TY  - THES
A1  - Semeniak, Daniela
T1  - Role of bone marrow extracellular matrix proteins on platelet biogenesis and function
T1  - Die Rolle der extrazellulären Matrixproteine des Knochenmarks auf die Thrombozytenbiogenes und -funktion
N2  - Platelets, small anucleated blood cells responsible for hemostasis, interact at sights of injury with several exposed extracellular matrix (ECM) proteins through specific receptors. Ligand binding leads to activation, adhesion and aggregation of platelets. Already megakaryocytes (MKs), the immediate precursor cells in bone marrow (BM), are in constant contact to these ECM proteins (ECMP). The interaction of ECMP with MKs is, in contrast to platelets, less well understood. It is therefore important to study how MKs interact with sinusoids via the underlying ECMP. This thesis addresses three major topics to elucidate these interactions and their role in platelet biogenesis. 
First, we studied the topology of ECMP within BM and their impact on proplatelet formation (PPF) in vitro. By establishing a four-color immunofluorescence microscopy we localized collagens and other ECMP and determined their degree of contact towards vessels and megakaryocytes (MKs). In in vitro assays we could demonstrate that Col I mediates increased MK adhesion, but inhibits PPF by collagen receptor GPVI. By immunoblot analyses we identified that the signaling events underyling this inhibition are different from those in platelet activation at the Src family kinase level.
Second, we determined the degree of MK-ECM interaction in situ using confocal laser scanning microscopy of four-color IF-stained femora and spleen sections. In transgenic mouse models lacking either of the two major collagen receptors we could show that these mice have an impaired association of MKs to collagens in the BM, while the MK count in spleen increased threefold. This might contribute to the overall unaltered platelet counts in collagen receptor-deficient mice.
In a third approach, we studied how the equilibrium of ECMP within BM is altered after irradiation. Collagen type IV and laminin-α5 subunits were selectively degraded at the sinusoids, while the matrix degrading protease MMP9 was upregulated in MKs. Platelet numbers decreased and platelets became hyporesponsive towards agonists, especially those for GPVI activation.
Taken together, the results indicate that MK-ECM interaction differs substantially from the well-known platelet-ECM signaling. Future work should further elucidate how ECMP can be targeted to ameliorate the platelet production and function defects, especially in patients after BM irradiation.
N2  - Thrombozyten, kleine kernlose Zellen, die für die Hämostase verantwortlich sind, interagieren an verletzten Gefäßwänden mit exponierten extrazellulären Matrixproteinen (EZMP) durch Oberflächenrezeptoren. Durch die Ligandenbindung werden die Thrombozyten aktiviert, adhärieren und aggregieren schlussendlich. Schon Megakaryozyten (MKs), die unmittelbaren Vorläuferzellen im Knochenmark (KM), stehen ebenfalls mit EZMP im ständigen Kontakt. Im Gegensatz zur Thrombozyteninteraktion ist die Interaktion der MKs mit EZMP jedoch nicht sehr gut untersucht. Aus diesem Grund ist es wichtig zu verstehen wie MKs mit Sinusoiden durch die darunterliegenden EZMP interagieren. Diese Doktorarbeit beleuchtet dazu drei Hauptthemen, die zu einem besseren Verständnis dieser Interaktion und dessen Rolle in der Thrombozytenbildung beitragen.
In einem ersten Themenblock klärten wir die Topologie verschiedener EZMP des Knochenmarks und deren Rolle bei der Proplättchenbildung auf. Durch die Etablierung einer Vierfarben-Immunfluoreszenzmikroskopie, lokalisierten wir verschiedene Kollagene und andere EZMP im KM und bestimmten deren Kontakt zu Gefäßen und MKs. In in vitro-Ansätzen konnten wir demonstrieren, dass Kollagen Typ I eine erhöhte Adhäsion von MKs vermittelt, aber die Proplättchenbildung durch den Kollagenrezeptor GPVI inhibiert. Mittels Immunoblotanalysen identifizierten wir eine Signalkaskade, die von der Thrombozytenaktivierung auf der Ebene der Src family Kinasen abweicht.
