TY - THES A1 - Mainz, Laura T1 - Cellular metabolism as target for cancer therapy T1 - Zellulärer Metabolismus als Krebstherapie-Target N2 - Due to a usually late diagnosis, drug resistance and early metastases, pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the seventh leading cause of global cancer deaths. Thus, there is an urgent need to develop new therapeutic concepts. Two different approaches have in recent years become the focus of intense research: (1) targeting cancer-associated metabolic rearrangements, and (2) targeting genetic vulnerabilities with combination therapy. Both concepts potentially have advantages such as increased efficacy, which decreases the likelihood of therapy-resistance, and reduced side effects, that are often associated with high concentrations of chemotherapeutic drugs. Autophagy is an evolutionary conserved signalling pathway that regulates cellular homeostasis. Regarding cancer, autophagy can either promote or suppress tumor growth. However, mouse models that allow genetic regulation of autophagy in established tumor tissue are not yet established. Therefore, we analysed new inducible shRNA mouse models targeting Atg5 or Atg7 with regard to functionality and toxicity. Both, shRNA Atg5- and shRNA Atg7-mediated knockdown anteceded functional autophagy impairment, and revealed unexpected profound phenotypic differences. Knockdown of Atg5 neither impaired the animal nor caused any grossly or microscopically detectable organ damage, whereas knockdown of Atg7 caused pancreatic destruction and eventually death. It is currently unclear whether mice died as a result of exocrine or endocrine collapse or due to a combination of both. The presented mouse models are highly potent RNAi mice that allow widespread and regulable inhibition of autophagy upon administration of doxycycline and provide a valuable and versatile toolbox for future autophagy and cancer research. In PDAC, argininosuccinate synthase 1 (ASS1) deficiency has been associated with higher recurrence rates, shorter disease-free survival, and shorter overall survival. During cancer development, rate-limiting enzymes of de novo arginine synthesis, like ASS1 or OTC, are downregulated via epigenetic silencing of their respective promotor. Known as ‘arginine auxotrophy‘, loss of these essential enzymes results in dependence on extracellular arginine. Based on this assumption, sensitivity of various cell lines to arginine deprivation was reported. However, the underlying mechanism is still unclear and the anti-tumor effects of the monotherapy are not sufficient to completely abrogate cancer cells. Therefore, the effects of arginine deprivation via rhArgI-PEG5000 were investigated in murine and human PDAC cells. In this study, we highlighted that arginine deprivation induced profound alterations such as autophagosome accumulation, induction of senescence and the ISR in pancreatic cancer cells. These alterations are potential genetic vulnerabilities that can be targeted by additional means to induce tumor cell death. N2 - Infolge einer späten Diagnose, Therapie-Resistenz und unentdeckten Mikrometastasen wurde das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) zur siebthäufigsten krebsbedingten Todesursache weltweit. Dies verdeutlicht, dass dringend neue therapeutische Ansätze entwickelt werden müssen. In den vergangenen Jahren wurde unter anderem auf zwei Ansätze fokussiert: (1) Behandlung Tumor-assoziierter metabolischer Veränderungen und (2) Behandlung genetischer Schwachstellen mit Kombinationstherapie. Zum einen erhofft man sich eine erhöhte Wirksamkeit, die die Wahrscheinlichkeit von Therapie-Resistenzen reduziert, zum anderen verringerte Nebenwirkungen, die meist mit hohen Chemotherapeutika-Konzentrationen verbunden sind. Autophagie ist ein evolutionär konservierter Signalweg, der für die Regulation der zellulären Homöostase verantwortlich ist. Es ist bekannt, dass dieser das Tumorwachstum sowohl fördern, als auch unterdrücken kann. Jedoch sind Mausmodelle, die eine genetische Regulierung von Autophagie im etablierten Tumorgewebe ermöglichen, noch nicht etabliert. Aus diesem Grund wurden neue induzierbare shRNA-Mausmodelle gegen Atg5 oder Atg7 hinsichtlich Funktionalität und Toxizität analysiert. Nach Induktion führten beide