TY - THES A1 - Bakirci, Ezgi T1 - Development of \(In\) \(vitro\) Models for Tissue Engineering Applications Using a High-Resolution 3D Printing Technology T1 - Entwicklung von \(In\) \(vitro\)-Modellen für Tissue-Engineering-Anwendungen mithilfe einer hochauflösenden 3D-Drucktechnologie N2 - In vitro models mimic the tissue-specific anatomy and play essential roles in personalized medicine and disease treatments. As a sophisticated manufacturing technology, 3D printing overcomes the limitations of traditional technologies and provides an excellent potential for developing in vitro models to mimic native tissue. This thesis aims to investigate the potential of a high-resolution 3D printing technology, melt electrowriting (MEW), for fabricating in vitro models. MEW has a distinct capacity for depositing micron size fibers with a defined design. In this thesis, three approaches were used, including 1) extending the MEW polymer library for different biomedical applications, 2) developing in vitro models for evaluation of cell growth and migration toward the different matrices, and 3) studying the effect of scaffold designs and biochemical cues of microenvironments on cells. First, we introduce the MEW processability of (AB)n and (ABAC)n segmented copolymers, which have thermally reversible network formulation based on physical crosslinks. Bisurea segments are combined with hydrophobic poly(dimethylsiloxane) (PDMS) or hydrophilic poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide) (PPO-PEG-PPO) segments to form the (AB)n segmented copolymers. (ABAC)n segmented copolymers contain all three segments: in addition to bisurea, both hydrophobic and hydrophilic segments are available in the same polymer chain, resulting in tunable mechanical and biological behaviors. MEW copolymers either support cells attachment or dissolve without cytotoxic side effects when in contact with the polymers at lower concentrations, indicating that this copolymer class has potential in biological applications. The unique biological and surface properties, transparency, adjustable hydrophilicity of these copolymers could be beneficial in several in vitro models. The second manuscript addresses the design and development of a melt electrowritten competitive 3D radial migration device. The approach differs from most of the previous literature, as MEW is not used here to produce cell invasive scaffolds but to fabricate an in vitro device. The device is utilized to systematically determine the matrix which promotes cell migration and growth of glioblastoma cells. The glioblastoma cell migration is tested on four different Matrigel concentrations using a melt electrowritten radial device. The glioblastoma U87 cell growth and migration increase at Matrigel concentrations 6 and 8 mg mL-1 In the development of this radial device, the accuracy, and precision of melt electrowritten circular shapes were investigated. The results show that the printing speed and design diameter are essential parameters for the accuracy of printed constructs. It is the first instance where MEW is used for the production of in vitro devices. The influence of biochemical cues and scaffold designs on astrocytes and glioblastoma is investigated in the last manuscript. A fiber comprising the box and triangle-shaped pores within MEW scaffolds are modified with biochemical cues, including RGD and IKVAV peptides using a reactive NCO-sP(EO-stat-PO) macromer. The results show that astrocytes and glioblastoma cells exhibit different phenotypes on scaffold designs and peptide-coated scaffolds. N2 - In-vitro-Modelle sind Werkzeuge, die die gewebespezifische Anatomie nachbilden und eine wesentliche Rolle in der personalisierten Medizin und bei der Behandlung von Krankheiten spielen. Als hochentwickelte, multifunktionale Fertigungstechnologie überwindet der 3D-Druck die Grenzen herkömmlicher Technologien und bietet ein hervorragendes Potenzial für die Herstellung von In-vitro-Modellen. Der 3D-Druck ist eine der vielversprechendsten Techniken, um biologische Materialien in einer komplexen Anordnung zusammenzusetzen, die das natürliche Gewebe nachahmt. In dieser Arbeit soll das Potenzial der hochauflösenden 3D-Drucktechnologie melt electrowriting (MEW), für die Herstellung von In-vitro-Modellen untersucht werden. Wir konzentrieren uns auf drei Ansätze: 1) die Erweiterung der MEW-Polymerbibliothek für verschiedene biomedizinische Anwendungen, 2) die Entwicklung von In-vitro-Modellen zur Bewertung des Zellwachstums und der Zellmigration in Richtung der verschiedenen Matrizes und 3) die Untersuchung der Auswirkungen von MEW-Gerüstdesigns und biochemischen Faktoren der Mikroumgebung auf Zellen. Zunächst haben wir die MEW-Verarbeitbarkeit von segmentierten (AB)n- und (ABAC)n-Copolymeren vorgestellt, die eine thermisch reversible Netzwerkformulierung auf der Grundlage physikalischer Vernetzungen aufweisen. Bisurea-Segmente werden mit hydrophoben hydrophobic poly(dimethyl siloxane) (PDMS) oder hydrophilen poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide) (PPO-PEG-PPO) Segmenten kombiniert, um die (AB)n segmentierten Copolymere zu bilden. Segmentierte (ABAC)n-Copolymere enthalten alle drei Segmente: Zusätzlich zu den Bisurea-Segmenten sind sowohl hydrophobe als auch hydrophile Segmente in derselben Polymerkette vorhanden, was den segmentierten (ABAC)n-Copolymeren abstimmbare mechanische und biologische Eigenschaften verleiht. MEW-Copolymere unterstützten entweder die Anhaftung an Zellen oder lösten sich ohne zytotoxische Nebenwirkungen auf, wenn sie in niedrigeren Konzentrationen mit ihnen in Berührung kamen, was darauf hindeutet, dass diese Copolymerklasse über umfassende biologische Eigenschaften verfügt. Die einzigartigen biologischen Eigenschaften und Oberflächeneigenschaften, die Transparenz und die einstellbare Hydrophilie dieser Copolymere könnten in verschiedenen In-vitro-Modellen von Vorteil sein. Das zweite Manuskript befasst sich mit einem durch MEW hergestellten wettbewerbsfähigen 3D-Radialmigrationsdesign. Der Ansatz unterscheidet sich vom Großteil der MEW-Literatur, da MEW nicht zur Herstellung von invasiven Zellgerüsten verwendet wurde, sondern zur Herstellung eines In-vitro-Designs diente. Das Design wurde verwendet, um systematisch die Matrix zu bestimmen, die die Zellmigration und das Wachstum von Glioblastomzellen fördert. Die Migration der Glioblastomzellen wurde auf vier verschiedenen Matrigel-Konzentrationen unter Verwendung einer durch MEW hergestellten Radialvorrichtung getestet. Das Wachstum und die Migration der Glioblastomzellen U87 nahmen bei Matrigelkonzentrationen von 6 und 8 mg mL-1 zu. Wir untersuchten auch die Genauigkeit und Präzision der durch MEW erzeugten Kreisformen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Druckgeschwindigkeit und der Designdurchmesser wesentliche Parameter für die Genauigkeit der gedruckten Konstrukte sind. Die Arbeit ist die erste Studie, die MEW für die Herstellung von In-vitro-Modellen verwendet. Im letzten Manuskript wurde der Einfluss von biochemische Funktionalisierung in Kombination mit Gerüstdesigns auf Astrozyten und Glioblastome untersucht. Die kastenförmigen und achteckigen MEW-Gerüste wurden mit biochemischen Wirkstoffen modifiziert, darunter RGD- und IKVAV-Peptide unter Verwendung von reaktivem NCO-sP(EO-stat-PO). Wir fanden heraus, dass Astrozyten und Glioblastomzellen unterschiedliche Phänotypen auf den verschiedenen Designs und mit Peptiden beschichteten Gerüsten aufweisen. KW - Melt electrowriting KW - 3D-Druck KW - 3D printing KW - In vitro model Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251645 ER - TY - THES A1 - Blahetek, Gina T1 - The role of alternative intronic polyadenylation on microRNA biogenesis in melanoma T1 - Der Einfluss von alternativer intronischer Polyadenylierung auf die Biogenese von microRNAs im Melanom N2 - mRNA is co- or post-transcriptionally processed from a precursor mRNA to a mature mRNA. In addition to 5'capping and splicing, these modifications also include polyadenylation, the addition of a polyA tail to the 3'end of the mRNA. In recent years, alternative polyadenylation in particular has increasingly been taken into account as a mechanism for regulating gene expression. It is assumed that approximately 70-75 % of human protein coding genes contain alternative polyadenylation signals, which are often located within intronic sequences of protein-coding genes. The use of such polyadenylation signals leads to shortened mRNA transcripts and thus to the generation of C-terminal shortened protein isoforms. Interestingly, the majority of microRNAs, small non-coding RNAs that play an essential role in post-transcriptional gene regulation, are also encoded in intronic sequences of protein-coding genes and are co-transcriptionally expressed with their host genes. The biogenesis of microRNA has been well studied and is well known, but mechanisms that may influence the expression regulation of mature microRNAs are just poorly understood. In the presented work, I aimed to investigate the influence of alternative intronic polyadenylation on the biogenesis of microRNAs. The human ion channel TRPM1 could already be associated with melanoma pathogenesis and truncated isoforms of this protein have already been described in literature. In addition, TRPM1 harbors a microRNA, miR211, in its sixth intron, which is assumed to act as a tumor suppressor. Since both, TRPM1 and miR211 have already been associated with melanoma pathogenesis, the shift towards truncated transcripts during the development of various cancers is already known and it has been shown that certain microRNAs play a crucial role in the development and progression of melanoma, melanoma cell lines were used as an in vitro model for these investigations. N2 - Das Melanom, auch als schwarzer Hautkrebs bekannt, ist einer der gefährlichsten und aggressivsten Hautkrebsarten welcher aus den pigmentgebenden Zellen, den sogenannten Melanozyten, entsteht. Hauptursache dieser malignen Erkrankung ist eine starke und wiederkehrende UV-Belastung, häufig einhergehend mit Sonnenbränden, aber auch genetische Veranlagungen oder das Vorhandensein vieler Leberflecke kann das Risiko einer Melanomerkrankung erhöhen. Weltweit ist in den letzten Jahren ein starker Anstieg an jährlichen Neuerkrankungen zu beobachten. Wird das Melanom frühzeitig erkannt ist die operative Entfernung die wichtigste und effektivste Behandlungsmethode. Hat das Melanom jedoch bereits angefangen in weit entfernte Lymphknoten und in andere Organe zu streuen und Metastasen zu bilden, sinkt die 5-Jahres Überlebensrate drastisch ab. Immuntherapien mit Checkpoint-Inhibitoren, Chemotherapie oder Bestrahlung helfen dann häufig nur noch bedingt. Es ist bereits bekannt, dass TRPM1, ein Kalzium-permeabler Ionenkanal, an der Entstehung eines Melanoms beteiligt sein kann und dessen Expression invers mit der Aggressivität eines Melanoms korreliert. Interessanterweise wurden verkürzte Isoformen dieses Proteins in der Literatur beschrieben, ein Mechanismus wie diese generiert werden wurde bisher jedoch noch nicht untersucht. Ebenfalls nennenswert ist eine im sechsten Intron von TRPM1 codierte microRNA, miR211. In Melanomzellen und Melanom Patientenproben wurde bereits eine verminderte Expression dieser microRNA gezeigt. Messenger RNA (mRNA) wird von einer Vorläuferform (prä-mRNA) zu einer reifen mRNA co- oder posttranskriptionell prozessiert. Zu diesen Modifikationen gehört neben dem 5’Capping und dem Spleißen auch die Polyadenylierung, das Anbringen eines polyA Schwanzes an das 3‘Ende der mRNA. Dieser polyA Schwanz ist essentiell für den Transport der mRNA aus dem Nukleus in das Zytosol, für die Stabilität der mRNA sowie für die Effizienz der Translation. Besonders die alternative Polyadenylierung wurde in den letzten Jahren vermehrt als Mechanismus zur Regulation der Genexpression berücksichtigt. Es wird angenommen, dass etwa 70-75 % der humanen proteincodierenden Gene alternative Polyadenylierungssignale enthalten. Häufig liegen diese in intronischen Sequenzen proteincodierender Gene. Die Verwendung solcher Polyadenylierungssignale führt zu verkürzten mRNA Transkripten und somit zur Generierung C-terminal verkürzter, und im Falle von Transmembranproteinen oft löslichen, Protein Isoformen. Für diverse Krebsarten konnte bereits gezeigt werden, dass es eine Verlagerung hin zu 3’UTR verkürzten mRNA Transkripten gibt oder es im speziellen Fall der chronisch lymphatischen Leukämie zu einem globalen Trend in der Aktivierung intronischer Polyadenylierungssignale kommt. Interessanterweise ist die Mehrheit an microRNAs, kleine nicht codierenden RNAs, die eine essentielle Rolle in der post-transkriptionellen Genregulation spielen, ebenfalls in intronischen Sequenzen proteincodierender Gene codiert und werden co-transkriptionell mit ihren Wirtsgenen exprimiert. Die Biogenese der microRNA ist bereits sehr gut untersucht und bekannt, die Mechanismen hingegen, die einen Einfluss auf die Expressionsregulation reifer microRNAs haben können sind nur sehr wenig untersucht. Durch vorangegangene Studien konnte bereits gezeigt werden, dass die U1 snRNA (U1 small nuclear RNA), neben ihrer initiierenden Rolle in der Spleißreaktion durch das Binden an 5‘ Spleißstellen, auch aktiv die Verwendung intronischer Polyadenylierungssignale unterdrücken kann und dadurch frühzeitiges Schneiden und Polyadenylieren der mRNA verhindert. Die Blockierung oder ein geringeres Level an U1 snRNA führt nicht nur zu einer verminderten Spleißreaktion, sondern auch zu einer vermehrten Aktivierung intronischer Polyadenylierungssignale. Ob diese Aktivierung jedoch auch einen Einfluss auf die Expression intronischer microRNAs haben kann, wurde bisher nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von alternativer intronischer Polyadenylierung auf die Biogenese von microRNAs untersucht werden. Der humane Ionenkanal TRPM1 konnte bereits mit der Pathogenese des Melanoms assoziiert werden und verkürzte Isoformen dieses Proteins wurden bereits in der Literatur beschrieben. Darüber hinaus beherbergt TRPM1 in seinem sechsten Intron eine microRNA, miR211, von der angenommen wird, dass sie als Tumorsuppressor agiert. Aus diesen Gründen war TRPM1 ein vielversprechendes Ziel die gegenseitige Verbindung zwischen alternativer intronischer Polyadenylierung und der Biogenese von microRNAs zu untersuchen. Da sowohl TRPM1 als auch miR211 bereits mit der Pathogenese des Melanoms assoziiert wurden, die Verlagerung hin zu verkürzten Transkripten während der Entstehung von unterschiedlichen Krebsarten bereits bekannt ist, und gezeigt werden konnte, dass diverse microRNAs eine entscheidende Rolle in der Entstehung und Progression des Melanoms spielen, wurden Melanomzelllinien als in vitro Modell für diese Untersuchungen verwenden. Durch 3’mRNA Sequenzierung von Melanomzelllinien und weitere molekularbiologische Analysen konnten zwei verkürzte Isoformen von TRPM1 identifizieren werden, welche durch Aktivierung alternativer Polyadenylierungssignale in Intron 3 oder Intron 10 generiert werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass in Melanomzelllinien im Vergleich zu einer Melanozyten Kontrollzelllinie, TRPM1 nicht nur vermindert exprimiert wird, sondern auch eine Verlagerung hin zu den verkürzten Isoformen, im Speziellen zur TRPM1 intron 3 Isoform, vorliegt. Durch Modulierung der Expression der unterschiedlichen TRPM1 Isoformen mittels Antisense-Oligonukleotide konnte gezeigt werden, dass speziell die Aktivierung des alternativen Polyadenylierungssignals in Intron 3 einen Einfluss auf die Biogenese der nachfolgend codierten intronischen miR211 hat, mit der Folge eines verringerten Expressionslevels. Zudem konnte eine U1 snRNA abhängige Verbindung zwischen frühzeitiger mRNA Transkriptions-Termination für TRPM1 und der Biogenese von miR211 in Melanomzelllinien gezeigt werden. Darüber hinaus wurde eine verminderte Expression der U1 snRNA in Melanomzelllinien im Vergleich zu einer Melanozyten Kontrollzelllinie gezeigt. Das Expressionslevel der U1 snRNA in Tumorgeweben oder auch anderen Krankheitsbildern im Vergleich zu gesundem Gewebe wurde bisher nur sehr wenig untersucht. Die verminderte Expression an U1 snRNA ist eine mögliche Erklärung für die Verlagerung hin zu verkürzten mRNA Transkripten während der Pathogenese und stellt somit einen vielversprechenden Ansatz für weitere Untersuchungen dar. Der in dieser Arbeit beschriebene Mechanismus zeigt eine neue, bisher nicht berücksichtigte Ebene zur Regulierung der Expression reifer microRNAs über die Aktivierung intronischer Polyadenylierungssignale. Die Möglichkeit, die Expression von mRNA Isoformen eines microRNA Wirtsgenes durch Antisense-Oligonukleotide spezifisch zu modulieren und damit zielgerichtet die Expression nachfolgend codierter microRNAs steuern zu können, bietet einen neuartigen und gezielten therapeutischen Ansatz. Dieser gezielte therapeutische Ansatz kann von TRPM1/miR211 im Melanom auch auf andere microRNA-Wirtsgene und deren intronische microRNAs übertragen werden, die mit der Entstehung von Krankheiten in Verbindung gebracht werden können. KW - Alternative polyadenylation KW - microRNA KW - U1 snRNA KW - alternative intronic polyadenylation KW - microRNA biogenesis KW - Polyadenylierung KW - Biogenese KW - miRNS KW - Melanom Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-254743 ER - TY - THES A1 - Behne, Robert Stefan Friedrich T1 - Development Of A Human iPSC-Derived Cortical Neuron Model Of Adaptor- Protein-Complex-4-Deficiency T1 - Entwicklung eines humanen iPSC-abgeleiteten kortikalen Neuronenmodells der Adaptor-Protein-Komplex-4-Defizienz N2 - Adaptor-protein-4-deficiency (AP-4-deficiency) is an autosomal-recessive childhood- onset form of complicated hereditary spastic paraplegia (HSP) caused by bi-allelic loss- of-function mutations in one of the four subunits of the AP-4-complex. These four conditions are named SPG47 (AP4B1, OMIM #614066), SPG50 (AP4M1, OMIM #612936), SPG51 (AP4E1, OMIM #613744) and SPG52 (AP4S1, OMIM #614067), respectively and all present with global developmental delay, progressive spasticity and seizures. Imaging features include a thinning of the corpus callosum, ventriculomegaly and white matter changes. AP-4 is a highly conserved heterotetrameric complex, which is responsible for polarized sorting of transmembrane cargo including the autophagy- related protein 9 A (ATG9A). Loss of any of the four subunits leads to an instable complex and defective sorting of AP-4-cargo. ATG9A is implicated in autophagosome formation and neurite outgrowth. It is missorted in AP-4-deficient cells and CNS-specific knockout of Atg9a in mice results in a phenotype reminiscent of AP-4-deficiency. However, the AP-4-related cellular phenotypes including ATG9A missorting have not been investigated in human neurons. Thus, the aim of this study is to provide the first human induced pluripotent stem cell- derived (iPSC) cortical neuron model of AP-4-deficiency to explore AP-4-related phenotypes in preparation for a high-content screening. Under the hypothesis that AP-4- deficiency leads to ATG9A missorting, elevated ATG9A levels, impaired autophagy and neurite outgrowth in human iPSC-derived cortical neurons, in vitro biochemical and imaging assays including automated high-content imaging and analysis were applied. First, these phenotypes were investigated in fibroblasts from three patients with compound heterozygous mutations in the AP4B1 gene and their sex-matched parental controls. The same cell lines were used to generate iPSCs and differentiate them into human excitatory cortical neurons. This work shows that ATG9A is accumulating in the trans-Golgi-network in AP-4- deficient human fibroblasts and that ATG9A levels are increased compared to parental controls and wild type cells suggesting a compensatory mechanism. Protein levels of the AP4E1-subunit were used as a surrogate marker for the AP-4-complex and were decreased in AP-4-deficient fibroblasts with co-immunoprecipitation confirming the instability of the complex. Lentiviral re-expression of the AP4B1-subunit rescues this corroborating the fact that a stable AP-4-complex is needed for ATG9A trafficking. Surprisingly, autophagic flux was present in AP-4-deficient fibroblasts under nutrient- rich and starvation conditions. These phenotypic markers were evaluated in iPSC-derived cortical neurons and here, a robust accumulation of ATG9A in the juxtanuclear area was seen together with elevated ATG9A protein levels. Strikingly, assessment of autophagy markers under nutrient-rich conditions showed alterations in AP-4-deficient iPSC- derived cortical neurons indicating dysfunctional autophagosome formation. These findings point towards a neuron-specific impairment of autophagy and need further investigation. Adding to the range of AP-4-related phenotypes, neurite outgrowth and branching are impaired in AP-4-deficient iPSC-derived cortical neurons as early as 24h after plating and together with recent studies point towards a distinct role of ATG9A in neurodevelopment independent of autophagy. Together, this work provides the first patient-derived neuron model of AP-4-deficiency and shows that ATG9A is sorted in an AP-4-dependent manner. It establishes ATG9A- related phenotypes and impaired neurite outgrowth as robust markers for a high-content screening. This disease model holds the promise of providing a platform to further study AP-4-deficiency and to search for novel therapeutic targets. N2 - Die Adaptor-Protein-4-Defizienz (AP-4-Defizienz) ist eine autosomal-rezessiv vererbte, komplizierte Form hereditären spastischen Paraplegien (HSPs), welche durch biallelische Mutationen in einer der vier Untereinheiten des AP-4-Gens verursacht wird. Die vier resultierenden Erkrankungen werden SPG47 (AP4B1, OMIM #614066), SPG50 (AP4M1, OMIM #612936), SPG51 (AP4E1, OMIM #613744) und SPG52 (AP4S1, OMIM #614067) genannt und präsentieren sich mit globaler Entwicklungsverzögerung im frühen Säuglingsalter, progressiver Spastik sowie Krampfanfällen. Radiologische Zeichen beinhalten ein verschmälertes Corpus callosum, Ventrikulomegalie und Veränderungen der weißen Substanz. AP-4 ist ein hoch konservierter, heterotetramerer Proteinkomplex, welcher für die polarisierte Verteilung von Transmembranproteinen einschließlich des „autophagy-related protein 9 A“ (ATG9A) zuständig ist. Eine „lossof- function“ Mutation in einer der vier Untereinheiten führt zur Instabilität des gesamten Komplexes und zur Beeinträchtigung des AP-4-abhängigen Proteintransportes. ATG9A ist notwendig für die Bildung von Autophagosomen und das Neuritenwachstum. In AP- 4-defizienten Zellen ist der ATG9A-Transport beeinträchtigt und ein ZNS-spezifischer Knockout von ATG9A erzeugt in Mäusen einen Phenotyp, der große Überschneidungen mit dem der AP-4-Defizienz aufweist. Bisher sind diese AP-4-abhängigen zellulären Phenotypen nicht in humanen Neuronen untersucht worden. Daher ist die Entwicklung des ersten humanen aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleiteten kortikalen Neuronenmodells der AP-4-Defizienz und die Identifikation AP-4-abhängiger Phenotypen für die Anwendung in einem Hochdurchsatzscreening das Ziel dieser Arbeit. Unter der Hypothese, dass AP-4- Defizienz in humanen iPSC-abgeleiteten kortikalen Neuronen zu ATG9A Fehltransport, erhöhtem ATG9A Protein, beeinträchtigter Autophagie und vermindertem Neuritenwachstum führt, wurden biochemische und automatisierte, Mikroskopie-basierte in vitro Assays entwickelt. Zunächst wurden primäre humane Fibroblasten von Patienten mit compound-heterozygoten Mutationen im AB4B1-Gen und geschlechtsangepasste, elterliche Kontrollzellen auf die genannten Phenotypen hin untersucht. Dieselben Zelllinien wurden anschließend für die Generierung von iPSCs und die Differenzierung in exzitatorische kortikale Neurone verwendet. 