TY - THES A1 - Leikeim, Anna T1 - Vascularization Strategies for Full-Thickness Skin Equivalents to Model Melanoma Progression T1 - Vaskularisierungsstrategien für Vollhautäquivalente zur Modellierung der Melanom-Progression N2 - Malignant melanoma (MM) is the most dangerous type of skin cancer with rising incidences worldwide. Melanoma skin models can help to elucidate its causes and formation or to develop new treatment strategies. However, most of the current skin models lack a vasculature, limiting their functionality and applicability. MM relies on the vascular system for its own supply and for its dissemination to distant body sites via lymphatic and blood vessels. Thus, to accurately study MM progression, a functional vasculature is indispensable. To date, there are no vascularized skin models to study melanoma metastasis in vitro, which is why such studies still rely on animal experimentation. In the present thesis, two different approaches for the vascularization of skin models are employed with the aim to establish a vascularized 3D in vitro full-thickness skin equivalent (FTSE) that can serve as a test system for the investigation of the progression of MM. Initially, endothelial cells were incorporated in the dermal part of FTSEs. The optimal seeding density, a spheroid conformation of the cells and the cell culture medium were tested. A high cell density resulted in the formation of lumen-forming shapes distributed in the dermal part of the model. These capillary-like structures were proven to be of endothelial origin by staining for the endothelial cell marker CD31. The established vascularized FTSE (vFTSE) was characterized histologically after 4 weeks of culture, revealing an architecture similar to human skin in vivo with a stratified epidermis, separated from the dermal equivalent by a basement membrane indicated by collagen type IV. However, this random capillary-like network is not functional as it cannot be perfused. Therefore, the second vascularization approach focused on the generation of a perfusable tissue construct. A channel was molded within a collagen hydrogel and seeded with endothelial cells to mimic a central, perfusable vessel. The generation and the perfusion culture of the collagen hydrogel was enabled by the use of two custom-made, 3D printed bioreactors. Histological assessment of the hydrogels revealed the lining of the channel with a monolayer of endothelial cells, expressing the cell specific marker CD31. For the investigation of MM progression in vitro, a 3D melanoma skin equivalent was established. Melanoma cells were incorporated in the epidermal part of FTSEs, representing the native microenvironment of the tumor. Melanoma nests grew at the dermo-epidermal junction within the well stratified epidermis and were characterized by the expression of common melanoma markers. First experiments were conducted showing the feasibility of combining the melanoma model with the vFTSE, resulting in skin models with tumors at the dermo-epidermal junction and lumen-like structures in the dermis. Taken together, the models presented in this thesis provide further steps towards the establishment of a vascularized, perfusable melanoma model to study melanoma progression and metastasis. N2 - Das maligne Melanom (MM) ist die gefährlichste Form von Hautkrebs mit weltweit steigender Inzidenz. Melanom-Hautmodelle können helfen, seine Ursachen und Entstehung aufzuklären oder neue Behandlungsstrategien zu entwickeln. Den meisten bisherigen Hautmodellen fehlt jedoch ein Gefäßsystem, was ihre Funktionalität und Anwendbarkeit einschränkt. Das MM ist auf das Gefäßsystem angewiesen, sowohl für die eigene Versorgung als auch für die Ausbreitung über Lymph- und Blutgefäße zu entfernten Körperstellen. Um die Entwicklung des MM genau zu studieren, ist daher eine funktionelles Gefäßsystem unabdingbar. Bislang gibt es keine vaskularisierten Hautmodelle, um die Melanommetastasierung in vitro zu untersuchen, weshalb solche Studien immer noch auf Tierversuche angewiesen sind. In der vorliegenden Arbeit werden zwei unterschiedliche Ansätze zur Vaskularisierung von Hautmodellen mit dem Ziel verfolgt, ein vaskularisiertes 3D in vitro Vollhautmodell (full-thickness skin equivalent, FTSE) zu etablieren, das als Testsystem zur Untersuchung der Entwicklung des MM dienen kann. Einerseits wurden Endothelzellen in den dermalen Teil von FTSEs integriert. Die optimale Aussaatdichte, eine sphäroidale Konformation der Zellen und das Zellkulturmedium wurden getestet. Eine hohe Zelldichte führte zur Bildung von lumenbildenden Formen, die im dermalen Teil des Modells verteilt waren. Diese kapillarähnlichen Strukturen wurden durch Färbung