TY  - THES
A1  - Nemec, Katarina
T1  - Modulation of parathyroid hormone 1 receptor (PTH1R) signaling by receptor activity-modifying proteins (RAMPs)
T1  - Regulierung der Signalübertragung des Parathormon 1-Rezeptors (PTH1R) durch Rezeptoraktivitäts-modifizierende Proteine (RAMPs)
N2  - The receptor activity-modifying proteins (RAMPs) are ubiquitously expressed membrane proteins that interact with several G protein-coupled receptors (GPCRs), the largest and pharmacologically most important family of cell surface receptors. RAMPs can regulate GPCR function in terms of ligand-binding, G-protein coupling, downstream signaling, trafficking, and recycling. The integrity of their interactions translates to many physiological functions or pathological conditions.
Regardless of numerous reports on its essential importance for cell biology and pivotal role in (patho-)physiology, the molecular mechanism of how RAMPs modulate GPCR activation remained largely elusive. 
This work presents new insights that add to the common understanding of the allosteric regulation of receptor activation and will help interpret how accessory proteins - RAMPs - modulate activation dynamics and how this affects the fundamental aspects of cellular signaling. Using a prototypical class B GPCR, the parathyroid hormone 1 receptor (PTH1R) in the form of advanced genetically encoded optical biosensors, I examined RAMP's impact on the PTH1R activation and signaling in intact cells. A panel of single-cell FRET and confocal microscopy experiments as well canonical and non-canonical functional assays were performed to get a holistic picture of the signaling initiation and transduction of that clinically and therapeutically relevant GPCR. Finally, structural modeling was performed to add molecular mechanistic details to that novel art of modulation. 
I describe here that RAMP2 acts as a specific allosteric modulator of PTH1R, shifting PTH1R to a unique pre-activated state that permits faster activation in a ligand-specific manner. Moreover, RAMP2 modulates PTH1R downstream signaling in an agonist-dependent manner, most notably increasing the PTH-mediated Gi3 signaling sensitivity and kinetics of cAMP accumulation. Additionally, RAMP2 increases PTH- and PTHrP-triggered β-arrestin2 recruitment to PTH1R and modulates cytosolic ERK1/2 phosphorylation. Structural homology modeling shows that structural motifs governing GPCR-RAMP interaction originate in allosteric hotspots and rationalize functional modulation. Moreover, to interpret the broader role of RAMP's modulation in GPCRs pharmacology, different fluorescent tools to investigate RAMP's spatial organization were developed, and novel conformational biosensors for class B GPCRs were engineered. Lastly, a high throughput assay is proposed and prototyped to expand the repertoire of RAMPs or other membrane protein interactors.
These data uncover the critical role of RAMPs in GPCR activation and signaling and set up a novel platform for studying GPCR modulation. Furthermore, these insights may provide a new venue for precise modulation of GPCR 
function and advanced drug design.
N2  - G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte und pharmakologisch wichtigste Familie von
Zelloberflächenrezeptoren, die zahlreiche (patho-)physiologische Prozesse im menschlichen Körper steuern. GPCRs
übertragen während des Rezeptoraktivierungsprozesses extrazelluläre Signale in das Zellinnere, wo durch die
extrazelluläre Stimulation Konformationsänderungen des Rezeptorkerns auslöst und die Bindung intrazellulärer
Bindungspartner – G Proteine, G Protein-gekoppelte Rezeptorkinase und Arrestine - ermöglicht. Es handelt sich
also um einen kritischen Prozess in der Signaltransduktion, der durch einige endogene Moleküle wie Ionen, Lipide
oder andere Proteine moduliert werden kann und Auswirkungen auf nachgeschaltete Signalkaskaden hat.
GPCRs bilden gewebeabhängige Oligomere mit ihren interagierenden Partnern, Rezeptor-Aktivitäts-modifizierende
Proteinen (RAMPs), ubiquitär exprimierten Membranproteinen. Bekannt ist, dass sie die Ligandenbindung, die G-
Protein-Kopplung, die nachgeschaltete Signalisierung, das Trafficking und das Recycling einiger GPCRs modulieren.
Ihre Rolle im kritischsten Prozess der Signaltransduktion - der Rezeptoraktivierung - wurde jedoch nur begrenzt
erforscht.
Anhand des physiologisch und therapeutisch wichtigen Parathormon-Rezeptors (PTH1R), einem GPCR der Klasse B,
wurden die Modulationseffekte von RAMPs auf den Prozess der Rezeptoraktivierung und ihre Folgen für die
nachgeschaltete Signalübertragung analysiert. Hierzu wurden verschiedene optische Biosensoren zur Messung der
Aktivierung des PTH1R und seiner Signalkaskade entwickelt und in verschiedenen Versuchsanordnungen
eingesetzt, mit dem Ziel einen holistischen Blick auf die Interaktion zwischen PTH1R und RAMPs und ihre
funktionellen Auswirkungen zu erhalten.