90 Diese Arbeit zeigt, dass ATG9A in AP-4-defizienten Fibroblasten im Bereich des Trans- Golgi-Netzwerkes akkumuliert und das ATG9A Proteinlevel erhöht sind, was auf eine kompensatorische Hochregulierung hindeutet. Die Proteinlevel der AP4E1-Untereinheit wurden als Surrogatparameter für einen stabilen AP-4-Komplex genutzt und waren in AP-4-defizienten Fibroblasten vermindert. In der Co-Immunpräzipitation konnte eine Instabilität des AP-4-Komplexes bestätigt werden. Die lentivirale Reexpression der AB4B1-Untereinheit führte zu einer Wiederherstellung des Wildtyp-Phänotyps und zeigt damit, dass ein stabiler AP-4-Komplex für die korrekte Verteilung von ATG9A notwendig ist. Trotz der bekannten Beteiligung von ATG9A an der Bildung von Autophagosomen, zeigte sich eine intakte Autophagosomenbildung und Degradation in AP-4-defizienten Fibroblasten. Die beschriebenen phänotypischen Marker wurden in iPSC-abgeleiteten kortikalen Neuronen evaluiert und auch hier konnten eine juxtanukleäre Akkumulation von ATG9A sowie erhöhte ATG9A Proteinlevel demonstriert werden. Im Gegensatz zu den Fibroblasten, zeigten AP-4-defiziente iPSCabgeleitete kortikale Neurone bereits unter nährstoffreichen Bedingungen eine Konstellation von Autophagiemarkern, die auf eine gestörte Autophagosomenbildung und damit auf eine Neuronen-spezifische Störung von Autophagie hindeuten und der weiteren Untersuchung bedürfen. Zusätzlich fand sich bei AP-4-defizienten kortikalen Neuronen bereits in den ersten 24 Stunden im Inkubator eine Störung des Neuritenwachstums und der -verzweigung, welche in Zusammenschau mit kürzlich erschienenen Arbeiten auf eine zusätzliche Autophagie-unabhängige Funktion von ATG9A hinweisen. Diese Arbeit stellt zusammenfassend die Entwicklung des ersten Patienten-abgeleiteten Neuronenmodells der AP-4-Defizienz dar und zeigt das ATG9A in einer AP-4-abhänigen Weise in der Zelle verteilt wird. Weiterhin etabliert diese Arbeit ATG9A-abhängige zelluläre Phänotypen und gestörtes Neuritenwachstum als robuste phänotypische Marker für ein High-Content Screening. Dieses zelluläre Krankheitsmodell trägt das Potential als Plattform für weitere Studien der AP-4-Defizienz zu dienen und damit neue therapeutische Möglichkeiten aufzudecken. KW - Adaptorproteine KW - hereditary spastic paraplegia KW - iPSC Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-351390 ER - TY - THES A1 - Reissland, Michaela T1 - USP10 is a \(de\) \(novo\) tumour-specific regulator of β-Catenin and contributes to cancer stem cell maintenance and tumour progression T1 - USP10 ist ein \(de\) \(novo\) tumorspezifischer Regulator von ß-Catenin und trägt zur Erhaltung von Krebsstammzellen und zur Tumorprogression bei N2 - Colorectal Cancer (CRC) is the third most common cancer in the US. The majority of CRC cases are due to deregulated WNT-signalling pathway. These alterations are mainly caused by mutations in the tumour suppressor gene APC or in CTNNB1, encoding the key effector protein of this pathway, β-Catenin. In canonical WNT-signalling, β-Catenin activates the transcription of several target genes, encoding for proteins involved in proliferation, such as MYC, JUN and NOTCH. Being such a critical regulator of these proto-oncogenes, the stability of β-Catenin is tightly regulated by the Ubiquitin-Proteasome System. Several E3 ligases that ubiquitylate and degrade β-Catenin have been described in the past, but the antagonists, the deubiquitylases, are still unknown. By performing an unbiased siRNA screen, the deubiquitylase USP10 was identified as a de novo positive regulator of β-Catenin stability in CRC derived cells. USP10 has previously been shown in the literature to regulate both mutant and wild type TP53 stability, to deubiquitylate NOTCH1 in endothelial cells and to be involved in the regulation of AMPKα signalling. Overall, however, its role in colorectal tumorigenesis remains controversial. By analysing publicly available protein and gene expression data from colorectal cancer patients, we have shown that USP10 is strongly upregulated or amplified upon transformation and that its expression correlates positively with CTNNB1 expression. In contrast, basal USP10 levels were found in non-transformed tissues, but surprisingly USP10 is upregulated in intestinal stem cells. Endogenous interaction studies in CRC-derived cell lines, with different extend of APCtruncation, revealed an APC-dependent mode of action for both proteins. Furthermore, by utilising CRISPR/Cas9, shRNA-mediated knock-down and overexpression of USP10, we could demonstrate a regulation of β-Catenin stability by USP10 in CRC cell lines. It is widely excepted that 2D cell culture systems do not reflect complexity, architecture and heterogeneity and are therefore not suitable to answer complex biological questions. To overcome this, we established the isolation, cultivation and genetically modification of murine intestinal organoids and utilised this system to study Usp10s role ex vivo. By performing RNA sequencing, dependent on different Usp10 levels, we were able to recapitulate the previous findings and demonstrated Usp10 as important regulator of β-dependent regulation of stem cell homeostasis. Since genetic depletion of USP10 resulted in down-regulation of β-Catenin-dependent transcription, therapeutic intervention of USP10 in colorectal cancer was also investigated. Commercial and newly developed inhibitors were tested for their efficacy against USP10, but failed to significantly inhibit USP10 activity in colorectal cancer cells. To validate the findings from this work also in vivo, development of a novel mouse model for colorectal cancer has begun. By combining CRISPR/Cas9 and classical genetic engineering with viral injection strategies, WT and genetically modified mice could be transformed and, at least in some animals, intestinal lesions were detectable at the microscopic level. The inhibition of USP10, which we could describe as a de novo tumour-specific regulator of β-Catenin, could become a new therapeutic strategy for colorectal cancer patients. N2 - Darmkrebs ist die dritthäufigste Krebsart in den USA. Die Mehrheit der Darmkrebsfälle sind auf einen deregulierten WNT-Signalweg zurückzuführen. Diese Veränderungen wer- den hauptsächlich durch Mutationen im Tumorsuppressor-Gen APC oder in CTNNB1 verursacht, welches für das zentrale Protein dieses Signalwegs, β-Catenin, kodiert. Beim kanonischen WNT-Signalweg aktiviert β-Catenin die Transkription mehrerer Gene, die für, an der Proliferation beteiligte Proteine wie MYC, JUN und NOTCH, kodieren. Da β-Catenin ein kritischer Regulator dieser proto-Onkogene ist, wird die Stabilität von β-Catenin durch das Ubiquitin-Proteasom-System streng reguliert. In der Vergangen- heit wurden mehrere E3-Ligasen beschrieben, die β-Catenin ubiquitylieren und abbauen, aber die Deubiquitylasen, sind grö𐀀tenteils noch unbekannt. Mit Hilfe eines unvoreingenommenen siRNA-Screens wurde die Deubiquitylase USP10 als de novo Regulator der β-Catenin-Stabilität in Darmkrebs-Zellen identifiziert. In der Literatur wurde bereits gezeigt, dass USP10 sowohl die Stabilität von mutiertem als auch von wild typ TP53 reguliert, NOTCH1 in Endothelzellen deubiquityliert und an der Regulation des AMPKα Signalwegs beteiligt ist. Insgesamt bleibt seine Rolle in der kolorektalen Tumorgenese aber bisher umstritten. Anhand der Analyse öffentlich zugänglicher Protein- und Genexpressionsdaten haben wir gezeigt, dass USP10 bei der Transformation stark hochreguliert oder amplifiziert wird und dass seine Expression positiv mit der von CTNNB1 korreliert. Im Gegensatz dazu wurden in nicht transformiertem Gewebe basale USP10-Spiegel gefunden, aber überraschenderweise ist USP10 in intestinalen Stammzellen hochreguliert. Endogene Interaktionsstudien in Darmkrebs-Zelllinien mit unterschiedlichem Ausma𐀀 an APC-Trunkierung zeigten eine APC-abhängige Interaktion für beide Proteine. Darüber hinaus konnten wir mit Hilfe von CRISPR/Cas9, shRNA-vermitteltem Knock-down und Überexpression von USP10 eine Regulation der β-Catenin-Stabilität durch USP10 in Darmkrebs-Zelllinien nachweisen. Es ist allgemein bekannt, dass 2D-Zellkultursysteme die Komplexität, Architektur und Heterogenität nicht widerspiegeln und daher nicht geeignet sind, um komplexe biologische Fragen zu beantworten. Um dies zu überwinden, haben wir die Isolierung, Kultivierung und genetische Veränderung von murinen Dar- morganoiden etabliert und dieses System genutzt, um die Rolle von Usp10 ex vivo zu untersuchen. Durch die Durchführung von RNA-Sequenzierungen in Abhängigkeit von unterschiedlichen Usp10-Spiegeln konnten wir die bisherigen Ergebnisse rekapitulieren und Usp10 als wichtigen Regulator der β-Catenin-abhängigen Regulation der Stammzell- homöostase nachweisen. Da die genetische Depletion von USP10 zu einer Herunterregulierung der β-Catenin- abhängigen Transkription führte, wurde auch die therapeutische Intervention von USP10 in Darmkrebs untersucht. Kommerzielle und neu entwickelte Inhibitoren wurden auf ihre Wirksamkeit gegen USP10 getestet, konnten jedoch die Aktivität von USP10 in Darmkrebs- Zellen nicht hemmen. Um die Erkenntnisse aus dieser Arbeit auch in vivo zu validieren, wurde mit der Entwicklung eines neuartigen Mausmodells für Darmkrebs begonnen. Durch die Kombination von CRISPR/Cas9 und klassischer Gentechnik mit viralen Injektionsstrategien konnten WT- und gentechnisch veränderte Mäuse trans- formiert werden und zumindest bei einigen Tieren waren Darmläsionen auf mikroskopis- cher Ebene nachweisbar. Die Inhibtierung von USP10, als de novo tumorspezifischer Regulator von β-Catenin, könnte eine neue therapeutische Strategie für Darmkrebs-Patienten werden. KW - Biomedizin KW - Biomedicine Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-319579 ER - TY - THES A1 - Gaballa, Abdallah Hatem Hassan Hosny Ahmed T1 - PAF1c drives MYC-mediated immune evasion in pancreatic ductal adenocarcinoma T1 - PAF1c treibt die MYC-vermittelte Immunevasion im duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse an N2 - The expression of the MYC proto-oncogene is elevated in a large proportion of patients with pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). Previous findings in PDAC have shown that this increased MYC expression mediates immune evasion and promotes S-phase progression. How these functions are mediated and whether a downstream factor of MYC mediates these functions has remained elusive. Recent studies identifying the MYC interactome revealed a complex network of interaction partners, highlighting the need to identify the oncogenic pathway of MYC in an unbiased manner. In this work, we have shown that MYC ensures genomic stability during S-phase and prevents transcription-replication conflicts. Depletion of MYC and inhibition of ATR kinase showed a synergistic effect to induce DNA damage. A targeted siRNA screen targeting downstream factors of MYC revealed that PAF1c is required for DNA repair and S-phase progression. Recruitment of PAF1c to RNAPII was shown to be MYC dependent. PAF1c was shown to be largely dispensable for cell proliferation and regulation of MYC target genes. Depletion of CTR9, a subunit of PAF1c, caused strong tumor regression in a pancreatic ductal adenocarcinoma model, with long-term survival in a subset of mice. This effect was not due to induction of DNA damage, but to restoration of tumor immune surveillance. Depletion of PAF1c resulted in the release of RNAPII with transcription elongation factors, including SPT6, from the bodies of long genes, promoting full-length transcription of short genes. This resulted in the downregulation of long DNA repair genes and the concomitant upregulation of short genes, including MHC class I genes. These data demonstrate that a balance between long and short gene transcription is essential for tumor progression and that interference with PAF1c levels shifts this balance toward a tumor-suppressive transcriptional program. It also directly links MYC-mediated S-phase progression to immune evasion. Unlike MYC, PAF1c has a stable, known folded structure; therefore, the development of a small molecule targeting PAF1c may disrupt the immune evasive function of MYC while sparing its physiological functions in cellular growth. N2 - Die Expression des MYC-Proto-Onkogens ist bei einem großen Teil der Patienten mit duktalem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) erhöht. Bisherige Erkenntnisse in der Erforschung des ankreaskarzinoms zeigen, dass die erhöhte MYCExpression die Umgehung des Immunsystems bewirkt und die Progression der S-Phase fördert. Wie diese Funktionen vermittelt werden und ob ein nachgeschalteter Faktor von MYC für diese Funktion verantwortlich ist, blieb jedoch bisher ungeklärt. Jüngste Studien zur Identifizierung des MYC-Interaktoms haben ein sehr komplexes Netzwerk an Interaktionspartnern von MYC aufgedeckt, was die Notwendigkeit unterstreicht, die onkogenen Eigenschaften von MYC und seinen Interaktionspartnern unvoreingenommen und genau zu untersuchen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MYC die genomische Stabilität während der S-Phase herstellt und Konflikte zwischen Transkription und Replikation verhindert. Die Depletion von MYC und die Hemmung der ATR-Kinase zeigten bei der Induktion von DNA Schäden eine synergistische Wirkung. Ein siRNA-Screen, der Gene beinhaltete, die MYC nachgeschaltet sind, ergab, dass PAF1c für die DNA-Reparatur und die S-PhasenProgression erforderlich ist. Es zeigte sich außerdem, dass die Rekrutierung von PAF1c an RNAPII von MYC abhängig ist. Für die Zellproliferation und die Regulierung von MYCZielgenen ist PAF1c jedoch weitgehend entbehrlich. Es konnte gezeigt werden, dass die Depletion von CTR9, einer Untereinheit von PAF1c, in einem murinen Modell des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse zu einer starken Tumorregression mit langfristigem Überleben einiger Mäuse führte. Diese Wirkung war nicht auf die Induktion von DNA-Schäden zurückzuführen, sondern auf die Wiederherstellung der Immunüberwachung des Tumors. Die Deletion von PAF1c führte zu einer Umverteilung von RNAPII und Trankriptionselongationsfaktoren wie SPT6, von langen Genen hin zu kurzen Genen. Dadurch wurden lange Gene wie zum Beispiel DNA Reparaturgene nicht vollständig transkribiert, kurze Gene wie MHC-Klasse-I-Gene hingegen schon. Diese Daten zeigen, dass ein Gleichgewicht zwischen der Transkription langer und kurzer Gene für die Tumorprogression wichtig ist und dass eine Verminderung der PAF1c-Konzentration dieses Gleichgewicht in Richtung eines tumorsuppressiven Transkriptionsprogramms verschiebt. Außerdem besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der MYCvermittelten S-Phasen-Progression und der Umgehung des Immunsystems. Im Gegensatz zu MYC verfügt PAF1c über eine stabile und gut bekannte gefaltete Struktur. Daher könnte die Entwicklung eines kleinen Moleküls, das PAF1c hemmt, die Funktion von MYC zur Umgehung des Immunsystems stören und gleichzeitig seine physiologischen Funktionen für das Zellwachstum nicht beeinträchtigen. KW - Myc KW - Transkription KW - PAF1c KW - Transcription elongation KW - Immune evasion KW - Immunevasion Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360459 ER - TY - THES A1 - Cruz de Casas, Paulina T1 - Sphingolipids as modulators of T cell function T1 - Sphingolipide als Modulatoren der T-Zell-Funktion N2 - The immune system is responsible for the preservation of homeostasis whenever a given organism is exposed to distinct kinds of perturbations. Given the complexity of certain organisms like mammals, and the diverse types of challenges that they encounter (e.g. infection or disease), the immune system evolved to harbor a great variety of distinct immune cell populations with specialized functions. For instance, the family of T cells is sub-divided into conventional (Tconv) and unconventional T cells (UTCs). Tconv form part of the adaptive arm of the immune system and are comprised of αβ CD4+ or CD8+ cells that differentiate from naïve to effector and memory populations upon activation and are essential during infection and cancer. Furthermore, UTCs, which include γδ T cells, NKT and MAIT, are involved in innate and adaptive immune responses, due to their dual mode of activation, through cytokines (innate-like) or TCR (adaptive), and function. Despite our understanding of the basic functions of T cells in several contexts, a great number of open questions related to their basic biology remain. For instance, the mechanism behind the differentiation of naïve CD4+ and CD8+ T cells into effector and memory populations is not fully understood. Moreover, the exact function and relevance of distinct UTC subpopulations in a physiological context have not been fully clarified. Here, we investigated the factors mediating naïve CD8+ T cell differentiation into effector and memory cells. By using flow cytometry, mass spectrometry, enzymatic assays, and transgenic mouse models, we found that the membrane bound enzyme sphingomyelin-phosphodiesterase acid-like 3b (Smpdl3b) is crucial for the maintenance of memory CD8+ T cells. Our data show that the absence of Smpdl3b leads to diminished CD8+ T cell memory, and a loss of stem-like memory populations due to an aggravated contraction. Our scRNA-seq data suggest that Smpdl3b could be involved in clathrinmediated endocytosis through modulation of Huntingtin interacting protein 1 (Hip1) levels, likely regulating TCR-independent signaling events. Furthermore, in this study we explored the role of UTCs in lymph node-specific immune responses. By using transgenic mouse models for photolabeling, lymph node transplantation models, infection models and flow cytometry, we demonstrate that S1P regulates the migration of tissue-derived UTC from tissues to draining lymph nodes, resulting in heterogeneous immune responses mounted by lymph nodes draining different tissues. Moreover, our unbiased scRNAseq and single lineage-deficient mouse models analysis revealed that all UTC lineages (γδ T cells, NKT and MAIT) are organized in functional units, based on transcriptional homogeneity, shared microanatomical location and migratory behavior, and numerical and functional redundancy. Taken together, our studies describe additional cell intrinsic (Smpdl3b) and extrinsic (S1Pmediated migration) functions of sphingolipid metabolism modulating T cell biology. We propose the S1P/S1PR1/5 signaling axis as the potential survival pathway for Smpdl3b+ memory CD8+ T cells and UTCs, mainly in lymph nodes. Possibly, Smpdl3b regulates S1P/S1PR signaling by balancing ligandreceptor endocytosis, while UTCs migrate to lymph nodes during homeostasis to be exposed to specific levels of S1P that assure their maintenance. Our results are clinically relevant, since several drugs modulating the S1P/S1PR signaling axis or the levels of Smpdl3b are currently used to treat human diseases, such as multiple sclerosis and B cell-mediated diseases. We hope that our discoveries will inspire future studies focusing on sphingolipid metabolism in immune cell biology. N2 - Das Immunsystem ist für die Aufrechterhaltung der Homöostase verantwortlich, wenn ein bestimmter Organismus verschiedenen Arten von Störungen ausgesetzt ist. In Anbetracht der Komplexität bestimmter Organismen wie Säugetiere und der verschiedenen Arten von Störungen, denen sie ausgesetzt sein können (z. B. Infektionen oder Krankheiten), hat sich das Immunsystem so entwickelt, dass es eine große Vielfalt verschiedener Immunzellpopulationen mit spezialisierten Funktionen beherbergt. So wird beispielsweise die Familie der T-Zellen in konventionelle (Tconv) und unkonventionelle T-Zellen (UTC) unterteilt. Tconv sind Teil des adaptiven Arms des Immunsystems und bestehen aus αβ-CD4+- oder CD8+-Zellen, die sich bei der Aktivierung von naiven zu Effektor- und Gedächtnispopulationen differenzieren und bei Infektionen und Krebs eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus sind UTCs, zu denen γδ-T-Zellen, NKT und MAIT gehören, aufgrund ihrer dualen Aktivierungsweise durch Zytokine (angeboren) oder TCR (adaptiv) und ihrer Funktion an angeborenen und adaptiven Immunantworten beteiligt. Trotz unseres Verständnisses der grundlegenden Funktionen von T-Zellen in verschiedenen Zusammenhängen gibt es nach wie vor eine große Anzahl offener Fragen im Zusammenhang mit ihrer grundlegenden Biologie. So ist beispielsweise der Mechanismus der Differenzierung naiver CD4+ und CD8+ T-Zellen in Effektor- und Gedächtnispopulationen noch nicht ausreichend verstanden. Auch die genaue Funktion und Bedeutung der verschiedenen UTCSubpopulationen im physiologischen Kontext sind noch nicht vollständig geklärt. Wir haben die Faktoren untersucht, die die Differenzierung naiver CD8+ T-Zellen in Effektorund Gedächtniszellen vermitteln. Mithilfe von Durchflusszytometrie, Massenspektrometrie, enzymatischen Assays und transgenen Mausmodellen konnten wir feststellen, dass das membrangebundene Enzym Sphingomyelin-Phosphodiesterase acid-like 3b (Smpdl3b) für die Aufrechterhaltung der CD8+ T-Zell-Gedächtnisfunktion entscheidend ist. Unsere Daten zeigen, dass das Fehlen von Smpdl3b zu einer verminderten Anzahl and CD8+ T Gedächtniszellen durch eine verstärke Kontraktion sowie einem Verlust von stammzellartigen Gedächtnispopulationen führt. Unsere scRNAseq- Daten deuten jedoch darauf hin, dass Smpdl3b an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligt sein könnte, indem es die Spiegel des Huntingtin interacting protein 1 (Hip1) moduliert und wahrscheinlich TCR-unabhängige Signalereignisse reguliert. Darüber hinaus untersuchten wir in dieser Studie die Rolle von UTCs bei lymphknotenspezifischen Immunantworten. Mit Hilfe von transgenen Mausmodellen für Photolabeling, Lymphknotentransplantationsmodellen, Infektionsmodellen und Durchflusszytometrie konnten wir zeigen, dass S1P die Migration von UTCs aus dem Gewebe in die drainierenden Lymphknoten reguliert, was zu heterogenen Immunantworten in den Lymphknoten führt, die verschiedene Gewebe drainieren. Ausserdem ergab unsere Analyse von scRNA-seq-Daten, sowie Mausmodelle mit einer genetischen Defizienz einzelner UTC-Linien (γδ-T-Zellen, NKT und MAIT), dass diese zusammen in funktionellen Einheiten organisiert sind, die auf transkriptioneller Homogenität, gemeinsamer mikroanatomischer Lage und Migrationsverhalten sowie numerischer und funktioneller Redundanz basieren. Zusammengenommen beschreiben unsere Studien zusätzliche zellinterne (Smpdl3b) und - externe (S1P-vermittelte Migration) Funktionen des Sphingolipid-Stoffwechsels, welche die T-Zell- Biologie modulieren. Wir schlagen die S1P/S1PR1/5-Signalachse als potenziellen Überlebensweg für Smpdl3b+ Gedächtnis-CD8+-T-Zellen und UTCs ausschließlich in Lymphknoten vor. Möglicherweise reguliert Smpdl3b die S1P/S1PR-Signalübertragung, indem es die Endozytose des Liganden-Rezeptors reguliert. Dadurch könnte deren Exposition zu bestimmten S1P-Mengen in der Homöostase im Lymphknoten reguliert werden, die wiederum das Überleben der UTC steuern. Unsere Ergebnisse sind klinisch relevant, da mehrere Medikamente, die die S1P/S1PR-Signalachse oder die Smpdl3b- Konzentration modulieren, derzeit zur Behandlung menschlicher Krankheiten eingesetzt werden, z. B. bei Multipler Sklerose und B-Zell-vermittelten Krankheiten. Wir hoffen, dass unsere Entdeckungen zukünftige Studien anregen werden, die sich auf den Sphingolipid-Stoffwechsel in der Immunzellbiologie konzentrieren. KW - T-Lymphozyt KW - Infektion KW - Lymphknoten KW - Cytokine KW - Sphingolipide KW - CD8+ T cell differentiation KW - Unconventional T cells KW - Sphingolipid biology KW - Immunology Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-359698 ER - TY - THES A1 - Amini, Emad T1 - How central and peripheral clocks and the neuroendocrine system interact to time eclosion behavior in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Wie zentrale und periphere Uhren und das neuroendokrine System zusammenwirken, um das Schlupfverhalten von \(Drosophila\) \(melanogaster\) zeitlich festzulegen N2 - To grow larger, insects must shed their old rigid exoskeleton and replace it with a new one. This process is called molting and the motor behavior that sheds the old cuticle is called ecdysis. Holometabolic insects have pupal stages in between their larval and adult forms, during which they perform metamorphosis. The pupal stage ends with eclosion, i.e., the emergence of the adult from the pupal shell. Insects typically eclose at a specific time during the day, likely when abiotic conditions are at their optimum. A newly eclosed insect is fragile and needs time to harden its exoskeleton. Hence, eclosion is regulated by sophisticated developmental and circadian timing mechanisms. In Drosophila melanogaster, eclosion is limited to a daily time window in the morning, regarded as the “eclosion gate”. In a population of laboratory flies entrained by light/dark cycles, most of the flies eclose around lights on. This rhythmic eclosion pattern is controlled by the circadian clock and persists even under constant conditions. Developmental timing is under the control of complex hormonal signaling, including the steroid ecdysone, insulin-like peptides, and prothoracicotropic hormone (PTTH). The interactions of the central circadian clock in the brain and a peripheral clock in the prothoracic gland (PG) that produces ecdysone are important for the circadian timing of eclosion. These two clocks are connected by a bilateral pair of peptidergic PTTH neurons (PTTHn) that project to the PG. Before each molt, the ecdysone level rises and then falls shortly before ecdysis. The falling ecdysone level must fall below a certain threshold value for the eclosion gate to open. The activity of PTTHn is inhibited by short neuropeptide F (sNPF) from the small ventrolateral neurons (sLNvs) and inhibition is thought to lead to a decrease in ecdysone production. The general aim of this thesis is to further the understanding of how the circadian clock and neuroendocrinal pathways are coordinated to drive eclosion rhythmicity and to identify when these endocrinal signaling pathways are active. In Chapter I, a series of conditional PTTHn silencing-based behavioral assays, combined with neuronal activity imaging techniques such as non-invasive ARG-Luc show that PTTH signaling is active and required shortly before eclosion and may serve to phase-adjust the activity of the PG at the end of pupal development. Trans-synaptic anatomical stainings identified the sLNvs, dorsal neurons 1 (DN1), dorsal neurons 2 (DN2), and lateral posterior neurons (LPNs) clock neurons as directly