TY - THES A1 - Schauber, Jürgen T1 - Modulation von Zellzyklus- und Apoptoseregulation in humanen kolorektalen Karzinomzellen durch Butyrat und Acetylsalicylsäure T1 - Modulation of cell cycle- and apoptosis control in human colorectal cancer cells by butyrate and aspirin N2 - Zahlreiche experimentelle und epidemiologische Studien schreiben der kurzkettigen Fettsäure Butyrat und dem Cyclooxygenasehemmer Acetylsalicylsäure eine Schutzwirkung auf die Entstehung des kolorektalen Karzinoms zu. Die genauen Mechanismen hinter der Wirkung beider Substanzen sind ungeklärt. Um die Effekte von Butyrat und Acetylsalicylsäure, sowie deren Kombination, auf das Wachstum, die Differenzierung und Apoptose von Kolonkarzinomzellen zu untersuchen, wurden Zellkulturexperimente und Western Blot Analysen durchgeführt. Unter Butyratinkubation kam es zu einer Steigerung der Differenzierung von HT-29-Kolonkarzinomzellen, jedoch nicht von Caco-2 Zellen. Acetylsalicylsäure allein hatte keinen relevanten Effekt auf die Zelldifferenzierung und in Kombination konnte Acetylsalicylsäure die differenzierende Wirkung des Butyrats nicht verstärken. Butyrat und Acetylsalicylsäure hemmten die Proliferation der untersuchten kolorektalen Karzinomzellen. Bei Inkubation mit einer Kombination von Butyrat und Acetylsalicylsäure wurde der antiproliferative Effekt der Einzelsubstanzen deutlich verstärkt. Im Western-Blot konnte diese Beobachtung durch Untersuchung des Proliferationsmarkers PCNA bestätigt werden. Gleichzeitig veränderte sich das Expressionsmuster zellzyklusregulierender Proteine in den untersuchten Zellen: Die Cyclin D3-Expression wurde in Caco-2 Zellen sowie in HT-29 Zellen durch Butyratinkubation erhöht. In Kombination mit Acetylsalicylsäure verstärkte sich die Wirkung von Butyrat auf die Expression von p21Waf1/Cip1 und cdk2: Acetylsalicylsäure und Butyrat in höheren Konzentrationen reduzierten die Expression von cdk2 in HT-29 Zellen, in niedrigen Konzentrationen führte nur die Acetylsalicylsäure-Butyrat-Kombination zu einem Abfall des cdk2-Proteingehalts. Butyrat induzierte die Expression des cdk-Inhibitors p21Waf1/Cip1 in beiden Kolonkarzinomzellinien. Die Wirkung auf p21Waf1/Cip1 war hierbei p53-unabhängig, da es gleichzeitig zu einem Abfall der Konzentration an p53-Protein in HT-29 Zellen kam und in Caco-2 Zellen kein p53 nachweisbar war. Acetylsalicylsäure hatte erst in höherer Konzentration einen Einfluss auf die p21Waf1/Cip1 Proteinexpression in HT-29 Zellen. Die Kombination von Butyrat und Acetylsalicylsäure übertraf in ihrer Wirkung die des Butyrats schon bei Konzentrationen, bei denen die alleinige Butyratinkubation ohne Effekt blieb. Weiterhin induzierte Butyrat, über einen Anstieg der Expression des pro-apoptotischen Faktors Bak, Apoptose in den untersuchten Kolonkarzinomzellen, bei gleichzeitigem Abfall des anti-apoptotischen Bcl-XL. Bei Inkubation mit der Acetylsalicylsäure-Butyrat-Kombination kam es zu einer deutlichen Verstärkung der Apoptoseinduktion, wobei Acetylsalicylsäure die Wirkung des Butyrats auf Bak und Bcl-XL jedoch nicht steigerte. Zudem konnte gezeigt werden, dass der Effekt des Butyrats mit einer Inhibition der Phosphorylierung und Degradation von IkBa, und damit einer Verhinderung der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB einhergeht, was die Wirkung von apoptose-induzierenden Substanzen verstärken kann. Zusammenfassend zeigte sich bei Kombination der Einzelsubstanzen Butyrat und Acetylsalicylsäure eine Verstärkung ihrer Wirkung auf die Zellproliferation, sowie die Apoptoseinduktion bei Kolonkarzinomzellen. Dieser Effekt wird durch unterschiedliche molekulare Mechanismen vermittelt, wobei mit p21Waf1/Cip1 und cdk2 erstmals Faktoren ermittelt wurden, auf deren Expression Butyrat und Acetylsalicylsäure additive oder potentiell synergistische Effekte haben. N2 - Numerous experimental and clinical study data support the view of a preventive effect of butyrate and aspirin on the incidence of colorectal carcinomas. The exact underlying mechanisms however remain unclear. In order to examine the effects of butyrate, aspirin and their combination on proliferation, differentiation and apoptosis in colorectal carcinoma cells, cell culture experiments and Western blot analyses were performed. Butyrate-incubation induced differentiation in HT-29 colon carcinoma cells, but not in Caco-2 cells. Aspirin did not exert relevant effects on cell differentiation and did not support the butyrate effects. Both butyrate and aspirin decreased the proliferation of the investigated cell lines. Coincubation with both substrates enhanced the antiproliferative effects of the single substances. In Western blot analyses this observation was confirmed by decreased levels of PCNA, a marker for cell proliferation. At the same time the expression pattern of cell cycle regulating factors was changed: Cyclin D3 expression was induced by butyrate in Caco-2 and HT-29 cells. In combination with aspirin the effect of butyrate on p21Waf1/Cip1 und cdk2 expression was enhanced: Aspirin and butyrate in high concentrations decreased the expression of cdk2 in HT-29 cells whereas in low concentrations only the aspirin-butyrate-combination decreased cdk2 protein. Butyrate induced the expression of the cdk-inhibitor p21Waf1/Cip1 in both cell lines. Butyrate induced p21Waf1/Cip1 independently from p53 as butyrate decreased p53 levels at the same time. Aspirin induced p21Waf1/Cip1 expression when applied at high concentrations. In combination butyrate and aspirin had a stronger effect on p21Waf1/Cip1 expression already at concentrations at which butyrate alone did not have an effect. Also butyrate induced apoptosis by inducing pro-apoptotic Bak and decreasing anti-apoptotic Bcl-XL in the investigated cell lines. When butyrate and aspirin were applied in combination the pro-apoptotic effects of butyrate were enhanced. However aspirin did not have an effect on Bak and Bcl-XL expression. Furthermore it could be shown that the butyrate effects are associated with an inhibition of phosphorylation and subsequent degradation of IkBa. This was followed by an inhibition of the activation of the transcription factor NFkB, which can support the effect of apoptosis-inducing factors. Taken together an enhanced effect of the aspirin-butyrate combination on cell proliferation and apoptosis in colorectal cancer cells was observed. This effect was mediated by different molecular mechanisms. For the first time factors could be identified, p21Waf1/Cip1 and cdk2, on which butyrate and aspirin exert additive and potentially synergistic effects. KW - Butyrat KW - Acetylsalicylsäure KW - Kolorektales Karzinom KW - Apoptose KW - Zellzyklusregulation KW - Butyrate KW - Aspirin KW - Colorectal Carcinoma KW - Apoptosis KW - Cell cycle control Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179976 ER - TY - THES A1 - Riedel, Walter K. T1 - Metastasierungsverhalten von Mundhöhlenkarzinomen in Abhängigkeit vom Therapieregime T1 - Metastasis in oral cancer in view of therapy N2 - In der vorliegenden retrospektiven Studie wurde das Metastasierungsverhalten von Mundhöhlenkarzinomen des Krankengutes der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie der Universität Würzburg aus den Jahren 1985 bis 1999 bei unterschiedlichen Therapiekonzepten untersucht. 774 Patienten wurden in die Untersuchung einbezogen. Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 59 Jahre. Das Verhältnis von männlichen zu weiblichen Patienten lag bei 4:1. 36,3 Prozent (280) der Tumoren lagen im Bereich des Mundbodens, 15,9 Prozent (123) in der Unterlippe, 13,7 Prozent (106) im Bereich des Oropharynx, 12,4 Prozent (96) im Unterkiefer-Alveolarfortsatz, 10,2 Prozent (79) in der Zunge, 7,1 Prozent (55) in Oberkiefer und Gaumen, 3,1 Prozent (24) in der Wangenschleimhaut und 1,2 Prozent (9) in der Oberlippe. Eine alleinige chirurgische Tumorresektion wurde bei 60,1 Prozent (465) der Patienten durchgeführt. Eine chirurgische Therapie mit präoperative Radiatio (40 Gy) erhielten 1,3 Prozent (10) der Patienten, eine chirurgische Therapie mit kombinierter präoperativer Radio-Chemo-Therapie (40 Gy) erhielten 25,5 Prozent (197). 7,4 Prozent (57) der Patienten erhielten eine alleinige Radio-Chemo-Therapie, 4,9 Prozent (38) eine Radiatio solo. Postoperativ wurde eine Bestrahlung bei 5,0 Prozent (39) und eine Chemotherapie bei 0,3 Prozent (2) der Patienten durchgeführt. 21,0 Prozent (163) aller Patienten erhielten eine ipsilaterale Lymphknotenausräumung, 22,4 Prozent (173) eine bilaterale Lymphbahnausräumung. 50,6 Prozent (170) der Patienten, deren Halsweichteile ausgeräumt wurden, erhielten ipsilateral eine radikale Neck dissection, 21,4 Prozent (72) eine konservierende Neck dissection, 28,0 Prozent (94) eine suprahyoidale Ausräumung. 72,5 Prozent (561) der Patienten blieben innerhalb der Nachbeobachtungszeit (durchschnittlich 2,9 Jahre) rezidiv- bzw. metastasenfrei. Ein Lokalrezidiv entwickelten 14,9 Prozent (115) der Patienten. Metastasen entwickelten innerhalb der Nachbeobachtungszeit 16,5 Prozent (128) der Patienten: 68,8 Prozent (88) regionäre Metastasen, 31,2 Prozent (40) Fernmetastasen. Einen statistisch signifikanten Einfluss (p<0,05) auf die Metastasenhäufigkeit hatte die Lokalisation des Primärtumors (26,3 Prozent Metastasen bei Tumoren im Bereich der Wangenschleimhaut, 24,3 Prozent bei Mundbodenkarzinomen, 23,6 Prozent bei Oropharynxkarzinomen, 20,0 Prozent bei Oberkieferkarzinomen, 15,9 Prozent bei Zungenkarzinomen, 13,4 Prozent bei Karzinomen des Unterkiefer-Alveolarfortsatzes, 7,0 Prozent bei Lippenkarzinomen und 0,0 Prozent Metastasen bei Oberlippenkarzinomen). Wurde eine alleinige Tumorresektion durchgeführt, traten bei 9,7 Prozent der Patienten Metastasen auf. Wurde die Behandlung durch eine präoperative Radio-Chemo-Therapie erweitert, traten bei 35,0 Prozent der Patienten Metastasen auf. Wurde zusätzlich noch eine postoperative Radiatio durchgeführt, entwickelten 38,5 Prozent der Patienten Metastasen. Nach Durchführung einer alleinigen Radiatio mit 70 Gy traten bei 11,1 Prozent der Patienten Metastasen auf, nach kombinierter Radio-Chemo-Therapie (70 Gy) bei 20,5 Prozent der Patienten. Histologisch positive Resekatränder erhöhten die Metastasenwahrscheinlichkeit statistisch signifikant von 17,0 Prozent auf 45,7 Prozent. Von der Art der Lymphbahnausräumung (ohne Berücksichtigung adjuvanter Therapien) ist die Metastasenwahrscheinlichkeit statistisch signifikant abhängig. Nach Durchführung einer alleinigen ipsilateralen radikalen Neck dissection zeigte sich eine Metastasierungsrate von 25,6 Prozent. Wurde statt dessen eine konservierende Neck dissection durchgeführt, traten bei 40,0 Prozent der Patienten Metastasen auf. Wurde die ipsilaterale radikale Neck dissection mit einer kontralateralen suprahyoidalen Ausräumung kombiniert, traten bei 37,1 Prozent der Patienten Metastasen auf. Nach ipsilateraler konservierender Neck dissection und kontralateraler suprahyoidaler Ausräumung zeigten sich bei 55,3 Prozent der Patienten Metastasen. Die Inzidenz kontralateraler Metastasen lag bei alleiniger ipsilateraler Behandlung bei 34,3 Prozent, bei zusätzlicher kontralateraler suprahyoidaler Ausräumung bei 30,2 Prozent (trotz der hier zumeist vorliegenden ungünstigeren Prognose durch größere Primärtumoren oder deren Lage im Bereich der Körpermedianen). KW - Mundhöhle KW - Karzinom KW - Metastasen KW - Therapie KW - Rezidiv KW - oral cancer KW - metastasis KW - therapy KW - recurrence Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181791 ER - TY - THES A1 - Reiß-Pönitz, Ulrike T1 - Untersuchung zum Wert der kieferorthopädischen Behandlung von Kl.II/1-Anomalien N2 - Ziel dieser Arbeit war, den subjektiven und objektiven Wert der kieferorthopädischen Behandlung zu erfassen. Es wurden zwei Gruppen von Patienten untersucht: 1. 30 ehemalige Patienten, die aufgrund einer Angle-Kl.II/1-Anomalie in ihrer Kindheit kieferorthopädisch behandelt wurden und 2. 16 unbehandelte Erwachsene, die zum Untersuchungszeitpunkt eine Kl.II/1-Dysgnathie aufwiesen. Das durchschnittliche Alter betrug etwa 29,5 Jahre. Geprüft wurden Mundgesundheitszustand,Funktionsbefund und die Patientenzufriedenheit mit der dentofazialen Ästhetik und der Funktion des Kauorgans (anhand von Fragebögen), bei den behandelten Patienten auch die Stabilität der Behandlungsergebnisse. Die Untersuchungsergebnisse wurden nach dem Helkimo-Index, dem DMF-T-Index und dem CPITN-Index ausgewertet. KW - Angle-Kl. II/1 KW - Stabilität KW - Helkimo-Index KW - DMF-T-Index KW - CPITN-Index Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179998 ER - TY - THES A1 - Piger, Veronika T1 - Einfluss immunologischer Mechanismen bei der Implantation von Embryonen und deren therapeutischer Nutzen im Rahmen des IVF-Programms T1 - The influency of immunological mechanisms for the implantation of embryos and the therapeutical effect for the ivf programm N2 - Trotz des hohen Standards in der IVF-Behandlung gibt es bestimmte Patientinnen bzw. Paare, bei denen es nach der Durchführung von drei oder mehr optimalen Behandlungszyklen mit einem Transfer von mehr als sechs Embryonen insgesamt, nicht zum Eintritt einer Schwangerschaft kommt, vermutlich liegen hierfür die Probleme in der Implantationsphase. Dies hieße, daß ein Embryo entweder gar nicht erst implantiert wird oder, daß er kurz nach der Implantation wieder abstirbt. Hieraus ergäbe sich eine Ähnlichkeit zum klinischen Abortgeschehen. Heute weiß man, daß dem klinischen Abortgeschehen in 60 bis 70 Prozent Chromosomenstörungen zu Grunde liegen, in den übrigen Fällen wird hauptsächlich eine immunologische Ursache angenommen. Somit könnte auch die Ursache wiederholter frustraner IVF-Behandlungen im immunologischen Bereich zu suchen sein. In unserer Untersuchung wurden 100 sterile Paare untersucht, die von 1987 bis 1995 das IVF-Programm durchliefen. Das Kollektiv umfaßt Patientinnen zwischen 22 und 42 Jahren, mit folgenden gynäkologischen Diagnosen: Normalbefund, idiopathische, tubare und ovarielle Sterilität. Bei den Partnern wurden die folgenden Befunde erhoben: Normozoospermie, Oligo-Astheno-Teratozoospermie und isolierte, aber sehr ausgeprägte Asthenozoospermie. Bei beiden Partnern wurden die HLA-Antigene bestimmt, sowie zytotoxische Antikörper im Serum der Frau gesucht. Anschließend wurden der Patientin intrakutan Lymphozyten ihres Partners in den Unterarm injiziert. Bei zu großer Übereinstimmung im HLA-System wurden Lymphozyten eines Fremdspenders verwendet, der in den wichtigsten Blutgruppenmerkmalen mit der Patientin übereinstimmmte. Nach 4 Wochen wurde im Serum der Patientin nach sog. "schützenden Antikörpern" gesucht. Je nach Testergebnis wurde ein ausreichender Schutz angenommen oder eine Auffrischung empfohlen. Es wurde eine kumulative Schwangerschaftsrate von 53 Prozent erzielt. In über 70 Prozent trat diese bereits im ersten Zyklus nach Immunisierung ein. Folgende Schwangerschaftsverläufe konnten beobachtet werden: je ein Drittel Geburt, intakte Schwangerschaft (>12. SSW), Abort bzw. EUG. Die Immunisierungstherapie, wie von uns durchgeführt, scheint eher unspezifisch zu sein und auch zeitlich begrenzt. Der genaue Wirkmechanismus bleibt noch zu klären. Die vorherrschenden Erklärungsmodelle in der Literatur für das immunologische Abortgeschehen sind die Folgenden: Ausbildung zytotoxischer Antikörper, Fehlen Blockierender Faktoren, erhöhtes HLA-Sharing der Partner. N2 - Though we have attended a high standard of ivf-treatments there are still patients who fail to become pregnant even after three or more cycles with a transfer of 6 or more embryos altogether. It is most probable that the main reasons herefore are during the implantation. That would mean that an embryo fails to be implanted or that he is aborted short afterwhile. It is known that the main reason for an abortion is an aberration of chromosomes in 60 to 80 per cent it is suggested that there are immunological reasons for the remaining 20 to 40 per cent. So it is likely that there are also immunological problemes responsible for recurrent ivf-failure. 100 patients from the age of 22 to 42 years who passed the ivf-programm from 1987 to 1995 were examened. Both partners were tested for the hla-antigens and it was looked for cytotoxic antibodies in the blood of the women. Lymphocytes of the husbands were injected in the forearm of the women for the immunological treatment. It was suggested to use lymphocytes of another donor if the hla-antigens of the partners were to much alike. Four weeks later "protective antibodies" were searched in the blood of the women. We could attend a pregnancy rate of 53 per cent, in about 70 per cent there was a pregnancy already in the first cycle after the immunization. About a third of the 53 patients gave birth to a healthy baby, another third was still pregnant, the other women aborted or had an extra-uterine pregnancy. The mechanisms of an immunological abortion are not yet detected but there are mainly the following reasons suggested: the developement of cytotoxic antibodies, the lack of blocking factors or a sharing of hla-antigens of the partners. The immunotherapy we carried out has to be considered as rather nonspecific and the way of its efficiency has still to be detected. KW - IVF KW - Sterilität KW - Immunisierung KW - Blockierende Faktoren KW - HLA-Antigene KW - zytotoxische Antikörper KW - ivf-failure KW - sterility KW - immunotherapy KW - blocking factors KW - hla-sharing KW - cytotoxic antibodies Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181788 ER - TY - THES A1 - Schwarz, Ulrike T1 - Biochemische und Molekularbiologische Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen Humanen Thrombozyten und Endothelzellen T1 - Biochemical and Molecular Characterization of Interactions Between Human Platelets and Endothelial Cells N2 - Der Blutkreislauf ist als wichtigstes Transportsystem im menschlichen Körper essentiell für die Versorgung der Gewebe und Organe mit Sauerstoff, Nährstoffen, Hormonen etc. Zwei Zelltypen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines funktionell intakten Blutgefäßsystems spielen, sind Thrombozyten, die zentralen Mediatoren der Blutgerinnung, und Endothelzellen, welche die luminale Seite der Gefäßwände auskleiden. Diese beiden Zellen sind aber auch wesentlich an der Pathologie der Atherosklerose und kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt. Durch direkte und indirekte Interaktionen beeinflussen sich diese beiden Zelltypen gegenseitig und regulieren ihre Aktivität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Analysenmethode entwickelt, welche den Funktionszustand der Thrombozyten quantitativ erfaßt. Sowohl die Aktivierung als auch die Hemmung humaner Thrombozyten wird durch die Phosphorylierung spezifischer Signalproteine reguliert. Basierend auf der Verwendung phosphorylierungsspezifischer Antikörper und der Durchflußzytometrie wurde eine Methode etabliert, welche die Proteinphosphorylierung auf Einzelzellebene erfaßt, schnell quantifizierbare Ergebnisse liefert und für die Analyse im Vollblut geeignet ist. Da die Sekretion von Endothelfaktoren den Phosphorylierungszustand dieser Proteine in den Thrombozyten beeinflußt, kann die Methode auch dazu verwendet werden, indirekt Rückschlüsse auf den Funktionszustand der Endothelzellen zu gewinnen. In einer ersten klinischen Anwendung wurde die Methode eingesetzt, um den Therapieverlauf der antithrombotischen Medikamente Ticlopidin und Clopidogrel, welche gezielt die ADP-induzierte Thrombozytenaktivierung hemmen, zu verfolgen und das Antwortverhalten von Patienten auf diese Medikamente zu messen. Mehrere Personen, bei denen Ticlopidin und Clopidogrel keine Wirkung zeigten, wurden gefunden, ein Hinweis darauf, daß eine Resistenz gegen Thienopyridine vorkommt. Es ist bekannt, daß Endothelfaktoren bestimmte Aspekte der Thrombozytenaktivierung hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der p38 und p42 Mitogen-aktivierten Proteinkinasen, die im Verlauf der Thrombozytenaktivierung von zahlreichen Agonisten induziert wird, ebenfalls durch die endothelialen Vasodilatatoren NO (Stickstoffmonoxid) und Prostaglandin gehemmt wurde. Außerdem hemmten diese Substanzen die Translokation der inflammatorischen Moleküle P-Selektin und CD40 Ligand (CD40L) aus intrazellulären Speicherorganellen auf die Thrombozytenoberfläche. P-Selektin und CD40L werden auf aktivierten Thrombozyten exprimiert und sind direkt an der Interaktion von Thrombozyten mit Leukozyten und Endothelzellen beteiligt. Um die Auswirkung von CD40L, P-Selektin und weiteren Faktoren aktivierter Thrombozyten auf humane Endothelzellen zu untersuchen, wurde mit Hilfe von cDNA-Arrays die differentielle Genexpression in Endothelzellen nach Koinkubation mit aktivierten Thrombozyten analysiert. Neben einer bereits bekannten Hochregulierung von Faktoren, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, wurde eine verstärkte Expression von Transkriptionsfaktoren (c-Jun, Egr1, CREB2), Wachstumsfaktoren (PDGF) sowie von Adhäsionsrezeptoren für extrazelluläre Matrixproteine (Integrin av, Integrin b1) gefunden. Diese Faktoren weisen darauf hin, daß aktivierte Thrombozyten die Migration und Proliferation der Endothelzellen anregen und damit die Wundheilung, aber auch pathophysiologische Prozesse wie die Ausbildung atherosklerotischer Plaques induzieren könnten. N2 - The blood circulation is the human body's main transport system and is essential for supplying tissues and organs with oxygen, nutrients, hormones, etc. Blood platelets, the central mediators of coagulation, and endothelial cells which line the inner wall of blood vessels, play important roles in the maintenance of functionally intact blood vessels. On the other hand, these cells also participate in the pathogenesis of atherosclerosis and cardiovascular diseases. These two cell types mutually influence each other and regulate their activity via direct and indirect interactions. In this work, a method which allows quantitative analysis of platelet function was developed. Platelet activation and inhibition is regulated by phosphorylation of specific signaling proteins. Based on the use of phosphorylation-specific antibodies and flow cytometry, a method was established which measures protein phosphorylation in single cells, gives fast and quantitative results, and is also suitable for analysis of whole blood samples. Since secretion of endothelial cell factors influences the phosphorylation state of these proteins, the method may also be used to get indirect information about the functional integrity of endothelial cells. In a first clinical application, this method was used to monitor the progression of a therapy with the anti-thrombotic drugs ticlopidine and clopidogrel which selectively inhibit ADP-induced platelet activation, and to determine the patients' responsiveness to these drugs. Several non-responders were identified, indicating the existence of a thienopyridine resistance. Endothelial cell factors are known to inhibit different aspects of platelet activation. In this work, phosphorylation of platelet p38 and p42 mitogen-activated protein kinases, which is induced by various platelet activators, was found to be inhibited by the endothelium-derived vasodilators nitric oxide (NO) and prostacyclin. Furthermore, these endothelial cell factors inhibited translocation of the inflammatory molecules P-selectin and CD40 ligand (CD40L) from intracellular granules to the platelet surface membrane. P-selectin and CD40L are expressed on activated platelets and are directly involved in the interaction of platelets with leukocytes and endothelial cells. To study effects of P-selectin, CD40L, and other parameters of activated platelets on human endothelial cells, cDNA Arrays were used to analyze differential gene expression in endothelial cells after coincubation with activated platelets. Besides the already known up-regulation of certain inflammatory factors, a number of additional genes which belong mainly to the group of transcription factors (c-Jun, Egr1, CREB2) and growth factors (PDGF) and of adhesion receptors for extracellular matrix proteins (integrin av, integrin b1) was found to be up-regulated by activated platelets. Expression of these genes indicates that activated platelets may induce migration and proliferation of endothelial cells and thereby initiate wound healing, but may also have pathophysiological effects like the development of atherosclerotic plaques. KW - Thrombozyt KW - Endothelzelle KW - Genexpression KW - Phosphorylierung KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyten KW - Endothelzellen KW - Durchflußzytometrie KW - Proteinphosphorylierung KW - Signaltransduktion KW - Genexpression KW - cDNA-Arrays KW - Atherosklerose KW - platelets KW - endothelial cells KW - flow cytometry KW - protein phosphorylation KW - signal transduction KW - gene expression KW - cDNA arrays KW - atherosclerosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2030 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Marc T1 - Die Rolle mitogener und stressinduzierter MAPK-Signalwege in der Regulation von keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen T1 - The role of mitogenic and stress-induced MAPK pathways in the regulation of growth and differentiation of keratinocytes N2 - Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält. N2 - Abnormal proliferation and differentiation processes play an important role in the pathogenesis of various skin diseases. The intracellular signaling mechanisms governing the balance between growth and differentiation of keratinocytes are still largely unknown. In this thesis the role of mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades in keratinocyte growth and differentiation was analysed. Induction of keratinocyte differentiation by elevation of extracellular calcium levels resulted in a rapid and transient activation of the Raf/MEK/Erk (MAPK) pathway but did not increase activity of the stress-activated Jnk or p38 MAPKs. Calcium-induced Erk activation differed in kinetics from mitogenic Erk activation by epidermal growth factor (EGF) and and could be modulated by alterations of intracellular calcium levels. While EGF-induced Erk activation was mediated by the small GTPase Ras, calcium-induced Erk activity occurred independently of active Ras. This suggests that proliferative and differentiation-inducing stimuli use alternative mechanisms to activate the Raf/MEK/Erk pathway. Despite the transient nature of Erk activation, calcium-induced expression of the cell cycle inhibitor protein p21 and the differentiation marker involucrin were sensitive to MEK inhibition which implies a role for the Raf/MEK/Erk pathway in early stages of keratinocyte differentiation. The two calcium binding S100 proteins additionally studied here, MRP8 and MRP14, seem to represent important convergent points between calcium and MAPK signaling. In vitro both proteins are expressed in a differentiation-dependent manner in keratinocytes. Elevation of intracellular calcium levels as well as activation of stress-activated MAPKs resulted in translocation of MRP8/MRP14 complexes to the cytoskeleton. When expression of MRP8 and MRP14 was analysed in serial paraffin- or kryo-sections of healthy or diseased skin, signals in normal skin were largely restricted to differentiating cells of the hair follicle, however, additionally a strong induction of MRP8/14 expression was observed in differentiating epidermal layers of hyperproliferative or tumorigenic skin. In this thesis important novel signaling interactions were identified which provide new basic insights into the molecular mechanisms involved in the regulation of skin homeostasis which is essential for the maintenance of the multiple functions of the epidermis. KW - Keratinozyt KW - Zelldifferenzierung KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Keratinozyten KW - Differenzierung KW - Calcium KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - S100-Protein KW - Raf/MEK/ERK KW - Keratinocyte KW - differentiation KW - calcium KW - MAPK KW - signal transduction KW - S100 protein KW - Raf/MEK/ERK Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2013 ER - TY - THES A1 - Schmid, Erik T1 - Die Rolle des CD9 bei der CDV-Infektion T1 - The significance of CD9 for the CDV-infection N2 - Die Infektion einer Zelle und die Virus-Ausbreitung von Zelle zu Zelle in infiziertem Gewebe oder in der Zellkultur ist abhängig von der Fähigkeit des Virus, die Fusion von Membranen zu induzieren und somit die natürliche Barriere zwischen einzelnen Zellen zu überwinden. Neben den viralen Glykoproteinen sind dabei Proteine in der Membran der Wirtszelle ausschlaggebend für einen erfolgreichen Ablauf dieser Fusionsprozesse. Kürzlich konnten wir mit CD9, einem Mitglied der Tetraspann-Transmembran-Proteinfamilie, ein zelluläres Oberflächenmolekül identifizieren, welches bei einer Infektion von Zellen mit CDV an diesen Fusionvorgängen beteiligt ist: Transfektion eines CD9-Expressionsplasmids in CD9-negative Zellen erhöht deren Infizierbarkeit und CD9-Antikörper inhibieren die Infektion von Zellkulturen mit CDV (OND). In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welcher Mechanismus hinter der Hemmung der CDV-Infektion durch CD9-Antikörper steht. Es besteht keine Korrelation zwischen der Expression von CD9 und der Virusbindung an Zellen besteht. Zudem konnte mit Antikörpern gegen CD9 die Bindung von CDV an Zellen nicht beeinträchtigt werden. Es konnte des weiteren kein unmittelbarer Effekt von CD9-Antikörpern auf die Virusaufnahme, sowie auf die virale mRNA- und Protein-Synthese festgestellt werden. Auch die posttranslationale Modifikation der viralen Proteine, wie die Spaltung des F0-Proteins in F1 und F2, und ihre Expression an der Zelloberfläche verläuft in Gegenwart von mAK K41 normal. Durch Antikörper gegen CD9 wird jedoch die Synzytienbildung in infizierten Zellkulturen stark gehemmt und die Freisetzung neuer Viruspartikel verringert. Untersuchungen der Fusion von uninfizierten mit persistent CDV-infizierten HeLa-Zellen zeigten, dass mAK K41 direkt die CDV-induzierte Zell-Zell-Fusion beeinflusst. Dabei wird aber kein Teilschritt des Fusionsprozesses, wie z.B. die Hemifusion, vollständig blockiert, da die Synzytienbildung selbst durch den Einsatz hoher Konzentrationen an mAK K41 nicht verhindert werden kann. Die Reduktion der Virustiter und der viralen mRNA-Mengen, die man etwa ab 18 Stunden nach Infektion in Gegenwart von mAK K41 beobachtet, entspricht der Reduktion, die man in Gegenwart eines fusionsinhibierenden Peptids (FIP) beobachtet. In beiden Fällen ist diese Reduktion höchstwahrscheinlich ein Sekundäreffekt der Inhibition der Infektionsaus-breitung durch Synzytienbildung.Bei CDV kann zwischen Stämmen, die Synzytien induzieren und Stämmen, die in infizierten Zellkulturen keine oder nur sehr geringe Plaquebildung zeigen, unterschieden werden. Diese Unterschiede basieren auf Sequenzunterschieden in den viralen Glykoproteinen H und F, die bei Morbilliviren für die Art des zytopatischen Effekts verantwortlich sind. Bei den Stämmen, die keine Synzytien induzieren, und dem Wildstamm A75/17 haben Antikörper gegen CD9 keinen inhibierenden Effekt auf die Infektion und es sind in Zellkulturen keine Unterschiede im Infektionsverlauf in An- oder Abwesenheit von mAK K41 zu beobachten. Die Hemmbarkeit einer CDV-Infektion durch CD9-Antikörper ist also abhängig von der Fähigkeit des jeweiligen Stammes Synzytien zu induzieren.Aus den vorliegenden Daten kann geschlossen werden, das CD9-Antikörper spezifisch die CDV-induzierte Zell-Zell-Fusion hemmen, nicht aber die Virus-Zell-Fusion. Im Gegensatz zur Virus-Zell-Fusion scheint die virusstammspezifischen Induktion der Zell-Zell-Fusion, neben dem zellulären Rezeptormolkül noch von weiteren Interaktionen der viralen Hüllproteine mit anderen Zelloberflächenmolekülen abhängig zu sein. Es ist anzunehmen, dass CD9 dabei direkt oder indirekt mit diesen Oberflächenmolekülen interagiert und somit Einfluß auf die Zellfusion hat. Bei der CDV-Infektion bewirken CD9-Antiköper eine Verzögerung der Synzytienbildung, während sie bei der NDV-Infektion zu einer verstärkten Synzytienbildung führen.Neben dem bereits bekannten fusionregulierenden Protein FRP-1/CD98 konnte so mit CD9 ein weiteres Membranprotein identfiziert werden, das an der Regulierung verschiedener viral-induzierter Zellfusionsvorgänge, aber auch an Zellfusionen im Zuge der Zelldifferenzierung und Entwicklung beteiligt ist. Die Regulierung der Fusion scheint aber bei CD9 und FRP-1 auf unterschiedlichen Mechanismen zu beruhen, da Antikörper gegen die beiden Membran-proteine bei NDV-infizierten Zellen die Zell-Zell-Fusion stimulieren, FRP-1-Antikörper aber keinen Einfluß auf die CDV-induzierte Zellfusion haben. Obwohl einige Interaktionspartner von CD9, wie z.B. Integrine, bekannt sind, konnte der Mechanismus der Regulation der Zell-Zell-Fusion durch CD9-Antikörper noch nicht aufgeklärt werden. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten mal Unterschiede in der Virus-Zell- und Zell-Zell-Fusion bei Paramyxoviren auf und ist ein erster Schritt zu einem besseren Ver-ständnis des Unterschiedes zwischen zellulären und viralen Fusionsvorgängen. N2 - Infection of cells and the cell-to-cell spread of a virus in infected tissues as well as in tissue culture depends on the capacity of the virus to induce membrane fusions overcoming the natural barriers between cells. Apart from the viral glycoproteins host cell membrane proteins are essential for successful fusion events. Recently, we found that in CDV infected cell cultures CD9, a member of the tetraspan transmembrane 4 superfamily, takes part in these fusion processes: Expression of CD9 in CD9-negative cell lines enhanced CDV infection, whereas anti-CD9 antibodies inhibited the infection of cells with the Onderstepoort strain of CDV.In this thesis I investigated which step of the CDV-infection is impaired by anti-CD9 antibodies. There is no correlation between the CD9-expression level and the binding of virus to target cells. Moreover antibodies against CD9 do not impair the binding of virus to cells. Neither the virus uptake, nor viral mRNA or protein levels are directly affected by anti-CD9-antibodies. Furthermore, the processing of viral proteins including cleavage of the F protein and the surface expression of viral proteins appears to be normal in presence of mAb K41. However, what is drastically affected by mAb K41 is the syncytium formation in infected cultures and virus release. In a fusion assay of uninfected with persistently infected HeLa cells, we found that mAb K41 directly impaires the CDV-induced cell-cell fusion. Yet none of the single steps of a fusion event, like f.e. hemifusion, is totally blocked, since even large amounts of mAb K41 cannot abolish the formation of syncitia.The reductions of the virus yield and of viral mRNA levels observed late after infection in the presence of mAb K41 are similar to those observed in the presence of a fusion inhibiting peptide (FIP), and therefore most likely are a secondary effect of the inhibition of syncytium formation.In case of CDV one can differentiate between syncytium-inducing strains and strains which don´t induce the formation of syncytia in infected cell cultures. This is propably due to sequenz differences of the H and F glycoproteins, which govern the type of cytopathic effect of Morbilliviruses. In cultures infected with non-syncitium-inducing strains or the wildstrain A75/17 anti-CD9-antibodies show no sign of inhibiting the infection and there is no difference in the progress of CDV-infection in absence or presence of mAb K41. Therefore the possibility to inhibit a CDV-infection by anti-CD9-antibodies depends on whether the used strain induces syncytium-formation or not.From these data we conclude that antibodies against CD9 specifically inhibit the CDV-induced cell-cell fusion, but not the virus-cell fusion. This indicates that the cell-to-cell spread and the infection of cells with extracellular virus are differentially regulated steps dependent on certain combinations and interactions of viral envelope proteins and cell surface molecules. It is probable that CD9 influences cell-cell-fuion by direct or indirect interaction with these surface molecules. CD9-antibodies delay the CDV-induced syncytium-formation and stimulate the NDV-induced syncytium-formation.Beside the allready known fusion regulation proteins FRP-1/CD98 and FRP-2 we found in CD9 another membrane protein that is involved in cell-cell-fusion induced by viruses or induced in the course of cell-differentiation and development. However, the mechanism by which CD9 and FRP-1/CD98 regulate fusion seem to be different, since antibodies against both proteins stimulate the NDV-induced cell-fusion but FRP-1-antibodies show no effect on CDV-induced cell-fusion.Although molecules interacting with CD9, such as integrins, are known, the mechanismus by which antibodies to CD9 regulate cell-cell fusion could not be unraveled yet. The presented thesis demonstrates for the first time differences in virus-cell fusion and cell-cell fusion induced by paramyxoviruses and is a first step for the understanding of differences between viral and cellular fusion processes. KW - Staupevirus KW - Antigen CD9 KW - Virusinfektion KW - Zellfusion KW - CDV KW - CD9 KW - Infektion KW - Morbillivirus KW - Fusion KW - Zell-Zell-Fusion KW - Virus-Zell-Fusion KW - CDV KW - CD9 KW - infection KW - morbillivirus KW - fusion KW - cell-cell-Fusion KW - virus-cell-Fusion Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1994 ER - TY - THES A1 - Schlereth, Bernd T1 - Entwicklung alternativer Vakizinierungsstrategien gegen Masernvirusinfektionen im Tiermodell T1 - Development of alternative measles vaccines in the animalmodel N2 - Trotz der Existenz einer Lebendvakzine gegen Masernvirusinfektionen erkranken jährlich 30-40 Millionen Menschen an Masern und mehr als 1 Million versterben daran. Besonders Kleinkinder besitzen innerhalb des ersten Lebensjahres ein hohes Risiko an Masern zu erkranken und der Anteil an schweren Krankheitsverläufen mit letalem Ausgang ist in dieser Altersgruppe besonders hoch. Aus diesem Grund wäre es sehr wichtig, wenn man Säuglinge bereits in den ersten Lebensmonaten erfolgreich immunisieren könnte. Da eine Immunisierung mit dem derzeitigen MV-Impfstoff in den ersten Lebensmonaten durch maternale MV-spezifische Antikörper inhibiert wird, hat die WHO dazu aufgerufen neuartige Impfstoffe zu entwickeln, die in Gegenwart maternaler Antikörper effektiv sind. Zur Entwicklung und Erprobung von alternativen Impfstoffen in Gegenwart maternaler Antikörper konnte bislang nur das Affenmodell benutzt werden, welches durch das geringe Angebot an Tieren und aus praktischen Gründen nur beschränkt einsetzbar ist. In der hier vorgestellten Dissertation wurde gezeigt, daß Baumwollratten (Sigmodon hispidus) alternativ zum Affen ein hervorragendes Tiermodell sind, um die Immunogenität potentieller Impfstoffvektoren und ihre Effektivität in Gegenwart maternaler Antikörper zu testen. Baumwollratten sind das einzige Nagetiermodell, in dem das Masernvirus wie beim Menschen im Respirationstrakt replizieren und auch in der Peripherie nachgewiesen werden kann. Nach Immunisierung mit MV-Impfstämmen entwickeln Baumwollratten wie der Mensch eine MV-spezifische Immunantwort und sind gegen eine anschließende Infektion mit MV-Wildtypstämmen geschützt. Um zu überprüfen, ob maternale Antikörper wie bei Säuglingen auch bei Baumwollratten die Vakzine-induzierte Serokonversion inhibieren, wurden zwei Modellsysteme für maternale Antikörper entwickelt. MV-immune Weibchen übertragen MV-spezifische maternale Antikörper auf ihre Jungtiere und stellen ein Modell für natürliche maternale Antikörper dar. Im zweiten Modell können nach Injektion eines humanen MV-spezifischen Serums in Baumwollratten maternale Antikörper simuliert werden. Die Vakzine-induzierte Serokonversion wurde sowohl durch natürliche maternale Antikörper, als auch durch passiv transferierte humane MV-spezifische Antikörper inhibiert. Die Verwendung eines heterologen Serums als Modell für maternale Antikörper bietet drei Vorteile: die Gabe von Humanserum ist gut reproduzierbar, humane MV-spezifische Antikörper werden schneller abgebaut, als natürliche maternale Antikörper und passiv transferierte (“maternale”) Antikörper können im ELISA von aktiv induzierten Antikörpern unterschieden werden. Mit Hilfe der DNS-Immunisierung konnte gezeigt werden, daß das MV-Hämagglutinin, das Fusionsprotein und das Nukleokapsidprotein (MV-Hauptantigene) in der Baumwollratte MV-spezifische Antikörper und eine MV-spezifische T-Zellantwort induzieren. Aber nur die beiden Glykoproteine F und H konnten im Gegensatz zum Nukleokapsidprotein MV-neutralisierende Antikörper induzieren und gegen eine Infektion des Respirationstraktes schützen. In Gegenwart maternaler Antikörper führte diese Form der Immunisierung nicht zu einer Vakzine-induzierten Serokonversion und zu Protektion. Um in Gegenwart maternaler Antikörper MV-neutralisierende Antikörper und Schutz gegen eine Infektion mit MV zu induzieren, wurde ein rekombinantes vesikuläres Stomatitis Virus (VSV-H) verwendet, welches das MV-Hämagglutinin (Hauptantigen für MV-neutralisierende Antikörper) in der Hülle von VSV exprimierte. Eine alternative MV-Vakzine muß die beiden MV-Glykoproteine (Hämagglutinin- und Fusionsprotein) enthalten, da sie sonst die atypischen Masern (eine schwere Verlaufsform der akuten Masern) in immunisierten Individuen nach Infektion mit dem Wildtypvirus induzieren kann. Da VSV das Fusionsprotein nicht stabil exprimiert, kann VSV nicht als Impfvektor bei Patienten eingesetzt werden. Im Baumwollrattensystem ließen sich mit diesem Vektorsystem jedoch wichtige Untersuchungen zur Immunisierung in Gegenwart maternaler Antikörper duchführen. Das MV-Hämagglutinin ist als zusätzliches Protein ("passenger protein") in die Hüllmembran von VSV inkorporiert und hat keine funktionelle Bedeutung für die virale Replikation. In vitro konnte gezeigt werden, daß VSV-H im Gegensatz zu MV durch MV-spezifische Antikörper nicht neutralisiert werden kann. Eine Immunisierung mit VSV-H induzierte sehr schnell hohe