TY - THES A1 - Adler, Melanie T1 - New approaches to improve prediction of drug-induced liver injury T1 - Neue Ansätze zur verbesserten Vorhersage arzneimittelinduzierter Leberschäden N2 - Das häufige Scheitern neuer Arzneistoffkandidaten aufgrund von Lebertoxizität in präklinischen und klinischen Studien stellt ein erhebliches Problem in der Entwicklung von neuen Arzneimitteln dar. Deshalb ist es wichtig, neue Ansätze zu entwickeln, mit deren Hilfe unerwünschte Wirkungen von Arzneimitteln früher und zuverlässiger erkannt werden können. Um die Vorhersage von Lebertoxizität in präklinischen Studien zu verbessern, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei wesentliche Ansätze gewählt: 1) die Evaluierung neuer Biomarker, durch die Lebertoxizität zuverlässiger und empfindlicher detektiert werden könnte und 2.) wirkmechanistische Untersuchungen mittels Toxcicogenomics für ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der Arzneimittel-induzierten Toxizität. Ein Ziel dieser Arbeit war, die Fähigkeit einiger neuer potenzieller Biomarker (NGAL, Thiostatin, Clusterin und PON1) zu bewerten, Arzmeimittel-induzierte Lebertoxizität in Ratten frühzeitig zu erkennen. Die Ergebnisse zeigen, dass PON1 und Clusterin infolge eines durch die verabreichten Arzneistoffkandidaten verursachten Leberschadens nicht konsistent verändert waren. Diese beiden Marker sind daher, verglichen mit bestehenden klinisch-chemischen Markern, nicht für eine sichere Vorhersage von Arzneistoff-induzierten Leberschäden geeignet. Bei Thiostatin und NGAL zeigte sich hingegen ein zeit- und dosisabhängiger Anstieg im Serum und Urin behandelter Tiere. Diese Veränderungen, die gut mit der mRNA Expression im Zielorgan übereinstimmten, korrelierten mit dem Schweregrad der Arzneistoff-induzierten Leberschäden. Die Analyse mittels ROC zeigte, Thiostatin im Serum, nicht aber NGAL, ein besserer Indikator für Arzneimittel-induzierte hepatobiliäre Schäden ist als die routinemäßig verwendeten klinische-chemischen Marker, wie z.B. die Leberenzyme ALP, ALT und AST. Thiostatin wird jedoch als Akute-Phase-Protein in einer Vielzahl von Geweben exprimiert und kann somit nicht spezifisch als Lebermarker betrachtet werden. Dennoch zeigen unsere Ergebnisse, dass Thiostatin als sensitiver, minimal-invasiver diagnostischer Marker für Entzündungsprozesse und Gewebeschäden eine sinnvolle Ergänzung in der präklinischen Testung auf Lebertoxizität darstellt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mittels RNA-Interferenz das pharmakologische Target des Arzneistoffkandidaten BAY16, der Glukagonrezeptor, auf mRNA-Ebene gehemmt und anhand von Genexpressionsanalysen untersucht, ob die pharmakologisch-bedingte Modulation des Glukagonrezeptors eine Rolle in der Toxizität von BAY16 spielt. Desweiteren sollten diese Arbeiten Aufschluss geben, welche molekularen Veränderungen auf die pharmakologische Wirkung des Arzneistoffs zurückzuführen sind, und daher für den Mechanismus der Toxizität möglicherweise wenig relevant sind. Während BAY16 in Konzentrationen von 75 µM starke zytotoxische Wirkungen aufwies, hatte die siRNA vermittelte Depletion des Glukagonrezeptors keinen Einfluss auf die Vitalität primärer Rattenhepatozyten. Daraus lässt sich ableiten, dass die Hepatotoxiziät von BAY16 in vitro und in vivo nicht mit der pharmakologischen Modulation des Glukagonrezeptors assoziiert ist. Diese Ergebnisse wurden durch die Tatsache gestützt, dass die meisten der durch BAY16 induzierten Genexpressionsveränderungen unabhängig von der pharmakologischen Modulation des Glucagonrezeptors auftraten. Diese beobachteten off-target-Effekte beinhalteten Veränderungen im Fremdstoffmetabolismus, oxidativer Stress, erhöhte Fettsäuresynthese und Veränderungen im Cholesterol- und Gallensäuremetabolismus. Obwohl Veränderungen in diesen molekularen Mechanismen zum Fortschreiten eines Leberschadens beitragen können, ist es anhand dieser Daten nicht möglich einen eindeutigen Mechanismus für die Toxizität von BAY16 abzuleiten. In dieser Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass die Anwendung der siRNA-Technologie einen neuen methodischen Ansatz darstellt, um Mechanismen arzneimittelbedingter Toxizität besser verstehen zu können. N2 - The high failure rate of new drug candidates in preclinical or clinical studies due to hepatotoxicity represents a considerable problem in the drug development. Hence, there is an urgent need to develop new approaches for early and reliable prediction of drug-induced hepatotoxicity that enables a better identification of drug candidates with high potential for toxicity at early stages of drug development. Therefore, the aim of this work was to improve the prediction of drug-induced liver injury in preclinical studies through evaluation of more reliable and sensitive biomarkers of hepatotoxicity and a better understanding of the underlying mechanistic basis for drug-induced toxicity. First, the ability of a set of potential markers (NGAL, thiostatin, clusterin, PON1) to detect early signs of liver injury was assessed in rats treated with drug candidates that were dropped from further development, in part due to toxic adverse effects in the liver. In summary, PON1 and clusterin were not consistently altered in response to liver injury and thus provide no additive information to the traditional liver enzymes in detecting drug-induced hepatotoxicity. In contrast, thiostatin and NGAL were increased in serum and urine of treated animals in a time- and dose-dependent manner. These changes correlated well with mRNA expression in the target organ and generally reflected the onset and degree of drug-induced liver injury. Receiver-operating characteristics analyses supported serum thiostatin, but not NGAL, as a better indicator of drug-induced hepatobiliary injury than conventional clinical chemistry parameters, such as ALP, ALT and AST. Although thiostatin, an acute phase protein expressed in a range of tissues, may not be specific for liver injury, our results indicate that thiostatin may serve as a sensitive, minimally-invasive diagnostic marker of inflammation and tissue damage in preclinical safety assessment. In the second part of this work, combined application of genomics profiling technology and RNAi to inhibit the pharmacological target of a drug candidate BAY16, a glucagon receptor (GCGR) antagonist, was used to determine if interference with the pharmacological target plays a role in the toxic response to BAY16, and to narrow down those molecular changes that are associated with toxicity, and not the pharmacological action of BAY16. In contrast to Bay 16, which was found to be cytotoxic at concentrations of 75 µM, silencing of the glucagon receptor did not affect cell viability in primary rat hepatocytes. Thus, it can be concluded that hepatotoxicity of Bay 16 was not related to the drugs inhibitory effect on the glucagon receptor in vitro and in vivo. These findings were supported by the fact that most of BAY16-induced changes in gene expression occurred independently of the pharmacological modulation of GCGR. These off-target effects include altered xenobiotic metabolism, oxidative stress, increased fatty acid synthesis, and alterations in cholesterol and bile acid metabolic processes. Although it was not possible to draw a final conclusion about the mechanism of BAY16 hepatotoxicity, changes in these molecular mechanisms appear contribute to progression of hepatic injury. With regard to drug safety assessment in preclinical studies, the utilization of siRNA technology in vitro represents a new approach to improve mechanistic understanding of the nature of drug’s toxicity, being either chemically mediated or due to primary or secondary pharmacological mode of action. KW - Biomarker KW - Leber KW - Hepatotoxizität KW - Lebertoxizität KW - biomarker KW - liver KW - hepatotoxicity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69512 ER - TY - JOUR A1 - Haarmann, Axel A1 - Deiss, Annika A1 - Prochaska, Juergen A1 - Foerch, Christian A1 - Weksler, Babette A1 - Romero, Ignacio A1 - Couraud, Pierre-Olivier A1 - Stoll, Guido A1 - Rieckmann, Peter A1 - Buttmann, Mathias T1 - Evaluation of Soluble Junctional Adhesion Molecule-A as a Biomarker of Human Brain Endothelial Barrier Breakdown N2 - Background: An inducible release of soluble junctional adhesion molecule-A (sJAM-A) under pro-inflammatory conditions was described in cultured non-CNS endothelial cells (EC) and increased sJAM-A serum levels were found to indicate