TY - THES A1 - Makgotlho, Phuti Edward T1 - Molecular characterization of the staphylococcal two component system sae and its role in the regulation of the adhesin Eap under SDS stress stimulation T1 - Die molekulare charakterisierung des zwei komponenten-systems sae in staphylokokken und seiner rolle in der Regulation des Eap adhäsins unter SDS vermittelten stress bedingungen N2 - The Staphylococcus aureus two component system (TCS) sae governs expression of numerous virulence factors, including Eap (extracellular adherence protein), which in turn among other functions also mediates invasion of host cells. The sae TCS is encoded by the saePQRS operon, with saeS coding for the sensor histidine kinase (SaeS) and saeR encoding the response regulator (SaeR). The saeRS system is preceded by two additional open reading frames (ORFs), saeP and saeQ, which are predicted to encode a lipoprotein (SaeP) and a membrane protein (SaeQ), respectively. Earlier, we have shown that SDS-containing subinhibitory concentrations of biocides (Perform®) and SDS alone activate sae transcription and increase cellular invasiveness in S. aureus strain Newman. The effect is associated with an amino acid exchange in the N-terminus of SaeS (L18P), specific to strain Newman. In this work, the role of whether the two additional genes, saePQ coding for the accessory proteins SaeP and SaeQ, respectively, are involved in SDS-mediated saeRS was investigated. It could demonstrated that the lack of the SaeP protein resulted in an increased saeRS transcription without SDS stress in both SaeSL/P variants, while the SDS effect was less pronounced on sae and eap expression compared to the Newman wildtype, suggesting that the SaeP protein represses the sae system. Also, SDS-mediated inductions of sae and eap transcription along with enhanced invasion were found to be dependent on presence of the SaeSP variant in Newman wildtype. On the other hand, the study also shows that the saePQ region of the sae operon is required for fully functional two-component system saeRS under normal growth conditions, but it is not involved in SDS-mediated activation of the saeS signaling and sae-target class I gene, eap. In the second approach, the study investigates whether SDS-induced sae expression and host cell invasion is common among S. aureus strains not carrying the (L18P) point mutation. To demonstrate this strain Newman, its isogenic saeS mutants, and various S. aureus isolates were analysed for sae, eap expression and cellular invasiveness. Among the strains tested, SDS exposure resulted only in an increase of sae transcription, Eap production and cellular invasiveness in strain Newman wild type and MRSA strain ST239-635/93R, the latter without an increase in Eap. Interestingly, the epidemic community-associated MRSA strain, USA300 LAC showed a biphasic response in sae transcription at different growth stages, which, however, was not accompanied by increased invasiveness. All other clinical isolates investigated displayed a decrease of the parameters tested. While in strain Newman the SDS effect was due to the saeSP allele, this was not the case in strain ST239-635/93R and the biphasic USA300 strains. Also, increased invasiveness of ST239-635/93R was found to be independent of Eap production. Furthermore, to investigate the global effect of SDS on sae target gene expression, strain Newman wild-type and Newman ∆sae were treated with SDS and analyzed for their transcription profiles of sae target genes using microarray assays. We could show that subinhibitory concentrations of SDS upregulate and downregulate gene expression of several signaling pathways involved in biosynthetic, metabolic pathways as well as virulence, host cell adherence, stress reponse and many hypothetical proteins. In summary, the study sheds light on the role of the upstream region saePQ in SDS-mediated saeRS and eap expression during S. aureus SDS stress. Most importantly, the study also shows that subinhibitory SDS concentrations have pronounced strain-dependent effects on sae transcription and subsequent host cell invasion in S. aureus, with the latter likely to be mediated in some strains by other factors than the known invasin Eap and FnBP proteins. Moreover, there seems to exist more than the saeSP-mediated mechanism for SDS-induced sae transcription in clinical S. aureus isolates. These results help to further understand and clarify virulence and pathogenesis mechanisms and their regulation in S. aureus. N2 - Das Zwei Komponenten-Systems (TCS) Sae in S. aureus reguliert die Expression einer Vielzahl von Virulenzfaktoren, dazu gehört unter anderem das extrazelluläre Adhärenzprotein Eap, welches neben weiteren Funktionen, die Invasion in eukaryotische Wirtszellen vermittelt. Die Gene des sae TCS sind in einem Operon organisiert (saePQRS), wobei saeS für die sensorische Histidinkinase (SaeS) und saeR für den „Response Regulator“ (SaeR) kodieren. Diesen Genen sind zwei weitere Genabschnitte, saeP und saeQ, vorangestellt, wobei saeP vermutlich für ein Lipoprotein (SaeP) und saeQ für ein Membranprotein (RelQ) kodieren. In einer früheren Arbeit konnten wir zeigen, dass SDS-haltige Biozide (Perform©) unter sub- inhibitorischen Konzentrationen, sowie reines SDS, die sae Transkription aktiviert und dadurch zu einer erhöhten Invasion des S. aureus Stamms Newman in Wirtszellen führt. Dieser Effekt ist assoziiert mit einem spezifischen Aminosäureaustausch im N-terminus von SaeS (L18P) des Stamm Newman. In dieser Arbeit soll nun die Beteiligung der zwei zusätzlichen Gene, saeP und saeQ, an der SDS vermittelten transkriptionellen Induktion von saeR/S untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass ohne SaeP, die saeR/S Transkription in beiden SaeL/P Varianten erhöht war, wobei eine zusätzliche SDS Behandlung hierfür nicht notwendig war. Im Gegenteil, es zeigte sich, dass der SDS Effekt auf die sae und eap Expression in der saeP Mutante deutlich weniger ausgeprägt ist als im Wildtyp Stamm. Das läßt vermuten, dass das Lipoprotein SaeP repremierend auf das sae System einwirkt. Des Weiteren wurde festgestellt, dass die SDS vermittelte transkriptionelle Induktion von sae und eap, zusammen mit der erhöhten Invasion, abhängig vom vorhanden sein der SaeSP Variante im Newman Wildtyp Stamm ist. Die Arbeit zeigt, dass die saePQ Region wichtig ist für die vollständige Funktion des Zwei Komponenten Systems SaeRS unter normalen Wachstumsbedingungen. Jedoch ist diese Region nicht involviert in der Aktivierung von SaeS, mit SDS als Signalgeber, sowie der darauffolgenden Aktivierung des sae Zielgens eap. In einem zweiten Ansatz wurde untersucht, ob die SDS induzierte sae Expression und Wirtszellinvasion auch häufig in S. aureus Stämmen auftritt, welche keine (L18P) Punktmutation besitzen. Dafür wurde Stamm Newman, die isogene saeS Mutante und verschiedene S. aureus Klinikisolate auf ihre sae, eap Expression, sowie zelluläre Invasionsfähigkeit hin analysiert. Von den getesteten Stämmen reagiert nur Wildtyp Stamm Newman und ein MRSA Stamm ST239-635/93R mit gesteigerter sae Transkription, Eap Produktion und zellulärer Invasion. Der MRSA Stamm jedoch ohne erhöhte Eap Produktion. Interessanterweise zeigt der „community- associated“ MRSA Stamm USA300 LAC eine biphasische sae Transkription in verschiedenen Wachstumsphasen, welche jedoch nicht einhergeht mit erhöhter Invasion. Alle anderen Klinikisolate zeigten abnehmende Tendenzen in den getesteten Parametern. Während im Stamm Newman der SDS Effekt auf das saeSP Allel zurückzuführen ist, gilt dies nicht für den Stamm ST239-635/93R, sowie den biphasischen Stamm USA300. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die erhöhte Invasion des Stamms ST239-635/93R unabhängig von seiner Eap Produktion ist. Des Weiteren zeigten wir den globalen Effekt von SDS auf die sae Zielgenexpression. Dafür behandelten wir Wildtyp Stamm Newman mit SDS und analysierten die Transkription der sae Zielgene mittels Microarray Analyse. Wir konnten zeigen, dass subinhibitorische SDS Konzentrationen, induzierende als auch repremierende Auswirkungen auf die Genexpression haben. Dabei sind Gene betroffen, die involviert sind in verschiedene Signalwege, Biosynthese/Metabolismus als auch in Virulenz, Wirtzelladhärenz und Stressantwort. Zusammenfassend gibt die Arbeit Aufschluss über die Rolle der „upstream“ Region saePQ hinsichtlich der SDS-abhängigen saeRS und eap Expression in S. aureus. Am wichtigsten ist hierbei die Erkenntnis, das subinhibitorische SDS Konzentrationen einen deutlichen stammabhängigen Effekt auf die sae Transkription und daraus folgernd auf die Wirtszellinvasion von S. aureus haben. Letzteres wird vermutlich in manchen Stämmen durch andere Faktoren als die bekannten Invasinproteine Eap und FnBP vermittelt. Außerdem scheint es in den klinischen S. aureus Isolaten mehr als nur den saeSP abhängigen Mechanismus der sae Induktion durch SDS zu geben. Diese Ergebnisse helfen uns die Virulenz und pathogenen Mechanismen als auch deren Regulation in S. aureus zu verstehen. Die Beobachtungen tragen zu unserem Verständnis bei, wie das sae System Signale der Umgebung detektieren kann. Dies ist bis jetzt eine Fragestellung mit vielen Unbekannten. KW - Staphylococcus aureus KW - Eap KW - Newman strain sae KW - virulence KW - Cellular invasion Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149403 ER - TY - THES A1 - Koch, Miriam T1 - Role of Coagulation Factor XII in Atherosclerosis T1 - Rolle des Koagulationsfaktors XII in der Atherosklerose N2 - Atherosclerosis is considered a chronic inflammatory disease of the arterial vessel wall which is not only modulated by innate and adaptive immune responses but also by factors of the blood coagulation system. In general hypercoagulability seems to increase the development and progression of experimental atherosclerosis in mice on an atherogenic background. In addition, the great majority of coagulation proteins including coagulation factor XII (FXII) have been detected in early and advanced human atherosclerotic lesions supporting the cross-link between the coagulation system and atherosclerosis. Moreover, FXII has been detected in close proximity to macrophages, foam cells and smooth muscle cells in these lesions and has been demonstrated to be functionally active in human plaques. Although these data indicate that factor XII may play a role in atherogenesis a direct contribution of FXII to atherogenesis has not been addressed experimentally to date. Furthermore, clinical studies examining the function of FXII in vascular disease have yielded conflicting results. Hence, in order to investigate the function of coagulation factor XII in atherosclerosis apolipoprotein E and FXII-deficient (F12\(^{-/-}\) apoE\(^{-/-}\)) mice were employed. Compared to F12\(^{+/+}\)apoE\(^{-/-}\) controls, atherosclerotic lesion formation was reduced in F12\(^{-/-}\)apoE\(^{-/-}\) mice, associated with diminished systemic T-cell activation and Th1-cell polarization after 12 weeks of high fat diet. Moreover, a significant decrease in plasma levels of complement factor C5a was evidenced in F12\(^{-/-}\)apoE\(^{-/-}\) mice. Interestingly, C5a increased the production of interleukin-12 (IL-12) in dendritic cells (DCs) and enhanced their capacity to trigger antigen-specific interferon-gamma (IFNγ) production in OTII CD4\(^+\) T cells in vitro. Importantly, a reduction in frequencies of IL-12 expressing splenic DCs from atherosclerotic F12\(^{-/-}\)apoE\(^{-/-}\) versus F12\(^{+/+}\)apoE\(^{-/-}\) mice was observed in vivo, accompanied by a diminished splenic Il12 transcript expression and significantly reduced IL-12 serum levels. Consequently, these data reveal FXII to play an important role in atherosclerotic lesion formation and to promote DC-induced and systemic IL 12 expression as well as pro-inflammatory T-cell responses likely at least in part via the activation of the complement system. N2 - Die Arteriosklerose wird als eine chronisch entzündliche Erkrankung der arteriellen Gefäßwand angesehen, welche nicht nur durch Antworten des angeborenen und erworbenen Immunsystems, sondern auch durch Faktoren des Blutgerinnungssystems beeinflusst wird. Aus Tierstudien weiß man, dass Hyperkoagulabilität im Allgemeinen die Entwicklung und das Fortschreiten der Arteriosklerose in Mäusen mit atherogenem Hintergrund steigert. Ferner wurde die Mehrheit der Blutgerinnungsproteine inklusive des Koagulationsfaktors XII (FXII) in frühen und fortgeschrittenen arteriosklerotischen Läsionen in Menschen nachgewiesen, was eine mögliche Verbindung zwischen Koagulationssystem und Arteriosklerose untermauert. Darüber hinaus wurde der FXII in diesen Läsionen im unmittelbaren Umfeld von Makrophagen, Schaumzellen und glatten Muskelzellen nachgewiesen und dessen funktionelle Aktivität in humanen Plaques aufgezeigt. Obwohl diese Daten eine Funktion von FXII in der Arteriosklerose nahelegen, wurde eine direkte Beteiligung von FXII an der Atherogenese bislang experimentell noch nicht untersucht. Ferner erzielten klinische Studien, welche die Funktion von FXII in Gefäßerkrankungen untersuchten, widersprüchliche Resultate. Um die Funktion des Koagulationsfaktors XII in der Atherosklerose zu untersuchen, wurden daher Apolipoprotein E und FXII-defiziente (F12\(^{-/-}\)apoE\(^{-/-}\)) Mäuse eingesetzt. Die Ausbildung arteriosklerotischer Läsionen war in F12\(^{+/+}\)apoE\(^{-/-}\) Mäusen im Vergleich zu F12\(^{+/+}\)apoE\(^{-/-}\) Kontrollen reduziert. Dies ging mit einer verringerten systemischen T-Zell Aktivierung und Th1-Zell Polarisierung nach 12-wöchiger atherogener Diät einher. Ferner konnte eine signifikante Reduktion der C5a-Plasmaspiegel in F12\(^{-/-}\)apoE\(^{-/-}\) Mäusen nachgewiesen werden. Interessanterweise konnte C5a die Interleukin-12 (IL 12) Produktion in dendritischen Zellen (DCs) steigern, sowie deren Fähigkeit erhöhen, eine antigen-spezifische Interferon-gamma (IFNγ) Produktion in vitro, in OTII CD4\(^+\) T-Zellen zu induzieren. Insbesondere konnte in vivo eine Reduktion IL-12-exprimierender DCs in Milzen arteriosklerotischer F12\(^{-/-}\)apoE\(^{-/-}\) im Vergleich zu F12\(^{+/+}\)apoE\(^{-/-}\) Mäusen beobachtet werden, welche mit einer verminderten Expression an Il12 Transkripten in der Milz und signifikant reduzierten IL-12 Serumspiegeln einherging. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass FXII eine wichtige Rolle in der Bildung arteriosklerotischer Läsionen spielt und die DC-vermittelte und systemische IL-12 Expression, sowie pro-inflammatorische T-Zell Antworten, vermutlich teilweise über eine Aktivierung des Komplementsystems, fördert. KW - Gerinnungsfaktor XII KW - Arteriosklerose KW - coagulation factor XII KW - atherosclerosis KW - T cells KW - dendritic cells Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97850 ER - TY - THES A1 - Knobloch, Gunnar T1 - Biochemical and structural characterization of chronophin T1 - Die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Chronophin N2 - The haloacid dehalogenase (HAD) family of phosphatases is an ancient, ubiquitous group of enzymes, and their emerging role in human health and disease make them attractive targets for detailed analyses. This thesis comprises the biochemical and structural characterization of chronophin, an HAD-type phosphatase, which has been shown to act on Ser3-phosphorylated cofiln-1, a key regulator of actin dynamics, and on the Ser/Thr-phosphorylated steroid receptor co-activator 3 (SRC-3). Besides being a specific phosphoprotein phosphatase, chronophin also acts on the small molecule pyridoxal 5'-phosphate (PLP, vitamin B6), implying that chronophin serves as a regulator of a variety important physiological pathways. The analysis of chronophin was performed on different levels, ranging from intrinsic regulatory mechanisms, such as the allosteric regulation via dimerization or the characterization of specificity determinants, to modes of extrinsic modulation, including the association with putative interacting proteins or the generation of chronophin-specific inhibitors. The association of the previously identified putative chronophin interactors calcium- and integrinbinding protein 1 (CIB1) and calmodulin was investigated using recombinantly expressed and purified proteins. These studies revealed that the interaction of chronophin with CIB1 or calmodulin is mutually exclusive and regulated by calcium. Neither CIB1 nor calmodulin had an effect on the in vitro chronophin phosphatase activity towards PLP or phospho-cofilin-1, but might regulate other functions of this important phosphatase. The role of chronophin dimerization was studied by generating a constitutively monomeric variant, which showed reduced PLP hydrolyzing activity. X-ray crystallographic studies revealed that dimerization is essential for the positioning of the substrate specificity loop in chronophin, unraveling a previously unknown mechanism of allosteric regulation through a homophilic interaction. This mechanism potentially applies to other enzymes of the C2a subfamily of HAD-type phosphatases, as all structurally characterized members show a conserved mode of dimerization. The general determinants of substrate specificity in the C2a subfamily of HAD phosphatases were investigated by performing domain swapping experiments with chronophin and its paralog AUM and subsequent biochemical analyses of the hybrid proteins. The X-ray crystallographic structure determination of the chronophin catalytic domain equipped with the AUM capping domain revealed the first partial structure of AUM. This structural information was then used in subsequent studies that analyzed the divergent substrate specificities of AUM and chronophin in an evolutionary context. Finally, a set of four chronophin inhibitors were generated based on the structure of PLP and characterized biochemically, showing moderate inhibitory effects with IC50-values in the micromolar range. These compounds nevertheless constitute valuable tools for future in vitro experiments, such as studies concerning the structure-function relationship of chronophin as a PLP phosphatase. In addition, the crystal structure of one inhibitor bound to chronophin could be solved. These results provide the basis for the further development of competitive chronophin inhibitors with increased specificity and potency. N2 - HAD Phosphatasen gehören zu einer phylogenetisch alten Proteinfamilie, die in allen drei Domänen des Lebens vertreten ist. Enzyme dieser vergleichsweise wenig charakterisierten Familie von Phosphatasen erweisen sich zunehmend als biomedizinisch interessante Zielmoleküle, da immer mehr Krankheiten identifiziert werden, bei denen HAD Phosphatasen eine Rolle spielen. In der hier vorliegenden Doktorarbeit wurde die HAD Phosphatase Chronophin biochemisch und strukturell charakterisiert. Bisher konnte gezeigt werden, dass Chronophin die Proteine Cofilin-1, ein Schlüsselprotein in der Regulation des Aktin-Zytoskeletts, und den Steroidrezeptor Coaktivator 3 (SRC-3) dephosphoryliert. Darüberhinaus ist bekannt, dass Chronophin eine spezifische Pyridoxal 5'-Phosphat (PLP, Vitamin B6) Phosphatase ist, und somit an der Regulation verschiedenster Signalwege beteiligt ist. Die hier beschriebene Analyse von Chronophin beinhaltet die Untersuchung intrinsischer Regulationsmechanismen, wie z.B. Determinanten der Substratspezifität, die allosterische Regulation über Dimerisierung, bis hin zur Kontrolle durch extrinsische Faktoren wie interagierende Proteine oder Inhibitoren. Die Interaktion von Chronophin mit den kürzlich in unserer Arbeitsgruppe identifizierten Interaktionspartnern CIB1 (Kalzium- und Integrin-bindendes Protein 1) und Calmodulin wurde mit Hilfe rekombinant exprimierter und gereinigter Proteine untersucht. Dabei kam heraus, dass sich die Assoziation von CIB1 und Calmodulin an Chronophin gegenseitig ausschließt, und dass dieser Prozess durch Kalzium reguliert wird. Dabei beeinflusst weder die Bindung an CIB1 noch an Calmodulin die Phosphataseaktivität von Chronophin gegenüber den Substraten PLP oder phosphoryliertem Cofilin-1. Möglicherweise regulieren die beiden interagierenden Proteine die Funktion von Chronophin auf eine andere, hier nicht weiter untersuchte Art und Weise. Der Einfluss der Chronophin-Dimerisierung wurde untersucht, indem wir eine konstitutiv monomere Variante des üblicherweise dimeren Chronophins geschaffen haben. Diese monomere Variante des Enzyms wies eine deutlich reduzierte Aktivität gegenüber PLP auf. Durch röntgenkristallographische Analysen des wild-typischen Proteins und der monomeren Variante konnten wir zeigen, dass die Dimerisierung von Chronophin notwendig ist, um ein Strukturelement, welches wichtig für die Substratspezifität ist, in einer korrekten Position zu halten. Dieser allosterische Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Substratspezifität war bisher unbekannt, und trifft möglicherweise auf alle Proteine der C2a Unterfamilie von HAD Phosphatasen zu, die strukturell mit Chronophin verwandt sind. Die Faktoren, welche auf die Substratspezifität von Chronophin Einfluss nehmen wurden untersucht, indem einzelne Proteindomänen mit dem paralogen Protein AUM ausgetauscht, und die so geschaffenen Protein-Hybride biochemisch untersucht wurden. Durch das Lösen der röntgenkristallographischen Struktur eines Protein-Hybrids, bestehend aus der katalytischen Domäne von Chronophin und der capping-Domäne von AUM, konnte die die erste partielle Struktur von AUM untersucht werden. Mit Hilfe dieser strukturellen Information und durch bioinformatische Analysen konnten anschließend die unterschiedliche Substratspezifitäten der beiden paralogen Phosphatasen Chronophin und AUM in einem evolutionsbiologischen Kontext untersucht werden. Zusätzlich wurden vier mögliche Chronophin-Inhibitoren auf der Basis der PLP-Struktur synthetisiert. Die biochemische Analyse der Substanzen als Chronophin-Hemmer ergab moderate inhibitorische Eigenschaften mit IC50-Werten im micromolaren Bereich. Jedoch stellen die hier charakterisierten Inhibitoren nützliche Werkzeuge für die Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von Chronophin als PLP-Phosphatase dar. Die röntgenkristallographische Struktur von Chronophin mit einem der Inhibitoren liefert außerdem eine wichtge Grundlage für die zukünfitige Verbesserung der Inhibitoren bezüglich Effektivität und Spezifität. KW - Phosphatasen KW - Pyridoxalphosphat KW - Dimerisierung KW - Inhibitor KW - Chronophin KW - Pyridoxal 5'-phosphate phosphatase KW - Haloacid dehalogenase KW - HAD phosphatase KW - PLP phosphatase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110088 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Christin Marliese T1 - Approaching antimicrobial resistance – Structural and functional characterization of the fungal transcription factor Mrr1 from Candida albicans and the bacterial ß-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 from Mycobacterium tuberculosis T1 - Auf den Spuren der antimikrobiellen Resistenz – Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Transkriptionsfaktors Mrr1 aus Candida albicans und der bakteriellen β-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 aus Mykobakterium tuberculosis N2 - The number of fungal infections is rising in Germany and worldwide. These infections are mainly caused by the opportunistic fungal pathogen C. albicans, which especially harms immunocompromised people. With increasing numbers of fungal infections, more frequent and longer lasting treatments are necessary and lead to an increase of drug resistances, for example against the clinically applied therapeutic fluconazole. Drug resistance in C. albicans can be mediated by the Multidrug resistance pump 1 (Mdr1), a membrane transporter belonging to the major facilitator family. However, Mdr1-mediated fluconazole drug resistance is caused by the pump’s regulator, the transcription factor Mrr1 (Multidrug resistance regulator 1). It was shown that Mrr1 is hyperactive without stimulation or further activation in resistant strains which is due to so called gain of function mutations in the MRR1 gene. To understand the mechanism that lays behind this constitutive activity of Mrr1, the transcription factor should be structurally and functionally (in vitro) characterized which could provide a basis for successful drug development to target Mdr1-mediated drug resistance caused by Mrr1. Therefore, the entire 1108 amino acid protein was successfully expressed in Escherichia coli. However, further purification was compromised as the protein tended to form aggregates, unsuitable for crystallization trials or further characterization experiments. Expression trials in the eukaryote Pichia pastoris neither yielded full length nor truncated Mrr1 protein. In order to overcome the aggregation problem, a shortened variant, missing the N-terminal 249 amino acids named Mrr1 ‘250’, was successfully expressed in E. coli and could be purified without aggregation. Similar to the wild type Mrr1 ‘250’, selected gain of function variants were successfully cloned, expressed and purified with varying yields and with varying purity. The Mrr1 `250’ construct contains most of the described regulatory domains of Mrr1. It was used for crystallization and an initial comparative analysis between the wild type protein and the variants. The proposed dimeric form of the transcription factor, necessary for DNA binding, could be verified for both, the wild type and the mutant proteins. Secondary structure analysis by circular dichroism measurements revealed no significant differences in the overall fold of the wild type and variant proteins. In vitro, the gain of function variants seem to be less stable compared to the wild type protein, as they were more prone to degradation. Whether this observation holds true for the full length protein’s stability in vitro and in vivo remains to be determined. The crystallization experiments, performed with the Mrr1 ‘250’ constructs, led to few small needle shaped or cubic crystals, which did not diffract very well and were hardly reproducible. Therefore no structural information of the transcription factor could be gained so far. Infections with M. tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, are the leading cause of mortality among bacterial diseases. Especially long treatment times, an increasing number of resistant strains and the prevalence of for decades persisting bacteria create the necessity for new drugs against this disease. The cholesterol import and metabolism pathways were discovered as promising new targets and interestingly they seem to play an important role for the chronic stage of the tuberculosis infection and for persisting bacteria. In this thesis, the 3-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 from M. tuberculosis was characterized and the potential for specifically targeting this enzyme was investigated. FadA5 catalyzes the last step of the β-oxidation reaction in the side-chain degradation pathway of cholesterol. We solved the three dimensional structure of this enzyme by X-ray crystallography and obtained two different apo structures and three structures in complex with acetyl-CoA, CoA and a hydrolyzed steroid-CoA, which is the natural product of FadA5. Analysis of the FadA5 apo structures revealed a typical thiolase fold as it is common for biosynthetic and degradative enzymes of this class for one of the structures. The second apo structure showed deviations from the typical thiolase fold. All obtained structures show the enzyme as a dimer, which is consistent with the observed dimer formation in solution. Thus the dimer is likely to be the catalytically active form of the enzyme. Besides the characteristic structural fold, the catalytic triad, comprising two cysteines and one histidine, as well as the typical coenzyme A binding site of enzymes belonging to the thiolase class could be identified. The two obtained apo structures differed significantly from each other. One apo structure is in agreement with the characteristic thiolase fold and the well-known dimer interface could be identified in our structure. The same characteristics were