TY - THES A1 - Kühnreich, Raphael T1 - Development and Validation of Methods for Impurity Profiling of Amino Acids T1 - Entwicklung und Validierung von Methoden für die Reinheitsanalytik von Aminosäuren N2 - The requirements for the impurity profiling of substances for pharmaceutical use have become greater over time. They can be accomplished by the use of modern instrumental analysis techniques, which have been evolved in the last decades. New types of columns with HILIC, mixed-mode and chiral stationary phases are suitable for the separation of all kinds of substances mixtures, that were previously hardly possible with the use of common reversed phase columns. Modern, almost universal detectors like CAD, ELSD and CNLSD can be applied for a sensitive detection of substances without a chromophore. However, in addition to some small individual disadvantages to these methods, the costs are high and applications are still kind of rare. Thus, the introduction of these devices at a broader level has not yet taken place. While this presumably will change over time, there is a need for methods that enable the impurity profiling of challenging substances with widespread analytics devices. Methionine is a substance with hydrophobic and hydrophilic impurities. With the help of a mixed-mode stationary phase, which is a combination of a reversed phase and a strong cationic exchanger, the separation of all putative impurities was found possible with good sensitivity and selectivity. The method requires apart from the column only standard isocratic HPLC equipment and was successfully validated. The evaluation of the enantiomeric purity of amino acids is challenging. Two approaches were made. The first method utilizes CE by means of in-capillary derivation with OPA and the subsequent separation with a cyclodextrin. With the use of OPA/NAC and γ-cyclodextrin, a simple and cost-effective method for the indirect enantioseparation of 16 amino acids was developed. With the second approach, racemic amino acids can be analyzed with HPLC and in-needle derivatization. For this, different columns and chiral thiols were evaluated and the chromatographic parameters were optimized. A method with OPA/NIBLC, a pentafluorophenyl column made the enantioseparation of 17 amino acids feasible. A LOQ of the minor enantiomer down to 0.04 % can be achieved with UV spectrophotometric detection. A similar method was developed for impurity profiling of L-amino acids. This can be used alternatively for the amino acid analysis performed by the European Pharmacopoeia. A simple, robust, precise and accurate method for the evaluation of impurities in glyceryl trinitrate solution was developed and validated. The four impurities of glyceryl trinitrate are separated by means of an acetonitrile-water gradient and the assay for this substance is also possible. N2 - Die Anforderungen an die Reinheitsanalytik von Substanzen für pharmazeutische Zwecke sind mit der Zeit größer geworden. Diese können durch die Verwendung von modernen instrumentellen Analysetechniken, die sich in den letzten Jahrzehnten entwickelt haben, erfüllt werden. Neue Arten von Säulen mit HILIC, mixed-mode und chiralen Phasen sind geeignet für die Trennung von allen möglichen Substanzgemischen, die vorher mit der Verwendung von gewöhnlichen Umkehrphasensäulen kaum möglich waren. Moderne, fast universelle Detektoren wie CAD, ELSD und CNLSD können für eine sensitive Detektion von Substanzen ohne Chromophor verwendet werden. Allerdings, neben ein paar individuellen Nachteilen von diesen Methoden, sind die Kosten sehr hoch und die Anwendungen noch eher selten. Daher haben sich diese Geräte noch nicht auf breiter Ebene durchgesetzt. Auch wenn sich das mit der Zeit ändern wird, gibt es die Notwendigkeit für Analysemethoden mit denen die Reinheitsanalytik von herausfordernden Substanzen auf verbreiteten analytischen Geräten ermöglicht wird. Methionin ist eine Substanz mit hydrophilen und hydrophoben Verunreinigungen. Mit