TY - CHAP A1 - Fiala, Brigitte A1 - Rabenstein, R. A1 - Maschwitz, Ulrich T1 - Ant-attracting plant-structures: Food bodies of SE Asian Vitaceae N2 - No abstract available KW - Pflanzen Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55177 ER - TY - THES A1 - Gupta, Kapuganti Jagadis T1 - Nitric oxide in plants: Investigation of synthesispathways and role in defense against avirulent Pseudomonas N2 - Die Zahl der physiologischen Prozesse in Pflanzen, die scheinbar durch NO reguliert werden, hat in den letzten Jahren stark zugenommen. NO übernimmt wichtige Rollen für die Steuerung von Wachstum und Entwicklung, für die Pathogenresistenz und bei abiotischem Stress, sowohl in unterirdischen als auch in oberirdischen Organen. In Pflanzen wurden bisher eine Reihe verschiedener enzymatischer und einige wenige nichtenzymatische Synthesewege für NO vorgeschlagen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand nun darin, die NO Produktion von Pflanzen und speziell von Wurzeln möglichst quantitativ zu erfassen und die beteiligten Enzyme zu identifizieren. Dieses Ziel sollte vor allem durch Chemilumineszenz-Messung von NO in der Gasphase (= direkte Chemilumineszenz) erreicht werden, aber auch durch die indirekte Chemilumineszenz, bei welcher Spuren von NO-Oxidationsprodukten wie Nitrat und Nitrit erfasst werden. Als Versuchspflanzen wurden verwendet: Wildtypen von Nicotiana tabacum cv. Xanthi oder cv. Gatersleben; Nitratreduktase-freie, auf Ammonium-N angezogene Mutanten, die keine Nitratreduktase (NR) induzieren; WT Pflanzen, die auf Wolframat angezogen wurden um die Synthese funktionaler MoCo-Enzyme zu unterbinden; eine NO-überproduzierende, Nitritreduktase (NiR)-freie Transformante, sowie gelegentlich Gerste, Reis und Erbsen. Eine hypersensitive Reaktion (HR) von Tabak wurde erzeugt durch Druckinfiltration von avirulenten Bakterien des Stammes Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Bei Sauerstoffkonzentrationen ≤1% wurde exogenes Nitrit auch von völlig NR-freien Wurzeln zu NO reduziert. Folglich war NR nicht die einzige NO-Quelle von Wurzeln. Im Gegensatz dazu waren NR-freie Blattstreifen nicht in der Lage, Nitrit zu NO umzusetzen. Die NO-Bildung von Wurzeln wurde außerdem durch Hemmstoffe des mitochondrialen Elektronentransportes, Myxothiazol und Salicylhydroxamsäure (SHAM) gehemmt, während die NO-Produktion von NR-exprimierenden Blattstreifen gegen diese Inhibitoren unempfindlich war. Damit stimmte auch überein, dass gereinigte Mitochondrien aus Wurzeln, aber nicht die aus Blättern Nitrit mit Hilfe von NADH zu NO reduzieren konnten. Die Inhibitor-Wirkung lässt darauf schließen, dass in Wurzelmitochondrien beide terminalen Oxidasen and der NO-Bildung beteiligt sind, und dass selbst in NR-haltigen Wurzeln ein großer Teil der Reduktion von Nitrit zu NO durch die Mitochondrien bewerkstelligt wird, und weniger durch NR selbst. Die Unterschiedliche Fähigkeit von Blatt-und Wurzelmitochondrien zur anaeroben Nitrit:NO-Reduktion wurde nicht nur bei Tabak, sondern auch bei Arabidopsis, Gerste und Erbse gefunden. Sie scheint also eine generelle Eigenschaft höherer Pflanzen zu sein. Die Nitrit:NO Reduktion wurden auch direkt als Nitrit- bzw. NADH-Verbrauch gemessen. Die Reaktion war außerdem exklusiv mit der Membranfraktion der Mitochondrien assoziert, ohne jede Beteiligung von Matrixkomponenten. Es wurde auch geprüft, ob Wurzelmitochondrien und- gereinigte Membranen NO ausschließlich aus Nitrit produzierten, oder eventuell auch über eine NO-Synthase (NOS). Außerdem wurde untersucht, ob und in welchem Umfang die NO-Messungen durch eine NO-Oxidation verfälscht werden konnten. Zusätzlich zur Chemilumineszenz wurden Fluoreszenzmessungen mit Diaminofluoreszeinen (DAF) zum Vergleich herangezogen. In Luft produzierten Mitochondrien ja kein Nitrit-abhängiges NO, und eine NOS-Aktivität konnte weder durch direkte noch durch indirekte Chemilumineszenz nachgewiesen werden. Mit DAF-2 oder DAR-4M wurde jedoch eine L-Arginin-abhängige Fluoreszenzerhöhung beobachtet. Diese scheinbare NOS-Aktivität wurde mit kommerzieller iNOS verglichen und zeigte dabei sehr untypische Antworten auf NOS-Inhibitoren, Substrate und Kofaktoren. Sie wird deshalb als Artefakt beurteilt. Bei Verwendung von iNOS wurden ca. 2/3 des insgesamt produzierten NO zu (Nitrit+Nitrat) oxidiert. Mitochondrien scheinen NO zu verbrauchen, ohne jedoch die Oxidation von NO zu (Nitrit+Nitrat) zu erhöhen. Vermutlich wird dabei ein flüchtiges Intermediat gebildet (eventuell N2O3). In unserer Gruppe wurde kürzlich gezeigt, dass der pilzliche Elicitor Cryptogein eine hypersensitive Reaktion (HR) bei Tabak hervorrief, die völlig unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit von NR war. Eine Schlussfolgerung daraus war, dass die NR-abhängige NO-Bildung für die HR keine Rolle spielte. Hier präsentieren wir Hinweise darauf, dass dieses Szenario Cryptogein-spezifisch sein könnte. Pseudomonas syringae pv phaseolicola wurde in Tabakblätter des Wildtyps und derNiR-defizienten, NO-überproduzierenden Mutante (clone 271) infiltriert, die entweder auf Ammonium oder auf Nitrat angezogen waren. Es wurde die Entwicklung der Läsionen, das Bakterienwachstum und die Zuckerkonzentrationen in den Blättern und im Blattapoplasten verfolgt. Die Läsionen-Entwicklung war positiv, und das Bakterienwachstum negativ korreliert mit der Nitrat-Ernährung und einer eventuellen NO-Produktion. Das Bakterienwachstum war positiv korreliert mit einer Ammonium-Ernährung und mit apoplastischen Zuckerkonzentrationen. Der Gesamtgehalt an freier + konjugierter Salicylsäure (SA) war durch bakterielle Infektion immer drastisch gesteigert, aber ohne klare Korrelation mit einer NO-Produktion. In Gegenwart von Cryptogein war das Wachstum von Pseudomonas fast völlig gehemmt. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die vermutete gegenseitige Abhängigkeit von Bakterienwachstum, NO-Produktion und der HR sehr komplex ist und nicht auf einfache unifaktorielle Beziehungen reduziert werden kann. N2 - During the last few years an increasing number of physiological processes in plants have been shown to be regulated by NO. NO plays important roles in growth and development, plant disease resistance, abiotic stress, and in above and underground plant organs. In recent years several enzymatic pathways and few non-enzymatic pathways were proposed for nitric oxide production in plants. The major goal of this work was to quantify NO production by plants and especially by roots, and to identify the enzymes responsible for NO production. As a major method, NO production by roots was followed through on-line measurement of NO emission into the gas phase by chemiluminescence (= direct chemiluminescence), and also by indirect chemiluminescence where trace amounts of oxidized products like NO2- and NO3- can be easily measured. Plants used were tobacco wild-type (N. tabacum cv Xanthi or cv Gatersleben), NR-free mutants grown on ammonium in order to prevent NR induction, plants grown on tungstate to inhibit synthesis of functional MoCo-enzymes, and a NO-overproducing nitrite reductase (NiR)-deficient transformant as well as barley, rice and pea. Induction of a hypersensitive response (HR) in tobacco leaves was achieved by using avirulent Pseudomonas syringae pv phaseolicola. At oxygen concentrations of <1%, even completely nitrate reductase (NR)-free root tissues reduced added nitrite to NO, indicating that in roots, NR was not the only source for nitrite-dependent NO formation. By contrast, NR-free leaf slices were not able to reduce nitrite to NO. Root NO formation was blocked by inhibitors of mitochondrial electron transport (Myxothiazol and SHAM), whereas NO formation by NR containing leaf slices was insensitive to the inhibitors. Consistent with that, mitochondria purified from roots, but not those from leaves, reduced nitrite to NO at the expense of NADH. The inhibitor studies suggest that, in root mitochondria, both terminal oxidases participate in NO formation, and they also suggest that even in NR-containing roots, a large part of the reduction of nitrite to NO was catalysed by mitochondria, and less by NR. The differential capacity of root and leaf mitochondria to reduce nitrite to NO appears to be common among higher plants, since it was observed with Arabidopsis, barley, pea, and tobacco. Nitrite and NADH consumption by mitochondria were also measured. Anaerobic, nitrite-dependent NO emission was exclusively associated with the membrane fraction, without participation of matrix components. It was also examined whether root mitochondria and mitochondrial membranes produce nitric oxide (NO) exclusively by reduction of nitrite or also via a nitric oxide synthase (NOS),- and to what extent direct NO measurements could be falsified by NO oxidation. In addition to chemiluminescence, Diaminofluoresceins (DAF) were used as an NO indicators for comparison. In air, mitochondria apparently produced no nitrite-dependent NO, and no NOS activity was detected by direct or indirect chemiluminescence. In contrast, with DAF-2 and DAR-4M an L-arginine-dependent fluorescence increase took place. However, the response of this apparent NOS activity to inhibitors, substrates and cofactors was untypical when compared with commercial iNOS and is considered an artefact. With iNOS, about 2/3 of the NO were oxidized to (nitrite + nitrate). Mitochondria also appear to consume NO without increasing oxidation to (nitrite+ nitrate). We therefore assume formation of NO to a volatile intermediate (eventually N2O3). It was recently shown that the hypersensitive response (HR) of tobacco triggered by the fungal elicitor cryptogein occurred independent of the presence or absence of nitrate reductase (NR). One conclusion was that NR-dependent NO formation played no role in the HR. Here we present evidence that the described scenario may be specific for cryptogein. Pseudomonas syringae pv. phaseolicola was infiltrated into tobacco leaves from WT plant and from the NiR-deficient NO-overproducing clone 271, grown either on nitrate or ammonium. Lesion development as well as bacterial growth and sugar concentrations in leaves and in the leaf apoplast was monitored. Lesion development was positively and bacterial growth was negatively correlated with nitrate nutrition and eventually with NO formation. Bacterial growth was positively correlated with ammonium nutrition and apoplastic sugar concentrations. Total (free and conjugated) SA content were always drastically increased by bacterial infection, but there was no clear correlation with NO production. In the presence of cryptogein, Pseudomonas growth was drastically reduced. This shows that the assumed interdependence of bacterial growth, NO production and the HR is complex and not unifactorial. KW - Pflanzen KW - Nitric Oxide KW - Mitochondria KW - Nitrate Reductase KW - Nitric Oxide Synthase KW - Nitrite KW - Stickstoffoxide KW - Stickstoffoxidsynthase KW - Mitochondrium KW - Nitratreduktase Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25545 ER - TY - THES A1 - Kehrberger, Sandra T1 - Effects of climate warming on the timing of flowering and emergence in a tritrophic relationship: plants - bees - parasitoids T1 - Auswirkungen der Klimaerwärmung auf die zeitliche Regulierung der Blüte und des Schlupfes in einer tritrophischen Beziehung: Pflanzen - Bienen - Parasitoide N2 - The right timing of phenological events is crucial for species fitness. Species should be highly synchronized with mutualists, but desynchronized with antagonists. With climate warming phenological events advance in many species. However, often species do not respond uniformly to warming temperatures. Species-specific responses to climate warming can lead to asynchrony or even temporal mismatch of interacting species. A temporal mismatch between mutualists, which benefit from each other, can have negative consequences for both interaction partners. For host-parasitoid interactions temporal asynchrony can benefit the host species, if it can temporally escape its parasitoid, with negative consequences for the parasitoid species, but benefit the parasitoid species if it increases synchrony with its host, which can negatively affect the host species. Knowledge about the drivers of phenology and the species-specific responses to these drivers are important to predict future effects of climate change on trophic interactions. In this dissertation I investigated how different drivers act on early flowering phenology and how climate warming affects the tritrophic relationship of two spring bees (Osmia cornuta & Osmia bicornis), an early spring plant (Pulsatilla vulgaris), which is one of the major food plants of the spring bees, and three main parasitoids of the spring bees (Cacoxenus indagator, Anthrax anthrax, Monodontomerus). In Chapter II I present a study in which I investigated how different drivers and their change over the season affect the reproductive success of an early spring plant. For that I recorded on eight calcareous grasslands around Würzburg, Germany the intra-seasonal changes in pollinator availability, number of co-flowering plants and weather conditions and studied how they affect flower visitation rates, floral longevity and seed set of the early spring plant P. vulgaris. I show that bee abundances and the number of hours, which allowed pollinator foraging, were low at the beginning of the season, but increased over time. However, flower visitation rates and estimated total number of bee visits were higher on early flowers of P. vulgaris than later flowers. Flower visitation rates were also positively related to seed set. Over time and with increasing competition for pollinators by increasing numbers of co-flowering plants flower visitation rates decreased. My data shows that a major driver for early flowering dates seems to be low interspecific competition for pollinators, but not low pollinator abundances and unfavourable weather conditions. Chapter III presents a study in which I investigated the effects of temperature on solitary bee emergence and on the flowering of their food plant and of co-flowering plants in the field. Therefore I placed bee cocoons of two spring bees (O. cornuta & O. bicornis) on eleven calcareous grasslands which differed in mean site temperature. On seven of these grasslands the early spring plant P. vulgaris occurred. I show that warmer temperatures advanced mean emergence in O. cornuta males. However, O. bicornis males and females of both species did not shift their emergence. Compared to the bees P. vulgaris advanced its flowering phenology more strongly with warmer temperatures. Co-flowering plants did not shift flowering onset. I suggest that with climate warming the first flowers of P. vulgaris face an increased risk of pollinator limitation whereas for bees a shift in floral resources may occur. In Chapter IV I present a study in which I investigated the effects of climate warming on host-parasitoid relationships. I studied how temperature and photoperiod affect emergence phenology in two spring bees (O. cornuta & O. bicornis) and three of their main parasitoids (C. indagator, A. anthrax, Monodontomerus). In a climate chamber experiment with a crossed design I exposed cocoons within nest cavities and cocoons outside of nest cavities to two different temperature regimes (long-term mean of Würzburg, Germany and long-term mean of Würzburg + 4 °C) and three photoperiods (Würzburg vs. Snåsa, Norway vs. constant darkness) and recorded the time of bee and parasitoid emergence. I show that warmer temperatures advanced emergence in all studied species, but bees advanced less strongly than parasitoids. Consequently, the time period between female bee emergence and parasitoid emergence decreased in the warm temperature treatment compared to the cold one. Photoperiod influenced the time of emergence only in cocoons outside of nest cavities (except O. bicornis male emergence). The