observed in all complex structures. In contrast, the second apo structure followed the thiolase fold only partially. One subdomain, spanning 30 amino acids, was in a different orientation. This reorientation was caused by the formation of two disulfide bonds, including the active site cysteines, which rendered the enzyme inactive. The disulfide bonds together with the resulting domain swap still permitted dimer formation, yet with a significantly shifted dimer interface. The comparison of the apo structures together with the preliminary activity analysis performed by our collaborator suggest, that FadA5 can be inactivated by oxidation and reactivated by reduction. If this redox switch is of biological importance requires further evaluation, however, this would be the first reported example of a bacterial thiolase employing redox regulation. Our obtained complex structures represent different stages of the thiolase reaction cycle. In some complex structures, FadA5 was found to be acetylated at the catalytic cysteine and it was in complex with acetyl-CoA or CoA. These structures, together with the FadA5 structure in complex with a hydrolyzed steroid-CoA, revealed important insights into enzyme dynamics upon ligand binding and release. The steroid-bound structure is as yet a unique example of a thiolase enzyme interacting with a complex ligand. The characterized enzyme was used as platform for modeling studies and for comparison with human thiolases. These studies permitted initial conclusions regarding the specific targetability of FadA5 as a drug target against M. tuberculosis infection, taking the closely related human enzymes into account. Additional analyses led to the proposal of a specific lead compound based on the steroid and ligand interactions within the active site of FadA5. N2 - Die Zahl der Pilzinfektionen, welche hauptsächlich durch den opportunistisch-pathogenen Pilz C. albicans verursacht werden, ist nicht nur in Deutschland, sondern weltweit steigend. Die auftretenden Infektionen betreffen vor allem immunsupprimierte Personen. Dieser Anstieg an Pilzinfektionen verursacht häufigere und immer länger andauernde Behandlungen und resultiert auch im vermehrten Auftreten von Resistenzen gegen Antimykotika, unter anderem gegen das klinisch eingesetzte Fluconazol. Eine Möglichkeit der Resistenzbildung in C. albicans ist die Expression der ‚Multidrug resistance pump 1‘ (Mdr1), einer Membranpumpe, die zur Major-Facilitator-Superfamilie zählt. Diese durch Mdr1-vermittelte Fluconazolresistenz wird durch den Mdr1 regulierenden Transkriptionsfaktor Mrr1 (‚Multidrug resistance regulator 1‘) gesteuert. In resistenten C. albicans Stämmen befindet sich Mrr1 ohne weitere Stimulation oder externe Aktivierung bereits in einem hyperaktiven Zustand, der durch Mutationen mit Funktionsgewinn im MRR1 Gen verursacht wird. Um die Mechanismen, die sich hinter der konstitutiven Aktivität von Mrr1 verbergen, zu entschlüsseln, sollte dieser Transkriptionsfaktor in vitro strukturell und funktionell charakterisiert werden. Diese Charakterisierung könnte im Anschluss genutzt werden, um Wirkstoffe gegen die von Mrr1 gesteuerte und von Mdr1-vermittelte Resistenz zu entwickeln. Zu diesem Zweck, wurde das gesamte, 1108 Aminosäuren umfassende, Protein in Escherichia coli exprimiert. Die anschließende Proteinreinigung war allerdings durch Aggregatbildung beeinträchtigt, welche Kristallisationsansätze oder eine weitere Charakterisierung dieses Proteinkonstruktes verhinderten. Im Eukaryot Pichia pastoris durchgeführte Expressionsanalysen, waren leider erfolglos und weder die Expression des Volllängen-Mrr1 noch seiner verkürzten Proteinvarianten konnte nachgewiesen werden. Um Proteinaggregation zu umgehen, wurde deshalb ein N-terminal, um 249 Aminosäuren, verkürztes Proteinkonstrukt, Mrr1 ‚250‘, in E. coli exprimiert und erfolgreich, ohne Aggregation, gereinigt. Zusätzlich zum wildtypischen Mrr1 ‚250‘ Protein wurden auch ausgewählte Varianten kloniert, exprimiert und gereinigt, allerdings mit unterschiedlicher Ausbeute und Reinheit. Da das verkürzte Mrr1 ‚250‘ Protein noch immer fast alle in der Literatur beschriebenen Regulierungsdomänen besitzt, wurde es zur Kristallisation und für einen initialen Vergleich zwischen Wildtyp und Varianten genutzt. So konnte zum Beispiel die vermutete Dimerisierung des Transkriptionsfaktors sowohl für das Wildtypprotein als auch für die Varianten gezeigt werden. Eine weiterführende Untersuchung der Sekundärstruktur mittels zirkular Dichroismus Messungen zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Mutanten und dem Wildtypprotein. Allerdings erscheinen die Funktionsgewinn Varianten von Mrr1 in vitro instabiler als das Wildtypprotein, was sich durch stärkeren Abbau der Variantenproteine zeigt. Ob diese Beobachtungen allerdings vom verkürzten Protein auf das Gesamtprotein und dessen in vitro und in vivo Stabilität übertragbar sind, ist derzeit noch unklar. Kristallisationsansätze, die mit den verschiedenen Varianten des Mrr1 ‚250‘ Konstrukts durchgeführt wurden, führten zu sehr wenigen, nadelförmigen oder kubischen Kristallen, die kaum reproduzierbar waren und schlecht diffraktierten. Bisher konnten deshalb keine strukturellen Daten für den untersuchten Transkriptionsfaktor erhalten werden. Noch immer sind Infektionen, die durch M. tuberculosis, dem Erreger der Tuberkulose, verursacht werden die Haupttodesursache im Bereich der bakteriellen Infektionen. In diesem Zusammenhang stellen vor allem lange Behandlungszeiten, das vermehrte Auftreten resistenter Stämme und das Vorkommen persistierender Bakterien, die Jahrzehnte in ihrem Wirt überdauern können, nach wie vor große Herausforderungen dar und die Entwicklung neuer Tuberkulosemedikamente ist dringend erforderlich. Sowohl der Cholesterinimport als auch dessen Stoffwechselweg wurden als vielversprechende Wirkstoffziele identifiziert. Nicht zuletzt, da beide Mechanismen eine wichtige Rolle während der chronischen Phase der Tuberkuloseinfektion und für persistierende Bakterien zu spielen scheinen. Im Laufe dieser Arbeit wurde die 3-ketoacyl-CoA Thiolase FadA5 aus M. tuberculosis strukturell charakterisiert und auf ihre Tauglichkeit als spezifisches Wirkstoffziel hin untersucht. FadA5 katalysiert den letzten Schritt der β-Oxidation im Zuge des Seitenkettenabbaus von Cholesterin. Wir konnten die Proteinstruktur des FadA5 Proteins mittels Röntgenkristallographie ermitteln und erhielten zwei unterschiedliche apo-Strukturen sowie drei Komplexstrukturen. In den Komplexstrukturen waren entweder Acetyl-CoA, CoA oder ein hydrolisiertes Steroid-CoA, welches das natürliche Produkt von FadA5 darstellt, an das Enzym gebunden. Die Strukturanalyse der apo-Strukturen lies für eine der beiden Modelle die typische Thiolasefaltung erkennen, welche für biosynthetische und degradative Enzyme dieser Klasse üblich ist. In der zweiten apo-Struktur konnte diese Faltung nur teilweise identifiziert werden. Das Protein liegt in allen erhaltenen Strukturen als Dimer vor, was auch in Lösung beobachtet werden konnte und darauf hinweist, dass das Dimer die katalytisch aktive Form des Proteins darstellt. Neben der charakteristischen Faltung, wurde das aktive Zentrum, bestehend aus zwei Cysteinen und einem Histidin, sowie die für Thiolasen übliche Coenzym A Bindetasche identifiziert. Die erhaltenen apo-Strukturen unterschieden sich deutlich voneinander. Die zuvor beschriebene typische Dimer-Interaktionsfläche wird auch in den Komplexstrukturen beobachtet. Dahingegen war die Thiolasefaltung in der zweiten Apo-Struktur nur teilweise vorhanden, da beispielsweise eine Domäne, die 30 Aminosäuren umfasst, umorientiert vorlag. Die Bildung zweier Disulfidbrücken, welche beide katalytischen Cysteine involviert, verursachte die beschriebene Umorientierung und damit gepaart eine wahrscheinliche Inaktivität des Enzyms. Trotz der beschriebenen Umorientierung und Disulfidbrückenbildung liegt das Protein noch immer als Dimer vor, allerdings mit einer deutlich verschobenen Interaktionsfläche. Der Vergleich der beiden apo-Strukturen in Kombination mit einer vorläufigen Aktivitätsanalyse, die von unseren Kollaborationspartnern durchgeführt wurde, lassen vermuten, dass FadA5 durch Oxidation inaktiviert und durch Reduktion reaktiviert werden kann. Ob diese Redoxregulierung biologisch relevant ist, muss noch geklärt werden, allerdings wäre dies der erste beschriebene Fall einer redoxregulierten bakteriellen Thiolase. Die Komplexstrukturen stellen verschiedene Stufen der Thiolasereaktion dar. In einigen dieser Strukturen lag FadA5 am katalytischen Cystein acetyliert vor und befand sich im Komplex mit acetyl-CoA oder CoA. Durch eine weitere Struktur, in der FadA5 im Komplex mit einem hydrolisierten Steroid-CoA vorlag, konnten wichtige Einblicke in die Enzymdynamik während der Ligandenbindung und Freisetzung gewonnen werden. Die Steroid gebundene Struktur stellt derzeit ein einzigartiges Beispiel einer Thiolase im Komplex mit einem großen, mehrere Ringsysteme umfassenden Liganden dar. Das charakterisierte Enzym diente als Ausgangspunkt für Modellierungsversuche und Vergleiche mit humanen Thiolasen. Diese Analysen erlaubten initiale Schlussfolgerungen bezüglich einer Verwendung von FadA5 als spezifisches Wirkstoffziel gegen Tuberkuloseinfektionen, im Kontext verwandter humaner Enzyme. Zusätzliche Untersuchungen ermöglichten die Ausarbeitung einer spezifischen Leitsubstanz, die auf den analysierten Interaktionen zwischen dem aktiven Zentrum von FadA5 und den gebundenen Liganden basiert. KW - Multidrug-Resistenz KW - Candida albicans KW - Tuberkulose KW - Röntgenkristallographie KW - Cholesterinstoffwechsel KW - Structural Biology KW - Transcription factor KW - Thiolase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108400 ER - TY - THES A1 - Bartlang, Manuela Slavica T1 - Timing is everything: The interaction of psychosocial stress and the circadian clock in male C57BL/6 mice T1 - Auf das richtige Timing kommt es an: Die Interaktion zwischen psychosozialem Stress und der inneren Uhr in männlichen C57BL/6 Mäusen N2 - Due to the rotation of the earth in the solar system all inhabitants of our planet are exposed to regular environmental changes since more than 3.5 billion years. In order to anticipate these predictable changes in the environment, evolutionarily conserved biological rhythms have evolved in most organisms – ranging from ancient cyanobacteria up to human beings – and also at different levels of organization – from single cells up to behavior. These rhythms are endogenously generated by so called circadian clocks in our body and entrained to the 24 h cycle by external timing cues. In multi-cellular organisms the majority of the cells in the body is equipped with such an oscillator. In mammals, the circadian system is structured in a hierarchical fashion: A central pacemaker resides in the bilateral suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus, while subsidiary peripheral clocks exist in nearly every tissue and organ. In contrast to the aforementioned recurrent environmental changes most organisms are also exposed to unpredictable changes in the environment. In order to adapt to these sudden alterations the acute activation of the stress response system, involving the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and the sympathetic nervous system, displays a fundamental survival mechanism. However, if activation of the stress system becomes chronic, devastating somatic and affective disorders might be the consequence. At first glance, the circadian and the stress system seem to represent two separate bodily control systems that are involved in adaptation to predictable and unpredictable stimuli, respectively. However, both systems are fundamental for survival, and thus, communicate with each other at various levels. Early studies already demonstrated that stressor exposure at different times of the diurnal cycle generates different stress effects, whereupon the type of stressor plays a pivotal role. Moreover, alterations in the SCN and peripheral circadian clocks could be shown following stressor exposure. In cooperation with various co-workers, I investigated whether the stress responsiveness is modulated by the endogenous clock in a diurnal fashion and whether repeated psychosocial stress impacts the circadian clock depending on the time of day of stressor exposure. Therefore, male C57BL/6 mice were repeatedly exposed to a psychosocial stressor, either at the beginning of the inactive/light phase (SDL mice) or active/dark phase (SDD mice). Subsequently, different behavioral, physiological/endocrine and immunological/ inflammatory consequences were assessed. It could be shown that the effects of repeated psychosocial stressor exposure strongly depend on the time of day of stressor exposure. The present results demonstrate that repeated daily stressor exposure has a more negative outcome when applied during the active/dark phase compared to the inactive/light phase. Stressor exposure during the active phase resulted in a loss of general activity, decreased interest in an unfamiliar conspecific, a shift towards a more pro-inflammatory body milieu, and rhythm disturbances in plasma hormones, all representing well-accepted hallmarks of depression. In contrast, C57BL/6 mice exposed to the stressor in their inactive phase exhibited minor physiological alterations that might prevent the formation of the maladaptive consequences mentioned above, thus representing beneficial adaptations. The second focus of this thesis was put on the investigation of the effects of repeated psychosocial stressor exposure at different times of the light-dark cycle on various levels of the circadian system. An increased expression of the PERIOD2 (PER2) protein, which represents an essential core clock component, could be found in the SCN of mice repeatedly exposed to the stressor during their active phase. In consistence with the alterations in the central circadian pacemaker, the daily rhythm of different hormones and the activity rhythm were considerably affected by SDD. Mice exposed to the psychosocial stressor in their active phase showed a shifted, or absent, rhythm of the hormones corticosterone and leptin. Moreover, their activity was found to be phase-delayed, which seems to be attributable to the Period (Per) gene since Per1/Per2 double-mutants still exhibited their normal activity rhythm following 19 days of stressor exposure during the active phase. In contrast, a phase-advance in the peripheral adrenal gland clock could be seen in C57BL/6 mice subjected to the stressor during their inactive phase. This phase-shift might be required for maintaining the normal rhythmicity in hormonal release and activity. It has previously been suggested that activation of the HPA axis upon stressor exposure at different times of the light-dark cycle is depending on whether the stressor is of physical or psychological nature. Data from the HPA axis analysis now refine previous findings, indicating that psychosocial stressors also modulate HPA axis responses based on the time of day of stressor presentation. The present results demonstrate that HPA axis activity was reduced following repeated stressor exposure during the active phase. It is reasonable to speculate that this reduced basal activity of the stress system represents a failure in HPA axis adjustment, which could contribute to the negative consequences of repeated psychosocial stressor exposure during the dark phase. Taken together, it can be concluded that the endogenous clock in mice modulates the stress responsiveness in a circadian fashion and that repeated psychosocial stressor exposure affects the biological clock depending on the time of day of stressor presentation. Thereby, stressor exposure during the active phase results in a more negative outcome as compared to stressor experience during the inactive phase. It is assumed that the interaction between the circadian clock and the stress system is a complex issue that might ensure that the endogenous clock does not get out of synchrony in any order. N2 - Aufgrund der Bewegung der Erde in unserem Sonnensystem sind alle Lebewesen auf unserem Planeten seit mehr als 3,5 Milliarden Jahren tagesperiodischen Veränderungen der Umweltbedingungen ausgesetzt. In Anpassung an diese zeitlichen Abläufe haben sich im Laufe der Evolution bei fast allen Organismen – vom Bakterium bis hin zum Menschen – und auf verschiedenen Ebenen – von der Zellebene bis zum Verhalten – biologische Rhythmen entwickelt, die von endogenen Uhren im Körper und äußeren Zeitgebern gesteuert werden. Bei vielzelligen Organismen besitzen nahezu alle Zelltypen ihren eigenen Oszillator. In Säugetieren ist das zirkadiane System hierarchisch strukturiert. Der zentrale Schrittmacher der inneren Uhr befindet sich im bilateralen suprachiasmatischen Nukleus (SCN) des Hypothalamus, während untergeordnete periphere Taktgeber in beinahe jedem Gewebe und Organ oszillieren. Im Gegensatz zu den oben erwähnten regelmäßig wiederkehrenden Veränderungen der Umweltbedingungen sind die meisten Lebewesen ebenso unvorhersehbaren und raschen Umweltveränderungen ausgesetzt. In Anpassung an derartig plötzlich wechselnde Reizbedingungen ist die kurzfristige Aktivierung des Stress-Systems, bestehend aus der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA axis) und dem sympathischen Nervensystem, für eine adaptive Reaktion essentiell und sogar lebensnotwendig. Im Gegensatz dazu zählt eine andauernde/chronische Aktivierung des Stress-Systems zu den Risikofaktoren für eine Reihe von somatischen und affektiven Erkrankungen. Obwohl das zirkadiane System und das Stress-System auf den ersten Blick zwei verschiedene körperliche Anpassungssysteme darstellen, kommt es auf mehreren Ebenen zum wechselseitigen Einfluss. Es wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt, dass eine Stressorexposition zu unterschiedlichen Tageszeiten verschiedene Effekte hervorruft, wobei die Natur des Stressors dabei eine entscheidende Rolle spielt. Des Weiteren konnten Veränderungen im SCN und peripheren zirkadianen Uhren als Folge einer Stressorexposition aufgezeigt werden. In Zusammenarbeit mit verschiedenen Kollegen wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit untersucht, ob die endogene Uhr die Stressempfindlichkeit tageszeitabhängig moduliert und ob wiederholter psychosozialer Stress die innere Uhr in Abhängigkeit von der Tageszeit der Stressorexposition beeinflusst. Männliche C57BL/6 Mäuse wurden daher entweder zu Beginn der inaktiven/Licht-Phase (SDL Mäuse) oder der aktiven/Dunkel-Phase (SDD Mäuse) wiederholt einem psycho-sozialem Stressor ausgesetzt. Im Anschluss wurden verschiedene Verhaltensweisen sowie physio¬logische/endo-krine und immunologische/inflammatorische Konsequenzen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Effekte wiederholter Stressorexposition auf das Verhalten, die Physiologie und die Immunologie deutlich von der Tageszeit der Stressorexposition abhängt. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass wiederholte Stressor¬exposition während der aktiven/Dunkel-Phase negativere Konsequenzen nach sich zieht als die Stressorexposition während der inaktiven/Licht-Phase. Wurden C57BL/6 Mäuse dem psychosozialen Stressor während ihrer aktiven Phase ausgesetzt, führte dies zu typischen Symptomen von depressiven Patienten wie z.B. einer Verringerung der Aktivität und des sozialen Erkundungsverhaltens, Entzündungserscheinungen, sowie Veränderungen in hormonalen Rhythmen im Plasma. Im Gegensatz dazu wiesen C57BL/6 Mäuse, die dem Stressor in ihrer inaktiven Phase begegneten, geringfügige physiologische Veränderungen auf, welche die Entstehung der oben genannten negativen Konsequenzen verhindern und somit positive Adaptationen darstellen könnten. Des Weiteren wurden in dieser Arbeit die Effekte wiederholter Stressorexposition zu unterschiedlichen Tageszeiten auf verschiedene Ebenen des zirkadianen Systems untersucht. Es konnte eine erhöhte Expression des PERIOD2 (PER2) Proteins, das einen essentiellen Bestandteil des zirkadianen Uhrenmechanismus darstellt, im SCN nach wiederholter Stressorexposition während der aktiven Phase festgestellt werden. Die Veränderung im zentralen Schrittmacher spiegelte sich auch in der Tagesrhythmik verschiedener Hormone sowie im rhythmischen Verhalten der Tiere wider. SDD Mäuse zeigten dabei einen verschobenen oder fehlenden Rhythmus in den Hormonen Corticosteron und Leptin. Des Weiteren war die Aktivität nach 19-tägiger Stressorexposition zu Beginn der aktiven Phase deutlich nach hinten verschoben. Dabei kommt dem Period (Per) Gen eine zentrale Bedeutung zu, da SDD Per1/Per2 Doppelmutanten keinen veränderten Aktivitätsrhythmus aufwiesen. Eine verfrühte Phasenlage der peripheren Uhr in der Nebenniere zeigte sich hingegen in C57BL/6 Mäusen, die dem Stressor während ihrer inaktiven Tageszeit ausgesetzt wurden. Diese Phasenverschiebung nach vorne könnte für die Aufrechterhaltung der Rhythmik im Verhalten und in der Hormonausschüttung eine Rolle spielen. Vorangehende Arbeiten wiesen bereits darauf hin, dass die HPA-Achsen-Aktivierung infolge einer Stressorexposition zu unterschiedlichen Tageszeiten davon abhängt, ob der Stressor von physischer oder psychologischer Natur ist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erweitern die bestehenden Erkenntnisse insofern, als dass die HPA-Achsen-Antwort auch von psychosozialen Stressoren tageszeitabhängig beeinflusst wird. Die HPA-Achsen-Analyse dieser Arbeit zeigte eine verringerte Aktivität der Stressachse nach wiederholter Stressorexposition zu Beginn der aktiven Phase. Mit großer Wahrscheinlichkeit stellt diese Verringerung der basalen HPA-Achsen-Aktivität eine dysfunktionale Überadjustierung dar, die zu den negativen Konsequenzen in Folge der Stressorexposition während der aktiven Phase beitragen könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die endogene Uhr in Mäusen die Stressempfindlichkeit tageszeitabhängig moduliert und dass wiederholter psychosozialer Stress die innere Uhr in Abhängigkeit von der Tageszeit der Stressorexposition beeinflusst. Dabei zieht die Stressorexposition während der aktiven Phase weitaus negativere Konsequenzen nach sich als die Stressor¬exposition in der inaktiven Phase. Aus den Daten kann geschlossen werden, dass die Wechselwirkung von der inneren Uhr und dem Stress-System einen komplexen Sachverhalt darstellt, der gewährleisten soll, dass die innere Uhr nicht beliebig aus dem Takt geraten kann. KW - Maus KW - Stressreaktion KW - Chronobiologie KW - psychosocial stress KW - clock genes KW - interaction stress and circadian system KW - Period2 KW - Tagesrhythmus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106486 ER - TY - THES A1 - Seifried, Annegrit T1 - Mechanistic insights into specificity determinants and catalytic properties of the haloacid dehalogenase-type phosphatase AUM T1 - Aufklärung von Determinanten der Spezifität und der katalytischen Eigenschaften der Haloazid Dehalogenase-Typ Phosphatase AUM N2 - Mammalian haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatases are an emerging family of enzymes with important functions in physiology and disease. HAD phosphatases can target diverse metabolites, lipids, DNA, and serine/threonine or tyrosine phosphorylated proteins with often high specificity (Seifried et al., 2013). These enzymes thus markedly enlarge the repertoire and substrate spectrum of mammalian phosphatases. However, the basis of HAD phosphatase substrate specificity is still elusive and a number of mammalian HAD phosphatases remain uncharacterized to date. This study characterizes the biochemical and structural properties of AUM (aspartate-based, ubiquitous, Mg2+-dependent phosphatase), a previously unexplored mammalian HAD phosphatase. In vitro phosphatase assays of purified, recombinant AUM showed phosphatase activity towards para-nitrophenyl phosphate and adenine and guanine nucleotide di- and triphosphates. Inhibitor studies indicated that similar to other HAD superfamily members, the AUM-catalyzed dephosphorylation reaction proceeds via a pentacovalent phosphoaspartate intermediate. In line with an aspartate-based catalytic mechanism, AUM was insensitive to inhibitors of serine/threonine phosphatases. The characterization of the purified recombinant murine enzyme also revealed that AUM exists in equilibrium between dimers and tetramers. AUM was identified as the closest, yet functionally distinct relative of chronophin, a pyridoxal 5’-phosphate and serine/threonine-directed phosphatase. Phylogenetic analyses showed that AUM and chronophin evolved via duplication of an ancestral gene at the origin of the vertebrates. In contrast to chronophin, AUM acts as a tyrosine-specific HAD-type phosphatase in vitro and in cells. To elucidate how AUM and chronophin achieve these distinct substrate preferences, comparative evolutionary analyses, biochemical approaches and structural analyses were combined. Swapping experiments of less homologous regions between AUM and chronophin were performed. The mutational analysis revealed residues important for AUM catalysis and specificity. A single differently conserved residue in the cap domain of AUM or chronophin is crucial for phosphatase specificity (AUML204, chronophinH182). The X-ray crystal structure of the AUM cap fused to the catalytic core of chronophin (CAC, PDB: 4BKM) was solved to 2.65 Å resolution. It presents the first crystal structure of the murine AUM capping domain. The detailed view of the catalytic clefts of AUM and chronophin reveals the structural basis of the divergent substrate specificities. These presented findings provide insights into the design principles of capped HAD phosphatases and show that their substrate specificity can be encoded by a small number of predictable residues. In addition, the catalytic properties of AUM were investigated, identifying a mechanism of reversible oxidation regulating the activity of AUM in vitro. AUM phosphatase activity is inhibited by oxidation and can be recovered by reduction. The underlying molecular mechanism was revealed by mutational analyses. The cysteines C35, C104 and C243, located in the AUM core domain, are responsible for the inhibition of AUM by oxidation. C293 mediates the redox-dependent tetramerization of AUM in vitro. Based on the chronophin and CAC structure, a direct impact of the oxidation of C35 on the nucleophile D34 is proposed. In addition, a redox-dependent disulfide bridge (C104, C243), connecting the core and cap domain of AUM may be important for an open/close-mechanism. This hypothesis is supported by CD spectroscopy experiments that demonstrate a structural change in AUM upon reduction. These data present the first evidence for the regulation of AUM catalysis by reversible oxidation. This finding is so far unique in the field of HAD phosphatases. In this context, the first cell-based AUM activity assay was developed. For this, the artificial substrate pNPP was combined with the reducing agent DTT to create a specific AUM activity readout. This fractionation-based assay is the first tool to differentiate between cell lines or tissues with different AUM concentrations or activities. Taken together, the presented biochemical characterization reveals the specificity determinants and catalytic properties of AUM. General insights into structural determinants of mammalian HAD phosphatase substrate recognition are provided and reversible oxidation as possible regulatory mechanism for AUM is proposed. These findings constitute a framework for further functional analyses to elucidate the biomedical importance of AUM. N2 - Enzyme der Klasse der Haloazid Dehalogenase (HAD)-Typ Phosphatasen in Säugern sind an einer Vielzahl biologischer Prozesse mit unmittelbarer Relevanz für Erkrankungen beteiligt. Ihre Funktionen sind jedoch nach wie vor nur rudimentär verstanden. Es ist bekannt, das HAD Phosphatasen, unterschiedliche Metabolite, Lipide und DNA, sowie an Serin/Threonin- oder Tyrosinresten phosphorylierte Proteine spezifisch dephosphorylieren (Seifried et al., 2013). Der Mechanismus dieser Substratspezifität ist bislang weitgehend unerforscht und einige HAD Phosphatasen in Säugern sind nach wie vor nicht charakterisiert. Diese Arbeit beschreibt die biochemischen und strukturellen Eigenschaften von AUM (Aspartat-basierte, ubiquitäre, Mg2+-abhängige Phosphatase), eine der bisher uncharakterisierten HAD Phosphatasen. In vitro Phosphatase-Assays mit gereinigtem, rekombinantem AUM zeigten, dass AUM kleinmolekulare Substrate wie z. B das artifizielle Substrat para-Nitrophenylphosphat und Adenin- und Guaninnukleotid Di- und Triphosphate dephosphorylieren kann. Inhibitorstudien bestätigten den Asparat-basierten Mechanismus der Katalyse für AUM. Des Weiteren zeigte die Charakterisierung des gereinigten rekombinanten murinen Enzyms, dass AUM in Lösung in einem dynamischen Verhältnis von Dimeren und Tetrameren vorliegt. AUM wurde als nächster Verwandter der Pyridoxal 5`-Phosphat und Serin/Threonin-gerichteten Phosphatase Chronophin identifiziert. Phylogenetische Analysen zeigten, dass AUM und Chronophin durch Duplikation eines gemeinsamen Vorläufergens zu Beginn der Vertebraten-Evolution entstanden sind. Beide Enzyme sind jedoch funktionell unterschiedlich; im Unterschied zu Chronophin zeigt AUM in Zellen und in vitro eine Tyrosin-gerichtete Phosphatase-Aktivität. Um die Basis der unterschiedlichen Substratpräferenz von AUM und Chronophin aufzuklären, wurden in der vorliegenden Arbeit evolutionsbiologische Analysen, biochemische Versuche und Strukturanalysen kombiniert. Durch den Austausch von Regionen geringer Homologie in AUM und Chronophin und die Bestimmung der Substratpräferenz der so generierten Mutanten wurden Reste identifiziert die für die Katalyse und Spezifität von AUM ausschlaggebend sind. So ist ein unterschiedlich konservierter Rest in der Cap-Domäne von AUM oder Chronophin (AUML204, ChronophinH182) entscheidend für die Spezifität der Phosphatasen. Die Struktur des CAC-Fusionsproteins (Cap-Domäne von AUM fusioniert mit der Core-Domäne von Chronophin) wurde röntgenstrukturanalytisch charakterisiert. Die gelöste CAC Struktur (2.65 Å, PDB: 4BKM) stellt die erste Struktur einer murinen AUM Cap-Domäne dar. Die Detailansicht der katalytischen Zentren von AUM und Chronophin zeigt den molekularen Aufbau der Substratspezifität der beiden Phosphatasen. Diese Daten geben Einblicke in den prinzipiellen Aufbau von HAD Phosphatasen mit Cap-Domäne und belegen, dass die Substratspezifität durch eine kleine Anzahl an vorhersagbaren Resten definiert werden kann. Zusätzlich wurden die katalytischen Eigenschaften von AUM untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die AUM-Aktivität in vitro durch reversible Oxidation reguliert wird. Die Phosphataseaktivität wird durch Oxidation inhibiert und kann durch Reduktion wiederhergestellt bzw. gesteigert werden. Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus wurde mittels Mutationsanalysen aufgeklärt. Die Cysteine C35, C104 und C243 sind für die durch Oxidation ausgelöste Inhibition von AUM verantwortlich. Die identifizierten Reste sind an, für die Katalyse wichtigen Positionen, der AUM Core-Domäne lokalisiert. Abgeleitet aus der Chronophin und CAC Struktur hat die Oxidation von C35 möglicherweise Einfluss auf die Eigenschaften des Nukleophils D34 und trägt so zur Inhibition der Phosphatasefunktion von AUM bei. Zusätzlich könnte eine Disulfidbrücke (C104, C243), welche die AUM Cap- und Core-Domäne verknüpft; für einen Redox-abhängingen open/close-Mechanismus des Enzyms verantwortlich sein. Diese Hypothese wird durch CD-spektroskopische Analysen gestützt mit welchen eine strukturelle Veränderung von AUM unter reduzierenden Bedingungen nachgewiesen wurde. Eine Redox-vermittelte Modulation der AUM Struktur könnte so zur Inhibition beitragen. Diese Daten sind ein erster Hinweis auf eine mögliche Regulation von AUM durch reversible Oxidation. Bis jetzt ist diese Beobachtung für HAD Phosphatasen einzigartig. In diesem Zusammenhang wurde auch der erste zellbasierte AUM-Aktivitäts-Assay entwickelt. Durch die Kombination des artifiziellen Substrats pNPP und des Reduktionsmittels DTT konnte spezifisch AUM Phosphatase-Aktivität in diversen Zelllysaten gemessen werden. Dieser Assay, basierend auf der säulenchromatografischen Fraktionierung von Zell- oder Gewebelysaten, macht es nun möglich, Zelllinien oder Gewebe mit unterschiedlichen AUM Konzentrationen oder mit unterschiedlichen AUM-Aktivitäten zu differenzieren. Die Substratspezifität von Enzymen sowie die Modulation von zellulären Prozessen durch Oxidation sind wichtige Bestandteile der Signaltransduktion. Durch die vorliegende biochemische Charakterisierung konnten die Determinanten der Spezifität und der katalytischen Eigenschaften der HAD-Typ Phosphatase AUM aufgeklärt werden. Des Weiteren wurde die reversible Oxidation von AUM als möglicher Mechanismus zur Regulation der Enzymaktivität identifiziert. Die präsentierten Daten können als Grundlage für zukünftige Arbeiten zur Aufklärung einer biomedizinischen Relevanz der Phosphatase AUM dienen. KW - Proteintyrosinphosphatase KW - phosphatase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101009 ER - TY - THES A1 - Sander, Bodo T1 - Structural and biochemical characterization of gephyrin and various gephyrin-ligand complexes T1 - Strukturelle und biochemische Charakterisierung von Gephyrin und verschiedenen Gephyrin-Liganden-Komplexen N2 - Efficient synaptic neurotransmission requires the exact apposition of presynaptic terminals and matching neurotransmitter receptor clusters on the postsynaptic side. The receptors are embedded in the postsynaptic density, which also contains scaffolding and regulatory proteins that ensure high local receptor concentrations. At inhibitory synapses the cytosolic scaffolding protein gephyrin assumes an essential organizing role within the postsynaptic density by the formation of self-oligomers which provide a high density of binding sites for certain -amino butyric acid type A (GABAA) and the large majority of glycine receptors (GlyR). Gephyrin contains two oligomerization domains: In isolation, the 20 kDa N-terminal G domain (GephG) and the 46 kDa E domain (GephE) trimerize and dimerize, respectively. In the full-length protein the domains are interconnected by a central ~150 amino acid linker, and only GephG trimerization is utilized, whereas GephE dimerization is prevented, thus suggesting the need for a trigger to release GephE autoinhibition, which would pave the way for the formation of higher oligomers and for efficient receptor clustering. The structural basis for this GephE autoinhibition has remained elusive so far, but the linker was reported to be sufficient for autoinhibition. This work dealt with the biochemical and structural characterization of apo-gephyrin and gephyrin in complexes with ligands which are known to promote the formation of synaptic gephyrin clusters (collybistin and neuroligin 2) and reorganize them (dynein light chain 1). For full-length gephyrin no structural information has been available so far. Atomic force microscopy (AFM) and small-angle X-ray scattering (SAXS) analyses described in this thesis disclosed that the gephyrin trimer forms a highly flexible assembly, which, due to the long linker, can switch between compact and extended conformational states in solution, with a preference for compact states. This partial compaction and potentially GephE autoinhibition are achieved by interactions of parts of the linker with the G and E domains, as suggested by circular dichroism spectroscopy. However, the linker on its own cannot account for GephE blockage, as size exclusion chromatography experiments coupled with multi angle light scattering detection (SEC-MALS) and SAXS analyses revealed that a gephyrin variant only encompassing the linker and GephE (GephLE) forms dimers and not monomers as suggested by an earlier study. The oligomeric state of GephLE and the observation that several gephyrin variants, in which linker segments of varying length were deleted, predominantly formed trimers, suggested the presence of a linker independent mechanism of GephE dimerization blockade. Taken together, the data indicated that linker-dependent and linker-independent mechanisms mediate gephyrin autoinhibition. In the second project gephyrin’s interaction with DYNLL1 (Dynein LC8 Light Chain 1) was characterized. DYNLL1 is a 25 kDa dimer incorporated into the dynein motor and provides two binding sites, each of which can accommodate an octapeptide derived from gephyrin’s linker region (referred to as GephDB). Originally, DYNLL1 was regarded as a cargo adaptor, linking gephyrin-GlyR complexes to the dynein motor, thus driving their retrograde transport and leading to a decrease of synaptic gephyrin-GlyR complexes. Building on these studies, this thesis assessed the cargo hypothesis as well as the so far unclear stoichiometry of the gephyrin-DYNLL1 complex. The cargo scenario would require ternary complex formation between gephyrin, DYNLL1 and the dynein intermediate chain (DIC) of the dynein motor. However, such a complex could not be detected by analytical size exclusion chromatography (aSEC) experiments – presumably because gephyrin and DIC competed for a common binding site in DYNLL1. This finding was consistent with a single DYNLL1 dimer capturing two linker segments of a single gephyrin trimer as suggested by a 26 kDa mass increase of the gephyrin species in the presence of DYNLL1 in SEC-MALS experiments. aSEC experiments at even higher concentrations (~20 µM gephyrin and ~80 µM DYNLL1) indicated that the affinity of GephDB was significantly impaired in the context of full-length gephyrin but also in a variant that bears only GephG and the first 39 residues of the linker (GephGL220). Presumably due to avidity effects two linkers stably associated with a single DYNLL1 dimer, whereas the third DYNLL1 binding motif remained predominantly unoccupied unless high concentrations of GephGL220 (50 µM) and DYNLL1 (200 µM) were used. These findings indicate that an interplay between GephG and the N-terminal linker segment mediates the attenuation of GephDB affinity towards DYNLL1 and that preventing DYNLL1 from the induction of higher gephyrin oligomers is either advantageous for DYNLL1-mediated reorganization of gephyrin-GlyR clusters or that DYNLL1 exerts possibly two (concentration-dependent) actions on gephyrin. The gephyrin-collybistin-neuroligin 2 complex was the subject of the third project. Previously, collybistin and gephyrin were observed to mutually trigger their translocation to the postsynaptic membrane, where the disordered cytoplasmic tail of the postsynaptic cell adhesion molecule NL2 (NL2cyt) causes the anchoring of collybistin 2 (CB2) by binding to its SH3 domain, thereby releasing SH3 domain mediated autoinhibiton of CB2 binding to the membrane phospholipid phosphatidylinositol-3-phosphate. Critical for this event is the binding of gephyrin to both CB2 and NL2, presumably via GephE. Following up on these previous studies biochemical data presented in this thesis confirm the formation of the ternary complex. Unexpectedly, analyses by means of native polyacrylamide gel electrophoresis pointed to: (1) The existence of a complex containing NL2cyt and CB2 lacking the SH3 domain and consequently an additional NL2 binding site in CB2. (2) Attenuated gephyrin-collybistin complex formation in the presence of the SH3 domain. (3) A requirement for high NL2cyt concentrations (> 30 µM) during the formation of the ternary complex. This might allow for the regulation by other factors such as additional binding partners or posttranslational modifications. Although of preliminary character, these results provide a starting point for future studies, which will hopefully elucidate the interplay between gephyrin, collybistin, NL2 and certain GABAA receptors. N2 - Eine effiziente synaptische Neurotransmission macht es erforderlich, dass sich presynaptische Nervenenden und die Schar (engl. Cluster) der dazugehörigen Neurotransmitterrezeptoren auf der postsynaptischen Seite exakt gegenüberliegen. Die Rezeptoren sind in der postsynaptischen Dichte eingebettet, die auch Gerüstproteine und regulatorische Proteine enthält, die hohe lokale Rezeptor-Konzentrationen gewährleisten. An inhibitorischen Synapsen übernimmt das cytosolische Gerüstprotein Gephyrin eine essentielle Rolle in der postsynaptischen Dichte durch die Bildung von Homo-Oligomeren, die für eine hohe Dichte an Bindungsstellen für bestimmte -Aminobuttersäure Typ A- (GABAA)- und die große Mehrheit der Glyzin-Rezeptoren (GlyR) sorgen. Gephyrin enthält zwei Oligomerisierungsdomänen: In isolierter Form bildet die N-terminale 20 kDa große G-Domäne (GephG) und die C-terminale 46 kDa große E-Domäne (GephE) Trimere beziehungsweise Dimere. Im Volllängenprotein sind die Domänen durch einen zentrale ~150 Aminosäure lange Region (auch Linker genannt) verknüpft, und nur von der GephG-Trimerisiung wird Gebrauch gemacht, wohingegen die GephE-Dimerisierung unterbunden ist, was nahelegt, dass ein Auslöser benötigt wird, der die Autoinhibierung von GephE aufhebt und dadurch den Weg zur Bildung höherer Oligomere ebnet. Die strukturelle Basis für die GephE- Autoinhibierung ist bislang nicht bekannt, aber eine veröffentlichte Studie kam zu dem Schluss, dass der Linker ausreicht, um die GephE-Dimerisierung zu inhibieren. Diese Arbeit beinhaltet die biochemische und strukturelle Charakterisierung von apo-Gephyrin und Gephyrin in Komplexen mit Liganden, von denen bekannt ist, dass sie entweder die Bildung von synaptischen Gephyrin-Selbstoligomeren begünstigen (Collybistin und Neuroligin 2) oder die Gephyrin-Selbstoligomere reorganisieren (Dynein leichte Kette 1). Für Volllängen-Gephyrin gab es bislang keine strukturellen Informationen. Rasterkraftmikroskopie (engl. AFM)- und Röntgenkleinwinkelbeugungs (engl. SAXS)-Analysen, die in dieser Arbeit beschrieben sind, deckten auf, dass das Gephyrin-Trimer eine hoch flexible Einheit ist, die – durch den langen Linker – zwischen kompakten und extendierten Zuständen hin- und herwechselt, mit einer leichten Präferenz für kompakte Zustände. Spektroskopische Messungen des zirkulären Dichroismus legten nahe, dass die partielle Kompaktierung und möglicherweise auch die GephE-Autoinhibition durch Interaktionen von Teilen des Linkers mit den G- und E-Domänen erreicht werden. Aber der Linker alleine kann nicht für die GephE-Blockade verantwortlich zeichnen, weil Größenausschluss-Chromatographie-Experimente gekoppelt mit Multiwinkel-Lichtstreudetektion (englische Abkürzung SEC-MALS) offenlegten, dass eine Gephyrin-Variante, die nur den Linker und GephE umfasst (GephLE), Dimere und keine Monomere ausbildet, wie in einer früheren Studie postuliert wurde. Der oligomere Zustand von GephLE und die Beobachtung, dass alle Gephyrin-Varianten, in denen Linker-Segmente verschiedener Länge deletiert wurden, überwiegend Trimere bildeten, legen nahe, dass ein Linker-unabhängiger Mechanismus für die GephE-Dimerisierungsblockade existiert. Zusammengenommen deuten die Daten darauf hin, dass Linker-abhängige und -unabhängige Mechanismen die GephE-Autoinhibtion vermitteln. Im zweiten Projekt wurde die Interaktion von Gephyrin mit DYNLL1 (Dynein LC8 Light Chain 1) charakterisiert. DYNLL1 is ein 25 kDa-Dimer, das im Dynein-Motor integriert ist, und bietet zwei Bindestellen, die beide ein von der Gephyrin-Linker-Region abgeleitetes Oktapeptid (im Weiteren GephDB) aufnehmen können. Ursprünglich wurde DYNLL1 als ein Ladungsadapter betrachtet, der Gephyrin-GlyR-Komplexe mit dem Dynein-Motor verknüpft und dadurch ihren retrograden Transport vorantreibt und somit zu einer Abnahme synaptischer Gephyrin-GlyR-Komplexe führt. Auf diesen Studien aufbauend, wurde in dieser Arbeit die Ladungsadapter-Hypothese analysiert ebenso wie die bislang unklare Stöchiometrie des Gephyrin-DYNLL1-Komplexes. Das Ladungsadapter-Szenario würde einen ternären Komplex aus Gephyrin, DYNLL1 und der mittleren Dynein-Kette (englische Abkürzung DIC) voraussetzen. Ein solcher Komplex konnte mittels analytischer Größenausschlusschromatographie (englische Abkürzung aSEC) nicht detektiert werden – vermutlich, weil Gephyrin und DIC um eine gemeinsame Bindungsstelle in DYNLL1 konkurrierten. Dieser Befund war konsistent mit einem Modell, in dem ein einzelnes DYNLL1-Dimer zwei Linker eines (einzelnen) Gephyrin-Trimers bindet, wie es auch durch eine 26 kDa-Massen-Zunahme der Gephyrin-Spezies in der Anwesenheit von DYNLL1 in SEC-MALS-Experimenten nahegelegt wurde. aSEC-Experimente auch bei hohen Konzentrationen (~20 µM Gephyrin und ~80 µM DYNLL1) deuteten darauf hin, dass die Affinität von GephDB im Kontext von Volllängen-Gephyrin signifikant beeinträchtigt war, aber auch bei einer Gephyrin-Variante, die nur GephG und die ersten 39 Reste des Linkers entielt (GephGL220). Voraussichtlich aufgrund von Aviditätseffekten banden zwei Linker stabil an ein einzelnes DYNLL1-Dimer, wohingegen das dritte DYNLL1-Bindungsmotiv unbesetzt blieb, so lange nicht hohe Konzentrationen an GephGL220 (50 µM) und DYNLL1 (200 µM) eingesetzt wurden. Diese Ergebnisse deuteten an, dass ein Zusammenspiel von GephG und dem N-terminalen Linker-Segment die Abschwächung der GephDB-Affinität zu DYNLL1 vermittelt und dass die Verhinderung der Induktion höherer Oligomere durch DYNLL1 entweder vorteilhaft für die Reorganization von Gephyrin-GlyR-Clustern ist oder dass DYNLL1 zwei (konzentrationsabhängige) Wirkungen auf Gephyrin ausübt. Der Gephyrin-Collybistin-Neuroligin 2-Komplex war Gegenstand des dritten Projektes. Im Vorfeld dieser Arbeit wurde festgestellt, dass Collybistin und Gephyrin gegenseitig ihre Translokation zur postsynaptischen Membran einleiten, wo der ungeordnete, cytosolische Anteil des postsynaptischen Zelladhäsionsmembranmoleküls Neuroligin 2 (NL2cyt) die Verankerung von Collybistin 2 (CB2) durch das Binden an seine “src homology 3”-Domäne (SH3-Domäne) bewirkt und dadurch die SH3-Domänen-vermittelte Autoinhibition der CB2-Bindung an das Membran-Phospholipid Phosphatidylinositol-3-phosphat aufhebt. Entscheidend für dieses Ereignis ist, dass Gephyrin sowohl an CB als auch an NL2cyt bindet, vermutlich vermittelt durch GephE. In einer Fortsetzung dieser frühreren Studien bestätigen biochemische Daten in dieser Arbeit die Bildung des ternären Komplexes. Unerwarteterweise deuteten Analysen mittels nativer Polyacrylamidgelektrophorese auf: (1) Die Existenz eines Komplexes aus NL2cyt und CB2 ohne SH3-Domäne und damit auf eine zusätzliche NL2-Bindungsstelle in CB2. (2) Abgeschwächte Gephyrin-Collybistin-Komplexbildung in der Anwesenheit der SH3-Domäne. (3) Hohe NL2-Konzentrationen (>30 µM) als Voraussetzung für die Bildung des ternären Komplexes. Dies könnte die Regulation durch andere Faktoren wie zusätzliche Bindungspartner oder posttranslationale Modifikationen ermöglichen. Wenngleich die Ergebnisse von vorläufigem Charakter sind, stellen sie einen Startpunkt für künftige Arbeiten dar, welche hoffentlich das Zusammenspiel von Gephyrin, Collybistin, NL2 und bestimmten GABAA-Rezeptoren weiter aufklären werden. KW - Gephyrin KW - Dynein Light Chain KW - Neuroligin 2 KW - Collybistin KW - Small-angle X-ray Scattering KW - Structural Biology Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104212 ER - TY - THES A1 - Rohleder, Florian T1 - The Intricate Network of Replication-dependent Interstrand Crosslink DNA Repair T1 - Das komplexe Netzwerk der replikationsabhängigen Reparatur von DNA-Quervernetzungen N2 - The Fanconi anemia (FA) pathway is a replication-dependent DNA repair mechanism which is essential for the removal of interstrand crosslink (ICL) DNA damages in higher eukaryotes (Moldovan and D’Andrea, 2009). Malfunctions in this highly regulated repair network lead to genome instability (Deans and West, 2011). Pathological phenotypes of the disease FA which is caused by mutations in the eponymous pathway are very heterogeneous, involving congenital abnormalities, bone-marrow failure, cancer predisposition and infertility (Auerbach, 2009). The FA pathway comprises a complex interaction network and to date 16 FA complementation groups and associated factors have been identified (Kottemann and Smogorzewska, 2013). Additionally, components of nucleotide excision repair (NER), homologous recombination repair (HRR), and translesion synthesis (TLS) are involved and coordinated by the FA proteins (Niedzwiedz et al., 2004; Knipscheer et al., 2009). One of the FA proteins is the DEAH helicase FANCM. In complex with its binding partners FAAP24 and MHF1/2 it binds the stalled replication fork and activates the FA damage response (Wang et al., 2013). However, the exact steps towards removal of the ICL damage still remain elusive. To decipher the underlying process of FA initiation by FANCM, this thesis mainly focuses on the archaeal FANCM homolog helicase-associated endonuclease for fork-structured DNA (Hef). Hef from the archaeal organism Thermoplasma acidophilum (taHef) differs from other archaeal Hef proteins and exclusively comprises an N-terminal helicase entity with two RecA and a thumb-like domain while others additionally contain a nuclease portion at the C-terminus. I solved the crystal structure of full-length taHef at a resolution of 2.43 Å. In contrast to the crystal structure of the helicase domain of Hef from Pyrococcus furiosus (pfHef), taHef exhibits an extremely open conformation (Nishino et al., 2005b) which implies that a domain movement of the RecA-like helicase motor domains of 61° is possible thus highlighting the flexibility of helicases which is required to translocate along the DNA. However, small-angle x-ray scattering (SAXS) measurements confirm an intermediate conformation of taHef in solution indicating that both crystal structures represent rather edge states. Most importantly, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was identified as an interaction partner of Hef. This interaction is mediated by a highly conserved canonical PCNA interacting peptide (PIP) motif. Intriguingly, the presence of PCNA does not alter the ATPase nor the helicase activity of taHef, thus suggesting that the interaction is entirely dedicated to recruit taHef to the replication fork to fulfill its function. Due to a high level of flexibility the taHef-taPCNA complex could not be crystallized and therefore SAXS was utilized to determine a low-resolution model of this quaternary structure. This newly discovered PCNA interaction could also be validated for the eukaryotic FANCM homolog Mph1 from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum (ctMph1). As the first step towards the characterization of this interaction I solved the crystal structure of PCNA from Chaetomium thermophilum (ctPCNA). Furthermore, it was possible to achieve preliminary results on the putative interaction between the human proteins FANCM and PCNA (hsFANCM, hsPCNA). In collaboration with Detlev Schindler (Human Genetics, Würzburg) and Weidong Wang (National Institute on Aging, Baltimore, USA) co-immunoprecipitation (CoIP) experiments were performed using hsFANCM and hsPCNA expressed in HEK293 cells. Although an interaction was reproducibly observed in hydroxyurea stimulated cells further experiments and optimization procedures are required and ongoing. N2 - Der Fanconi Anämie (FA) Signalweg ist ein replikationsabhängiger DNA-Reparaturmechanismus, der grundlegend zur Beseitigung von DNA-Schäden in Form von intermolekularen Quervernetzungen (ICL) beiträgt (Moldovan and D’Andrea, 2009). Fehlfunktionen in diesem stringent regulierten Reparaturnetzwerk führen somit zu Genominstabilität (Deans and West, 2011). Der pathologische Phänotyp der Krankheit FA, die durch Mutationen in dem gleichnamigen DNA-Reparatur Signalweg verursacht wird, ist sehr heterogen und umfasst angeborene Deformationen, Knochenmarksversagen, eine erhöhte Tumor Disposition sowie Infertilität (Auerbach, 2009). Der FA Mechanismus ist ein komplexes Netzwerk und bisher wurden 16 FA Komplementationsgruppen sowie weitere beteiligte Faktoren identifiziert (Kottemann and Smogorzewska, 2013). Zusätzlich sind Komponenten der Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER), der homologen Rekombinationsreparatur (HRR) und Transläsionssynthese (TLS) involviert, die durch FA Proteine koordiniert werden (Niedzwiedz et al., 2004; Knipscheer et al., 2009). Eines der FA Proteine ist die DEAH Helikase FANCM. Im Komplex mit seinen Interaktionspartnern FAAP24 und MHF1/2 bindet FANCM an die durch den ICL Schaden zum Stillstand gekommene Replikationsgabel und aktiviert die FA Schadensantwort (Wang et al., 2013). Die weiteren Schritte, die zur Entfernung des ICL Schadens führen, sind jedoch weitestgehend ungeklärt. Zur Aufklärung der Initiation des FA Mechanismus und der Rolle, die das FANCM dabei spielt, wurde in dieser Arbeit hauptsächlich das archaische FANCM Homolog Helicase-associated Endonuclease for Fork-structured DNA (Hef) analysiert. Hef aus dem archaischen Organismus Thermoplasma acidophilum (taHef) unterscheidet sich von anderen archaischen Hef Proteinen und besteht ausschließlich aus einem N-terminalen Helikase-Abschnitt mit zwei RecA und einer thumb-like Domäne, während andere Hef Proteine am C-Terminus zusätzlich eine Nuklease-Domäne besitzen. Ich habe die Kristallstruktur des taHef Proteins bei einer Auflösung von 2,43 Å gelöst. Im Gegensatz zur Kristallstruktur eines vergleichbaren Hef-Konstruktes aus Pyrococcus furiosus (pfHef) (Nishino et al., 2005b) liegt in taHef eine extrem offene Konformation der beiden RecA-Domänen vor, was impliziert, dass eine Bewegung der RecA-ähnlichen Helikase Motordomänen um 61° möglich ist und zudem die zur Translokation entlang der DNA notwendige Flexibilität von Helikasen verdeutlicht. Messungen mittels Kleinwinkelröntgenstreuung (SAXS) deuten hingegen auf eine intermediäre Konformation des taHef Proteins in Lösung hin, wodurch beide Kristallstrukturen als eher Randzustände angesehen werden können. Besonders hervorzuheben ist, dass das Protein Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) als Hef Interaktionspartner identifiziert wurde. Diese Interaktion wird durch ein hoch-konserviertes kanonisches PCNA Interaktionspeptid-Motiv vermittelt. Interessanterweise beeinflusst PCNA aber weder die ATPase noch die Helikase Aktivität von taHef, was darauf hindeutet, dass diese Interaktion nur zur Rekrutierung des Hef Proteins zur Replikationsgabel dient. Wegen des hohen Maßes an Flexibilität konnte der taHef-taPCNA Komplex nicht kristallisiert werden, wohingegen SAXS Messungen erfolgreich waren und ein Model bei niedriger Auflösung konnte erhalten werden. Diese nachgewiesene Interaktion zwischen Hef und PCNA konnte auch für das eukaryotische FANCM Homolog Mph1 aus dem thermophilen Pilz Chaetomium thermophilum (ctMph1) bestätigt werden. Als ersten Schritt zur Charakterisierung dieser Interaktion habe ich die Kristallstruktur von PCNA aus Chaetomium thermophilum (ctPCNA) gelöst. Weiterhin war es möglich, vorläufige Resultate bezüglich der mutmaßlichen Interaktion zwischen den humanen Proteinen FANCM und PCNA (hsFANCM, hsPCNA) zu erhalten. In Kooperation mit Detlev Schindler (Humangenetik, Würzburg) und Weidong Wang (National Institute on Aging, Baltimore, USA) wurden Co-Immunopräzipitations-Experimente (CoIP) mit humanem FANCM und humanem PCNA aus HEK293-Zellen durchgeführt. Obwohl eine Interaktion in Hydroxyurea-stimulierten Zellen reproduzierbar nachgewiesen werden konnte, sind weitere Experimente notwendig, um diese Interaktion zu charakterisieren. KW - DNS-Reparatur KW - DNA Repair KW - Fanconi Anemia KW - Structural Biology KW - Fanconi-Anämie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113121 ER - TY - THES A1 - Vögtle, Timo T1 - Studies on receptor signaling and regulation in platelets and T cells from genetically modified mice T1 - Studien zur Signaltransduktion und Regulierung von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen genetisch veränderter Mäuse N2 - Receptors with tyrosine-based signaling motifs control essential functions of hematopoietic cells, including lymphocytes and platelets. Downstream of the platelet receptor glycoprotein (GP) VI and the T