TY - THES A1 - Niewidok, Natalia T1 - Modulation of radiosensitivity of human tumor and normal cells by inhibition of heat shock proteins Hsp90 and Hsp70 T1 - Modulation der Strahlenempfindlichkeit humaner maligner und nicht-maligner Zellen mittels Inhibition der Hitzeschockproteine Hsp90 und Hsp70 N2 - Cancer is the leading cause of death in economically developed countries (Jemal et al. 2011). Heat shock protein 90 can be a promising target in cancer treatment as it is responsible for sustaining protein homeostasis in every human cell by folding and activating of more than 200 client proteins (Picard et al. 2002). Apart from strong anti-tumor activities in vitro (Smith et al. 2005) and in vivo (Supko et al. 1995), Hsp90 inhibitors can sensitize tumor cells to radiation (Bisht et al. 2003, Stingl et al.2010, Schilling et al. 2011). Recently, our group showed the radiosensitizing potential of novel Hsp90 inhibitors: NVP-AUY922 and NVP-BEP800 (Stingl et al. 2010). The drugs were administered to cancer cell lines of different origin 24 hours before irradiation (drug-first treatment). In the present work, we explored the effects of a schedule other than drug-first treatment on A549 and SNB19 tumor cell lines. Cell samples were treated with either NVP-AUY922 or NVP-BEP800 one hour before IR and kept in the drug-containing medium for up to 48 hours (simultaneous drug-IR treatment). Our findings showed that depending on the tumor cell line, the combination of Hsp90 inhibition and irradiation may result in radiosensitization or apoptosis of cancer cell lines. It is advised to adjust the sequence of treatment, involving Hsp90 inhibition and irradiation, on the basis of the genetic background of tumor cells. Before entering the clinic, novel therapeutics should be tested on non-malignant tissue to exclude their possible toxic activities. Thus, we applied the simultaneous drug-IR treatment on human skin fibroblast strains. This work showed that Hsp90 inhibitors NVP-AUY922 and NVP-BEP800 preferentially sensitize tumor cells to radiation, whereas the effect(s) on normal fibroblasts was much weaker. The exact mechanisms underlying the Hsp90 inhibitors’ selectivity towards malignant cells remain to be elucidated. It was shown previously that the administration of Hsp90 inhibitors, including NVP-AUY922 and NVP-BEP800, induces heat shock response (Niewidok et al. 2012). Heat shock response triggers the up-regulation of Hsp70, which, due to its strong anti-apoptotic properties, might be responsible for reducing the effects of Hsp90 inhibition. The transfection with Hsp70 siRNA suppressed the NVP-AUY922-induced over-expression of the target protein. However, on the long-term scale, it did not influence the radiosensitivity of A549 and SNB19 cells. To summarize, the use of siRNA proved that Hsp70 inhibition could be used to support Hsp90 inhibition on the short-term scale. Therefore, for future works, more potent and stable methods of Hsp70 inhibition are needed. This thesis presented the effects induced by two novel Hsp90 inhibitors NVP-AUY922 and NVP-BEP800, in combination with irradiation in tumor cell lines as well as in normal skin fibroblasts. Hsp70 pre-silencing was tested as a method for improving radiosensitizing potential of NVP-AUY922. These results support the use of NVP-AUY922 and NVP-BEP800 in combination with irradiation in future clinical trials. N2 - Trotz aller wissenschaftlicher Fortschritte, die in den letzten Jahren in der Onkologie erfolgten, ist Krebs eine der Haupttodesursachen in den wirtschaftlich entwickelten Ländern. Das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) stellt ein vielversprechendes neues Target für die Krebstherapie dar, weil es einen großen Anteil des Proteingleichgewichts in jeder humanen Zelle durch Faltung und Aktivierung seiner Klientenproteine kontrolliert (Picard et al. 2002, Trepel et al. 2010). Es wurde gezeigt, dass Hsp90 Inhibitoren starke anti-proliferative Eigenschaften in vitro (Smith et al. 2005) und in vivo aufweisen (Supko et al. 1995). Außerdem führte