data also shows that the effect of photoperiod compared to the effect of temperature on emergence phenology was much weaker. I suggest that with climate warming the synchrony of emergence phenologies of bees and their parasitoids will amplify. Therefore, parasitism rates in solitary bees might increase which can negatively affect reproductive success and population size. In this dissertation I show that for early flowering spring plants low interspecific competition for pollinators with co-flowering plants is a major driver of flowering phenology, whereas other drivers, like low pollinator abundances and unfavourable weather conditions are only of minor importance. With climate warming the strength of different drivers, which act on the timing of phenological events, can change, like temperature. I show that warmer temperatures advance early spring plant flowering more strongly than bee emergence and flowering phenology of later co-flowering plants. Furthermore, I show that warmer temperatures advance parasitoid emergence more strongly than bee emergence. Whereas temperature changes can lead to non-uniform temporal shifts, I demonstrate that geographic range shifts and with that altered photoperiods will not change emergence phenology in bees and their parasitoids. In the tritrophic system I investigated in this dissertation climate warming may negatively affect the reproductive success of the early spring plant and the spring bees but not of the parasitoids, which may even benefit from warming temperatures. N2 - Der richtige Zeitpunkt von phänologischen Ereignissen ist maßgeblich für das Überleben und die Fortpflanzung einer Art. Arten sollten eine möglichst hohe Synchronisation mit Mutualisten aufweisen, aber eine möglichst geringe mit Antagonisten. Die Klimaerwärmung führt dazu, dass sich bei vielen Arten phänologische Ereignisse verfrühen. Allerdings reagieren Arten unterschiedlich auf wärmere Temperaturen. Artspezifische Reaktionen auf die Klimaerwärmung können zu Asynchronität oder sogar zu zeitlicher Diskrepanz bei interagierenden Arten führen. Eine zeitliche Diskrepanz zwischen Mutualisten, die voneinander profitieren, kann sich negativ auf beide Interaktionspartner auswirken. Bei Wirt-Parasitoid Beziehungen kann der Wirt von einer zeitlichen Diskrepanz profitieren, wenn er seinem Parasitoid zeitlich entfliehen kann, was wiederum negative Folgen für den Parasitoid haben kann. Jedoch kann der Parasitoid profitieren, wenn er die Synchronisation mit seinem Wirt erhöhen kann, was wiederum den Wirt negativ beeinflussen kann. Das Wissen über die Treiber von phänologischen Ereignissen und die artspezifischen Reaktionen auf diese Treiber sind von Bedeutung um die Auswirkungen des Klimawandels auf trophische Beziehungen vorherzusagen. In meiner Doktorarbeit habe ich untersucht, wie verschiedene Treiber mit einer frühen Blüte zusammenhängen und wie der Klimawandel die tritrophische Beziehung von zwei Frühlingsbienen (Osmia cornuta & Osmia bicornis), einer Frühlingspflanzenart (Pulsatilla vulgaris), die eine der wichtigen Futterpflanzen der Bienen ist, und der drei Hauptparasitoiden der Frühlingsbienen (Cacoxenus indagator, Anthrax anthrax, Monodontomerus) beeinflusst. In Kapitel II präsentiere ich eine Studie, in der ich den Einfluss verschiedener Treiber und ihre saisonale Veränderung auf den Fortpflanzungserfolg einer Frühlingspflanzenart untersucht habe. Dazu habe ich auf acht Kalkmagerrasen bei Würzburg (Deutschland) die innersaisonalen Veränderungen der Bestäuberverfügbarkeit, der Anzahl an gleichzeitig blühenden Pflanzenarten und die Wetterbedingungen aufgezeichnet. Des Weiteren habe ich erforscht wie diese Faktoren die Blütenbesuchsrate, die Blütenlanglebigkeit und den Samenansatz der Frühlingspflanze P. vulgaris beeinflussen. Ich konnte zeigen, dass die Anzahl an Bienen und die Anzahl an Stunden, die ein Furagieren von Bestäubern ermöglicht hätten, am Anfang der Saison niedrig waren und mit der Zeit zunahmen. Jedoch war die Blütenbesuchsrate und die geschätzte Anzahl an Bienenbesuchen höher bei frühen als bei späten P. vulgaris Blüten. Die Blütenbesuchsrate wirkte sich auch positiv auf den Samenansatz aus. Die Blütenbesuchsrate nahm mit der Zeit und mit zunehmender Konkurrenz um Bestäuber durch eine zunehmende Anzahl an gleichzeitig blühenden Pflanzenarten ab. Meine Daten zeigen, dass ein Hauptreiber von frühen Blühzeitpunkten die geringe zwischenartliche Konkurrenz um Bestäuber ist, aber nicht die niedrige Bestäuberanzahl und ungünstige Wetterbedingungen. Kapitel III präsentiert eine Studie, in welcher ich die Auswirkungen der Temperatur auf den Schlupf von Solitärbienen und die Blüte ihrer Futterpflanzen und gleichzeitig blühenden Pflanzen im Freiland untersucht habe. Dafür habe ich Bienenkokons von zwei Frühlingsbienen (O. cornuta & O. bicornis) auf elf Kalkmagerrasen, die sich in der mittleren Flächentemperatur unterschieden, platziert. Auf sieben dieser Kalkmagerrasen kam die Frühlingspflanzenart P. vulgaris vor. Ich konnte zeigen, dass wärmere Temperaturen den mittleren Schlupf von O. cornuta Männchen verfrühen. Die Männchen von O. bicornis und die Weibchen beider Arten haben ihren Schlupfzeitpunkt jedoch nicht verschoben. Im Vergleich zu den Bienen verfrühte P. vulgaris seine Blühphänologie bei warmen Temperaturen stärker. Die gleichzeitig blühenden Pflanzenarten verschoben ihren Blühbeginn nicht. Die Daten zeigen, dass wärmere Temperaturen den Bienenschlupf weniger stark verfrühen als die Blüte ihrer Futterpflanze. Das lässt darauf schließen, dass mit dem Klimawandel die ersten Blüten von P. vulgaris ein erhöhtes Risiko haben nicht bestäubt zu werden, während die Bienen möglicherweise auf andere Blühressourcen ausweichen müssen. Kapitel IV beschreibt eine Studie, in welcher ich die Auswirkungen der Klimaerwärmung auf Wirt-Parasitoid Beziehungen untersucht habe. Dabei habe ich die Auswirkungen von Temperatur und Photoperiode auf die Schlupfphänologie zweier Frühlingsbienen (O. cornuta & O. bicornis) und drei ihrer Hauptparasitoide (C. indagator, A. anthrax, Monodontomerus) erforscht. In einem Klimakammerexperiment mit gekreuztem Design habe ich Kokons in Nesthöhlen und Kokons außerhalb von Nesthöhlen, zwei verschiedenen Temperaturregimen (Langzeitmittel von Würzburg, Deutschland und Langzeitmittel von Würzburg + 4 °C) und drei Photoperioden (Würzburg, Deutschland contra Snåsa, Norwegen contra Dauerdunkel) ausgesetzt und die Zeitpunkte des Bienen- und Parasitoidenschlupfes aufgezeichnet. Ich konnte zeigen, dass warme Temperaturen in allen untersuchten Arten den Schlupfzeitpunkt verfrühten, jedoch bei den Bienen weniger stark als bei den Parasitoiden. Eine Folge daraus ist, dass sich die Zeitspanne zwischen dem Schlupf der Bienenweibchen und dem Schlupf der Parasitoide im warmen Temperaturregime im Vergleich zum kalten verkürzte. Die Photoperiode hatte auf den Zeitpunkt des Schlupfes nur in Kokons außerhalb von Nisthöhlen einen Effekt (außer beim Schlupf von O. bicornis Männchen). Die Daten zeigen auch, dass der Effekt der Photoperiode auf die Schlupfphänologie im Vergleich zu dem Effekt der Temperatur viel schwächer war. Daraus schließe ich, dass sich im Zuge der Klimaerwärmung die Synchronisation der Schlupfphänologien von Bienen und ihren Parasitoiden verstärken wird. Eine Folge davon könnten erhöhte Parasitierungsraten bei Solitärbienen sein, welche den Reproduktionserfolg und die Populationsgröße negativ beeinflussen können. In dieser Doktorarbeit habe ich gezeigt, dass einer der Haupttreiber einer frühen Blüte bei Frühlingspflanzen geringe zwischenartliche Konkurrenz um Bestäuber mit später gleichzeitig blühenden Pflanzenarten ist, während andere Treiber, wie geringe Bestäuberabundanzen und ungünstige Wetterbedingungen nur von geringer Bedeutung sind. Im Zuge des Klimawandels könnte sich die Stärke verschiedener Treiber, die den Zeitpunkt von phänologischen Ereignissen beeinflussen, verändern. Ich konnte außerdem zeigen, dass wärmere Temperaturen die Blüte von frühen Frühlingspflanzen stärker verfrühen, als den Schlupf von Bienen und die Blüte von später gleichzeitig blühenden Pflanzenarten. Des Weiteren zeigte ich, dass wärmere Temperaturen den Schlupf von Parasitoiden stärker verfrühen als den Schlupf der Bienen. Ich konnte zeigen, dass während Temperaturveränderungen zu verschieden starken zeitlichen Verschiebungen führen können, Verschiebungen von geografischen Verbreitungsgebieten und damit geänderten Photoperioden die Schlupfphänologie von Bienen und ihren Parasitoiden wahrscheinlich nicht ändern werden. In dem tritrophischen System, das ich in dieser Doktorarbeit untersucht habe, könnte die Erwärmung des Klimas den Fortpflanzungserfolg der frühen Frühlingspflanze und der Frühlingsbienen negativ beeinflussen, aber wahrscheinlich nicht die der Parasitoide, die vielleicht sogar davon profitieren können. KW - Biene KW - Klimaänderung KW - Interaktion KW - Parasitoid KW - Pflanzen KW - Klimaerwärmung KW - Mutualismus KW - Antagonismus KW - Synchronisation KW - Phänologie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213932 ER - TY - THES A1 - Kuhlmann, Franziska T1 - The influence of ultraviolet radiation on plant-insect interactions T1 - Der Einfluss von ultravioletter Strahlung auf Pflanzen-Insekten Interaktionen N2 - Plants must respond to multiple stimuli in a natural environment. Therefore they need the ability to rapidly reorganise and specifically build up appropriate metabolites to adapt to their environment. Abiotic cues, such as ambient solar radiation, influence the next trophic level directly, but also an altered plant composition triggered by these environmental cues can have an effect on the behaviour of herbivores. The aim of this study was to test effects of the important ultraviolet (UV) radiation on plants and on plant-insect interactions using multi-level investigations. The focus was on the conduction of controlled experiments with broccoli plants in highly engineered greenhouses covered with innovative materials, which only differed in their UV-B transmission. For the first time in this controlled environment the plant-mediated UV-B effects on phloem-feeding aphids were studied. Broccoli plants (Brassica oleracea L. convar. botrytis, Brassicaceae) were under filter tents either exposed to (inclusion, +UV) or not exposed to (exclusion, -UV) UV-A / UV-B radiation. In greenhouses covered with new, innovative materials transmitting high (80%), medium (23%) or low (4%) levels of ambient solar UV-B radiation, in particular the influence of UV-B radiation on broccoli was examined. Plants respond highly specific to environmental stimuli such as UV-B radiation and herbivory. UV-B radiation has a strong impact on the plants’ architecture and flavonoid contents, which can in turn influence plant-insect interactions. Phloem-feeding aphids can be negatively affected by UV-B mediated plant changes. However, a direct effect of UV radiation on the behaviour of herbivores is also evident. Mainly the number, composition and quality of herbivorous species as well as an exceeding of a certain infestation threshold determine the mode of plant changes. In conclusion, UV-B radiation has the potential to harden plants against herbivores and simultaneously increases the concentrations of valuable secondary metabolites for human nutrition in important crop species such as broccoli. N2 - In ihrer natürlichen Umgebung sind Pflanzen verschiedensten und vor allem wechselnden Umwelteinflüssen ausgesetzt, auf die sie schnell und angemessen reagieren müssen. Das Insektenverhalten der nächsten trophischen Ebene wird direkt durch abiotische Umweltfaktoren, wie zum Beispiel Sonnenstrahlung, sowie durch daraus resultierende Veränderungen in Pflanzen gesteuert. Das Ziel dieser Untersuchung war es, herauszufinden, wie sich ultraviolette (UV) Strahlung auf Pflanzen und Pflanzen-Insekten Interaktionen auswirken kann. Dies wurde auf verschiedensten Ebenen untersucht. Mit Hilfe von speziell angefertigten Gewächshäusern konnten Brokkolipflanzen unter kontrollierten UV-B Bedingungen angezogen werden. Der Einfluss von UV-B Strahlung auf Brokkoli und von UV-B induzierten Effekten in Brokkoli auf phloem-fressende Blattläuse wurde erstmals untersucht. Die Experimente wurden mit Brokkolipflanzen (Brassica oleracea L. convar. botrytis, Brassicaceae) durchgeführt, die in Folienzelten mit unterschiedlicher UV-Strahlungsdurchlässigkeit exponiert wurden. Die Eindeckungen der Folienzelte waren entweder UV-A / UV-B durchlässig (+UV) oder undurchlässig (-UV). Gewächshäuser mit innovativen Eindeckungsmaterialien, die speziell UV-B in hohen (80%), mittleren (23%) oder geringen (4%) Mengen transmittierten, wurden genutzt, um den alleinigen Effekt von UV-B Strahlung auf Pflanzen hervorzuheben. Pflanzen reagieren auf verschiedene Umweltreize wie zum Beispiel UV-B Strahlung und Herbivorie sehr zielgerichtet. UV-B Strahlung hat einen starken Einfluss auf das Pflanzenwachstum und die Flavonoidgehalte, was wiederum Pflanzen-Insekten Interaktionen artspezifisch steuern kann. Phloem-fressende Herbivoren können durch UV-B-induzierte Pflanzenveränderungen negativ beeinflusst werden. Ein direkter UV-Effekt auf das Verhalten von Herbivoren ist jedoch ebenfalls erwiesen. Sowohl die Anzahl, Zusammensetzung und Qualität von Herbivorenarten also auch das Überschreiten einer definierten Befallsschwelle bestimmen das Ausmaß der Pflanzenveränderungen. Zusammenfassend ist zu sagen, dass UV-B Strahlung Pflanzen gegenüber Fraßfeinden abhärten und gleichzeitig die Konzentration wertvoller pflanzlicher Inhaltsstoffe für die menschliche Ernährung in Feldfrüchten erhöhen kann. KW - ultraviolette Strahlung KW - Pflanzen KW - Insekten KW - chemische Ökologie KW - ultraviolette Strahlung KW - Pflanzen KW - Insekten KW - chemische Ökologie KW - ultraviolet radiation KW - plant KW - insect KW - chemical ecology Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39608 ER - TY - THES A1 - Kunz, Marcel T1 - Diffusion kinetics of organic compounds and water in plant cuticular model wax under the influence of diffusing barrier-modifying adjuvants T1 - Diffusionskinetiken organischer Verbindungen und Wasser in pflanzlichem kutikulärem Modellwachs unter dem Einfluss von diffundierenden, barriere-modifizierenden Adjuvantien N2 - To reach their target site, systemic pesticides must enter the plant from a spray droplet applied in the field. The uptake of an active ingredient (AI) takes place via the barrier-forming cuticular membrane, which is the outermost layer of the plant, separating it from the surrounding environment. Formulations are usually used which, in addition to the AI, also contain stabilizers and adjuvants. Adjuvants can either have surface-active properties or they act directly as barrier-modifying agents. The latter are grouped in the class of accelerating adjuvants, whereby individual variants may also have surface-active properties. The uptake of a pesticide from a spray droplet depends essentially on its permeability through the cuticular barrier. Permeability defines a combined parameter, which is the product of AI mobility and AI solubility within the cuticle. In recent decades, several tools have been developed that allowed the determination of individual parameters of organic compound penetration across the cuticular membrane. Nevertheless, earlier studies showed that mainly cuticular waxes are the barrier-determining component of the cuticular membrane and additionally, it was shown that mainly the very-long-chain aliphatic compounds (VLCAs) are responsible for establishing an effective barrier. However, the barrier-determining role of the individual VLCAs, being classified according to their respective functional groups, is still unknown. Therefore, the following objectives were pursued and achieved in this work: (1) A new ATR-FTIR-based approach was developed to measure the temperature-dependent real-time diffusion kinetics of organic models