cell receptor (TCR) the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) initiates a signaling cascade that involves kinases, adapter and effector proteins and finally leads to cellular activation. This thesis summarizes the results of three studies investigating different aspects of receptor signaling and regulation in platelets and T cells. In the first part, the impact of constitutive Ca2+ influx on TCR signaling and T cell physiology was investigated using a transgenic mouse line with a mutation in the Ca2+ sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1). The elevated cytoplasmic Ca2+ level resulted in an altered phosphorylation pattern of the key enzyme phospholipase (PL) Cγ1 in response to TCR stimulation, but without affecting its enzymatic activity. Withdrawal of extracellular Ca2+ or inhibition of the phosphatase calcineurin restored the normal phosphorylation pattern. In addition, there was a decrease in the release of Th2-type cytokines interleukin 4, 5 and 13 upon stimulation in vitro. The second part of the thesis deals with the role of the adapter protein growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in platelets using a megakaryocyte/platelet-specific knockout mouse line. Loss of Grb2 severely impaired signaling of GPVI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), a related hemITAM receptor. This was attributed to defective stabilization of the linker for activation of T cells (LAT) signalosome and resulted in reduced adhesion, aggregation, Ca2+ mobilization and procoagulant activity downstream of (hem)ITAM-coupled receptors in vitro. In contrast, the signaling pathways of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the integrin αIIbβ3, which do not utilize the LAT signalosome, were unaffected. In vivo, the defective (hem)ITAM signaling caused prolonged bleeding times, however, thrombus formation was only affected under conditions where GPCR signaling was impaired (upon acetylsalicylic acid treatment). These results establish Grb2 as an important adapter protein in the propagation of GPVI- and CLEC-2-induced signals. Finally, the proteolytic regulation of the immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)-bearing receptor CD84 in platelets was investigated. This study demonstrated that in mice CD84 is cleaved by two distinct and independent proteolytic mechanisms upon platelet activation: shedding of the extracellular part, which is exclusively mediated by a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 and cleavage of the intracellular C-terminus by the protease calpain. Finally, the analysis of soluble CD84 levels in the plasma of transgenic mice revealed that shedding of CD84 by ADAM10 occurs constitutively in vivo. N2 - Rezeptoren mit Tyrosin-basierten Signaltransduktionsmotiven sind von fundamentaler Bedeutung für die Funktion hematopoietischer Zellen wie Lymphozyten und Thrombozyten. Unterhalb des Glykoproteins (GP) VI auf Thrombozyten und des T-Zell Rezeptors (TZR) auf T-Zellen initiiert das immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) eine Signalkaskade, die Kinasen, Adapter- und Effektorproteine mit einbezieht und schlussendlich zur Aktivierung der Zelle führt. Die hier vorgelegte Arbeit fasst die Ergebnisse dreier Studien zusammen, die sich mit verschiedenen Aspekten der Signaltransduktion und Regulation von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen befasst. Im ersten Teil wurde der Einfluss eines konstitutiven Ca2+-Einstroms auf die TZR Signalkaskade und T-Zell Funktion untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einer Mutation im Ca2+-Sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) verwendet. Die erhöhte zytoplasmatische Ca2+-Konzentration veränderte das Phosphorylierungsmuster der Phospholipase (PL) Cγ1, ein Schlüsselenzym der Signalkaskade, nach Stimulation des TZRs. Die enzymatische Aktivität der PLCγ1 blieb hierbei jedoch unverändert. In der Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ oder bei Inhibition der Phosphatase Calcineurin war das Phosphorylierungsmuster hingegen wieder normal. Darüber hinaus zeigten die T Zellen nach Stimulation in vitro eine verringerte Produktion von Interleukinen des Th2-Typs (Interleukin-4, 5 und 13). Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Funktion des Adapterproteins growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in Thrombozyten, die unter Zuhilfenahme einer Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Knockout Mauslinie untersucht wurde. Hierbei zeigte es sich, dass der Verlust von Grb2 die Signaltransduktion von GPVI und des verwandten hemITAM-Rezeptors C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) schwer beeinträchtigt. Dies konnte auf eine mangelnde Stabilisierung des linker for activation of T cells (LAT) Signalosoms zurückgeführt werden und resultierte in einer verminderten Adhäsion, Aggregation, Ca2+-Mobilisierung und prokoagulatorischen Aktivität nach Aktivierung (hem)ITAM gekoppelter Rezeptoren in vitro. Im Gegensatz hierzu blieben die Signaltransduktionswege G-protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) und des Integrins αIIbβ3, die das LAT Signalosom nicht nutzen, unbeeinflusst. In in vivo Studien verursachte die beeinträchtigte (hem)ITAM Signaltransduktion eine verlängerte Blutungszeit der Mäuse, während die Entstehung von Thromben nur bei gleichzeitiger Hemmung von GPCR-Signalwegen (durch Acetylsalicylsäuregabe) vermindert war. Diese Ergebnisse etablieren Grb2 als ein wichtiges Adapterprotein in der Signaltransduktionskaskade von GPVI und CLEC-2. Schließlich wurde im dritten Teil dieser Arbeit die proteolytische Regulation des Rezeptors CD84, der ein immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM) enthält, untersucht. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass CD84 in Mausthrombozyten durch zwei verschiedene und unabhängige proteolytische Mechanismen geschnitten wird: Zum einen durch Shedding des extrazellulären Teils, was ausschließlich durch die a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 bewerkstelligt wird, und zum anderen durch das Schneiden des intrazellulären C Terminus durch die Protease Calpain. Des Weiteren zeigte eine Untersuchung von Plasmaproben transgener Mäuse, dass das Shedding von CD84 durch ADAM10 konstitutiv in vivo erfolgt. KW - Thrombozyt KW - T-Lymphozyt KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - Calcium KW - Platelet KW - Thrombose KW - T cell KW - receptor signaling KW - calcium KW - ITAM KW - Hämostase KW - Metalloproteinasen KW - Adapterprotein Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97114 ER - TY - THES A1 - Westermann, Alexander J. T1 - Dual RNA-seq of pathogen and host T1 - Duale RNA-Sequenzierung eines Pathogens und seines Wirts N2 - The infection of a eukaryotic host cell by a bacterial pathogen is one of the most intimate examples of cross-kingdom interactions in biology. Infection processes are highly relevant from both a basic research as well as a clinical point of view. Sophisticated mechanisms have evolved in the pathogen to manipulate the host response and vice versa host cells have developed a wide range of anti-microbial defense strategies to combat bacterial invasion and clear infections. However, it is this diversity and complexity that makes infection research so challenging to technically address as common approaches have either been optimized for bacterial or eukaryotic organisms. Instead, methods are required that are able to deal with the often dramatic discrepancy between host and pathogen with respect to various cellular properties and processes. One class of cellular macromolecules that exemplify this host-pathogen heterogeneity is given by their transcriptomes: Bacterial transcripts differ from their eukaryotic counterparts in many aspects that involve both quantitative and qualitative traits. The entity of RNA transcripts present in a cell is of paramount interest as it reflects the cell’s physiological state under the given condition. Genome-wide transcriptomic techniques such as RNA-seq have therefore been used for single-organism analyses for several years, but their applicability has been limited for infection studies. The present work describes the establishment of a novel transcriptomic approach for infection biology which we have termed “Dual RNA-seq”. Using this technology, it was intended to shed light particularly on the contribution of non-protein-encoding transcripts to virulence, as these classes have mostly evaded previous infection studies due to the lack of suitable methods. The performance of Dual RNA-seq was evaluated in an in vitro infection model based on the important facultative intracellular pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium and different human cell lines. Dual RNA-seq was found to be capable of capturing all major bacterial and human transcript classes and proved reproducible. During the course of these experiments, a previously largely uncharacterized bacterial small non-coding RNA (sRNA), referred to as STnc440, was identified as one of the most strongly induced genes in intracellular Salmonella. Interestingly, while inhibition of STnc440 expression has been previously shown to cause a virulence defect in different animal models of Salmonellosis, the underlying molecular mechanisms have remained obscure. Here, classical genetics, transcriptomics and biochemical assays proposed a complex model of Salmonella gene expression control that is orchestrated by this sRNA. In particular, STnc440 was found to be involved in the regulation of multiple bacterial target mRNAs by direct base pair interaction with consequences for Salmonella virulence and implications for the host’s immune response. These findings exemplify the scope of Dual RNA-seq for the identification and characterization of novel bacterial virulence factors during host infection. N2 - Die Infektion einer eukaryontischen Wirtszelle mit einem bakteriellen Pathogen ist eines der komplexesten Beispiele einer Domänen-überschreitenden Wechselwirkung zweier Organismen. Infektionsprozesse sind in höchstem Maße relevant, sowohl in der Grundforschung als auch von einem klinischen Blickwinkel aus betrachtet. Im Laufe der Evolution entstanden komplizierte Mechanismen, die es einem Pathogen erlauben, die Wirtsantwort zu manipulieren. Umgekehrt haben potentielle Wirtszellen eine Reihe von anti-mikrobiellen Verteidigungsstrategien entwickelt, um bakterielle Infektionen zu bekämpfen und letztlich zu beseitigen. Es sind jedoch genau diese Verschiedenheit und Komplexität, welche die Infektionsforschung so anspruchsvoll und technisch schwer analysierbar machen. Gängige Analysemethoden wurden zumeist entweder für bakterielle oder aber eukaryontische Organismen entwickelt. Dagegen werden Techniken benötigt, welche es erlauben, mit den mitunter extremen Unterschieden zwischen Wirt und Pathogen umzugehen, die sich in etlichen zellulären Eigenschaften und Prozessen manifestieren. Eine Klasse zellulärer Makromoleküle, die diese Heterogenität zwischen Wirt und Pathogen widerspiegelt, sind ihre jeweiligen Transkriptome: Bakterielle Transkripte unter-scheiden sich von ihren eukaryontischen Pendants in vielerlei Hinsicht, was sowohl quantitative als auch qualitative Aspekte miteinschließt. Die Gesamtheit zellulärer Transkripte ist von größter Bedeutung, da sie den physiologischen Zustand der jeweiligen Zelle unter den gegebenen Bedingungen reflektiert. Aus diesem Grund werden Genom-weite Transkriptom-techniken wie etwa die RNA-Sequenzierung seit etlichen Jahren erfolgreich angewandt, um biologische Prozesse zu untersuchen – jedoch ist deren Eignung für Infektionsstudien in starkem Maße limitiert. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Etablierung eines neuartigen Ansatzes, „Duale RNA-Sequenzierung“ genannt, der Transkriptomstudien mit der Infektionsbiologie kompatibel macht. Mithilfe dieser Technologie wurde hier im Besonderen versucht, die Rolle nicht-proteinkodierender RNA-Moleküle für die Virulenz zu beleuchten, da die Charakterisierung dieser RNA-Klassen bisherigen Infektionsstudien weitgehend verwehrt blieb. Die Anwendbar-keit der Dualen RNA-Sequenzierung wurde innerhalb eines In-vitro-Infektionsmodells getestet, welches auf dem wichtigen, fakultativ intrazellulären Pathogen Salmonella enterica serovar Tyhimurium und verschiedenen humanen Zelllinien basiert. Die Duale RNA-Sequenzierung zeigte sich dabei in der Lage alle wesentlichen bakteriellen sowie humanen Transkriptklassen zu erfassen und erwies sich als reproduzierbar. Im Zuge dieser Experimente wurde ein Gen für eine zuvor kaum beschriebene kleine nicht-kodierende RNA (STnc440) als eines der am stärksten induzierten Gene intrazellulärer Salmonellen identifiziert. Interessanterweise hatten vorherige Studien gezeigt, dass die Inaktivierung dieses Gens zu einem Virulenzdefizit innerhalb unterschiedlicher Tiermodelle für Salmonellose führt. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen blieben jedoch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden genetische, Transkriptom- sowie biochemische Analysen eingesetzt um das komplexe Regulationsnetzwerk dieser kleinen RNA erstmals näher zu beleuchten. Im Einzelnen konnte gezeigt werden, dass STnc440 die Expression mehrerer bakterieller mRNAs durch das Ausbilden zwischen-molekularer Basenpaarungen reguliert, was weitreichende Konsequenzen sowohl für die Virulenz des Pathogens als auch die Immunantwort des Wirts hat. Diese Ergebnisse veranschaulichen das Potential der Dualen RNA-Sequenzierung für das Auffinden und Charakterisieren neuer bakterieller Virulenzfaktoren während der Wirtsinfektion. KW - Transkriptomanalyse KW - Dual RNA-seq KW - Salmonella enterica KW - Wirtszelle Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112462 ER - TY - THES A1 - Luibl [née Hermann], Christiane T1 - The role of the neuropeptides NPF, sNPF, ITP and PDF in the circadian clock of Drosophila melanogaster T1 - Die Rolle der Neuropeptide NPF, sNPF, ITP und PDF in der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster N2 - Organisms have evolved endogenous clocks which allow them to organize their behavior, metabolism and physiology according to the periodically changing environmental conditions on earth. Biological rhythms that are synchronized to daily changes in environment are governed by the so-called circadian clock. Since decades, chronobiologists have been investigating circadian clocks in various model organisms including the fruitfly Drosophila melanogaster, which was used in the present thesis. Anatomically, the circadian clock of the fruitfly consists of about 150 neurons in the lateral and dorsal protocerebrum, which are characterized by their position, morphology and neurochemistry. Some of these neurons had been previously shown to contain either one or several neuropeptides, which are thought to be the main signaling molecules used by the clock. The best investigated of these neuropeptides is the Pigment Dispersing Factor (PDF), which had been shown to constitute a synchronizing signal between clock neurons as well as an output factor of the clock. In collaboration with various coworkers, I investigated the roles of three other clock expressed neuropeptides for the generation of behavioral rhythms and the partly published, partly unpublished data are presented in this thesis. Thereby, I focused on the Neuropeptide F (NPF), short Neuropeptide F (sNPF) and the Ion Transport Peptide (ITP). We show that part of the neuropeptide composition within the clock network seems to be conserved among different Drosophila species. However, the PDF expression pattern in certain neurons varied in species deriving from lower latitudes compared to higher latitudes. Together with findings on the behavioral level provided by other people, these data suggest that different species may have altered certain properties of their clocks - like the neuropeptide expression in certain neurons - in order to adapt their behavior to different habitats. We then investigated locomotor rhythms in Drosophila melanogaster flies, in which neuropeptide circuits were genetically manipulated either by cell ablation or RNA interference (RNAi). We found that none of the investigated neuropeptides seems to be of equal importance for circadian locomotor rhythms as PDF. PDF had been previously shown to be necessary for rhythm maintenance in constant darkness (DD) as well as for the generation of morning (M) activity and for the right phasing of the evening (E) activity in entrained conditions. We now demonstrate that NPF and ITP seem to promote E activity in entrained conditions, but are clearly not the only factors doing so. In addition, ITP seems to reduce nighttime activity. Further, ITP and possibly also sNPF constitute weak period shortening components in DD, thereby opposing the effect of PDF. However, neither NPF or ITP, nor sNPF seem to be necessary in the clock neurons for maintaining rhythmicity in DD. It had been previously suggested that PDF is released rhythmically from the dorsal projection terminals. Now we discovered a rhythm in ITP immunostaining in the dorsal projection terminals of the ITP+ clock neurons in LD, suggesting a rhythm in peptide release also in the case of ITP. Rhythmic release of both ITP and PDF seems to be important to maintain rhythmic behavior in DD, since constantly high levels of PDF and ITP in the dorsal protocerebrum lead to behavioral arrhythmicity. Applying live-imaging techniques we further demonstrate that sNPF acts in an inhibitory way on few clock neurons, including some that are also activated by PDF, suggesting that it acts as signaling molecule within the clock network and has opposing effects to PDF. NPF did only evoke very little inhibitory responses in very few clock neurons, suggesting that it might rather be used as a clock output factor. We were not able to apply the same live-imaging approach for the investigation of the clock neuron responsiveness to ITP, but overexpression of ITP with various driver lines showed that the peptide most likely acts mainly in clock output pathways rather than inter-clock neuron communication. Taking together, I conclude that all investigated peptides contribute to the control of locomotor rhythms in the fruitfly Drosophila melanogaster. However, this control is in most aspects dominated by the actions of PDF and rather only fine-tuned or complemented by the other peptides. I assume that there is a high complexity in spatial and temporal action of the different neuropeptides in order to ensure correct signal processing within the clock network as well as clock output. N2 - Die meisten Organismen haben endogene Uhren entwickelt, mit deren Hilfe sie ihre Verhaltensweisen, ihren Metabolismus und auch ihre Physiologie an die periodisch wechselnden Umweltbedingungen auf unserer Erde anpassen können. Die sogenannten circadianen Uhren steuern dabei biologische Rhythmen, die an täglich wiederkehrende Umweltfaktoren angepasst sind. Schon seit Jahrzehnten wurden diese circadianen Uhren von Chronobiologen in verschiedensten Modellorganismen untersucht. Zu diesen gehört auch die Taufliege Drosophila melanogaster, welche im Rahmen dieser Doktorarbeit Verwendung fand. Anatomisch besteht die circadiane Uhr der Taufliege aus etwa 150 sogenannten Uhrneuronen, die sich im dorsalen und lateralen Protocerebrum der Fliege befinden. Diese können anhand ihrer Position im Gehirn, ihrer Morphologie als auch ihrer neurochemischen Eigenschaften charakterisiert werden. Es wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt, dass einige dieser Uhrneuronen jeweils ein oder mehrere Neuropeptide exprimieren, welche mit großer Wahrscheinlichkeit die wichtigsten Signalmoleküle der Uhr darstellen. Dabei ist der „Pigment Dispersing Factor“ (PDF) wohl das Neuropeptid, welches bisher in Bezug auf seine Funktion in der Uhr die größte Aufmerksamkeit fand. Es ist daher auch das Neuropeptid, das bei Weitem am besten untersucht ist. So wurde bereits gezeigt, dass PDF die Oszillationen der Uhrneuronen untereinander synchronisiert und auch in Ausgangssignalwegen der Uhr zu nachgeschalteten Gehirnregionen eine Rolle spielt. In Zusammenarbeit mit verschiedenen Kollegen, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit untersucht, welche Rolle drei andere Neuropeptide, welche in den Uhrneuronen exprimiert werden, in der Generierung von Verhaltensrhythmen spielen. Der Fokus lag dabei auf der Untersuchung des Neuropeptids F (NPF) des short Neuropeptids F (sNPF) und des Ion Transport Peptids (ITP). Wir konnten für manche dieser Peptide zeigen, dass ihre Verwendung im Uhrnetzwerk unterschiedlicher Drosophila-Arten konserviert zu sein scheint. Im Falle von PDF zeigten sich jedoch Unterschiede in der zellspezifischen Expression in Arten aus südlichen Breitengraden im Vergleich zu Arten aus nördlichen Breitengraden. Zusammen mit ergänzenden Verhaltensdaten anderer Arbeitsgruppen, gehen wir davon aus, dass unterschiedliche Arten bestimmte Eigenschaften ihrer Uhr – wie etwa die Neuropeptid-Expression in bestimmten Zellen – verändert haben, um ihr Verhalten bestmöglich an ihr jeweiliges Habitat anzupassen. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die Aktivitätsrhythmik in Fliegen untersucht, in welchen gezielt bestimmte Neuropeptid-Systeme auf genetischem Wege - entweder durch Zellablation oder RNA-Interferenz (RNAi) - manipuliert wurden. Wir konnten zeigen, dass wohl keines der untersuchten Peptide eine ähnlich große Rolle für die Aktivitätsrhythmik spielt wie PDF. Aus früheren Arbeiten geht hervor, dass PDF sowohl für die Aufrechterhaltung eines Rhythmus in konstanter Dunkelheit (DD), als auch für die Generierung der Morgenaktivität und für die richtige Phasenlage der Abendaktivität in Licht-Dunkel Zyklen (LD) essentiell ist. Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen nun, dass NPF und ITP die Abendaktivität in LD fördern, dass sie jedoch nicht die einzigen Faktoren sind, die dies bewerkstelligen. ITP scheint außerdem Aktivität während der Nacht zu hemmen. Des Weiteren stellen ITP und möglicherweise auch sNPF eine schwache Perioden verkürzende Komponente in DD dar, ganz im Gegensatz zu PDF, welches eine Perioden verlängernde Wirkung besitzt. Jedoch scheinen weder ITP, NPF noch sNPF für die generelle Aufrechterhaltung eines Rhythmus in DD nötig zu sein. Vorhergehende Arbeiten wiesen bereits darauf hin, dass PDF wahrscheinlich rhythmisch an den dorsalen Nervenendigungen ausgeschüttet wird. Unsere jetzigen Ergebnisse zeigen desweiteren eine Oszillation in der ITP-Immunfärbung in den dorsalen Projektionen der ITP+ Uhrneuronen in LD, was auch auf eine rhythmische Ausschüttung dieses Peptids schließen lässt. Die rhythmische Freisetzung beider Peptide scheint für die Aufrechterhaltung eines Verhaltensrhythmus in DD wichtig zu sein, da eine konstant hohe Menge an ITP und PDF im dorsalen Gehirn den Freilauf-Rhythmus störten. Die live-Imaging Experimente dieser Arbeit zeigten, dass sNPF auf manche Uhrneuronen inhibitorisch wirkt – auch auf einige, die durch PDF aktiviert werden können. sNPF könnte also als Signalmolekül innerhalb des Uhrnetzwerkes fungieren. Auch NPF führte zu inhibitorischen Zellantworten, jedoch waren diese äußerst schwach und betrafen nur wenige Uhrneuronen, was darauf schließen lässt, dass dieses Peptid wahrscheinlich am Signalausgang der Uhr beteiligt ist. Es war uns bisher nicht möglich dieselben live-Imaging Untersuchungen auch für ITP durchzuführen, jedoch zeigten Überexpressionsstudien mit verschiedenen Treiberlinien, dass auch ITP mit großer Wahrscheinlichkeit im Signalausgang der Uhr fungiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle hier untersuchten Neuropeptide an der Kontrolle der rhythmischen Lokomotoraktivität von Drosophila melanogaster mitwirken. Dabei ist PDF eindeutig der dominierende Faktor, während die anderen Neuropeptide die Wirkung von PDF eher feinregulieren oder komplementieren. Aus den Daten kann geschlossen werden, dass die örtliche und zeitliche Funktionsweise dieser verschiedenen Peptide sehr komplex ist, um sowohl die Prozessierung von Signalen innerhalb des Uhrnetzwerkes als auch in den weitgehend noch unbekannten Ausgangswegen der Uhr zu gewährleisten. KW - Taufliege KW - Biologische Uhr KW - Neuropeptide KW - Innere Uhr KW - Drosophila KW - Circadian Rhythms Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-93796 ER - TY - THES A1 - Büchner, Claudia Nadine T1 - Single molecule studies of DNA lesion search and recognition strategies T1 - Einzel-Molekül-Studien von Strategien zur DNS-Schadenssuche und -erkennung N2 - The integrity of our genome is continuously endangered by DNA damaging factors. Several cellular mechanisms have evolved to recognize and remove different types of DNA lesions. Despite the wealth of information on the three-dimensional structure and the catalytic mechanism of DNA repair enzymes, the essential process of target site search and identification remains more elusive. How can a small number of repair proteins find and detect the rare sites of damage rapidly and efficiently over an excess of millions of undamaged bases? To address this pivotal question in DNA repair, I focused on the central players from the two DNA damage excision repair pathways in my studies: nucleotide excision repair (NER) and base excision repair (BER). As examples for completely different approaches of damage search, recognition and verification, I compared the NER protein Xeroderma pigmentosum group D (XPD) with the BER proteins human thymine DNA glycosylase (hTDG) and human 8-oxoguanine glycosylase (hOgg1). In particular, the single molecule approach of atomic force microscopy (AFM) imaging and complementary biochemical and biophysical techniques were applied. I established a simple, optimized preparation approach, which yields homogeneous and pure samples of long (several hundreds to thousands of base pairs) DNA substrates suitable for the AFM studies with DNA repair proteins. Via this sample preparation, a single target site of interest can be introduced into DNA at a known position, which allows separate analysis of specific protein-DNA complexes bound to the lesion site and nonspecific complexes bound to non-damaged DNA. The first part of the thesis investigates the XPD protein involved in eukaryotic NER. In general, the NER mechanism removes helix-distorting lesions – carcinogenic UV light induced photoproducts, such as cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) as well as bulky DNA adducts. The 5’-3’ helicase XPD has been proposed to be one of the key players in DNA damage verification in eukaryotic NER, which is still a matter of hot debate. In the studies, I focused on XPD from the archaeal species Thermoplasma acidophilum (taXPD), which shares a relatively high sequence homology with the sequence of the human protein and may serve as a good model for its eukaryotic counterpart. Based on AFM experiments and accompanying DNA binding affinity measurements with the biosensor technology Biolayer Interferometry (BLI), a clear role of XPD in damage verification was deciphered. Specifically, the data suggested that the ATP-dependent 5’-3’ helicase activity of XPD was blocked by the presence of damage leading to stalled XPD-DNA damage verification complexes at the lesion sites. Successful damage verification led to ATP-dependent conformational changes visible by a significant transition in DNA bend angles from ~ 50° to ~ 65° at the site of the bound protein. Remarkably, this DNA bend angle shift was observed both in the presence of ATP and ATPγs (non-hydrolyzable ATP analog) indicating that ATP-binding instead of ATP hydrolysis was sufficient to induce repair competent conformational changes of XPD. Most importantly, detailed protein binding position and DNA bend angle analyses revealed for the first time that XPD preferably recognizes a bulky fluorescein lesion on the translocated strand, whereas a CPD lesion is preferentially detected on the opposite, non-translocated strand. Despite the different recognition strategies for both types of damages, they share a common verification complex