TY  - THES
A1  - Aigner, Max
T1  - Establishing successful protocols and imaging pipelines for Expansion Microscopy in murine blood platelets
T1  - Etablierung erfolgreicher Protokolle zur Probenpräparation und Bildgebung für die ‚Expansion Microscopy‘ in murinen Thrombozyten
N2  - Platelets play an important role in the body, since they are part of the hemostasis
system, preventing and stopping blood loss. Nevertheless, when platelet or
coagulation system function are impaired, uncontrolled bleedings but also irreversible
vessel occlusion followed by ischemic tissue damage can occur. Therefore,
understanding platelet function and activation, mechanisms which are controlled by a
variety of platelet membrane receptors and other factors is important to advance out
knowledge of hemostasis and platelet malfunction. For a complete picture of platelet
function and their modulating behavior it is desired to be able to quantify receptor
distributions and interactions of these densely packed molecular ensembles in the
membrane. This challenges scientists for several reasons. Most importantly, platelets
are microscopically small objects, challenging the spatial resolution of conventional
light microscopy. Moreover, platelet receptors are highly abundant on the membrane
so even super-resolution microscopy struggles with quantitative receptor imaging on
platelets.
With Expansion microscopy (ExM), a new super-resolution technique was introduced,
allowing resolutions to achieve super-resolution without using a super-resolution
microscope, but by combining a conventional confocal microscopy with a highly
processed sample that has been expanded physically. In this doctoral thesis, I
evaluated the potential of this technique for super-resolution platelet imaging by
optimizing the sample preparation process and establishing an imaging and image
processing pipeline for dual-color 3D images of different membrane receptors. The
analysis of receptor colocalization using ExM demonstrated a clear superiority
compared to conventional microscopy. Furthermore, I identified a library of
fluorescently labeled antibodies against different platelet receptors compatible with
ExM and showed the possibility of staining membrane receptors and parts of the
cytoskeleton at the same time.
N2  - Thrombozyten spielen eine wichtige Rolle im Körper, denn als Teil des
Gerinnungssystems, sind sie daran beteiligt Blutverlust vorzubeugen und zu stoppen.
Gleichwohl können sie bei Störungen des Gerinnungssystems zu unkontrollierbaren
Blutungen und auch durch Aggregation zu kardiovaskulären Ereignissen, wie
Herzinfarkt und Schlaganfällen führen. Für ein besseres Verständnis von Hämostase
und Gerinnungsstörungen ist es deshalb nötig die Funktion und Aktivierung von
Thrombozyten zu verstehen, welche durch eine Vielzahl von Membranrezeptoren und
anderen Faktoren gesteuert wird. Eine Methode, um weitere Einblicke in diese
Prozesse zu bekommen ist die mikroskopische Darstellung von Rezeptorverteilungen
auf der Zellmembran und deren Interaktionen. Dies zu realisieren ist aus
verschiedenen Gründen anspruchsvoll. Der mikroskopisch kleine Durchmesser der
Thrombozyten macht es konventioneller Lichtmikroskopie schwer, einzelne
Rezeptoren auf der Membran darzustellen. Außerdem befinden sich sehr viele
Rezeptoren dicht gepackt auf der Membran, sodass sogar superhochauflösende
Mikroskope Schwierigkeiten haben, die Rezeptoren quantitativ zu beurteilen.
Mit ‚Expansion microscopy‘ (ExM) wurde eine relativ junge superhochaufösende
Technik auf Thrombozyten angewendet. Diese Technik erreicht Auflösungen
vergleichbar mit sogenannten ‚super-resolution‘ Mikroskopen, ohne die Benutzung
selbiger, sondern durch die Kombination von konfokaler Mikroskopie mit einer
physikalisch expandierten Probe. In dieser Arbeit evaluierte ich das Potential dieser
Technik für superhochauflösende Bilder von Thrombozytenrezeptoren und optimierte
die Probenvorbereitung, sodass zweifarbige 3D Bilder von verschiedenen
Membranrezeptoren möglich waren. Die Ergebnisse der Kolokationsanalyse zeigten
einen deutlich vergrößerten Dynamikumfang durch ExM. Außerdem katalogisierte ich
fluoreszenzmarkierte Antikörper gegen verschiedene Thrombozyten Rezeptoren
bezüglich ihrer Tauglichkeit mit ExM und zeigte, dass es möglich ist
Membranrezeptoren und Bestandteile des Zytoskeletts gleichzeitig zu färben.
