TY  - THES
A1  - Brown, Helena Charlotte
T1  - Investigating the role of the platelet receptor C-type lectin-like receptor 2 in models of thrombosis
T1  - Untersuchungen zur Rolle des Thrombozytenrezeptors CLEC-2 (C-
type lectin-like receptor 2) in Thrombosemodellen
N2  - Platelets have a key physiological role in haemostasis however, inappropriate thrombus formation can lead to cardiovascular diseases such as myocardial infarction or stroke. Although, such diseases are common worldwide there are comparatively few anti-platelet drugs, and these are associated with an increased risk of bleeding. Platelets also have roles in thrombo-inflammation, immuno-thrombosis and cancer, in part via C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) and its ligand podoplanin. Although CLEC-2 contributes to these diseases in mice, as well as to thrombus stability, it is unclear whether CLEC-2 has similar roles in humans, particularly as human CLEC-2 (hCLEC-2) cannot be investigated experimentally in vivo.
To investigate hCLEC-2 in vivo, we generated a humanised CLEC-2 mouse (hCLEC-2KI) model, as well as a novel monoclonal antibody, HEL1, that binds to a different site than an existing antibody, AYP1. Using these antibodies, we have provided proof of principle for the use of hCLEC-2KI mice to test potential therapeutics targeting hCLEC-2, and shown for the first time that hCLEC-2 can be immunodepleted, with little effect on haemostasis. However, our results have also suggested that there are species differences in the role of CLEC-2 in arterial thrombosis. We further confirmed this using human blood where blocking CLEC-2 ligand binding had no effect on thrombosis, whereas we confirmed a minor role for mouse CLEC-2 in thrombus stability. We also investigated the effect of blocking CLEC-2 signalling using the Bruton’s tyrosine kinase inhibitor PRN473 on CLEC-2 mediated immuno-thrombosis in a Salmonella typhimurium infection model. However, no effect on thrombosis was observed suggesting that CLEC-2 signalling is not involved.
Overall, our results suggest that there may be differences in the role of human and mouse CLEC-2, at least in arterial thrombosis, which could limit the potential of CLEC-2 as an anti-thrombotic target. However, it appears that the interaction between CLEC-2 and podoplanin is conserved and therefore CLEC-2 could still be a therapeutic target in immuno-thrombosis, thrombo-inflammation and cancer. Furthermore, any potential human specific therapeutics could be investigated in vivo using hCLEC-2KI mice.
N2  - Thrombozyten sind ein wichtiger Bestandteil der Hämostase, können allerdings durch die Bildung eines Blutgerinnsels auch kardiovaskuläre Krankheitsbilder wie Myokardinfarkte oder Schlaganfälle hervorrufen. Obwohl diese Erkrankungen weltweit zu den führenden Todesursachen zählen, gibt es vergleichsweise wenig Thrombozyteninhibitoren und die bislang verfügbaren Wirkstoffe gehen mit einem erhöhten Blutungsrisiko einher. Darüber hinaus spielen Thrombozyten auch bei thrombo-inflammatorischen oder malignen Erkrankungen eine Rolle und sind maßgeblich an Entzündungs-vermittelten Thrombosen (Immunothrombosen) beteiligt. Daten aus Mausmodellen legen nahe, dass die Interaktion zwischen dem Thrombozytenrezeptor CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2) und seinem Liganden Podoplanin von Bedeutung für diese Krankheitsbilder, und die Thrombusstabilität ist. Allerdings ist bislang unklar, ob CLEC-2 im Menschen eine ähnliche Rolle spielt, da die Rolle des menschlichen CLEC-2 (hCLEC-2) in diesen Prozessen bislang nicht experimentell in vivo erforscht werden kann.
Um hCLEC-2 in vivo zu erforschen, haben wir Mäuse generiert, die humanes CLEC-2 exprimieren (hCLEC-2KI), sowie einen neuen, monoklonalen Antikörper (HEL1) entwickelt, der an eine andere Bindungsstelle als der zuvor generierter Antikörper (AYP1) bindet. Mit Hilfe dieser Antikörper haben wir erstmalig gezeigt, dass hCLEC-2KI Mäuse geeignet sind, um potenzielle Therapeutika zu testen, die auf hCLEC-2 abzielen. Des Weiteren konnten wir erstmalig zeigen, dass auch hCLEC-2 immunodepletiert werden kann und dass der Verlust des Rezeptors in zirkulierenden Thrombozyten die Hämostase nur minimal beeinträchtigt. Allerdings deuten unsere Ergebnisse auch darauf hin, dass es hinsichtlich der Bedeutung CLEC-2 für die arterielle Thrombose artspezifische Unterschiede gibt: Während Maus CLEC-2 zur Stabilität der Thromben beiträgt, hatte die Blockade der Ligandenbindungsstelle von hCLEC-2 keinen Einfluss auf Thrombose. Des Weiteren wurde mit Hilfe des Bruton’s tyrosine kinase Inhibitors PRN473 der Effekt einer Blockierung des CLEC-2 Signalwegs auf die durch CLEC-2 hervorgerufene Immuno-Thrombose in einem Salmonella typhimurium Infektionsmodel erforscht. Da jedoch keine Effekte nachgewiesen werde konnten, schlussfolgern wir, dass der CLEC-2 Signalweg nicht in diesen Prozess involviert ist.
Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass es Unterschiede in der Rolle von CLEC-2 zwischen Mensch und Maus gibt, zumindest im Kontext der arteriellen Thrombose, was das Potenzial von CLEC-2 als antithrombotisches Ziel einschränken könnte. Da allem Anschein nach die Interaktion zwischen CLEC-2 und Podoplanin konserviert ist, könnte CLEC-2 dennoch als Therapeutikum für Thrombo-Inflammation, Immunothrombose und Krebsbildungen genutzt werden. Des Weiteren könnten für den Menschen entwickelte Therapieansätze mit Hilfe von hCLEC-2KI Mäusen in vivo untersucht werden.
KW  - Thrombozyt
KW  - Thrombose
KW  - Platelet
KW  - Thrombosis
KW  - Rezeptor
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-293108
ER  - 
TY  - THES
A1  - Mott, Kristina
T1  - Regulation of platelet biogenesis in the native and myeloablated bone marrow niche
T1  - Die Regulation der Thrombozytenbiogenese im nativen und myeloablatierten Knochenmark
N2  - Megakaryocytes (MKs) are the largest cells of the hematopoietic system and the precursor cells of platelets. During proplatelet formation (PPF) bone marrow (BM) MKs extent large cytoplasmic protrusions into the lumen of sinusoidal blood vessels. Under homeostatic conditions PPF occurs exclusively in the direction of the sinusoid, while platelet generation into the marrow cavity is prevented. So far, the mechanisms regulating this process in vivo are still not completely understood, especially when PPF is deregulated during disease. This thesis investigated the mechanisms of PPF in native BM and after myeloablation by total body irradiation (TBI).
First, we have identified a specialized type of BM stromal cells, so called CXCL12-abundant reticular (CAR) cells, as novel possible regulators of PPF. By using complementary high-resolution microscopy techniques, we have studied the morphogenetic events at the MK/vessel wall interface in new detail, demonstrating that PPF formation preferentially occurs at CAR cell-free sites at the endothelium.
In the second part of this thesis, we analyzed the processes leading to BM remodeling in response to myeloablation by TBI. We used confocal laser scanning microscopy (CLSM) to study the kinetic of radiation-triggered vasodilation and mapped extracellular matrix (ECM) proteins after TBI. We could demonstrate that collagen type IV and laminin α5 are specifically degraded at BM sinusoids. At the radiation-injured vessel wall we observed ectopic release of platelet-like particles into the marrow cavity concomitantly to aberrant CAR cell morphology, suggesting that the balance of factors regulating PPF is disturbed after TBI. ECM proteolysis is predominantly mediated by the matrix metalloproteinase MMP9, as revealed by gelatin-zymography and by a newly established BM in situ zymography technique. In transgenic mice lacking MMP9 vascular recovery was delayed, hinting towards a role of MMP9 in vessel reconstitution after myeloablation.
In a third series of experiments, we studied the irradiated BM in the context of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). By using mice as BM donors that ubiquitously express the fluorescent reporter protein dsRed we tracked engraftment of donor cells and especially MKs in the recipient BM. We found a distinct engraftment pattern and cluster formation for MKs, which is different from other blood cell lineages.
Finally, we assessed platelet function after TBI and HSCT and were the first to demonstrate that platelets become massively hyporeactive, particularly upon stimulation of the collagen receptor GPVI.
In summary, our findings shed light on the processes of PPF during health and disease which will help to develop treatments for aberrant thrombopoiesis.
N2  - Megakaryozyten (MKs) sind die größten Zellen des hämatopoetischen Systems und die Vorläuferzellen der Blutplättchen. Während der Ausbildung von Proplättchen schnüren MKs im Knochenmark (KM) große zytoplasmatische Ausläufer in das Lumen der sinusoidalen Blutgefäße ab. Unter homöostatischen Bedingungen erfolgt die Proplättchenbildung ausschließlich in Richtung der Sinusoide, während die Thrombozytenbildung in die Knochenmarkkavität verhindert wird. Bislang sind die Mechanismen, die diesen Prozess in vivo steuern, noch nicht vollständig aufgeklärt insbesondere, wenn die Thrombozytenbiogenese unter Krankheitsbedingungen dereguliert ist. In dieser Arbeit wurden die Mechanismen der Thrombopoese im nativen Knochenmark und nach Myeloablation durch Ganzkörperbestrahlung (total body irradiation, TBI) untersucht.
