TY - THES A1 - Stoll, Georg T1 - Identification of the mRNA-associated TOP3β- TDRD3-FMRP (TTF) -complex and its implication for neurological disorders T1 - Identifikation des mRNA-assoziierten TOP3β-TDRD3-FMRP (TTF) -Komplex und seine Bedeutung für neurologische Störungen N2 - The propagation of the genetic information into proteins is mediated by messenger- RNA (mRNA) intermediates. In eukaryotes mRNAs are synthesized by RNA- Polymerase II and subjected to translation after various processing steps. Earlier it was suspected that the regulation of gene expression occurs primarily on the level of transcription. In the meantime it became evident that the contribution of post- transcriptional events is at least equally important. Apart from non-coding RNAs and metabolites, this process is in particular controlled by RNA-binding proteins, which assemble on mRNAs in various combinations to establish the so-called “mRNP- code”. In this thesis a so far unknown component of the mRNP-code was identified and characterized. It constitutes a hetero-trimeric complex composed of the Tudor domain-containing protein 3 (TDRD3), the fragile X mental retardation protein (FMRP) and the Topoisomerase III beta (TOP3β) and was termed TTF (TOP3β-TDRD3-FMRP) -complex according to its composition. The presented results also demonstrate that all components of the TTF-complex shuttle between the nucleus and the cytoplasm, but are predominantly located in the latter compartment under steady state conditions. Apart from that, an association of the TTF-complex with fully processed mRNAs, not yet engaged in productive translation, was detected. Hence, the TTF-complex is a component of „early“ mRNPs. The defined recruitment of the TTF-complex to these mRNPs is not based on binding to distinct mRNA sequence-elements in cis, but rather on an interaction with the so-called exon junction complex (EJC), which is loaded onto the mRNA during the process of pre-mRNA splicing. In this context TDRD3 functions as an adapter, linking EJC, FMRP and TOP3β on the mRNP. Moreover, preliminary results suggest that epigenetic marks within gene promoter regions predetermine the transfer of the TTF-complex onto its target mRNAs. Besides, the observation that TOP3β is able to catalytically convert RNA-substrates disclosed potential activities of the TTF-complex in mRNA metabolism. In combination with the already known functions of FMRP, this finding primarily suggests that the TTF-complex controls the translation of bound mRNAs. In addition to its role in mRNA metabolism, the TTF-complex is interesting from a human genetics perspective as well. It was demonstrated in collaboration with researchers from Finland and the US that apart from FMRP, which was previously linked to neurocognitive diseases, also TOP3β is associated with neurodevelopmental disorders. Understanding the function of the TTF-complex in mRNA metabolism might hence provide important insight into the etiology of these diseases. N2 - Die Umwandlung der genetischen Information in Proteine erfolgt über Boten-RNA (mRNA) -Intermediate. Diese werden in Eukaryonten durch die RNA-Polymerase II gebildet und nach diversen Prozessierungs-Schritten der Translationsmaschinerie zugänglich gemacht. Während man früher davon ausging, dass die Genexpression primär auf der Ebene der Transkription reguliert wird, ist heute klar, dass post- transkriptionelle Prozesse einen ebenso wichtigen Beitrag hierzu leisten. Neben nicht-kodierenden RNAs und Metaboliten tragen insbesondere RNA- Bindungsproteine zur Kontrolle dieses Vorgangs bei. Diese finden sich in unterschiedlichen Kombinationen auf den mRNAs zusammen und bilden dadurch den sog. „mRNP-Code“ aus. Im Rahmen dieser Dissertation wurde eine bislang unbekannte Komponente des mRNP-Codes identifiziert und charakterisiert. Es handelt es sich dabei um einen hetero-trimeren Komplex, welcher aus dem Tudor Domänen Protein 3 (TDRD3) dem Fragilen X Mentalen Retardations-Protein (FMRP) sowie der Topoisomerase III beta (TOP3β) besteht. Aufgrund seiner Zusammensetzung wurde dieser TTF (TOP3β-TDRD3-FMRP) -Komplex genannt. In der vorliegenden Arbeit konnte der Nachweis geführt werden, dass sämtliche Komponenten des TTF-Komplexes zwischen Zellkern und Cytoplasma pendeln, unter Normalbedingungen jedoch vornehmlich im Cytoplasma lokalisiert sind. Des Weiteren ließ sich eine Assoziation des TTF-Komplexes mit mRNAs nachweisen, die zwar vollständig prozessiert, jedoch noch nicht Teil der produktiven Phase der Translation sind. Der TTF-Komplex ist somit eine Komponente „früher“ mRNPs. Die Rekrutierung des TTF-Komplexes an definierte mRNPs wird nicht durch Bindung an spezifische