for active ingredients (AIs) in paraffin wax, exclusively consisting of very-long chain alkanes. (2) The developed ATR-FTIR approach was applied to determine the diffusion kinetics of self-accelerating adjuvants in cuticular model waxes of different VLCA composition. At the same time, wax-specific changes were recorded in the respective IR spectra, which provided information about the respective wax modification. (3) The ATR-FTIR method was used to characterize the diffusion kinetics, as well as to determine the wax-specific sorption capacities for an AI-modeling organic compound and water in cuticular model waxes after adjuvant treatment. Regarding the individual chemical compositions and structures, conclusions were drawn about the adjuvant-specific modes of action (MoA). In the first chapter, the ATR-FTIR based approach to determine organic compound diffusion kinetics in paraffin wax was successfully established. The diffusion kinetics of the AI modelling organic compounds heptyl parabene (HPB) and 4-cyanophenol (CNP) were recorded, comprising different lipophilicities and molecular volumes typical for AIs used in pesticide formulations. Derived diffusion coefficients ranged within 10-15 m2 s-1, thus being thoroughly higher than those obtained from previous experiments using an approach solely investigating desorption kinetics in reconstituted cuticular waxes. An ln-linear dependence between the diffusion coefficients and the applied diffusion temperature was demonstrated for the first time in cuticular model wax, from which activation energies were derived. The determined activation energies were 66.2 ± 7.4 kJ mol-1 and 56.4 ± 9.8 kJ mol-1, being in the expected range of already well-founded activation energies required for organic compound diffusion across cuticular membranes, which again confirmed the significant contribution of waxes to the cuticular barrier. Deviations from the assumed Fickian diffusion were attributed to co-occurring water diffusion and apparatus-specific properties. In the second and third chapter, mainly the diffusion kinetics of accelerating adjuvants in the cuticular model waxes candelilla wax and carnauba wax were investigated, and simultaneously recorded changes in the wax-specific portion of the IR spectrum were interpreted as indications of plasticization. For this purpose, the oil derivative methyl oleate, as well as the organophosphate ester TEHP and three non-ionic monodisperse alcohol ethoxylates (AEs) C12E2, C12E4 and C12E6 were selected. Strong dependence of diffusion on the respective principal components of the mainly aliphatic waxes was demonstrated. The diffusion kinetics of the investigated adjuvants were faster in the n-alkane dominated candelilla wax than in the alkyl ester dominated carnauba wax. Furthermore, the equilibrium absorptions, indicating equilibrium concentrations, were also higher in candelilla wax than in carnauba wax. It was concluded that alkyl ester dominated waxes feature higher resistance to diffusion of accelerating adjuvants than alkane dominated waxes with shorter average chain lengths due to their structural integrity. This was also found either concerning candelilla/policosanol (n-alcohol) or candelilla/rice bran wax (alkyl-esters) blends: with increasing alcohol concentration, the barrier function was decreased, whereas it was increased with increasing alkyl ester concentration. However, due to the high variability of the individual diffusion curves, only a trend could be assumed here, but significant differences were not shown. The variability itself was described in terms of fluctuating crystalline arrangements and partial phase separation of the respective wax mixtures, which had inevitable effects on the adjuvant diffusion. However, diffusion kinetics also strongly depended on the studied adjuvants. Significantly slower methyl oleate diffusion accompanied by a less pronounced reduction in orthorhombic crystallinity was found in carnauba wax than in candelilla wax, whereas TEHP diffusion was significantly less dependent on the respective wax structure and therefore induced considerable plasticization in both waxes. Of particular interest was the AE diffusion into both waxes. Differences in diffusion kinetics were also found here between candelilla blends and carnauba wax. However, these depended equally on the degree of ethoxylation of the respective AEs. The lipophilic C12E2 showed approximately Fickian diffusion kinetics in both waxes, accompanied by a drastic reduction in orthorhombic crystallinity, especially in candelilla wax, whereas the more hydrophilic C12E6 showed significantly retarded diffusion kinetics associated with a smaller effect on orthorhombic crystallinity. The individual diffusion kinetics of the investigated adjuvants sometimes showed drastic deviations from the Fickian diffusion model, indicating a self-accelerating effect. Hence, adjuvant diffusion kinetics were accompanied by a distinct initial lag phase, indicating a critical concentration in the wax necessary for effective penetration, leading to sigmoidal rather than to exponential diffusion kinetics. The last chapter dealt with the adjuvant-affected diffusion of the AI modelling CNP in candelilla and carnauba wax. Using ATR-FTIR, diffusion kinetics were recorded after adjuvant treatment, all of which were fully explicable based on the Fickian model, with high diffusion coefficients ranging from 10-14 to 10-13 m2 s-1. It is obvious that the diffusion coefficients presented in this work consistently demonstrated plasticization induced accelerated CNP mobilities. Furthermore, CNP equilibrium concentrations were derived, from which partition- and permeability coefficients could be determined. Significant differences between diffusion coefficients (mobility) and partition coefficients (solubility) were found on the one hand depending on the respective waxes, and on the other hand depending on treatment with respective adjuvants. Mobility was higher in candelilla wax than in carnauba wax only after methyl oleate treatment. Treatment with TEHP and AEs resulted in higher CNP mobility in the more polar alkyl ester dominated carnauba wax. The partition coefficients, on the other hand, were significantly lower after methyl oleate treatment in both candelilla and carnauba wax as followed by TEHP or AE treatment. Models were designed for the CNP penetration mode considering the respective adjuvants in both investigated waxes. Co-penetrating water, which is the main ingredient of spray formulations applied in the field, was likely the reason for the drastic differences in adjuvant efficacy. Especially the investigated AEs favored an enormous water uptake in both waxes with increasing ethoxylation level. Surprisingly, this effect was also found for the lipophilic TEHP in both waxes. This led to the assumption that the AI permeability is not exclusively determined by adjuvant induced plasticization, but also depends on a “secondary plasticization”, induced by adjuvant-attracted co-penetrating water, consequently leading to swelling and drastic destabilization of the crystalline wax structure. The successful establishment of the presented ATR-FTIR method represents a milestone for the study of adjuvant and AI diffusion kinetics in cuticular waxes. In particular, the simultaneously detectable wax modification and, moreover, the determinable water uptake form a perfect basis to establish the ATR-FTIR system as a universal screening tool for wax-adjuvants-AI-water interaction in crop protection science. N2 - Um ihren Zielort zu erreichen, müssen systemische Pestizide aus einem auf dem Feld ausgebrachten Sprühtropfen in die Pflanze gelangen. Die Aufnahme eines Wirkstoffs (AI) erfolgt über die barrierebildende Kutikularmembran, die äußerste Schicht der Pflanze, die sie von der Umgebung trennt. In der Regel werden Formulierungen verwendet, die neben dem AI auch Stabilisatoren und Adjuvantien enthalten. Adjuvantien können entweder oberflächenaktive Eigenschaften haben oder sie wirken direkt als barrieremodifizierende Substanzen. Letztere werden in der Klasse der beschleunigenden Adjuvantien zusammengefasst, wobei einzelne Varianten auch oberflächenaktive Eigenschaften haben können. Die Aufnahme eines Pestizids aus einem Sprühtropfen hängt im Wesentlichen von seiner Durchlässigkeit durch die kutikuläre Barriere ab. Die Permeabilität ist ein kombinierter Parameter, der sich aus der Mobilität und der Löslichkeit des Wirkstoffs in der Kutikula ergibt. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Methoden entwickelt, die die Bestimmung einzelner Parameter der Permeation organischer Verbindungen durch die Kutikularmembran ermöglichen. Frühere Studien zeigten jedoch, dass hauptsächlich kutikuläre Wachse die barrierebestimmende Komponente der Kutikula darstellen, und darüber hinaus wurde gezeigt, dass hauptsächlich die sehr langkettigen aliphatischen Verbindungen (VLCAs) für die Errichtung einer wirksamen Barriere verantwortlich sind. Die Rolle der einzelnen VLCAs, die nach ihren jeweiligen funktionellen Gruppen klassifiziert werden, ist jedoch in Bezug auf die Bestimmung der Barriereeigenschaften noch unbekannt. Daher wurde in dieser Arbeit folgende Ziele verfolgt und erreicht: (1) Ein neuer ATR-FTIR-basierter Ansatz wurde entwickelt, um die temperaturabhängige Echtzeit-Diffusionskinetik von organischen Modellen für Wirkstoffe (AI) in ausschließlich aus Alkanen bestehendem Paraffinwachs zu messen. (2) Der entwickelte ATR-FTIR-Ansatz wurde zur Bestimmung der Diffusionskinetik von selbstbeschleunigenden Adjuvantien in kutikulären Modellwachsen unterschiedlicher VLCA-Zusammensetzung angewendet. Gleichzeitig wurden wachsspezifische Veränderungen in den jeweiligen IR-Spektren aufgezeichnet, welche Informationen über die jeweilige Wachsmodifikation lieferten. (3) Die ATR-FTIR-Methode wurde zur Charakterisierung der Diffusionskinetik, sowie zur Bestimmung der wachsspezifischen Sorptionskapazitäten für eine AI-modellierende organische Verbindung und von Wasser in kutikulären Modellwachsen nach Adjuvans-Behandlung verwendet. Im Hinblick auf die einzelnen chemischen Zusammensetzungen und Strukturen wurden Rückschlüsse auf die adjuvansspezifischen Wirkweisen (MoA) gezogen. Im ersten Kapitel wurde der ATR-FTIR-basierte Ansatz zur Bestimmung der Diffusionskinetik organischer Verbindungen in Paraffinwachs erfolgreich etabliert. Es wurde die Diffusionskinetik der organischen AI-Modellverbindungen Heptylparaben (HPB) und 4-Cyanophenol (CNP) aufgezeichnet, die unterschiedliche Lipophilitäten und Molekülvolumina aufweisen, wie sie für AIs in Pestizidformulierungen typisch sind. Die abgeleiteten Diffusionskoeffizienten lagen im Bereich von 10-15 m2 s-1 und waren damit höher als die zuvor in rekonstituierten kutikulären Wachsen beobachteten Diffusionskoeffizienten. Zum ersten Mal wurde eine ln-lineare Abhängigkeit zwischen den Diffusionskoeffizienten und der angewandten Diffusionstemperatur in kutikulärem Modellwachs nachgewiesen, aus der schließlich Aktivierungsenergien abgeleitet wurden. Die ermittelten Aktivierungsenergien betrugen 66.2 ± 7.4 kJ mol-1 und 56.4 ± 9,8 kJ mol-1 und lagen damit im erwarteten Bereich der bereits gut begründeten Aktivierungsenergien, die für die Diffusion organischer Verbindungen durch kutikuläre Membranen erforderlich sind. Dies bestätigte abermals den signifikanten Beitrag der Wachse zur kutikulären Barriere. Abweichungen von der angenommenen Fick'schen Diffusion wurden auf die gleichzeitig stattfindende Wasserdiffusion und gerätespezifische Artefakte zurückgeführt. Im zweiten und dritten Kapitel wurde vor allem die Diffusionskinetik von beschleunigenden Adjuvantien in den kutikulären Modellwachsen Candelillawachs und Carnaubawachs untersucht und gleichzeitig aufgezeichnete Veränderungen im wachspezifischen Teil des IR-Spektrums als Hinweise auf eine Plastifizierung interpretiert. Zu diesem Zweck wurden das Ölderivat Methyloleat, sowie der Organophosphatester TEHP und drei nichtionische monodisperse Alkoholethoxylate (AEs) C12E2, C12E4 und C12E6 ausgewählt. Es wurde eine starke Abhängigkeit der Adjuvansdiffusion von den jeweiligen Hauptkomponenten der hauptsächlich aliphatisch strukturierten Wachse nachgewiesen. So war die Diffusionskinetik der untersuchten Adjuvantien in dem hauptsächlich aus n-Alkanen bestehenden Candelillawachs schneller als in dem von Alkylestern dominierten Carnaubawachs. Darüber hinaus waren die Gleichgewichtsabsorptionen, die auf Gleichgewichtskonzentrationen hinweisen, in Candelillawachs ebenfalls höher als in Carnaubawachs. Daraus wurde gefolgert, dass Wachse mit hohen Alkylesteranteilen aufgrund ihrer strukturellen Integrität einen höheren Widerstand gegen die Diffusion von beschleunigenden Adjuvantien aufweisen als Wachse mit kürzeren durchschnittlichen Kettenlängen. Dies wurde auch bei Candelilla/Policosanol- (n-Alkohol) oder Candelilla/Reiskleiewachs-Mischungen (Alkylester) festgestellt: Mit steigender Alkoholkonzentration nahm die Barrierefunktion ab, während sie mit steigender Alkylesterkonzentration zunahm. Aufgrund der hohen Variabilität der einzelnen Diffusionskurven konnte hier jedoch nur ein Trend vermutet werden, signifikante Unterschiede zeigten sich jedoch nicht. Die Variabilität selbst wurde mit schwankenden kristallinen Anordnungen und teilweiser Phasentrennung der jeweiligen Wachsmischungen erklärt, die sich zwangsläufig auf die Diffusion der Adjuvantien auswirkten. Die Diffusionskinetik hing jedoch auch stark von den untersuchten Adjuvantien ab. In Carnaubawachs wurde eine deutlich langsamere Methyloleat-Diffusion festgestellt, die mit einer weniger ausgeprägten Verringerung der orthorhombischen Kristallinität einherging als in Candelillawachs, während die TEHP-Diffusion deutlich weniger von der jeweiligen Wachsstruktur abhängig war und in beiden Wachsen eine erhebliche Plastifizierung bewirkte. Von besonderem Interesse war die AE-Diffusion in den untersuchten Wachsen. Auch hier wurden Unterschiede in der Diffusionskinetik zwischen Candelillamischungen und Carnaubawachs festgestellt. Diese hingen jedoch gleichermaßen vom Ethoxylierungsgrad der jeweiligen AEs ab. Das lipophile C12E2 zeigte in beiden Wachsen eine annähernd Fick‘sche Diffusionskinetik, die mit einer drastischen Verringerung der orthorhombischen Kristallinität einherging, insbesondere im Candelillawachs, während das hydrophilere C12E6 eine deutlich verzögerte Diffusionskinetik zeigte, die mit einer geringeren Auswirkung auf die orthorhombische Kristallinität einherging. Die individuellen Diffusionskinetiken der untersuchten Adjuvantien zeigten teilweise drastische Abweichungen vom Fick‘schen Diffusionsmodell, was auf einen selbstbeschleunigenden Effekt hindeutet. Die Diffusionskinetik der Adjuvantien wurde von einer ausgeprägten anfänglichen Verzögerungsphase begleitet, die auf das Erreichen einer kritischen Konzentration im Wachs hindeutet. Es wird angenommen, dass aufgrund der initialen Verzögerungsphase letztlich sigmoidale, statt Fick’sche Diffusionskinetiken vorlagen. Das letzte Kapitel befasste sich mit der adjuvansbeeinflussten Diffusion der für Wirkstoffe modellhaften organischen Substanz CNP in Candelilla- und Carnaubawachs. Mittels ATR-FTIR wurden Diffusionskinetiken nach Adjuvans-Behandlung aufgezeichnet, die alle auf der Grundlage des Fick‘schen Modells vollständig erklärbar waren, einhergehend mit hohen Diffusionskoeffizienten von 10-14 bis 10-13 m2 s-1. Es ist offensichtlich, dass die in dieser Arbeit vorgestellten Diffusionskoeffizienten durchweg eine durch die Plastifizierung bedingte erhöhte CNP-Mobilität belegen. Darüber hinaus wurden CNP-Gleichgewichtskonzentrationen abgeleitet, aus denen Verteilungs- und Permeabilitätskoeffizienten bestimmt werden konnten. Signifikante Unterschiede zwischen Diffusionskoeffizienten (Mobilität) und Verteilungskoeffizienten (Löslichkeit) wurden zum einen in Abhängigkeit von den jeweiligen Wachsen und zum anderen in