für den Endothelzellmarker CD31 als endothelialen Ursprungs nachgewiesen. Das etablierte vaskularisierte FTSE (vFTSE) wurde nach 4 Wochen Kultur histologisch charakterisiert und zeigte eine der menschlichen Haut in vivo ähnliche Architektur mit einer geschichteten Epidermis, die vom dermalen Äquivalent durch eine Basalmembran, gezeigt durch Kollagen Typ IV, getrennt ist. Dieses zufällige kapillarartige Netzwerk ist jedoch nicht funktional, da es nicht durchblutet werden kann. Daher konzentrierte sich der zweite Vaskularisierungsansatz auf die Erzeugung eines perfundierbaren Gewebekonstrukts. Ein Kanal wurde in einem Kollagenhydrogel geformt und mit Endothelzellen besiedelt, um ein zentrales, perfundierbares Gefäß zu imitieren. Die Erzeugung und die Perfusionskultur des Kollagenhydrogels wurde durch die Verwendung von zwei speziell angefertigten, 3D-gedruckten Bioreaktoren ermöglicht. Die histologische Beurteilung der Hydrogele zeigte die Auskleidung des Kanals mit einer Einzelschicht von Endothelzellen, die den zellspezifischen Marker CD31 exprimieren. Für die Untersuchung der MM-Progression in vitro wurde ein 3D-Melanom-Hautäquivalent hergestellt. Melanomzellen wurden in den epidermalen Teil von FTSEs integriert, was die native Mikroumgebung des Tumors darstellt. Die Melanomnester wuchsen an der dermo-epidermalen Grenzfläche innerhalb der gut stratifizierten Epidermis und wurden durch die Expression gängiger Melanommarker charakterisiert. Zusätzlich konnte die Kombination des Melanom-Modells mit dem vFTSE gezeigt werden, was zu Hautmodellen mit Tumoren an der dermo-epidermalen Grenzfläche und lumenartigen Strukturen in der Dermis führte. Alles in allem bieten die in dieser Arbeit vorgestellten Modelle weitere Schritte hin zur Entwicklung eines vaskularisierten, perfundierbaren Melanommodell zur Erforschung der Melanomprogression und Metastasierung. KW - Tissue Engineering KW - In-vitro-Kultur KW - Melanom KW - skin model KW - vascularization KW - in vitro-Testsystem KW - perfused hydrogel Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-272956 ER - TY - THES A1 - Kremer, Antje T1 - Tissue Engineering of a Vascularized Meniscus Implant T1 - Tissue Engineering eines vaskularisierten Meniskus-Implantates N2 - The knee joint is a complex composite joint containing the C-shaped wedge-like menisci composed of fibrocartilage. Due to their complex composition and structure, they provide mechanical resilience to the knee joint protecting the articular cartilage. Because of the limited repair potential, meniscal injuries do not only affect the meniscus itself but also lead to altered joint homeostasis and inevitably to secondary osteoarthritis. The meniscus was characterized focusing on its anatomy, structure and meniscal markers such as aggrecan, collagen type I (Col I) and Col II. The components relevant for meniscus tissue engineering, namely cells, Col I scaffolds, biochemical and biomechanical stimuli were studied. Meniscal cells (MCs) were isolated from meniscus, mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow and dermal microvascular endothelial cells (d-mvECs) from foreskin biopsies. For the human (h) meniscus model, wedge-shape compression of a hMSC-laden Col I gel was successfully established. During three weeks of static culture, the biochemical stimulus transforming growth factor beta-3 (TGF beta-3) led to a compact collagen structure. On day 21, this meniscus model showed high metabolic activity and matrix remodeling as confirmed by matrix metalloproteinases detection. The fibrochondrogenic properties were illustrated by immunohistochemical detection of meniscal markers, significant GAG/DNA increase and increased compressive properties. For further improvement, biomechanical stimulation systems by compression and hydrostatic pressure were designed. As one vascularization approach, direct stimulation with ciclopirox olamine (CPX) significantly increased sprouting of hd-mvEC spheroids even in absence of auxiliary cells such as MSCs. Second, a cell sheet composed of hMSCs and hd-mvECs was fabricated by temperature triggered cell sheet engineering and transferred onto the wedge-shaped meniscus model. Third, a biological vascularized scaffold (BioVaSc-TERM) was re-endothelialized with hd-mvECs providing a viable vascularized network. The vascularized BioVaSc-TERM was suggested as wrapping scaffold of the meniscus model by using two suture techniques, the all-inside-repair (AIR) for the posterior horn, and the outside-in-refixation (OIR) for the anterior horn and the middle part. This meniscus model for replacing torn menisci is a promising approach to be further optimized regarding vascularization, biochemical