der Hilfe einer „mixed-mode“-Phase, welche eine Kombination aus Umkehrphase und starker Kationenaustauscher ist, wurde die Trennung von allen mutmaßlichen Verunreinigungen mit guter Sensitivität und Selektivität ermöglicht. Die Methode benötigt abgesehen von der Säule nur eine normale isokratische HPLC und wurde erfolgreich validiert. Die Untersuchung der chiralen Reinheit von Aminosäuren ist anspruchsvoll. Zwei Ansätze wurden durchgeführt. Die erste Methode verwendet CE mittels In-Capillary- Derivatisierung durch OPA und der anschließenden Trennung mit Hilfe von einem Cyclodextrin. Durch den Gebrauch von OPA/NAC und γ-Cyclodextrin, wurde eine einfache und kosteneffektive Methode für die indirekte Enantioseparation von 16 Aminosäuren entwickelt. Mit dem zweiten Ansatz können Aminosäuren mittels HPLC und einer In-Needle- Derivatisierung analysiert werden. Dafür wurden verschiedene Säulen und chirale Thiole getestet und die chromatographischen Parameter optimiert. Eine Methode mit OPA/NIBLC, einer Pentafluorophenyl-Säule ermöglichte die Trennung on 17 Aminosäuren. Ein LOQ des kleinen Enantiomers von 0,04 % kann mit UV-spektroskopischer Detektion erreicht werden. Eine ähnliche Methode wurde für die Reinheitsanalytik von L-Aminosäuren entwickelt. Diese kann alternativ zur Aminosäurenanalyse im Europäischen Arzneibuch verwendet werden. Zusammenfassung 163 Eine einfache, robuste, präzise und richtige Methode zur Untersuchung der Verunreinigungen in Glyceryltrinitratlösung wurde entwickelt und validiert. Die vier Verunreinigungen von Glyceryltrinitrat werden mit Hilfe eines Acetonitril-Wasser-Gradienten getrennt und die Gehaltsbestimmung dieser Substanz ist ebenfalls möglich. KW - Aminosäuren KW - HPLC KW - Enantiomere KW - Trennung KW - amino acid KW - impurity profiling KW - chiral separation KW - Aminosäure KW - Reinheitsanalytik KW - chirale Trennung Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145718 ER - TY - THES A1 - Almeling, Stefan T1 - The use of aerosol-based detection systems in the quality control of drug substances T1 - Die Verwendung von aerosol-basierten Detektionssystemen in der Qualitätskontrolle von Arneiwirkstoffen N2 - The work presented in this thesis was mainly targeted at exploring the capabilities of evaporation based LC detectors as well as further alternatives for the control of impurities in substances not exhibiting a suitable chromophore for UV-detection. In the course of the work carried out, several new methods for the identification, impurities control and composition testing of APIs were elaborated. An evaporation based detector that entered into the field of pharmaceutical analysis in the recent years was the Evaporative Light Scattering Detector (ELSD). However, non-reproducible spikes were reported when injecting concentrated test solutions as they are usually required for the control of impurities. The reasons, for the appearance of these spikes as well as possibilities for their avoidance were explored in a systematic study. Moreover, the dependence of the detector sensitivity on different eluent composition, eluent flow-rate and ELSD settings was investigated. In the course of the revision of the Ph.Eur. monographs for aspartic acid and alanine, a C18 reversed phase ion-pair LC method using 1 mmol/L of perfluoroheptanoic acid as an ion-pair reagent and a charged aerosol detector (CAD) was developed and fully validated for the purity control of Asp. The method was capable of separating the organic acids and major amino acids known to occur as process related impurities. With a slight modification, the method was also applicable for the purity control of Ala. Based on the developed LC-CAD method for the impurity control of alanine, a comparative study of the performance characteristics of different evaporation based LC detectors, i.e. ELSD, CAD and the recently developed Nano Quantity Analyte Detector (NQAD) was carried out. Additionally, an MS detector and qNMR were included