Abhängigkeit von den jeweiligen Adjuvantien festgestellt. Die CNP-Mobilität war in Candelillawachs nur nach Behandlung mit Methyloleat höher als in Carnaubawachs. Die Behandlung mit TEHP und AEs führte zu einer höheren CNP-Mobilität in dem polaren, von Alkylestern dominierten Carnaubawachs. Die Verteilungskoeffizienten hingegen waren nach der Behandlung mit Methyloleat sowohl in Candelilla- als auch in Carnaubawachs deutlich niedriger als nach der Behandlung mit TEHP oder AE. Es wurden Modelle für den CNP-Penetrationsmodus unter Berücksichtigung der jeweiligen Adjuvantien in den beiden untersuchten Wachsen entwickelt. Der Grund für die drastischen Unterschiede in der Wirksamkeit der Adjuvantien liegt wahrscheinlich im Ko-Penetrieren von Wasser, dem Hauptbestandteil der auf dem Feld angewandten Spritzformulierungen. Insbesondere die untersuchten AEs begünstigten eine enorme Wasseraufnahme in beiden Wachsen mit zunehmendem Ethoxylierungsgrad. Überraschenderweise wurde dieser Effekt auch für das lipophile TEHP in beiden Wachsen gefunden. Dies führte zu der Vermutung, dass die AI-Permeabilität nicht ausschließlich durch die adjuvansinduzierte Plastifizierung bestimmt wird, sondern auch von einer "sekundären Plastifizierung" abhängt, die durch die Ko-Penetration von Wasser induziert wird und so zur Quellung und drastischen Destabilisierung der kristallinen Wachsstruktur führt. Die erfolgreiche Etablierung der vorgestellten ATR-FTIR-Methode stellt einen Meilenstein für die Untersuchung der Diffusionskinetik von Adjuvantien und AIs in kutikulären Wachsen dar. Insbesondere die gleichzeitig nachweisbare Wachsmodifikation und darüber hinaus die bestimmbare Wasseraufnahme bilden eine perfekte Grundlage, um das ATR-FTIR-System als universelles Screening-Tool für Wachs-Adjuvans-AI-Wasser-Interaktionen in der Pflanzenschutzwissenschaft zu etablieren. KW - Pflanzen KW - Kutikula KW - Adjuvans KW - Aktivierungsenergie KW - ATR-FTIR KW - Diffusion coefficient KW - Pesticide KW - wax Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-274874 ER - TY - THES A1 - Leingärtner, Annette T1 - Combined effects of climate change and extreme events on plants, arthropods and their interactions T1 - Kombinierte Effekte von Klimawandel und Extremereignissen auf Pflanzen, Arthropoden und ihre Interaktionen N2 - I. Global climate change directly and indirectly influences biotic and abiotic components of ecosystems. Changes in abiotic ecosystem components caused by climate change comprise temperature increases, precipitation changes and more frequently occurring extreme events. Mediated by these abiotic changes, biotic ecosystem components including all living organisms will also change. Expected changes of plants and animals are advanced phenologies and range shifts towards higher latitudes and altitudes which presumably induce changes in species interactions and composition. Altitudinal gradients provide an optimal opportunity for climate change studies, because they serve as natural experiments due to fast changing climatic conditions within short distances. In this dissertation two different approaches were conducted to reveal species and community responses to climate change. First, species richness and community trait analyses along an altitudinal gradient in the Bavarian Alps (chapters II, III) and second, climate change manipulation experiments under different climatic contexts (chapters IV, V, IV). II. We performed biodiversity surveys of butterfly and diurnal moth species on 34 grassland sites along an altitudinal gradient in the National Park Berchtesgaden. Additionally, we analysed the dominance structure of life-history traits in butterfly assemblages along altitude. Species richness of butterflies and diurnal moths decreased with increasing altitude. The dominance of certain life-history-traits changed along the altitudinal gradient with a higher proportion of larger-winged species and species with higher egg numbers towards higher altitudes. However, the mean egg maturation time, population density and geographic distribution within butterfly assemblages decreased with increasing altitude. Our results indicate that butterfly assemblages were mainly shaped by environmental filtering. We conclude that butterfly assemblages at higher altitudes will presumably lack adaptive capacity to future climatic conditions, because of specific trait combinations. III. In addition to butterfly and diurnal moth species richness we also studied plant species richness in combination with pollination type analyses along the altitudinal gradient. The management type of the alpine grasslands was also integrated in the analyses to detect combined effects of climate and management on plant diversity and pollination type. Plant species richness was highest at intermediate altitudes, whereby the management type influenced the plant diversity with more plant species at grazed compared to mown or non-managed grasslands. The pollination type was affected by both the changing climate along the gradient and the management type. These results suggest that extensive grazing can maintain high plant diversity along the whole altitudinal gradient. With ongoing climate change the diversity peak of plants may shift upwards, which can cause a decrease in biodiversity due to reduced grassland area but also changes in species composition and adaptive potential of pollination types. IV. We set up manipulation experiments on 15 grassland sites along the altitudinal gradient in order to determine the combined effects of extreme climatic events (extreme drought, advanced and delayed snowmelt) and elevation on the nutritional quality and herbivory rates of alpine plants. The leaf CN (carbon to nitrogen) ratio and the plant damage through herbivores were not significantly affected by the simulated extreme events. However, elevation influenced the CN ratios and herbivory rates of alpine plants with contrasting responses between plant guilds. Furthermore, we found differences in nitrogen concentrations and herbivory rates between grasses, legumes and forbs, whereas legumes had the highest nitrogen concentrations and were damaged most. Additionally, CN ratios and herbivory rates increased during the growing season, indicating a decrease of food plant quality during the growing season. Contrasting altitudinal responses of grasses, legumes and forbs presumably can change the dominance structure among these plant guilds with ongoing climate change. V. In this study we analysed the phenological responses of grassland species to an extreme drought event, advanced and delayed snowmelt along the altitudinal gradient. Advanced snowmelt caused an advanced beginning of flowering, whereas this effect was more pronounced at higher than at lower altitudes. Extreme drought and delayed snowmelt had rather low effects on the flower phenology and the responses did not differ between higher and lower sites. The strongest effect influencing flower phenology was altitude, with a declining effect through the season. The length of flowering duration was not significantly influenced by treatments. Our data suggest that plant species at higher altitudes may be more affected by changes in snowmelt timing in contrast to lowland species, as at higher altitudes more severe changes are expected. However, the risk of extreme drought events on flowering phenology seems to be low. VI. We established soil-emergence traps on the advanced snowmelt and control treatment plots in order to detect possible changes in abundances and emergence phenologies of five arthropod orders due to elevation and treatment. Additionally, we analysed the responses of Coleoptera species richness to elevation and treatment. We found that the abundance and species richness of Coleoptera increased with elevation as well as the abundance of Diptera. However, the abundance of Hemiptera decreased with elevation and the abundances of Araneae and Hymenoptera showed no elevational patterns. The advanced snowmelt treatment increased the abundances of Araneae and Hymenoptera. The emergence of soil-hibernating arthropods was delayed up to seven weeks at higher elevations, whereas advanced snowmelt did not influence the emergence phenology of arthropods immediately after snowmelt. With climate change earlier snowmelt will occur more often, which especially will affect soil-hibernating arthropods in alpine regions and may cause desynchronisations between species interactions. VII. In conclusion, we showed that alpine ecosystems are sensitive towards changing climate conditions and extreme events and that many alpine species in the Bavarian Alps are endangered. Many alpine species could exist under warmer climatic conditions, however they are expected to be outcompeted by more competitive lowland species. Furthermore, host-parasite or predator-prey interactions can be disrupted due to different responses of certain guilds to climate change. Understanding and predicting the complex dynamics and potential risks of future climate change remains a great challenge and therefore further studies analysing species and community responses to climate change are needed. N2 - I. Der globale Klimawandel beeinflusst direkt und indirekt biotische und abiotische Komponenten der Ökosysteme. Durch Klimawandel verursachte Veränderungen in den abiotischen Komponenten der Ökosysteme umfassen Temperaturanstiege, Veränderungen im Niederschlag und häufiger auftretende Extremereignisse. Als Folge dieser abiotischen Veränderungen, werden sich auch die biotischen Komponenten der Ökosysteme, die alle lebenden Organismen einschließen, verändern. Voraussichtliche Veränderungen bei Pflanzen und Tieren sind vorverlegte Phänologien und Verbreitungsverschiebungen in Richtung höherer Breitengrade und Höhenlagen, was möglicherweise Veränderungen von Interaktionen zwischen Arten und in der Artzusammensetzung verursacht. Höhengradienten bieten durch sich schnell verändernde klimatische Bedingungen innerhalb kurzer Distanzen eine optimale Möglichkeit für Klimawandelstudien im Freiland. In dieser Dissertation wurden zwei unterschiedliche Versuchsansätze genutzt, um die Reaktionen von Arten und Artengemeinschaften auf den Klimawandel zu untersuchen: erstens Analysen zum Artenreichtum und zu Merkmalen innerhalb von Artengemeinschaften entlang eines Höhengradienten in den Bayerischen Alpen (Kapitel II, III) und zweitens Manipulationsexperimente zur Simulation von Klimawandel bei unterschiedlichen klimatischen Bedingungen (Kapitel IV, V, VI). II. Wir haben Biodiversitätsaufnahmen von Schmetterlings- und tagaktiven Nachtfalterarten entlang eines Höhengradienten im Nationalpark Berchtesgaden durchgeführt. Zusätzlich haben wir die Dominanzstruktur von Life-History-Merkmalen in Schmetterlingsgesellschaften entlang des Höhengradienten analysiert. Der Artenreichtum von Schmetterlingen und tagaktiven Nachtfaltern nahm mit zunehmender Höhe ab. Die Dominanz von bestimmten Life-History-Merkmalen veränderte sich entlang des Höhengradienten. Zum Beispiel fanden wir einen höheren Anteil an Arten mit größeren Flügeln und eine größere Anzahl an Eiern in höheren Lagen. Die mittlere Eireifezeit, Populationsdichte und geographische Verbreitung von Schmetterlingsgesellschaften nahm mit steigender Höhe ab. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Schmetterlingsgesellschaften hauptsächlich durch den Filtereffekt der Umwelt geformt werden. Wir schlussfolgern, dass sich bestimmte Merkmalskombinationen von Schmetterlingsgesellschaften in höheren Lagen möglicherweise ungünstig auf die Anpassungskapazität an zukünftige klimatische Veränderungen auswirken. III. Zusätzlich zum Artenreichtum von Schmetterlingen und tagaktiven Nachtfaltern haben wir auch den Artenreichtum von Pflanzen in Kombination mit Analysen zu Bestäubungstypen entlang des Höhengradienten untersucht. Die Bewirtschaftungsform der alpinen Grasländer wurde in die Analysen integriert, um kombinierte Auswirkungen von Klima und Bewirtschaftungsform auf die Pflanzendiversität und den Bestäubungstyp zu erfassen. Der Artenreichtum von Pflanzen war auf mittleren Höhen am größten, wobei die Bewirtschaftungsform die Pflanzendiversität beeinflusste. Es kamen mehr Pflanzenarten auf beweideten im Vergleich zu gemähten oder nicht bewirtschafteten Wiesen vor. Der Bestäubungstyp wurde sowohl durch das sich verändernde Klima entlang des Gradienten als auch durch die Bewirtschaftungsform beeinflusst. Unsere Ergebnisse lassen vermuten, dass extensive Beweidung eine hohe Pflanzendiversität entlang des gesamten Höhengradienten erhalten kann. Mit fortschreitendem Klimawandel könnte sich der Bereich mit höchster Pflanzendiversität nach oben verschieben, was zu einem Biodiversitätsverlust durch eine Abnahme an Grasflächen führen könnte, aber auch zu Veränderungen in der Artenzusammensetzung und dem Anpassungspotential von Bestäubungstypen. IV. Wir simulierten Extremereignisse (extreme Dürre, frühere und spätere Schneeschmelze) auf 15 Grasflächen entlang des Höhengradienten, um kombinierte Effekte von extremen klimatischen Ereignissen und Höhenlage auf die Futterqualität und den Blattfraß von alpinen Pflanzen zu untersuchen. Das Verhältnis von Kohlenstoff zu Stickstoff (CN) in Blättern und die Fraßschäden durch Pflanzenfresser wurden durch die simulierten Extremereignisse nicht signifikant beeinflusst. Dagegen beeinflusste die Höhenlage das CN-Verhältnis und die Herbivorieraten von alpinen Pflanzen mit entgegengesetzten Reaktionen unter den Pflanzengruppen. Des Weiteren haben wir Unterschiede in den Stickstoffkonzentrationen und Herbivorieraten zwischen Gräsern, Leguminosen und krautigen Pflanzen gefunden, wobei die Leguminosen die höchsten Stickstoffkonzentrationen aufwiesen und am stärksten angefressen waren. Zusätzlich stiegen die CN-Verhältnisse und die Fraßschäden während der Vegetationsperiode an, was auf eine Abnahme der Futterqualität im Verlauf der Vegetationsperiode hindeutet. Entgegengesetzte Muster von Gräsern, Leguminosen und krautigen Pflanzen über die Höhe können möglicherweise die Dominanzstruktur zwischen diesen Pflanzengruppen mit fortschreitendem Klimawandel verändern. V. In dieser Studie haben wir die phänologischen Reaktionen von Graslandarten auf ein extremes Dürreereignis, eine frühere und eine spätere Schneeschmelze entlang des Höhengradienten, analysiert. Die frühere Schneeschmelze bewirkte einen früheren Blühbeginn, wobei dieser Effekt auf höheren Lagen ausgeprägter war als auf tieferen Lagen. Extreme Dürre und spätere Schneeschmelze hatten eher geringe Auswirkungen auf die Blühphänologie und die Auswirkungen unterschieden sich nicht zwischen höher und tiefer gelegenen Flächen. Am stärksten würde die Blühphänologie von der Höhenlage beeinflusst wobei sich der Effekt im Verlauf der Vegetationsperiode verringerte. Die Länge der Blühdauer wurde durch die Simulationen nicht signifikant beeinflusst. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Pflanzenarten in höheren Lagen stärker durch Veränderungen des Zeitpunktes der Schneeschmelze beeinflusst werden als Tieflandarten, weil in höheren Lagen stärkere Veränderungen erwartet werden. Das Risiko von extremer Dürre für die Blühphänologie scheint aber gering zu sein. VI. Wir untersuchten Effekte der Höhenlage und früherer Schneeschmelze auf Häufigkeiten und Schlupfphänologien fünf verschiedener Arthropodenordnungen. Dazu installierten wir Bodenphotoeklektoren auf Flächen mit früherer Schneeschmelze und Kontrollflächen. Außerdem analysierten wir die Auswirkungen der Höhenlage und der früheren Schneeschmelze auf den Artenreichtum von Coleoptera. Wir stellten fest, dass die Abundanz und der Artenreichtum von Coleoptera sowie die Abundanz der Diptera mit steigender Höhenlage zunahmen, während die Abundanz der Hemiptera mit steigender Höhe abnahm. Araneae und Hymenoptera zeigten keine Abundanzmuster entlang des Höhengradienten. Eine simulierte frühere Schneeschmelze ließ die Abundanz der Araneae und Hymenoptera ansteigen. Arthropoden, die im Boden überwinterten, schlüpften in höheren Lagen bis zu sieben Wochen später. Eine frühere Schneeschmelze beeinflusste die Schlupfphänologie der Arthropoden unmittelbar nach der Schneeschmelze jedoch nicht. Aufgrund des Klimawandels wird eine frühere Schneeschmelze häufiger auftreten, was vor allem Auswirkungen auf bodenüberwinternde Arthropoden in der Alpenregion haben kann und zu Desynchronisationen mit interagierenden Arten führen kann. VII. Abschließend lässt sich sagen, dass alpine Ökosysteme sensibel auf klimatische Veränderungen und Extremereignisse reagieren und dass viele alpine Arten in den Bayerischen Alpen gefährdet sind. Viele alpine Arten könnten unter wärmeren klimatischen Bedingungen existieren, aber vermutlich werden sie von konkurrenzstärkeren Tieflandarten verdrängt. Des Weiteren können Wirt-Parasit oder Räuber-Beute Interaktionen durch unterschiedliche Reaktionen von bestimmten Gruppen auf Klimawandel gestört werden. Es bleibt eine große Herausforderung die komplexen Dynamiken und möglichen Gefahren des zukünftigen Klimawandels zu verstehen und vorherzusagen. Wir empfehlen weitere Studien, die die Auswirkungen des Klimawandels auf Arten und Artengesellschaften untersuchen. KW - Insekten KW - Klimaänderung KW - Pflanzen KW - Höhenstufe KW - climate change KW - insects KW - altitudinal gradient KW - extreme events KW - Klimawandel KW - Insekten KW - Höhengradient KW - Extremereignisse Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87758 ER - TY - THES A1 - Li, Kunkun T1 - Dissecting the interconnection of Ca\(^{2+}\) and pH signaling in plants with a novel biosensor for dual imaging T1 - Untersuchung der Verknüpfung von Ca\(^{2+}\) und pH-Signalen in Pflanzen mit einem neuartigen Biosensor für duale Bildgebung N2 - Calcium ion (Ca2+) and protons (H+) are both regarded as second messengers, participating in plant growth and stress mechanisms. However, H+ signals in plant physiology are less well investigated compared to Ca2+ signals. If interconnections between these two second messengers exist remains to be uncovered because appropriate imaging tools to monitor Ca2+ and H+ simultaneously in the same cell as well as accurate bioinformatics analysis remain to be developed. To overcome this problem and unravel the role and possible interconnection of Ca2+ and H+ in plants, a new biosensor named CapHensor was developed and optimized to visualize intracellular Ca2+ and H+ changes simultaneously and ratiometrically in the same cell. The CapHensor consisted of an optimized green fluorescent pH sensor (PRpHluorin) and an established red fluorescent Ca2+ sensor (R-GECO1) that were combined in one construct via a P2A sequence. A P2A self-cleavage site between the two sensors allowed to express equal amounts but spatially separated sensors, which enabled artifact-free and ratiometric imaging of cellular Ca2+ and pH side-by-side. The function of the CapHensor was verified in pollen tubes, since they possess standing Ca2+ and pH gradients. We found better imaging quality and the signal-to-noise ratio to be enhanced in live-cell imaging when two R-GECO1 proteins were fused in tandem within the CapHensor construct. To guarantee exclusive subcellular localization and avoid mixed signals from different compartments, Nuclear Export Sequence (NES) and Nuclear Localization Sequence (NLS) were used to target PRpHluorin and R-GECO1 to distinct compartments. After optimization and verification its function, CapHensor was successfully expressed in different cell types to investigate the role of Ca2+ and H+ signals to control polar growth of pollen tube, stomatal movement or leaf defense signaling. Results obtained in the past indicated both Ca2+ gradients and pH gradients in pollen tubes play roles in polar growth. However, the role and temporal relationship between the growth process and changes in Ca2+ and pH have not been conclusively resolved. Using CapHensor, I found cytosolic acidification at the tip could promote and alkalization to suppress growth velocity in N. tabacum pollen tubes, indicating that cytosolic H+ concentrations ([H+]cyt) play an important role in regulation pollen tubes growth despite the accompanied changes in cytosolic Ca2+ concentrations ([Ca2+]cyt). Moreover, growth correlated much better with the tip [H+]cyt regime than with the course of the tip [Ca2+]cyt regime. However, surprisingly, tip-focused [Ca2+]cyt andII [H+]cyt oscillations both lagged behind growth oscillations approximately 33 s and 18 s, respectively, asking for a re-evaluation of the role that tip [Ca2+]cyt may play in pollen tube growth. Live-cell CapHensor imaging combined with electrophysiology uncovered that oscillatory membrane depolarization correlated better with tip [H+]cyt oscillations than with tip [Ca2+]cyt oscillations, indicative for a prominent role of [H+]cyt to also control electrogenic membrane transport. Using CapHensor, reading out cellular movement at the same time enabled to provide a precise temporal and spatial resolution of ion signaling events, pointing out a prominent role of [H+]cyt in pollen tube tip growth. For leaf cells, a special CapHensor construct design had to be developed, containing additional NES localization sequences to avoid overlapping of fluorescense signals from the nucleus and the cytosol. Once this was achieved, the role of Ca2+ and pH changes in guard cells, another typical single-cell system was investigated. Cytosolic pH changes have been described in stomatal movement, but the physiological role of pH and the interaction with changing Ca2+ signals were still unexplored. Combining CapHensor with the here developed technique to monitor stomatal movement in parallel, the role of Ca2+ and H+ in stomatal movement was studied in detail and novel aspects were identified. The phytohormone ABA and the bacterial elicitor flagellin (flg22) are typical abiotic and biotic stresses, respectively, to trigger stomatal closure. What kind of Ca2+ and H+ signals by ABA and flg22 are set-off in guard cells and what their temporal relationship and role for stomatal movement is were unknown. Similar [Ca2+]cyt increases were observed upon ABA and flg22 triggered stomatal closure, but [H+]cyt dynamics differed fundamentally. ABA triggered pronounced cytosolic alkalization preceded the [Ca2+]cyt responses significantly by 57 s while stomata started to close ca. 205 s after phytohormone application. With flg22, stomatal closure was accompanied only with a mild cytosolic alkalization but the [Ca2+]cyt response was much more pronounced compared to the ABA effects. Where the cytosolic alkalization originates from was unclear but the vacuole was speculated to contribute in the past. In this thesis, vacuolar pH changes were visualized by the dye BCECF over time, basically displaying exactly the opposite course of the concentration shift in the vacuole than observed in the cytosol. This is indicative for the vacuolar pH dynamics to be coupled strongly to the cytosolic pH changes. In stomatal closure signalling, reactive oxygen species (ROS) were proposed to play a major role, however, only very high concentration of H2O2 (> 200 µM), which resulted in the loss of membrane integrity, induced stomatal closure. Unexpectedly, physiological concentrations of ROS led to cytosolic acidificationIII which was associated with stomatal opening, but not stomatal closure. To study the role of [H+]cyt to steer stomatal movement in detail, extracellular and intracellular pH variations were evoked in N. tabacum guard cells and their behaviour was followed. The results demonstrated cytosolic acidification stimulated stomatal opening while cytosolic alkalization triggered stomatal closure accompanied by [Ca2+]cyt elevations. This demonstrated pH regulation to be an important aspect in stomatal movement and to feed-back on the Ca2+-dynamics. It was remarkable that cytosolic alkalization but not [Ca2+]cyt increase seemed to play a crucial role in stomatal closure, because more pronounced cytosolic alkalization, evoked stronger stomatal closure despite similar [Ca2+]cyt increases. Increases in [Ca2+]cyt, which are discussed as an early stomatal closure signal in the past, could not trigger stomatal closure alone in my experiments, even when extremely strong [Ca2+]cyt signals were triggered. Regarding the interaction between the two second messengers, [Ca2+]cyt and [H+]cyt were negatively correlated most of the times, which was different from pollen tubes showing positive correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt regimes. [Ca2+]cyt elevations were always associated with a cytosolic alkalization and this relationship could be blocked by the presence of vanadate, a plasma membrane H+-pump blocker, indicating plasma membrane H+-ATPases to contribute to the negative correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt. To compare with guard cells, cytosolic and nuclear versions of CapHensor were expressed in N. benthamiana mesophyll cells, a multicellular system I investigated. Mesophyll cell responses to the same stimuli as tested in guard cells demonstrated that ABA and H2O2 did not induce any [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes while flg22 induced an increase in [Ca2+]cyt and [H+]cyt, which is different from the response in guard cells. I could thus unequivocally demonstrate that guard cells and mesophyll cells do respond differently with [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes to the same stimuli, a concept that has been proposed before, but never demonstrated in such detail for plants. Spontaneous Ca2+ oscillations have been observed for a long time in guard cells, but the function or cause is still poorly understood. Two populations of oscillatory guard cells were identified according to their [Ca2+]cyt and [H+]cyt phase relationship in my study. In approximately half of the oscillatory cells, [H+]cyt oscillations preceded [Ca2+]cyt oscillations whereas [Ca2+]cyt was the leading signal in the other half of the guard cells population. Strikingly, natural [H+]cyt oscillations were dampened by ABA but not by flg22. This effect could be well explained by dampening of vacuolar H+ oscillations in the presence of ABA, but not through flg22. Vacuolar pH contributes to spontaneous [H+]cyt oscillations and ABA but not flg22 can block the interdependence of naturalIV [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals. To study the role of [Ca2+]cyt oscillations in stomatal movement, solutions containing high and low KCl concentrations were applied aiming to trigger [Ca2+]cyt oscillations. The triggering of [Ca2+]cyt oscillations by this method was established two decades ago leading to the dogma that [Ca2+]cyt increases are the crucial signal for stomatal closure. However, I found stomatal movement by this method was mainly due to osmotic effects rather than [Ca2+]cyt increases. Fortunately, through this methodology, I found a strong correlation between cytosolic pH and the transport of potassium across the plasma membrane and vacuole existed. The plasma membrane H+-ATPases and H+-coupled K+ transporters were identified as the cause of [H+]cyt changes, both very important aspects in stomata physiology that were not visualized experimentally before. Na+ transport is also important for stomatal regulation and leaves generally since salt can be transported from the root to the shoot. Unlike well-described Ca2+- dependent mechanisms in roots, how leaves process salt stress is not at all understood. I applied salt on protoplasts from leaves, mesophyll cells and guard cells and combined live-cell imaging with Vm recordings to understand the transport and signaling for leaf cells to cope with salt stress. In both, mesophyll and guard cells, NaCl did not trigger Ca2+-signals as described for roots but rather triggered Ca2+ peaks when washing salt out. However, membrane depolarization and pronounced alkalinization were very reliably triggered by NaCl, which could presumably act as a signal for detoxification of high salt concentrations. In line with this, I found the vacuolar cation/H+ antiporter NHX1 to play a role in sodium transport, [H+]cyt homeostasis and the control of membrane potential. Overexpression of AtNHX1 enabled to diminish [H+]cyt changes and resulted in a smaller depolarization responses druing NaCl stress. My results thus demonstrated in contrast to roots, leaf cells do not use Ca2+-dependent signalling cascades to deal with salt stress. I could show Na+ and K+ induced [H+]cyt and Vm responses and Cl- transport to only have a minor impact. Summing all my results up briefly, I uncovered pH signals to play important roles to control pollen tube growth, stomatal movement and leaf detoxification upon salt. My results strongly suggested pH changes might be a more important signal than previously thought to steer diverse processes in plants. Using CapHensor in combination with electrophysiology and bioinformatics tools, I discovered distinct interconnections between [Ca2+]cyt and [H+]cyt in different cell types and distinct [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals are initiated through diverse stimuli and environmental cues. The CapHensor will be very useful in the future to further investigate the coordinated role of Ca2+ and pH changes in controlling plant physiology. N2 - Kalziumionen (Ca2+) und Protonen (H+) werden beide als Botenstoffe angesehen, die am Pflanzenwachstum und an Mechanismen zur Stressbewältigung beteiligt sind. In der Pflanzenphysiologie sind H+-Signale jedoch im Vergleich zu Ca2+-Signalen weniger gut untersucht. Die Frage, ob zwischen diesen beiden Botenstoffen Zusammenhänge bestehen, muss noch geklärt werden, da geeignete bildgebende Verfahren zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Ca2+ und H+ Signalen sowie eine genaue bioinformatische Analyse noch entwickelt werden müssen. Um dieses Problem zu überwinden und die Rolle und möglichen Zusammenhang von Ca2+ und H+ Signalen in Pflanzen zu entschlüsseln, wurde ein neuer Biosensor namens CapHensor entwickelt und optimiert, um intrazelluläre Ca2+- und H+-Veränderungen gleichzeitig und ratiometrisch zu untersuchen. Der CapHensor bestand aus einem optimierten grün fluoreszierenden pH-Sensor (PRpHluorin) und einem etablierten rot fluoreszierenden Ca2+-Sensor (R-GECO1), die über eine P2A-Sequenz in einem Konstrukt kombiniert wurden. Eine sogenannte P2A-„self-cleavage site“ zwischen den beiden Sensoren ermöglichte die Expression gleicher Mengen, aber räumlich getrennter Sensoren, was eine artefaktfreie und ratiometrische Darstellung von zellulärem Ca2+ und pH nebeneinander ermöglichte. Die Funktion des CapHensors wurde in Pollenschläuchen verifiziert, da diese einen ständigen Ca2+- und pH-Gradienten aufweisen. Wir stellten fest, dass die Qualität der Bildaufnahmen und das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Bildgebung in lebenden Zellen verbessert wurden, wenn zwei R-GECO1-Proteine innerhalb des CapHensor-Konstrukts translational fusioniert wurden. Um eine ausschließliche zytosolische Lokalisierung zu gewährleisten und gemischte Signale aus verschiedenen Kompartimenten zu vermeiden, wurden sogenannte „Nuclear Export Sequence“ (NES) und die „Nuclear Localization Sequence“ (NLS) verwendet, um PRpHluorin und R-GECO1 in unterschiedlichen Kompartimente zu lokalisieren. Nach der Optimierung und Überprüfung seiner Funktionsweise wurde CapHensor erfolgreich in verschiedenen Zelltypen exprimiert, um die Rolle von Ca2+- und H+-Signalen bei der Kontrolle des polaren Wachstums von Pollenschläuchen, die Stomabewegung oder Abwehrmechanismen der Blätter zu untersuchen. Die in der Vergangenheit erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl der Ca2+-Gradient als auch der pH-Gradient in Pollenschläuchen eine Rolle beim polaren Wachstum spielen, wobei dem Ca2+-Gradient zum Teil die Hauptrolle zugesprochen wird. Die Rolle