inflammation in non-CNS vascular beds. Here we studied the regulation of JAM-A expression in cultured brain EC and evaluated sJAM-A as a serum biomarker of blood-brain barrier (BBB) function. Methodology/Principal Findings: As previously reported in non-CNS EC types, pro-inflammatory stimulation of primary or immortalized (hCMEC/D3) human brain microvascular EC (HBMEC) induced a redistribution of cell-bound JAM-A on the cell surface away from tight junctions, along with a dissociation from the cytoskeleton. This was paralleled by reduced immunocytochemical staining of occludin and zonula occludens-1 as well as by increased paracellular permeability for dextran 3000. Both a self-developed ELISA test and Western blot analysis detected a constitutive sJAM-A release by HBMEC into culture supernatants, which importantly was unaffected by pro-inflammatory or hypoxia/reoxygenation challenge. Accordingly, serum levels of sJAM-A were unaltered in 14 patients with clinically active multiple sclerosis compared to 45 stable patients and remained unchanged in 13 patients with acute ischemic non-small vessel stroke over time. Conclusion: Soluble JAM-A was not suited as a biomarker of BBB breakdown in our hands. The unexpected non-inducibility of sJAM-A release at the human BBB might contribute to a particular resistance of brain EC to inflammatory stimuli, protecting the CNS compartment. KW - Biomarker KW - Gehirn Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-68468 ER - TY - THES A1 - Hahn, Tim T1 - Integrating neurobiological markers of depression: an fMRI-based pattern classification approach T1 - Integration neurobiologischer Marker depressiver Erkrankungen mittels fMRT-basierter Musterklassifikation N2 - While depressive disorders are, to date, diagnosed based on behavioral symptoms and course of illness, the interest in neurobiological markers of psychiatric disorders has grown substantially in recent years. However, current classification approaches are mainly based on data from a single biomarker, making it difficult to predict diseases such as depression which are characterized by a complex pattern of symptoms. Accordingly, none of the previously investigated single biomarkers has shown sufficient predictive power for practical application. In this work, we therefore propose an algorithm which integrates neuroimaging data associated with multiple, symptom-related neural processes relevant in depression to improve classification accuracy. First, we identified the core-symptoms of depression from standard classification systems. Then, we designed and conducted three experimental paradigms probing psychological processes known to be related to these symptoms using functional Magnetic Resonance Imaging. In order to integrate the resulting 12 high-dimensional biomarkers, we developed a multi-source pattern recognition algorithm based on a combination of Gaussian Process Classifiers and decision trees. Applying this approach to a group of 30 healthy controls and 30 depressive in-patients who were on a variety of medications and displayed varying degrees of symptom-severity allowed for high-accuracy single-subject classification. Specifically, integrating biomarkers yielded an accuracy of 83% while the best of the 12 single biomarkers alone classified a significantly lower number of subjects (72%) correctly. Thus, integrated biomarker-based classification of a heterogeneous, real-life sample resulted in accuracy comparable to the highest ever achieved in previous single biomarker research. Furthermore, investigation of the final prediction model revealed that neural activation during the processing of neutral facial expressions, large rewards, and safety cues is most relevant for over-all classification. We conclude that combining brain activation related to the core-symptoms of depression using the multi-source pattern classification approach developed in this work substantially increases classification accuracy while providing a sparse relational biomarker-model for future prediction. N2 - Während depressive Erkrankungen bislang größtenteils auf der Basis von Symptomen auf der Verhaltensebene und den jeweiligen Krankheitsverläufen diagnostiziert werden, hat das Interesse an der Verwendung neurobiologischer Marker bei psychischen Erkrankungen in den letzten Jahren stark zugenommen. Da jedoch die momentan verfügbaren Klassifikationsansätze zumeist auf Informationen eines einzelnen Biomarkers beruhen, ist die Vorhersage von auf der Symptomebene so komplexen Erkrankungen wie Depressionen in der Praxis deutlich erschwert. Dementsprechend konnte keiner der einzelnen bisher untersuchten Biomarker eine Vorhersagegüte erreichen, die für die praktische Anwendung eines solchen Ansatzes im klinischen Alltag ausreichend wäre. Vor diesem Hintergrund schlagen wir deshalb zur Verbesserung der Klassifikationsgüte einen Algorithmus vor, der Messdaten vielfältiger depressionsrelevanter neuronaler Prozesse integriert. Zunächst wurden hierzu die Kernsymptome depressiver Erkrankungen aus standardisierten Klassifikationssystemen ermittelt. Anschließend entwickelten wir drei experimentelle Paradigmen, welche die Messung neuronaler Korrelate der mit den depressiven Kernsymptomen assoziierten psychologischen Prozesse mittels funktioneller Kernspintomographie ermöglichen. Um die resultierenden 12 hochdimensionalen Biomarker zu integrieren, entwickelten wir basierend auf der Kombination von Gauß-Prozess Klassifikatoren und Entscheidungsbäumen einen zweistufigen Mustererkennungsalgorithmus für multiple, hochdimensionale Datenquellen. Dieser Ansatz wurde an einer Gruppe von 30 gesunden Probanden und 30 unterschiedlich schwer betroffenen und unterschiedlich medizierten stationären depressiven Patienten evaluiert. Insgesamt ermöglicht der Ansatz eine hohe Klassifikationsgüte auf Einzelfallebene. Insbesondere die Integration der verschiedenen Biomarker führte zu einer Klassifikationsgüte von 83%, wohingegen die alleinige Klassifikationsgüte der 12 einzelnen Biomarker mit bestenfalls 72% deutlich geringer ausfiel. Somit konnte der entwickelte Klassifikationsansatz in einer heterogenen, im Alltag aber typisch anzutreffenden depressiven Patientenstichprobe, eine Klassifikationsgüte erreichen, die mit der bislang bestmöglichen durch einzelne Biomarker erreichten Klassifikationsgüte in selektiven Einzelstichproben vergleichbar ist. Darüber hinaus zeigte die Analyse des empirischen Prädiktionsmodells, dass die Kombination der neuronalen Aktivität während der Verarbeitung von neutralen Gesichtern, großen monetären Belohnungen und Sicherheitssignalen zur optimalen Gesamtklassifikation führt. Zusammenfassend lässt sich schlussfolgern, dass der im Rahmen dieser Arbeit entwickelte, zweistufige Mustererkennungsalgorithmus für multiple, hochdimensionale Datenquellen die Klassifikationsgüte substantiell verbessert und erstmals die Konstruktion eines effizienten relationalen Biomarker-Modells für zukünftige Vorhersagen ermöglicht. KW - Patientenklassifikation KW - Depression KW - Biomarker KW - Neurobiologie KW - Algorithmus KW - Gauss Prozess Klassifikation KW - Klassifikations- und Regressionsbaum KW - Systematik KW - Automatische Klassifikation KW - Magnetische Resonanz KW - Gaussian Process Classification Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49962 ER - TY - THES A1 - Hauser, Tobias Gregor T1 - Mineralocorticoid-receptor antagonism and its metabolic consequences in haemodialysis patients T1 - Mineralkortikoidrezeptorantagonismus und seine metabolischen Folgen in Hämodialysepatienten N2 - Patients on haemodialysis are highly susceptible to different forms of heart failure. To date, the benefit of Mineralocorticoid-receptor antagonist (MRA) administration in haemodialysis patients remains subject to discussion. Biomarkers play an important role in therapy guidance and pose a promising tool to detect pathological processes of heart failure in an earlier stage. The randomised-controlled Mineralocorticoid-Receptor Antagonists in End-Stage Renal Disease (MiREnDa) trial was set up to investigate the effect of 50 mg of spironolactone once daily on left ventricular mass index in haemodialysis patients and several secondary endpoints. This dissertation reports findings from the MiREnDa trial on (a) the efficacy of spironolactone to influence serum levels of biomarkers of heart failure, fibrosis and inflammation and electrolytes and (b) the ability of N-terminal pro-B-type natriuretic peptide (NT-proBNP), Galectin-3 and soluble