in this study. It was found that the control of impurities in Alanine at an ICH conform level could be ensured using LC coupled to CAD, MSD and NQAD detection as well as by the use of qNMR. In terms of performance, prize and ease of use CAD and NQAD were found to be the most suitable alternatives. In terms of repeatability and sensitivity, the CAD appeared slightly superior to the NQAD. The quality of streptomycin sulfate is not sufficiently controlled by the current Ph.Eur. monograph in that an appropriate test for the control of the related substances is missing. A study was carried out to develop a C18 reversed phase ion-pair LC method using pentafluoropropionic acid as an ion-pair reagent and a CAD for the identification and control of the related substances. The developed method allowed the separation of 21 impurities from streptomycin. Moreover, coupling of the method to MS allowed the identification of the separated impurities. The method was shown to be sufficiently sensitive to control the related substances with a disregard limit of 0.1% as it is normally applied in the Ph.Eur. for products derived from fermentation. Currently, the aescin content of horse-chestnut standardized dry extract is determined using a complex and laborious photometric determination. A more selective LC-UV assay determination for beta-aescin has been proposed for the Ph.Eur. draft monograph of horse-chestnut standardized dry extract. Possibilities were explored to further improve the LC-method using detection by CAD. It was demonstrated that by the use of a modified LC-CAD method several problems related to the differences in the UV-response of the various components contained in the active aescin fraction could be eliminated. Moreover the proposed reference standard strategy was reviewed. Eventually, it was demonstrated on the example of two different clusters of pharmacologically active peptides how low energy collision induced dissociation mass spectrometry (low energy CID-MS) can successfully be used for identification testing in pharmacopoeial monographs. In this respect, the combination of a direct confirmation of the molecular mass via the m/z-ratio of the molecule ions with structural sequence information obtained by low energy CID-MS experiments was found to deliver a higher degree of certainty of the identity of a given substance than the set of tests currently described in the monographs. A significant gain in efficiency and throughput and important reduction of the amount of sample consumed during testing were identified as being additional advantages of this approach. Taken together, it could be demonstrated on various examples how recent technological advancements in the field of analytical chemistry can contribute to improve the quality control of APIs. N2 - Die durchgeführten Arbeiten hatten zum Ziel, das Potential von evaporationsbasierten HPLC-Detektoren sowie weiterer moderner Techniken hinsichtlich ihrer Eignung zur Reinheitsprüfung von pharmazeutischen Wirkstoffen zu untersuchen. Im Zuge der Arbeiten wurden verschiedene neue Methoden zur Identifizierung, Verunreinigungskontrolle und zur Überprüfung der Zusammensetzung von pharmazeutischen Wirkstoffen entwickelt. Ein evaporationsbasierter Detektor, der in den letzten Jahren Einzug in die pharmazeutische Analytik gehalten hat, ist der Lichtstreudetektor (ELSD). Allerdings wurde berichtet, dass es im Zusammenhang mit der Injektion konzentrierter Testlösungen zum Auftreten nicht reproduzierbarer Spikes kam. In einer systematischen Studie wurden die Gründe hierfür ermittelt und gleichzeitig Möglichkeiten ihrer Vermeidung aufgezeigt. Darüber hinaus wurde die Abhängigkeit der Empfindlichkeit des Detektors von der Zusammensetzung der mobilen Phase, der LC-Flußrate und den Einstellungen des ELSD untersucht. Im Zuge der Revision der Monografien für Asparaginsäure und Alanin wurde eine C18-Ionenpaar-HPLC-Methode unter Verwendung von 1 mmol/L Perfluorheptansäure und Detektion