In einem zweiten Themenkomplex bestimmten wir in situ den Grad an Interaktion von MKs mit EZMP mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie von vierfach immunfluoreszenzgefärbten Femora- und Milzschnitten. In transgenen Mäusen, denen einer der zwei Hauptkollagenrezeptoren fehlen, konnten wir zeigen, dass MKs dieser Mäuse eine veränderte Assoziation zu Kollagenen im Knochenmark aufweisen, während die MK-Anzahl in der Milz um das Dreifache anstieg. Dies könnte insgesamt zur unbeeinflussten Thrombozytenzahl in diesen Mäusen beitragen.
In einem dritten Themenkomplex untersuchten wir wie das Gleichgewicht im Knochenmark nach Bestrahlung beeinflusst ist. Spezifisch Kollagen Typ IV und laminin-α5 waren an den Sinusoiden degradiert, während die Expression der matrixabbauenden Protease MMP-9 in MKs hochreguliert war. Die Thrombozytenzahl sank und sie wurden hyporesponsiv auf Agonisten, speziell auf diejenigen für die GPVI-Aktivierung. 
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass die Interaktion von MKs mit EZMP sich substantiell von der Thrombozyten-EZMP vermittelten Signaltransduktion unterscheidet. Zukünftige Untersuchungen sollen weiter beleuchten wie EZMP gezielt beeinflusst werden können um Defekte in der Thrombozytenproduktion und –funktion abzumildern, besonders in Patienten nach Bestrahlung.
KW  - Knochenmark
KW  - Thrombozyt
KW  - Extracellular matrix proteins
KW  - platelet biogenesis
KW  - Extrazelluläre Matrix
KW  - Megakaryocytes
KW  - platelets
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155857
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heidenreich, Julius Frederik
T1  - Characterization of the widely used Rac1-inhibitors NSC23766 and EHT1864 in mouse platelets
T1  - Untersuchung der Rac1-Inhibitoren NSC23766 und EHT1864 in murinen Thrombozyten
N2  - Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic diseases, such as myocardial infarction and stroke. Extracellular agonists induce platelet activation by stimulation of platelet membrane receptors. Signal transduction results in reorganization of the cytoskeleton, shape change, platelet adhesion and aggregation, cumulating in thrombus formation. Several Rho GTPases, including Rac1, Cdc42 and RhoA, are essential mediators of subsequent intracellular transduction of ITAM- and GPCR-signaling. Therefore, inhibition or knockout can result in severely defective platelet signaling.
Mice with platelet specific Rac1-deficiency are protected from arterial thrombosis. This benefit highlights further investigation of Rac1-specific functions and its potential as a new pharmacological target for prevention of cardiovascular diseases. Two newly developed synthetic compounds, NSC23766 and EHT1864, were proposed to provide highly specific inhibition of Rac1 activity, but both drugs have never been tested in Rac1-deficient cell systems to rule out potential Rac1-independent effects.
This study revealed significant off-target effects of NSC23766 and EHT1864 that occurred in a dose-dependent fashion in both wild-type and Rac1-deficient platelets. Both inhibitors individually affected resting platelets after treatment, either by altering membrane protein expression (NSC23766) or by a marked decrease of platelet viability (EHT1864). Platelet apoptosis could be confirmed by enhanced levels of phosphatidylserine exposure and decreased mitochondrial membrane potential. Phosphorylation studies of the major effector proteins of Rac1 revealed that NSC23766 and EHT1864 abolish PAK1/PAK2 activation independently of Rac1 in wild-type and knockout platelets, which may contribute to the observed off-target effects.
Additionally, this study demonstrated the involvement of Rac1 in G protein-coupled receptor-mediated platelet activation and GPIb-induced signaling. Furthermore, the data revealed that Rac1 is dispensable in the process of integrin  IIb 3-mediated clot retraction.
This study unveiled that new pharmacological approaches in antithrombotic therapy with Rac1 as molecular target have to be designed carefully in order to obtain high specificity and minimize potential off-target effects.
N2  - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach Gefäßverletzungen ist entscheidend um starken Blutverlust zu vermeiden. Allerdings können diese Prozesse auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen führen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall. Die Stimulation der Membranrezeptoren durch Triggersubstanzen leitet die Thrombozytenaktivierung und somit die Reorganisation des Zytoskeletts ein. Dies ermöglicht die Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten und führt letztendlich zur Thrombusbildung. Die Rho GTPasen Rac1, Cdc42 und RhoA sind als wichtige Mediatoren an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligt. Eine medikamentöse Hemmung oder ein genetischer Knockout kann daher die intrazellulären Signalkaskaden so stark beeinträchtigen, dass eine effiziente Aktivierung der Thrombozyten nicht mehr möglich ist. In Mäusen mit thrombozytenspezifischem Knockout von Rac1 wurde festgestellt, dass der Funktionsverlust von Rac1 gleichzeitig auch Schutz vor der Entwicklung von arterieller Thrombose bedeutet. Könnte man sich diese Tatsache pharmakologisch zunutze machen, würde die Hemmung von Rac1 möglicherweise einen neuen, erfolgsversprechenden Ansatz in der Prävention von kardiovaskulären Erkrankungen darstellen.