source of tumorigenicity 2 (sST2) to reflect left ventricular hypertrophy and diastolic dysfunction assessed by imaging characteristics. Treatment of spironolactone over a 40-week period did not alter serum levels of biomarkers of heart failure, fibrosis and inflammation including NT-proBNP, Galectin-3 and sST2. A small but significant effect on serum sodium but not potassium was observed. NT-proBNP was significantly different in the presence or absence of left ventricular hypertrophy (LVH) (normal vs. LVH (median [IQR]): 2,120 [810; 5,040] vs. 6,340 [2,410; 15,360] pg/ml, p<0.01) or moderate and severe diastolic dysfunction (DD) (normal diastolic function and DD grade I vs. DD grade II and DD grade III: 2,300 [850; 6,050] vs. 12,260 [3,340; 34,830] pg/ml, p=0.02). NT-proBNP further showed a significant correlation at baseline with LVMi (Spearman’s rho=0.41, p<0.001), LAVi (Spearman’s rho=0.55, p<0.001) and septal E/e’ (Spearman’s rho=0.45, p<0.001). No correlation was observed between Galectin-3 and the investigated functional and morphological parameters. sST2 was mildly correlated to LVMi at baseline (Spearman’s rho=0.21, p=0.05) and NT-proBNP at baseline (Spearman’s rho=0.37, p<0.001). In conclusion, spironolactone did not affect the investigated parameters but NT-proBNP proved to be significantly correlated to cardiac imaging measurements. N2 - Dialysepatienten erkranken häufig an Formen der Herzinsuffizienz. Zugleich ist der Nutzen von Mineralkortikoidrezeptorantagonisten bei Dialysepatienten bis heute umstritten. Biomarkermessungen ermöglichen es, pathologische Prozesse am Herzen in einem möglichst frühen Stadium zu erkennen. In der randomisiert-kontrollierten "Mineralocorticoid-Receptor Antagonists in End-Stage Renal Disease" (MiREnDa) Studie wurde der Effekt der täglichen Einnahme von 50 mg Spironolacton auf den linksventrikulären Massenindex bei Dialysepatienten zusammen mit verschiedenen sekundären Endpunkten untersucht. Diese Arbeit beleuchtet Ergebnisse der MiREnDa-Studie zur Wirkung von Spironolacton auf Serumspiegel von Biomarkern für Herzinsuffizienz, Fibrose und Entzündung sowie von Elektrolyten. Darüber hinaus wird der Zusammenhang zwischen N-terminalen natriuretischen Peptid Typ B (NT-proBNP), Galectin-3 und Soluble source of tumorigenicity 2 (sST2) und Veränderungen in den wichtigsten bildgebenden Merkmalen linksventrikulärer Hypertrophie und diastolischer Dysfunktion beschrieben. Die Einnahme von Spironolacton über 40 Wochen hatte keinen Effekt auf Biomarker für Herzinsuffizienz, Fibrose und Entzündung wie NT-proBNP, Galectin-3 und sST2. Lediglich die Natriumspiegel, nicht aber die Kaliumspiegel, wurden signifikant beeinflusst. NT-proBNP unterschied sich signifikant zwischen Patient*innen mit und ohne links-ventrikulärer Hypertrophie (LVH) (normal vs. LVH (Median [IQR]): 2.120 [810; 5.040] vs. 6.340 [2.410; 15.360] pg/ml, p<0,01) beziehungsweise mit und ohne relevanter diastolischer Dysfunktion (DD) (normale diastolische Funktion und DD Grad I vs. DD Grad II und DD Grad III: 2.300 [850; 6.050] vs. 12.260 [3.340; 34.830] pg/ml, p=0,02). NT-proBNP korrelierte außerdem signifikant mit LVMi (Spearman's rho=0,41, p<0,001), LAVi (Spearman's rho=0,55, p<0,001) und E/e' (Spearman's rho=0,45, p<0,001). Galectin-3 war unabhängig von allen untersuchten Parametern. sST2 korrelierte mäßig mit LVMi (Spearman's rho=0,21, p=0,05) und deutlich mit NT-proBNP (Spearman's rho=0,37, p<0,001). Zusammenfassend beeinflusste Spironolacton keinen der untersuchten Parameter relevant und lediglich NT-proBNP wies eine signifikante Korrelation zu kardialen Bildgebungsparameters auf. KW - Dialyse KW - Spironolacton KW - Biomarker KW - haemodialysis KW - spironolactone KW - biomarker Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259382 ER - TY - THES A1 - Jaud, Tobias Armin T1 - Application based personalized food choices and health sustainment: scientific background and investigation of biomarkers in human tissue specimens T1 - Gesundheitserhaltende Ernährung: Wissenschaftlicher Hintergrund einer App zur personalisierten Lebensmittelauswahl und Identifizierung von Biomarkern für die Ernährungsweise in Humangewebe N2 - Dietary fatty acids serve as objective biomarkers for the estimation of habitual diet mainly because biomarkers are free of memory bias or inaccuracies of food databases. The aim of the present work encompassed the implementation of a gas chromatographical method coupled with a mass spectrometrical and flame-ionization detector for analysis of fatty acid biomarkers in human biospecimens, their analytical determination and statistical evaluation in two different study populations and different biospecimens as well as the elaboration of adverse reactions to food ingredients with special focus on food allergies and food intolerances in the context of a possible implementation into an application for consumer health. The first aim was the identification of potential influence of fatty acid biomarkers on desaturase and elongase indexes (Δ9DI, Δ6DI, Δ5DI and ELOVLI5), which are factors in type 2 diabetes risk, in breast adipose tissue from healthy women. Influence of further variables on respective indexes was also investigated. 40 samples were investigated and potential variables were either collected by questionnaire or determined. Principle component analysis was applied for fatty acid biomarkers (PCdiet1, PCdiet2 and PCdiet3 representative for the dietary intake of vegetable oils/nuts, fish and partially hydrogenated vegetable oils), endogenous estrogens (PCE1) and oxysterols (PCOxy1). Multiple linear regression models were applied. Δ9DI and Δ6DI were influenced non-significantly and significantly negatively by PCdiet2 supporting a putative beneficial effect of vegetable oils and nuts on type 2 diabetes risk factors. ELOVLI5 and Δ5DI were influenced significantly and non-significantly positively by PCdiet1 supporting a putative beneficial effect of fish consumption on type 2 diabetes risk factors. On the other hand, PCdiet1 also significantly and non-significantly positively influenced Δ9DI and Δ6DI supporting a putative adverse effect of fish biomarkers on type 2 diabetes risk factors. The opposing influences of PCdiet1 suggesting an ambivalent role of dietary intake of fish on investigated indexes. Δ6DI was significantly positively influenced by PCdiet3 and number of pregnancies supporting a putative adverse effect of partially hydrogenated vegetable oils and pregnancies on type 2 diabetes risk factors. Lifestyle factors like smoking significantly and non-significantly influenced Δ9DI and Δ6DI putatively adversely. Δ5DI was influenced significantly positively by estrogen active drugs suggesting a putative beneficial effect on type 2 diabetes risk factors. It must be considered that a variation coefficient of up to 0.44 only explained 44% of variance of the respective indexes, suggesting other influencing factors might play a role. The second aim was the implementation of a gas chromatographical method coupled with a mass spectrometrical and flame-ionization detector for analysis of fatty acid biomarkers in human biospecimens. The method was optimized for separation and detection of 40 fatty acids. Mean recovery for tridecanoic acid was x(tridecanoic acid) = 90.51% and for nonadecanoic acid x(nonadecanoic acid) = 96.21%. Thus, there was no significant loss of fatty acids with shorter and longer carbon chains over the extraction process to be expected. Limit of detections were calculated in adipose tissue samples and ranged from 0.007 to 0.077% of the proportion of the respective fatty acid to total fatty acids. The third aim was the investigation if differentiation between breast glandular and adipose tissue had a relevant impact on the analysis of dietary fatty acid biomarkers or if contamination of breast glandular with breast adipose tissue and vice versa was neglectable for the analysis of dietary fatty acid biomarkers. No statistical significant differences were observed for all investigated fatty acid biomarkers (pentadecanoic-, heptadecanoic-, trans palmitoleic-, eicosapentaenoic-, docosahexaenoic-, linoleic and α-linolenic acid) between breast glandular and adipose tissue. Thus, differentiation between breast glandular and adipose tissue seems not to be necessary for the analysis of fatty acids serving as biomarkers for the intake of specific food groups. Potential influence of mixed breast tissue on fatty acid biomarkers analysis seems to be neglectable. The fourth aim was the determination of fatty acid biomarkers in adipose tissue in another study population from healthy participants. 