conformation, which may serve as a signal for the recruitment of further NER factors. In the second part of the thesis, AFM imaging and a 2-Aminopurine fluorescence-based base-flipping assay were combined to investigate damage search and recognition by DNA glycosylases in BER. Exemplarily, I chose to study hTDG as a representative of the vast glycosylase family. hTDG excises thymine and uracil from mutagenic G:T and G:U mispairs contributing to cancer and genetic disease. The AFM data suggested that hTDG uses the intrinsic flexibility of G:T and G:U wobble pairs for initial damage sensing, while scanning DNA as a search complex (SC, slightly bent DNA). Remarkably, hTDG has been indicated to continuously switch between the search and interrogation conformation (IC, stronger bent DNA) during damage search. In the IC, target bases are interrogated by extrahelical base flipping, which is facilitated by protein-induced DNA bending and enhanced DNA flexibility at mismatches. AFM and fluorescence analyses revealed that the flipped base is stabilized via hTDG’s arginine finger. Correct target bases are perfectly stabilized within the enzyme’s catalytic pocket resulting in prolonged residence time and enhanced excision probability. To test for the generalizability of the proposed hTDG damage search model to BER glycosylases, identical studies were performed with a second glycosylase, hOgg1. The data on hOgg1, which removes structurally more stable 8-oxoguanine lesions, supported the hypothesis developed for lesion recognition by hTDG as a common strategy employed by BER glycosylases N2 - Die Stabilität des menschlichen Genoms wird durch DNA-schädigende Faktoren ständig bedroht. Mehrere zelluläre Mechanismen haben sich entwickelt, um verschiedene Typen von DNS-Schädigungen zu erkennen und zu entfernen. Obwohl zahlreiche und vielfältige Informationen über die drei-dimensionalen Strukturen und katalytischen Mechanismen von DNS-Reparaturenzymen vorhanden sind, ist der essentielle Prozess der Suche und Identifikation von Läsionen kaum verstanden. Wie ist es möglich, dass eine kleine Anzahl an Reparaturenzymen die seltenen DNS-Schadensstellen unter Millionen von unbeschädigten Basen schnell und effizient finden kann? Diese zentrale Frage der DNS-Reparatur habe ich mit Hilfe von Schlüssel-Proteinen aus zwei verschiedenen DNS-Reparaturmechanismen untersucht, zum einen aus der Nukleotid- (NER) und zum anderen aus der Basenexzisionsreparatur (BER). Als Beispiel für zwei völlig unterschiedliche Ansätze zur Schadenssuche, -erkennung und -verifizierung, habe ich das NER Protein Xeroderma pigmentosum group D (XPD) mit den BER Proteinen humane Thymin DNA Glykosylase (hTDG) und der humanen 8-Oxoguanin Glykosylase (hOgg1) verglichen. Im Detail habe ich Einzelmoleküluntersuchungen mittels Rasterkraftmikroskopie (engl. ‚atomic force microscopy‘, AFM) und unterstützenden biochemischen und biophysikalischen Techniken angewandt. Ich habe eine einfache und optimierte Probenaufbereitungsmethode etabliert, welche es ermöglicht homogene, hochreine und lange (mehrere 100 Basenpaare) DNS-Substrate herzustellen, die für AFM Studien mit DNS-Reparaturenzymen geeignet sind. Mit Hilfe dieser Probenherstellungs-Technik kann eine einzelne, gewünschte Zielstelle an einer bestimmten Position in diese DNS-Substrate eingefügt werden. Die Verwendung dieser speziellen DNS-Substrate erlaubt eine separate Analyse von spezifischen Protein-DNS-Komplexen, die an bestimmte Läsionen gebunden sind, und unspezifischen Komplexen mit unbeschädigter DNS. Der erste Teil dieser Arbeit behandelt die Rolle von XPD in der eukaryotischen NER. Der NER Mechanismus entfernt DNS-Schäden, welche die Helix-Struktur der DNS verzerren. Das sind zum einen krebserregende UV-Schäden, wie zum Beispiel Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPDs) sowie sperrige DNS-Addukte. Die 5‘-3‘ Helikase XPD wird als eines der Schlüsselenzyme bei der Schadens-Verifizierung gehandelt, was jedoch derzeit noch umstritten ist. In meinen Studien habe ich mich mit dem XPD-Protein aus dem archäischen Organismus Thermoplasma acidophilum (taXPD) beschäftigt. Dieses weist eine relativ große Sequenzhomologie mit dem humanen Protein auf und stellt daher ein gutes Modell für das eukaryotische XPD dar. Auf Grund von AFM Experimenten und DNS-Bindungsaffinitätsmessungen mittels Biolayer-Interferometrie (BLI), konnte XPD eine eindeutige Rolle in der DNS-Schadensverifizierung zugesprochen werden. Meine Ergebnisse zeigten, dass die ATP-abhängige Helikase-Aktivität von XPD durch die Anwesenheit eines DNA-Schadens gehemmt wird, was zur Schadensverifizierung und Bildung von XPD-DNA-Komplexen führt, die von der Schadensstelle ‚aufgehalten‘ wurden. Eine erfolgreiche Schadensverifizierung führt daraufhin zu ATP-abhängigen Konformationsänderungen, die sich in einer Änderung des DNA-Biegewinkels von ~ 50° zu ~ 65° an der Stelle des gebunden Proteins äußern. Es ist bemerkenswert, dass diese Änderung des DNS-Biegewinkels sowohl mit ATP und als auch mit ATPγs (nicht-hydrolysierbares ATP Analog) beobachtet wurde. Dies zeigt, dass bereits die Bindung und anstatt der Hydrolyse von ATP ausreicht, um reparaturkompetente Konformationsänderungen durch XPD zu veranlassen. Darüber hinaus haben meine detaillierten Proteinbindeposition- und DNS-Biegewinkelanalysen haben zum ersten Mal gezeigt, dass XPD sperrige Fluoreszein-Schäden vor allem auf dem translozierten DNS-Strang erkennt, während CPD-Schäden vor allem auf dem gegenüberliegendem nicht-translozierten Strang erkannt werden. Trotz dieser unterschiedlichen Erkennungsstrategien für die zwei Schadenstypen, nehmen die beiden Schäden die gleiche Konformation im Schadensverifizierungs-Komplex an, was als Signal für die Rekrutierung weiterer NER Faktoren dienen könnte. Im zweiten Teil meiner Arbeit kombinierte ich AFM-Experimente mit einem sogenannten ‚base flipping' Test, der auf der Fluoreszenz von 2-Aminopurine basiert, um die Schadenssuche und -erkennung durch DNS-Glykosylasen im BER-Mechanismus zu untersuchen. Als Beispiel für die weitläufige Familie der Glykosylasen wählte ich hTDG aus. hTDG schneidet Thymin und Uracil aus mutagenen G:T und G:U Fehlpaarungen heraus. Die AFM Daten zeigten, dass sich hTDG für die initiale Schadenserkennung die intrinsische Flexibilität in G:T und G:U Paaren zu Nutze macht, während die DNA als Suchkomplex geprüft wird (engl. ‚search complex‘, SC, leicht gebogene DNS-Struktur). Erstaunlicherweise scheint hTDG dabei kontinuierlich zwischen einem Such- und Prüfkomplex umzuschalten (engl. ‚interrogation complex‘, IC, stärkere Biegung der DNS). Im IC werden Basen durch „flippen“ außerhalb der DNS-Helix geprüft, was durch die Protein induzierte DNS-Biegung und die erhöhte Flexibilität von Fehlpaarungen in der DNS ermöglicht wird. Die Analyse von AFM- und Fluoreszenzexperimenten brachte zum Vorschein, dass die ‚geflippte‘ Base durch den Arginin-Finger von hTDG stabilisiert wird. Die korrekten Zielbasen passen exakt in die katalytische Tasche des Enzyms und werden dort perfekt stabilisiert, was zu einer längeren Aufenthaltsdauer führt, die wiederum die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die Base herausgeschnitten wird. Um zu testen, ob das für hTDG vorgeschlagene Schadenssuchmodel auch allgemein für andere BER Glykosylasen gilt, habe ich die gleichen Experimente mit einer weiteren Glykosylase (hOgg1) durchgeführt, ein Protein das strukturell stabilere 8-Oxoguanin-Schäden entfernt. Die Daten für hOgg1 untermauern die Hypothese, die für die Schadenssuche von hTDG erarbeitet wurde, als eine gemeinsame Strategie von BER Glykosylasen. KW - Rasterionenmikroskop KW - DNS-Schädigung KW - Single-molecule KW - Atomic-force-microscopy KW - DNA lesion KW - Einzel-Molekül KW - Rasterkraft-Mikroskopie KW - DNS-Schaden Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111886 ER - TY - THES A1 - Schulze, Markus T1 - Role of Chronophin for glioma cell migration and invasion T1 - Die Rolle von Chronophin für die Migration und Invasion von Gliomzellen N2 - Abstract Glioblastomas, primary brain tumors, represent a tumor entity with a dismal prognosis and a median survival of only about one year. Invasion into the healthy brain parenchyma contributes substantially to the malignancy of this type of brain tumor. Therefore, a better understanding of the mechanisms promoting the invasive behavior of these brain tumors is needed to identify new therapeutic targets. Cofilin, an actin regulatory protein, has been shown to be an important regulator of the invasive behavior of tumor cells in other types of cancer and the actin cytoskeleton is involved in the formation of a variety of cellular structures important for cell migration and invasion. Cofilin is regulated by phosphorylation on a single residue, serine 3. The aim of this thesis was to examine the role of the cofilin regulatory phosphatase chronophin for glioma cell migration and invasion. First, it was established that chronophin depletion in the cell line GBM6840 leads to an increase in the ratio of phosphorylated cofilin to total cofilin. Higher chronophin levels were correlated with a decrease in F-actin in the cell lines GBM6840 and U87 as measured in an actin spin down assay and in a flow cytometry based assay. Furthermore, it was shown that knockdown of chronophin in two different cell lines, GBM6840 and DBTRG-05-MG, strongly increased their invasiveness in vitro. Expression of human chronophin in the cell line U87 decreased its invasiveness substantially. There was no difference in cell proliferation between GBM6840 and DBTRG-05-MG cells expressing a chronophin targeting shRNA or a control shRNA and U87 cells transfected with an empty vector or a human chronophin encoding plasmid. The increase in invasiveness after chronophin depletion could be correlated with an increase in directionality in cell migration under 2D culture conditions in the cell lines U87 and GBM6840. Moreover, treatment with the ROCK inhibitor Y-27632 decreased directionality in GBM6840 cells under 2D culture conditions and reduced the invasiveness of GBM6840 chronophin shRNA cells back to control levels. Expression of a non-phosphorylatable cofilin mutant, the S3A mutant, was able to reduce invasiveness and to reduce directionality under 2D culture conditions back to control levels in GBM6840 chronophin shRNA cells. This provides important evidence for the involvement of cofilin phosphoregulation in the phenotypes described above. In vivo, when injected into NOD-SCID mice, chronophin depleted cells showed a dramatic growth reduction as compared to control and rescue cells. Transciptomic characterization of GBM6840 cells by microarray analysis and subsequent comparison of the data with microarray profiles of normal brain tissues and different glioma entities identified two specifically chronophin regulated transcripts potentially involved in tumor progression and invasion, MXI1 and EDIL3. Moreover, c-myc was identified as a significantly altered transcription factor after chronophin deregulation based on the number of c-myc target molecules in the microarray dataset. MXI1 is a potential negative regulator of c-myc dependent transcription, and was strongly downregulated after chronophin knockdown in GBM6840. In line with this, the activity of a c-myc reporter plasmid was increased after chronophin depletion in GBM6840 and reduced after chronophin expression in U87 cells. However, the protein level of the c-myc protein was reduced after chronophin depletion in GBM6840. Finally, anaylsis of the expression of proteases known to be important for glioblastoma pathogenesis revealed no major changes in protease expression between chronophin depleted and control cells. Therefore, a comprehensive analysis of chronophin in the context of glioma pathogenesis has been performed in this thesis. It has been shown that chronophin depletion strongly enhanced invasiveness of glioma cells and that it induced transcriptomic changes potentially involved in tumor progression. The proteins regulating cofilin phosphorylation are therefore valuable therapeutic targets for anti-invasive therapy in glioblastomas. Inhibitors for kinases upstream of cofilin, e.g. LIMKs and ROCKs, are available, and might be promising agents for anti-invasive therapy. N2 - Zusammenfassung Glioblastome sind primäre Gehirntumore, die eine besonders schlechte Prognose besitzen und bei denen die mediane Überlebenszeit nur ca. ein Jahr beträgt. Zur Malignität dieses Tumortyps trägt entscheidend das Eindringen der Tumorzellen in das gesunde Hirnparenchym bei. Daher ist es notwendig die molekularen Mechanismen zu verstehen, die diesem Phänomen zu Grunde liegen, um neue therapeutische Zielmoleküle zu identifizieren. Cofilin, ein Protein das das Aktinzytoskellet reguliert, ist in anderen Krebsarten als wichtiger Regulator des invasiven Verhaltens von Zellen bekannt und das Aktinzytoskellet ist an der Bildung einer Vielzahl von zellulären Strukturen beteiligt, die wichtig für die Zellmigration und –invasion sind. Cofilin wird über die Phosphorylierung einer einzigen Aminosäure, des Serin 3, reguliert. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Cofilin regulatorischen Phosphatase Chronophin für Zellmigration und -invasion zu untersuchen. Zuerst konnte gezeigt werden, dass eine Chronophin Depletion in der Zelllinie GBM6840 zu einer Zunahme des Anteils von P-Cofilin am Gesamtcofilin führt. Ebenso war ein hohes Chronophin Level in den Zelllinien GBM6840 und U87 mit einer Abnahme des F-Actin Levels korreliert, was in einem Aktin spin down Assay als auch mittels Durchflusszytrometrie gemessen werden konnte. Es konnte weiter gezeigt werden, dass eine shRNA vermittelte Depletion des Chronphin zu einer starken Zunahme der Invasivität in den Zelllinien GBM6840 und DBTRG-05-MG in vitro führt. Chronophin Expression in der Zelllinie U87 führte zu einer starken Abnahme der Invasivität. Es gab hingegen keinen Chronophin abhängigen Unterschied in der Proliferation von GBM6840 und DBTRG-05-MG Zellen, die entweder eine Kontroll- oder eine Chronophin gerichtete shRNA exprimierten, sowie keinen zwischen U87 Zellen, die mit einem Leervektor oder einem Chronophin codierenden Konstrukt transfiziert worden waren. Die Zunahme der Invasion nach Chronophin Depletion konnte mit einer Zunahme der Direktionalität der Zellen bei der Migration in einer 2D Umgebung korreliert werden. Desweiteren konnte durch Behandlung mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 in GBM6840 Zellen eine Erniedrigung der Direktionalität bei der Migration in 2D Kultur ebenso erreicht werden, wie eine Reduktion der Invasivität von Chronophin shRNA exprimierenden GBM6840 Zellen auf Kontrollniveau. Die Expression einer nicht-phosphorylierbaren Cofilin Mutante, der S3A Mutante, erniedrigte sowohl die Direktionalität in der 2D Migration als auch die Invasivität von GBM6840 Chronophin shRNA exprimierenden Zellen zurück auf Kontrollniveau. Diese Experimente lieferten wichtige Hinweise darauf, dass die Phosphoregulation von Cofilin ursächlich an der Entstehung der Phänotypen beteiligt war, die nach Chronophin Knockdown beobachtet wurden. In vivo konnte nach Injektion in NOD-SCID Mäuse eine dramatische Wachstumsreduktion der Chronophin depletierten Zellen gemessen werden. Durch Charakterisierung des Transkriptoms der Zelllinie GBM6840 mittels Microarrays und nachfolgender Vergleich der Ergebnisse mit Microarray-Profilen von Normalhirngewebe und verschiedenen Gliomentitäten konnten zwei spezifisch Chronophin abhängig regulierte Transkripte identifiziert werden, MXI1 und EDIL3, die potentiell mit der Progression und Invasivität von Gliomen verknüpft sind. MXI1, ein potentieller negativer Regulator der c-myc abhängigen Transkription, war nach Chronophin Herunterregulation in GBM6840 stark herunterreguliert. In Übereinstimmung mit diesem Befund war die Aktiviät eines c-myc Reporterplasmids nach Chronophin Herunterregulation in GBM6840 erhöht, nach Chronophin Expression in U87 jedoch erniedrigt. Das c-myc Protein selbst wies eine deutliche Reduktion nach Chronophin Depletion in GBM6840 auf. Abschließend wurde die Expression von Proteasen untersucht, für die eine Rolle in der Gliominvasion bekannt ist. Hier wurden jedoch keine größeren Chronophin abhängigen Expressionsunterschiede gefunden. Zusammenfassend gesagt konnte eine umfassende Charakterisierung der Rolle des Chronophin in der Gliompathogenese erreicht werden. Zum einen konnte gezeigt werden, dass Chronophin ein äußerst wichtiger Regulator der Invasion ist, zum anderen dass es zu Chronophin abhängigen transkriptomischen Veränderungen kommt, die potentiell zur Malignisierung des Tumors beitragen. Daher sind die Proteine die die Cofilinphosphorylierung regulieren potentielle therapeutische Zielmoleküle für eine anti-invasive Therapie im Glioblastom. Inhibitoren für die Kinasen, die Regulatoren des Cofilin sind, die ROCK- und LIM-Kinasen, sind verfügbar und stellen möglicherweise vielversprechende Substanzen für die anti-invasive Therapie dar. KW - Zellmigration KW - Chronophin KW - Invasion KW - Glioblastom KW - Gliom KW - PDXP KW - Glioma KW - Glioblastoma KW - Invasion KW - Migration Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109292 ER - TY - THES A1 - Tran-Gia, Johannes T1 - Model-Based Reconstruction Methods for MR Relaxometry T1 - Modellbasierte Rekonstruktionsmethoden für die MR-Relaxometrie N2 - In this work, a model-based acceleration of parameter mapping (MAP) for the determination of the tissue parameter T1 using magnetic resonance imaging (MRI) is introduced. The iterative reconstruction uses prior knowledge about the relaxation behavior of the longitudinal magnetization after a suitable magnetization preparation to generate a series of fully sampled k-spaces from a strongly undersampled acquisition. A Fourier transform results in a spatially resolved time course of the longitudinal relaxation process, or equivalently, a spatially resolved map of the longitudinal relaxation time T1. In its fastest implementation, the MAP algorithm enables the reconstruction of a T1 map from a radial gradient echo dataset acquired within only a few seconds after magnetization preparation, while the acquisition time of conventional T1 mapping techniques typically lies in the range of a few minutes. After validation of the MAP algorithm for two different types of magnetization preparation (saturation recovery & inversion recovery), the developed algorithm was applied in different areas of preclinical and clinical MRI and possible advantages and disadvantages were evaluated. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein modellbasiertes Verfahren namens MAP (engl. Model-based Acceleration of Parameter mapping) für die Bestimmung des T1-Gewebeparameters mittels Magnetresonanztomographie (MRT) entwickelt. Dieser iterative Algorithmus verwendet das Vorwissen über den nach einer Magnetisierungspräparation zu erwartenden Signalverlauf, um aus einer im Anschluss an eine initiale Präparation aufgenommene zeitliche Serie stark unterabgetasteter k-Räume eine Serie voll abgetasteter k-Räume zu generieren.Eine Fourier-Transformation dieser Serie in den Bildraum zeigt den örtlich aufgelösten zeitlichen Verlauf der longitudinalen Relaxation, was eine Kartierung des Gewebeparameters T1 ermöglicht. In seiner schnellsten Form ermöglicht dieses Verfahren die Rekonstruktion einer T1-Karte aus einem innerhalb weniger Sekunden nach einer passenden Magnetisierungspräparation aufgenommenen radialen Gradienten-Echo-Datensatz, während die Messdauer herkömmlich verwendeter T1-Bestimmungstechniken üblicherweise im Bereich von einigen Minuten liegt. Nach der Validierung des MAP-Algorithmus für zwei unterschiedliche Arten der Magnetisierungspräparation (Sättigungspräparation, Inversion) wurde die entwickelte Technik im Rahmen dieser Arbeit in verschiedenen Bereichen der präklinischen und klinischen MRT angewendet und mögliche Vor- und Nachteile untersucht. KW - Kernspintomographie KW - Radiologische Diagnostik KW - Bildgebendes Verfahren KW - Magnetic Resonance Relaxometry KW - Magnetresonanz-Relaxometrie KW - Model Based Reconstruction Algorithms in Magnetic Resonance Imaging KW - Modellbasierte-Rekonstruktionsalgorithmen in der Magnetresonanztomografie KW - Relaxation Parameter Mapping in Magnetic Resonance Imaging KW - Bestimmung des Relaxations-Parameters in der Magnetresonanztomografie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109774 ER - TY - THES A1 - Post, Antonia T1 - Snap25 heterozygous knockout mice as a potential model for attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD) T1 - Heterozygote Snap25 Knockout-Mäuse als Modell für Aufmerksamkeitsdefizit- / Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) N2 - SNAP25 (Synaptosomal-Associated Protein of 25 kDa; part of the SNARE complex) is involved in the docking and fusion of synaptic vesicles in presynaptic neurons necessary for the regulation of neurotransmitter release, as well as in axonal growth and synaptic plasticity. In humans, different single nucleotide polymorphisms of SNAP25 have repeatedly been associated with attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD). Thus, in this study heterozygous Snap25 knockout mice were investigated as a model of ADHD. Heterozygous (+/-) Snap25 knockout mice as well as their wild-type (+/+) littermates were reared under control conditions or underwent a Maternal Separation (MS) procedure. Starting at the age of 2 months, mice were tested for locomotor activity in a repeated long-term Open Field (OF) task, for attention deficits and impulsive behavior in the 5 Choice Serial Reaction Time Task (5CSRTT), for anxiety-like behavior in the Light-Dark Box (LDB) and for depression-like behavior in the Porsolt Forced Swim Test (FST). The brains of these mice were subsequently tested for the expression of several ADHD related genes in a quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) study. Another group of female mice (+/+; +/-) underwent a one hour OF test after oral administration of 45 mg/kg Methylphenidate (MPH) or placebo. To find an optimized dosage for this MPH challenge, a pilot study was performed. Wild-type C57BL/6 mice were tested in a long-term OF with several dosages of MPH both intraperitoneally (i.p.) and orally. The brains of these animals were afterwards investigated for neurotransmitter concentrations. In this pilot study the dosages of MPH that were similarly behaviorally effective without causing symptoms of overdosing were 7.5-15 mg/kg intraperitoneally and 30-60 mg/kg orally. However, even though it was possible to find intraperitoneal and oral doses that correlate behaviorally, the neurochemistry was mostly different. In the study on Snap25-deficient mice, unstressed controls showed a hyperactive phenotype in the second of two long-term OF sessions (60 min) spaced three weeks apart. Considering all groups, there was a significant interaction of stress and genotype in the second session, with animals subjected to MS being overall hyperactive with no genotype differences. In the training phase of the 5CSRTT only effects of stress were found, with MS animals finding and consuming fewer rewards. In the single test trial, several genotype effects became apparent, with tendencies for the number of correct nose pokes and the number of rewards eaten, and a significant effect for the number of rewards eaten directly after the correct response. In all of these variables +/- mice performed worse than their wild-type littermates. In the LDB +/- mice entered the lit compartment of the arena earlier than the controls, thus showing attenuated anxiety-like behavior. Regarding depressive-like behavior in the FST, male +/- mice spent significantly less time struggling than male +/+ mice. In the gene expression study, +/- mice had lower expression levels of Maoa and Comt, and higher expression levels of Nos1 than wild-types. Finally, the locomotor activity response to MPH was exaggerated in +/- mice as compared to controls. Heterozygous Snap25 knockout mice show some of the behavioral characteristics of ADHD, as for example a mild hyperactivity in a familiar environment, difficulties in the correct execution of a given task and even some behavior that can be interpreted as delay aversion. Additionally, expression levels of three ADHD related genes were changed in these animals. Although the exaggerated locomotor activity response to MPH is not to be expected of an ADHD model, the difference in the response between +/+ and +/- mice nonetheless implicates a potential dysfunction of the brain dopaminergic system. N2 - SNAP25 (Synaptosomal assoziiertes Protein, 25 kDa; Teil des SNARE Komplexes) ist an der Fusion von synaptischen Vesikeln mit der präsynaptischen Zellmembran beteiligt, und somit notwendig für die Regulation der Neurotransmitter-Ausschüttung. Außerdem wird eine wichtige Funktion bei dem Wachstum von Axonen und synaptischer Plastizität diskutiert. In Humanstudien wurden wiederholt verschiedene Einzelnukleotid-polymorphismen von SNAP25 mit Aufmerksamkeitsdefizit- / Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) assoziiert. In der vorliegenden Studie wurden heterozygote Snap25 knockout Mäuse als Modell für ADHS untersucht. Heterozygote (+/-) Snap25 knockout Mäuse und ihre wildtypischen Wurfgeschwister wurden unter Kontrollbedingungen großgezogen oder einer maternalen Separation (MS) unterzogen. Beginnend im Alter von etwa 2 Monaten wurden diese Mäuse verschiedenen Verhaltenstests unterzogen: in einem wiederholten Langzeit-Open-Field (OF) Test wurde Aktivität untersucht, Aufmerksamkeitsdefizite und Impulsivität mit dem 5 Choice Serial Reaction Time Task (5CSRTT), angst-ähnliches Verhalten in der Light-Dark Box (LDB) und depressions-ähnliches Verhalten im Porsolt Forced Swim Test (FST). Die Gehirne dieser Mäuse wurden anschließend auf die Expression verschiedener ADHS bezogener Gene in einer quantitativen Real-Time-PCR (qRT-PCR) untersucht. Eine zusätzliche Gruppe weiblicher Mäuse (+/+; +/-) durchlief einen einstündigen OF Test nach oraler Gabe von 45 mg/kg Methylphenidat (MPH) oder Placebo. Um eine optimale Dosierung für MPH in diesem Experiment zu finden, wurde eine Pilotstudie durchgeführt. Hierbei wurden wildtypische C57/BL6 Mäuse in einem Langzeit OF Test mit Gabe unterschiedlicher Dosierungen von MPH, sowohl oral als auch intraperitoneal (i.p.), untersucht. Im Anschluss wurden die Gehirne dieser Tiere auf Neurotransmitter-konzentration geprüft. Diese Pilotstudie ergab als optimale Dosierungen von MPH auf Verhaltensebene 7.5-15 mg/kg i.p. und 30-60 mg/kg oral. Allerdings waren die neurochemischen Effekte der beiden unterschiedlichen Applikationsarten größtenteils verschieden. In der Snap25 Studie zeigten ungestresste Kontroll-Tiere einen leicht hyperaktiven Phänotyp in dem zweiten von zwei Langzeit-Open-Field Tests (60 min) im Abstand von 3 Wochen. Bei Betrachtung aller Gruppen ergab sich auch eine signifikante Interaktion von Stress und Genotyp in der zweiten Testung, und zwar dahingehend, dass MS Tiere grundsätzlich aktiveres Verhalten zeigten, ohne Genotypen-Unterschiede. In der Anfangsphase des 5CSRTT lagen nur signifikante Haupteffekte für Stress vor, gestresste Tiere hatten größere Probleme im Meistern der Aufgabe als Wildtypen. Erst im sogenannten Test-Trial am Ende der Versuchsreihe ergaben sich signifikante Haupteffekte für den Genotyp. Heterozygote Snap25 knockout Mäuse zeigten beispielsweise weniger korrekte Reaktionen und konsumierten auch weniger Belohnungspellets direkt im Anschluss an eine korrekte Reaktion als Wildtypen. In der LDB brauchten +/- Mäuse wiederum weniger Zeit als Wildtypen, um den erleuchteten Teil der Arena zu betreten, und zeigten dadurch ein reduziertes Angst-ähnliches Verhalten. Im Gegensatz dazu ergab sich ein erhöht Depressions-ähnliches Verhalten für männliche heterozygote Snap25 knockout Mäuse im FST. Auf der Genexpressions-Ebene hatten +/- Mäuse niedrigere Expressionslevels von Maoa und Comt und höhere Expressionslevels von Nos1 als Wildtypen. Abschließend zeigte sich eine erhöhte Reaktion auf MPH bei heterozygoten Mäusen. Zusammenfassend