Für den Forschungseinsatz wurden die zwei synthetischen Inhibitoren NSC23766 und EHT1864 entwickelt um Rac1-vermittelte Funktionen zu studieren. Beide Substanzen versprechen eine hochspezifische Hemmung der Rac(1)-Aktivität, wurden bisher jedoch nicht in Zellsystemen mit Rac1-Defizienz verwendet um die Substanzen kritisch auf mögliche, unerwünschte Nebenwirkungen zu untersuchen.
In dieser Dissertation wurde gezeigt, dass NSC23766 und EHT1864 zwar effektive Hemmstoffe für Rac1 sind, allerdings genauso Rac1-unabhängige Nebenwirkungen verursachen. Beide Hemmstoffe führten zu Veränderungen der Thrombozyten: Während unter NSC23766 eine verminderte Expression von Membranrezeptoren beobachtet wurde, führte EHT1864 zu einer stark beeinträchtigten Vitalität der Thrombozyten. Anhand von erhöhten Phosphatidylserin-Werten und einer Veränderung des mitochondrialen Membranpotenzials in den behandelten Thrombozyten konnte die EHT1864-vermittelte Apoptose nachgewiesen werden. Letztendlich wurde anhand der verminderten Phosphorylierung von PAK1/PAK2
gezeigt, dass die Aktivierung dieser Rac1-Effektorproteine durch NSC23766 und EHT1864 direkt unterdrückt wird.
Zusätzlich zu den Inhibitor-vermittelten Effekten wurde anhand von Rac1-defizienten Thrombozyten nachgewiesen, dass Rac1 auch an GPCR- und GPIb-vermittelten Signalkaskaden beteiligt ist. Außerdem wurde beobachtet, dass Rac1 für die Integrin  IIb 3-vermittelte clot retraction entbehrlich ist.
Die Ergebnisse dieser Studie legen dar, dass neue pharmakologische Substanzen für die antithrombotische Therapie mit Rac1 als Zielmolekül gründlich erforscht und hinterfragt werden müssen um die Spezifität zu maximieren und vor allem das Nebenwirkungsprofil zu minimieren.
KW  - Thrombozyt
KW  - Thrombose
KW  - Signaltransduktion
KW  - Enzyminhibitor
KW  - Rho-Proteine
KW  - mouse platelets
KW  - rac1 inhibitors
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165453
ER  - 
TY  - THES
A1  - Popp, Michael
T1  - Mechanisms of platelet activation and receptor regulation in genetically modified mice
T1  - Mechanismen der Thrombozytenaktivierung und Rezeptorregulation in genetisch veränderten Mäusen
N2  - This work summarizes the results of studies on several major aspects of platelet activation and platelet receptor regulation. Therefore, this thesis is divided into four parts.
Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic disease states, such as myocardial infarction and stroke. Agonist-induced elevation in cytosolic Ca2+ concentrations is essential for platelet activation in hemostasis and thrombosis. The principal route of Ca2+ influx in platelets is store-operated calcium entry (SOCE). The calcium sensor molecule stromal interaction molecule 1 (STIM1) regulates SOCE by activating the membrane calcium channel protein Orai1, but the exact mechanisms of this interaction are not fully understood. Using affinity chromatography to screen for STIM1 interacting proteins in platelets, bridging integrator 2 (BIN2), an adapter protein belonging to the family of BAR proteins that is mainly expressed in the hematopoietic system, was identified. Newly generated BIN2 KO mice were viable and fertile but their platelets displayed markedly impaired SOCE in response to thapsigargin (TG) as well as agonists acting on immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) or G protein-coupled receptors. This SOCE defect resulted in impaired (hem)ITAM induced platelet activation, aggregate formation under flow and procoagulant activity. As a consequence, mice lacking BIN2 in platelets were protected from occlusive arterial thrombus formation and thrombo-inflammatory cerebral infarct progression in a model of experimental stroke. These results identify BIN2 as a critical regulator of platelet SOCE in thrombosis and thrombo-inflammatory disease.
