TY - THES A1 - Schäfer, Matthias T1 - Molecular mechanisms of floor plate formation and neural patterning in zebrafish T1 - Molekulare Mechanismen der Bodenplatten Entwicklung und neuronale Musterbildung im Zebrafisch N2 - The vertebrate spinal cord is composed of billions of neurons and glia cells, which are formed in a highly coordinated manner during early neurogenesis. Specification of these cells at distinct positions along the dorsoventral (DV) axis of the developing spinal cord is controlled by a ventrally located signaling center, the medial floor plate (MFP). Currently, the origin and time frame of specification of this important organizer are not clear. During my PhD thesis, I have analyzed the function of the novel secreted growth factor Midkine-a (Mdka) in zebrafish. In higher vertebrates, mdk and the related factor pleiotrophin (ptn) are widely expressed during embryogenesis and are implicated in a variety of processes. The in-vivo function of both factors, however, is unclear, as knock-out mice show no embryonic phenotype. We have isolated two mdk co-orthologs, mdka and mdkb, and one single ptn gene in zebrafish. Molecular phylogenetic analyses have shown that these genes evolved after two large gene block duplications. In contrast to higher vertebrates, zebrafish mdk and ptn genes have undergone functional divergence, resulting in mostly non-redundant expression patterns and functions. I have shown by overexpression and knock-down analyses that Mdka is required for MFP formation during zebrafish neurulation. Unlike the previously known MFP inducing factors, mdka is not expressed within the embryonic shield or tailbud but is dynamically expressed in the paraxial mesoderm. I used epistatic and mutant analyses to show that Mdka acts independently from these factors. This indicates a novel mechanism of Mdka dependent MFP formation during zebrafish neurulation. To get insight into the signaling properties of zebrafish Mdka, the function of both Mdk proteins and the candidate receptor Anaplastic lymphoma kinase (Alk) have been compared. Knock-down of mdka and mdkb resulted in the same reduction of iridophores as in mutants deficient for Alk. This indicates that Alk could be a putative receptor of Mdks during zebrafish embryogenesis. In most vertebrate species a lateral floor plate (LFP) domain adjacent to the MFP has been defined. In higher vertebrates it has been shown that the LFP is located within the p3 domain, which forms V3 interneurons. It is unclear, how different cell types in this domain are organized during early embryogenesis. I have analyzed a novel homeobox gene in zebrafish, nkx2.2b, which is exclusively expressed in the LFP. Overexpression, mutant and inhibitor analyses showed that nkx2.2b is activated by Sonic hedgehog (Shh), but repressed by retinoids and the motoneuron-inducing factor Islet-1 (Isl1). I could show that in zebrafish LFP and p3 neuronal cells are located at the same level along the DV axis, but alternate along the anteroposterior (AP) axis. Moreover, these two different cell populations require different levels of HH signaling and nkx2.2 activities. This provides new insights into the structure of the vertebrate spinal cord and suggests a novel mechanism of neural patterning. N2 - Das Rückenmark von Vertebraten besteht aus Milliarden von Neuronen und Gliazellen, die in einem sehr komplexen Muster während der frühen Neurogenese gebildet werden. Die Spezifizierung dieser Zellen an spezifischen Positionen entlang der dorsoventralen (DV) Achse des Rückenmarks wird durch ein ventrales Organisationszentrum, die mediale Bodenplatte (MFP), kontrolliert. Die Herkunft und der Zeitraum der Spezifizierung dieses wichtigen Organisationszentrums sind zurzeit nicht klar. In meiner Doktorarbeit habe ich die Funktionen des neuen Wachstumsfaktors Midkine-a (Mdka) im Zebrafisch charakterisiert. Mdka und der verwandte Faktor pleiotrophin (ptn) zeigen ein breites Expressionsmuster während der Embryogenese von höheren Vertebraten und sind offenbar an einer Vielzahl von Prozessen beteiligt. Die exakten in-vivo Funktionen sind jedoch nicht bekannt, da knock-out Mäuse keinen embryonalen Phänotyp zeigen. Im Zebrafisch haben wir zwei co-orthologe mdk Gene, mdka und mdkb, sowie ein ptn Gen-Ortholog isoliert. Molekulare phylogenetische Analysen ergaben, dass diese Gene durch zwei unabhängige Duplikationen eines Gen-Blocks entstanden sind. Im Gegensatz zu höheren Vertebraten haben mdk und ptn Gene divergente Funktionen