mRNA-Sequenzelemente bedingt, sondern basiert auf einer Interaktion mit dem sog. Exon Junction Complex (EJC), welcher im Kontext des pre-mRNA Spleißens auf die mRNA geladen wird. Hierbei spielt TDRD3 als Adapter zwischen dem EJC, FMRP und TOP3β die entscheidende Rolle. Präliminäre Experimente legen darüber hinaus den Schluss nahe, dass epigenetische Markierungen im Promotor-Bereich distinkter Gene von entscheidender Bedeutung für den Transfer des TTF-Komplexes auf dessen Ziel-mRNAs sind. Einen wichtigen ersten Hinweis auf die potentielle Funktion des TTF-Komplexes im Kontext des mRNA Metabolismus erbrachte die Beobachtung, dass TOP3β in der Lage ist RNA katalytisch umzusetzen. Dieser Befund lässt in Verbindung mit den bereits beschriebenen Aktivitäten von FMRP vermuten, dass der TTF-Komplex die Translation gebundener mRNAs kontrolliert. Zusätzlich zu seiner Rolle im mRNA Metabolismus ist der TTF-Komplex auch aus humangenetischer Sicht hoch interessant. So konnte in Zusammenarbeit mit finnischen und US-amerikanischen Forschern gezeigt werden, dass neben FMRP, einem bekannten Krankheitsfaktor neurokognitiver Syndrome, auch TOP3β mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert ist. Das Verständnis der Funktion des TTF-Komplexes im mRNA Metabolismus könnte daher wichtige Einblicke in die Etiologie dieser Krankheiten liefern. KW - Messenger-RNS KW - Messenger-RNP KW - RNA binding proteins KW - mRNA metabolism KW - eukaryotic gene expression Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111440 ER - TY - THES A1 - Brosi, Cornelia T1 - Functional characterization of the TTF complex and its role in neurodevelopmental disorders T1 - Funktionelle Charakterisierung des TTF-Komplexes und seine Rolle in neurologischen Entwicklungsstörungen N2 - The eukaryotic gene expression requires extensive regulations to enable the homeostasis of the cell and to allow dynamic responses due to external stimuli. Although many regulatory mechanisms involve the transcription as the first step of the gene expression, intensive regulation occurs also in the post-transcriptional mRNA metabolism. Thereby, the particular composition of the mRNPs plays a central role as the components associated with the mRNA form a specific “mRNP code” which determines the fate of the mRNA. Many proteins which are involved in this regulation and the mRNA metabolism are affected in diseases and especially neurological disorders often result from an aberrant mRNP code which leads to changes in the regulation and expression of mRNPs. The focus of this work was on a trimeric protein complex which is termed TTF complex based on its subunits TDRD3, TOP3β and FMRP. Biochemical investigations revealed that the three components of the TTF complex are nucleo-cytosolic shuttle proteins which localize in the cytoplasm at the steady-state, associate with mRNPs and are presumably connected to the translation. Upon cellular stress conditions, the TTF components concentrate in stress granules. Thus, the TTF complex is part of the mRNP code, however its target RNAs and function are still completely unknown. Since the loss of functional FMRP results in the fragile X syndrome and TOP3β is associated with schizophrenia and intellectual disability, the TTF complex connects these phenotypically related neuro-psychiatric disorders with each other on a molecular level. Therefore, the aim of this work was to biochemically characterize the TTF complex and to define its function in the mRNA metabolism. In this work, evidence was provided that TDRD3 acts as the central unit of the TTF complex and directly binds to FMRP as well as to TOP3β. Thereby, the interaction of TDRD3 and TOP3β is very stable, whereas FMRP is a dynamic component. Interestingly, the TTF complex is not bound directly to mRNA, but is recruited via the exon junction complex (EJC) to mRNPs. This interaction is mediated by a specific binding motif of TDRD3, the EBM. Upon biochemical and biological investigations, it was possible to identify the interactome of the TTF complex and to define the role in the mRNA metabolism. The data revealed that the TTF complex is mainly associated with “early” mRNPs and is probably involved in the pioneer round of translation. Furthermore, TOP3β was found to bind directly to the ribosome and thus, establishes a connection between the EJC and the translation machinery. A reduction of the TTF components resulted in selective changes in the proteome in cultured cells, whereby individual protein subsets seem to be regulated rather than the global protein expression. Moreover, the enzymatic analysis of TOP3β indicated that TOP3β is a type IA topoisomerase which can catalytically