shRNAs zum systemweiten Knockdown, der im weiteren Verlauf eine funktionelle Beeinträchtigung des Signalwegs zur Folge hatte. Jedoch traten unerwartete phänotypische Unterschiede auf. Der Atg5-Knockdown beeinträchtigte weder den Allgemeinzustand des Tieres noch verursachte es makroskopisch oder mikroskopisch nachweisbare Organschäden. Im Gegenteil dazu hatte der Atg7- Knockdown die Zerstörung des Pankreas und schließlich den Tod des Tieres zur Folge. Es bleibt unklar, ob die Tiere infolge eines exokrinen oder endokrinen Kollapses oder aufgrund einer Kombination aus beidem starben. Dennoch ermöglichen die vorgestellten Mausmodelle eine systemweite Regulation von Autophagie. Daher stellen sie eine wertvolle und vielseitige Methode für die zukünftige Autophagie- und Krebs-Forschung dar. Ein Argininosuccinate Synthase 1 (ASS1)-Mangel in PDAC-Patienten wird mit einem höheren Rezidiv, einem kürzeren krankheitsfreien Überleben und einem kürzeren Gesamtüberleben in Verbin-dung gebracht. Im Laufe der Entwicklung eines Tumors kommt es häufig zum Verlust essentieller Enzyme, wie ASS1 oder OTC, innerhalb der Arginine de novo Synthese. Bekannt als ‘Arginin-Auxotrophie‘, hat dies die Abhängig von extrazellulärem Arginine zur Folge. Basierend auf dieser Annahme, wurde die Sensibilität verschiedener Tumorzelllinien auf Argininentzug nachgewiesen. Jedoch ist der zugrunde liegende Mechanismus noch unklar und die Wirksamkeit nicht ausreichend, um alle Tumorzellen zu zerstören. Aus diesem Grund wurde der Effekt von Argininentzug mittels rhArgI-PEG5000-Behandlung auf murine und humane PDAC-Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Argininentzug Akkumulation von Autophagosomen, die Induktion von Seneszenz und die ISR zur Folge hatte. Diese Veränderungen stellen potentielle genetische Schwachstellen dar, die in Kombination mit anderen Medikamenten behandelt werden könnten, um Tumorzelltod zu induzieren. KW - Arginine KW - Autophagy KW - tumor metabolism KW - targeted therapy Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211480 ER - TY - THES A1 - Börner, Kevin T1 - How CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells T1 - Wie CLEC16A die Funktion von Thymus-Epithelzellen beeinflusst N2 - Genomweite Assoziationsstudien haben CLEC16A als ein Suszeptibilitätsgen für Typ 1 Diabetes und weitere Autoimmunerkrankungen identifiziert. Die genaue Funktion von CLEC16A bleibt jedoch ungeklärt. Studien zeigten, dass sowohl das Drosophila Ortholog ema als auch das murine Clec16a eine Rolle in Autophagie spielen. Autophagie trägt zur Beladung der MHC-Klasse-II Moleküle und somit der Antigenpräsentation bei. Darüber hinaus konnten Studien belegen, dass Autophagie zur Antigenpräsentation während der T-Zell Selektion in Thymus-Epithelzellen benötigt wird. Dies schlägt eine mögliche Funktion von CLEC16A in Thymus-Epithelzellen während der T-Zell Selektion vor. Außerdem berichteten Arbeiten, dass CLEC16A als quantitativer Trait Locus für seine Nachbargene fungiert und dass Clec16a KD in Langerhans Inseln im Pankreas die Insulinsekretion und den Glukosestoffwechsel beeinträchtigt. Dieser Arbeit vorausgehend hatten Schuster et al. eine Clec16a KD NOD Maus generiert, welche vor spontanem autoimmunem Diabetes geschützt war. Für diese Arbeit wurde vermutet, dass CLEC16A als Suszeptibilitätsgen für Typ 1 Diabetes den Prozess der Autophagie in Thymus-Epithelzellen beeinträchtigt und somit Antigenpräsentation und das T-Zell Repertoire beeinflusst. Um auf der Vorarbeit von Schuster et al. aufzubauen und diese zu ergänzen, zielte diese Arbeit darauf ab, den Einfluss von CLEC16A auf Thymus-Epithelzellen zu untersuchen. Hierfür wurde ein CLEC16A KD in menschlichen Zellen mittels RNA Interferenz erzeugt und Autophagie durch Immunoblotting untersucht. Zusätzlich wurde die Entzündung im Pankreasgewebe von Clec16a KD NOD Mäusen mittels H.E. Färbung beurteilt und bewertet. Thymus-Transplanationen wurden durchgeführt, um zu sehen, ob der Einfluss von Clec16a KD T-Zell intrinsisch ist. Außerdem wurden intraperitoneale Glukosetoleranztests durchgeführt, um den Blutzuckerstoffwechsel in Clec16a KD Mäusen zu beurteilen. Schließlich wurden mittels qPCR Expressionslevel der benachbarten Gene, wie zum Beispiel Dexi und Socs1, erhoben, um die Eigenschaften von