Zunächst haben wir einen spezialisierten Typ von KM-Stromazellen, die sog. CXCL12-abundant reticular (CAR) Zellen, als neue mögliche Regulatoren der Proplättchenbildung identifiziert. Durch den Einsatz komplementärer hochauflösender Mikroskopietechniken haben wir die morphogenetischen Vorgänge an der Schnittstelle zwischen MKs und Gefäßwand genauer untersucht und gezeigt, dass die Generierung von Proplättchen bevorzugt an CAR-Zell-freien Stellen am Endothel stattfindet.
Im zweiten Teil dieser Arbeit analysierten wir die Prozesse, die zum Knochenmarkumbau nach Myeloablation durch TBI führen. Mit Hilfe von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersuchten wir die Kinetik der strahleninduzierten Vasodilatation und kartierten die extrazelluläre Matrix (EZM) Proteine nach TBI. So konnten wir zeigen, dass Kollagen Typ IV und Laminin α5 spezifisch an den Knochenmarksinusoiden abgebaut werden. An der strahlengeschädigten Gefäßwand beobachteten wir die ektope Freisetzung plättchenartiger Partikel in die Knochenmarkkavität, die mit einer abnormalen CAR-Zellmorphologie einherging. Dies weist darauf hin, dass das Gleichgewicht der Faktoren, die die gerichtete Proplättchenbildung regulieren, nach TBI gestört ist. Die EZM-Proteolyse wird vor allem durch die Matrix-Metalloproteinase MMP9 vermittelt, was durch Gelatine-Zymographie und durch eine neu etablierte in situ Zymographie-Technik für das Knochenmark nachgewiesen wurde. Bei transgenen Mäusen, die defizient für MMP9 sind, war die Regeneration der Vaskulatur verzögert, was auf eine Rolle von MMP9 bei der Gefäßrekonstitution nach Myeloablation hindeutet.
In einer dritten Versuchsreihe untersuchten wir das bestrahlte KM im Rahmen einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT). Mit Hilfe von Mäusen als KM-Spender, die ubiquitär das fluoreszierende Reporterprotein dsRed exprimieren, verfolgten wir das Anwachsen von Spenderzellen und insbesondere von MKs im Empfängerknochenmark. Wir
beobachteten ein eindeutiges Muster bzw. Clusterbildung für anwachsende MKs, die sich von anderen Blutzelllinien unterschied.
Schließlich untersuchten wir die Funktion von Thrombozyten nach TBI und HSZT und konnten als erste zeigen, dass Thrombozyten eine massive Hyporeaktivität ausbilden, insbesondere nach Stimulation des Kollagenrezeptors GPVI.
Zusammenfassend geben unsere Ergebnisse Aufschluss über die Prozesse der Thrombopoese im nativen und pathologischen Knochenmark, was zur Entwicklung von Therapien zu Behandlung von defekter Thrombozytenbiogenese beitragen wird.
KW  - Knochenmark
KW  - Knochenmarktransplantation
KW  - Megakaryozyt
KW  - Thrombozyt
KW  - Ganzkörperbestrahlung
KW  - bone marrow
KW  - myeloablation
KW  - thrombopoiesis
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289630
ER  - 
TY  - THES
A1  - Baumann, Juliane
T1  - Studies on the influence of mutations in the Myh9 gene on platelet function
T1  - Studien zum Einfluss von Mutationen im Myh9 Gen auf die Thrombozytenfunktion
N2  - The platelet cytoskeleton ensures normal size and discoid shape under resting conditions and undergoes immediate reorganization in response to changes in the extracellular environment through integrin-based adhesion sites, resulting in actomyosin-mediated contractile forces. Mutations in the contractile protein non-muscle myosin heavy chain IIA display, among others, macrothrombocytopenia and a mild to moderate bleeding tendency in human patients. It is insufficiently understood which factors contribute to the hemostatic defect found in MYH9-related disease patients. Therefore, a better understanding of the underlying biophysical mechanisms in thrombus formation and stabilization is warranted.
This thesis demonstrates that an amino acid exchange at the positions 702, 1424 and 1841 in the heavy chain of the contractile protein non-muscle myosin IIA, caused by heterozygous point mutations in the gene, resulted in macrothrombocytopenia and increased bleeding in mice, reflecting the clinical hallmark of the MYH9-related disease in human patients. Basic characterization of biological functions of Myh9 mutant platelets revealed overall normal surface glycoprotein expression and agonist-induced activation when compared to wildtype platelets. However, myosin light chain phosphorylation after thrombin-activation was reduced in mutant platelets, resulting in less contractile forces and a defect in clot retraction. Altered biophysical characteristics with lower adhesion and interaction forces of Myh9 mutant platelets led to reduced thrombus formation and stability. Platelets from patients with the respective mutations recapitulated the findings obtained with murine platelets, such as impaired thrombus formation and stiffness.
Besides biological and biophysical characterization of mutant platelets from mice and men, treatment options were investigated to prevent increased bleeding caused by reduced platelet forces. The antifibrinolytic agent tranexamic acid was applied to stabilize less compact thrombi, which are presumably more vulnerable to fibrinolysis. The hemostatic function in Myh9 mutant mice was improved by interfering with the fibrinolytic system. These results show the beneficial effect of fibrin stabilization to reduce bleeding in MYH9-related disease.