KW  - Expansion Microscopy
KW  - platelets
KW  - Mikroskopie
KW  - Microscopy
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-309003
ER  - 
TY  - THES
A1  - Maier, Sophia Edith
T1  - Mapping membrane receptor distribution on resting platelets combining Expansion Microscopy and fluorescence confocal microscopy
T1  - Kartierung der Membranrezeptorverteilung auf nicht-aktivierten Blutplättchen mithilfe der Kombination aus Expansionsmikroskopie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie
N2  - Stroke and myocardial infarction are the most prominent and severe consequences of pathological thrombus formation. For prevention and/or treatment of thrombotic events there is a variety of anti-coagulation and antiplatelet medication that all have one side effect in common: the increased risk of bleeding. To design drugs that only intervene in the unwanted aggregation process but do not disturb general hemostasis, it is crucial to decipher the exact clotting pathway which has not been fully understood yet. Platelet membrane receptors play a vital role in the clotting pathway and, thus, the aim of this work is to establish a method to elucidate the interactions, clustering, and reorganization of involved membrane receptors such as GPIIb/IIIa and GPIX as part of the GPIb-IX-V complex. The special challenges regarding visualizing membrane receptor interactions on blood platelets are the high abundancy of the first and the small size of the latter (1—3µm of diameter). The resolution limit of conventional fluorescence microscopy and even super-resolution approaches prevents the successful differentiation of densely packed receptors from one another. Here, this issue is approached with the combination of a recently developed technique called Expansion Microscopy (ExM). The image resolution of a conventional fluorescence microscope is enhanced by simply enlarging the sample physically and thus pulling the receptors apart from each other. This method requires a complex sample preparation and holds lots of obstacles such as variable or anisotropic expansion and low images contrast. To increase ExM accuracy and sensitivity for interrogating blood platelets, it needs optimized sample preparation as well as image analysis pipelines which are the main part of this thesis. The colocalization results show that either fourfold or tenfold expanded, resting platelets allow a clear distinction between dependent, clustered, and independent receptor organizations compared to unexpanded platelets.Combining dual-color Expansion and confocal fluorescence microscopy enables to image in the nanometer range identifying GPIIb/IIIa clustering in resting platelets – a pattern that may play a key role in the clotting pathway
N2  - Schlaganfall und Myokardinfarkt sind die wohl bekanntesten und schwerwiegendsten Folgen von pathologischer Thrombenbildung. Zur Vorbeugung und/oder Behandlung thrombotischer Ereignisse gibt es eine Vielzahl von Antiplättchen-Medikamenten wie Aspirin oder Plavix, denen allerdings eine Nebenwirkung gemein ist: das unerwünschte, erhöhte Blutungsrisiko. Um Medikamente zu entwickeln, die tatsächlich nur den Aggregationsprozess unterbinden, die generelle Blutstillung jedoch nicht unterbinden, ist es entscheidend, eine detaillierte Vorstellung der Signalkaskade der Plättchenadhesion und -aktivierung zu bekommen. Da diese bisher noch nicht vollständig verstanden wurde, soll eine Methode zur Aufklärung schneller Wechselwirkungen, Clusterbildung und Reorganisation von Plättchenrezeptoren wie GPIIb/IIIa und GPIX, als Teil des Rezeptorkomplex GPIb-IX-V, etabliert werden. Die besonderen Herausforderungen bei der Visualisierung von Wechselwirkungen von Membranrezeptoren auf Blutplättchen sind sowohl ihre hohe Dichte als auch die geringe Größe der Blutplättchen (1–3μm Durchmesser). Die Auflösungsgrenze der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie sowie der superhochauflösenden-Mikroskopie ist nicht in der Lage dicht gepackte Rezeptoren voneinander zu unterscheiden. Eine kürzlich entwickelte Technik namens Expansionsmikroskopie (ExM) bietet hierfür einen Lösungsansatz: Die Bildauflösung von einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop wird dadurch verbessert, dass Proben physikalisch vergrößert werden, sodass markierte Rezeptoren auseinanderdriften und besser voneinander unterschieden werden können. Dieses Verfahren erfordert eine komplexe Probenvorbereitung und birgt viele Unsicherheiten wie die Variabilität des Expansionsfaktors, die Isotropie des Expansionsprozesses sowie das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis in den mikroskopischen Bildern. Um die Genauigkeit und Empfindlichkeit des Ansatzes auf seine Tauglichkeit zur Untersuchung nicht-aktivierter Blutplättchen zu überprüfen, wurde ein Arbeitsablauf für die optimale Probenvorbereitung entwickelt sowie auf wichtige Analysekriterien für die Kolokalisationsanalyse hingewiesen, welches den Hauptteil dieser Arbeit darstellt. Die Ergebnisse der Kolokalisationsanalyse zeigen, dass die vier– beziehungsweise zehnfache Expansion ruhender Blutplättchen eine eindeutige Unterscheidung zwischen abhängigen, geclusterten und unabhängigen Rezeptororganisationen im Vergleich zu nicht expandierten Blutplättchen erlaubt. Die Kombination aus ExM und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie ermöglichte die Identifizierung von Clustern der GPIIb/IIIa-Rezeptoren in ruhenden Blutplättchen – ein Vorgang, der möglicherweise eine Schlüsselrolle in der Plättchenaggregation spielt.
