bei 5 % Sauerstoff in drei Kategorien eingeordnet. Zudem wurde für jede der sechs Zelllinien die Expression von LDH-A, LDH-B sowie MCT-1 und MCT-4 auf Proteinebene nachgewiesen. Wesentliches Ziel der Untersuchungen war die Überprüfung des antiprolife-rativen Potentials der beiden Inhibitoren NaOx und αCHC einzeln oder in Kombination mit 5-FU bei den tumorspezifischen Sauerstoffkonzentrationen von 5 % und 1 %. Die Kombination aus NaOx und αCHC induzierte bei 1 % Sauerstoff nach 9 Tagen in Kultur zytotoxische Effekte und war damit so wirksam wie 5x10-6 mol/L 5-FU. Die Zugabe von 5-FU zur Kombination aus NaOx und αCHC führte zu keiner Steigerung des zelltoxischen Effektes. Die beiden Inhibitoren NaOx und αCHC waren für SW620 Zellen weniger wirksam als für Zellen der anderen fünf Zelllinien. Das mehr „oxidative“ Profil von SW620 Zellen (bester P:O-Quotient, geringste Laktatbildung bei 5 % und 1 % Sauerstoff; zudem die höchsten IC50-Werte für NaOx und αCHC) könnte erklären, warum die beiden Stoffwechselinhibitoren, die einen glykolytischen Phänotyp (starke Bildung von Laktat) erfordern, für SW620 Zellen von geringerer Wirksamkeit waren. Für die Hemmstoffe NaOx und αCHC wurden zytostatische bzw. zytotoxische Effekte in kolorektalen Karzinomzellen gezeigt. Dies deutet darauf hin, dass Krebszellen auf einen ungehinderten glykolytischen Stoffwechsel angewiesen sind. Für beide Hemmstoffe wurde ebenfalls gezeigt, dass sie auch bei tumorre-levanten Sauerstoffkonzentrationen von 5 % und 1 % wirksam sind. N2 - The aim of the thesis was to investigate whether the metabolism of colorectal carcinoma cells can provide suitable target structures for possible therapeutic approaches. Both the Warburg effect, in the case of normoxia, and anaerobic glycolysis, in the case of hypoxia, induce a massive production of lactate in cancer cells. If a cancer cell can be permanently prevented from reoxidising reduction equivalents NADH+H+ with the help of lactate dehydrogenase, which is necessary for glycolysis, and/or the removal of lactate via the transporters MCT1 and MCT4 can be inhibited, then this combination of a deficiency and intracellular acidification results in the apoptotic death. As far as the in vivo situation is concerned, it is crucial that cells from normal tissue also produce lactate in hypoxia, but that this does not constitute a predominant physiological situation. Sodium oxamate (NaOx), an inhibitor for the lactate dehydrogenase and α-cyano-4-hydroxy cinnamate (αCHC), an inhibitor for MCT 1 and MCT 4 were examined in the six human colorectal carcinoma cell lines Colo741, HCT116, HT29, LS174T, SW620 and WiDr. In addition, glucose consumption and lactate production were determined as well as the function of the respiratory chain. The half maximal inhibitory concentration (IC50) for 5-FU, NaOx, and αCHC was determined and NaOx was used in a concentration of 40x10-3 mol/L, αCHC in a concentration of 2x10-3 mol/L and 5-FU in a concentration von 5x10-6 mol/L. The cells were incubated for up to 120 hours at tumour physiological concentrations of oxygen of 5% and 1%. The respiratory chain function in the mitochondria of colorectal carcinoma cells was verified by determining the P:O quotient and the respiratory control index (RCI), two important parameters for respiratory chain function. Five of the six carcinoma cell lines showed a reduced P:O quotient and respiratory control index (RCI), when compared to control cell line J774. These results indicate that the mitochondria of these cells were malfunctioning, but not fully defective. This finding supports the generally accepted view that most tumours possess functional mitochondria. By analysing the glucose metabolism of the six colorectal cell lines, which showed varying degrees of glycolytic phenotype,these cells were ranked into three categories according to the amount of lactate production at 5% oxygen. Moreover, the expression of LDH-A, LDH-B and MCT-1 and MCT-4 at protein level was confirmed for each of the six cell lines. The main focus of the work was to verify the antiproliferative potential of the two inhibitors NaOx and αCHC alone and in combination with 5-FU in the presence of tumour-specific oxygen concentrations of 5% and 1%. At 1% oxygen the combination of NaOx and αCHC induced cytotoxic effects after 9 days of culture, making it as effective as 5x10-6 mol/L 5-FU. The addition of 5-FU to the combination of NaOx and αCHC did not increase the cell-toxic effect. NaOx and αCHC were less effective for SW620 cells then in the other five cell lines. The more "oxidative" profile of SW620 cells (best P:O quotient, least amount of lactate production at 5% and 1% oxygen, and the highest IC50 values for NaOx and αCHC) might explain why the two metabolism inhibitors, which require a glycolytic phenotype (strong lactate production) were less effective in SW620 cells. Cytostatic or cytotoxic effects of the inhibitors NaOx and αCHC were demon-strated in colorectal carcinoma cells. This indicates that cancer cells are de-pendent on a functioning glycolytic metabolism. Both inhibitors were also effective in the presence of tumour-relevant oxygen concentrations of 5% and 1%. KW - Tumorzelle KW - Tumorhypoxie KW - Stoffwechselinhibitoren KW - Natriumoxamat KW - alfa-cyano-4-hydroxycinnamat KW - kolorektale Karzinomzelllinien KW - Warburg-Effekt KW - Sauerstoffkonzentration KW - Stoffwechsel KW - Inhibitor KW - Lactatdehydrogenase KW - Warburg, Otto Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140061 ER - TY - THES A1 - Lother, Jasmin T1 - Interaktion dendritischer Zell-Subtypen mit dem human pathogenen Schimmelpilz \(Aspergillus fumigatus\) T1 - Interaction of dendritic cell subtypes with the human pathogenic mould fungus \(Aspergillus fumigatus\) N2 - Die invasive Aspergillose (IA) z¨ ahlt zu den seltenen, bei immunsupprimierten Patienten jedoch mit einer hohen Letalit¨ at verbundenen Infektionskrankheiten. Sie wird, wie alle Aspergillosen, durch den humanpathogenen Schimmelpilz Aspergillus fumigatus ausgel¨ ost. Bis heute ist die oft nicht effektive Therapie einer IA mit hohen Nebenwirkungen und Kosten verbunden. Die Entwicklung von Pathogen-spezifischen Immuntherapien soll durch die Forschung im Bereich der immunologischen Infektionsbiologie vorangetrieben werden. Fur neuen Erkenntnisse wird die Interaktion von humanen Immunzellen mit ¨ A. fumigatus analysiert. In der vorliegenden Studie wurde mit dendritischen Zellen (DCs) gearbeitet, da diese Pilzmorphologien von A. fumigatus phagozytieren k¨ onnen und uber Antigenpr ¨ ¨ asentation das adaptive Immunsystem aktivieren. Es wurden aus humanen Monozyten differenzierte DCs (moDCs) verwendet, mit welchen viele Forschergruppen aufgrund ihrer verfugbar ¨ großen Anzahl arbeiten. Allerdings dauert die Generierung von moDCs funf Tage. Aus ¨ dem peripheren Blut entstammende CD1c-positive myeloide DCs (mDCs) oder CD303- positive plasmazytoide DCs (pDCs) k¨ onnen dagegen direkt nach der Isolation verwendet werden. Die beiden DC-Populationen werden aus verschiedenen Vorl¨ auferzellen des h¨ amatopoetischen Systems im Knochenmark gebildet. Ihr Ph¨ anotyp und ihre Immunfunktionen unterscheiden sich untereinander und auch von denen der moDCs. In Interaktionsstudien konnte analysiert werden, dass die drei verwendeten DC-Subtypen (moDCs, mDCs, pDCs) unterschiedlich auf A. fumigatus reagieren. moDCs und mDCs reiften in direktem Kontakt zu Aspergillus, sie sekretierten ein relativ ¨ ahnliches Zytokinprofil und exprimierten die bekannten Aspergillus-Rezeptoren Dectin-1, TLR2 und TLR4. Im Kontrast dazu verblieben pDCs trotz Aspergillus-Kontakt unreif und sekretierten nahezu keine Zytokine. Da moDCs und mDCs eine Immunreaktion auf den Pilz zeigten, wurden sie mit verschiedenen Aspergillus-Antigenen beladen und n¨ aher untersucht. Bevor verschiedene Aspergillus-Antigene zur Beladung der DCs eingesetzt werden konnten, wurden diese analysiert und aufgereinigt. Hierfur wurde ein routinierter Arbeitsprozess ¨ etabliert. Zwei der vier verfugbaren Proteinantigene waren mit Endotoxin kontaminiert. ¨ Da schon geringe Mengen an Endotoxinen auf DCs einen stimulatorischen Effekt ausubten, ¨ wurden die Proteine mittels Affinit¨ atschromatografie von den verunreinigenden Endotoxinen befreit. In den Stimulationsexperimenten wirkten die beiden Proteinantigene CcpA und SHMT immunogen auf moDCs und mDCs. CcpA induzierte eine st¨ arkere Maturierung und Zytokinfreisetzung als SHMT. Auff¨ allig war, dass mDCs im Vergleich zu moDCs die Expression von MHC Klasse II st¨ arker erh¨ ohten und mehr IL18 freisetzten. Die mit CcpA oder SHMT beladenen moDCs und mDCs aktivierten autologe T-Zellen zur IFNg Sekretion und zur Proliferation. Zudem wurden durch die beiden Proteine Aspergillus-spezifische, CD154- positive T-Zellen induziert. Diese Aspergillus-spezifische Immunogenit¨ at von CcpA und SHMT macht die beiden Proteine zu interessanten Kandidaten fur einen Vakzinierungs- ¨ Cocktail einer DC-Immuntherapie. Aspergillus Lysat induzierte als weiteres Antigen eine T-Zell Immunantwort mit CD154-positiven T-Zellen. Zudem war die Proliferation und IFNg Sekretion von T-Zellen induziert, obwohl moDCs und mDCs nicht reiften und nur wenige Zytokine sekretierten. Die beiden Aspergillus-Proteine CpcB und fg-gap induzierten die Reifung und Zytokinsekretion von moDCs und mDCs nicht. Demzufolge sind CpcB und fg-gap fur eine DC-Immuntherapie nicht empfehlenswert. ¨ Ein Vakzinierungs-Cocktail enth¨ alt in der Regel Adjuvantien, welche die Immunreaktion verst¨ arken. Adjuvante Effekte auf moDCs konnten die getesteten Aspergillus-RezeptorLiganden Zymosan, Pam3CSK4, LPS ultrapur und R848 ausl¨ osen. Hyalurons¨ aure konnte keine Verbesserung der Reifung oder Vitalit¨ at von moDCs und mDCs bewirken. Die Antigen-bedingte Reifung der DCs fur n ¨ ¨ otige Restimulationen w¨ ahrend der Therapie konnte mittels einer tiefgekuhlten Lagerung in CryoStor Einfriermedium stabil beibehalten ¨ werden. Die beiden immunogenen Aspergillus-Proteine, die adjuvanten Rezeptor-Agonisten und die stabile Lagerung in CryoStor k¨ onnen als elementare Grundsteine fur einen Vakzinierungs- ¨ Cocktail einer anti-fungalen DC-Immuntherapie mit moDCs oder mDCs angesehen werden. N2 - Invasive aspergillosis (IA) is one of the rare infectious diseases associated with a high mortality rate that occurs in immunocompromised patients. Like all aspergillosis, it is caused by the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus. No effective therapy of IA is known to date and the current therapy is associated with high side effects and costs. More in-depth research is needed in the field of immunological infection biology, such as the interactions of human immune cells with A. fumigatus, for the development of pathogen-specific immunotherapies. In the present study dendritic cells (DCs) are investigated due to their ability to phago- cytose fungal morphologies of A. fumigatus and activate the adaptive immune system via antigen presentation. Monocytes which differentiate into DCs (moDCs) are used by many research groups due to their large numbers; however, their total generation time lasts five days. CD1c-positive myeloid DCs (mDCs) and CD303-positive plasmacytoid DCs (pDCs) found in the peripheral blood can be used directly after isolation. The two DC populations are formed from different precursor cells of the hematopoietic system in the bone marrow and therefore their phenotype and immune functions differ from each other and also from those of moDCs. ... KW - Dendritische Zellen KW - Aspergillus KW - Untertyp Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140940 ER - TY - THES A1 - Ratz, Valentin T1 - Entwicklung einer funktionellen 3D Magnetresonanz-Defäkographie T1 - Development of a functional 3D magnetic resonance defecography N2 - Epidemiologische Studien schätzen die Inzidenz chronischer Obstipation auf bis zu 27% der Gesamtbevölkerung. Betroffenen Patienten ist die Stuhlentleerung nicht oder nur unter großer Anstrengung und nicht selten nur unter Zuhilfenahme der Hand möglich. Häufig sind funktionelle Pathologien, welche sich nur während der Defäkation ausbilden, hierfür verantwortlich. Daher ist für die Diagnose und Evaluation dieser Pathologien ein bildgebendes Verfahren notwendig, welches die dynamische Darstellung der Defäkation ermöglicht. Der Goldstandard zur Untersuchung von Patienten mit funktionellen Beckenbodenstörungen ist die Entero-Colpo-Cysto-Defäkographie (ECCD). Diese Durchleuchtungsmethode erfordert die Applikation ionisierender Strahlung im Bereich des Beckens. Außerdem müssen für die Untersuchung Rektum und Vagina mit bariumhaltigem Kontrastmittel, der Dünndarm mit barium- und iodhaltigem Kontrastmittel und zusätzlich die Blase mit iodhaltigem Kontrastmittel gefüllt werden. Bei der MR-Defäkographie hingegen ist keine ionisierende Strahlung notwendig und nur eine rektale Füllung mit Ultraschallgel als Kontrastmittel erforderlich. Zudem ermöglichen statische Aufnahmen aufgrund des hohen Weichteilkontrasts der MR-Bildgebung eine detaillierte Darstellung des gesamten Beckenbodens. Die MR-Bildgebung ist jedoch im Vergleich zu anderen Bildgebungsmodalitäten, wie beispielsweise der radiographischen Durchleuchtung, langsam. Besonders zur Darstellung dynamischer Prozesse ist daher eine starke Beschleunigung des Akquisitionsprozesses notwendig. Bei der Standard 2D MR-Defäkographie wird für die Beschleunigung der Datenakquisition eine regelmäßige zweifache Unterabtastung des k-Raums vorgenommen. Hierdurch lassen sich aber nur drei räumlich voneinander getrennte 68 2D Schichten mit einer zeitlichen Aktualisierungsrate der drei Schichten von ca. 1s akquirieren. Dadurch ist aber besonders die Diagnose lateral lokalisierter Pathologien eingeschränkt oder gar nicht möglich. Daher wurde in dieser Arbeit eine 3D MR-Defäkographie zur dynamischen Darstellung der Defäkation innerhalb eines vollständigen 3D Volumens entwickelt, implementiert und anhand von 9 Patientenmessungen optimiert. Die letzten 4 Patienten wurden mit den optimierten Sequenzparametern untersucht. Ausgehend von der kartesischen Datenakquisition der bestehenden 2D MRDefäkographie wurden zunächst dreidimensionale kartesische Trajektorien zur Datenakquisition und dafür geeignete Algorithmen zur Datenrekonstruktion untersucht. In diesem Zusammenhang wurde ein GRAPPA Centric-Out Akquisitionsschema in Kombination mit einer GRAPPA Datenrekonstruktion vorgestellt. Es zeigte sich jedoch, dass eine Stack-of-Stars Trajektorie in Bezug auf die stabile, rauscharme, dynamische Darstellung der Defäkation, vorteilhaft gegenüber der untersuchten kartesischen GRAPPA Centric-Out Trajektorie ist. Zur weiteren Optimierung der Messsequenz wurden daher drei radiale Stackof-Stars Akquisitionsschemata untersucht: Das Standard Stack-of-Stars Schema sowie zwei mit View-Sharing und zwei unterschiedlichen Dichtegewichtungen modifizierte Stack-of-Stars Schemata (DW-Sampling 1 und DW-Sampling 2). Das View-Sharing ermöglicht durch die Umstellung der Reihenfolge der akquirierten Partitionen nahezu eine Verdopplung der rekonstruierten Zeitpunkte der dynamisch gemessenen Zeitserie. Die Dichtegewichtung bewirkt, dass in den zentralen Partitionen mehr radiale Speichen gemessen werden und damit das k-Raum Zentrum dichter abgetastet wird als in den äußeren Partitionen. Beim Dichtegewichtungsschema DW-Sampling 2 ist der Abfall der Anzahl der innerhalb einer Partition gemessenen Speichen stärker als beim DW-Sampling 1. Trotzdem führte das mit View-Sharing und DW-Sampling 2 modifizierte Stackof-Stars Akquisitionsschema in Verbindung mit der FISTA Compressed Sensing Datenrekonstruktion zum besten Kompromiss zwischen erreichbarer räumlicher 69 und zeitlicher Auflösung. Dieses optimierte Setup ermöglicht die dynamische Darstellung der Defäkation in 7 Schichten eines vollständigen 3D Volumens mit einer Volumenaktualisierungsrate von 1,3s. Im Vergleich zur standardmäßig durchgeführten 2D MR-Defäkographie ist daher eine mehr als doppelt so große Abdeckung mit einer vergleichbaren zeitlichen Aktualisierungsrate und einer etwas geringeren räumlichen Auflösung gewährleistet. Hierdurch lassen sich zusätzlich zu den gewöhnlichen zentral gelegenen Pathologien auch lateral ausgeprägte Pathologien besser abdecken und diagnostizieren. N2 - Epidemiological studies estimated that the incidence of chronic obstructive diseases is up to 27% of the general population. Affected patients suffer from incomplete obstructed defecation and in many cases defecation is only possible with manual maneuvers. Functional pathologies that only arise during the defecation process are responsible for that. Therefore, for the diagnosis and evaluation of these pathologies an imaging technique is necessary, that allows to visualize the dynamic of the defecation process. The gold-standard to evaluate patients with functional pelvic floor disorders is the radiographic method of Entero-Colpo-Cysto Defecography (ECCD). Two major disadvantages of ECCD are the application of ionizing radiation in the pelvic floor region and the displeasing measurement procedure for the patients. Barium containing contrast agent has to be administered to rectum and vagina of the patient, barium and iodine containing contrast agents have to be administered to the small intestine and in addition the bladder has to be filled with iodine containing contrast agent. However MR-defecography uses no ionizing radiation and only requires a rectal filling with sonographic gel as contrast agent. In addition static MR images provide a detailed overview over the whole pelvic floor due to the high soft tissue contrast. But compared to other imaging modalities like ECCD MR imaging is slow and thus a high acceleration of the data acquisition is necessary to visualize the fast dynamic defecation process. In the standard 2D MR-defecography a regular twofold undersampling of the kspace is performed for acceleration. Hereby only 3 spatially separated 2D slices with a temporal update rate of about 1s can be acquired. Thus especially the detection of lateral localized pathologies is limited or even impossible. 72 Therefore, a 3D MR-defecography was developed, implemented and optimized by means of a study in 9 patients. The last 4 patients were investigated with the optimized parameters. Based on the Cartesian data acquisition of the standard 2D MR-defecography, 3D Cartesian trajectories for data acquisition and suitable algorithms for data reconstruction were evaluated. In this context a GRAPPA Centric-Out acquisition scheme in combination with a GRAPPA data reconstruction was presented. It turned out however, that a Stack-of-Stars trajectory is preferable to the proposed Cartesian GRAPPA Centric-Out trajectory in regard to a stable, low-noise and dynamic visualization of the defecation. Therefore, to further optimize the measurement sequence, three different Stackof-Stars data acquisition schemes were investigated: The standard Stack-ofStars scheme as well as the two with View-Sharing and Density-Weighting modified Stack-of-Stars schemes DW-Sampling 1 and DW-Sampling 2. ViewSharing allows to almost double the number of reconstructed time frames by changing the order of the acquired partitions. The Density-Weighting results in more radial spokes in the central partitions than in the outer partitions and thereby assures a denser sampling of the k-space center than in the kspace periphery. The undersampling factors in the outer partitions are higher in DW-Sampling 2 than in DW-Sampling 1. Nevertheless the Stack-of-Stars acquisition scheme modified with View-Sharing and DW-Sampling 2 in combination with a FISTA Compressed Sensing data reconstruction led to the best trade-off between achievable spatial and temporal resolution. This optimized setup allows the dynamic visualization of the defecation within 7 slices and a volume update rate of 1,3s. Compared to the standard 2D MR-defecography a more than doubled spatial coverage and a comparable temporal update rate are provided. This offers the possibility to cover and evaluate lateral localized pathologies additionally to the standard central localized pathologies. KW - Kernspintomografie KW - Defäkographie KW - Dynamische MR-Bildgebung KW - Radiale MR-Bildgebung KW - Stack-of-Stars Sequenz KW - Dichtegewichtung KW - Schnelle MR-Bildgebung KW - Dynamic MR imaging KW - radial MR imaging KW - fast MR imaging KW - Stack-of-Stars sequence KW - density weighting Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139762 ER - TY - THES A1 - Eberlein, Uta T1 - Zusammenhang zwischen physikalischer Dosimetrie und DNA Doppelstrangbrüchen in Lymphozyten nach Radionuklidtherapie T1 - Relationship between internal dosimetry and DNA double strand breaks in lymphocytes after radionuclide therapy N2 - In der nuklearmedizinischen Therapie werden Radiopharmaka meist systemisch verabreicht. Primär werden dafür, wegen der kurzen Reichweite, beta-Strahler eingesetzt. Als Folge davon verteilt sich das Radiopharmakon im Körper, reichert sich in Organen und Zielstrukturen an und bestrahlt somit den Körper intern, im Gegensatz zur externen Bestrahlung bei der Strahlentherapie. Das Verteilungsmuster der verabreichten Aktivität im Körper wird durch die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Radiopharmakons bestimmt. Außerdem sind die Aktivität und die Art der Anreicherung ausschlaggebend für die durch ionisierende Strahlung deponierte Energie im Körper, der Energiedosis. Gemeinsam haben externe und interne Bestrahlungsverfahren, dass der Patient ionisierender Strahlung ausgesetzt ist, die nicht nur die kranken Zellen zerstört, sondern auch gesunde Zellen schädigen kann. Dies geschieht durch direkte oder indirekte Wechselwirkung der Strahlung mit der DNA, die zur Schädigung der DNA-Struktur führt. Am häufigsten sind dabei Einzelstrangbrüche und Basenschäden. Die Doppelstrangbrüche sind im Vergleich zu Einzelstrangbrüchen und Basenschäden sehr selten aber sehr viel schädlicher für die Zelle, da die Reparatur komplizierter ist. Somit sind diese primär für den Zelltod oder für die Folgen nach fehlerhafter Reparatur verantwortlich. Eine sehr schnelle Antwort auf strahleninduzierte oder durch andere Stoffe, wie z.B. zytotoxische Substanzen, induzierte Doppelstrangbrüche ist die Phosphorylierung der Histon H2 Variante H2AX, die gamma-H2AX genannt wird. Zusätzlich reichert sich das Protein 53BP1 nach dem Erkennen eines Doppelstrangbruches durch Sensorproteine sofort am Chromatin, das den Doppelstrang umgibt, an. Damit ist 53BP1 ein weiterer Biomarker, der strahleninduzierte Doppelstrangbrüche sehr effektiv nachweisen kann und der auf sehr verlässliche Weise mit gamma-H2AX kolokalisiert. Mittels Immunfluoreszenzfärbung lassen sich gamma-H2AX und 53BP1 als umschriebene „Foci“, im Zellkern mikroskopisch darstellen und zählen. Unter der Annahme, dass ein Focus einem Doppelstrangbruch entspricht, kann die Anzahl der Foci im Zellkern als quantitativer Biomarker für DNA Doppelstrangbrüche und damit für die Strahlenexposition und Strahlenwirkung verwendet werden. Zudem zeigen Studien der Induktion von gamma-H2AX nach externer Bestrahlung von unterschiedlichen Gewebearten Linearität zwischen der Energiedosis und der Zahl der Foci im Zellkern. Weitere Studien beschäftigen sich mit den Auswirkungen externer Bestrahlung auf Patienten, aber nur wenige mit offenen radioaktiven Substanzen. Ziele dieser Arbeit waren daher: 1. Die Generierung einer bisher noch nicht beschriebenen in-vitro Kalibrierkurve nach interner Bestrahlung von Vollblut mit den in der Therapie eingesetzten beta-Strahlern. 2. Die gleichzeitige Bestimmung der physikalischen Dosis sowie der strahleninduzierten Anzahl der Foci in Lymphozyten, gewonnen aus Blutproben von Patienten nach Radiopeptidtherapie mit Lu-177 und Radioiodtherapie mit I-131. 3. Eine umfassende Beschreibung der Induktion und der Abnahme der Foci in den Lymphozyten aus den Blutproben der Patienten unter Einbeziehung der in-vitro Kalibrierung, um den dosis- und zeitabhängigen Verlauf der Anzahl der strahleninduzierten Foci zu bestimmen. Für die in-vitro Kalibrierung mit I-131 und Lu-177 wurden bei Probanden Blutproben gewonnen und mit unterschiedlichen Aktivitätskonzentrationen ergänzt. Das Ziel war, eine Energiedosis bis 100mGy zu erhalten. Das Ergebnis war, dass sich die Zahl der strahleninduzierten Foci in Abhängigkeit von der Energiedosis gut durch eine lineare Funktion beschreiben lässt, so wie es auch für die externe Bestrahlung bereits gezeigt wurde. Die Patientenstudien befassten sich mit dem Zusammenhang zwischen der im Blut deponierten Energiedosis und der Anzahl und dem zeitlichen Verlauf der induzierten Doppelstrangbrüche im peripheren Blut von Patienten unter Peptidrezeptor-Radionuklidtherapie mit Lu-177 DOTATATE/-TOC und Patienten unter Radioiodtherapie mit I-131 bei Ablationstherapien nach Operation eines differenzierten Schilddrüsenkarzinoms. Die durchschnittliche Anzahl induzierter DSB-Foci zeigte in den frühen Zeitpunkten einen linearen dosisabhängigen Anstieg. In den ersten Stunden nach Therapie stimmten die in-vitro Kalibrierung und die Zahl der strahleninduzierten Foci sowohl für Lu-177 als auch für I-131 für die Patientendaten gut überein. Die späteren Zeitpunkte werden durch eine Abnahme der Dosisrate und der Foci-Anzahl, bedingt durch Reparatur der DNA-Schäden, charakterisiert. Überstiegen die Blutdosiswerte in der ersten Stunde jedoch 20mGy (nur nach I-131-Gabe beobachtet), dann war die Induktion eines schnellen Reparaturprozesses festzustellen. Diese experimentellen Ergebnissen und Modellierungen beschreiben erstmalig die Dosisabhängigkeit und den zeitlichen Verlauf der in-vitro und in-vivo DNA-Schadensantwort nach Inkorporation von beta-emittierenden Radionukliden. N2 - In radionuclide therapy radiopharmaceuticals are administered mostly systemically. Primarily, beta-emitters are used because of their short range in tissue. As a result the radiopharmaceutical distributes within the human body and accumulates in organs and target structures. Thus, the body is irradiated internally, in contrast to external irradiation in radiotherapy. The pattern of the activity distribution within the human body is determined by the physical and chemical properties of the radiopharmaceutical. Furthermore, the amount of activity and its accumulation in organs or tissues is essential for the calculation of the absorbed dose which defines the energy deposited in the body by ionizing radiation. During internal or external irradiation, patients are exposed to ionizing radiation which does not only destroy the malignant cells but also damages healthy tissue and cells. This is mainly caused by direct and indirect interaction of the radiation with the DNA which damages the DNA structure. Most frequently, there are single strand breaks and base damages. DNA double strand breaks (DSBs) are rare; nevertheless, they are the most critical lesions for cells as repairing the damage is difficult. Unrepaired or misrepaired DNA could cause mutations, chromosomal aberrations or lead to cell death. The formation of a DNA DSB in nuclear chromatin results in the rapid phosphorylation of the histone H2 variant H2AX, then called gamma-H2AX. Furthermore, DSBs also recruit the damage sensor 53BP1 to the chromatin surrounding the DSBs, which leads to 53BP1 and gamma-H2AX co-localization in the chromatin surrounding a DSB. By immunofluorescence staining with gamma-H2AX and 53BP1 antibodies those biomarkers can be addressed by microscopically visible DNA damage protein foci, this is also known as the DNA damage focus assay. With progression of DSB repair, gamma-H2AX and 53BP1 foci disappear. It is assumed that one focus corresponds to one DSB. Therefore, the number of foci per cell can be used as a quantitative biomarker for DNA double strand breaks and hence for radiation exposure and radiation effects. Most studies dealing with the DNA damage focus assay performed in the last years were looking only on the effect of external irradiation after external radiation therapy or after diagnostic radiology procedures, but only few with the effects after administration of radiopharmaceuticals. Therefore, the aims of this thesis were: 1. To develop a method to generate an in-vitro calibration curve for the DSB focus assay after internal irradiation with beta-emitting radionuclides by creating a low dose and low dose-rate blood irradiation situation in-vitro, at dose-rates that are similar to the ones that have been observed in nuclear medicine patients. 2. To determine the absorbed dose and the number of radiation-induced foci in lymphocytes by sampling blood from patients after radiopeptide therapy with Lu-177 and radioiodine therapy with I-131. 3. To describe comprehensively the temporal and dose-dependent behavior of the DNA damage focus assay in radiation treatment-naive patients after their first radionuclide therapy using the results of the in-vitro calibration. For the in-vitro calibration with I-131 and Lu-177 blood samples For the in-vitro calibration with I-131 and Lu-177 blood samples were drawn from volunteers. Different activity concentrations were added to the samples for achieving absorbed doses up to 100mGy. As a result it was shown that the number of radiation-induced foci were linearly dependent of the absorbed dose. This is the same result that has been shown after external irradiation. The patient studies addressed the relationship between the absorbed dose to the blood and the number and temporal behavior of radiation-induced DNA double strand breaks in peripheral blood samples under radiopeptide therapy and under radioiodine therapy. The average number of radiation-induced foci showed a linear dose-response relationship within the first hours after administration of the radiopharmaceutical. The slope of the in-vitro calibration curve was in good agreement with the slopes of the linear functions fitted to the in-vivo data for Lu-177 and I-131. Later time points were characterized by a diminishing number of radiation-induced foci which was in accordance with the progression of DNA repair and the declining dose rates. Most patients treated with I-131 exceeded 20mGy in the first hour and in these patients the onset of a fast repair component was observed. With the experimental results and model calculations presented in this work, for the first time a dose-response relationship and a description of the time course of the in-vitro and in-vivo damage response after internal irradiation of beta-emitters could be established. KW - DNS-Doppelstrangbruch KW - gamma-H2AX KW - 53BP1 KW - DNA Doppelstrangbrüche KW - Dosimetrie KW - Medizinphysik KW - Radionuklidtherapie KW - Nuklearmedizin KW - DNA double strand breaks KW - dosimetry KW - medical physics KW - radionuclide therapy KW - nuclear medicine KW - Dosimetrie KW - Radionuklid KW - Therapie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120440 ER - TY - THES A1 - Wagner, Julia T1 - Untersuchung von Rezeptoren und G-Proteinen mittels Einzelmolekülfluoreszenztechniken T1 - Investigation of receptors and G-proteins using single molecule fluorescence techniques N2 - In dieser Arbeit wurden Einzelmolekültechniken zur Untersuchung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und G-Proteinen in der Zellmembran lebender Zellen etabliert und angewendet. GPCR stellen die größte Familie membrangebundener Rezeptoren dar und leiten Signale über heterotrimere G-Proteine in das Zellinnere weiter. Auch wenn jüngst sowohl inaktive, als auch aktive Konformationen von GPCR und G-Proteinen mittels Röntgenstrukturanalyse aufgelöst werden konnten, sind die Dynamiken ihrer Aktivierung und Deaktivierung bisher nur bruchstückhaft bekannt. In der Vergangenheit wurden die Schritte der Signalkaskade, beginnend mit der Bindung des Rezeptorliganden bis hin zur Bildung von sekundären Botenstoffen, erfolgreich mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Techniken aufgeklärt. Diesen experimentell bestimmten Aktivierungszeiten stehen Daten aus Modellierungsstudien gegenüber, die sehr viel schnellere Konformationsänderungen vorhersagen, welche bereits in Studien mittels Kernspinresonanzspektroskopie nachgewiesen werden konnten. Folglich ist anzunehmen, dass die Zeitdomäne, innerhalb der die Aktivierung der GPCR stattfindet, sehr breit gefächert ist. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diese mehrere Größenordnungen umfassenden Zeitskalen der GPCR-Aktivierung, welche in der Literatur beschrieben werden, mittels bildgebender Einzelmolekülverfolgung (SPT) und Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) zu untersuchen. Beide Verfahren liefern durch Einzelmolekülspuren oder Korrelationskurven eine Art Fingerabdruck des dynamischen Verhaltens des untersuchten Systems, was jeweils mit Vor- und Nachteilen verbunden ist. Die Stärke der Techniken zeigte sich bei dem vorliegenden Projekt vor allem in ihrer Kombination: Die klassische FCS bietet die Möglichkeit, Dynamiken über einen weiten Zeitraum von Mikrosekunden bis Sekunden auszuwerten, allerdings nur innerhalb eines kleinen, optisch definierten Detektionsvolumens. Die bildgebende Einzelmolekülverfolgung liefert hingegen ein großes Sichtfeld und ermöglicht somit die parallele Analyse vieler Einzelmolekülereignisse über die Zelle verteilt, jedoch auf Kosten der Zeitauflösung. Durch die Anwendung von SPT und FCS konnte in dieser Arbeit ein Zeitbereich der Rezeptor- (und G-Protein-) Dynamiken von Mikrosekunden bis Sekunden gefunden und diskutiert werden. Um die selektive Anregung der Plasmamembran zu gewährleisten, wurde die Interne Totalreflexionsfluoreszenzanregung verwendet. Diese eignet sich ideal als Grundlage für die spätere Analyse mittels SPT und FCS, welche komplementär nutzbar sind und mit dem gleichen zellulären Assay und unter Verwendung der gleichen Fluoreszenzmarker betrieben werden können. Die Studie am Beispiel der α2A- und β2-adrenergen Rezeptoren sowie des Gαi1-Proteins demonstrierte das enorme Potential dieser Einzelmolekültechniken für die Untersuchung von GPCR und skizziert die Komplexität deren Dynamik, wie sie auch durch neueste Modellierungsstudien vorhergesagt wird. N2 - In this work single molecule techniques for the investigation of G-protein coupled-receptors (GPCR) and G-proteins in living cells were established and applied. GPCR constitute the largest family of membrane bound receptors and transduce extracellular stimuli via heterotrimeric G-proteins. Very recently inactive as well as active conformations of GPCR and G-proteins have been deduced from X-ray crystallography. Nevertheless, only little is known about the dynamics of receptor activation and deactivation. Techniques based on Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) have allowed for the study of the GPCR signaling cascade from ligand binding up to second messenger generation. However, the reported activation times based on such FRET investigations seem to contradict data from molecular modelling studies which predict much faster conformational changes and are supported by recent Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy data. Thus, the timescale of GPCR activation remains actively debated, and is quite likely widely spread. One objective of this work was to experimentally probe this orders-of-magnitude broad time scale for GPCR activation reported in the literature using Single Particle Tracking (SPT) and Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). By directly probing the dynamic behavior via both single particle traces and correlation curves, the advantages and disadvantages offered by each technique can be compensated. In combination SPT and FCS pool forces: Classical FCS allows evaluating dynamics within a broad time domain from the microsecond to the second range. The compromised small ‘field of observation’ comes with the advantage of high temporal resolution. By contrast, SPT allows parallel analysis of many single receptor or G-protein events distributed over at least the dimension of a single cell, however with lower temporal resolution. In this study the application of FCS and SPT allowed for the detection of receptor (and G-protein) dynamics. Selective illumination of the plasma membrane was achieved by using Total Internal Reflection Fluorescence. Data was subsequently analyzed by SPT as well as FCS, both methods working with the same cellular assay as well as fluorescent probes. Exemplarily investigating the α2A- and β2-adrenergic receptor as well as the Gαi1-protein, uncovers a wide timescale of receptor dynamics from microseconds to seconds, closing the gap between times that already could have been solved with other fluorescent techniques such as FRET. This study reveals the enormous potential of single molecule methods for the investigation of GPCR and delineates the complexity of GPCR dynamics as recently predicted by molecular modelling. KW - G-Protein-gekoppelte Rezeptoren KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - single particle tracking Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118281 ER - TY - THES A1 - Endres, Marcel Matthias T1 - LASP1 reguliert die Genexpression und Sekretion von Matrix-Metalloproteasen in Brustkrebszellen T1 - LASP1 regulates the gene expression as well as the secretion of matrix-metalloproteases in breast cancer cells N2 - Migration und Tumorzellinvasion erfordern die vorhergehende Degradation der umliegenden Extrazellulärmartrix (EZM). Dieser Umbauprozess erfolgt primär durch proteolytische Endopeptidasen, sog. Matrix-Metalloproteasen (MMPs). Damit diese ihre funktionelle Aktivität ausüben können, müssen sie zunächst rekrutiert und mit Hilfe podosomaler bzw. invadopodialer Strukturen in die EZM sezerniert werden. Das LIM und SH3 Domänen Protein 1 (LASP1), ein neu in Podosomen von Makrophagen identifiziertes regulatorisches Gerüstprotein, beeinflusst, neben Größe, Anzahl und Beständigkeit von Podosomen, in hohem Maße die Matrixdegradationskapazität der Zelle. Auch in invasiven Brustkrebszellen wurde eine Lokalisation von LASP1 an Invadopodien, den Podosomen-äquivalenten Strukturen, detektiert. Das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die funktionelle Charakterisierung von LASP1 in Invadopodien. Unter Etablierung eines Matrix-Degradations-Assays konnte gezeigt werden, dass eine Herunterregulation von LASP1 auch in der humanen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231, die zuvor schon für Makrophagen gezeigte Matrixdegradation nachhaltig beeinträchtig. Durch Analyse und Verifikation von zugänglichen Mikroarraydaten mittels qRT-PCR und Western Blot konnte ferner belegt werden, dass LASP1 in den Brustkrebszellen die Genexpression und Proteintranslation von MMP1, -3 und -9 positiv moduliert und somit das gesamt-invasive Potential der Zelle steigert. Darüber hinaus deuten Zymogramme und die Analyse des konditionierten Mediums darauf hin, dass LASP1 als Strukturprotein die vesikuläre Sekretion der inaktiven Zymogene (proMMPs) in die EZM fördert. Demzufolge modifiziert LASP1 während der Krebsprogression die zelluläre Mikroumgebung zugunsten einer erhöhten Metastasierungsrate. Die neu identifizierte regulatorische Funktion von LASP1 auf die Transkription sowie Sekretion von Matrix-Metalloproteasen erklärt die in früheren Arbeiten beobachtete Korrelation zwischen einer erhöhten LASP1 Konzentration im Gewebe und dem vermehrten Auftreten von Metastasen, und damit einhergehend, schlechteren Überleben der Patientinnen. N2 - The process of migration and tumor invasion requires the degradation of the surrounding extracellular matrix by proteolytic endopeptidases, called matrix-metalloproteases (MMPs). Therefore, cells form protrusive invadopodia or podosomes that recruit and secret MMPs to degrade the basement membrane. The LIM and SH3 protein 1 (LASP1) was recently identified as a new scaffolding protein in podosomes of macrophages. Knockdown of LASP1 affected size, number and lifetime of the podosomes and moreover, inhibited matrix degradation capacity. The main objective of the presented dissertation was to characterize the function of LASP1 in invadopodia of cancer cells. By establishing a matrix-degradation-assay, we demonstrated that down-regulation of LASP1 impaired matrix-degradation in MDA-MB-231 breast cancer cells, an effect earlier observed in macrophages. By analyzing and verifying accessible microarray data sets we observed regulation of MMPs by LASP1. qRT-PCR and Western Blot experiments confirmed that LASP1 positively modulates gene expression and translation of MMP1, -3 and -9, and thereof enhances cellular invasion. Furthermore, zymography and analysis of the conditioned medium revealed cytosolic LASP1 promotion of MMP vesicle secretion into the extracellular matrix, thus altering the microenvironment during cancer progression. In summary, the newly identified role of LASP1 in regulating matrix degradation by affecting MMP transcription and secretion elucidated the migratory potential observed in former studies that described upregulation of LASP1 in metastatic cancer cells. KW - Brustkrebs KW - Genexpression KW - Sekretion KW - Metalloproteasen KW - LASP1 (LIM und SH3 Protein 1) KW - LASP1 (LIM and SH3 Protein 1) KW - MMP (Matrix-Metalloproteasen) KW - MMP (Matrix-Metalloproteases) KW - Matrix-Metalloproteasen Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136733 ER - TY - THES A1 - Röhrig, Florian T1 - Verbesserung der Medikamenteneinbringung in solide Tumoren durch Modifikation der extrazellulären Matrix T1 - Improving drug delivery into solid tumors by modification of the extracellular matrix N2 - Bei der Behandlung solider Tumoren spielen systemisch verabreichte Chemotherapeutika eine wich- tige Rolle. Allerdings akkumulieren diese Therapeutika besser in normalem Gewebe als in Tumoren. Als Ursache für diesen unzureichenden Transport von Medikamenten in den Tumor wurde bisher vor allem die dysfunktionale Tumorvaskulatur diskutiert. Diese befindet sich in einem chaotischen und unreifen Zustand ohne ausreichende Bedeckung der Gefäße mit stabilisierenden Perizyten. Aus dem Zustand der Vaskulatur resultierend erreichen Medikamente den Tumor nur in geringem Ausmaß und werden dort heterogen verteilt. Als Grund für den Zustand der Vaskulatur wur- de ein großer Überschuss an pro-angiogenetischen Faktoren im Tumor ausgemacht. Durch eine anti-angiogenetische Behandlung konnte in präklinischen Modellen für einen gewissen Zeitraum die Tumorvaskulatur „normalisiert“ werden. Dies zeichnete sich vor allem durch Veränderung von zwei wichtigen Parametern für die Medikamenteneinbringung aus: zum Einen kommt es zu einer Reduktion der Gefäßdichte. Zum Anderen zu einer Reifung der Blutgefäße. In einem Teil von Pati- enten scheint dabei der Effekt der Gefäßverbesserung zu überwiegen und es kann eine verbesserte Perfusion detektiert werden. Mutmaßlich führt dies auch zu einer verbesserten Einbringung von Therapeutika in den Tumor und so zu einer erhöhten Effizienz der Therapie. In einem weiteren Teil der Patienten scheint jedoch der Effekt der Gefäßreduktion zu überwiegen und die detektierte Perfusion im Tumor wird durch die Behandlung verringert. Das in dieser Arbeit verwendete MT6-Fibrosarkom-Modell reagierte auf eine anti-angiogenetische Therapie nicht mit einer sonst in murinen Modellen beobachteten Wachstumsreduktion. Die- se ermöglichte eine so bisher nicht mögliche Untersuchung der sekundären Effekte einer anti- angiogenetischen Therapie wie die Medikamenteneinbringung in den Tumor. Die Vaskulatur in MT6-Tumoren zeigte dabei nach einer anti-angiogenetischen Vorbehandlung, die erwarteten Merk-male einer „normalisierten“ Vaskulatur wie eine Reduktion der Gefäßdichte bei gleichzeitiger Rei- fung der verbleibenden Gefäße. Dies führte jedoch nicht zu einer verbesserten Effizienz einer subsequenten Chemotherapie. Durch Vergleich mit einem weiteren Tumor-Modell, dem 4T1-Modell für ein metastasierendes Mammakarzinom, konnten signifikante Unterschiede im Gefäßbild beider Modelle ausgeschlossen werden. Durch mikroskopische Methoden konnte dabei beobachtet werden, dass die Diffusion von Medikamenten aus den Blutgefäßen des MT6-Modells im Vergleich zum 4T1-Modell verringert war. Weitere Untersuchungen deuten auf eine Differenz in der Qualität der extrazellulären Matrix der verwendeten Tumor-Modelle. Durch mRNA-Expressionsanalysen konnte die Enzymfamilie der Lysyloxidasen als mögliche Ursache für diesen Diffusionsunterschied identi- fiziert werden. Lysyloxidasen katalysieren vor allem die Quervernetzung von Proteinen der Extra- zellulärmatrix. Im Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Quervernetzung von Matrixproteinen durch Lysyloxidasen ursächlich für die Diffusions-Inhibierung kleiner Moleküle wie das Chemo- therapeutikum Doxorubicin sein kann. Durch spezifische Inhibition der Lysyloxidasen mittels des Inhibitors βAPN konnte diese Diffusions-Inhibition sowohl in vitro als auch im MT6-Tumor-Modell nahezu vollständig verhindert werden. Die hohe Aktivität von Lysyloxidasen im MT6-Modell stell- te allerdings kein Alleinstellungsmerkmal dieses Modells dar. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Lysyloxidasen in einer Vielzahl von murinen und humanen Tumorzelllinien überexprimiert wird. Die Inhibition von Lysyloxidasen durch βAPN konnte dabei in allen unter- suchten Modellen die Einbringung von Medikamenten in den Tumor erhöhen und könnte so eine sinnvolle adjuvante Maßnahme zur Verbesserung bestehender Chemotherapien darstellen. N2 - Systemically administered chemotherapeutics play a major role in in the treatment of so- lid tumors. However, these chemotherapeutics accumulate better in healthy tissue than in tumors. The reason for this insufficient transport of drugs into the tumor could be the dysfunctional tumor vasculature, which is in a chaotic and immature state without an adequate vessel coverage by stabilizing pericytes. As a result of this vasculature, only small amounts of drugs reach the tumor and are further just heterogeneously distributed. A great abundance of pro-angiogenic factors in the tumor was believed to cause this insufficient vasculature. In pre-clinical models, „normalization“ of the tumor vasculature could be achieved with anti-angiogenic therapy for a certain period of time. This was characterized by changes in two important parameters for drug administration: on the one hand reduction of vessel density, on the other hand maturation of blood vessels. In one part of patients, the effect of vessel normalization seems to be predominant leading to improved perfusion. Presumably, this leads to improved administration of chemotherapeu- tics into the tumor and therefore to a more efficient therapy. In another part of patients, the effect of vessel reduction seems to be predominant and the detectable perfusion in the tumor is decreased. The MT6 fibrosarcoma model, which was used in this work, did not respond to the anti-angiogenic therapy with an inhibition of tumor growth as usually observed in murine models. This observation enabled a so far not possible investigation of the secondary effects of an anti-angiogenic therapy, such as drug transport into the tumor. After the anti-angiogenic pre-treatment, the vasculature of MT6 tumors indicated the expected characteristics of a „normalized“ vasculature, such as reduction of vessel density and simultaneous maturation of remaining vessels. However, this did not lead to improved efficacy of subsequently administered chemotherapy. Comparison with another tumor model, the 4T1 model for metastasizing mamma carcinoma, did not reveal signifi- cant differences in the vessel pattern. Observation with microscopic methods indicated a reduced diffusion of drugs from the blood vessels of the MT6 model compared to those of the 4T1 model. Further investigations showed differences in the quality of the extracel- lular matrix of both used tumor models. mRNA expression analyses revealed the family of lysyl oxidases as a putative cause for the differences in diffusion. Lysyloxidases catalyze primarily the cross-linking of proteins of the extracellular matrix. Moreover, it was shown that the cross-linking of matrix proteins by lysyl oxidases is causative for the inhibition of diffusion of small molecules such as the chemotherapeutic doxorubicin. A specific inhibi- tion of lysyl oxidases with the inhibitor βAPN could almost entirely prevent the inhibition of diffusion in vitro and in the MT6 model. However, the high activity of lysyl oxidases in the MT6 model is not a unique feature of this model. Further investigations showed, that lysyl oxidases are over expressed in many human and murine tumor cell lines. In all investigated models, inhibition of lysyl oxidases with βAPN improved drug transport into the tumor and βAPN could therefore be a reasonable adjuvant therapy to improve the efficacy of already existing chemotherapeutics. KW - Lysin-Oxidase KW - Tumor KW - Angiogenese KW - Chemotherapie KW - extrazelluläre Matrix KW - Lysyloxidasen KW - Tumor KW - extrazelluläre Matrix KW - Lysyl oxidases KW - Tumour KW - extracellular matrix Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117381 ER - TY - THES A1 - Volkert, Julia T1 - Identifikation kognitiver Subgruppen bei der bipolaren Störung und Evaluation eines kognitiven Remediationsprogramms T1 - Identification of cognitive subgroups in bipolar disorder and evaluation of a cognitive remediation program N2 - Die bipolare Störung ist eine psychische Erkrankung, die sich durch wiederkehrende depressive und (hypo-) manische Phasen auszeichnet. Neben Stimmungsschwankungen leiden viele Patienten unter kognitiven Beeinträchtigungen, die nicht nur während akuter Episoden, sondern auch in der Remission, d.h. in euthymer Stimmungslage persistieren. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit den klinischen Korrelaten von kognitiven Defiziten und der Effektivität eines kognitiven Trainings bei bipolaren Patienten (BP). In der ersten Teilstudie wurde untersucht, wie sich die kognitive Leistung der Patienten von der akuten Phase bis zur Remission verändert. Dazu wurden 55 akut depressive und (hypo-) manische BP und 55 gesunde Kontrollpersonen wiederholt mit einer neuropsychologischen Testbatterie untersucht. 29 Patienten konnten nach mindestens 3-monatiger Remission erneut getestet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die akut kranken BP domänenübergreifend kognitive Störungen im Vergleich zu gesunden Kontrollen aufweisen, wobei die depressiven Patienten eher in der Verarbeitungsgeschwindigkeit, der Aufmerksamkeit und dem Gedächtnis beeinträchtigt waren. Die akut manischen Patienten hatten hingegen auffällige Defizite in den exekutiven Funktionen. Die Performanz der BP besserte sich zwar in der Remission, es waren aber weiterhin im Vergleich zu den Kontrollen Defizite in der psychomotorischen Geschwindigkeit, dem Arbeitsgedächtnis und dem verbalen Gedächtnis festzustellen. Es zeigte sich außerdem, dass die Verarbeitungsgeschwindigkeit, die Aufmerksamkeit und das verbale Gedächtnis in Zusammenhang mit subdepressiven Symptomen und Schlafstörungen standen, wohingegen die exekutiven Testmaße nicht mit diesen „State“-Faktoren assoziiert waren. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die exekutiven Funktionen als Trait-Merkmale der bipolaren Störung in Frage kommen, wohingegen Aufmerksamkeit und Gedächtnis durch das Vorliegen von Residualsymptomen beeinträchtigt sind. Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, eine kognitive Defizit- vs. Nondefizit Subgruppe innerhalb der BP zu identifizieren, um herauszufinden welche soziodemographischen oder krankheitsrelevanten Charakteristika mit kognitiven Störungen in Zusammenhang stehen. Dazu wurde die neuropsychologische Testleistung von 79 euthymen BP und 70 gesunden Kontrollen verglichen. Es zeigte sich erwartungsgemäß, dass die BP in der psychomotorischen Geschwindigkeit, der Aufmerksamkeit, dem Arbeitsgedächtnis, dem verbalen Gedächtnis, der Wortflüssigkeit und dem problemlösenden Denken trotz stabiler Remission signifikant schlechtere Leistungen erbrachten als die gesunden Kontrollen. Im Anschluss wurde die bipolare Stichprobe anhand ihrer Testleistung in eine Defizit- und eine Nondefizit Gruppe aufgeteilt. Die Ergebnisse zeigen, dass 54% der BP in allen Tests eine völlig normgerechte Leistung erbrachten. Die Studie bestätigte demnach, dass nicht alle Patienten kognitive Defizite aufweisen, sondern Subgruppen bestehen, die sich in verschiedenen Variablen voneinander unterscheiden: Die Defizit-Subgruppe berichtete signifikant mehr subdepressive Symptome und es lagen häufiger persistierenden Schlafstörungen und die Diagnose einer komorbiden Erkrankung vor (Angststörung, ADHS und Migräne). Zudem zeigte sich ein Zusammenhang zwischen Polypharmazie und kognitiven Defiziten. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass ein Teil der kognitiven Störungen bei BP durch eine nicht vollständige Remission und sekundäre Symptome bedingt sind. Es ergab sich keine Assoziation zwischen kognitiver Leistung und krankheitsrelevanten Variablen, wie z.B. Anzahl der Phasen, Bipolar-Subtyp oder Ersterkrankungsalter. Diese Daten widersprechen zwar nicht der Hypothese, dass kognitive Störungen durch neurodegenerative Prozesse bedingt sind, sie weisen jedoch darauf hin, dass bei der bipolaren Störung häufig Residualsymptome vorliegen, welche im Rahmen von Studie als auch bei der therapeutischen Arbeit stärker als bisher berücksichtigt werden müssen. In beiden Teilstudien zeigte sich zudem, dass kognitive Störungen mit einem reduzierten psychosozialen Funktionsniveaus in Verbindung stehen. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit bisherigen Untersuchungen, die berichten, dass Patienten mit kognitiven Defiziten soziale und berufliche Einschränkungen aufweisen, die wiederum mit einem schlechteren Krankheitsverlauf assoziiert ist. Aufgrund dessen wurde von einigen Autoren vorgeschlagen, mit Hilfe spezieller Interventionen wie der kognitiven Remediation (KR) die geistigen Funktionen zu rehabilitieren. In der vorliegenden Interventionsstudie wurde deshalb der Frage nachgegangen, ob die neurokognitive Leistungsfähigkeit und das psychosoziale Funktionsniveau der bipolaren Stichprobe durch KR verbessert werden kann. Zudem sollte untersucht werden, inwiefern kognitives Training zu Veränderungen der präfrontalen Hirnaktivität führt. Dafür wurde vor und nach dem Training eine Messung mit der Methode der funktionellen Nahinfrarotspektroskopie (fNIRS) durchgeführt. Das 3-monatige KR-Programm bestand aus einem computerisierten kognitiven Training und der Vermittlung von kognitiven Skills im Rahmen von 12-wöchentlichen Gruppensitzungen. Im Anschluss an das Training wurden die Teilnehmer (26 bipolare und als Vergleichsgruppe 13 unipolare Patienten) im Rahmen einer Post-Messung wiederholt untersucht. Zudem wurde zum Vergleich eine Kontrollgruppe von 10 BP im Abstand von 3 Monaten untersucht, die keine Intervention, sondern die Standardbehandlung erhielt. Aufgrund zahlreicher Drop-Outs konnten am Ende des Erhebungszeitraums die Daten von 16 bipolaren und 10 unipolar depressiven Patienten ausgewertet werden. Die Trainingsteilnehmer erbrachten im Gegensatz zu der Kontrollgruppe signifikante Leistungssteigerungen in den Tests zur Erfassung der psychomotorischen Geschwindigkeit, dem Arbeitsgedächtnisses, dem verbalen Gedächtnis und dem problemlösenden Denken. Zudem zeigte sich nach dem Training eine Verbesserung des psychosozialen Funktionsniveaus und eine Reduktion der subdepressiven Symptomatik. Eine Veränderung der präfrontalen Hirnaktivierung konnte jedoch nicht verifiziert werden. Die Ergebnisse lassen demnach schlussfolgern, dass Patienten mit affektiven Störungen von einem kognitiven Training profitieren, wobei die damit einhergehenden funktionalen Veränderungen der Hirnaktivität in Studien mit größeren Stichproben untersucht werden müssen. N2 - Bipolar disorder is a recurrent and highly disabling affective disorder characterized by mood instability as well as cognitive disturbances. Considerable evidence has demonstrated that neuropsychological deficits are prevalent both during acute episodes and euthymia. Recent studies verified cognitive impairments during euthymia with deficits up to one standard deviation below average in psychomotor speed, attention, working memory, long term memory and executive functioning. Up to now, the mechanisms behind why some bipolar patients (BP) do not reach their former level of cognitive performance and psychosocial functioning while others remit completely, are not understood. In the first part of this doctoral thesis a longitudinal study was conducted which aimed to characterize changes in cognitive functioning from acute illness to remission in BP. For this purpose, 55 acutely admitted BP (35 depressed, 20 hypo-/ manic) and 55 healthy controls (HC) were tested with an extended neuropsychological test battery (attention, working memory, verbal memory and executive functioning). The measurement was repeated after three month of remission in 29 BP and 55 controls. The results showed global impairments in acutely admitted BP compared to HC. In particular, depressed patients showed a characteristic psychomotor slowing while (hypo-) manic patients had severe deficits in working memory and frontal-executive functions. During remission, cognitive functions in BP partially recovered while psychomotor speed, working memory and verbal memory were still impaired. Furthermore, it was shown that “state” factors such as subclinical symptoms and persisting sleep disorder were significantly associated with speed, attention and verbal memory. In contrast, working memory was correlated with psychotic symptoms (life time), indicating this cognitive domain as trait-related. Therefore, the results of this study indicate that residual symptoms could be potential confounders in studies on cognition and the search for cognitive endophenotypes in BD. However, to clarify trait vs. disease process effects in cognition in BD, more studies with a prospective design are needed. The second study of the present thesis aimed to identify a “cognitive deficit vs. non-deficit” subgroup within BD to find clinical correlates of cognitive impairments. Therefore, the neuropsychological test performance of 79 euthymic outpatients (BD-I and II) was compared to 70 matched, healthy controls. As expected, the sample of euthymic BP performed significantly worse than controls in psychomotor speed, divided attention, working memory, verbal memory, word fluency and problem solving. However, 54 % of the patients did not have any neurocognitive deficits at all, and whether or not a patient belonged to the non-deficit group was not influenced by disease severity (e.g. number of previous episodes, duration of illness, age of onset or bipolar subtype). Instead, our results demonstrated that patients suffering from persistent sleep disturbances and sub-threshold depressive symptomatology show more severe cognitive dysfunctions. In addition, comorbid disorders like anxiety, ADHD and migraine were associated with cognitive deficits. Furthermore, polypharmacy seemed to have a negative influence on cognitive functioning in BP. In sum, these results suggest that a major part of cognitive impairment in bipolar disorder is due to partial remission and secondary symptoms, especially sleep disorder and sub-syndromal depression. Even though our results do not disprove the idea of neurodegenerative processes in bipolar disorder, our data underscore the importance of residual symptoms. This has implications for future research and calls for the improvement of treatment options for cognitively impaired BP. The results of both studies reported above, showed an association between cognitive deficits and low psychosocial functioning. This is in line with previous studies showing strong associations between cognitive impairment and low social or occupational functioning which has in turn negative effects on illness progression. Therefore, many researchers suggest interventions not only to improve affective symptoms, but also cognitive dysfunctions. Cognitive remediation (CR) is a new psychological treatment specifically targeting cognitive functioning and coping skills, which is commonly assessed in patients with schizophrenia. Although BP have less severe, but similar cognitive deficits compared to patients suffering from schizophrenia, there is only little evidence on the efficacy of CR programs in patients with affective disorders. In the present thesis we developed a tailored CR program to evaluate the effect on the patients’ objective neuropsychological performance and everyday psychosocial functioning. Furthermore, we assessed the effect of CR on neural activity. For this purpose we applied functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) to measure frontal cortex activation prior and after CR. The CR program was composed of 12 group sessions which were conducted weekly. It consisted of a computerized training of several cognitive functions and a cognitive-skills part including mindfulness-based strategies as well as memorizing, problem solving, verbal reasoning, planning, organization in daily life and effective communication techniques. 