Titer an MV-neutralisierenden Antikörpern, die höher waren als nach Immunisierung mit MV. In vivo konnte bestätigt werden, das VSV-H durch maternale Antikörper nicht neutralisiert wird und auch in Gegenwart maternaler Antikörper MV-neutralisierende Antikörper und Schutz gegen eine respiratorische MV-Infektion induziert. Hierbei ist die Stimulation des mukosalen Immunsystems sehr wichtig, da VSV-H nur nach intranasaler und nicht nach intraperitonealer Immunisierung maternale Antikörper umgehen kann. Die Replikationsfähigkeit von VSV-H ist ebenfalls essentiell, da Immunisierungsversuche mit UV-inaktiviertem VSV-H bzw. mit VSV-H Deletionsmutanten, die eine stark verminderte Replikationsfähigkeit aufweisen, nicht zu Vakzine-induzierter Serokonversion und zu Schutz in Gegenwart maternaler Antikörper führten. An alternative Vektorsysteme muß deshalb die Forderung gestellt werden, daß sie das Schleimhaut-assoziierte Immunsystem stimulieren, Masernvirusproteine als akzessorische Proteine exprimieren und eine gewisse Restvirulenz aufweisen. Für die Untersuchung derartiger Vakzine-Kandidaten auf die Induktion der Serokonversion in Gegenwart maternaler Antikörper und Schutz gegen MV Infektion ist das Baumwollrattenmodell hervorragend geeignet. N2 - Although measles vaccination with an attenuated live vaccine has proven to be successful, forty million cases of measles continue to occur annually worldwide, of which more than one million are fatal. Especially infants in the first year of life are at high risk for measles virus (MV) infection and MV associated mortality is very high in this age group. For this reason it would be desirable to be able to immunize infants in the first year of life. As immunization of infants with the current MV-vaccine is inhibited by the presence of maternal MV-specific antibodies, the World Health Organization (WHO) has called to develop alternative MV vaccines which are effective in the presence of maternal antibodies. For the development and testing of vaccine candidates rhesus macaques were so far the only animal model. Due to the restricted availability of monkeys and due to practical reasons we have set up a cotton rat animal model for MV-infections in which we could test the immunogenicity of new MV vaccines and evaluate their efficiency in the presence of maternal antibodies. Cotton rats (Sigmodon hispidus) are the only rodents in which MV replicates in the respiratory tract after intranasal infection. After immunization with MV vaccine strains cotton rats develop a MV-specific immune response and are protected against challenge with MV wildtype strains. To investigate whether maternal antibodies inhibit vaccine-induced seroconversion in cotton rats we have developed two models for maternal antibodies in cotton rats. MV immune dams transmit MV specific maternal antibodies to their offspring and represent a model for natural maternal antibodies. In a second model we use a human MV specific serum to simulate maternal antibodies. Vaccine-induced seroconversion is efficiently inhibited in both models. The use of a heterologious serum as model for maternal antibodies offers three advantages: the transfer of human serum is well reproducible, human MV specific antibodies decline more rapidly than natural maternal antibodies and the use of a human serum allows us to differentiate between passively transferred human antibodies (”maternal antibodies”) and actively generated cotton rat antibodies by ELISA. By DNA immunization we could show that plasmids expressing the MV hemagglutinin-, the MV fusion- and the MV nucleocapsid protein induced MV specific antibodies and MV specific T cell response. In contrast to the nucleocapsid protein the two glycoproteins F and H induced MV neutralizing antibodies and gave full protection against MV infection of the respiratory tract. In the presence of maternal antibodies plasmid immunization doesn’t result in vaccine-induced seroconversion and protection against respiratory infection with MV. To induce MV neutralizing antibodies and protection against MV infection we have used a recombinant vesicular stomatitis virus (VSV-H) expressing the MV hemagglutinin (major target antigen for the induction of MV neutralizing antibodies). An alternative MV vaccine has to express both the MV hemagglutinin and the MV fusionprotein. Otherwise atypical measles (a severe form of acute measles) may occur in immunized individuals after infection with wildtyp measles virus. With the VSV expression system it was not possible to stably express the MV fusionprotein. For this reason it is not possible to use VSV as immunization vector in humans. Using VSV-H in the cotton rat animal model for maternal antibodies we were able to investigate the problem of immunization in the presence of maternal antibodies. In the recombinant VSV-H the MV hemagglutinin is incorporated as passenger protein in the bullet-shaped envelope of VSV and the MV hemagglutinin has no functional relevance in viral replication. In vitro we could show that VSV-H is in contrary to MV not neutralized by MV specific antibodies. Immunization with VSV-H induced very fast high titers of MV neutralizing antibodies that were even higher than after immunization with MV. In vivo we could confirm that VSV-H is not neutralized by maternal antibodies and that VSV-H is able to induce MV neutralizing antibodies and protection in the presence of maternal antibodies. To overcome maternal antibodies it is essential to stimulate the mucosal immune system as VSV-H is able to circumvent maternal antibodies after intranasal immunization whereas after intraperitoneal immunization it is not. The use of replication competent virus is also essential as immunization with UV-inactivated VSV-H or immunization with VSV-H deletion mutants with highly reduced replication capability doesn’t result in seroconversion and protection in the presence of maternal antibodies. Our data demonstrate that alternative MV vaccine vectors should stimulate the mucosa-associated immune system, express MV proteins as passenger proteins and retain a certain virulence. To investigate the ability of vaccine vectors to induce seroconversion and protection in the presence of maternal antibodies the cotton rat is a well suited animal model. KW - Masernvirus KW - Säugling KW - Impfung KW - Alternative KW - Baumwollratte KW - Masern KW - Impfung KW - Alternative Strategien KW - measles KW - vaccination KW - alternative strategies Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1982 ER - TY - THES A1 - Scheerer, Jochen T1 - Untersuchungen zum Einfluss exogener und endogener Faktoren auf den Pilocarpingehalt von Pilocarpus microphyllus Stapf ex Wardleworth unter natürlichen Bedingungen N2 - Mit dieser Arbeit sollten, vor anwendungsbezogenem Hintergrund, die Einflüsse endogener und exogener Faktoren auf den Pilocarpingehalt von P. microphyllus Stapf unter natürlichen Bedingungen untersucht werden. Die Bestimmung der Pilocarpingehalte der entsprechenden Proben erfolgte mit Hilfe von HPLC –Analysen der, zuvor durch Festphasenextraktion aufgereinigten, Pflanzenextrakte. Mit dem Ziel, Pflanzenmaterial gleicher genetischer Herkunft untersuchen zu können, wurde versucht, die Pflanzen über Keimlinge und Sprosstecklinge zu vermehren. Während erstere Versuche zu Keimraten von bis zu mehr als 80 Prozent führten, blieben die Bemühungen einer Stecklingsvermehrung trotz unterschiedlicher Ansätze erfolglos. Im Zusammenhang mit Untersuchungen zum Einfluß endogener Faktoren auf den Pilocarpingehalt in den Blättern, wurden vegetative Merkmale (Blüten, Knospen, Früchte und Blattaustriebe) den jeweiligen Gehalten gegenübergestellt. In einem Zeitraum von zehn Monaten konnten bei keiner der Versuchspflanzen ein Zusammenhang zwischen dem jeweiligen vegetativen Zustand und der Menge an Pilocarpin in den Blättern festgestellt werden. Während der vegetative Zustand von P.microphyllus Stapf keine offensichtlichen Auswirkungen auf den Pilocarpingehalt der Blätter hatte, ergaben die Versuchsreihen zum Blattalter einen deutlichen Einfluß dieses endogenen Faktors. In zahlreichen Analysen konnte gezeigt werden, daß junge Blätter durchschnittlich 70 Prozent mehr Pilocarpin enthalten als alte Blätter der jeweils selben Pflanze. Pilocarpin wurde in unterschiedlichen Konzentrationen in allen Teilen von P. microphyllus Stapf nachgewiesen. In Langzeitbeobachtungen über den Zeitraum eines Jahres, konnten in allen Fällen Schwankungen im Pilocarpingehalt der Blätter beobachtet werden. Bis auf eine Ausnahme verliefen diese Änderungen nach einem ähnlichen Muster, welches sich jedoch nicht mit klimatischen Faktoren in einen logischen Zusammenhang bringen ließ. Als ein exogener Faktor mit deutlichem Einfluß auf den Pilocarpingehalt der Blätter, wurden die Strahlungsverhältnisse identifiziert. Bei vergleichenden Analysen von Versuchspflanzen, welche in einem Schattenbeet wuchsen, mit solchen, die der vollen Sonneneinstrahlung ausgesetzt waren, wurde deutlich, daß die Schattenpflanzen durchschnittlich etwa 37 Prozent mehr Pilocarpin enthielten. In einem Düngungsversuch konnte gezeigt werden, daß sich die Nährstoffversorgung entscheidend auf den Pilocarpingehalt auswirken kann. Nach dreimaliger Zugabe eines Düngers, welcher vor allem die Phosphat- und Kaliumversorgung der Pflanzen verbesserte, wurden Mengen an Pilocarpin gefunden, welche um bis zu knapp 300 Prozent über den Werten vor der Düngung lagen. Experimente mit unterschiedlichen Methoden zur Trocknung von geernteten Pilocarpusblättern ergaben, daß die Art der Trocknung einen entscheidenten Einfluß auf den Gehalt an Pilocarpin in den Blättern nach der Ernte hat. Unter günstigen Lagerbedingungen konnten Pilocarpusblätter für mindestens ein Jahr ohne größere Verluste an Pilocarpin aufbewahrt werden. Im Laufe dieser Arbeit ergaben sich aus den Chromatogramspektren der verschiedenen Analysen Hinweise auf verschiedene, möglicherweise chemische, Varietäten innerhalb der Art P.microphyllus Stapf. N2 - In this dissertation the influence of endogenous and exogenous factors that possibly affect on the content of Pilocarpine in P. microphyllus Stapf under natural conditions has been analyzed. An HPLC method was developed to determine the content of Pilocarpine in respective plant extracts, which had been conditioned previously by solid phase extraction. To obtain genetically identical plant material, attempts were made to propagate plants by seedlings and stem-cuttings. The seedling experiments resulted in germination rates of more than 80 per cent, meanwhile various cutting attempts did not lead to any success. In studies regarding the influence of endogenous factors on the content of Pilocarpine in the leaves, vegetative features (flowers, buds, and fruits) were compared with the respective Pilocarpine contents. During a 10 months observation period no correlation could be determined between the vegetative characteristics and the content of Pilocarpine. Unlike vegetative features, the age of the leaves was determined as an endogenous factor with a significant influence on the Pilocarpine content. In numerous analyses it could be shown that young leaves contain in average 70 per cent more Pilocarpine than old ones of the same plant. Pilocarpine was found in all parts of P. microphyllus Stapf. In observations made during a period of time of one year, fluctuations of the Pilocarpine content in the leaves were found in all cases. Besides one exception, those fluctuations showed a similar pattern. However, no correlation with climatic factors could be found. Radiation conditions were identified as an external factor with significant influence on the Pilocarpine content of the leaves. In analysis comparing leaves of plants growing in full sunlight and those growing under shade, the average content of Pilocarpine of the latter was 37 per cent higher. In an experiment with a fertilizer it could be shown that the nutrient supply has a significant importance on the Pilocarpine content. After a three times application of a fertilizer, which mainly improved the phosphate and potassium supply of the plants, up to 300 per cent more Pilocarpine was found compared with contents before the application. Experiments with different drying techniques of harvested leaves revealed that the applied drying method has a decisive influence on the Pilocarpine content of the leaves. Under suitable conditions it has been possible to store dried Pilocarpus leaves for at least one year without important loss in Pilocarpine. Based on the chromatograms obtained during this dissertation, indications for different, possibly chemical, varieties of the species P.microphyllus Stapf were revealed. KW - Parna´iba KW - Pilocarpus microphyllus KW - Pilocarpin KW - Jaborandi KW - Pilocarpus KW - Pilocarpin KW - Glaukom KW - Xerostomia KW - Jaborandi KW - Pilocarpus KW - pilocarpine KW - glaucoma KW - xerostomia Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181463 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Rolf T1 - Aktivierung von Caspasen in AKR-2B Mausfibroblasten T1 - Activation of caspases in AKR-2B mouse fibroblasts N2 - In der vorliegenden Arbeit konnte die essentielle Beteiligung von Caspasen im Zelltodmodell der AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen und ihre Aktivitäten charakterisiert werden. AKR 2B-Mausfibroblasten stellen eine subklonierte und gut charakterisierte Zellinie dar, in der durch Entzug des Serums der Zelltod induziert wird. Während des Zelltods sterben innerhalb von 6h etwa 50 Prozent einer dichtearretierten Kultur. Die überlebenden Zellen bleiben von diesem Mangelzustand für mindestens weitere 48h unbeeinflußt, benötigen aber zum Überleben eine Proteinneusynthese. Der Zelltod zeigt für eine Apoptose typische morphologische Veränderungen der Zelle, obwohl apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder die Aufnahme der zerfallenen Zelle durch benachbarte Zellen, ausbleiben. Mittels unterschiedlicher Methoden konnte die Expression von mRNA aller für den apoptotischen Prozeß bekannten relevanten Caspasen in den AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen werden. Die Caspasen-1, -2, -3, -6 und -9 liegen in ihrer zymogenen Form konstitutiv in den Zellen vor. Mit Ausnahme der Caspase-9 konnte die durch Serumentzug induzierte Spaltung dieser Caspasen in Untereinheiten und somit ihre Aktivierung nicht detektiert werden. Die wesentliche Beteiligung dieser Cystein-Proteasen wurde jedoch durch den protektiven Effekt spezifischer Inhibitoren und den Nachweis ihrer spezifischen Aktivität bestimmt. Die Charakterisierung dieser enzymatischen Aktivitäten lieferte Hinweise zur Identität der aktivierten Caspasen. Neben einer konstitutiven VEIDase- und IETDase-Aktivität wird 3h nach Entzug des Serums eine DEVDase maximal aktiviert. Das Gemisch an Caspase-Aktivitäten wird durch eine DEVDase dominiert. Diese Aktivität wird zum größten Teil durch nur ein Enzym gestellt, wie durch eine Affinitätsmarkierung und 2D-Gelelektrophorese gezeigt wurde. KM- und Ki-Wert-Bestimmungen der DEVDase deuten darauf hin, daß dieses Enzym typische Effektoreigenschaften, wie die der Caspase-3, besitzt. Daneben werden Lamine während des Zelltods in AKR 2B-Mausfibroblasten abgebaut, was auf eine aktivierte Caspase-6 hinweist. Die enzymatischen Charakteristika dieser Protease weichen aber von den in AKR 2B-Mausfibroblasten festgestellten Werten deutlich ab, so daß man ihr nur eine untergeordnete Rolle im Caspasen-Gemisch zuordnen kann. Eine mehrfach chromatographische Reinigung der Aktivität bietet die beste Grundlage für eine anschließende Sequenzierung der Caspase mit dem Ziel ihrer Identifizierung. Durch die Expression des viralen Caspase-Inhibitors CrmA konnte eine tragende Rolle der Caspase-8 und damit des Rezeptor-vermittelten Weges in der Initiierung des apoptotischen Programms in AKR 2B-Mausfibroblasten ausgeschlossen werden. Gleiches gilt für den mitochondrial-vermittelten Weg, für dessen Beteiligung, bis auf die Spaltung der Caspase-9, keine Hinweise vorliegen. Der Weg, der zur Aktivierung der DEVDase führt, ist Ziel gegenwärtiger Untersuchungen. Substanzen, die Signalwege aktivieren PDGF-BB, TPA, Forskolin und 8Br-cAMP) oder auch Substanzen, deren Verbindung zu Signalwegen noch weitgehend offen ist, schützen die Zellen vor dem Zelltod. Der protektive Effekt dieser Signalwege konzentriert sich in einem Konvergenzpunkt, der auf noch unbekannte Weise die Aktivierung der Effektor-Caspasen blockiert. Die Identität dieses Konvergenzpunktes und von ihm ausgehenden protektiven Weges ist Ziel weiterer Untersuchungen. So ist es möglicherweise dieser Weg, der zum Überleben von 50 Prozent der AKR 2B-Mausfibroblasten während des Serumentzugs wesentlich beiträgt. N2 - In the work presented here, the essential involvement of caspases in the cell death of AKR 2B-fibroblasts could be proved as well as their activities could be characterized. Confluent AKR 2B-fibroblasts, a good characterized and subcloned cell line, rapidly disintegrate after serum deprivation. Dying of the cells ceases after 6 hours with a survival of 50 per cent. These surviving cells remain uneffected for additional 48 hours which is dependent on neo-protein biosynthesis. During cell death AKR 2B-fibroblasts show morphological changes characteristically for apoptosis, even though typical features like oligonucleosomal DNA fragmentation is absent. Using different approaches the expression of mRNA of all known caspases, which are believed to be involved in apoptosis essentially, was successfully detected in AKR 2B-fibroblasts. Caspases-1, -2, -3, -6 and -9 were constitutively expressed as zymogens. With the exception of Caspase-9, the processing into their active subunits induced by serum removal could not be detected. At least their considerable importance during cell death of AKR cells could be proved by using specific caspase inhibitors and by determination of their specific activity. The characterization of that activity gave some hints for the identity of activated caspases. Beside constutive VEIDase and IETDase activities, a DEVDase reaches its maximum 3 hours after the onset of apoptosis. The present mixture of caspase activity is dominated by this DEVDase, which seems to be represented by just one enzyme, as shown by affinity labeling and 2D-SDS-PAGE. Determinations of KM- and Ki-values lead to the conclusion, that this enzyms has typical effector caspase characteristics, like caspase-3. Cleavage of lamins during cell death of the fibroblasts indicate that a caspase-6 became active. However, the known characteristics of caspase-6 are different of that found in AKR 2B cells, so that it may play just a minor role in the caspase mixture. Established repeated purification steps by chromatography, offers best conditions for protein sequencing and identification of the active caspase. The involvement of the receptor mediated pathway could be excluded by an overexpression of CrmA , a cowpox virus derived Caspase inhibitor; also there are no hints for an involvement of the mitochondria mediated pathway, except of caspase-9 cleavage. Pathways which lead to DEVDase activation are of major interests in present and future. Stimulation of signal pathways by PDGF-BB, TPA, Forskolin and 8Br-cAMP and others agents protect the fibroblasts from death. The stimulated pathways converge in one point up stream of effector-caspase activation. The identification of this point and its regulatory properties is a future goal, which will maybe lead to an understanding of processes responsible for surviving of 50 per cent of AKR 2B-Mausfibroblasten during serum removal. KW - Maus KW - Fibroblast KW - Apoptosis KW - Proteasen KW - AKR-2B Fibroblasten KW - Apoptose KW - Anisomycin KW - Caspase KW - Serumentzug KW - DEVDase KW - AKR-2B fibroblasts KW - apoptosis KW - anisomycin KW - caspase KW - serum deprivation KW - DEVDase Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1950 ER - TY - THES A1 - Sauer, Christina T1 - Charakterisierung intrazellulärer, bakterieller Endosymbionten im Mitteldarm von Ameisen der Gattung Camponotus T1 - Characterization of intracellular, bacterial endosymbionts in the midgut of different Camponotus species N2 - In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Themenbereiche bearbeitet, die zur Charakterisierung der intrazellulären, bakteriellen Endosymbionten im Mitteldarm von Ameisen der Gattung Camponotus beitrugen. Es wurden phylogenetische Untersuchungen mit Hilfe der 16S rDNA-Sequenzen der Symbionten und der Sequenzen der Cytochrom-Oxidase-Untereinheit I (COI-Sequenzen) ihrer Wirte durchgeführt, die zur näheren Klärung der Fragen zu Übertragungsweg und Stellung der Camponotus-Endosymbionten verhalfen. Untersuchungen an dreizehn verschiedenen Camponotus-Arten brachten folgende Ergebnisse. Die intrazellulären Bakterien der Ameisen gehören zur g-Subklasse der Proteobakterien. Innerhalb des 16S-Stammbaumes der Symbionten kann man drei Untergruppen unterscheiden, in denen die einzelnen Arten enger miteinander verwandt sind. Bei den nächstverwandten Bakteriennachbarn der Camponotus-Endosymbionten handelt es sich um die ebenfalls symbiontisch lebenden Bakterien der Gattungen Wigglesworthia und Buchnera. Die Ameisen-Symbionten besitzen in ihren rrs-Genen intervenierende DNA-Sequenzen (IVS), die stabile Sekundärstrukturen ausbilden können. Ihre 16S-Gene sind nicht strangaufwärts von den 23S-Genen lokalisiert. Durch diese genetische Besonderheit ähneln die Camponotus-Symbionten den Buchnera-Symbionten, deren rRNA-Gene auf zwei Transkriptionseinheiten verteilt sind. Innerhalb des Stammbaumes der untersuchten Wirtsameisen existieren ebenfalls drei Untergruppen, deren einzelne Arten enger miteinander verwandt sind. Die direkte Gegenüberstellung des Symbionten-Stammbaumes mit dem der Ameisen zeigt ein weitgehend gleiches Verzweigungsmuster. Beide Dendrogramme zeigen signifikante Übereinstimmungen bezüglich ihrer taxonomischen Beziehungen und legen eine kongruente Entwicklung von Symbionten und Wirten, die nur durch einen vertikalen Übertragungsweg erzeugt werden kann, nahe. Einzige Ausnahme bildete hierbei der C. castaneus-Symbiont, bei dem ein horizontaler Transfer von Symbionten nicht gänzlich ausgeschlossen werden kann. Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten phylogenetischen Untersuchungen ermöglichten die Benennung einer neuen Symbiontengattung innerhalb der gamma-Subgruppe der Proteobakterien: "Candidatus Blochmannia spp." Histologische Studien der Endosymbiose mit Hilfe von licht- und elektronenmikroskopischen Methoden sollten Fragen zur Symbiontenlokalisation innerhalb adulter Individuen beantworten und die Ergebnisse zum Übertragungsweg der intrazellulären Bakterien festigen. Die Endosymbionten sind in den Mitteldarmepithelien von Arbeiterinnen, Königinnen und Männchen in Myzetozytenzellen lokalisiert, die in das Mitteldarmepithel interkalieren. Diese spezialisierten Zellen besitzen kaum Vesikel und tragen keinen Mikrovillisaum. In den Oozyten der Ovarien von Königinnen und Arbeiterinnen wurden ebenfalls große Symbiontenmengen gefunden. Die Spermatheka der Königinnen und die Geschlechtsorgane der Männchen waren symbiontenfrei. Die Abwesenheit von Symbionten innerhalb dieser beiden Organe zeigt, dass eine Bakterieninfektion der weiblichen Tiere nicht durch die Männchen stattfindet, sondern wie schon in den phylogenetischen Untersuchungen postuliert, ein rein maternaler Übertragungsweg der Symbionten vorliegt. Die Detektion der Bakterien in Eiern und Larven der Ameisen mittels In situ-Hybridisierungen trugen zur Aufklärung des Weges der Endosymbionten während der Embryogenese bei. Während sich im abgelegten Ei ein Ring aus Symbionten bildete, kam es in den Larvenstadien 1 bis 3 zur Auswanderung der Bakterien in Meso- bzw. Ektoderm. Im größten untersuchten Larvenstadium 4, das kurz vor der Verpuppung stand, konnten die Symbionten ausschließlich in den Myzetozyten des Mitteldarmes detektiert werden. Die Behandlung der Ameisen mit Antibiotika ermöglichte es, symbiontenfreie Ameisen zu erzeugen, die über einen längeren Zeitraum weiterlebten, ohne ihre Symbionten zu regenerieren. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es erstmals, die intrazellulären Bakterien intakt aus dem sie umgebenden Mitteldarmgewebe zu isolieren. Somit konnten gereinigte Symbionten für Kultivierungs- und Infektionsversuche verwendet werden. Diese Versuche die mit Hilfe von Bakteriennährmedien und Insektenzelllinien durchgeführt wurden, zeigten jedoch sehr deutlich, dass es nicht möglich ist, die Camponotus-Symbionten außerhalb ihrer Wirte zu kultivieren. N2 - This thesis deals with the characterization of intracellular endosymbiotic bacteria in the midgut of carpenter ants (Camponotus spp.). Sequences of the 16S rDNA of the symbionts and the mitochondrial cytochrome oxidase subunit I (COI) were used for phylogenetic analyses, respectively. These investigations led to new insights concerning the transmission pathway and the phylogenetic classification of the Camponotusendosymbionts. The following results were obtained by extensive analysis of thirteen different Camponotus species. The intracellular bacteria of these species form a distinct lineage in the gamma-subclass of the Proteobacteria. Within the Camponotus symbionts three subclusters are apparent, in which the strains are more related to each other than to the members of the other subclusters. The taxa closest related to the antsymbionts are the symbiotic bacteria of the genus Wigglesworthia and Buchnera. The rrs genes of the Camponotusendosymbionts contain putative intervening sequences (IVS). Their 16S rDNA apparently is not located upstream of the 23S rDNA, and the 16S and 23Sgenes seem to be organized in different transcription units. This genetic characteristic was already described for the symbionts of the genus Buchnera. Similar to the endosymbionts, the phylogenetic relationship of the host ants could be arranged into three clusters with increasingly closer relationship. The direct comparison of the phylogenetic trees of the endosymbiotic bacteria and the ants revealed a nearly similar branching pattern. The exception is C. castaneus, which can not be related to any other species on the basis of the COI analysis. Nevertheless, both trees showed very significant congruence suggesting parallel evolution of symbiotic bacteria and host ant species. These phylogenetic investigations provided the justification for proposing a new taxon in the gamma-subclass of the Proteobacteria: "Candidatus Blochmannia spp". By light- and electronmicroscopical studies I investigated the mode of transmission of the endosymbionts and their location in adult individuals. These studies showed that the bacteria are localized in specialized cells, so-called mycetocytes. These cells are intercalated between the epithelial cells of the midgut. The mycetocytes lack vesicles and microvilli. Camponotusendosymbionts have not been detected in spermathecae of queens or in the testes of males, but they were found intracellularly in oocytes of queens and workers. This strongly indicates a maternal transmission of the bacteria. Using in situ hybridization with species specific probes, the endosymbiotic bacteria could be detected in eggs and larvae. With these experiments it was possible to study the spatial arrangements of the symbionts during embryogenesis. In the egg-stage the symbionts form a ball. In larval stages 1-3 a migration of bacteria into the meso- and ectoderm was observed. In larval stage 4 the symbionts were accumulated in the midgut epithelium, like in adult individuals. Symbionts could only be detected in the mycetocytes of the gut. Ants treated with antibiotics were free of symbionts, and could be maintained to a long time period (more than 12 weeks) without regenerating their bacteria. In these studies we were able to isolate the symbionts out of the midgut epithelial successfully. These isolated microorganisms were used for cultivation and infection experiments. Using different culture mediums and insect cells we showed, that it is impossible to cultivate the Camponotus symbionts outside their host organisms. KW - Rossameise KW - Mitteldarm KW - Endosymbiont KW - Endosymbionten KW - Ameisen KW - Blochmannia KW - Camponotus KW - Symbionten KW - Bakterien KW - Insekten KW - Hymenoptera KW - endosymbionts KW - ants KW - Blochmannia KW - Camponotus KW - symbionts KW - bacteria KW - insects KW - hymenoptera Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1940 ER - TY - THES A1 - Sauer, Christian T1 - Untersuchungen zu den genetischen Ursachen hereditärer Netzhautdegenerationen des Menschen T1 - Analyses of the genetic causes of hereditary retinal degenerations in human N2 - Die Positionsklonierung hat sich als erfolgreiche Strategie zur Identifizierung und Isolierung von Genen erwiesen. Da ihre Anwendung im Allgemeinen keine Informationen über den zugrundeliegenden Pathomechanismus einer Erkrankung voraussetzt, eignen sich die Methoden der Positionsklonierung in besonderem Maße für die Erforschung hereditärer Netzhauterkrankungen. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden sie zur Untersuchung ausgewählter retinaler Degenerationen eingesetzt. Dabei konnten wichtige Beiträge für die Aufklärung der genetische Ursachen dieser Erkrankungen geleistet werden. Die autosomal dominante North Carolina Makuladystrophie (NCMD) oder die zentral areoläre Pigmentepitheldystrophie (CAPED) sind allelische Erkrankungen mit allenfalls gering progredientem Verlauf. Ihr Genlokus liegt in einem etwa 7,2 cM großen Bereich auf 6q14-q16.2 zwischen den DNA-Markern D6S424 und D6S1671. Mit Hilfe von 21 polymorphen DNA-Markern welche den NCMD-Lokus (MCDR1) flankieren, wurden Kopplungsanalysen in drei deutschen NCMD-Familien durchgeführt. Die Analyse der krankheitsassoziierten Haplotypen erbrachte Hinweise auf einen gemeinsamen Vorfahren aller drei Familien. Darüber hinaus konnte der MCDR1-Lokus auf 3,2 cM eingeengt werden und wird von den Markern D6S249 und D6S475 flankiert. Dies bedeutet einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Klonierung des zugrundeliegenden Krankheitsgens. Eine häufige Ursache für den frühzeitigen Verlust der zentralen Sehschärfe bei Jungen ist die X-gebundene juvenile Retinoschisis (RS). Ihr Genlokus wurde in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert, wo er von den DNA-Markern DXS418 und DXS999/DXS7161 flankiert wird. Die Analyse von EST-Sequenzen aus dieser Region ermöglichte die Isolierung eines neuen retinaspezifischen Transkriptes, welches als RS1 bezeichnet wurde. Das RS1-Gen besteht aus sechs Exonen und codiert ein Protein, welches eine in der Evolution hoch konservierte Discoidin-Domäne enthält. Diese Domäne ist in anderen Proteinen u.a. an der Ausbildung von Zell-Zell-Interaktionen beteiligt. Mutationsanalysen in betroffenen Personen aus neun nicht-verwandten RS-Familien ergaben neun verschiedene Sequenzveränderungen die mit dem Krankheitsbild der jeweiligen Familie segregierten. Einen ersten Einblick in die zeitliche und räumliche Expression ergab die Untersuchung des murinen Orthologs Rs1h mit Hilfe von Northern Blot, RT-PCR und RNA in situ-Hybridisierungen. Rs1h wird in der Maus hauptsächlich in den Photorezeptoren exprimiert. Die Expression beginnt erst postnatal und ist mit der Entwicklung der Photorezeptoren korreliert. Das Auftreten zahlreicher weißlich-gelber Flecken, sogenannter Drusen, in radiärer Anordung am hinteren Augenpol ist das charakteristische Merkmal einer Gruppe von Netzhauterkrankungen mit gemeinsamer Ätiologie, die unter dem Begriffen Doynsche Honigwaben Dystrophie (DHRD), Malattia Leventinese (MLVT) oder radiäre Drusen zusammengefasst werden. Der Genlokus dieser Erkrankung wurde auf den kurzen Arm von Chromosom 2 in den Bereich 2p16 kartiert. Die Durchsuchung von EST-Datenbanken führte zur Identifizierung des neuronal exprimerten Gens pNEU60. Dieses besteht aus zwei Exonen, wobei der vollständige codierende Bereich im zweiten Exon liegt. Die Analyse des pNEU60-Proteins ergab eine Struktur aus sieben Transmembrandomänen, dem gemeinsamen Merkmal G-Protein gekoppelter Rezeptoren, wie z.B. Rhodopsin. Patienten mit radiären Drusen zeigten keinerlei Sequenzveränderungen in pNEU60. Die Untersuchung von fast 200 Patienten mit der phänotypisch sehr ähnlichen altersbedingten Makuladegeneration (AMD), führte zur Identifizierung von drei potentiellen Mutationen, darunter eine nonsense-Mutation, sowie zwei polymorphen Veränderungen. Die Assoziation einer einzigen missense-Mutation (R345W) im ubiquitär exprimierten Gen EFEMP1 (EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1) mit der DHRD und MLVT wurde von einer amerikanischen Arbeitsgruppe nachgewiesen. Die R345W Mutation in diesem proximal zu pNEU60 liegenden Gen wurde in den zur Verfügung stehenden zwei MLVT-Familien sowie einer DHRD-Familie nachgewiesen. Bei der Analyse von 14 Patienten mit sporadischen radiären Drusen konnte weder die R345W Mutation, noch irgendeine andere krankheitsassoziierte Mutation nachgewiesen werden. Es wurden jedoch drei polymorphe Sequenzvarianten, sowie zwei polymorphe Di- bzw. Trinukleotidsequenzen identifiziert. Die Klonierung des orthologen EFEMP1-Gens des Rinds diente als Voraussetzung zur Untersuchung der Interaktionsfähigkeit von EFEMP1 mit anderen Proteinen. Mit der Anwendung des Hefe Zwei-Hybrid Systems konnte gezeigt werden, dass die EGF-Domänen von EFEMP1 eine Interaktion mit sich selbst ermöglichen. Die Einführung der R345W Mutation hatte dabei keinen Einfluss auf diese Wechselwirkungen. Die beschriebene Interaktion mit dem zur Familie der Ubiquiline gehörenden Protein DA41 konnte nicht reproduziert werden. Das Gen welches mit der inkompletten Form der X-gebundenen kongenitalen stationären Nachtblindheit (CSNB2) assoziiert ist, codiert die a1-Untereinheit des retinaspezifischen spannungsabhängigen L-Typ Kalziumkanals (CACNA1F). Mit Hilfe von RT-PCR Analysen und RNA in situ-Hybridisierungen wurde die räumliche Expression dieses Gens in der Netzhaut untersucht. Dabei wurde das CACNA1F-Transkript in der äußeren und inneren Körnerschicht, sowie in der Ganglienzellschicht nachgewiesen. N2 - The positional cloning strategy is a powerful tool for the identification and isolation of genes. The application of positional cloning methods to the investigation of hereditary retinal disorders proved to be suitable as they require no informations about the pathology underlying the disease. For the investigations described in this thesis several retinal degenerations were selected for the examination with the positional cloning strategy. The findings of those researches contribute to the further enlightenment of the genetic causes of those disorders. Autosomal dominant North Carolina macular dystrophy (NCMD) or central areolar pigment epithelial dystrophy (CAPED) is an allelic disorder with slow progression. It maps to an approximately 7.2 cM interval between DNA markers at D6S424 and D6S1671 on 6q14-q16.2. A total of 21 polymorphic DNA markers flanking the NCMD locus (MCDR1) were used for genetic linkage analysis in three multigeneration families of German descent expressing the NCMD phenotype. The analysis of the disease associated haplotypes provide evidence for an ancestral founder for all three families. In addition the haplotype analysis refined the MCDR1 locus to a 3.2 cM interval flanked by markers D6S249 and D6S475. This facilitates further approaches in cloning the gene underlying NCMD. X-linked juvenile retinoschisis (RS) is an important cause of early vision lost in males. The RS gene has been localized to Xp22.2 to an approximately 900 kb interval between DXS418 and DXS999/DXS7161. The analysis of expressed sequence tags (ESTs) have identified a novel transcript, designated RS1, within the RS locus that is exclusively expressed in retina. RS1 consists of six exons and encodes for a protein containing the highly conserved discoidin-domain which is implicated in cell-cell interaction. Mutational analyses of RS1 in affected individuals from nine unrelated RS families revealed nine different sequence variations segregating with the disease phenotype in the respective families. The temporal and spatial expression of the murine ortholog Rs1h was studied by northern blot and RT-PCR analyses as well as RNA in situ hybridizations. Predominant expression of Rs1h was found in photoreceptor cells starting postnatal with correlation to photoreceptor development. The appearance of multiple yellowish-white drusen in the posterior pole of the retina is characteristic of a group of retinal disorders with a common etiology, often referred to a Doyne honeycomb retinal dystrophy (DHRD), Malattia Leventinese (MLVT) or radial drusen. The gene underlying this disorder has been mapped to the short arm of chromosome 2 at 2p16. EST database searches led to the identification of the neuronal tissue specific gene pNEU60. The complete coding sequence of this gene is located in the second of two exons. Motif searches in protein databases revealed homology to a seven transmembrane domain which is a hallmark for G-protein coupled receptors like rhodopsin. While mutational analyses in patients with radial drusen identified no sequence variation in pNEU60, three potential pathogenic variants and two frequent polymorphic changes were found in a cohort of almost 200 patients with phenotypically similar age-related macular degeneration (AMD). The association of DHRD and MLVT with a single missense mutation (R345W) in the ubiquitously expressed gene encoding the EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 (EFEMP1) has been recently demonstrated by a research group from the United States. The presence of the R345W mutation has been demonstrated for our two MLVT-families and the one DRHD-family. The mutational analyses in 14 unrelated individuals with sporadic early onset drusen did not detect the R345W mutation or any other disease-associated mutation. Three different polymorphic sequence variations and two intragenic polymorphic repeats were present in similar frequencies in the patients and control individuals. As a prerequisite to the analysis of the interaction capability of EFEMP1, he bovine ortholog of this gene has been cloned. The use of a yeast two hybrid system demonstrated that the EGF-motifs of EFEMP1 could interact with each other. The introduction of the R345W mutation had no effect on that interaction. The described interaction of EFEMP1 with DA41, a family member of the ubiquilin protein family could not be reproduced. The gene associated with the incomplete form of the X-linked congenital stationary nightblindness encodes the a1-subunit of a retina specific L-type calcium-channel (CACNA1F). The spatial expression of this gene within the retina has been investigated by RT-PCR analyses and RNA in situ hybridizations. Transcriptional activity could be detected in the outer an inner nuclear layer as well as in the ganglion cell layer. KW - Netzhautdegeneration KW - Erbkrankheit KW - Molekulargenetik KW - Netzhaut KW - Degeneration KW - Makula KW - Positionsklonierung KW - North Carolina Makuladystrophie KW - Retinoschisis KW - Radiäre Drusen KW - Nachtblindheit KW - retina KW - degeneration KW - makula KW - positional cloning KW - North Carolina Makuladystrophy KW - Retinoschisis KW - radial drusen KW - night blindness Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1936 ER - TY - THES A1 - Ryser, Christoph T1 - Elektrophysiologische Untersuchungen an einzelligen marinen Riesenalgen T1 - Electro-physiological studies on giant-celled marine algae N2 - Die kombinierte Mikroperfusions-/Ladungspulstechnik an einzelligen marinen Riesenalgen ermöglicht die getrennte Darstellung der elektrischen Eigenschaften von Plasmalemma und Tonoplast durch gezielte Manipulation des vakuolären und externen Mediums. Dabei kann der für die Physiologie der Zellen wichtige hydrostatische Innendruck (Turgor) ständig kontrolliert werden. Die Applikation eines Ladungspulses resultierte bei Valonia utricularis und Ventricaria ventricosa in einer biphasischen Relaxation des Gesamt-membranpotentials, die durch die Summe zweier Exponentialfunktionen beschrieben werden konnte. Die Zeitkonstanten dieser beiden Relaxationen lagen dabei im Bereich von 0.1 ms und 1 ms (V. utricularis), bzw. 0.1 ms und 10 ms (V. ventricosa). Addition von Nystatin (einem membranimpermeablen und porenbildenden Antibiotikum) zu der vakuolären Perfusionslösung führte bei beiden Spezies zu einem Verschwinden der langsamen Relaxation des Spektrums, während über das Badmedium (extern) dotiertes Nystatin die Zeitkonstante der schnellen Komponente dramatisch verringerte. Die jeweils andere Relaxation blieb dabei unbeeinflusst. Folglich muss die schnelle Relaxation den RC-Eigenschaften des Plasmalemmas und die langsame den Eigenschaften des Tonoplasten zugeordnet werden. Dies ist ein klarer Beweis für das sog. "Zwei-Membranen Modell". In Übereinstimmung damit beeinflussten externe Ionentauschexperimente sowie externe Zugabe von Kanal/Carrier-Inhibitoren wie TEA (Tetraethylammonium), Ba2+ und DIDS (4,4'-Diisothiocyanatostilben-2,2'-Disulfonsäure), nur die schnelle Relaxation des Ladungspulsspektrums, nicht aber die langsame. Dagegen hatte die Zugabe dieser Inhibitoren zu der vakuolären Perfusionslösung keinen signifikanten Einfluss auf das Relaxationspektrum der marinen Algen. Bei der Berechnung der passiven Membranparameter fiel eine ungewöhnlich hohe flächenspezifische Kapazität des Tonoplasten auf, die nach elektronenmikroskopischen Untersuchungen mit einer etwa 9-fachen Oberflächenvergrößerung erklärt werden konnte. Diese resultierte aus tubulären Ausstülpungen des Tonoplasten, die in das Zytosol hineinreichen. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass - entgegen der Lehrmeinung - der Widerstand des Tonoplasten mariner Algen hoch ist (0.3 bis 1.1 Ohm m²) und somit Werte aufweist, die mit Messungen an Vakuolen höherer Pflanzen vergleichbar sind. Darüber hinaus ergaben Nystatin-Experimente, dass das Zytoplasma von V. ventricosa stark negativ geladen ist (bis zu -70 mV). Neben vielen Gemeinsamkeiten existieren auch klare Unterschiede in der Physiologie dieser Algen. Während bei V. ventricosa die Plasmalemmaleitfähigkeit durch Kalium dominiert wurde, war das Plasmalemma von V. utricularis deutlich permeabler für Chlorid als für Kalium. Variation des externen pH-Wertes wirkte sich nur bei V. utricularis, nicht aber bei V. ventricosa, im Relaxationsspektrum in einer drastischen Erhöhung der schnellen Zeitkonstante aus. Für die Analyse turgorgesteuerter Membrantransportprozesse an marinen Algen bedeuten diese Arbeiten einen methodischen Durchbruch, so dass die vollständige Aufklärung der biophysikalischen Prozesse, die mit der Turgorregulation assoziiert werden, unmittelbar bevorsteht. N2 - The intergrated perfusion/charge-pulse technique allows the separated determination of the electrical properties of the tonoplast and the plasmalemma of giant-celled marine algae with exact manipulation of the vacuolar and external solution. The hydrostatic pressure in the cells (the so-called turgor-pressure), which is one of the most important parameters for the physiology of the cell, can easily be regulated during the experiments. The charge-pulse relaxation spectrum of Valonia utricularis and Ventricaria ventricosa showed a biphasic shape that could be described by the sum of two exponentials decays. The time constants of the two relaxations were calculated to be around 0.1 ms and 1 ms (V. utricularis), and 0.1 ms and 10 ms (V. ventricosa), respectively. Addition of nystatin (a membrane-impermeable and pore-forming antibiotic) to the the vacuolar perfusion-solution of both species resulted in the disappearance of the slow exponential of the spectrum, wheras the presence of nystatin in the bath decreased dramatically the time constant of the fast component. The other relaxation remained unaffected. Consequently, the fast relaxation process must be assigned to the RC-properties of the plasmalemma and the slow one to those of the tonoplast. This is a clear proof for the so-called "two-membrane model". Consistent with this, external variation of the major ions as well as external addition of channel/carrier inhibitors like TEA (tetraethyammonium), Ba2+ and DIDS (4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid) affected only the fast relaxation, but not the slow one. In contrast, addition of these blockers to the vacuolar perfusion solution showed no measurable effect on the charge-pulse relaxation spectrum of the marine algae. Calculating the individual passive electrical parameters of the membranes, an unusually high area-specific capacitance of the tonoplast was detected. According to electronmicroscopic studies this could be explained by a approximately 9-fold enlargement of the tonoplast surface showing tubular "fingers" invading the cytoplasm. Above that it could be demonstrated that the area-specific resistance of the tonoplast of V. utricularis and V. ventricosa is high (0.3 to 1.1 ohm m²) and thus comparable with data observed on vacuoles of higher plants. Furthermore, the nystatin-studies indicated that the cytoplasm is negatively charged (up to -70 mV). Although they have a lot in common, the two species exhibit some clear differences in their physiology. With V. ventricosa, the conductance of the plasmalemma was dominated by K+, whereas the plasmalemma of V. utricularis was more permeable to Cl- than to K+. Variation of the external pH had a significant effect on the charge-pulse relaxation spectrum only of V. utricularis but not of V. ventricosa. The presented studies can be seen as a technical breakthrough in the analysis of turgor-regulated transport processes of marine algae. A complete elucidation of the biophysical properties which contribute to the turgorregulation can now be achieved. KW - Algen KW - Plasmamembran KW - Tonoplast KW - Elektrische Eigenschaft KW - Valonia utricularis KW - Ventricaria ventricosa KW - elektrische Messungen KW - Tonoplast KW - Plasmalemma KW - Membranbarriere KW - Turgordruck KW - vakuoläre Perfusion KW - Valonia utricularis KW - Ventricaria ventricosa KW - electrical measurements KW - tonoplast KW - plasmalemma KW - membrane barrier KW - turgor pressure Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1922 ER - TY - THES A1 - Rotzer, Diana T1 - Biologische Charakterisierung der Rezeptoren für Transforming Growth Faktor-ß T1 - Biological charakterization of the receptors for Transforming Growth Factor-ß N2 - Transforming growth factor-ß (TGF-ß) reguliert eine Vielzahl zellulärer Funktionen, wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Über membrangebundene Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren werden TGF-ß Signale durch Phosphorylierung an Smad-Proteine, die intrazellulären Signaltransduktoren, weitergeleitet, die im Kern die Transkription spezifischer Gene modulieren. Obwohl die drei TGF-ß Isoformen, TGF-ß1, -ß2 und -ß3, äußerst homologe Proteine sind, unterscheiden sich die Phänotypen ihrer Genknockouts stark. Variabilität und Spezifität können auf vielerlei Arten und Ebenen der TGF-ß Signalübertragung erreicht werden. In der vorliegenden Arbeit wird eine alternativ gespleißte Variante des TGF-ß Typ II Rezeptors (TßRII), TßRII-B, charakterisiert. Dieser Rezeptor ist, im Gegensatz zum bisher bekannten TßRII, in der Lage alle drei TGF-ß Isoformen hochaffin zu binden und in Abwesenheit eines unterstützenden Typ III Rezeptors (TßRIII) Signale über den Smad-Pathway weiterzuleiten. TßRII-B ist außerdem fähig ligandenabhängig mit den verschiedenen TGF-ß Rezeptortypen zu Oligomerisieren. Erste Hinweise auf Besonderheiten der TGF-ß2 Bindung an TßRII-B wurden mittels verschiedener zellbiologischer Ansätzen gewonnen. Aus Untersuchungen zur gewebespezifischen Expression des Rezeptors geht hervor, daß TßRII-B, im Vergleich zu TßRII, ein distinktes Expressionsmuster aufweist und v.a. in TGF-ß2-beeinflußten Geweben nachgewiesen werden kann. In diesen Erkenntnissen spiegelt sich die Bedeutung dieses Rezeptors für eine TGF-ß Isoform-spezifische Signalübertragung wider. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von TGF-ß und seinen Rezeptoren bei der Entstehung von Tumoren. B-Zellen einiger Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (B-CLL), der häufigsten Form adulter Leukämie in westlichen Ländern, zeigen Resistenz gegenüber TGF-ß-vermittelter Wachstumsinhibierung und ein verändertes Expressionsmuster der TGF-ß Rezeptoren an ihrer Zelloberfläche. In dieser Arbeit wird die Identifizierung und Charakterisierung zweier Mutationen innerhalb der putativen Signalpeptidsequenz des TGF-ß Typ I Rezeptors (TßRI) in B-Zellen TGF-ß resistenter CLL-Patienten beschrieben. Hierbei handelt es sich um einen Aminosäure-Austausch (L12Q) und eine ‚in-frame‘ Alanin-Deletion (A8) innerhalb einer aus 9 Alaninen bestehenden Sequenz. Es konnte gezeigt werden, daß diese Mutationen zwar keinen Einfluß auf Oberflächenexpression und Komplexbildungseigenschaften des TßRI haben, jedoch TGF-ß stimulierte Reportergeninduktion verringern, was eine kausale Beziehung bei der Entwicklung TGF-ß resistenter B-CLL-Zellen vermuten läßt. Ein Auftreten von Mutationen innerhalb der 9-Alanin-Sequenz des TßRI korreliert mit TGF-ß Insensitivität von B-CLL Zellen. Obwohl noch weitere Studien benötigt werden, um den präzisen molekularen Mechanismus zu verstehen, der zu TGF-ß Resistenz in B-CLL Zellen führt, kann spekuliert werden, daß TßRI Mutationen das Voranschreiten von B-CLL und evtl. anderen Tumorarten unterstützen. Gezieltes Screenen nach TßRI Signalpeptidsequenz Mutationen könnte demnach als prognostischer Indikator für Tumorprogression eingesetzt werden. N2 - Transforming growth factor-ß (TGF-ß) regulates a variety of cellular functions like proliferation, differentiation and apoptosis. It signals through membrane-bound serine/threonine kinase receptors, which upon stimulation phosphorylate Smad proteins, the intracellular signaltransducers, and thereby trigger their nuclear translocation and transcriptional activity. Although the three mammalian TGF-ß isoforms, TGF-ß1, -ß2 and –ß3, are highly homologous proteins, the phenotypes of their genknockouts reveal striking differences. Variability and specificity can be achieved on different levels of the TGF-ß signaltransduction. In this work an alternatively spliced variant of the TGF-ß type II receptor (TßRII), TßRII-B, is characterized, which in contrast to TßRII binds and mediates signaling of all TGF-ß isoforms. This signaling occurs via the Smad pathway and is independent of any supporting type III receptor (TßRIII). Therefore interaction and oligomerization of TßRII-B with the TGF-ß isoforms as well as the different TGF-ß receptor types was analyzed in detail. Furthermore we defined the characteristics of TGF-ß2 binding to TßRII-B. Expression studies demonstrate that TßRII-B expression is restricted to cells originating from tissues where the TGF-ß2 isoform has a predominant role. All that reflects the importance of this receptor splice-variant in TGF-ß isoform-specific signaling. The second part of this work focuses on the role of TGF-ß and its receptors in tumor development. B cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is the most common lymphoid cancer in Western societies, and is also currently incurable. B-cells from some B-CLL patients are resistant to the growth inhibitory effects of TGF-ß and show a different expression pattern of TGF-ß receptors at their cell surface. In this work the identification and characterization of two mutations within the putative signal sequence of the tßrI gene in B-cells from TGF-ß resistant B-CLL patients is described. Thereby a single aminoacid substitution (L12Q) is accompanied by an ‘in frame’ single alanine deletion within an 9-alanine stretch. It could be shown that this mutations do not mediate the apparent loss of functional TßRI in TGF-ß resistant B-CLL, but they attenuate reporter gene induction stimulated by TGF-ß, suggesting a causal relationship in the development of TGF-ß resistant B-CLL. The appearance of mutations within the 9-alanine stretch of the TßRI correlated with and predicted for B-CLL patient insensitivity to TGF-ß. Although more studies are needed to ascertain the precise molecular mechanism leading to TGF-ß resistance in B-CLL cells, it is tempting to speculate that these TßRI mutations may promote the progression of B-CLL and other cancers from their indolent to active states. This suggests that screening for TßRI signal sequence mutations can be employed as a prognostic indicator of B-CLL patient sensitivity to TGF-ß. KW - Transforming growth factor beta KW - Rezeptor KW - TGF-ß Rezeptoren KW - TßRII-B KW - chronische lymphatische Leukämie KW - Tumorgenese KW - TGF-ß receptors KW - TßRII-B KW - chronic lymphocytic Leukemia KW - tumorigenesis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180907 ER - TY - THES A1 - Pietschmann, Thomas T1 - Molekularbiologische Untersuchungen zur Funktion des Hüllproteins des Humanen Foamyvirus T1 - Molecular studies on the envelope protein of the human foamy virus N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass fremde virale Hüllproteine wie das Env Protein des murinen Leukämievirus (MLV) oder das Glykoprotein des Virus der vesiklären Stomatitis (VSV) nicht in der Lage sind, die Funktion des homologen HFV Hüllproteins in Bezug auf die Viruspartikelfreisetzung des Humanen Foamyvirus zu übernehmen. Offenbar werden für die HFV Viruspartikelmorphogenese und -freisetzung spezifische Interaktionen zwischen dem Kapsid und dem homologen Hüllprotein benötigt. Mutationsanalysen ergaben, dass die membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins in diesem Zusammenhang spezifische Aufgaben erfüllt, die nicht durch heterologe Formen der Membranverankerung übernommen werden können. Die Analyse der Fusionsaktivität verschiedener Hüllproteinmutanten zeigte, dass die zytoplasmatische Domäne des Proteins nicht essentiell für die Fusionsaktivität benötigt wird. Umfangreichere Deletionen, die auch Teile der langen membranspannenden Domäne des Proteins einschlossen, führten dagegen zum Verlust der Fusionseigenschaften des Hüllproteins. Innerhalb der membranspannenden Domäne des HFV Hüllproteins befindet sich ein konserviertes Lysin-Prolin Motiv, dessen Mutation sich auf den zellulären Transport und auf die Fusionsaktivität des Proteins auswirkte. Es zeichnet sich ab, dass die lange membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins nicht nur als Membranverankerung dient, sondern zusätzlich für verschiedene Funktionen des Hüllproteins von Bedeutung ist. N2 - In the course of these studies it was shown that heterologous viral envelope proteins like the Env protein of MLV (murine leukemia virus) and the glycoprotein of VSV (vesicular stomatitis virus) are not able to substitute for the HFV Env protein in HF virus (human foamy virus) particle morphogenesis. These data suggest that HFV capsids require specific interactions with their homologous envelope protein in order to be enveloped and released from the cell. A mutational analysis revealed that the long membrane-spanning domain (MSD) of HFV Env plays a key role in this respect, since it cannot be replaced by alternative forms of membrane anchorage. The analysis of fusion activity of various HFV env mutants showed that the cytoplasmic domain (CyD) is not required to mediate membrane fusion. However, fusogenicity was lost when C-terminal parts of the MSD were deleted. Furthermore, it was shown, that mutations of the conserved lysine-proline motif within the MSD result in altered transport and fusion activity of HFV Env. Together, these data imply that the MSD of HFV Env does not only function as a domain that anchors the protein in the lipid bilayer. Instead, it appears that it adopts a specific conformation that is required to mediate different functions of the HFV Env protein. KW - Spumaviren KW - Hüllproteine KW - Molekularbiologie KW - Foamyvirus KW - Retroviren KW - Hüllprotein KW - Morphogenese KW - Fusion KW - foamy virus KW - retro virus KW - envelope protein KW - morphogenesis KW - fusion Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1879 ER - TY - THES A1 - Piechaczek, Katharine T1 - Untersuchungen zum Einfluß der Pathogenitätsinseln I536 und II536 auf die Genexpression des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536 T1 - Studies on the influence of the pathogenicity islands I536 and II536 on the gene expression of the gene expression of the uropathogenic Escherichia coli strain 536 N2 - Escherichia coli wird als der häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Um die Krankheit auslösen zu können, benötigen die Bakterien ganz bestimmte Eigenschaften, die als Virulenzfaktoren bezeichnet werden und durch die sie sich von apathogenen Stämmen unterscheiden. Der uropathogene E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) exprimiert verschiedene Virulenzfaktoren wie a-Hämolysin, die Adhäsine S-, P-related (Prf) und Typ 1-Fimbrien sowie das Kapselantigen K15. Außerdem wurden auch Enterobaktin- und Yersiniabaktin-Produktion sowie Serumresistenz nachgewiesen. Die Ausprägung der Virulenz hängt unter anderem mit dem Vorhandensein von Pathogenitätsinseln (PAI I536-V536) zusammen, die mit seltenen tRNA-Genen assoziiert sind. Die Deletion der Inseln PAI I536 und PAI II536 führt zum Verlust der Virulenz und zur Zerstörung der entsprechenden tRNA Gene. Es wurde festgestellt, daß die leuX-kodierte tRNA5Leu, die mit der PAI II536 assoziiert ist, einen Einfluß auf die Expression von Typ 1-Fimbrien sowie auf die Serumresistenz, Motilität und die Enterobaktin- und a-Hämolysin-Produktion hat. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Bedeutung der leuX-kodierten tRNA5Leu und der Pathogenitätsinseln I536 und II536 für die Expression von Proteinen sowie Typ 1-Fimbrien bei dem E. coli Stamm 536. Dazu wurde zunächst eine Proteomanalyse durchgeführt. Mit der Hilfe von 2D-Gelen wurde der Einfluß von leuX-kodierten tRNA5Leu und PAI I536 und PAI II536 auf die Expression verschiedener Proteine im E. coli Stamm 536 (PAI I536+, PAI II536+, leuX+) und seinen Mutanten: 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) und 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) untersucht. Mit Hilfe von präparativen Gelen konnten in den zytosolischen Fraktionen 39 Unterschiede in der Expression von Proteinen nachgewiesen werden. Von diesen differentiell exprimierten Proteinen wurden 37 mit Hilfe von MALDI-TOF-MS identifiziert. Die zwei weiteren Proteine konnten nicht identifiziert werden. In den Kulturüberstandsfraktionen der untersuchten Stämme konnten drei Unterschiede in der Expression von Proteine nachgewiesen werden. Außerdem wurde der Einfluß der leuX-kodierten tRNA5Leu auf die Expression der Membranproteine der jeweiligen Stämme untersucht. Zu diesem Zwecke wurden sowohl ein- wie auch zweidimensionale Gele durchgeführt. Mit Hilfe von zweidimensionalen Gelen konnten zwischen den untersuchten Stämmen mehrere Unterschiede in der Expression von Proteinen festgestellt werden. Dabei konnten vier Unterschiede in der Proteinexpression detektiert werden. Mit Hilfe der 2 D-Gelelektrophorese wurde ein leuX-abhängiges Protein (YgaG), das ein Analogon des LuxS-Proteins ist, gefunden. Das LuxS-Protein ist ein Bestandteil des "Quorum sensing"-Systems von Vibrio harveyi und wird in ähnlicher Form bei vielen Bakterien beschrieben. Sein Einfluß auf die Pathogenität wurde bei vielen Bakterien beschrieben. Aus diesem Grund wurde eine ygaG-Mutante im E. coli Stamm 536 hergestellt. Anschließend wurde der Einfluß des YgaG-Proteins auf die Expression von Virulenzfaktoren überprüft und ein Proteomvergleich zwischen dem Wildtyp Stamm E. coli 536 und der ygaG-Mutante wurde durchgeführt. Die Expression der bekannten Virulenzfaktoren wurde von YgaG nicht beeinflußt. Weiterhin wurden Transkriptionsfusionen zwischen den Promotoren der fimB- und fimE-Gene mit dem promotorlosen ß-Galaktosidase-Gen (lacZ) konstruiert. Es sollte damit die Frage beantwortet werden, ob die leuX-kodierte tRNA5Leu als potentieller Regulator die Transkription von Typ 1-Fimbrien beeinflußt. Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Transkription von fimB und fimE zwischen dem Wildtyp Stamm 536 und der leuX-Mutante 536D102 festgestellt werden. N2 - Escherichia coli is one of the common causes of urinary tract infections. Pathogenic E. coli differ from non-pathogenic E. coli variants by the presence of certain virulence factors which contribute to their ability to cause disease. The uropathogenic E. coli strain 536 (O6:K15:H31) is able to produce different virulence factors such as a-hemolysin, fimbrial adhesins (P-, type 1 and S-fimbriae) and specific capsules. Furthermore the bacteria produce iron uptake systems like enterobactin and yersiniabactin and have the capacity to survive in human serum. The development of pathogenicity is connected to pathogenicity islands (PAI I536-V536). All four PAIs are associated with tRNA genes. The deletion of PAI I536 and PAI II536 results in the truncation of the associated tRNA gene and loss of virulence. The deletion of PAI II536 results in the truncation of the leuX gene. PAI II536 as well as leuX deletion mutants show a reduced production of type 1 fimbriae, flagellae and of the iron uptake system enterobactin. Furthermore, they show delayed hemolysin production and a reduced serum resistance. Additionally, the leuX-encoded tRNA5Leu may also regulate the expression of various other genes. The aim of this work was the further characterization and analysis of the role of PAI I536/II536 and of the tRNA5Leu for protein expression as well as for the regulation and expression of two site-specific recombinases, FimB and FimE, of the E. coli strain 536. Firstly, the protein expression patterns of E. coli 536 and different derivatives were studied. Differences in the protein expression pattern of the wild-type strain E. coli 536, its mutants 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) and strain 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) were analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. With the help of preparative 2 D-gel electrophoresis 39 differentially expressed intracellular proteins could be identified. The identities of 37 proteins have been determined by MALDI-TOF mass spectrometry in Halle. Two of these proteins show no matches in sequence databases. The preparations of the culture supernatants resulted in 2 D proteinpatterns from which three protein spots whose expression is markedly altered in the different strains are identified. The influence of the tRNA5Leu on the expression of outer membrane proteins was also studied. Differences in the protein expression patterns of the wild-type strain 536 and the mutants were analyzed by one- and two-dimensional gel electrophoresis. The analysis of 2 D protein patterns of outer membrane preparation resulted in the detection of some proteinspots whose expression was altered in the different strain backgrounds. It was identified during the proteom analysis that tha expression of the YgaG protein was shown to be reduced in a leuX-negative background. This protein shows a strong homology to the LuxS protein of Vibrio harveyi. The LuxS protein is a component of the quorum sensing system. It has been shown that many bacteria express proteins similar to LuxS of V. harveyi and that quorum sensing may play a role in pathogenicity. To investigate whether YgaG contributes to the virulence of the E. coli strain 536, a ygaG deletion mutant was made. In addition, differences in the protein expression pattern of the wild-type strain E. coli 536 and the ygaG mutant were analyzed by 2 D gel electrophoresis. Whether YgaG contributes to the virulence of the E. coli Strain 536 has not be investigated. In order to get a deeper insight into the role of the tRNA5Leu as a potential regulator of the expression of the typ 1-fimbriae, a transcriptional fusion between the promotor area of fimB and fimE and the lacZ gene lacking its own promotor was constructed. However the transcription of fimB and fimE did not show any significant differences between the wild-type strain 536 and the leuX-mutant 536D102. KW - Escherichia coli KW - Harnwegskrankheit KW - Virulenzfaktor KW - Proteom KW - Proteom KW - Pathogenitätsinseln KW - leuX-tRNA KW - uropathogener E. coli Stamm 536 KW - Proteomics KW - Pathogenicity islands KW - leuX-tRNA KW - uropathogenic E. coli strain 536 Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1862 ER - TY - THES A1 - Pfeuffer, Thilo T1 - Interaktion des Proteins ActA von Listeria monocytogenes mit dem Wirtszellprotein LaXp180 T1 - Interaction of Listeria monocytogenes ActA with the host cell protein LaXp180 N2 - Listeria monocytogenes, ein fakultativ intrazellulärer Krankheitserreger, besitzt die Fähigkeit, Wirtszellen zu penetrieren, sich in ihnen zu vermehren, sich intrazellulär zu bewegen und auch benachbarte Zellen direkt zu infizieren. Die intrazelluläre Fortbewegung erfolgt durch Polymerisation von zellulärem Aktin, wodurch charakteristische Aktinschweife an einem Pol der Bakterien entstehen. Der einzige bakterielle Faktor, der für die Aktinpolymerisation notwendig ist, ist das Oberflächenprotein ActA. ActA allein ist aber nicht in der Lage, Aktin zu polymerisieren, sondern kann dies nur in Assoziation mit Proteinen der Wirtszelle. Die einzigen bisher bekannten Wirtszellproteine, die direkt mit ActA interagieren, sind das Phosphoprotein VASP und der Arp2/3-Komplex. VASP bindet an den zentralen prolinreichen Bereich von ActA und beschleunigt durch die Rekrutierung von Profilin den Prozeß der Aktinpolymerisation. Der Arp2/3-Komplex interagiert mit dem N-terminalen Bereich von ActA und initiiert die eigentliche Aktin-Polymerisation. Um weitere eukaryotische, mit ActA interagierende Proteine (AIPs) zu isolieren, wurde über einen "Yeast Two-Hybrid"-Test mit ActA als Köder eine embryonale Maus-cDNA-Genbank getestet. Dabei wurden drei verschiedene AIPs identifiziert, von denen eines identisch mit dem humanen Protein LaXp180 (auch "CC1" genannt) ist. LaXp180 ist ein 180 kDa Protein mit über 50 theoretischen Phosphorylierungsstellen in der N-terminalen Hälfte, während die C-terminale Hälfte "coiled-coil"-Strukturen ausbilden kann. Darüberhinaus enthält LaXp180 eine Kern-Lokalisations-Sequenz und ein Leucin-Zipper-Motiv. Die Bindung von LaXp180 an ActA wurde in vitro unter Verwendung von rekombinantem His6-Tag-LaXp180 und rekombinantem ActA bestätigt, da rekombinantes ActA nur an einer Ni-Agarose-Säule gebunden wurde, wenn diese vorher mit His6-Tag-LaXp180 beladen war. Über RT-PCR konnte zum ersten Mal die Expression LaXp180-spezifischer mRNA in verschiedenen Säugerzellen nachgewiesen und mit einem polyklonalen anti-LaXp180-Serum durch Immunopräzipitation erstmals ein 194 kDa großes Protein in Säugerzellextrakten detektiert werden. Die intrazelluläre Lokalisation von LaXp180 wurde über Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Immunfluoreszenzfärbungen von Fibroblasten mit dem anti-LaXp180-Serum zeigten eine starke Färbung der Zellkerne und definierter Bereiche direkt neben den Kernen, während das restliche Zytoplasma schwach gefärbt war. Über Immunfluoreszenzmikroskopie mit dem anti-LaXp180-Serum an mit L. monocytogenes infizierten Zellen konnte gezeigt werden, daß LaXp180 mit der Oberfläche vieler, aber nicht aller intrazellulärer, ActA-exprimierender Listerien kolokalisiert. Dagegen wurde nie eine Kolokalisation mit intrazellulären, aber ActA-defizienten Mutanten beobachtet. Darüberhinaus ist LaXp180 asymmetrisch auf der Bakterienoberfläche verteilt und schließt sich gegenseitig mit der F-Aktin-Polymerisation aus. LaXp180 ist ein putativer Bindungspartner von Stathmin, einem 19 kDa Phosphoprotein, das die Mikrotubuli-Dynamik reguliert. Über Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, daß auch Stathmin mit intrazellulären, ActA-exprimierenden L. monocytogenes kolokalisiert. N2 - Listeria monocytogenes, a facultative intracellular pathogen, is able to penetrate and to multiply in host cells, to move intracellularly and to infect neighbouring cells directly. Intracellular movement is caused by the polymerisation of host cell actin leading to the generation of characteristic actin tails at one pole of the bacterium. The only bacterial factor necessary for actin polymerisation is the surface protein ActA. However, ActA itself is unable to polymerize actin, and can only do so in association with host cell proteins. So far the only known host cell proteins directly interacting with ActA are the phosphoprotein VASP and the Arp2/3 complex. VASP binds to the central proline-rich repeat region of ActA and accelerates actin polymerisation by the recruitment of profilin. The Arp2/3 complex interacts with the N-terminal domain of ActA and initiates the actin polymerisation process. To identify additional eukaryotic ActA-interacting proteins (AIPs), an embryonic mouse cDNA library was screened in a yeast two-hybrid approach using ActA as bait. Three different AIPs were isolated, one of which was identical to the human protein LaXp180 (also called "CC1"). LaXp180 is a 180 kDa protein with more than 50 theoretical phosphorylation sites in the N-terminal part. The C-terminal part is able to form coiled-coil structures. Furthermore, LaXp180 contains a nuclear localisation sequence and a leucine-zipper motif. Binding of LaXp180 to ActA was demonstrated in vitro using recombinant histidine-tagged LaXp180 and recombinant ActA. Recombinant ActA was retained on a Ni-agarose column after prior loading of the column with histidine-tagged LaXp180. Using RT-PCR, the expression of LaXp180 specific mRNA in different mammalian cells was demonstrated for the first time. A protein with a molecular weight of 194 kDa was detected in cell extracts by immunoprecipitation with a polyclonal anti-LaXp180 antiserum. The intracellular localisation of LaXp180 was analysed by immunofluorescence microscopy. Immunofluorescence staining of fibroblasts with the anti-LaXp180 serum showed a strong staining of the nuclei and of defined regions next to the nuclei as well as a weak staining of the rest of the cytoplasm. Fluorescence microscopy with the anti-LaXp180 antiserum of cells infected with L. monocytogenes revealed colocalisation of LaXp180 with the bacterial surface of a subset of intracellular, ActA-expressing listeriae. In contrast, colocalisation with intracellularly growing but ActA-deficient mutants was never observed. Furthermore, LaXp180 binding to intracellular L. monocytogenes was asymmetrical and mutually exclusive with F-actin polymerisation on the bacterial surface. LaXp180 is a putative binding partner of stathmin, a 19 kDa phosphoprotein regulating microtubule dynamics. Using immunofluorescence, colocalisation of stathmin with intracellular, ActA-expressing L. monocytogenes was also demonstrated. KW - Listeria monocytogenes KW - Virulenz KW - Actin KW - Wirtszelle KW - Molekularbiologie KW - Listeria monocytogenes KW - ActA KW - LaXp180 KW - Stathmin KW - Listeria monocytogenes KW - ActA KW - LaXp180 KW - Stathmin Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1859 ER - TY - THES A1 - Otto, Ines Maria T1 - Klonierung und funktionelle Analyse des Aktinreorganisators p150-Spir T1 - Cloning and functional analysis of the p150-Spir actin reorganizator N2 - Die c-Jun-N-terminale Kinase (JNK), ein Mitglied der Familie der MAP-Kinasen (Mi-togen Activated Protein Kinases), wirkt als signalübertragender Effektor, der den klei-nen GTPasen der Rho–Familie Rac und Cdc42 nachgeschaltet ist. Rho-GTPasen spielen eine Schlüsselrolle in der Regulation von zellulären Aktinstrukturen und steuern Prozesse in der Zelle, die Änderungen der Aktinstruktur erfordern, wie z.B. Änderungen der Zellmorphologie, Zellmigration, Wachstum und Differenzierung. Genetische Studien an der Fruchtfliege Drosophila melanogaster konnten eine Rolle des Drosophila-JNK-Homologs DJNK(basket) in der Regulation von Zellbewegungen und Zellmorphologieänderungen während der Drosophila-Embryogenese zeigen. Inhibierung der Funktion von DJNK auf allen Stufen der DJNK-Signaltransduktions-kaskade führt zum sogenannten dorsal closure-Phänotyp der Embryonen mit fehlender Zellstreckung und fehlender Migration dorsaler Epithelzellen. Der molekulare Mechanismus, mit dessen Hilfe Rho-GTPasen Aktinstrukturen regu-lieren und wie JNK Einfluss auf Zellmorphologie und Zellbewegung nimmt, ist bisher nicht bekannt. Die Identifizierung neuer, mit JNK interagierender Proteine könnte zum besseren Verständnis der Funktion und Regulation von JNK führen. In dieser Arbeit wurde ein Yeast-Two-Hybrid-Screen mit dem Drosophila-Homolog DJNK/basket durchgeführt, der zur Entdeckung des Drosophila-Proteins p150-Spir als Interaktionspartner von DJNK führte. Der C-terminus des p150-Spir-Proteins enthält eine JNK-Interaktionsdomäne, ein DEJL-Motiv (Docking Site for Erk and JNK, LxL) und wird von aktivierten JNK-Proteinkinasen phosphoryliert. p150-Spir ist ein Multi-Domänen-Protein, das in seiner aminoterminalen Hälfte eine Aufeinanderfolge von vier WH2-Domänen (Wiskott Aldrich Homology Domain 2) enthält. WH2-Domänen binden monomeres Aktin, Proteine mit WH2 Domänen, wie z.B. WASP oder WAVE sind Aktinreorganisatoren. Die transiente Überexpression von p150-Spir in NIH3T3-Mausfibroblasten führt ebenfalls zu einer Aktinreorganisation. Eine weitere Domäne in p150-Spir ist eine modifizierte FYVE-Zinkfinger-Struktur (mFYVE) im zentralen Bereich des Proteins, die für die subzelluläre Lokalisation von p150-Spir von Bedeutung ist. Mutationen, welche die Zinkfingerstruktur zerstören, führen bei Überexpression in NIH3T3-Zellen zu einer zytoplasmatischen Lokalisation der mutierten p150-Spir-Proteine, während Wildtyp-p150-Spir perinukleär akkumuliert. Spir-Proteine sind evolutionär hoch konserviert. Es konnten Spir-ähnliche Sequenzen auf den humanen Chromosomen 16 und 18, in der Maus und in der Seescheide Ciona savignyi gefunden werden. Der höchste Grad an Konservierung besteht im Bereich der funktionellen Proteindomänen. Ein in allen Spir-Proteinen ent-haltenes, als Spir-Box bezeichnetes hoch konserviertes Sequenzmotiv befindet sich unmittelbar vor dem mFYVE-Zinkfinger. Die Spir-Box zeigt Strukturverwandschaft zur Rab-GTPase-Bindungsregion in Rabphilin 3A, einem Protein, das ebenfalls eine FYVE-Domäne besitzt. Rab-GTPasen sind wie FYVE-Domänenproteine in die Regulation zellulärer Vesikeltransportprozesse involviert. Das Vorhandensein beider Do-mänen in p150-Spir deutet auf eine Rolle des Proteins in zellulären Transportprozes-sen hin. Ein denkbares Modell wäre, daß p150-Spir unter der Kontrolle von JNK-Signalen zelluläre Aktinstrukturen reguliert, die für Transportprozessse in der Zelle von Bedeutung sind; p150-Spir fungiert damit möglicherweise als direktes Bindeglied zwischen MAPK-Signaltransduktionskaskaden und dem Aktinzytoskelett. N2 - Summary c-Jun-N-terminal kinases (JNKs) are members of the MAPK family (mitogen activated protein kinases) and act as downstream effectors of Rho family-GTPases, Rac and Cdc42. Rho family GTPases are involved in the regulation of cellular actin structures and control cellular processes which require remodelling of the actin skeleton, such as morphological changes, migration, growth and differentiation. A role for the Drosophila JNK-homolog DJNK/basket in the regulation of cell move-ment and cell shape changes during Drosophila embryogenesis arises from its func-tion in the process of dorsal closure. Inhibition of the DJNK-cascade results in a mu-tant phenotyp, where the dorsal elongation and migration of the epithelial cells fails. However, a direct link between JNK signaling and actin reorganization has not yet been established. A Yeast-Two-Hybrid-Screen using DJNK as a bait led to the discovery of the new Drosophila protein p150-Spir. p150-Spir is a multi-domain protein with a stretch of acidic amino acids, a cluster of 4 WH2-domains (Wiskott Aldrich Homology Domain 2), a Spir-Box and a modified FYVE zinc-finger motif (mFYVE). In addition, the C-terminus of p150-Spir harbors a docking site for ERK and JNK, LXL (DEJL-motif) and is phosphorylated by JNK in vitro and in vivo. When coexpressed with p150-Spir in NIH3T3 cells, JNK translocates to and colocalizes with p150-Spir at discrete spots around the nucleus. In its N-terminal part p150-Spir possesses 4 WH2-Domains. WH2-domains bind monomeric actin and WH2-family proteins, such as WASP and WAVE are involved in actin reorganization. We can show that in NIH3T3 mouse fibroblasts, p150-Spir co-localizes with F-actin and its overexpression induces clustering of filamentous actin around the nucleus. A modified FYVE zinc-finger structure (mFYVE) is located in the central region of the protein. FYVE-fingers mediate cell membrane localization of proteins. Disruption of the p150-Spir mFYVE-structure by deletion mutagenesis or cysteine/serine substitu-tions shows that the mFYVE-domain determines the subcellular localisation of p150-Spir. In contrast to the perinuclear distribution of the wild type p150-Spir, the mutated protein exhibits a uniform cytoplasmic distribution. Spir-family proteins are highly conserved among different species. Comparison of Drosophila p150-Spir sequences to EST data bases identified similar sequences in human (on chromosomes 16 and 18), mouse and the ascidian Ciona savignyi. A con-served sequence motif found in all Spir proteins - called Spir-Box - is located in the N-terminus, next to the mFYVE domain. Close inspection of the Spir-Box sequence revealed homology to the GTPase binding region of Rabphilin 3A, a FYVE domain containing protein which binds the small GTPase Rab3a. Rab-GTPases are involved in the regulation of cellular vesicle trafficking processes. The presence of a mFYVE domain in p150-Spir protein and a Spir-Box - a possible Rab-GTPase binding motif - suggests a potential function of Spir proteins in vesicel transport. In a possible model Spir initiates remodelling processes of the actin cytoskeleton, necessary for cellular transport processes under the control of JNK signals and thereby provides a direct link between MAPK-signaling and the actin cytoskeleton. KW - Taufliege KW - Actin KW - MAP-Kinase KW - Molekulargenetik KW - p150-Spir KW - JNK KW - Drosophila KW - MAPK KW - Aktin KW - Zytoskelett KW - WH2-Domäne KW - FYVE-Motiv KW - Vesikeltransport KW - Rab-GTPase KW - p150-spir KW - JNK KW - Drosophila KW - MAPK KW - actin KW - cytosceleton KW - WH2-domain KW - FYVE-motif KW - vesicle trafficking KW - Rab-GTPase Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1178402 ER - TY - THES A1 - Niederführ, Alexandra T1 - Expressionskartierung des menschlichen Chromosoms 11p13 T1 - Expression mapping of human chromosome 11p13 N2 - In die Region p13 des menschlichen Chromosoms 11 kartieren mehrere krankheitsrelevante Gene wie das Wilms' Tumor Gen WT1 oder das für die Aniridie verantwortliche Gen PAX6. Beide Gene können bei Patienten mit dem WAGR-Syndrom deletiert sein, was das Auftreten von Wilms' Tumoren oder Aniridie bei diesen Patienten erklärt. Die genetische Ursache für weitere Symptome des WAGR-Syndroms, wie beispielsweise die geistige Retardierung, ist bisher nicht geklärt. Des weiteren wurden Allelverluste auf 11p13 in Verbindung mit verschiedenen Tumoren (Lunge, Blase, Brust, Ovar) beobachtet, ohne daß die ursächlichen Gene hierfür beschrieben werden konnten. Eine Kartierung und anschließende Sequenzierung dieser Region dient als Grundlage für die Identifizierung neuer Gene, die möglicherweise im Zusammenhang mit diesen Krankheiten stehen. Mit dem Ziel der Sequenzierung dieser Region wurde ausgehend von einem YAC-Contig, das 8 Mb des Chromosoms 11p13-14.1 abdeckt, eine Feinkartierung der Region 11p13 durchgeführt. Über ein Screening einer humanen PAC-Bibliothek mit 11p13-spezifischen Proben, wurden PAC-Klone erhalten, die aus dieser Region stammen. Mit einem Teil dieser Klone konnte mittels "chromosome walking" ein 4,5 Mb großes PAC-Contig erstellt werden. Zur Sequenzierung des Chromosomenabschnitts 11p13 am Sanger Centre/UK wurden die PAC-Klone des "minimal tiling path" gewählt. Auf der Grundlage des PAC-Contigs wurden auf experimentellem Weg mit Hilfe des Exontrappings neue Transkripte isoliert. Hierfür wurden sechs PAC-Klone, die etwa 700 kb des Chromosoms 11p13 abdecken, herangezogen. Zusätzlich wurden erste Sequenzabschnitte (insgesamt ca. 640 kb) der PAC-Klone über eine computergestütze Auswertung mit dem Programmpaket NIX/HGMP analysiert. Insgesamt konnten mit Hilfe des Exontrappings und der in silico Analyse fünf neue potentielle Transkripte identifiziert werden. Eine erste Untersuchung dieser Transkripte wurde mit Hilfe von Datenbankvergleichen und Expressionsstudien auf Northern Blots und in situ Hybridisierungen durchgeführt. Aussagen über eine mögliche Funktion konnten bei zwei der identifizierten Transkripte anhand von Datenbankvergleichen getroffen werden. Es handelt sich zum einen um ein Transkript mit Homologien zum Gen cca3 aus der Ratte, für das aufgrund der enthaltenen BTB-Domäne eine regulatorische Funktion auf DNA-Ebene postuliert werden kann. Zum anderen wurde ein Gen mit Ähnlichkeiten zu einem Transkript aus Achlya ambisexualis isoliert. Letzteres besitzt möglicherweise die Funktion eines Steroidrezeptors. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Transkripten, können aus dem erstellten PAC-Contig neue Gene auf der Basis von cDNA-Selektion, Exontrapping oder, nach Fertigstellung der gesamten Sequenz, über in silico Analysen identifiziert werden. N2 - The human chromosomal region 11p13 harbours several disease related genes among them the Wilms' tumour gene WT1 and PAX6 which is responsible for aniridia. Both genes can be deleted in patients with the WAGR syndrome explaining the Wilms' tumour or aniridia of the WAGR-syndrome. Additional symptoms of the WAGR syndrome like mental retardation are not yet understood genetically. Furthermore loss of heterozygosity of 11p13 has been observed in severel cancers (breast, bladder, ovary, lung). None of these regions of allele loss have been narrowed down to a single gene yet. In order to identify genes associated with these diseases mapping and subsequent sequencing of the 11p13 region are of great interest. With the aim of sequencing this region, fine mapping of 11p13 has been performed based on a YAC-contig spanning 8 Mb of chromosome 11p13-14.1. Screening of a human PAC-library with 11p13 derived probes resulted in a set of clones located in 11p13. Using the strategy of chromosome walking a PAC contig covering 4,5 Mb of 11p13 could be established with a subset of these clones. For sequencing 11p13 by the Sanger Centre/UK a minimal tiling path of PAC clones was chosen. The PAC contig has been used to isolate new transcripts located in this region. For this purpose exon trapping was performed with six of the PAC clones spanning 700 kb of 11p13. Additionally, genomic sequences of some of the PAC clones (ca. 640 kb) were analysed in silico by the NIX program package/HGMP. The exon trapping approach together with the in silico analyses resulted in the identification of five new transcripts which were investigated by database searches as well as expression studies via Northern blots and in situ hybridisations. For two of the identified transcripts a possible function could be suggested based on database searches. One shows similarities to a rat gene named cca3 which may be involved in transcriptional regulation due to its BTB domain. The other one is similar to a transcript of Achlya ambisexualis. For the latter a role as a steroid receptor has been postulated. In addition to the transcripts described here, new genes can be isolated by using the established PAC contig for either exon trapping, cDNA selection or in silico analysis of the sequence which will be finished in the near future. KW - Mensch KW - Chromosom 11 KW - Genexpression KW - Genkartierung KW - Chromosom 11p13 KW - PAC-Contig KW - genomische Sequenzierung KW - Expressionskartierung KW - Genidentifizierung KW - DNA-Sequenzanalyse KW - chromosome 11p13 KW - PAC contig KW - genomic sequencing KW - expression mapping KW - gene identification KW - DNA sequence analysis KW - exon trapping Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1803 ER - TY - THES A1 - Neumann, Arne T1 - Aktivierung phagozytierender Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts" und beta-Amyloid-Implikationen für die Pathogenese der Alzheimer'schen Demenz T1 - Activation of phagocytic cells by "Advanced Glycation Endproducts" and beta-Amyloid Implications for Alzheimer's Disease pathogenesis N2 - Typisch für die Alzheimer' schen Erkrankung ist die Bildung unlöslicher Ablagerungen im Gehirn, sogenannter "seniler Plaques". Diese Plaques bestehen im Wesentlichen aus fibrillärem beta-Amyloid, das durch Glykierungen verändert vorliegen kann. Außerdem beinhalten die Plaques, sogenannte AGEs "Advanced Glycation Endproducts", die aus nichtenzymatisch glykierten Proteinen entstehen. Diese AGE-modifizierten Proteine sowie das fibrilläre beta-Amyloid sind in der Lage Mikrogliazellen zu aktivieren. Die sessilen Gehirnmakrophagen wirken in aktiviertem Zustand neurotoxisch, wobei es verschiedene Hypothesen gibt, wie die Mikrogliazellen zu dem neuronalen Zelltod führen. Um dieses zu untersuchen wurden murine Mikrogliazellen herangezogen, die als Merkmal ihrer Aktivierung auf die Translokation des Transkriptionsfaktors NF-kappa-B in den Zellkern überprüft wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Rahmenbedingungen näher untersucht, die zu der AGE vermittelten Mikrogliaaktivierung führen. Es wurde in vitro gezeigt, daß die Mikrogliaaktivierung zunächst durch eine hochmolekulare Hyaluronsäure, wie sie nativ in der extrazellulären Matrix vorliegt, verhindert wird. Im Gegensatz dazu konnte NF-kappa-B in Mikrogliazellen aktiviert werden, die in Gegenwart von Hyaluronsäurefragmenten mit AGE behandelt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, daß die Mikrogliaaktivierbarkeit umgekehrt proportional zu der durchschnittlichen Hyaluronsäuremolekülgröße ist. Andere Glykosaminoglykane aus der extrazellulären Matrix, wie D-Glukuronsäure, N-Azetylglukosamin oder Chondroitin-4-sulfat reduzierten die Aktivierbarkeit der Mikrogliazellen nur geringfügig. Sowohl beta-Amyloid, als auch AGEs setzen während ihres Entstehungsprozesses reaktive Sauerstoffspezies frei, die Hyaluronsäure in kleinere Bruchstücke zerschneiden können. Die Signaltransduktion der AGE-aktivierten Mikrogliazellen wurde mittels unterschiedlicher Inhibitoren gehemmt und die Auswirkung auf die NF-kappa-B Aktivierung untersucht. Hier zeigte sich ein komplexes Netzwerk an aktivierten Signalwegen, so daß kein Rückschluß auf einen bestimmten Rezeptor möglich war. Daher wurde ein "in vitro Modell" entwickelt, um die ausschlaggebende neurotoxischen Komponenten der Mikrogliareaktion aufzufinden. Darin wurden die Signalkaskaden der aktivierten Mikroglia erneut durch pharmakologische Inhibierung unterbrochen, das zellfreie Medium das von diesen Mikrogliazellen sezerniert wurde, wurde als "konditioniertes Medium" für die Kultur muriner Neuronen eingesetzt. Diese wurden bezüglich ihrer Überlebensrate in diesem konditionierten Medium untersucht. Die Hemmung der Transkription oder der Translation in den Mikrogliazellen zeigte keine Reduktion der neurotoxischen Wirkung des konditionierten Mediums. Ebensowenig wirkten Inhibitoren der mitochondrialen Atmungskette, der Radikalquellen Xanthin Oxidase, Lipoxygenase oder Cyclooxygenase. Die Hemmung der NADPH Oxidase reduzierte die Neurotoxizität des konditionierten Mediums auf etwa 30 Prozent. Die NADPH Oxidase ist ein Enzymkomplex, der im Rahmen des "oxidativen bursts" große Mengen Superoxidanionen freisetzt. Um die Bedeutung der NADPH Oxidase Aktivierung für die neurotoxische Wirkung nachzuweisen, wurde eine Untereinheit der NADPH Oxidase, das membranständige gp91phox in den Mikrogliazellen deaktiviert. Dies führte dazu, daß diese Zellen kein Superoxid auf die Stimulation mit beta-Amyloid oder AGE hin abgaben, im Gegensatz zu den Mikrogliazellen mit funktioneller NADPH Oxidase. Das konditionierte Medium der NADPH Oxidase defizienten Zellen war nicht mehr neurotoxisch. Die freien Sauerstoffradikale die aufgrund der NADPH Oxidase Aktivierung entstehen, können zu einer NF-kappa-B Aktivierung führen. NF-kappa-B wurde erfolgreich in den Mikroglia durch exogenes Wasserstoffperoxid stimuliert, wobei aber keine neurotoxische Wirkung im Modellsystem festgestellt wurde. NF-kappa-B scheint damit nicht für die mikrogliavermittelte Neurotoxizität verantwortlich zu sein, im Gegensatz zu der NADPH Oxidase, deren Aktivität unmittelbar mit der Neurotoxizität korreliert ist. N2 - Senile plaques are a hallmark in Alzheimer's Disease progression. These plaques consist mainly of fibrillar beta-amyloid, which can be modified by glycation. In addition these plaques contain so called AGEs "Advanced Glycation Endproducts", emerging from nonenzymatic glycated proteins. Subsequent dehydration, condensation and oxidation produces a heterogenous group of heterocyclic, coloured and fluorescent compounds. These AGE modified proteins are resistant to proteases and their formation is irreversible. AGEs and beta-amyloid are able to activate Microglia cells, resulting in a neurotoxic effect, with several hypothesis of how microglia contribute to neuronal cell death. To investigate the neurotoxic effect murine microglia cells were used. The NF-kappa-B translocation into the nucleus was taken as an indicator of microglial activation. In this work conditions were investigated, that are necessary to activate murine microglia cells by AGE stimulation. High molecular weight hyaluronic acid from extracellular matrix, in its native form, is inhibiting activation of microglia cells in vitro. In contrast NF-kappa-B was activated in AGE stimulated microglia cells in the presence of low molecular weight hyaluronic acid fragments. Here it was shown that the ability to activate microglia cells is inversly proportional to the average size of the hyaluronic acid. The ability for activation of microglia cells was reduced only in parts by other extracellular matrix glycosaminoglycans, like D-glucuronic acid, N-acetylglucosaminoglycane or chondroitine-4-sulfate. Ab and AGEs release reactive oxyen species during their develompent, which were shown to be able to cleave hyaluronic acid into small fragments. The signal transduction of AGE activated microglia cells was examined by measurement of NF-kappa-B activation reduced by different inhibitors. A complex network of signaling pathways was detected, without revealing a certain receptor. Therefore an "in vitro model" was established, to find out the main neurotoxic component in the reaction of microglia cells. Again the signaling pathways were inhibited pharmacologically, using the cell free medium produced by these microglia cells as "conditioned medium" in neuronal cell culture. The murine neuronal cells were tested for their surviving in the conditioned medium, to correlate activated signal pathways with neurotoxicity. Inhibition of translation or transcription in microglia cells led to no reduction of the neurotoxic effect of the conditioned medium, nor did the inhibition of the mitochochondrial respiratory chain or the radical sources xanthine oxidase, lipoxygenase or cyclooxygenase. Inhibition of NADPH oxidse was able to reduce the neurotoxicity of the conditioned medium down to 30 per cent. The NADPH oxidase is an enzyme complex , releasing huge numbers of superoxide anion radicals during the "oxidative burst". The neurotoxic component was released 30 min after activation of microglia cells into the conditioned medium, was bigger than 50 kDa and was removed out of the conditioned medium by EDTA chelation followed by dialysis. To proof the importance of NADPH oxidase activation for neurotoxicity, a part of the NADPH oxidase, the membranebound gp91phox was disrupted by gene targeting. As a consequence these cells did not react with superoxide release, when treated with beta-amyloid or AGE. Conditioned medium of these cells was not neurotoxic, in contrast to that of the microglia cells with a functional NADPH oxidase. The reactive oxygen species resulting from the NADPH oxidase activity are able to activate NF-kappa-B. Because of the wide range of gene activation performed by NF-kappa-B, there are various potential neurotoxic gene products to consider. For that reason NF-kappa-B was stimulated sucessfully in microglia cells with exogenous hydrogen stimulation, without a neurotoxic result in the model system. Activated NF-kappa-B seems not to be responsible for the microglia mediated neurotoxicity, whereas there is a direct correlation of NADPH oxidase activity and neurotoxicity. KW - Alzheimer-Krankheit KW - Amyloid KW - Glykolisierung KW - Mikroglia KW - Zelltod KW - Alzheimer' schen Erkrankung KW - seniler Plaques KW - AGEs KW - Advanced Glycation Endproducts KW - Mikroglia KW - Hyaluronsäure KW - NF-kappa-B KW - Glykosaminoglykane KW - Alzheimer' Disease KW - senile plaque KW - AGEs KW - advanced glycation endproducts KW - hyaluronic acid KW - NF-kappa-B KW - glucosaminoglycane KW - ECM KW - amyloid Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1796 ER - TY - THES A1 - Neufeld, Bernd T1 - Neue Interaktionspartner der MAPKAP-Kinasen 3pK und MK2 T1 - New interaction partners of the MAPKAP-kinases 3pK and MK2 N2 - Auf der Suche nach physiologischen Substraten der MAPK-aktivierten Proteinkinasen (MAPKAP-Kinasen), 3pK und MAPKAP-K2 (MK2), wurden Mitglieder eines Säuger-Polycomb-Komplexes, HPH2 und das Protoonkoprotein Bmi1, als Interaktionspartner identifiziert. Proteine aus der Polycomb-Gruppe (PcG) sind dafür bekannt, multimere, Chromatin-assoziierte Proteinkomplexe zu bilden. Diese wirken als transkriptionelle Repressoren und spielen als solche eine wichtige Rolle sowohl in der Regulation von Entwicklungsprozessen als auch in der Kontrolle der zellulären Proliferation. HPH2 bindet im Hefe two-hybrid-System sowohl an 3pK als auch an MK2. Die Kinasen coimmunpräzipitieren auch mit den PcG-Proteinen. Weiterhin wurde festgestellt, daß nicht aktivierte und DNA-assoziierte 3pK, ähnlich wie Bmi1, in einem in vivo Repressionsassay als transkriptioneller Repressor wirkt. Dies unterstellt, daß 3pK, wie Bmi1, fähig sein muß, andere PcG-Proteine an das Zielgen zu rekrutieren, wo sich dann ein biologisch funktioneller Repressionskomplex rekonstituiert. Bmi1 ist ein Phosphoprotein und beide MAPKAP-Kinasen konnten in dieser Arbeit als in vitro Bmi1-Kinasen identifiziert werden. Da der Phosphorylierungsstatus von Bmi1 mit seiner Dissoziation und der anderer PcG-Proteine vom Chromatin korreliert, könnten die MAPKAP-Kinasen Regulatoren einer phosphorylierungs-abhängigen PcG-Komplex/Chromatin-Interaktion sein. 3pK und MK2 wurden hier als die ersten Kinasen identifiziert, die in Assoziation mit Proteinen von PcG-Komplexen vorliegen, was ein funktionelles Zusammenwirken von MAPK-Signaltransduktionsnetzwerk und der Regulation der PcG-Funktion nahe legt. Ein weiterer durch das two-hybrid-System und Coimmunpräzipitationsexperimente identifizierter Interaktionspartner beider hier analysierter MAPKAP-Kinasen ist der basische Helix-Loop-Helix- (bHLH) Transkriptionsfaktor E47. Dieses E2A-kodierte Protein bindet als Homo- bzw. Heterodimer mit gewebespezifischen bHLH-Proteinen an sogenannte E-Box-DNA-Motive und ist so in die Regulation gewebespezifischer Genexpression und Zelldifferenzierung involviert. In dieser Arbeit konnten 3pK und MK2 als in vitro Kinasen des in Zellen phosphoryliert vorliegenden Transkriptionsfaktors identifiziert werden. Weiterhin führte die transiente Expression jeder dieser Kinasen in einem Reportergenassay mit einem E-Box-Promotorkonstrukt zu einer Repression der transkriptionellen Aktivität von E47. Der bHLH-Transkriptionsfaktor E47 interagiert also mit beiden MAPKAP-Kinasen, 3pK und MK2, was die Kinasen als neu identifizierte Regulatoren der E47-abhängigen Genexpression präsentiert. Mit dieser Arbeit ist ein erster Aufschluß der physiologischen Aktivität der MAPKAP-Kinasen 3pK und MK2 als transkriptionelle Regulatoren gelungen. N2 - SUMMARY In a search for physiological substrates for the MAPK-activated protein kinases (MAPKAP kinases), 3pK and MAPKAPK-2 (MK2), constituents of a mammalian polycomb complex, HPH2 and the proto-oncoprotein Bmi1 were identified as interaction partners. Polycomb group (PcG) proteins are characterised to form large multimeric, chromatin-associated protein complexes with repressive transcriptional function. PcG complexes have an important role in the regulation of developmental processes and in the control of cellular proliferation. HPH2 binds to either kinase in a yeast two-hybrid assay and both, 3pK and MK2 are shown here to coimmunoprecipitate with HPH2 and Bmi1 or Bmi1 from mammalian cell lysates, respectively. Further, non-activated and DNA-bound 3pK could be identified as a transcriptional repressor of a chromatin-embedded gene in an artificial repression assay similar to the function of Bmi1. This suggests, that non-activated and DNA-bound 3pK, like Bmi1, must be able to recruit other PcG proteins to the target gene to reconstitute a functional repressive complex. Bmi1 is a phosphoprotein and both, 3pK and MK2 were identified in this paper to be in vitro Bmi1-kinases. Since the Bmi1 phosphorylation status was shown to be correlated with its dissociation from chromatin, it is likely that the MAPKAP kinases might be regulators of phosphorylation-dependent PcG-complex/chromatin interaction. In summary, the MAPK-activated protein kinases 3pK and MK2 are the first kinases identified to be assembled with members of PcG-protein complexes, suggesting a link of the MAPK signalling network to the regulation of PcG complex function. Another new interaction partner of both MAPKAP kinases which was identified by means of the two-hybrid system and coimmunoprecipitation experiments is the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor E47. This E2A-encoded protein is known to be involved in the regulation of tissue-specific gene expression and cell differentiation. E47 is a phosphoprotein, and 3pK and MK2 were identified as E47-kinases in vitro. Further, expression of either kinase results in a repression of the transcriptional activity of overexpressed E47 in transient reporter gene assays with an E-box containing promoter construct. In summary, the MAPK-activated protein kinases 3pK and MK2 were identified to be assembled with the bHLH transcription factor E47 suggesting that these kinases are regulators of E47 activity and E47 dependent gene expression. These results provide first evidence for the physiological function of the MAPKAP kinases 3pK and MK2 as transcriptional regulators. KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Molekularbiologie KW - intrazelluläre Signaltransduktion KW - MAPK-Signalwege KW - MAPKAP-Kinase KW - 3pK KW - MK2 KW - Polycomb KW - HPH2 KW - Bmi1 KW - Molecular biology KW - intracellular signal transduction KW - MAPK-Signalwege KW - MAPKAP kinase KW - 3pK KW - MK2 KW - Polycomb KW - HPH2 KW - Bmi1 KW - bHLH transcription factor Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1765 ER - TY - THES A1 - Nesper, Jutta M. T1 - Charakterisierung von spontan phagenresistenten Vibrio cholerae O1 El Tor Mutanten T1 - Charakterization of spontaneous phageresistant Vibrio cholerae O1 El Tor mutants N2 - Vibrio cholerae, der Erreger der Cholera, ist ein Gram-negatives, fakultativ pathogenes Bakterium. In dieser Arbeit konnte die V. cholerae Oberflächenstruktur identifiziert werden, an die der temperente V.cholerae-Phage K139 adsorbiert. Phagenbindungs-Studien mit gereinigtem Lipopolysaccharid (LPS) ergaben, daß das O-Antigen der Serogruppe O1 den Phagenrezeptor darstellt. Zusätzlich wurden phagenresistente Mutanten des transluzenten O1 El Tor Inaba Stammes P27459 nach Inkubation mit einem lytischen K139-Derivat isoliert. Analysen des LPS-Laufverhaltens in Polyacrylamid-Gelen (PAA) zeigten, daß viele der Spontanmutanten defekte LPS-Moleküle synthetisierten, die entweder im O-Antigen, im Kernoligosaccharid oder in beidem betroffen waren.Phagenresistente Mutanten mit offensichtlich unverändertem LPS bildeten entweder transluzente oder opake Kolonien. Weiterhin wurden ausgewählte spontan phagenresistente Stämme genetisch analysiert. O-Antigen Mutanten wurden in Southernblot-Analysen mit spezifischen, gegen das bereits gut charakterisierte O-Antigen-Biosynthese-Gencluster (rfb) gerichtete Sonden untersucht. Zwei der O-Antigen negativen Stämme waren durch Insertion des IS-Elementes IS1004 in das rfb-Gencluster entstanden. Spontan phagenresistente Mutanten mit verändertem Kernoligosaccharid ohne O-Antigen (R-LPS-Mutanten) sind wahrscheinlich im Kernoligosaccharid-Biosynthese-Gencluster (waa) mutiert, das in der V. cholerae Datenbank identifiziert wurde. waaF, das für die Heptosyl-II-Transferase kodiert, wurde durch genetische Manipulation inaktiviert und zeigte im PAA-Gel das gleiche Migrationsverhalten wie zwei spontan phagenresistente Mutanten. In den Spontanmutanten konnte jedoch im Gegensatz zu der konstruierten Mutante durch ein WaaF-exprimierendes Plasmid lediglich das Kernoligosaccharid, nicht aber das O-Antigen wiederhergestellt werden. Weitere genetische Analysen ergaben, daß eine der Spontanmutanten 546 bp deletiert hatte, die Teile von waaF und waaL betrafen, letzteres kodiert dabei vermutlich für die O-Antigen-Ligase. Spontanmutanten mit intaktem O-Antigen aber verändertem Kernoligosaccharid konnten als galU-Mutanten charakterisiert werden, die auch im Galaktosekatabolismus beeinträchtigt waren. Zusätzlich wurden zwei weitere gal-Gene, galE und galK, durch genetische Manipulation inaktiviert. Diese Mutanten konnten ebenfalls keine Galaktose mehr verstoffwechseln, synthetisierten aber ein intaktes LPS. In Gegenwart hoher Galaktosekonzentrationen wurde in galU- und galE- Mutanten aufgrund der Defekte im Gal-Stoffwechsel Lyse beobachtet. Zusätzlich wurde die Rolle von galU und galE in der Biofilmbildung untersucht. Da der transluzente Wildtyp (Wt) im Gegensatz zu Opakvarianten keinen Biofilm bilden konnte, wurden galE und galU auch in einer Opakvariante inaktiviert. galU- und galE-Mutationen erzeugten in der Opakvariante wieder eine transluzente Koloniemorphologie und einen biofilm-negativen Phänotyp an abiotischen Oberflächen. Diese Daten deuten an, daß die Synthese von UDP-Galaktose ausgehend von UDP-Glukose für die Synthese des Exopolysaccharides (VPS) notwendig ist. Virulenzstudien in neugeborenen Mäusen ergaben, daß O-Antigen negative Stämme sowie galU-Mutanten sehr viel schlechter und R-LPS-Mutanten nicht mehr im Dünndarm kolonisieren konnten. Da galE und galEK-Mutanten ebenso gut wie der Wt kolonisierten, konnte ausgeschlossen werden, daß toxische Galaktose-Effekte für den Kolonisierungsdefekt der galU-Mutante verantwortlich waren. Zusätzlich wurde die Überlebensfähigkeit der LPS-Mutanten in Gegenwart von verschiedenen Substanzen, die nachweislich im menschlichen Dünndarm vorkommen, unter „in vitro“ Bedingungen untersucht. R-LPS und galU-Mutanten waren im Vergleich mit dem Wt sensitiver gegenüber schwachen organischen Säuren, Defensinen, dem Komplementsystem und Gallensäuren. O-Antigen negative Stämme waren dagegen weiterhin resistent gegenüber Gallensäuren und schwachen organischen Säuren aber sensitiv gegen die Komponenten des angeborenen Immunsystems. Bisher wurde für keine der LPS-Mutanten eine größere Beeinträchtigung weiterer Virulenzfaktoren, wie z.B. Motilität, Synthese der Pili TCP oder Choleratoxin-Produktion festgestellt. Auch die Zusammensetzung der Proteine in der äußeren Membran war offensichtlich nicht beeinträchtigt, allerdings wurde beobachtet, daß aus galU Mutanten in geringem Maße und aus R-LPS Mutanten in verstärktem Maße periplasmatische Proteine in den Überstand diffundieren können. Diese Ergebnisse deuten an, daß nicht nur das O-Antigen, wie bereits bekannt, sondern auch eine spezifische Kernoligosaccharid-Struktur für eine effektive Kolonisierung von V. cholerae essentiell ist. Der Grund dafür ist höchstwahrscheinlich in der Ausbildung einer stabilen äußeren Membran zu suchen, die die Persistenz in Gegenwart bakteriozider Substanzen des Dünndarms ermöglicht. N2 - Vibrio cholerae is a Gram-negative, facultative pathogen and is the causative agent of cholera. In this study the adsorption site of the temperate phage K139 on the bacterial cell surface was determined. Phage-binding studies with purified lipopolysaccharide (LPS) showed that the O-antigen of the serogroup O1 serves as the phage receptor. In addition, phage resistant mutants of the O1 El Tor Inaba strain P27459 were screened by using a virulent isolate of phage K139. Analysis of the LPS by PAGE migration patterns revealed that most of the spontaneous mutants synthesize incomplete LPS molecules, either composed of defective O-antigen or core oligosaccharide. Phage resistent isolates with apparently normal LPS form either translucent or opaque colonies. The genetic nature of spontaneous phage resistant strains was investigated. O-antigen negative strains were investigated by Southern hybridization with probes specific for the well known O1-antigen biosynthesis cluster (rfb). Two of the investigated O-antigen negative mutants revealed insertions of element IS1004 into the rfb-gene cluster. Spontaneous phage resistant R-LPS mutants were found to synthesize an altered core without attached O-antigen. This type of mutants are most likely affected in the core oligosaccharide biosynthesis gene cluster (waa), which was identified by searching the V. cholerae genomic database. waaF, encoding heptosyl-II-transferase, was inactivated and the LPS was found to have the same migration behaviour in PAA gels than two spontaneous mutants. However, in contrast to the constructed waaF mutant complementation with waaF in trans restored only the core oligosaccharide but not the O-antigen synthesis in the spontaneous mutants. Further analysis revealed that one mutant had a deletion of 546 bp affecting waaF and waaL, the latter is thought to encode the putative O-antigen-ligase. Spontaneous mutants with intact O-antigen but altered core oligosaccharide were identified as galU mutants, which were also affected in the galactose catabolism. Other gal genes, galE and galK, were inactivated and these mutants were also found to be defective in the catabolism of exogenous galactose but synthesized an apparently normal LPS. Additionally, galU and galE mutants were found to lyse in the presence of high galactose concentrations. Furthermore the role of galU and galE in biofilm formation was investigated. In contrast to the spontaneous phage resistant opaque colony variant the translucent wt-strain was unable to form a biofilm, therefore the galE and galU mutations were also introduced into the opaque colony variant. galU and galE mutants of the opaque strain were translucent and unable to form a biofilm on abiotic surfaces, suggesting that the synthesis of UDP-galactose, via UDP-glucose, is essential for the biosynthesis of the exopolysaccharide. Virulence studies in infant mice indicated that O-antigen negative mutants, galU and R-LPS mutants but not galE and galEK mutants were defective in colonization of the mouse small intestine, excluding any toxic galactose effects in the gut. By investigating the sensitivity to several substances known to be present in the intestine „in vitro“, it was shown that galU and R-LPS mutants were more sensitive to weak organic acids, cationic antimicrobial peptides, the complement system and bile salts. O-antigen negative strains were found to be sensitive against gut-associated bacteriocidal substances, but they displayed significant resistance to bile salts and organic acids. No gross change in other virulence determinants such as motility, synthesis of pili TCP, choleratoxin production or outer-membrane proteins has yet been found for any of the LPS mutants. However, some periplasmic leakage for galU and significant leakage for R-LPS mutants was observed. These results suggest that not only the O-antigen, as already known, but also a specific core oligosaccharide architecture seems to be required for V. cholerae colonization, most probably in providing resistance against bacteriocidal substances. KW - Vibrio cholerae KW - Resistenz KW - Bakteriophagen KW - Vibrio cholerae KW - LPS KW - Virulenz KW - Biofilmbildung KW - Vibrio cholerae KW - LPS KW - virulence KW - biofilmformation Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1747 ER - TY - THES A1 - Mehling, Beatrix T1 - Klonierung und Charakterisierung eines polymorphen MHC Kl. I-Moleküls der LEW.1F-Ratte, das präferentiell Va8.2-exprimierende CD8-T-Zellen expandiert T1 - Cloning and characterization of a polymorphic MHC class I molecule of the LEW.1F rat, which preferentially expands Va8.2 positive CD8 T-cells N2 - Der MHC der Lewis.1F-Ratte (RT1f) stimuliert die präferentielle Expansion von CD8-T-Zellen, die das V-Segment 8.2 (AV8S2) der TCR-alpha-Kette verwenden. Sowohl als Folge der positiven thymischen Selektion in der Lewis.1F-Ratte (LEW.1F) wie auch bei der RT1f-Alloerkennung. Es war Ziel dieser Arbeit, das MHC Kl. I-Molekül der LEW.1F-Ratte, das diese präferentielle Expansion von AV8S2-Zellen induziert, zu klonieren sowie die Kontaktpunkte der Interaktion zwischen dem MHC-Molekül und AV8S2 zu kartieren. Über RT-PCR wurde ein MHC-I-Gen der LEW.1F-Ratte (RT1.Af) isoliert, sequenziert und zusammen mit einem anderen MHC-I-Gen aus der LEW.1F-Ratte (A2f) analysiert, das von einer Arbeitsgruppe aus Babraham (Cambridge, UK) gefunden worden war. Durch einen Nukleotidsequenz-Vergleich von Af und A2f mit bekannten Ratte-MHC-I-Genen konnte gezeigt werden, daß die Sequenzen beider charakteristisch für Ratte-MHC-I-Gene sind. Beide Moleküle wurden stabil in L-Zellen, rCD80-transfizierte P815-Zellen und T-Zellhybridomen (THO35/1) exprimiert. Die serologische Charakterisierung mit 19 RT1f-reaktiven Alloantikörpern ergab, daß sich die LEW.1F-Serologie alleine durch Af erklären läßt. In einem Zytotoxizitätstest mit LEW.1F-reaktiven zytotoxischen T-Lymphozyten, wurde Af spezifisch erkannt, A2f dagegen nicht. Serologie und Zytotoxizitätstest zeigen, daß die RT1f-spezifische Alloerkennung das Af-Molekül fokussiert, A2f unbedeutend scheint. Möglicherweise, da dieses Molekül in der LEW.1F-Ratte nur schwach exprimiert ist. Die Interaktion von Af und A2f mit AV8S2-Zellen wurde mittels einer MLR (gemischte Lymphozytenreaktion) in der Alloerkennung untersucht: Af, nicht aber A2f, stimuliert die präferentielle Expansion AV8S2-positiver CD8-T-Zellen in der Alloreaktion. Somit ist Af als das Molekül identifiziert, daß die Überselektion von AV8S2-Zellen vermutlich auch in der thymischen Repertoire-Selektion induziert. Zur Kartierung der Af/AV8S2-Interaktion wurden Hybridmoleküle aus Aa und Af gentechnisch hergestellt: Aa und Af unterscheiden sich extrazellulär nur in sieben Aminosäuren, die konzentriert auf zwei Regionen des MHC-Moleküls liegen: "Region I" (AS 62, 63, 65, 69, 70) und "Region II" (167, 169). Aa stimuliert keine präferentielle AV8S2-Zell-Expansion, daher muß die charakteristische Kombination dieser sieben Aminosäuren für die präferentielle Interaktion mit AV8S2-positiven CD8-T-Zellen ausschlaggebend sein. Durch MLRs mit Hybrid-exprimierenden Stimulatorzellen wurde gezeigt, daß beide Regionen zur präferentiellen Expansion AV8S2-exprimierender CD8-T-Zellen beitragen. Durch den Vergleich mit anderen Daten unseres Labors konnte dargelegt werden, daß die beta-Kette zur präferentiellen Interaktion von AV8S2-Zellen mit Af keinen spezifischen Beitrag leistet. Ebenso unbeteiligt ist die Komplementarität-bestimmende Region 2 (CDR2) der alpha-Kette. Die charakteristischen Sequenzen von CDR1alpha und CDR3alpha dagegen sind für die präferentielle Expansion von AV8S2-positiven CD8-T-Zellen durch Af essentiell. N2 - It was shown previously that RT1f (the MHC of the LEW.1F rat) preferentially expands AV8S2 (V-segment 8.2 of the TCR-alpha chain) expressing T-cells in positive thymic selection in the LEW.1F rat (overselection) as well as AV8S2 cells alloreactive to RT1f. As the preferential AV8S2 expansion was only detected in the CD8 T-cells, a MHC class I molecule of the LEW.1F rat was postulated to be responsible for the overselection. In this thesis the MHC I molecule of the LEW.1F rat promoting preferential expansion of AV8S2 CD8 T-cells in allorecognition was identified. To this end a MHC I molecule of the LEW.1F rat, Af, was cloned and sequenced. Together with A2f, another MHC I molecule of the LEW.1F rat, cloned and sequenced by a group from Babraham/UK, Af was expressed in various cell lines and hybridomas. The two molecules were tested for recognition by RT1f-reactive antibodies and cytotoxic T-lymphocytes. By these criteria Af was defined as a MHC class I molecule of the LEW.1F rat whereas A2f was not. The ability to overselect AV8S2 CD8 T-cells was examined by MLR (mixed lymphocyte reaction). Preferential interaction of this TCR segment with Af but not A2f has therefore been demonstrated. Thus Af is the molecule preferentially expanding AV8S2 cells. To identify the Af/AV8S2-contact points hybrids between Aa and Af were generated: Extracellularly, Aa differs from Af in only seven aminoacids, which are clustered in two different regions (region I and II). Yet Aa is not able to promote preferential expansion of AV8S2 CD8 T-cells. Therefore the specific combination of the seven aminoacids differing between the two molecules are crucial in the observed preferential AV8S2 reactivity of Af. In generating hybrids differing in these regions, equal contributions of both regions for recognition by AV8S2 RT1f-reactive CD8 T-cells could be demonstrated. By theoretical implication the Af/AV8S2 interaction points could be narrowed down further: On the side of the MHC, solely the presumably directly TCR-contacted MHC aminoacids 62, 65, 69 and 167 are likely to be involved in AV8S2-cell expansion. On TCR side, the beta-chain is not involved in specific Af interaction. Only complementarity determining regions 1 and 3 of the TCR-alpha chain are essential for preferential interaction with Af by AV8S2 positive CD8 T-cells. KW - Antigen CD8 KW - T-Lymphozyt KW - MHC Klasse I KW - Molekulargenetik KW - T-Zellrezeptor KW - MHC Kl. I KW - positive thymische Selektion KW - Alloreaktion KW - gemischte Lymphozytenreaktion KW - CD8 T-Zell-Subpopulation KW - T-cell receptor KW - MHC class I KW - positive thymic selection KW - alloreaction KW - MLR KW - CD8 T-cell subpopulation Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1727 ER - TY - THES A1 - Matenia, Dorthe T1 - Die Rolle der Serin/Threonin Kinase Cot in Proliferation, Differenzierung und Apoptose N2 - Mitogene Signale werden von der Plasmamembran zum Zellkern über komplexe z.T. miteinander verknüpfte Signaltransduktionskaskaden übertragen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Proto-Onkoprotein Cot als eine neue Komponente von mitogenen Signalkaskaden identifiziert, die die Fähigkeit hat, sowohl die klassische mitogene Kaskade als auch den JNK-Streß-Kinaseweg zu aktivieren. Wildtyp und aktiviertes Cot phosphorylieren und aktivieren MEK-1 und SEK-1 in vitro. Expression von onkogenem Cot in 293-, NIH3T3- und PC12- Zellen führt auch in vivo zu einer Phosphorylierung der endogenen Proteine c-Jun und ERK-1/2. In Bezug auf diese Fähigkeit, zwei unterschiedliche Signalkaskaden zu stimulieren, wurden die biologischen Effekte von Cot auf verschiedene Zelltypen, sowie seine tumorauslösende Wirkung in der Maus untersucht. Expression von onkogenem c-Raf-1 oder v-Mos führt zu einer Differenzierung in PC12-Zellen. Cot induziert ebenfalls Neuritenbildung in diesen Zellen. Ähnlich wie v-raf hat onkogenes cot eine antiapoptotische Wirkung auf 32D-Zellen nach IL-3-Entzug. In neugeborenen NSF/N-Mäusen induzierte retroviral-exprimiertes onkogenes Cot nach einer Latenzzeit von 7-10 Wochen B-Zell-Lymphome vergleichbar mit v-raf/v-myc induzierten Tumoren [191]. Diese Daten stimmen mit der Rolle von Cot in der klassischen mitogenen Kaskade überein und lassen darauf schließen, daß die simultane Aktivierung von JNK in diesem Zusammenhang keinen antagonistischen Effekt hat. Aktives NF-kB reguliert die Transkription einer Reihe von Ziel-Genen, die in verschiedenen zellulären Funktionen involviert sind. Viele Stimuli, Mitglieder der mitogenen Kaskade eingeschlossen, aktivieren NF-kB, so z.B. auch c-Raf-1, das mit Cot überlappende Effekte auf Apoptose-Suppression, Transformation und Differenzierung aufweist und auf der gleichen Ebene zu funktionieren scheint. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß Cot NF-kB aktiviert, dieses aber indirekt durch einen autokrinen Loop geschieht, der den EGFR und die Streß-Kinasekaskade involviert. Mit c-Raf-1 konnten in unserem Labor bereits ähnliche Ergebnisse gezeigt werden [234]. Eine direkte Interaktion zwischen Cot und der NF-kB-Aktivierung konnte durch die Identifikation von p105, einem Vorläuferprotein und Regulator von NF-kB, als Cot-Interaktionspartner in einem Two-Hybrid Screen gefunden werden. Die Tatsache, daß Cot mit IKKa und IkBa, beides NF-kB-Regulatoren, copräzipitiert, deutet ebenfalls auf einen direkten Mechanismus der Cot-abhängigen NF-kB-Aktivierung hin. Dieser Prozeß wird hauptsächlich durch den Transport der Komponenten des NF-kB-Transkriptionsfaktorkomplexes und seiner Regulatoren zwischen Zytosol und Nukleus kontrolliert. Das kleine G-Protein Ran spielt eine kritische Rolle in derartigen Transportprozessen und wurde interessanterweise ebenfalls in einem Two-Hybrid Screen als neuer Interaktionspartner von Cot identifiziert. Durch Coimmunopräzipitationsexperimente konnte dieses Ergebnis bestätigt werden. Diese Daten weisen auf einen neuen Mechanismus der NF-kB-Regulation durch Cot hin und geben neue Ansätze, die komplexen Funktionen von Cot in der Zelle zu diskutieren und weiter zu analysieren. N2 - Mitogenic signals initiated at the plasma membrane are transmitted to the nucleus through complex and partially connected signal transduction cascades. The proto oncoprotein Cot was identified in this thesis as a new component of mitogenic signalling cascades, which activates both, the classic cytoplasmic cascade and the JNK stress pathway. Wildtype and activated Cot phosphorylate and activate MEK-1 and SEK-1 in vitro. Moreover, expression of oncogenic Cot in 293, NIH3T3 and PC12 cells leads to phosphorylation of endogenous c-Jun and ERK 1/2 in vivo. To test the relevance of the ability of Cot to stimulate two different signalling cascades we have examined the effects of Cot on different cell types as well as on tumor induction in mice. Expression of oncogenic c-Raf-1 or v-Mos leads to differentiation of PC12 cells. Cot induces as well neurite outgrowth in these cells. Furthermore, oncogenic Cot shows similar to v-raf an antiapoptotic effect on 32D cells after IL-3 deprivation. Retrovirally expressed oncogenic Cot induces B-cell lymphomas in newborn NSF/N mice after a latency of 7-10 weeks similiar to v-raf/v-myc [191]. This data are consistent with the role of Cot in the classic mitogenic cascade and suggest that the simultaneously activated JNK stress pathway has no antagonistic effects in this context. Active NF-kB regulates transcription of a variety of target genes involved in distinct cellular functions. Many stimuli activate NF-kB including members of the mitogenic cascade, e.g. c-Raf-1, which seems to function on the same level as oncogenic Cot and has partially overlapping effects on apoptosis suppression, transformation and differentiation. The work presented in this thesis demonstrates that Cot activates NF-kB and that this activation occurs indirectly via an autocrine loop which involves the EGF-receptor and also results in the activation of the stresskinase pathway. Similar results have been obtained in our lab in the past with Raf-1 [234]. An additional more direct pathway from Cot to NF-kB activation was demonstrated by our identification of p105, a precursor protein and regulator of NF-kB, as Cot interaction partner in a Two-hybrid screen. Furthermore, Cot coprecipitates with IKKa and IkBa, which are both regulators of NF-kB. The process of NF-kB activation is mainly controlled by the shuttling of components of the active transcription factor complex as well as of its regulators between cytosol and the nucleus. It is assumed that the small GTPase Ran plays a crucial role in these transports. Interestingly, we observed in a Two-hybrid screen that Ran is interacting with Cot which also was confirmed by coimmunoprecipitation experiments. These results point to a new mechanism of NF-kB regulation by activated Cot and gives new starting points to analyse the complex functions of Cot in the cell. KW - Protein-Serin-Threonin-Kinasen KW - Apoptosis KW - Proliferation KW - Zelldifferenzierung KW - Molekularbiologie KW - Proto-Onkoprotein Cot KW - Apoptose KW - JNK-Streß-Kinase KW - proto oncoprotein Cot KW - apoptosis KW - JNK stress pathway Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1712 ER - TY - THES A1 - Loske, Claudia T1 - Metabolische Veränderungen und Zelltod in neuralen Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts" T1 - Metabolic changes and cell death in neural cells by "advanced glycation endproducts" N2 - Advanced Glycation Endproducts (AGEs) entstehen aus nicht-enzymatisch glykierten Proteinen. In einer Folge von Dehydratations-, Kondensations- und Oxidationsschritten entsteht ein heterogenes Gemisch aus farbigen, fluoreszierenden Verbindungen. AGE-modifizierte Proteine sind unlöslich und proteaseresistent, bei ihrer Bildung entstehen freie Radikale und andere reaktive Intermediate. Von der AGE-Bildung betroffen sind vor allem langlebige Proteine mit geringem Umsatz wie Kollagen und Kristallin aber auch pathologische Proteinablagerungen, z.B. in der Alzheimer´schen Demenz (AD). Die Akkumulation von AGEs spielt in der Pathogenese von Komplikationen des Diabetes und der Hämodialyse eine Rolle, für die AD wird eine Beteiligung von AGEs am Krankheitsverlauf diskutiert. Die Alzheimer´sche Demenz ist gekennzeichnet durch den histologischen Nachweis seniler Plaques und neurofibrillärer Bündel in Hirngewebe der Patienten. Auf Ebene des Stoffwechsels kommt es zu einer Verringerung des zerebralen Glukoseumsatzes, es finden sich Marker sowohl für eine Akutphasenreaktion als auch für oxidativen Stress. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die AGE-Bildung in vitro die Aggregation von ßA4, dem Hauptbestandteil der senilen Plaques in der AD, beschleunigt. Der geschwindigkeits-bestimmende Schritt ist dabei die Glykierung des ßA4-Monomers. Durch Zugabe von Übergangsmetall-ionen kann die Vernetzung weiter beschleunigt werden. Dies deutet darauf hin, dass AGEs zur Plaquebildung in der AD beitragen, redox-aktive Eisenionen sind in der AD mit den Plaques assoziiert. Mit Hilfe von Metallchelatoren, Antioxidantien oder mit Substanzen, welche die zur Vernetzung notwendigen Aminogruppen abblocken, lässt sich die Aggregation von ßA4 verlangsamen oder verhindern. AGEs wirken zytotoxisch auf BHK 21 Fibroblasten und humane SH-SY5Y Neuroblastoma Zellen. Die Toxizität unterschiedlicher Modell-AGEs ist abhängig von verschiedenen Faktoren, u.a. von dem zur Herstellung verwendeten Protein und vom Zucker. Die LD50 der Modell-AGEs korreliert mit dem AGE-Gehalt und der Radikalproduktion der Präparationen in vitro. Die AGE-Toxizität ist hauptsächlich radikalvermittelt. Oxidativer Stress lässt sich in AGE-behandelten Zellen durch die Bildung intrazellulärer Lipidperoxidationsprodukte nachweisen. Auf Ebene der Signaltransduktion konnte die Aktivierung des Transkriptions-faktors NfkB als Zeichen der Stressabwehr nachgewiesen werden. Die Gabe von Antioxidantien vor oder gleichzeitig mit den AGEs verringerte den Zelltod. Auch durch das Blockieren des Rezeptors für AGEs (RAGE) mit spezifischen Antikörpern konnte die Zahl überlebender Zellen gesteigert werden. Durch AGEs ausgelöster Stress führt in Neuroblastoma Zellen bereits in Konzentrationen unterhalb der LD50 zu Störungen im Redoxstatus, es kommt zur Depletion von GSH und zu Verschiebungen im Verhältnis GSH/GSSG. Damit einher gehen Veränderungen im Energiestoffwechsel der Zelle, nach anfänglich erhöhter Glukoseaufnahme kommt es im weiteren Verlauf der Inkubation zu einer Verringerung der Aufnahme von Glukose aus dem Medium, gefolgt von einer Zunahme der Laktatausschüttung. Ausserdem wurde eine Depletion von ATP um bis zu 50 Prozent nachgewiesen. Antioxidantien können die Störungen im Metabolismus der Zellen verhindern oder abschwächen, die meisten der getesteten Substanzen konnten Redoxstatus und ATP-Gehalt der Zellen zu normalisieren. Obwohl sich in AGE-gestressten Zellkulturen durch Annexin-Fluorescein-Markierung ein geringfügig erhöhter Prozentsatz apoptotischer Zellen nachweisen ließ und AGEs auch die Freisetzung von Cytochrom c ins Zytoplasma induzieren, verläuft der durch AGEs ausgelöste Zelltod verläuft offenbar insgesamt nekrotisch. Sowohl durch Radikalproduktion als auch über rezeptorvermittelte Signalwege verursachen AGEs oxidativen Stress und induzieren Veränderungen im Metabolismus der Zelle. Dies führt u. a. dazu, dass für die antioxidativen Schutzmechanismen der Zelle nicht mehr genügend Energie zur Verfügung steht. AGE-Stress trägt damit in einer selbstverstärkenden Reaktionskaskade zur Neurodegeneration bei und kann so an der Pathogenese der AD beteiligt sein. Antioxidantien und auch AGE-Inhibitoren könnten einen interessanten Ansatz zur Entwicklung alternativer Therapien in der AD darstellen. N2 - One of the most important post-translational modification of proteins is the non-enzymatic attachment of reducing sugars. Subsequent oxidations, dehydrations and rearrangements produce a heterogenous group of heterocyclic, coloured and fluorescent compounds termed "advanced glycation endproducts" (AGEs). In the course of their formation, free radicals and other reactive intermediates are created. AGE-modified proteins are resistant to proteases, their formation is irreversible. They accumulate on long-lived proteins with slow turn-over, e.g. on collagen or eye lens cristallin and on pathological protein deposits, e.g. in Alzheimer´s diease (AD). Accumulation of AGEs also occurs in the diabetic kidney and is discussed to be of importance in the etiology of AD. The pathology of Alzheimer´s disease involves accumulation of intra and extracellular protein aggregates like senile plaques and tangles. Further hallmarks are a reduction of glucose metabolism in the affected brain areas, together with signs for an acute phase response and for oxidative stress. In vitro experiments showed that AGEs accelerate the crosslinking of ßA4, the major component of senile plaques in AD. Since glycation of the peptide monomer is the first step of this reaction, this points to a participation of glycation in plaque-formation in AD. The formation of covalently crosslinked hight-weight ßA4 oligomers is further accelerated by micromolar amounts of copper and iron ions. Formation of these AGE-crosslinks can be inhibited by agents which are able of capping amino-groups, by metall chelators and by antioxidants, suggesting that these drugs may have the potential to slow down the formation of insoluble protein deposits in vivo AGEs have a direct toxic effect on BHK 21 fibroblasts and human SH-SY5Y neuroblastoma cells. AGE-modification renders proteins cytotoxic, the toxicity of a protein increases with the total AGE-content and depends from the modified protein. The LD50 of a model-AGE can be correlated with the in vitro radical production by the modified protein. On the level of signal transduction, AGEs induce the activation of the nuclear transcription factor kB as a stress response in neuroblastoma cells. AGEs enhance the formation of intracellular lipid-peroxidation products as markers for oxidative stress. AGE-toxicity is mediated by ROS and oxidative stress since various antioxidants were able to attenuate AGE-induced cell death. The receptor for AGEs (RAGE) appeared to be involved in AGE-toxicity as well, because blocking of RAGE with neutralizing antibodies increased the percentage of vital cells after AGE-treatment. The AGE-induced cell death shows signs of an initial apoptotic, final necrotic pathway. Though the percentage of annexin positive, apoptotic cells is slighly increased in cell cultures treated with sublethal amounts of AGEs and cytochrome c is released in the cytoplasma no activation of caspase-3 was found. AGE-induced stress leads to an imbalance in the cellular redox-status, recognizable by a shift in the GSH/GSSG ratio and a depletion of intracellular glutathione. This is accompanied by changes in the cells glucose metabolism and impairment of energy production. During the first hours of AGE-stress glucose uptake of the cells was increased. After this time point almost no further uptake of glucose from the medium was detectable but hight amounts of lactate were released. The ATP content of the cells was reduced up to 50 per cent. Administration of antioxidants together with or before administration of AGEs normalized ATP-levels as well as glucose uptake and lactate release. Interaction of AGEs with cells has been shown to cause oxidative stress, not only by receptor mediated pathways but also by production of free radicals by chemical oxidation and degradation of AGEs. This causes metabolic dysfunctions, energy depletion and impairment of the cells antioxidative defense. In the AD brain, this may lead to neurodegeneration and cell death, suggesting a role of AGEs in the pathogenesis of this disease. The results encourage the use of membrane permeable antioxidants in novel treatment strategies of AD. AGE-inhibitors may represent an interesting approach to slow down plaque formation. KW - Alzheimer-Krankheit KW - Nervenzelle KW - Zelltod KW - Proteinstoffwechsel KW - Advanced Glycation Endproducts KW - Alzheimer KW - oxidativer Stress KW - beta A4 KW - ATP KW - Antioxidantien KW - Zytotoxizität KW - RAGE KW - Apoptose KW - SH-SY5Y KW - Advanced glycation endproducts KW - Alzheimer KW - oxidative stress KW - beta A4 KW - ATP KW - antioxidants KW - cytotoxicity KW - RAGE KW - SH-SY5Y KW - apoptosis Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1707 ER - TY - THES A1 - Leimeister, Cornelia T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Genen für die Entwicklung der Nieren und des Urogenitalsystems T1 - Identification and characterization of genes involved in development of the kidney and the urogenital system N2 - Das Studium der Nierenentwicklung gibt Einblicke in generelle entwicklungsbiologische Prozesse wie induktive Wechselwirkungen, mesenchymale Kondensation, mesenchymale-epitheliale Umformung, Determinierung von Zellschicksal sowie Differenzierung und damit auch in die Entstehung congenitaler Fehlbildungen. Nach Induktion durch die Ureterknospe entstehen aus dem metanephrogenen Mesenchym die funktionellen Einheiten der Niere - die Nephrone - und das Nierenstroma. Diesen morphogenetischen Prozessen liegen komplexe regulatorische Veränderungen in der Genexpression zugrunde, die bislang nicht im Detail aufgeklärt sind. Ziel dieser Arbeit war deshalb die Identifizierung bekannter und insbesondere neuer Gene, die durch Induktion im metanephrogenen Mesenchym reguliert werden. Mit Hilfe der ddPCR und Transfilter-Organkulturen wurde die Genexpression von induziertem versus nicht-induziertem Mesenchym aus Mäuse-Nierenanlagen untersucht. Einzelne Kandidaten wurden auf differenzielle Expression durch Northern Blot Analyse überprüft und für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Als eines der bekannten Gene wurde sFRP2 als im metanephrogenen Mesenchym induziert bestätigt und durch in situ Hybridisierung ganzer Mäuseembryonen und Paraffinschnitte näher untersucht. Es zeigt eine spezifische und dynamische Expression während der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe, die mit den Expressionsmustern von sFRP1 und sFRP4 verglichen wurde. Die detailierte Genexpressionsanalyse der sFRP-Familie in der murinen Embryonalentwicklung sollte als Grundlage für funktionelle Studien dieser erst kürzlich entdeckten neuen Genfamilie dienen. Erste Untersuchungen der ddPCR-Produkte C0-5, J6-3 und M2-4 zeigten, daß es sich um neue Gene handelt, die unterschiedliche Expressionsmuster in der Niere zeigen. Während C0-5 dynamisch in Epithelzellen von Ureter und Nephronvorläufern exprimiert ist, markiert J6-3 Stromazellen und M2-4 ist bereits im kondensierenden Mesenchym, später aber auch in den epithelialen Derivaten nachweisbar. Die Isolierung und Analyse der dem C0-5-ddPCR-Fragment entsprechenden cDNA zeigte, daß sie für ein kollagenartiges Protein codiert, welches beim Menschen in der Nähe des EWS-Gens auf Chromosom 22q12 liegt. Darüber hinaus wurde eine neue zu hairy und dem E(spl)-Komplex verwandte Genfamile identifiziert. Aufgrund ihrer Verwandtschaft und einem charakteristischen YRPW-Tetrapeptid wurden sie als Hey-Gene bezeichnet für: "hairy- und E(spl)-verwandt mit YRPW-Motiv". Sie zeigen gegenüber hairy/E(spl) oder den entsprechenden Vertebraten-Homologen der Hes-Genfamilie veränderte DNA- und Protein-Bindungseigenschaften. Darüber hinaus korrelieren ihre Expressionsmuster häufig mit Genen des Delta-Notch-Signaltransduktionsweg, was auf eine Beteiligung der Hey-Gene an Zelldeterminierung und Bildung von Zellgrenzen hinweist. Diese Vermutung konnte durch die Analyse von Dll1-Knockout-Mäusen für die Somitogenese ansatzweise bestätigt werden. Die Kombination von Transfilter-Organkultur mit ddPCR erwies sich als geeignet, um transkriptionell regulierte Gene des metanephrogenen Mesenchyms zu identifizieren. Expressions- und Sequenzanalyse vor allem der neuen Gene deutet auf ihre Beteiligung an der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe hin, die nun im Einzelnen untersucht werden muß. Mehr als 50 weitere Kandidaten für neue Gene bilden eine breite Basis zur weiteren Erforschung molekularer Grundlagen der Nierenentwicklung. N2 - Studies on kidney development provide insights into general processes of embryogenesis like inductive interactions, mesenchymal condensation, mesenchymal-epithelial interactions, cell fate determination as well as differentiation and thereby into the basis of congenital malformations. Once induced by the ureteric bud, the metanephrogenic mesenchyme gives rise to the functional units of the kidney - the nephrons - and the renal stroma. These morphogenetic processes rely on complex regulatory changes in gene expression, which to date are not understood in detail. The present thesis aimed to identify known and primarily novel genes regulated within the metanephrogenic mesenchyme upon induction. Gene expression of induced versus uninduced mesenchyme from murine kidney anlagen was compared using ddPCR together with transfilter organ culture. Several candidates were assayed for differential expression by northern blot hybridization and selected for further characterization. As one of the known genes, sFRP2 was verified to be induced within the metanephrogenic mesenchyme. In situ hybridization of whole-mount mouse embryos and paraffin sections revealed specific and dynamic expression patterns for sFRP2 as well as for the related genes sFRP1 and sFRP4 in the developing kidney and other tissues. The detailed sFRP gene expression analysis was performed to guide functional studies for this recently identified novel gene family. Preliminary investigations of the ddPCR products C0-5, J6-3 and M2-4 revealed that they are all derived from novel genes with distinct expression patterns during kidney development. While C0-5 expression dynamically switches from the ureteric bud to the nephron precursors and the collecting system, J6-3 specifies the stromal cell lineage and M2-4 is already detectable in the condensing mesenchyme with subsequent expression in epithelial derivatives. Isolation and analysis of the C0-5 cDNA resulted in the identification of a collagen-like protein in mice and humans that is located upstream of the EWS gene of the human chromosome 22q12. Additionally, a novel gene family related to hairy and the E(spl)-complex genes has been identified. Because of this relationship and a characteristic YRPW tetrapeptide they were designated as Hey genes for "hairy and E(spl) related with YRPW motif". Compared to hairy/E(spl) or the mammalian Hes proteins they show novel features of DNA-binding and protein interaction. Moreover, their expression patterns frequently correlate with those of members of the Delta-Notch signaling pathway suggesting that Hey genes may participate in this pathway in cell fate decisions and boundary formation. Analysis of Dll1 knockout mice partly confirmed this assumption for Hey1 and Hey2 during somitogenesis. This screen has shown that transfilter organ culture in combination with ddPCR is a powerful tool to identify genes regulated within the metanephrogenic mesenchyme upon induction. Expression and sequence analysis of the novel genes implies a function during development of the kidney and other tissues that can now be studied in further detail. The collection of more than 50 additional candidates for novel genes regulated during nephrogenesis provides a rich resource for future analysis of the networks governing kidney development KW - Niere KW - Entwicklung KW - Molekulargenetik KW - Niere KW - Urogenitalsystem KW - Differential Display PCR KW - Entwicklung KW - In situ Hybridisierung KW - Somitogenese KW - Neurogenese KW - Mesenchym KW - Maus KW - Delta KW - kidney KW - urogenital system KW - differential display PCR KW - development KW - in situ hybridization KW - somitogenesis KW - neurogenesis KW - mesenchyme KW - mouse Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1690 ER - TY - THES A1 - Kuß, Andreas T1 - Untersuchungen zur CD40 induzierten Expression von A1 in B-Lymphozyten der Maus T1 - Investigations concerning the CD40 induced expression of A1 in murine B lymphocytes N2 - Stimulation von unreifen B-Lymphozyten der Maus über den Antigenrezeptor führt zu Wachstumsstopp und Apoptose. Eine gleichzeitige Stimulation über CD40 bewirkt die Aufrechterhaltung der Proliferation und schützt die Zellen vor programmiertem Zelltod. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Stimulation über CD40 die Genexpression von A1 - einem antiapoptotischen Mitglied der Bcl2-Proteinfamilie - in primären B-Lymphozyten aus Mäusen anregt. Die CD40 Abhängigkeit der A1 Expression wurde in WEHI 231 Lymphomzellen, einem Modellsystem für unreife B-Lymphozyten, bestätigt. Um das Potential von A1 in den BZR-abhängigen Prozessen Wachstumsstopp und Apoptose zu untersuchen, wurden WEHI 231 Zellen mit A1 transduziert. Die cDNA von A1 wurde mittels rekombinanten, replikationsdefekten Retroviren eingeschleust. Positive Populationen wurden über chimäre Marker aus Gelbfluoreszenzprotein und Zeocin Resistenzprotein, deren Expression über eine "internal ribosomal entry site" (IRES) an die Expression des Testgens gekoppelt war, selektioniert. Nach Stimulation der A1 transduzierten Zellen über den BZR wiesen diese eine größere Überlebensrate auf als Zellen der entsprechenden Kontrollpopulation. Dabei hatte die konstitutive Expression von A1 jedoch keinerlei Einfluß auf den durch BZR Stimulation hervorgerufenen Zellzyklusarrest. Dieses Ergebnis erklärt sich durch die Tatsache, dass A1 alleine nicht in der Lage war, die durch den BZR negativ regulierte Expression von c-myc RNA zu verhindern. Auch der BZR-abhängige Aktivitätsverlust eines NFkB-abhängigen Luciferasereporters wurde durch A1 alleine nicht verhindert. Die Überexpression von induzierbarem cMyc-ER in A1 transduzierten Zellen, um damit durch parallele Induktion des ektopischen cMyc-ER den BZR-induzierten Verlust von cMyc auszugleichen, führte nicht zur Wiederherstellung der Proliferationsfähigkeit dieser Populationen. Ektopisches cMyc-ER hatte im Gegenteil selbst eine proliferationshemmende und apoptotische Wirkung, die von A1 unbeeinflusst blieb. Untersuchungen zur Funktionsweise von A1 zeigten, dass es den Abbau des Caspasesubstrates Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP), die Aktivierung der Caspase 7, aber auch die Freisetzung radikalischer Sauerstoffverbindungen aus den Mitochondrien unterdrückte. Das CD40-Signal scheint sich also oberhalb von A1 in zwei Hauptkomponenten aufzuteilen, wovon eine die Proliferationsfähigkeit aufrecht erhält, während die andere das Überleben der Zellen sichert. A1 ist allem Anschein nach für letztere von zentraler Bedeutung. N2 - Engagement of the antigen receptor on murine immature B lymphocytes leads to growth arrest followed by apoptosis. Concomitant signalling through CD40 rescues the cells from apoptosis and sustains proliferation. It is shown here, that in primary murine B cells crosslinking of CD40 stimulates the expression of A1, an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family. CD40 dependent stimulation of A1 was confirmed in WEHI 231 cells, an immature B cell lymphoma line. WEHI 231 cells were transduced with A1 and a chimeric selection marker comprising the enhanced yellow fluorescent protein and the zeocin resistance protein via recombinant replicationdefective retroviruses. Expression of A1 and marker proteins was coupled through an internal ribosomal entry site. A1 transduced WEHI 231 cells showed a significantly enhanced survival rate after engagement of the antigen receptor whereas constitutive expression of A1 did not abrogate c-myc downregulation and activity-loss of a NFkB-dependent luciferase reporter, both of which were induced by BCR-crosslinking. Expression of inducible cMyc-ER in A1 transduced cells did not restore proliferation in these populations. In contrast, upon induction cMyc-ER itself caused growth arrest and apoptosis of these cells despite the presence of A1. Studies of functional properties of A1 revealed that it was able to suppress BCR-induced degradation of the caspase substrate PARP as well as activation of Caspase 7. The generation of reactive oxigen species, a further consequence of BCR signalling, was also significantly reduced by A1. Taken together these result suggest that upstream of A1 the CD40 signal is divided into two major components, one of which is responsible for the upkeep of proliferation whereas the other secures cell survival. It seems that for the latter A1 is of major importance. KW - Apoptosis KW - B-Lymphozyt KW - Proteasen KW - CD40 KW - Bcl-2 KW - Unreife B-Zelle KW - Apoptose KW - Wachstumsstopp KW - Caspasen KW - CD40 KW - bcl-2 KW - Immature B cell KW - Apoptosis KW - Growth Arrest KW - Caspases Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1669 ER - TY - THES A1 - Kühlkamp, Thomas T1 - Der plasmamembran assoziierte Transportregulator RS1 bindet Ubiquitin und gelangt in den Zellkern T1 - The plasma membrane associated transport modifier RS1binds ubiquitin und migrates into the nucleus N2 - Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Erkenntnisse über die subzelluläre Verteilung und die Funktion des RS1-Proteins vom Schwein (pRS1), einem Regulator von Plasmamembran-transportern. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) wurde mit pRS1 fusioniert und in LLC-PK1 Zellen exprimiert. Das GFP-pRS1 Fusionsprodukt (96 kD) konnte an der Plasmamembran, im Zytosol und im Zellkern entdeckt werden. Bei GFP-Fusion mit trunkierten pRS1-Proteinen zeigte sich, dass der C-Terminus die Kernlokalisierung beeinflusst. Dagegen wurde die Kernlokalisierung durch eine Trunkierung des N-Terminus nicht gestört. Im C-Terminus des pRS1 konnte von AS 579 bis 616 eine Ubiquitin associated domain (UBA) identifiziert werden, die auch in den anderen bisher bekannten RS1-Proteinen aus Mensch, Kaninchen und Maus konserviert vorliegt. Eine Ubiquitin-Affinitätschromatographie zeigte, dass das pRS1-Protein Ubiquitin auf nicht kovalente Weise bindet. Nach der Trunkierung der UBA-Domäne war keine Wechselwirkung des pRS1-Proteins mit Ubiquitin mehr feststellbar. Ein konserviertes Di-Leucin-Endozytose-Motiv (pRS1 AS 366/67) deutet eine Funktion des pRS1-Proteins bei der Internalisierung von Plasmamembranproteinen an. Deshalb wurde das Endozytoseverhalten von pRS1 überexprimierenden LLC-PK1 Zellen untersucht, wobei sich zeigte, dass diese Zellen eine deutlich höhere Aufnahme des Endozytosefarbstoffes RH 414 aufwiesen als Zellen, die pRS1 nicht überexprimierten. Die in dieser Arbeit gesammelten Daten zum RS1-Protein wurden zusammen mit früher erhobenen Ergebnissen zum RS1-Protein im Rahmen eines Modells zusammengefasst. In diesem hypothetischen Modell wird angenommen, dass RS1 ein Adapterprotein ist, welches die ubiquitinabhängige Endozytose von Plasmamembrantransportern vermittelt und als Signalmolekül in den Zellkern gelangen kann, wo es an der Transcriptionsrepression des SGLT1 beteiligt ist. N2 - This work discribes investigations about the subcellular distribution and function of the plasma membrane-associated protein RS1, an regulator of plasma membrane transporters like the Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 or the organic cation transporter OCT2 (Vehyl et al., 1993; Reinhardt et al., 1999; Valentin et al., 2000). The green fluorescent protein (GFP) was fused to RS1 from pig (pRS1) and expressed in LLC-PK1 cells. The GFP-pRS1 protein could be detected at the plasma membrane, in the cytoplasma and in the nucleus. Expression of various truncated forms of GFP-pRS1 showed that the N-terminal half of pRS1 (amino acids 1-328) is not necessary for the migration of pRS1 into the nucleus. In contrast, truncations of the C-terminus inhibited translocation into the nucleus. The C-terminus of pRS1 contains a conserved ubiquitin associated domain (UBA) at amino acids 579 to 616. Affinity chromatography with ubiquitin-conjungated Sepharose beads showed a noncovalent binding of pRS1 to immobilized ubiquitin, which was abolished in the presence of an excess of free ubiquitin. Further analysis schowed that the C-terminal 111 amino acids were indispensable for ubiquitin binding. A conserved di-leucine signal (pRS1 336/337) is a well known endocytosis motif and points to an involvement of pRS1 in the internalisation of plasma membrane proteins. This hypothesis was supported by the finding of an increased uptake of the intercalating membrane dye RH 414 in a pRS1-overexpressing LLC-PK1 cell line. Based on this findings together with previous data, a model for the physiological role of RS1 was proposed. In this model, RS1 serves as an adaptor which links ubiquitinated plasma membrane transporters such as SGLT1 to the endocytosis machinery. Moreover RS1 migrates into the nucleus and is involved in the transcriptional suppression of SGLT1. KW - Ubiquitin KW - Carrier-Proteine KW - Plasmamembran KW - Zellkern KW - RS1 KW - SGLT1 KW - UBA KW - Ubiquitin KW - Plasmamembrane KW - Zellkern KW - Endocytose KW - RS1 KW - SGLT1 KW - UBA KW - ubiquitin KW - plasma membrane KW - nucleus KW - endocytosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179507 ER - TY - THES A1 - Kolb-Mäurer, Annette T1 - Interaktion humaner dendritischer Zellen mit Listeria monocytogenes T1 - Interaction of human dendritic cells with Listeria monocytogenes N2 - Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort gegenüber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich höher als im Plasma-freien Medium oder Medium mit fötalem Kälberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antikörper gegen das listerielle Oberflächenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antikörper das Haupt-Opsonin für die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma während der Inkubationszeit, was den Schluss zulässt, dass Immunglobuline gegen das Oberflächenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, für die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich phänotypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgelöste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichonsäure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, führte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes könnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Träger. N2 - Dendritic cells (DC) activate naive CD4+ and CD8+ lymphocytes and are therefore critical for the initiation of an immune response against microorganisms. In this work the interaction between DC and L. monocytogenes was examined. Immature DC show a very efficient uptake of L. monocytogenes. Phagocytosis was much higher in the presence of human plasma than with plasma free media or media with fetal calf serum (FCS). However, the addition of immunoglobulins showed a concentration dependent increase in phagocytosis comparable with the addition of human plasma. Human plama contains antibodies against the listerial surface protein p60. By using a iap-deletion mutant it was shown that antibodies against p60 are the main opsonin for the uptake of L. monocytogenes into DC. Because no difference in the uptake of this deletion mutant in the presence or absence of human plasma was observed; antibodies against p60 appear to be resonsible for the efficient uptake of L. monocytogenes and other apathogenic Listeria strains. A major portion of internalized bacteria is found in membrane-bound phagosomes and rarely free in the cytosol. Most of the bacteria that were taken up by DC were killed very efficiently in the phagosome. Interestingly, infection with L. monocytogenes caused maturation of the immature DC into mature DC. This effect appeared to be largely mediated by listerial lipoteichoic acid. Although L. monocytogenes infection is known to induce death in other cell types, DC were relatively resistant and only 20 per cent of infected DC underwent cell death. Uptake, maturation and resistance to apoptosis suggest that DC are essentiel antigen presenting cell (APC) for L. monocytogenes immunity. Thus these observations into the interaction of L. monocytogenes with human DC provide an important into the pathogenesis of Listeria infection as well as providing a basis for Listeria-based vaccination strategies. KW - Mensch KW - Dendritische Zelle KW - Listeria monocytogenes KW - Dendritische Zelle KW - Listeria monocytogenens KW - Apoptose KW - dendritic cell KW - Listeria monocytogenes KW - apoptosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1638 ER - TY - THES A1 - Kohlert, Claudia T1 - Systemische Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol nach oraler Applikation einer thymianhaltigen Zubereitung im Menschen T1 - Systemic availability and pharmacokinetics of thymol after oral application of a thyme containing preparation in humans N2 - Ätherische Öle bzw. Ätherisch-Öl Komponenten sind etabliert in der Therapie der chronischen und akuten Bronchitis. Eine klinische Studie, die mit Thymianextrakt durchgeführt wurde, ließ auf die klinische Wirksamkeit bei akuter Bronchitis schließen. Zahlreiche pharmakodynamische Effekte konnten in vitro für Thymianextrakt bzw. das ätherische Thymianöl gezeigt werden, jedoch wurde bis jetzt die systemische Verfügbarkeit der betreffenden Verbindungen am Zielorgan noch nicht untersucht. Diesbezügliche Untersuchungen sind notwendig, um die Verknüpfung zwischen den in vitro beobachteten Effekten und der klinischen Wirksamkeit herstellen zu können. Eine pharmakokinetische Studie wurde nach Einnahme einer Einzeldosis BronchipretTP (Filmtabletten mit 60 mg Primelwurzelextrakt und 160 mg Thymianextrakt) durchgeführt, um festzustellen, ob Thymol, das den Hauptbestandteil des ätherischen Thymianöls darstellt, zur Wirksamkeit dieser Zubereitung beitragen kann. Dazu wurde eine Extraktionsmethode für die Bestimmung von Thymol nach enzymatischer Spaltung des Phase-II-Konjugates Thymolsulfat im Plasma sowie von Thymolsulfat und Thymolglucuronid im Urin entwickelt. Es wurde eine neuartige, automatisierte headspace Festphasenmikroextraktionsmethode (HS-SPME) entwickelt, die Extraktion, Anreicherung und Probenaufgabe in einem einzigen Schritt ermöglichte. Die Quantifizierung von Thymol im unteren ng.mL-1 Bereich wurde durch die Verwendung von Gaschromatographie in Kombination mit Flammenionisationsdetektion durchgeführt. Die Automatisierung der Methode war notwendig um sie nach internationalen Richtlinien zur Validierung bioanalytischer Methoden validieren zu können. Dies ist das erste Mal, dass eine Bioverfügbarkeitsstudie bzw. eine pharmakokinetische Studie mit Hilfe der HS-SPME durchgeführt wurde. Thymol selbst war nicht systemisch verfügbar. Es war kein freies Thymol oberhalb von 1,4 ng/mL im Plasma detektierbar. Der systemisch verfügbare Phase-II-Metabolit wurde per LC-MS/MS als Thymolsulfat identifiziert. Thymolsulfat wurde nur im Plasma detektiert, wohingegen sowohl Thymolsulfat als auch Thymolglucuronid im Urin nachgewiesen wurden. Im Urin wurde kein freies Thyxmol oberhalb von 2,1 ng/mL detektiert. Da Thymol nur in Form von Thymolsulfat systemisch verfügbar war, wurde die pharmakokinetische Auswertung an Hand der sich nach enzymatischer Spaltung von Thymolsulfat ergebenden Daten vorgenommen. Die pharmakokinetische Studie wurde nach Verabreichung einer Einzeldosis BronchipretTP (1,08 mg Thymol) mit 12 Probanden durchgeführt. Die Resorption von Thymol war frühzeitig. Bereits nach 20 min konnte Thymol im hydrolisierten Plasma nachgewiesen werden. Maximale Plasmakonzentrationen (cmax) von 93,1±24,5 ng/mL (MW±SD) wurden nach 1,97±0,77 h (tmax) (MW±SD) erreicht. Die Plasmakonzentrationen zeigten einen biphasischen Verlauf und die terminale Eliminationphase setzte nach ca. 10 h ein. Die Eliminationshalbwertszeit errechnete sich zu 10,2 h. Dies betont die Wichtigkeit entsprechend langer Meßzeiträume in Verbindung mit einer hoch sensitiven Analytik, um die Elimination vollständig erfassen zu können. Bezogen auf die verabreichte Thymoldosis (1,08 mg) wurden 16,2±4,5 Prozent (MW±SD) mit unverändertem Thymolgrundgerüst renal eliminiert. Die renale Clearance von 271±156 mL/h (MW±SD) indiziert eine hohe Plasmaeiweißbindung und/oder tubuläre Reabsorption. Die Daten deuten darauf hin, dass die klinische Wirksamkeit nach Applikation einer thymianextrakthaltigen Zubereitung auf Thymolsulfat oder mögliche Phase-I-Metabolite zurückzuführen sein könnte. Die pharmakodynamischen Effekte dieser Verbindungen wurden bislang noch nicht untersucht. Andererseits könnte die Aktivität von Sulfatasen im Lungengewebe die pulmonale Elimination von Thymol erklären. Freies Thymol könnte somit am Respirationstrakt wirksam sein, obwohl es im Plasma nicht detektiert wurde. N2 - Essential oil compounds are established for the therapy of chronic and acute bronchitis. A clinical trial with a preparation containing thyme extract has suggested clinical efficacy for acute bronchitis. Various pharmacodynamic effects have been demonstrated in vitro for thyme extract and the essential thyme oil, respectively, but systemic availability of these compounds in the respective target organs has not been proven yet. Such investigations are necessary to provide the link between in vitro effects and in vivo studies. A pharmacokinetic study following a single dose of BronchipretTP tablets (60 mg primrose extract and 160 mg thyme extract) was performed to determine whether thymol, which is the main compound in the essential oil of thyme, might contribute to the efficacy of this formulation containing thyme extract. Therefore an extraction method for the analysis of thymol after enzymatic cleavage of the phase II conjugates thymol sulfate in plasma as well as thymol sulfate and thymol glucuronide in urine was developed. A novel automated headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) method was developed, which provided extraction, concentration and sampling in a single step. Quantification of thymol was consequently achieved at the lower ng×mL-1 level using gas chromatography combined with flame ionization detection. Automation of the method was necessary to test the method according to international guidelines for validation of bioanalytical procedures. This is the first time that HS-SPME has been used for a bioavailability or pharmacokinetic study. Thymol itself was not systemically available because no free thymol could be detected in plasma above 1.4 ng/mL. The systemically available phase II metabolite was identified as thymol sulfate by HPLC-MS/MS. Thymol sulfate was identified in plasma whereas both thymol sulfate and thymol glucuronide were detected in urine. No free thymol was detected in urine above a limit of quantification of 2.1 ng/mL. As thymol was systemically available only in the form of thymol sulfate, pharmacokinetic analysis of the data was carried out based on the data obtained after enzymatic cleavage of thymol sulfate. The pharmacokinetic study comprised a single-dose study with 12 healthy volunteers (1 tablet BronchipretTP equivalent to 1.08 mg thymol). Absorption of thymol was rapid after administration of a single dose of BronchipretTP tablets. Thymol could be detected in hydrolyzed plasma 20 min after application. Maximum plasma levels (cmax) of 93.1±24.5 ng/mL(mean±SD) were reached after 1.97±0.77 h (tmax) (mean±SD). Plasma concentrations showed a biphasic profile and the terminal elimination phase set in after about 10 h and continued up to 38 h. The terminal elimination half life was calculated to be 10.2 h. This stresses the importance of long sampling periods in combination with highly sensitive analytical tools to adequately follow the elimination profile. With regard to the applied thymol dose (1.08 mg) the renally eliminated amount of thymol with unchanged thymol base structure was 16.2±4.5 per cent (mean±SD). The renal clearance of 271±156 mL/h (mean±SD) indicates high protein binding and/or tubular reabsorption. The data indicate that the pharmacological effect observed in vivo after application of preparations containing thyme extract could be due to thymol sulfate or putative phase I metabolites. However, the pharmacodynamic effects of these compounds have not been investigated yet. Also the activities of sulfatases in lung tissue could explain the observed pulmonary elimination of thymol. Free thymol could therefore be effective at the respiratory system, although it was not detected in plasma. KW - Mensch KW - Thymian KW - Etherisches Öl KW - Bioverfügbarkeit KW - Pharmakokinetik KW - Bioverfügbarkeit KW - Pharmakokinetik KW - Thymian KW - Thymol KW - BronchipretTP KW - Festphasenmikroextraktion KW - Plasma KW - Urin KW - Bioavailability KW - Pharmacokinetics KW - Thyme KW - Thymol KW - BronchipretTP KW - Solid-phase microextraction KW - Plasma KW - Urine Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1621 ER - TY - THES A1 - König, Jochen T1 - Tex aus Bordetella pertussis definiert eine neue Familie von Nukleinsäure-Bindeproteinen N2 - Das Tex Protein aus Bordetella pertussis definiert eine neue Familie hoch konservierter Proteine in Eubakterien. Ursprünglich wurde das tex Gen aufgrund seines Einflusses auf die Toxinexpression in bestimmten regulatorischen Mutanten von B. pertussis gefunden (Fuchs et al. (1996), J Bacteriol 178, 4445-52). Wie hier gezeigt wird, sind Leserahmen für entsprechende Proteine bei den Eubakterien ubiquitär und mehrheitlich zu über 69 Prozent konserviert. Eine Ausnahme bilden einige wenige Taxa mit bekanntermaßen reduzierten Genomen, bei denen das Gen wahrscheinlich verloren gegangen ist, wie zum Beispiel verschiedene Mycoplasma spp. oder der obligate Blattlaus- (Aphiden-) Symbiont Buchnera aphidicola. In Eukaryonten und Archaeen konnte ein zu tex homologes Gen bisher nicht gefunden werden. Die Funktion von Tex in der Bakterienzelle ist unklar. Während das Gen in B. pertussis essenziell ist und auch nicht überexprimiert werden kann, sind Deletionsmutanten in Neisseria meningitidis und Escherichia coli phänotypisch nicht von den entsprechenden Wildtypen unterscheidbar. Ausgiebige Wachstumsstudien mit einer E. coli tex-Mutante unter verschiedenen Wachstums- und Stressbedingungen ergaben ebenfalls keinen Hinweis auf eine Bedeutung von Tex, die die außerordentliche Konservierung des Proteins erklären könnte. Das Protein zeigt in seinem N-Terminus ausgeprägte Ähnlichkeit mit dem Mannitol-Repressor (MtlR) von Escherichia coli und besitzt eine C-terminale S1-Domäne. Da die meisten der Proteine mit S1-Domänen als RNA-bindende Proteine gelten, wurde die Fähigkeit von Tex untersucht, mit Nukleinsäuren zu interagieren. In Festphasen-Bindeassays mit an Magnetkügelchen immobilisiertem Tex Protein aus E. coli konnte eine spezifische Bindung an RNA-Gesamtpräparationen gezeigt werden. DNA wurde hingegen nicht gebunden. Durch Verkürzung des N-Terminus geht die präferenzielle Bindung an RNA jedoch verloren und die Bindung von DNA erfolgt mit der gleichen Effizienz wie die von RNA. Festphasen-Bindeassays wurden weiterhin dazu benutzt, mögliche spezifische Interaktionspartner von Tex aus RNA-Gesamtpräparationen zu finden. Tatsächlich konnten über diesen Ansatz die regulatorische RNA CsrB und die ribosomale 16S RNA als spezifische Liganden isoliert werden. Über die biologische Relevanz dieser Interaktion kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt allerdings noch keine Aussage gemacht werden. N2 - The Bordetella pertussis Tex protein defines a new family of highly conserved eubacterial proteins. The tex gene was originally found due to its negative influence on toxin expression when over-expressed slightly in certain regulatory mutants of B. pertussis (Fuchs et al. (1996), J Bacteriol 178, 4445-52). As shown in this work apparently homologous reading frames are ubiquitous within the Eubacteria. The majority of these mostly putative proteins are more than 69 per cent conserved. Only some of the genomes of some obligate intracellular pathogens, e. g. various Mycoplasma ssp., or the aphid symbiont Buchnera aphidicola known for their reduced gene numbers were found to lack a tex gene and probably have lost it during phylogeny. The actual function of Tex within the bacterial cell is as yet mysterious as the gene can neither be deleted nor can it be highly over-expressed in B. pertussis. However, deletion mutants in Neisseria gonorrhoeae and Escherichia coli do not show any phenotype different to the respective wild type. Extensive growth studies on an E. coli tex-mutant did not reveal any clue to the reason for the extraordinary conservation of the protein. The N-terminus of Tex shows extensive similarity to the mannitol repressor (MtlR) of E. coli whereas the C-terminus contains an S1 domain. Because most S1 domain containing proteins have been shown to bind RNA, the capacity of Tex to interact with nucleic acids was investigated. In solid phase binding assays with purified Tex protein from E. coli immobilized to magnetic beads the protein showed specific binding of RNA but not DNA. NÓterminal deletions of different length abolished this preference for RNA and both types of nucleic acid bound equally well. Again a solid phase binding assay was used to enrich for specific ligands of Tex from total cellular RNA preparations. This approach identified the regulatory CsrB RNA and ribosomal 16S RNA as preferential binding targets. However, it is not yet possible to comment on the biological relevance of these findings. KW - Bordetella pertussis KW - Nucleinsäuren KW - Bindeproteine KW - tex KW - Bordetella pertussis KW - Bindeprotein Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1601 ER - TY - THES A1 - Köhler, Rolf T1 - Entwicklung eines GFP-Reportersystems in Legionella und molekularbiologische Funktionsanalyse des Legionella Mip-Proteins T1 - Development of a GFP-Reportersystems in Legionella and molecular analysis of the Legionella Mip-protein N2 - Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 als Erreger der Legionellose, einer schweren atypisch verlaufenden Pneumonie identifiziert. Es besitzt ein duales Wirtssystem und kann sich sowohl in aquatischen Habitaten in Protozoen als auch in phagozytierenden Humanzellen als Pathogen vermehren. Zur Analyse der komplexen Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle wurde in dieser Arbeit ein GFP (Green Fluorescent Protein)-Reportersystem etabliert und erfolgreich eingesetzt. Es erlaubt ein in vivo Monitoring von Legionella Infektionen und ermöglicht die schnelle Quantifizierung bakterieller Invasion in Wirtszellen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren. Zur Etablierung der GFP-vermittelten Fluoreszenz wurde eine transkriptionelle Fusion des gfpmut2-Gens mit dem Legionella spezifischen mip ("macrophage infectivity potentiator")-Promoter (Pmip) konstruiert. Zusätzlich wurde ein Vektor mit dem von Listeria stammenden sod ("super oxid dismutase")-Promoter eingesetzt. Mit diesen Vektoren transformierte Legionella-Stämme zeigten nach entsprechender Anregung eine starke Grünfluoreszenz und belegen somit erstmals die Funktionalität von GFP in Legionella. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, Spektrofluorimetrie und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) wurden die Stämme hinsichtlich der Unterschiede in der Virulenz und der intrazellulären Vermehrung untersucht. Ergebnisse, die durch die zeitaufwendige Bestimmung von CFU-Werten ermittelt wurden, konnten verifiziert und damit die Validität des GFP-Reportersystems in Legionella bestätigt werden. Quantitative Analysen der mip-Promoteraktivität belegen die konstitutive Expression und zeigen, dass Unterschiede in der Virulenz nicht auf variierende mip-Promoteraktivität zurückzuführen sind. Darüber hinaus konnte der Einfluss verschiedener Phagozytose-Inhibitoren auf die Aufnahme von Legionellen in die Protozoenwirte Acanthamoeba castellanii und Hartmannella vermiformis mittels des GFP-Reportersystems quantifiziert und qualitativ bewertet werden. Durch die Verwendung des Inhibitors Cytochalasin D konnte ein Einfluss Mikrofilament-abhängiger Phagozytose auf die Aufnahme in H. vermiformis und A. castellanii ausgeschlossen werden. Wie in Inhibitionsstudien mit Cycloheximid und Methylamin bestätigt werden konnte, erfolgt die Phagozytose in H. vermiformis wahrscheinlich vorwiegend über Rezeptor-vermittelte-Endozytose. Dem Protozoenwirt A. castellanii stehen dagegen zusätzliche Möglichkeiten der bakteriellen Internalisierung zur Verfügung. Diese Ergebnisse bestätigen die postulierte Heterogenität der Aufnahme-Mechanismen innerhalb verschiedener Protozoenwirte. Nach erfolgter Phagozytose von L. pneumophila wird der endosomale Weg der Phagolysosom- Reifung blockiert, hierfür wird die Sekretion bislang unbekannter Effektoren verantwortlich gemacht. Durch die Konstruktion von C-terminalen Mip::GFP-Fusionsproteinen sollte die Detektion einer eventuellen Translokation des Mip-Proteins als Virulenzfaktor innerhalb der Wirtszelle ermöglicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine waren wahrscheinlich aufgrund der homodimeren Mip-Struktur instabil und wurden nicht über die Cytoplasmamembran hinweg transportiert. Sie erwiesen sich daher als nicht geeignet, dieser Fragestellung weiter nachzugehen. Da die in vivo Funktion von PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) wie dem Mip-Protein in Prokaryoten bis heute weitgehend unbekannt ist, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit versucht werden, einen Interaktionspartner zu identifizieren und den Einfluss der Dimerisierung und der PPIase-Aktivität des Mip-Proteins auf die Virulenz von L. pneumophila zu untersuchen. Durch Quervernetzung-Experimente konnte ein putativer, prokaryotischer Interaktionspartner des Legionella Mip-Proteins detektiert werden. Die N-terminale Aminosäure-Sequenzierung ergab jedoch keinerlei Homologie zu bereits bekannten Legionella- oder anderen Proteinen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine N-terminale Blockierung die Aufklärung der Sequenz ursächlich verhindert. Wie in früheren Arbeiten gezeigt wurde, ist die PPIase-Aktivität des Legionella Mip-Proteins für die Invasion und das intrazelluläre Überleben in Protozoen, Monozyten und der Makrophagen-ähnlichen Zelllinie U937 nicht notwendig. Ein weiteres Charakteristikum des Proteins ist seine homodimere Struktur und die Assoziation mit der äußeren Membran. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Fischer in Halle konnte durch Deletion der N-terminalen Domäne (AS 4-79) ein verkürztes Dimer-defizientes Legionella Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) erzeugt und biochemisch charakterisiert werden. Durch site-spezifische Mutagenese N-terminal lokalisierter Aminosäuren (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) konnte deren Beteiligung an der Dimerisierung nachgewiesen werden. Zur Analyse des Einflusses der dimeren Ouartärstruktur auf die Pathogenität wurde ein mip-negativer Stamm mit dem nur noch als Monomer vorliegenden Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) in cis komplementiert und die Expression sowie Integration in L. pneumophila PhilI JR32-2.4 verifiziert. Ergebnisse aus Infektionsstudien zeigten deutlich, dass die Dimerisierung des Legionella Mip-Proteins und nicht die Isomerase-Aktivität für die Infektion von monozellulären Systemen entscheidend ist. Im Gegensatz dazu konnte in Tierexprimenten (Meerschweinchen) die Beteiligung der Isomerase-Aktivität an der Pathogenität von L. pneumophila nachgewiesen werden. Der Verlust der Isomerase-Aktivität wirkt sich, verglichen mit dem monozellulären System (A. castellanii), im Tiermodel wesentlich dramatischer auf das intrazelluläre Überleben aus. Mit site-spezifisch verändertem Mip-Protein komplementierte Legionella-Stämme zeigten eine intrazelluläre Vermehrung in Abhängigkeit der gemessenen in vitro Isomerase-Restaktivität. Durch den Einsatz der dimerisierungsdefizienten Mip-Komplementante, L. pneumophila PhilI JR32-2.4, wurde die Notwendigkeit der Dimerisierung des Mip-Proteins auch im Tiermodell bestätigt. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Funktion der Isomerase-Aktivität für die Infektion monozellulärer Systeme und höherer Organismen unterschiedlich ist. N2 - The facultative intracellular bacterium Legionella pneumophila was first identified in 1977 as the etiologic agent of legionellosis, a severe and atypical pneumonia. It possesses a dual host system which allows the bacteria to replicate in protozoa in aquatic habitats as well as a pathogen in human phagocytic cells. In order to analyze the complex interaction of the bacterial pathogen and its host cells, in this thesis a new GFP reporter system was established and sussessfully evaluated. It is now possible to monitor a Legionella infection in vivo and to quantify bacterial invasion influenced by different factors in a more convenient way. To analyze GFP expression in Legionella a transcriptional fusion of the gfpmut2 gene with the Legionella-specific mip (macrophage infectivity potentiator) promoter was constructed. In addition, a vector habouring the sod (super oxid dimutase) promoter derived from Listeria monocytogenes was used. Following transformation into Legionella strains strong GFP-mediated fluorescence was detected confirming the functionality of GFP in Legionella for the first time. Using fluorescence microscopy, spectrofluorimetry and flow cytometry (FACS-analysis) the strains were examined regarding differences in virulence and intracellular replication. Re-confirming results from earlier studies obtained by using enumeration of CFU values showed the validity of the method. Quantification of the mip promoter activity revealed a constitutively expression, this indicates that differences in Legionella virulene are not due to variations in mip promoter activity. Moreover, the influence of different phagocytosis inhibitors on Legionella uptake into the protozoan hosts Acanthamoeba castellanii and Hartmannella vermiformis using the GFP reporter system was examined. Application of cytochalasin D had no influence on bacterial uptake in A. castellanii and H. vermiformis suggesting in microfilament-independent mechanism. Phagocytosis in H. vermiformis is mainly accomplished using receptor-mediated phagocytosis as it was evident from inhibition studies with cycloheximide and methylamine. In contrast, phagocytosis in A. castellanii is mediated by other receptors or additional mechanisms are available. This results confirm the proposed heterogeneity of uptake mechanisms by different protozoan hosts. After L. pneumophila is phagocytosed the endosomal pathway of phagosome maturation is blocked, by means of secreted but as yet unidentified effector molecules. To study a putative protein translocation C-terminal Mip::GFP fusion proteins were constructed. The stability of the proteins was rather weak which is likely due to the dimeric conformational state of the Mip protein. In addition, transport over the cytoplasmic membran was not accomplished. Therefore the fusion proteins proved not to be useful for examine translocational events. Because of the unknown in vivo function of bacterial PPIases the focus in the the second part of this work was to identify a putative interaction partner of the Mip protein and to elucidate the influence of dimerization and PPIase activity on Legionella's virulence. Using cross linking experiments a putative interaction partner could be detected. N-terminal sequencing revealed no homology to already known Legionella or other proteins. N-terminal blockade of the putative partner molecule may be the cause that hampered sequence identification. It has been shown that the isomerase activity of the Legionella Mip protein is not necessary for invasion and intracellular survival in protozoan, monocytes and U937 macrophages. Additional features of the protein are its homodimeric conformational state and the assoziation with the outer membrane. In cooperation with the group of Prof. Dr. G. Fischer in Halle a N-terminal truncated (aa 4-79) dimerization-deficient Mip protein (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) was constructed and biochemically characterized. Using site specific mutagenesis participation of the N-terminal located amino acids (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) in the dimerization of the Mip protein was confirmed. To analyze the influence on pathogenicity of the dimeric state of the Mip protein a mip negative strain was complemented by providing the gene encoding the monomeric Mip (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) in cis. The proper integration and protein expression was confirmed. The results demonstrate that the isomerase activity is dispensable for intracellular growth in protozoan hosts. Moreover, the results clearly demonstrated that dimerization and not the isomearse activity are essential for virulence of Legionella in a monocellular system. In contrast, it could be shown that the isomerase activity is necessary for full virulence in the animal model (guinea pigs). The loss of the isomerase avtivity have a more dramatic impact on the intracellular survival of Legionella compared to the monocellular system (A. castellanii). Moreover, Legionella strains replicated intracellulary dependent on their remaining in vitro isomerase activity. Using the monomeric Mip expressing strain L.p.JR32-2.4 it could be demonstrated that dimerization also plays a role in the animal model. This work provides evidence for a different role of the isomerase activity of the Mip protein in monocellular systems and during the infection of higher organisms. KW - Legionella pneumophila KW - Bakterielle Infektion KW - Grün fluoreszierendes Protein KW - In vivo KW - Legionella pneumophila KW - GFP-Reportergen KW - in vivo Monitoring KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - FACS-Analyse KW - MIP KW - PPIasen KW - Dimerisierung KW - Legionella pneumophila KW - GFP-reportersystem KW - in vivo monitoring KW - fluorescence microscopy KW - FACS-analysis KW - Mip KW - PPIases KW - dimerization Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1594 ER - TY - THES A1 - Knörr, Constanze Helga T1 - Untersuchungen zu den Mechanismen in der Entwicklung maligner B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ T1 - Mechanisms in the development of low-grade B-cell lymphomas of the mucosa-associated lymphoid tissue (MALT)-type N2 - B-Zell-Lymphome des mukosaassoziierten lymphatischen Gewebes (MALT) entwickeln sich außerhalb des primären lymphatischen Gewebes und entstehen hauptsächlich im Magen aufgrund einer H. pylori-assoziierten chronischen Entzündung. Vorangegangene immunhisto-chemische und funktionelle Untersuchungen zeigten, daß die Tumorzellen phänotypisch Gedächtnis-B-Zellen entsprechen und Antigenrezeptoren auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. In der vorliegenden Arbeit konnten mit Hilfe von molekulargenetischen Antigenrezeptor-analysen die Tumorzellpopulationen identifiziert und charakterisiert werden. Dabei wurde deutlich, daß sowohl mono- als auch biklonale B-Zell-Lymphome existieren. Im Vergleich zu neueren veröffentlichten Daten von MALT-Typ Lymphomen aus der Speicheldrüse, konnte jedoch bei den hier untersuchten gastralen Tumoren keine VH-Gen-restriktion nachgewiesen werden. Die tumorspezifischen VH-Mutationsanalysen zeigten, daß es sich bei den Tumor-B-Zellen auch genotypisch um Gedächtnis-B-Zellen handelt, die jedoch offensichtlich unter-schiedlich lange dem Mechanismus der Keimzentrumsmaturation ausgesetzt worden waren. Zudem konnte bei mono- und biklonale Lymphomen, im Gegensatz zu Fällen mit poly-klonalem Entzündungsinfiltrat die Translokation t(11;18)(q21;q21) nachgewiesen werden. Ausgehend von der Tatsache, daß die Tumorprogression dieser B-Zell-Lymphome anfangs noch abhängig von dem lokal vorhandenen Mikromilieu zu sein scheint, wurden die tumorinfiltrierenden T-Zellen (TITL) genauer charakterisiert. Es wurden überwiegend CD4+ TITLs nachgewiesen, die sowohl aktiviert (C69+) als auch immunkompetent (CD28+) waren und die für T/B-Zell-Kooperationen essentiellen Moleküle wie CD40-Ligand und Fas-Ligand exprimierten. Zudem konnten im Tumorgewebe vor allem TH2/3-Typ Cytokine (IL10, IL13, TGFb1) nachgewiesen werden, die ebenfalls das Tumorwachstum in vitro positiv beeinflussen können. Um in Zukunft spezifischere Untersuchungen zu den Wechselwirkungen zwischen Tumor-B-Zellen und TITLs durchführen zu können, wurde abschließend ein Zellkultursystem ent-wickelt, mit dessen Hilfe es möglich sein wird das Tumormikromilieu in vitro spezifisch zu simulieren, um so das Verhalten der Tumor-B-Zellen auch ex vivo beobachten und analysieren zu können. Die Daten dieser Arbeit geben einen vertieften und verbesserten Einblick in die tumorspezifischen Mechanismen und ermöglichen den Entwurf eines neuen detaillierteren Mo-dells zur Tumorentstehung und -progression von niedrig-maligne MALT-Typ Lymphomen. N2 - B-cell lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) arise in sites primarily devoid of lymphoid tissue, preferentially in the stomach preceded by a chronic inflammation associated with H. pylori infection. Previous studies suggested that the tumor cells are the malignant counterpart of memory B-cells and express functional antigen receptors on their cell surfaces with autoantigenic reactivity. In the present work the molecular structure of the tumor antigen receptor was described more detailed in several cases of gastric MALT-type lymphomas and compared with recently published data from normal B-cells and different tumor entities. These findings clearly showed the existence of mono- as well as biclonal B-cell lymphomas. However, in contrast to recent molecular data derived from salivary gland MALT-type lymphomas, no VH-gene restriction was found. The tumorspecific VH-gene analyses confirmed the memory B-cell phenotype of the tumor cells at the DNA level. Furthermore, it is likely that the tumor B-cells passed several rounds of maturation cycles in the germinal centres because of their mutation pattern in the hypervariable region of the antigen receptor. By comparing clonality of the tumors it became obvious that those lymphomas showing the t(11;18)(q21;q21) translocation were directed towards (mono-)clonality. Therefore this translocation appears to represent a major progression event in tumor establishment. Because at least low-grade MALT-type B-cell lymphoma growth is depended on the local microenvironment, the tumorinfiltrating T-lymphocytes (TITL) were investigated in detail. In the tumor tissue CD4+ TITLs were found predominantly which were activated (CD69+) as well as immuncompetent (CD28+) and express CD40-Ligand and Fas-Ligand, two molecules which play a keyrole in T/B-cell interactions in germinal centre reaction. In addition, TH2/3 cytokines (IL10, IL13, TGFb1) were detected in the tumor tissue. These cytokines were shown to stimulate the tumor growth in vitro. Therefore it will be mandatory to engage CD40-Ligand and FAS-Ligand simultaneously for further detailed investigations of early steps of tumor development. An in vitro system will offer the possibility to investigate and analyse the behaviour of tumor B-cells ex vivo and compare t(11;18) positive and negative cases and thus lead to a biological based model of tumor-development and -progression of low-grade MALT-type lymphomas. KW - MALT KW - B-Zell-Lymphom KW - Carcinogenese KW - Molekularbiologie KW - MALT-Typ Lymphom KW - VH-Mutationsanalysen KW - T/B-Zellinteraktion KW - Keimzentrumsreaktion KW - Marginalzone KW - TITL KW - t(11;18)(q21;q21) KW - TH2-Typ Cytokine KW - MALT-type lymphoma KW - VH-mutations KW - T/B-cell-interaction KW - germinal centre KW - marginal zone KW - TITL KW - t(11;18)(q21;q21) KW - TH2-type cytokine Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1586 ER - TY - THES A1 - Knödel, Matthias T1 - Regulation der terminalen B-Zell-Differenzierung durch Blimp-1 T1 - Regulation of B cell terminal differentiation by Blimp-1 N2 - Nach Aktivierung differenzieren B-Zellen entweder direkt zu IgM sezernierenden Plasmazellen oder treten in den Differenzierungsweg zur Gedächtniszelle ein, der sowohl durch die Affinitätsreifung als auch den Klassensprung zu sekundären Immunglobulin-Isotypen gekennzeichnet ist. Welchen Weg die B-Zelle durchläuft, ist abhängig von der Intensität und der Dauer des BZR-Signals, von der Verfügbarkeit und der Art der T-Zell-Hilfe und von weiteren Signalen in der speziellen Mikroumgebung des Keimzentrums. Der Transkriptionsfaktor Blimp-1 ("B lymphocyte induced maturation protein 1") wird als ein „Mastergen“ der terminalen B-Zell-Differenzierung betrachtet und ist in der Lage, die komplexen Differenzierungsprozesse zu Ig-sezernierenden Plasmazellen auszulösen und voranzutreiben. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit identifizieren Blimp-1 als wichtigen Regulator, der bestimmt, ob eine B-Zelle zur Plasmazelle oder zur Gedächtniszelle differenziert. Unter Verwendung ruhender, primärer B-Zellen der Maus, die in vitro mit Interleukin-4 (IL-4), anti-mF(ab´)2 oder anti-CD40 in verschiedenen Kombinationen sowohl in An- als auch in Abwesenheit von LPS stimuliert wurden, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die IgM-Sekretion und die Expression von Blimp-1 durch Signalgebung über den BZR oder CD40 und durch IL-4 entweder nicht induziert oder sogar unterdrückt wird. Die Zugabe von IL-2 und IL-5 induziert die Expression von Blimp-1 und erleichtert die Sekretion von IgM und IgG1 in diesem System. Gleiches kann durch direkte Transduktion der B-Zellen mit rekombinanten Retroviren erreicht werden, die für Blimp-1 codieren. Auf der anderen Seite wird der durch IL-4 induzierte Klassensprung nach IgG1 durch Blimp-1 gehemmt. Blimp-1 bewirkt daher ein Umschalten des B-Zell-Differenzierungsweges von der Gedächtniszelle zur Plasmazelle. Die Unterdrückung der Expression von Blimp-1 sowohl durch Antigen-BZR-Wechselwirkungen als auch durch die von T-Helferzellen abhängige Signalgebung über CD40 und IL-4 unterdrückt die terminale Differenzierung zur Plasmazelle und ist für den Eintritt und das Durchlaufen des Gedächtniszell-Differenzierungsweges notwendig. Zur Identifikation von Genen, deren Expression durch Blimp-1 direkt oder indirekt beeinflusst wird, wurde Blimp-1 in WEHI 231 B-Lymphomzellen unter Verwendung rekombinanter Retroviren überexprimiert. Messika et al. zeigten, dass die Überexpression von Blimp-1 in B-Lymphomzellen in Abhängigkeit vom Reifungsstadium der Zelle entweder einen Wachstumsnachteil, gefolgt vom Zelltod, induziert oder zur terminalen Differenzierung führt. Obwohl WEHI 231 Zellen unreife, d.h. sIgM+ B-Zellen repräsentieren, exprimieren Blimp-1 transduzierte WEHI 231 Zellen die J-Kette, zeigen eine erhöhte Konzentration der für die sekretorische Form der my-Kette codierenden mRNA, exprimieren den Plasmazellmarker Syndecan-1 auf ihrer Oberfläche und sezernieren für kurze Zeit IgM. Diese Differenzierungsprozesse gehen allerdings mit einem Wachstumsnachteil und Zellzyklus-Arrest, gefolgt vom Zelltod, einher. Blimp-1 exprimierende WEHI 231 Zellen zeigen somit den Phänotyp kurzlebiger Plasmazellen. Eine Langzeitkultur Blimp-1+ WEHI 231 Zellen führt zum Verlust des differenzierten Phänotyps, d.h der Erhalt IgM-sezernierender WEHI 231 Zellen ist nicht ohne weitere Maßnahmen möglich. Auf molekularer Ebene hemmt Blimp-1 die Expression von c-myc und diejenige des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes A1, stimuliert aber die Expression von mad4. Die Verschiebung des Verhältnisses von Myc/Max- zu Mad/Max-Heterodimeren zugunsten von Mad/Max-Komplexen und die daraus resultierende Inhibition der Transkription von Myc-abhängigen, proiliferationsfördernden Genen ist in vielen Systemen als von zentraler Bedeutung für die Initiation von Differenzierungsprozessen beschrieben und wurde auch bereits für B-Zellen diskutiert. Auch in primären B-Zellen führt Blimp-1 zu einer verstärkten Expression von mad4. Wird der durch Blimp-1 bewirkte Verlust der Expression von A1 durch dessen Überexpression in Blimp-1+ WEHI 231 Zellen kompensiert, so überleben diese Zellen wieder erheblich länger, bleiben aber weiterhin im Zellzyklus arretiert. Der differenzierte Phänotyp, charakterisiert durch die verstärkte Expression von mad4 und der Sekretion von IgM, wird dabei aufrechterhalten. Wachstumsnachteil und Zelltod können in diesem System daher entkoppelt werden. In primären Zellen führt Blimp-1 ebenfalls zur Erniedrigung der A1 Expression. Da diese Zellen aber nicht in dem Maße wie WEHI 231 Zellen absterben, kann der Verlust von A1 offensichtlich besser kompensiert werden. Die Lebensdauer einer Blimp-1+ Plasmazelle ist somit durch Manipulation der Expression von antiapoptotischen Molekülen wie A1 verlängerbar. N2 - Blimp-1 (“B lymphocyte-induced maturation protein 1”) is a zinc-finger containing transcription factor that drives B-cell terminal differentiation to immunoglobulin-secreting plasma cells. Following stimulation, primary B cells either directly undergo terminal differentiation to IgM secreting plasma cells, thus providing a rapidly established source of neutralizing antibodies, or enter the memory pathway characterized by affinity maturation and isotype switching. Which of the various fates is adopted by the B cells is determined by the strength and the duration of the BCR-signal, the availability and the quality of T cell help and other signals derived from the microenvironment of the germinal center. High rate secretion is correlated with endogenous Blimp-1 levels and can be caused by ectopic expression of Blimp-1, suggesting that Blimp-1 is a master gene which is able to initiate and maintain the complex terminal differentiation program. Using cultures of resting primary mouse B cells stimulated in vitro in various combinations with interleukin-4 (IL-4), anti-mF(ab´)2 or anti-CD40 in the absence or presence of LPS, it is shown that IgM secretion and the expression of Blimp-1 is either not induced or even suppressed by BCR or CD40 ligation and by IL-4. Additional treatment with IL-2 and IL-5 induces Blimp-1 expression and facilitates IgM and IgG1 secretion, which can also be achieved by retroviral transduction of Blimp-1. In contrast, the increase in sIgG1+ cells with time in presence of IL-4 is greatly diminished in cells forced to express Blimp-1, suggesting that Blimp-1 inhibits further class-switching. Therefore, Blimp-1 expression takes B cells out of the memory pathway and initiates the terminal differentiation program. On the other hand, suppression of Blimp-1 by antigen-BCR interaction and T helper cell dependent CD40 and IL-4 signalling is necessary to facilitate entrance into the memory pathway and to prevent terminal differentiation. To identify genes whose expression is influenced by Blimp-1, WEHI 231 B lymphoma cells were retrovirally transduced with Blimp-1. Overexpression of Blimp-1 in B lymphoma cells has been reported to induce either growth arrest and cell death or immunoglobulin secretion and terminal differentiation, depending on the developmental stage of the recipient lymphomas. Surprisingly, Blimp-1 transduced immature WEHI 231 cells produce J chain, increased levels of the secretory form of my heavy chain mRNA, express the plasma cell marker syndecan-1 on their surface and secrete IgM for a short period of time. Concomitantly, they exhibit a distinct growth disadvantage with cell cycle arrest, followed by cell death. Thus, Blimp-1+ WEHI 231 cells aquire the phenotype of short-lived plasma cells. However, this differentiated phenotype of Blimp-1+ WEHI 231 cells was transient and not longer observed after long term culture. On the molecular level, Blimp-1 transduced WEHI 231 cells exhibit altered ratios of c-myc/mad4 mRNA levels and a reduction in the expression of the anti-apoptotic bcl-2 family member A1. It is known from several experimental systems that induction of transcripts of the mad family and therefore a change in favor of mad/max rather than myc/max complexes favors differentiation over proliferation. An important role for the myc/max/mad network in B cell proliferation, differen-tiation and apoptosis has recently been discussed by Melchers. The upregulation of mad4 expression by Blimp-1 is also observed in primary B cells. To determine whether A1 downregulation is causally involved in the short live span of Blimp-1+ WEHI 231 cells, sublines overexpressing A1 were established by retroviral transduction. Additional ectopic expression of A1 greatly extends the life span of Blimp-1 expressing WEHI 231 cells but does not overcome their block in cell cycle transition. Therefore, the proliferative disadvantage of Blimp-1 transduced cells can be separated from cell death in this system. A1+ Blimp-1+ WEHI 231 cells still show the differentiated phenotype characterized by IgM secretion and increased mad4 expression. In primary B cells, Blimp-1 also leads to a decrease in the expression of A1. However, the loss of A1 can be compensated in primary B cells since Blimp-1 expression does not lead to a comparable cell death as observed in WEHI 231 cells. These data suggest that levels of A1 and other anti-apoptotic molecules may determine the checkpoint between death and survival of Blimp-1 expressing B cells. KW - B-Lymphozyt KW - Zelldifferenzierung KW - Genregulation KW - Blimp-1 KW - B-Zellen KW - terminale Differenzierung KW - A1 KW - WEHI 231 KW - retroviraler Gentransfer KW - IL-4 KW - CD40 KW - Plasmazellen KW - Gedächtniszellen KW - Blimp-1 KW - B cells KW - terminal differentiation KW - A1 KW - WEHI 231 KW - retroviral gene transfer KW - IL-4 KW - CD40 KW - plasma cells KW - memory cells Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1571 ER - TY - THES A1 - Klagge, Ingo M. T1 - Interaktion von Masernviren mit humanen Dendritischen Zellen T1 - Interaction of Measles Virus with human Dendritic Cells N2 - Das Masernvirus ist ein Mitglied der Familie der Paramyxoviridae. Obwohl eine wirksame attenuierte Lebendvakzine erhältlich ist, bleiben Masern eine bedeutende virale Infektionserkrankung, die jährlich ca. eine Millionen Opfer fordert. Trotz einer während der Infektion induzierten protektiven und MV-spezifischen Immunantwort, ruft MV eine generelle Immunsuppression hervor, die zu einer Störung der zellulären Immunantwort führt. Diese Immunsuppression begünstigt bakterielle und virale Superinfektionen, was vor allem in unterentwickelten Ländern begleitet von mangelhafter ärztlicher Versorgung und Unternährung zu einem fatalen Ausgang einer MV-Infektion führt. Die molekularen Grundlagen der MV-assoziierten Immunsuppression sind noch nicht ausreichend verstanden. Dendritische Zellen (DC) gelten als ein Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort. Sie sind entscheidend an der Auslösung einer primären, adaptiven T-Zellantwort beteiligt und könnten im Falle einer MV-Infektion somit sowohl eine Rolle in der Induktion der protektiven Immunantwort als auch in der Etablierung der MV-assoziierten Immunsuppression spielen. Tatsächlich sind DC, die in vitro aus humanen Monozyten des peripheren Bluts (MoDC) generiert wurden, durch MV-Stämme infizierbar. Dabei zeigten sogenannte Wildtypstämme im Vergleich mit Vakzinestämmen eine schnellere Inektionskinetik einhergehend mit einem stärkeren zytopathischen Effekt (CPE) in den MoDC-Kulturen. Zudem konnte festgestellt werden, dass eine Infektion der MoDC-Kulturen zu einer Aktivierung und Ausreifung der Zellen führte, wobei es zur Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen kam. Neben Tumornekrosefaktor alpha (TNF-a) konnte Typ I-Interferon (IFN) nachgewiesen werden, das die Expression des kostimulatorischen Oberflächenmoleküls CD86 induzierte. MV-Infektionen beeinflussten zudem die Sekretion von Interleukin 12 (IL-12), das als ein Schlüsselzytokin für die Polarisierung von T-Zellantworten angesehen wird. Infektionen mit einem prototypischen MV-Vakzinestamm (ED-B) führten unter allen Stimulationsbedingungen zu einer Hemmung oder deutlichen Reduktion der sezernierten Mengen IL-12. Eine Infektion mit dem Wildtypstamm WTF hingegen induzierte bereits ohne weitere Stimulation der MoDC IL-12 und verstärkte die Sekretion an IL-12 nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS). Trotz der zu beobachtenden Aktivierung der MoDC nach Infektion mit MV zeigten diese MoDC-Kulturen in einem funktionellen Test, einer allogenen mixed leukocyte reaction (MLR), keine Stimulation der T-Zellproliferation. Es zeigte sich, dass das Ausbleiben der T-Zellproliferation mit der Zahl an MV-infizierten MoDC korrelierte. MV-infizierte MoDC-Kulturen hemmten zudem die Proliferation von T-Zellkulturen, die mit Phytohämagglutinin (PHA) oder mit Staphylococcusenterotoxin A (SEA) aktiviert worden waren. Diese dominant hemmende Wirkung MV-infizierter MoDC-Kulturen unterblieb, wenn rekombinante MV eingesetzt wurden, denen die MV-spezifischen Glykoproteine H und F fehlten. N2 - Measles virus (MV) is a member of the paramyxoviridae. Despite the existence of a effective attenuated life vaccine measles still remains a important infectious disease which causes the death of over one million people each year. Although a protective and MV-specific immune response is generated during the infection MV induces a profound general immunosuppression disturbing the cellular immune system. This immunosuppression favours bacterial and viral secondary infections which especially in developing countries when accompanied by insufficient medical care and malnutrition leads to a fatal outcome of MV infections. The molecular basis underlying this MV-associated immunosuppression is hardly understood. Dendritic cells (DC) are now seen as a link between the innate and the adaptive immune system. They are decisively involved in the induction of a primary adaptive T cell response. In the case of MV infection DC might play a role both in establishing a MV specific and protective immune response and in inducing the MV-associated immunosuppression.. Indeed, DC generated in vitro using human monocytes from peripheral blood (MoDC) can be infected with MV strains. Compared with vaccine strains so called wildtype strains showed faster infection kinetics and a more pronounced cytopathic effect (CPE) in infected MoDC cultures. Additionally, infection of MoDC cultures led to activation and maturation of the cells resulting in upregulation of costimulatory molecules and secretion of proinflammatory cytokines. Besides tumour necrosis factor alpha (TNF-a) type I interferon (IFN) could be found which induced the expression of the costimulatory surface molecule CD86. Furthermore, MV infection influenced the secretion of interleukin 12 (IL-12) which is recognised as being a key regulator in the polarisation of T cell responses. Infections with the prototypic vaccine strain ED-B resulted in a drastic reduction or repression of the amount of IL-12 released under all conditions tested. Instead, a infection with the MV wildtype strain WTF induced IL-12 secretion by MoDC without additional stimulation and enhanced the secretion of IL-12 after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). In spite of the observed activation of MoDC after infection with MV in a functional assay, the allogenic mixed leukocyte reaction (MLR), these cultures induced no T cell proliferation. The lack of T cell proliferation correlated with the number of MV-infected MoDC. In addition, MV-infected MoDC cultures blocked the proliferation of T cell cultures stimulated with phytohemagglutinin (PHA) or staphylococcus enterotoxin A (SEA). This dominant inhibitory effect was absent when MoDC cultures were infected with recombinant MV lacking the MV specific glycoproteins H and F. KW - Dendritische Zelle KW - Masernvirus KW - Masernvirus KW - Dendritische Zellen KW - Immunsuppression KW - IL-12 KW - MLR KW - Glykoproteine KW - measles virus KW - dendritic cells KW - immunosuppression KW - IL-12 KW - MLR KW - glycoproteins Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180982 ER - TY - THES A1 - Kemmer, Gabriele T1 - Charakterisierung der initialen Aufnahme des Kofaktors V (NAD) bei Haemophilus influenzae T1 - Characterization of the initial uptake of the cofactor V (NAD) in Haemophilus influenzae N2 - H. influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium und wird in die Familie der Pasteurellacaea eingeordnet. Das Bakterium zeigt Auxotrophien für Hämin unter aeroben Bedingungen und für Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) bei aeroben wie anaeroben Wachstum. Es können zwei Unterarten unterschieden werden: die bekapselten Stämme, die systemische Erkrankungen hervorrufen und die unbekapselten bzw. nicht-typisierbaren Stämme, die für Oberflächeninfektionen verantwortlich sind. Da bei H. influenzae bisher nur wenig über die NAD-Aufnahme bekannt war, sollten in dieser Arbeit Proteine identifiziert und charakterisiert werden, die an der NAD-Aufnahme beteiligt sind. Das Außenmembranprotein e(P4), kodiert von dem hel-Gen, wurde als eine Komponente des Häminaufnahmesystems beschrieben. In dieser Arbeit wurde eine hel-Deletionsmutante hergestellt, anhand der nachgewiesen wurde, daß e(P4) als saure Phosphatase nicht an der Hämin-, sondern an der NAD-Aufnahme beteiligt ist. Mit Hilfe von verschiedenen Phosphatase-Assays und dem Malat-Enzym-Assay konnten NADP und Nikotinamid-Mononukleotid (NMN) als physiologisch relevante Substrate identifiziert werden. Die biologische Relevanz von e(P4) für die NAD-Aufnahme wurde durch Mutantenanalyse in Wachstumstests und Transport-Assays nachgewiesen. Es wurde gezeigt, daß die hel-Deletionsmutante mit NAD und NMN ein signifikantes Wachstumsdefizit hatte und nicht fähig war, beide Nikotinamid-Nukleotid-Quellen aufzunehmen, während die Nutzung von Nikotinamid-Ribosyl (NR) keinen Unterschied zum Wildtyp aufwies. Um die Frage zu klären, ob die Lokalisation von e(P4) als Lipoprotein an der Außenmembran wichtig für die NMN-Spaltung ist, wurden zwei Mutanten hergestellt, bei denen im hel-Gen der Lipidanker Cystein durch ein Glycin ausgetauscht wurde, um das Protein im Periplasma zu exprimieren. Die Periplasma-Extrakte dieser Cystein-Mutanten zeigten in Phosphatase-Assays keine Aktivität. Um zu untersuchen, ob die Phosphatase-Aktivität die einzige für die NAD-Aufnahme relevante Funktion von e(P4) ist, wurden Phosphatase-Mutanten hergestellt und charakterisiert. Sie exprimierten ein mutiertes e(P4)-Protein, das durch einen Aminosäureaustausch die Phosphatase-Aktivität verloren hatte. Es zeigte sich, daß die Phänotypen der Phosphatase-Mutanten in Bezug auf die Fähigkeit NMN zu spalten, NAD und NMN aufzunehmen und als Faktor V-Quelle zum Wachstum zu nutzen, exakt mit den Phänotypen der Deletionsmutante korrelierten. Es konnten daher keine weiteren Funktionen von e(P4) festgestellt werden. Das periplasmatische Protein NadN wurde als Pyrophosphatase beschrieben, die fähig ist, NAD zu NMN zu hydrolysieren. Weiter wurde eine 5´-Nukleotidase-Aktivität nachgewiesen, mit der NadN NMN zu NR dephosphorylieren kann. Die Relevanz von NadN für die NAD-Aufnahme wurde anhand einer nadN-Knockout-Mutante untersucht. In Wachstumskurven und Transport-Assays zeigte sich, daß die nadN-Mutante nicht fähig war, NAD aufzunehmen und zum Wachstum zu verwenden. Auch die Nutzung von NMN war bei der Mutante eingeschränkt, während mit NR als Faktor V-Substrat kein Unterschied zum Stamm Rd erkennbar war. Durch die Charakterisierung einer hel nadN-Doppelmutante konnte nachgewiesen werden, daß keine weiteren Enzyme außer e(P4) und NadN an der Prozessierung von NAD zu NR beteiligt sind. Es zeigte sich auch, daß nur NR über einen putativen Transporter ins Zytoplasma aufgenommen wird. Das Protein OmpP2 stellt ein Hauptporin der äußeren Membran dar. Durch eine ompP2-Deletionsmutante konnte mit Hilfe von Wachstumskurven und Transport-Assays nachgewiesen werden, daß NAD, NMN und NR durch diese Pore ins Periplasma diffundieren. N2 - H. influenzae is a facultativ anaerobic, Gram-negative bacterium and belongs to the familiy of Pasteurellaceae. This bacterium shows auxotrophies for hemin under aerobic conditions and for nicotinamid adenine dinucleotide (NAD) at aerobic and anaerobic growth. Two subspecies are distinguishable: the encapsulated strains, the causative agents for systemic and invasive diseases and the unencapsulated or nontypeable strains, responsible for inflammation of the respiratory tract. In H. influenzae little is known about the utilization of NAD, therefore this work was aimed to identify and characterize gene products which are involved in the uptake of NAD. The outer membrane protein e(P4), encoded by the gene hel, was described as a component of the hemin uptake system. In this work a hel deletion mutant was constructed to proof that the acid phosphatase e(P4) is not involved in the uptake of hemin but in the uptake of NAD. With the aid of different phosphatase assays and the maleic enzyme assay NADP and NMN could be identified as the physiological relevant substrates. The biological relevance of e(P4) was proofed by mutant analysis in growth tests and transport assays. It was shown that the hel deletion mutant had a significant growth deficiency with NAD and NMN and was not able to take up both nicotinamide nucleotide sources, whereas the utilization of nicotinamide ribosyl (NR) showed no difference compared to the wildtype. To address the question, wether the localization of the lipoprotein e(P4) at the outer membrane is important for the hydrolysis of NMN, two mutants were constructed which had a Cystein-Glycin replacement in the lipid anchor of the hel gene to express the protein in the periplasm. The periplasm extracts of these Cystein mutants showed no activity in phosphatase assays. To investigate wether the phosphatase acitivty of e(P4) is the only relevant function for the uptake of NAD, phosphatase mutants were constructed and characterized. They expressed a mutated e(P4) protein which had lost the phosphatase activity by an amino acid replacement. The phenotypes of the phosphatase mutants correlated exactly with the phenotype of the deletion mutant concerning the ability to cleave NMN, to take up NAD and NMN and to use them as factor V sources. The periplasmic protein NadN was described as a pyrophosphatase which is able to hydrolase NAD to NMN. Further a 5´-nucleotidase function was identified enabling NadN to dephosphorylate NMN to NR. The relevance of NadN for the utilization of NAD was investigated with a nadN knockout mutant. Growth curves and transport assays revealed that the nadN mutant was not able to take up NAD and to use it for growth. The utilization of NMN was reduced, whereas the utilization of NR showed no difference compared to the wildtype. By characterizing a hel nadN double mutant it was shown that no further enzymes than e(P4) and NadN are involved in the processing of NAD to NR and that only NR is taken up into the cytoplasm through a putativ transporter. The protein OmpP2 is the major porin of the outer membrane. Growth curves and transport assays with an ompP2 deletion mutant revealed that NAD, NMN and NR diffuse through this porin into the periplasm. KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - Pyrophosphatase KW - 5`-Nukleotidase KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - pyrophosphatase KW - 5`-nucleotidase Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1548 ER - TY - THES A1 - Jármy, Gergely T1 - Herstellung und Anwendungen eines replikationsinkompetenten lentiviralen Vektorsystems N2 - Aufgrund ihrer Charakteristika stellen die Lentiviren besonders gut geeignete Vektoren für den Gentransfer in eukaryotische Zellen dar. Lentivirale Vektoren sind in der Lage ruhende und sich nicht teilende Zellen zu infizieren und ihr genetisches Material in das Zielzellgenom zu integrieren. Dies führt zu einer stabilen Expression des Zielgens in den infizierten Zellen und deren Tochterzellen. In den vergangenen Jahren wurden eine Reihe replikationsinkompetenter lentiviraler Vektoren für verschiedene Studien, meist für gentherapeutische Ansätze, hergestellt. Replikationsinkompetente Vektoren sind in der Lage Zielzellen einmalig zu infizieren, können aber in den Zielzellen nicht weiter replizieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf HIV-1 basierendes replikationsinkompetentes Vektorsystem etabliert. Mit Hilfe des replikationsinkompetenten Vektorsystems wurde eine rasch durchführbare phänotypische Resistenztestung etabliert, welche für die Messung der Sensitivität von HIV gegen antivirale Inhibitoren geeignet ist. Die Transduktionseffizienz wurde durch den Einbau eines Markergens in das Vektorsystem untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass mit dem Vektorsystem Zielzellen mit hoher Effizienz transduziert werden können. Inhibitoren gegen die virale Protease, Reverse Transkriptase und Integrase waren in der Lage die Transduktion auf konzentrationsabhängige Weise zu reduzieren. In das Vektorsystem konnten PR- und RT-Sequenzen sowohl von viralen Isolaten als auch von Patienten eingesetzt werden und deren Sensitivität bzw. Resistenz gegen die zur Zeit zur Verfügung stehenden Medikamente konnten nachgewiesen werden. Da das hergestellte Vektorsystem den wichtigen Sicherheitsmaßnahmen entspricht, stellt dieses eine sichere Alternative zur Testung der Wirksamkeit von antiviralen Substanzen bei HIV-infizierten Patienten dar. Unter Verwendung des replikationsinkompetenten Vektorsystems konnte die Testung unter biologischer Sicherheitstufe 2 innerhalb von zwei Wochen ausgeführt werden. Damit wurden die bislang zur Verfügung stehenden phänotypischen Resistenztestungen deutlich verbessert. In dieser Arbeit wurde außerdem untersucht, ob das Foamyvirus (FV) Hüllprotein (Env) in der Lage ist, lentivirale Partikel zu pseudotypisieren und welche Bereiche des Hüllproteins für die Pseudotypisierung notwendig sind. Es wurde festgestellt, dass HIV-Kapside mit dem Hüllprotein des Felinen Foamyvirus (FFV) mit sehr hoher Effizienz pseudotypisiert werden können. Das Hüllprotein der Primaten Foamyviren konnte die Pseudotypisierung von lentiviralen Partikel nicht unterstützen. Mit Hilfe verschiedener Mutanten wurde gezeigt, dass bei der Pseudotypisierung das Signalpeptid (SP) eine wichtige Rolle spielt. Die Unterschiede in der Effizienz der Pseudotypisierung zwischen Hüllproteinen von FV verschiedener Spezies wurden primär durch das jeweilige SP bedingt. Aufgrund seines breiten Wirtsspektrum und der Konzentrierbarkeit bietet das FFV-Env eine attraktive Alternative zu herkömmlich verwendeten Hüllproteinen bei der Produktion und Anwendung von HIV-Vektoren. N2 - Vectors based on lentiviruses are highly efficient vehicles for gene transfer approaches. The principle advantages of lentiviral vectors include the infection of nondividing cells, integration into the host cell genome, high level of gene expression and transmission to all the progeny of the infected cell. Within the last years many replication-defective lentiviral vectors have been developed. Replication-defective vectors infect cells, but can not replicate after infection. In the course of these studies a self-inactivating replication-defective vector system derived from the human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) with enhanced biosafety features was constructed. The vector system was used to develop a rapid and easy phenotypic drug resistance assay to detect and measure emerging resistance of HIV against antiviral drugs. The vector system contains a reporter gene for rapid quantification of transduced target cells. The vector proved highly efficient for transducing target cells. Reporter gene transduction could be inhibited with nucleoside and non-nucleoside reverse transcriptase (RT) inhibitors, integrase (IN) and protease (PR) inhibitors in a dose dependent manner. Protease (PR) and reverse transcriptase (RT) gene coding sequences derived either from proviral isolates or from HIV-infected patients could be inserted into this vector system. Both sensitivity and resistance against currently used antiviral drugs could be detected. Due to the biosafety features of the vector system this novel drug resistance assay represents a rapid and easy method without the need for propagation of infectious virus. In the course of these studies was also studied whether capsids of the HIV-1 can be pseudotyped with wild-type and chimeric foamy virus (FV) envelope proteins from virus isolates derived from different species. Further, it was analysed which domains of the FV envelope play a role in pseudotyping HIV capsids. HIV capsids could be efficiently pseudotyped with feline foamy virus (FFV) envelope protein. The primate foamy virus envelope was not able to support the export of lentiviral capsides. The experiments with the chimeric mutants revealed that the signal peptid plays a key role in pseudotyping. Due to the unique properties of the FFV envelope, including the broad host range and the ability to tolerate concentration of viral particles by ultracentrifugation, pseudotyping