KW  - Expansion Microscopy
KW  - platelets
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-300317
ER  - 
TY  - THES
A1  - Trinks, Nora Isabel
T1  - Super-resolution fluorescence microscopic visualization and analysis of interactions between human immune cells and \(Aspergillus\) \(fumigatus\)
T1  - Hochaufgelöste, fluoreszenzmikroskopische Visualisierung und Analyse der Interaktionen zwischen humanen Immunzellen und \(Aspergillus\) \(fumigatus\)
N2  - The mold Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is known as human pathogen and can cause life-threatening infections in humans with a weakened immune system. This is a known complication in patients receiving glucocorticoids, e.g. after hematopoietic stem cell transplantation or solid organ transplantation. Although research in the field of immune cell/fungus interaction has discovered key strategies how immune cells fight against infectious fungi, our knowledge is still incomplete. In order to develop effective treatment options against fungal infections, a detailed understanding of their interactions is crucial. Thus, visualization of immune cell and fungus is an excellent approach to gain further knowledge. For a detailed view of such interaction processes, a high optical resolution on nanometer scale is required. There is a variety of super resolution microscopy techniques, enabling fluorescence imaging beyond the diffraction limit. This work combines the use of three complementary super resolution microscopy techniques, in order to study immune cell/fungus interaction from different points of view.
Aim of this work is the introduction of the recently invented imaging technique named expansion microscopy (ExM) for the study of immune cell/fungus interactions. The core aspect of this method is the physical magnification of the specimen, which increases the distance between protein structures that are close to each other and which can therefore be imaged separately.
The simultaneous magnification of primary human natural killer (NK) cells and A. fumigatus hyphae was established in this work using ExM. Reorganization of cytoskeletal components of interacting NK cells was demonstrated here, by expansion of the immunological synapse (IS), formed between NK cells and A. fumigatus. In addition, reorganization of the microtubule-organizing center (MTOC) towards fungal hyphae and an accumulation of actin at the IS has been observed. Furthermore, ExM has been used to visualize lytic granules of NK cells after degranulation. After magnification of the specimen, lysosome associated protein 1 (LAMP1) was shown to surround perforin. In absence of the plasma membrane-exposed degranulation marker LAMP1, a “ring-shaped” structure was often observed for fluorescently labeled perforin. Volume calculation of lytic granules demonstrated the benefit of ExM. Compared to pre-expansion images, analyses of post-expansion images showed two volume distributions for degranulated and non-degranulated NK cells. In addition, this work emphasizes the importance of determining the expansion factor for a structure in each species, as variations of expansion factors have been observed. This factor, as well as possible sample distortions should be considered, when ExM is used in order to analyze the interaction between two species.
A second focus of this work is the visualization of a chimeric antigen receptor (CAR), targeting an epitope on the cell wall of A. fumigatus. Structured illumination microscopy (SIM) revealed that the CAR is part of the immunological synapse of primary human CAR T cells and CAR-NK-92 cells. At the interaction site, an accumulation of the CAR was observed, as well as the presence of perforin. CAR accumulation at fungal hyphae was further demonstrated by automated live cell imaging of interacting CAR-NK-92 cells, expressing a fluorescent fusion protein.
Additionally, the use of direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) gave first insights in CAR expression levels on the basal membrane of CAR-NK-92 cells, with single molecule sensitivity. CAR cluster analyses displayed a heterogeneous CAR density on the basal membrane of transfected NK 92 cells.
In summary, this work provides insights into the application of ExM for studying the interaction of primary human NK cells and A. fumigatus for the first time. Furthermore, this thesis presents first insights regarding the characterization of an A. fumigatus-targeting CAR, by applying super-resolution fluorescence microscopy, like SIM and dSTORM.
N2  - Der Schimmelpilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist bekannt als Humanpathogen und kann lebensbedrohliche Infektionen bei Menschen mit einem geschwächten Immunsystem verursachen. Dies ist eine bekannte Komplikation bei Patienten die Glucocorticoide erhalten, z.B. nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation oder soliden Organtransplantation. Obwohl die Forschung im Bereich der Immunzelle/Pilz Interaktion Schlüsselstrategien entdeckt hat, wie Immunzellen infektiöse Pilze bekämpfen, ist unser Wissen immer noch unvollständig. Um effektive Therapieoptionen gegen Pilzinfektionen zu entwickeln, ist ein detailliertes Verständnis ihrer Interaktionen äußerst wichtig. Die Visualisierung von Immunzelle und Pilz ist daher ein exzellenter Ansatz um weitere Erkenntnisse zu gewinnen. Für einen detaillierten Einblick in solche Interaktionsprozesse ist eine hohe optische Auflösung im Nanometerbereich erforderlich. Hierzu gibt es eine Vielzahl an hochauflösenden Mikroskopietechniken, die es ermöglichen, Fluoreszenzbildgebung jenseits der Beugungsbegrenzung zu erzielen. Diese Arbeit kombiniert die Nutzung von drei sich ergänzenden hochauflösenden Mikroskopietechniken, um die Interaktion von Immunzelle/Pilz aus verschiedenen Blickwinkeln zu studieren.