27 adipose tissue samples were analyzed. Milk and ruminant fat biomarkers exhibited proportions of 0.47% for pentadecanoic acid, 0.34% for heptadecanoic acid and 0.25% for trans palmitoleic acid. Fish fatty acid biomarkers revealed proportions of 0.034% for eicosapentaenoic acid and 0.061% for docosahexaenoic acid. The mean proportion of vegetable oils and nuts biomarkers were 9.58% for linoleic acid and 0.48% for α-linolenic acid in all adipose tissues. Principle component analysis was applied for the fatty acid biomarkers to provide objective markers of habitual diet for this study population. PCdiet1 was mainly characterized by pentadecanoic acid, heptadecanoic acid and trans palmitoleic acid and therefore served as a principle component for the dietary intake of milk and ruminant fat. PCdiet2 and PCdiet3 only exhibited pattern for ω3 and ω6 fatty acids but not for dietary intake of specific food groups and could therefore not used as objective marker. PCdiet1, 2 and 3 explained 82.76% of variance. The last aim of this thesis was the elaboration of adverse reactions to food ingredients with special focus on food allergies and food intolerances in the context of a possible implementation into an application for consumer health. Scientific information on adverse reactions to food ingredients and trigger substances was provided in this thesis and possible implementation strategies were evaluated. For food allergens, which have regulatory requirements in the context of labelling, a strategy was elaborated, where it is necessary to provide information on the list of ingredients, the nexus ’contain’ and the respective food allergen as well as information on the name of the product. For food intolerances, which do not have regulatory requirements, limits were shown in the context of the application. If the elaborated food intolerances shall be implemented into the application, a professional dietary concept has to be developed for every food intolerance because of the complexity of the implementation. N2 - Die vorliegende Arbeit umfasste die Implementierung einer analytischen Methode zur Bestimmung von Fettsäurebiomarkern in unterschiedlichen Bioproben, die analytische Bestimmung und statistische Evaluation von Fettsäurebiomarkern in zwei Studienpopulationen und unterschiedlichen Bioproben sowie die Ausarbeitung und Bereitstellung wissenschaftlicher Information zu adversen Reaktionen von Lebensmittelzutaten mit besonderem Fokus auf Nahrungsmittelallergien sowie Nahrungsmittelunverträglichkeiten im Kontext einer strategischen Implementierung dieser adversen Reaktionen in eine Applikation im Sinne des Verbraucherschutzes. Das erste Ziel war die Identifizierung von potentiellen Einflüssen durch Fettsäurebiomarker der Ernährung auf Desaturase- und Elongase-Indices (Δ9DI, Δ6DI, Δ5DI, ELOVLI5), welche Einflussfaktoren auf das Typ 2 Diabetes Risiko darstellen, in Brustfettgewebe von gesunden Frauen. Der potentielle Einfluss von weiteren Variablen auf Desaturase- und Elongase-Indices wurde ebenfalls untersucht. 40 Proben wurden untersucht und potentielle Variablen sowohl mithilfe eines Fragebogens erhoben als auch analytisch ermittelt. Hauptkomponentenanalysen wurden für Fettsäurebiomarker (PCdiet1, PCdiet2 und PCdiet3 repräsentativ für eine Ernährung reich an pflanzlichen Ölen/Nüssen, Fisch und gehärteten Ölen), endogene Estrogene (PCE1) und Oxysterole (PCOxy1) angewendet. Potentielle Einflussfaktoren wurden mittels multiple linearer Regressionsanalyse ermittelt. Δ9DI und Δ6DI wurden nicht-signifikant und signifikant durch PCdiet2 beeinflusst. Dies unterstützt einen möglicherweise vorteilhaften Effekt von Fettsäurebiomarkern repräsentativ für die Aufnahme von pflanzlichen Ölen und Nüssen auf Typ 2 Diabetes Risikofaktoren. PCdiet1 hatte einen möglicherweise vorteilhaften signifikanten und nicht-signifikanten Einfluss auf ELOVLI5 und Δ5DI. Auf der anderen Seite hatte PCdiet1 einen möglicherweise adversen signifikanten Einfluss auf Δ9DI und Δ6DI, was auf eine ambivalente Rolle von Fettsäurebiomarkern des Fischkonsums hindeutet. Möglicherweise adverse signifikante Einflüsse auf Δ6DI hatten PCdiet3 sowie die Anzahl an Schwangerschaften. Rauchen hatte einen signifikanten und nicht-signifikanten möglicherweise adversen Einfluss auf Δ9DI und Δ6DI. Einen möglicherweise vorteilhaften Einfluss auf ELOVLI5 wurde mit der Einnahme von estrogenaktiven Substanzen beobachtet. Berücksichtigt werden muss allerdings, dass mit einem Variationskoeffizienten von bis zu 0.44 nur 44% der Varianz der entsprechenden Indices erklärt werden konnte und somit weitere Einflussfaktoren eine Rolle spielen könnten. Das zweite Ziel war die Implementierung einer gaschromatographischen Methode für die Trennung und Detektion von 40 Fettsäuren. Die Chromatographie war simultan an einen Massenspektrometer und einen Flammenionisationsdetektor gekoppelt. Recovery Versuche zeigten für die Internen Standards Tridecansäure und Nonadecansäure Wiederfindungs raten von x(Tridecansäure) = 90.51% und x(Nonadecansäure) = 96.21%. Die Nachweisgrenzen der Fettsäuren wurden mit Fettgewebsproben bestimmt und reichten von 0.007 bis 0.077% Anteil der jeweiligen Fettsäuren an der Gesamtfettsäureverteilung. Die Untersuchung der Fragestellung ob die Differenzierung zwischen Brustdrüsen- und Brustfettgewebe einen relevanten Einfluss auf die Analyse von Fettsäurebiomarkern repräsentativ für eine Ernährung reich an Milch, Fisch und pflanzlichen Ölen/Nüssen hat war das dritte Ziel der vorliegenden Arbeit. Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den prozentualen Anteilen der Fettsäurebiomarkern (Pentadecan-, Heptadecan-, trans Palmitolein-, Eicosapentaen-, Docosahexaen-, Linol- und α-Linolensäure) in Brustdrüsen und Brustfettgewebe entdeckt. Eine Differenzierung zwischen Brustdrüsen- und Brustfettgewebe scheint daher in Bezug auf die Analyse von Fettsäurebiomarker der Ernährung nicht notwendig zu sein. Der potentielle Einfluss von, mit Brustdrüsen- und Brustfettgewebe, gemischtem Gewebe scheint damit in Bezug auf die Analyse von Fettsäurebiomarkern vernachlässigbar zu sein. Das vierte Ziel der vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der Fettsäureverteilung mit besonderem Fokus auf Fettsäurebiomarker für die Ernährung in Fettgewebe in einer anderen Studienpopulation von gesunden Teilnehmerinnen und Teilnehmern. 27 Fettgewebsproben wurde untersucht. Der Anteil an Fettsäurebiomarker für den Konsum von Milch- und Wiederkäuerfette betrug 0.47% für Pentadecansäure, 0.34% für Heptadecansäure und 0.25% für trans Palmitoleinsäure. Fettsäurebiomarker repräsentativ für Fischkonsum hatten Anteile von 0.034% für Eicosapentaensäure und 0.061% für Docosahexaensäure. Für Fettsäurebiomarker repräsentativ für den Konsum von pflanzlichen Fetten und Nüssen wurden Anteile von 9.58% für Linolsäure und 0.48% für α-Linolensäure gefunden. Anschließend wurde eine Hauptkomponentenanalyse der Fettsäurebiomarker für die Ernährung durchgeführt. PCdiet1 wurde hauptsächlich durch Pentadecansäure, Heptadecansäure und trans Palmitoleinsäure charakterisiert. PCdiet1 wurde folglich als Hauptkomponente für den Konsum von Milch- und Wiederkäuerfetten interpretiert. PCdiet2 und PCdiet3 wurden ausschließlich von ω3 und ω6 Fettsäuren charakterisiert. Eine eindeutige Zuordnung zu speziellen Lebensmittelgruppen war nicht möglich. Die Biomarker für den Konsum von Fisch und pflanzlichen Fetten sowie Nüssen können daher nicht durch PCdiet2 und PCdiet3 zusammengefasst werden. PCdiet1, 2 und 3 erklärten 82.76% der Varianz. Das letzte Ziel der vorliegenden Arbeit war die Ausarbeitung von adversen Reaktionen gegenüber Lebensmittelinhaltsstoffen mit speziellem Fokus auf Nahrungsmittelallergien und Nahrungsmittelunverträglichkeiten im Kontext einer möglichen Implementierung in eine Applikation im Sinne des Verbraucherschutzes. Hierfür wurden wissenschaftliche Informationen zu adversen Reaktionen gegenüber Lebensmittelinhaltsstoffen und potentiellen Triggersubstanzen zusammengetragen und mögliche Implementierungsstrategien evaluiert. Für Nahrungsmittelallergene, welche spezielle regulatorische Voraussetzungen im Sinne von Beschriftung und Deklaration besitzen, wurde eine Strategie ausgearbeitet, welche die Notwendigkeit der Informationen von Zutatenliste, der Verknüpfung der Signalwörter ’enthält’ und dem entsprechenden Allergen wie auch den Namen des Produktes