und die zeitlicheVI Beziehung zwischen dem Wachstumsprozess und den Veränderungen von Ca2+ und pH sind jedoch noch nicht abschließend geklärt. Mit Hilfe von CapHensor fand ich heraus, dass eine zytosolische Ansäuerung an der Spitze die Wachstumsgeschwindigkeit in N. tabacumPollenschläuchen fördern und eine Alkalisierung die Wachstumsgeschwindigkeit unterdrücken kann, was darauf hindeutet, dass die zytosolische H+-Konzentration ([H+]cyt) trotz der damit einhergehenden Veränderungen der zytosolischen Ca2+-Konzentration ([Ca2+]cyt) eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Pollenschläuchen spielt. Außerdem korrelierte das Wachstum viel besser mit dem [H+]cyt-Verlauf an der Spitze als mit dem Verlauf des [Ca2+]cytSignals. Überraschenderweise hinkten jedoch sowohl die [Ca2+]cyt- als auch die [H+]cytOszillationen an der Spitze den Wachstumsoszillationen um etwa 33 s bzw. 18 s hinterher, so dass die Rolle von [Ca2+]cyt an der Spitze für das Wachstum des Pollenschlauchs neu bewertet werden muss. Die CapHensor-Bildgebung an lebenden Zellen in Kombination mit Elektrophysiologie ergab, dass die oszillierende Membrandepolarisation besser mit den [H+]cyt-Oszillationen an der Spitze korrelierte als mit den [Ca2+]cyt-Oszillationen, was darauf hindeutet, dass [H+]cyt auch eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des elektrogenen Membrantransports spielt. Mit Hilfe des CapHensors und dem gleichzeitigen Auslesen der Zellbewegungen konnte eine präzise zeitliche und räumliche Auflösung der Ereignisse erzielt werden, was auf eine herausragende Rolle von [H+]cyt beim Wachstum der Pollenschlauchspitze hinweist. Für den Einsatz des CapHensors in Blattzellen musste ein spezielles CapHensor-Konstrukt entwickelt werden, das zusätzliche NES-Lokalisierungssequenzen enthielt, um eine Überlappung der Fluoreszenzsignale aus dem Zellkern und dem Zytosol zu vermeiden. Nachdem dies erreicht war, wurde die Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen in Schließzellen, einem gut beschriebenen Einzelzellsystem, untersucht. Veränderungen des zytosolischen pH-Werts wurden bei der Bewegung von Stomata in früheren Studien beschrieben, aber die physiologische Rolle dieser Veränderungen und die Interaktion mit sich verändernden Ca2+-Signalen waren noch unerforscht. Der Einsatz von CapHensor zusammen mit der von mir entwickelten Technik zur parallelen Erfassung der Stomatabewegung hat unser Verständnis der Rolle von Ca2+ und H+ bei der Stomatabewegung erheblich verbessert. Das Phytohormon ABA und der bakterielle Elicitor Flagellin (flg22) sind typische abiotische bzw. biotische Stressfaktoren, die das Schließen der Stomata auslösen. Welche Art von Ca2+- und H+-Signalen in den Schließzellen durch ABA und flg22 ausgelöst werden und in welchem zeitlichen Zusammenhang sie stehen und welche Rolle sieVII für die Bewegung der Stomata spielen, war bisher unbekannt. Bei der durch ABA und flg22 ausgelösten Schließung der Stomata wurde ein Anstieg von [Ca2+]cyt beobachtet, aber die Dynamik von [H+]cyt unterschied sich grundlegend und zeigte eine andere Dynamik. ABA löste eine ausgeprägte zytosolische Alkalisierung aus, die der [Ca2+]cyt-Antwort um 57 s deutlich vorausging, während die Spaltöffnungen erst ca. 205 s danach anfingen zu schliessen. Bei Flg22 ging das Schließen der Spaltöffnungen nur mit einer leichten zytosolischen Alkalisierung einher, aber die Ca2+-Reaktion war im Vergleich zur ABA-Reaktion viel ausgeprägter. Woher die zytosolische Alkalisierung stammt, war unklar, aber in der Vergangenheit wurde spekuliert, dass die Vakuole dazu beiträgt. In dieser Arbeit wurden vakuoläre pH-Änderungen mit Hilfe des Farbstoffs BCECF über die Zeit verfolgt, wobei die Konzentrationsverschiebung in der Vakuole im Grunde genommen genau den umgekehrten Verlauf aufwies als im Zytosol beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Dynamik des vakuolären pH-Wertes stark an die Änderungen des zytosolischen pHWertes gekoppelt ist. Aus der Literatur ist bekannt, dass reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bei der Signalgebung für das Schließen der Stomata eine wichtige Rolle spielen. Als ich jedoch definierte H2O2-Mengen auf die Zellen applizierte, führten nur unphysiologosch hohe H2O2-Konzentrationen (> 200 µM), die zu einem Verlust der Membranintegrität führten, zum Schließen der Stomata. Unerwarteterweise führten physiologische Konzentrationen von ROS zu einer Ansäuerung des Zytosols, die mit der Öffnung der Stomata, aber nicht mit der Schließung der Stomata in Verbindung gebracht wurde. Um die Rolle von [H+]cyt bei der Steuerung der stomatären Bewegung im Detail zu untersuchen, wurden extrazelluläre und intrazelluläre pH-Änderungen in N. tabacumSchließzellen hervorgerufen um deren Verhalten bei pH-Änderungen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine zytosolische Ansäuerung die Öffnung der Stomata stimuliert, während eine zytosolische Alkalisierung die Schließung der Stomata auslöst, begleitet von einem Anstieg von [Ca2+]cyt. Dies beweist, dass die pH-Regulierung ein wichtiger Aspekt der stomatären Bewegung darstellt und auf die Ca2+-Dynamik einwirkt. Bemerkenswert war, dass die zytosolische Alkalisierung und nicht der Ca2+-Anstieg eine entscheidende Rolle bei der Schließung der Stomata zu spielen schien, da eine stärkere zytosolische Alkalisierung trotz eines ähnlichen [Ca2+]cyt - Anstiegs eine stärkere Schließung der Stomata hervorrief. Erhöhungen von [Ca2+]cyt, die in der Vergangenheit als frühes Stomataschließungssignal diskutiert wurden, konnten in meinen Experimenten den Stomataschluß nicht allein auslösen, selbst wenn extrem starke Ca2+-Signale ausgelöst wurden. Was die Interaktion zwischen den beiden Botenstoffen anbelangt, so warenVIII [Ca2+]cyt und [H+]cyt meist negativ miteinander korreliert, was sich von den Pollenschläuchen unterschied, die eine positive Korrelation zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt aufwiesen. Ca2+- Erhöhungen waren immer mit einer Alkalisierung des Zytosols verbunden, und diese Beziehung konnte durch die Anwesenheit von Vanadat, ein H+-Pumpen Blocker blockiert werden, was darauf hindeutet, dass die H+-ATPasen der Plasmamembran zu der negativen Korrelation von [Ca2+]cyt und [H+]cyt beitragen. Im Vergleich zu den CapHensor-Reaktionen bei Schließzellen wurden zytosolische und Zellkern-lokalisierende Versionen von CapHensor in Mesophyllzellen von N. benthamiana, einem von uns untersuchten multizellulären System, exprimiert. Die Reaktionen der Mesophyllzellen auf die gleichen Stimuli wie bei den Schließzellen zeigten, dass ABA und H2O2 keine Veränderungen von [Ca2+]cyt und [H+]cyt hervorrufen, während flg22 einen Anstieg von [Ca2+]cyt und [H+]cyt bewirkt, der sich von der Reaktion in Schließzellen unterscheidet. Damit konnte ich eindeutig nachweisen, dass Schließ- und Mesophyllzellen in Bezug auf [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Änderungen sehr unterschiedlich auf dieselben Stimuli reagieren, ein Konzept, das zwar schon früher vorgeschlagen, aber noch nie so detailliert für Pflanzen nachgewiesen wurde. Ein Phänomen, das seit langem in Schließzellen beobachtet wird, dessen Funktion oder Ursache aber noch nicht verstanden ist, sind regelmäßige Ca2+-Oszillationen, die spontan auftreten. Interessanterweise wurden zwei Populationen von oszillierenden Schließzellen anhand ihrer [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Phasenbeziehung identifiziert. Bei etwa der Hälfte der oszillierenden Zellen gingen die [H+]cyt-Oszillationen den [Ca2+]cyt-Oszillationen voraus, während in der anderen Hälfte der Schließzellenpopulation [Ca2+]cyt das vorangehende Signal war. Auffallend ist, dass die natürlichen [H+]cyt-Oszillationen durch ABA gedämpft wurden, nicht aber durch flg22. Dieser Effekt lässt sich gut durch die Dämpfung der vakuolären H+-Oszillationen in Gegenwart von ABA erklären, aber nicht durch flg22, das ich mit BCECF sichtbar gemacht habe. Es zeigte sich, dass sowohl der vakuoläre pH-Wert zu spontanen [H+]cyt-Oszillationen beiträgt als auch, dass ABA, nicht aber flg22, den Zusammenhang der natürlichen [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale blockieren kann. Um die Rolle der [Ca2+]cyt-Oszillationen bei der Bewegung der Stomata zu untersuchen, wurden Lösungen mit hohen und niedrigen KCl-Konzentrationen verwendet, um [Ca2+]cyt-Oszillationen auszulösen. Das Auslösen von Ca2+-Oszillationen nach dieser Methode wurde in Studien vor zwei Jahrzehnten etabliert, und die Ergebniss daraus haben zu dem Dogma geführt, dass der Anstieg von [Ca2+]cyt das entscheidende Signal für die Schließung von Stomata ist. Ich habe jedoch herausgefunden, dass die Bewegung der Stomata mit dieser Methode hauptsächlich auf osmotischeIX Effekte und nicht auf die Auswirkungen der [Ca2+]cyt-Erhöhungen zurückzuführen waren. Glücklicherweise fand ich mit dieser Methode heraus, dass es eine starke Korrelation zwischen dem zytosolischen pH-Wert und dem Kaliumtransport über die Plasmamembran und die Vakuole gibt. Die H+-ATPasen der Plasmamembran und die H+-gekoppelten K+-Transporter wurden als Ursache für die pH-Änderungen identifiziert, beides sehr wichtige Aspekte in der Stomaphysiologie, die zuvor nicht experimentell sichtbar gemacht werden konnten. Der Transport von Natriumionen (Na+) ist für die Regulierung der Stomata und der Adaption von Blättern bei Salzstress wichtig, da Salz von der Wurzel zum Spross transportiert werden kann. Im Gegensatz zu den gut beschriebenen Ca2+-abhängigen Na+-Transportmechanismen in den Wurzeln ist überhaupt nicht bekannt, wie Blätter Salzstress verarbeiten. Ich habe Salz auf Protoplasten von Blättern, Mesophyllzellen und Schießzellen appliziert und „Live-Cell-Imaging“ mit Aufzeichnungen der Membranspannung kombiniert, um den Transport und die Signalreizweiterleitung bei Salzstress in Blättern zu verstehen. Sowohl in Mesophyll- als auch in Schließzellen löste NaCl keine Ca2+-Signale aus, wie sie für Wurzeln beschrieben wurden, sondern führte beim Auswaschen von Salz zu [Ca2+]cyt-Transienten. Eine Membrandepolarisation und eine ausgeprägte Alkalisierung wurden jedoch sehr zuverlässig durch NaCl ausgelöst, was vermutlich als Signal für die Entgiftung von hohen Salzkonzentrationen dienen könnte. Im Einklang damit konnte ich zeigen, dass der vakuoläre Kationen/H+-Antiporter NHX1 eine Rolle beim Natriumtransport, der zytosolischen pH-Homöostase und der Kontrolle des Membranpotenzials spielt. Die Überexpression von AtNHX1 ermöglichte es, [H+]cyt-Veränderungen zu vermindern und führte zu einer geringeren Depolarisationsreaktion unter NaCl-Stress. Meine Ergebnisse zeigen somit, dass Blattzellen im Gegensatz zu Wurzeln keine Ca2+-abhängigen Signalkaskaden nutzen, um mit Salzstress umzugehen, und ich konnte zeigen, dass Na+ und K+ die [H+]cyt- und Membranspannungs-Reaktionen auslöst und der Cl--Transport nur einen geringen Einfluss hat. Zusammenfassend habe ich festgestellt, dass pH-Signale eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Wachstums von Pollenschläuchen spielen, sowie bei der Bewegung der Stomata und der Entgiftung der Blätter durch Salz beteiligt sind. Meine Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass pH-Änderungen ein wichtigeres Signal für die Steuerung verschiedener Prozesse in Pflanzen sein könnten als bisher angenommen. Durch den Einsatz des CapHensors in Kombination mit elektrophysiologischen und bioinformatischen Methoden konnte ich feststellen, dass in verschiedenen Zelltypen unterschiedliche Zusammenhänge zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt bestehenX und dass unterschiedliche [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale durch verschiedene Stimuli und Umweltreize ausgelöst werden. Der CapHensor wird in Zukunft sehr nützlich sein, um die koordinierte Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen bei der Steuerung der Pflanzenphysiologie weiter zu untersuchen. KW - Calcium KW - pH KW - live-cell imaging KW - pollen tubes KW - guard cells KW - mesophyll cells KW - Pflanzen KW - Biosensor KW - Bilderzeugung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249736 ER - TY - THES A1 - Masota, Nelson Enos T1 - The Search for Novel Effective Agents Against Multidrug-Resistant Enterobacteriaceae T1 - Die Suche nach neuen wirksamen Wirkstoffen gegen multiresistente Enterobacteriaceae N2 - This thesis aimed at searching for new effective agents against Multidrug-Resistant Enterobacteriaceae. This is necessitated by the urgent need for new and innovative antibacterial agents addressing the critical priority pathogens prescribed by the World Health Organization (WHO). Among the available means for antibiotics discovery and development, nature has long remained a proven, innovative, and highly reliable gateway to successful antibacterial agents. Nevertheless, numerous challenges surrounding this valuable source of antibiotics among other drugs are limiting the complete realization of its potential. These include the availability of good quality data on the highly potential natural sources, limitations in methods to prepare and screen crude extracts, bottlenecks in reproducing biological potentials observed in natural sources, as well as hurdles in isolation, purification, and characterization of natural compounds with diverse structural complexities. Through an extensive review of the literature, it was possible to prepare libraries of plant species and phytochemicals with reported high potentials against Escherichia coli and Klebsiella pneumnoniae. The libraries were profiled to highlight the existing patterns and relationships between the reported antibacterial activities and studied plants’ families and parts, the type of the extracting solvent, as well as phytochemicals’ classes, drug-likeness and selected parameters for enhanced accumulation within the Gram-negative bacteria. In addition, motivations, objectives, the role of traditional practices and other crucial experimental aspects in the screening of plant extracts for antibacterial activities were identified and discussed. Based on the implemented strict inclusion criteria, the created libraries grant speedy access to well-evaluated plant species and phytochemicals with potential antibacterial activities. This way, further studies in yet unexplored directions can be pursued from the indicated or related species and compounds. Moreover, the availability of compound libraries focusing on related bacterial species serves a great role in the ongoing efforts to develop the rules of antibiotics penetrability and accumulation, particularly among Gram-negative bacteria. Here, in addition to hunting for potential scaffolds from such libraries, detailed evaluations of large pool compounds with related antibacterial potential can grant a better understanding of structural features crucial for their penetration and accumulation. Based on the scarcity of compounds with broad structural diversity and activity against Gram-negative bacteria, the creation and updating of such libraries remain a laborious but important undertaking. A Pressurized Microwave Assisted Extraction (PMAE) method over a short duration and low-temperature conditions was developed and compared to the conventional cold maceration over a prolonged duration. This method aimed at addressing the key challenges associated with conventional extraction methods which require long extraction durations, and use more energy and solvents, in addition to larger quantities of plant materials. Furthermore, the method was intended to replace the common use of high temperatures in most of the current MAE applications. Interestingly, the yields of 16 of 18 plant samples under PMAE over 30 minutes were found to be within 91–139% of those obtained from the 24h extraction by maceration. Additionally, different levels of selectivity were observed upon an analytical comparison of the extracts obtained from the two methods. Although each method indicated selective