upstream of the PTTHn. Eclosion motor behavior is initiated by Ecdysis triggering hormone (ETH) which activates a pair of ventromedial (Vm) neurons to release eclosion hormone (EH) which positively feeds back to the source of ETH, the endocrine Inka cells. In Chapter II trans-synaptic tracing showed that most clock neurons provide input to the Vm and non-canonical EH neurons. Hence, clock can potentially influence the ETH/EH feedback loop. The activity profile of the Inka cells and Vm neurons before eclosion is described. Vm and Inka cells are active around seven hours before eclosion. Interestingly, all EH neurons appear to be exclusively peptidergic. In Chapter III, using chemoconnectomics, PTTHns were found to express receptors for sNPF, allatostatin A (AstA), allatostatin C (AstC), and myosuppressin (Ms), while EH neurons expressed only Ms and AstA receptors. Eclosion assays of flies with impaired AstA, AstC, or Ms signaling do not show arrhythmicity under constant conditions. However, optogenetic activation of the AstA neurons strongly suppresses eclosion. Chapter IV focuses on peripheral ventral’ Tracheal dendrite (v’Td) and class IV dendritic arborization (C4da) neurons. The C4da neurons mediate larval light avoidance through endocrine PTTH signaling. The v’Td neurons mainly receive O2/CO2 input from the trachea and are upstream of Vm neurons but are not required for eclosion rhythmicity. Conditional ablation of the C4da neurons or torso (receptor of PTTH) knock-out in the C4da neurons impaired eclosion rhythmicity. Six to seven hours before eclosion, PTTHn, C4da, and Vm neurons are active based on ARG-Luc imaging. Thus, C4da neurons may indirectly connect the PTTHn to the Vm neurons. In summary, this thesis advances our knowledge of the temporal activity and role of PTTH signaling during pupal development and rhythmic eclosion. It further provides a comprehensive characterization of the synaptic and peptidergic inputs from clock neurons to PTTHn and EH neurons. AstA, AstC, and Ms are identified as potential modulators of eclosion circuits and suggest an indirect effect of PTTH signaling on EH signaling via the peripheral sensory C4da neurons. N2 - Um zu wachsen, müssen Insekten ihr altes, starres Exoskelett abwerfen und durch ein neues ersetzen. Dieser Vorgang wird als Häutung bezeichnet, und das motorische Verhalten, bei dem die alte Kutikula abgestoßen wird, heißt Ekdysis. Holometabole Insekten haben zwischen ihrer Larven- und Erwachsenenform ein Puppenstadium, in welchem sie eine Metamorphose durchlaufen. Das Puppenstadium endet mit dem Schlüpfen des erwachsenen Tieres aus der Puppenhülle. Die Insekten schlüpfen in der Regel zu einem bestimmten Zeitpunkt am Tag, wenn die abiotischen Bedingungen optimal sind, da das frisch geschlüpfte Insekt zerbrechlich ist und Zeit braucht, um sein Exoskelett auszuhärten. Daher wird der Schlupf durch ausgeklügelte Mechanismen der Entwicklung und der inneren Uhr gesteuert. Bei Drosophila melanogaster ist der Sclupf auf ein tägliches Zeitfenster am Morgen beschränkt, das als "Schlupffenster" bezeichnet wird. In einer Population von Laborfliegen, die durch Licht/Dunkel-Zyklen gesteuert wird, schlüpfen die meisten Fliegen in etwa um das Einschalten der Beleuchtung. Dieses rhythmische Schlupfmuster wird von der inneren Uhr gesteuert und bleibt auch unter konstanten Bedingungen bestehen. Das Timing der Entwicklung wird von komplexen hormonellen Signalen gesteuert, darunter das Steroid Ecdyson, insulinähnliche Peptide und das prothorakotrope Hormon (PTTH). Die Wechselwirkungen zwischen der zentralen zirkadianen Uhr im Gehirn und einer peripheren Uhr in der Prothorakaldrüse (PG), die Ecdyson produziert, sind wichtig für die zirkadiane Zeitsteuerung des Schlupfs. Diese beiden Uhren sind durch ein bilaterales Paar peptiderger PTTH-Neuronen (PTTHn) verbunden, die in die PG projizieren. Vor jeder Häutung steigt der Ecdysonspiegel an und fällt dann kurz vor danach wieder ab. Der fallende Ecdysonspiegel muss einen bestimmten Schwellenwert unterschreiten, damit sich das Schlupffenster öffnen kann. Die Aktivität der PTTHn wird durch das kurze Neuropeptid F (sNPF) aus den kleinen ventrolateralen Neuronen (sLNvs) gehemmt, und es wird angenommen, dass die Hemmung zu einer Abnahme der Ecdysonproduktion führt. Das allgemeine Ziel dieser Thesis besteht darin, die Koordination zwischen der zirkadianen Uhr und den neuroendokrinen Signalwegen zur Steuerung der Eklosionsrhythmik weiter zu charakterisieren und zu ermitteln, wann diese endokrinen Signalwege aktiv sind. In Kapitel I zeigen eine Reihe von Verhaltenstests, die auf der konditionalen Ausschaltung von PTTHn basieren, in Kombination mit Techniken zur Darstellung neuronaler Aktivität, wie z. B. nicht-invasives ARG-Luc imaging, dass PTTH-Signale kurz vor dem Schlupf aktiv und erforderlich sind und zur Phasenanpassung der Aktivität der PG am Ende der Puppenentwicklung dienen könnten. Trans-synaptische anatomische Färbungen identifizierten die sLNvs, die dorsalen Neuronen 1 (DN1), die dorsalen Neuronen 2 (DN2) und die lateralen posterioren Neuronen (LPNs) als Uhrneuronen, die dem PTTHn direkt vorgeschaltet sind. Das motorische Schlupfverhalten wird durch das Ecdysis-auslösende Hormon (ETH) ausgelöst, das ein Paar ventromedialer (Vm) Neuronen zur Freisetzung des Eklosionshormons (EH) anregt, welches positiv an die Quelle des ETH, die endokrinen Inka-Zellen, zurückkoppelt. In Kapitel II zeigte die trans-synaptische Nachverfolgung, dass die meisten Uhrneuronen Input für die Vm- und nicht-kanonischen EH-Neuronen liefern, sodass die Uhr möglicherweise die ETH/EH-Rückkopplungsschleife beeinflussen kann. Das Aktivitätsprofil der Inka-Zellen und Vm-Neuronen vor dem Schlupf wird beschrieben. Vm- und Inka-Zellen sind etwa sieben Stunden vor dem Schlupf aktiv. Interessanterweise scheinen alle EH-Neuronen ausschließlich peptiderg zu sein. In Kapitel III wurde mit Hilfe von Chemoconnectomics festgestellt, dass PTTH-Neuronen Rezeptoren für sNPF, Allatostatin A (AstA), Allatostatin C (AstC) und Myosuppressin (Ms) exprimieren, während EH nur Ms- und AstA-Rezeptoren exprimieren. Eklosionsversuche mit Fliegen, deren AstA-, AstC- oder Ms-Signalübertragung beeinträchtigt ist, zeigen unter konstanten Bedingungen keine Arrhythmie. Eine optogenetische Aktivierung der AstA-Neuronen führt jedoch zu einer starken Unterdrückung des Schlupfs. Kapitel IV konzentriert sich auf die peripheren ventralen Trachealdendritischen Neurone (v'Td) und dendritische Verzweigungsneurone der Klasse IV (C4da). Die C4da-Neuronen vermitteln die Lichtvermeidung der Larven durch endokrine PTTH-Signale. Die v'Td-Neuronen erhalten hauptsächlich O2/CO2-Input aus den Tracheen und sind den Vm-Neuronen vorgeschaltet, werden aber für die Schlupfrhythmik nicht benötigt. Die bedingte Ablation der C4da-Neuronen und das Knock-out von torso (Rezeptor für PTTH) in den C4da-Neuronen beeinträchtigten die Schlupfrhythmik. Sechs bis sieben Stunden vor dem Schlupf sind die PTTHn-, C4da- und Vm-Neuronen aktiv. Somit könnten C4da-Neuronen indirekt die PTTHn mit den Vm-Neuronen verbinden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit unser Wissen über das zeitliche Aktivitätsmuster und der Rolle des PTTH signalling während der Puppenentwicklung und dem rhythmisches Schlupf erweitert. Sie liefert auch eine umfassende Charakterisierung der synaptischen und peptidergen Eingänge von Uhrneuronen zu PTTHn- und EH-Neuronen. AstA, AstC und Ms wurden als potenzielle Modulatoren der neuronalen Schlupfschaltkreise identifiziert und deuten auf einen indirekten Effekt der PTTH-Signalgebung auf das EH signalling über die peripheren sensorischen C4da-Neuronen hin. KW - Prothoracicotropic hormone KW - Prothoracic gland KW - Eclosion KW - Eclosion hormone KW - C4da KW - v’Td KW - Neuropeptide KW - Neuroendokrines System KW - Taufliege Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-361309 ER - TY - THES A1 - Glück, Valentina T1 - Habitual avoidance in trait anxiety and anxiety disorders T1 - Habituelles Vermeidungsverhalten bei Ängstlichkeit und Angststörungen N2 - Maladaptive avoidance behaviors can contribute to the maintenance of fear, anxiety, and anxiety disorders. It has been proposed that, throughout anxiety disorder progression, extensively repeated avoidance may become a habit (i.e., habitual avoidance) instead of being controlled by internal threat-related goals (i.e., goal-directed avoidance). However, the process of the acquisition of habitual avoidance in anxiety disorders is not yet well understood. Accordingly, the current thesis aimed to investigate experimentally whether trait anxiety and anxiety disorders are associated with an increased shift from goal-directed to habitual avoidance. The aim of Study 1 was to develop an experimental operationalization of maladaptive habitual avoidance. To this end, we adapted a commonly used action control task, the outcome devaluation paradigm. In this task, habitual avoidance was operationalized as persistent responses after extensive training to avoid an unpleasant stimulus when the aversive outcome was devalued, i.e., when individuals knew the aversive outcome could not occur anymore. We included indicators for costly and low-cost habitual avoidance, whereby habitual avoidance was associated with a monetary cost, while low-cost habitual avoidance was not associated with monetary costs. In Experiment 1 of Study 1, a pronounced costly and non-costly outcome devaluation effect was observed. However, this result may have partly resulted from trial-and-error learning or a better-safe-than-sorry strategy since not instructions about the stimulus-response-outcome contingencies after the outcome devaluation procedure had been provided to the participants. In Experiment 2 of Study 1, instructions on these stimulus-response-outcome contingencies were included to prevent the potential confounders. As a result, we observed no indicators for costly habitual avoidance, but evidence for low-cost habitual avoidance, potentially because competing goal-directed responses could easily be implemented and inhibited costly habitual avoidance tendencies. In Study 2, the strength of habitual avoidance acquisition was compared between participants with and without anxiety disorders, using the experimental task of Experiment 1 in Study 1. The results indicated that costly and low-cost habitual avoidance was not more pronounced in participants with anxiety disorders than in the healthy control group. However, in an exploratory subgroup comparison, panic disorder predicted more substantial habitual avoidance acquisition than social anxiety disorder. In Study 3, we investigated whether trait anxiety as a risk factor for anxiety disorders is associated with a specific increased shift from goal-directed to habitual avoidance and approach. The task from the Experiment 1 of Study 1 was adapted to include parallel versions for operationalizing habitual avoidance and habitual approach responses. Using a within-subjects design, the individuals – pre-screened for high and low trait anxiety – took part in the approach and the avoidance outcome devaluation task version. The results suggested stronger non-costly habitual responses in more highly trait-anxious individuals independent of the task version, and suggested a tendency towards an impact of trait anxiety on costly habitual approach rather than on costly habitual avoidance. In summary, individuals with high trait anxiety or anxiety disorders did not develop habitual avoidance more readily than individuals with low trait anxiety or without anxiety disorders. Therefore, this thesis does not support the assumption that an increased tendency to acquire habitual avoidance contributes to persistent maladaptive avoidance in anxiety disorders. The thesis also contributes to the discourse on the validity of outcome devaluation studies in general by highlighting the impact of task features, such as the instructions after the outcome devaluation procedure or the task difficulty in the test phase, on the experimental results. Such validity issues may partly explain the heterogeneity of findings in research with the outcome devaluation paradigm. We suggest ways towards more valid operationalizations of habitual avoidance in future studies. N2 - Vermeidungsverhalten ist an der Aufrechterhaltung von Furcht, Angst und Angststörungen beteiligt. Maladaptives Vermeidungsverhalten ist in Bezug auf die objektiv vorliegende Bedeutung einer Bedrohung unverhältnismäßig und kann selbst in Abwesenheit von Furcht oder Angst anhalten. In ätiologischen Modellen zu maladaptiver Vermeidung wurde zur Erklärung solcher anhaltenden Vermeidung vorgeschlagen, dass sich Vermeidung über die Zeit von einer geplanten, zielgerichteten zu einer gewohnheitsmäßigen, habituellen Vermeidung entwickeln könnte. Die Rolle habituellen Vermeidungsverhaltens in der Entstehung und Aufrechterhaltung von Angststörungen ist bisher nicht ausreichend verstanden und untersucht worden. Die vorliegenden Studien prüfen, ob Trait-Ängstlichkeit als Risikofaktor für Angststörungen sowie bereits vorliegende Angststörungen mit einer verstärkten Tendenz zur Ausbildung habitueller Vermeidung einhergehen. In der ersten Studie wurde eine häufig verwendete experimentelle Aufgabe zur Untersuchung von zielgerichteter und habitueller Handlungssteuerung, das Ergebnis-Devaluations-Paradigma, weiterentwickelt. Gewohnheitsmäßige Vermeidung wurde hierbei als jene Tendenz operationalisiert, ein Vermeidungsverhalten, nachdem es ausführlich trainiert worden war, auch dann noch auszuführen, wenn die entsprechende Bedrohung nicht mehr bedeutsam, d.h. devaluiert war. Die fortgeführte, habituelle Vermeidung konnte – bei sogenannter kostspieliger habitueller Vermeidung – mit finanziellen Kosten verbunden sein oder – bei der sogenannten kostenarmen habituellen Vermeidung – keine finanziellen Kosten verursachen. Im ersten Experiment der ersten Studie wurden nach dem ausführliche Vermeidungstraining sowohl kostspielige als auch kostenarme fortgeführte Vermeidung beobachtet. Diese Effekte konnten jedoch möglicherweise auf Versuch-und-Irrtum-Lernen erklärt werden, auf das die Versuchsteilnehmer_innen möglicherweise zurückgriffen, da sie nach dem Vermeidungstraining keine ausreichenden Informationen darüber erhalten hatten, welche Reaktionen zu Kosten oder keinen Kosten führten (Stimulus-Reaktions-Ergebnis-Zusammenhänge). Im zweiten Experiment der ersten Studie wurden die Stimulus-Reaktions-Ergebnis-Zusammenhänge explizit erklärt, um Versuch-und-Irrtum-Lernen zu verhindern. Kostenreiche habituelle Vermeidung wurde nun nicht mehr beobachtet, dafür jedoch ein Hinweis auf kostenarme Vermeidung. Dies könnte mit der niedrigeren Aufgabenschwierigkeit und der damit verbundenen Erleichterung von zielgerichtetem Handeln erklärt werden, wodurch möglicherweise kostenreiche habituelle Tendenzen abgeschwächt werden konnte. In der zweiten Studie wurde die experimentelle Aufgabe aus dem ersten Experiment der ersten Studie erneut verwendet, um die Stärke habitueller Vermeidung zwischen Personen mit und ohne Angststörungen zu vergleichen. Im Ergebnis zeigte sich keine verstärkte kostenreiche oder kostenarme habituelle Vermeidung bei Personen mit Angststörungen im Vergleich mit der gesunden Kontrollgruppe. In einer explorativen Analyse zeigte sich zwar stärkere habituelle Vermeidung bei Personen mit Panikstörung als bei Personen mit sozialer Angststörung, ein mögliches Versuch-und-Irrtum-Lernen erschwerte jedoch wieder die Interpretation dieser Ergebnisse. Die experimentelle Aufgabe wurde in der dritten Studie deshalb weiter angepasst und um eine parallele Version zur Untersuchung habitueller Annäherung erweitert. Personen mit hoher und niedriger Trait-Ängstlichkeit nahmen bearbeiteten sowohl die Annäherungs- als auch der Vermeidungsversion. Die Trait-Ängstlichkeit der Teilnehmer_innen sagte eine stärkere Tendenz zu kostenarmen habituellen Reaktionen vorher. Zudem fanden wir einen Hinweis auf stärkere kostenreiche habituelle Annäherung, nicht jedoch habituelle Vermeidung bei Personen mit höherer Trait-Ängstlichkeit. Auch unabhängig von Trait-Ängstlichkeit wurde eine stärkere habituelle Annäherung als eine habituelle Vermeidung beobachtet. Möglicherweise hingen diese Unterschiede erneut mit unerwarteten Aufgabeneffekten zusammen. Zusammenfassend zeigten Personen mit hoher Trait-Ängstlichkeit oder Angststörungen in den vorliegenden Studien keine stärkere habituelle Vermeidung als Personen mit niedriger Trait-Ängstlichkeit oder ohne Angststörungen. Die verstärkte Entstehung habitueller Vermeidung erschien daher nicht als relevanter Faktor in der Aufrechterhaltung maladaptiven Vermeidungsverhaltens bei Personen mit Angststörungen. Die Arbeit zeigt zudem deutlich den Einfluss von Aufgabendetails auf die experimentellen Ergebnisse in Ergebnis-Devaluations-Paradigmen auf. Die Diskussion dieser Ergebnisse könnte zur Erhöhung der Validität in zukünftigen Ergebnis-Devaluations-Studien beitragen. KW - Gewohnheit KW - Vermeidungsreaktion KW - Angststörung KW - Habits KW - Avoidance KW - Anxiety disorder Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360227 ER - TY - THES A1 - Nirchal, Naveen Kumar T1 - Mechanistische Regulierung des gastroösophagealen Übergangs und die Rolle der Retinsäure bei der Entwicklung des Barrett-Ösophagus T1 - Mechanistic regulation of gastroesophageal junction and role of retinoic acid in the development of Barrett's esophagus N2 - Der gastroösophageale Übergang (GEJ), der die Region abgrenzt, in der der distale Ösophagus auf die proximale Magenregion trifft, ist bekannt für die Entwicklung pathologischer Zustände, wie Metaplasie und Adenokarzinom des Ösophagus (EAC). Es ist wichtig, die Mechanismen der Entwicklungsstadien zu verstehen, die zu EAC führen, da die Inzidenzrate von EAC in den letzten 4 Jahrzehnten um das 7-fache gestiegen ist und die Gesamtüberlebensrate von 5 Jahren 18,4 % beträgt. In den meisten Fällenwird die Diagnose im fortgeschrittenen Stadium ohne vorherige Symptome erstellt. Der Hauptvorläufer für die Entwicklung von EAC ist eine prämaligne Vorstufe namens Barrett-Ösophagus (BE). BE ist der metaplastische Zustand, bei dem das mehrschichtige Plattenepithel des nativen Ösophagus durch ein spezialisiertes einschichtiges Säulenepithel ersetzt wird, das die molekularen Eigenschaften des Magen- sowie des Darmepithels aufweist. Zu den wichtigsten Risikofaktoren für die Entwicklung von BE gehören die chronische gastroösophageale Refluxkrankheit (GERD), eine veränderte Mikrobiota und veränderte Retinsäure-Signalwege (RA). Es ist unklar, welche Zelle der Ursprung für BE ist, da es keine eindeutigen Beweisen für den Prozess der BE-Initiation gibt. In dieser Arbeit habe ich untersucht, wie die GEJ-Homöostase in gesundem Gewebe durch stammzellregulatorische Morphogene aufrechterhalten wird, welche Rolle der Vitamin-A (RA-Signalübertragung) spieltund wie ihre Veränderung zur BE-Entwicklung beiträgt. Im ersten Teil meiner Dissertation habe ich anhand von Einzelmolekül-RNA in situ-Hybridisierung und Immunhistochemie eindeutig das Vorhandensein von zwei Arten von Epithelzellen nachweisen können, dem Plattenepithel in der Speiseröhre und dem Säulenepithel imMagenbereich des GEJ. Mittels Abstammungsanalysen im Mausmodell konnte ich zeigen, dass die Epithelzellen des Ösophagus und des Magens von zwei verschiedenen epithelialen Stammzelllinien imGEJ abstammen. Die Grenze zwischen Plattenepithel und Säulenepithelzellen im SCJ des GEJ wirddurch gegensätzliche Wnt-Mikroumgebungen streng reguliert. Plattenepithelstammzellen des Ösophagus werden durch das Wnt-hemmende Mikroumgebungssignal aufrechterhalten, während Magensäulenepithelzellen durch das Wnt-aktivierende Signal aus dem Stromakompartiment erhalten werden. Ich habe die in vivo Erhaltung der Epithelstammzellen des GEJ mit Hilfe eines in vitro Epithel-3D-Organoidkulturmodells rekonstruiert. Das Wachstum und die Vermehrung von Magensäulenepithel-Organoiden hängen von Wnt-Wachstumsfaktoren ab, während das Wachstum von Plattenepithel-Organoiden von Wnt-defizienten Kulturbedingungen abhängt. Darüber hinaus zeigte die Einzelzell-RNA-Sequenzanalyse (scRNA-seq) der aus Organoiden gewonnenenEpithelzellen, dass der nicht-kanonische Wnt/ planar cell polarity (PCP) Signalweg an der Regulierung der Plattenepithelzellen beteiligt ist. Im Gegensatz dazu werden säulenförmige Magenepithelzellen durch den kanonischen Wnt/beta-Catenin- und den nicht-kanonischen Wnt/Ca2+-Weg reguliert. Meine Daten zeigen, dass die SCJ-Epithelzellen, die am GEJ verschmelzen, durch entgegengesetzte stromale Wnt-Faktoren und unterschiedliche Wnt-Weg-Signalee in den Epithelzellen reguliert werden. Im zweiten Teil der Dissertation untersuchte ich die Rolle der bioaktiven Vitamin A Verbindung RA auf Ösophagus- und Magenepithelstammzellen. Die In-vitro-Behandlung von epithelialen Organoiden der Speiseröhre und des Magens mitRA oder seinem pharmakologischen Inhibitors BMS 493 zeigte, dass jeder Zelltyp unterschiedlich reguliert wurde. Ich beobachtete, dass eine verstärkte RA die Differenzierung von Stammzellen und den Verlust der Schichtung förderte, während die RA-Hemmung zu einer verstärkten Stammzellbildung und Regeneration im mehrschichtigen Epithel der Speiseröhre führte. Im Gegensatz zur Speiseröhre ist der RA-Signalweg in Magen-Organoiden aktiv, und die Hemmung von RA hat ein reduziertes Wachstum von Magen-Organoiden. Globale transkriptomische Daten und scRNA-seq-Daten zeigten, dass derRA-Signalweg einen Ruhephänotyp in den Ösophaguszellen induziert. Dagegen führt das Fehlen von RA in Magenepithelzellen zur Expression von Genen, die mit BE assoziiert sind. Daher isteine räumlich definierte Regulation der Wnt- und Retinsäure-Signalgebung amGEJ entscheidend für eine gesunde Homöostase, und ihre Störung führt zur Entwicklung von Krankheiten. N2 - Gastroesophageal junction (GEJ), demarcating the region where the distal esophagus meets with the proximal stomach region, is known for developing pathological conditions, including metaplasia and esophageal adenocarcinoma (EAC). It is essential to understand the mechanisms of developmental stages which lead to EAC since the incidence rate of EAC increased over 7-fold during the past four decades, and the overall five years survival rate is 18.4%. In most cases, patients are diagnosed in the advanced stage without prior symptoms. The main precursor for the development of EAC is a pre-malignant condition called Barrett's esophagus (BE). BE is the metaplastic condition where the multilayered squamous epithelium of the native esophagus is replaced by specialized single-layered columnar epithelium, which shows the molecular characteristics of the gastric as well as intestinal epithelium. The main risk factors for BE development include chronic gastro-esophageal acid reflux disease (GERD), altered microbiota, and altered retinoic acid signaling (RA). The cell of origin of BE is under debate due to a lack of clear evidence demonstrating the process of BE initiation. Here, I investigated how GEJ homeostasis is maintained in healthy tissue by stem cell regulatory morphogens, the role of vitamin A (RA signaling), and how its alteration contributes to BE development. In the first part of my thesis, I showed the presence of two types of epithelial cells, the squamous type in the esophagus and the columnar type in the stomach region in the GEJ, using single-molecule RNA in situ hybridization (smRNA-ISH) and immunohistochemistry. Employing lineage tracing in the mouse model, I have demonstrated that the esophageal epithelial and stomach epithelial cells derived from two distinct epithelial stem cell lineages in the GEJ. The border between squamous and columnar epithelial cells in the Squamo-columnar junction (SCJ) of GEJ is regulated by opposing Wnt microenvironments. The regeneration of stomach columnar epithelial stem cells is maintained by Wnt activating signal from the stromal compartment while squamous epithelial stem cells of the esophagus are maintained by the Wnt inhibitory signals. I recapitulated the in vivo GEJ epithelial stem cell maintenance by using in vitro epithelial 3D organoid culture model. The growth and propagation of stomach columnar epithelial organoids depend on Wnt growth factors, while squamous epithelial organoids' development needs Wnt-deficient culture conditions. Further, single-cell RNA sequence (scRNA-seq) analysis of organoid-derived epithelial cells revealed the non-canonical Wnt/ planar cell polarity (PCP) pathway involvement in regulating the squamous epithelial cells. In contrast, columnar stomach epithelial cells are regulated by the canonical Wnt/ beta-catenin and non-canonical Wnt/Ca2+ pathways. My data indicate that the SCJ epithelial cells that merge at the GEJ are regulated by opposing stromal Wnt factors and distinct Wnt pathway signaling in the epithelial cells. In the second part of the thesis, I investigated the role of Vitamin A-derived bioactive compound RA on esophageal and stomach epithelial stem cells. In vitro treatment of esophageal and stomach, epithelial organoids with RA or its pharmacological inhibitor BMS 493 revealed that each cell type was regulated distinctly. I observed that enhanced RA promoted