of HIV capsids with this envelope might provide a useful tool for future gene transfer approaches. KW - Vektor KW - Lentiviren KW - HIV Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181304 ER - TY - THES A1 - Lührmann, Anja T1 - Analyse der Reifung von Afipien- und Rhodokokken-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen T1 - Analysis of the maturation of Afipia- and Rhodococcus-containing phagosomes in macrophages N2 - Die Isolierung von Phagosomen ermöglicht die biochemische Analyse der Phagosomen-Zusammensetzung sowie der an der Phagosomenreifung beteiligten Moleküle. Deshalb wurde im Rahmen dieser Promotionsarbeit eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, Bakterien-enthaltende Phagosomen zu isolieren. Diese Methode erzielt im Vergleich zu anderen in der Literatur beschriebenen Methoden eine gute Ausbeute (fast 40 Prozent) und vor allem eine höhere Reinheit an Bakterien-enthaltenden Phagosomen. So besteht keine Kontamination mit Teilen des Golgi-Apparates und nur eine sehr geringe Kontamination mit endosomalen und lysosomalen Proteinen sowie Plasmamembranbestandteilen. Allerdings wurde eine Kontamination mit Mitochondrien und ER detektiert. Letzteres muss nicht unbedingt eine Kontamination darstellen, sondern könnte ein wichtiger Bestandteil von Phagosomen sein. Afipia felis ist ein Gram-negatives Bakterium, das für einige Fälle der Katzen-Kratz Krankheit verantwortlich ist. Es kann innerhalb von Makrophagen überleben und sich vermehren. Die genaue Kompartimentierung der Afipia felis-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen war allerdings unbekannt und sollte deshalb in der vorliegenden Promotionsarbeit analysiert werden. Ovalbumin Texas Red, mit dem Lysosomen vor der Infektion markiert wurden, gelangt nicht in die Afipien-enthaltenden Phagosomen, und die Afipien-enthaltenden Phagosomen sind auch nicht zugänglich für Ovalbumin Texas Red, mit dem das gesamte endozytische System nach der etablierten Infektion markiert wurde. Außerdem sind etablierte, isolierte Afipia felis-enthaltende Phagosomen nur in geringem Umfang positiv für spät endosomale/lysosomale Markerproteine und negativ für früh endosomale Markerproteine. Die Afipien, die ein nicht endozytisches Kompartiment etablieren, werden vom Makrophagen in ein EEA1-negatives Kompartiment aufgenommen, das auch zu späteren Zeitpunkten negativ für LAMP-1 ist. Nur die circa 30 Prozent der Afipien, die sich in einem Kompartiment befinden, das zum endozytischen System gehört, gelangen nach der Aufnahme durch den Makrophagen in ein EEA1-positives Kompartiment, das zu einem späteren Zeitpunkt positiv für LAMP-1 wird. Tötung der Afipien oder Opsonisierung mit Antikörpern vor der Infektion normalisiert die Reifung der Afipia felis-enthaltenden Phagosomen in den J774E-Makrophagen. Somit konnte nachgewiesen werden, dass die Mehrzahl der Phagosomen (70 Prozent), die Afipia felis enthalten, nicht zum endozytischen System gehören. Diese ungewöhnliche Kompartimentierung besteht bereits bei der Aufnahme und kann nur von lebenden Afipien etabliert werden. Rhodococcus equi ist ein Gram-positives Bakterium, das unter anderem Bronchopneumonien beim Fohlen verursacht. Aber auch Menschen und andere Säugetiere sind von Infektionen mit R. equi betroffen. Die Fähigkeit der Rhodokokken, innerhalb der Makrophagen zu überleben und sich zu vermehren, ist mit dem Vorhandensein eines 85 kbp Plasmids assoziiert. Da über die genaue Kompartimentierung von R. equi im Mausmakrophagen wenig bekannt war, und der Frage, ob es einen Unterschied zwischen der Kompartimentierung von R. equi(+)- und R. equi(-)-enthaltenden Phagosomen gibt, noch nicht nachgegangen wurde, war beides Thema dieser Promotionsarbeit. Dabei zeigt sich, dass R. equi(-)-enthaltende Phagosomen wesentlich stärker mit den spät endosomalen/lysosomalen Markerproteinen vATPase und LAMP-1 assoziiert sind sowie eine höhere ß-Galaktosidase-Aktivität aufweisen als die R. equi(+)-enthaltenden Phagosomen. Da sowohl die isolierten R. equi(-)- als auch die R. equi(+)-enthaltenden Phagosomen mit dem früh endosomalen Markerprotein rab5 assoziiert sind, ist anzunehmen, dass Rhodokokken unabhängig vom Vorhandensein des 85 kbp Plasmids in der Lage sind, die Phagosomenreifung zu verzögern. Aber R. equi(-) kann die Reifung zwar verzögern, aber letztendlich nicht verhindern. Wahrscheinlich reifen die Phagosomen, die R. equi(-) enthalten, zu einem späteren Zeitpunkt zu Phagolysosomen, wohingegen R. equi(+) ein ungewöhnliches Kompartiment etabliert und dadurch die Phagosomenreifung endgültig zu verhindern scheint. Somit ist anzunehmen, dass mindestens ein vom 85 kbp Plasmid kodiertes Molekül für die Etablierung dieses ungewöhnlichen, R. equi(+)-enthaltenden Kompartimentes, verantwortlich ist. Da eine Infektion mit Rhodococcus equi zytotoxisch für die infizierte Zelle sein kann, wurde die von den Rhodokokken vermittelte Zytotoxizität näher analysiert. Die in dieser vorliegenden Promotionsarbeit dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, dass nur die Plasmid-enthaltenden Rhodokokken zur Nekrose, aber nicht zur Apoptose ihrer Wirtszellen führen, während R. equi(-) keinen Einfluss auf die Vitalität ihrer Wirtszellen haben. Dieses Phänomen ist allerdings abhängig vom Wirtszelltyp. So sind R. equi(-) als auch R. equi(+) für humane Monozyten nur geringfügig zytotoxisch. N2 - The isolation of phagosomes from phagocytes enables their fine biochemical analysis as well as the determination of the role of various molecules in phagosome biogenesis. Therefore, a method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages has been established in this study. In comparison with previously described methods a good yield (40 per cent) and a higher level of purity of bacteria-containing phagosomes were obtained using this phagosome isolation method. No Golgi-derived contamination and only very little endosomal or lysosomal and plasma membrane-derived contaminations was found. Furthermore, some mitochondrial and ER contaminations were detectable. Afipia felis is a Gram-negative bacterium that causes some cases of human Cat Scratch Disease. It can survive and multiply in macrophages, but the precise intracellular compartimentalization of Afipia felis-containing phagosomes is unknown. In this study we show evidence, that 70 per cent of Afpia felis-containing phagosomes do not belong to the endocytic pathway. This is supported by the facts that neither did ovalbumin preloaded into lysosomes enter most Afipia felis-containing phagosomes, nor did ovalbumin loaded into the endocytic system after infection. Furthermore the percentage of isolated Afipia felis-containing phagosomes positive for late endosomal/lysosomal markerproteins were very low and early endosomal marker proteins were rarely detectable. Those bacteria that were to be found in a nonendosomal compartment entered the macrophage via an EEA1-negative compartment, which remained negative for LAMP-1. The small population of Afipia felis whose phagosomes were part of the endocytic system entered into an EEA1-positive compartment which also subsequently acquired LAMP-1. Killing of Afipia felis or opsonization with antibodies before infection lead to a strong increase in the percentage of Afipia felis-containing phagosomes that interact with the endocytic system. We conclude that most phagosomes containing Afipia felis are disconnected from the endocytic system. This unusual compartalization is decided at uptake and can only be established by viable Afipia felis. Rhodococcus equi is a Gram-positive bacterium that causes granulomatous pneumonia in foals. It is also a pathogen for other animals and human beings. The pathogenicity of Rhodococcus equi is depending on its ability to exist and multiply inside macrophages and this correlates with the presence of a 85 kbp plasmid. The aim of this study was to elucidate the intracellular compartmentation of Rhodococcus equi and the mechanism by which the bacteria might avoid the destruction in host macrophages. The importance of the virulence-associated plasmid was also evaluated. In this study it is shown that R. equi(-)-containing phagosomes contained much more of the late endosomal/lysosomal marker proteins vATPase or LAMP-1 and also a larger amount of the lysosomal enzyme ß-galactosidase than R. equi(+)-containing phagosomes. Both R. equi(+)- and R. equi(-)-containing phagosomes associated with the early endosomal marker protein rab5. Based on these results it can be speculated that Rhodococcus equi is able to slow down or arrest the maturation of its phagosome independently of the 85 kbp virulence-associated plasmid. Whereas R. equi(-) is able to slow down but not to arrest its phagosomes, R. equi(+) establishes an unusual compartment, which possibly represents a recycling-endosome. Therefore, for the long term establishment of the unusual R. equi(+)-containing phagosomes at least one of the molecules encoded by the 85 kbp plasmid is necessary. Since Rhodococcus equi infection ultimately proves toxic for macrophages, the R. equi mediated cytotoxicity was analyzed. In this study it is shown that Rhodococcus equi induce necrosis in their host cells and which is dependent on the presence of the virulence-associated 85 kbp plasmid. But the Rhodococcus induced necrosis can only be observed in mouse macrophages and not in human monocytes. KW - Afipia KW - Rhodococcus KW - Phagosom KW - Makrophage KW - Makrophage KW - J774 KW - Phagosom KW - Endosom KW - Lysosom KW - Phagozytose KW - Zytotoxizität KW - Afipia felis KW - Rhodococcus equi KW - Macrophage KW - J774 KW - phagosome KW - endosome KW - lysosome KW - phagocytosis KW - cytotoxicity KW - Afipia felis KW - Rhodococcus equi Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1619 ER - TY - THES A1 - Nesplak, Elke T1 - Umstellungsosteotomien des Unterkiefers T1 - Orthodontic osteotomies of the mandible N2 - Umstellungsosteotomien des Unterkiefers Eine retrospektive Analyse des Patientengutes von 1981-1995 an der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgie der Universität Würzburg Die retrospektive Betrachtung des Krankengutes von 1981-1995 bezüglich der Diagnostik, Therapie und Verläufe von Patienten mit Fehlbildungen und Entwicklungsstörungen des Unterkiefers war nach der Erstellung eines standardisierten Datenerhebungsbogen und der Verwendung eines relationalen Datenbank-Managementsystemes, MS-Access 2.0, möglich. Statistische Berechnungen wurden mit dem Chi²-Test sowie dem t-Test mit einem Signifikanzniveau von p<0,05 durchgeführt. 465 Patienten hatten sich einer sagittalen Spaltung des Unterkiefers und 35 weitere einer anterioren subapikalen Segmentosteotomie des Unterkiefers unterzogen. Auffallend war ein geschlechtsunabhängiger signifikanter Anstieg des Durchschnittsalters von 21,3±6,9 auf 27,4±7,8 Jahre sowie das mit 71,0 Prozent deutliche Überwiegen weiblicher Patienten gegenüber 29,0 Prozent männlicher Patienten. Die Auswertung der Daten ergab in 67,8 Prozent der Fälle eine Distalbiss- und bei 11,8 Prozent der Patienten eine Progeniekorrektur. Es konnte eine Gesamtosteoplastikrate nach anteriorer Segmentosteotomie des Unterkiefers von 40,0 Prozent festgestellt werden, die statistisch signifikant höher war als die entsprechende Quote von 8,0 Prozent nach sagittaler Spaltung des Unterkiefers. Ein Richtwert des Ausmaßes der Verlagerung für die Entscheidung pro oder contra Osteoplastik konnte allerdings nicht ermittelt werden. In 28 Fällen, 5,6 Prozent, wurden Mittelgesichtshypoplasien durch Augmentation korrigiert. 1985 wurde die zentrale Kondylenpositionierung und eine rigide Osteosynthese mit übungsstabilen Positionsschrauben eingeführt. Der stationäre Aufenthalt wurde signifikant von 22,2 ±7,6 auf 10,8±2,4 Tage gekürzt. Es wurden alle Komplikationen und Besonderheiten ermittelt, die während oder nach dem operativen Eingriff zur Dysgnathiekorrektur oder zur Entfernung des Osteosynthesematerials eintraten. Das Risiko einer Verletzung des Nervus alveolaris inferior ist im Rahmen einer Segmentosteotomie mit 5,7 Prozent höher, aber nicht signifikant, als bei sagittalen Spaltungen des Unterkiefers. In 2 Fällen (0,0 Prozent) wurde nach der operativen Korrektur zeitweilig eine Fazialisparese dokumentiert. Die Wundinfektionsrate (2,2 Prozent) ist mit antibiotischer Prophylaxe sehr gering. N2 - Orthodontic osteotomies of the mandible A retrospective analysis of the patients from 1981 to 1995 at the clinic and outpatientsclinic for maxillofacial surgery of the Würzburg university The retrospective analysis of the patients from 1981 to 1995 concerning the diagnostic, therapy and sequels of patients with malformations and deficiencies of the mandible was possible after designing a standard data logging form and making use of a relational data base management system, MS-Access 2.0. Statistical calculations were performed with chi²- and t-test at a significance level of p<0,05. 465 patients underwent sagittal split osteotomy of the mandible and 35 other patients anterior subapical segmental osteotomy of the mandible. Remarkable were a genus independent significant growth of the average age from 21.3±6.9 to 27.4±7.8 years and the clear overbalance of female patients with 71.0 per cent compared with 29.0 per cent male patients. The data processing amounted in 67.8 per cent of the cases to a surgical correction of retrognathism and in 11.8 per cent of the patients to correction of prognathism. A total osteoplastic rate after anterior segmental osteotomy of the mandible of 40.0 per cent, was determined, which is significantly higher than the corresponding rate of 8,0 per cent after sagittal split osteotomy of the mandible. An approximate value of the extent of the shift enabling to decide for or against osteoplasty could not be determinated. Hypoplasia of the midface was corrected in 28 cases, 5.6 per cent, by augmentation. A central positioning of the condyle and a rigid osteosyntesis with functionally stable position screws were introduced in 1985. The stay at a hospital was significantly shortened from 22.2 ±7.6 to 10.8±2.4 days. All complications and characteristic features during or succeeding the surgical correction of the mandibular deficiency or the surgical removing of the osteosynthesis materials were determined. The risk of an injury of the inferior alveolar nerve is for a segmental osteotomy, with 5.7 per cent not significantly higher than for a sagittal split osteotomy (3.0 per cent). A temporal facial nerve palsy after the surgical correction was reported in two cases (0.0 per cent). The rate of wound infection (2.2 per cent) is very low with antibiotic prophylaxis. KW - Unterkieferosteotomie KW - sagittale Unterkieferspaltung KW - anteriore subapikale Segmentosteotomie KW - Osteosynthesematerialien KW - Mittelgesichtshypoplasie KW - osteotomy of the mandible KW - sagittal split osteotomy of the mandible KW - anterior subapical segmental osteotomy KW - osteosynthesis materials Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180878 ER - TY - THES A1 - Mock, Tobias T1 - Die Bestimmung visuell evozierter Potentiale bei Kindern T1 - Determination of visual evoked potentials with children N2 - Zur Messung von visuell evozierten Potentialen ist eine gute Aufmerksamkeit während der Messung notwendig, die jedoch vor allem bei Kindern nicht immer gewährleistet ist. Unser Ziel war es, unter standardisierten Meßbedingungen im klinischen Routinebetrieb eine kindgerechte Meßmethode zu entwickeln, die eine Verbesserung der Aufmerksamkeit ermöglicht. Gleichzeitig sollte die Kontrolle der Aufmerksamkeit verbessert werden. Zusätzlich prüften wir die Meßergebnisse auf ihre Reproduzierbarkeit und untersuchten, ob das VEP bei Kindern unter klinischen Routinebedingungen in unserem Labor eingesetzt werden kann. Wir entwarfen dazu eine Bildergeschichte, die zur Ablenkung während der Meßvorbereitungen dient und die Kinder auf die Meßbedingungen einstimmt. Zusätzlich entwickelten wir ein sog. Aufmerksamkeits-Spiel, das eine gute Fixation auf den Bildschirm erfordert. Die Schwierigkeit der dabei zu lösenden Aufgaben wurde adaptiv angepaßt. Die bei der Aufgabe berechenbare Schwellenzeit war ein Maß zur Beurteilung der Aufmerksamkeit. Die an der Untersuchung teilnehmenden Schielpatienten unserer Sehschule wurden in eine Kindergruppe und eine Erwachsenengruppe eingeteilt. Eine Gruppe von Normalpersonen diente als Vergleichsgruppe zu den erwachsenen Patienten. Abgeleitet wurde ein bipolares VEP nach dem Standard der ISCEV. Die absoluten Werte von Amplitude und Latenz entsprachen den in der Literatur beschriebenen Werten und bei der monokularen Ableitung des Muster-VEPs entsprachen die Meßergebnisse der Schielpatienten denen der Normalpersonen. Zur Beurteilung der Reproduzierbarkeit der Meßergebnisse werteten wir den relativen Variationskoeffizienten aus. Dieser lag für die Latenz fast um das Zehnfache niedriger als der relative Variationskoeffizient der Amplitude. Bei Kindern war der relative Variationskoeffizient doppelt so groß wie bei Normalpersonen. Die Reproduzierbarkeit der Meßergebnisse war demnach nur halb so gut. Der Variationskoeffizient der Erwachsenen lag etwas höher als bei den Normalpersonen. Das Aufmerksamkeits-Spiel konnte von fast allen Kindern ab 6 Jahren gelöst werden. Die kindgerechte Gestaltung der standardisierten Versuchsbedingungen mit der Bildergeschichte und dem Aufmerksamkeits-Spiel ermöglicht deshalb den Einsatz der Muster-VEP-Messung im klinischen Routinebetrieb für Kinder ab 6 Jahren. In Einzelfällen können auch jüngere Kinder gemessen werden. Die Schwellenzeit war bei Kindern im Mittel wesentlich höher als bei Erwachsenen und Normalpersonen, d.h. die Aufmerksamkeit war bei ihnen wesentlich schlechter. Die Reproduzierbarkeit der Amplitude nahm mit zunehmender Schwellenzeit ab, die Reproduzierbarkeit der Latenz war unabhängig von der Schwellenzeit. Standardisierte VEP-Messungen unter klinischen Routinebedingungen können damit durch die kindgerechte Gestaltung der Untersuchungsbedingungen auch bei Kindern ab 6 Jahren durchgeführt werden. Die Beurteilung der Aufmerksamkeit konnte durch das Aufmerksamkeits-Spiel verbessert werden. N2 - Visually-evoked potentials should be measured during good mental concentration, seldom the case with children. Our aim was to develop a standardised measuring procedure suitable for use with children under routine clinical conditions and enabling improved concentration. At the same time we wanted to improve concentration assessment. We additionally tested the reproducibility of our results and examined the possibility of VEP measurements on children in our laboratory under routine clinical conditions. For the project we developed a short comic strip to occupy the children during preparations for the experiment and to attune the children to the imminent examination. In addition we created a concentration-based game requiring good fixation on the monitor. The difficulty of this game can be individually adjusted. The threshold time measured during the game reflects the child’s concentration. The strabismus patients in the experiment were divided into a children`s and an adult group. A group of normal-vision adults served as control-group for the adults. We used a bipolar VEP to ISCEV standards. The absolute results of amplitude and latency were comparable with results described in the literature. The results of monocular pattern VEPs of strabismus patients corresponded to those of the normal-vision group. To assess the reproducibility of our results we used the relative variation coefficient. It was for latency about ten times lower than for amplitude. For children the relative variation coefficient was twice as high as for the normal-vision adults. The reproducibility of the results was therefore only half as good as that of the normal-vision adults. The variation coefficient for the adults was slightly higher than for the control group. The concentration-based game could be solved by almost all children aged 6 or more. In individual cases we could also include younger children. The average threshold time for children was significantly higher than for adults and the control-group, i.e. their concentration was considerably poorer. The reproducibility in amplitude decreased with increasing threshold time, the reproducibility of latency was independent of threshold time. We found that use of the comic-strip and the game enabled child-friendly VEP measurement for ages of 6 and upwards under routine clinical conditions. The concentration-based game improved concentration assessment. KW - Vep KW - Kinder KW - Reproduzierbarkeit KW - Aufmerksamkeit KW - Relativer Variationskoeffizient KW - Amplitude KW - Latenz KW - Schwellenzeit KW - Routine KW - VEP KW - children KW - reproducibility KW - assessment KW - relative variation coefficient KW - amplitude KW - latency KW - threshold KW - standard KW - routine Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180405 ER - TY - THES A1 - Meisenzahl, Christina T1 - Regulation der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase durch Interferon in retinalen Pigmentepithelzellen T1 - Regulation of metalloproteinases stromelysin and collagenase by interferons in retinal pigment epithelial cells N2 - Ophtalmologische Krankheitsbilder, die mit Degeneration oder erblichen Dystrophien der Retina einhergehen, führen in vielen Fällen zur Erblindung und stellen daher ein großes Problem in der Augenheilkunde dar. Als Korrelat des Zellverlustes wurde der apoptotische Zelltod identifiziert. Die Schritte, die zwischen der Genmutation und dem funktionellen Defizit in der Zelle liegen sowie die Signalketten, die letztlich zur Entscheidung zum Zelltod führen, sind noch relativ unklar. Im Zusammenhang mit der Frage, welche Gene die molekulargenetische Grundlage für den Vorgang der Apoptose in Zellen der menschlichen Netzhaut bilden, wurde in dieser Arbeit die Frage untersucht, ob in der humanen Pigmentepithelzellinie ARPE-19 die Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase produziert werden und ob die Genexpression dieser Metalloproteinasen durch eine Behandlung der Zellen mit humanen Interferonen stimuliert werden kann. Der Nachweis sollte auf der mRNA-Ebene erfolgen. Als Nachweismethoden dienten die Northern-blot-Analyse, wobei für die Hybridisierung Digoxigenin-markierte antisense-RNA verwendet wurde, die durch in vitro-Transkription gewonnen wurde, sowie die RT-PCR. Als Modell diente die ARPE-19-Zelle, die sich durch ihre epitheliale Morphologie und rasche Proliferationsrate von anderen primären RPE-Kulturen unterscheidet . Als Kontrolle wurden humane Fibroblasten sowie Gliomazellen verwendet. Mit der Northern-blot-Analyse konnte in der ARPE-19-Zelle die mRNA der Metalloproteinase Collagenase nicht nachgewiesen werden. Der Versuch, eine eventuell sehr geringe mRNA-Menge durch Behandlung mit Interferon alpha und gamma über die Nachweisgrenze zu erhöhen, erbrachte ebenfalls ein negatives Ergebnis. Für die Untersuchung von Stromelysin 1 wurde auf die sensiblere Methode der RT-PCR übergegangen. Während Stromelysin 1 in den Kontrollzellen nachgewiesen werden konnte, konnte auch mit der RT-PCR-Methode in der ARPE-19-Zelle Stromelysin 1 nicht nachgewiesen werden. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die ARPE-19-Zelle durch die Anzahl der Passagen, der sie während der Zellkultur unterzogen wurde, zwar nicht immortalisierte, jedoch eine gewisse Zahl von Genen abschaltete, zu denen auch die Gene der hier untersuchten Metalloproteinasen Collagenase und Stromelysin gehören, oder dass die Zellinie nicht den komplett identischen Chromosomensatz einer originären retinalen Pigmentepithelzelle besitzt. Die Tatsache, daß hochspezialisierte Zellen bei oftmaligem Passagieren ihre spezialisierten Eigenschaften verlieren, kann in der Forschung häufig beobachtet werden. Offenbar ist die in Kultur gehaltene ARPE-19-Zelle eine in ihrer transkriptionellen Aktivität extrem reduzierte Zelle, bei der auch die Transkription der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase abgeschaltet ist. N2 - Ophtalmological diseases that imply degeneration or hereditary dystrophia of retina often lead to blindness and form a crucial problem in ophtalmology. Apoptotic cell death was identified as origin for cell loss. Actually, the linkage between genetic mutation and loss of cellular functionality as well as the signal transduction pathways leading to apoptosis remained unclear. Settled in the research of molecular genetic origins for apoptosis in human retina, this thesis investigates if the metalloproteinases stromelysin and collagenase are product of the human pigment epithelial cell-line ARPE-19 and if the genetic expression of these metalloproteinases can be stimulated by treatment with human interferons. Detection was performed at mRNA-Level using northern-blot-analysis with digoxigenin-marked antisense-RNA formed by in-vitro transcription and RT-PCR. Due to their epithelial morphology and rapid proliferation ARPE-19 cells were used as a model. Human fibroblasts and glioma cells formed controls. In ARPE-19 cells, northern-blot-analysis could not detect the metalloproteinase collagenase. The approach to augment a probably extremely low amount of mRNA by interferon-alpha/gamma-stimulation of the retinal pigment epithelial cells led to negative result as well. When investigating stromelysin-1, the more sensitive method of RT-PCR was utilized. Using this technique, stromelysin-1 was detected in control cells, but not in ARPE-19 cells. We assume that ARPE-19 cells did not immortalize during its passages in cell culture, but switched off a certain number of genes implying the investigated metalloproteinases collagenase and stromelysin, or maybe the cell line does not comprise the complete identical chromosomal set of an originary pigment epithelial cell. The loss of differentiated attributes during multiple passages is a known phenomenon in cell culture research. Obviously, the cultured ARPE-19 cell is highly reduced in transcriptional activity, omitting the transcription of the metalloproteinases stromelysin and collagenase. KW - Maus KW - Coronaviren KW - Genexpression KW - Apoptose KW - Metalloproteinase KW - retinales Pigmentepithel KW - Interferon KW - Stromelysin KW - Collagenase KW - Apoptosis KW - metalloproteinase KW - retinal pigment epithelium KW - interferon KW - stromelysin KW - collagenase Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180452 ER - TY - THES A1 - Maldeghem, Jeannette ¬von¬ T1 - Charakterisierung und Antibiotika-Resistenzprofil von Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli Isolaten von Patienten und Ausscheidern T1 - Antimicrobial Resistance of Shiga Toxin-producing Escherichia coli O157 and non-O157 Strains isolated from Patients and Healthy Subjects N2 - Einhundertvierundvierzig STEC-Stämme von Patienten mit hämolytisch-urämischem Syndrom (68 Stämme), von Durchfallpatienten (42 Stämme) und von asymptomatischen Ausscheidern (44 Stämme) wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Antibiotika-empfindlichkeit hin untersucht. Zu den insgesamt 13 getesteten Antibiotika zählten die ß-Laktam Antibiotika Ampicillin, Piperacillin, Cefotaxim, Ceftazidim, Cefotiam und Imipenem, die Aminoglykoside Gentamicin und Streptomycin, die Gyrasehemmer Ofloxacin und Ciprofloxacin sowie Tetracyclin, Chlorampenicol und die Sulfamethoxazol/Trimethoprim-Kombination Cotrimoxazol. Alle E. coli O157 Stämme, die von Patienten mit HUS isoliert wurden, waren sensibel gegen die getesteten Antibiotika. Lediglich ein E. coli O157 Stamm, der von einem Durchfall-Patienten isoliert wurde, zeigte eine Resistenz gegen Tetracyclin. Allgemein häufiger wurden Antibiotikaresistenzen bei non-O157 Stämmen gefunden. Fünf von 22 non-O157 Stämmen, die von HUS-Patienten isolierten wurden, zeigten mindestens eine Resistenz gegen die getesteten Antibiotika. Vierzehn von fünfunddreißig non-O157 E. coli Stämmen, die sowohl von Durchfall-Patienten als auch von asymptomatischen Ausscheidern stammten, konnten sowohl Einfachresistenzen als auch Multiresistenzen aufweisen. Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) zeigte, daß alle resistente Stämme einen extrem hohen Resistenzstatus besitzen. Sowohl ß-Laktam als auch Tetracyclin Resistenzen konnten mittels Konjugation auf einen E. coli-Laborstamm übertragen werden. Dies läßt die Anwesenheit von R-Plasmiden vermuten. Die Tatsache, daß über 12 Prozent Shigatoxin produzierender E. coli Stämme aus humanen Stuhlproben Antibiotikaresistenzen aufweisen, hat klinische und epidemiologische Bedeutung. Resistente STEC-Stämme hätten einen selektiven Vorteil gegenüber anderen koliformen Bakterien in Mastbetrieben, die Antibiotika dem Futtermittel beimengen. Hieraus wiederum steigt die Gefahr einer potentiellen Übertragung resistenter Pathogene auf den Menschen. Auf der anderen Seite könnte die ansteigende Anzahl Antibiotika-resistenter Stämme zu einer rasch durchführbaren epidemiologischen Nachweismethode führen. N2 - The resistance to antibiotics of 144 Shiga Toxin-producing E. coli (STEC) strains isolated from patients with haemolytic-uremic syndrome (HUS) (68 strains), diarrhoea (42 strains) and from healthy subjects (44 strains) was examined using ampicillin, piperacillin, cefotaxime, ceftazidime, gentamicin, tetracycline, trimethoprimsulfamethoxazole, ofloxacin, ciprofloxacin, chloramphenicol, imipenem and streptomycin and resistant strains were characterised. All E. coli O157 isolates from patients with HUS were sensitive to the antibiotics tested. Only one E. coli O157 strain, obtained from patient with diarrhoea, was resistant against tetracycline. However, resistance in non-O157 strans occurred more frequently. 5 of 22 non-O157 strains from HUS-patients were resistant to between one and six of the antibiotics tested. Fourteen of 35 non-O157 strains from patients with diarrhoea and healthy individuals were also resistant against at least one of the antibiotics tested. Determination of minimal inhibitory concentrations (MIC) revealed that all strains expressed highly resistance phenotypes. ß-Lactam and tetracycline resistance phenotypes could be transferred by conjugation to E. coli laboratory strains, suggesting the presence of R-plasmids in STEC. The observation that > 12 per cent of STEC strains in human stool samples are resistant to antibiotics has clinical and epidemiological implications. KW - STEC KW - Antibiotika KW - Resistenzen KW - STEC KW - Antibiotics KW - Resistance Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181990 ER - TY - THES A1 - Kurzai, Oliver T1 - Molekulare Charakterisierung pH-regulierter Gene bei der humanpathogenen Hefespezies Candida dubliniensis und ihr Nutzen für die epidemiologische Diagnostik T1 - PH-regulated genes of the pathogenic yeast Candida dubliniensis and their impact in epidemiological diagnostics N2 - Candida dubliniensis ist eine 1995 erstmals beschriebene pathogene Hefespezies mit enger phylogenetischer Verwandtschaft zu Candida albicans. Sie wird mittels routinemäßig angewendeter Verfahren nicht von C. albicans unterschieden, weil sie als einzige Spezies im Genus Candida neben C. albicans Chlamydosporen ausbilden kann. C. dubliniensis ist bisher vor allem aus dem Oropharynx HIV-positiver Patienten isoliert worden. PHR1 und PHR2 sind funktionell homologe, pH-abhängig exprimierte Gene von C. albicans, deren Produkte essentiell für die Verknüpfung von b-1,3- und b-1,6-Glukan in der Zellwand sind. Die Deletion jedes dieser Gene führt zu einem pH-abhängigen Phänotyp mit aberranter Morphogenese in vitro und reduzierter Virulenz im Tiermodell. In dieser Arbeit werden PHR homologe Gene im Genom von C. dubliniensis charakterisiert. CdPHR1 weist eine Homologie von 90,5 Prozent zu PHR1 und CdPHR2 eine Homologie von 91,7 Prozent zu PHR2 auf. Wie PHR1 wird auch CdPHR1 nur unter neutralen und alkalischen Bedingungen exprimiert, während sich CdPHR2 Transkript, wie das von PHR2, nur unter sauren Bedingungen nachweisen lässt. Die funktionelle Homologie von CdPHR1 zu PHR1 wird durch Komplementation des Phänotyps einer C. albicans phr1 Mutante mit CdPHR1 gezeigt. Dabei erweist sich der native Promoter von CdPHR1 als funktional in C. albicans. Im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae wird CdPHR1 unter Kontrolle seines nativen Promotors dagegen pH-unabhängig exprimiert. Auch die zusätzliche Einführung eines mutierten, dominant aktiven Allels von RIM101, das in C. albicans für die pH-abhängige Genexpression verantwortlich ist, hat darauf keinen Einfluss. In C. glabrata und Aspergillus nidulans findet sich keine Expression von CdPHR1. Basierend auf Sequenzunterschieden zwischen PHR1 und CdPHR1 wird ein PCR-Schnelltest zur Speziesunterscheidung entwickelt. Dieser wird in einer epidemiologischen Studie mit 133 chlamydosporenpositiven klinischen Isolaten evaluiert. 21 oropharyngeale Isolate von 14 HIV-positiven Patienten können so retrospektiv als C. dubliniensis klassifiziert werden, dies entspricht einer Prävalenz von C. dubliniensis in diesem Kollektiv von 30 Prozent. Die Ergebnisse der PCR werden durch Sequenzierung ribosomaler Gene (V3, ITS1, ITS2) bestätigt. Parallel werden phänotypische Tests zur Identifizierung von C. dubliniensis auf ihre diagnostische Validität getestet. Während sich die Chlamydosporenmorphologie der Isolate und die Koloniefärbung auf dem Farbindikatormedium CHROMagar Candida als unzulänglich für die Unterscheidung erweisen und das für C. dubliniensis beschriebene Wachstumsdefizit bei 45°C zwar sensitiv, nicht aber spezifisch für die Identifizierung dieser Spezies ist, korreliert die Koloniemorphologie auf Staib-Agar zu 100 Prozent mit den molekularen Daten. Alle C. dubliniensis Isolate werden in einem biochemischen Assay (Micronaut RC) untersucht, dabei zeigt der Test auf b-Glukosidase Aktivität hohes diskriminatorisches Potenzial. In Resistenztestungen zeigen sich die C. dubliniensis Isolate sensibler als die oropharyngealen C. albicans Isolate gegen gebräuchliche Antimykotika. In dieser Studie kann gezeigt werden, dass C. dubliniensis und C. albicans auf teilweise austauschbare Mechanismen zur Reaktion auf Alterationen des pH-Milieus verfügen. Die pH-abhängige Regulation zellwandassoziierter Gene ist dabei eng mit morphogenetischen Prozessen verbunden. Trotz dieser Ähnlichkeit ist C. dubliniensis nicht nur weniger virulent als C. albicans, sondern zeigt auch ein unterschiedliches epidemiologisches Spektrum, das durch eine Spezialisierung auf oropharyngeale Kolonisation und Infektion bei HIV-positiven Patienten gekennzeichnet ist. Um die Gründe für diese Unterschiede aufzeigen zu können, ist eine verlässliche Identifizierung von C. dubliniensis notwendig. Dazu stellen die präsentierten Daten einerseits einen schnellen und verlässlichen PCR Test, andererseits eine sorgfältige Evaluierung derzeit gebräuchlicher phänotypischer Verfahren vor. Phänotypisch und genotypisch exzellent charakterisierte Isolate beider Spezies stehen für weitere Untersuchungen zur Verfügung. N2 - Candida dubliniensis is a recently described pathogenic yeast species that is phylogenetically closely related to Candida albicans. In routine clinical diagnostic procedures both species are not differentiated due to the unique ability of C. dubliniensis to form germ-tubes and chlamydospores as C. albicans. Most C. dubliniensis isolates have been recovered from the oropharynx of HIV-infected patients. PHR1 and PHR2 are functionally homologous genes of C. albicans responsible for crosslinking b-1,3- and b-1,6-glucans of the yeast cell wall. These genes are characterized by a unique pattern of pH-dependent transcription. Deletion of each of these genes results in a pH-dependent phenotype with aberrant in vitro morphogenesis and reduced virulence in an animal model. Here, PHR homologous genes of C. dubliniensis are characterized. CdPHR1 is 90.5 per cent homologous to PHR1, CdPHR2 is 91.7 per cent homologous to PHR2. Like PHR1, CdPHR1 is only expressed in neutral to alkaline conditions, whereas CdPHR2 transcript - as with PHR2 - can only be found in acidic conditions. Functional homology of CdPHR1 with PHR1 is shown by complementation of a phr1 phenotype in C. albicans with CdPHR1. The native promoter of CdPHR1 is thereby shown to be functional in C. albicans. In contrast CdPHR1 is expressed in a pH-independent manner in bakers yeast Saccharomyces cerevisiae. This constitutive expression is not altered by additional integration of a dominant active allele of RIM101, encoding the transcription factor, that ensures pH-dependent gene expression in C. albicans. CdPHR1 is not expressed in C. glabrata and Aspergillus nidulans. A rapid PCR-test for discrimination between C. albicans and C. dubliniensis is constructed based on sequence differences between PHR1 and CdPHR1. This test is evaluated in an epidemiological study with 133 chlamydospore-positive clinical yeast isolates. 21 oropharyngeal isolates are retrospectively identified as C. dubliniensis, resulting in a prevalence of 30 per cent in this patient collective. PCR-results are confirmed by sequencing rDNA (V3, ITS1, ITS2). Phenotypic tests for identification of C. dubliniensis are evaluated with respect to their diagnostic potential. Whereas chlamydospore-morphology and colony colour on Chromagar Candida are not suited for reliable discrimination, and the growth deficit of C. dubliniensis at 45°C is sensitive but not specific, colony morphology on Staib agar corresponds 100 per cent to the molecular biology data. All C. dubliniensis isolates are biochemically characterized using the Micronaut RC system. The test for b-glucosidase activity within this system shows a high discriminatory potential. Susceptibility testing reveals, that the C. dubliniensis isolates are more sensitive to antifungals than the C. albicans isolates. C. dubliniensis and C. albicans rely on interchangeable mechanisms to react to the ambient pH. Furthermore, pH-regulated expression of cell wall associated genes is closely linked to morphogenesis. Despite this, C. dubliniensis is not only less virulent than C. albicans but also displays a distinct epidemiology characterized by a preference for oropharyngeal colonialization and infection of HIV-positive patients. To reveal the reasons for this, reliable identification of C. dubliniensis is necessary. For that purpose, a rapid PCR test is introduced together with an evaluation of currently available phenotypic methods. Thoroughly characterized isolates of both species are available for further studies. KW - Candida KW - albicans KW - dubliniensis KW - pH KW - PHR KW - CdPHR KW - RIM101 KW - Zellwand KW - Candida KW - albicans KW - dubliniensis KW - pH KW - PHR KW - CdPHR KW - RIM10 KW - cell wall Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1182281 ER - TY - THES A1 - Kruchten, Birgit T1 - Prognostische Bedeutung der Vascular Endothelial Cell Growth Factor (VEGF)-Immunreaktivität beim Nierenzell-Carcinom N2 - Die Abschätzung des individuellen Rezidiv- und Progressrisikos eines Patienten mit einem Nierenzellkarzinom gelingt durch Bestimmung von Staging und Grading nur unzureichend. Ziel der durchgeführten Untersuchung war es neben etablierten Prognoseparametern wie Staging und Grading eines Nierentumors die VEGF-Immunreaktivität zu untersuchen und auf seine Tauglichkeit als Prognoseparameter zu überprüfen. Hierzu wurden parafin-fixierte Präparate von 200 Patienten, die an der Urologischen Universitätsklinik Würzburg zwischen 1985 und 1994 tumornephrektomiert wurden, immunhistochemisch untersucht. Zu allen Patienten ist ein postoperativer Verlauf bekannt. Die Präparate wurden zunächst nach der Avidin-Biotin-Methode gefärbt und zur Auswertung vorbereitet. Für jedes Präparat wurde nun der prozentuale Anteil der VEGF-positiven Zellen im Tumor durch zwei unabhängige Untersucher bestimmt. Als Mass der Prognose (abhängige Variable) wurden Überlebenszeit und rezidivfreie Zeit nach Tumornephrektomie gewählt. Als prognostische Parameter (unabhängige Variable) dienten die etablierten Faktoren wie Staging und Grading sowie der potentiell relevante Faktor VEGF. VEGF erwies sich, im Präparat immunhostochemisch gemessen, als statistisch signifikanter Prognosefaktor, der aber den klassischen Faktoren unterlegen ist. In einer multivariaten Prognoseanalyse und in einer Berechnung von Prognoseindizes sowie Receiver Operating Characteristics (ROC)-Kurven konnte gezeigt werden, dass eine Kombination der etablierten Prognosefaktoren mit VEGF eine statistisch signifikante Steigerung der Vorhersagegenauigkeit erreicht KW - VEGF KW - Nierenzellcarcinom KW - Staging KW - Grading KW - Tumornephrektomie KW - multivariate Prognoseanalyse Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181778 ER - TY - THES A1 - Klein, Andreas T1 - Der altersabhängige Verlust der Geschlechtschromosomen beim Menschen unter Einwirkung von 5-Azadeoxycytidin T1 - Age related loss of human sex chromosomes induced by 5-azadeoxycytidine N2 - Die vorliegende Arbeit untersucht, ob mit zunehmendem Alter während der Mitose häufiger Geschlechtschromsomen verlorengehen. Die Beobachtungen erfolgten an Lymphozytenkulturen gesunder weiblicher und männlicher Probanden aus drei verschiedenen Altersgruppen. Unter Zugabe von 5-Azadeoxycytidin, einem Nukleosidanalogon, ergab sich in den höheren Altersgruppen ein verstärktes Auftreten von Mikronuklei. Mikronuklei enthalten Chromosomen oder -bruchstücke, die während der Mitose nicht in die Tochterzellkerne integriert wurden. Mittels in situ Hybridisierung konnte in den Mikronuklei der Frauen zu 5,5 Prozent ein X-Chromosom, bei den Männern mit 10,7 Prozent überzufällig häufig ein Y-Chromosom nachgewiesen werden. Zwischen den einzelnen Altersstufen änderte sich dieser Anteil nicht wesentlich. 5-Azadeoxycytidin wird als Nukleosidanalogon während der Replikation in die DNA eingebaut und verhindert die Methylierung des Tochterstrangs, da ein Kohlenstoffatom im Pyrimidinrings durch ein Stickstoffatom substituiert ist. Wahrscheinlich resultiert aus der Hyomethylierung eine falsche "Verpackung" des Gonosoms während der Mitose, dadurch erfolgt eine fehlerhafte Aufteilung des Chromosoms mit Bildung eines Mikronukleus. N2 - In lymphocyte cultures, the number of aneuploid cell nuclei increases with age. A preferential loss of sex chromosomes is supected. Lymphocyte cultures of female and male probands were treated with 5-azadeoxycytidine and an increased frequency of micronuclei in relation to age was observed. In situ hybridizations with X-specific and Y-specific DNA probes were carried out, and 5.5 per cent of female and 10.7 per cent of male micronuclei contained a sex chromosom. 