die Hsp90 Inhibition zur Radiosensibilisierung unterschiedlicher Tumorzelllinien (Bisht et al. 2003, Stingl et al.2010, Schilling et al. 2011). Vor Kurzem wurde in unserer Arbeitsgruppe gezeigt, dass die neuartigen Hsp90 Inhibitoren NVP-AUY922 und NVP-BEP800 zur Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit der Tumorzelllinien führen (Stingl et al. 2010). Die Krebszellen wurden 24 Stunden vor der Bestrahlung behandelt und bestrahlt (‚drug-first’ Behandlungsschema). In dieser Doktorarbeit wurden die Effekte eines anderen Behandlungsschemas auf die A549 und SNB19 Tumorzelllinien untersucht. Die Zellen wurden entweder mit NVP-AUY922 oder NVP-BEP800 eine Stunde vor der Bestrahlung behandelt und bis zu 48 Stunden nach der Bestrahlung weiterhin mit Hsp90 Inhibitor kultiviert (simultane drug-IR Behandlungsschema). Zusammenfassend zeigen die hier gewonnenen Ergebnisse, dass abhängig von der Tumorzelllinie, die Kombination der Hsp90 Inhibition mit Bestrahlung zur Radiosensibilisierung oder zur Apoptose führen kann. Die Reihenfolge der Behandlung mit Hsp90 Inhibitoren und Bestrahlung sollte individuell der Tumorart und den vorliegenden Mutationen angepasst werden. Bevor Medikamente in der Klinik angewendet werden können, müssen sie auf nicht-malignem Gewebe getestet werden, um eine mögliche toxische Wirkung auszuschließen. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit die zwei humane Hautfibroblastenlinien HFib1 und HFib2 nach dem simultanen Behandlungsschema mit Hsp90 Inhibitoren und Bestrahlung behandelt. Diese Arbeit zeigte, dass NVP-AUY922 und NVP-BEP800 Tumorzelllinien für die Bestrahlung sensibilisieren, wohingegen der Einfluss von Hsp90 Inhibitoren auf normale Fibroblasten geringer war. Der exakte Mechanismus der Selektivität der Hsp90 Inhibitoren auf Krebszellen ist aber noch unbekannt und erfordert weitere Experimente. Die Behandlung mit N-terminalen Hsp90 Inhibitoren, zum Beispiel mit NVP-AUY922 oder mit NVP-BEP800, induziert die Hitzeschockantwort und unter anderem die Hochregulierung von Hsp70 (Niewidok et al. 2012). Hsp70 ist bekannt für seine starken anti-apoptotischen Eigenschaften, die das therapeutische Potenzial der Hsp90 Inhibitoren reduzieren können. Die Behandlung mit siRNA reduzierte die von NVP-AUY922 induzierte Hsp70-Überexpression, aber beeinflusste nicht die Strahlenempfindlichkeit der Tumorzelllinien A549 und SNB19. Die Transfektion mit siRNA hat bewiesen, dass die Hsp70 Inhibition als eine Unterstützung der Hsp90 Inhibition dienen kann. Dies ist jedoch eine kurzzeitige Methode der Hemmung und alternative Methoden zur Hemmung der Hsp70 Aktivitäten nötig sind. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse erläutern die Effekte, die von zwei neuartigen Hsp90 Inhibitoren NVP-AUY922 und NVP-BEP800 in Kombination mit Bestrahlung induziert werden, sowohl in Tumorzelllinien als auch in normalen Hautfibroblasten. Hsp70-Silencing wurde als Methode zur Erhöhung des radiosensibilisierenden Potenzials des Inhibitor NVP-AUY922 getestet. Alle diese Resultate zusammen sprechen für eine Anwendung von NVP-AUY922 und NVP-BEP800 in klinischen Studien, die alleine oder in Kombination mit Bestrahlung erfolgen könnte. KW - Tumorzelle KW - Strahlenbiologie KW - Strahlenempfindlichkeit KW - Hitzeschockproteine KW - Tumorzellen KW - nicht-maligne Zellen KW - radiation biology KW - radiosensitization KW - heat shock proteins KW - tumor cell lines KW - Hitzeschock-Proteine KW - Krebsforschung Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78728 ER - TY - THES A1 - Rapp, Ulrike T1 - Achieving protective immunitity against intracellular bacterial pathogens : a study on the efficiency of Gp96 as a vaccine carrier T1 - Immunisierung gegen intrazelluläre Bakterien mit Hilfe von HSP-Fusionsproteinen N2 - Protective vaccination against intracellular pathogens using HSP fusion proteins in the listeria model. N2 - Impfschutz gegen intrazelluläre Pathogene durch Immunisierung mit HSP-Fusionsproteinen im listerien Modell. KW - Listeria monocytogenes KW - Immunisierung KW - Hitzeschock-Proteine