Integrin αIIbβ3 plays a central role in the adhesion and aggregation of platelets. Integrin activation requires the transmission of a signal from the small cytoplasmic tails of the α or β
subunit to the large extracellular domains resulting in conformational changes of the extracellular domains to enable ligand binding. It was hypothesized that Hic-5 is a novel regulator of integrin αIIbβ3 activation in mice. As demonstrated in the second part of this thesis, lack of Hic-5 had no detectable effect on platelet integrin activation and function in vitro and in vivo under all tested conditions. These results indicate that Hic-5 is dispensable for integrin αIIbβ3 activation and consequently for arterial thrombosis and hemostasis in mice.
The Rho GTPase family members RhoA and Rac1 play major roles in platelet activation at sites of vascular injury. Little is known about possible redundant functions of these Rho GTPases in regulating platelet function. To investigate functional redundancies of RhoA and Rac1 in platelet production and function, mice with MK- and platelet-specific double- deficiencies in RhoA and Rac1 were generated. RhoA/Rac1 double-deficiency phenocopied the respective single knockouts without any additional effects in the double-knockout animals, demonstrating for the first time a functional non-redundancy of RhoA and Rac1 in platelet function.
Antibodies against platelet glycoproteins (GP) trigger platelet destruction in immune thrombocytopenia (ITP) by binding to Fcγ receptors (FcγRs) on immune cells. However, antibodies against the platelet collagen receptor GPVI exert powerful anti-thrombotic action in vivo by inducing ectodomain shedding of the receptor associated with a transient thrombocytopenia. As shown in the final part of this thesis, blockade or deficiency of the inhibitory FcγRIIB abolished sequestration of anti-GPVI opsonized platelets in the hepatic vasculature and GPVI shedding. This process was mediated by liver sinusoidal endothelial cells (LSEC), the major FcγRIIB expressing cell type in the body. Furthermore, LSEC FcγRIIB mediated hepatic platelet sequestration and contributed to thrombocytopenia in mice treated with antibodies against αIIbβ3, the major target antigen in human ITP. These results reveal a novel and unexpected function of hepatic FcγRIIB in the processing of antibody-opsonized platelets.
N2  - Diese Arbeit fasst Untersuchungen zu verschiedenen Aspekten der Aktivierung von Thrombozyten und deren Rezeptorregulation zusammen. Daher ist diese Doktorarbeit in vier Teile gegliedert.
Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach einer Gefäßverletzung ist entscheidend, um einen übermäßigen Blutverlust zu vermeiden, kann aber auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall, führen. Bei der Aktivierung der Thrombozyten kommt es zu einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration. Der Ca2+-Einstrom in die Thrombozyten erfolgt hauptsächlich durch den „store operated calcium entry“ (SOCE). Der Calciumsensor „stromal interaction molecule 1“ (STIM1) reguliert den SOCE indem er das Ionenkanal-bildende Protein Orai1 in der Plasmamembran aktiviert. Der genaue Mechanismus dieser Interaktion ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Durch den Einsatz von Affinitätschromatographie, um Interaktionspartner von STIM1 zu identifizieren, wurde „bridging integrator 2“ (BIN2) gefunden. BIN2 ist ein Adapterprotein, aus der Familie der BAR Proteine, welches hauptsächlich von Zellen des hämatopoetischen Systems exprimiert wird. BIN2-defiziente Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar, aber ihre Thrombozyten zeigten einen deutlich verminderten SOCE. Diese Reduktion zeigte sich sowohl nach der Stimulation mit Thapsigargin, aber auch nach der Stimulation mit Agonisten, die „immunoreceptor tyrosine-based activation motif-“ (ITAM-) oder G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktivieren. Der defekte SOCE führte zu verminderter (hem)ITAM-induzierter Thrombozytenaktivierung, reduzierter Thrombenbildung im Flusskammersystem und verminderter prokoagulanter Aktivität. Dies hatte zur Folge, dass Mäuse mit thrombozytenspezifischer BIN2-Defizienz vor arterieller Thrombose und, in einem Schlaganfallmodell, vor thrombo-inflammatorischer Infarktprogression geschützt sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass BIN2 ein wichtiger Regulator des SOCE in Thrombozyten bei Thrombosen und thrombo-inflammatorischen Erkrankungen ist.