esophageal stem cell differentiation and loss of stratification, while RA inhibition led to enhanced stemness and regeneration of the esophagus stratified epithelium. As opposed to the esophagus, RA signaling is active in the stomach organoids, and inhibition of RA reduces the growth of stomach organoids. Global transcriptomic data and scRNA-seq data revealed that RA signaling induces dormancy phenotype in the esophageal cells. In contrast, the absence of RA in stomach epithelial cells induces the expression of genes associated with BE. Thus, spatially defined regulation of Wnt and RA signaling at GEJ is critical for healthy homeostasis, and its perturbation leads to disease development. KW - Retinoesäure KW - Esophageal adenocarcinoma KW - Intestinal metaplasia KW - Epithelial lineage KW - Organoid KW - Retinoic acid KW - Gastroesophageal reflux KW - Endobrachyösophagus KW - Esophageal disease Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-311556 ER - TY - THES A1 - Scheiner, Christin T1 - Vulnerability in adolescence: prevalence, pandemic impact and prevention T1 - Vulnerabilität im Jugendalter: Prävalenzen, Einfluss der Pandemie und Prävention N2 - This compilation focuses on adolescent mental disorders and their prevention. It comprises three distinct studies, each contributing to a deeper understanding of this critical topic. This work addresses a critical gap in the understanding of, and approach to, adolescent mental health, and as a result reveals a critically important and urgently needed policy implication for action. The thematic structure of these studies begins with an examination of the epidemiology of child and adolescent mental disorders. Baseline data were collected from N = 877 adolescents with a mean age of 12.43 years (SD = 0.65). Mental health problems, such as depressive symptoms, non-suicidal self-injury, suicidal ideation, symptoms of eating disorders, and gender differences, are thoroughly examined. Results revealed a significant portion of our sample displaying mental health problems as early as the 6th and 7th grades, with girls generally being more affected than boys. The findings underscore the importance of early adolescence in the emergence of mental health problems and thereby emphasize the need for preventive measures. Moving beyond prevalence estimates, the compilation delves into the etiology of these disorders, exploring their potential correlation with a COVID-19 infection. Understanding the early signs and risk factors is crucial for timely support. While numerous studies have investigated potential risk and protective factors during the pandemic, our focus shifts to adolescents’ coping when an infection with the virus was involved (N = 2,154, M = 12.31, SD = 0.67). We hypothesized that students infected or with close family members infected, would exhibit an increased psychopathology and a decreased functioning of protective factors such as self-efficacy or self-esteem. We found no connection between infection and the mental health status within our sample, but protective factors and mental well-being were positively associated. Thus, universal primary prevention appears to be the preferred approach for promoting mental health. Lastly, the compilation introduces LessStress, a noteworthy contribution to more evidence-based prevention programs. This universal approach is designed to reduce stress in schools, accompanied by a cluster-randomized trial to evaluate its effectiveness (estimated sample size N = 1,894). Existing studies have demonstrated the effectiveness of stress prevention, leading us to introduce a short and easy-to-implement prevention program. There is positive evidence for one-lesson interventions in schools for promoting well-being and health behaviors among adolescents. LessStress is designed based on a life skills approach that not only imparts psychoeducational content but also teaches skills relevant to everyday life and directly applicable. Throughout these studies, a common thread emerges: the pressing need to address mental disorders during childhood and adolescence. These formative years play a pivotal role in the development of mental health problems. These formative years play a crucial role in the development of mental health problems. They highlight the importance of epidemiological data collection and analysis based on the latest models to develop prevention interventions that are not only effective but also reach young people on a global level. N2 - Diese Zusammenstellung konzentriert sich auf psychische Störungen bei Jugendlichen und deren Prävention. Sie umfasst drei verschiedene Studien, die jeweils zu einem tieferen Verständnis dieses wichtigen Themas beitragen. Es wird eine kritische Lücke im Verständnis und Umgang mit der psychischen Gesundheit Jugendlicher adressiert und damit ein wichtiger und dringender politischer Handlungsbedarf aufgezeigt. Die thematische Struktur dieser Studien beginnt mit einer Untersuchung der Epidemiologie psychischer Störungen bei Kindern und Jugendlichen. Es wurden Ausgangsdaten von N = 877 Jugendlichen mit einem Durchschnittsalter von 12,43 Jahren (SD = 0,65) erhoben. Psychische Gesundheitsprobleme wie depressive Symptome, nicht-suizidale Selbstverletzungen, Suizidgedanken, Symptome von Essstörungen und geschlechtsspezifische Unterschiede werden eingehend untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass ein erheblicher Teil der Stichprobe bereits in der 6. und 7. Klasse psychische Probleme aufweist, wobei Mädchen stärker betroffen sind als Jungen. Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung des frühen Jugendalters für die Entstehung psychischer Probleme und verdeutlichen damit die Notwendigkeit von Präventionsmaßnahmen. Die Zusammenstellung geht über Prävalenzschätzungen hinaus und befasst sich mit der Ätiologie dieser Störungen und untersucht ihren möglichen Zusammenhang mit einer COVID-19-Infektion. Während zahlreiche Studien potenzielle Risiko- und Schutzfaktoren während der Pandemie untersucht haben, konzentriert sich unsere Studie auf die Bewältigung von Jugendlichen im Zusammenhang mit einer Infektion mit dem Virus (N = 2.154, M = 12.31, SD = 0,67). Wir stellten die Hypothese auf, dass eine Infektion mit einer erhöhten Psychopathologie und einer verminderten Funktion von Schutzfaktoren einhergeht. Wir fanden keinen Zusammenhang zwischen der Infektion und dem psychischen Gesundheitszustand in unserer Stichprobe, aber Schutzfaktoren und psychisches Wohlbefinden waren positiv assoziiert. Somit scheint die universelle Primärprävention der bevorzugte Ansatz zur Förderung der psychischen Gesundheit zu sein. Schließlich wird in der Zusammenstellung mit LessStress ein entscheidender Beitrag zu evidenzbasierten Präventionsprogrammen vorgestellt. Dieses universelle Konzept zur Stress-reduzierung in Schulen wird von einer cluster-randomisierten Studie zur Bewertung seiner Wirksamkeit begleitet (geschätzte Stichprobengröße N = 1.894). LessStress wurde auf der Grundlage eines Life-Skills-Ansatzes entwickelt, der nicht nur psychoedukative Inhalte vermittelt, sondern auch alltagsrelevante und direkt anwendbare Fähigkeiten lehrt. Aus den drei vorgestellten Studien geht ein roter Faden hervor: die dringende Notwendigkeit, psychische Störungen im Kindes- und Jugendalter anzugehen. Diese prägenden Jahre spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Problemen der psychischen Gesundheit. Sie machen deutlich, wie wichtig die Sammlung epidemiologischer Daten und deren Analyse auf der Grundlage neuester Modelle für die Entwicklung von Präventionsmaßnahmen ist, die nicht nur wirksam sind, sondern auch junge Menschen auf globaler Ebene erreichen. KW - Jugend KW - Psychische Belastung KW - Resilienz KW - Stress KW - mental health KW - epidemiology KW - depression KW - etiology KW - Depression KW - Psychische Gesundheit KW - Epidemiologie KW - Ätiologie KW - COVID-19 KW - Primärprevention Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-351644 ER - TY - THES A1 - Knorr, Susanne T1 - Pathophysiology of early-onset isolated dystonia in a DYT-TOR1A rat model with trauma-induced dystonia-like movements T1 - Pathophysiologie der früh beginnenden, isolierten Dystonie in einem DYT-TOR1A Rattenmodell mit Trauma-induzierten Dystonie-ähnlichen Bewegungen N2 - Early-onset torsion dystonia (DYT-TOR1A, DYT1) is an inherited hyperkinetic movement disorder caused by a mutation of the TOR1A gene encoding the torsinA protein. DYT-TOR1A is characterized as a network disorder of the central nervous system (CNS), including predominantly the cortico-basal ganglia-thalamo-cortical loop resulting in a severe generalized dystonic phenotype. The pathophysiology of DYTTOR1A is not fully understood. Molecular levels up to large-scale network levels of the CNS are suggested to be affected in the pathophysiology of DYT-TOR1A. The reduced penetrance of 30% - 40% indicates a gene-environmental interaction, hypothesized as “second hit”. The lack of appropriate and phenotypic DYT-TOR1A animal models encouraged us to verify the “second hit” hypothesis through a unilateral peripheral nerve trauma of the sciatic nerve in a transgenic asymptomatic DYT-TOR1A rat model (∆ETorA), overexpressing the human mutated torsinA protein. In a multiscale approach, this animal model was characterized phenotypically and pathophysiologically. Nerve-injured ∆ETorA rats revealed dystonia-like movements (DLM) with a partially generalized phenotype. A physiomarker of human dystonia, describing increased theta oscillation in the globus pallidus internus (GPi), was found in the entopeduncular nucleus (EP), the rodent equivalent to the human GPi, of nerve-injured ∆ETorA rats. Altered oscillation patterns were also observed in the primary motor cortex. Highfrequency stimulation (HFS) of the EP reduced DLM and modulated altered oscillatory activity in the EP and primary motor cortex in nerve-injured ∆ETorA rats. Moreover, the dopaminergic system in ∆ETorA rats demonstrated a significant increased striatal dopamine release and dopamine turnover. Whole transcriptome analysis revealed differentially expressed genes of the circadian clock and the energy metabolism, thereby pointing towards novel, putative pathways in the pathophysiology of DYTTOR1A dystonia. In summary, peripheral nerve trauma can trigger DLM in genetically predisposed asymptomatic ΔETorA rats leading to neurobiological alteration in the central motor network on multiple levels and thereby supporting the “second hit” hypothesis. This novel symptomatic DYT-TOR1A rat model, based on a DYT-TOR1A genetic background, may prove as a valuable chance for DYT-TOR1A dystonia, to further investigate the pathomechanism in more detail and to establish new treatment strategies. N2 - Früh beginnende Torsionsdystonie (DYT-TOR1A, DYT1) ist eine genetisch bedingte hyperkinetische Bewegungsstörung, die aufgrund einer Mutation im TOR1A Gen verursacht wird, welches für das TorsinA-Protein codiert. DYT-TOR1A wird als zentrale Netzwerkstörung bezeichnet und betrifft hauptsächlich die kortiko-striatothalamo-kortikale Funktionsschleife, welches schließlich zu einem schweren generalisierten dystonen Phänotyp führt. Die Pathophysiologie von DYT-TOR1A ist nicht vollständig verstanden, man geht jedoch davon aus, dass Ebenen im Zentralnervensystem von molekularer Basis bis hin zu ganzen Netzwerken betroffen sind. Die reduzierte Penetranz von nur 30% bis 40% deutet auf eine Gen-UmweltInteraktion hin, im Sinne einer „2-Treffer-Hypothese“. Auch das Fehlen eines adäquaten DYT-TOR1A Tiermodelles hat uns dazu veranlasst, die „2-TrefferHypothese“ zu verifizieren, indem eine unilaterale periphere Quetschläsion des Nervus ischiadicus in einem transgenen, asymptomatischen DYT-TOR1A Rattenmodell (∆ETorA) durchgeführt wurde, welches das humane mutierte TorsinA-Protein überexprimiert. Das Tiermodell wurde phänotypisch und pathophysiologisch auf verschiedenen Analysenebenen charakterisiert. ∆ETorA Ratten mit Quetschläsion entwickelten Dystonie-ähnliche Bewegungen (DLM) mit teilweise generalisiertem Phänotyp. Erhöhte Theta-Oszillationen im Globus pallidus internus (GPi) sind bezeichnend für die humane Dystonie, welche auch im Nucleus entopeduncularis (EP), dem Äquivalent zum humanen GPi, von ∆ETorA Ratten mit Quetschläsion nachgewiesen wurden. Veränderte oszillatorische Muster wurden auch im primären Motorkortex gefunden. Hochfrequenz-Stimulation (HFS) des EP konnte das klinische Erscheinungsbild verbessern und hatte zudem auch einen modulatorischen Effekt auf die veränderte oszillatorische Aktivität des EP und des primären Motorcortex von ∆ETorA Ratten mit Quetschläsion. Auch das veränderte dopaminerge System erwies sich als ein pathologisches Merkmal in ∆ETorA Ratten. Es fand sich eine erhöhte striatale Ausschüttung von Dopamin und ein erhöhter Dopaminumsatz. In der Transkriptomanalyse kamen die zirkadiane Uhr und der Energiemetabolismus als weitere potentielle Signalwege in der Pathophysiologie der DYT-TOR1A Dystonie zum Vorschein. Zusammengefasst konnten DLM in genetisch prädisponierten, asymptomatischen ΔETorA Ratten mittels peripheren Nerventraumas ausgelöst werden, welches zu neurobiologischen Veränderungen in verschiedenen Ebenen des zentralen motorischen Netzwerk führte. Somit konnte die „2-Treffer-Hypothese“ bestätigt werden. Dieses neue symptomatische DYT-TOR1A Rattenmodell, fundiert auf der genetischen Grundlage von DYT-TOR1A, kann sich als wertvolle Möglichkeit für die DYT-TOR1A Dystonie erweisen, um Pathomechanismen genauer zu untersuchen und neue Behandlungsstrategien zu entwickeln. KW - Dystonie KW - Trauma KW - Ratte KW - Zentralnervensystem KW - DYT-TOR1A KW - early-onset isolated dystonia KW - gene-environmental interaction KW - peripheral nerve trauma KW - striatum KW - dopamine KW - deep brain stimulation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206096 ER - TY - THES A1 - Peña Mosca, María Josefina T1 - Local regulation of T-cell immunity in the intestinal mucosa T1 - Lokale Regulation der T-Zell-Immunität in der Darmschleimhaut N2 - After priming in Peyer's patches (PPs) and mesenteric lymph nodes (mLN) T- cells infiltrate the intestine through lymphatic draining and homing through the bloodstream. However, we found that in mouse models of acute graft-versus-host disease (GvHD), a subset of alloreactive T-cells directly migrates from PPs to the adjacent intestinal lamina propria (LP), bypassing the normal lymphatic drainage and vascular trafficking routes. Notably, this direct migration occurred in irradiated and unirradiated GvHD models, indicating that irradiation is not a prerequisite for this observed behavior. Next, we established a method termed serial intravascular staining (SIVS) in mouse models to systematically investigate the trafficking and migration of donor T- cells in the early stages of acute GvHD initiation. We found that the direct migration of T-cells from PPs to LP resulted in faster recruitment of cells after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). These directly migrating T-cells were found to be in an activated and proliferative state, exhibiting a TH1/TH17-like phenotype and producing cytokines such as IFN-γ and TNF-α. Furthermore, we observed that the directly migrating alloreactive T-cells expressed specific integrins (α4+, αE+) and chemokine receptors (CxCR3+, CCR5+, and CCR9+). Surprisingly, blocking these integrins and chemokine-coupled receptors did not hinder the direct migration of T- cells from PPs to LP, suggesting the involvement of alternative mechanisms. Previous experiments ruled out the involvement of S1PR1 and topographical features of macrophages, leading us to hypothesize that mediators of cytoskeleton reorganization, such as Coro1a, Dock2, or Cdc42, may play a role in this unique migration process. Additionally, we observed that directly migrating T-cells created a local inflammatory microenvironment, which attracts circulating T-cells. Histological analysis confirmed that alloreactive PPs-derived T-cells and bloodborne T-cells colocalized. We employed two experimental approaches, including either photoconversion of T-cells in PPs or direct transfer of activated T-cells into the vasculature, to demonstrate this colocalization. We hypothesize that cytokines released by migrating T-cells, such as IFN-γ and TNF-α, may play a role in recruiting T-cells from the vasculature, as inhibiting chemokine-coupled receptors did not impair recruitment. N2 - Nach der Priming-Phase in den Peyer-Plaques (PPs) und mesenterialen Lymphknoten (mLN) migrieren T-Zellen über die lymphatische Drainage und den Blutkreislauf die Darmschleimhaut. Allerdings haben wir festgestellt, dass in Mausmodellen der akuten Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD) eine Untergruppe alloreaktiver T-Zellen direkt von den Peyer-Plaques in das benachbarte intestinale Lamina propria (LP) migriert, ohne lymphatische Drainage- oder vaskuläre Transportwege zu nutzen. Bemerkenswert ist, dass diese direkte Migration sowohl in bestrahlten als auch in nicht bestrahlten GvHD-Modellen auftrat, was darauf hindeutet, dass Gewebeschaden durch ionisierende Strahlung keine Voraussetzung für dieses beobachtete T-Zell-Migrationsverhalten ist. Anschließend haben wir die Methode der "serielle intravaskulären Zellmarkierung" (SIVS) für Mausmodelle etabliert, um systematisch das Migrationsverhalten von alloreaktiven Spender-T-Zellen in den frühen Stadien der akuten GvHD-Initiierung zu untersuchen. Wir beobachteten, dass die direkte Migration von T-Zellen von PPs zu LP zu einer schnelleren Rekrutierung von Zellen nach allogener hämatopoetischer Zelltransplantation (allo-HCT) führte. Diese direkt migrierenden T-Zellen befanden sich in einem aktivierten und proliferativen Zustand, wiesen einen TH1-/TH17- ähnlichen Phänotyp auf und produzierten Zytokine wie IFN- γ und TNF-α. Darüber hinaus beobachteten wir, dass die direkt migrierenden alloreaktiven T-Zellen spezifische Integrine (α4+, αE+) und Chemokinrezeptoren (CxCR3+, CCR5+ und CCR9+) exprimierten. Überraschenderweise verhinderte die Blockierung dieser Integrine und Chemokinrezeptoren nicht die direkte Migration von T-Zellen aus PPs in LP, was auf die Beteiligung alternativer T- Zellmigrationsmechanismen schließen lässt. Vorangegangene Experimente schlossen die Beteiligung von S1PR1 und topografischer Merkmale gewebeständiger Makrophagen aus, was uns zu der Hypothese führte, dass Mediatoren der Zytoskelett- Reorganisation wie Coro1a, Dock2 oder Cdc42 eine Rolle in diesem einzigartigen Migrationsprozess spielen könnten. Zusätzlich beobachteten wir, dass direkt migrierende T-Zellen in der Darmschleimhaut ein lokales entzündliches Mikromilieu schaffen, welches zirkulierende T-Zellen anzieht. Die histologische Analyse bestätigte die Kolokalisation von direkt aus PP stammenden T-Zellen und T Zellen, welche über die Blutbahn in die Darmmukosa einwanderten. Um die direkte T-Zellmigration eindeutig zu bestätigen, wählten wir zwei experimentelle Ansätze: Die Photokonversion von T-Zellen in PPs während der Priming-Phase sowie den direkten Transfer aktivierter T-Zellen in das Gefäßsystem, um eine T-Zellkolokalisierung nachzuweisen. Aufbauend auf den Ergebnissen vermuten wir, dass Zytokine, die von migrierenden T-Zellen freigesetzt werden, wie zum Beispiel IFN-γ und TNF-α, möglicherweise eine Rolle bei der Rekrutierung von T-Zellen aus dem Gefäßsystem spielen, da die Hemmung von G- Protein-gekoppelter Rezeptoren (und somit aller Chemokinrezeptoren) die T-Zell- Rekrutierung nicht beeinträchtigte. KW - T-Lymphozyt KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Zellmigration KW - Darm KW - Peyer's patch KW - Graft versus Host disease KW - T-cell KW - Cell migration KW - Small intestine KW - Bone marrow transplantation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-352665 ER - TY - THES A1 - Neagoe, Raluca Alexandra Iulia T1 - Development of techniques for studying the platelet glycoprotein receptors GPVI and GPIb localisation and signalling T1 - Entwicklung von Methoden zur Untersuchung zur der Lokalisation und Signaltransduktion der Thrombozytenrezeptoren GPVI und GPIb N2 - Platelets play an important role in haemostasis by mediating blood clotting at sites of blood vessel damage. Platelets, also participate in pathological conditions including thrombosis and inflammation. Upon vessel damage, two glycoprotein receptors, the GPIb-IX-V complex and GPVI, play important roles in platelet capture and activation. GPIb-IX-V binds to von Willebrand factor and GPVI to collagen. This initiates a signalling cascade resulting in platelet shape change and spreading, which is dependent on the actin cytoskeleton. This thesis aimed to develop and implement different super-resolution microscopy techniques to gain a deeper understanding of the conformation and location of these receptors in the platelet plasma membrane, and to provide insights into their signalling pathways. We suggest direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) and structured illumination microscopy (SIM) as the best candidates for imaging single platelets, whereas expansion microscopy (ExM) is ideal for imaging platelets aggregates. Furthermore, we highlighted the role of the actin cytoskeleton, through Rac in GPVI signalling pathway. Inhibition of Rac, with EHT1864 in human platelets induced GPVI and GPV, but not GPIbα shedding. Furthermore, EHT1864 treatment did not change GPVI dimerisation or clustering, however, it decreased phospholipase Cγ2 phosphorylation levels, in human, but not murine platelets, highlighting interspecies differences. In summary, this PhD thesis demonstrates that; 1) Rac alters GPVI signalling pathway in human but not mouse platelets; 2) our newly developed ExM protocol can be used to image platelet aggregates labelled with F(ab’) fragments N2 - Thrombozyten, spielen in der Hämostase eine entscheidende Rolle, indem sie die Blutstillung bei Gefäßverletzung vermitteln. Sie sind jedoch auch an pathologischen Prozessen wie zum Beispiel der Thrombose und Entzündungen beteiligt. Bei einer Gefäßverletzung spielen zwei Glykoproteinrezeptoren eine wichtige Rolle bei der Adhäsion und Aktivierung von Thrombozyten: der GPIb-IX-V-Komplex und GPVI. GPIb-IX-V bindet an den von-Willebrand-Faktor und GPVI an Kollagen. Dies initiiert eine Signalkaskade, die zu einer Änderung der Morphologie der Thrombozyten führt, welche vom Aktin-Zytoskelett abhängig ist. Ziel dieser Doktorarbeit war die Entwicklung und Anwendung verschiedener hochauflösender Mikroskopietechniken, um ein tieferes Verständnis der Konformation und Lokalisation dieser Rezeptoren in der Plasmamembran der Thrombozyten zu erlangen und Einblicke in ihre Signalwege zu gewinnen. Hierbei etablierten wir dSTORM und die structured illumination microscopy (SIM) als die geeignetsten Methoden für die mikroskopische Untersuchung einzelner Thrombozyten, während die Expansionsmikroskopie (ExM) ideal für die Darstellung von Thrombozytenaggregaten ist. Darüber heben unsere Ergebnisse zur Funktion von Rac im GPVI Signalweg die wichtige Rolle des Aktin-Zytoskeletts hervor. Die Hemmung von Rac mit EHT1864 in menschlichen Thrombozyten induzierte das Abscheiden (shedding) von GPVI und GPV, nicht jedoch von GPIbα. Darüber hinaus blieb die GPVI Dimerisierung und GPVI-Clusterbildung durch EHT1864-Behandlung unverändert, jedoch verringerte sich die Phosphorylierung der Phospholipase Cγ2 in humanen, aber nicht in murinen Thrombozyten, was Unterschiede zwischen den Spezies aufzeigt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, dass; 1) Rac den GPVI Signalweg in humanen aber nicht in murinen Thrombozyten beeinflusst; 2) unser neu entwickeltes ExM-Protokoll zur Darstellung von F(ab’)-Fragment markierten Thrombozytenaggregaten verwendet werden kann. KW - Platelet-Membranglykoprotein p62 KW - Platelets KW - Microscopy KW - GPVI KW - Rac1 Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313064 ER - TY - THES A1 - Weisert, Nadine T1 - Characterization of telomere-associated proteins in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Charakterisierung Telomer-assoziierter Proteine in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The unicellular pathogen Trypanosoma brucei is the causative agent of African trypanosomiasis, an endemic disease prevalent in sub-Saharan Africa. Trypanosoma brucei alternates between a mammalian host and the tsetse fly vector. The extracellular parasite survives in the mammalian bloodstream by periodically exchanging their ˈvariant surface glycoproteinˈ (VSG) coat to evade the host immune response. This antigenic variation is achieved through monoallelic expression of one VSG variant from subtelomeric ˈbloodstream form expression sitesˈ (BES) at a given timepoint. During the differentiation from the bloodstream form (BSF) to the procyclic form (PCF) in the tsetse fly midgut, the stage specific surface protein is transcriptionally silenced and replaced by procyclins. Due to their subtelomeric localization on the chromosomes, VSG transcription and silencing is partly regulated by homologues of the mammalian telomere complex such as TbTRF, TbTIF2 and TbRAP1 as well as by ˈtelomere-associated proteinsˈ (TelAPs) like TelAP1. To gain more insights into transcription regulation