zeigen heterozygote Snap25 knockout Mäuse einige Charakteristika von ADHS auf Verhaltensebene, wie zum Beispiel eine leichte Hyperaktivität in bekannter Umgebung, Schwierigkeiten im Erlernen einer gestellten Aufgabe und sogar Verhaltensweisen, die auf eine Abneigung gegenüber Verzögerungen hindeuten. Zusätzlich kommt es aufgrund des Knockouts zu veränderten Expressionslevels verschiedener ADHS assoziierter Gene. Auch wenn die erhöhte Verhaltensreaktion von +/- Mäusen auf MPH nicht die erwartete Reaktion eines ADHS Modells darstellt, deutet sie dennoch auf ein Ungleichgewicht des dopaminergen Systems im Gehirn hin, das bei ADHS eine wichtige Rolle spielt. KW - Aufmerksamkeitsdefizit-Syndrom KW - SNAP-Rezeptor KW - Tiermodell KW - Verhalten KW - Genexpression KW - Animal model KW - Snap25 KW - Attention deficit / hyperactivity disorder Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122899 ER - TY - THES A1 - Murti, Krisna T1 - The Role of NFATc1 in Burkitt Lymphoma and in Eµ-Myc induced B cell Lymphoma T1 - Die Role des NAFTc1 Transkriptionsfaktors im Burkitt Lymphom und im Eµ-Myc-induzierten B-Zell Lymphom N2 - Burkitt lymphoma (BL) is a highly aggressive B cell malignancy. Rituximab, a humanized antibody against CD20, in a combination with chemotherapy is a current treatment of choice for B-cell lymphomas including BL. However, certain group of BL patients are resistant to Rituximab therapy. Therefore, alternative treatments targeting survival pathways of BL are needed. In BL deregulation of MYC expression, together with additional mutations, inhibits differentiation of germinal centre (GC) B cells and drives proliferation of tumor cells. Pro-apoptotic properties of MYC are counteracted through the B-cell receptor (BCR) and phosphoinositide-3-kinase (PI3K) pathway to ensure survival of BL cells. In normal B-cells BCR triggering activates both NF-κB and NFAT-dependent survival signals. Since BL cells do not exhibit constitutive NF-κB activity, we hypothesized that anti-apoptotic NFATc1A isoform might provide a major survival signal for BL cells. We show that NFATc1 is constitutively expressed in nuclei of BL, in BL cell lines and in Eµ-Myc–induced B cell lymphoma (BCL) cells. Nuclear residence of NFATc1 in these entities depends on intracellular Ca2+ levels but is largely insensitive to cyclosporine A (CsA) treatment and therefore independent from calcineurine (CN) activity. The protein/protein interaction between the regulatory domain of NFATc1 and DNA binding domain of BCL6 likely contributes to sustained nuclear residence of NFATc1 and to the regulation of proposed NFATc1-MYC-BCL6-PRDM1 network in B-cell lymphomas. Our data revealed lack of strict correlation between the expression of six NFATc1 isoforms in different BL-related entities suggesting that both NFATc1/alphaA and -betaA isoforms provide survival functions and that NFATc1alpha/betaB and -alpha/betaC isoforms either do not possess pro-apoptotic properties in BL cells or these properties are counterbalanced. In addition, we show that in BL entities expression of NFATc1 protein is largely regulated at post-transcriptional level, including MYC dependent increase of protein stability. Functionally we show that conditional inactivation of Nfatc1 gene in Eµ-Myc mice prevents development of BCL tumors with mature B cell immunophenotype (IgD+). Loss of NFATc1 expression in BCL cells ex vivo results in apoptosis of tumor cells. Together our results identify NFATc1 as an important survival factor in BL cells and, hence, as a promising target for alternative therapeutic strategies for BL. N2 - Das Burkitt Lymphom (BL) ist eine hoch aggressive B-Zellentartung. Rituximab, ein humanisierter Antikörper gegen CD20, in Kombination mit Chemotherapie ist die augenblickliche Behandlung der Wahl für B-Zelllymphome inklusive dem BL. Allerdings sind bestimmte Gruppen der BL-Patienten resistent gegenüber einer Rituximabtherapie. Deshalb werden alternative Behandlungsmöglichkeiten, die das Überleben der BL gezielt beeinflussen, gesucht. Die Deregulation der MYC-Expression, zusammen mit weiteren Mutationen, inhibiert die Differenzierung der Keimzentrums- (GC-) B-Zellen im BL und treibt die Proliferation der Tumorzellen. Die pro-apoptotischen Eigenschaften von MYC sind durch den B-Zellrezeptor (BCR) und Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-Signalwege gegenreguliert, was zum Überleben der BL-Zellen führt. Da BL-Zellen keine konstitutive NF-κB-Aktivität aufweisen, stellten wir die Hypothese auf, dass die anti-apoptotischen Isoformen von NFATc1A ein Hauptüberlebenssignal für BL-Zellen bereitstellen könnten. Wir zeigen, dass NFATc1 konstitutiv in den Kernen primärer BL-Zellen, der BL-Zelllinien und in den Zellen eines Eµ-MYC-induzierten B-Zelllymphoms (BCL) vorliegt. Nukleäre NFATc1-Präsenz in diesen Entitäten hängt von intrazellulären Ca2+-Mengen ab, ist aber weitestgehend unempfindlich gegenüber Cyclosporine A (CsA)-Behandlung und unabhängig von Calcineurin (CN)-Aktivität. Stattdessen trägt wahrscheinlich die Protein/Proteininteraktion zwischen der regulatorischen Domäne von NFATc1 und der DNA-Bindungsdomäne von BCL6 zur anhaltenden nukleären Präsenz von NFATc1 und dem vorgeschlagenen NFATc1-MYC-BCL6-PRDM1-Netzwerk in B-Zelllymphomen bei. Unsere Daten ergaben keine strenge Korrelation zwischen der Expression der sechs NFATc1-Isoformen in verschiedenen BL-verwandten Entitäten. Dies suggeriert, dass sowohl NFATc1/αA wie –βA Überlebenssignale vermitteln und dass NFATc1α/βB und –α/βC-Isoformen in BL-Zellen keine pro-apoptotischen Eigenschaften besitzen oder diese Funktionen gegenreguliert werden. Des Weiteren zeigen wir, dass in BL-Entitäten die Expression der NFATc1-Proteine auf post-transkriptioneller Ebene reguliert werden. Dies schließt einen MYC-abhängigen Anstieg der Proteinstabilität ein. In Bezug auf die Funktion von NFATc1 zeigen wir, dass seine konditionelle Inaktivierung in Eµ-MYC-Mäusen die Entwicklung von BCL-Tumoren mit reifem T-Zellimmunphänotyp (IgD+) verhindert. Dementsprechend resultiert der Verlust der NFATc1-Expression in BCL-Zellen ex vivo in einer Apoptose der Tumorzellen. Zusammengefasst brandmarken unsere Resultate NFATc1 als einen entscheidenden Überlebensfaktor in BL-Zellen bzw. identifizieren es als vielversprechendes Ziel alternativer therapeutischer Strategien in BL. KW - Transkriptionsfaktor KW - Burkitt Lymphom KW - B-Zell-Lymphom KW - NFATc1 KW - Burkitt Lymphoma Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106448 ER - TY - THES A1 - Koziol, Uriel T1 - Molecular and developmental characterization of the Echinococcus multilocularis stem cell system T1 - Molekulare und entwicklungsbiologische Charakterisierung des Echinococcus multilocularis Stammzellsystems N2 - The metacestode larva of Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), one of the most dangerous zoonotic diseases in the Northern Hemisphere. Unlike “typical” metacestode larvae from other tapeworms, it grows as a mass of interconnected vesicles which infiltrates the liver of the intermediate host, continuously forming new vesicles in the periphery. From these vesicles, protoscoleces (the infective form for the definitive host) are generated by asexual budding. It is thought that in E. multilocularis, as in other flatworms, undifferentiated stem cells (so-called germinative cells in cestodes and neoblasts in free-living flatworms) are the sole source of new cells for growth and development. Therefore, this cell population should be of central importance for the progression of AE. In this work, I characterized the germinative cells of E. multilocularis, and demonstrate that they are indeed the only proliferating cells in metacestode vesicles. The germinative cells are a population of undifferentiated cells with similar morphology, and express high levels of transcripts of a novel non-autonomous retrotransposon family (ta-TRIMs). Experiments of recovery after hydroxyurea treatment suggest that individual germinative cells have extensive self-renewal capabilities. However, germinative cells also display heterogeneity at the molecular level, since only some of them express conserved homologs of fgfr, nanos and argonaute genes, suggesting the existence of several distinct sub-populations. Unlike free-living flatworms, cestode germinative cells lack chromatoid bodies. Furthermore, piwi and vasa orthologs are absent from the genomes of cestodes, and there is widespread expression of some conserved neoblast markers in E. multilocularis metacestode vesicles. All of these results suggest important differences between the stem cell systems of free-living flatworms and cestodes. Furthermore, I describe molecular markers for differentiated cell types, including the nervous system, which allow for the tracing of germinative cell differentiation. Using these molecular markers, a previously undescribed nerve net was discovered in metacestode vesicles. Because the metacestode vesicles are non-motile, and the nerve net of the vesicle is independent of the nervous system of the protoscolex, we propose that it could serve as a neuroendocrine system. By means of bioinformatic analyses, 22 neuropeptide genes were discovered in the E. multilocularis genome. Many of these genes are expressed in metacestode vesicles, as well as in primary cell preparations undergoing complete metacestode regeneration. This suggests a possible role for these genes in metacestode development. In line with this hypothesis, one putative neuropeptide (RGFI-amide) was able to stimulate the proliferation of primary cells at a concentration of 10-7 M, and the corresponding gene was upregulated during metacestode regeneration. N2 - Das Metazestoden Larvenstadium von Echinococcus multilocularis ist die Ursache für die alveoläre Echinokokkose (AE), eine der gefährlichsten Zoonosen in der nördlichen Hemisphäre. Im Gegensatz zu Metazestoden anderer Bandwürmer wächst es zu einem Labyrinth verknüpfter Vesikel, die in der Peripherie permanent neu gebildet werden und dabei die Leber des Wirts infilitrieren. In diesen Vesikeln werden die Protoskolizes (das infizierende Stadium für den Endwirt) durch asexuelle Knospung aus der Vesikelwand heraus gebildet. Man geht davon aus dass in E. multilocularis, wie in anderen Plattwürmen, undifferenzierte Stammzellen (so gennante „Germinative cells” in Bandwürmern und Neoblasten in Turbellarien) der einzige Ursprung neuer Zellen für Wachstum und Entwicklung sind. Deshalb sollte diese Zellpopulation eine zentrale Rolle im Fortschritt der AE spielen. In dieser Arbeit habe ich die Germinative cells von E. multilocularis charakterisiert und zeige, dass sie tatsächlich die einzigen sich vermehrenden Zellen in Metazestodenvesikeln sind. Die Germinative cells sind eine Population von undifferenzierten Zellen mit ähnlicher Morphologie, die eine hohe Zahl an Transkripten einer neuen Retrotransposonfamilie (ta-TRIMs) exprimieren. Experimente nach Behandlung mit Hydroxyurea deuten darauf hin, dass einzelne Germinative cells die Fähigkeit haben sich selbst zu erneuern. Allerdings, zeigen die Germinative cells auch Heterogenität auf molekurarer Ebene, da nur manche von Ihnen konservierte Homologe von fgfr, nanos und argonaute Genen exprimieren, was auf die Existenz eindeutiger Subpopulationen hinweist. Im Gegensatz zu Turbellarien fehlen den Germinative cells von Zestoden “Chromatoid bodies”, weiterhin fehlen dem Genom der Zestoden Orthologe von piwi und vasa und es werden einige Neoblastenmarker in den Metazestodenvesikeln von E. multilocularis umfassend exprimiert. All diese Ergebnisse zeigen deutliche Unterschiede zwischen den Stammzellsystemen von Turbellarien und Zestoden auf. Ich beschreibe ausserdem molekulare Marker für differenzierte Zelltypen, inklusive solche des Nervensystems. Mit diesen Markern wurde ein Nervennetz in Metazestodenvesikeln endeckt, das bis dato unbeschrieben war. Da die Vesikel unbeweglich sind und ihr Nervennetz unabhängig vom Nervensystem des Protoscolex ist wird angenommen dass es als Neuroendokrinsystem dient. Mit Hilfe von Genomanalysen wurden 22 Neuropeptidgene im Genom von E. multilocularis entdeckt. Viele von ihnen werden sowohl in Metazestodenvesiklen exprimiert als auch in Primärzellpräparationen, die zu kompletten Vesikeln regenerieren. Das weist auf eine mögliche Rolle dieser Gene in der Metazestodenentwicklung hin. Einhergehend mit dieser Hypothese war ein putatives Neuropeptid (RGFIamide) in der Lage die Vermehrung von Primärzellen bei einer Konzentration von 10-7 M zu stimulieren, dabei war das korrespondierende Gen während der Metazestodenregeneration hochreguliert. KW - Fuchsbandwurm KW - Echinococcus multilocularis KW - Stammzelle KW - Larve Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105040 ER - TY - THES A1 - Chen, Wenchun T1 - Studies on the role of calcium channels and the kinase domain of transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) in platelet function T1 - Studien über die Rolle von Calcium Kanälen und der Kinase Dömane von transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) für die Thrombozytenfunktion N2 - Platelet activation and aggregation are essential processes for the sealing of injured vessel walls and preventing blood loss. Under pathological conditions, however, platelet aggregation can lead to uncontrolled thrombus formation, resulting in irreversible vessel occlusion. Therefore, precise regulation of platelet activation is required to ensure efficient platelet plug formation and wound sealing but also to prevent uncontrolled thrombus formation. Rapid elevations in the intracellular levels of cations are a core signaling event during platelet activation. In this thesis, the roles of Ca2+ and Mg2+ channels in the regulation of platelet function were investigated. Orai1, the major store-operated calcium (SOC) channel in platelets, is not only vital for diverse signaling pathways, but may also regulate receptor-operated calcium entry (ROCE). The coupling between the Orai1 signalosome and canonical transient receptor potential channel (TRPC) isoforms has been suggested as an essential step in the activation of store-operated calcium entry (SOCE) and ROCE in human platelets. However, the functional significance of the biochemical interaction between Orai and TRPC isoforms still remains to be answered. In the first part of this thesis, the functional crosstalk between Orai1 and TRPC6 was addressed. Orai1-mediated SOCE was found to enhance the activity of phospholipases (PL) C and D, to increase diacylglycerol (DAG) production and finally to regulate TRPC6-mediated ROCE via DAG, indicating that the regulation of TRPC6 channel activity seems to be independent of the physical interaction with Orai1. Furthermore, Orai1 and TRPC6 double deficiency led to a reduced Ca2+ store content and basal cytoplasmic Ca2+ concentrations, but surprisingly also enhanced ATP secretion, which may enhance Ca2+ influx via P2X1 and compensate for the severe Ca2+ deficits seen in double mutant platelets. In addition, Orai1 and TRPC6 were not essential for G protein-coupled receptor (GPCR)-mediated platelet activation, aggregation and thrombus formation. Transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) contains a cytosolic serine/threonine protein kinase. To date, a few in vitro substrates of the TRPM7 kinase have been identified, however, the physiological role of the kinase remains unknown. In the second part of this thesis, mice with a point mutation which blocks the catalytic activity of the TRPM7 kinase (Trpm7KI) were used to study the role of the TRPM7 kinase in platelet function. In Trpm7KI platelets phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) metabolism and Ca2+ mobilization were severely impaired upon glycoprotein (GP) VI activation, indicating that the TRPM7 kinase regulates PLC function. This signaling defect in Trpm7KI platelets resulted in impaired aggregate formation under flow and protected animals from arterial thrombosis and ischemic brain infarction. Altogether, these results highlight the kinase domain of TRPM7 as a pivotal signaling moiety implicated in the pathogenesis of thrombosis and cerebrovascular events. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten sind zwei elementare Prozesse für das Abdichten verletzter Gefäßwände und damit zur Verhinderung von exzessivem Blutverlust. Unter pathologischen Bedingungen kann die Thrombozytenaggregation jedoch zur unkontrollierten Thrombusbildung und folglich zum irreversiblen Gefäßverschluss führen. Daher ist eine präzise Regulation der Thrombozytenaktivierung wichtig, um effizient Gefäßverletzungen zu schließen aber gleichzeitig eine unkontrollierte Thrombusbildung zu verhindern. Schnelle Veränderungen der zytoplasmatischen Konztentration von Kationen stellen ein Kernelement der Signaltransduktion während der Plättchenaktivierung dar. In dieser Arbeit wurden die Rolle von Ca2+ und Mg2+ Kanälen in der Regulation der Thrombozytenfunktion untersucht. Orai1, der bedeutendste store-operated calcium (SOC) Kanal in Thrombozyten, ist nicht nur entscheidend für verschiedene Signalwege, sondern reguliert möglicherweise auch receptor-operated calcium entry (ROCE). Die Kopplung zwischen dem Orai1-Signalkomplex und canonical transient receptor potential channel (TRPC) Isoformen wurde als entscheidender Schritt in der Aktivierung in der Aktivierung von store-operated calcium entry (SOCE) und ROCE in humanen Thrombozyten vermutet. Die Frage nach der funktionellen Relevanz der Interaktion zwischen Orai und TRPC Isoformen blieb jedoch unbeantwortet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der funktionelle Crosstalk zwischen Orai1 und TRPC6 adressiert. Hierbei zeigte sich, das Orai1-vermittelter SOCE die Aktivität der Phosholipasen (PL) C und D steigert, die Diacylglycerol (DAG) Produktion verstärkt und schließlich TRPC6-vermittelten ROCE via DAG reguliert, was darauf hindeutet, dass die Regulation der TRPC6 Kanalaktivität unabhängig von einer direkten Interaktion mit Orai1 zu sein scheint. Darüber hinaus führte die Doppeldefizienz von Orai1 und TRPC6 zu verringerten Ca2+ Konzentrationen in intrazellulären Ca2+-Speichern und im Zytoplasma der Thrombozyten. Überraschenderweise war auch die ATP-Sekretion erhöht, was eventuell den Ca2+-Einstrom durch P2X1 verstärkt und möglicherweise das starke Ca2+-Defizit in den doppeldefizienten Thrombozyten kompensiert. Außerdem wurde gezeigt, dass Orai1 und TRPC6 nicht für die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten sowie für die Thrombusbildung mittlels G protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) benötigt werden. Transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) enthält eine zytosolische Serin/Threonin-Kinase Domain. Bislang wurden zwar wenige in vitro Substrate der TRPM7 Kinase identifiziert, jedoch ist die physiologische Rolle dieser Kinase immer noch unbekannt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Mäuse mit einer Punktmutation, welche die katalytische Aktivität der TRPM7 Kinase blockiert (Trpm7KI) eingesetzt um die Rolle der TRPM7 Kinase für die Funktion von Thrombozyten zu untersuchen. In Trpm7KI Thrombozyten war der Metabolismus von phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) und die Ca2+-Mobilisierung nach Aktivierung des Rezeptors Glykoprotein (GP) VI schwer beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass die Aktivität der TRPM7 Kinase die Funktion der PLC reguliert. Aus diesem Signaltransduktionsdefekt in Trpm7KI Thrombozyten resultierte eine verringerte Aggregatbildung unter Flussbedingungen und ein Schutz der Tiere vor arteriellen Thrombosen und ischämischem Schlaganfall. Zusammenfassend heben diese Ergebnisse die Kinasedomäne von TRPM7 als einen ausschlaggebenden Bestandteil in Signalkaskaden hervor und implizieren eine Rolle dieser Domäne in der Pathogenese von ischämischen Kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen. KW - Thrombozyt KW - Calciumkanal KW - Protein TRPC6 KW - Platelet KW - Orai1 KW - Crosstalk KW - TRPM7 kinase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103719 ER - TY - THES A1 - Weber, David T1 - Hey target gene regulation in embryonic stem cells and cardiomyocytes T1 - Regulation von Hey Zielgenen in embryonalen Stammzellen und Kardiomyozyten N2 - The Notch signaling pathway is crucial for mammalian heart development. It controls cell-fate decisions, coordinates patterning processes and regulates proliferation and differentiation. Critical Notch effectors are Hey bHLH transcription factors (TF) that are expressed in atrial (Hey1) and ventricular (Hey2) cardiomyocytes (CM) and in the developing endocardium (Hey1/2/L). The importance of Hey proteins for cardiac development is demonstrated by knockout (KO) mice, which suffer from lethal cardiac defects, such as ventricular septum defects (VSD), valve defects and cardiomyopathy. Despite this clear functional relevance, little is known about Hey downstream targets in the heart and the molecular mechanism by which they are regulated. Here, I use a cell culture system with inducible Hey1, Hey2 or HeyL expression to study Hey target gene regulation in HEK293 cells, in murine embryonic stem cells (ESC) and in ESC derived CM. In HEK293 cells, I could show that genome wide binding sites largely overlap between all three Hey proteins, but HeyL has many additional binding sites that are not bound by Hey1 or Hey2. Shared binding sites are located close to transcription start sites (TSS) where Hey proteins preferentially bind to canonical E boxes, although more loosely defined modes of binding exist. Additional sites only bound by HeyL are more scattered across the genome. The ability of HeyL to bind these sites depends on the C-terminal part of the protein. Although there are genes which are differently regulated by HeyL, it is unclear whether this regulation results from binding of additional sites by HeyL. Additionally, Hey target gene regulation was studied in ESC and differentiated CM, which are more relevant for the observed cardiac phenotypes. ESC derived CM contract in culture and are positive for typical cardiac markers by qRT PCR and staining. According to these markers differentiation is unaffected by prolonged Hey1 or Hey2 overexpression. Regulated genes are largely redundant between Hey1 and Hey2. These are mainly other TF involved in e.g. developmental processes, apoptosis, cell migration and cell cycle. Many target genes are cell type specifically regulated causing a shift in Hey repression of genes involved in cell migration in ESC to repression of genes involved in cell cycle in CM. The number of Hey binding sites is reduced in CM and HEK293 cells compared to ESC, most likely due to more regions of dense chromatin in differentiated cells. Binding sites are enriched at the proximal promoters of down-regulated genes, compared to up-or non-regulated genes. This indicates that up-regulation primarily results from indirect effects, while down-regulation is the direct results of Hey binding to target promoters. The extent of repression generally correlates with the amount of Hey binding and subsequent recruitment of histone deacetylases (Hdac) to target promoters resulting in histone H3 deacetylation. However, in CM the repressive effect of Hey binding on a subset of genes can be annulled, likely due to binding of cardiac specific activators like Srf, Nkx2-5 and Gata4. These factors seem not to interfere with Hey binding in CM, but they recruit histone acetylases such as p300 that may counteract Hey mediated histone H3 deacetylation. Such a scenario explains differential regulation of Hey target genes between ESC and CM resulting in gene and cell-type specific regulation. N2 - Der Notch Signalweg ist essenziell für die Herzentwicklung in Säugetieren. Er kontrolliert Zell-differenzierung, koordiniert Musterbildungsprozesse und reguliert Proliferation und Differenzierung. Kritische Notch Effektoren sind Hey bHLH Transkriptionsfaktoren, welche im Herzen in atrialen (Hey1) und ventrikulären (Hey2) Kardiomyozyten und dem sich entwickelnden Endokardium (Hey1/2/L) exprimiert werden. Die Bedeutung von Hey Proteinen während der Herzentwicklung wird an Hand von verschiedenen KO Mäusen ersichtlich, welche letale Herzdefekte, wie ventrikuläre Septumdefekte, Herzklappendefekte und Kardiomyopathien, entwickeln. Trotz dieser klaren funktionalen Relevanz ist wenig über Hey Zielgene im Herzen und den molekularen Mechanismus bekannt, über den diese reguliert werden. Hier wurde ein Zellkultursystem mit induzierbarer Expression von Hey1, Hey2 oder HeyL verwendet, um Hey Zielgene in HEK293, murinen embryonalen Stammzellen und in differenzierten Kardiomyozyten zu studieren. In HEK293 Zellen konnte ich zeigen, dass die Bindestellen im Genom weitestgehend zwischen allen drei Hey Proteinen überlappen, HeyL jedoch viele zusätzliche Bindestellen aufweist, welche weder von Hey1 noch Hey2 gebunden werden. Gemeinsame Bindestellen befinden sich nahe Transkriptionsstartstellen, präferentiell an kanonische E boxen. Die nur von HeyL gebunden Bindestellen sind mehr über das Genom verteilt. Dabei ist die Fähigkeit von HeyL diese Stellen zu binden vom C-terminalen Teil abhängig. Obwohl es Gene gibt, die unterschiedlich von HeyL reguliert werden, ist es auf Grund der sehr viel größeren Anzahl an HeyL Bindestellen unklar, ob diese Regulation das Resultat von zusätzlicher HeyL Bindung ist. Zusätzlich wurde die Regulation von Hey Zielgenen in embryonalen Stammzellen und differenzierten Kardiomyozyten untersucht, da diese Zellen für die beobachteten kardialen Phänotypen relevanter sind. Differenzierte Kardiomyozyten kontrahieren in Kultur und sind positiv für typische kardiale Marker an Hand von qRT-PCR und Färbungen. Nach diesen Markern ist die Differenzierung durch kontinuierliche Überexpression von Hey1 oder Hey2 unverändert. Die Hey1 und Hey2 regulierten Gene sind weitestgehend redundant. Viele Zielgene sind andere Transkriptionsfaktoren, die zum Beispiel an Entwicklungsprozessen, Apoptose, Zellmigration und dem Zellzyklus beteiligt sind. Diese werden oft Zelltyp spezifisch reguliert, was zur Folge hat, dass in embryonalen Stammzellen auch an der Zellmigration beteiligte Gene reprimiert werden, während es in Kardiomyozyten vor allem Gene sind, die den Zellzyklus betreffen. Die Zahl der Hey Bindestellen ist in Kardiomyozyten und HEK293 Zellen verglichen mit embryonalen Stammzellen reduziert, höchstwahrscheinlich da differenzierte Zellen weniger offenes Chromatin besitzen. Die Bindestellen sind in reprimierten Genen verglichen mit induzierten oder nicht regulierten Genen angereichert. Dies deutet an, dass eine Induktion meist durch indirekte Effekte zu Stande kommt, während eine Repression das direkte Ergebnis der Hey Bindung an Zielpromotoren ist. Die Stärke der Repression korreliert dabei generell mit der Menge an Promoter gebundenem Hey Protein, welches Histon-Deacetylasen rekrutiert und zu einer Reduktion der Histon H3 Acetylierung führt. In Kardiomoyzyten wird der repressive Effekt von Hey für bestimmte Gene unterbunden, wahrscheinlich durch Bindung herzspezifischer Aktivatoren, wie Srf, Nkx2 5 und Gata4. Diese Faktoren scheinen nicht die Bindung von Hey zu beeinflussen, aber sie rekrutieren Acetylasen wie p300, welche Hey vermittelter Histon H3 Deacetylierung entgegenwirken. Dieses Model erklärt die unterschiedliche Regulation von Hey Zielgenen zwischen embryonalen Stammzellen und Kardiomyozyten. KW - Transkriptionsfaktor KW - Gen notch KW - Gene regulation KW - Notch signalling KW - Hey proteins KW - Genregulation KW - Notch Signalweg KW - Hey Proteine Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101663 ER - TY - THES A1 - Jordan Garrote, Ana-Laura T1 - The role of host dendritic cells during the effector phase of intestinal graft-versus-host disease T1 - Die Rolle der dendritischen Zellen in der akuten intestinalen Graft-versus-Host Reaktion N2 - Monocytes can be functionally divided in two subsets, both capable to differentiate into dendritic cells (DCs): CX3CR1loCCR2+ classical monocytes, actively recruited to the sites of inflammation and direct precursors of inflammatory