Das Integrin αIIbβ3 spielt bei der Adhäsion und Aggregation von Thrombozyten eine wichtige Rolle. Um das Integrin zu aktivieren, bedarf es einer Signalübertragung von den kleinen zytoplasmatischen Teilen der α und β Untereinheiten zu den großen extrazellulären Domänen, was zu deren Konformationsänderung führt und schließlich die Ligandenbindung ermöglicht. Es besteht die Hypothese, dass Hic-5 an der Regulation des Integrins αIIbβ3 in murinen Thrombozyten beteiligt ist. Wie im zweiten Teil dieser Arbeit gezeigt werden konnte, hat eine Hic-5 Defizienz jedoch weder in vitro noch in vivo Einfluss auf die Aktivierung und Funktion des Integrins αIIbβ3 in Thrombozyten. Diese Ergebnisse zeigen, dass Hic-5 für die Aktivierung des Integrins αIIbβ3 und folglich auch für die arterielle Thrombose und Hämostase in Mäusen entbehrlich ist.
Kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie, wie z.B. RhoA und Rac1 spielen bei der Thrombozytenaktivierung bei Gefäßverletzungen eine wichtige Rolle. Dennoch ist wenig über redundante Funktionen von RhoA und Rac1 bei der Steuerung der Thrombozytenfunktion bekannt. Um eine mögliche funktionelle Redundanz von RhoA und Rac1 zu untersuchen, wurden MK- und thrombozytenspezifische RhoA und Rac1 doppelt-defiziente Tiere gezüchtet. Die Thrombozyten der Tiere zeigten die Phänotypen einer RhoA- und Rac1-Defizienz, ohne dass weiter Effekte bemerkbar waren. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass es keine funktionelle Redundanz von RhoA und Rac1 bei der Regulation der Thrombozytenfunktion gibt.
Antikörper, die gegen Glykoproteine auf Thrombozyten gerichtet sind, führen bei einer Immunthrombozytopenie (ITP) durch die Bindung an Fcγ Rezeptoren auf Immunzellen, zu einer Zerstörung der Thrombozyten. Eine Ausnahme sind Antikörper gegen den Kollagenrezeptor GPVI der Thrombozyten. Hier führen diese Antikörper zu einem starken antithrombotischen Schutz in vivo, indem sie das sog. „Shedding“ der Ektodomäne des Rezeptors und nur eine vorübergehende Thrombozytopenie auslösen. Im letzten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die Blockade, also auch das vollständige Fehlen des inhibitorischen FcγRIIB, die Sequestrierung von anti-GPVI-opsonierten Thrombozyten und das Shedding von GPVI verhindert. Für diese Prozesse ist speziell der FcγRIIB auf „liver sinusoidal endothelial cells“ (LSEC) ursächlich. Ferner konnte gezeigt werden, dass FcγRIIB auf LSECs auch für die Sequestrierung von Thrombozyten und die Thrombozytopenie in Mäusen, die mit Antikörpern gegen αIIbβ3, dem Hauptantigen bei humaner ITP, behandelt wurden, verantwortlich ist. Diese Ergebnisse enthüllen eine neue und unerwartete Funktion des hepatischen FcγRIIB bei der Reaktion auf Antikörper-opsonierte Thrombozyten.