39 bipolar und unipolar depressive patients took part in the cognitive training, however, due to several drop-outs only 26 patients could be measured again after the training. A comparable control group consisting of 10 BP was measured at baseline and follow-up after three month of treatment. Within the patient group a significant improvement of cognitive performance after cognitive training could be assessed: Compared to the control group, BP showed an improved performance in divided attention, working memory, verbal memory and problem solving after the CR program; unipolar depressive patients additionally improved in psychomotor speed and susceptibility to interference. Both bipolar and unipolar patients showed a higher psychosocial functioning and a reduction of subdepressive symptoms after the CR program. However, we did not reveal any pre-post changes in neural activity of the prefrontal cortex as measured by fNIRS. Therefore, our results demonstrate that patients with affective disorders benefit from CR with regard to mood symptoms and neurocognitive/ psychosocial functioning. However, the relation between behavioral changes and changes in functional activation following CR requires further studies. KW - Manisch-depressive Krankheit KW - Kognition KW - bipolare Störung KW - bipolar disorder KW - kognitive Defizite KW - kognitive Remediation KW - cognitive deficits KW - cognitive remediation KW - Kognitive Störung Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116695 ER - TY - THES A1 - Wiegner, Armin T1 - Auswirkungen der gepaarten Stimulation des Hörnerven und des Nervus vagus auf die spektrale Plastizität im auditorischen Kortex der mongolischen Wüstenrennmaus T1 - Effects of paired stimulation of auditory nerve and vagus nerve on spectral plasticity in auditory cortex of the Mongolian gerbil N2 - Das Cochlea-Implantat (CI) ermöglichte bereits >300 000 hochgradig hörgeschädigten Menschen weltweit eine grundsätzlich wiederhergestellte Hörfunktion. Es wird angenommen, dass sich das Sprachverständnis von CI-Trägern verbessert, wenn die funktionale Trennung der CI-Kanäle erhöht wird. Neben verschiedenen auf die auditorische Peripherie beschränkten Ansätzen gibt es Überlegungen, eine verbesserte Kanaltrennung durch die Rehabilitation taubheitsinduzierter Degenerationen in der spektralen Verarbeitung im zentralen auditorischen System zu erreichen. Es konnte in ertaubten Tieren bislang allerdings kein adäquates CI-Stimulationsmuster beschrieben werden, dass es erlaubte, eine gezielte neuronale Plastizität in der spektralen Verarbeitung zu induzieren. Die Arbeitsgruppe um M.P. Kilgard (UT Dallas, USA) zeigte in mehreren Studien in hörenden Tieren, dass auditorische Stimulation gepaart mit elektrischer Vagusnerv-Stimulation (VNS) zu einer gezielten kortikalen Plastizität führt. Diese gepaarte Stimulation konnte die spektrale Verarbeitung von Signalen im auditorischen Kortex (AC) gezielt beeinflussen und so z.B. pathologisch verbreiterte Repräsentationen von Tönen wieder verfeinern. Dieses hochgradige Potential für gezielte Plastizität im AC durch die gepaarte VNS scheint eine vielversprechende Lösung darzustellen, um die durch verbreiterte Repräsentation im ertaubten AC verminderte CI-Kanaltrennung zu verbessern. Vor diesem Hintergrund sollte in der vorliegenden Promotion die Übertragbarkeit dieses hochgradigen Potentials auf das ertaubte und CI-stimulierte auditorische System evaluiert werden. Um die CI-Kanaltrennung zu untersuchen, wurde ein Multikanal-CI für die Mongolische Wüstenrennmaus (Gerbil) entwickelt. Trotz der kleinen Ausmaße von Cochlea und AC im Gerbil und der generell breiten neuronalen Erregung durch intracochleäre elektrische Stimulation konnte eine tonotop organisierte und selektive Repräsentation der neuronalen Antworten für mehrere CI-Kanäle im AC nachgewiesen werden. Für die gepaarte CI/VN-Stimulation wurden die Tiere zusätzlich mit einer Manschettenelektrode um den linken zervikalen Nervus vagus (VN) implantiert. Die chronischen Implantate erlaubten über mehrere Wochen hinweg eine stabile und zuverlässige elektrische Stimulation im frei-beweglichen Gerbil. Damit kombiniert das in dieser Promotion entwickelte Multikanal-CI-VNS-Modell die Vorteile einer tonotop selektiven und stabilen neuronalen Aktivierung mit den ethischen, kostenrelevanten und entwicklungsbezogenen Vorteilen, die der Einsatz von Kleinnagern bietet. Als nächster Schritt wurde das grundsätzliche Potential der gepaarten CI/VN-Stimulation für gezielte plastische Veränderungen im AC des Gerbils getestet. Engineer et al. (2011) hatten bereits in akustischen Studien in hörenden Ratten die kortikale Überrepräsentation eines einzelnen chronisch mit VNS gepaarten Tones gezeigt. In der vorliegenden Promotion wurde versucht, die Ergebnisse aus der akustischen Studie in hörenden Ratten in zwei verschiedenen Studien im Gerbil zu reproduzieren. Analog zur gepaarten Ton/VN-Stimulation in der Ratte untersuchten wir zuerst in ertaubten Gerbils die Auswirkungen einkanaliger CI-Stimulation gepaart mit VNS. Im AC des Gerbils konnten keine Veränderung der zentralen Repräsentation des VNS gepaarten CI-Kanals festgestellt werden. Um speziesspezifische (Ratte vs. Gerbil) und stimulusspezifische (akustisch vs. elektrisch) Unterschiede zwischen den Studien als mögliche Gründe für das Ausbleiben der VNS induzierten Plastizität auszuschließen, wurde nun die gepaarte Ton/VN-Stimulation (Engineer et al., 2011) im hörenden Gerbil wiederholt. Eine kortikale Überrepräsentation des VNS gepaarten Signals konnte aber auch im hörenden Gerbil nicht reproduziert werden. Mögliche Gründe für die Diskrepanz zwischen unseren Ergebnissen im Gerbil und den publizierten Ergebnissen in der Ratte werden diskutiert. Die generelle Funktionsfähigkeit der VNS in den chronisch stimulierten Tieren wurde durch die Ableitung VNS evozierter Potentiale (VNEP) kontrolliert. Ein speziesspezifischer Unterschied erscheint bei der biologischen Nähe von Ratte und mongolischer Wüstenrennmaus unwahrscheinlich, kann allerdings durch die vorliegenden Studien nicht vollständig ausgeschlossen werden. Eine Abhängigkeit des plastischen Potentials der gepaarten VNS von der Stimulationsintensität ist bekannt. Da Ratten und Gerbils ähnliche VNEP-Schwellen zeigten und mit identischen VNS-Amplituden stimuliert wurden, gehen wir davon aus, dass Unterschiede im plastischen Potential gepaarter VNS zwischen beiden Spezies nicht auf die verwendete Stimulationsintensität zurückzuführen sind. Die beschriebene Diskrepanz im Potential für kortikale Plastizität durch gepaarte VNS weckt Zweifel an der Übertragbarkeit des für die Ratte publizierten Potentials auf andere Spezies, einschließlich des Menschen. N2 - Worldwide, cochlear implants (CI) successfully restored hearing in >300 000 severely hearing- impaired patients. It is assumed that speech discrimination ability of CI users can be improved by increasing the number of functionally independent CI-channels. Aside from several approaches that focus on manipulations of the auditory periphery, there are considerations to target the central auditory system in order to improve CI-channel discrimination by restoring deafness-induced degradations in the neuronal spectral processing of auditory signals. Despite several studies in deaf animals on the effects of chronic CI-stimulation on the spectral representation of electric signals in the central auditory system, it was not yet possible to identify CI-stimulation patterns that were effecttive in inducing directed neuronal plasticity. In hearing animals, M.P. Kilgard and colleagues (UT Dallas, USA) showed that auditory stimulation paired with electric vagus nerve stimulation (VNS) can induce targeted cortical plasticity. The stimulus-specific potential of such paired stimulation was found to affect spectral signal processing in auditory cortex (AC) and was successfully used to restore pathologically expanded representations of acoustic tones. This powerful potential of paired VNS for directed plasticity in AC appears to be a promising approach to improve deafness-induced degradations in CI-channel representation in the central auditory system. The aim of this project was, therefore, to test the potential of paired CI/VN-stimulation on spectral neuronal plasticity in the deaf auditory system. To investigate spectral interactions to intracochlear stimulation in the central auditory system, a multichannel CI for the Mongolian gerbil was developed. Despite the small scale of the gerbil cochlea and AC and despite the well-known broad spread of electric activation with a CI, tonotopic and selective representations of neuronal responses to several CI-channels were demonstrated in AC. To test the effects of paired CI/VN-stimulation on spectral signal processing, animals were implanted with a cuff electrode around the left cervical vagus nerve (VN). Chronic implants provided effective and reliable stimulation for several weeks in the free-moving gerbil. Taken together, the here described multichannel-CI-VNS-model combines the advantages of tonotopically selective and stable neuronal activation with the ethical, cost-related and developmental advantages of using rodents in auditory research. As a next step, the potential of paired CI/VN-stimulation for directed plastic changes in the gerbil AC was tested. In acoustic studies in hearing rats, Engineer et al. (2011) had already reported the cortical overrepresentation of a single tone that was paired with VNS. In this project, we tried to reproduce the results of this acoustic study by two different studies in the Mongolian gerbils. First, analogue to the paired tone/VN-stimulation in the rat we investigated the effects of single channel CI-stimulation paired with VNS in the deaf gerbil. Results showed no effect of VNS on the spectral representation of the paired CI-channel in gerbil AC. To exclude species-specific (rat vs. gerbil) and stimulus-specific (acoustic vs. electric) differences between the two studies as potential causes underlying the lack of VNS-induced plasticity, we next repeated the paired tone/VN stimulation (Engineer et al. 2011) in the hearing gerbil. Again, a change in the cortical representation of the VNS-paired signal could not be reproduced in the hearing gerbil. Potential reasons for the discrepancy between our results in gerbils and the published results in rats are discussed. The general efficacy of VNS in the chronically stimulated animals was controlled by measuring VNS evoked potentials (VNEP). A species-specific difference seems to be unlikely, because of the biological proximity of rat and gerbil, but cannot fully be excluded by the present studies. It is known that the plastic potential of paired VNS is dependent on the stimulation level. Given that both rats and gerbils revealed similar VNEP thresholds and were stimulated with identical VNS-amplitudes, we conclude that differences in the plastic potential of paired VNS between both species are not explained by the used stimulation intensity. The described discrepancy in the potential of paired VNS for cortical plasticity creates doubt about the simple transferability of the plastic potential reported in rat to other species, including humans. KW - Hörrinde KW - Plastizität KW - Vagus KW - Cochlear-Implantat KW - Mongolische Rennmaus KW - gepaarte Vagusnerv-Stimulation KW - Auditorischer Kortex Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135887 ER - TY - THES A1 - Brockmann, Markus T1 - Inhibition von Aurora-A als neue Therapiestrategie gegen MYCN-amplifizierte Neuroblastome T1 - Inhibition of Aurora-A as a novel therapeutic strategy against MYCN-amplified Neuroblastoma N2 - Im Neuroblastom ist die Amplifikation des MYCN-Gens, das für den Transkriptionsfaktor N-Myc kodiert, der klinisch bedeutendste Faktor für eine schlechte Prognose. Als Mitglied der onkogenen Myc-Familie induziert N-Myc die Expression von Genen, die in vielen biologischen Prozessen wie Metabolismus, Zellzyklusprogression, Zellwachstum und Apoptose eine wichtige Rolle spielen. Die Deregulation der MYCN-Expression führt zu einem charakteristischen Genexpressionsprofil und einem aggressiven Phenotyp in den Tumorzellen. In normalen neuronalen Vorläuferzellen wird N-Myc gewöhnlich sehr schnell proteasomal abgebaut. Während der Mitose wird N-Myc an Serin 62 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung dient als Erkennungssignal für die Kinase GSK3β, die die Phosphorylierung an Threonin 58 katalysiert. Das Phosphodegron wird von Fbxw7, einer Komponente des E3-Ubiquitinligase-Komplex SCFFbxw7, erkannt. Die anschließende Ubiquitinierung induziert den proteasomalen Abbau des Proteins. Die Reduktion der N-Myc–Proteinlevel ermöglicht den neuronalen Vorläuferzellen den Austritt aus dem Zellzyklus und führt zu einer terminalen Differenzierung. In einem shRNA Screen konnte AURKA als essentielles Gen für die Proliferation MYCN-amplifizierter Neuroblastomzellen identifiziert werden. Eine Aurora-A–Depletion hatte jedoch keinen Einfluss auf das Wachstum nicht-amplifizierter Zellen. Während dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass Aurora-A speziell den Fbxw7-vermittelten Abbau verhindert und dadurch N-Myc stabilisiert. Für die Stabilisierung ist zwar die Interaktion der beiden Proteine von entscheidender Bedeutung, überraschenderweise spielt die Kinaseaktivität von Aurora-A jedoch keine Rolle. Zwei spezifische Aurora-A–Inhibitoren, MLN8054 und MLN8237, sind allerdings in der Lage, nicht nur die Kinaseaktivität zu hemmen, sondern auch die N-Myc-Proteinlevel zu reduzieren. Beide Moleküle induzieren eine Konformationsänderung in der Kinasedomäne von Aurora-A. Diese ungewöhnliche strukturelle Veränderung hat zur Folge, dass der N-Myc/Aurora-A–Komplex dissoziiert und N-Myc mit Hilfe von Fbxw7 proteasomal abgebaut werden kann. In MYCN-amplifizierten Zellen führt diese Reduktion an N-Myc zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Die in vitro Daten konnten in einem transgenen Maus-Modell für das MYCN-amplifizierte Neuroblastom bestätigt werden. Die Behandlung mit MLN8054 und MLN8237 führte in den Tumoren ebenfalls zu einer N-Myc-Reduktion. Darüber hinaus konnte ein prozentualer Anstieg an differenzierten Zellen, die vollständige Tumorregression in der Mehrzahl der Neuroblastome und eine gesteigerte Lebenserwartung beobachtet werden. Insgesamt zeigen die in vitro und in vivo Daten, dass die spezifischen Aurora-A–Inhibitoren ein hohes therapeutisches Potential gegen das MYCN-amplifizierte Neuroblastom besitzen. N2 - Amplification of MYCN, encoding the transcription factor N-Myc, is one of the strongest clinical predictors of poor prognosis in neuroblastoma. As a member of the oncogenic Myc family, N-Myc activates genes that are involved in several biological processes like metabolism, cell cycle progression, cell growth and apoptosis. Deregulation of MYCN expression leads to a distinct gene expression profile and an aggressive phenotype in neuroblastoma cells. In normal neuronal progenitor cells, N-Myc is rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome system. N-Myc degradation is controlled by two phospho-sites. During mitosis, Cyclin B/Cdk1 phosphorylates N-Myc at serine 62, which primes the protein for a second phosphorylation at threonine 58 via GSK3β. This phospho-degron provides a recognition site for Fbxw7, an F-box protein of the E3-Ligase complex SCFFbxw7, leading to destabilisation of the N-Myc protein. Mitotic degradation of the N-Myc protein allows progenitor cells to exit the cell cycle and enables terminal differentiation. Our group had previously identified AURKA as a gene that is required for cell growth in MYCN-amplified neuroblastoma cells but not essential for cells lacking MYCN. Here, we show that Aurora-A counteracts the Fbxw7-mediated degradation, and that the interaction between Aurora-A and N-Myc is cruical for N-Myc stabilization. Surprisingly, Aurora-A stabilizes the transcription factor in a kinase-independent manner. Interestingly, two Aurora-A-Inhibitors, MLN8054 and MLN8237, inhibit the kinase activity but also destabilize the N-Myc protein. These inhibitors induce an unusual conformation of the kinase domain and resulting in the dissociation of the N-Myc/Aurora-A complex. We demonstrate that the disruption of the complex promotes Fbxw7-mediated degradation of N-Myc. Inhibitor treatment in neuroblastoma cells leads to a cell cycle arrest in G1-phase. In a transgenic mouse model of MYCN-driven neuroblastoma, treatment causes downregulation of N-Myc protein levels, differentiation of the tumor cells and complete tumor regression in the majority of tumors. Consistent with the tumor reduction, treatment with MLN8054 and MLN8234 results in an extension of survival of the transgenic mice. Collectively, these results demonstrate that the Aurora-A–Inhibitors MLN8054 and MLN8237 are potential therapeutics against MYCN-amplified Neuroblastoma. KW - N-Myc KW - Neuroblastoma KW - Therapie KW - Neuroblastom KW - MYCN-amplified KW - Therapy KW - Aurora-A Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135951 ER - TY - THES A1 - Grebler, Rudi T1 - Untersuchung der Rolle von Rhodopsin 7 und Cryptochrom im Sehprozess von Drosophila melanogaster T1 - Investigation of Rhodopsin 7 and Cryptochrome in Drosophila melanogaster vision N2 - Ausgangspunkt für die Detektion von Licht ist im gesamten Tierreich die Absorption von Photonen durch photorezeptive Proteine, die sogenannten Opsine und in geringerem Ausmaß die Typ 1 Cryptochrome. Die Taufliege Drosophila melanogaster besitzt sechs eingehend charakterisierte, auch als Rhodopsine bezeichnete Opsine (Rh1-Rh6) und ein Cryptochrom (CRY). Neben den Ocellen und den Hofbauer-Buchner Äuglein werden die Rhodopsine in erster Linie in den Photorezeptorzellen der Komplexaugen, den Hauptorganen der Lichtperzeption exprimiert, wo sie der Vermittlung der visuellen Wahrnehmung dienen. Basierend auf Sequenzvergleichen wurde im Jahr 2000 ein neues Protein namens Rh7 zur Gruppe der Drosophila Opsine hinzugefügt. Bis heute fehlt allerdings jeglicher experimentelle Beleg für die photorezeptive Funktion dieses Proteins. Im Gegensatz dazu wird Cryptochrom in erster Linie in einigen Uhrneuronen des Drosophila Gehirns exprimiert, wo es diesen Neuronen die Fähigkeit zur Lichtdetektion verleiht und das Photoentrainment der inneren Uhr lenkt. Neueren Untersuchungen zu folge spielt CRY allerdings auch bei der visuellen Wahrnehmung der Augen eine Rolle. Die vorliegende Arbeit zielte nun darauf ab die potentielle Funktion von Rh7 als neuen Photorezeptor in Drosophila sowie die Rolle von CRY bei der visuellen Lichtperzeption zu untersuchen. Die Aufnahmen der Elektroretinogramme (ERGs) von transgenen Fliegen, die Rh7 anstelle von oder zusammen mit dem dominanten Photorezeptor Rh1 in den Komplexaugen exprimieren, zeigen, dass Rh7 die Phototransduktionskaskade bei Belichtung mit Weißlicht nicht aktivieren kann. Die Abwesenheit von Rh7 sorgt allerdings trotzdem für eine Beeinträchtigung der lichtinduzierten Antwort der Rezeptorzellen im Komplexauge. So zeigen die Intensitäts-Response Kurven der ERG Rezeptorpotentialamplitude von rh7 Knockout-Fliegen unter Weißlicht niedriger und mittlerer Intensität nach einer anfänglichen Dunkeladaptation von 15min eine insgesamt, im Vergleich zur Kontrolle erhöhte Rezeptorpotentialamplitude. Der Verlauf dieser Kurven deutet außerdem darauf hin, dass die Zunahme der Rezeptorpotentialamplitude mit steigender Lichtintensität größer wird. Zudem zeigt das Aktionsspektrum für die Rezeptorpotentialamplitude der rh7 Knockout-Fliegen, dass diese Empfindlichkeitszunahme im gesamten Bereich von 370-648nm auftritt. Diese Beeinträchtigung scheint jedoch zu fehlen, wenn die Fliegen vor Experimentbeginn nur 1min dunkeladaptiert wurden, oder wenn intensives Blaulicht zur Belichtung verwendet wird. Des weiteren ist auch das 4s nach Ende des Lichtpulses im ERG gemessene Nachpotential bei fehlendem Rh7 reduziert. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Rh7, wenn auch nicht als Photorezeptor, bei Belichtung mit Weißlicht niedriger und mittlerer Intensität die Lichtantwort in den Rezeptorzellen des Komplexauges in Abhängigkeit von Intensität und Adaptationszustand beeinflusst und dass dieser Einfluss scheinbar nicht durch Licht eines eng begrenzten Wellenlängenbereichs induziert wird. Des weiteren legt die Untersuchung des ERG Nachpotentials nahe, dass Rh7 möglicherweise für eine normale Beendigung der Lichtantwort benötigt wird. Die allgemeine Funktion von Rh7 als Photorezeptor in Drosophila sowie die Eigenschaften der endogenen Funktion von Rh7 werden diskutiert. Unabhängig davon wird in der vorliegenden Arbeit auch gezeigt, dass Fliegen ohne CRY zwar nach 15-minütiger, nicht jedoch nach 1-minütiger Dunkeladaptation bei Belichtung mit Weißlicht niedriger Intensität eine insgesamt geringere ERG Rezeptorpotentialamplitude aufweisen. Dies könnte auf eine Beeinträchtigung der Dunkeladaptationsprozesse bei Abwesenheit von CRY hindeuten. N2 - Throughout the animal kingdom light detection is based on the absorption of photons by photoreceptive proteins, the so called opsins and to a minor degree the type 1 cryptochromes. The fruit fly Drosophila melanogaster possesses six well characterized opsins, also referred to as rhodopsins (Rh1-Rh6) and one cryptochrome (CRY). Besides the ocelli and the Hofbauer-Buchner eyelet, the rhodopsins are predominantly expressed in the photoreceptor cells of the compound eye, the major light receptive organ of the fly, where they mediate visual perception. Based on sequence comparisons a new protein, called Rh7, was added to the group of Drosophila opsins in the year 2000. But to date there is no experimental evidence for the photoreceptive function of this protein. By contrast cryptochrome is predominantly expressed in some clock neurons of the Drosophila brain, where it confers light sensitivity to these neurons and guides the photoentrainment of the endogenous clock. But recent publications also envisage a role for CRY in visual perception. The present thesis now aimed to investigate the putative function of Rh7 as a new photoreceptor in Drosophila as well as the role of CRY in visual perception. Recordings of the electroretinogram (ERG) of transgenic flies, that express Rh7 instead of or together with the major photoreceptor Rh1 in the compound eye, show that Rh7 can not activate the phototransduction cascade under white-light. Nevertheless, the absence of Rh7 impairs the light induced response of the receptor cells in the compound eye. Thus, the irradiance-response curves for the ERG receptor potential of rh7 knockout-flies show an overall increased amplitude of the receptor potential compared to controls upon illumination with white-light in the low- and mid-intensity range and after an initial dark adaptation of 15min. The curve shape also indicates that the gain in amplitude gets bigger with increasing light intensity. In addition the action spectrum for the receptor potential of rh7 knockout-flies demonstrates that this increase in sensitivity covers the whole range from 370-648nm. However this impairment seems to be absent when flies were only allowed to dark adapt for 1min before the experiment or when intense blue light is used for illumination. Moreover also the ERG afterpotential measured 4s after lights-off is reduced in absence of Rh7. Taken together these results indicate that Rh7, even though it might not work as a photoreceptor under white-light, alters the light response of the receptor cells in the compound eyes under low- and mid-intense white-light in an intensity and adaptation dependent manner and that this alteration seems not to be caused by light of a limited spectral range. Furthermore the analysis of the ERG afterpotential indicates that Rh7 may also be required for normal light response termination. The general function of Rh7 as a photoreceptor in Drosophila as well as the characteristics of the endogenous function of Rh7 are discussed. Independently the present thesis also demonstrates that flies lacking CRY show a decreased ERG receptor potential amplitude upon illumination with low-intensity white-light when 15min but not when 1min of dark adaptation preceded the recording. This may indicate an impairment of the dark adaptation process without cryptochrome. KW - Taufliege KW - Rhodopsin 7 KW - Rhodopsin KW - Cryptochrom KW - Drosophila Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114466 ER - TY - THES A1 - Taschik, Julia T1 - Zytokingenpolymorphismen bei Kindern mit akuter lymphatischer Leukämie T1 - Genetic cytokine polymorphism in children with acute lymphoblastic leukamie N2 - Die akute lymphatische Leukämie ist die häufigste maligne Erkrankung im Kindesalter. Trotz systematischer Erhebung und Auswertung von Daten im Rahmen der ALL-BFM-Studiengruppe und der damit verbundenen kontinuierlichen Verbesserung der Prognose hat man noch immer keine Ursache für eine ALL gefunden. Daher nimmt eine umfangreiche Risikostratifizierung eine zentrale Rolle in der Behandlungsplanung einer ALL ein. Basierend auf einer exakten Stratifizierung kann die Therapie risikoadaptiert und individualisiert werden, um eine Übertherapie zu vermeiden und letztlich die Heilungschancen zu verbessern. Pro- und antiinflammatorische Zytokine kommt in den komplexen Wirkungsmechanismen des Immunsystems eine Schlüsselrolle zu. Viele Infektions-, Auto-immun- oder Tumorerkrankungen werden durch das Produktionsprofil der Zyto-kine beeinflusst. Da genetisch determinierte Zytokingenpolymorphismen Krank-heitsverläufe beeinflussen und verändern, wurde untersucht, ob Zytokine einen Einfluss auf pädiatrische Patienten mit einer ALL haben. Im Zuge dieser Arbeit wurden 95 pädiatrische Patienten mit ALL auf Polymorphismen der Zytokine TNF-α, TGF-β1, IL-10, IL-6 und IFN-γ analysiert, die im Zeitraum vom 21.06.2004 bis zum 30.04.2014 an der Kinderklinik des Universitätsklinikums Würzburg behandelt wurden. Mittels DNA-Extraktion, sequenz-spezifischer PCR und Gelelektropherese wurden 35 Proben bei Erstdiagnose und 93 zum Zeitpunkt der Remission mit folgender zentralen Fragestellung untersucht: Gibt es genetische Risikofaktoren, die Einfluss auf • die Risikogruppe • die Art der Leukämie • die Genfrequenz • die Rezidivrate und • das Gesamtüberleben einer akuten lymphatische Leukämie im Kindesalter haben und sich zudem durch Einzelnukleotidpolymorphismen in pro- und antiinflammatorischen Zytokinen auszeichnen? Im Rahmen dieser Studie konnte festgestellt werden, dass das immunsuppressive Zytokin IL-10 einen Einfluss auf die Genfrequenz, die Risikogruppe, die Rezidivrate sowie die Prognose bei Kindern mit ALL hat. Patienten mit niedrigen Zytokinexpressionsraten (Genotypen ACC/ACC und ACC/ATA) wurden häufiger in der Hochrisikogruppe therapiert, hatten mehr Rezidive und eine schlechtere Prognose als Patienten mit hohen Zytokinexpressionsraten. Dar-über hinaus ist der Genotyp GCC/ACC signifikant häufiger bei ALL-Patienten anzutreffen als im gesunden Kollektiv. Beim immunsuppressiven IL-6 konnte festgestellt werden, dass der Genotyp C/C signifikant häufiger bei Patienten mit einer ALL auftritt als bei gesunden Patienten. Ferner zeigte sich, dass es so-wohl für IL-6 als auch für TNF-α eine Änderung des Genotyps zwischen Erstdiagnose und in Remission auftrat, die Hinweise auf einen blastenspezifischen „immune-escape“-Mechanismus geben. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass das immunmodulatorische Zytokin TGF-β1 einen Einfluss auf die Risikogruppe sowie die Rezidivrate hat. Patienten, die eine T/T Kombination am Codon 10 aufwiesen wurden häufiger im Hochrisikozweig therapiert als Patienten mit den Genotypen T/C oder C/C. Des Weiteren wurde demonstriert, dass Patienten mit einem C/C an Codon 25 häufiger an Rezidiven erkrankten als Patienten mit ei-nem G/C oder G/G. Für die TH1 Zytokine IFN-γ sowie TNF-α wurde kein Zusammenhang zwischen der Genfrequenz, der Risikogruppe, der Art der Leukämie, der Rezidivrate oder dem Gesamtüberleben gefunden. Auch wenn man bisher noch nicht genau weiß, wie Zytokingenpolymorphismen Einfluss auf pädiatrische ALL nehmen, wird anhand dieser Arbeit gezeigt, dass Zytokine einen Beitrag zur Pathogenese der ALL leisten und daher zukünftig für eine umfassendere Risikostratifizierung geeignet sind. Darüber hinaus können diese Ergebnisse dazu beitragen, dass Zytokine als biologische Marker etabliert werden, um eine weniger toxische immunmodulierende bzw. -suppressive Therapie zu gewährleisten. Dies führt dazu, dass eine Therapie anhand des Risikoprofils individuell und prognoseverbessernd abgestimmt werden kann. Je-doch wäre für eine nachfolgende Untersuchung eine größere multizentrische Stichprobe sowie eine prospektive Evaluation der Daten erstrebenswert. Gera-de bei hereditären Erkrankungen haben einzelne Gene nur einen geringen Einfluss auf das Gesamtrisiko, sodass größere Fallzahlen erforderlich wären, um auch schwache Effekte zu detektieren. N2 - Acute lymphoblastic leukaemia (ALL) is the most common malignant disease in childhood. Although survival rates in paediatric patients with ALL have greatly improved since effective drug combinations and risk-adapted therapy protocols were introduced, possible causes for ALL are yet to be determined. The incomplete information on the pathogenesis of ALL heightens the need for extensive risk stratification in order to develop and improve treatment methods. Exact stratification helps to continuously improve and develop risk-adapted and individual therapy approaches to minimise over- or under-treatment. Based on the empirical finding that cytokines play a decisive role in immune responses and that many autoimmune and malignant diseases are influenced by cytokine production, this study hypothesized that genetically determined cy-tokine gene polymorphisms might have an impact on children with ALL. 95 pediatric ALL patients were examined between June 2004 and April 2013 at the Children’s Hospital of the University of Würzburg with regard to cytokine gene polymorphisms in TNF-α, TGF-β1, IL-10, IL-6 and IFN-γ. Applying DNA extraction, sequence-specific PCR and gel electrophoresis, 35 samples at initial diagnosis and 93 samples in remission were obtained in order to find an answer to the following question: Are there any genetic risk factors, which influence the • risk group • type of leukaemia • gene frequency • relapse rate • overall survival with acute lymphoblastic leukaemia in childhood? Within the scope of this study the immunosuppressive IL-10 has an influence on gene frequency, risk group, relapse rate and overall survival. IL-10 high-producer-haplotypes were reduced in ALL-patients compared with healthy controls and resulted in a reduced relapse rate, a superior overall survival and resulted more often in the low risk group compared with IL-10 low producer haplotypes. By analysing immunosuppressive IL-6, it was demonstrated, that the genotype C/C is significantly more frequent in ALL-patients in comparison to healthy patients. Interestingly, with regard to IL-6 as well as to TNF-α genotypes a change in the genotype from initial diagnosis to remission was found in some patients, which may indicate a blast specific immune-escape mechanism. Moreover, the immune-modulatory cytokine TGF-β1 has an influence on risk group and relapse rate. Patients with a C/C in Codon 10 suffered more often from relapses than patients with G/C or G/G. TGF-β1 high producer haplotypes were correlated with a high initial blast-count (Codon 25 G/G) and were elevated in high-risk ALL-patients (Codon 10 T/T). For the TH1 cytokines IFN-γ and TNF-α no correlation between frequencies, risk group, type of leukaemia, re-lapse rate or overall survival could be found. Even though the mechanisms by which the cytokine polymorphisms influence the outcome of paediatric ALL remain to be determined, the data of the present study suggest an important contribution of cytokines to the pathogenesis of ALL and demonstrate their potential applicability in the clinical evaluation of prognosis in paediatric patients. Confirmatory studies correlating cytokine alleles with disease markers will support the concept of cytokine-mediated immune surveil-lance in humans as well as the importance of the genetic background of the patient for strong anti-tumour immunity and responses to therapy. These data can finally help to establish biomarkers for therapy stratification as well as immune-therapeutic tools in childhood ALL for a more risk-adapted therapy, in order to adapt the therapy intensity. However, for further studies an increase in sample size and a prospective multicentre evaluation would be desirable. Especially in hereditary diseases, single genes have only a small influence on the overall risk. That is why it is crucial to have a sufficiently high number of cases to detect even small effects. KW - Cytokine KW - Polymorphismus KW - Akute lymphatische Leukämie KW - Zytokingenpolymorphismus KW - akute lymphatische Leukämie bei Kindern KW - genetic cytokine polymorphism KW - acute lymphoblastic leukaemia KW - pediatric hematology oncology KW - Cancer biology KW - molecular biology of cytokines KW - Zytokin Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133312 ER - TY - THES A1 - Friedrich, Alexandra T1 - Beeinflussung des Na+-D-Glukose-Kotransporters SGLT1 und der Na+-Nukleosidtransporter CNT durch Peptidmotive des Regulatorproteins RS1 im Darm T1 - Effects of RS1-derived peptides on Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 and Na+- nucleoside cotransporters CNTs in small intestine N2 - Der Natrium-D-Glukose Kotransporter 1 (SGLT1) spielt eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Glukose aus dem Darmlumen in die Enterozyten des Darms. Anhand von Untersuchungen an Xenopus laevis-Oozyten konnte in unserem Labor das Protein RS1 als posttranslationales Regulatorprotein für SGLT1 und diverse andere Transporter ermittelt werden. Es wurde eine regulatorische Domäne aus RS1 mit vielen potentiellen Phosphorylierungsstellen isoliert (RS1-Reg) und gezeigt dass RS1-Reg die Abschnürung von Transporter enthaltenen Vesikeln vom Transgolgi-Netzwerk hemmt. Neben SGLT1 reguliert RS1 auch die konzentrierenden Nukleosidtransporter (CNTs) am TGN. Die Regulation der Transporter ist vom Phosphorylierungszustand von RS1-Reg abhängig. So wurde durch Versuche an Oozyten von Xenopus laevis und Injektion von RS1-Reg Mutanten gezeigt, dass die Phosphorylierung von RS1-Reg an einigen Stellen zu einer Inhibition von SGLT1 führte, während der Nukleosidtransporter CNT1 durch die dephosphorylierte Mutante herunterreguliert wurden. Neben der phosphorylierungsabhängigen Regulation konnte für SGLT1 auch gezeigt werden, dass die Herunterregulation nur unter Niedrigzucker-Bedingungen erfolgte, nicht jedoch bei hohen Glukosekonzentrationen. Für die CNTs war eine derartige Zuckerabhängigkeit nicht zu beobachten. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob die Ergebnisse aus den Oozytenmessungen auch in vivo in einem Säugetier gezeigt werden können. Hierzu wurden Mutanten der regulatorischen Domäne (RS1-Reg) des Maus-Proteins, welche den phosphorylierten Zustand simulierten (RS1-Reg (S19E)), oder die Phosphorylierung verhinderten (RS1-Reg (S19A)) eingesetzt. Diese wurden an ein Nanohydrogel gekoppelt, um eine Aufnahme in die Enterozyten im Darm zu gewährleisten. Es wurde in der RS1KO-Mausohne funktionelles RS1 gezeigt, dass auch im in vivo-System eine Herunterregulation von SGLT1 durch mRS1-Reg (S19E), nicht jedoch durch mRS1-Reg (S19A) erfolgte, während die CNTs nur durch mRS1-Reg (S19A) inhibiert wurden. Des Weiteren führte mRS1-Reg (S19A) in der Wildtypmaus bei niedrigen Zuckerkonzentrationen zu einer Stimulation von SGLT1, was für eine Kompetition mit dem endogenen RS1-Proteins spricht. Es konnte indirekt der Beweis erbracht werden, dass über Nanohydrogele längere Proteine in die Zelle gebracht werden können und dort funktionell freigesetzt werden. N2 - The Sodium-D-glucose cotransporter 1 (SGLT1) is important for the uptake of glucose from the intestinal lumen into the enterocytes. In experiments with Xenopus-laevis oocytes, which were performed in our laboratory, we identified protein RS1 as a regulatory protein for SGLT1. A sequence of 80 aminoacids was identified to be the regulatory domain of RS1 (RS1-Reg) and prevents the constriction of transporter-containing vesicles from the transgolgi-network (TGN). Besides SGLT1, RS1 is able to regulate concentrative nucleoside transporters (CNTs) and the organic cation transporter 2 (OCT2). The regulation of the transporters depends on the phosphorylation-state of RS1-Reg. While SGLT1 is inhibited by the phosphorylated form of the regulatory domain, CNTs are regulated by the dephosphorylated form. In addition, the regulation of SGLT1 depends on the glucose concentration of the cells. RS1 only inhibits SGLT1 under low glucose conditions, while the regulation of CNTs is independent of glucose. In the following study we analyzed whether the results of the oocyte measurements could be reproduced in vivo. For this, we used mutants of the mouse regulatory domain (mRS1-Reg). In one mutant, the phosphorylation was mimicked (mRS1-Reg (S19E)), in a second mutant, phosphorylation was prevented (mRS1-Reg (S19A)). The mutants were coupled to nanohydrogels, to enable the uptake into enterocytes. By usage of a mouse-strain without functional RS1 and a wildtype-mouse-strain, I was able to discriminate between direct effects of the mutant and competition of mutants with endogenous RS1. Only mRS1-Reg (S19E) down regulates SGLT1, but not mRS1-Reg (S19A), while CNTs were downregulated by mRS1-Reg (S19A) but not by mRS1-Reg (S19E). In the wildtype-mouse mRS1-Reg (S19A) leads to an increase of SGLT1-activity which could be due to a competition with the endogenous RS1. The fact, that some peptides were able to regulate transporters leads to the conclusion, that longer proteins can be transported into cells by nanohydrogels and that these proteins are released in the cells in a functional active state. KW - Glucosetransport KW - SGLT1 KW - RS1 KW - Regulation KW - Glatter Krallenfrosch KW - Oozyte KW - Glucosetransportproteine KW - Darm Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127394 ER - TY - THES A1 - Zink [geb. Sondergeld], Thomas Gerd T1 - Der Cofilin-Signalweg im Glioblastoma multiforme - Ursachen für den Verlust von Chronophin und Einfluss von LIM-Kinase-Inhibitoren T1 - The cofilin pathway in glioblastoma multiforme - Reasons for chronophin loss and effect of LIM-kinase inhibitors N2 - Das invasive Potential maligner Gliome beeinflusst maßgeblich die schlechte Prognose dieser Tumorentität. Migration und Invasion von Tumorzellen werden entscheidend durch die Cofilin-vermittelte Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts geprägt, die durch die Aktivität antagonistischer Cofilin-Kinasen und -Phosphatasen reguliert wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein progressiver Expressionsverlust der Cofilin-Phosphatase Chronophin mit ansteigendem Malignitätsgrad astrozytärer Gliome aufgezeigt werden, der mit einer Zunahme der Phosphorylierung von Cofilin einhergeht. In den entsprechenden Gewebeproben gelang gleichzeitig der Nachweis einer gesteigerten Expression der Cofilin-Kinase LIMK-2. Genetische und epigenetische Analysen des Chronophin-Locus konnten eine Hypermethylierung im Bereich der Promotorregion der Phosphatase identifizieren, die möglicherweise dem Verlust von Chronophin in Glioblastom-Gewebeproben zugrunde liegt. In Glioblastom-Zelllinien, die unterschiedliche Expressionsmuster von Chronophin aufwiesen, konnten hingegen keine molekularen Alterationen festgestellt werden. Untersuchungen des Einflusses von ROCK- und LIMK-Inhibitoren auf Glioblastomzellen konnten ausgeprägte Veränderungen der Zellmorphologie dokumentieren, wobei erstmals die Induktion eines stellate cell-Phänotyps unter Einfluss des LIMK-Inhibitors BMS-5 beschrieben wird. Während ROCK- und LIMK-Inhibitoren keinen Einfluss auf die 2D-Motilität der Tumorzellen hatten, wiesen die Glioblastomzellen in Abhängigkeit ihrer basalen Cofilin-Aktivität eine verstärkte bzw. verminderte 3D-Invasivität auf. Die Erkenntnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung des Cofilin-Signalweges für die Migration und Invasion von Gliomzellen, zeigen neue Angriffspunkte in der Therapie maligner Gliome auf und warnen zugleich vor einem unkritischen Einsatz neuer Wirkstoffe. N2 - The invasive potential of malignant gliomas is the main reason for the dismal prognosis of this tumor entity. Migration and invasion of tumor cells is crucially determined by the cofilin dependent reorganization of the actin cytoskeleton regulated by the activity of antagonistic cofilin kinases and phosphatases. This study revealed a progressive loss of expression of the cofilin phosphatase chronophin with increasing malignancy grade of astrocytic glioma, accompanied by an increase of cofilin phosphorylation. Moreover, the analyzed glioma specimens were characterized by a simultaneous increase of expression of the cofilin kinase LIMK-2. Integrated genetic and epigenetic analysis of the chronophin locus identified an aberrant promoter methylation as a possible mechanism leading to chronophin down-regulation in glioblastoma tissue samples. In contrast, molecular alterations of the chronophin locus were undetectable in glioblastoma cell lines characterized by different chronophin expression levels. Analysis of glioblastoma cells demonstrated striking effects of ROCK and LIMK inhibitors on cell morphology, providing first evidence of the induction of a stellate cell-phenotype by the LIMK inhibitor BMS-5. While ROCK and LIMK inhibitors had no detectable effect on the 2D motility of the tumor cells, the inhibitors increased or decreased the 3D-invasiveness of the glioma cells depending on their basal cofilin activity. The findings of this study stress the importance of the cofilin signaling pathway as a key regulator of glioma migration and invasion, indicate novel targets for glioma therapy, but also warn against a noncritical use of new drugs. KW - Cofilin KW - Glioblastom KW - Chronophin KW - Actin KW - Rho-Proteine KW - PDXP KW - LIMK KW - BMS-5 KW - Signalkette KW - Rho-GTPasen Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127065 ER - TY - THES A1 - Paletta, Daniel Sylvester T1 - Die Variabilität des Ratten iNKT TCR T1 - The Variability Of The Rat iNKT TCR N2 - Typ 1 NKT Zellen oder iNKT Zellen (invariante Natürliche Killer T Zellen) stellen eine Subpopulation der abT Zellen dar, die sich durch mehrere charakteristische Eigenschaften aus- zeichnet. Ihr Hauptmerkmal ist die Expression eines semi-invarianten T Zellrezeptors (TCR), der die Bindung von CD1d:Glycolipid Komplexen ermöglicht, wohingegen ‚klassische‘ T Zellen an Komplexe aus MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) Molekülen und Peptiden binden. Die während der Reifung im Thymus durch Transkriptionsfaktoren festgelegte Voraktivierung der iNKT Zellen ermöglicht das unmittelbare Freisetzen von Cytokinen bei Antigenkontakt, wodurch iNKT Zellen die adaptive Immunantwort stark beeinflussen können: Sie tragen sowohl zur Regulation von Autoimmunerkrankungen als auch der Bekämpfung von Krebs und Infektionen bei. Der iNKT TCR setzt sich aus einer invarianten a-Kette (AV14/AJ18 in der Maus bzw. AV24/AJ18 im Menschen) und einer charakteristischen Auswahl an b-Ketten (vorwiegend BV8S2, BV7 und BV2 in der Maus und BV11 im Menschen) zusammen. Das Cerebrosid a-Galactosylceramid (aGC, KRN7000) stellt eines der potentesten Antigene für iNKT Zellen dar. Die Präsentation dieser Antigenklasse erfolgt durch CD1d Moleküle, die, abgesehen von tiefen hydrophoben Bindungstaschen, strukturell MHC I Molekülen ähneln, jedoch nicht polymorph sind und außerhalb des MHC Locus codiert sind. Die, zwischen Maus und Mensch hochkon- servierte, Interaktion von iNKT TCR und CD1d:aGC Komplex zeichnet sich bei potenten Antigenen durch die eingeschränkte Nutzung der Antigenspezifität bestimmenden Regionen aus: CDR1a, CDR3a und CDR2b. Die den CDR3b definierende V-D-J Umlagerung der b-Kette stellt im iNKT TCR den Bereich der höchsten Variabilität dar, beeinflusst jedoch nur die Bindung schwächerer Antigene. Natürlich auftretende Variabilität innerhalb der a-Kette kann durch Abweichungen von der kanonischen V-J Umlagerung am Beginn des CDR3a entstehen und beeinflusst ebenfalls die Bindung des iNKT TCR. Die iNKT Zellpopulation in F344 Ratten ähnelt in Frequenz und Korezepotorexpression derjenigen des Menschen. Ratten besitzen ein CD1D Gen, welches hoch homolog zu denen der Maus ist und zwei dem BV8S2 Gensegment der Maus homologe BV Segmente (BV8S2 und BV8S4), die in F344 Ratten beide funktionell sind. Eine Besonderheit der Ratte ist jedoch das Auftreten einer AV14 Multigenfamilie von bis zu zehn Gensegmenten. Diese unterscheiden sich neben dem HV4 vor allem in ihren CDR2 Sequenzen und werden anhand dieser Unterschiede in zwei Gruppen (Typ 1 und 2) eingeteilt. Zusätzlich wurde in der iNKT Zellpopulation eine hohe Frequenz an natürlich auftretenden A93G Substitutionen in der TCR↵ Kette beschrieben und es wurde gezeigt, dass, im Gegensatz zur Kreuzreaktivität zwischen iNKT TCR und CD1d von Maus und Mensch, iNKT Zellen der Ratte nicht an Maus CD1d binden. Die Besonderheiten des Ratten iNKT TCR und deren Auswirkungen auf die TCR Expression und Ligandenbindung der Ratten iNKT Zellpopulation wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht. Durch in dieser Arbeit durchgeführte in vitro Mutagenesestudien konnten Position 68 in der vierten Hypervariablen Schleife (HV4↵) und Position 93 zu Be- ginn des CDR3↵ als entscheidende Modulatoren der CD1d Bindung im iNKT TCR von Ratte und Maus identifiziert werden, wobei auch speziesspezifische Unterschiede aufgedeckt werden konnten. Die Spezieskreuzreaktivität des Ratten iNKT TCR selbst hing stark von einer A93G Substitution im TCRa ab. Bei Untersuchungen der b-Kette zeigte sich, dass sowohl BV Segmente als auch CDR3b Region die Ligandenbindung in differenziellem Zusammenspiel beeinflussen, was bei Paarung mit unterschiedlichen AV14 Segmenten verschieden ausgeprägt sein konnte. Weiterhin wurden humane CD1d Dimere generiert und zum ersten Mal die Bindung von Ratten CD1d an humane iNKT TCR gezeigt. Weiterhin wurde in dieser Arbeit das TCR Repertoire von iNKT Zellen der F344 Ratte und deren CD1d Bindungseigenschaften charakterisiert. Hierzu wurde die bereits etablierte Methode der in vitro Expansion von iNKT Zellen aus der Rattenmilz weiterentwickelt, was die Langzeitkultur und -expansion der sortierten iNKT Zellpopulation ermöglichte. Bei Untersuchung der TCR Expression konnte gezeigt werden, dass die Auswahl der im Ratten iNKT TCR genutzten BV Gensegmente ähnlich limitiert ist wie in der Maus. Neben der dominanten Nutzung der BV8S4 und BV8S2 Gensegmente wurden hauptsächlich BV8S1, BV14 und BV7 gefunden. Bei Untersuchungen der CD1d Dimerbindung der iNKT Zellpopulation konnte der Einfluss der na- türlich auftretenden A93G Substitution in der iNKT TCRa Kette bestätigt werden. Außerdem zeigte sich hier ebenfalls der Einfluss des BV Gensegments auf die Ligandenbindung, wobei BV8S4 negative Zellen im Vergleich zu BV8S4 positiven Zellen eine stärkere Ratten CD1d Dimerbindung zeigten. N2 - Type 1 NKT cells, also called iNKT cells (invariant Natural Killer T cells), are a subpopulation of abT cells with characteristic features. Their hallmark is the expression of a semi-invariant T cell receptor (TCR) which binds CD1d:glycolipid complexes. This is in contrast to ‚conventional‘ T cells which bind complexes of MHC (major histocompatibility complex) molecules and peptides. iNKT cells show a transcription factor dependend, preactivated phenotype which is obtained during their development in the thymus. This allows for immediate cytokine release after antigen encounter and enables iNKT cells to strongly influence the adaptive immune re- sponse: They are not only able to help regulating autoimmune diseases, but also contribute to the clearance of cancer and infections. The iNKT TCR is composed of an invariant a-chain (AV14/AJ18 in mice, AV24/AJ18 in humans) and a limited number of � chains (mostly BV8S2, BV7 and BV2 in mice and BV11 in humans). a-galactosyceramide (aGC, KRN7000), a cerebroside, is one of the most potent iNKT cell antigens known so far. iNKT cell antigens are presented by CD1d, a non polymorphic molecule which is encoded outside the MHC locus. CD1d molecules resemble MHC I structurally but possess deep hydrophobic pockets as antigen binding grooves. The iNKT TCR interaction with CD1d:aGC complexes is highly conserved between mice and humans. Its binding mode is characteristic for the restricted CDR (complementarity determining region) usage and relies mostly on CDR1a, CDR3a and CDR2b. The only highly variable region within the iNKT TCR, the CDR3b defining diverse V-D-J rearrangement of the TCRb chain, has been shown to only influence binding to less potent antigens. Natural variability within the TCRa chain is usually only possible due to non canonical AV14/AJ18 rearrangements at the beginning of CDR3a and has been shown to indirectly influence ligand binding. The iNKT cells in F344 rats resemble human iNKT cells in terms of frequency and coreceptor expression profile. Rats have one CD1D gene, highly homologous to those found in mice, and two BV8S2 homologs (BV8S2 and BV8S4 ), which are both functional in F344 rats. Peculiar for the rat is the presence of an AV14 gene family with up to ten members, which have been grouped by their CDR2↵ sequences into Type 1 and 2, and a high frequency of A93G substitutions within the iNKT TCRa chains. Additionally, in contrast to the species cross-reactive interaction of iNKT TCR and CD1d from mice and humans, a lack of mouse CD1d binding by the rat iNKT TCR has been demonstrated. Those characteristic features of the rat iNKT TCR and its influence on TCR expression and ligand binding of rat iNKT cells were investigated in this study. Due to in vitro mutagenesis studies conducted in this thesis, position 68 within the fourth hypervariable loop of the TCRa chain (HV4a) as well as position 93 at the start of CDR3a could be identified as strong modulators of CD1d binding within the iNKT TCR of rat and mouse with specific features for both species. Furthermore, species cross-reactivity of rat iNKT TCR was found to be strongly enhanced due to the naturally occuring A93G substitution within the rat TCRa chain. The analysis of the rat iNKT TCRb chain showed that BV segments as well as the highly diverse CDR3b region influence CD1d binding in a complex interplay, which also differs depending on the paired a-chain. Furthermore, human CD1d dimers were generated and for the first time binding of rat CD1d to human iNKT TCRs could be shown. Additionally, the TCR repertoire of F344 rat iNKT cells and its ligand binding has been characterized in this study. For this purpose, the already established in vitro expansion of rat iNKT cell from splenocytes was further developed, allowing long term culture and expansion of purified iNKT cell populations. Analysis of the TCR expression did reveal a restricted BV segment usage, similar to mouse iNKT cells. Besides the predominant usage of BV8S2 and BV8S4 gene sements, mainly BV8S1 BV14 and BV7 were found. CD1d dimer binding studies confirmed the influence of the A93G substitution on ligand binding properties of the rat iNKT cell population and the influence of different BV segments on CD1d binding could also be seen by comparison of BV8S4 positive and negative iNKT cell subpopulations, where BV8S4 usage led to a lower rat CD1d binding profile. KW - T-Lymphozyt KW - T-Lymphozyten-Rezeptor KW - Ratte KW - invariante NKT Zellen KW - invariant NKT cells KW - CD1d KW - CD1d Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114521 ER - TY - THES A1 - Kollert, Sina T1 - Kaliumkanäle der K2P-Familie kontrollieren die Aktivität neuronaler Zellen - TRESK als Regulator inflammatorischer Hyperalgesie T1 - Potassium channels of the K2P-family control the activity of neuronal cells - TRESK as regulator of inflammatory hyperalgesia N2 - Das Empfinden von Schmerz ist für uns überlebenswichtig. Chronischer Schmerz hingegen hat seine physiologische Bedeutung verloren und wird als eigenes Krankheitsbild angesehen. Schmerzempfindung beginnt mit der Nozizeption. Die Zellkörper nozizeptiver Neurone befinden sich in den Spinalganglien (Hinterwurzelganglion, dorsal root ganglion DRG) und Trigeminalganglien (TG). In den DRG-Neuronen macht der Zwei-Poren-Kaliumkanal (K2P) TRESK die Hauptkomponente eines Kaliumstromes, des „standing outward currents“ IKSO, aus. Die physiologische Hauptaufgabe der TRESK-Kanäle liegt in der Regulation der zellulären Erregbarkeit nozizeptiver Neurone. Während einer Entzündungsreaktion werden Entzündungsmediatoren wie Histamin, Bradykinin, Serotonin und Lysophosphatidsäure (LPA) ausgeschüttet und können durch die Aktivierung ihrer G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) oder direkte Interaktion mit Ionenkanälen die nozizeptive Erregung beeinflussen. Durch Anwendung von RT-PCR und eines neu entwickelten Antikörpers wurde die Ko-Expression von TRESK-Kanälen zusammen mit Kanälen der Transient-Receptor-Potential-Kationenkanalfamilie (TRP) und LPA-Rezeptoren in DRG-Neuronen nachgewiesen. Durch rekombinante Ko-Expression von TRESK-Kanälen und LPA2-Rezeptoren in Xenopus Oozyten konnte durch Zugabe von LPA eine fast 10-fache Aktivierung des basalen K+-Stromes erzielt werden. Die Auswertung der Dosis-Wirkungskurve ergab einen EC50-Wert von 0,2 µM LPA. Die LPA-induzierte TRESK-Stromaktivierung konnte durch die Verwendung des mutierten Kanals TRESK[PQAVAD] oder durch die Zugabe des Phospholipase C (PLC) Inhibitors U73122 verhindert werden. Dies zeigt die Beteiligung des PLC-Signalwegs und die Bindung von Calcineurin an den TRESK-Kanal bei der Stromaktivierung. TRESK ist das einzige Mitglied der K2P-Familie, das eine LPA-induzierte Aktivierung des Stromes zeigt. TREK- und TASK-1-Ströme werden durch LPA inhibiert. In DRG-Neuronen mit kleinem Durchmesser wird Nozizeption durch die Aktivierung von TRPV1-Kanälen durch Hitze oder Capsaicin, dem Inhaltsstoff des Chilis, und zusätzlich durch die Substanz LPA verursacht. Ein weiteres Mitglied der TRP-Familie, der TRPA1-Kanal, ist bei der verstärkten Nozizeption während einer Entzündung involviert. Werden TRESK- und TRP-Kanäle in Xenopus Oozyten ko-exprimiert, verursacht LPA gleichzeitig einen Kationeneinwärts- wie auch -auswärtsstrom. Unter diesen Bedingungen verschob sich das Umkehrpotenzial in einen Bereich zwischen den Umkehrpotenzialen von Oozyten, die nur den K+-Kanal exprimieren und von Oozyten, die nur den unspezifischen Kationenkanal exprimieren. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, dass die LPA-induzierte Ko-Aktivierung von TRP-Kanälen und TRESK zu einer Begrenzung des exzitatorischen Effekts führen kann. Die DRG-ähnlichen F11-Zellen exprimieren keine TRESK-Kanäle. Sie sind in der Lage durch Strompulse Aktionspotenziale zu generieren. Mit TRESK transfizierte F11-Zellen zeigten eine Verschiebung des Umkehrpotenzials in negative Richtung, einen größeren Auswärtsstrom und den Verlust von spannungsgesteuerten Natriumkanälen. Auch hohe Strompulse konnten keine Aktionspotenziale mehr auslösen. Bei Spannungs-Klemme-Messungen von primären DRG-Neuronen von TRESK[wt]-Mäusen erhöhte sich der IKSO nach Zugabe von LPA um über 20 %. Im Gegensatz dazu zeigten DRG-Neurone von TRESK[ko]-Mäusen unter diesen Bedingungen eine leichte Hemmung des IKSO von etwa 10 %. In Neuronen, die TRPV1 exprimieren, führte LPA nicht nur zum Anstieg des IKSO, sondern auch zur Aktivierung eines Einwärtsstromes (TRPV1). Im Vergleich dazu wurde in TRESK[ko]-Neuronen durch LPA nur der Einwärtsstrom aktiviert. In Strom-Klemme-Experimenten führte LPA-Applikation zur Entstehung von Aktionspotenzialen mit höherer Frequenz in Zellen von TRESK[ko]-Mäusen im Vergleich zu Zellen von TRESK[wt]-Mäusen. Zusätzlich wurde die Erregung, die durch Strompulse von 100 pA ausgelöst wurde, in den beiden Genotypen durch LPA unterschiedlich moduliert. Die Aktionspotenzialfrequenz in TRESK[wt]-Neuronen wurde gesenkt, in TRESK[ko]-Neuronen wurde sie erhöht. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Erregung nozizeptiver Neurone durch LPA aufgrund der Ko-Aktivierung der TRESK-Kanäle abgeschwächt werden kann. Die Erregbarkeit von sensorischen Neuronen wird strak durch die Aktivität und Expression der TRESK-Kanäle kontrolliert. Deswegen sind TRESK-Kanäle gute Kandidaten für die pharmakologische Behandlung von Schmerzkrankheiten. N2 - Pain sensation is essential for survival. Chronic pain lost its physiological function and is categorized as a disease. Pain sensation is initiated by nociception. The cell bodies of nociceptive neurons are located in dorsal root ganglia (DRG) and trigeminal ganglia (TG). In DRG neurons TRESK two-pore-domain potassium channels (K2P) constitute the major current component of the standing outward current IKSO. A prominent physiological role of TRESK channels has been attributed to the regulation of pain sensation. During inflammation mediators of pain e.g. histamine, bradykinin, serotonin and lysophosphatidic acid (LPA) are released and modulate nociceptive signaling by activation of their G-protein coupled receptors (GPCR) or ionic channels. By means of RT-PCR and a newly developed antibody the co-expression of TRESK channels, channels of the transient-receptor-potential (TRP) cation channel family and LPA receptors in DRG neurons were demonstrated. Recombinant co-expression of TRESK channels and LPA2 receptors in Xenopus oocytes revealed an almost 10 fold activation of basal K+ currents upon LPA application with an EC50 of 0.2 µM LPA. Using mutant TRESK[PQAVAD] or application of the phospholipase C (PLC) inhibitor U73122 blocked current augmentation by LPA indicating cellular signaling via PLC pathway and calcineurin binding to TRESK channels. TRESK was the only member of the K2P family that showed a LPA induced activation of current. TREK- und TASK-1 currents were inhibited through LPA. In small diameter DRG neurons nociception results from TRPV1 channel activation by painful stimuli including the inflammatory substance LPA or activation of TRPA1 channels during inflammation. When TRESK and TRP channels are co-expressed in Xenopus oocytes cationic inward and outward currents were simultaneously activated by LPA. Under these conditions the reversal potential of ramp recordings was intermediate to recordings from oocytes expressing only the K+ or the unspecific cation channel. Principally this finding demonstrates that TRESK activation by an inflammatory substance dampens noxious excitation induced by the same agent. DRG-like F11 cells lacking endogenous TRESK channels generate action potential upon current stimulation. However when TRESK channels were recombinantly expressed in F11 cells, they exhibit a shift of the reversal potential to more negative values, a larger outward current and a loss of voltage-gated sodium currents. Accordingly, depolarizing pulses failed to elicit action potentials. In patch-clamp recordings from primary cultured DRG neurons of TRESK[wt] mice IKSO currents increased after application of LPA by over 20 % whereas under these conditions IKSO currents of neurons from TRESK[ko] mice decreased moderately by about 10 %. In TRPV1 positive neurons LPA application induced in TRESK[wt] neurons not only an activation of the IKSO but also an increase of the inward (TRPV1) current. In contrast, in TRESK[ko] neurons LPA only activated an inward (TRPV1) current. Under current-clamp conditions LPA application elicited spike trains in DRG neurons, with higher frequency in cells of TRESK[ko] mice than in cells of TRESK[wt] animals. In addition, upon depolarizing pulses (100 pA) excitability was differentially modulated by LPA in these genotypes. Spike frequency was attenuated in TRESK[wt] neurons and augmented in TRESK[ko] neurons. Accordingly, excitation of nociceptive neurons by LPA is balanced by co-activation of TRESK channels. It is evident that the output of sensory neurons is strongly controlled by the activity and the expression of TRESK channels, which therefore are good candidates for the pharmacological treatment of pain disorders. KW - Kaliumkanal KW - Schmerz KW - Entzündungschmerz KW - Nozizeptor KW - Entzündung Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119077 ER - TY - THES A1 - Hummel, Jonas Florian T1 - Hüllproteine endogener Retroviren interferieren mit der allostimulatorischen Aktivität dendritischer Zellen T1 - Human endogenous retrovirus envelope proteins target dendritic cells to modulate T-cell activation N2 - Das humane Genom besteht zu ungefähr 8 % aus humanen endogenen Retroviren (HERVs), jedoch sind viele aufgrund von Mutationen oder Deletionen nicht mehr funktionell. Trotzdem wurden funktionelle HERV-Proteine gefunden, welche offene Leserahmen (ORFs) besitzen und für funktionelle Hüll-Glykoproteine wie z.B. Syncytin-1, Syncytin-2 und HML-2 kodieren. Diese HERV-Hüllproteine beinhalten eine suppressive Domäne (SU) und induzieren möglicherweise eine Immunsuppression diverser Immunzellen während einer gesunden Schwangerschaft. In dieser Arbeit wurden spezifisch die modulatorischen Eigenschaften verschiedener HERVHüllproteine (Syncytin-1, -2 und HML-2) auf Immunzellen untersucht. Wir konnten zeigen, dass die HERV-Bindungsrezeptoren ASCT-1, -2 und MFSD2A auf der Oberfläche von T-Zellen und DCs exprimiert werden. Für funktionelle Experimente wurden HERV-Hüllproteine transgen in CHO-Zellen exprimiert, die als Effektorzellen in Ko-Kultur- Systemen verwendet wurden. Es konnte keine Hemmung der PMA/Ionomycin-stimulierten T-Zell-Proliferation durch die Effektorzellen gefunden werden. Darüber hinaus beeinträchtigten die Effektorzellen nicht die Expression von Reifungsmarkern auf DCs nach LPS-Aktivierung, induzierten jedoch die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine IL- 12 und TNF-α. Dagegen inhibierten die konstitutiv HERV-Hüllprotein-exprimierenden Chorionkarzinom-Zelllinien BeWo und JEG die PMA/Ionomycin-stimulierte T-Zell- Proliferation sehr effektiv. Die Chorionkarzinom-Zelllinien hatten ebenfalls keinen Einfluss auf die phänotypische LPS-DC-Reifung, modulierten aber die LPS-DC-Zytokin-Antwort sehr effektiv zu einem suppressiven Profil durch eine Inhibition der pro-inflammatorischen Zytokine IL-12 und TNF-α sowie einen Anstieg von anti-inflammatorischem IL-10. BeWound JEG-Zellen, aber auch HERV-Hüllprotein-exprimierende Effektorzellen verändern die durch LPS-DC-stimulierte allogene T-Zell-Proliferation. Dies war mit einer verringerten Bildung von DC/T-Zell-Konjugaten sowie mit einer Hemmung der IFN-γ-Sekretion und der Ca2+-Mobilisation dieser T-Zellen assoziiert. Des Weiteren wurden eine reduzierte p-Tyrosin- Akkumulation und kein Ausschluss des F-Aktin-Signals in der immunologischen Synapse, der Kontaktstelle dieser DC/T-Zell-Konjugate, gefunden. Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse vermuten, dass HERV-Hüllproteine die T-Zell- Proliferation nicht direkt beeinflussen, sich aber modulierend auf DCs auswirken und dadurch mit deren allogene T-Zell-Proliferation interferieren. N2 - Human endogenous retroviruses (HERVs) comprise about 8 % of the human genome but many are not functional due to mutations or deletions. However, some HERVs have been reported to harbor open reading frames (ORFs) and are coding for functional envelope (env) glycoproteins (Syncytin-1, Syncytin-2 and HML-2). These HERV env glycoproteins have suppressive domains (SU) and may modulate immune cells especially in the placenta where they are highly expressed. In this work, we investigated the ability of different HERV envs (Syncytin-1, -2 and HML-2) to modulate immune cell function. We showed that HERV binding receptors ASCT-1, -2 and MFSD2A are expressed by T-cells and DCs. For functional analysis, HERV envs were transiently expressed in CHO-cells which were then used as effector cells for co-culture assays. We demonstrated that HERV env expressing CHO effector cells did not significantly inhibit PMA/Ionomycin stimulated T-cell proliferation, and did not prevent phenotypic maturation of DCs in response to LPS. However, they did strongly augment the release of the pro-inflammatory cytokines IL-12 and TNF-α from LPS-DCs. In contrast, BeWo and JEG choriocarcinoma cell-lines constitutively expressing HERV env proteins reduced the T-cell proliferation very effectively. These celllines did not prevent phenotypic maturation of LPS-DCs, but shifted their cytokine response towards an immune suppressive profile by inhibiting the pro-inflammatory cytokines IL-12 and TNF-α and enhancing the release of the anti-inflammatory cytokine IL-10. The choriocarcinoma cell-lines and CHO effector cells inhibited the LPS-DC induced allogenic Tcell- proliferation. This was associated with a loss of DC/T-cell conjugate frequency as well as with an impairment of IFN-γ release and Ca2+ mobilization in T-cells. In addition, we observed an aberrant pattern of p-tyrosine and F-actin signal in the interface of these DC/Tcell conjugates. Altogether, these findings suggest that HERV proteins do not target T-cell activation directly, but modulate the DCs' ability to promote T-cell expansion. KW - Syncytin KW - dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - HERV KW - immunologische Synapse KW - DC/T-Zell-Konjugate KW - T-Zelle Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118964 ER - TY - THES A1 - Rund, Stefan A. T1 - Interferenz des probiotischen Escherichia coli Stammes Nissle 1917 mit Adhäsion, Replikation und Shiga Toxin Produktion von EHEC Stämmen in vitro T1 - Interference of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 with adhesion, replication and Shiga toxin production of EHEC strains in vitro N2 - E. coli Nissle 1917 (EcN) zählt durch seine fast hundertjährige Nutzung als Arzneimittel und aufgrund der weitreichenden Forschung während der letzten Jahrzehnte mittlerweile zu einem der am besten untersuchten Probiotika. EcN wird als Medikament zur Remissionserhaltung von Patienten mit Kolitis, bei chronischer Verstopfung und bei Durchfall von Kleinkindern eingesetzt. Der enteroaggregative – hämorrhagische - E. coli (EAHEC) mit dem Serotyp O104:H4 war 2011 in Deutschland für den bisher größten EHEC-Ausbruch seit Beginn der Aufzeichnungen verantwortlich. Es fehlt bis zum heutigen Tage immer noch an effektiven Möglichkeiten einer Infektionsprophylaxe oder einer Behandlung der Erkrankung. Ein alternatives Therapeutikum wird daher dringend benötigt. In dieser Arbeit wurden die antagonistischen Effekte von EcN auf pathogene E. coli Stämme wie dem EHEC Stamm EDL933 oder klinischen EAHEC O104:H4 Isolaten untersucht. Es wurden die Auswirkungen von EcN auf die Adhäsion an humane Epithelzellen, das Wachstum und die Shiga Toxin Produktion der pathogenen Stämme untersucht. Zusätzlich wurde die Resistenz von EcN gegenüber Shiga Toxin Phagen nachgewiesen. Zunächst wurde die Adhäsionseffizienz der verschiedenen E. coli Stämme bestimmt. Der am schlechtesten an die humanen Epithelzelllinien Caco-2 und LS-174T adhärierende Stamm war EcN. Dies ist insofern überraschend, da von Probiotika erwartet wird, besser als Pathogene an Epithelzellen zu adhärieren. Dem ungeachtet konnte jedoch gezeigt werden, dass EcN die Adhäsion von zwei EAHEC O104:H4 Isolaten, des nahe verwandten enteroaggregativen E. coli (EAEC) Stammes 55989 und des enterohämorrhagischen (EHEC) E. coli Stammes O157:H7 EDL933 an beide Zelllinen hemmt. Die von EcN produzierten Mikrozine M und H47 konnten hier für einen Teil des beobachteten anti-adhäsiven Effektes von EcN auf die pathogenen E. coli Stämme verantwortlich gemacht werden. Die Mikrozine wurden hier als einzige Substanz, die das Wachstum der pathogenen E. coli Stämme beeinflusst, identifiziert. Einer der wichtigsten Virulenzfaktoren von EAHEC und EHEC Stämmen ist das Shiga Toxin. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass EcN die Shiga Toxin Produktion der am häufigsten auftretenden EHEC Stämme (´Big Five´: O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H25) und der klinischen Isolate von EAHEC O104:H4 im Zellkulturmedium DMEM hemmt. Auffällig war, dass die Stx1 Produktion von EHEC O103:H2 und O111:H- nicht nur von EcN, sondern auch von E. coli K-12 Stamm MG1655, gehemmt wurde, im Gegensatz zur EcN-spezifischen Blockierung der Stx2-Produktion in den Serotypen O104:H4, O26:H11, O145:H25. Die Reduktion der Stx-Produktion in EAHEC O104:H4 TY3730 und TY3456, sowie EHEC O26:H11 war zum Teil von der Mikrozinproduktion abhängig. Diese hatte jedoch keinen Einfluss auf die Stx-Produktion in EHEC O157:H7 EDL933 und EHEC O145:H25. Bei Verwendung von LB-Medium zeigte sich im Gegensatz zum DMEM-Medium keine Mikrozin-Abhängigkeit der Toxinproduktion bei den EAHEC Isolaten TY3730 und TY3456. Die Toxinproduktion von EHEC EDL933 wurde ebenfalls nicht durch die Deletion der Mikrozin-Gene in EcN beeinflusst. Studien der Toxinproduktion in SCEM-Medium zeigten ebenfalls eine EcN-Dosisabhängige Reduktion der Stx-Produktion in Co-Kultur. Um den Mechanismus der Hemmung der Stx-Produktion zu untersuchen, wurden Versuche mit der EcN-Mutante EcN::luxS durchgeführt. Diese Deletion des AI-2 ´Quorum sensing´ Moleküls in EcN hatte allerdings keinen Einfluss auf die Hemmung der Stx-Produktion. Der Einsatz von Acetat führte, im Gegensatz zu publizierten Ergebnissen, nicht zu einer Reduktion der Stx-Produktion. Auch eine Beeinflussung der Lyse der EHEC-Bakterien, oder der Verminderung der Sekretion von Shiga Toxin durch EcN, konnte widerlegt werden. Zur Untersuchung der Stx-Expression wurde ein Assay mit einem biolumineszenten C-P (Chromosom-Plasmid) Reporter System etabliert. Damit konnte die Shiga Toxin Expression im Stammhintergrund EHEC EDL933 in Echtzeit untersucht werden. Hier wurde wiederum eine Reduktion der Shiga Toxin Expression in Co-Kultur mit EcN erfolgreich nachgewiesen. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass EcN nicht nur die Shiga Toxin Produktion von nicht-induzierten EAHEC Bakterien, sondern auch in mit Mitomycin C induzierten Bakterien hemmt. Als wichtiger Sicherheitsaspekt einer Behandlung mit EcN wurde die Resistenz von EcN gegenüber Shiga Toxin Phagen untersucht. Die Infektion der Bakterien wurde hierbei mit stx-spezifischer PCR, Phagen-Plaque-Assay, Stx-ELISA und K+-Efflux Assay untersucht. Es konnte durch diese verschiedenen Methoden erfolgreich gezeigt werden, dass EcN nicht durch Shiga Toxin Phagen infiziert wird. Als möglicher Resistenzmechanismus kommt hier eine Mutation vom Phagenrezeptor LamB in Frage, was jedoch noch bestätigt werden muss. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit wichtige antagonistische Effekte von EcN auf pathogene E. coli Stämme untersucht, die als Grundlage von neuen und dringend benötigten Behandlungen von EHEC-Infektionen dienen können. N2 - Due to extensive studies in the last decades and its centennial application as a pharmaceutical, E. coli Nissle 1917 (EcN) is among the best characterized probiotics. EcN is used as remedy for remission maintenance of ulcerative colitis, chronic obstipation and diarrhea in children. The enteroaggregative – haemorrhagic - E. coli (EAHEC) strain O104:H4 was responisible for one of the biggest outbreaks of EHEC recorded so far, that took place in Germany in 2011. Currently, there is no effective prophylaxis or treatment available for EHEC infections in humans. Therefore, alternative therapeutics are desperately needed. The antagonistic effects of EcN on pathogenic E. coli strains like the EHEC O157:H7 strain EDL933 or clinical isolates of EAHEC O104:H4 were investigated in this study. The influence of EcN on adhesion to human epithelial cell lines, the growth and the Shiga toxin production of pathogenic strains were analysed. Furthermore, the resistence of EcN against Shiga toxin phages was proven. Initially, the adhesion efficiency of EcN and pathogenic E. coli strains were determined in monocultures. EcN showed the lowest number of adhering bacteria to Caco-2 and LS-174T cells. This was insofar surprising, since probiotics are expected to adhere more efficiently to epithelial cells than pathogens. Regardless of this fact, it could be shown that EcN is inhibiting the adhesion of two EAHEC O104:H4 isolates, the closely related EAEC strain 55989 and the EHEC O157:H7 strain EDL933 to both cell lines. The microzins M and H47, which are produced by EcN, can be held responsible for a fraction of the observed anti-adhesive effect of EcN. The Microzins were also identified as the only substance that was influencing the growth of the pathogenic E. coli strains. One of the most important virulence factors of EHEC and EAHEC strains is Shiga toxin. In this study could be shown, that EcN is inhibiting the Shiga toxin production of the most common EHEC strains (big five: O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H25) and two clinical isolates of EAHEC O104:H4 in the cell culture medium DMEM. Interesingly, the Shiga toxin 1 production of EHEC O103:H2 and O111:H- was not only reduced by EcN, but also the E. coli K-12 strain MG1655. In contrast, the Stx2 production of the serotypes O104:H4, O26:H11, O145:H25 was only blocked by EcN. The reduction of the Shiga toxin production in EAHEC O104:H4 TY3730 und TY3456, as well as EHEC O26:H11 was partly dependent on the microcin production of EcN. No influence of microzins on the Stx production of EHEC O157:H7 EDL933 and EHEC O145:H25 was detected. When using LB-medium instead of DMEM-medium, no influence of microzin on the Shiga toxin production of neither EAHEC TY3730 and TY3456, nor EHEC EDL933 could be shown. Experiments with SCEM-medium also resulted in an EcN-dose-dependent inhibition of Shiga toxin production of pathogenic E. coli strains in co-culture with EcN. In order to investigate the mechanism responsible for the observed effects, the EcN mutant EcN::luxS was used in co-culture experiments. However, the deletion of the quorum sensing molecule AI-2 in EcN::luxS had no influence on the Stx production. Using acetate in the experiments did not, in contrast to published results, lead to a reduction of Shiga toxin production. In addition, an influence of EcN on lysis of EHEC strains or the secretion of Shiga toxin could be ruled out. To study the Shiga toxin expression an assay with a bioluminescent C-P (chromosome-plasmid) reporter system was successfully established. Here, Shiga toxin expression could be monitored in real time with the strain background EHEC EDL933. Moreover, a reduction of Shiga toxin expression in co-culture with EcN could be detected. In further experiments could be shown, that EcN is not only reducing the Shiga toxin production in uninduced bacteria, but also in the Mitomycin C induced EAHEC O104:H4 strain TY3730. An important safety issue, in order to use EcN as a pharmaceutical against EHEC strains, is the resistance of EcN against Shiga toxin phages. The infection of bacteria was here investigated with phage plaque assay, stx-PCR, Stx-ELISA and K+-efflux assay. With these different methods could be successfully shown, that EcN is not infected by the tested Shiga toxin phages. A mutation in the phage receptor LamB could be a possible, but still unconfirmed, phage resistance mechanism of EcN. In summary, this study showed important antagonistic effects of EcN against pathogenic E. coli strains, which could be the foundation of new and desperately needed treatment options of EHEC infections. KW - EHEC KW - Probiotikum KW - Escherichia coli KW - E. coli Nissle Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104837 ER - TY - THES A1 - Spannaus, Ralf T1 - Regulation der foamyviralen Proteaseaktivität T1 - Regulation of the foamy viral Protease Activity N2 - Alle Retroviren prozessieren ihre Pol- und Strukturproteine mit Hilfe der viralen Protease. In dieser Arbeit wurden zentrale Mechanismen der Regulation der foamyviralen Protease untersucht und charakterisiert. Dazu wurde eine chromatographische Virusreinigungsmethode entwickelt und die relative Pol- und Env-Enkapsidierung bestimmt. Foamyviren enthalten weniger Pol als andere Retroviren aber deutlich mehr Env als humane Immunodefizienzviren. Die Pol-Inkorporation könnte durch die limitierte Prozessierung mit nur einer einzigen Schnittstelle in Gag und Pol kompensiert werden. Deshalb wurde untersucht, ob die foamyvirale Protease ein beschränktes Schnittstellenrepertoire aufweist. In Zellkulturen sind die Schnitt-stellenpositionen P2’ und P2 auf die Aminosäurereste Valin und Valin/Asparagin beschränkt. Demnach hat die foamyvirale Protease ein eingeschränkteres Schnittstellenrepertoire als die Protease des humanen Immunodefizienzvirus. Weiterhin wurde hier gezeigt, dass die vollständige reverse Transkription die Prozessierung von Gag voraussetzt und Proteaseaktivität-defiziente oder Gag-Schnittstellen-defiziente Viren keine vollständige cDNA bilden können. Demnach kompensieren Foamyviren die niedrige Proteasekonzentration, indem sie sicherstellen, dass die reverse Transkription erst nach der Gag-Maturation vollendet werden kann. Weiterhin wird bei humanen Immunodefizienzviren durch die Gag-Maturation die essenzielle Mobilität der wenigen Env-Trimere auf der Hüllmembran getriggert. Die erstmals in dieser Arbeit bei Foamyviren quantifizierte Env-Menge ergab, dass Foamyviren 28 mal mehr Env- pro Gag-Molekül als humane Immunodefizienzviren besitzen. Wahrscheinlich dient dieser hohe Env-Gehalt der Kompensation der eingeschränkten Env-Mobilität, die durch die limitierte Gag-Prozessierung an nur einer carboxyterminalen Schnittstelle verursacht wird. Da für die Aktivierung der foamyviralen Protease virale Ribonukleinsäure benötigt wird, wurde untersucht, welche Pol-Domänen für die Aktivierung der Protease benötigt werden. Im Gegensatz zur Integrase, deren Deletion in reduzierter Proteaseaktivität resultierte, war die funktionelle RNaseH-Domäne essenziell für die Gag-Prozessierung. Die Substitution der foamyviralen RNaseH durch RNaseH-Domänen von anderen Retroviren resultierte in genomunabhängiger Proteaseaktivität in Zellen und genomabhängiger Proteaseaktivität in den rekombinanten Viren. Demnach scheint die dimerstabilisierende Funktion der RNaseH durch direkte Protein-Protein-Interaktion oder durch unspezifische RNA-Bindung verursacht zu werden. N2 - Retroviral Pol and structural proteins are processed by the viral protease. Here, central mechanisms of the foamy viral protease regulation were investigated and characterized. For determination of the relative Pol and Env encapsidation a novel chromatographic purification method was developed. In comparison with human immunodeficiency viruses, foamy viruses encapsidate less Pol but significantly more Env. Foamy viruses might compensate these low Pol amount by limiting Gag and Pol processing to a single cleavage site. I sought to investigate, whether a limited cleavage site repertoire of foamy viral protease might be a consequence of this restriction. In cell culture positions P2’ and P2 within the cleavage sites are invariant and restricted to valine and valine/asparagine, supporting the conclusion that foamy viral protease cleavage at more specific sites than its human immunodeficiency viral counterpart. Secondly, I could show that complete foamy viral reverse transcription is dependent on Gag maturation, since viruses deficient in protease activity or with an inactive Gag cleavage site were incapable of producing cDNA beyond the first strong stop. Thus, low protease encapsidation is compensated by a delay of the reverse transcription until sufficient Gag maturation occurred. The human immunodeficiency viral Gag processing triggers the mobility of the few Env trimmers on the viral membrane. This Env clustering was shown to be essential for infectivity. Here, foamy viral Env was quantified and found that foamy viruses incorporate 28 times more Env per Gag molecule than the human immunodeficiency viruses. It seems to be likely that these higher Env amounts are required to compensate for the lack of Env mobility due to the restricted Gag processing at a single site at the carboxyl terminus. The dimerization and activation of the foamy viral protease depends on the binding of viral RNA and protein-protein interactions. Since the protease is active in the Pol and in the PRRT context the Pol domains essential for protease activity were mapped. While deletion of the integrase in context of recombinant viruses resulted in reduced protease activity further deletion of the RNase H domains abolished protease function. Substituting the RNase H domain with the RNase H of other retroviruses could restore protease activity even in the absence of viral RNA in cells , but not in viruses. Thus, the RNase H domains serve as protein-protein interaction domain or might dimerize the PRRT domains by binding to unspecific RNA. KW - Spumaviren KW - Proteasen KW - Regulation KW - Reverse Transkriptase KW - Enzymaktivierung KW - Protease KW - protease KW - Foamyviren KW - foamy viruses KW - Regulation KW - regulation KW - reverse Transkription KW - reverse transcription KW - Proteaseaktivität KW - protease activity Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113401 ER - TY - THES A1 - Arnold, Eva T1 - Bedeutung von Desmoglein 2 und Desmoglein 3 für die interzelluläre Adhäsion in Keratinozyten T1 - Importance of desmoglein 2 and desmoglein 3 for intercellular adhesion in keratinocytes N2 - Desmogleine (Dsg1-4) sind transmembranäre Adhäsionsproteine aus der Gruppe der desmosomalen Cadherine, die Zell-Zell-Kontakte zwischen benachbarten Keratinozyten der Epidermis in und außerhalb von Desmosomen vermitteln. Eine durch Autoantikörper induzierte Störung dieser Haftstrukturen (hauptsächlich Dsg1 und Dsg3) resultiert im klinischen Bild der Pemphigus-Erkrankung. Dieses ist makroskopisch durch eine Blasenbildung der Haut gekennzeichnet. Auf zellulärer und molekularbiologischer Ebene lassen sich im Falle von Pemphigus vulgaris (PV) eine Retraktion des Zytoskeletts, eine Reduzierung der Dsg3-Proteinmenge und eine Aktivierung verschiedener Signalwege u.a. der p38MAPK nachweisen. PV eignet sich daher als Modellerkrankung zur Untersuchung der Bedeutung desmosomaler Cadherine für die interzelluläre Adhäsion in Keratinozyten. Durch zahlreiche Studien wurde die wichtige Funktion von Dsg3 als Adhäsionsprotein bestätigt und eine Beteiligung an der Modulation zahlreicher Signalwege, die in Zusammenhang mit der Pemphigus-Pathogenese stehen, untersucht. Im Gegensatz dazu konnte bisher keine spezifische Funktion des desmosomalen Cadherins Dsg2 in der Epidermis identifiziert werden. Dsg2 kommt als einziges Desmoglein in allen Geweben vor, die Desmosomen enthalten, und ist auch an den Zell-Zell-Kontakten im Myokard und Darmepithel vorhanden, wo kein Dsg1 und Dsg3 exprimiert werden. Hier nimmt Dsg2 eine wichtige Rolle als Adhäsionsmolekül und als Regulator interzellulärer Prozesse ein. In dieser Arbeit wurde daher vergleichend die Bedeutung von Dsg2 und Dsg3 für die interzelluläre Adhäsion in Keratinozyten im Hinblick auf ihre Funktion als Adhäsionsmolekül und als Rezeptormolekül, speziell im p38MAPK-Signalweg, untersucht. Wesentliche Unterschiede zeigten sich zunächst in der Lokalisation beider Proteine. Während sich die in der Literatur beschriebene Lokalisation von Dsg3 im Stratum basale und spinosum der Epidermis bestätigte, konnte Dsg2 nur am Haarfollikel nachgewiesen werden. In differenzierten HaCaT-Zellen, einer Keratinozyten-Zelllinie war Dsg2 eher punktförmig und Dsg3 nahezu linear an der Zellmembran lokalisiert. Dementsprechend ließ sich Dsg2 nach Triton-vermittelter Zellfraktionierung in ähnlicher Verteilung zwischen der Zytoskelett-gebunden und -ungebundenen Fraktion nachweisen wie Desmoplakin, das an der Zellemembran ausschließlich in Desmosomen vorkommt. Durch Dsg-spezifische Antikörper, deren inhibitorische Eigenschaft in zellfreien AFM-Studien nachgewiesen wurde, konnte nur eine Inhibierung der Dsg3- und nicht der Dsg2-vermittelten Adhäsion in HaCaT-Zellen erzielt werden. Im Gegensatz dazu induzierte derselbe Dsg2-spezifische Antikörper einen signifikanten Haftungsverlust in einer Darmepithelzelllinie. Die mittels siRNA induzierte Reduzierung der Dsg2-Proteinmenge führte jedoch nur unter erhöhter mechanischer Belastung der Zellen zu einem Adhäsionsverlust. Die simultane Modulation der Funktion von Dsg2 und Dsg3 mittels siRNA bzw. der Inkubation Dsg2-depletierter Zellen mit AK23, einem inhibitorischen Dsg3-spezifischen Antikörper, resultierte in einem drastischen, teilweise p38MAPK-abhängigen, Adhäsionsverlust. Dieser Befund lieferte erste Hinweise auf eine kompensatorische Funktion von Dsg2 bei eingeschränkter Dsg3-vermittelter Haftung in Keratinozyten. Um dies näher zu untersuchen, wurde die Verteilung von Dsg2 an der Zellemembran Dsg3-depletierter HaCaT-Zellen untersucht. Der Verlust von Dsg3 resultierte hierbei in einer Zunahme und Linearisierung der Dsg2-Membranfärbung, was die Hypothese einer kompensatorischen Funktion im Falle einer Beeinträchtigung der Dsg3-Funktion bekräftigt. Um die Funktion von Dsg2 unter dieser Bedingung gezielter zu untersuchen, wurde das transgene Dsg3-Mausmodell eingesetzt und primäre Keratinozyten aus neonatalen Dsg3-defizienten und nicht-Dsg3-defizienten Geschwistertieren isoliert. Entsprechend der vorhergehenden Befunde zeigten die Dsg3-defizienten Zellen eine deutliche Zunahme der Dsg2-Membranlokalisation sowie zusätzlich eine erhöhte DSG2-mRNA-Expression, allerdings bei unveränderten Dsg2-Proteinmengen. Weiterhin wurde die Funktion von Dsg2 und Dsg3 als Modulator des p38MAPK-Signalweges näher untersucht. Der für Dsg3 identifizierte Komplex mit der phosphorylierten Form der p38MAPK (p-p38MAPK) konnte für Dsg2 nicht nachgewiesen werden. Ebenso führte eine Reduzierung der Dsg2-Proteinmenge, im Gegensatz zur Reduzierung der Dsg3-Proteinmenge, nicht zur Aktivierung der p38MAPK und einer Retraktion des Zytoskeletts. Der direkte Zusammenhang zwischen einem Dsg3-Funktionsverlust und der p38MAPK-Aktivität ließ sich dadurch bestätigen, dass sowohl die Keratinretraktion als auch der Haftungsverlust nach Dsg3-Depletion durch den Einsatz eines p38MAPK-spezifischen Inhibitors partiell inhibierbar waren. Auch in primären Keratinozyten mit vollständiger Dsg3-Defizienz verbesserte eine p38MAPK-Inhibierung die Zelladhäsion. Ebenso wurde in Dsg3-defizienten Zellen im Vergleich zu Zellen mit endogener Dsg3-Expression eine deutliche Lokalisation der p-p38MAPK an der Zellmembran nachgewiesen, was darauf schließen lässt, dass möglicherweise in Abwesenheit von Dsg3 andere Membranproteine an der Regulation dieses Signalweges beteiligt sind. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine bisher nicht beschriebene Funktion von Dsg2 als Kompensationspartner für Dsg3 in Keratinozyten identifiziert und die Rolle von Dsg3 als Modulator des p38MAPK-Signalweges näher charakterisiert. N2 - Desmogleins (Dsg1-4) are transmembrane adhesion proteins and members of the protein family of desmosomal cadherins which mediate cell-cell adhesion of adjacent keratinocytes inside and outside of desmosomes. Autoantibody-induced loss of binding of these proteins (mainly Dsg1 and Dsg3) results in the phenotype of Pemphigus vulgaris (PV). The patients suffer from erosions and lesions in skin and mucous membranes. Hallmarks of the disease on cellular level are the retraction of the keratin intermediate filaments, a depletion of Dsg3 and a modulation of several signaling pathways, e.g. p38MAPK. PV is therefore an important disease model to study the role of desmosomal cadherins for intercellular adhesion in keratinocytes. Numerous research groups confirmed the importance of Dsg3 as an adhesion protein and furthermore investigated a contribution of Dsg3 to signaling pathways in PV pathogenesis. In contrast, up to now no specific function for the desmosomal cadherin Dsg2 has been identified in the epidermis. Dsg2 is the only desmoglein isoform that is ubiquitously expressed in all desmosome-containing tissues and can also be identified in the cell-cell contacts of the myocardium and the intestinal epithelium in which Dsg1 and Dsg3 are absent. In both tissues, Dsg2 plays an important role as adhesion protein or regulator of intracellular processes. Therefore, in the present study the relevance of the two desmosomal cadherins Dsg2 and Dsg3 for intercellular adhesion was compared and their roles as modulators of the p38MAPK pathway were studied. Basic differences were identified in the localization of both proteins: Dsg2 was restricted to keratinocytes in the hair follicle in adult human skin, whereas Dsg3 was located in the basal and the suprabasal layers of the epidermis. In differentiated HaCaT cells, an immortalized keratinocyte cell line Dsg2 localization appeared to be punctuated along the cell membrane whereas Dsg3 showed a linear distribution. Accordingly, Dsg2 was predominantly detectable in the cytoskeleton-anchored, desmosome-containing protein pool after Triton-X-100-mediated cell fractionation predominantly. Using Dsg-specific antibodies which were proven to be inhibitory in cell-free studies by atomic-force microscopy, loss of cell cohesion was detectable after targeting of Dsg3 only. In contrast, the same Dsg2-specific antibody induced a significant loss of cell-cell cohesion in an intestinal epithelial cell line. Interestingly, the siRNA-mediated reduction of Dsg2-protein levels induced a loss of cell cohesion under conditions of increased shear only. The simultaneous modulation of Dsg2 and Dsg3 by siRNA or by incubation of Dsg2-depleted cells with AK23, a pathogenic Dsg3-specific antibody, led to a drastic and partially p38MAPK-dependent loss of cell-cell adhesion. This indicated a compensatory role of Dsg2 under impaired Dsg3-function in keratinocytes. Therefore, in further studies the distribution of Dsg2 after transfection with Dsg3-specific siRNA was investigated. Indeed, Dsg3-depleted keratinocytes demonstrated a pronounced and linearized distribution of Dsg2 along the cell membrane which corroborated the hypothesis of Dsg2 compensating for Dsg3 under conditions of reduced Dsg3-binding properties. To further investigate the function of Dsg2 under conditions of complete loss of Dsg3, primary murine keratinocyte were isolated from Dsg3-knockout mice and their wild-type littermates. According to the results of the cell-culture model, Dsg3-deficient primary keratinocytes showed a prominent membrane localization of Dsg2 and increased levels of DSG2-mRNA but not of Dsg2-protein. Next, the function of Dsg2 and Dsg3 as modulators in the p38MAPK signaling pathway was investigated. The recently identified complex of Dsg3 with phosphorylated-p38MAPK (p-p38MAPK) was not detectable after Dsg2 immunoprecipitation. According to this, depletion of Dsg2 in contrast to Dsg3 did not result in activation of p38MAPK and p38MAPK-dependent keratin retraction. The protective effect of p38MAPK inhibition on both loss of cell-cell adhesion as well as keratin retraction after Dsg3-depletion confirmed the direct relation between loss of Dsg3-function and p38MAPK activation. Similarly, in primary murine keratinocytes lacking Dsg3, inhibition of p38MAPK was effective to improve cell adhesion. In these cells a more pronounced membrane localization of p-p38MAPK was detectable. This indicates that other membrane proteins play a role as regulators of this signaling molecule under conditions of Dsg3-deficiency. In summary, the results of this work identify a novel function for Dsg2 as compensation partner for Dsg3 and further characterize the role of Dsg2 and Dsg3 as modulators of the p38MAPK signaling pathway in keratinocytes. KW - Desmogleine KW - Pemphigus KW - Zellkontakt KW - Keratinozyt KW - Desmoglein 2 KW - Desmoglein 3 KW - p38MAPK Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109267 ER - TY - THES A1 - Weyhmüller Reboredo, Jenny T1 - Tissue Engineering eines Meniskus - Vom Biomaterial zum Implantat T1 - Tissue Engineering of a meniscus - from a biomaterial to the implant N2 - Der Meniskus, ein scheibenförmiger Faserknorpel, spielt im Kniegelenk eine bedeutende Rolle, weil er Kräfte und Druck im Kniegelenk gleichmäßig verteilt, Stöße dämpft sowie der Kraftübertragung und Stabilisierung dient. Durch die Entfernung des Gewebes, der sogenannten Totalmeniskektomie, nach einer Meniskusverletzung oder einem Riss, verändern sich die mechanischen Eigenschaften des Gelenks stark und verursachen durch die erhöhte Belastung der Gelenkflächen Arthrose. Arthrose ist weltweit die Häufigste aller Gelenkerkrankungen. Der Erhalt der körperlichen Leistungsfähigkeit und Mobilität bis ins hohe Alter sowie die Bewahrung der Gesundheit von Herz-Kreislauf- und Stoffwechselorganen zählen aufgrund des demografischen Wandels zu den großen medizinischen Herausforderungen. Die Erkrankung des muskuloskelettalen Systems stellte 2010 im Bundesgebiet die am häufigsten vorkommende Krankheitsart dar. Während Risse in den äußeren Teilen des Meniskus aufgrund des Anschlusses an das Blutgefäßsystem spontan heilen können, können sie dies in tieferen Zonen nicht. Durch die begrenzte Heilungsfähigkeit des Knorpels bleibt langfristig der Einsatz eines Ersatzgewebes die einzige therapeutische Alternative. In der vorliegenden Arbeit wurde als therapeutische Alternative erfolgreich ein vaskularisiertes Meniskusersatzgewebe mit Methoden des Tissue Engineering entwickelt. Es soll in Zukunft als Implantat Verwendung finden. Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Forschungsfeld, in dem Gewebe außerhalb des Körpers generiert werden. Schlüsselkomponenten sind Zellen, die aus einem Organismus isoliert werden, und Trägerstrukturen, die mit Zellen besiedelt werden. Die Biomaterialien geben den Zellen eine geeignete Umgebung, die die Extrazelluläre Matrix (EZM) ersetzen soll, um die Funktion der Zellen beizubehalten, eigene Matrix zu bilden. Zum Erhalt eines funktionelles Gewebes werden oftmals dynamische Kultursysteme, sogenannte Bioreaktoren, verwendet, die natürliche Stimuli wie beispielsweise den Blutfluss oder mechanische Kompressionskräfte während der in vitro Reifungsphase des Gewebes, zur Verfügung stellen. Das Gewebekonstrukt wurde auf Basis natürlicher Biomaterialien aufgebaut, unter Verwendung ausschließlich primärer Zellen, die später direkt vom Patienten gewonnen werden können und damit Abstoßungsreaktionen auszuschließen sind. Da der Meniskus teilvaskularisiert ist und die in vivo Situation des Gewebes bestmöglich nachgebaut werden sollte, wurden Konstrukte mit mehreren Zelltypen, sogenannte Ko-Kulturen aufgebaut. Neben mikrovaskulären Endothelzellen (mvEZ) und Meniskuszellen (MZ) erfolgten Versuche mit mesenchymalen Stammzellen (MSZ). Zur Bereitstellung einer zelltypspezifischen Matrixumgebung, diente den mvEZ ein Stück Schweinedarm mit azellularisierten Gefäßstrukturen (BioVaSc®) und den MZ diente eine geeig- nete Kollagenmatrix (Kollagen Typ I Hydrogel). Die Validierung und Charakterisierung des aufgebauten 3D Meniskuskonstrukts, welches in einem dynamischen Perfusions-Bioreaktorsystem kultiviert wurde, erfolgte mit knorpeltypischen Matrixmarkern wie Aggrekan, Kollagen Typ I, II und X sowie mit den Transkriptionsfaktoren RunX2 und Sox9, die in der Knorpelentstehung von großer Bedeutung sind. Zusätzlich erfolgten Auswertungen mit endothelzellspezifischen Markern wie vWF, CD31 und VEGF, um die Vaskularisierung im Konstrukt nachzuweisen. Analysiert wurden auch die Zellvitalitäten in den Konstrukten. Aufgrund einer nur geringen Verfügbarkeit von MZ wurden Kulturansätze mit alternativen Zellquellen, den MSZ, durchgeführt. Dafür erfolgte zunächst deren Isolation und Charakterisierung und die Auswahl einer geeigneten 3D Kollagenmatrix. Die beste Zellintegration der MSZ konnte auf einer eigens hergestellten elektrogesponnenen Matrix beobachtet werden. Die Matrix besteht aus zwei unterschiedlichen Kollagentypen, die auf insgesamt fünf Schichten verteilt sind. Die Fasern besitzen weiter unterschiedliche Ausrichtungen. Während die Kollagen Typ I Fasern in den äußeren Schichten keiner Ausrichtung zugehören, liegen die Kollagen Typ II Fasern in der mittleren Schicht parallel zueinander. Der native Meniskus war für den Aufbau einer solchen Kollagen-Trägerstruktur das natürliche Vorbild, das imitiert werden sollte. Nach der Besiedelung der Matrix mit MSZ, konnte eine Integration der Zellen bereits nach vier Tagen bis in die Mittelschicht sowie eine spontane chondrogene Differenzierung nach einer insgesamt dreiwöchigen Kultivierung gezeigt werden. Das Biomaterial stellt in Hinblick auf die Differenzierung der Zellen ohne die Zugabe von Wachstumsfaktoren eine relevante Bedeutung für klinische Studien dar. Zur Kultivierung des 3D Meniskuskonstrukts wurde ein Bioreaktor entwickelt. Mit diesem können neben Perfusion der Gefäßsysteme zusätzlich Kompressionskräfte sowie Scherspannungen auf das Ersatzgewebe appliziert und die Differenzierung von MZ bzw. MSZ während der in vitro Kultur über mechanische Reize stimuliert werden. Ein anderes Anwendungsfeld für den neuartigen Bioreaktor ist seine Verwendung als Prüftestsystem für die Optimierung und Qualitätssicherung von Gewebekonstrukten. N2 - The meniscus, a disk-shaped fibrous cartilage, plays an important role in the equal distribution of pressure, shock absorption, power transmission and stability within the knee joint. After a meniscus injury or a meniscus tear, a total meniscectomy is done where the complete tissue is removed. This leads to a change of mechanical properties in the joint and causes arthrosis by an increased strain on the joint surfaces. Wordwide arthrosis is the most frequent of all joint diseases. Due to the demographic change, maintaining physical fitness and mobility up to an old age are the main challenges besides ensuring health of the heart and circulatory system and of the metabolic organs. Musculoskeletal disorders represented the most frequent type of disease in Germany in 2010. While tears in the outer zone of the meniscus heal spontaneously because of its connection to the blood vessel system, tears in the deeper zones do not heal. Due to the limited healing capacity of cartilage the use of a replacement tissue is the only therapeutic alternative in the long run. In the present work a vascularized meniscus construct as therapeutic alternatives has been developed with the Tissue Engineering method for the further use as an implant. Tissue En- gineering is an interdisciplinary research field to generate tissues outside the body. The key components are isolated cells from an organism, and scaffolds, which are seeded with cells. Biomaterials provide a suitable environment that replaces the extracellular matrix (ECM) to maintain cell functionality to let cells build up their own matrix. To maintain a functional tissue during in vitro dynamic culture, bioreactor systems are used to provide natural stimuli such as blood flow or mechanical compression forces. The tissue construct is based on natural biomaterials and solely on primary cells, which later can be isolated directly from the patient and thereby exclude repulsion reactions. Due to its limited vascularity of the meniscus and the aim to build up at its best the in vivo situation more than one cell type is used to generate constructs, so called co-culture systems. Mesen- chymal stem cells (MSZ) besides microvascular endothelial cells (mvEZ) and meniscus cells (MZ) were used in the experiments. To supply a cell type specific matrix environment, a segment of a porcine jejunum with decellularized vascular structures (BioVaSc®) for the mvEZ and a collagen based matrix (collagen type I hydrogel) for the MZ were employed. The validation and characterization of the de- veloped 3D meniscus construct, that was cultured in a dynamic perfusion bioreactor system, was performed by using cartilage matrix specific markers, such as aggrecan, collagen type I, II and X, as well as the transcription factors RunX2 and Sox9 that are of major importance for cartilage development. Further analysis with endothelial cell specific markers, such as vWF, CD31 and VEGF were performed to evaluate the vascularization of the construct. Furthermore, cell vitality tests of the construct were made. Because of the limited availability of primary MZ, culture approaches with MSZ as an alter- native cell source were investigated. Cell isolation and characterization were performed and a suitable 3D collagen matrix was selected. The best cell integration of the MSZ could be observed on a specifically engineered electrospun matrix. The matrix consists of two different collagen types that are arranged in a total of five layers. The fibers are further orientated in different directions. While outer layers consist of randomly-aligned collagen type I fibers, the collagen type II fibers in the middle layer are aligned parallel to each other. The native meniscus tissue serves as natural example and its structure is replicated in such a collagen scaffold. After seeding the scaffold with MSZ, cell integration into the middle layer could be observed after four days, as well as a spontanous chondrogenic differentation after three weeks of culture. The biomaterial developed in this work has to be considered as relevant for clinical studies with regard to cell differentiation without adding growth factors to the culture. For the culture of 3D meniscus construct a bioreactor was successfully developed, that can apply compressive strength and shear stress to the tissue model in addition to perfusing the vascular system. With these measures the differentiation of MZ or MSZ could be induced with mechanical strains during the in vitro culture. Another field of application for the new bioreactor is its use as a test system for the optimization and quality control of the tissue models. KW - Tissue Engineering KW - Meniskustransplantation KW - Bioreaktor KW - Gewebekultur KW - Biomaterial KW - Elektrospinning KW - Implantatentwicklung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108477 ER - TY - THES A1 - Wittmann, Tanja T1 - Die Bedeutung von Phospholamban Pentameren für die Phospholamban-Phosphorylierung und die Regulation der SERCA2a-Aktivität T1 - The role of phospholamban pentamers for phospholamban phosphorylation and regulation of SERCA2a activity N2 - Phospholamban (PLN) reguliert in der Herzmuskelzelle die Aktivität der Kalzium-ATPase SERCA2a und damit maßgeblich die Kinetik des myozytären Kalzium-Kreislaufs. PLN liegt im Herz in Form von Monomeren und Pentameren vor, wobei angenommen wird, dass nur die Monomere die Aktivität der SERCA2a durch direkte Interaktion hemmen. Die Funktion der Pentamere ist noch immer unklar. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob PLN-Pentamere für die PKA-abhängige Phosphorylierung des PLN und damit für die Regulation der PLN-Aktivität von Bedeutung sein können. Mit Hilfe transfizierter HEK293AD-Zellen und verschiedener PLN-Mutanten wurde gezeigt, dass sowohl PLN-Monomere als auch -Pentamere durch die PKA phosphoryliert werden, wobei die Phosphorylierung der Monomere in Anwesenheit von Pentameren geringer ist und verzögert abläuft. Ohne Pentamer war die Phosphorylierung der Monomere dagegen bereits basal und nach moderater PKA-Stimulation stärker. Ursache dafür schien eine höhere Affinität der PKA für PLN-Pentamere als für Monomere zu sein. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass nicht nur PLN-Monomere sondern auch das PLN-Pentamer mit der SERCA2a interagieren und das Oligomer im Gegensatz zum PLN-Monomer nach PLN-Phosphorylierung zu einem kleinen Anteil an die SERCA2a gebunden bleibt. Auch spiegelten sich die unterschiedlichen Phosphorylierungsmuster von PLN-Pentamer und Monomer in den SERCA2a-Aktivitäten wieder. Messungen der SERCA2a-Aktivität in Mäuseherzen mit (Wildtyp und TgPLN) und ohne (TgAFA-PLN) PLN-Pentamere zeigten, dass Wildtyp-PLN und TgPLN die SERCA2a stärker inhibieren als TgAFA-PLN, was auf die stärkere basale Phosphorylierung des TgAFA-PLN zurückzuführen war. Nach PKA-Stimulation war der Anstieg der Enzymaktivität in Anwesenheit von TgPLN fast dreimal höher als in TgAFA-PLN. Analog zeigte TgPLN eine deutlichere Steigerung der Phosphorylierung der PLN-Monomere als TgAFA-PLN. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass PLN-Pentamere durch Hemmung der Monomer-Phosphorylierung deren Aktivität erhöhen mit der Folge einer verstärkten Inhibition der SERCA2a. Da die inhibitorische Wirkung durch PKA-Stimulation vollständig aufgehoben werden kann, erhöhen die Pentamere die Regulationsmöglichkeiten der SERCA2a-Aktivität. N2 - Phospholamban (PLN) regulates the activity of the calcium ATPase SERCA2a and thus the kinetics of myocyte calcium cycling. In the heart, PLN occurs in monomeric and pentameric form, however, only monomers are thought to inhibit the activity of SERCA2a by direct interaction. The function of the pentamer is still unclear. The aim of the present work was to investigate whether PLN pentamers may play a role for PKA dependent PLN phosphorylation and thus for regulating PLN activity. Using transfected HEK293AD cells and various PLN mutants, it was shown that both PLN monomers and pentamers get phosphorylated by PKA. Intriguingly, phosphorylation of monomers was delayed in the presence of pentamers but increased in the absence of pentamers, both under basal conditions and moderate PKA stimulation. The underlying reason for this observation turned out to be a higher affinity of PKA for PLN pentamers compared to monomers. Furthermore, not only PLN monomers but also PLN pentamers interacted with SERCA2a. Unlike monomers, a small proportion of PLN oligomers was still bound to SERCA2a following PLN phosphorylation. Further, SERCA2a activity reflected the different phosphorylation patterns of monomers and pentamers. Measurements of SERCA2a activity in mouse hearts with (Wildtyp-PLN; TgPLN) and without PLN pentamers (TgAFA-PLN) showed that wild-type PLN and TgPLN strongly inhibit SERCA2a due to stronger phosphorylation of TgAFA-PLN. After PKA stimulation, the increase of SERCA2a enzyme activity was almost three times higher in TgPLN than in TgAFA-PLN. Likewise, the increase of monomer phosphorylation was more pronounced in TgPLN than in TgAFA-PLN. Taken together, it was shown that PLN pentamers increase the activity of PLN monomers by attenuating monomer phosphorylation leading to increased inhibition of SERCA2a. Since this inhibition can be completely abolished by PKA stimulation, we conclude that PLN pentamers augment the regulatory range of SERCA2a. KW - Phospholamban KW - SERCA2a KW - Phosphorylierung KW - Herzmuskelzelle KW - Calciumtransport Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108286 ER - TY - THES A1 - Richter, Dominik T1 - Compressed Sensing zur Filterung und Reduktion der Rekonstruktionszeit in der Positronen-Emissions-Tomographie T1 - Compressed sensing for filtering and reduction of reconstruction time in positron emission tomography N2 - Durch die Verwendung radioaktiver Substanzen mit ihrer schädigenden Wirkung auf den menschlichen Körper besteht in der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ein fortwährendes Interesse an der Reduktion der applizierten Dosis bei gleichbleibender Qualität der Ergebnisse. Zusätzlich ist im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit der Systeme eine Reduktion sowohl der Akquisitions- als auch der Rekonstruktionszeit erstrebenswert. In dieser Arbeit werden zwei Möglichkeiten vorgestellt, diese Ziele durch den Einsatz von Compressed Sensing (CS) zu erreichen. Neben der Entwicklung neuartiger Rekonstruktionsalgorithmen können Filtertechniken eingesetzt werden, um eine qualitative Verbesserung rekonstruierter Bilder zu erzielen. Der Vorteil eines Filters besteht unter anderem darin, dass diese retrospektiv angewandt werden können. Es ist folglich möglich, die Qualität eines Bildes zu überprüfen und lediglich im Bedarfsfall einen Filter einzusetzen. Die Technik des CS war in den letzten Jahren Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten im Bereich der Bildgebung, insbesondere in der Magnetresonanztomographie und der Computertomographie (CT). Mit CS könnten bildgebende Verfahren wie die CT oder die PET mit weniger Messungen durchgeführt werden, wodurch sich die Messzeit und die Strahlenexposition reduziert. In der molekularen Bildgebung mit der PET ist CS jedoch weitgehend unbekannt. Im ersten Teil dieser Dissertation wird eine Methode vorgestellt, welche CS als Filtertechnik in der PET einsetzt. Den Ausgangspunkt stellt ein vollständiger, analytisch rekonstruierter Datensatz dar. Dieser wird mit einer Reihe unterschiedlicher Abtastmuster retrospektiv unterabgetastet und jeweils erneut, unter Verwendung von CS rekonstruiert. Im rauschfreien Fall würde CS stets das Originalbild liefern. Das überlagerte Rauschen führt jedoch zu Artefakten und einer Verschlechterung des Ergebnisses. CS kann nun einerseits das Rauschen vermindern. Andererseits ist es durch die Mittelung mehrerer unterschiedlicher Rekonstruktionen möglich, die Artefakte zu reduzieren. Auf diesem Weg kann die Bildqualität signifikant verbessert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Technik sowohl für 2D, als auch für 3D Datensätze verwendet werden kann. Die größten qualitativen Verbesserungen werden erzielt, wenn der Datensatz lediglich aus wenigen Ereignissen besteht. In diesem Fall ist die Bildqualität der analytischen Rekonstruktionen extrem schlecht, die Verbesserung durch die Filtertechnik mit CS und die damit verbundene Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses jedoch am größten. Bei diesen Datensätzen können die Ergebnisse iterativer Rekonstruktionen übertroffen werden. In der Praxis wäre damit ein Einsatz speziell bei dynamischen oder getriggerten Aufnahmen denkbar. In beiden Fällen basieren die Rekonstruktionen nicht selten auf wenigen Ereignissen. Die resultierenden Bilder sind häufig von schlechter Qualität, womit eine Verbesserung durch Filterung sinnvoll ist. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Rohdaten-basierten Triggerung am Kleintier-PET sowie mit dem Einsatz von CS zur Reduktion der Rekonstruktionszeit. Frühere Veröffentlichungen zeigten bereits die Anwendbarkeit Rohdaten-basierter Triggermethoden bei humanen Datensätzen. Im Hinblick auf eine präklinische Anwendung, speziell bei Datensätzen mit dem Fokus auf Mäuseherzen, existieren jedoch nur wenige Studien. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die segmentierte Methode des Massenschwerpunkts (COMseg) eine Technik darstellt, welche die kardiale Triggerung sowohl bei Datensätzen von Ratten, als auch von Mäusen erlaubt. Ein nicht zu unterschätzender Nachteil der COMseg besteht darin, dass vor deren Anwendung die List-Mode Datei in kleine Zeitframes unterteilt und in Sinogramme sortiert werden muss. Auf jedes Sinogramm wird im Anschluss ein Rebinning Algorithmus angewandt. Dies stellt einen enormen Zeitaufwand dar, wodurch sich eine Anwendung bei größeren Studien in der Praxis als schwierig erweist. Ziel der Triggermethoden ist die Gewinnung eines Triggersignals, durch welches beispielsweise der Herzschlag in mehrere Phasen aufgeteilt werden kann. Das Triggersignal hat für gewöhnlich eine dünnbesetzte Repräsentation im Frequenzraum. Dieses Vorwissen ermöglicht den Einsatz von CS. Anstelle des vollständigen Datensatzes wurde lediglich ein Teil der Daten in kleine Zeitframes sortiert und mit der COMseg ausgewertet. Aus diesem unterabgetasteten Datensatz wird mit Hilfe von CS das vollständige Triggersignal rekonstruiert. Die Stärke der Unterabtastung entspricht in etwa dem Faktor der Reduktion der Rekonstruktionszeit. Auf diesem Weg ist es möglich, eine signifikante Beschleunigung zu erzielen. Die Anwendung dieser Technik ist jedoch nicht auf die COMseg beschränkt. Prinzipiell kann das Verfahren bei allen Methoden der Rohdaten-basierten Triggerung angewandt werden, welche es erlauben, die Abtastpunkte des Signals separat zu berechnen. Damit werden Algorithmen interessant, deren Einsatz aufgrund aufwändiger Berechnungen bislang in der Praxis nicht sinnvoll war. Zusammenfassend legen die in dieser Arbeit vorgestellten Daten nahe, dass CS ein neuartiges Werkzeug in der PET darstellen könnte, mit welchem eine Filterung von Bildern sowie eine Reduktion der Rekonstruktionszeit möglich ist. N2 - In positron emission tomography (PET) radioactive substances are used. The exposure to ionizing radiation can cause damage to the human body. Therefore, there is an ongoing interest in reducing the amount of applied dose while keeping the quality of the results. With regard to the cost effectiveness of the systems a reduction of acquisition as well as reconstruction time is desirable. Within this work two possibilities are presented that enable achieving these objectives by using compressed sensing (CS). Filtering methods can be used beside the development of novel reconstruction algorithms to improve the quality of reconstructed images. One advantage of filters is the possibility of retrospective usage. Therewith, the image quality can be evaluated and the filter is solely applied if necessary. Over the past years, CS was the subject of several research activities in the field of imaging techniques, especially in magnetic resonance imaging and x-ray computed tomography (CT). CS could enable imaging modalities such as CT and PET to reconstruct images using fewer measurements, thus reducing scanning time and a patient's exposure to radiation. However, data on applications of CS in the molecular imaging with PET are lacking. The first part of this dissertation describes a method that uses CS as a filter in PET. The initial point is a complete and analytically reconstructed dataset. Several different sampling patterns are applied for retrospective undersampling followed by an reconstruction using CS. In the noise-free case each reconstruction would yield the original image. However, additional noise results in artefacts and in a decline of the result. On the one hand, CS is able to reduce noise. On the other hand, an averaging of several different reconstructions can reduce artefacts. Therewith, the image quality can be improved significantly. It is shown that the method could be applied to 2D as well as to 3D datasets. Best results are obtained when the dataset consists of a few events only. While the quality of analytically reconstructed images is extremely bad, the greatest improvement and therewith the maximum increase of the signal-to-noise ratio is achieved using the CS filter method. Thereby, it is possible to outperform the results of iterative reconstructions. In practice, an application to dynamic or gated acquisitions would be conceivable. Reconstructions at both acquisition modes are often based on few counts. The resulting images are commonly of bad quality, whereby an improvement using a filter is reasonable. The second part of this work deals with raw data based triggering at a small animal PET as well as the application of CS to reduce reconstruction time. Former publications already showed the practicability of raw data based triggering methods at human datasets. However, with regard to preclinical utilisation and especially to datasets that focus mice hearts, there are only few studies available. Within this work it is shown that the segmented centre of mass method (COMseg) enables cardiac gating of datasets of rats as well as mice. When applying the COMseg list-mode data have to be sub-divided into small time frames and sorted to sinograms. Afterwards, a rebinning algorithm is applied to each sinogram. The enormous expenditure of time is a disadvantage that should not be underestimated. In practice, an application to larger studies is difficult thereby. The aim of triggering methods is to yield a triggering signal which enables subdivision e.g. of the heartbeat in several phases. Usually, a triggering signal has a sparse representation in frequency space. This previous knowledge allows the application of CS. Instead of all data only a fraction of the dataset is sorted to small time frames and analysed using the COMseg. CS is used to calculate the complete triggering signal out of the undersampled one. The amount of undersampling corresponds to the reduction factor of reconstruction time. Thereby, a significant acceleration can be achieved. However, the application of this technique is not limited to the COMseg. If a raw data based triggering method calculates each sample individually, CS can be applied. Therefore, algorithms that were not practicable because of long computation times may become interesting. In summary, data of this work suggest that CS could be a novel analysis tool for filtering and reduction of reconstruction time in PET. KW - Komprimierte Abtastung KW - Positronen-Emissions-Tomographie KW - Medizintechnik KW - Filter KW - filtering KW - Compressed Sensing KW - PET Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106569 ER - TY - THES A1 - Walz, Susanne T1 - DNA-Bindung von Myc und Miz1 und transkriptionelle Regulation ihrer Zielgene T1 - DNA binding of Myc and Miz1 and transcriptional regulation of their target genes N2 - Die Deregulation des Transkriptionsfaktors Myc ist ein charakteristisches Merkmal für eine Vielzahl von humanen Tumoren. Durch die transkriptionelle Aktivierung von Genen, die im Zusammenhang mit Metabolismus, Translation und Proliferation stehen, wird dadurch das Tumorwachstum begünstigt. Myc bildet zudem mit dem Zinkfinger-Protein Miz1 einen Komplex, der hemmend auf die Transkription von Zielgenen wirkt. Bisher sind nur wenige Myc/Miz1-reprimierte Zielgene bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnten genomweit die DNA-Bindestellen von Myc und Miz1 durch Chromatin-Immunpräzipitationen gefolgt von Hochdurchsatzsequenzierung in einer Zervixkarzinomzelllinie bestimmt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Myc an Promotoren aller drei RNA-Polymerasen sowie in enhancer-Regionen bindet, während Miz1 Kernpromotoren von RNA-Polymerase II- und III-transkribierten Genen besetzt. reChIP-Experimente zeigten, dass Myc und Miz1 als Komplex an Promotoren von Zielgenen binden. Zudem wurde ein Miz1-DNA-Bindemotiv identifiziert und der transaktivierende Einfluss von Miz1 auf Gene mit diesem Motiv nachgewiesen. Das überwiegende Vorhandensein von Myc/Max-Komplexen führt zu einer Transaktivierung von E-Box-haltigen Promotoren. Andererseits erfolgt die transkriptionelle Repression von Myc/Miz1-Zielgenen an Promotoren, an denen der Myc/Miz1-Komplex vorherrscht. In aktuellen Publikationen konnte gezeigt werden, dass nach mitogener Stimulation von Lymphozyten es zu einer Erhöhung der Myc-Expression kommt, wodurch Myc als ein genereller Transkriptionsaktivator fungiert, der alle Gene gleichermaßen induziert. Trotz hoher Myc-Mengen in Tumorzellen konnte die generelle Myc-vermittelte Transaktivierung nicht nachgewiesen werden. Zusätzlich zur Myc-abhängigen Transaktivierung von E-Box-haltigen Genen, z. B. beteiligt an Translation und RNA-Prozessierung, und der Miz1-vermittelten transkriptionellen Aktivierung von Genen mit Miz1-Motiv (z. B. involviert in Autophagie), konnte entgegen dem Modell der generellen Genamplifikation durch Myc eine Myc/Miz1-abhängige Repression von Zielgenen belegt werden. Die neu gewonnenen Erkenntnisse des Bindeverhaltens des Myc/Miz1-Komplexes und der daraus resultierenden transkriptionellen Regulation von Myc/Miz1-Zielgenen ermöglichen ein besseres Verständnis der Myc-Funktion in Tumorzellen und könnte zur Verbesserung von Tumortherapien führen. N2 - Deregulation of the transcription factor Myc is a characteristic feature of a variety of human tumors. The Myc-dependent transcriptional activation of genes involved in metabolism, translation and proliferation therefor promotes tumor growth. Additionally, Myc forms a complex with the zinc finger protein Miz1, which represses transcription of target genes. So far, only a limited number of Myc/Miz1-repressed genes is known. Within the present thesis DNA binding sites of Myc and Miz1 were mapped genome-wide using chromatin immunoprecipitations followed by high-throughput sequencing in a cervical cancer cell line. It could be shown that Myc binds to promoters of all three RNA polymerases as well as to enhancer regions, whereas Miz1 binding sites could be found only in core promoters of RNA polymerase II and III transcribed genes. reChIP experiments illustrated binding of Myc and Miz1 as a complex on DNA. Additionally, a DNA binding motif of Miz1 was identified and furthermore it was possible to verify the transctivating influence of Miz1 on genes carrying that motif in the promoter. On E-box containing promoters the predominantly existence of Myc/Max complexes resulted in transactivation of the respective genes. Otherwise, transcriptional repression of Myc/Miz1 target genes occured at promoters where the Myc/Miz1 complex dominates. Recent publications have illustrated that after mitogenic stimulation of primary lymphocytes, Myc expression is enhanced, whereby Myc serves as a general transcriptional activator that induces the expression of virtually all genes. Although Myc levels are high in tumor cells that general mechanism of Myc-mediated transactivation could not be verified. Additionally to the Myc-dependent transactivation of E-box-containing genes, e. g. involved in translation and RNA processing, and Miz1-mediated transcriptional activation of genes containing a Miz1 binding motif (e. g. autophagy-related genes), and in opposition to the general amplifier model a Myc/Miz1-dependent repression of target genes could be proven. The obtained evidences concerning DNA binding properties of the Myc/Miz1 complex as well as the resulting transcriptional regulation of Myc/Miz1 target genes facilitates a better understanding of Myc function in tumor cells and could leed to better anti-tumor therapies. KW - Myc KW - High throughput screening KW - DNS-Bindung KW - Tumorzelle KW - Differentielle Genexpression KW - Miz1 KW - ChIP-Seq KW - General amplifier model KW - Hochdurchsatzsequenzierung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106249 ER - TY - THES A1 - Peter, Stefanie T1 - Hemmung der Myc-Funktion durch niedermolekulare Inhibitoren der E3-Ubiquitin-Ligase Huwe1 T1 - Inhibition of Myc function using small molecule inhibitors of the E3 ubiquitin ligase Huwe1 N2 - Die Deregulation des Transkriptionsfaktors Myc ist ein zentraler Mechanismus in der kolorektalen Karzinogenese. Die Myc-Deletion in Tumormodellen hemmt das Wachstum von Kolonkarzinomen, somit stellt die Inaktivierung von Myc einen Ansatzpunkt in der Behandlung von kolorektalen Tumoren dar. Die direkte Inhibition von Myc ist schwierig, da Myc keine katalytische Aktivität besitzt und stattdessen für die Myc-Funktion nötige Protein-Protein- oder Protein-DNA-Interaktionen angegriffen werden müssen. Die E3-Ubiquitin-Ligase Huwe1 interagiert sowohl mit Myc als auch mit dem Myc-interagierenden Protein Miz1 und ist im Kolonkarzinom überexprimiert. Huwe1 ubiquitiniert Myc und induziert darüber dessen Transaktivierungsfunktion. Die Inaktivierung von Huwe1 ist somit eine vielversprechende Möglichkeit für die Inhibition der Myc-Funktion und die Therapie des Kolonkarzinoms. In dieser Arbeit wird mittels shRNA-vermittelter Depletion von Huwe1 in Zellkulturexperimenten gezeigt, dass Huwe1 für die Proliferation von Kolonkarzinomzelllinien und für die Transaktivierung von Myc-Zielgenen benötigt wird. Mit zwei von Boehringer Ingelheim identifizierten niedermolekularen Huwe1-Inhibitoren (BI8622 und BI8626) ist es möglich, die Huwe1-Funktion spezifisch in Zellen zu blockieren. Die Huwe1-Inhibitoren induzieren einen Proliferationsarrest in kolorektalen Karzinomzelllinien, wohingegen die Substanzen auf embryonale Stammzellen keine Auswirkungen haben. Die Inaktivierung von Huwe1 führt zu einer Akkumulation von Miz1 an Promotoren Myc-aktivierter Zielgene und darüber zu einer vermehrten Bildung repressiver Myc/Miz1-Komplexe, was mit einer Deacetylierung von Histon H3 und einer transkriptionellen Repression