mittels eines geladenen Sprühnebeldetektors (Charged Aerosol Detector – CAD) für die Reinheitskontrolle von Asparaginsäure entwickelt und validiert. Mit Hilfe dieser Methode konnten sowohl organische Säuren als auch die wesentlichen Aminosäuren, die als prozessrelevante Verunreinigungen bekannt sind, abgetrennt werden. Nach geringfügiger Modifikation konnte diese Methode auch zur Reiheitskontrolle von Alanin eingesetzt werden. Basierend auf der HPLC-CAD-Methode für Alanin wurde eine vergleichende Studie der Leistungsfähigkeit verschiedener evaporationsbasierter HPLC-Detektoren durch-geführt. Untersucht wurden der ELSD, der CAD und der kürzlich entwickelte „Nano Quantity Analyte Detektor“ (NQAD). Weiterhin wurden ein massenspektrometrischer Detektor (MSD) sowie die Quantifizierung mittels NMR-Spektroskopie (qNMR) in die Untersuchung einbezogen. Im Ergebnis war die Reinheitskontrolle von Alanin auf einem ICH konformen Niveau unter Verwendung des CAD, NQAD und MSD sowie mittels qNMR möglich. Hinsichtlich der Kriterien Leistungsfähigkeit, Preis und Benutzerfreundlichkeit waren der CAD und der NQAD die geeignetsten Alternativen. Bezüglich Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit war der CAD dem NQAD leicht überlegen. Die Qualität von Streptomycinsulfat wird von der aktuellen Arzneibuchmonografie mangels eines geeigneten Reinheitstests nicht ausreichend kontrolliert. Aus diesem Grund wurde eine C18-Ionenpaar-HPLC-Methode unter Verwendung von Perfluorpropionsäure und Detektion mittels CAD zur Identifizierung und Kontrolle der Verunreinigungen entwickelt. Mit dieser Methode konnten 21 Verunreinigungen von Streptomycin abgetrennt und nach massenspektormetrischer Kopplung identifiziert werden. Die Methode erwies sich als ausreichend empfindlich, um Verunreinigungen mit einer Ausschlussgrenze von 0.1%, wie sie im Europäischen Arzneibuch für Fermentationsprodukte üblicherweise angewandt wird, zu kontrollieren. Derzeit wird der Aescingehalt in standardisiertem Rosskastanien-Trockenextrakt mittels einer komplexen photometrischen Methode bestimmt. Für den entsprechen-den Entwurf einer Monografie des Europäischen Arzneibuchs wurde eine selektivere HPLC-UV-Methode vorgeschlagen. Die Möglichkeiten einer weiteren Verbesserung dieser Methode unter Verwendung des CAD wurden untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine modifizierte HPLC-CAD-Methode geeignet ist, Probleme, die sich aus der unterschiedlichen UV-Absorption der im Aescingemisch enthaltenen Substanzen ergeben, zu eliminieren. Weiterhin wurde die vorgeschlagene Referenzstandard Strategie überprüft. Abschließend wurde am Beispiel von zwei Gruppen pharmakologisch wirksamer Peptide nachgewiesen, wie kollisionsinduzierte Massenspektrometrie (CID-MS) erfolgreich für die Identitätskontrolle in Arzneibuchmongrafien eingesetzt werden kann. Diesbezüglich erbrachte die Kombination der direkten Massenbestätigung mittels des m/z-Verhältnisses des Molekül-Ions mit den aus dem CID-MS-Experiment erhaltenen Informationen ein höheres Maß an Gewissheit hinsichtlich der Identitätsbestätigung als die derzeit beschriebenen Tests. Als weitere Vorteile dieses Ansatzes wurden ein wesentlicher Effizienzgewinn sowie eine erhebliche Reduktion des durch die Testung verbrauchten Probenmaterials identifiziert. Zusammenfassend zeigen die Arbeiten an verschiedenen Beispielen, wie aktuelle Entwicklungen im Bereich der analytischen Chemie dazu beitragen können, die Qualitätskontrolle von Arzneimittelwirkstoffen zu verbessern. KW - Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie KW - Qualitätskontrolle KW - Arzneimittel KW - Reinheitsanalytik KW - evaporationsbasierte Detektoren KW - Charged Aerosol Detektion KW - Streptomycin KW - Aminosäuren KW - Aescin KW - HPLC KW - Europäsches Arzneibuch KW - Purity control KW - evaporation based detectors KW - charged aerosol detector KW - Streptomycin KW - Amino acids KW - Aescin Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64722 ER -