KW - Hitzeschockproteine KW - Immunsierung KW - Intrazelluläre Pathogene KW - Heat Shock Proteins KW - Immunization KW - Intracellular Pathogens Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9096 ER - TY - THES A1 - Schulze, Andrea T1 - Investigating the mechanism of the Hsp90 molecular chaperone using photoinduced electron transfer fluorescence quenching T1 - Untersuchungen zum Mechanismus des molekularen Chaperons Hsp90 mittels photoinduzierter Elektronentransfer-Fluoreszenzlöschung N2 - The molecular chaperone Hsp90 facilitates the folding and activation of a wide array of structurally and functionally diverse client proteins. Hsp90 presents a central node of protein homeostasis and is frequently involved in the development of many human diseases. Although Hsp90 is a promising target for disease treatment, the mechanism by which Hsp90 facilitates client recognition and maturation is poorly understood. The shape of the homodimeric protein resembles a molecular clamp that opens and closes in response to binding and hydrolysis of ATP. Structural studies reveal a network of distinct local conformational rearrangements that coordinate the slow transition into the hydrolysis-active, closed state configuration (time order of minutes). However, the kinetics of local conformational changes remain elusive because spectroscopic tools that can detect them have been missing so far. Fluorescence quenching of extrinsic fluorophores by the natural amino acid Tryptophan is based on a photoinduced electron transfer (PET) reaction, which requires sub-nanometer contact between fluorophore and Tryptophan. This quenching mechanism has been developed into a 1-nm spectroscopic tool for the detection of rapid protein folding dynamics. Within the scope of this doctoral thesis, PET-reporter systems were designed to investigate the kinetics of local conformational motions that are part of the mechanistic core of the Hsp90 chaperone cycle. ATP-triggered kinetics of closure of the ATP-lid as well as swapping of the N-terminal ß-strand across subunits and association of the N-terminal and middle-domain were estimated in solution. Bulk experiments revealed that local motions occur on similar timescales and are in good agreement with the ATP-hydrolysis rate. Functional mutations demonstrated that local motions act cooperatively. Furthermore, the lid was shown to close via a two-step process consisting of a rapid lid-reconfiguration in direct response to ATP-binding, followed by slow closure of the lid. The co-chaperone Aha1 seems to act early in the chaperone cycle by remodelling of the lid and by stabilization of apo Hsp90 in a NM-domain pre-associated conformation. A two-colour single-molecule PET microscopy method was developed to observe local motions at remote positions simultaneously and in real-time. Thus, directionality within the network of local conformational changes could be revealed. In a first attempt, the feasibility of detecting PET-complexes on the single-molecule surface was tested on Hsp90 constructs that report on only one motion (one-colour single-molecule PET microscopy). PET-quenched complexes could be distinguished from photobleached fluorophores through oxidation by molecular oxygen, resulting in fluorescence recovery. In two-colour experiments, a dimmed state was identified for PET-quenched complexes, but not for all of the used PET-reporter systems. Results suggest that local motions occur simultaneously within the time-resolution of the experiment (0.3 sec). Furthermore, bi-exponential kinetics of transition into the closed clamp configuration indicate a more complex mechanism of clamp-closure than of clamp-opening, which could be well described by a mono-exponential function. N2 - Das molekulare Chaperon Hsp90 ermöglicht die korrekte Faltung und Aktivierung eines breiten Spektrums an strukturell und funktionell unterschiedlichen Klienten-Proteinen. Hsp90 bildet einen zentralen Knotenpunkt der Protein-Homöostase und ist an der Entstehung einer Vielzahl von humanen Erkrankungen