beinhaltet. Zutaten und Inhaltsstoffe, die Nahrungsmittelunverträglichkeiten hervorrufen können, haben keine speziellen regulatorischen Voraussetzungen. Limitierungen einer möglichen Implementierung von Nahrungsmittelunverträglichkeiten in die Applikation wurden im Rahmen dieser Arbeit aufgezeigt. Aufgrund der Komplexizität der Implementierung einer jeder einzelnen Nahrungsmittelunverträglichkeit in die Applikation sollte für jede einzelne ausgewählte Unverträglichkeit ein individuelles Konzept entwickelt werden. KW - Lebensmittelchemie KW - Massenspektrometrie KW - Biomarker KW - Gaschromatographie KW - Masspectrometry KW - Biomarker KW - Gas chromatography Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-298646 ER - TY - THES A1 - Kuzkina, Anastasia T1 - Dermal α-synuclein oligomers and aggregates in Parkinson’s disease T1 - Nachweis von Alpha-Synuclein-Oligomeren und -Aggregaten in Hautbiopsien von Parkinson-Patienten N2 - Lewy bodies and Lewy neurites are neuropathological hallmarks of Parkinson’s disease (PD). These depositions in the brain mostly consist of aggregated α-synuclein (α-syn) phosphorylated at Ser129. A number of studies reported detection of phosphorylated α-syn (p-α-syn) in the dermal nerve fibers in Parkinson’s disease. The objective of this study was to investigate whether pathological α-syn accumulations detected in the skin represent aggregated protein. A number of methods aimed at detecting α-syn oligomers and aggregates were first tested and optimized on the brain samples in PD and normal control. These methods included proximity ligation assay (PLA), PET-blot, immunohistochemical (IHC) stains with α-syn aggregate (5G4) or oligomer specific (ASyO5) antibodies and a stain against native α-syn (syn211) after proteinase K (PK) digestion. Subsequently, the most specific methods (stains with 5G4, ASyO5 and syn211 after PK digestion) were studied in two separate patient and control cohorts. Anti-p-α-syn stain was performed in parallel. Single sections from at least 2 biopsy sites from 44 patients and 22 controls (cohort 1) as well as serial sections of 4 biopsy sites from 27 patients and 5 controls (cohort 2) were systematically studied for presence of aggregated and oligomeric α-syn. In total, 5G4 positive deposits were found in 24% (cohort 1) and 37% (cohort 2), ASyO5 positive lesions in 17,7% (cohort 1) and 33% (cohort 2), syn211 positive lesions after PK digestion in 38,7% (cohort 1) and 48% (cohort 2) of cases. There was a major overlap among positivity for a particular staining on the patient level and in most cases, the same nerve fiber was found to be positive for all 4 markers in neighboring sections. Among the skin biopsies which contained p-α-syn accumulation, 59% were also PK resistant, 41% were 5G4 positive and 45% were ASyO5 positive. The samples belonging to normal controls did not show any positive signal in either of the newly established stainings or in the anti-p-α-syn staining. Using 3 distinct IHC methods, α-syn oligomers and aggregates were detectable in the majority of p-α-syn positive skin biopsies. This finding supports the hypothesis that α-syn aggregation occurs in the peripheral (i.e. dermal) nerves and can be specifically detected using skin biopsy. N2 - Die neuropathologischen Kennzeichen des Morbus Parkinson sind Lewy-Körperchen und Lewy-Neuriten. Diese Ablagerungen im Gehirn bestehen hauptsächlich aus aggregiertem α-Synuclein (α-Syn), das am Ser129 phosphoryliert ist. Mehrere Studien konnten zeigen, dass phosphoryliertes α-Syn (p-α-Syn) auch in Nervenfasern der Haut von Parkinsonpatienten nachweisbar ist. Das Ziel dieser Arbeit war, zu untersuchen, ob es sich bei den pathologischen Ablagerungen von p-α-Syn in der Haut wie im Gehirn um Aggregate handelt. Mehrere Methoden, die dem Nachweis von α-Syn-Oligomere und Aggregate dienen, wurden zuerst an Gehirnen von einem Parkinsonpatienten und Normalkontrolle getestet und optimiert, darunter: Proximity Ligation Assay (PLA), PET-Blot, immunhistochemische Färbungen mit α-Syn-Aggregat- (5G4) oder Oligomer-spezifischen Antikörper (ASyO5) und eine Färbung mit einem Antikörper gegen natives α-Syn (syn211) nach Verdau mit Proteinase K (PK). Danach wurden die spezifischsten Methoden (Färbung mit 5G4, ASyO5 und syn211 nach PK-Verdau) an den Hautstanzbiopsien von zwei Patienten- und Normalkontrollkohorten untersucht. Parallel wurde in den Biopsien das p-α-Syn angefärbt. Einzelschnitte von je mind. 2 Biopsiestellen von 44 Patienten und 22 Kontrollen (Kohorte 1) sowie Serienschnitte von je 4 Biopsiestellen von 27 Patienten und 5 Kontrollen (Kohorte 2) wurden systematisch nach Vorliegen von aggregierten und oligomerischen α-Syn untersucht. Zusammenfassend, wurden 5G4-positive Ablagerungen in 24% (Kohorte 1) und 37% (2. Kohorte), ASyO5-positive Läsionen in 17,7% (Kohorte 1) und 33% (Kohorte 2), syn211-positive Läsionen nach PK-Verdau in 38,7% (Kohorte 1) und 48% (Kohorte 2) der Fälle gefunden. Das p-α-Syn wurde entsprechend in 43,6% und 48% der Fälle detektiert. Es zeigte sich die Tendenz, dass Patienten, bei denen p-α-Syn nachweisbar war, auch für mehrere der neuen Marker positiv waren; auch häufig waren für alle 4 Marker positive Nervenfasern in naheliegenden Schnitte zu sehen, was für eine Kolokalisation spricht. Unter den Hautbiopsien, in den p-α-Syn-Ablagerungen zu sehen waren, hatten 59% gleichzeitig PK-resistente, 41% 5G4- und 45% ASyO5-positive Ablagerungen. Bei Kontrollen waren Ablagerungen weder mit den neu eingeführten Methoden noch mit anti-p-α-Syn-Färbung detektierbar. Mit Hilfe von drei unterschiedlichen immunhistochemischen Methoden waren Oligomere und Aggregate vom α-Syn im Großteil der p-α-Syn-positiven Hautbiopsien nachweisbar. Dieser Befund unterstützt die Hypothese, dass die Ablagerung von α-Syn-Aggregaten auch in peripheren (v.a. dermalen) Nerven vorkommt und spezifisch nachgewiesen werden kann. KW - Parkinson-Krankheit KW - Biomarker KW - Haut KW - Biopsie KW - parkinson's disease KW - skin biopsy KW - alpha-synuclein KW - biomarker Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204369 ER - TY - THES A1 - Nube, Jacqueline Sui Lin T1 - Comparative Analysis of Vaccinia Virus-Encoded Markers Reflecting Actual Viral Titres in Oncolytic Virotherapy T1 - Vergleichende Analyse von Vaccinia Virus-Kodierten Markern in Zusammenhang mit den viralem Titre in der onkolytischen Virotherapie N2 - Using viruses to treat cancer is a novel approach to an age-old disease. Oncolytic viruses are native or recombinant viruses that have the innate or enhanced capability to infect tumour cells, replicate within the tumour microenvironment and subsequently lyse those cells. One representative, the vaccinia virus (VACV), belongs to the orthopoxvirus genus of the Poxviridae family. GLV-1h68, a recombinant and attenuated vaccinia virus devel- oped by the Genelux Corporation, is a member of this family currently being tested in various phase I/II clinical trials under the name GL-ONC1. It has been shown to specif- ically replicate in tumour cells while sparing healthy tissue and to metabolise prodrug at or transport immunological payloads to the site of affliction. Since imaging modalities offer little insight into viral replication deep within the body, and because oncolytic virotherapy is dependent on replication within the target tissue, the need for a monitoring system is evident. Pharmacokinetic analysis of this oncolytic agent was to give insight into the dynamics present in tumours during treatment. This, in turn, would give clinicians the opportunity to monitor the efficacy as early as possible after the onset of treatment, to observe treatment progression and possibly to gauge prognosis, without resorting to invasive procedures, e.g. biopsies. A criteria for viable biomarkers was that it had to be directly dependent on viral replica- tion. Ideally, a marker for treatment efficacy would be specific to the treatment modality, not necessarily the treatment type. Such a marker would be highly detectable (high sen- sitivity), specific for the treatment (high specificity), and present in an easily obtained specimen (blood). Taking this into consideration, the biomarkers were chosen for their potential to be indicators of viral replication. Thus, the biomarkers analysed in this thesis are: the native proteins expressed by the viral genes A27L and B5R, the virally encoded recombinant proteins β-galactosidase, β-glucuronidase, green fluorescent protein (GFP), carboxypeptidase G2 (CPG2) and carcinoembryonic