Die Interaktion zwischen PTH1R und RAMPs erwies sich als besonders ausgeprägt für RAMP2, und RAMP2 zeigte
eine spezifische allosterische Modulation der PTH1R-Konformation, sowohl im basalen als auch im Liganden-
aktivierten Zustand. Ein einzigartiger voraktivierter oder (meta-stabiler) Zustand ermöglichte eine schnellere
Rezeptoraktivierung auf Liganden-spezifische Weise. Außerdem beeinflusste RAMP2 die G Protein- und Nicht-G
Protein-vermittelte Signalübertragung indem es die PTH-vermittelte Gi3-Signalempfindlichkeit und die Kinetik der
cAMP-Akkumulation modulierte. Weiterhin erhöhte RAMP2 die Menge der β-Arrestin2-Rekrutierung an PTH1R auf
Liganden-spezifische Weise. Dies könnte mit einer erhöhten zytosolischen ERK-Menge zusammenhängen, die hat
sich von der nukleären ERK-Phosphorylierung unterscheidet. Um einen molekularen Mechanismus für die
vorgestellten Ergebnisse vorzuschlagen, wurden mehrere strukturelle Modelle entwickelt und analysiert.
Diese Arbeit liefert den Beweis, dass RAMP die GPCR-Aktivierung mit funktionellen Auswirkungen auf die zelluläre
Signalübertragung reguliert. Die Ergebnisse sollten im Zusammenhang mit zellspezifischen Koexpressionsmustern
interpretiert werden und können zur Entwicklung von fortschrittlichen Therapeutika positiv beitragen. Da GPCRs
praktisch alle Zellfunktionen koordinieren und seit jeher wichtigen Angriffspunkten für Medikamente sind, tragen
die vorgestellten Erkenntnisse zum universellen Verständnis der molekularen Mechanismen bei, die den
menschlichen Körper orchestrieren.
KW  - G-Protein gekoppelter Rezeptor
KW  - GPCR
KW  - RAMP
KW  - PTH1R
KW  - FRET
KW  - BRET
KW  - pharmacology
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - Förster Resonanz Energie Transfer
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-288588
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schihada, Hannes
T1  - Novel optical methods to monitor G-protein-coupled receptor activation in microtiter plates
T1  - Neue optische Methoden zur Messung der Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Mikrotiter-Platten
N2  - G-protein-coupled receptors (GPCRs) regulate diverse physiological processes in the human body and represent prime targets in modern drug discovery. Engagement of different ligands to these membrane-embedded proteins evokes distinct receptor conformational rearrangements that facilitate subsequent receptor-mediated signalling and, ultimately, enable cellular adaptation to altered environmental conditions. Since the early 2000s, the technology of resonance energy transfer (RET) has been exploited to assess these conformational receptor dynamics in living cells and real time. However, to date, these conformational GPCR studies are restricted to single-cell microscopic setups, slowing down the discovery of novel GPCR-directed therapeutics. In this work, we present the development of a novel generalizable high-throughput compatible assay for the direct measurement of GPCR activation and deactivation. By screening a variety of energy partners for fluorescence (FRET) and bioluminescence resonance energy transfer (BRET), we identified a highly sensitive design for an α2A-adrenergic receptor conformational biosensor. This biosensor reports the receptor’s conformational change upon ligand binding in a 96-well plate reader format with the highest signal amplitude obtained so far. We demonstrate the capacity of this sensor prototype to faithfully quantify efficacy and potency of GPCR ligands in intact cells and real time. Furthermore, we confirm its universal applicability by cloning and validating five further equivalent GPCR biosensors. To prove the suitability of this new GPCR assay for screening purposes, we measured the well-accepted Z-factor as a parameter for the assay quality. All tested biosensors show excellent Z-factors indicating outstanding assay quality. Furthermore, we demonstrate that this assay provides excellent throughput and presents low rates of erroneous hit identification (false positives and false negatives). Following this phase of assay development, we utilized these biosensors to understand the mechanism and consequences of the postulated modulation of parathyroid hormone receptor 1 (PTHR1) through receptor activity-modifying protein 2 (RAMP2). We found that RAMP2 desensitizes PTHR1, but not the β2-adrenergic receptor (β2AR), for agonist-induced structural changes. This generalizable sensor design offers the first possibility to upscale conformational GPCR studies, which represents the most direct and unbiased approach to monitor receptor activation and deactivation. Therefore, this novel technology provides substantial advantages over currently established methods for GPCR ligand screening. We feel confident that this technology will aid the discovery of novel types of GPCR ligands, help to identify the endogenous ligands of so-called orphan GPCRs and deepen our understanding of the physiological regulation of GPCR function.