N2  - Das thrombozytäre Zytoskelett gewährleistet eine normale Zellgröße und diskoide Form unter ruhenden Bedingungen. Als Reaktion auf Veränderungen in der extrazellulären Umgebung wird das Zytoskelett durch Integrin-basierte Adhäsionsstellen reorganisiert, was zu Aktomyosin-vermittelten kontraktilen Kräften führt. Mutationen in der schweren Kette des kontraktilen nicht-muskulären Proteins Myosin IIA führen bei Patienten u. a. zu einer Makrothrombozytopenie und einer leichten bis mittelschweren Blutungsneigung. Es ist unzureichend geklärt, welche Faktoren zum hämostatischen Defekt bei Patienten mit MYH9-bedingter Erkrankung beitragen. Daher ist ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden biophysikalischen Mechanismen bei der Thrombusbildung und -stabilisierung erforderlich.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Austausch von einzelnen Aminosäuren an den Positionen 702, 1424 und 1841 im kontraktilen Protein Myosin IIA, hervorgerufen durch Punktmutationen im kodierenden Gen, zu einer Makrothrombozytopenie und zu einer verlängerten Blutungszeit in Mäusen führt. Dies spiegelt die klinischen Merkmale der MYH9-assoziierte Erkrankungen bei Patienten wider. Die basale Charakterisierung der biologischen Funktionen von Myh9-mutierten Thrombozyten im Vergleich zu Wildtyp-Thrombozyten ergab eine insgesamt normale Oberflächenglykoproteinexpression und Agonisten-induzierte Aktivierung. Interessanterweise war die Phosphorylierung der leichten Myosinkette in den mutierten Thrombozyten nach Aktivierung reduziert, was zu einer geringeren Kontraktionskraft und damit zu einem Defekt beim Zusammenziehen des Gerinnsels führte. Mit Hilfe von biophysikalischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass geringere Adhäsions- und Interaktionskräfte von Thrombozyten mit Punktmutationen im Myh9 Gen zu einer verminderten Thrombusbildung und -stabilität führen. Thrombozyten von Patienten mit den entsprechenden Mutationen rekapitulierten die mit murinen Thrombozyten erhaltenen Ergebnisse, wie z. B. eine beeinträchtigte Thrombusbildung und -steifigkeit.
Neben der biologischen und biophysikalischen Charakterisierung der Thrombozyten von Mäusen und Menschen mit den Punktmutationen wurden Behandlungsmöglichkeiten untersucht, um die erhöhte Blutungsneigung aufgrund der verminderten Thrombozytenkräfte zu verhindern. Das Antifibrinolytikum Tranexamsäure wurde eingesetzt, um weniger kompakte Thromben zu stabilisieren, die vermutlich anfälliger für Fibrinolyse sind. Die hämostatische Funktion von Mäusen mit Myh9-Mutationen konnte durch die Gabe von Tranexamsäure verbessert werden. Diese Ergebnisse zeigen die positive Wirkung der Fibrinstabilisierung zur Verringerung von Blutungsneigungen bei MYH9-assoziierte Erkrankungen.
KW  - Thrombozyt
KW  - Zellskelett
KW  - Platelets
KW  - Cytoskeleton
KW  - Biomechanics
KW  - Myosin IIA
KW  - Biomechanik
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-287953
ER  - 
TY  - THES
A1  - Göb [née Klaus], Vanessa Aline Domenica
T1  - Pathomechanisms underlying ischemic stroke
T1  - Pathomechanismen des ischämischen Schlaganfalles
N2  - Every year, stroke affects over 100 million people worldwide and the number of cases continues to grow. Ischemic stroke is the most prevalent form of stroke and rapid restoration of blood flow is the primary therapeutic aim. However, recanalization might fail or reperfusion itself induces detrimental processes leading to infarct progression. Previous studies identified platelets and immune cells as drivers of this so-called ischemia/reperfusion (I/R) injury, establishing the concept of ischemic stroke as thrombo-inflammatory disease. Reduced cerebral blood flow despite recanalization promoted the hypothesis that thrombus formation within the cerebral microcirculation induces further tissue damage. The results presented in this thesis refute this: using complementary methodologies, it was shown that infarct growth precedes the occurrence of thrombi excluding them as I/R injury-underlying cause. Blood brain barrier disruption is one of the hallmarks of ischemic stroke pathology and was confirmed as early event during reperfusion injury in the second part of this study. Abolished platelet α-granule release protects mice from vascular leakage in the early reperfusion phase resulting in smaller infarcts. Using in vitro assays, platelet α-granule-derived PDGF-AB was identified as one factor contributing to blood-brain barrier disruption.