CLEC16A als quantitativer Trait Locus einzuordnen. Gemeinsam mit den Ergebnissen von Schuster et al. kann diese Arbeit aufzeigen, dass Clec16a KD die Ausprägung von Insulitis im Pankreas reduziert und Clec16a KD NOD Mäuse vor spontanem Autoimmundiabetes schützt. Dieser Schutz vor Erkrankung wird durch beeinträchtigte Autophagie in Thymus-Epithelzellen hervorgerufen, welche die T-Zell Selektion beeinflusst und die Reaktivität von T-Zellen reduziert. Der Einfluss des Clec16a KD ist innerhalb des Thymus wirksam. Der Blutzuckerstoffwechsel in Clec16a KD NOD Mäusen bleibt unverändert und kann deshalb als Ursache für den Schutz vor Type 1 Diabetes ausgeschlossen werden. Clec16a und Dexi zeigen ähnliche Expressionslevel auf, dennoch benötigt es weitere detaillierte Studien, um eine Beziehung zwischen den beiden Genen etablieren zu können. Letztlich konnte die Beeinträchtigung von Autophagie in menschlichen CLEC16A KD Zellen nachgewiesen werden, was bedeutet, dass die Funktion von CLEC16A evolutionär konserviert ist und ein möglicher Zusammenhang zwischen CLEC16A Polymorphismen und einem erhöhten Risiko für Typ 1 Diabetes im Menschen besteht. N2 - Genome-wide association studies revealed CLEC16A as a candidate gene for Type 1 Diabetes and multiple other autoimmune disorders. The function of CLEC16A remains unknown. However, previous work showed that the CLEC16A ortholog ema and the murine Clec16a were both implicated in autophagy, a process partially required for MHC class II loading and antigen presentation. Furthermore, studies could show that autophagy was required in thymic epithelial cells for antigen presentation during T cell selection, suggesting a possible role of CLEC16A in T cell selection in the thymus. Additionally, it was postulated that CLEC16A may function as an expression quantitative trait locus for its neighboring genes and that Clec16a KD was involved in pancreatic islet function and impaired insulin secretion and glucose homeostasis. Prior to this work, Schuster et al. had created a Clec16a KD NOD mouse, which was protected from spontaneous autoimmune diabetes. For this work it was hypothesized that CLEC16A variation serves as a Type 1 Diabetes risk gene by affecting autophagy in thymic epithelial cells, which modulates antigen presentation and shapes the T cell repertoire. To expand and complement previous findings by Schuster et al., this thesis aimed to investigate how CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells. For this purpose, CLEC16A KD was induced in human cells via RNA interference and autophagy was studied through immunoblotting. Additionally, inflammation of pancreatic tissue in Clec16a KD NOD mice was scored using H.E. stained pancreatic sections. Thymic transplantation experiments were conducted to test whether the effects of Clec16a KD were T cell intrinsic. Also, intraperitoneal glucose tolerance tests were performed to study glucose homeostasis in Clec16a KD NOD animals. Finally, using qPCR, gene expression levels of neighboring genes such as Dexi and Socs1 were measured to study Clec16a as an expression quantitative trait locus. In combination with the findings of Schuster et al., this thesis demonstrates that Clec16a KD reduces the severity of insulitis and protects from onset of spontaneous diabetes in the NOD mouse. Disease protection is conveyed by impaired autophagy in TEC, which leads to altered T cell selection and hyporeactive CD4+ T cells. The effects of Clec16a KD in the NOD mouse are thymus intrinsic. Glucose homeostasis remains unchanged in the Clec16a KD NOD mouse and plays no role in disease protection. Clec16a and Dexi presented similar expression levels, but further studies are required to investigate a clear link between these two genes. Finally, impaired autophagy could be replicated in human CLEC16A KD cells, which demonstrates a conserved function of CLEC16A and suggests a possible link between CLEC16A variation and risk of autoimmune disease in human. KW - Thymus KW - Toleranz KW - Autoimmunität KW - Diabetes mellitus Typ 1 KW - Epithelzelle KW - CLEC16A KW - T cell selection KW - Antigen presentation KW - Autophagy KW - Autoimmunity KW - T Zell Selektion KW - Antigenpräsentation KW - Autophagie Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200230 ER -