entwickelt, was zu weitestgehend nicht redundanten Funktionen und Expressionsmustern geführt hat. Mittels Überexpressions- und knock-down Analysen konnte ich zeigen, dass Mdka für die Bildung der MFP im Zebrafisch benötigt wird. Anders als bisher bekannte MFP induzierende Faktoren ist Mdka nicht im embryonalen Gastrula-Organisator, dem ‚Shield’ oder der Schwanzknospe exprimiert, sondern dynamisch im paraxialen Mesoderm. Durch epistatische Analysen und Mutanten-Experimente konnte ich weiterhin zeigen, dass Mdka unabhängig von diesen Faktoren wirkt. Dies deutet auf einen neuen Mdka abhängigen Mechanismus der MFP- Bildung während der Neurogenese im Zebrafisch hin. Um Einblick in den Signalweg von Mdka im Zebrafisch zu erhalten, wurde die Funktion der midkine Gene mit der des potentiellen Rezeptors, der Anaplastischen Lymphom-Kinase (Alk), verglichen. Ein ‚Knock-down’ beider Mdk Proteine führte zu einer vergleichbaren Reduktion von Iridophoren wie bei Alk defizienten Mutanten. Demnach könnte Alk ein Rezeptor beider Mdk Proteine während der Zebrafisch-Embryogenese sein. In vielen Vertebratenspezies wurde neben der MFP eine laterale Bodenplatten (LFP) Domäne definiert. In höheren Vertebraten wurde gezeigt, dass LFP Zellen innerhalb der p3 neuronalen Domäne lokalisiert sind, welche V3 Interneuronen bilden. Es ist zurzeit nicht klar, wie diese Zelltypen angeordnet sind und wie sie während der Embryogenese gebildet werden. Ich habe ein neues Homeobox Gen nkx2.2b im Zebrafisch analysiert, welches ausschließlich in der LFP exprimiert ist. Überexpressions-, Mutanten- und Inhibitorenanalysen haben gezeigt, dass nkx2.2b durch Sonic Hedgehog (Shh) aktiviert, durch Retinolsäure und den Motoneuronen induzierenden Faktor Islet-1 (Isl1) aber reprimiert wird. Ich konnte weiterhin zeigen, dass im Zebrafisch LFP und p3 neuronale Zellen auf der gleichen Ebene entlang der DV Achse lokalisiert sind und entlang der anteroposterioren (AP) Achse alternieren. Diese zwei Zellpopulationen benötigen verschiedene Aktivitäten von Hedgehog und nkx2.2b. Dies stellt einen neuen Aspekt für den Aufbau des Rückenmarks von Vertebraten dar und deutet auf einen bisher unbekannten Mechanismus der neuronalen Musterbildung hin. KW - Zebrabärbling KW - Wachstumsfaktor KW - Neurogenese KW - Homöobox KW - Bodenplatte KW - neuronale Musterbildung KW - Midkine KW - Homeobox Gene KW - Zebrafisch KW - floor plate KW - neural patterning KW - Midkine KW - Homeobox genes KW - zebrafish Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15789 ER - TY - THES A1 - Sasi, Manju T1 - A mouse model for genetic deletion of presynaptic BDNF from adult hippocampal mossy fiber terminals T1 - Mausmodell für genetische Deletion von präsynaptischem BDNF aus adulten hippokampalen Moosfaserterminalen N2 - Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is a modulator and mediator of structural and functional plasticity at synapses in the central nervous system. Despite our profound knowledge about the synaptic function of BDNF at synapses, it is still controversially discussed whether synaptic BDNF acts primarily from pre- or postsynaptic sites. In the central nervous system, several studies show that mossy fiber (MF) projections formed by hippocampal granule neurons store the highest amount of BDNF. However, immunofluorescence and RNA labelling studies suggest that MF BDNF is primarily produced by granule neurons. Multiple other studies prefer the view that BDNF is primarily produced by postsynaptic neurons such as CA3 pyramidal neurons. Here, we question whether the BDNF, which is stored in the mossy fiber synapse, is primarily produced by granule neurons or whether by other cells in the MF-CA3 microcircuit. After standardization of immunolabelling of BDNF, confocal imaging confirmed the localization of BDNF in presynaptic MF terminals. This anterograde location of synaptic BDNF was also found in distinct regions of the fear and anxiety circuit, namely in the oval nucleus of the bed nucleus stria terminals (ovBNST) and in the central amygdala. To find out whether the presynaptic BDNF location is due to protein translation in the corresponding presynaptic dentate gyrus (DG) granule neuron, we developed and characterized a mouse model that exhibits BDNF deletion specifically from adult DG granule neurons. In this mouse model, loss of presynaptic BDNF immunoreactivity correlated with the specific Creactivity in granule neurons, thus confirming that MF BDNF is principally released by granule neurons. After