extraction of higher quantities or additional types of certain phytochemicals, a slightly larger number of additional compounds were observed under maceration. The use of this method allows efficient extraction of a large number of samples while sparing heat-sensitive compounds and minimizing chances for cross-reactions between phytochemicals. Moreover, findings from another investigation highlighted the low likelihood of reproducing antibacterial activities previously reported among various plant species, identified the key drivers of poor reproducibility, and proposed possible measures to mitigate the challenge. The majority of extracts showed no activities up to the highest tested concentration of 1024 µg/mL. In the case of identical plant species, some activities were observed only in 15% of the extracts, in which the Minimum Inhibitory Concentrations (MICs) were 4 – 16-fold higher than those in previous reports. Evaluation of related plant species indicated better outcomes, whereby about 18% of the extracts showed activities in a range of 128–512 μg/mL, some of the activities being superior to those previously reported in related species. Furthermore, solubilizing plant crude extracts during the preparation of test solutions for Antibacterial Susceptibility Testing (AST) assays was outlined as a key challenge. In trying to address this challenge, some studies have used bacteria-toxic solvents or generally unacceptable concentrations of common solubilizing agents. Both approaches are liable to give false positive results. In line with this challenge, this study has underscored the suitability of acetone in the solubilization of crude plant extracts. Using acetone, better solubility profiles of crude plant extracts were observed compared to dimethyl sulfoxide (DMSO) at up to 10 %v/v. Based on lacking toxicity against many bacteria species at up to 25 %v/v, its use in the solubilization of poorly water-soluble extracts, particularly those from less polar solvents is advocated. In a subsequent study, four galloylglucoses were isolated from the leaves of Paeonia officinalis L., whereby the isolation of three of them from this source was reported for the first time. The isolation and characterization of these compounds were driven by the crucial need to continually fill the pre-clinical antibiotics pipeline using all available means. Application of the bioautography-guided isolation and a matrix of extractive, chromatographic, spectroscopic, and spectrometric techniques enabled the isolation of the compounds at high purity levels and the ascertainment of their chemical structures. Further, the compounds exhibited the Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) in a range of 2–256 µg/mL against Multidrug-Resistant (MDR) strains of E. coli and K. pneumonia exhibiting diverse MDR phenotypes. In that, the antibacterial activities of three of the isolated compounds were reported for the first time. The observed in vitro activities of the compounds resonated with their in vivo potentials as determined using the Galleria mellonella larvae model. Additionally, the susceptibility of the MDR bacteria to the galloylglucoses was noted to vary depending on the nature of the resistance enzymes expressed by the MDR bacteria. In that, the bacteria expressing enzymes with higher content of aromatic amino acids and zero or positive net charges were generally more susceptible. Following these findings, a plausible hypothesis for the observed patterns was put forward. The generally challenging pharmacokinetic properties of galloylglucoses limit their further development into therapeutic agents. However, the compounds can replace or reduce the use of antibiotics in livestock keeping as well as in the treatment of septic wounds and topical or oral cavity infections, among other potential uses. Using nature-inspired approaches, a series of glucovanillin derivatives were prepared following feasible synthetic pathways which in most cases ensured good yields and high purity levels. Some of the prepared compounds showed MIC values in a range of 128 – 512 μg/mL against susceptible and MDR strains of Klebsiella pneumoniae, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium (VRE). These findings emphasize the previously reported essence of small molecular size, the presence of protonatable amino groups and halogen atoms, as well as an amphiphilic character, as crucial features for potential antibacterial agents. Due to the experienced limited success in the search for new antibacterial agents using purely synthetic means, pursuing semi-synthetic approaches as employed in this study are highly encouraged. This way, it is possible to explore broader chemical spaces around natural scaffolds while addressing their inherent limitations such as solubility, toxicity, and poor pharmacokinetic profiles. N2 - Ziel dieser Arbeit war die Suche nach neuen wirksamen Antiinfektiva gegen multiresistente Enterobacteriaceae. Grund dafür ist der dringende Bedarf an neuen und innovativen antibakteriellen Wirkstoffen gegen die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als vorrangig eingestuften Krankheitserreger. Unter den verfügbaren Methoden zur Entdeckung und Entwicklung von Antibiotika ist die Natur seit langem ein bewährtes, innovatives und äußerst zuverlässiges Mittel, um erfolgreich zu antibakteriellen Wirkstoffen zu gelangen. Dennoch stehen dieser wertvollen Quelle von Antibiotika und anderen Arzneimitteln zahlreiche Herausforderungen gegenüber, die die vollständige Ausschöpfung ihres Potenzials einschränken. Dazu gehören die Verfügbarkeit qualitativ hochwertiger Daten über die hochpotenten natürlichen Quellen, Einschränkungen bei den Methoden zur Herstellung und zum Screening von Rohextrakten, Engpässe bei der Reproduktion des in natürlichen Quellen beobachteten biologischen Potenzials sowie Hürden bei der Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Naturstoffen mit unterschiedlicher struktureller Komplexität. Mittels einer umfassenden Durchsicht der Literatur war es möglich, Bibliotheken mit Pflanzenarten und Phytochemikalien zu erstellen, die ein hohes Potenzial gegen Escherichia coli und Klebsiella pneumnonia aufweisen. Die Bibliotheken wurden profiliert, um die bestehenden Muster und Beziehungen zwischen den berichteten antibakteriellen Aktivitäten und den untersuchten Pflanzenfamilien und -teilen, der Art des Extraktionslösungsmittels sowie den Klassen der Phytochemikalien, der Wirkstoffähnlichkeit und ausgewählten Parametern für eine verstärkte Akkumulation in den gramnegativen Bakterien aufzuzeigen. Darüber hinaus wurden Motivationen, Ziele, die Rolle traditioneller Methoden und andere wichtige experimentelle Aspekte beim Screening von Pflanzenextrakten auf antibakterielle Aktivitäten identifiziert und diskutiert. Auf der Grundlage der strengen Aufnahmekriterien bieten die erstellten Bibliotheken einen schnellen Zugang zu gut bewerteten Pflanzenarten und Phytochemikalien mit potenziellen antibakteriellen Aktivitäten. Auf diese Weise können weitere Studien in noch unerforschten Richtungen mit den angegebenen oder ähnlichen Arten und Verbindungen durchgeführt werden. Darüber hinaus spielt die Verfügbarkeit von Substanzbibliotheken, die sich auf verwandte Bakterienarten konzentrieren, eine große Rolle bei den laufenden Bemühungen, die Regeln für die Penetration und Akkumulation von Antibiotika zu entwickeln, insbesondere bei gramnegativen Bakterien. Neben der Suche nach potenziellen Molekülgerüsten aus solchen Bibliotheken können detaillierte Bewertungen großer Pools von Verbindungen mit antibakteriellem Potenzial ein besseres Verständnis der strukturellen Merkmale ermöglichen, die für ihre Penetration und Akkumulation entscheidend sind. Da es kaum Verbindungen mit breiter struktureller Vielfalt und Aktivität gegen gramnegative Bakterien gibt, ist die Erstellung und Aktualisierung solcher Bibliotheken nach wie vor ein mühsames, aber wichtiges Unterfangen. Es wurde eine schnelle mikrowellenunterstützte Extraktionsmethode unter Druck (PMAE) und bei niedrigen Temperaturen entwickelt und mit der herkömmlichen Kaltmazeration mit längerer andauernd verglichen. Mit der PMAE-Methode sollten die wichtigsten Probleme herkömmlicher Extraktionsmethoden gelöst werden, die eine lange Extraktionsdauer erfordern, mehr Energie und Lösungsmittel verbrauchen und zudem größere Mengen an Pflanzenmaterial benötigen. Darüber hinaus sollte die Methode die übliche Verwendung hoher Temperaturen in den meisten der derzeitigen MAE-Anwendungen ersetzen. Interessanterweise lag die Ausbeute von 16 der 18 Pflanzenproben bei der 30-minütigen PMAE zwischen 91 und 139 % der jenigen, die bei der 24-stündigen Extraktion durch Mazeration erzielt wurde. Darüber hinaus wurden bei einem analytischen Vergleich der mit den beiden Methoden gewonnenen Extrakte unterschiedliche Selektivitätsgrade festgestellt. Obwohl jede Methode eine selektive Extraktion größere Mengen oder zusätzlicher Arten bestimmter Phytochemikalien anzeigte, wurde bei der Mazeration eine etwas größere Anzahl an Verbindungen beobachtet. Die Anwendung dieser PMAE-Methode ermöglicht eine effiziente Extraktion einer großen Anzahl von Proben, wobei hitzeempfindliche Verbindungen geschont werden und die Wahrscheinlichkeit von Kreuzreaktionen zwischen Phytochemikalien minimiert wird. Die weitere Untersuchung von Pflanzenextraktionen haben die geringe Reproduzierbarkeit von antibakteriellen Aktivitäten, die zuvor für verschiedene Pflanzenarten berichtet wurden, aufgedeckt, die Hauptursachen für die schlechte Reproduzierbarkeit identifiziert und mögliche Maßnahmen zur Minimierung dieser Herausforderung vorgeschlagen. Die Mehrheit der Extrakte zeigte bis zur höchsten getesteten Konzentration von 1024 µg/ml keine Aktivitäten. Bei identischen Pflanzenarten wurden nur bei 15 % der Extrakte gewisse Aktivitäten beobachtet, wobei die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) um das Vier- bis 16-fache höher waren als in früheren Berichten. Die Auswertung verwandter Pflanzenarten zeigte geringfügig bessere Ergebnisse, wobei etwa lagen 18 % der Extrakte Aktivitäten in einem Bereich von 128-512 µg/ml aufwiesen; dabei einige der Aktivitäten über denen, die zuvor bei verwandten Arten berichtet wurden. Darüber hinaus wurde die Löslichkeit von Pflanzenrohextrakten bei der Herstellung von Testlösungen für die Bestimmung der Antimikrobischen Suszeptibilität (AST) als eine der größten Herausforderungen bezeichnet. Bei dem Versuch, diese Herausforderung zu bewältigen, wurden in einigen Studien bakterientoxische Lösungsmittel oder allgemein inakzeptable Konzentrationen gängiger Lösungsvermittler verwendet. Beide Ansätze können zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Deshalb hat diese Studie die Eignung von Aceton für die Solubilisierung von Pflanzenrohextrakten unterstrichen. Bei Verwendung von Aceton wurden eine bessere Löslichkeit der Pflanzenrohextrakten im Vergleich zu Dimethylsulfoxid (DMSO) bei bis zu 10 % v/v beobachtet. Aufgrund der fehlenden Toxizität gegen viele Bakterienarten bei bis zu 25 % v/v wird die Verwendung von Aceton für die Solubilisierung schwer wasserlöslicher Extrakte, insbesondere solcher aus weniger polaren Lösungsmitteln, befürwortet. In der nachfolgenden Untersuchung wurden vier Galloylglucosen aus den Blättern von Paeonia officinalis L. isoliert, wobei von drei Substanzen aus dieser Quelle zum ersten Mal berichtet wurde. Die Isolierung und Charakterisierung dieser Verbindungen wurden durch die dringende Notwendigkeit vorangetrieben, die präklinische Antibiotika-Pipeline mit allen verfügbaren Methoden zu füllen. Die Anwendung der bioautographisch gesteuerten Isolierung und einer Matrix aus extraktiven, chromatographischen, spektroskopischen und spektrometrischen Techniken ermöglichte die Isolierung der Verbindungen mit hohem Reinheitsgrad und die Bestimmung ihrer chemischen Strukturen. Darüber hinaus wiesen die Verbindungen minimale Hemmkonzentrationen (MHK) in einem Bereich von 2-256 µg/ml gegen multiresistente (MDR) Stämme von E. coli und K. pneumonia auf, die verschiedene MDR-Phänotypen aufweisen. Über die antibakteriellen Aktivitäten von drei der isolierten Verbindungen wurde zum ersten Mal berichtet. Die beobachteten In-vitro-Aktivitäten der Verbindungen stimmten mit ihren In-vivo-Potenzialen überein, die anhand des Galleria mellonella-Larvenmodells ermittelt wurden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Empfindlichkeit der MDR-Bakterien gegenüber den Galloylglucosen von der Art der von den MDR-Bakterien exprimierten Resistenzenzyme abhängt. So waren die Bakterien, die Enzyme mit einem höheren Gehalt an aromatischen Aminosäuren und null oder positiven Nettoladungen exprimieren, im Allgemeinen anfälliger. Nach diesen Erkenntnissen wurde eine plausible Hypothese für die beobachteten Muster aufgestellt. Die allgemein schwierigen pharmakokinetischen Eigenschaften von Galloylglucosen schränken ihre weitere Entwicklung als therapeutischen Wirkstoffen ein. Die Verbindungen können jedoch den Einsatz von Antibiotika in der Tierhaltung sowie bei der Behandlung von septischen Wunden und Infektionen der Haut oder der Mundhöhle ersetzen oder reduzieren, neben anderen potenziellen Anwendungen. Mit von der Natur inspirierten Ansätzen wurde eine Reihe von Glucovanillin-Derivaten synthetisch hergestellt. Einige der neuen Verbindungen wiesen MHK-Werte im Bereich von 128 - 512 μg/ml gegen empfindliche und MDR-Stämme von Klebsiella pneumoniae, Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus (MRSA) und Vancomycin-resistentem Enterococcus faecium (VRE) auf. Diese Ergebnisse unterstreichen die bereits früher berichtete Bedeutung einer kleinen Molekülgröße, des Vorhandenseins protonierbarer Aminogruppen und Halogenatome sowie eines amphiphilen Charakters als entscheidende Merkmale für potenzielle antibakterielle Wirkstoffe. Da die Suche nach neuen antibakteriellen Wirkstoffen mit rein synthetischen Mitteln bisher nur begrenzt erfolgreich war, sind halbsynthetische Ansätze, wie sie in dieser Studie verwendet wurden, sehr zu empfehlen. Auf diese Weise ist es möglich, größere chemische Räume um natürliche Molekülgerüste herum zu erforschen und gleichzeitig deren inhärente Einschränkungen wie Löslichkeit, Toxizität und schlechte pharmakokinetische Profile zu überwinden. KW - Enterobacteriaceae KW - Pflanzen KW - Synthese KW - Multidrugresistant KW - Plant extracts KW - Isolation and Characterization KW - Microwave Assisted Extraction KW - Nature-Insipired Synthesis KW - Reproducibility challenges KW - Library of Phytochemicals KW - Library of plant species KW - Plants KW - Characterization KW - Synthesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302632 ER - TY - THES A1 - Munz, Eberhard T1 - Physiological and metabolical high-resolution MRI of plants T1 - Physiologische und metabolische hochaufgelöste Pflanzen-Magnetresonanzbildgebung N2 - The noninvasive magnetic resonance imaging technique allows for the investigation of functional processes in the living plant. For this purpose during this work, different NMR imaging methods were further developed and applied. For the localisation of the intrusion of water into the germinating rape seed with the simultaneous depiction of the lipid-rich tissue via a 3D rendering, in Chap. 5 the technique of interleaved chemical selective acquisition of water and lipid was used in the germinating seed. The utilization of high-resolution MR images of germinated seeds enabled the localization of a predetermined water gap in the lipid-rich aleurone layer, which resides directly under the seed coat. The for a long time in biology prevalent discussion, whether such a gap exists or the seed soaks up the water from all sides, rather like a sponge, could hereby, at least for the rapeseed seed, be answered clearly. Furthermore, the segmentation and 3D visualization of the vascular tissue in the rapeseed seeds was enabled by the high-resolution