In vivo visualization of platelet activation would provide important insights in the spatio-temporal context of platelet activation in stroke pathology. As platelet signaling results in elevated intracellular Ca2+ levels, this is an ideal readout. To overcome the limitations of chemical calcium indicators, a mouse line expressing an endogenous calcium reporter specifically in platelets and megakaryocytes was generated. Presence of the reporter did not interfere with platelet function, consequently these mice were characterized in in vivo and ex vivo models. 
Upon ischemic stroke, neutrophils are among the first cells that are recruited to the brain. Since for neutrophils both, beneficial and detrimental effects are described, their role was investigated within this thesis. Neither neutrophil depletion nor absence of NADPH-dependent ROS production (Ncf-/- mice) affected stroke outcome. In contrast, abolished NET-formation in Pad4-/- mice resulted in reduced infarct sizes, revealing detrimental effects of NETosis in the context of ischemic stroke, which might become a potential therapeutic target. 
Cerebral venous (sinus) thrombosis, CV(S)T is a rare type of stroke with mainly idiopathic onset. Whereas for arterial thrombosis a critical contribution of platelets is known and widely accepted, for venous thrombosis this is less clear but considered more and more. In the last part of this thesis, it was shown that fab-fragments of the anti-CLEC-2 antibody INU1 trigger pathological platelet activation in vivo, resulting in foudroyant CVT accompanied by heavy neurological symptoms. Using this novel animal model for CVT, cooperative signaling of the two platelet receptors CLEC-2 and GPIIb/IIIa was revealed as major trigger of CVT and potential target for treatment.
N2  - Jährlich sind weltweit über 100 Millionen Menschen von einem Schlaganfall betroffen, wobei die Zahl der Fälle weiter zunimmt. Der ischämische Schlaganfall ist die häufigste Form des Schlaganfalls, und die sofortige Wiederherstellung des Blutflusses ist das oberste Therapie¬ziel. Allerdings kommt es vor, dass die Rekanalisierung des betroffenen Gefäßes fehlschlägt oder die Reperfusion selbst zu schädlichen Prozessen führt, die das Fortschreiten des Infarkts begünstigen. In vorangegangen Studien wurden Thrombozyten und Immunzellen als treibende Kräfte dieser so genannten Ischämie/Reperfusion (I/R)-Schädigung identifiziert und der ischämische Schlaganfall als thrombo-inflammatorische Erkrankung definiert. Eine verminderte zerebrale Durchblutung trotz Rekanalisation führte zu der Hypothese, dass die Bildung von Thromben in der zerebralen Mikrozirkulation zu weiteren Gewebeschäden führt. Die hier vorgestellten Ergebnisse widerlegen dies: Mit Hilfe komplementärer Methoden konnte gezeigt werden, dass das Infarktwachstum dem Auftreten von Thromben vorausgeht, was diese als Ursache für die I/R-Verletzung ausschließt.
Die Störung der Blut-Hirn-Schranke ist eines der charakteristischen Kennzeichen der Pathologie des ischämischen Schlaganfalls und wurde im zweiten Teil dieser Studie als frühes Ereignis während des Reperfusionsschadens bestätigt. Mit Hilfe transgener Mäuse konnte gezeigt werden, dass die Ausschüttung von α-Granula aus Thrombozyten in der frühen Reperfusionsphase an Störungen der Blut-Hirn-Schranke beteiligt ist und somit zum Infarktwachstum beiträgt. In in-vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, dass PDGF-AB, ein Bestandteil der α-Granula, an Prozessen, die für die Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlich sind, beteiligt ist.
Die Sichtbarmachung von aktivierten Thrombozyten in vivo, würde wichtige Erkenntnisse über den räumlichen und zeitlichen Kontext der Aktivierung von Thrombozyten im Verlauf des Schlaganfalls liefern. Da alle aktivierenden Signalwege zum Anstieg des intrazellulären Kalziumspiegels führen, ist Kalzium ein idealer Indikator der Thrombozytenaktivierung. Um die Grenzen chemischer Kalziumindikatoren zu überwinden, wurde eine transgene Mauslinie erzeugt, welche einen endogenen Kalziumreporter speziell in Thrombozyten und Megakaryozyten exprimiert. Die Anwesenheit des Reporters hatte keine Auswirkung auf die Funktionalität der Thrombozyten und die Mäuse wurden in vivo sowie ex vivo in verschiedenen Experimenten charakterisiert. 
In der Folge eines ischämischen Schlaganfalles gehören Neutrophile zu den am frühesten ins Gehirn einwandernden Zellen. Dabei werden Neutrophilen sowohl günstige als auch schädliche Wirkungen auf den Verlauf des ischämischen Schlaganfalls zugeschrieben. Aus diesem Grund wurde ihre Rolle in dieser Arbeit näher untersucht. Weder die Abwesenheit von Neutrophilen noch das Fehlen der NADPH-abhängigen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (Ncf1-/- Mäuse) beeinflussen den Ausgang eines Schlaganfalls. Im Gegensatz dazu, führte die Verhinderung der NET-Bildung (NET = neutrophil extracellular traps) in Pad4-/- Mäusen zu verringerten Infarktgrößen, was auf eine schädliche Wirkung der NETose im Zusammenhang des Schlaganfalls hinweist und somit ein therapeutisches Angriffsziel darstellen könnte. 