antigen (CEA). Each marker is under the control of one of five different promoters present. All recombinant viruses used in this thesis express A27L, B5R, GFP and β-glucuronidase and all are derived from the parental virus GLV-1h68. In addition to these markers, GLV-1h68 expresses β-galactosidase; GLV-1h181 expresses CPG2. [...] N2 - Onkolytische Viren sind natu ̈rliche oder rekombinante Viren, die die angeborene oder erworbene F ̈ahigkeit besitzen, Tumorzellen zu infizieren, sich in ihnen zu replizieren und anschließend diese Zellen zu lysieren. Ein Vertreter dieser Viren, das Vaccinia-Virus (VACV) geho ̈rt zu der Gattung der Orthopoxviren der Familie der Poxviridae. GLV- 1h68 ist ein von der Fa. Genelux entwickelter, rekombinant attenuierter Vaccinia-Virus Stamm (rVACV). Er hat die nachgewiesene Fa ̈higkeit, ausschließlich in Tumorzellen zu replizieren und dabei gesundes Gewebe zu verschonen. Viren dieses Stamms k ̈onnen auch sogenannte Prodrugs lokal am Tumor metabolisieren und/oder immunologische Payloads in die Tumorzellen einschleusen. Die Effizienz von GLV-1h68 (auch bezeichnet als GL- ONC1) wird zurzeit in mehreren klinischen Studien der Phase I/II getestet. Da die derzeitigen bildgebenden Verfahren wenig Aufschluss u ̈ber die virale Replikation und damit den therapeutischen Effekt des Virus geben, ist es dringend notwendig, eine Methode zu entwickeln, die Virusreplikation anhand von Blutproben und nicht-invasiver Untersuchungsmethoden nachzuweisen. Eine pharmakokinetische Analyse des Virus sollte Informationen u ̈ber die Dynamik geben, die sich w ̈ahrend der Therapie im Tumorinneren manifestiert. Dies gibt wiederum den behandelnden A ̈rzten die Mo ̈glichkeit, sowohl den Fortschritt also auch den Erfolg der Therapie im Patienten zu verfolgen. Daher wurden in dieser Arbeit verschiedene biologische Merkmale des Virus auf ihr Potenzial als Indikator fu ̈r die Virusreplikation getestet. Ein biologisches Merkmal kann als ein sogenannter Biomarker der Virustherapie ange- sehen werden, wenn dessen Expression in direkter Abha ̈ngigkeit zur viralen Replikation steht. Zusammen mit der Voraussetzung, im Blut einfach und spezifisch nachweisbar zu sein, kommen folglich bei der onkolytischen Virotherapie nur Proteine in Frage, die viral kodiert sind. Die Biomarker, die im Rahmen der oben genannten Problematik in dieser Arbeit diskutiert wurden, sind das exprimierte Protein des A27L-Gens, das B5R- exprimierte Glykoprotein, β-Galaktosidase (β-Gal), β-Glukuronidase (β-Glc), das gru ̈n- fluoreszierende Protein (GFP), Carboxypeptidase G2 (CPG2) und das carcinoembryonale Antigen (CEA). [...] KW - Onkolyse KW - Vaccinia-Virus KW - Biomarker KW - Virotherapie KW - Biomarker KW - Biomarker KW - Virotherapy KW - Tumour KW - Poxviridae KW - Oncolysis KW - Pockenviren KW - Tumor Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85689 ER - TY - JOUR A1 - Rinaldetti, Sébastien A1 - Pfirrmann, Markus A1 - Manz, Kirsi A1 - Guilhot, Joelle A1 - Dietz, Christian A1 - Panagiotidis, Panayiotidis A1 - Spiess, Birgit A1 - Seifarth, Wolfgang A1 - Fabarius, Alice A1 - Müller, Martin A1 - Pagoni, Maria A1 - Dimou, Maria A1 - Dengler, Jolanta A1 - Waller, Cornelius F. A1 - Brümmendorf, Tim H. A1 - Herbst, Regina A1 - Burchert, Andreas A1 - Janßen, Carsten A1 - Goebeler, Maria Elisabeth A1 - Jost, Philipp J. A1 - Hanzel, Stefan A1 - Schafhausen, Philippe A1 - Prange-Krex, Gabriele A1 - Illmer, Thomas A1 - Janzen, Viktor A1 - Klausmann, Martine A1 - Eckert, Robert A1 - Büschel, Gerd A1 - Kiani, Alexander A1 - Hofmann, Wolf-Karsten A1 - Mahon, François-Xavier A1 - Saussele, Susanne T1 - Effect of ABCG2, OCT1, and ABCB1 (MDR1) Gene Expression on Treatment-Free Remission in a EURO-SKI Subtrial JF - Clinical Lymphoma, Myeloma & Leukemia N2 - Within the EURO-SKI trial, 132 chronic phase CML patients discontinued imatinib treatment. RNA was isolated from peripheral blood in order to analyze the expression of MDR1, ABCG2 and OCT1. ABCG2 was predictive for treatment-free remission in Cox regression analysis. High transcript levels of the ABCG2 efflux transporter (>4.5 parts per thousand) were associated with a twofold higher risk of relapse. Introduction: Tyrosine kinase inhibitors (TKIs) can safely be discontinued in chronic myeloid leukemia (CML) patients with sustained deep molecular response. ABCG2 (breast cancer resistance protein), OCT1 (organic cation transporter 1), and ABCB1 (multidrug resistance protein 1) gene products are known to play a crucial role in acquired pharmacogenetic TKI resistance. Their influence on treatment-free remission (TFR) has not yet been investigated. Materials and Methods: RNA was isolated on the last day of TKI intake from peripheral blood leukocytes of 132 chronic phase CML patients who discontinued TKI treatment within the European Stop Tyrosine Kinase Inhibitor Study trial. Plasmid standards were designed including subgenic inserts of OCT1, ABCG2, and ABCB1 together with GUSB as reference gene. For expression analyses, quantitative real-time polymerase chain reaction was used. Multiple Cox regression analysis was performed. In addition, gene expression cutoffs for patient risk stratification were investigated. Results: The TFR rate of 132 patients, 12 months after TKI discontinuation, was 54% (95% confidence interval [CI], 46%-62%). ABCG2 expression (parts per thousand) was retained as the only significant variable (P=.02; hazard ratio, 1.04; 95% CI, 1.01-1.07) in multiple Cox regression analysis. Only for the ABCG2 efflux transporter, a significant cutoff was found (P=.04). Patients with an ABCG2/GUSB transcript level >4.5 parts per thousand (n=93) showed a 12-month TFR rate of 47% (95% CI, 37%-57%), whereas patients with low ABCG2 expression (<= 4.5 parts per thousand; n=39) had a 12-month TFR rate of 72% (95% CI, 55%-82%). Conclusion: In this study, we investigated the effect of pharmacogenetics in the context of a CML treatment discontinuation trial. The transcript levels of the efflux transporter ABCG2 predicted TFR after TKI discontinuation. (C) 2018 The Authors. Published by Elsevier Inc. KW - ABCG2 KW - Biomarker KW - CML KW - Imatinib KW - Prediction Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-226281 VL - 18 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Simon, Karoline T1 - Development and Evaluation of a Generic HPLC-Tandem MS Screening Method for the Detection of Potential Biomarkers for Reactive Intermediates T1 - Entwicklung und Evaluierung einer generischen HPLC-Tandem MS Methode zur Detektion potentieller Biomarker für Reaktive Intermediate N2 - Conjugation of reactive intermediates of drugs with proteins or DNA may result in toxic effects such as hepatotoxicity, agranulocytosis, allergies, tumors, etc. From 1975 to 1999, 2.9% of drugs were withdrawn from the market due to such severe adverse drug reactions. Thus, formation of chemically reactive intermediates is a widely discussed problem in drug development processes. Early detection of potentially toxic compounds is required for drug discovery and drug development. Conjugation of such electrophilic compounds with glutathione (GSH) is one of the most important detoxifying reactions in vivo. Processing of these GSH-conjugates ultimately leads to the formation of renally cleared mercapturic acids, which may also be oxidized to sulfoxides. Thus, mercapturic acids may be generated and detected in vitro and non-invasively in vivo in urine to assess the reactivity of a compound in early stages of drug development processes. Therefore, the aim of this work was to develop and evaluate a HPLC-MS/MS screening method for simple and rapid detection and characterization of known and unknown mercapturic acids and application of the method to several different matrices. Based on the common constant neutral loss (CNL) of 129 Da of all mercapturic acids tested (in negative ion mode), a CNL survey scan was performed using a linear ion trap instrument and was combined with two enhanced product ion (EPI) scans with different collision energies to characterize the detected signals. The CNL resulted from the cleavage between the sulfur and the carbon atom in the N-acetyl-L-cysteine moiety. After optimization of the experimental parameters, the detection limits of the reference substances in rat urine ranged from 0.3 to 15.5 pmol on column (i.e. 20 ng/ml to 800 ng/ml). For in vitro evaluation of the method, the model compounds acetaminophen, diclofenac, bifonazole, clozapine, troglitazone, carbamazepine, and bisphenol A were