of VSG genes, the identification and characterization of other TelAPs is critical and has not yet been achieved. In a previous study, two biochemical approaches were used to identify other novel TelAPs. By using ˈco-immunoprecipitationˈ (co-IP) to enrich possible interaction partners of TbTRF and by affinity chromatography using telomeric repeat oligonucleotides, a listing of TelAP candidates has been conducted. With this approach TelAP1 was identified as a novel component of the telomere complex, involved in the kinetics of transcriptional BES silencing during BSF to PCF differentiation. To gain further insights into the telomere complex composition, other previously enriched proteins were characterized through a screening process using RNA interference to deplete potential candidates. VSG expression profile changes and overall proteomic changes after depletion were analyzed by mass spectrometry. With this method, one can gain insights into the functions of the proteins and their involvement in VSG expression site regulation. To validate the interaction of proteins enriched by co-IP with TbTRF and TelAP1 and to identify novel interaction proteins, I performed reciprocal affinity purifications of the four most promising candidates (TelAP2, TelAP3, PPL2 and PolIE) and additionally confirmed colocalization of two candidates with TbTRF via immunofluorescence (TelAP2, TelAP3). TelAP3 colocalizes with TbTRF and potentially interacts with TbTRF, TbTIF2, TelAP1 and TelAP2, as well as with two translesion polymerases PPL2 and PolIE in BSF. PPL2 and PolIE seem to be in close contact to each other at the telomeric ends and fulfill different roles as only PolIE is involved in VSG regulation while PPL2 is not. TelAP2 was previously characterized to be associated with telomeres by partially colocalizing with TbTRF and cells show a VSG derepression phenotype when the protein was depleted. Here I show that TelAP2 interacts with the telomere-binding proteins TbTRF and TbTIF2 as well as with the telomere-associated protein TelAP1 in BSF and that TelAP2 depletion results in a loss of TelAP1 colocalization with TbTRF in BSF. In conclusion, this study demonstrates that characterizing potential TelAPs is effective in gaining insights into the telomeric complex's composition and its role in VSG regulation in Trypanosoma brucei. Understanding these interactions could potentially lead to new therapeutic targets for combatting African trypanosomiasis. N2 - Der einzellige Pathogen Trypanosoma brucei ist der Erreger der afrikanischen Trypanosomiasis, eine endemische Krankheit vertreten in der Sub-Sahara Zone Afrikas. Trypanosoma brucei wechselt zwischen einem Säugerwirt und dem Insektenvektor, der Tsetse-Fliege. Der im Blutstrom des Säugers vorkommende, extrazelluläre Parasit ändert seinen Oberflächenmantel bestehend aus dem ˈvariablen Oberflächenproteinˈ (VSG) in periodischen Abständen, um der Immunantwort des Wirtes auszuweichen. Diese antigenetische Variation wird durch die monoallelische Expression einer einzelnen VSG-Variante, lokalisiert auf den ˈBlutstromform Expressionsseitenˈ (BES), zu einem bestimmten Zeitpunkt erreicht. Diese stadienspezifischen Oberflächenproteine werden während der Differenzierung der ˈBlutstromformˈ (BSF) zur ˈprozyklischen Formˈ (PCF) im Mitteldarm der Tsetse-Fliege stillgelegt und durch Prozykline ersetzt. Wegen der subtelomeren Lokalisation wird die VSG Transkription und Stilllegung teilweise durch Homologe des Säuger Telomerkomplexes TbTRF, TbTIF2 und TbRAP1 als auch durch Telomer-assoziierte Proteine (TelAPs) wie TelAP1 reguliert. Um Einblicke in die Transkriptionsregulation der VSG Gene zu erhalten, ist die Identifikation und Charakterisierung anderer Telomer-assoziierter Proteine von großem Interesse. In einer vorherigen Studie wurden zwei komplementäre biochemische Versuchsansätze verwendet, um weitere neue TelAPs zu identifizieren. Es wurde eine ko-Immunpräzipitation (co-IP) durchgeführt, um mögliche Interaktionspartner von TbTRF zu identifizieren, sowie eine Affinitätschromatographie unter Verwendung telomerischen Wiederholungseinheiten. Hierdurch wurde eine Liste von potenziellen Kandidaten generiert. Mit diesem Ansatz wurde TelAP1 als neue Komponente des Telomerkomplexes identifiziert, welches an der Kinetik der transkriptionellen BES-Stilllegung während der Differenzierung von BSF zu PCF beteiligt ist. Um weitere Einblicke in die Zusammensetzung des Telomerkomplexes zu erhalten, wurden zuvor angereicherte Proteine durch einen Screening-Prozess unter Verwendung von RNA-Interferenz charakterisiert. Nach der Depletion von 21 Proteinen wurden massenspektrometrische Analysen der VSG Expressionsprofiländerungen sowie allgemeine Veränderungen des Proteomenprofils analysiert. Mit dieser Methode können Erkenntnisse über die Funktion der jeweiligen Proteine und ihrer Beteiligung an der Regulierung der antigenetischen Variation von T. brucei gewonnen werden. Um die Interaktionen von Proteinen zu validieren, welche bei den Co-Immunpräzipitationen mit TbTRF und TelAP1 angereichert wurden, habe ich eine reziproke Affinitätschromatographie mit vier der vielversprechendsten Kandidaten durchgeführt (TelAP2, TelAP3, PPL2 und PolIE). Zusätzlich bestätigte ich die Co-lokalisation von zwei Kandidaten mit TbTRF via Immunfluoreszenzaufnahmen (TelAP2, TelAP3). TelAP3 ko-lokalisiert mit TbTRF und TelAP1 und interagiert potenziell mit TbTRF, TbTIF2, TelAP1 und TelAP2 als auch mit den zwei Transläsionspolymerasen PPL2 und PolIE in BSF. PPL2 und PolIE stehen in engem Kontakt zueinander und nehmen an den Telomerenden unterschiedliche Funktionen ein, da nur PolIE an der VSG Regulation beteiligt ist. TelAP2 wurde in einer vorherigen Publikation als Telomer-assoziiertes Protein durch partielle Co-Lokalisation mit TbTRF identifiziert und Zellen zeigen nach der Depletion von TelAP2 eine Derepression von zuvor stillgelegten VSGs. In dieser Studie zeige ich, dass TelAP2 mit den Telomer-bindenden Proteinen TbTRF und TbTIF2 sowie mit dem telomerassoziierten Protein TelAP1 in BSF interagiert und dass die Depletion von TelAP2 zu dem Verlust der Co-Lokalisation von TelAP1 mit TbTRF in BSF führt. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass die Charakterisierung potenzieller TelAPs dazu beiträgt, Einblicke in die Zusammensetzung des Telomerkomplexes und dessen Rolle bei der VSG-Regulation in Trypanosoma brucei zu gewinnen. Das Verständnis dieser Interaktionen könnte möglicherweise zu neuen therapeutischen Ansatzpunkten zur Bekämpfung der afrikanischen Trypanosomiasis führen. KW - Telomer KW - Trypanosoma brucei KW - telomere-associated protein Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-352732 ER - TY - THES A1 - Choi, Jihyoung T1 - Development of an Add-On Electrode for Non-Invasive Monitoring in Bioreactor Cultures and Medical Devices T1 - Entwicklung einer Zusatzelektrode für das nicht-invasive Monitoring von Bioreaktorkulturen und Medizinprodukten N2 - Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) is a valuable technique analyzing electrochemical behavior of biological systems such as electrical characterization of cells and biomolecules, drug screening, and biomaterials in biomedical field. In EIS, an alternating current (AC) power signal is applied to the biological system, and the impedance of the system is measured over a range of frequencies. In vitro culture models of endothelial or epithelial barrier tissue can be achieved by culturing barrier tissue on scaffolds made with synthetic or biological materials that provide separate compartments (apical and basal sides), allowing for further studies on drug transport. EIS is a great candidate for non-invasive and real-time monitoring of the electrical properties that correlate with barrier integrity during the tissue modeling. Although commercially available transendothelial/transepithelial electrical resistance (TEER) measurement devices are widely used, their use is particularly common in static transwell culture. EIS is considered more suitable than TEER measurement devices in bioreactor cultures that involve dynamic fluid flow to obtain accurate and reliable measurements. Furthermore, while TEER measurement devices can only assess resistance at a single frequency, EIS measurements can capture both resistance and capacitance properties of cells, providing additional information about the cellular barrier's characteristics across various frequencies. Incorporating EIS into a bioreactor system requires the careful optimization of electrode integration within the bioreactor setup and measurement parameters to ensure accurate EIS measurements. Since bioreactors vary in size and design depending on the purpose of the study, most studies have reported using an electrode system specifically designed for a particular bioreactor. The aim of this work was to produce multi-applicable electrodes and established methods for automated non-invasive and real-time monitoring using the EIS technique in bioreactor cultures. Key to the electrode material, titanium nitride (TiN) coating was fabricated on different substrates (materials and shape) using physical vapor deposition (PVD) and housed in a polydimethylsiloxane (PDMS) structure to allow the electrodes to function as independent units. Various electrode designs were evaluated for double-layer capacitance and morphology using EIS and scanning electron microscopy (SEM), respectively. The TiN-coated tube electrode was identified as the optimal choice. Furthermore, EIS measurements were performed to examine the impact of influential parameters related to culture conditions on the TiN-coated electrode system. In order to demonstrate the versatility of the electrodes, these electrodes were then integrated into in different types of perfusion bioreactors for monitoring barrier cells. Blood-brain barrier (BBB) cells were cultured in the newly developed dynamic flow bioreactor, while human umblical vascular endothelial cells (HUVECs) and Caco-2 cells were cultured in the miniature hollow fiber bioreactor (HFBR). As a result, the TiN-coated tube electrode system enabled investigation of BBB barrier integrity in long-term bioreactor culture. While EIS measurement could not detect HUVECs electrical properties in miniature HFBR culture, there was the possibility of measuring the barrier integrity of Caco-2 cells, indicating potential usefulness for evaluating their barrier function. Following the bioreactor cultures, the application of the TiN-coated tube electrode was expanded to hemofiltration, based on the hypothesis that the EIS system may be used to monitor clotting or clogging phenomena in hemofiltration. The findings suggest that the EIS monitoring system can track changes in ion concentration of blood before and after hemofiltration in real-time, which may serve as an indicator of clogging of filter membranes. Overall, our research demonstrates the potential of TiN-coated tube electrodes for sensitive and versatile non-invasive monitoring in bioreactor cultures and medical devices. N2 - Die elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) ist eine nützliche Methode, um das elektrochemische Verhalten von biologischen Systemen zu analysieren, wie z.B. die elektrische Charakterisierung von Zellen und Biomolekülen, Drug Screening und Biomaterialien im biomedizinischen Bereich. Für die EIS wird ein Wechselstrom an das biologische System angeschlossen und die Impedanz des Systems über einen Frequenzbereich gemessen. In vitro-Modelle von Gewebekulturen epithelialer Barrieren können mithilfe künstlicher oder biologischer Materialien, die über unterschiedliche Kompartimente (apikale und basolaterale Seite) verfügen, hergestellt werden und ermöglichen weitere Untersuchungen zum Transport von Arzneistoffen. Die EIS bietet dabei eine hervorragende Methode für das nicht-invasive Echtzeit-Monitoring der elektrischen Eigenschaften, die mit der Barriere-Integrität während der Gewebeentwicklung korreliert. Obwohl kommerziell erhältliche Geräte zur Messung des transendothelialen/transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) umfangreich verwendet werden, ist ihre Verwendung besonders bei statischen Transwell-Kulturen verbreitet. Durch die EIS kann im Gegensatz zur TEER-Messung für Bioreaktor-Kulturen, die einen dynamischen Medienfluss aufweisen, genauere und verlässliche Messungen erhalten werden. Zudem können EIS-Messungen anders als die TEER-Messung, die nur den Widerstand einer einzelnen Frequenz misst, gleichzeitig den elektrischen Widerstand und die Kapazität von Zellen erfassen und damit zusätzliche Informationen über die zellulären Barriereeigenschaften über verschiedene Frequenzen hinweg liefern. Der EIS-Einbau in ein Bioreaktor-System bedarf einer sorgfältigen Optimierung der Elektrodenintegration in das Bioreaktor-Setup und der Messparameter, um akkurate EIS-Messungen durchführen zu können. Da Bioreaktoren abhängig vom Untersuchungszweck in ihrer Größe und ihrem Design variieren, verwenden die meisten Studien speziell entwickelte Elektrodensysteme für einzelne Bioreaktoren. Das Ziel dieser Arbeit war die Herstellung von vielseitig anwendbaren Elektroden und etablierten Methoden für das automatisierte nicht-invasive Echtzeit-Monitoring von Bioreaktor-Kulturen mithilfe der EIS. Entscheidend für das Elektrodenmaterial war die Titannitrid (TiN)-Beschichtung, die auf verschiedenen Substraten (Materialien und Formen) durch Physical Vapor Deposition (PVD) hergestellt und in einer Polydimethylsiloxan (PDMS)-Struktur untergebracht wurde, damit die Elektroden unabhängig voneinander arbeiten können. Verschiedene Elektrodendesigns wurden auf Doppelschicht-Kapazität mithilfe der EIS bzw. auf die Morphologie mit Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Die TiN-beschichteten Elektroden in Röhrenform erwiesen sich als optimal. Weiterhin wurden EIS-Messungen durchgeführt, um die Auswirkung von beeinflussenden Parametern auf die Kulturbedingungen durch das TiN-beschichtete Elektrodensystem zu untersuchen. Um die Vielseitigkeit der Elektroden aufzuzeigen, wurden diese anschließend zum Monitoring von Barriere-bildenden Zellen in unterschiedliche Perfusionsbioreaktoren integriert. Zellen der Blut-Hirn-Schranke (BHS) wurden im neu entwickelten dynamischen Flussreaktor kultiviert, wohingegen humane umbilikale vaskuläre Endothelzellen (HUVEC) und Caco-2-Zellen in Hohlfaserbioreaktoren (HFBR) in Miniaturform kultiviert wurden. Das TiN-beschichtete Röhrenelektrodensystem ermöglichte die Untersuchung der BHS-Barrieren-Integrität in einer Langzeit-Bioreaktorkultur. Während die EIS-Messung in der Miniaturform-HFBR-Kultur keine elektrischen Eigenschaften der HUVECs detektieren konnte, war es möglich, eine Barriere-Integrität der Caco-2-Zellen zu messen, die den potentiellen Nutzen für die Evaluierung deren Barrierefunktion aufzeigt. Nach den Bioreaktorkulturen wurde die Anwendung der TiN-beschichteten Röhrenelektrode auf die Hämofiltration erweitert, auf Grundlage der Hypothese, dass das EIS-System ein Gerinnen oder Verstopfen während der Hämofiltration überwachen könnte. Die Ergebnisse zeigen, dass das EIS-Monitoring-System Veränderungen in der Ionenkonzentration des Blutes vor und nach Hämofiltration in Echtzeit verfolgen kann, welches eventuell als Messgröße für ein Verstopfen der Filtermembranen genutzt werden kann. Insgesamt weisen TiN-beschichtete Röhrenelektroden unseren Forschungen zufolge ein großes Potential für ein empfindliches und vielfältiges nicht-invasives Monitoring von Bioreaktorkulturen und Medizingeräte auf. KW - Monitoring KW - Tissue Engineering KW - Electrode KW - Perfusion Bioreactor KW - Hemofiltration KW - Medizinprodukt KW - Electrochemical Impedance Spectroscopy Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-358232 ER - TY - THES A1 - Kutschka, Ilona T1 - Activation of the integrated stress response induces remodeling of cardiac metabolism in Barth Syndrome T1 - Aktivierung der "Integrated Stress Response" führt zur Umstellung des kardialen Metabolismus im Barth Syndrom N2 - Barth Syndrome (BTHS) is an inherited X-chromosomal linked disorder, characterized by early development of cardiomyopathy, immune system defects, skeletal muscle myopathy and growth retardation. The disease displays a wide variety of symptoms including heart failure, exercise intolerance and fatigue due to the muscle weakness. The cause of the disease are mutations in the gene encoding for the mitochondrial transacylase Tafazzin (TAZ), which is important for remodeling of the phospholipid cardiolipin (CL). All mutations result in a pronounced decrease of the functional enzyme leading to an increase of monolysocardiolipin (MLCL), the precursor of mature CL, and a decrease in mature CL itself. CL is a hallmark phospholipid of mitochondrial membranes, highly enriched in the inner mitochondrial membrane (IMM). It is not only important for the formation of the cristae structures, but also for the function of different protein complexes associated with the mitochondrial membrane. Reduced levels of mature CL cause remodeling of the respiratory chain supercomplexes, impaired respiration, defects in the Krebs cycle and a loss of mitochondrial calcium uniporter (MCU) protein. The defective Ca2+ handling causes impaired redox homeostasis and energy metabolism resulting in cellular arrhythmias and defective electrical conduction. In an uncompensated situation, blunting mitochondrial Ca2+ uptake provokes increased mitochondrial emission of H2O2 during workload transitions, related to oxidation of NADPH, which is required to regenerate anti-oxidative enzymes. However, in the hearts and cardiac myocytes of mice with a global knock-down of the Taz gene (Taz-KD), no increase in mitochondrial ROS was observed, suggesting that other metabolic pathways may have compensated for reduced Krebs cycle activation. The healthy heart produces most of its energy by consuming fatty acids. In this study, the fatty acid uptake into mitochondria and their further degradation was investigated, which showed a switch of the metabolism in general in the Taz-KD mouse model. In vivo studies revealed an increase of glucose uptake into the heart and decreased fatty acid uptake and oxidation. Disturbed energy conversion resulted in activation of retrograde signaling pathways, implicating overall changes in the cell metabolism. Upregulated integrated stress response (ISR) was confirmed by increased levels of the downstream target, i.e., the activating transcription factor 4 (ATF4). A Tafazzin knockout mouse embryonal fibroblast cell model (TazKO) was used to inhibit the ISR using siRNA transfection or pharmaceutical inhibition. This verified the central role of II the ISR in regulating the metabolism in BTHS. Moreover, an increased metabolic flux into glutathione biosynthesis was observed, which supports redox homeostasis. In vivo PET-CT scans depicted elevated activity of the xCT system in the BTHS mouse heart, which transports essential amino acids for the biosynthesis of glutathione precursors. Furthermore, the stress induced signaling pathway also affected the glutamate metabolism, which fuels into the Krebs cycle via -ketoglutarate and therefore supports energy converting pathways. In summary, this thesis provides novel insights into the energy metabolism and redox homeostasis in Barth syndrome cardiomyopathy and its regulation by the integrated stress response, which plays a central role in the metabolic alterations. The aim of the thesis was to improve the understanding of these metabolic changes and to identify novel targets, which can provide new possibilities for therapeutic intervention in Barth syndrome. N2 - Barth Syndrome (BTHS) ist eine X-chromosomal vererbbare Erkrankung, welche sich in der frühen Entstehung von Kardiomyopathie, Störungen des Immunsystems, Skelettmuskelschwäche und Wachstumsverzögerungen manifestiert. Das Krankheitsbild ist sehr variabel mit milden Symptomen bis hin zu sehr schwerwiegenden Fällen, bei denen die schnelle Verschlechterung der Kardiomyopathie bereits in jungen Jahren eine Herztransplantation erfordern kann. Betroffenen Patienten zeigen eine deutliche Intoleranz gegenüber körperlicher Anstrengung, welche mit schneller Müdigkeit einhergeht. Die Krankheit wird durch verschiedene Mutationen auf dem Gen für die mitochondriale Transacylase Tafazzin (TAZ) ausgelöst. Die Mutationen führen zu einem Funktionsverlust des Enzyms, welches in der Biosynthese des Phospholipids Cardiolipin (CL) eine entscheidende Rolle spielt. Die Vorstufe des Lipids, das sogenannte Monolysocardiolipin (MLCL), reichert sich dadurch an, wohingegen die Menge an reifem CL entscheidend verringert ist. CL ist ein bedeutendes Phospholipid in den Mitochondrien, wo es vor allem in der inneren Mitochondrien Membran vorkommt. CL ist einerseits wichtig für die Ausbildung der Cristae Strukturen der inneren Mitochondrien Membran. Darüber hinaus ist es notwendig für die Struktur und Funktion verschiedenster Proteinkomplexe in der Membran, welche dadurch erst ihre volle Funktionsfähigkeit erhalten. Es wurde bereits gezeigt, dass der Verlust von reifem CL in BTHS zu einer Dissoziation der Superkomplexe der Atmungskette führt, welche dadurch in ihrer Funktion beeinträchtigt ist. Zusätzlich sind Störungen im Krebs Zyklus und der Kalziumaufnahme durch den mitochondriellen Kalzium (Ca2+) -Uniporter (MCU) Komplex bekannt. Die beeinträchtigte mitochondriale Ca2+ Aufnahme beeinflusst sowohl die Redox Homöostase als auch den Energie Metabolismus, was zu Arrhythmien und einer Störung der elektrischen Weiterleitung im Herzen führt. Im gesunden Herzen gewinnen die Herzmuskelzellen den Hauptanteil ihrer Energie aus dem Abbau von Fettsäuren. In dieser Studie wurde durch die Untersuchung des Fettsäurestoffwechsels im Taz knockdown Mausmodell (Taz-KD) gezeigt, dass eine deutliche Reduktion in Proteinen vorliegt, welche für die Aufnahme und die Verstoffwechselung der Fettsäuren in den Mitochondrien verantwortlich sind. Diese Veränderungen führten in vivo zu einer verringerten Aufnahme und Verstoffwechselung von Fettsäuren und einer Erhöhten Aufnahme von Glucose. Dysfunktionale Mitochondrien aktivieren retrograde Signalwege, welche eine generelle IV Umstellung des Metabolismus zur Folge haben. Eine erhöhte Menge des Transkriptionsfaktors ATF4, welcher sowohl Fettsäure- als auch Aminosäuremetabolismus beeinflusst, zeigte die Aktivierung der sogenannten „Integrated stress response“ (ISR). Ein Zellmodel embryonaler Fibroblasten aus der Maus mit einem Taz knockout (TazKO) wurde verwendet um die ISR durch siRNA Transfektion oder einem pharmakologischen Inhibitor zu blockieren. Dadurch konnte die zentrale Rolle der ISR in der Umstellung des Metabolismus bestätigt werden. Zusätzlich konnte eine erhöhte metabolische Aktivität in Richtung der Glutathion Biosynthese beobachtet werden, welche für die Redox Homöostase in den Mitochondrien von Bedeutung ist. In vivo PET-CT Untersuchungen zeigten eine erhöhte Aktivität des xCT Systems im Herzen des BTHS Mausmodells auf. Dies dient der Aufnahme von Aminosäuren, welche für die Glutathion Biosynthese benötigt werden. Hinzu kommt, dass die Aktivierung des Stresssignalweges den Glutamat Stoffwechsel in der Zelle beeinflusste. Über -Ketoglutarat trägt Glutamat so vermehrt zur Energiegewinnung bei. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, die metabolischen Veränderungen in BTHS zu untersuchen, um die veränderten Vorgänge besser zu verstehen und so neue mögliche Angriffspunkte für Therapiemöglichkeiten zu identifizieren. KW - Herzmuskelkrankheit KW - Mitochondrium KW - Stoffwechsel KW - Barth Syndrome Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-358186 ER - TY - THES A1 - Kühnemundt, Johanna T1 - Defined microphysiologic 3D tumour models with aspects from the tumour microenvironment for the evaluation of cellular immunotherapies T1 - Definierte mikrophysiologische 3D-Tumormodelle mit Aspekten aus der Tumormikroumgebung zur Evaluierung von zellulären Immuntherapien N2 - Adoptive cellular immunotherapy with chimeric antigen receptor (CAR) T cells is highly effective in haematological malignancies. This success, however, has not been achieved in solid tumours so far. In contrast to hematologic malignancies, solid tumours include a hostile tumour microenvironment (TME), that poses additional challenges for curative effects and consistent therapeutic outcome. These challenges manifest in physical and immunological barriers that dampen efficacy of the CAR T cells. Preclinical testing of novel cellular immunotherapies is performed mainly in 2D cell culture and animal experiments. While 2D cell culture is an easy technique for efficacy analysis, animal studies reveal information about toxicity in vivo. However, 2D cell culture cannot fully reflect the complexity observed in vivo, because cells are cultured without anchorage to a matrix and only short-term periods are feasible. Animal studies provide a more complex tissue environment, but xenografts often lack human stroma and tumour inoculation occurs mostly ectopically. This emphasises the need for standardisable and scalable tumour models with incorporated TME-aspects, which enable preclinical testing with enhanced predictive value for the clinical outcome of immunotherapies. Therefore, microphysiologic 3D tumour models based on the biological SISmuc (Small Intestinal mucosa and Submucosa) matrix with preserved basement membrane were engaged and improved in this work to serve as a modular and versatile tumour model for efficacy testing of CAR T cells. In order to reflect a variety of cancer entities, TME-aspects, long-term stability and to enhance the read-out options they were further adapted to achieve scalable and standardisable defined microphysiologic 3D tumour models. In this work, novel culture modalities (semi-static, sandwich-culture) were characterised and established that led to an increased and organised tissue generation and long-term stability. Application of the SISmuc matrix was extended to sarcoma and melanoma models and serial bioluminescence intensity (BLI)-based in vivo imaging analysis was established in the microphysiologic 3D tumour models, which represents a time-efficient read-out method for quality evaluation of the models and treatment efficacy analysis, that is independent of the cell phenotype. Isolation of cancer-associated-fibroblasts (CAFs) from lung (tumour) tissue was demonstrated and CAF-implementation further led to stromal-enriched microphysiologic 3D tumour models with in vivo-comparable tissue-like architecture. Presence of CAFs was confirmed by CAF-associated markers (FAP, α-SMA, MMP-2/-9) and cytokines correlated with CAF phenotype, angiogenesis, invasion and immunomodulation. Additionally, an endothelial cell barrier was implemented for static and dynamic culture in a novel bioreactor set-up, which is of particular interest for the analysis of immune cell diapedesis. Studies in microphysiologic 3D Ewing’s sarcoma models indicated that sarcoma cells could be sensitised for GD2-targeting CAR T cells. After enhancing the scale of assessment of the microphysiologic 3D tumour models and improving them for CAR T cell testing, the tumour models were used to analyse their sensitivity towards differently designed receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1) CAR T cells and to study the effects of the incorporated TME-aspects on the CAR T cell treatment respectively. ROR1 has been described as a suitable target for several malignancies including triple negative breast cancer (TNBC), as well as lung cancer. Therefore, microphysiologic 3D TNBC and lung cancer models were established. Analysis of ROR1 CAR T cells that differed in costimulation, spacer length and targeting domain, revealed, that the microphysiologic 3D tumour models are highly sensitive and can distinguish optimal from sub-optimal CAR design. Here, higher affinity of the targeting domain induced stronger anti-tumour efficacy and anti-tumour function depended on spacer length, respectively. Long-term treatment for 14 days with ROR1 CAR T cells was demonstrated in dynamic microphysiologic 3D lung tumour models, which did not result in complete tumour cell removal, whereas direct injection of CAR T cells into TNBC and lung tumour models represented an alternative route of application in addition to administration via the medium flow, as it induced strong anti-tumour response. Influence of the incorporated TME-aspects on ROR1 CAR T cell therapy represented by CAF-incorporation and/or TGF-β supplementation was analysed. Presence of TGF-β revealed that the specific TGF-β receptor inhibitor SD-208 improves ROR1 CAR T cell function, because it effectively abrogated immunosuppressive effects of TGF-β in TNBC models. Implementation of CAFs should provide a physical and immunological barrier towards ROR1 CAR T cells, which, however, was not confirmed, as ROR1 CAR T cell function was retained in the presence of CAFs in stromal-enriched microphysiologic 3D lung tumour models. The absence of an effect of CAF enrichment on CAR T cell efficacy suggests a missing component for the development of an immunosuppressive TME, even though immunomodulatory cytokines were detected in co-culture models. Finally, improved gene-edited ROR1 CAR T cells lacking exhaustion-associated genes (PD-1, TGF-β-receptor or both) were challenged by the combination of CAF-enrichment and TGF-β in microphysiologic 3D TNBC models. Results indicated that the absence of PD-1 and TGF-β receptor leads to improved CAR T cells, that induce strong tumour cell lysis, and are protected against the hostile TME. Collectively, the microphysiologic 3D tumour models presented in this work reflect aspects of the hostile TME of solid tumours, engage BLI-based analysis and provide long-term tissue homeostasis. Therefore, they present a defined, scalable, reproducible, standardisable and exportable model for translational research with enhanced predictive value for efficacy testing and candidate selection of cellular immunotherapy, as exemplified by ROR1 CAR T cells. N2 - Die adoptive Immuntherapie mit chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimierenden T-Zellen zeigt bei hämatologischen Krebsformen eine hohe Wirksamkeit. Bisher konnte dieser Erfolg für solide Tumore nicht erreicht werden. Im Gegensatz zu hämatologischen Krebsformen zeigen solide Tumore eine feindliche Tumormikroumgebung (TME), die zusätzliche Herausforderungen für die Erlangung kurativer Effekte und konsistenter Therapieergebnisse darstellen. Diese Herausforderungen äußern sich in physikalischen und immunologischen Barrieren, welche die Wirksamkeit der CAR-T-Zellen abschwächt. Zur präklinischen Testung neuartiger zellulärer Immuntherapien werden hauptsächlich 2D-Zellkulturen und Tierstudien durchgeführt. 2D-Zellkulturexperimente eignen sich vor allem für Wirksamkeitsanalysen, während Tierstudien Aufschluss über die Toxizität in-vivo geben können. Allerdings kann die 2D-Zellkultur die Komplexität der in-vivo Situation nicht vollständig widerspiegeln, da die Zellen ohne Verankerung an einer Matrix kultiviert werden und nur kurzfristige Zeiträume abgebildet werden können. Tierstudien bieten einen komplexeren Gewebekontext, wobei Xenografts aber oft das humane Stroma fehlt und die Tumorinokulation meist ektopisch erfolgt. Dies unterstreicht den Bedarf an standardisierbaren und skalierbaren Tumormodellen mit inkorporierten TME-Aspekten, die präklinische Testungen mit erhöhtem Vorhersagewert für den klinischen Erfolg von Immuntherapien ermöglichen. Daher wurden in dieser Arbeit mikrophysiologische 3D-Tumormodelle auf Basis der biologischen SISmuc (Small Intestinal mukosa und Submukosa)-Matrix mit erhaltener Basalmembran eingesetzt und verbessert, um als modulares und vielseitiges Tumormodell für die Wirksamkeitsprüfung von CAR T-Zellen zu dienen. Um eine Vielzahl von Krebsentitäten, TME-Aspekte und Langzeitstabilität abzubilden und um die Ausleseparamter zu verbessern, wurden die Tumormodelle weiter angepasst um skalierbare und standardisierbare definierte mikrophysiologische 3D Tumormodelle zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Kulturmodalitäten (semistatische Kultur, Sandwich-Kultur) charakterisiert und etabliert, die zu einer vermehrten und erhöhten Gewebebildung sowie Langzeitstabilität der Modelle führen. Die Anwendung der SISmuc-Matrix wurde auf Sarkom- und Melanom-Modelle erweitert und in den mikrophysiologischen 3D-Tumormodellen wurde ein serielles Biolumineszenz-Intensitäts (BLI)-basiertes In-vivo-Analyse-Verfahren etabliert, welches eine zeiteffiziente Methode für die Qualitätsbewertung der Modelle sowie die Analyse der Therapiewirksamkeit darstellt, welche unabhängig vom Zell-Phänotyp ist. Die Isolation von Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) aus Lungen-(Tumor) Gewebe wurde demonstriert und die CAF-Implementierung führte des Weiteren zu stromal-angereicherten mikrophysiologischen 3D-Tumormodellen mit in-vivo vergleichbarer gewebeähnlicher Architektur. CAFs wurden mit Hilfe von CAF-assoziierten Markern (FAP, α-SMA, MMP-2/-9) und einer Zytokinanalyse in den Modellen identifiziert. Diese bestätigte ebenfalls Zytokine, welche mit Angiogenese, Invasion und Immunmodulation assoziiert sind. Zusätzlich wurde eine Endothelzellbarriere sowohl in statischer als auch in der dynamischen Kultur implementiert, wofür ein neuer Bioreaktoraufbau verwendet wurde, welcher insbesondere für die Analyse der Immunzelldiapedesis interessant ist. Studien in mikrophysiologischen 3D-Ewing-Sarkom-Modellen zeigten, dass diese für GD2-spezifische CAR-T-Zellen sensibilisiert werden können. Nach der Erweiterung des Untersuchungsumfangs der mikrophysiologischen 3D-Tumormodelle und deren Verbesserung für die CAR-T-Zell-Testung wurden die Tumormodelle verwendet, um ihre Sensitivität gegenüber unterschiedlich designten Rezeptor-Tyrosinkinase-like Orphan-Rezeptor 1 (ROR1) -spezifischen CAR-T-Zellen zu analysieren. Des Weiteren wurden die Auswirkungen der eingebauten TME-Aspekte auf die CAR-T-Therapie untersucht. ROR1 wurde als geeignetes Ziel für verschiedene maligne Erkrankungen beschrieben, darunter auch triple-negtive-breast-cancer (TNBC) und Lungenkrebs. Daher wurden mikrophysiologische 3D-TNBC- und Lungenkrebs-Modelle für die Testungen aufgebaut. Die Analyse von ROR1-CAR-T-Zellen, die sich in Kostimulation, Spacerlänge und der Ziel-Domäne unterschieden, zeigte, dass die mikrophysiologischen 3D-Tumormodelle eine hohe Sensitivität zur Unterscheidung von suboptimal und optimal designten CARs aufweisen. Dabei induzierte eine Ziel-Domäne mit höherer Affinität eine stärkere Anti-Tumor-Wirkung. Zusätzlich war die Anti-Tumor-Funktion abhängig von der Spacerlänge. In dynamischen mikrophysiologischen 3D-Lungentumormodellen wurde eine Langzeitbehandlung über 14 Tage mit ROR1-CAR-T-Zellen realisiert, die jedoch nicht zu einer vollständigen Entfernung der Tumorzellen führte. Die direkte Injektion von CAR-T-Zellen in TNBC- und Lungentumormodellen induzierte eine starke Anti-Tumorantwort und stellt somit neben der Zugabe über den Medienstrom einen alternativen Applikationsweg dar. Des Weiteren wurde der Einfluss der inkorporierten TME-Aspekte auf die ROR1 CAR T-Zelltherapie untersucht, welche sich durch CAF-Inkorporation und/oder TGF-β-Supplementierung darstellten. Die Zugabe von TGF-β zeigte, dass der spezifische TGF-β-Rezeptor-Inhibitor SD-208 die Funktion der ROR1 CAR T-Zellen verbesserte, da er die immunsuppressiven Effekte von TGF-β in TNBC-Modellen effektiv aufhob. Die Implementierung von CAFs sollte eine physikalische und immunologische Barriere gegenüber ROR1 CAR T-Zellen darstellen, was sich jedoch nicht bestätigte, da die Funktion der ROR1 CAR T-Zellen in Anwesenheit von CAFs in stromal-angereicherten mikrophysiologischen 3D-Lungentumormodellen erhalten blieb. Das Fehlen eines Effekts der CAF-Anreicherung auf die CAR T-Zell-Effektivität deutet auf eine fehlende Komponente für die Entwicklung eines immunsuppressiven TME hin, obwohl immunmodulatorische Zytokine in Co-Kultur-Modellen nachgewiesen wurden. Schließlich wurden verbesserte gen-editierte ROR1-CAR-T-Zellen, denen erschöpfungsassoziierte Gene (PD-1, TGF-β-Rezeptor oder beide) fehlten, durch die Kombination von CAF-Anreicherung und TGF-β in mikrophysiologischen 3D-TNBC-Modellen herausgefordert. Die Ergebnisse zeigten, dass ROR1 CAR T Zellen ohne PD-1 und TGF-β-Rezeptor überlegen sind, eine starke Tumorzell-Lyse induzieren und vor der feindlichen TME geschützt sind. Zusammenfassend spiegeln die in dieser Arbeit vorgestellten mikrophysiologischen 3D-Tumormodelle Aspekte der feindlichen TME solider Tumore wider, ermöglichen BLI-basierte Analysen und bieten eine langfristige Gewebehomöostase. Daher stellen sie ein definiertes, skalierbares, reproduzierbares, standardisierbares und exportierbares Modell für die translationale Forschung mit erhöhtem Vorhersagewert dar. Sie können für die Wirksamkeitsprüfung sowie Kandidatenauswahl von zellulären Immuntherapie verwendet werden, was vor allem am Beispiel der ROR1 CAR T-Zellen gezeigt wurde. KW - CAR T cell KW - immunotherapy KW - 3D tumour model KW - solid tumour KW - tumour microenvironment KW - TNBC KW - lung cancer KW - tumour stroma KW - microphysiologic 3D tumour model KW - Immuntherapie KW - Lungenkrebs KW - Stroma KW - Tumormikroumgebung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-276674 ER - TY - THES A1 - Yu, Yanying T1 - Applied machine learning for the analysis of CRISPR-Cas systems T1 - Angewandtes maschinelles Lernen für die Analyse von CRISPR-Cas-Systemen N2 - Among the defense strategies developed in microbes over millions of years, the innate adaptive CRISPR-Cas immune systems have spread across most of bacteria and archaea. The flexibility, simplicity, and specificity of CRISPR-Cas systems have laid the foundation for CRISPR-based genetic tools. Yet, the efficient administration of CRISPR-based tools demands rational designs to maximize the on-target efficiency and off-target specificity. Specifically, the selection of guide RNAs (gRNAs), which play a crucial role in the target recognition of CRISPR-Cas systems, is non-trivial. Despite the fact that the emerging machine learning techniques provide a solution to aid in gRNA design with prediction algorithms, design rules for many CRISPR-Cas systems are ill-defined, hindering their broader applications. CRISPR interference (CRISPRi), an alternative gene silencing technique using a catalytically dead Cas protein to interfere with transcription, is a leading technique in bacteria for functional interrogation, pathway manipulation, and genome-wide screens. Although the application is promising, it also is hindered by under-investigated design rules. Therefore, in this work, I develop a state-of-art predictive machine learning model for guide silencing efficiency in bacteria leveraging the advantages of feature engineering, data integration, interpretable AI, and automated machine learning. I first systematically investigate the influential factors that attribute to the extent of depletion in multiple CRISPRi genome-wide essentiality screens in Escherichia coli and demonstrate the surprising dominant contribution of gene-specific effects, such as gene expression level. These observations allowed me to segregate the confounding gene-specific effects using a mixed-effect random forest (MERF) model to provide a better estimate of guide efficiency, together with the improvement led by integrating multiple screens. The MERF model outperformed existing tools in an independent high-throughput saturating screen. I next interpret the predictive model to extract the design rules for robust gene silencing, such as the preference for cytosine and disfavoring for guanine and thymine within and around the protospacer adjacent motif (PAM) sequence. I further incorporated the MERF model in a web-based tool that is freely accessible at www.ciao.helmholtz-hiri.de. When comparing the MERF model with existing tools, the performance of the alternative gRNA design tool optimized for CRISPRi in eukaryotes when applied to bacteria was far from satisfying, questioning the robustness of prediction algorithms across organisms. In addition, the CRISPR-Cas systems exhibit diverse mechanisms albeit with some similarities. The captured predictive patterns from one dataset thereby are at risk of poor generalization when applied across organisms and CRISPR-Cas techniques. To fill the gap, the machine learning approach I present here for CRISPRi could serve as a blueprint for the effective development of prediction algorithms for specific organisms or CRISPR-Cas systems of interest. The explicit workflow includes three principle steps: 1) accommodating the feature set for the CRISPR-Cas system or technique; 2) optimizing a machine learning model using automated machine learning; 3) explaining the model using interpretable AI. To illustrate the applicability of the workflow and diversity of results when applied across different bacteria and CRISPR-Cas systems, I have applied this workflow to analyze three distinct CRISPR-Cas genome-wide screens. From the CRISPR base editor essentiality screen in E. coli, I have determined the PAM preference and sequence context in the editing window for efficient editing, such as A at the 2nd position of PAM, A/TT/TG downstream of PAM, and TC at the 4th to 5th position of gRNAs. From the CRISPR-Cas13a screen in E. coli, in addition to the strong correlation with the guide depletion, the target expression level is the strongest predictor in the model, supporting it as a main determinant of the activation of Cas13-induced immunity and better characterizing the CRISPR-Cas13 system. From the CRISPR-Cas12a screen in Klebsiella pneumoniae, I have extracted the design rules for robust antimicrobial activity across K. pneumoniae strains and provided a predictive algorithm for gRNA design, facilitating CRISPR-Cas12a as an alternative technique to tackle antibiotic resistance. Overall, this thesis presents an accurate prediction algorithm for CRISPRi guide efficiency in bacteria, providing insights into the determinants of efficient silencing and guide designs. The systematic exploration has led to a robust machine learning approach for effective model development in other bacteria and CRISPR-Cas systems. Applying the approach in the analysis of independent CRISPR-Cas screens not only sheds light on the design rules but also the mechanisms of the CRISPR-Cas systems. Together, I demonstrate that applied machine learning paves the way to a deeper understanding and a broader application of CRISPR-Cas systems. N2 - Unter den Verteidigungsstrategien, welche sich über Millionen von Jahren in Mikroben entwickelt haben, hat sich das angeborene adaptive CRISPR-Cas Immunsystem in vielen Bakterien und den meisten Archaeen verbreitet. Flexibilität, Einfachheit und Spezifizität von CRISPR-Cas Systemen bilden die Grundlage für CRISPR-basierten genetischen Werkzeugen. Dennoch verlangt die effiziente Anwendung CRISPR-basierter genetischer Werkzeuge ein rationales Design, um die Effektivität zu maximieren und Spezifizität zu gewährleisten. Speziell die Auswahl an Leit-RNAs, oder auch „guide“ RNAs (gRNAs), welche eine essentielle Rolle in der Ziel-Erkennung des CRISPR-Cas Systems spielen, ist nicht trivial. Trotz aufkommender Techniken des maschinellen Lernens, die mit Hilfe von Vorhersage-Algorithmen eine Unterstützung im gRNA-Design darstellen, sind die Design-Regeln für viele CRISPR-Cas Systeme schlecht definiert und die breite Anwendung dadurch bisher gehindert. CRISPR Interferenz (CRISPRi), eine Methode der Genrepression, nutzt ein katalytisch inaktives Cas-Protein, um die Gen-Transkription zu verhindern und ist eine führende Technik für Gen-Funktionsstudien, der Manipulation von Stoffwechselwegen und genomweiter Screens in Bakterien. Auch wenn viele der Anwendungen vielversprechend sind, ist die Umsetzung aufgrund der wenig untersuchten Design-Regeln schwierig. Daher entwickele ich in dieser Arbeit ein hochmodernes auf maschinellem Lernen basierendes Modell für die Vorhersage der gRNA Genrepressions-Effizienz in Bakterien, wobei die Merkmalskonstruktion, Datenintegration, interpretierbare künstliche Intelligenz (KI) und automatisiertes maschinelles Lernen genutzt wurden. Zuerst untersuche ich systematisch die Einflussfaktoren, welche zum Ausmaß der Depletion in genomweiten CRISPRi-Screens zur Gen-Essentialität in Escherichia coli beitragen und demonstriere den überraschend dominanten Beitrag genspezifischer Effekte, wie z. B. dem Genexpressionslevel. Diese Beobachtungen erlaubten mir die genspezifischen Störvariablen mit einem sogenannten mixed-effect random forest (MERF) Modell zu segregieren, um eine bessere Einschätzung der gRNA Effizienz zu erreichen und durch die Integration zusätzlicher Screen-Daten noch weiter zu verbessern. Das MERF Modell übertraf dabei bereits existierende Werkzeuge in einem unabhängigen Hochdurchsatz Sättigungs-Screen. Als nächstes interpretiere ich die Modell Vorhersage, um Design-Regeln für eine solide Genrepression zu extrahieren, wie z. B. eine Präferenz für Cytosin und eine Abneigung gegenüber Guanin und Thymin innerhalb und der „protospacer adjacent motif“ (PAM) direkt umgebenden Sequenz. Weiterhin integrierte ich das MERF Modell in einem Web-basierten Werkzeug, welches unter www.ciao.helmholtz-hiri.de frei zugänglich ist. Ein Vergleich von existierenden Werkzeugen mit dem MERF Modell zeigt, dass alternative, für CRISPRi in Eukaryoten optimierte, gRNA Design-Werkzeuge schlecht abschneiden, sobald sie in Bakterien angewandt werden. Dies lässt Zweifel an einer robusten Übertragbarkeit dieser Vorhersage-Algorithmen zwischen verschiedenen Organismen. Zusätzlich haben CRISPR-Cas Systeme, trotz einiger genereller Gemeinsamkeiten, höchst diverse Wirkungsmechanismen. Die Vorhersagemuster eines Datensets sind daher schlecht generalisierbar, sobald sie auf andere Organismen oder CRISPR-Cas Techniken angewandt werden. Diese Lücke kann mit dem hier präsentierten Ansatz des maschinellen Lernens für CRISPRi geschlossen werden und als eine Vorlage für die Entwicklung effektiver Vorhersage-Algorithmen für spezifische Organismen oder CRISPR-Cas Systeme dienen. Der explizite Arbeitsablauf beinhaltet drei Hauptschritte: 1) Aufnehmen des Merkmalsets des jeweiligen CRISPR-Cas Systems bzw. der CRISPR-Cas Technik; 2) Optimierung des maschinellen Lernen Modells durch automatisiertes maschinelles Lernen; 3) Erklärung des Modells mit interpretierbarer KI. Um die Anwendbarkeit des Arbeitsablaufs und die Diversität der Ergebnisse, im Zusammenhang mit unterschiedlichen Organismen und CRISPR-Cas Systemen, zu demonstrieren, habe ich diese Arbeitsschritte zur Analyse drei unterschiedlicher genomweiter Screens angewandt. Von dem CRISPR „base editor“ Essentialitäts-Screen in E. coli, konnten die PAM Präferenzen und der Sequenzkontext innerhalb des Editierungsfensters für eine effiziente Editierung abgeleitet werden. Beispielsweise tragen ein A an der zweiten PAM Position, ein A/TT/TG an der PAM direkt nachgeschalten Position und ein TC an der vierten oder fünften gRNA Position zur effizienten Editierung bei. Im CRISPR-Cas13a Screen in E. coli, stellten wir eine starke Korrelation zwischen dem Genexpressionslevel und der gRNA-Depletion fest. Zusätzlich ist das Expressionslevel des Ziel-Gens der stärkste Vorhersagefaktor des Modells, was das Expressionslevel als Hauptdeterminante für die Cas13-induzierte Immunität hervorhebt und die bessere Charakterisierung von CRISPR-Cas13 Systemen ermöglicht. Aus dem CRISPR-Cas12a Screen in Klebsiella pneumoniae, habe ich gRNA Design Regeln für die robuste antimikrobielle Aktivität über unterschiedliche K. pneumoniae Stämme hinweg extrahiert und einen Vorhersage-Algorithmus für das gRNA Design bereitgestellt. Dies ermöglicht die Nutzung von Cas12a als eine alternative Lösung, um Antibiotikaresistenzen zu bekämpfen. Zusammengefasst präsentiert diese Thesis einen akkuraten Vorhersage-Algorithmus für die CRISPRi gRNA Effizienz in Bakterien und gibt Einblicke in die Determinanten für eine effiziente Genrepression und optimales gRNA Design. Die systematische Exploration führte zu einem robusten Ansatz des maschinellen Lernens für effektive Modell Entwicklungen in unterschiedlichen bakteriellen Spezies und CRISPR-Cas Systemen. Durch die Anwendung dieses Ansatzes auf unabhängige CRISPR-Cas Screens, konnte ich nicht nur wichtige Design Regeln ableiten, sondern auch die Mechanismen der jeweiligen CRISPR-Cas Systeme besser erleuchten. Zu guter Letzt demonstriere ich hier, dass angewandtes maschinelles Lernen den Weg zu einem tieferen Verständnis und einer breiteren Anwendung von CRISPR-Cas Systemen ebnen kann. KW - Maschinelles Lernen KW - CRISPR/Cas-Methode KW - Bakterien KW - machine learning KW - CRISPR-Cas KW - guide effiiciency Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320219 ER - TY - THES A1 - Ramirez, Yesid A. T1 - Structural basis of ubiquitin recognition and rational design of novel covalent inhibitors targeting Cdu1 from \(Chlamydia\) \(Trachomatis\) T1 - Strukturelle Grundlage der Ubiquitin-Erkennung und rationales Design neuer kovalenter Inhibitoren gegen die Deubiquitinylase Cdu1 aus \(Chlamydia\) \(Trachomatis\) N2 - The WHO-designated neglected-disease pathogen Chlamydia trachomatis (CT) is a gram-negative bacterium responsible for the most frequently diagnosed sexually transmitted infection worldwide. CT infections can lead to infertility, blindness and reactive arthritis, among others. CT acts as an infectious agent by its ability to evade the immune response of its host, which includes the impairment of the NF-κB mediated inflammatory response and the Mcl1 pro-apoptotic pathway through its deubiquitylating, deneddylating and transacetylating enzyme ChlaDUB1 (Cdu1). Expression of Cdu1 is also connected to host cell Golgi apparatus fragmentation, a key process in CT infections. Cdu1 may this be an attractive drug target for the treatment of CT infections. However, a lead molecule for the development of novel potent inhibitors has been unknown so far. Sequence alignments and phylogenetic searches allocate Cdu1 in the CE clan of cysteine proteases. The adenovirus protease (adenain) also belongs to this clan and shares a high degree of structural similarity with Cdu1. Taking advantage of topological similarities between the active sites of Cdu1 and adenain, a target-hopping approach on a focused set of adenain inhibitors, developed