Sinusvenenthrombosen sind eine seltene Form des Schlaganfalls, die meist ohne bekannte Ursache auftreten. Während für die arterielle Thrombose ein kritischer Beitrag der Thrombozyten bekannt und weithin akzeptiert ist, ist dies für venöse Thrombosen weniger klar, wird aber immer mehr in Betracht gezogen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Fab-Fragmente des anti-CLEC-2-Antikörpers INU1 in vivo eine pathologische Aktivierung von Thrombozyten auslösen, die zu einer fulminanten Sinusvenenthrombose mit schweren neurologischen Symptomen führt. Mit Hilfe dieses neuartigen Tiermodells wurde die zusammenwirkende Signalübertragung der beiden Thrombozytenrezeptoren CLEC-2 und GPIIb/IIIa als Hauptauslöser der Sinusvenenthrombose und damit potenzielles Ziel für eine Behandlung identifiziert.
KW  - Schlaganfall
KW  - Thrombozyt
KW  - Maus
KW  - Blut-Hirn-Schranke
KW  - Sinusthrombose
KW  - thrombo-inflammation
KW  - ischemic stroke
KW  - blood brain barrier
KW  - CVT
KW  - platelets
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286727
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TY  - THES
A1  - Klingler, Philipp
T1  - Exploration of proteasome interactions with human platelet function
T1  - Untersuchung von Proteasom-Wechselwirkungen mit der Funktion humaner Thrombozyten
N2  - Platelets are anucleated cell fragments derived from megakaryocytes. They play a fundamental role in hemostasis, but there is rising evidence that they are also involved in immunological processes. Despite absence of a nucleus, human platelets are capable of de novo protein synthesis and contain a fully functional proteasome system, which is, in nucleated cells, involved in processes like cell cycle progression or apoptosis by its ability of protein degradation. The physiological significance of the proteasome system in human platelets is not yet fully understood and subject of ongoing research.
Therefore, this study was conducted with the intention to outline the role of the proteasome system for functional characteristics of human platelets. For experimentation, citrated whole blood from healthy donors was obtained and preincubated with proteasome inhibitors. In addition to the commonly used bortezomib, the potent and selective proteasome inhibitor carfilzomib was selected as a second inhibitor to rule out agent-specific effects and to confirm that observed changes are related to proteasome inhibition.
Irreversibly induced platelet activation and aggregation were not affected by proteasome blockade with bortezomib up to 24 hours. Conversely, proteasome inhibition led to enhanced threshold aggregation and agglutination up to 25 %, accompanied by partial alleviation of induced VASP phosphorylation of approximately 10-15 %. Expression of different receptors were almost unaffected. Instead, a significant increase of PP2A activity was observable in platelets after proteasome blockade, accompanied by facilitated platelet adhesion to coated surfaces in static experiments or flow chamber experiments.
Carfilzomib, used for the first time in functional experimentation with human platelets in vitro, led to a dose-dependent decrease of proteasome activity with accumulation of poly ubiquitylated proteins. Like bortezomib, carfilzomib treatment resulted in enhanced threshold aggregation with attenuated VASP phosphorylation.
As the main conclusion of this thesis, proteasome inhibition enhances the responsiveness of human platelets, provided by an alleviation of platelet inhibitory pathways and by an additional increase of PP2A activity, resulting in facilitated platelet adhesion under static and flow conditions. The proteasome system appears to be involved in the promotion of inhibitory counterregulation in platelets. The potential of proteasome inhibitors for triggering thromboembolic adverse events in patients must be clarified in further studies, in addition to their possible use for targeting platelet function to improve the hemostatic reactivity of platelets.
N2  - Thrombozyten sind kernlose Zellfragmente, welche aus Megakaryozyten gebildet werden. Sie spielen eine fundamentale Rolle in der Hämostase, aber es gibt immer mehr Hinweise, dass Thrombozyten auch in immunologischen Prozessen involviert sind. Trotz Fehlen eines Zellkerns haben humane Thrombozyten die Fähigkeit zur de novo Proteinsynthese und besitzen außerdem ein voll funktionstüchtiges Proteasomsystem, welches in kernhaltigen Zellen über den Proteinabbau an Prozessen wie dem Fortschreiten des Zellzyklus oder der Apoptose beteiligt ist. Die physiologische Bedeutung des Proteasomsystems in humanen Thrombozyten ist nicht vollständig geklärt und ist aus diesem Grund Gegenstand aktueller Forschung.
Daher war es Ziel dieser Studie, die Rolle des Proteasomsystems für die funktionellen Eigenschaften humaner Thrombozyten zu erforschen. Für die Experimente wurde Citrat-Vollblut von gesunden Spendern gewonnen und mit Proteasom-Hemmstoffen vorinkubiert. Es wurde neben dem gängigen Bortezomib der potente und selektive Proteasom-Inhibitor Carfilzomib als zweiter Inhibitor eingesetzt, um substanzspezifische Effekte auszuschließen und zu bestätigen, dass die beobachteten Veränderungen auf der Proteasom-Inhibition beruhen.