screened for formation of reactive intermediates and, hence, detection of the corresponding mercapturic acids. To determine possible species- and tissue-specific toxicities, the model compounds were incubated with stimulated neutrophils and with liver microsomes from rats and humans. Species-specific differences were observed in incubations of acetaminophen and diclofenac with rat and human hepatic microsomes. Tissue-specific differences in biotransformation of the model compounds in incubations with human neutrophils and human liver microsomes were observed for diclofenac, carbamazepine, clozapine, and bifonazole. The developed HPLC-MS/MS method was also evaluated in vivo by analysis of rat and human urine. Drug-related mercapturic acids were detected in urine of rats orally treated with acetaminophen (20 mg/kg and 640 mg/kg b.w.) or diclofenac (10 mg/kg and 20 mg/kg b.w.). Human urine samples were analyzed before and after oral administration of a clinically used dose of 500 mg and 50 mg of acetaminophen. Besides detection of the mercapturic acid of N-acetylbenzoquinoneimine (AAP-MA), a second mercapturic acid with m/z 327 occurred dose-dependently in rat and human urine samples after administration of acetaminophen. Further investigations on identification of this metabolite using authentic compounds and comparing their MS/MS mass spectra demonstrated oxidation of AAP-MA to stereoisomeric sulfoxides in vivo. For diclofenac, a novel mercapturic acid with m/z 441 was detected in rat urine samples that was identical to a metabolite obtained in incubations with human neutrophils before. The in vivo formation of this diclofenac metabolite is described here for the first time. In addition, three endogenously formed mercapturic acids were detected and identified. In conclusion, the results of the in vitro and in vivo evaluation demonstrate the advantages of the rapid and generic HPLC-MS/MS screening method for the detection of mercapturic acids, that can be obtained with a minimum of sample preparation and a high throughput in diverse matrices. N2 - Konjugation reaktiver Intermediate mit Proteinen oder DNA kann zu toxischen Effekten wie Hepatotoxizität, Neutropenie, Allergien, Tumoren u.a. führen. Zwischen 1975 und 1999 wurden 2.9% der zugelassenen Arzneistoffe wegen Auftretens solcher unerwünschten, toxischen Nebenwirkungen vom Markt genommen. Daher stellen Substanzen, die reaktive Intermediate bilden können, ein großes Problem in der Arzneistoffentwicklung dar. Aus diesem Grund ist die pharmazeutische Forschungsindustrie daran interessiert, solche potenziell toxischen Substanzen bereits in frühen Phasen der Arzneistoffentwicklung zu erfassen. Elektrophile, reaktive Intermediate sind instabil und reagieren schnell mit nukleophilen Substraten. Die Konjugation reaktiver Intermediate mit Glutathion stellt hierbei einen der Hauptmechanismen der Detoxifizierung im Organismus dar. In vivo können enzymatisch geregelte Reaktionen das Glutathionaddukt abbauen und so zur Bildung renal ausscheidbarer Merkaptursäuren führen, die auch zu den entsprechenden Sulfoxiden oxidiert werden können. Man kann Merkaptursäuren aber auch direkt durch Konjugation mit N-Acetyl-L-cystein gewinnen. So können reaktive Intermediate in vitro generiert und als Merkaptursäuren detektiert und nicht-invasiv auch in vivo erfasst werden. Ziel dieser Arbeit war es, eine HPLC-MS/MS-Screening-Methode zur einfachen und schnellen Detektion und Charakterisierung von bekannten und unbekannten Merkaptursäuren als Biomarker für die Bildung reaktiver Metabolite in verschiedenen Matrices zu entwickeln und zu evaluieren. Für alle untersuchten Merkaptursäuren und deren Sulfoxide war ein Neutralverlust von 129 Da (im negativen Ionenmodus) charakteristisch. Dieser entstand durch Spaltung der Schwefel-Kohlenstoff-Bindung im Merkaptursäureanteil und diente als Basis für die Entwicklung der HPLC-MS/MS-Methode. Dafür wurde ein CNL-Scan auf 129 Da im negativen Ionenmodus durchgeführt. Der CNL-Scan konnte unter Verwendung der vorhandenen Ionenfalle mit zwei Produkt-ionen-Scans (EPI) mit unterschiedlichen Kollisionsenergien kombiniert und für eine Charakterisierung der detektierten Signale verwandt werden. Nach Optimierung der Instrument- und HPLC-Parameter wurden für die einzelnen Referenzsubstanzen Nachweisgrenzen im Bereich von 0.3 bis 15.5 pmol on column (entspricht einem Bereich von 20 ng/ml bis 800 ng/ml) in Rattenurin bestimmt. Für die In-vitro-Evaluierung der CNL-Screening-Methode wurden die Modellsubstanzen Paracetamol, Diclofenac, Troglitazon, Bifonazol, Clozapin, Carbamazepin und Bisphenol A auf die Bildung reaktiver Intermediate hin untersucht, die durch Zusatz von N-acetylcystein abgefangen wurden. Um eventuell Aufschluß über gewebe- oder speziesspezifische Toxizitäten von Arzneistoffen zu bekommen, wurden die Modellsubstanzen in stimulierten neutrophilen Granulozyten und in Ratten- und Humanlebermikrosomen inkubiert. Speziesspezifische Unterschiede in der Bildung von reaktiven Intermediaten zwischen Inkubationen mit Ratten- und Humanlebermikrosomen wurden bei Paracetamol und Diclofenac beobachtet. Organspezifische Unterschiede in der Bildung von reaktiven Intermediaten zwischen Inkubationen mit neutrophilen Granulozyten und humanen Lebermikrosomen wurden bei Diclofenac, Carbamazepin, Clozapin und Bifonazol gefunden. Die HPLC-MS/MS-Screening-Methode wurde durch Messungen von Ratten- und Humanurinproben auch in vivo evaluiert. Arzneistoffbezogene Merkaptursäuren wurden in Urinproben von Ratten gemessen, die über eine Schlundsonde Paracetamol (20 mg/kg und 640 mg/kg K.G.) bzw. Diclofenac (10 mg/kg und 20 mg/kg K.G.) zugeführt bekommen hatten. Humanurin wurde nach Gabe einer therapeutischen Dosis von 500 mg Paracetamol und einer subtherapeutischen Dosis von 50 mg analysiert. Neben der bekannten Merkaptursäure des N-acetylbenzochinonimins (NAPQI) wurde ein weiterer Metabolit (m/z 327) dosisabhängig in den Urinproben von Ratte und Mensch detektiert. Durch nähere Untersuchungen zur Identifizierung dieses Metaboliten anhand von Referenzsubstanzen und deren Massenspektren konnte nachgewiesen werden, dass das Merkapturat des NAPQI zu stereoisomeren Sulfoxiden oxidiert wurde. Bei den Diclofenac-Proben wurde zum ersten Mal ein Metabolit mit m/z 441 in Rattenurin detektiert und charakterisiert, der nur in Inkubationen mit stimulierten neutrophilen Granulozyten, jedoch nicht mit Lebermikrosomen gebildet wurde. Mit der entwickelten HPLC-MS/MS Screening Methode konnten weitere, vom Arzneistoff unabhängige Merkaptursäuren im Urin detektiert und charakterisiert werden. Schließlich zeigen die Ergebnisse zur In-vitro- und In-vivo-Evaluierung die Vorteile dieser schnellen und generischen HPLC-MS/MS-Screening-Methode zur Detektion von Merkaptursäuren, die mit minimaler Probenvorbereitung und hohem Probendurchsatz für verschiedene Matrices eingesetzt werden kann. KW - Acetylcysteinderivate KW - Reaktive Zwischenstufe KW - Biomarker KW - HPLC-MS KW - Merkaptursäuren KW - Biomarker KW - Massenspektrometrie KW - reaktive Metabolite KW - mercapturic acids KW - biomarker KW - mass spectrometry KW - reactive metabolites Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21916 ER - TY - JOUR A1 - Vergho, Daniel A1 - Kneitz, Susanne A1 - Rosenwald, Andreas A1 - Scherer, Charlotte A1 - Spahn, Martin A1 - Burger, Maximilian A1 - Riedmiller, Hubertus A1 - Kneitz, Burkhard T1 - Combination of expression levels of miR-21 and miR-126 is associated with cancer-specific survival in clear-cell renal cell carcinoma N2 - Background Renal cell carcinoma (RCC) is marked by high mortality rate. To date, no robust risk stratification by clinical or molecular prognosticators of cancer-specific survival (CSS) has been established for early stages. Transcriptional profiling of small non-coding RNA gene products (miRNAs) seems promising for prognostic stratification. The expression of miR-21 and miR-126 was analysed in a large cohort of RCC patients; a combined risk score (CRS)-model was constructed based on expression levels of both miRNAs. Methods Expression of miR-21 and miR-126 was evaluated by qRT-PCR in tumour and adjacent non-neoplastic tissue in n = 139 clear cell RCC patients. Relation of miR-21 and miR-126 expression with various clinical parameters was assessed. Parameters were analysed by uni- and multivariate COX regression. A factor derived from the z-score resulting from the COX model was determined for both miRs separately and a combined risk score (CRS) was calculated