DCs; and CX3CR1hiCCR2− non-classical monocytes, characterized by CX3CR1-dependent recruitment to non-inflamed tissues. Yet, the function of non-classical monocyte-derived DCs (nc-mo-DCs), and the factors, which trigger their recruitment and DC differentiation, have not been clearly defined to date. Here we show that in situ differentiated nc-moDCs mediate immunosuppression in the context of intestinal graft-versus-host disease (GVHD). Employing multi-color confocal microscopy we observed a dramatic loss of steady state host-type CD103+ DC subset immediately after transplantation, followed by an enrichment of immune-regulatory CD11b+ nc-moDCs. Parabiosis experiments revealed that tissue-resident non-classical CX3CR1+ monocytes differentiated in situ into intestinal CD11b+ nc-moDCs after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). Differentiation of this intestinal DC subset depended on CSF-1 but not on Flt3L, thus defining the precursors as monocytes and not pre-DCs. Importantly, CX3CR1 but not CCR2 was required for this DC subset differentiation, hence defining the precursors as non-classical monocytes. In addition, we identify PD-L1 expression by CX3CR1+ nc-moDCs as the major mechanism they employ to suppress alloreactive T cells during acute intestinal GVHD. All together, we demonstrate that host nc-moDCs surprisingly mediate immunosuppression in the context of murine intestinal GVHD – as opposed to classical “inflammatory” monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) – via coinhibitory signaling. This thorough study unravels for the first time a biological function of a - so far only in vitro and phenotypically described - DC subset. Our identification of this beneficial immunoregulatory DC subset points towards alternate future strategies in underpinning molecular pathways to foster their function. We describe an unexpected mechanism of nc-moDCs in allo-HCT and intestinal GVHD, which might also be important for autoimmune disorders or infections of the gastrointestinal tract. N2 - Monozyten (MO) lassen sich funktionell in zwei Subpopulationen unterteilen, die sich in dendritische Zellen (DC) differenzieren können: 1) Klassische Monozyten (CX3CR1loCCR2+), die direkte Vorläuferzellen von inflammatorischen DCs (mo-DCs) sind und aktiv an die Stelle der Entzündung rekrutiert werden und 2) nicht-klassische Monozyten (CX3CR1hiCCR2−). Bisher ist weder die Funktion der, aus nicht-klassischen Monozyten abstammenden, DC-Subpopulation (nc-mo-DCs) bekannt, noch ist geklärt, welche Faktoren die Ausdifferenzierung und die Rekrutierung der nc-mo-DCs in periphere Gewebe ermöglichen. In dieser Dissertationsarbeit zeige ich, dass nc-mo-DCs in situ differenzieren und in der akuten intestinalen Graft-versus-Host Erkrankung (GVHD) immunsuppressiv wirken. Konfokale Mikroskopie verdeutlichte den Rückgang der, im gesunden Gleichgewicht im intestinalen Gewebe dominierenden, CD103+ DCs direkt nach allogener hämatopoetischer Zelltransplantation (HCT) zugunsten immunregulatorischer CD11b+ nc-moDCs. Weiterhin zeigten Parabiose Experimente, dass nicht-klassische CX3CR1+ Monozyten im intestinalen Gewebe ansässig sind und sich nach allogener HCT in situ zu CD11b+ nc-moDCs ausdifferenzieren. Die Differenzierung findet in Abhängigkeit von CSF-1 und unabhängig von Flt3L statt, ein Beweis dafür, dass dieser Zelltyp aus Monozyten und nicht aus DC-Vorläuferzellen gebildet wird. Die Differenzierung dieser intestinalen DC Subpopulation hängt von CX3CR1, nicht jedoch von CCR2 ab, ein Beweis dafür, dass dieser Zelltyp aus nicht-klassischen Monozyten gebildet wird. Mechanistisch zeigen wir, dass nc-moDCs alloreaktive T-Zellen durch die Expression von PD-L1 supprimieren. Zusammenfassend beschreiben wir erstmalig nc-moDCs als neue DC Subpopluation, die im Mausmodell die intestinale GVHD unterdrückt und sich damit wesentlich von den bisher beschriebenen, klassischen proinflammatorischen mo-DCs unterscheidet. Die von den nc-moDCs vermittelte immunregulatorische Wirkung könnte weiterhin eine wichtige Rolle bei Autoimmunerkrankungen und Infektionen im Magen-Darm-Trakt spielen und sollte daher in zukünftigen Therapieansätzen berücksichtigt werden. KW - Knochenmarktransplantation KW - bone marrow transplantation KW - Immunologie KW - Dendritische Zellen KW - imunology KW - dendritic cells KW - Immunologie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102130 ER - TY - THES A1 - Karabeg, née Lee, Margherita Maria T1 - Differences and Similarities in the Impact of Different Types of Stress on Hippocampal Neuroplasticity in Serotonin Transporter Deficient Mice T1 - Unterschiede und Gemeinsamkeiten in den Auswirkungen verschiedener Arten von Stress auf die Neuroplastizität im Hippocampus von Mäusen mit fehlendem Serotonin Transporter N2 - Stress has been shown to influence neuroplasticity and is suspected to increase the risk for psychiatric disorders such as major depression and anxiety disorders. Additionally, the short variant of the human serotonin transporter (5-HTT) length polymorphism (5-HTTLPR) is suggested to increase the risk for the development of such disorders. While stress as well as serotonergic signaling are not only discussed to be involved in the development of psychiatric disorders, they are also known to influence hippocampal adult neurogenesis (aN). Therefore, it has long been suspected that aN is involved in the etiology of these illnesses. The exact role of aN in this context however, still remains to be clarified. In the present doctoral thesis, I am introducing two different studies, which had been carried out to assess possible changes in neuroplasticity and behavior as a result of 5-HTT genotype by stress interactions. In both studies, animals of the 5-HTT knock-out (5-HTT-/-) mouse line were used, which have been found to exhibit increased anxiety- and depression-related behavior, an altered stress response and decreased aggressive behavior. The aim of the first study, the so-called Spatial Learning study, had been to evaluate whether mice with altered levels of brain 5-HT as a consequence of lifelong 5-HTT deficiency perform differently in two spatial memory tests, the Morris Water Maze (WM) and the Barnes Maze (BM) test prospectively differing in aversiveness. Mice of the Spatial Learning study were of male sex and six months of age, and where subjected to a total of 10 (BM) or 15 (WM) trials. My particular interest was to elucidate if there are genotype by treatment interactions regarding blood plasma corticosterone levels and, if neurobiological equivalents in the brain to the found behavioral differences exist. For this purpose I carried out a quantitative immunohistochemistry study, investigating stem cell proliferation (via the marker Ki67) and aN (via the immature neuron marker NeuroD), as well as expression of the two immediate early genes (IEGs) Arc and cFos as a markers for neuronal activity in the hippocampus. The aim of the second study, the chronic mild stress (CMS) study had been to evaluate whether the innate divergent depression-like and anxiety-like behavior of mice with altered levels of brain 5-HT as a consequence of 5-HTT-deficiency is altered any further after being subjected to a CMS paradigm. Two cohorts of one-year-old female mice had been subjected to a variety of unpredictable stressors. In order to exclude possible interfering influences of behavioral testing on corticosterone levels and the outcome of the quantitative immunohistochemistry study the first cohort had been behaviorally tested after CMS while the second one had remained behaviorally untested. The objective of my part of the study was to find out about possible genotype by treatment interactions regarding blood plasma corticosterone as well as regarding aN in the hippocampus of the mice that had been subjected to CMS. For this purpose I performed a quantitative immunohistochemistry study in order to investigate the phenomenon of adult neurogenesis (via Ki67, NeuroD and the immature neuron marker DCX). Both studies led to interesting results. In the CMS study, we could not replicate the increased innate anxiety- and depression-like behavior in 5-HTT-/- mice known from the literature. However, with regard to the also well documented reduced locomotor activity, as well as the increased body weight of 5-HTT-/- mice compared to their 5-HTT+/- and 5-HTT+/+ littermates, we could demonstrate that CMS leads to increased explorative behavior in the Open Field Test and the Light/Dark Box primarily in 5-HTT+/- und 5-HTT+/+ mice. The Spatial learning study revealed that increased stress sensitivity of 5-HTT-/- mice leads to a poorer performance in the WM test in relation to their 5-HTT+/+ and 5-HTT+/- littermates. As the performance of 5-HTT-/- mice in the less aversive BM was undistinguishable from both other genotypes, we concluded that the spatial learning ability of 5-HTT-/- mice is comparable to that of both other genotypes. As far as stress reactivity is concerned, the experience of a single trial of either the WM or the BM resulted in increased plasma corticosterone levels, irrespective of the 5-HTT genotype. After several trials 5-HTT-/- mice exhibited higher corticosterone concentrations compared with both other genotypes in both tests. Blood plasma corticosterone levels were highest in 5-HTT-/- mice tested in the WM indicating greater aversiveness of the WM and a greater stress sensitivity of 5-HTT deficient mice. In the CMS study, the corticosterone assessment of mice of cohort 1, which had undergone behavioral testing before sacrifice, resulted in significantly elevated corticosterone levels in 5-HTT-/- mice in relation to their 5-HTT+/+ controls. Contrary, corticosterone levels in mice of cohort 1, which had remained behaviorally untested, were shown to be elevated / increased after CMS experience regardless of the 5-HTT genotype. Regarding neuroplasticity, the Spatial Learning study revealed higher baseline levels of cFos- and Arc-ir cells as well as more proliferation (Ki67-ir cells) and higher numbers of neuronal progenitor cells (NeuroD-ir cells) in 5-HTT-/- compared to 5-HTT+/+ mice. Moreover, in 5-HTT-/- mice we could demonstrate that learning performance in the WM correlates with the extent of aN. The CMS study, in which aN (DCX-ir cells), has also been found to be increased in 5-HTT-/- mice compared to their 5-HTT+/+ littermates, yet only in control animals, did show hampered proliferation (Ki67-ir cells) in the hippocampus of all 5-HTT genotypes following CMS experience. Interestingly, the number of immature neurons (DCX-ir cells) was diminished exclusively in 5-HTT-/- mice in response to CMS. From the Spatial Learning study we concluded, that increased IEG expression and aN levels observed in the hippocampus of 5-HTT deficient mice can be the neurobiological correlate of emotion circuit dysfunction and heightened anxiety of these mice and that 5-HTT-/- animals per se display a “stressed” phenotype as a consequence of long-life 5-HTT deficiency. Due to the different age and sex of the mice in the two studies, they cannot be compared easily. However, although the results of the CMS study seem to contradict the results of the Spatial Learning study at the first glance, they do support the conclusion of the Spatial Learning study by demonstrating that although CMS does have an impact on 5-HTT-/- mice on the neurobiological level (e.g. manifesting in a decrease of DXC-ir cells following CMS) CMS experience cannot add onto their heightened inborn stress-level and is almost ineffective regarding further changes of the behavior of 5-HTT-deficient mice. I thus propose, that 5-HTT-/- mice as a result of lifelong altered 5-HT signaling display a stressed phenotype which resembles a state of lethargy and is paralleled by baseline heightened IEG expression and aN. It cannot be altered or increased by CMS, but it becomes most visible in stressful situations such as repeated spatial learning tests like the WM in which locomotor activity is required. N2 - Es ist bekannt, dass Stress die Neuroplastizität beeinflusst und es wird vermutet, dass dieser das Risiko erhöht eine psychische Erkrankung wie Depressionen oder Angststörungen zu entwickeln. Daneben wurde auch die kurze Variante des menschlichen Serotonintransporter (5-HTT)-Gens mit einem erhöhten Risiko für psychische Erkrankungen assoziiert. Stress und 5-HT werden jedoch nicht nur mit psychischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, sondern sie sind auch bekannt dafür, dass sie die hippocampale adulte Neurogenese (aN) beeinflussen. Nicht zuletzt deswegen wird seit langem vermutet, dass die aN an der Ätiologie dieser Erkrankungen beteiligt ist. Dabei ist jedoch noch unklar, welche Rolle die aN hierbei spielt. In der vorliegenden Doktorarbeit stelle ich zwei verschiedene Studien vor, die durchgeführt wurden um mögliche Veränderungen in der Neuroplastizität und dem Verhalten aufgrund von Interaktionen zwischen dem 5-HTT Genotyp und Stress zu erforschen. In beiden Studien wurden Tiere der 5-HTT knock-out (5-HTT-/-) Mauslinie verwendet, die bekannt dafür sind, erhöhtes depressions- und angstähnliches Verhalten, sowie eine veränderte Stressantwort und verringertes aggressives Verhalten zu zeigen. Das Ziel der ersten Studie, der sogenannten Spatial Learning-Studie, war es herauszufinden ob Mäuse, die aufgrund des lebenslangen Fehlens des 5-HTT einen veränderten 5-HT-Spiegel besitzen, im Morris Water Maze (WM) und dem Barnes Maze (BM), zwei Verhaltenstests, die das räumliche Gedächtnis überprüfen und sich potenziell in ihrer Aversivität unterscheiden, ein verändertes Verhalten zeigen. Die Mäuse der Spatial Learing-Studie waren männlich, sechs Monate alt und waren im Ganzen zehnmal dem BM und fünfzehnmal dem WM unterzogen worden. Mein spezielles Interesse galt der Untersuchung ob es Interaktionen zwischen Genotyp und Testbedingung gibt, die sich auf den Kortikosteron-Spiegel sowie auf neurobiologischer Ebene auswirken. Zu diesem Zweck führte ich eine quantitative immunhistologische Studie durch. In dieser untersuchte ich die hippocampale aN auf Ebene der Stammzellproliferation (über den Marker Ki67) und auf Ebene von jungen unreifen Neuronen (über neuronalen Vorläuferzell-Marker NeuroD) sowie die Expression der beiden Immediate Early Genes (IEGs) Arc und cFos, als Marker für neuronale Aktivität im Hippocampus. Das Ziel der zweiten Studie, in der Mäuse unterschiedlichen 5-HTT-Genotyps chronisch mildem Stress (chronic mild stress, CMS) ausgesetzt wurden, war es herauszufinden, ob das angeborene, verstärkte depressions- und angstähnliche Verhalten von 5-HTT-defizienten Mäusen noch weiter durch den CMS moduliert wird. Hierfür wurden zwei Kohorten von einjährigen weiblichen Mäusen unterschiedlichen 5-HTT-Genotyps einer Auswahl an unvorhersehbaren Stressoren ausgesetzt. Die Mäuse der ersten Kohorte wurden nach dem CMS noch verschiedenen Verhaltenstests unterzogen, während die Mäuse der zweiten Kohorte nicht auf ihr Verhalten hin getestet wurden. Meine Aufgabe in dieser Studie zielte darauf, mögliche Interaktionseffekte zwischen dem 5-HTT-Genotyp und der Behandlung mit CMS in Bezug auf den Kortikosteron-Spiegel im Blutplasma sowie auf die aN im Hippocampus zu finden. Die aN wurde mithilfe der quantitativen Immunhistochemie und verschiedenen Markern einzelner aN-Stadien wie z.B. Ki67, NeuroD sowie DCX untersucht. Beide Studien führten zu interessanten Ergebnissen. Das aus der Literatur bekannte verstärkte depressions- und angstähnliche Verhalten der 5-HTT-/- Mäuse konnte im Rahmen unserer CMS-Studie nicht repliziert werden. Jedoch gelang uns bezüglich der bereits von mehreren Studien ebenfalls dokumentierten reduzierten lokomotiorischen Aktivität, als auch dem erhöhten Gewicht der 5-HTT-/-- im Vergleich zu den 5-HTT+/+-Mäusen der Nachweis, dass CMS vor allem in 5-HTT+/- und 5-HTT+/+ Mäusen zu vermehrtem explorativem Verhalten im Open Field Test und in der Light/Dark Box führt. Die Spatial Learning-Studie zeigte, dass 5-HTT-/- Mäuse im Vergleich zu 5-HTT+/+ Mäusen im der WM-Tests, aber nicht der BM-Tests, eine schlechter Leistung an den Tag legten, dass aber alle Mäuse unabhängig vom 5-HTT-Gentoyps gut räumlich lernen konnten. Im Hinblick auf die Stressantwort konnte gezeigt werden, dass ein einzelner Durchgang im WM oder BM zu einem vom 5-HTT-Genotyp unabhängigen Kortikosteronanstieg im Blutplasma führte. Mehrere Durchgänge resultierten jedoch in beiden Tests in Genotyp-abhängigen Unterschieden der Kortikosteronskonzentrationen. Diese waren 5-HTT-/- Mäusen im Vergleich zu 5-HTT+/- und 5-HTT+/+ Mäusen erhöht. Hierbei zeigten 5-HTT-/- Mäuse nach mehrfacher WM-Erfahrung, noch tendenziell höhere Kortikosteronkonzentrationen im Blutplasma als die Mäuse nach mehrfacher BM-Erfahrung, was auf eine höhere Aversivität des WM sowie eine höhere Stresssensitivität der 5-HTT-/- Mäuse hindeutet. In der CMS-Studie resultierte die Untersuchung von Mäusen der Kohorte 1, die vor ihrem Tod noch Verhaltenstests unterzogen worden waren, unabhängig von ihrer CMS-Erfahrung in signifikant erhöhten Kortikosteronkonzentrationen in 5-HTT-/- im Vergleich zu 5-HTT+/- und 5-HTT+/+ Mäusen. Im Gegensatz dazu waren die Kortikosteron-Werte der Kohorte 2, unabhängig vom Genotyp, in den CMS-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen siginikant erhöht. Die Untersuchung neuroplastischer Phänomene ergab im Rahmen der Spatial Learning-Studie in 5-HTT-/-, verglichen mit 5-HTT+/+-Mäusen, eine erhöhte Anzahl cFos- und Arc-immunreaktiven (ir) Zellen, eine erhöhte Anzahl neuronaler Vorläuferzellen (NeuroD-ir Zellen) sowie mehr proliferierende Zellen (Ki67-ir Zellen). Darüberhinaus konnte in 5-HTT-/- Mäusen gezeigt werden, dass die Leistung im WM-Test mit der Anzahl neu gebildeter junger Neurone korreliert, was für die funktionelle Relevanz der aN spricht. Auch in der CMS Studie, war die aN (DCX-ir Zellen) in 5-HTT-/- gegenüber 5-HTT+/+ Mäusen erhöht, wenn auch nur in Kontrolltieren. Außerdem konnte mit der CMS Studie gezeigt werden dass Stress, sowohl unabhängig vom Genotyp als auch in Interaktion mit dem 5-HTT-/- Genotyp, die Proliferation, sowie die Anzahl unreifer Neurone verringert. Aus den Ergebnissen der Spatial Learning-Studie folgerten wir, dass die Expression von IEGs und das Ausmaß der aN im Hippocampus von 5-HTT-defizienten Mäusen das neurobiologische Korrelat von erhöhter Ängstlichkeit sein könnte, da 5-HTT-/- Mäuse aufgrund des ihnen lebenslang fehlenden 5-HTT von sich aus einen gestressten Phänotyp mitbringen. Aufgrund des unterschiedlichen Alters und Geschlechts der Mäuse dieser beiden Studien ist es nicht leicht die Ergebnisse dieser beiden Studien zu vergleichen. Dennoch unterstützen sie die Schlussfolgerung der Spatial Learning-Studie, selbst wenn die Ergebnisse der CMS Studie denen der Spatial Learning-Studie auf den ersten Blick zu widersprechen scheinen. Und zwar zeigen die Ergebnisse, dass CMS, obwohl er sich neurobiologisch, in Form einer Verringerung von DCX-ir Zellen, auf 5-HTT-/- Mäuse auswirkt, nichts in punkto des angeborenen erhöhten Stress-Levels ausrichten kann und beinahe wirkungslos ist im Hinblick auf das Verhalten der 5-HTT-/- Mäuse. Aus alledem folgere ich, dass 5-HTT-defiziente Mäuse aufgrund ihrer lebenslang veränderten 5-HT-Homöostase einen gestressten Phänotyp aufweisen, welcher sich u.a. durch eine verstärkte Lethargie bemerkbar macht, parallel dazu zeichnen sich die 5-HTT-defizienten Mäuse durch eine verstärkte Expression von IEGs sowie durch erhöhte aN aus. Die genannte verstärkte Lethargie kann durch CMS nicht verändert oder verstärkt werden sondern wird in Situationen mit erhöhtem Stress, z. B. in Verhaltenstests wie dem WM, welche körperliche Aktivität voraussetzen, besonders leicht erkennbar. KW - Serotonin KW - Neuronale Plastizität KW - Maus KW - Stress KW - Serotonin Transporter KW - Chronic Mild Stres KW - Morris Water Maze KW - Neuroplasticity KW - Learning Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115831 ER - TY - THES A1 - Patil, Sandeep S. T1 - Oncolytic virotherapy and modulation of tumor microenvironment with vaccinia virus strains T1 - Onkolytische Virotherapie und Modulation des Tumormilieus mittels verschiedener Vaccinia Virus Typen N2 - Oncolytic viral therapies have shown great promise pre-clinically and in human clinical trials for the treatment of various cancers. Oncolytic viruses selectively infect and replicate in cancer cells, destroying tumor tissue via cell lysis, while leaving noncancerous tissues unharmed. Vaccinia virus (VACV) is arguably one of the safest viruses, which has been intensively studied in molecular biology and pathogenesis as a vaccine for the eradication of smallpox in more than 200 million people. It has fast and efficient replication, and cytoplasmic replication of the virus lessens the chance of recombination or integration of viral DNA into the genome of host cells. Anti-tumor therapeutic efficacy of VACV has been demonstrated for human cancers in xenograft models with a variety of tumor types. In addition recombinant oncolytic VACVs carrying imaging genes represent an advance in treatment strategy that combines tumor-specific therapeutics as well as diagnostics. As for other targeted therapies, a number of challenges remain for the clinical translation of oncolytic virotherapy. These challenges include the potential safety risk of replication of oncolytic virus in non-tumor tissue, the relatively poor virus spread throughout solid tumor tissue and the disadvantageous ratio between anti-viral and anti-tumoral immunity. However, manipulation of components of the tumor microenvironment may help oncolytic virus infection in killing the tumor tissue and thereby increasing the anti-tumor efficacy. Furthermore, dogs with natural cancer are considered as one of the best animal models to develop new drugs for cancer therapy. Traditionally, rodent cancer models have been used for development of cancer therapeutics. However, they do not adequately represent several features that define cancer in humans, including biology of initiation of tumor, the complexity of cancer recurrence and metastasis and outcomes to novel therapies. However, the tumor microenvironment, histopathology, molecular and genomics data from dog tumors has significant similarities with corresponding human tumors. These advantages of pet dog cancers provide a unique opportunity to integrate canine cancer patients in the studies designed for the development of new cancer drugs targeted against both human and canine cancers. This dissertation centers on the use of VACV strains in canine cancer xenografts with the aim of understanding the effects of modulation of tumor microenvironment on VACV-mediated tumor therapy. In the first studies, wild-type VACV strain LIVP6.1.1 was tested for its oncolytic efficiency in canine soft tissue sarcoma (STSA-1) and canine prostate carcinoma (DT08/40) cells in culture and xenografts models. LIVP6.1.1 infected, replicated within, and killed both STSA-1 and DT08/40 cells in cell culture. The replication of virus was more efficient in STSA-1 cells compared to DT08/40 cells. In xenograft mouse models, LIVP6.1.1 was safe and effective in regressing both STSA-1 and DT08/40 xenografts. However, tumor regression was faster in STSA-1 xenografts compared to DT08/40 xenografts presumably due to more efficient replication of virus in STSA-1 cells. Biodistribution profiles revealed persistence of virus in tumors 5 and 7 weeks post virus injection in STSA-1 and DT08/40 xenografts, respectively, with the virus mainly cleared from all other major organs. Immunofluorescence staining detected successful colonization of VACV in the tumor. Consequently, LIVP6.1.1 colonization in the tumor showed infiltration of innate immune cells mainly granulocytes and macrophages in STSA-1 tumor xenografts. These findings suggest that virotherapy-mediated anti-tumor mechanism in xenografts could be a combination of direct viral oncolysis of tumor cells and virus-dependent infiltration of tumor-associated host immune cells. In further studies, the effects of modulation of tumor angiogenesis of VACV therapy were analyzed in canine cancer xenografts. GLV-1h109 VACV strain (derived from prototype virus GLV-1h68) encoding the anti-VEGF single chain antibody GLAF-1 was characterized for its oncolytic efficacy in STSA-1 and DT08/40 cancer cells in culture and tumor xenografts. Concomitantly, the effects of locally expressed GLAF- 1 in tumors on virus replication, host immune infiltration, tumor vascularization and tumor growth were also evaluated. GLV-1h109 was shown to be similar to the parental virus GLV-1h68 in expression of the two marker genes that both virus strains have in common (Ruc-GFP and gusA) in cell cultures. Additionally, the anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 was expressed by GLV-1h109 in both cell cultures and tumor xenografts. The insertion of GLAF-1 did not significantly affect the replication and cytotoxicity of GLV-1h109 in the STSA-1 and DT08/40 cell lines, although at early time points (24-48 hpi), the replication of GLV-1h109 was higher in STSA-1 cells compared to DT08/40 cells. In addition, STSA-1 cells were more susceptible to lysis with GLV-1h109 than DT08/40 cells. GLV-1h109 achieved a significant inhibition of tumor growth in both STSA-1 and DT08/40 canine xenografts models. Consequently, the significant regression of tumor growth was initiated earlier in STSA-1 tumor xenografts compared to regression in DT08/40 xenografts. The reason for the higher efficacy of GLV-1h109 in STSA-1 xenografts than DT08/40 xenografts was attributed to more efficient replication of virus in STSA-1 cells. In addition, tumor-specific virus infection led to a continued presence of GLAF-1 in peripheral blood, which could be useful as a pharmacokinetic marker to monitor virus colonization and persistence in GLV-1h109- injected xenograft mice. GLAF-1 is a single-chain antibody targeting human and murine VEGF. It was demonstrated that GLAF-1 was functional and recognized both canine and human VEGF with equal efficiency. Histological analysis of tumor sections 7 days after GLV-1h109 injection confirmed that colonization of VACV and intratumoral expression of GLAF-1 translated into a significant decrease in blood vessel number compared to GLV-1h68 or PBS-treated control tumors. Subsequently, reduction in blood vessel density significantly improved the spread and replication of VACV as observed by FACS analysis and standard plaque assay, respectively. Inhibition of tumor angiogenesis and increased replication of virus further improved the infiltration of innate immune cells mainly granulocytes and macrophages in STSA-1 tumor xenografts. Both the results, i.e. improved virus spread and increased infiltration of innate immune cells in tumor, were explained by a phenomenon called “vascular normalization”, where anti-VEGF therapy normalizes the heterogeneous tumor vasculature thereby improving delivery and spread of VACV. In summary, the effects of inhibition of tumor angiogenesis on virus spread and replication were demonstrated using a vaccinia virus caring an anti- angiogenic payload targeting vascular endothelial growth factor (VEGF) in canine cancer xenografts. In the final studies, the effects of VACV therapy on modulation of the immune system were analyzed in canine cancer patients enrolled in a phase I clinical trial. V-VET1 (clinical grade LIVP6.1.1 VACV) injection significantly increased the percentages of CD3+CD8+ T lymphocytes at 21 days after initiation of treatment. CD3+CD8+ T lymphocytes are mainly cytotoxic T lymphocytes that have potential to lyse cancer cells. Subsequently, the frequency of immune suppressor cells, mainly MDSCs and Treg was also analyzed in peripheral blood of canine cancer patients. Increase in the MDSC population and decreased CD8/Treg ratio is known to have inhibitory effects on the functions of cytotoxic T cells. We demonstrated that injection of V-VET1 in canine cancer patients significantly reduced the percentages of MDSCs at 21 days post initiation of treatment. Additionally, CD8/Treg ratio was increased 21 days