and biomechanical stimuli. N2 - Das Knie ist ein komplex zusammengesetztes Gelenk mit zwei C-förmigen Keilen aus Bindegewebsknorpel, die Menisken. Sie sorgen für die mechanische Belastbarkeit des Knies, wodurch der Gelenksknorpel geschützt wird. Aufgrund des limitierten Heilungspotentials beeinträchtigen Meniskusverletzungen nicht nur den Meniskus selbst, sondern schädigen auch das Gelenksgleichgewicht und führen zu sekundärer Osteoarthritis. Der Meniskus wurde in seiner Anatomie, Struktur und Meniskusmarkern wie Aggrekan, Kollagen I und Kollagen II charakterisiert. Die Komponenten von Meniskus Tissue Engineering, Zellen, Kollagen I Materialien, biochemische und biomechanische Stimuli wurden untersucht. Meniskuszellen (MCs) wurden aus Meniskus isoliert, mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus Knochenmark und dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (d-mvECs) aus Vorhautbiopsien. Für das humane (h) Meniskus-Modell wurde die keilförmige Kompression eines hMSC-beladenen Kollagen I Gels erfolgreich etabliert. Während drei Wochen statischer Kultur führte der biochemische Stimulus transformierender Wachs-tumsfaktor beta-3 (TGF beta-3) zu einer kompakten Kollagenstruktur. An Tag 21 zeigte dieses Meniskus-Modell eine hohe metabolische Aktivität und Matrixumbau durch die Detektion von Matrix-Metalloproteasen. Der Bindegewebsknorpel wurde durch immunhistochemische Detektion der Meniskusmarker, einem signifikanten GAG/DNA Anstieg und erhöhter Kompressionseigenschaften bestätigt. Für weitere Verbesserungen wurden biomechanische Stimulierungssysteme mittels Kompression und hydrostatischen Druck aufgebaut. Als Vaskularisierungsansatz führte die direkte Stimulierung mit Ciclopirox Olamine (CPX) sogar in Abwesenheit von Helferzellen wie MSCs zu einem erhöhten Sprouting der hd-mvEC Spheroide. Zweitens wurde ein hMSC/hd-mvEC Sheet mithilfe eines Temperatur-abhängigen Verfahrens produziert und auf das keilförmige Meniskus-Modell transferiert. Drittens wurde ein vaskularisiertes Biomaterial (BioVaSc-TERM) mit hd-mvECs besiedelt, wodurch ein vitales Gefäßystem bereitgestellt wurde. Die vaskularisierte BioVaSc-TERM wurde als Hülle des Meniskus-Modells unter der Verwendung von zwei Nahttechniken vorgeschlagen: die All-Inside-Repair (AIR) für das Hinterhorn und die Outside-In-Refixation (OIR) für das Vorderhorn und den mittleren Teil. Dieses Meniskus-Modell ist ein vielversprechender Ansatz für den Meniskusersatz, um in Vaskularisierung, biochemischer und biomechanischer Stimuli weiter optimiert zu werden. KW - Meniskus KW - Tissue Engineering KW - Regenerative Medizin KW - Meniskusimplantat KW - meniscus implant KW - Tissue Engineering KW - tissue engineering KW - vascularization KW - Vaskularisierung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184326 ER - TY - JOUR A1 - Groeber, Florian A1 - Engelhardt, Lisa A1 - Lange, Julia A1 - Kurdyn, Szymon A1 - Schmid, Freia F. A1 - Rücker, Christoph A1 - Mielke, Stephan A1 - Walles, Heike A1 - Hansmann, Jan T1 - A First Vascularized Skin Equivalent as an Alternative to Animal Experimentation JF - ALTEX - Alternatives to Animal Experimentation N2 - Tissue-engineered skin equivalents mimic key aspects of the human skin, and can thus be employed as wound coverage for large skin defects or as in vitro test systems as an alternative to animal models. However, current skin equivalents lack a functional vasculature limiting clinical and research applications. This study demonstrates the generation of a vascularized skin equivalent with a perfused vascular network by combining a biological vascularized scaffold (BioVaSc) based on a decellularized segment of a porcine jejunum and a tailored bioreactor system. Briefly, the BioVaSc was seeded with human fibroblasts, keratinocytes, and human microvascular endothelial cells. After 14 days at the air-liquid interface, hematoxylin & eosin and immunohistological staining revealed a specific histological architecture representative of the human dermis and epidermis including a papillary-like architecture at the dermal-epidermal-junction. The formation of the skin barrier was measured non-destructively using impedance spectroscopy. Additionally, endothelial cells lined the walls of the formed vessels that could be perfused with a physiological volume flow. Due to the presence of a complex in-vivo-like vasculature, the here shown skin equivalent has the potential for skin grafting and represents a sophisticated in vitro model for dermatological research. KW - alternative to animal testing KW - skin equivalents KW - tissue engineering KW - vascularization Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164438 VL - 33 IS - 4 ER -