Die irreversibel induzierte Thrombozytenaktivierung und -aggregation wurde durch die Hemmung des Proteasoms mit Bortezomib bis zu 24 Stunden nicht beeinflusst. Allerdings führte die Proteasom-Hemmung zu einer verstärkten Schwellenwertaggregation und -agglutination um bis zu 25 % sowie zu einer partiellen Abschwächung der induzierten VASP-Phosphorylierung um etwa 10-15 %. Die Expression verschiedener Rezeptoren blieb nahezu unbeeinflusst. Stattdessen konnte unter Proteasom-Inhibition eine erhöhte Enzymaktivität der PP2A beobachtet werden, begleitet von einer erleichterten Thrombozytenadhäsion an beschichteten Oberflächen bei statischen Versuchen ober bei Flusskammerversuchen.
Carfilzomib, welches erstmals für funktionelle Experimente mit menschlichen Thrombozyten in vitro eingesetzt wurde, führte zu einer dosisabhängigen Abnahme der Proteasom-Aktivität mit einer Akkumulation von poly ubiquitylierten Proteinen. Wie Bortezomib mündete die Behandlung mit Carfilzomib in einer verstärkten Schwellenwertaggregation und abgeschwächter VASP-Phosphorylierung.
Die wichtigste Schlussfolgerung dieser Arbeit ist, dass die Inhibition des Proteasoms die Reaktivität humaner Thrombozyten erhöht, gekennzeichnet durch eine Abschwächung der hemmenden Signalwege der Thrombozyten und durch eine zusätzliche Erhöhung der PP2A-Enzymaktivität, was zu einer erleichterten Thrombozytenadhäsion unter statischen Verhältnissen und unter Flussbedingungen führt. Das Proteasomsystem scheint an der Förderung der hemmenden Gegenregulation in Thrombozyten beteiligt zu sein. Das Potenzial von Proteasom Inhibitoren, thromboembolische Nebenwirkungen bei Patienten auszulösen, muss in weiteren Studien geklärt werden, ebenso wie ihr möglicher Einsatz für die gezielte Beeinflussung der Thrombozytenfunktion zur Verbesserung der hämostatischen Reaktivität der Thrombozyten.
KW  - Thrombozyt
KW  - Proteasom
KW  - Platelet
KW  - Proteasome
KW  - Bortezomib
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321089
ER  - 
TY  - THES
A1  - Cherpokova, Deya
T1  - Studies on modulators of platelet (hem)ITAM signaling and platelet production in genetically modified mice
T1  - Untersuchungen an Modulatoren des thrombozytären (hem)ITAM-Signalwegs und der Thrombozytenbildung in genetisch veränderten Mäusen
N2  - Summary
Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic disease states, such as myocardial infarction and stroke. Glycoprotein (GP) VI and C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) are essential platelet activating receptors in hemostasis and thrombo-inflammatory disease which signal through a (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-dependent pathway. The adapter molecules Src-like adapter protein (SLAP) and SLAP2 are involved in the regulation of immune cell receptor surface expression and signaling, but their function in platelets is unknown. As revealed in this thesis, single deficiency of SLAP or SLAP2 in mice had only moderate effects on platelet function, while SLAP/SLAP2 double deficiency resulted in markedly increased signal transduction, integrin activation, granule release, aggregation, procoagulant activity and thrombin generation following (hem)ITAM-coupled, but not G protein-coupled receptor activation. Slap-/-/Slap2-/- mice displayed accelerated occlusive arterial thrombus formation and a dramatically worsened outcome after focal cerebral ischemia. These results establish SLAP and SLAP2 as critical inhibitors of platelet (hem)ITAM signaling in the setting of arterial thrombosis and ischemic stroke.
GPVI has emerged as a promising novel pharmacological target for treatment of thrombotic and inflammatory disease states, but the exact mechanisms of its immunodepletion in vivo are incompletely understood. It was hypothesized that SLAP and SLAP2 may be involved in the control of GPVI down-regulation because of their role in the internalization of immune cell receptors. As demonstrated in the second part of the thesis, SLAP and SLAP2 were dispensable for antibody-induced GPVI down-regulation, but anti-GPVI treatment resulted in prolonged strong thrombocytopenia in Slap-/-/Slap2-/- mice. The profound thrombocytopenia likely resulted from the powerful platelet activation which the anti-GPVI antibody induced in Slap-/-/Slap2-/- platelets, but importantly, not in wild-type platelets. These data indicate that the expression and activation state of key modulators of the GPVI signaling cascade may have important implications for the safety profile and efficacy of anti-GPVI agents.