datasets, a multiply branched structure preconstructed in the seed could be shown. The water is directed by the vascular tissue and thus awakens the seed gradually to life. This re-awakening could as well be tracked by means of invasive imaging via an oxygen sensor. In the re-awakened seeds, the lipid degradation starts, other than expected, not in the lipid-rich cotyledons but in the residual endosperm remaining from seed development and in the aleurone layer which previously protected the embryo. Within this layer, the degradation could be verified in the high-resolution MR datasets. The method presented in Chap. 6 provides a further characteristic trait for phenotyping of seeds and lipid containing plants in general. The visualization of the compounds of fatty acids in plant seeds and fruits could be achieved by the distinct utilization of chemical shift-selective imaging techniques. Via the application of a CSI sequence the fatty acid compounds in an olive were localized in a 2D slice. In conjunction with an individually adjusted CHESS presaturation module Haa85 the high-resolution 3D visualization of saturated and unsaturated fatty acid compounds in different seeds was achieved. The ratio maps calculated from these datasets allow to draw conclusions from the developmental stage or the type of seed. Furthermore, it could be shown that the storage condition of two soybean seeds with different storage time durations lead to no degradation of the fatty acid content. Additional structural information from inside of dry seeds are now accessible via MRI. In this work the imaging of cereal seeds could be significantly improved by the application of the UTE sequence. The hitherto existing depictions of the lipid distribution, acquired with the spin echo sequence, were always sufficient for examinations of the lipid content, yet defects in the starchy endosperm or differences in the starch concentration within the seed remained constantly unseen with this technique. In a direct comparison of the datasets acquired with the previous imaging technique (spin echo) and with UTE imaging, the advantage of data acquisition with UTE could be shown. By investigating the potential seed compounds (starch, proteins, sugar) in pure form, the constituent parts contributing to the signal could be identified as bound water (residual moisture) and starch. The application of a bi-exponential fit on the datasets of the barley seed enabled the separate mapping of magnetization and of relaxation time of two components contributing to the NMR signal. The direct comparison with histological stainings verified the previous results, thus this technique can be used for the selective imaging of starch in dry seeds. Conclusions on the translocation characteristics in plants can be drawn by the technique proposed in Chap. 8. The associated translocation velocities can now, even in the range of several um/h, be determined in the living plant. Based on calculated concentrations of an MR contrast agent, which was taken up by the plant, these translocation velocities were estimated both in longitudinal direction, thus along the vascular bundle, and in horizontal direction, thus out of the bundle. The latter velocity is located below the contrast agent's velocity value of free diffusion. By adjusting a dynamic contrast-enhancing imaging technique (DCE-Imaging, Tof91) the acquisition duration of a T1-map was significantly reduced. By means of these maps, local concentrations of the contrast agent in plant stems and the siliques of the rapeseed plant could be determined. Numerous questions in plant science can only be answered by non-invasive techniques such as MRI. For this reason, besides the experimental results achieved in this work, further NMR methods were tested and provided for the investigation of plants. As an example, the study on the imaging of magnetic exchange processes are mentioned, which provided the groundwork for a possible transfer of CEST experiments (Chemical Exchange Saturation Transfer) to the plant. The results are presented in the bachelor thesis of A. Jäger Jae17, which was performed under my supervision, they find great interest under biologists. The development of new technologies, which extend the possibilities for the investigation of living organisms, is of great importance. For this reason, I have contributed to the development of the currently unpublished method RACETE (Refocused Acquisition of Chemical Exchange Transferred Excitations [Jak17, Reu17, Gut18a]). By rephasing the transferred magnetization the utilization of properties which have not been available in chemical "`exchange"' experiments is enabled. With this method a positive contrast is generated, thus a reference experiment is not mandatory. Furthermore, the image phase, which in classical experiments contains no information about the exchanged protons, can be used for the distinct identification of multiple substances which have been excited simultaneously. This recently at the Department of Experimental Physics V developed method can be used in particular for the identification of lipids and for the localization of sugars and amino acids, thus it can serve the enhancement and improvement of non-invasive analytical methods. N2 - Die nicht-invasive Bildgebungstechnik der Magnetresonanz ermöglicht es, funktionelle Prozesse in Pflanzen am lebenden Objekt zu untersuchen. Hierfür wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene NMR-Bildgebungsmethoden weiterentwickelt und angewendet. Da Pflanzen ein magnetisch sehr inhomogenes Gewebe besitzen, bedingt durch Lufteinschlüsse und das Vorhandensein verschiedenster gelöster Stoffe im Pflanzengewebe, wurden daher hauptsächlich Spin-Echo-Methoden für die Bildgebung verwendet. Um das erste Eindringen des Wassers in den keimenden Raps-Samen bei gleichzeitiger Darstellung des lipid-reichen Gewebes mittels einer 3D-Visualisierung zu lokalisieren, wurde in Kapitel 5 die Technik der verschachtelten, chemisch selektiven Aufnahme von Wasser und Lipid im keimenden Samen verwendet. Durch Verwendung von hochausgelösten MR-Aufnahmen an gekeimten Samen konnte weiterhin in der lipid-reichen Aleuron-Schicht, die sich direkt unter der Samenschale befindet, ein gezielt angelegter Einlass für das Wasser verortet werden. Die in der Biologie lange Zeit verbreitete Diskussion, ob es einen solchen Einlass gibt oder der keimende Samen das Wasser eher wie ein Schwamm von allen Seiten aufsaugt, konnte hierdurch, zumindest für den Raps-Samen, eindeutig beantwortet werden. Weiterhin konnte durch die hoch-aufgelösten Aufnahmen das vaskuläre Gewebe in den Raps-Samen segmentiert und in 3D veranschaulicht werden, es zeigte sich eine mehrfach verzweigte Struktur, die bereits im Samen angelegt ist. Das Wasser folgt hierbei dem vaskulären Gewebe und erweckt hierdurch den Samen schrittweise zum Leben. Dieses Wieder-Erwachen konnte ebenfalls durch die invasive Bildgebung mittels eines Sauerstoff-Sensors nachverfolgt werden. Im nun erwachten Samen selbst beginnt der Lipid-Abbau, anders als zunächst angenommen, nicht in den lipid-haltigen Kotyledonen sondern im von der Samen-Entwicklung verbliebenden Endosperm und in der den Keimling vormals schützenden Aleuron-Schicht. In dieser konnte der Abbau an gekeimten Samen durch hochaufgelöste MR-Aufnahmen nachgewiesen werden. Die in Kapitel 6 vorgeschlagene Methode liefert ein weiteres Merkmal zur Phenotypisiserung von Samen und lipidhaltigen Pflanzenbestandteilen im Allgemeinen. Die Darstellung der Bestandteile ungesättigter Fettsäuren in Pflanzensamen und -Früchten konnte durch gezielte Verwendung von chemisch selektiven Bildgebungstechniken erreicht werden. Durch die Anwendung einer CSI-Sequenz konnten die Fettsäurebestandteile in Oliven in einer 2D-Schicht lokalisiert werden. In Verbindung mit einem jeweils angepassten CHESS-Vorsättigungsmodul Haa85 wurde die hochaufgelöste 3D-Darstellung von gesättigten und ungesättigten Fettsäurebestandteilen in unterschiedlichen Samen erreicht. Rückschlüsse über das Entwicklungsstadium sowie die Sorte der verwendeten Samen können aus den Verhältnis-Karten, die aus den jeweiligen Datensätzen berechnet wurden, gezogen werden. Dass in diesem Fall die Aufbewahrungsmethode zu keiner Degradation der Fettsäurezusammensetzung geführt hat, konnte weiterhin am Beispiel von zwei Sojasamen mit unterschiedlicher Lagerdauer gezeigt werden. Zusätzliche strukturelle Informationen aus dem Inneren trockener Samen sind nun mittels MRT zugänglich. In dieser Arbeit konnte durch die UTE-Sequenz die Bildgebung von Getreidesamen deutlich vorangebracht werden. Die bisherigen Darstellungen der Lipid-Verteilung, aufgenommen mit einer Spin-Echo Sequenz, waren zwar für die Betrachtung des Lipid-Gehalts stets ausreichend, Defekte im stärkehaltigen Endosperm oder Unterschiede in der Stärke-Konzentration innerhalb des Samen blieben mit dieser Technik jedoch stets verborgen. Im direkten Vergleich der mit der bisherigen Technik (Spin-Echo) und der UTE-Bildgebung aufgenommenen Datensätze konnte der Vorteil der Datenaufnahme mit UTE gezeigt werden. Durch die Untersuchung der möglichen Samenbestandteile (Stärke, Proteine, Zucker) in Reinform konnten die zum Signal beitragen Bestandteile als gebundenes Wasser (Restfeuchte) und Stärke identifiziert werden. Die Verwendung bi-exponentiellen Fits and die Messdaten ermöglichte es im Gersten-Samen, zwei zum Signal beitragende Komponenten in getrennten Karten bezüglich ihrer Magnetisierung und Relaxationszeit zu trennen. Der Vergleich mit histologischen Färbungen bestätigte die bisherigen Ergebnisse, somit kann diese Technik zur selektiven Darstellung von Stärke in trockenen Samen verwendet werden. Rückschlüsse auf das Transportverhalten in Pflanzen können durch die in Kapitel 8 vorgestellte Technik gezogen werden. Die zugehörigen Transportgeschwindigkeiten im lebenden Pflanzenobjekt können nun, selbst im Bereich von wenigen $\mu$m/h, bestimmt werden. Diese wurden anhand von berechneten Konzentrationen eines von der Pflanze aufgenommenen MR-Kontrastmittels sowohl in longitudinaler Richtung, also entlang des Leitgewebebündels, als auch in horizontaler Richtung, also aus dem Leitbündel heraus, abgeschätzt werden; Letztere Geschwindigkeit liegt deutlich unter dem Wert der freien Diffusionsgeschwindigkeit des Kontrastmittels. Hierfür wurden durch Anpassung einer dynamischen Kontrast-erhöhenden Bildgebungstechnik (DCE-Imaging, Tof91) die Aufnahmedauer einer für die weiteren Berechnungen benötigen T1-Karte deutlich reduziert. Mittels dieser Karten konnten die lokalen Konzentrationen des Kontrastmittels in Pflanzenstängeln und Schoten der Rapspflanze bestimmt werden. Zahlreiche Fragen in der Pflanzenforschung können nur durch nicht-invasive Techniken wie MRT beantwortet werden. Deswegen wurden, neben den experimentellen Ergebnissen, die mittels dieser Arbeit erreicht wurden, auch weitere NMR Methoden für die Untersuchung von Pflanzen getestet und zur Verfügung gestellt. Als Beispiel seien hier die Untersuchungen zur Bildgebung von magnetischen Austauschprozessen genannt, welche eine Vorarbeit zur möglichen Übertragung con CEST-Experimenten (Chemical Exchange Saturation Transfer) auf das Modell Pflanze liefern. Die Ergebnisse sind in der Bachelor-Arbeit von A. Jäger \cite{jaeger17}, an deren Durchführung ich als Betreuer maßgeblich beteiligt war, dargestellt und finden großes Interesse bei Biologen. Von besonderer Wichtigkeit sind auch die Entwicklungen neuer Technologien, die die Möglichkeiten zur Untersuchung von lebenden Organismen erweitern können. Deswegen habe ich zu der Entwicklung der bislang unveröffentlichten Methode RACETE (Refocused Acquisition of Chemical Exchange Transferred Excitations [Jak17, Reu17, Gut18a]) beigetragen. Durch das Rephasieren der transferierten Magnetisierung können Eigenschaften, die bislang in chemischen "`Austausch"'-Experimenten nicht zur Verfügung stehen, ausgenutzt werden. Mit dieser Methode wird ein positiver Kontrast erzeugt, sie ist deshalb nicht zwingend auf ein Referenz-Experiment angewiesen. Weiterhin kann die Bildphase, welche in klassichen CEST-Experimenten keine Information über die ausgetauschten Protonen enthält, zur eindeutigen Identifizierung mehrerer parallel angeregter Substanzen verwendet werden. KW - Kernspintomografie KW - Pflanzen KW - Pflanzenbildgebung Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172518 ER - TY - JOUR A1 - Zonneveld, Ben J. M. T1 - The DNA weights per nucleus (genome size) of more than 2350 species of the Flora of The Netherlands, of which 1370 are new to science, including the pattern of their DNA peaks JF - Forum Geobotanicum N2 - Besides external characteristics and reading a piece of DNA (barcode), the DNA weight per nucleus (genome size) via flow cytometry is a key value to detect species and hybrids and determine ploidy. In addition, the DNA weight appears to be related to various properties, such as the size of the cell and the nucleus, the duration of mitosis and meiosis and the generation time. Sometimes it is even possible to distinguish between groups or sections, which can lead to new classification of the genera. The variation in DNA weight is also useful to analyze biodiversity, genome evolution and relationships between related taxa. Moreover, it is important to know how large a genome is before one determines the base sequence of the DNA of a plant. Flow cytometry is also important for understanding fundamental processes in plants such as growth and development and recognizing chimeras. In the literature, DNA weight measurements are usually limited to one genus and often only locally (Siljak et al. 2010; Bai et al. 2012). In this study, however, it was decided to investigate all vascular plants from one country. This can also contribute to the protection of rare plants. This study is the first flora in the world whose weight of DNA per nucleus and peak patterns has been determined. More than 6400 plants, representing more than 2350 (sub)species (more than 90%) have been collected, thanks to the help of almost 100 volunteers of Floristisch Onderzoek Nederland (Floron). Multiple specimens of many species have therefore been measured, preferably from different populations, in some cases more than fifty. For 1370 species, these values were not previously published. Moreover, a good number of the remaining 45% are new for The Netherlands. In principle, each species has a fixed weight of DNA per nucleus. It has also been found that, especially between the genera, there are strong differences in the number of peaks that determine the DNA weight, from one to five peaks. This indicates that in a plant or organ there are sometimes nuclei with multiples of its standard DNA weight (multiple ploidy levels). It is impossible to show graphs of more than 2350 species. Therefore, we have chosen to show the peak pattern in a new way in a short formula. Within most genera there are clear differences in the DNA weights per nucleus between the species, in some other genera the DNA weight is hardly variable. Based on about twenty genera that were previously measured completely in most cases (‘t Hart et al. 2003: Veldkamp and Zonneveld 2011; Soes et al. 2012; Dirkse et al. 2014, 2015; Verloove et al. 2017; Zonneveld [et al.] 2000−2018), it can be noted that even if all species of a genus have the same number of chromosomes, there can still be a difference of up to three times in the weight of the DNA. Therefore, a twice larger DNA weight does not have to indicate four sets of chromosomes. Finally, this research has also found clues to examine further the current taxonomy of a number of species or genera. KW - DNA weight KW - Pflanzen KW - genome KW - flora KW - Netherlands Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189724 UR - http://www.forum-geobotanicum.net/articles/vol_8-2018/zonneveld_flora-of-the-netherlands/zonneveld_flora-of-the-netherlands.pdf SN - 1867-9315 VL - 8 ER -