5-azadeoxycytidine induces hypomethylation of the DNA and undercondensation in the heterochromatic regions of chromosomes 1, 9, 15, 16, and Y. The results suggest that in 5-azadeoxycytidine-treated cultures the Y-chromosome is lagged during mitosis, with subsequent chromosome loss via micronucleus formation. This mechanism may explain hypoploidy of sex chromosomes with ageing. KW - Altern KW - Geschlechtschromosomen KW - Chromosomenverlust KW - 5-Azadeoxycytidin KW - Mikronukleus KW - ageing KW - sex chromosomes KW - chromosome loss KW - 5-azadeoxycytidine micronucleus Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181416 N1 - Aus datenschutzrechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. Eine inhaltlich identische neue Version ist erhältlich unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-32771 ER - TY - THES A1 - Imbusch, Ruth T1 - Phytoprostane F1 T1 - Phytoprostanes F1 N2 - Isoprostane F2 sind Autoxidationsprodukte der Arachidonsäure, die über radikal-katalysierte Oxidation entstehen. Bei einigen Erkrankungen im Tier konnte gezeigt werden, daß die Konzentration von Isoprostanen F2 mit dem verstärkten Vorkommen von freien Radikalen korreliert, weshalb Isoprostane heute als Marker des oxidativen Streß genutzt werden. Darüber hinaus weisen einige Isoprostane eine biologische Aktivität auf, weshalb sie heute als Signalstoffe des oxidativen Streß im Tier diskutiert werden. Pflanzen hingegen können keine Isoprostane F2 synthetisieren, da ihnen der Precursor Arachidonsäure fehlt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß analog zu den Isoprostanen F2 Phytoprostane F1 in Pflanzen aus Linolensäure gebildet werden. Hierfür wurden HPLC- und Gaschromatographie-Massenspektroskopie-Methoden entwickelt, die eine Quantifizierung von Phytoprostanen F1 in Pflanzen ermöglichten. In frischen Pflanzenorganen wurden Phytoprostane F1 sowohl in freier als auch in veresterter Form detektiert. Darüber hinaus stieg die Konzentration sowohl freier als auch veresterter Phytoprostane F1 in Pfefferminzblättern nach Verwundung und in pflanzlichen Zellkulturen nach Zusatz von Agentien, von denen bekannt ist, daß sie pflanzliche Zellen oxidativ schädigen, an. In getrockneten Pflanzenmaterialien wurden extrem hohe Konzentrationen an Phytoprostanen F1 quantifiziert. Daher steht die Vermutung nahe, daß Phytoprostane F1 ähnlich wie die Isoprostane F2 im Tier als sensitiver Marker der oxidativen Zellverletzung in der Pflanze eingesetzt werden können. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß der Zusatz von Phytoprostanen F1 zu Eschscholzia californica-, Crotalaria cobalticola- and Thalictrum tuberosum-Zellsuspensionskulturen zu einer Phytoalexinakkumulation führte. N2 - Isoprostanes F2 are arachidonate autoxidation products in mammals that have been shown to be induced during several human disorders associated with enhanced free-radical generation. Isoprostanes F2 represent not only extremely reliable markers of oxidative stress in vivo but also exert potent biological effects. Therefore, it has been postulated that isoprostanoids are mediators of oxidant injury in vivo. Plants, however, do not generate isoprostanes since they since they are generally unable to synthesize arachidonic acid. Here we show that a series of isoprostane F2 analogs termed phytoprostanes F1 are formed by an analogous pathway from a-linolenate in plants. HPLC and gas chromatography-mass spectrometry methods have been developed to quantify phytoprostanes F1. In fresh plant organs, phytoprostanes F1 were found in free and esterified form in lipids. In addition, wounding of peppermint leaves and oxidative stress, which was triggered by the addition oxidative agents to plant cell cultures significantly increased levels of free and esterified phytoprostanes F1. Extremely high levels of phytoprostanes F1 were found in autoxidised plant material. Thus, phytoprostanes F1 represent a sensitive measure of oxidative damage in plants similar to isoprostanes in animals and men. The addition of phytoprostanes F1 to Eschscholzia californica-, Crotalaria cobalticola- and Thalictrum tuberosum-cell suspension cultures triggered a phytoalexine accumulation . KW - Pflanzen KW - Oxidativer Stress KW - Prostaglandine KW - Analoga KW - Phytoprostane KW - Prostaglandin-ähnliche Verbindungen in Pflanzen KW - Isoprostane KW - Phytoprostanes KW - prostaglandin-like compounds in plants KW - Isoprostanes Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1182238 ER - TY - THES A1 - Hose, Eleonore T1 - Untersuchungen zum radialen Abscisinsäure- und Wassertransport in Wurzeln von Helianthus annuus L. und Zea mays L. N2 - Mit den Experimenten dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ein Phytohormon wie Abscisinsäure mit dem "Solvent-drag" des Wasserflusses apoplastisch durch den Wurzelzellwandbereich in die Xylemgefäße transportiert werden kann. Es konnte ein Bypass-Fluss für ABA durch den gesamten Zellwandapoplasten, auch durch lipophile Barrieren wie Exo- und Endodermis nachgewiesen werden. Dies ist durch die speziellen Moleküleigenschaften von Abscisinsäure möglich: (i) der geringe Durchmesser des Moleküls (8 - 11 nm) und (ii) die hohe Lipophilie von ABA bei schwach sauren pH-Werte. Mit einer Penetration apoplastischer Barrieren ist demnach zu rechnen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Ausbildung solcher lipophilen Zellwandnetze einen signifikanten Einfluss auf den apoplastischen ABA-Transport besitzt. Die Ausbildung einer Exodermis in Mais, wie sie unter natürlichen Bedingungen zu beobachten ist, konnte den ABA-Fluss in das Xylem um die Faktoren 2 bis 4 reduzieren. Da gleichzeitig eine Verminderung der hydraulischen Wurzelleitfähigkeit um denselben Betrag auftrat, blieb das Wurzel-Spross-ABA-Signal, die Phytohormonkonzentration, im Xylem gleich. Die zu den Stomata geleitete Information über den Wasserzustand der Wurzel änderte sich also nicht. Im natürlichen System ist sogar eine Verstärkung des Signals zu erwarten, da eine Exodermis nicht als Aufnahme-Barriere für gewebeproduzierte ABA wirkt. Gleichzeitig verringert sie den Verlust von apoplastischer ABA an die Rhizosphäre. Außerdem wird der Wasserverlust aus dem Gewebe durch eine Exodermis signifikant reduziert wird. Somit sind solche Wurzeln gut an die Bedingungen eines eintrocknenden Bodens angepasst. Apoplastische Barrieren sind demnach, neben membran-lokalisierten Tranportern, wichtige Parameter für die Beurteilung von Wurzeltransporteigenschaften für Wasser und darin gelöste Substanzen. Der Beitrag der apoplastischen Komponente zum Gesamt-ABA-Transport ist abhängig von der untersuchten Pflanzenart, der aktuellen Transpirations- oder Wasserflussrate und von Umwelteinflüssen wie erhöhter ABA-Konzentration im Wurzelgewebe (z.B. durch Trockenstress), pH-Wert der Rhizosphäre und den Ernährungsbedingungen der Pflanze. Erhöhter radialer Wasserfluss, erhöhte ABA-Wurzelgewebegehalte und niedriger pH-Wert der Rhizosphäre verstärken den apoplastischen Bypass-Fluss unter physiologischen Bedingungen. Geringe Wassertransportraten, niedrige ABA-Konzentrationen im Gewebe, alkalische pH-Werte der Rhizosphäre und Ammoniumernährung verstärken dagegen den symplastischen Beitrag zum ABA-Transport. In der vorliegenden Arbeit konnten die sich widersprechenden Theorien bezüglich des ABA-Effektes auf die hydraulische Leitfähigkeit von Wurzeln erklärt werden. ABA erhöht über einen Zeitraum von 2 Stunden die Zellleitfähigkeit (Lp) mit einem Maximum 1 Stunde nach ABA-Inkubation. Dies wirkt sich in einem verstärktem Lpr von intakten Wurzelsystemen aus, das einem ähnlichen Zeitmuster folgt. Pflanzen sind demnach in der Lage, mittels ABA den zellulären Wassertransportweg reversibel zu optimieren, um so unter mildem Trockenstress, wie er in einem gerade eintrocknenden Boden auftritt, die Pflanze mit ausreichend Wasser zu versorgen. Tritt ein länger andauernder Wassermangel ein, versperrt die Pflanze diesen Weg wieder. Dieser transiente Effekt erklärt auch die aus der Literatur bekannten stimulierenden und inhibierenden ABA-Wirkungen. Durch den verstärkten Wasserfluss zu Beginn der Stresssituation erzeugt ABA auf diese Weise ein sich selbst verstärkendes, wurzelbürtiges Hormonsignal in den Spross. Das Blatt erreicht in effektiver Weise eine ABA-Menge, die ausreichend ist, um die Stomata zu schließen. Es folgt eine Reduktion der Transpiration. Eine weiter andauernde Erhöhung des symplastischen Wassertransportweges wäre ohne physiologische Bedeutung. Regulierende Membranstrukturen für diesen Vorgang könnten ABA-sensitive Wasserkanäle (Aquaporine) der Plasmamembran sein. Es wurde gezeigt, dass der Rezeptor für diesen Vorgang innerhalb von corticalen Maiswurzelzellen lokalisiert und hochspezifisch für (+)-cis-trans-ABA ist. Die Signaltransduktion für diesen Kurzzeiteffekt erfolgt nicht mittels verstärkter Aquaporintranskription, könnte aber über ABA-induzierte Aktivierung (Phosphorylierung), oder Einbau von Aquaporinen in die Zellmembran ablaufen. Der Abscisinsäure-Transport ist ein komplexer Vorgang. Er wird beeinflusst durch Umwelteinflüsse, Wurzelanatomie, ist gekoppelt mit dem Wasserfluss und durch sich selbst variierbar. Herkömmliche Vorstellungen einer simplen Hormondiffusion können diesen regulierbaren Vorgang nicht mehr beschreiben. Pflanzen besitzen ein ABA-Transportsystem, das schnell, effektiv und an sich verändernde Umweltbedingungen adaptierbar ist. N2 - The experimental work of the presented study has been able to show, for the first time, that a phytohormone like ABA can be transported apoplastically into xylem vessels by solvent-drag of the water flow. For ABA, a bypass-flow throughout the whole cell wall apoplast, including lipophilic barriers like exo-and endodermis, could be demonstrated. This may be due to the particular properties of the 264 Da ABA-molecule: (i) the small diameter of the molecule (8 to 11 nm) and (ii) the high lipophily of the uncharged ABA under physiological conditions. Conclusively, a penetration of apoplastic barriers is supposed to be possible. Furthermore, this study shows the development of such lipophilic cell wall-nets should have significant influence on apoplastic ABA-transport-properties. The formation of an exodermis in maize, as it occurs under natural conditions, was able to reduce the ABA-flow into the xylem by factors of 2 up to 4. As, simultaneously, the root-hydraulic conductivity was decreased by the same rate, the root-to-shoot ABA-signal, the phytohormone concentration in the xylem, remained constant. The information about the root-water-status addressed to the guard cells has not changed, therefore. In the natural environment even an increase of this signal is to be expected, as exodermal layers are no uptake-barriers for the tissue-produced ABA. On the contrary, an exodermis will retard the leakage of ABA to the rhizosphere. At the same time, roots are more effectively adapted to drought because water loss from exodermal roots is also reduced significantly. Apoplastic barriers are, therefore, beside membrane-located transport-proteins, the important parameters for determining root-transport-properties for water and solutes. The contribution of the apoplastic component to the entire ABA-transport depends on the plant species investigated, the actual transpiration- or water-flow rate and on external conditions like high ABA-concentrations in the root tissue (e.g. after drought), pH of the rhizosphere, and the nutrient status of the plant. Increased radial water-flow, raised ABA-contents of the root tissue, and a low pH of the rhizosphere intensified the apoplastic bypass-flow under physiological conditions. Low water-transport rates, low ABA tissue-contents, alkaline pH-values in the rhizosphere and ammonium as the only N-source, on the other hand, increased the symplastic contribution to the ABA-transport. In the presented study, the controversal dispute concerning the ABA-effect on root hydraulic conductivity could be settled. ABA raises cell hydraulic conductivity (Lp) for 2 h with a maximum after 1 h of ABA-application. This results in an increased Lpr (hydraulic conductivity of intact root systems), directed by a similar time-pattern. So, by ABA plants are able to reversibly optimise the cellular transport path of water to support the plant under mild drought stress with sufficient water. However, if water deficiency continues, plants again close this additional symplastic pathway. This transient ABA-effect explains both stimulating and inhibiting ABA-actions, as known from literature. At the beginning of a stress situation ABA induces by an increased water flow a self-intensifying root-to-shoot-signal. Thus, in an effective way the leaf achieves a sufficient amount of ABA in order to close the stomata. A reduction in transpiration follows. Further continuous stimulation of the symplastic water transport path would be without any physiological meaning. Membrane structures, responsible for regulating this mechanism may be ABA-responsive water channels (aquaporins) in the plasma membrane. It has been shown that the receptor for regulating these channels is localised inside the cortical cells of maize roots and highly specific for (+)-cis-trans-ABA. Signal transduction for this short-time effect is not mediated by intensified aquaporin-transcription, but there may be evidence of ABA-induced regulation by channel activation (phosphorylation) or by incorporation of aquaporins into cell membranes. The transport of abscisic acid is a complex process modified by environmental conditions, root anatomy, coupled with the water flow, and variable by itself. Customary ideas about a simple hormone diffusion are not apt to describe this complex process anymore. Plants possess an ABA-transport system, which is fast, effective, and adaptable to changing environmental conditions. KW - Sonnenblume KW - Wurzel KW - Wassertransport KW - Abscisinsäure KW - Stofftransport KW - Mais KW - Abscisinsäure KW - ABA KW - Aquaporin KW - Exodermis KW - Hydraulische Leitfähigkeit KW - Wassertransport KW - Wurzel KW - Helianthus annuus KW - Zea mays KW - Abscisic acid KW - ABA KW - aquaporin KW - exodermis KW - hydraulic conductivity KW - water transport root KW - Helianthus annuus KW - Zea mays KW - Nicotiana tabacum Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1421 ER - TY - THES A1 - Hoffacker, Viola Josefa Maria T1 - Abnormes Mikromilieu und gestörte Thymopoese in Thymomen als Grundlage der Autoimmunisierung im peripheren Immunsystem T1 - Abnormal micromilieu factors and altered thymopoiesis inside thymomas are the basis for autoimmune reactions in the periphery N2 - Thymome sind die einzigen Tumoren, die reife T-Zellen aus unreifen Vorläuferzellen generieren, wobei die unreifen Thymozytenpopulationen in Thymomen im Vergleich zum Thymus abnorm vermehrt und die reifen Populationen vermindert sind. Zusätzlich weist das Thymomgewebe im Vergleich zum Thymus weniger B-Zellen und Effektor-T-Zellen auf. Bisher ist unbekannt, welche Faktoren die veränderte intratumoröse Zusammensetzung der Zellpopulationen bedingen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Mikromilieufaktoren in Thymomen mit möglichen Auswirkungen auf die intratumoröse Thymopoese zu identifizieren und deren Einfluß auf das periphere Immunsystem zu untersuchen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde nach Ursachen für die abnorme Thymozytenreifung und die Generierung autoreaktiver T-Zellen in Thymomen gesucht. Als potentielles Autoantigen, das die positive Selektion in Thymomen beeinflussen könnte, wurde das in Thymomen exprimierte Protein p153 als Neurofilament mittleren Molekulargewichtes (NF-M) identifiziert. Mittels T-Zell-Proliferationstests konnte gezeigt werden, daß intratumoröse T-Zellen von Thymompatienten mit Myasthenia gravis (MG) nach Stimulation mit dem mittleren Fragment dieses Proteins (NF-M-B) signifikant höhere Antworten aufwiesen als Thymozyten von Thymitispatienten oder Thymompatienten ohne MG. NF-M-B-reaktive T-Zellen waren charakteristisch für die paraneoplastische MG, wohingegen T-Zell-Antworten gegen ein Azetylcholinrezeptor (AChR)-Fragment bei allen MG-Patienten (Thymitis und Thymom) erhöht waren. Diese Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, daß intratumoröses NF-M eine autoantigene Determinante speziell für die paraneoplastische MG darstellt. Das Mikromilieu von Thymomen wurde außerdem mittels cDNA-Arrays und RT-PCR analysiert. Als differentiell exprimierte Gene sind besonders das "Heparin-binding growth-associated molecule" (HB-GAM) und der "B-cell growth factor 1" (BCGF 1) hervorzuheben. Die Expression von HB-GAM zeigte sowohl eine Abhängigkeit vom histologischen Thymomtyp (kortikal > gemischt / medullär) als auch vom MG-Status der Patienten (MG+ > MG-).Umgekehrt wurde für den Faktor BCGF 1 eine signifikante Erhöhung in Thymomen ohne MG gefunden und keine Abhängigkeit vom histologischen Thymomtyp. Die Expression des Chemokins "Interferon-inducible T cell alpha chemoattractant" (I-TAC) war ebenfalls mit dem MG (+)-Status von Thymompatienten signifikant assoziiert. Diese Befunde machen eine Beteiligung von HB-GAM, BCGF 1 und I-TAC an der Pathogenese der paraneoplastischen MG wahrscheinlich. Im Gegensatz dazu wurde die Expression des Chemokins "Thymus-expressed chemokine" (TECK) weder durch den histologischen Thymomtyp noch durch den MG-Status der Patienten beeinflußt. TECK ist vermutlich auch in Thymomen dafür verantwortlich, daß unreife Thymozyten nicht ins Blut gelangen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe von FACS-Analysen und T-Zell-Proliferationsassays der Einfluß von Thymomen auf das periphere Immunsystem untersucht. Es zeigte sich, daß die veränderte Thymopoese und autoreaktive T-Zell-Funktion in Thymomen mit immunologischen Veränderungen im Blut korreliert waren. Der Anteil zirkulierender CD45RA+ CD8+ T-Zellen war bei Thymompatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant erhöht, in Übereinstimmung mit einer intratumorösen T-Zell-Reifung, die in Richtung der CD8+-Linie verschoben war. Auf funktioneller Ebene war die intratumorös nachweisbare, thymomtypische T-Zell-Autoreaktivität gegen NF-M-B und alpha-AChR (301-398) gleichermaßen im Thymom und Blut zu finden. Diese funktionellen Studien unterstützen die Hypothese, daß die in Thymomen stattfindende Thymopoese das periphere T-Zell-Repertoire verändert. Hinsichtlich des Importes von T-Zellen aus der Peripherie in das Thymom ergaben die funktionellen Assays dagegen, daß T-Zellen, die auf ein fremdes Antigen (Tetanus Toxoid) reagierten, nur innerhalb zirkulierender T-Zellen, nicht aber innerhalb intratumoröser Thymozyten nachweisbar waren. Ebenso fanden sich erhöhte autoreaktive T-Zell-Antworten gegen andere Fragmente des NF-M-Proteins (NF-M-A und NF-M-C) sowie für ein Fragment der delta-Untereinheit des AChR nur im Blut von Thymompatienten. Diese Befunde sprechen dafür, daß die Migration von Effektor-T-Zellen aus der Peripherie ins Thymom vermindert ist. Während die Mechanismen für diese gestörte T-Zell-Rezirkulation ins Thymom ungeklärt sind, bestand eine Korrelation zwischen der Expression des B-Zell-spezifischen Chemokins BLC (B-Lymphocyte chemoattractant) und der Anzahl der B-Zellen, die immunhistochemisch in den entsprechenden Geweben dargestellt wurden. Dieser Befund kann auf eine Rolle von BLC bei der Migration reifer B-Zellen in Thymus- bzw. Thymomgewebe hinweisen. Zusammenfassend konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit Mikromilieufaktoren benannt werden, die von potentieller pathogenetischer Relevanz für die gestörte, nicht-tolerogene Thymopoese innerhalb von Thymomen sind. Zweitens konnte eindeutig gezeigt werden, daß die intratumoröse Thymopoese das periphere Immunsystem beeinflußt und bei MG-assoziierten Thymomen in Richtung auf ein höheres autoreaktives Potential verändert N2 - Thymomas are the only tumors that generate mature T cells from immature precursors. In particular, the precursor subsets are increased inside thymomas while the mature T-cell subsets are decreased compared with normal thymus. Moreover, the number of B cells and effector T-cells are diminished in thymomas. It is unknown, which kind of intratumorous factors are responsible for the abnormal thymopoiesis and abnormal thymocyte subset composition in these tumors. The aim of this study was therefore to investigate micromilieu factors inside thymomas which have an impact on the abnormal thymopoiesis and on the extrathymic immune system. In the first part of the study, the molecular basis of the abnormal thymopoiesis and the generation of autoreactive T cells inside thymomas were investigated. It was shown, that the previously described thymoma protein p153 and the midsize-neurofilament (NF-M) are the same molecule. This potential autoantigen could have an impact on the generation of autoreactive T cells by influencing the positive selection inside thymomas. Using T-cell proliferation assays, intratumorous T cells showed significantly increased responses to one fragment of this protein (NF-M-B) in thymoma patients with myasthenia gravis (MG), in contrast to MG patients with thymitis or thymoma patients without MG. NF-M-B reactive T cells were characteristic for paraneoplastic MG while anti-AChR responses were increased in MG patients in general. These results offer further evidence that intratumurous NF-M is an autoantigenic determinant in paraneoplastic MG. Further investigations concerning the micromilieu inside thymomas were performed, using cDNA array technology and RT-PCR analysis. Among the differentially expressed genes were "heparin-binding growth-associated molecule" (HB-GAM) and the "B-cell growth factor" (BCGF 1). The expression of HB-GAM depended on the histological thymoma subtype (cortical > mixed/medullar) and on the MG association of the thymomas (MG+ > MG-). By contrast, BCGF 1 was significantly increased in thymomas of patients without MG, irrespective of the histological thymoma subtype. Furthermore, there was a significant association between the expression of the chemokine "Interferon-inducible T cell alpha chemoattractant" (I-TAC) and the occurrence of MG. These results could be a hint at an influence of HB-GAM, BCGF 1 or I-TAC on the pathogenesis of MG. By contrast, expression of the chemokine "thymus-expressed chemokine" (TECK) was normal irrespective of the histological thymoma subtype and the MG association. Therefore, this chemokine probably acts as a "thymocyte retention factor" inside thymomas as previously described for non-neoplastic thymus. In the second part of this work, the impact of thymomas on the peripheral immune system was investigated, using FACS analysis and T-cell proliferation assays. The results showed, that abnormal thympoiesis and autoreactive T-cell function in thymomas correspond with immunologic alterations in the blood. Specifically, the proportion of circulating CD45RA+ CD8+ T cells was significantly increased in patients with thymoma compared with normal controls, in accordance with intratumorous T-cell development that is abnormally skewed toward the CD8+ phenotype. On the functional level, the intratumous thymoma-specific T-cell responses to NF-M-B and alpha-AChR (301-398) were equally distributed between thymomas and blood. These functional studies support the hypothesis that thymopoiesis occurring within thymomas alters the peripheral T-cell repertoire. Concerning T-cell import from the periphery into thymomas, the functional studies demonstrate that T-cell responses to foreign antigen (ie, tetanus toxoid) were seen only among circulating T cells and not among thymoma-derived T cells. Moreover, increased autoreactive T-cell responses towards other fragments of the NF-M protein (NF-M-A, NF-M-C) or toward a fragment of the AChR d-subunit could be detected only in the blood of thymoma patients. These results demonstrate a diminished migration of effector T-cells from the periphery into thymomas. While the mechanisms for this altered T-cell recirculation are still unknown, the results of this study could show a correlation between the expression of the B-cell chemokine "B-lymphocyte chemoattractant" (BLC) and the number of B cells as determined by immunohistochemistry. This is a hint at a role of BLC in the migration of mature B cells into thymus or thymoma tissue. In summary, the present study could identify micromilieu factors with potential relevance for the pathogenesis of the disturbed, non-tolerogenic thympoiesis occurring inside thymomas. Furthermore, it could be shown unequivocally that intratumorous thymopoiesis has an impact on the peripheral immune system of virtually all thymoma patients but contributes to its increased autoreactive potential specifically in thymoma patients with myasthenia gravis. KW - Thymom KW - T-Lymphozyt KW - Reifung KW - Autoaggressionskrankheit KW - Myasthenia gravi KW - Thymom KW - Thymus KW - Myasthenia gravis KW - T-Zell-Reifung KW - Thymopoese KW - Autoimmunerkrankung KW - thymoma KW - thymus KW - myasthenia gravis KW - t-cell maturation KW - thymopoiesis KW - autoimmune disease Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1413 ER - TY - THES A1 - Hövel, Thorsten T1 - Charakterisierung der Funktion des Tight Junction Proteins hu-CLDN1 und seine Bedeutung bei der Tumorgenese T1 - Functional Characterisation of the Tight Junction Protein hu-CLDN1 and its Relevance for the Process of Cancerogenesis N2 - Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandomänen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der überwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz während der Tumorgenese untersucht werden. Für diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antikörper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antikörper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifität und Epitoperkennungsstelle überprüft. Für biologische Untersuchungen wurden für die neuen Antikörper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper wurde die zelluläre Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. Vor 2 Jahren wurden erstmals die wahrscheinlich wichtigsten Tight Junction Proteine, Claudin-1 und -2 in der Maus beschrieben. An Hand von Sequenzhomologien konnten bis heute dieser 4 Transmembrandomänen Proteinfamilie 18 Mitglieder mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen zugeordnet werden. Parallel zum murinen Claudin-1 wurde von (Swisshelm et al. 1999) das humane Claudin-1 mit einer 91 prozentigen Sequenzhomologie zum murinen Protein isoliert und molekulargenetisch beschrieben. In der überwiegenden Mehrzahl von Brusttumorzellinien ist die Expression von hu-CLDN1 verloren gegangen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die biologische Funktion des humanen Claudin-1 (hu-CLDN1) und dessen Relevanz während der Tumorgenese untersucht werden. Für diese Aufgabenstellung mußten monoklonale Antikörper mittels DNA Vakzinierung und hu-CLDN1 Retroviren zur effektiven Transduktion von Tumorzellen entwickelt werden. Die Antikörper wurden in ELISA, kompetitiven hu-CLDN1 Peptid ELISA und Western Blot auf ihre hu-CLDN1 Spezifität und Epitoperkennungsstelle überprüft. Für biologische Untersuchungen wurden für die neuen Antikörper optimale immunzytochemische und immunhistochemische Methoden etabliert. Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper wurde die zelluläre Proteinexpression und die Lokalisation, als auch die Expression von hu-CLDN1 in Gewebeschnitten von Tumoren- und Normalgewebe untersucht. Für die Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen wurden retrovirale Genshuttlesysteme hergestellt. Die retroviralen Genshuttlesysteme basieren auf dem MoMuLV Grundgerüst und als Besonderheit wurde der l-NGFR Rezeptor zur schnellen und sicheren Identifkation transduzierter Zellen einkloniert. Hergestellt wurde ein Mock Kontrollvektor (nur l-NGFR) und der hu-CLDN1 Vektor mit l-NGFR. Die hu-CLDN1 retroviralen Überstände wurden verwendet, um verschiedene Brusttumorzellinien zu transduzieren. Die Expression von hu-CLDN1 wurde mittels eigens entwickelter quantitativer gekoppelter Reverser Transkription Polymerase Ketten Reaktion (qRT PCR) in verschiedenen Brusttumorzellinien untersucht. Wie aus der vorliegenden Arbeit ersichtlich, konnten erstmalig monoklonale Antikörper gegen hu-CLDN1 entwickelt werden. Diese sind spezifisch und haben eine hohe Sensitivität gegenüber hu-CLDN1. Desweiteren gelang es erstmals Antikörper gegen alle 4 extra- und intrazellulären Domänen zu gewinnen. Mit diesen Antikörpern gelang es nachzuweisen, daß es sich bei hu-CLDN1 um ein ausschließlich membranständiges Protein handelt. Die Expression des Proteins findet sich nur in konfluenten Zellkulturen von natürlicherweise hu-CLDN1 exprimierenden Brusttumorzellen (T47D, MCF7), wobei die Lokalisation ausschließlich auf die Zell-Zell Kontaktstelle beschränkt ist. Bei der hu-CLDN1 Transduktion in hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellinen zeigte sich eine konstitutive mRNA Expression in subkonfluenten und konfluenten Zellkulturen. Allerdings ist fluoreszenzmikroskopisch hu-CLDN1 Protein nur in konfluenten Zellkulturen nachweisbar, wobei diese Tumorzellen das Protein korrekt nur an der Zell-Zell Kontaktstelle einbauen. Offensichtlich haben die hu-CLDN1 negativen Brusttumorzellen noch den intakten Signalweg zur korrekten Expression mit einer noch unbekannten posttranskriptionellen Kontrolle. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, daß in Brusttumorzellen, die weder Occludin noch ZO-1 exprimieren (MDA-MB-435) die physiologisch korrekte Expression von hu-CLDN1 existiert. Offensichtlich ist die Lokalisation von hu-CLDN1 von beiden Proteinen unabhängig. Die Analyse von unterschiedlichen hu-CLDN1 positiven und negativen Brusttumorzellen zeigte, daß der Verlust der hu-CLDN1 Expression besser zur in vitro Invasivität von Brusttumorzellen korreliert als der Expressionsverlust von Occludin und ZO-1. Die klinische Relevanz des Verlustes von hu-CLDN1 während der Tumorgenese wurde bei den Expressionsanalysen auf normalen Brust- und Darmgewebe gegenüber transformierten Brust- und Darmgewebe untersucht. Bei der Analyse von normalem Brustgewebe konnte festgestellt werden, daß hu-CLDN1 ein rein epthelial/endotheliales Protein mit eindeutiger Membranlokalisation darstellt. In den untersuchten transformierten Geweben zeigte keines der transformierten Gewebe mehr die membranständige Färbung, sondern nur noch zytoplasmatische Färbung. Desweiteren war eine signifikant reduzierte oder nicht vorhandene hu-CLDN1 Färbung in einer größeren Anzahl von Tumoren zu beobachten. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Verlust der Expression zumindest bei der Brust- und Darmtumorentwicklung offensichtlich mit der in vivo Tumorprogression korreliert. Um die Bedeutung der hu-CLDN1 Relokalisation bzw. verringerten Expression während der Tumorgenese zellphysiologisch zu verstehen, wurden in vitro Zellkulturstudien mit hu-CLDN1 negativen Zellinien und ihren hu-CLDN1 transduzierten Tochterpopulationen durchgeführt. In den adhärenten Zellkulturen hat die hu-CLDN1 Expression keinen Einfluß auf Zellwachstum und Apoptose. Allerdings zeigte sich in drei dimensional wachsenden Tumorzellaggregaten, daß die Reexpression von hu-CLDN1 zu einer drastischen Erhöhung der Apoptose führt. Die parazellulären Fluxstudien ergaben, daß bei der Reexpression von hu-CLDN1 in Brusttumorzellen der parazelluläre Flux zwischen den Zellen deutlich zurückgeht. Somit könnte die reduzierte Wachstumskapazität bzw. erhöhte Apoptose in 3 D Kulturen mit einer reduzierten Zugänglichkeit von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren in hu-CLDN1 transduzierten Zellen verursacht sein. Dies würde auch erklären, warum bei den untersuchten transformierten noch hu-CLDN1 positiven Brust- und Darmtumorgeweben sich ausschließlich eine zytoplasmatische Lokalisation in den Tumorzellen findet. Während in Organen und Drüsengeweben Epithelien einschichtig vorkommen und die Versorgung der Zellen mit Wachstumsfaktoren basolateral oder apikal durch Diffusion und Mikro-/Makropinozytose erfolgen kann, wachsen Tumorepithelzellen mehrschichtig. Wären die Tight Junctions im Tumor noch intakt, so könnte es zu einer Mangelversorgung und somit zur Apoptose kommen. Für das in vivo Wachstum eines Tumors ist es also notwendig, Membranproteine, die den parazellulären Flux inhibieren, zu verringern. Wie die zellphysiologischen in vitro Studien der vorliegenden Arbeit zeigen, ist es aber möglich, einen tumorinhibierenden Effekt allein durch die Reexpression von hu-CLDN1 unabhängig von Occludin und ZO-1 zu erreichen. In diesem Sinne kann zumindest zellphysiologisch hu-CLDN1 als Tumorsuppressorprotein betrachtet werden. N2 - Two years ago probably the most important tight junction proteins in mice were identified: claudin-1 and -2 . By sequence homology up to 18 members could be assigned to this 4 transmembrane protein family. The human claudin-1 with a 91 per cent sequence similarity to the murine claudin-1 was isolated in parallel (Swisshelm et al. 1999) and it has been shown that most breast cancer cell lines lost the expression of hu-CLDN1. The goal of this Ph. D. thesis was the evaluation of the cell physiological function of the human Claudin-1 (hu-CLDN1) and its relevance during tumorigenesis. To investigate the protein expression and cellular homing monoclonal antibodies using DNA vaccination were generated. The antibodies were analyzed for hu-CLDN1 specifity by Western blot and the epitope binding sites were identified by a competetive hu-CLDN1 peptide ELISA. Using the monoclonal antibodies optimal immunocytochemical and immunohistochemical methods for biological methods were established. With these antibodies the cellular expression and localization, and the expression of hu-CLDN1 in tissue slices of tumor versus normal tissues was analyzed. For the reexpression of hu-CLDN1 in breast tumor cells, retroviral shuttle systems were generated, based on a MoMuLV backbone using the l-NGFR receptor for efficient and rapid transduction of breast cancer cells with hu-CLDN1. For this purpose a mock vector (containing l-NGFR only ) and a hu-CLDN1 vector with l-NGFR were cloned. The expression of hu-CLDN1 in various breast cancer cell lines was analysed using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT PCR). The monoclonal antibodies against hu-CLDN1 are specific against hu-CLDN1. In addition antibodies for all 4 extra- and cytosolic domains were generated. Using these antibodies it was shown by immunofluorescence microscopic analysis that hu-CLDN1 is an exclusively membrane located protein. The expression of the protein is detectable only in confluent cell cultures of naturally hu-CLDN1 expressing cell lines (T47-D, MCF7) and only in the areas of direct cell cell contact. The transduction of hu-CLDN1 negative cell lines analyzed by qRT PCR displayed a mRNA expression in subconfluent and confluent cell cultures, while the protein was only detectable in confluent cell cultures. This indicates that the hu-CLDN1 negative breast tumor cell lines still have the intact signal transduction pathway for the correct expression with an up to now unknown posttranscriptional control mechanism of protein expression. In this context it is noteworthy that even occludin and ZO-1 negative breast tumor cell lines (e. g. MDA-MB-435) still have the physiological homing mechanism of hu-CLDN1. Therefore it can be suggested that expression and homing at hu-CLDN1 might be independent of occludin and ZO-1. The analysis of different hu-CLDN1 positive and negative breast tumor cells showed that the loss of expression of hu-CLDN1 correlates more significantly to the tumorigenesis of cells in comparison to occludin and ZO-1. The clinical relevance of the downregulation and loss of hu-CLDN1 was analyzed using expression analysis of breast and colon tissue versus tumor tissue on tissue microarrays. Normal breast tissue displayed a epithelial/endothelial hu-CLDN1 membrane localization only. None of the breast tumor tissue displayed a membrane localization of the hu-CLDN1 however a relocalization to the cytoplasm was evident. Additionally a significant reduction or loss of expression could be detected in the majority of tumor tissues. These results show that the loss of expression of hu-CLDN1 in breast and colon tumors correlates with tumor progression. In order to analyze the relevance of hu-CLDN1 relocalization and reduction of expression during tumorigenesis on a cellphysiological level, in vitro cell culture studies were performed using hu-CLDN1 negative cell lines (MDA-MB-361) and their hu-CLDN1 transduced counterparts. Hu-CLDN1 transduced cells growing in 2 D cell cultures displayed no altered growth or increased levels of apoptosis. However in three dimensional growing tumor cell aggregates the reexpression of hu-CLDN1 results in a significantly increased induction of apoptosis. In addition paracellular flux analysis revealed that reexpression of hu-CLDN1 decreased the paracellular flux significantly. This data suggests that the reduced growth and increased apoptosis in hu-CLDN1 positive tumor cell aggregates could be due to reduced accessibility of growth factors in hu-CLDN1 transduced cell aggregates. This would explain the necessity for the cytoplasmic homing and loss of expression of hu-CLDN1 during tumorprogression in breast and colon tumors. Most epithelia exist as single layers in organs and lobular structures resulting in a good accessibility of growth factors via diffusion or micro-/macropinocytosis. However, carcinoma tumor cells grow in multilayers. Intact tight junction complexes in carcinoma multi layers would result in a reduced accessibility of growth factors and nutrients. Therefore it is suggested that it is essential for the in vivo growth of a tumor to decrease the expression of tight junctions regulating the paracellular flux. According to the molecular and cell physiological studies presented it might be possible to achieve a tumor inhibiting effect by re-expression of hu-CLDN1. Therefore at least from a cell physiological point of view hu-CLDN1 can be considered to be a tumor suppressor protein. KW - Proteine KW - Tight junction KW - Carcinogenese KW - Molekularbiologie KW - - KW - - Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1409 ER - TY - THES A1 - Hayen, Wiebke T1 - Determinanten der Tumorzellmigration T1 - Determinants of tumor cell migration N2 - Hyaluronsäure (HS) ist ein weit verbreitetes Glykosaminoglykan in der Extrazellulärmatrix vieler Gewebe und tritt in erhöhten Konzentrationen in der Umgebung solider Tumore auf. Es ist bekannt, daß HS die Zellmigration vieler Zellarten stimuliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HS in der Tumorzellmigration auf der Basis eines dreidimensionalen Fibringel-Systems, in welches Tumorzell-bedeckte Microcarrier eingebettet wurden, untersucht. Ein Vergleich zwischen zwei- und dreidimensionaler Migration unterverschiedenen Bedingungen ergab, daß die dreidimensionale Migration nicht von HS-spezifischen Oberflächenrezeptoren abhängt, sondern hauptsächlich von der Porosität der Matrix. In zweidimensionalen Systemen war die Migration durch Antikörper gegen den HS-Rezeptor CD44 inhibierbar, unter dreidimensionalen Bedingungen jedoch nicht. Zur Bestimmung der strukturellen Eigenschaften der Fibringele wurden spektrometrische Messungen, konfokale Mikroskopie, Kompaktionsmessungen und Flüssigkeitspermeation herangezogen. Eine weitere Lokalisation ergab ein intrazelluläres Auftreten von HS vorwiegend perinukleär mit dem Zytoskelett assoziiert. Ein direkter Einfluß auf die Aktinpolymerisation konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die direktionale Migration von Tumorzellen auf Endothelzellen sowohl in dreidimensionalen Fibringelsystemen als auch unter zweidimensionalen Bedingungen untersucht. Endothelzell-konditioniertes Medium wurde weiter aufgereinigt und es konnten massenspektrometrisch mehrere potentiell chemotaktisch aktive Moleküle im Medium bestimmt werden. N2 - Hyaluronic acid (HA) is a glycosaminoglycan which is ubiquitously present in the extracellular matrix of many tissues and increased concentrations are found in the environment of solid tumors. In the first part of this work the role of HA in tumor cell migration based on a three-dimensional fibrin gel-sytem was investigated. The comparison of two- and threedimensional migration resulted in the conclusion that threedimensional migration mainly depends on the porosity of the matrix and not on specific HA-receptors. The HA-induced migration could be inhibited under two-dimensional conditions by antibodies to the HA-receptor CD44 while in three-dimensional systems the migration was unaffected by these antibodies. The structural properties of the fibrin gels were analyzed by turbidity measurement, confocal microscopy, compaction assay and liquid permeation. Further experiments resulted in perinuclear localization of this macromolecule. A direct mechanical influence of HA on actin polymerization could not be detected. The second part of this work concentrated on the directional migration of tumor cells to endothelial cells. In three-dimensional cocultures of tumor cells and endothelial cells it was found that the tumor cells were chemotactically attracted by endothelial cells. This effect could be verified in two-dimensional Boyden chamber assays. Endothelial-derived conditioned medium was further purified and possible chemotaxins for tumor cell migration could be identified by mass spectrometry. KW - Tumorzelle KW - Zellmigration KW - Hyaluronsäure KW - Endothelzelle KW - Tumorzellmigration KW - Hyaluronsäure KW - Fibrin KW - Tumor cell migration KW - hyaluronic acid KW - fibrin Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180784 ER -