Small GTPases of the Rho family, such as RhoA and Cdc42, are critically involved in the regulation of cytoskeletal rearrangements during platelet activation, but little is known about the specific roles and functional redundancy of both proteins in platelet biogenesis. As shown in the final part of the thesis, combined deficiency of RhoA and Cdc42 led to marked alterations in megakaryocyte morphology and the generation of platelets of heterogeneous size and granule content. Despite severe hemostatic defects and profound thrombo¬cytopenia, circulating RhoA-/-/Cdc42-/- platelets were still capable of granule secretion and the formation of occlusive thrombi. These results implicate the existence of both distinct and overlapping roles of RhoA and Cdc42 in platelet production and function.
N2  - Zusammenfassung
Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach einer Gefäßverletzung ist entscheidend, um einen starken Blutverlust zu vermeiden. Diese Prozesse können aber auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen führen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall. Die aktivatorischen Thrombozytenrezeptoren Glykoprotein (GP) VI und C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) spielen eine wichtige Rolle im Prozess der Hämostase und Thrombo-Inflammation. Die Aktivierung beider Rezeptoren leitet eine (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-abhängige Signalkaskade ein. Die Adapterproteine Src-like adapter protein (SLAP) und SLAP2 sind an der Regulation der Oberflächenexpression von Immunzellrezeptoren und der Steuerung nachgeschalteter Signalwege beteiligt, aber ihre Funktion in Thrombozyten ist unbekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Einzeldefizienz von SLAP oder SLAP2 in Mäusen einen milden Effekt auf die Thrombozytenfunktion hatte. Hingegen führte das Fehlen beider Proteine zu deutlich verstärkter Signaltransduktion, Integrinaktivierung, Freisetzung von Granula, Aggregation, prokoagulatorischer Aktivität und Thrombingenerierung nach (hem)ITAM-abhängiger, aber nicht G Protein-gekoppelter Rezeptoraktivierung. Die SLAP/SLAP2-Doppeldefizienz ging mit beschleunigter Bildung okklusiver arterieller Thromben und dramatisch verschlechtertem Zustand nach fokaler zerebraler Ischämie einher. Diese Ergebnisse etablieren SLAP und SLAP2 als essentielle Inhibitoren des (hem)ITAM-Signalwegs in arterieller Thrombose und im ischämischen Schlaganfall.
GPVI wird zunehmend als vielversprechender neuer pharmakologischer Angriffspunkt für die Behandlung von thrombotischen und entzündlichen Erkrankungen betrachtet. Die genauen Mechanismen der Herabregulierung von GPVI nach Antikörper-Gabe in vivo sind jedoch unvollständig aufgeklärt. Im Hinblick auf die Rolle von SLAP und SLAP2 in der Internalisierung von Immunzellrezeptoren wurde die Hypothese aufgestellt, dass beide Adapterproteine entscheidend an der Herabregulierung von GPVI beteiligt sein könnten. Im zweiten Teil dieser Dissertation wurde aber gezeigt, dass SLAP und SLAP2 nicht erforderlich sind für die Depletion von GPVI. Dagegen ging die Antikörper-induzierte Herabregulierung von GPVI mit lang anhaltender starker Thrombozytopenie in Slap-/-/Slap2-/- Mäusen einher. Der anti-GPVI-Antikörper induzierte eine starke Aktivierung von Slap-/-/Slap2-/- Thrombo¬zyten, nicht aber von Wildtypthrombozyten, was eine mögliche Erklärung für die schwere Thrombozytopenie lieferte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Expression und der Aktivierungszustand von Molekülen, die die Feinregulierung der GPVI-Signalkaskade steuern, wichtige Auswirkungen auf das Sicherheitsprofil und die Wirksamkeit von an GPVI angreifenden Substanzen haben könnten.
Kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie, wie z.B. RhoA und Cdc42, sind maßgeblich an der Regulation von Umstrukturierungen des Zytoskeletts während der Aktivierung von Thrombozyten beteiligt. Dennoch ist wenig über spezifische und überlappende Funktionen von RhoA und Cdc42 während der Thrombozyten-Biogenese bekannt. Der letzte Teil der Arbeit befasste sich mit den Auswirkungen einer Doppeldefizienz von RhoA und Cdc42 in Megakaryozyten. Das Fehlen beider Proteine führte zu einer dramatisch veränderten Megakaryozyten¬morphologie und zur Produktion von Thrombozyten heterogener Größe und Granulainhaltes. Trotz markanter Thrombozytopenie und stark beeinträchtigter Hämostase in den RhoA-/-/Cdc42-/- Mäusen waren zirkulierende Thrombozyten in der Lage, ihre Granula freizusetzen, und die Bildung okklusiver Thromben war weitestgehend unverändert. Diese Ergebnisse implizieren, dass RhoA und Cdc42 sowohl unterschiedliche als auch überlappende Rollen in der Produktion und Funktion von Thrombozyten spielen.
KW  - Thrombozyt
KW  - Thrombozytenaggregation
KW  - Platelets
KW  - platelet aggregation
KW  - megakaryocyte
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-303777
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Die ursprüngliche Veröffentlichung war am 06.10.2017
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