Myc-gebundener Gene assoziiert ist. Miz1 akkumuliert nach Huwe1-Inhibition ebenso an direkten Miz1-Zielgenen, deren Expression bleibt aber unbeeinflusst. Diese Daten weisen darauf hin, dass eine kontinuierliche Degradierung von Miz1 durch Huwe1 zur Transaktivierung von Myc-Zielgenen in Kolonkarzinomzellen nötig ist. Damit wurde ein neuer Mechanismus identifiziert, über den Huwe1 die Myc-Transaktivierung reguliert und der eine tumorzellspezifische Repression der Myc-Funktion mit Hilfe von Huwe1-Inhibitoren ermöglicht. N2 - Deregulation of the transcription factor Myc is a central driver in colorectal carcinogenesis. Deletion of Myc in murine tumor models inhibits the growth of colon carcinoma, therefore inactivation of Myc is an attractive possibility for treating these types of malignancies. Since Myc does not contain any catalytic activity, protein-protein or protein-DNA interactions necessary for Myc function need to be modified, making direct targeting of Myc difficult. The E3 ubiquitin ligase Huwe1 interacts both with Myc and the Myc-interacting protein Miz1 and is overexpressed in colorectal cancer. Huwe1 ubiquitinates Myc thereby inducing its transactivation function. Hence, inactivation of Huwe1 is a reasonable approach for inhibition of Myc function and treatment of colon cancer. In this work depletion of Huwe1 via shRNA shows that Huwe1 is required for the proliferation of colon carcinoma cell lines and for transactivation of Myc target genes. Two novel small molecule inhibitors of Huwe1 (BI8622 and BI8626), which were identified by Boehringer Ingelheim, block Huwe1 function in cells specifically. The Huwe1 inhibitors induce a proliferation arrest in colorectal cancer cell lines, but not in embryonic stem cells. Inactivation of Huwe1 leads to an accumulation of Miz1 at promoters of Myc-activated target genes and to an increased formation of repressive Myc/Miz1 complexes at these sites. This is associated with deacetylation of histone H3 and transcriptional repression of Myc-bound genes. Additionally, Miz1 accumulates at direct Miz1 target genes upon Huwe1 inhibition but this does not influence expression of these genes. These data suggest that a continuous degradation of Miz1 by Huwe1 is required for transcriptional activation of Myc target genes in colon cancer cells. This identified a new principle how Huwe1 regulates Myc transactivation allowing a tumor cell-specific repression of Myc function via small molecule inhibitors of Huwe1. KW - Myc KW - Ubiquitin KW - Huwe1 KW - Kolonkarzinom KW - Colonkrebs Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104449 ER - TY - THES A1 - Schiller, Roswitha Dorothee T1 - Studien zu Virulenzeigenschaften typischer und atypischer uropathogener Escherichia coli T1 - Studies on virulence properties of typical and atypical uropathogenic Escherichia coli N2 - Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre liefern immer mehr Hinweise darauf, dass eine klare Unterscheidung von Fitness- und Virulenzfaktoren in vielen Fällen, insbesondere bei extraintestinal pathogenen Escherichia coli, nicht möglich ist. So lässt sich auch bei Harnwegsinfektionen verursachenden E. coli den bakteriellen und teils stammspezifischen Faktoren oftmals nicht eindeutig eine typische Virulenz- oder Fitness-assoziierte Funktion zuordnen. Zudem werden in neueren Studien immer häufiger atypische uropathogene Isolate von E. coli beschrieben, die in ihrem „Virulenzrepertoire“ deutlich von typischen uropathogenen E. coli (UPEC) abweichen, da sie keine klassischen UPEC-Virulenzfaktoren aufweisen. In dieser Arbeit wurden daher Virulenzeigenschaften typischer als auch atypischer UPEC untersucht. Der Effekt eines bestimmten bakteriellen Faktors auf den Wirtsorganismus wird teilweise indirekt durch sekundäre Modifikation bedingt. Dies offenbart sich beispielsweise am Autotransporterprotein AIDA-I, dessen Konformation durch posttranslationale Glykosylierung stabilisiert wird, wodurch es seine Funktionalität als Adhäsin erhält. Da bisherige Studien zum AIDA-I homologen Autotransporterprotein Antigen 43 (Ag43) auf der Analyse von künstlich glykosyliertem Protein basieren, lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Untersuchung der natürlichen Glykosylierung von Ag43 in UPEC Stamm 536. Es zeigte sich, dass beide Ag43-Varianten von E. coli Stamm 536 natürlicherweise glykosyliert vorliegen, der Grad der Glykosylierung jedoch wesentlich geringer ausfällt als bei natürlich glykosyliertem AIDA-I. Inwieweit die natürliche Glykosylierung von Ag43 zu dessen Funktionalität beiträgt, kann erst durch die Identifizierung der für die Ag43-Glykosylierung verantwortlichen Glykosyltransferase geklärt werden. Die in silico-Analyse des Genoms von UPEC Stamm 536 für potentielle Glykosyltransferasen von Ag43 lieferte neun Kandidatengene. Die Gene wurde teils im Wildtyp-Hintergrund, teils im rfaH-negativen Hintergrund von E. coli Stamm 536 deletiert und die Mutanten im Anschluss phänotypisch charakterisiert. Die Deletion der Kandidatengene waaF, waaG und waaQ, die für Glykosyltransferasen des LPS-Biosynthesesystems kodieren, führte zu den deutlichsten Unterschieden in Bezug auf Motilität, Curli/Zellulose-Produktion, Hämolyseaktivität und Expression von Typ 1 Fimbrien. Der Einfluss des „knock-out“ der Kandidatengene auf die Glykosylierung von Ag43 muss in weiterführenden Studien untersucht werden. Zur Charakterisierung des uropathogenen Virulenzpotentials verschiedener E. coli Stämme in vivo hat sich in den letzten Jahren das murine Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion etabliert. Mit Hilfe dieses Modells wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl spezifische Deletionsmutanten prototypischer UPEC als auch atypische E. coli Harnwegsisolate bezüglich ihrer Urovirulenz getestet und verglichen. Bei der Untersuchung der klassischen UPEC lag der Fokus auf der möglichen Urovirulenzmodulation durch die folgenden spezifischen Faktoren: dem Autotransporterprotein Ag43, dem „Response regulator“ UvrY, dem Polyketid Colibactin sowie dem Exopolysaccharid poly-β-1,6-N-Acetylglucosamin (PGA). Für Ag43 war bei der Etablierung einer Harnwegsinfektion keine eindeutige Funktion feststellbar. Es ist jedoch denkbar, dass Ag43 zur Langzeitpersistenz im Harnwegstrakt beitragen kann, was in weiteren Studien belegt werden sollte. Die Expression von UvrY in der natürlichen uvrY-Deletionsmutante UPEC Stamm 536 ließ keine Erhöhung des Urovirulenzpotentials im Mausmodell erkennen. In diesem Zusammenhang konnte allerdings gezeigt werden, dass die Expression des Genotoxins Colibactin in UPEC Stamm 536 dessen Virulenz signifikant herabsetzte. Die Untersuchungen zur Relevanz des Exopolysaccharids PGA belegen deutlich, dass PGA für die Langzeitpersistenz von E. coli im murinen Harnwegstrakt benötigt wird. Für die initiale Kolonisierung scheint PGA hingegen keine Bedeutung zu haben. Für atypische UPEC Isolate, die Charakteristika von STEC und EAEC zeigen und sich in ihrem Virulenzmuster deutlich von prototypischen UPEC unterscheiden, ließ sich im murinen Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion, verglichen mit dem UPEC Modellorganismus 536, ein ähnliches, teils sogar erhöhtes uropathogenes Virulenzpotential nachweisen. Die Ergebnisse der Arbeit untermauern somit die heutige Vorstellung bezüglich der Entwicklung und Etablierung einer Harnwegsinfektion, dass verschiedene E. coli Stämme unterschiedliche (Kontroll-) Mechanismen entwickelt haben, um erfolgreich den Harnwegstrakt kolonisieren und eine Infektion auslösen zu können. Zudem weisen sie darauf hin, dass diese Fähigkeit nicht auf Isolate typischer phylogenetischer UPEC Entwicklungslinien beschränkt und auf das Vorhandensein charakteristischer UPEC Virulenzfaktoren angewiesen ist. N2 - Research findings over the last years indicate that in many cases, including extraintestinal pathogenic Escherichia coli, a clear distinction between fitness and virulence factors is not possible. Accordingly, the classical distinction of often strain-specific virulence- and fitness-related traits of uropathogenic E. coli (UPEC) can often not be made. Furthermore, recent studies describe atypical UPEC isolates. These isolates remarkably differ in their “virulence repertoire” compared to typical UPEC, because they lack classical UPEC-related virulence factors. Therefore, the aim of the present study was the investigation of virulence properties of typical as well as atypical UPEC strains. The effect of a certain bacterial factor upon the host organism is in part indirectly influenced by secondary modifications. For instance, the conformation of the autotransporter protein AIDA-I is stabilized by posttranslational glycosylation which in turn confers its functionality as an adhesin. Prior studies on the AIDA-I homologous autotransporter protein antigen 43 (Ag43) are based on the analysis of the artificially glycosylated protein. Thus, a key aspect of the current work was to elucidate the naturally occurring glycosylation of Ag43 in UPEC strain 536. For both Ag43 variants of E. coli 536 natural glycosylation was detected. However, Ag43 was less glycosylated than naturally glycosylated AIDA-I. The future identification of the glycosyltransferase responsible for natural glycosylation of Ag43 will help to determine the impact of this posttranslational modification on the functionality of Ag43. In silico analysis of the UPEC strain 536 genome regarding potential glycosyltransferases of Ag43 revealed nine candidate genes. Corresponding deletion mutants of the identified genes were constructed in part in the wild type strain background and in part in the rfaH-negative background of UPEC 536. The most prominent differences concerning motility, curli/cellulose production, hemolytic activity and expression of type 1 fimbriae were observed upon deletion of the genes waaF, waaG or waaQ coding for glycosyltransferases of the LPS biosynthesis pathway. The impact of the deleted candidate genes on the glycosylation of Ag43 has to be further investigated. In recent years the murine model of ascending urinary tract infection was established to characterize the uropathogenic potential of E. coli strains in vivo. By means of this model the uropathogenic potential of different specific “knock-out” mutants of prototypic UPEC strains as well as of atypical E. coli urinary tract isolates was tested and compared. The analysis of the impact of specific factors on the uropathogenic potential of classical UPEC strains focused on the autotransporter protein Ag43, the response regulator UvrY, the genotoxin colibactin, and the exopolysaccharide poly-β-1,6-N-acetylglucosamine (PGA). Ag43 did not exhibit a distinct function during the establishment of urinary tract infection in mice. However, it is conceivable that Ag43 can contribute to long-term persistence in the urinary tract, which should be covered in further studies. Expression of UvrY in the natural uvrY-negative UPEC strain 536 did not increase the uropathogenic potential. However, expression of the genotoxin colibactin significantly reduced the urovirulence of UPEC strain 536. The exopolysaccharide PGA was shown to contribute to long-term persistence of UPEC in the murine model of urinary tract infection. For the initial colonization of the urinary tract, PGA seems to be dispensable. The atypical UPEC isolates investigated in this study display typical characteristics of STEC and EAEC and differ significantly in their virulence gene content compared to prototypic UPEC strains. Nevertheless, in the murine model of ascending UTI many atypical UPEC isolates exhibited a comparable and sometimes even increased uropathogenic potential relative to UPEC model strain 536. The results of this work support the current idea regarding the development and establishment of a urinary tract infection that different E. coli strains have evolved diverse (control-) mechanisms to successfully colonize the urinary tract and provoke an infection. In addition, the findings point out that the ability to cause a urinary tract infection is not limited to phylogenetic lineages of classical UPEC isolates and the presence of characteristic UPEC virulence traits. KW - Escherichia coli KW - Harnwegsinfektion KW - Glykosylierung KW - UPEC KW - Autotransporterprotein KW - Glykosyltransferase KW - murines Modell der aufsteigenden Harnwegsinfektion Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103907 ER - TY - THES A1 - Rein, Alice Felicitas T1 - Identifizierung von durch PI3K-Inhibition induzierten Spleißvarianten in T-Zellen mittels Exon Array und die Effekte funktionell relevanter Gene auf T-Zell-Funktionen und Viabilität T1 - Identification of splice variants in response to PI3K inhibition in T cells using an Exon Array approach and effects of functional relevant genes on key T cell functions and viability N2 - Die Interaktion des Masernvirus mit T-Zellen stört die Aktivierung der TCR-Signalkaskade durch die Hemmung der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), die zur Einstellung der T-Zell-Funktionen führt und dadurch nachgeschaltete (downstream) Signalwege sowie den Eintritt in den Zellzyklus, aber auch die Genexpression reguliert. Infolgedessen können die Aktivität spleißregulatorischer Faktoren sowie die Spleißmuster von mRNAs verändert werden, wie zum Beispiel bei der alternativ gespleißten SHIP1-Isoform SIP110, die eine T-Zell-inhibitorische Aktivität zeigt. Um alternativ gespleißte (AS) und differentiell regulierte (RG) Transkripte in T-Zellen infolge von PI3K-Inhibition zu erfassen, wurde ein Human Exon 1.0 ST Array an RNA-Proben von humanen T-Zellen, 24 h stimuliert und stimuliert/ PI3K-inhibiert, durchgeführt. Durch die Anwendung geeigneter bioinformatischer Algorithmen konnten spezifisch in PI3K-inhibierten Zellen angereicherte Transkripte nachgewiesen und in die Kategorien AS (2192 Gene) und RG (619 Gene) eingeteilt werden. Ausgewählte Gene wurde mittels RT-PCR und qPCR validiert, gefolgt von der funktionellen Annotation beider Genlisten. AS Gene konnten verstärkt in ECM-Rezeptor Interaktionen, fokaler Adhäsion, Proliferation, Zytoskelettorganisation und Tumorsignalwegen gefunden werden, während RG Gene eher in der DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Stressantwort vertreten waren. Gene beider Gruppen konnten auf Signalwege bezogen werden, die essentiell für den TCR-Signalweg, die Zytoskelettdynamik und den Zellzykluseintritt waren. Das stützt die Annahme, dass die Außerkraftsetzung der PI3K-Schüsselprozesse der T-Zell-Aktivierung sowohl auf der Ebene der RG als auch der AS Gene wirkt. Über die Ingenuity Pathway Analyse konnten wir unsere Genlisten mit Genen vergleichen, die bereits auf solche Schlüsselprozesse und die Viabilität bezogen werden können. In der Überschneidung wurden z.B. die AS GTP-Austauschfaktoren Vav1 und Vav3 gefunden, die für die Übersetzung extrazellulärer Signale in Zytoskelettdynamik, Proteinphosphatasen und Adapter von Bedeutung sind. Ausgewählte Gene (AS - FBXO6 und LAT2, RG - SLFN5) wurden aus PI3K-arretierten T-Zellen kloniert und deren Effekt auf grundlegende zelluläre Funktionen durch Überexpression in HEK293T-Zellen überprüft. Die Fusionsproteine veränderten weder die Zellviabilität noch die Proliferation dieser Zellen. Über einen auf siRNA basierenden Knockdown wurde überprüft, ob das RG Gene SLFN5 als Suppressor auf die T-Zell-Aktivierung agiert. Der Knockdown in primären T-Zellen zeigte keinen Einfluss auf die Zellviabilität, Proliferation und Polarisation. Jedoch konnte ein signifikanter Effekt auf die T-Zell-Adhärenz auf Fibronektin gezeigt werden, was darauf schließen lässt, dass SLFN5 die T-Zell-Adhärenz negativ reguliert. Des Weiteren wurde die MV-induzierte Regulation selektierter Gene betrachtet und Unterschiede in der Regulation im Vergleich zur direkten PI3K-Inhibition festgestellt. Ein Grund dafür könnte sein, dass das MV eine Inhibition auf vielen Ebenen induziert, anstelle der alleinigen PI3K-Inhibition. Abschließend wurde untersucht, ob ausgewählte Gene an der Regulation in verschiedenen T-Zelllinien beteiligt sind und als Tumorsuppressoren agieren könnten. FBXO6 als Regulator der CHK1-Stabilität wurde in den meisten Zelllinien nicht exprimiert. Die Annahme, dass eine Stress-induzierte defekte Ubiquitinierungsmaschinerie an der Resistenz von Tumorzellen auf Chemotherapeutika beteiligt ist, macht FBXO6 zu einem interessanten Kandidaten als Biomarker für Tumorsensitivität gegenüber Krebsmedikamenten. Diese Annahme bedarf jedoch weiterer Untersuchungen. N2 - The interaction of measles virus (MV) with T cells interferes with the activation of the TCR-signaling by the inhibition of the phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K), leading to the termination of T cell functions and consequently to the regulation of downstream signaling as well as cell cycle entry. PI3K-inhibition also affects the activity of splice regulatory elements and the splicing pattern of mRNAs, as for example the alternatively spliced SHIP1 isoform SIP110 that shows T cell inhibitory activity. To integrate early alternatively spliced (AS) and differentially regulated (RG) transcripts in response to PI3K interference in T cells at a general level, we performed a Human Exon 1.0 ST Array analysis on RNAs isolated from human T cells PI3K-inhibited or not prior to 24h stimulation. Applying suitable bioinformatic algorithms, transcripts detected specifically in PI3K-inhibited cells were assigned to categories defining RG (619 genes) and AS species (2192 genes). A selection of genes was validated by RT-PCR and qPCR followed by functional annotation of both gene lists. AS genes were found to be enriched in ECM-receptor interactions, focal adhesion, proliferation, cytoskeleton organization and tumor signaling, while RG genes were rather related to processes as DNA-replication, DNA-repair and stress response. Some genes that belonged to both groups target pathways essential for TCR-signaling, cytoskeletal dynamics and cell cycle entry, strongly support the notion that PI3K abrogation interferes with key T cell activation processes at the level of differential regulation as well as alternative splicing. Using Ingenuity Pathway Analysis we compared our gene lists to genes already known to specifically relate to key T cell functions and viability. In the overlap we found for example AS GTP-exchange factors Vav1 and Vav3 important for translating extracellular signals into cytoskeletal dynamics, protein phosphatases and adaptors. Selected candidate genes (AS - FBXO6 und LAT2, RG - SLFN5) were cloned from PI3K-arrested T cells into the pEGFP-vector and tested by overexpression in HEK293T for their effect on basic cell functions. These fusion proteins did not affect viability and proliferation of these cells. Using siRNA-based knockdown the potential of the RG gene SLFN5 to act as suppressors of key steps in T cell activation was tested. Its knockdown in primary T cells did not affect cell viability, proliferation and polarization. However, T cell adherence on fibronectin was significantly enhanced indicating that SLFN5 negatively regulates T cell adhesion to the ECM. Additionally we had a look at the MV induced regulation of selected genes and found a difference of the regulation in comparison to direct PI3K-inhibition. A reason for these unexpected results could be that MV induces a multi-level inhibition, rather than PI3K-inhibition only. Finally we wanted to find out, if selected genes were also implicated in the regulation of different T cell lines and therefore could act as tumor suppressors. FBXO6, a regulator of CHK1 stability, for example was not expressed in most investigated cell lines. Assuming that a stress-induced defective ubiquitination complex is involved in the resistance of tumor cells to chemotherapeutic agents FBXO6 might be an interesting candidate as biomarker for tumor sensitivity to cancer medication. If some of these differences in regulation are the result of immortalization, corresponding genes could consequently act as tumor suppressor. This issue has to be subject to further research. KW - Phosphatidylinositolkinase KW - RNS-Spleißen KW - Masern KW - T-Lymphozyt KW - Exon Array KW - SLFN5 KW - FBXO6 KW - LAT2 KW - Funktionelle Annotation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103462 ER - TY - THES A1 - Langenhorst, Daniela T1 - Induktion und Aktivierung regulatorischer T-Zellen durch superagonistische Stimulation des CD28 Moleküls T1 - Induction and activation of regulatory T-cells by superagonistic Stimulation of the CD28 molecule N2 - Regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine ntscheidende Rolle beim Erhalt der Immunhomöostase und bei der Kontrolle überschießender Immunantworten. Sie können anhand ihres Entstehungsortes in im Thymus generierte natürliche Tregs (nTregs) und in der Peripherie generierte induzierte Tregs (iTregs) unterteilt werden. Ihr Phänotyp wie auch ihre Funktion werden zu einem großen Teil durch den transkriptionellen Masterregulator Foxp3 kontrolliert. Das kostimulatorische Molekül CD28 wird von nTregs für die Differenzierung benötigt und von Tregs und konventionellen T-Zellen (Tkons) für ihre Aktivierung. Superagonistische CD28 spezifische monoklonale Antikörper (CD28SA) aktivieren T-Zellen im Gegensatz zu konventionellen anti-CD28 Antikörpern ohne zusätzliche Ligation des T-Zellrezeptors. Die in vivo Applikation des CD28SA bewirkt eine starke Aktivierung der Tregs und eine präferentielle Expansion der Tregs gegenüber Tkons. Dies erklärt die präventive und therapeutische Wirkung der CD28SA Behandlung in verschiedenen Krankheitsmodellen bei Nagern. Die erste Anwendung des humanisierten CD28SA TGN1412 führte in den Testpersonen jedoch zu einem unerwarteten „Cytokine-Release Syndrom“. Daher wurde hier am Mausmodell der Zusammenhang zwischen Treg Aktivierung und systemischer Zytokinausschüttung näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die CD28SA vermittelte Proliferation der T-Zellen abhängig vom CD28 Signal und von parakrinem Interleukin (IL)-2 ist. Durch die in vivo Depletion der Tregs vor der CD28SA Injektion wurde deutlich, dass es auch in Mäusen nach CD28SA Stimulation zu einer systemischen Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine kommt, die jedoch, im Gegensatz zum humanen System, von Tregs effektiv kontrolliert werden kann. Um die usschüttung pro-inflammatorischer Zytokine zu verhindern, wäre eine zusätzliche prophylaktische Behandlung mit Corticosteroiden möglich, da diese auch in hohen Dosen die CD28SA vermittelte Aktivierung und Expansion der Tregs nicht beeinflussen. Neben der Expansion wird durch die Stimulation mit CD28SA auch die Produktion des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 in Tregs induziert und so eine genauere Untersuchung des Ursprungs und des Schicksals IL-10 produzierender Tregs ermöglicht. Diese Tregs exprimieren im Vergleich zu IL-10 negativen Tregs ein höheres Niveau an Molekülen, die mit einer supprimierenden Aktivität verbunden sind. Zudem werden IL-10 Produzenten aufgrund der Veränderung im Expressionsmuster der Migrationsrezeptoren nach der Stimulation von einem lymphknotensuchenden CCR7+CCR5-CCR6- zu einem entzündungssuchenden CCR7-CCR5+CCR6+ Phänotyp verstärkt in Bereiche mit stattfindender Immunantwort rekrutiert. Schließlich sind IL-10 produzierende Tregs von CD28SA stimu2 lierten Mäusen in vitro stärker apoptoseanfällig als die IL-10 negativen Tregs. Die Aktivierung der Tregs scheint somit die terminale Differenzierung zu einem IL-10 produzierenden Effektorphänotyp mit begrenzter Lebensdauer zu induzieren. Dies führt auch zur Beendigung der Immunsuppression. Die Kombination aus schwachem TZR und starkem CD28 Signal, die die CD28SA Stimulation in naiven T-Zellen auslöst, induziert zumindest in vitro abhängig von IL-2 und TGFβ effizient die Expression von Foxp3. Die so generierten iTregs haben, ähnlich wie konventionell in vitro erzeugte iTregs, in Bezug auf die Expression von Oberflächenmolekülen und den Methylierungsstatus bestimmter Regionen des Foxp3 Gens einen Phänotyp, der zwischen dem von Tkons und Tregs liegt. Da auch die supprimierende Aktivität der iTregs geringer ist als die der ex vivo Tregs bedarf es einer weiteren Optimierung des Stimulationsprotokolls, um diese Zellen für therapeutische Zwecke verwenden zu können. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die superagonistische Stimulation des CD28 Moleküls ein vielseitig einsetzbares Instrument ist. Einerseits können durch die CD28SA Stimulation Tregs polyklonal aktiviert und für therapeutische Zwecke mobilisiert werden und andererseits kann die besondere Art der T-Zellstimulation auch dazu genutzt werden, neue Aspekte von nTregs und iTregs zu untersuchen. N2 - Regulatory T-cells (Tregs) are important to maintain immune homeostasis and to control overshooting immune responses. Depending on the place where they are generated Tregs can be divided into thymus-derived natural Tregs (nTregs) and peripheral-derived induced Tregs (iTregs). Their phenotype and function is controlled by the transcriptional masterregulator Foxp3. The costimulatory molecule CD28 is required for nTreg differentiation and for the activation of Tregs and conventional T-cells (Tcons). Superagonistic CD28 specific monoclonal antibodies (CD28SA) activate T-cells without additional T-cell receptor ligation in contrast to conventional anti-CD28 antibodies. In vivo CD28SA treatment induces strong Treg activation and preferential expansion of Tregs over Tcons. This explains the preventive and therapeutic effects of CD28SA in various rodent disease models. In contrast, a first-in-man trail of the human CD28SA TGN1412 resulted in an unexpected cytokine release syndrome. Thus, using the mouse system the relationship between Treg activation and systemic cytokine release was reinvestigated. It could be shown that CD28SA induced T-cell proliferation is dependent on the CD28 signal and on paracrine interleukin (IL)-2. In vivo depletion of Tregs prior CD28SA injection showed that in mice, too, CD28SA stimulation induces a systemic release of pro-inflammatory cytokines, but in contrast to humans, this can be effectively controlled by Tregs. To prevent the pro-inflammatory cytokine release an additional prophylactic treatment with corticosteroids might be feasible since even high doses of corticosteroids have no effect on CD28SA driven Treg activation and expansion. Beside expansion, CD28SA stimulation also induces the production of anti-inflammatory IL-10 in Tregs. This allows for examination of the origin and fate of IL-10 producing Tregs. In comparison to IL-10 negative Tregs, these cells express higher levels of molecules associated with suppressive activity. In addition IL-10 producers are preferentially recruited to sites of ongoing immune responses, as they shift their expression pattern of migration receptors after stimulation from a CCR7+CCR5-CCR6- lymph node-seeking to a CCR7-CCR5+CCR6+ inflammation-seeking phenotype. Finally, IL-10 producing Tregs of CD28SA stimulated mice are more apoptosis-prone in vitro than their IL-10 negative counterparts. Thus, activation of Tregs induces terminal differentiation towards an IL-10 producing effector phenotype with a limited life span. This also terminates the immune suppression. The special combination of weak TCR and strong CD28 signals following CD28SA stimulation of naïve T-cells can, at least in vitro and dependent on IL-2 and TGFβ, efficiently induce Foxp3 expression. The phenotype regarding expression of certain surface molecules and the methylation level of particular regulatory regions of the Foxp3 gene is similar in CD28SA and anti-CD3/ anti-CD28 (+ IL-2/TGFβ) induced iTregs, and shows properties of both Tcons and Tregs. Since the suppressive activity of these iTregs is also lower than that of ex vivo Tregs, further improvement of the stimulation protocol is needed before these cells could be used for therapeutic purposes. In conclusion, this study shows that superagonistic stimulation of CD28 molecules is a versatile tool. On the one hand CD28SA stimulation polyclonally activates Tregs and can be used as a therapeutic, on the other hand the special way of T-cell stimulation can also be utilized to investigate new aspects of nTregs and iTregs. KW - Antigen CD28 KW - regulatorische T-Zellen KW - CD28 Molekül KW - T-Zellaktivierung KW - CD28 Superagonist KW - T-Lymphozyt KW - Immunreaktion KW - Immunologie Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96700 ER - TY - THES A1 - Nerreter, Thomas T1 - Untersuchungen über den Einfluss des Tyrosinkinaseinhibitors Dasatinib auf die Funktion von T-Zellen und aus Monozyten generierten Dendritischen Zellen T1 - Studies on the effect of the tyrosine-kinase inhibitor dasatinib on function of T cells and monocyte-derived dendritc cells N2 - Kinasen der SRC-Familie (SFKs) sind sowohl in Wachstum und Metastasierung von Tumor- und Leukämiezellen als auch an prominenter Stelle in vielgestaltige Signalwege aller Immunzellen involviert. Eine Hemmung von SFKs ist damit ein vielversprechendes Mittel zur Therapie maligner Erkrankungen, kann aber darüber hinaus auch sehr effektiv zur Immunmodulation genutzt werden. Für den zur Therapie von CML und AML zugelassenen Tyrosinkinaseinhibitor (TKI) Dasatinib (Handelsname Sprycel®), für den unter anderem SFKs die Hauptziele darstellen, wurden, neben der antitumoralen Wirkung, sowohl immunsuppressive als auch immunstimulierende Effekte beschrieben. Aus diesem Grund könnte Dasatinib ein für die Modulation von Immunantworten sehr interessantes Hilfsmittel darstellen. In der vorliegenden Arbeit werden die hemmenden und fördernden Einflüsse von Dasatinib auf zwei Typen von Immunzellen genauer untersucht, um so die Auswirkungen einer Dasatinib-Behandlung auf Zellen des Immunsystems besser zu verstehen und sich das immunmodulatorische Potenzial von Dasatinib besser nutzbar machen zu können. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung möglicher kombinatorischer Effekte zwischen Dasatinib und dem Glucocorticoid Dexamethason auf verschiedene Subsets von T-Zellen vor dem Hintergrund eines potentiellen Einsatzes der Kombination bei der allogenen Hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) zur Separation von Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekten und der Graft-versus-host Disease (GvHD). Während keine kombinatorischen Effekte bei der Aktivierung von T-Zellen auftraten, ergaben sich bei der Untersuchung des Einflusses auf die Proliferation besonders in CD8+ T-Zellen additive Effekte durch die Kombination. Die Proliferation naiver T-Zell-Subsets wurde bereits durch die beiden Einzelsubstanzen alleine stark gehemmt. Dagegen waren Memory T-Zell-Subsets deutlich unempfindlicher, allerdings konnte durch eine Kombination von Dexamethason und Dasatinib auch die Proliferation dieser Memory Subsets effektiv gehemmt werden. Hierbei zeigten sich bei CD8+ Memory Subsets die deutlichsten synergistischen Effekte. Da eine Kombination in stärkerem Maße auch CD8+ gegenüber CD4+ Memory Subsets hemmt und diese Subsets unterschiedliche Rollen in der Induktion von GvL-Effekten und der Auslösung einer GvHD zu spielen scheinen, ist eine Steigerung der GvL-Effektivität durch die Medikamenten-Kombination bei gleichzeitiger Minimierung eines GvHD-Risikos in Zusammenhang mit anderen publizierten Ergebnissen durchaus denkbar. Weil eine starke Hemmung von virus-spezifischen T-Zellen nur bei sehr hohen Konzentrationen auftrat, ist zudem das Risiko einer Virus-Reaktivierung, die ein großes Problem bei einer HSCT darstellt, eher als gering einzuschätzen. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von Dasatinib auf aus Monozyten generierte Dendritische Zellen (moDCs) mit einem Fokus auf der Beeinflussung ihrer Migration. Während eine Behandlung mit Dasatinib nur sehr geringe Auswirkungen auf die Ausreifung der moDCs und die Expression von kostimulatorischen Molekülen hatte, führte eine Dasatinib-Behandlung zu einer Zeit- und Dosis-abhängigen Verringerung der Zytokinsekretion (IL-10 und IL-12). Im Gegensatz dazu hatte Dasatinib keinen Einfluss auf die phagozytotische Aktivität der moDCs und auf ihre Fähigkeit, Virus-spezifische T-Zell-Antworten auszulösen. Dasatinib zeigte dagegen einen deutlich steigernden Einfluss auf die Migration von moDCs gegen einen CCL19-Gradienten im Transwell-Assay, ohne die Expression des CCL19-Rezeptors CCR7 zu beeinflussen. Da ähnliche Migrations-steigernde Effekte auch bei einer Behandlung mit dem spezifischen SFK-Inhibitor SKI-1 auftraten, eine Behandlung mit Nilotinib, einem TKI der nicht auf SFKs wirkt, im Gegensatz dazu aber zu einer Hemmung der Migration führte, liegt es nahe dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über SFKs vermittelt wird. Dasatinib führte zu einer deutlichen Inhibierung der Phosphorylierung der inhibitorischen Immunrezeptoren Siglec-9 und Siglec-3 (CD33) ohne ihre Expressionslevel zu beeinflussen. Eine mit spezifischen Antikörpern durchgeführte Blockierung dieser Immunrezeptoren, deren ITIM-Domänen mutmaßlich von SFKs phosphoryliert werden, hatte eine deutliche Steigerung der Migration und eine verringerte Phosphorylierung von Siglec-9, Siglec-3 und SHP-2 zur Folge. Letztere ist eine Phosphatase, die nach Bindung an phosphorylierte ITIM-Domänen von Rezeptoren wie den Siglecs verschiedene Zielmoleküle dephosphoryliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über eine Hemmung von SFKs und daraus resultierend auf dem Wegfall eines inhibitorischen Signalwegs erfolgt. Diese Steigerung der Migration könnte in der Tumor-Therapie von großem Nutzen sein, da bei einer Vakzinierung mit autologen DCs, die mit Tumor-assoziierten Antigenen stimuliert wurden, die schlechte Einwanderung in die Lymphknoten eines der Hauptprobleme darstellt. Zur Überwindung dieses Problems könnte Dasatinib ein sehr effektives Hilfsmittel darstellen und die Therapie-Effizienz deutlich verbessern. Da Dasatinib aber auch eine ganze Reihe weiterer, sehr vielfältiger Einflüsse auf alle Arten von Immunzellen ausübt, scheint eine Verwendung spezifischer blockierender α-Siglec-Antikörper auf Grund geringerer Nebenwirkungen im Vergleich zu Dasatinib möglicherweise sogar noch deutlich besser geeignet zu sein, das Migrationsverhaltens Dendritischer Zellen positiv zu beeinflussen. Die Verwendung gegen Siglec-Rezeptoren gerichteter Antikörper als Adjuvantien könnte somit zu einem erfolgreicheren Einsatz der Vakzination mit Dendritischen Zellen in der Tumor-Therapie führen. N2 - SRC-family kinases (SFKs) are involved in growth and metastasis of tumor and leukemic cells as well as in manifold signaling pathways at prominent position in all types of immune cells. Inhibition of SFKs thereby represents a promising tool for the therapy of malignant diseases but can also be used quite effectively for immunomodulation. Besides its antitumoral activity, immune-suppressive as well as immune-stimulatory effects have been described for the tyrosine kinase inhibitor (TKI) dasatinib (trademark Sprycel®) which is approved for the treatment of CML and AML. Therefore the use of dasatinib could be a very interesting method for the modulation of immune responses. The present paper aimes to scrutinize the inhibitory and promoting effects of dasatinib on two types of immune cells to gain a better insight into the consequences of a dasatinib treatment in immune cells and to take advantage of the immunomodulatory potential of dasatinib. The first part of the paper deals with the investigation of potential combinatory effects between dasatinib and the glucocorticoid dexamethasone on various T cell subsets in the context of a potential use of the combination in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to dissect Graft-versus-leukemia (GvL) effects and Graft-versus-host Disease. While no combinatory effects regarding T cell activation occurred, the investigation of the influence on T cell proliferation revealed significant additive effects of the combination especially in CD8+ T cells. The proliferation of naïve T cell subsets was inhibited already by use of the single agents. In contrast, memory T cell subsets proved to be much more insensitive, but their proliferation was effectively hampered by a combination of dasatinib and dexamethasone whereas the most pronounced synergistic effects occurred in CD8+ memory subsets. Since the combination more potently inhibits also CD8+ in comparison to CD4+ Memory subsets and since these subsets seem to fulfill diverging roles in mediation of GvL effects and induction of GvHD, an increase in GvL efficacy by the drug combination while concurrently reducing the risk of a GvHD is conceivable, especially when including other published results. Moreover, as a potent inhibition of virus-specific T cells only occurred at very high concentrations, the risk of viral reactivations, which represent a major problem with HSCT, could be considered as rather marginal. The second part of the paper addresses the influence of dasatinib on monocyte-derived dendritic cells (moDCs) with a special focus on its influence on their migration. While dasatinib treatment exhibited only negligible effects on moDCs’ maturation and expression of costimulatory molecules, dasatinib led to a time- and dose-dependent reduction in cytokine secretion (IL-10 and IL-12). In contrast, dasatinib had no influence on phagocytotic activity of moDCs and on their ability to induce virus-specific T cell responses. Notably Dasatinib had a pronounced beneficial effect on migration of moDCs towards a CCL-19 gradient in a transwell assay without altering the expression of the CCL19 receptor CCR7. Since comparable migration-enhancing effects also occurred in presence of the specific SFK-inhibitor SKI-1 while the use of nilotinib, a TKI not inhibiting SFKs, in contrast led to an inhibition of migration, it can be assumed that dasatinib mediates its migration-enhancing effects via an inhibition of SFKs. Dasatinib treatment led to a dramatic decrease in phosphorylation of the inhibitory immunoreceptors Siglec-9 and Siglec-3 (CD33) without altering their expression levels. The use of specific antibodies for blocking of these immunoreceptors, whose ITIM domains are thought to be phosphorylated by SFKs, led to a powerful increase in migration and diminished phosphorylation of Siglec-9, Siglec-3 and SHP-2. The latter is a phosphatase which dephosphorylates target molecules after binding phosphorylated ITIM domains of receptors like the Siglecs. This paper’s results suggest that dasatinib mediates its migration-enhancing effects via inhibition of SFKs resulting in omission of an inhibitory signaling pathway. This enhancement of migratory capacity could be very useful in anti-tumor therapy as limited migration to the lymph nodes is one of the major problems when vaccinating with autologous dendritic cells that were stimulated with tumor-associated antigens. Dasatinib could be a potent mediator to overcome this problem and could lead to an improvement in the efficacy of therapy. Since dasatinib in addition also affects a broad range of processes in all immune cells, the use of specific α-Siglec blocking antibodies seems to be the more appropriate attempt to positively influence the migratory behavior of dendritic cells due to fewer side effects in comparison to dasatinib. Utilization of antibodies that target siglec receptors as adjuvants could lead to a more successful use of a vaccination with dendritic cells in tumor therapy. KW - Protein-Tyrosin-Kinasen KW - Dexamethason KW - T-Lymphozyt KW - Dendritische Zelle KW - Tyrosinkinaseinhibitor Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99477 ER - TY - THES A1 - Camara, Monika T1 - Die Rolle der CD8+ T Zellen in der Pathogenese der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis in der Lewis Ratte T1 - The role of CD8+ T cells in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats N2 - Multiple Sclerosis (MS) and its corresponding animal model Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) are autoimmune diseases of the central nervous system (CNS). Besides CD4+ T cells specific for myelin-derived antigens CD8+ T cells additionally contribute to the pathogenesis of that disease. However, the role of CD8+ T cells during the induction phase of the disease outside the CNS has not been clarified so far. Thus the contribution of CD8+ T cells to the immunopathogenesis of EAE in the Lewis rat was investigated in this work. For that purpose active EAE was induced in normal Lewis rats and animals that were deficient for CD8+ T cells due to the application of CD8-specific monoclonal antibodies. The CD8-depleted animals showed diminished disease activity in comparison to control rats. Equally, CD8-knockout rats, characterized by the absence of functional CD8+ T cells, developed clearly reduced symptoms of the disease in comparison to wild type littermates. Reduced disease activity of the CD8-deficient animals was accompanied by reduced infiltration of T cells and macrophages into the CNS. In the draining lymph nodes activated gpMBP-specific CD4+ T cells could be detected in the absence of CD8+ T cells, but they produced less amounts of proinflammatory cytokines like interferon-gamma than CD4+ T cells of normal rats. Obviously in the active EAE, myelin-specific CD4+ T cells are not able to differentiate completely into effector cells and invade the CNS upon absence of CD8+ T cells. In contrast fully differentiated encephalitogenic CD4+ effector cells equally potently induced EAE upon transfer into either normal or CD8-deficient rats. Hence, the pathogenic potential of completely differentiated CD4+ effector cells does not depend on the presence of CD8+ T cells. With the help of a rat-IFN-gamma ELISpot interferon-gamma-producing gpMBP-specific CD8+ T cells were detected in animals immunized with gpMBP. To directly detect gpMBP-specific CD8+ T cells, RT1.Al-Ig dimeres were generated and loaded with different gpMBP-derived peptides. Indeed, CD8+ T cells specifically recognizing RT1.Al-Ig dimeres loaded with gpMBP125-133 could be detected in the draining lymph nodes of rats, immunized with gpMBP in CFA. The results of this work allow the conclusion that in the EAE of the Lewis rat interferon--producing CD8+ T cells interact with myelin-specific CD4+ T cells, thus licensing these cells to differentiate into CNS invading effector cells. N2 - Die Multiple Sklerose (MS) und ihr Tiermodell, die Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), sind Autoimmunerkrankungen des Zentralen Nervensystems (ZNS). Neben myelinspezifischen CD4+ T-Zellen tragen auch CD8+ T-Zellen zur Pathogenese dieser Erkrankungen bei. Allerdings ist die Rolle der CD8+ T-Zellen während der Induktionsphase der Erkrankung außerhalb des ZNS noch unklar. In dieser Arbeit wurde daher der Beitrag der CD8+ T-Zellen in der EAE der Lewis-Ratte näher untersucht. Dazu wurde die Krankheitsaktivität der aktiven EAE in normalen Lewis-Ratten mit Tieren verglichen, in denen die CD8+ T-Zellen durch CD8-spezifische monoklonale Antikörper depletiert wurden. Die CD8-depletierten Tiere zeigten dabei eine verminderte Krankheitsaktivität im Vergleich zu den Kontrolltieren. Ebenso entwickelten CD8 knockout Ratten, die durch die Abwesenheit funktionsfähiger CD8+ T-Zellen gekennzeichnet sind, deutlich reduzierte Krankheitssymptome im Vergleich zu wildtypischen Tieren. Die reduzierte Krankheitsaktivität in den CD8-defizienten Tieren war von einer verminderten Infiltration von T-Zellen und Makrophagen in das ZNS begleitet. Zwar konnten aktivierte gpMBP-spezifische CD4+ T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten von CD8-depletierten Ratten detektiert werden, diese produzierten jedoch in deutlich reduziertem Umfang pro-inflammatorische Zytokine wie beispielsweise Interferon-. Offensichtlich können in der aktiven EAE myelinspezifische CD4+ T-Zellen in Abwesenheit von CD8+ T-Zellen nicht vollständig zu Effektorzellen differenzieren und infolgedessen das ZNS nicht infiltrieren. Umgekehrt konnten nach adoptivem Transfer von voll ausdifferenzierten enzephalitogenen CD4+ Effektorzellen sowohl in normalen als auch CD8-defizienten Empfängertieren gleich starke Symptome einer AT-EAE beobachtet werden. Die Entfaltung des pathogenen Potentials voll ausgereifter CD4+ Effektorzellen scheint somit nicht von der Präsenz von CD8+ T-Zellen abzuhängen. Mit Hilfe eines Ratten-IFN- ELISpots gelang erstmals die Detektion Interferon--produzierender gpMBP-spezifischer CD8+ T-Zellen in Tieren, die zuvor mit gpMBP immunisiert wurden. Zum direkten Nachweis von gpMBP-spezifischen CD8+ T-Zellen wurden RT1.Al-Ig Dimere generiert und mit verschiedenen gpMBP-Peptiden beladen. Tatsächlich konnten in den drainierenden Lymphknotenzellen von Ratten, die zuvor mit gpMBP in CFA immunisiert wurden, CD8+ T-Zellen detektiert werden, die gpMBP125-133-beladene RT1.Al-Ig Dimere erkennen. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen insgesamt den Schluss nahe, dass bei der EAE der Lewis-Ratte Interferon--produzierende CD8+ T-Zellen in der Peripherie mit myelinspezifischen CD4+ T-Zellen interagieren und damit deren Differenzierung zu ZNS-infiltrierenden Effektorzellen ermöglichen. KW - Multiple Sklerose KW - CD8+ T cells KW - Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) KW - Multiple Sclerosis KW - CD8+ T-Zellen KW - Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) KW - Multiple Sklerose KW - Encephalomyelitis KW - T-Lymphozyt KW - Ratte KW - EAE Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98497 PB - Journal of Neuroimmunology (2013) ER - TY - THES A1 - Bieringer, Maria T1 - Analyse der Speziesbarriere humaner Zellen gegenüber Infektion mit Hundestaupevirus (CDV) T1 - Analysis of the species barrier of human cells against infection with canine distemper Virus (CDV) N2 - Die geplante Ausrottung der Masern bis 2020 und die damit eventuell einhergehende Beendigung der Masernimpfung könnten die Voraussetzungen dafür schaffen, dass andere Morbilliviren, wie beispielsweise das Hundestaupevirus (CDV), einen Wirtswechsel zum Menschen vollbringen könnten. CDV ist ein hoch ansteckendes Pathogen und besitzt einen weiten Wirtstropismus, der sich aktuell immer weiter ausbreitet. Im Gegensatz dazu kann das Masernvirus (MV) nahezu ausschließlich Menschen und nur sehr bedingt wenige Affenarten infizieren. In dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass eine Adaptierung des rekombinanten wildtypischen CDV-Stammes CDV-75/17red an den humanen Rezeptor SLAM (signaling lymphocytic activation molecule, CD150) reproduzierbar und innerhalb weniger Passagen erfolgt. Bei der Adaptierung an das humane SLAM ist dabei nur eine Mutation in dem Gen für das virale Hämagglutinin notwendig. Diese Mutation an Position 8697 von A zu G im viralen Genom (Aminosäure D540G im Hämagglutinin) konnte reproduzierbar detektiert werden, obwohl veröffentlicht wurde, dass unterschiedliche Mutationen im Hämagglutinin verschiedener CDV-Stämme eine SLAM-Adaptierung ermöglichen. Die Mutation D540G im Hämagglutinin des humanen SLAM-adaptierten CDV-A75/17red kompensiert eine negative Ladung der Aminosäure 71E, die speziesspezifisch im humanen SLAM vorhanden ist. Durch Wachstumskinetiken konnte belegt werden, dass das an humanes SLAM-adaptierte CDV-A75/17red auch weiterhin das canine SLAM effizient verwendet. Ein weiterer Eintrittsrezeptor, humanes Nectin4, konnte mit demselben CDV-Stamm ohne adaptive Mutation in den viralen Hüllproteingenen benutzt werden. Wachstumskurven auf verschiedenen humanen B-Lymphozyten Zelllinien zeigen allerdings, dass eine alleinige Adaptierung an die humanen Wirtszellrezeptoren, für eine effiziente Virusreplikation, nicht ausreicht. Damit das CDV die Speziesbarriere durchbrechen kann, muss offenbar ein weiterer Adaptierungsprozess an die humanen Wirtszellen erfolgen, der voraussichtlich mit umfangreicheren Mutationen des viralen Genoms einhergehen würde. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass intrinsische Faktoren und das angeborene Immunsystem eine wichtige Barriere bilden und den Menschen vor einer CDV-Infektion schützen. Allerdings würde eine Fortführung der MV-Impfung auch nach Ausrottung der Masern, aufgrund der Kreuzreaktivität gegen andere Morbilliviren, den Schutz vor einer möglichen Adaptierung eines Morbillivirus, wie CDV, an den Menschen deutlich verstärken. N2 - Analysis of the species barrier of human cells against infection with canine distemper Virus (CDV) KW - Staupevirus KW - Masernvirus KW - Anpassung KW - Nectin4 KW - CD150 KW - human KW - canine KW - Adaptation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97725 ER - TY - THES A1 - Nowotny, Boris T1 - Etablierung von zellulären Testsystemen für die Identifizierung von neuartigen Inhibitoren des HIV-1 Vif-induzierten APOBEC3G-Abbaus T1 - Establishment of cellular test systems for the identification of novel inhibitors of the HIV-1 Vif-induced APOBEC3G- degradation N2 - Als einer der ersten gegen HIV gerichteten Restriktionsfaktoren konnte die Cytidindeaminase APOBEC3G isoliert werden. Dieses zelluläre Enzym hemmt äußerst effizient die Replikation von HIV. Weiterführende Untersuchungen konnten demonstrieren, dass die Hemmung der Virusreplikation hauptsächlich auf einer Deaminase-katalysierten G zu A-Hypermutation des viralen Genoms während der Reversen Transkription beruht. Als Gegenstrategie zur antiretroviralen Wirkung von A3G kodiert HIV-1 das Protein Vif (virion infectivity factor), welches durch eine direkte Wechselwirkung den Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Abbau von A3G bewirkt. Vor diesem Hintergrund wird der Inhibition des Vif induzierten A3G- Abbaus großes Potential als neuartiges Wirkstoffziel bei der Behandlung von HIV Infektionen vorhergesagt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb in der Etablierung von zellulären Screening-Assays für die Identifizierung von Inhibitoren des Vif induzierten A3G-Abbaus. Im Rahmen dieser Arbeit konnten insgesamt vier fluoreszenzbasierte zelluläre Assays erfolgreich entwickelt und als Screeningsysteme für die Wirkstoffsuche etabliert werden. Drei dieser Assays basieren auf stabilen Zelllinien, von denen eine Vif und ein mit EYFP markiertes A3G ko-exprimiert. Dieser sogenannte A3G-Abbauassay stellt den primären Assay für die Identifizierung von Inhibitoren des Vif induzierten A3G-Abbaus dar und wird durch zwei weitere Zelllinien-basierte Assays ergänzt. Diese sekundäre Assays erlauben die Detektion von Substanzen, die falsch-positive oder falsch-negative Signale im A3G-Abbauassays generieren. Zusammengenommen ermöglichen die drei Assays die präzise Identifizierung von Inhibitoren, die spezifisch auf den A3G-Abbau wirken und stellen damit eine wesentliche Verbesserung bereits existierender Screeningsysteme dar. Weiterhin wurde ein auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) basierendes Testsystem entwickelt. Besagtes System misst die direkte Interaktion zwischen Vif und ElonginC in lebenden Zellen und repräsentiert damit ein weiteres Testsystem für die Identifizierung von Inhibitoren der Vif induzierten A3G-Degradation. Den zweiten Teil dieser Arbeit umfasste die Analyse von Derivaten des Vif Antagonisten RN-18 und neu entwickelten niedermolekularen Inhibitoren der Vif-ElonginC- Interaktion. Als ein wichtiges Ergebnis der Derivat-Analyse ergab sich, dass RN-18 zytotoxisch wirkt und im hier etablierten A3G-Abbauassay ein falsch-positives Signal generiert. Unter den analysierten Vif-ElonginC-Interaktionsinhibitoren fand sich eine Verbindung, die in einem initialen Screening, unter Verwendung des A3G-Abbauassays, eine deutliche Inhibition der Vif induzierten A3G-Degradation bewirkte. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieses Promotionsprojektes erfolgreich mehrere Screeningsysteme für die Identifizierung von spezifischen Inhibitoren des A3G-Abbaus etabliert werden. Diese Systeme werden zukünftig dazu beitragen, dass Auffinden von neuartigen Therapeutika für die Behandlung von HIV-Infektionen zu beschleunigen. N2 - One of the first cellular HIV restriction factors isolated was the cytosine deaminase APOBEC3G. This cellular enzyme was shown to efficiently inhibit the replication of HIV and other viruses. Further research revealed that restriction of the viral replication is primarily based on a deaminase-catalyzed G to A hypermutation of the viral genome during reverse transcription. As a mode of counteraction, the HIV-1 encoded accessory protein Vif (virion infectivity factor) binds to A3G leading to its ubiquitin-dependent proteasomal degradation. It has been hypothesized that inhibition of the A3G degradation rescues the antiviral properties of the APOBEC3 protein and thus represents an attractive target for novel antiretroviral drugs. Therefore, the goal of this study was to establish cellular screening assays for the identification of inhibitors of the Vif mediated A3G degradation. Four fluorescent based cellular assays have been established for the screening of small organic compounds. Three of these assays are based on stable cell lines, one of which co-expresses Vif and an EYFP tagged A3G protein. This so-called A3G degradation assay represents the primary assay for identification of degradation inhibitors and is complemented by two additional cell line based assays. These secondary assays enable the detection of compounds generating false-positive or false-negative signals in the A3G degradation assay. These systems allow the precise identification of true-positive A3G degradation inhibitors and thus representing a significant improvement of existing screening platforms. Furthermore, a cellular assay based on the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) was developed. The BiFC-assay measures the direct interaction between Vif and ElonginC in living cells and can be used as a new screening platform for identification of inhibitors targeting the Vif- ElonginC interaction, which is an essential step in the A3G degradation sequence. The aim of the second part of the project was the application of the established screening assays for testing of derivatives of the Vif antagonist RN-18 and rational designed inhibitors targeting the direct interaction between Vif and ElonginC. As a result of the compound testing it was shown, that RN-18 is cytotoxic and generates a false-positive signal in the A3G degradation assay. In case of the Vif-ElonginC interaction inhibitors one compound exhibited a strong inhibitory effect on A3G degradation in an initial screen. Taken together, screening assays for the precise identification of specific inhibitors of the A3G degradation were successfully established. These screening assays will accelerate the identification of novel anti-HIV agents. KW - Inhibitor KW - Screening KW - HIV KW - APOBEC3G KW - HIV-1 Vif KW - Inhibitor KW - Screening KW - APOBEC3G KW - HIV-1 Vif KW - Inhibitor KW - Screening KW - Restriktionsenzym Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70477 ER - TY - THES A1 - Pachel, Christina Elisabeth T1 - Entzündliche Faktoren und Blutplättchen im experimentellen myokardialen ischämischen Schaden T1 - Inflammatory factors and blood platelets in experimental myocardial ischemic injury N2 - Die erfolgreiche therapeutische Beeinflussung pathophysiologischer Prozesse im Herzen nach myokardialem Infarkt stellt nicht zuletzt durch die steigenden Fallzahlen in der westlichen Welt und die vergleichsweise hohe Mortalität eine Herausforderung an Forschung und Entwicklung dar. In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene therapeutische Strategien in klinisch relevanten Mausmodellen des Myokardinfarkts und des Ischämie-Reperfusions-Schadens getestet. Zunächst wird untersucht, ob sich der Einsatz des NFκB-aktivierenden Zytokins TWEAK, welches weitreichende Funktionen in physiologischen Prozessen wie Wundheilung und Entzündung besitzt, als eine mögliche Therapiestrategie eignet. Die Expression von TWEAK wird nach myokardialem Infarkt stark im Herzgewebe induziert. Das gleiche gilt für den Rezeptor von TWEAK, Fn14, der vor allem auf kardialen Fibroblasten exprimiert wird. Daher wird angenommen, dass das TWEAK-Fn14-System am kardialen Remodelling und der Wundheilung im infarzierten Herzen beteiligt sein kann. Eine rekombinante Variante von TWEAK - HSA-Flag-TWEAK - wird im Mausmodell des Myokardinfarkts getestet. Überraschenderweise zeigt sich hierbei, dass die therapeutische Behandlung von infarzierten Versuchstieren mit diesem Protein die Mortalität im Vergleich zu Placebo-behandelten Mäusen signifikant erhöht. Dies geht mit einem vermehrten Auftreten an linksventrikulären Rupturen einher, ohne dass Defekte im kardialen Remodelling oder eine erhöhte Apoptoserate im Herzen festgestellt werden können. HSA-Flag-TWEAK bewirkt eine Erhöhung der Gewebekonzentrationen an verschiedenen pro-inflammatorischen Zytokinen (IFN-γ, IL-5, IL-12, GITR, MCP-1/-5 und RANTES) und das vermehrte Einwandern von Immunzellen in das Myokard. Hierbei ist insbesondere die stark erhöhte Infiltration an neutrophilen Granulozyten auffällig. Ein kausaler Zusammenhang zwischen diesen Immunzellen und den auftretenden kardialen Rupturen kann durch die Depletion der Neutrophilen gezeigt werden: Nach der systemischen Applikation eines Ly6G-depletierenden Antikörpers ist das Auftreten von kardialen Rupturen nach TWEAK-Gabe vergleichbar mit der Placebo-behandelten Infarktgruppe. Die Tatsache, dass die Mortalität dennoch erhöht ist, deutet auf weitere negative Effekte durch TWEAK hin. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass eine Hemmung der TWEAK-Fn14-Achse positive Effekte auf die Wundheilung nach Herzinfarkt bewirken könnte. Als zweite Therapiestrategie wird die pharmakologische Beeinflussung verschiedener Blutplättchen-spezifischer Zielstrukturen untersucht, um das Auftreten von Mikrothromben nach Myokardinfarkt zu reduzieren. Eine Hemmung über das Blutplättchen-Glykoprotein GPVI bewirkt in dem hier eingesetzten Mausmodell der kardialen Ischämie-Reperfusion eine signifikant verbesserte Mikrozirkulation sowie verringerte Infarktgrößen. GPVI stellt somit ein vielversprechendes Ziel für eine blutplättchenhemmende Therapie nach Myokardinfarkt dar. Zusammengefasst werden in der vorliegenden Arbeit verschiedene neuartige Therapieoptionen untersucht, die die Auswirkungen ischämischer Erkrankungen des Herzens beeinflussen können. Die Ergebnisse besitzen daher das Potenzial, zur Entwicklung neuer Therapien nach Myokardinfarkt beizutragen. N2 - The successful therapeutic targeting of pathophysiological processes in the heart is of importance for the treatment of patients suffering from myocardial infarction. Due to the combination of the rising incidence of this diesease in Western countries with its comparably high mortality, novel therapies need to be developed. In the work presented here, several innovative concepts are tested in clinically relevant mouse models of myocardial infarction and ischemia-reperfusion injury. First, the feasibility of using the NFκB-activating cytokine TWEAK as a novel drug in the treatment of myocardial infarction is assessed. TWEAK is involved in wound healing and inflammation and might therefore play a pivotal role in cardiac remodelling and the outcome after myocardial infarction. The expression of this cytokine within the infarcted heart is significantly up-regulated as is the expression of the TWEAK receptor Fn14, which is mainly expressed on cardiac fibroblasts. A recombinant variant of this cytokine - HSA-Flag-TWEAK - is used to treat infarcted mice in order to assess whether exogeneous TWEAK modulates the pathologic events following ischemic cardiac injury. Surprisingly, the treatment of infarcted test animals with HSA-Flag-TWEAK results in significantly increased mortality compared to placebo-treated mice. This is accompanied with an increased incidence in left ventricular cardiac ruptures without apparent defects in cardiac remodelling or increased rates of cardiac apoptosis. Treatment with HSA-Flag-TWEAK increases tissue levels of several pro-inflammatory cytokines (IFN-γ, IL-5, IL-12, GITR, MCP-1/-5 and RANTES) and elevates the numbers of immune cells within the myocardium. In particular, the infiltration of neutrophilic granulocytes is markedly increased. Employing Ly6G-depleting antibodies in vivo proves neutrophils to be a causal factor in the occurrence of cardiac ruptures following HSA-Flag-TWEAK treatment. Depletion of these cells results in a reduction of cardiac rupture incidences to baseline values. Nevertheless, mice treated with HSA-Flag-TWEAK still show increased mortalities, irrespective of being proficient or deficient for neutrophils. This implies further negative mechanisms induced by the activation of the TWEAK-Fn14 axis in this experimental setting and might pave the way for the development of therapies neutralizing or blocking TWEAK as a novel means to improve the outcome after myocardial infarction. As a second therapeutic strategy, several platelet-specific proteins are targeted in a mouse model of myocardial ischemia-reperfusion injury to reduce the incidence of microthrombi after myocardial infarction. Inhibiting the platelet glycoprotein GPVI results in significantly improved microcirculation and decreased infarct sizes. Platelet inhibition by targeting GPVI might therefore be a promising novel therapeutic strategy after myocardial infarction. In summary, a number of innovative therapeutic strategies targeting different molecular structures are tested here and the results of this study may contribute to the development of novel therapies after myocardial infarction. KW - Herzinfarkt KW - Herzruptur KW - Entzündung KW - Thrombozyt KW - TWEAK KW - Thrombozyt KW - Inflammation KW - TWEAK KW - Rupturen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-92565 ER -