Ziel dieser Arbeit ist das Einführen der kürzlich entwickelten Bildgebungsmethode, namens Expansions-Mikroskopie (engl. expansion microscopy, kurz: ExM), um Immunzelle/Pilz Interaktionen zu studieren. Kernaspekt dieser Methode ist die physische Vergrößerung der Probe, wodurch der Abstand zwischen nahe beieinanderliegenden Proteinstrukturen vergrößert wird und diese daher separiert aufgenommen werden können.
Die simultane Vergrößerung von primären humanen Natürlichen Killerzellen (engl. Natural Killer, kurz: NK) und A. fumigatus Hyphen wurde in dieser Arbeit mittels ExM etabliert. Durch Expansion der Immunologischen Synapse (engl. immunological synapse, kurz: IS), ausgebildet zwischen NK Zellen und A. fumigatus, konnte hier die Reorganisation von Bestandteilen des Zytoskeletts interagierender NK Zellen gezeigt werden. Darüber hinaus konnte eine Reorganisation des Mikrotubuli-organisierenden Zentrums (engl. microtubule-organizing center, kurz: MTOC) in Richtung Pilzhyphen, sowie eine Anreicherung von Aktin an der IS beobachtet werden. Außerdem konnte ExM genutzt werden, um lytische Granula von NK Zellen nach Degranulation zu visualisieren. Für das Lysosom-assoziierte Membranprotein 1 (engl. lysosome-associated protein 1, kurz: LAMP1) konnte nach Vergrößerung der Probe gezeigt werden, dass es Perforin umgibt. Unter Abwesenheit des Plasmamembran-exponierten Degranulations-Markers LAMP1 wurde oft eine „ringförmige“ Struktur für fluoreszenzmarkiertes Perforin beobachtet. Die Volumen Berechnung von lytischen Granula demonstrierte den Nutzen der ExM. Im Vergleich zu Analysen von Bildern vor Expansion, zeigten Analysen von Bildern nach Expansion zwei Verteilungen für die Volumengröße degranulierter und nicht-degranulierter NK Zellen. Zusätzlich unterstreicht diese Arbeit die Wichtigkeit, den Expansionsfaktor für eine Struktur aus jeder Spezies zu bestimmen, da Variationen für Expansionsfaktoren beobachtet wurden. Dieser Faktor sollte ebenso wie mögliche Proben-Deformationen in Betracht gezogen werden, wenn ExM genutzt wird, um die Interaktion zwischen zwei Spezies zu analysieren.
Ein zweiter Fokus dieser Arbeit ist die Visualisierung eines chimärischen Antigenrezeptors (engl. chimeric antigen receptor, kurz: CAR), der ein Epitop auf der Zellwand von A. fumigatus erkennt. Strukturierte Beleuchtungs-Mikroskopie (engl. structured illumination microscopy, kurz: SIM) zeigte, dass der CAR Teil der Immunologischen Synapse von primären CAR-T Zellen und CAR-NK-92 Zellen ist. Eine Anreicherung des CARs, an der Interaktionsseite wurde beobachtet, so wie das Vorhandensein von Perforin. Die Anreicherung vom CAR an der Pilz-Hyphe wurde ferner durch automatisierte Lebend-Zell-Bildgebung interagierender CAR-NK-92 Zellen demonstriert, die ein fluoreszierendes Fusionsprotein exprimieren.
Zusätzlich lieferte das Nutzen von direkter stochastischer optischer Rekonstruktions-Mikroskopie (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy, kurz: dSTORM) erste Einblicke in CAR Expressionslevel auf der basalen Membran von CAR-NK-92 Zellen, mit Einzelmolekül Empfindlichkeit. CAR Cluster Analysen zeigten eine heterogene CAR Dichte auf der basalen Membran transfizierter NK-92 Zellen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit erstmals Einblicke in die Anwendung von ExM für die Untersuchung der Interaktion von primären humanen NK Zellen und A. fumigatus liefert. Zudem präsentiert die Thesis erste Einblicke hinsichtlich der Charakterisierung eines A. fumigatus-erkennenden CARs, unter Anwendung von hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie, wie SIM oder dSTORM.
KW  - Mikroskopie
KW  - Konfokale Mikroskopie
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Aspergillus fumigatus
KW  - Natürliche Killerzelle
KW  - Expansion Microscopy
KW  - Structured Illumination Microscopy
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266407
ER  -