at Novartis, has been pursued. The thereby identified cyano-pyrimidines represent the first active-site directed covalent reversible inhibitors for Cdu1. High-resolution crystal structures of Cdu1 in complex with the covalently bound cyano-pyrimidines as well as with its substrate ubiquitin have been elucidated. The structural data of this thesis, combined with enzymatic assays and covalent docking studies, provide valuable insights into Cdu1s activity, substrate recognition, active site pocket flexibility and potential hotspots for ligand interaction. Structure-informed drug design permitted the optimization of this cyano-pyrimidine based scaffold towards HJR108, the first molecule of its kind specifically designed to disrupt the function of Cdu1. The structures of potentially more potent and selective Cdu1 inhibitors are herein proposed. This thesis provides important insights towards our understanding of the structural basis of ubiquitin recognition by Cdu1, and the basis to design highly specific Cdu1 covalent inhibitors. N2 - Der Krankheitserreger Chlamydia trachomatis (CT) - ein gramnegatives Bakterium - ist verantwortlich für die häufigste sexuell übertragene Infektionskrankheit weltweit, die CT basierte Chlamydiose. Sie wird von der Weltgesundheitsorganisation zu den vernachlässigten Krankheiten gezählt. CT Infektionen können unter anderem zu Unfruchtbarkeit, Erblindung und reaktiver Arthritis führen. CT agiert als Krankheitserreger mittels seiner Fähigkeit, die Immunantwort des Wirts zu umgehen. Dies umfasst unter anderem die Schwächung und Störung der NF-κB vermittelten Entzündungsantwort und des Mcl1 pro-Apoptoseweges über ihr deubiquitinierendes, deneddylierendes und trans-acetylierendes Enzym ChlaDub1 (Cdu1). Die Expression von Cdu1 ist aber auch mit der Fragmentierung des Golgi-Apparates des Wirtes verknüpft, ein Schlüsselprozess bei Infektionen mit CT. Cdu1 ist daher vermutlich ein attraktives Zielprotein für die Entwicklung von Wirkstoffen, um CT Infektionen zu behandeln. Eine Leitstrukturverbindung zur Entwicklung neuer wirksamer Inhibitoren war bislang jedoch noch nicht bekannt. Sequenzvergleiche und phylogenetische Untersuchungen verorten Cdu1 im CE Clan der Cysteinproteasen. Die Adenovirus-Protease (Adenain) gehört ebenfalls diesem Clan an und besitzt strukturelle Ähnlichkeit mit Cdu1. Unter Ausnutzung der topologischen Ähnlichkeiten der aktiven Zentren von Cdu1 und Adenain wurde ein Target-Hopping Ansatz mit einem klar definierten und fokussierten Satz von bei Novartis entwickelten Adenain-Inhibitoren verfolgt. Die hierbei identifizierten Cyano-Pyrimidine stellen die ersten kovalenten Inhibitoren von Cdu1 dar, die an das aktive Zentrum von Cdu1 binden und es direkt adressieren. Hochauflösend wurden Kristallstrukturen sowohl von Komplexen von Cdu1 mit kovalent gebundenen Cyano-Pyrimidinen als auch mit Cdu1’s natürlichem Substrat Ubiquitin bestimmt. Die Kristallstrukturdaten dieser Doktorarbeit in Kombination mit Enzymassays und kovalenten Docking-Studien liefern wertvolle Hinweise bezüglich der Aktivität des Enzyms, der molekularen Substraterkennung, der Flexibiliät der Proteintasche rund um das aktive Zentrum und potentielle Hotspots für die Wechselwirkung mit Liganden. Ein strukturbasiertes Wirkstoffdesign erlaubte die Optimierung des Cyano-Pyrimidin-basierten Molekülgerüstes, die zu der Entwicklung der HJR108 Verbindung führte. Es ist das erste Molekül seiner Art, das speziell dazu entworfen wurde Cdu1 zu inhibieren. Strukturen potentiell noch wirksamerer und selektiver Cdu1 Inhibitoren werden in dieser Arbeit vorgeschlagen. Diese Dissertationsschrift liefert somit wertvolle Beiträge zum Verständnis der strukturellen Grundlagen der molekularen Erkennung von Ubiquitin durch Cdu1 und Hinweise, die die Entwicklung hoch-spezifischer kovalenter Cdu1 Inhibitoren erlauben sollten. KW - CE Proteaes KW - covalent inhibition KW - drug repurposing KW - DUB KW - Ubiquitin KW - Inhibitor KW - Chlamydia trachomatis Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-191683 ER - TY - THES A1 - Hutterer, née Herzog, Katharina T1 - Treatment-like use of discrimination training to reduce generalization of conditioned fear T1 - Behandlungsähnlicher Einsatz eines Diskriminationstrainings zur Verringerung von Generalisierung konditionierter Furcht N2 - Anxiety patients overgeneralize fear, also because of an inability to perceptually discriminate threat and safety signals. Therefore, some studies have developed discrimination training that successfully reduced the occurrence of fear generalization. The present work is the first to take a treatment-like approach by using discrimination training after generalization has occurred. Therefore, two studies were conducted with healthy participants using the same fear conditioning and generalization paradigm, with two faces as conditioned stimuli (CSs), and four facial morphs between CSs as generalization stimuli (GSs). Only one face (CS+) was followed by a loud scream (unconditioned stimulus, US). In Study 1, participants underwent either fear-relevant (discriminating faces) or fear-irrelevant discrimination training (discriminating width of lines) or a non-discriminative control training between the two generalization tests, each with or without feedback (n = 20 each). Generalization of US expectancy was reduced more effectively by fear-relevant compared to fear-irrelevant discrimination training. However, neither discrimination training was more effective than non-discriminative control training. Moreover, feedback reduced generalization of US expectancy only in discrimination training. Study 2 was designed to replicate the effects of the discrimination-training conditions in a large sample (N = 244) and examine their benefits in individuals at risk for anxiety disorders. Again, feedback reduced fear generalization particularly well for US expectancy. Fear relevance was not confirmed to be particularly fear-reducing in healthy participants, but may enhance training effects in individuals at risk of anxiety disorder. In summary, this work provides evidence that existing fear generalization can be reduced by discrimination training, likely involving several (higher-level) processes besides perceptual discrimination (e.g., motivational mechanisms in feedback conditions). Its use may be promising as part of individualized therapy for patients with difficulty discriminating similar stimuli. N2 - Angstpatienten übergeneralisieren Furcht, unter anderem weil sie nicht in der Lage sind, Bedrohungs- und Sicherheitsreize zu unterscheiden. Daher wurde in einigen Studien ein Diskriminationstraining entwickelt, das das Auftreten von Furchtgeneralisierung erfolgreich reduzierte. Die vorliegende Arbeit ist die erste, die einen behandlungsähnlichen Ansatz verfolgt, indem sie Diskriminationstraining einsetzt, nachdem die Generalisierung stattgefunden hat. Zu diesem Zweck wurden zwei Studien mit gesunden Teilnehmern durchgeführt, die dasselbe Paradigma zur Furchtkonditionierung und -generalisierung verwendeten, mit zwei Gesichtern als konditionierte Stimuli (CSs) und vier Gesichtsmorphen zwischen den CS als Generalisierungsstimuli (GSs). Nur auf ein Gesicht (CS+) folgte ein lauter Schrei (unkonditionierter Stimulus, US). In Studie 1 durchliefen die Teilnehmer zwischen den beiden Generalisierungstests entweder ein furchtrelevantes (Unterscheidung von Gesichtern) oder ein furchtirrelevantes Diskriminationstraining (Unterscheidung der Breite von Linien) oder ein non-diskriminatives Kontrolltraining, jeweils mit oder ohne Feedback (jeweils n = 20). Die Generalisierung der US-Erwartung wurde durch furchtrelevante im Vergleich zu furchtirrelevanten Diskriminationstrainings effektiver reduziert. Keines der beiden Diskriminationstrainings war jedoch effektiver als ein non-diskriminatives Kontrolltraining. Darüber hinaus verringerte das Feedback die Generalisierung der US-Erwartung nur im Diskriminationstraining. Studie 2 sollte die Effekte der Diskriminationstrainingsbedingungen in einer großen Stichprobe (N = 244) replizieren und ihre Effekte bei Individuen mit einem Risiko für Angststörungen untersuchen. Auch hier reduzierte das Feedback die Furchtgeneralisierung besonders gut für die US-Erwartung. Die Furchtrelevanz erwies sich bei gesunden Teilnehmern nicht als besonders furchtreduzierend, könnte aber die Trainingseffekte bei Personen mit einem Risiko einer Angststörung verstärken. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit Hinweise dafür liefert, dass bestehende Furchtgeneralisierung durch ein Diskriminationstraining reduziert werden kann, wobei wahrscheinlich mehrere Prozesse (höherer Ordnung) neben der perzeptuellen Diskrimination beteiligt sind (z. B. motivationale Mechanismen in den Feedback Bedingungen). Die Anwendung des Diskriminationstrainings als Teil einer individualisierten Therapie für Patienten mit Schwierigkeiten bei der Unterscheidung ähnlicher Stimuli könnte vielversprechend sein. KW - Furcht KW - Generalisierung KW - Diskriminationslernen KW - classical conditioning KW - fear generalization KW - discrimination training KW - Diskriminationstraining KW - Klassische Konditionierung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317286 ER - TY - THES A1 - Kuklovsky [former Finke], Valerie T1 - Are some bees smarter than others? An examination of consistent individual differences in the cognitive abilities of honey bees T1 - Sind manche Bienen schlauer als andere? Eine Untersuchung von konsistenten individuellen Unterschieden in den kognitiven Fähigkeiten von Honigbienen N2 - Cognition refers to the ability to of animals to acquire, process, store and use vital information from the environment. Cognitive processes are necessary to predict the future and reduce the uncertainty of the ever-changing environment. Classically, research on animal cognition focuses on decisive cognitive tests to determine the capacity of a species by the testing the ability of a few individuals. This approach views variability between these tested key individuals as unwanted noise and is thus often neglected. However, inter-individual variability provides important insights to behavioral plasticity, cognitive specialization and brain modularity. Honey bees Apis mellifera are a robust and traditional model for the study of learning, memory and cognition due to their impressive capabilities and rich behavioral repertoire. In this thesis I have applied a novel view on the learning abilities of honey bees by looking explicitly at individual differences in a variety of learning tasks. Are some individual bees consistently smarter than some of her sisters? If so, will a smart individual always perform good independent of the time, the context and the cognitive requirements or do bees show distinct isolated ‘cognitive modules’? My thesis presents the first comprehensive investigation of consistent individual differences in the cognitive abilities of honey bees. To speak of an individual as behaving consistently, a crucial step is to test the individual multiple times to examine the repeatability of a behavior. I show that free-flying bees remain consistent in a visual discrimination task for three consecutive days. Successively, I explored individual consistency in cognitive proficiency across tasks involving different sensory modalities, contexts and cognitive requirements. I found that free-flying bees show a cognitive specialization between visual and olfactory learning but remained consistent across a simple discrimination task and a complex concept learning task. I wished to further explore individual consistency with respect to tasks of different cognitive complexity, a question that has never been tackled before in an insect. I thus performed a series of four experiments using either visual or olfactory stimuli and a different training context (free-flying and restrained) and tested bees in a discrimination task, reversal learning and negative patterning. Intriguingly, across all these experiments I evidenced the same results: The bees’ performances were consistent across the discrimination task and reversal learning and negative patterning respectively. No association was evidenced between reversal learning and negative patterning. After establishing the existence of consistent individual differences in the cognitive proficiency of honey bees I wished to determine factors which could underlie these differences. Since genetic components are known to underlie inter-individual variability in learning abilities, I studied the effects of genetics on consistency in cognitive proficiency by contrasting bees originating from either from a hive with a single patriline (low genetic diversity) or with multiple patrilines (high genetic diversity). These two groups of bees showed differences in the patterns of individually correlated performances, indicating a genetic component accounts for consistent cognitive individuality. Another major factor underlying variability in learning performances is the individual responsiveness to sucrose solution and to visual stimuli, as evidenced by many studies on restrained bees showing a positive correlation between responsiveness to task relevant stimuli and learning performances. I thus tested whether these relationships between sucrose/visual responsiveness and learning performances are applicable for free-flying bees. Free-flying bees were again subjected to reversal learning and negative patterning and subsequently tested in the laboratory for their responsiveness to sucrose and to light. There was no evidence of a positive relationship between sucrose/visual responsiveness and neither performances of free-flying bees in an elemental discrimination, reversal learning and negative patterning. These findings indicate that relationships established between responsiveness to task relevant stimuli and learning proficiency established in the laboratory with restrained bees might not hold true for a completely different behavioral context i.e. for free-flying bees in their natural environment. These results show that the honey bee is an excellent insect model to study consistency in cognitive proficiency and to identify the underlying factors. I mainly discuss the results with respect to the question of brain modularity in insects and the adaptive significance of individuality in cognitive abilities for honey bee colonies. I also provide a proposition of research questions which tie in this theme of consistent cognitive proficiency and could provide fruitful areas for future research. N2 - Unter Kognition versteht man die Fähigkeit von Tieren, essenzielle Informationen aus der Umwelt zu erfassen, zu verarbeiten, zu speichern und zu nutzen. Kognitive Prozesse sind notwendig, um die Zukunft vorherzusagen und die Unvorhersehbarkeit der sich ständig verändernden Umwelt zu verringern. Die Forschung der Kognition von Tieren konzentriert sich klassischerweise auf entscheidende kognitive Tests, um die Fähigkeit einer Spezies anhand der Leistungen einiger weniger Individuen zu bestimmen. Bei diesem Ansatz wird die Variabilität zwischen Individuen als unerwünschtes Rauschen betrachtet und daher vernachlässigt. Die interindividuelle Variabilität liefert jedoch wichtige Erkenntnisse über die Plastizität des Verhaltens, die kognitive Spezialisierung und die Modularität des Gehirns. Die Honigbiene Apis mellifera ist aufgrund ihrer eindrucksvollen Fähigkeiten und ihres reichen Verhaltensrepertoires ein robuster und traditioneller Modellorganismus für die Untersuchung von Lernen, Gedächtnis und Kognition. In dieser Arbeit habe ich das Lernverhalten von Honigbienen in einem neuen Blickwinkel betrachtet, indem ich explizit die individuellen Unterschiede bei diversen Lernaufgaben untersucht habe. Zeigen manche Bienen durchweg eine erhöhte Lernleistung im Vergleich zu ihren Schwestern? Wenn ja, erbringt ein Individuum unabhängig von der Zeit, dem Kontext und den kognitiven Anforderungen der Lernaufgaben immer gute Leistungen, oder zeigen Bienen ausgeprägte unabhängige "kognitive Module"? Die vorliegende Doktorarbeit stellt die erste umfassende Untersuchung konsistenter individueller Unterschiede in den kognitiven Fähigkeiten von Honigbienen dar. Um von einem konsistenten Verhalten sprechen zu können, ist es entscheidend das Individuum mehrfach zu testen, um die Wiederholbarkeit eines Verhaltens zu untersuchen. Ich konnte zeigen, dass frei fliegende Bienen bei einer visuellen Unterscheidungsaufgabe an drei aufeinanderfolgenden Tagen eine konsistente Lernleistung zeigen. Im Anschluss untersuchte ich die individuelle Konsistenz der kognitiven Fähigkeiten bei Lernaufgaben mit unterschiedlichen sensorischen Modalitäten, Kontexten und kognitiven Anforderungen. Frei fliegende Bienen zeigten eine kognitive Spezialisierung zwischen visuellem und olfaktorischem Lernen, während sie bei einer einfachen Unterscheidungsaufgabe und einer komplexen Konzeptlernaufgabe konsistent im Lernverhalten blieben. Anschließend wollte ich die individuelle Konsistenz im Lernverhalten bei Aufgaben unterschiedlicher kognitiver Komplexität weiter erforschen, eine Frage, die bisher noch nie bei einem Insekt behandelt wurde. Ich führte dazu eine Reihe von vier Experimenten durch, bei denen entweder visuelle oder olfaktorische Stimuli und ein unterschiedlicher Trainingskontext (frei fliegend oder eingespannt) verwendet wurden. Die Bienen wurden in einer Unterscheidungsaufgabe, einer Umlernaufgabe und in Negative Patterning getestet. Erstaunlicherweise wurden bei diesen Experimenten die gleichen Ergebnisse festgestellt: Die Lernleitung der Bienen in der Unterscheidungsaufgabe zeigte eine positive Korrelation mit der Lernleistung im Umlernen und Negative Patterning. Zwischen dem Umkehrlernen und Negative Patterning konnte jedoch kein Zusammenhang festgestellt werden. Nachdem ich festgestellt hatte, dass es konsistente individuelle Unterschiede in den kognitiven Fähigkeiten von Bienen gibt, wollte ich die Faktoren ermitteln, die diesen Unterschieden zugrunde liegen könnten. Es war bereits bekannt, dass genetische Komponenten der interindividuellen Variabilität im Lernverhalten zugrunde liegen. Deshalb untersuchte ich den Einfluss von genetischer Vielfalt auf die Beständigkeit von kognitiven Fähigkeiten, indem ich Bienen gegenüberstellte, die entweder aus einem Bienenstock mit einer einzigen Patriline (geringe genetische Vielfalt) oder mit mehreren Patrilinen (hohe genetische Vielfalt) stammten. Diese beiden Gruppen von Bienen wiesen Unterschiede in den Mustern der individuellen korrelierten Lernleistungen auf, was darauf hindeutet, dass eine genetische Komponente für kognitive Individualität verantwortlich ist. Ein weiterer wichtiger Faktor, welcher der Variabilität im Lernverhalten zugrunde liegt, ist die individuelle Reaktionsfähigkeit auf Saccharose Lösungen und auf visuelle Stimuli. Dies wurde durch viele Studien an eingespannten Bienen gezeigt, die eine positive Korrelation zwischen der Reaktionsfähigkeit auf aufgabenrelevante Reize und den Lernfähigkeiten feststellten. Ich habe daher untersucht, ob diese Beziehungen zwischen der Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und visuellen Stimuli und den Lernleistungen auch für frei fliegende Bienen zutreffen. Die individuellen Lernleistungen im Umlernen und Negative patterning von frei fliegenden Bienen wurden erneut ermittelt und anschließend wurde im Labor die Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und Licht getestet. Es gab keine Hinweise auf eine positive Korrelation zwischen der Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und Licht und den Lernleistungen von frei fliegenden Bienen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Beziehungen zwischen der Reaktionsfähigkeit auf aufgabenrelevante Stimuli und der Lernleistung, die im Labor mit eingespannten Bienen festgestellt wurden, möglicherweise nicht für einen anderen Verhaltenskontext gelten, d. h. für frei fliegende Bienen in ihrer natürlichen Umgebung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Honigbiene ein hervorragendes Insektenmodell ist, um die Konsistenz kognitiver Fähigkeiten zu untersuchen und die zugrunde liegenden Faktoren zu ermitteln. Ich diskutiere die Ergebnisse vor allem im Hinblick auf die Frage der Modularität des Gehirns bei Insekten und die adaptive Bedeutung von individuellen konsistenten kognitiven Fähigkeiten für Honigbienenvölker. Ich schlage auch Forschungsfragen vor, die mit individuellen konsistenten kognitiven Fähigkeiten zusammenhängen und wertvolle Bereiche für künftige Forschungen darstellen könnten. KW - Lernen KW - Biene KW - Kognition KW - Individual differences KW - Cognitive consistency KW - Cognitive profile KW - Learning KW - Honeybee KW - Cognition Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323012 ER - TY - THES A1 - Beudert, Matthias T1 - Bioinspired Modification and Functionalization of Hydrogels for Applications in Biomedicine T1 - Biologisch-inspirierte Modifizierung und Funktionalisierung von Hydrogelen für Anwendungen in der Biomedizin N2 - Over the years, hydrogels have been developed and used for a huge variety of different applications ranging from drug delivery devices to medical products. In this thesis, a poly(2-methyl-2-oxazoline) (POx) / poly(2-n-propyl-2-oxazine) (POzi) bioink was modified and analyzed for the use in biofabrication and targeted drug delivery. In addition, the protein fibrinogen (Fbg) was genetically modified for an increased stability towards plasmin degradation for its use as wound sealant. In Chapter 1, a thermogelling, printable POx/POzi-based hydrogel was modified with furan and maleimide moieties in the hydrophilic polymer backbone facilitating post-printing maturation of the constructs via Diels-Alder chemistry. The modification enabled long-term stability of the hydrogel scaffolds in aqueous solutions which is necessary for applications in biofabrication or tissue engineering. Furthermore, we incorporated RGD-peptides into the hydrogel which led to cell adhesion and elongated morphology of fibroblast cells seeded on top of the scaffolds. Additional printing experiments demonstrate that the presented POx/POzi system is a promising platform for the use as a bioink in biofabrication. Chapter 2 highlights the versatility of the POx/POzi hydrogels by adapting the system to a use in targeted drug delivery. We used a bioinspired approach for a bioorthogonal conjugation of insulin-like growth factor I (IGF-I) to the polymer using an omega-chain-end dibenzocyclooctyne (DBCO) modification and a matrix metalloprotease-sensitive peptide linker. This approach enabled a bioresponsive release of IGF-I from hydrogels as well as spatial control over the protein distribution in 3D printed constructs which makes the system a candidate for the use in personalized medicine. Chapter 3 gives a general overview over the necessity of wound sealants and the current generations of fibrin sealants on the market including advantages and challenges. Furthermore, it highlights trends and potential new strategies to tackle current problems and broadens the toolbox for future generations of fibrin sealants. Chapter 4 applies the concepts of recombinant protein expression and molecular engineering to a novel generation of fibrin sealants. In a proof-of-concept study, we developed a new recombinant fibrinogen (rFbg) expression protocol and a Fbg mutant that is less susceptible to plasmin degradation. Targeted lysine of plasmin cleavage sites in Fbg were exchanged with alanine or histidine in different parts of the molecule. The protein was recombinantly produced and restricted plasmin digest was analyzed using high resolution mass spectrometry. In addition to that, we developed a novel time resolved screening protocol for the detection of new potential plasmin cleavage sites for further amino acid exchanges in the fibrin sealant. N2 - Hydrogele wurden im Laufe der Jahre für eine Vielzahl von Anwendungen, von der Verabreichung von Medikamenten bis hin zu medizinischen Produkten, entwickelt und eingesetzt. In dieser Arbeit wurde eine Poly(2-methyl-2-oxazolin) POx) / Poly(2-n-propyl-2- oxazin) (POzi) Biotinte modifiziert und für den Einsatz in der Biofabrikation und für die gezielte Verabreichung von Medikamenten analysiert. Außerdem wurde das Protein Fibrinogen (Fbg) gentechnisch verändert, um seine Stabilität gegenüber dem Plasminabbau in seiner Funktion als Wundkleber zu erhöhen In Kapitel 1 wurde ein thermogelierendes, druckbares Hydrogel auf POx/POzi-Basis mit Furan- und Maleimid-Funktionen im hydrophilen Polymerrückgrat modifiziert, was die Reifung der Konstrukte nach dem Druck durch Diels-Alder-Chemie bewirkt. Die Modifizierung ermöglichte eine langfristige Stabilität der Hydrogele in wässrigen Lösungen, was für Anwendungen im Bereich der Biofabrikation oder im Tissue Engineering erforderlich ist. Darüber hinaus haben wir RGD-Peptide in das Hydrogel integriert, was zur Zelladhäsion und einer verlängerten Morphologie von Fibroblasten, die auf den Gelen ausgesät wurden, führte. Weitere Druckexperimente zeigen außerdem, dass das POx/POzi-System eine vielversprechende Plattform für den Einsatz als Biotinte in der Biofabrikation ist. Kapitel 2 unterstreicht die Vielseitigkeit