attack not only DNA but also RNA. This aspect is particularly interesting with regard to the connection between early mRNPs and the translation which has been revealed in this work. The data obtained in this work suggest that the TTF complex plays a role in regulating the metabolism of an early mRNP subset possibly in the course of the pioneer round of translation. Until now, the link between an RNA topoisomerase and the mRNA metabolism is thereby unique and thus provides a completely new perspective on the steps in the post-transcriptional gene expression and its regulation. N2 - Die eukaryotische Genexpression bedarf einer umfassenden Regulation um die Homöostase der Zelle zu gewährleisten und um dynamische Reaktionen auf externe Einflüsse zu ermöglichen. Obwohl viele der regulatorischen Mechanismen die Transkription als ersten Schritt der Genexpression betreffen, findet auch eine intensive Regulierung auf der Ebene des post-transkriptionellen mRNA-Metabolismus statt. Dabei spielt die jeweilige Zusammensetzung der mRNPs eine zentrale Rolle, da je nachdem, mit welchen Faktoren eine mRNA assoziiert ist, ein sog. „mRNP-Code“ entsteht, der das Schicksal der mRNA bestimmt. Viele der an der Regulierung und dem mRNA-Metabolismus beteiligten Proteine sind in Krankheiten betroffen und gerade neurologische Erkrankungen resultieren häufig von einem fehlerhaften mRNP-Code, der zu Veränderungen in der Regulation und Expression von mRNPs führt. Im Zentrum dieser Arbeit stand ein trimerer Proteinkomplex, der aufgrund seiner Untereinheiten TDRD3, TOP3β und FMRP als TTF-Komplex bezeichnet wird. Biochemische Daten haben gezeigt, dass die drei Komponenten des TTF-Komplexes nucleo-cytoplasmatische „Shuttle“-Proteine sind, die sich im „steady-state“ hauptsächlich im Cytoplasma befinden, mit mRNPs assoziieren und vermutlich mit der Translation in Verbindung stehen. Unter zellulären Stressbedingungen konzentrieren sich die TTF-Komponenten in Stress Granula. Der TTF-Komplex ist damit Teil des mRNP-Codes, dessen zelluläre Ziel-RNAs und Funktion bislang aber völlig unbekannt sind. Da der Verlust von funktionellem FMRP zu der Ausprägung des fragilen X Syndroms (FXS) führt und TOP3β mit Schizophrenie und geistiger Retardation in Verbindung steht, verbindet der TTF-Komplex phänotypisch verwandte neuro-psychiatrische Krankheiten auf molekularer Ebene miteinander. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den TTF-Komplex biochemisch zu charakterisieren und seine Funktion im mRNA-Metabolismus zu definieren. Im Zuge dieser Arbeit gelang der Nachweis, dass TDRD3 als zentrale Einheit des TTF-Komplexes agiert und sowohl FMRP als auch TOP3β direkt bindet. Die Interaktion von TDRD3 und TOP3β ist hierbei sehr stabil, FMRP ist hingegen eine dynamische Komponente. Interessanterweise wird der TTF-Komplex nicht direkt an mRNA gebunden, sondern über den Exon-Junction-Komplex (EJC) an mRNPs rekrutiert. Diese Interaktion wird durch ein spezifisches Bindungsmodul in TDRD3, dem sog. EBM vermittelt. In einer Reihe von biochemischen und systembiologischen Studien konnte das Interaktom des TTF-Komplexes bestimmt und seine Rolle im mRNA-Metabolismus definiert werden. Die Daten offenbarten, dass der TTF-Komplex primär mit „frühen“ mRNPs assoziiert ist und sehr wahrscheinlich an der „pioneer round of translation“ beteiligt ist. Weiterhin zeigte sich, dass TOP3β das Ribosom direkt bindet und somit eine Verbindung des EJC und der Translationsmaschinerie etabliert. Die Reduktion von Komponenten des TTF-Komplexes in kultivierten Zellen führte zu selektiven Änderungen im Proteom, wobei einzelne Proteinteilgruppen, jedoch nicht die globale Expression durch den TTF-Komplex reguliert zu sein scheinen. Die enzymatische Analyse von TOP3β hat darüber hinaus gezeigt, dass es sich um eine Topoisomerase vom Typ IA handelt, die nicht nur DNA sondern auch RNA angreifen kann. Dieser Aspekt ist besonders interessant im Zusammenhang der in dieser Arbeit aufgedeckten Verbindung von frühen mRNPs mit der Translation. Die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten legen nahe, dass der TTF-Komplex eine Rolle bei der Regulation des Metabolismus „früher“ mRNP-Teilgruppen möglicherweise im Zuge der „Pionierrunde“ der Translation spielt. Dabei ist die Verbindung einer RNA-Topoisomerase mit dem mRNA-Metabolismus bisher einzigartig und eröffnet so eine ganz neue Sichtweise auf die post-transkriptionellen Schritte der Genexpression und ihre Regulation. KW - Messenger-RNP KW - Fragiles-X-Syndrom KW - Schizophrenie KW - Translation KW - Gene Expression KW - TTF complex KW - TDRD3 KW - TOP3b KW - FMRP Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157783 ER -