N2  - Die Klasse der G-protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) stellt die größte Familie membranständiger Proteine dar. GPCRs regulieren eine Vielzahl diverser physiologischer Prozesse in eukaryotischen Zellen und kontrollieren so unterschiedliche Zellfunktionen im menschlichen Organismus. Sie stellen die Zelloberflächenrezeptoren für verschiedenartige extrazelluläre Stimuli, wie zum Beispiel Photonen, niedermolekulare chemische Verbindungen, Peptide und Lipide dar. Die Wechselwirkung mit diesen sogenannten Liganden stabilisiert spezifische GPCR-Konformationen. Diese dienen wiederum als Ausgangspunkt für nachgeschaltete intrazelluläre Signalkaskaden, die beispielweise über membranverankerte G-Proteine vermittelt werden können. Während endogene GPCR-Agonisten diese Signalweiterleitung verstärken, können andere Biomoleküle wie Lipide, Ionen oder andersartige Membranproteine die Funktion, und damit die Signalweiterleitung der GPCRs modulieren.  	
Aufgrund ihrer Einbindung in eine Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Prozesse, wurden GPCRs schon früh als Angriffspunkte („Targets“) zur Behandlung verschiedener Erkrankungen erforscht und genutzt. Heutzutage vermitteln etwa 30% aller zugelassenen Arzneistoffe ihre Wirkung über G-protein-gekoppelte Rezeptoren. Dennoch wird das große Potential dieser Rezeptorfamilie als Targets für medikamentöse Behandlungen noch nicht in vollem Umfang ausgeschöpft. Tatsächlich gibt es für mehr als 200 GPCRs, die nicht der olfaktorischen Wahrnehmung dienen, noch keine Arzneistoffe, da wenig über deren Pharmakologie und physiologische Bedeutung bekannt ist. Zudem wird die Entwicklung neuartiger GPCR-Liganden erheblich durch das eingeschränkte Methodenrepertoire beeinträchtigt. Alle derzeit etablierten Techniken zur Identifizierung neuer GPCR-Liganden erfassen entweder den Ligand-GPCR-Bindungsprozess, der keine Informationen über die tatsächliche Aktivität der Verbindung liefert, oder messen weit-nachgeschaltete Signale, wie Änderungen sogenannter „Second-Messenger“-Konzentrationen (meist cAMP oder Calcium) und Reporter-Gen-Expressionslevel. Aufgrund ihrer Entfernung vom eigentlichen Rezeptor-Aktivierungsprozess haben diese Methoden allerdings bedeutende Nachteile und produzieren so häufig Falsch-Positive und Falsch-Negative Ergebnisse.	
Seit den frühen 2000er wurden GPCR-Konformationssensoren auf Basis von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zur Messung der Ligand-induzierten Rezeptordynamik genutzt. Jedoch wies keiner der bisher entwickelten FRET- oder BRET- (Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer) Sensoren ausreichende Signalstärke auf, um im Hochdurchsatz-Screening (HTS) angewendet werden zu können. 
Die vorliegende Studie beschreibt das erste GPCR-Sensordesign, das aufgrund seiner exzellenten Signalstärke im Hochdurchsatz-Verfahren verwendet werden kann. Wir haben 21 unterschiedliche FRET- und BRET-Sensoren des α2A-adrenergen Rezeptors (α2AAR) getestet und dabei die Kombination der kleinen und hellen Luziferase NanoLuciferase (Nluc) mit dem rot-fluoreszierenden HaloTag-Farbstoff 618 als sensitivstes RET-Paar identifiziert. Der α2AARNluc/Halo(618) Biosensor ermöglicht die Messung der Aktivität und Wirkstärke von α2AAR-Liganden im Mikrotiterplattenformat. Um die universelle Anwendbarkeit dieses Sensordesigns zu prüfen, wurden fünf weitere Nluc/Halo(618)-basierende Sensoren für GPCRs unterschiedlicher Unterfamilien entwickelt. Zudem konnten wir zeigen, dass diese GPCRNluc/Halo(618)-Fusionsproteine weiterhin ihre natürlichen Signalkaskaden in Gang setzen können und damit die biologische Funktionalität dieser Rezeptoren erhalten ist. Außerdem belegt die vorlegende Arbeit, dass diese neue Sensor-Generation zur Messung Ligand-vermittelter Rezeptordynamiken im Hochdurchsatz-Format und zur Untersuchung der GPCR-Regulation durch endogene Modulatoren genutzt werden kann.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass wir den ersten HTS-kompatiblen Assay zur Messung der GPCR-Konformationsänderungen entwickelt haben. Diese Biosensoren erlauben die Charakterisierung neuartiger GPCR-Liganden direkt auf der Rezeptorebene und funktionieren damit unabhängig von nachgeschalteter Signalamplifikation oder Überlagerung verschiedener Signalwege, welche die Aussagekraft traditioneller GPCR-Screening-Verfahren häufig beeinträchtigen. Diese Technik kann zur Entdeckung neuartiger GPCR-Arzneistoffe genutzt werden, zu einem besseren Verständnis bisher kaum erforschter Rezeptoren beitragen und der Identifizierung und Charakterisierung potentieller GPCR-Modulatoren dienen.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Hochdurchsatz-Screening
KW  - Förster Resonanz Energie Transfer
KW  - High-thropughput screening
KW  - Bioluminescence resonance energy transfer
KW  - G-protein-coupled receptors
KW  - Receptor dynamics
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175415
ER  -