BDNF deletion from granule neurons, we observed more immature neurons with widely arborized dendritic trees. This indicated that local BDNF deletion also affects the local adult neurogenesis, albeit Cre-mediated BDNF deletion only occur in adult granule neurons. Since BDNF is a master regulator of structural synaptic plasticity, it was questioned whether it is possible to visualize presynaptic, synapse-specific, structural plasticity in mossy fiber synapses. It was established that a combination of Cre-techniques together with targeting of GFP to membranes with the help of palmitoylation / myristoylation anchors was able to distinctly outline the synaptic structure of the BDNF-containing MF synapse. In summary, the mouse model characterized in here is suited to investigate the synaptic signalling function of presynaptic BDNF at the mossy fiber terminal, a model synapse to investigate microcircuit information processing from molecule to behaviour. N2 - Der neurotrophe Wachstumsfaktor BDNF (brain-derived neurotrophic factor) ist ein Regulator und Vermittler von struktureller und funktionaler Plastizität in Synapsen des zentralen Nervensystems. Trotz des umfassenden Wissens über die synaptische Funktion von BDNF an Synapsen wird immer noch kontrovers diskutiert, ob synaptisches BDNF vorrangig von der prä- oder von der postsynaptischen Seite her agiert. Zahlreiche Studien zeigen, dass die größten BDNF Mengen des Zentralnervensystems in den Projektionen der hippocampalen Körnerzellen, den sogenannten Moosfasern (MF), enthalten sind. Während manche Studien basierend auf der Markierung von RNA und Immunofloureszenz nahelegen, dass MF BDNF in erster Linie von Körnerzellen produziert wird, bevorzugen zahlreiche andere Studien wiederum die Sicht, dass BDNF primär von postsynaptischen Neuronen wie beispielsweise den CA3 Pyramidenneuronen gebildet wird. In dieser Arbeit wurde die Fragestellung untersucht, ob das BDNF, welches in den Moosfasersynapsen enthalten ist, in erster Linie von Körnerzellen hergestellt wird, oder ob es hauptsächlich von anderen Zellen aus dem MF-CA3 Mikronetzwerk gebildet wird. Nachdem eine Standardisierung der Immunfluoreszenzmarkierung von BDNF etabliert wurde, konnte anhand von konfokaler Bildgebung die Lokalisierung von BDNF in den präsynaptischen MF Terminalen bestätiget werden. Diese anterograde Lokalisierung synaptischen BDNFs konnte außerdem in zwei weiteren Regionen des Furcht- und Angstnetzwerkes, genauer gesagt im ovalen Kern des bed nucleus stria terminalis (ovBNST) und in der zentralen Amygdala, nachgewiesen werden. Um Herauszufinden, ob die präsynaptische Lokalisation von BDNF von der Proteintranslation in den zugehörigen präsynaptischen Körnerzellen des Gyrus Dentatus abhängig ist, entwickelten und charakterisierten wir ein Mausmodel , welches die spezifische Deletion von BDNF aus den ausgereiften Körnerzellen des Gyrus Dentatus ermöglicht. In diesem Mausmodell korrelierte der Verlust präsynaptischer BDNF Immunreaktivität mit der spezifischen Cre-Aktivität in Körnerzellen, was bestätigt, dass MF BDNF hauptsächlich von den Körnerzellen ausgeschüttet wird. Nach BDNF Deletion aus den Körnerzellen konnten mehr unreife Neurone mit sich weit verzweigenden, dendritischen Strukturen beobachtet werden. Dies weist darauf hin, dass die lokale Deletion von BDNF auch die lokale adulte Neurogenese beeinflusst, obwohl die Crevermittelte BDNF Deletion nur in adulten Körnerzellen stattfindet. Da BDNF ein Hauptregulator von struktureller synaptischer Plastizität ist, kam die Frage auf, ob es möglich ist, diese präsynaptische, synapsenspezifische strukturelle Plastizität in Moosfasersynapsen zu visualisieren. Es wurde festgestellt, dass eine Kombination aus der Cre- Technik zusammen mit der gezielten Verankerung von GFP in der Zellmembran durch Palmitoylierungs-/Myristoylierungsmotive in der Lage ist, die synaptische Struktur von BDNF enthaltenden MF Synapsen darzustellen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass das hier entwickelte und charakterisierte Mausmodell dafür geeignet ist, die synaptische Signalfunktion präsynaptischen BDNFs in der Moosfaserterminale, einer Modellsynapse für die Erforschung der Informationsverarbeitung in Mikronetzwerken vom Molekül bis hin zum Verhalten, zu untersuchen. KW - Wachstumsfaktor KW - Brain derived neurotorphic factor KW - Hippokampus KW - Moosfaserterminalen KW - hippocampus KW - mossy fiber terminal Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186250 ER -