KW  - Hämostase
KW  - Maus
KW  - Thrombose
KW  - Thrombozyt
KW  - Schlaganfall
KW  - RhoGTPase
KW  - Hic-5
KW  - SOCE
KW  - GPVI
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135494
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stegner, David
T1  - Novel Aspects of Platelet Signaling and of the Pathogenesis of Immune Thrombocytopenia
T1  - Neue Aspekte in Signalwegen von Blutplättchen und in der Pathogenese der Immunthrombozytopenie
N2  - This work summarizes the results of studies on three major aspects of platelet signaling and of the pathogenesis of immune thrombocytopenia. Therefore, this thesis is divided into three parts. i) Platelet activation and subsequent thrombus formation at sites of vascular injury is crucial for normal hemostasis, but it can also trigger myocardial infarction and stroke. The initial capture of flowing platelets to the injured vessel wall is mediated by the interaction of the glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex with von Willebrand factor (vWF) immobilized on the exposed subendothelial extracellular matrix (ECM). The central importance of GPIb for platelet adhesion is well established, whereas GPV is generally considered to be of minor relevance for platelet physiology and thrombus formation. This study intended to clarify the relevance of this receptor during thrombus formation using Gp5-/- mice and mice with different double-deficiencies in GPV and in other platelet receptors. It was found that GPV and the collagen receptor integrin a2b1 have partially redundant functions in collagentriggered platelet aggregation. Further, it was revealed that GPV limits thrombus formation and impairs hemostasis in vivo. The data presented here demonstrate that the protective effect of GPVI-deficiency (another platelet collagen receptor) in arterial thrombosis and ischemic stroke depends on the expression of GPV. Moreover, it was demonstrated that lack of GPV restores the hemostatic function of mice lacking both GPVI and a2b1 or mice lacking GPVI and the C-type lectin receptor 2 (CLEC-2). Conclusively, GPV-depletion or blockade might have the potential to treat hemorrhagic disease states. ii) Platelets contain the two phospholipase (PL) D isoforms, PLD1 and PLD2, both of which presumably become activated upon platelet stimulation. However, the function of PLD in the process of platelet activation and aggregation has not been definitively explored. Thus, PLD-deficient mice were analyzed. Mice lacking PLD1 or PLD2 were viable, fertile and had normal platelet counts. PLD1 was found to be responsible for the inducible PLD-activity in platelets and to contribute to efficient integrin activation under static conditions. Moreover, flow adhesion experiments revealed that PLD1 is essential for efficient GPIb-mediated integrin activation. Consequently, Pld1-/- mice were protected from arterial thrombosis and ischemic brain infarction without affecting tail bleeding times. Hence, inhibition of PLD1 might be a novel approach for antithrombotic therapy. iii) Cellular activation of platelets or immune cells results in increased cytosolic calcium (Ca2+) levels. Store-operated calcium entry (SOCE) via the STIM1-Orai1 axis is the main route of Ca2+ entry downstream of immunoreceptor tyrosine-based activating motif (ITAM) receptor stimulation in mast cells and T cells. However, the requirement of Ca2+-mobilization in Fcg receptor (FcgR)-signaling and the relevance of STIM2 for T cell SOCE have been unclear. To address these questions, genetically modified mice lacking central molecules of the SOCE machinery were analyzed. Ca2+-measurements revealed that both STIM isoforms contribute to Ca2+-mobilization downstream of T cell receptor activation. Additionally, it was found that FcgR stimulation results in SOCE and is mediated by STIM1 and probably Orai1. Animal models of immune thrombocytopenia (ITP) revealed that SOCE is essential for platelet clearance and that both STIM isoforms contribute to the pathology of ITP. Moreover, in this work it was also demonstrated that STIM1 and Orai1 are essential in IgG-mediated systemic anaphylaxis. STIM2 contributes to IgG-mediated, but not to IgE-mediated anaphylaxis. The data indicate that interference with SOCE might become a new strategy to prevent or treat IgG-dependent autoimmune diseases.