der POx/POzi-Hydrogele, indem das System für die gezielte Abgabe von Medikamenten angepasst wird. Wir verwendeten einen von der Natur inspirierten Ansatz für eine biorthogonale Konjugation vom Insuline-like Growth Factor I (IGF- I) an das Polymer unter Verwendung einer Dibenzocyclooctin-Modifikation des Polymers am Ende der Omega-Kette und eines Matrix-Metalloproteasen-empfindlichen Peptid-Linkers. Dieser Ansatz ermöglichte eine bioresponsive Freisetzung von IGF-I aus Hydrogelen sowie eine räumliche Kontrolle über die Proteinverteilung in 3D-gedruckten Konstrukten, was das System zu einem Kandidaten für den Einsatz in der personalisierten Medizin macht. Kapitel 3 gibt einen allgemeinen Überblick über die Notwendigkeit von Wundversiegelungsmitteln und die derzeit auf dem Markt befindlichen Generationen von Fibrinklebern einschließlich der Vorteile und Herausforderungen. Darüber hinaus werden Trends und potenzielle neue Strategien zur Lösung aktueller Probleme und zur Erweiterung der Toolbox für künftige Generationen von Fibrinklebern aufgezeigt. In Kapitel 4 werden die Konzepte der rekombinanten Proteinexpression und des Molecular Engineering auf eine neue Generation von Fibrin Wundklebern angewandt. In einer Proof-of- Concept-Studie haben wir ein neues rekombinantes Fbg Expressionsprotokoll und eine Fbg Mutante entwickelt, die weniger anfällig für einen Abbau durch Plasmin ist. Gezielte Lysine in Plasmin-Schnittstellen in Fbg wurde entweder durch Alanin oder Histidin in unterschiedlichen Teilen des Moleküls ausgetauscht. Das Protein wurde rekombinant hergestellt und eine verminderte Schnittrate wurde mittels hochauflösender Massenspektrometrie gezeigt. Zusätzlich haben wir ein neues zeitaufgelöstes Screening-Protokoll entwickelt, mit dem sich neue potenzielle Plasmin-Spaltstellen für weitere Aminosäurenaustausche in Fibrin-Klebern auflösen lassen. KW - Hydrogel KW - Targeted drug delivery KW - 3 D bioprinting KW - Hydrogels KW - Modification KW - Bioinks KW - Fibrinogen KW - Drug Delivery Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-322887 ER - TY - THES A1 - Dietrich, Oliver T1 - Integrating single-cell multi-omics to decipher host-pathogen interactions T1 - Integration von Genomik Daten einzelner Zellen zur Entschlüsselung von Wirt-Pathogen Interaktionen N2 - Interactions between host and pathogen determine the development, progression and outcomes of disease. Medicine benefits from better descriptions of these interactions through increased precision of prevention, diagnosis and treatment of diseases. Single-cell genomics is a disruptive technology revolutionizing science by increasing the resolution with which we study diseases. Cell type specific changes in abundance or gene expression are now routinely investigated in diseases. Meanwhile, detecting cellular phenotypes across diseases can connect scientific fields and fuel discovery. Insights acquired through systematic analysis of high resolution data will soon be translated into clinical practice and improve decision making. Therefore, the continued use of single-cell technologies and their application towards clinical samples will improve molecular interpretation, patient stratification, and the prediction of outcomes. In the past years, I was fortunate to participate in interdisciplinary research groups bridging biology, clinical research and data science. I was able to contribute to diverse projects through computational analysis and biological interpretation of sequencing data. Together, we were able to discover cellular phenotypes that influence disease progression and outcomes as well as the response to treatment. Here, I will present four studies that I have conducted in my PhD. First, we performed a case study of relapse from cell-based immunotherapy in Multiple Myeloma. We identified genomic deletion of the epitope as mechanism of immune escape and implicate heterozygosity or monosomy of the genomic locus at baseline as a potential risk factor. Second, we investigated the pathomechanisms of severe COVID-19 at the earliest stage of the COVID- 19 pandemic in Germany in March 2020. We discovered that profibrotic macrophages and lung fibrosis can be caused by SARS-CoV-2 infection. Third, we used a mouse model of chronic infection with Staphylococcus aureus that causes Osteomyelitis similar to the human disease. We were able to identify dysregulated immunometabolism associated with the generation of myeloid-derived suppressor cells (MDSC). Fourth, we investigated Salmonella infection of the human small intestine in an in vitro model and describe features of pathogen invasion and host response. Overall, I have been able to successfully employ single-cell sequencing to discover important aspects of diseases ranging from development to treatment and outcome. I analyzed samples from the clinics, human donors, mouse models and organoid models to investigate different aspects of diseases and managed to integrate data across sample types, technologies and diseases. Based on successful studies, we increased our efforts to combine data from multiple sources to build comprehensive references for the integration of large collections of clinical samples. Our findings exemplify how single-cell sequencing can improve clinical research and highlights the potential of mechanistic discoveries to drive precision medicine. N2 - Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen bestimmen die Entwicklung und den Verlauf von Erkrankungen als auch deren Ausgang. Die Medizin zieht Nutzen aus genaueren Beschreibungen von Krankheiten durch höhere Präzision von Prävention, Diagnose und Behandlung. Genomische Messungen in einzelnen Zellen werden durch innovative Technologien ermöglicht, welche die Wissenschaft revolutionieren indem sie die Auflösung erhöhen mit der wir Krankheiten untersuchen können. Inzwischen werden sowohl die Zusammensetzung von Zelltypen als auch Unterschiede in der Genexpression routinemäßig über Krankheiten hinweg untersucht. Der Einsatz von Technologien die einzelne Zellen untersuchen und ihre Anwendung auf klinische Proben wird die molekulare Interpretation, die Stratifizierung von Patienten und die Prognose des Ausgangs von Krankheiten verbessern. In den letzten Jahren konnte ich mich an interdisziplinären Forschungsgruppen beteiligen und die Bereiche der Biologie, klinischer Forschung und Datenwissenschaften kombinieren. Ich war in der Lage zu unterschiedlichen Projekten beizutragen und eine führende Rolle in der Analyse und biologischen Interpretation von Daten aus Sequenzierungen zu übernehmen. Zusammen konnten wir zelluläre Phänotypen entdecken, die Entwicklung und Ausgang von Krankheiten sowie die Antwort auf Therapien beeinflussen. In dieser Arbeit werde ich vier Studien vorstellen, die ich während meiner Promotion durchgeführt habe. Zuerst haben wir einen Fall vom Rezidiv des Multiplen Myeloms nach zellulärer Immuntherapie untersucht. Dabei konnten wir feststellen, dass eine Deletion des genomischen Abschnitts für das immunogene Epitop dafür sorgte, dass die Krebszellen der Immunantwort entkommen konnten. Des weiteren konnten wir nachweisen, dass einige Patienten vor Beginn der Therapie nur eine Kopie des Gens besitzen und dadurch einen potentiellen Risikofaktor für ein Scheitern der Therapie. Zweitens haben wir im März 2020 die ersten Fälle von akutem Lungenversagen in COVID-19 und die Ursachen der Pathologie untersucht. Dabei haben wir festgestellt, das profibrotische Makrophagen und Lungenfibrose durch SARS-CoV-2 ausgelöst werden. Als Drittes haben wir Osteomyelitis in Mäusen untersucht, die von dem Bakterium Staphylococcus aureus ausgelöst wird und der Erkrankung im Menschen ähnlich ist. Wir konnten feststellen, dass deregulierter Metabolismus von Immunzellen der Enstehung von myeloiden Zellen mit T-Zell supprimierender Aktivität (MDSC) zugrunde liegt. Viertens haben wir die Infektion des humanen Dünndarms mit Salmonella in einem Organoidmodell untersucht und konnten Merkmale der Pathogeninvasion und der Wirtsantwort beschreiben. Insgesamt konnte ich die Sequenzierung von RNAs in einzelnen Zellen nutzen um wichtige Aspekte in der Entwicklung, dem Verlauf und dem Ausgang von Erkrankungen zu entdecken. Ich konnte Proben aus der Klinik, von Donoren, Mausmodellen und Organoidmodellen analysieren und die Daten über die Art von Proben, Technologien und Krankheiten hinweg integrieren. Durch unsere erfolgreichen Studien konnten wir uns ambitioniertere Ziele setzen um Daten von verschiedenen Quellen in umfassenden Referenzen zusammenzuführen um große Kollektionen klinischer Proben gemeinsam zu untersuchen. Unsere Ergebnisse demonstrieren wie die Untersuchung einzelner Zellen die klinische Forschung verbessern kann und zeigt das Potential auf wie Entdeckungen in der Biomedizin zur Präzisionsmedizin beitragen können. KW - Einzelzellanalyse KW - Single-cell sequencing KW - Host-Pathogen Interactions Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360138 ER - TY - THES A1 - Hartmann, Oliver T1 - Development of somatic modified mouse models of Non-Small cell lung cancer T1 - Entwicklung von somatisch veränderten Mausmodellen für nichtkleinzelligen Lungenkrebs N2 - In 2020, cancer was the leading cause of death worldwide, accounting for nearly 10 million deaths. Lung cancer was the most common cancer, with 2.21 million cases per year in both sexes. This non-homogeneous disease is further subdivided into small cell lung cancer (SCLC, 15%) and non-small cell lung cancer (NSCLC, 85%). By 2023, the American Cancer Society estimates that NSCLC will account for 13% of all new cancer cases and 21% of all estimated cancer deaths. In recent years, the treatment of patients with NSCLC has improved with the development of new therapeutic interventions and the advent of targeted and personalised therapies. However, these advances have only marginally improved the five-year survival rate, which remains alarmingly low for patients with NSCLC. This observation highlights the importance of having more appropriate experimental and preclinical models to recapitulate, identify and test novel susceptibilities in NSCLC. In recent years, the Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt mouse model developed by Tuveson, Jacks and Berns has been the main in vivo model used to study NSCLC. This model mimics ADC and SCC to a certain extent. However, it is limited in its ability to reflect the genetic complexity of NSCLC. In this work, we use CRISPR/Cas9 genome editing with targeted mutagenesis and gene deletions to recapitulate the conditional model. By comparing the Trp53fl/fl KRaslsl- G12D/wt with the CRISPR-mediated Trp53mut KRasG12D, we demonstrated that both showed no differences in histopathological features, morphology, and marker expression. Furthermore, next-generation sequencing revealed a very high similarity in their transcriptional profile. Adeno-associated virus-mediated tumour induction and the modular design of the viral vector allow us to introduce additional mutations in a timely manner. CRISPR-mediated mutation of commonly mutated tumour suppressors in NSCLC reliably recapitulated the phenotypes described in patients in the animal model. Lastly, the dual viral approach could induce the formation of lung tumours not only in constitutive Cas9 expressing animals, but also in wildtype animals. Thus, the implementation of CRISPR genome editing can rapidly advance the repertoire of in vivo models for NSCLC research. Furthermore, it can reduce the necessity of extensive breeding. N2 - Krebs war mit fast 10 Millionen Todesfällen weltweit die häufigste Todesursache in 2020. Mit 2,21 Millionen Fällen pro Jahr in beiden Geschlechtern kombiniert war Lungenkrebs die häufigste Unterart. Auszeichnend für dieses Krankheit ist die hohe Komplexität und Heterogenität. Daher wird diese weiter in kleinzelligen Lungenkrebs (SCLC, 15 %) und nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC, 85 %) unterteilt. Die American Cancer Society schätzt, dass bis 2023 13 % aller neuen Krebsfälle und 21 % aller geschätzten Krebstodesfälle auf das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom entfallen werden. In den letzten Jahren hat sich die Behandlung von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom durch die Entwicklung neuer therapeutischer Maßnahmen und das Anwenden personalisierter Therapien verbessert. Allerdings haben diese Fortschritte die Fünfjahresüberlebensrate nur geringfügig verbessert, die für Patienten mit NSCLC nach wie vor alarmierend niedrig ist. Diese macht deutlich, wie wichtig es ist, über geeignetere experimentelle und präklinische Modelle zu verfügen, um neue Therapieansätze beim NSCLC zu rekapitulieren, zu identifizieren und zu testen. In der letzten Dekade war das von Tuveson, Jacks und Berns entwickelte Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt-Mausmodell das wichtigste In-vivo-Modell zur Untersuchung von NSCLC. Dieses kann grundlegend das Krankheitsbild von NSCLC wiederspiegeln. Es ist jedoch nur begrenzt in der Lage, die genetische Komplexität von NSCLC im vollen Umfang zu refelktieren. In dieser Arbeit verwenden wir CRISPR/Cas9 Genome Editing mit gezielter Mutagenese und Gendeletionen, um das konditionale Modell zu rekapitulieren. Durch den Vergleich des Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt mit dem CRISPR-vermittelten Trp53mut KRasG12D konnten wir zeigen, dass beide keine Unterschiede in Bezug auf histopathologische Merkmale, Morphologie und Markerexpression aufweisen. Darüber hinaus ergab die Analyse mittels Next Generation Sequencing 8Hochdruchsatz.Sequenzierung) eine sehr große Ähnlichkeit in ihrem Transkriptionsprofil. Die Adeno-assoziierte Virus-vermittelte Tumorinduktion und der modulare Aufbau des viralen Vektors ermöglichen es uns, zusätzliche Mutationen zeitnah einzuführen. Die CRISPR-vermittelte Mutation von häufig mutierten Tumorsuppressoren bei NSCLC rekapitulierte zuverlässig die bei Patienten beschriebenen Phänotypen im Tiermodell. Schließlich konnte der duale virale Ansatz die Bildung von Lungentumoren nicht nur in konstitutiv Cas9 exprimierenden Tieren, sondern auch in Wildtyp-Tieren induzieren. Somit kann die Anwendung von CRISPR-Genome Editing das Repertoire an In-vivo- Modellen für die NSCLC-Forschung rasch erweitern. Darüber hinaus kann es die Notwendigkeit umfangreicher Züchtungen verringern. KW - CRISPR/Cas-Methode KW - in vivo KW - Lung Cancer KW - CRISPR/Cas9 KW - in vivo genome editing KW - Immunohistochemistry KW - Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom KW - NSCLC KW - Mouse Model KW - CRISPR Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363401 ER - TY - THES A1 - Hahn, Sarah T1 - Investigating non-canonical, 5' UTR-dependent translation of MYC and its impact on colorectal cancer development T1 - Untersuchung der nicht-kanonischen, 5' UTR-abhängigen Translation von MYC und ihres Einflusses auf die Entwicklung von Darmkrebs N2 - Colorectal cancer (CRC) is the second most common tumour disease in Germany, with the sequential accumulation of certain mutations playing a decisive role in the transition from adenoma to carcinoma. In particular, deregulation of the Wnt signalling pathway and the associated deregulated expression of the MYC oncoprotein play a crucial role. Targeting MYC thus represents an important therapeutic approach in the treatment of tumours. Since direct inhibition of MYC is challenging, various approaches have been pursued to date to target MYC indirectly. The MYC 5' UTR contains an internal ribosomal entry site (IRES), which has a particular role in the initiation of MYC translation, especially in multiple myeloma. As basis for this work, it was hypothesised on the basis of previous data that translation of MYC potentially occurs via its IRES in CRC as well. Based on this, two IRES inhibitors were tested for their potential to regulate MYC expression in CRC cells. In addition, alternative, 5’ UTR-dependent translation of MYC and interacting factors were investigated. EIF3D was identified as a MYC 5' UTR binding protein which has the potential to regulate MYC expression in CRC. The results of this work suggest that there is a link between eIF3D and MYC expression/translation, rendering eIF3D a potential therapeutic target for MYC-driven CRCs. N2 - Das kolorektale Karzinom (KRK) ist die zweithäufigste Tumorerkrankung in Deutschland, wobei die sequenzielle Akkumulation bestimmter Mutationen eine entscheidende Rolle beim Übergang vom Adenom zum Karzinom spielt. Insbesondere die Deregulation des Wnt-Signalweges und die damit verbundene deregulierte Expression des MYC-Onkoproteins spielen eine entscheidende Rolle. MYC ist ein zentraler Vermittler von Zellfunktionen und reguliert als Transkriptionsfaktor die Expression fast aller Gene sowie verschiedener RNA-Spezies. Selbst kleine Veränderungen der zellulären MYC-Konzentration können das Proliferationsverhalten beeinflussen und die Entstehung und das Fortschreiten von Tumoren fördern. Die gezielte Beeinflussung von MYC stellt daher einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Behandlung von Tumoren dar. Da eine direkte Hemmung von MYC aufgrund seiner Struktur herausfordernd ist, wurden bisher verschiedene Ansätze verfolgt, um MYC indirekt zu beeinflussen, etwa über seinen Interaktionspartner MAX oder auf Ebene der Stabilität, Transkription oder Translation. In unserer eigenen Forschungsgruppe lag der Schwerpunkt in den letzten Jahren speziell auf der Translation von MYC im KRK. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der kanonischen cap-abhängigen Translation nicht wie erwartet zu einer Verringerung der zellulären MYC-Level führt, was auf einen alternativen Mechanismus der MYC-Translation hindeutet, der unabhängig vom eIF4F-Komplex abläuft. Die 5'-UTR von MYC enthält eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), die eine besondere Rolle bei der Initiierung der MYC-Translation spielt, insbesondere im Multiplen Myelom. Als Grundlage für diese Arbeit wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass die Translation von MYC im KRK möglicherweise ebenfalls über die IRES erfolgt. Auf dieser Grundlage wurden zunächst zwei publizierte IRES-Inhibitoren auf ihr Potenzial zur Regulierung der MYC-Expression in KRK-Zellen getestet. J007-IRES hatte keine Auswirkungen auf die MYC-Proteinmenge, und Cymarin scheint weitaus globalere Auswirkungen zu haben, die nicht ausschließlich auf die Verringerung der MYC-Proteinmenge zurückzuführen sind. Daher wurde weiter untersucht, inwieweit die alternative Translation von MYC generell von der 5'-UTR und damit interagierenden Faktoren abhängig ist. EIF3D wurde als MYC-5'-UTR-Bindungsprotein identifiziert, dessen Knockdown zu reduzierten MYC-Leveln, einem Proliferationsdefizit sowie einer Verringerung der globalen Proteinsynthese in KRK-Zellen führte. Darüber hinaus führte die Depletion von EIF3D zu ähnlichen Veränderungen im zellulären Genexpressionsmuster wie die Depletion von MYC, wobei viele tumorassoziierte Signalwege betroffen waren. Mittels eCLIP-seq wurde die Bindung von eIF3D an die MYC mRNA nachgewiesen, der genaue Mechanismus einer möglicherweise durch eIF3D vermittelten Translation von MYC muss jedoch weiter untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass eine Verbindung zwischen eIF3D und der MYC-Expression/Translation besteht, wodurch eIF3D zu einem potenziellen therapeutischen Ziel für MYC-getriebene KRKs wird. KW - Myc KW - Translation KW - Colorectal cancer KW - 5' UTR Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-364202 ER - TY - THES A1 - Merscher, Alma-Sophia T1 - To Fear or not to Fear: Unraveling the (Oculo)motor and Autonomic Components of Defensive States in Humans T1 - Vor Furcht Erstarren: Charakterisierung der (Okulo)motorischen und Autonomen Komponenten Menschlicher Defensivreaktionen N2 - Defensive behaviors in response to threats are key factors in maintaining mental and physical health, but their phenomenology remains poorly understood. Prior work reported an inhibition of oculomotor activity in response to avoidable threat in humans that reminded of freezing behaviors in rodents. This notion of a homology between defensive responding in rodents and humans was seconded by concomitant heart rate decrease and skin conductance increase. However, several aspects of this presumed defense state remained ambiguous. For example, it was unclear whether the observed oculomotor inhibition would 1) robustly occur during preparation for threat-avoidance irrespective of task demands, 2) reflect a threat-specific defensive state, 3) be related to an inhibition of somatomotor activity as both motion metrics have been discussed as indicators for freezing behaviors in humans, and 4) manifest in unconstrained settings. We thus embarked on a series of experiments to unravel the robustness, threat-specificity, and validity of previously observed (oculo)motor and autonomic dynamics upon avoidable threat in humans. We provided robust evidence for reduced gaze dispersion, significantly predicting the speed of subsequent motor reactions across a wide range of stimulus contexts. Along this gaze pattern, we found reductions in body movement and showed that the temporal profiles between gaze and body activity were positively related within individuals, suggesting that both metrics reflect the same construct. A simultaneous activation of the parasympathetic (i.e., heart rate deceleration) and sympathetic (i.e., increased skin conductance and pupil dilation) nervous system was present in both defensive and appetitive contexts, suggesting that these autonomic dynamics are not only sensitive to threat but reflecting a more general action-preparatory mechanism. We further gathered evidence for two previously proposed defensive states involving a decrease of (oculo)motor activity in a naturalistic, unconstrained virtual reality environment. Specifically, we observed a state consisting of a cessation of ongoing behaviors and orienting upon relatively distal, ambiguous threat (Attentive Immobility) while an entire immobilization and presumed allocation of attention to the threat stimulus became apparent upon approaching potential threat (Immobility under Attack). Taken together, we provided evidence for specific oculomotor and autonomic dynamics upon increasing levels of threat that may inspire future translational work in rodents and humans on shared mechanisms of threat processing, ultimately supporting the development of novel therapeutic approaches. N2 - Angemessen auf Gefahren zu reagieren, ist überlebensnotwendig, wissenschaftlich jedoch wenig verstanden. Eine frühere Studie wies auf, dass ProbandInnen ihre Augen weniger bewegten, wenn sie mit einer Bedrohung konfrontiert waren, der sie mit einer schnellen Bewegung entkommen konnten. Dieses eingeschränkte Blickbewegungsmuster wurde von einer Herzraten-Dezeleration und einem Anstieg der Hautleitfähigkeit begleitet und wies damit Ähnlichkeiten mit bestimmten Erstarrungsreaktionen auf Bedrohungen (Freezing) bei Nagetieren auf. Es blieb jedoch unklar, ob die eingeschränkten Augenbewegungen 1. robust und unabhängig von spezifischen Aufgabenstellungen als Reaktion auf eine vermeidbare Bedrohung auftreten, 2. eine bedrohungsspezifische Komponente eines Defensivzustands darstellen, 3. von einer körperlichen Bewegungsreduktion begleitet und 4. im freien Raum auftreten würden. Wir haben daher untersucht, ob dieses eingeschränkte Blickbewegungsmuster sowie seine autonomen Begleiterscheinungen robust, bedrohungsspezifisch und valide sind. In unseren Studien traten verringerte Augenbewegungen robust und bedrohungsspezifisch als Reaktion auf vermeidbare Bedrohungen auf und sagten schnellere Reaktionszeiten vorher. Die eingeschränkten Augenbewegungen wurden von verringerten Körperbewegungen begleitet, deren zeitliche Verläufe miteinander korrelierten. Dies könnte auf ein zugrundeliegendes gemeinsames Konstrukt hinweisen. Wir beobachteten außerdem eine Herzraten-Dezeleration sowie erhöhte Hautleitfähigkeit und Pupillendilation in bedrohlichen und appetitiven Kontexten, was darauf hindeutet, dass diese autonomen Dynamiken nicht nur durch Bedrohungen, sondern auch allgemein handlungsvorbereitend ausgelöst werden können. Zuletzt konnten wir in einer frei explorierbaren, virtuellen Umgebung Hinweise auf zwei Defensivzustände liefern, deren Unterscheidung zuvor postuliert, jedoch noch nicht weitreichend belegt war. Bei relativ weit entfernter und ambivalenter Gefahr hielten die ProbandInnen inne und drehten sich, vermutlich zur Orientierung, zum potentiellen Ort der Bedrohung hin (Attentive Immobility). Wenn sich die Bedrohung jedoch näherte, verringerten sich sowohl Körper- als auch Augenbewegungen, als würden die ProbandInnen ihre Aufmerksamkeit auf die Bedrohung ausrichten (Immobility under Attack). Zusammenfassend lieferten unsere Erhebungen damit Belege für spezifische (okulo)motorische und autonome Dynamiken bei steigender Bedrohung, die zukünftige translationale Forschungen über Homologien von Defensivzuständen zwischen Nagetieren und Menschen inspirieren und damit womöglich die Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren unterstützen können. KW - Furcht KW - Fear Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-327913 ER -