beteiligt. Trotz des vielversprechenden Potentials, das Hsp90 als Zielprotein für die Behandlung von Erkrankungen besitzt, ist der Mechanismus, durch den Hsp90 seinen Klienten erkennt und dessen Reifung gewährt, noch unbekannt, Die Gestalt des homodimeren Proteins ähnelt einer molekularen Klammer, die sich durch Bindung und Hydrolyse von ATP öffnet und schließt. Strukturelle Studien zeigen ein Netzwerk an weit voneinander entfernt liegenden lokalen Konformationsänderungen, die den langsamen Übergang (im Bereich von Minuten) in die Hydrolyse-aktive, geschlossene Konfiguration koordinieren. Allerdings sind die Kinetiken der lokalen Konformationsänderungen unbekannt, da es bisher noch keine spektroskopische Methode gibt, die diese detektieren könnte. Die natürliche Aminosäure Tryptophan kann durch eine photoinduzierte-Elektronentransfer-(PET)-Reaktion die Fluoreszenz extrinsischer Fluorophore löschen. Fluorophor und Tryptophan müssen hierfür in einer Kontakt-Distanz im sub-nanometer Bereich stehen. Dieser Lösch-Mechanismus wurde zu einem 1-nm sensitiven, spektroskopischen Werkzeug entwickelt, das für die Detektion schneller Proteinfaltungsdynamiken angewendet werden kann. Im Rahmen der hier vorliegenden Dissertation wurden PET-Reporter-Systeme entworfen. Diese dienten der Untersuchung lokaler Konformationsänderungen, die Teil des mechanistischen Kerns des Hsp90-Chaperon-Zyklus sind. ATP-induzierte Kinetiken des ATP-Lid Schlusses sowie des Untereinheiten-Wechsels des N-terminalen ß-Faltblatts als auch der Assoziation der N-terminalen mit der mittleren Domäne wurden ermittelt. In Ensemble Experimenten konnte gezeigt werden, dass lokale Bewegungen auf ähnlichen Zeitskalen stattfinden und in guter Übereinstimmung mit der ATP-Hydrolyserate sind. Durch die Anwendung von Funktionsmutanten konnte demonstriert werden, dass die lokalen Bewegungen zusammenwirkend geschehen. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Lid anhand eines zweistufigen Prozesses schließt. Dieser besteht aus einer, durch die Bindung von ATP ausgelösten, raschen Lid-Rekonfiguration, gefolgt von der langsamen Schließung des Lids. Das Co-Chaperon Aha1 scheint den ATPase-Zyklus bereits in einem frühen Stadium, durch die Remodellierung der Lid-Konformation und die Stabilisierung des apo-Hsp90 in einer vor-assoziierten Konformation der NM-Domänen, zu beeinflussen Des Weiteren wurde eine Zwei-Farben-Einzelmolekül-PET-Mikroskopie-Methode entwickelt, die es ermöglicht lokale Bewegungen an entfernten Positionen simultan und in Echtzeit zu beobachten. Dadurch kann festgestellt werden, ob eine Richtungscharakteristik innerhalb des Netzwerks lokaler Konformationsänderungen besteht. Hierfür wurde zunächst anhand von einfach markierten Hsp90 Konstrukten, die nur eine Bewegung darstellen, getestet ob die Detektion von PET-Komplexen auf der Einzelmoleküloberfläche möglich ist (Ein-Farben-Einzelmolekül-PET-Mikroskopie). Die Fluoreszenz PET-gelöschter Komplexe konnte mittels Oxidation durch molekularen Sauerstoff wiederhergestellt werden, wodurch eine Unterscheidung zu photogebleichten Fluorophoren möglich war. In Zwei-Farben-Experimenten konnte zudem ein gedimmter Zustand der PET-gelöschten Fluorophore festgestellt werden, allerdings nicht für jedes der verwendeten PET-Reportersysteme. Die Ergebnisse deuten auf ein innerhalb der Zeitauflösung des Experiments (0.3 sec) gleichzeitiges Auftreten der lokalen Bewegungen hin. Des Weiteren scheint der Mechanismus des Klammerschlusses komplexer zu sein, als der Mechanismus der Klammeröffnung. Während die Kinetiken der Klammeröffnung durch eine mono-exponentielle Fit-funktion angepasst werden konnten, benötigte der Klammerschluss eine bi-exponentielle Anpassungsfunktion. KW - Hitzeschock-Proteine KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Fluoreszenzspektroskopie KW - Kinetik KW - Heat shock protein 90 KW - Hitzeschockprotein 90 KW - photoinduzierter Elektronentransfer KW - photoinduced electron transfer KW - single molecule microscopy Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162155 ER -