N2  - Diese Arbeit fasst Untersuchungen von drei wesentlichen Aspekten der Signalwege von Blutplättchen und der Pathogenese der Immunthrombozytopenie zusammen. Daher ist diese Doktorarbeit in drei Teile unterteilt. i) Die Aktivierung von Blutplättchen und die anschließende Thrombusbildung in Folge vaskulärer Verletzungen sind für die normale Hämostase elementar, sie können aber auch Herzinfarkt oder Schlaganfall verursachen. Die anfängliche Adhäsion zirkulierender Blutplättchen an der verletzten Gefäßwand wird durch die Wechselwirkung des Glykoprotein (GP) Ib-V-IX Komplexes mit dem auf der freigelegten subendothelialen Matrix immobilisierten von Willebrand Faktor (vWF) vermittelt. Die zentrale Bedeutung von GPIb für die Adhäsion von Blutplättchen ist lange bekannt, wohingegen GPV allgemein als unbedeutend für die Physiologie von Blutplättchen oder die Thrombusbildung angesehen wird. Das Ziel dieser Arbeit war, die Bedeutung dieses Rezeptors für die Thrombusbildung zu überprüfen. Hierfür wurden GPV-defiziente Mäuse und mehrere Mauslinien, denen neben GPV ein weiterer Plättchenrezeptor fehlte, analysiert. Es wurde festgestellt, dass GPV und der Kollagenrezeptor Integrin a2b1 teilweise redundante Funktionen in der Kollagenvermittelten Plättchenaggregation haben. Des Weiteren wurde gezeigt, dass GPV die Thrombusbildung begrenzt sowie die Wundstillung reguliert. Die hier gezeigten Daten belegen, dass GPV überraschenderweise für den Schutz vor arterieller Thrombose oder ischämischem Schlaganfall, der aus dem Fehlen des wichtigsten Kollagenrezeptors GPVI resultiert, benötigt wird. Außerdem wurde gezeigt, dass die Abwesenheit von GPV die Hämostase in Mäusen, denen GPVI und a2b1 oder GPVI und CLEC-2 (von C-type lectin receptor 2) fehlt, wieder herstellt. Folglich, könnte die pharmakologische Herabregulierung der GPV-Expression oder die Blockade des Rezeptors eine neue Behandlungsmöglichkeit von hämorrhagischen Krankheitszuständen darstellen. ii) Blutplättchen exprimieren die beiden Phospholipase (PL) D Isoformen PLD1 und PLD2, die vermutlich beide im Zuge der Blutplättchenstimulation aktiviert werden. Allerdings wurde die Rolle von PLD in der Thrombozytenaktivierung und -aggregation noch nicht abschließend untersucht. Daher wurden PLD-defiziente Mäuse analysiert. Mäuse, denen entweder PLD1 oder PLD2 fehlt, sind lebensfähig, fertil und haben normale Thrombozytenzahlen. Es zeigte sich, dass PLD1 für den induzierbaren Anteil der PLD-Aktivität in Blutplättchen verantwortlich und an der Integrinaktivierung unter statischen Bedingungen beteiligt ist. Des Weiteren ergaben Adhäsionsexperimente unter Flussbedingungen, dass PLD1 für die GPIb-vermittelte Integrinaktivierung von zentraler Bedeutung ist. Folglich sind Mäuse mit einer genetischen Ablation von PLD1 vor arterieller Thrombusbildung und ischämischem Schlaganfall geschützt. Da die Blutungszeiten dieser Tiere nicht verlängert waren, könnte die Inhibition von PLD1 einen anti-thrombotischen Therapieansatz darstellen. iii) Die zelluläre Aktivierung von Thrombozyten oder Immunzellen geht mit einem Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration einher. Der sogenannte Speicher-vermittelte Kalziumeinstrom (store-operated calcium entry, SOCE) über die STIM1-Orai1-Achse ist der wichtigste Kalziumeinstrommechanismus in Folge der Stimulation von Rezeptoren mit einem immunoreceptor tyrosine-based activating motif (ITAM) in Mastzellen und T-Zellen. Allerdings ist die Notwendigkeit eines Kalziumeinstroms in Fcg Rezeptor (FcgR)-vermittelten Signalprozessen sowie die Relevanz von STIM2 hierbei noch unklar. Daher wurden gentechnisch veränderte Mäuse, denen zentrale Moleküle des SOCE-Apparats fehlen, untersucht. Kalziummessungen zeigten, dass beide STIM-Isoformen an der Kalziummobilisierung in Folge der T-Zellrezeptorstimulation beteiligt sind. Außerdem wurde gezeigt, dass die Stimulation von FcgRs zu SOCE führt, der von STIM1 und vermutlich auch von Orai1 vermittelt wird. Die Daten aus dem Immunthrombozytopenie (ITP) Tiermodell belegen, dass SOCE für die Zerstörung von Plättchen essentiell ist. Weiterhin sprechen die hiervorliegenden Ergebnisse für eine Rolle beider STIM Isoformen in der Pathologie der ITP. Außerdem konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass STIM1 und Orai1 entscheidende Faktoren für IgG-vermittelte systemische Anaphylaxie sind. STIM2 ist ebenfalls an der IgG-vermittelten, nicht jedoch an der IgE-vermittelten Anaphylaxie beteiligt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Eingriffe in den SOCE eine neue Strategie in der Behandlung von IgG-abhängigen immunologischen Erkrankungen sein könnten.
KW  - Thrombozyt
KW  - Phospholipase D
KW  - Calcium
KW  - Immunthrombozytopenie
KW  - Glycoprotein GPV
KW  - platelet
KW  - Immune Thrombocytopenia
KW  - phospholipase D
KW  - glycoprotein GPV
KW  - store-operated calcium entry
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87980
ER  -