multiplying the relative expression of miR-21 and miR-126 by this factor. The best fitting COX model was selected by relative goodness-of-fit with the Akaike information criterion (AIC). Results RCC with and without miR-21 up- and miR-126 downregulation differed significantly in synchronous metastatic status and CSS. Upregulation of miR-21 and downregulation of miR-126 were independently prognostic. A combined risk score (CRS) based on the expression of both miRs showed high sensitivity and specificity in predicting CSS and prediction was independent from any other clinico-pathological parameter. Association of CRS with CSS was successfully validated in a testing cohort containing patients with high and low risk for progressive disease. Conclusions A combined expression level of miR-21 and miR-126 accurately predicted CSS in two independent RCC cohorts and seems feasible for clinical application in assessing prognosis. KW - Renal cell carcinoma KW - RCC KW - Kidney cancer KW - miRNA KW - miR-21 KW - miR-126 KW - Prognosis KW - Profiling KW - Biomarker KW - Tumour markers Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110061 ER - TY - THES A1 - Wendlinger, Simone Alice T1 - Function of Peripheral Blood Eosinophils in Melanoma T1 - Funktion der Eosinophilen Granulozyten aus dem peripheren Blut im Melanom N2 - Despite accounting for only a small proportion of all skin cancers, malignant melanoma displays a serious health risk with increasing incidence and high mortality rate. Fortunately, advances in the treatment of malignant melanoma now prolong survival and enhance response and treatment efficacy. Established biomarkers help evaluate disease progression and facilitate choosing appropriate and individual treatment options. However, the need for easily accessible and reliable biomarkers is rising to predict patient-specific clinical outcome. Eosinophil infiltration into the tumor and high peripheral eosinophil counts prior and during treatment have been associated with better response in patients for various cancer entities, including melanoma. An analysis of a heterogeneous study cohort reported high serum ECP levels in non-responders. Hence, eosinophil frequency and serum ECP as a soluble eosinophil-secreted mediator were suggested as prognostic biomarkers in melanoma. We examined whether melanoma patients treated with first-line targeted therapy could also benefit from the effects of eosinophils. In total, 243 blood and serum samples from patients with advanced melanoma were prospectively and retrospectively collected before and after drug initiation. To link eosinophil function to improved clinical outcome, soluble serum markers and peripheral blood counts were used for correlative studies using a homogeneous study cohort. In addition, functional and phenotypical characterizations provided insights into the expression profile and activity of freshly isolated eosinophils, including comparisons between patients and healthy donors. Our data showed a significant correlation between high pre-treatment blood eosinophil counts and improved response to targeted therapy and by trend to combinatorial immunotherapy in patients with metastatic melanoma. In accordance with previous studies our results links eosinophil blood counts to better response in melanoma patients. High pre-treatment ECP serum concentration correlated with response to immunotherapy but not to targeted therapy. Eosinophils from healthy donors and patients showed functional and phenotypical similarities. Functional assays revealed a strong cytotoxic potential of blood eosinophils towards melanoma cells in vitro, inducing apoptosis and necrosis. In addition, in vitro cytotoxicity was an active process of peripheral eosinophils and melanoma cells with bidirectional features and required close cell-cell interaction. The extent of cytotoxicity was dose-dependent and showed susceptibility to changes in physical factors like adherence. Importantly, we provide evidence of an additive tumoricidal function of eosinophils and combinatorial targeted therapy in vitro. In summary, we give valuable insights into the complex and treatment-dependent role of eosinophils in melanoma. As a result, our data support the suggestion of eosinophils and their secreted mediators as potential prognostic biomarkers. It will take additional studies to examine the molecular mechanisms that underlie our findings. N2 - Obwohl das Maligne Melanom nur einen geringen Anteil aller Hautkrebsarten ausmacht, stellt es ein ernstzunehmendes Gesundheitsrisiko mit steigender Inzidenz und hoher Sterblichkeitsrate dar. Durch Fortschritte in der Behandlung des malignen Melanoms konnten die Überlebenszeit verlängert und das Ansprechen und die Wirksamkeit der Behandlung verbessert werden. Etablierte Biomarker helfen bei der Bewertung des Krankheitsverlaufs und erleichtern die Wahl geeigneter und individueller Behandlungsoptionen. Der Bedarf an leicht zugänglichen und zuverlässigen Biomarkern zur Vorhersage patientenspezifischer klinischer Ergebnisse nimmt zu. Die Infiltration von Eosinophilen in den Tumor und hohe periphere Eosinophilenzahl vor und während der Behandlung wurden mit einem besseren Ansprechen bei Patienten mit verschiedenen Tumorarten, einschließlich des Melanoms, in Verbindung gebracht. Eine Analyse einer heterogenen Patientenkohorte berichtete über hohe ECP-Serumspiegel bei Patienten, die nicht auf eine Melanombehandlung ansprechen. Daher wurden periphere Eosinophile im Blut und ECP im Serum, als löslicher, von Eosinophilen sekretierter Mediator, als prognostische Biomarker für das Melanom vorgeschlagen. Wir untersuchten, ob sich die positive Wirkung der peripheren Eosinophilen beim Melanom auf Patienten übertragen lässt, die mit einer zielgerichteten Erstlinientherapie behandelt werden. Insgesamt wurden 243 Blut- und Serumproben von Patienten mit fortgeschrittenem Melanom prospektiv und retrospektiv vor und nach Einleitung einer medikamentösen Behandlung gesammelt. Um die Eosinophilenfunktion mit einem verbesserten klinischen Ergebnis in Verbindung zu bringen, wurden lösliche Serummarker und periphere Blutbilder für korrelative Studien in einer homogenen Studienkohorte analysiert. Darüber hinaus lieferten funktionelle und phänotypische Charakterisierungen Einblicke in das Expressionsprofil und die Aktivität von frisch isolierten Eosinophilen. Vergleiche von Patienten und gesunden Spendern wurden ebenfalls durchgeführt. Unsere Daten zeigten, dass eine hohe prätherapeutische Eosinophilenzahl im Blut zu einer signifikanten Verbesserung des Ansprechens auf eine zielgerichtete Therapie und tendenziell zu einer Verbesserung des Ansprechens auf eine kombinatorische Immuntherapie bei Patienten mit metastasiertem Melanom beiträgt. In Übereinstimmung mit bereits publizierten Studien bringen unsere Ergebnisse eine erhöhte Eosinophilenzahl im Blut mit einem besseren Ansprechen bei Melanompatienten in Verbindung. Eine hohe prätherapeutische ECP- Serumkonzentration korrelierte mit dem Ansprechen auf eine Immuntherapie, nicht aber auf eine zielgerichtete Therapie. Eosinophile von gesunden Spendern und Patienten wiesen zudem funktionelle und phänotypische Ähnlichkeiten auf. Außerdem zeigten funktionelle Tests ein starkes zytotoxisches Potenzial von Eosinophilen gegenüber Melanomzellen in vitro. Periphere Eosinophile lösten Apoptose und Nekrose in den Melanomzellen aus. Darüber 3 hinaus war die Zytotoxizität in vitro ein aktiver Prozess zwischen peripheren Eosinophilen und Melanomzellen mit bidirektionalem Einfluss und erforderte eine enge Zell-Zell-Interaktion. Das Ausmaß der Zytotoxizität war dosisabhängig und zeigte eine Anfälligkeit für Veränderungen der physikalischen Faktoren wie der Adhärenz. Wir konnten Beweise für eine additive tumorizide Funktion von Eosinophilen und einer kombinatorischen zielgerichteten Therapie in vitro liefern. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit wertvolle Einblicke in die komplexe und behandlungsabhängige Rolle der Eosinophilen beim Melanom bietet. Unsere Daten unterstützen den Vorschlag, Eosinophile und die von ihnen sekretierten Mediatoren als potenzielle prognostische Biomarker zu verwenden. Weitere Studien sind erforderlich, um die molekularen Mechanismen unserer Beobachtungen zu entschlüsseln. KW - Melanom KW - Therapie KW - Granulozyten KW - Targeted therapy KW - Peripheral eosinophils KW - Malignant melanoma KW - Biomarker Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-301194 PB - Cancers (Basel) ER -