after initiation of V-VET1 treatment. We also showed that changes in the frequency of immune cells neither depends on dose of virus nor depends on tumor type according to the data observed from this clinical trial with eleven analyzed patients. This preclinical and clinical data have important clinical implications of how VACV therapy can be used for the treatment of canine cancers. Moreover, dogs with natural cancers can be used as an ideal animal model to improve the oncolytic virotherapy for human cancers. Furthermore, modulation of tumor microenvironment mainly tumor angiogenesis and tumor immunity has significant impact on the success of oncolytic virotherapy. N2 - Therapien für verschiedenste Krebsarten mittels onkolytischer Viren zeigten sowohl in präklinischen- als auch in humanen klinischen Studien ein erfolgversprechendes Potenzial. Onkolytische Viren infizieren selektiv Krebszellen und replizieren ausschließlich in diesen. In der Folge zerstören sie Tumorgewebe durch Zelllyse, während gesundes Gewebe unbeeinträchtigt bleibt. Das Vaccinia-Virus besitzt ein äußerst geringes Risikopotential, und wurde intensiv auf molekularbiologischer Ebene und in Bezug auf seine Pathogenese untersucht. All das qualifizierte es als Vakzin zur Ausrottung der Pocken und seit Markteinführung mehr als 200 Millionen Menschen injiziert. Das Vaccinia-Virus zeigt eine schnelle und effiziente Replikation, welche im Zytoplasma der Zelle stattfindet. Dies verringert die Möglichkeit der Rekombination oder Integration der viralen DNA in das Wirtsgenom. Die therapeutische Wirksamkeit onkolytischer Vaccinia-Viren (VACVs) wurde in humanen Xenograft-Mausmodellen mit unterschiedlichen Tumorarten gezeigt. Rekombinante onkolytische VACVs, welche mit fluoreszierenden Genen ausgestattet sind, kombinieren die Vorteile tumorspezifischer Therapeutika und dienen gleichzeitig als Diagnostika. Wie auch andere spezifische Therapien, steht auch die onkolytische Virustherapie vor einer Reihe von Herausforderungen. Dazu gehören die Replikation onkolytischer Viren in nicht-kanzerogenem Gewebe, relativ schlechte Virusverbreitung durch solides Tumorgewebe und ein unvorteilhaftes Verhältnis zwischen antiviraler und antitumoraler Immunität. Die gezielte Manipulation einzelner Komponenten des Tumormikromilieus kann jedoch zu einer verbesserten Virusinfektion und Lyse des Tumorgewebes führen und somit die Effizienz der antitumoralen Therapie verstärken. ... KW - Onkolyse KW - Vaccinia-Virus KW - Tumor microenvironment KW - Oncolytic Virotherapy Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99514 ER - TY - THES A1 - Kern, Selina Melanie T1 - Functional characterization of splicing-associated kinases in the blood stages of the malaria parasite Plasmodium falciparum T1 - Funktionelle Charakterisierung von Splicing-assoziierten Kinasen in den Blutstadien des Malariaerregers Plasmodium falciparum N2 - Besides HIV and tuberculosis, malaria still is one of the most devastating infectious diseases especially in developing countries, with Plasmodium falciparum being responsible for the frequently lethal form of malaria tropica. It is a major cause of mortality as well as morbidity, whereby pregnant women and children under the age of five years are most severely affected. Rapidly emerging drug resistances and the lack of an effective and safe vaccine hamper the combat against malaria by chemical and pharmacological regimens, and moreover the poor socio-economic and healthcare conditions in malaria-endemic countries are compromising the extermination of this deadly tropical disease to a large extent. Malaria research is still questing for druggable targets in the parasitic protozoan which pledge to be refractory against evolving resistance-mediating mutations and yet constitute affordable and compliant antimalarial chemotherapeutics. The parasite kinome consists of members that represent most eukaryotic protein kinase groups, but also contains several groups that can not be assigned to conservative ePK groups. Moreover, given the remarkable divergence of plasmodial kinases in respect to the human host kinome and the fact that several plasmodial kinases have been identified that are essential for the intraerythrocytic developmental cycle, these parasite enzymes represent auspicious targets for antimalarial regimens. Despite elaborate investigations on several other ePK groups, merely scant research has been conducted regarding the four identified members of the cyclin-dependent kinase-like kinase (CLK) family, PfCLK-1-4. In other eukaryotes, CLKs are involved in mRNA processing and splicing by means of phosphorylation of serine/arginine-rich (SR) proteins, which are crucial components of the splicing machinery in the alternative splicing pathway. All four PfCLKs are abundantly expressed in asexual parasites and gametocytes, and stage-specific expression profiles of PfCLK-1 and PfCLK-2 exhibited nucleus-associated localization and an association with phosphorylation activity. In the course of this study, PfCLK-3 and PfCLK-4 were functionally characterized by indirect immunofluorescence, Western blot analysis and kinase activity assays. These data confirm that the two kinases are primarily expressed in the nucleus of trophozoites and both kinases possess in vitro phosphorylation activity on physiological substrates. Likewise PfCLK-1 and PfCLK-2, reverse genetic studies exhibited the indispensability of both PfCLKs on the asexual life cycle of P. falciparum, rendering them as potential candidates for antiplasmodial strategies. Moreover, this study was conducted to identify putative SR proteins as substrates of all four PfCLKs. Previous alignments revealed a significant homology of the parasite CLKs to yeast SR protein kinase Sky1p. Kinase activity assays showed in vitro phosphorylation of the yeast Sky1p substrate and SR protein Npl3p by precipitated PfCLKs. In addition, four homologous plasmodial SR proteins were identified that are phosphorylated by PfCLKs in vitro: PfASF-1, PFSRSF12, PfSFRS4 and PfSR-1. All four parasite SR splicing factors are predominantly expressed in the nuclei of trophozoites. For PfCLK-1, a co-localization with the SR proteins was verified. Finally, a library of human and microbial CLK inhibitors and the antiseptic chlorhexidine (CHX) was screened to determine their inhibitory effect on different parasite life cycle stages and on the PfCLKs specifically. Five inhibitors out of 63 compounds from the investigated library were selected that show a moderate inhibition on asexual life cycle stages with IC50 values ranging between approximately 4 and 8 µM. Noteworthy, these inhibitors belong to the substance classes of aminopyrimidines or oxo-β-carbolines. Actually, the antibiotic compound CHX demonstrated an IC50 in the low nanomolar range. Stage-of-inhibition assays revealed that CHX severely affects the formation of schizonts. All of the selected CLKs inhibitors also affect gametocytogenesis as well as gametogenesis, as scrutinized in gametocyte toxicity assays and exflagellation assays, respectively. Kinase activity assays confirm a specific inhibition of CLK-mediated phosphorylation of all four kinases, when the CLK inhibitors are applied on immunoprecipitated PfCLKs. These findings on PfCLK-inhibiting compounds are initial attempts to determine putative antimalarial compounds targeting the PfCLKs. Moreover, these results provide an effective means to generate chemical kinase KOs in order to phenotypically study the role of the PfCLKs especially in splicing events and mRNA metabolism. This approach of functionally characterizing the CLKs in P. falciparum is of particular interest since the malarial spliceosome is still poorly understood and will gain further insight into the parasite splicing machinery. N2 - Neben HIV und Tuberkulose stellt Malaria vor allem in Entwicklungsländern immer noch eine der verheerendsten Infektionskrankheiten dar, wobei Plasmodium falciparum für die oft tödlich verlaufende Form der Malaria tropica verantwortlich ist. Sie ist eine der Hauptgründe für Mortalität und Morbitität, von der vor allem schwangere Frauen und Kinder unter fünf Jahren am schlimmsten betroffen sind. Das Fehlen eines effektiven und ungefährlichen Impfstoffes und sich schnell ausbreitende Medikamentenresistenzen erschweren die Bekämpfung von Malaria mit Arzneimitteln. Darüber hinaus beeinträchtigen die schlechten sozioökonomischen Bedingungen und der mangelhafte Zustand des Gesundheitssystems in Malaria-endemischen Ländern die Elimination dieser tödlichen Tropenkrankheit in hohem Maße. Die Malariaforschung ist immer noch auf der Suche nach vielversprechenden Angriffspunkten im Parasiten, die widerstandsfähig gegenüber sich entwickelnden resistenz-vermittelnden Mutationen sind und dennoch erschwingliche und verträgliche Chemotherapeutika gegen Malaria darstellen. Das Kinom des Parasiten besteht aus Vertretern der meisten eukaryotischen Proteinkinase-Gruppen und enthält zudem einige Gruppen, die keiner der konventionellen Gruppen zuordenbar sind. Darüber hinaus stellen Kinasen vielversprechende Angriffspunkte für Malariamedikamente dar, da das Parasitenkinom bemerkenswerte Divergenzen gegenüber dem Wirtskinom aufweist und zudem einige Parasitenkinasen identifiziert wurden, die unerlässlich für den Replikationszyklus von asexuellen Parasiten sind. Trotz umfangreicher Untersuchungen anderer Kinasegruppen des Parasiten wurden die vier identifizierten Vertreter der Zyklin-abhängige-Kinase-ähnlichen Kinasen (cyclin-dependent kinase-like kinases, CLKs) bisher kaum untersucht. In anderen Eukaryoten sind CLKs an der mRNA-Prozessierung und am Spleißen durch die Phosphorylierung von Serin/Arginin-reichen (SR-) Proteinen beteiligt, welche wiederum Komponenten der Spleißmaschinerie sind. Alle vier PfCLKs sind abundant exprimiert in asexuellen Parasiten sowie Gametozyten, und stadien-spezifische Expressionsprofile von PfCLK-1 und PfCLK-2 zeigten eine Kern-assoziierte Expression sowie Phosphorylierungsaktivität in in vitro-Aktivitätsstudien. Im Verlauf dieser Studie wurden PfCLK-3 und PfCLK-4 mittels indirekter Immunfluoreszenzstudien, Western Blot-Analysen und Kinaseaktivitätsassays funktionell charakterisiert. Die Ergebnisse bestätigen, dass beide Kinasen vorrangig im Nukleus von P. falciparum-Trophozoiten lokalisiert sind und Phosphorylierungsaktivität gegenüber physiologischen Substraten in vitro aufweisen. Ähnlich wie für PfCLK-1 und PfCLK-2 konnte in Reverse-Genetik-Studien gezeigt werden, dass sowohl PfCLK-3 als auch PfCLK-4 essentiell für den asexuellen Replikationszyklus von P. falciparum sind. Dieser Umstand macht beide Kinasen zu potenziellen Angriffspunkten für antiplasmodiale Bekämpfungsstrategien. Des Weiteren wurde diese Studie ausgeführt, um mögliche Interaktionspartner aller vier PfCLKs zu identifizieren. Vorangegangene Sequenzabgleiche brachten eine bemerkenswerte Homologie der Parasiten-CLKs zur SR-Proteinkinase Sky1p der Bäckerhefe zu Tage. Kinaseaktivitätsassays zeigten Phosphorylierung des Sky1p-Substrates und SR-Proteins Npl3p durch präzipitierte PfCLKs in vitro. Außerdem wurden vier homologe plasmodiale SR-Proteine bzw. mutmaßliche Spleißfaktoren identifiziert, die ebenso von den PfCLKs in vitro phosphoryliert werden: PfASF-1, PFSRSF12, PfSFRS4 und PfSR-1. Alle vier Parasiten-Spleißfaktoren sind vorwiegend in Kernen von Trophozoiten exprimiert. Für PfCLK-1 konnte eine Ko-Lokalisation mit den SR-Proteinen nachgewiesen werden. Abschließend wurden eine Sammlung humaner und mikrobieller CLK-Inhibitoren sowie das Antiseptikum Chlorhexidin (CHX) auf ihren hemmenden Effekt auf verschiedene Lebenszyklusstadien von P. falciparum und gezielt auf die PfCLKs überprüft. Es wurden fünf Inhibitoren aus einer Sammlung von 63 Substanzen auserwählt, die eine moderate Hemmung auf asexuelle Lebenszyklusstadien aufwiesen, mit IC50-Werten zwischen ungefähr 4 und 8 µM. Das Antibiotikum CHX zeigte sogar einen IC50-Wert im niedrigen nanomolaren Bereich. Nachfolgende Stage-of-Inhibition-Assays deckten auf, dass CHX die Entwicklung von Schizonten enorm beeinträchtigt. Wie in Gametozyten-Toxizitätsassays und Exflagellationsassays ermittelt wurde, hemmen alle ausgewählten CLK-Inhibitoren ferner sowohl die Gametozytogenese als auch die Gametogenese. Kinaseaktivitätsassays bestätigen eine spezifische Hemmung der CLK-vermittelten Phosphorylierung aller vier Kinasen, wenn die CLK-Inhibitoren auf immunopräzipitierte PfCLKs angewendet wurden. Diese Erkenntnisse über PfCLK-hemmende Substanzen sind erste Ansätze, um mögliche Wirkstoffe gegen Malaria zu finden, die die PfCLKs als Angriffspunkte haben. Zudem stellen diese Resultate ein wirksames Mittel zur Verfügung, um chemische Kinase-Knockout-Parasiten zu generieren. Diese können dann verwendet werden, um die Rolle der PfCLKs vor allen in Bezug auf Spleißvorgänge und mRNA-Metabolismus phänotypisch zu untersuchen. Der Ansatz, die CLKs des Parasiten funktionell zu charakterisieren, ist von besonderem Interesse, da das Spleißosom des Malariaparasiten immer noch nicht ausreichend erforscht ist. Dadurch können weitere Erkenntnisse über die Spleißmaschinerie des Parasiten gewonnen werden. KW - Plasmodium falciparum KW - Malaria tropica KW - Posttranskriptionelle Regulation KW - Kinasen KW - Splicing KW - SR proteins KW - Molekularbiologie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115219 ER - TY - THES A1 - Gonzalez-Leal, Iris Janet T1 - Roles of cathepsins B and L in the Th1/Th2 polarization by dendritic cells T1 - Die Rolle von Kathepsinen B und L während der Th1/Th2 Polarisierung durch Dendritische Zellen N2 - Leishmaniasis is a neglected tropical disease that can be manifested through different clinical forms, ranging from cutaneous to visceral. The host response against Leishmania spp. is greatly dependent on T cell-mediated immunity, in which T helper 1 responses are associated with macrophage activation and elimination of the parasite, while regulatory T cells and T helper 2 responses are correlated with parasite survival and persistence of infection. Leishmania uses different virulence factors as strategies for evading the immune response of the host. One of them are cathepsin-like cysteine proteases, which are currently under extensive investigation as targets for drug development. Previous studies with inhibitors of cathepsins B and L in vivo revealed an outstanding modulation of the host T helper cell response. However, the mechanisms behind these observations were not further investigated. Given the urgent need for better treatments against leishmaniasis, the aim of this study was to investigate the effects that the lack of cathepsin B and L activity have on the signals that dendritic cells use to instruct T helper cell polarization in response to infection with Leishmania major. The cathepsin inhibitors tested showed low or no cytotoxicity in bone marrow-derived dendritic cells, and dendritic cells and macrophages could be generated from cathepsin B and cathepsin L-deficient mice without apparent alterations in their phenotype in comparison to wild-type controls. Furthermore, lack of cathepsin B and L activity showed no impact in the rate of promastigote processing by dendritic cells. Cathepsin B and cathepsin L-deficient macrophages showed no differences in parasite proliferation and capacity to produce nitric oxide in comparison to wild-type macrophages. In response to the parasite, dendritic cells treated with a cathepsin B inhibitor and dendritic cells from cathepsin B-deficient mice showed higher levels of expression of major histocompatibility complex (MHC) class II molecules than dimethyl sulfoxide (DMSO) or wild-type controls, but it was not accompanied by changes in the expression of costimulatory molecules. Wild-type dendritic cells and macrophages are not able to express the pro-inflammatory cytokine interleukin (IL)-12 in response to promastigotes. However, cells treated with a cathepsin B inhibitor or cells deficient for cathepsin B were able to express IL-12, whilethe expression of other cytokines -including IL-6 and tumor necrosis factor (TNF)-alpha-remained unchanged. These characteristics point towards a more “pro-Th1” profile of dendritic cells in the absence of cathepsin B. This data is the first report on IL-12 regulation depending on cathepsin B. The IL-12 up-regulation observed was already present at the transcriptional level. Furthermore, it was also present in macrophages and dendritic cells in response to LPS, and the latter had a higher capacity to induce T cell helper 1 polarization in vitro than wild-type dendritic cells. The activation of different signaling pathways was analyzed, but the up-regulation of IL-12 could not be attributed to modulation of nuclear factor-kappaB (NFkappaB), p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) and extra-cellular signal-regulated kinase (ERK)1/2 pathways. Thus, the mechanism behind IL-12 regulation by cathepsin B remains to be elucidated, and the impact of these effects is yet to be confirmed in vivo. Altogether it is tempting to speculate that cathepsin B, in addition to its role in processing endocytosed material, is involved in the modulation of the pro-inflammatory cytokine IL-12. N2 - Leishmaniose ist eine hauptsächlich in den Tropen vorkommende Infektionskrankheit, die sich in verschiedenen klinischen Formen, von kutan bis viszeral, manifestieren kann. Die Reaktion des Wirtes gegen Leishmania spp. hängt stark von der T-Zell-vermittelten Immunantwort ab, wobei die Antwort der T1-Helferzellen assoziiert ist mit der Aktivierung von Makrophagen und der Beseitigung des Parasiten, während die regulatorischen T-Zellen und T2-Helferzellen mit dem Überleben der Parasiten und der Fortdauer der Infektion in Verbindung stehen. Leishmania verwendet verschiedene Virulenzfaktoren als Strategie zur Umgehung der Immunantwort des Wirtes. Darunter zählen Cathepsin-ähnliche Cysteinproteasen, die derzeit Gegenstand umfangreicher Untersuchungen sind mit dem Ziel, für die Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden zu können. Frühere Studien mit Inhibitoren von Cathepsin B und L in vivo zeigten eine hervorragende Modulation der Wirt-T-Helferzellantwort. Jedoch wurden die Mechanismen, die diesen Beobachtungen zu Grunde liegen, nicht weiter untersucht. Angesichts der dringenden Notwendigkeit einer besseren Behandlung gegen Leishmaniose war das Ziel dieser Studie die Auswirkungen zu untersuchen, die das Fehlen von Cathepsin B und L-Aktivität auf die Signale hat, welche die dendritischen Zellen verwenden, um die Reaktion der T-Helferzellen auf eine Infektion mit Leishmania major zu beeinflussen. Die getesteten Cathepsin-Inhibitoren zeigten geringe oder keine Cytotoxizität in den aus dem Knochenmark präparierten dendritischen Zellen. Dendritische Zellen und Makrophagen von Cathepsin B- und Cathepsin L-defizienten Mäusen zeigten keine offensichtlichen Veränderungen ihres Phänotyps im Vergleich zu Wildtypkontrollen. Weiterhin zeigte das Fehlen von Cathepsin B- und L-Aktivität keine Auswirkung auf die Prozessierung der Promastigoten durch dendritische Zellen. Auch zeigten Cathepsin Bund Cathepsin L-defiziente Makrophagen keine Unterschiede in der Parasitenproliferation und der Fähigkeit Stickoxid zu produzieren im Vergleich zu Wildtyp-Makrophagen. In Reaktion auf den Parasiten war bei mit einem Cathepsin-B-Inhibitor behandelten dendritischen Zellen und dendritischen Zellen von Cathepsin-B-defizienten Mäusen eine höhere Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen ersichtlich im Vergleich zu DMSO oder Wildtyp-Kontrollen, aber es wurden keine Veränderungen in der Expression von costimulatorischen Molekülen festgestellt. Dendritische Zellen und Makrophagen von Wildtyp-Mäusen sind nicht in der Lage das pro-inflammatorische Zytokin IL-12 als Reaktion auf die Promastigoten zu exprimieren. Jedoch konnten dendritische Zellen, die mit einem Cathepsin-B-Inhibitor behandelt waren oder Cathepsin-B-defiziente Zellen, IL-12 exprimieren, während die Expression von anderen Zytokinen - einschließlich IL-6 und TNF-alpha- unverändert blieb. Diese Eigenschaften weisen in die Richtung einer "pro-Th1"-Antwort der dendritischen Zellen in Abwesenheit von Cathepsin B. Diese Daten sind der erste Bericht über die IL-12-Regulierung in Abhängigkeit von Cathepsin B. Die Hochregulation von IL-12 war bereits auf der Transkriptionsebene zu beobachten. Weiterhin war sie in Makrophagen und dendritischen Zellen auch als Reaktion auf LPS vorhanden. Dendritische Zellen von Cathepsin B-defizienten Mäusen hatten eine höhere Kapazität zur Induktion einer eine T1-Helferzell-Polarisierung in vitro als dendritische Zellen von Wildtyp-Mäusen. Die Aktivierung von verschiedenen Signalwegen wurde untersucht, jedoch konnte die Hochregulierung von IL-12 nicht auf die Modulation von NF_B, p38 MAPK und ERK1/2-Signalwege zurückgeführt werden. Damit ist der für die IL-12-Regulierung durch Cathepsin B verantwortliche Mechanismus noch nicht geklärt; auch die Auswirkungen dieser Effekte in vivo müssen noch bestätigt werden. Insgesamt lässt die vorliegende Studie vermuten, dass Cathepsin B nicht nur an der Prozessierung von endozytiertem Material sondern auch an der Regulierung des pro-inflammatorischen Zytokins IL-12 beteiligt ist. KW - Leishmaniose KW - Dendritische Zelle KW - leishmaniasis KW - dendritic cells KW - th1/th2 polarization KW - T-Lymphozyt KW - Helferzelle KW - Immunologie KW - Infektionsbiologie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114397 ER - TY - THES A1 - Alrefai, Hani Gouda Alsaid T1 - Molecular Characterization of NFAT Transcription Factors in Experimental Mouse Models T1 - Molekulare Charakterisierung von NFAT-Transkriptionsfaktoren in experimentellen Mausmodellen N2 - In this work we wanted to investigate the role of NFATc1 in lymphocyte physiology and in pathological conditions (eg. psoriasis). NFATc1 is part of the signal transduction pathways that regulates B cells activation and function. NFATc1 has different isoforms that are due to different promoters (P1 and P2), polyadenylation and alternative splicing. Moreover, we tried to elucidate the points of interactions between the NFAT and the NF-κB pathways in activated B-cell fate. NFAT and NF-κB factors share several properties, such as a similar mode of induction and architecture in their DNA binding domain. We used mice which over-express a constitutive active version of NFATc1/α in their B cells with -or without- an ablated IRF4. IRF4 inhibits cell cycle progression of germinal center B cell-derived Burkitt’s lymphoma cells and induces terminal differentiation toward plasma cells. Our experiments showed that a ‘double hit’ in factors affecting B cell activation (NFATc1 in this case) and late B cell Differentiation (IRF4 in this case) alter the development of the B cells, lead to increase in their numbers and increase in stimulation induced proliferation. Therefore, the overall picture indicates a link between these 2 genes and probable carcinogenic alterations that may occur in B cells. We also show that in splenic B cells, c-Rel (of the NF-κB canonical pathway) Support the induction of NFATc1/αA through BCR signals. We also found evidence that the lack of NFATc1 affects the expression of Rel-B (of the NF-κB non-canonical pathway). These data suggest a tight interplay between NFATc1 and NF-κB in B cells, influencing the competence of B cells and their functions in peripheral tissues. We also used IMQ-induced psoriasis-like inflammation on mice which either lack NFATc1 from B cell. Psoriasis is a systemic chronic immunological disease characterized primarily by abnormal accelerated proliferation of the skin keratinocytes. In psoriasis, the precipitating event leads to immune cell activation. Our experiments showed that NFATc1 is needed for the development of psoriasis. It also showed that IL-10 is the link that enables NFAT from altering the B cell compartment (eg Bregs) in order to affect inflammation. The important role of B cell in psoriasis is supported by the flared up psoriasis-like inflammation in mice that lack B cells. Bregs is a special type of B cells that regulate other B cells and T cells; tuning the immunological response through immunomodulatory cytokines. N2 - Diese Arbeit befasst sich mit der Regulation und der Funktion des Transkriptionsfaktors NFATc1 (“nuclear factor of activated T-cells c1) in B-Lymphozyten. Hierzu wurde zum einen die transkriptionelle Kontrolle des Nfatc1-Gens in aktivierten B-Lymphozyten und zum anderen die Bedeutung dieses Faktors für die Wachstumskontrolle und Autoimmunität anhand verschiedener Modellsysteme analysiert. Sechs verschiedene NFATc1-Isoformen können in B-Lymphozyten durch die Nutzung zweier verschiedener Promotoren, zweier Polyadenylierungsstellen und eines alternativen Splicings generiert werden. Wir zeigen hier, dass insbesondere die NF-kB Faktoren c-Rel und p50 eine essentielle Bedeutung für die starke Induktion des Promoters P1 und damit der Expression der kurzen Isoform NFATc1A in B-Zell-Rezeptor-stimulierten B-Zellen spielen. Interessanterweise zeigen NFATc1-defiziente B-Lymphozyten eine geschwächte Aktivierung der NF-kB-Faktoren, was auf eine enge Verknüpfung dieser zwei Signalwege hindeutet. NFATc1-defiziente B-Lymphozyten weisen eine Aktivierungs- und Wachstumsschwäche auf (Bhattacharyya S., et.al.). Hier zeigen wir, dass die Überexpression von konstitutiv aktivem NFATc1A in B-Lymphozyten, insbesondere wenn dies im Kontext einer IRF4-Defizienz geschieht, zu einer verstärkten Expansion der B-Zellpopulation, insbesondere nach deren Aktivierung, führt. Dies belegt die kritische Bedeutung, die der wohldosierten Expressions- und Aktivierungskontrolle der NFATc1-Faktoren in B-Lymphozyten zukommt. Dies zeigt sich auch in einem Imiquimod-induziertem Psoriasis Mausmodell. Hier wird durch Applikation von Imiquimod auf die Haut eine der Schuppenflechte ähnelnde entzündliche Reaktion ausgelöst, die insbesondere durch eine stark verstärkte Proliferation der Keratinozyten gekennzeichnet ist. Wir können zeigen, dass die NFATc1-Faktoren in B-Lymphozyten kritisch an dieser Reaktion beteiligt sind. Fehlt den B-Lymphozyten das NFATc1-Gen, so produziert eine Subpopulation, die sogenannten regulatorischen B-Zellen, verstärkt das immunmodulatorischen Zytokins IL-10, wodurch die entzündliche Reaktion fast komplett unterdrückt wird. Dies ähnelt vorhergehenden Beobachtungen, in denen wir zeigen konnten, dass auch in einem Mausmodell der Multiplen Sklerose (EAE) die Immunreaktion durch den Verlust von NFATc1 in B-Zellen erheblich gelindert werden kann (Bhattacharyya S., et.al.). KW - Schuppenflechte KW - Maus KW - Transkriptionsfaktor KW - B-Lymphozyt KW - NFAT KW - NF-kB KW - Transgenic mice KW - Psoriasis KW - Cancer KW - B cells Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97905 ER - TY - THES A1 - Konopik, Oliver T1 - The impact of logging and conversion to oil palm plantation on Bornean stream-dependent frogs and their role as meso-predators T1 - Die Auswirkungen von Abholzung des Regenwalds und Umwandlung zu Ölpalmplantagen auf bachbewohnende Frösche und ihre Rolle als Mesoprädatoren in Borneo N2 - I. Nowadays, tropical landscapes experience large-scale land use intensification and land conversion driven by increasing demand for resourses. Due to the continuously high demand for tropical timber and politically intended step increase in palm oil production, multiple rounds of logging and subsequent conversion to oil palm plantations became a regionally wide-spread land conversion pattern in Southeast Asia. Although many tree species and some animals are highly threatened by logging, a great number of species groups, such as birds or mammals, have been shown to persist in logged forests. Accordingly, many ecosystem services, such as dung removal, seed dispersal or the activity of scavengers, are functionally maintained in logged forests. In contrast, oil palm plantations have been shown to not only dramatically alter the species composition and reduce biodiversity, but also curtail many crucial biotic and abiotic ecosystem functions. The focus of this dissertation was to investigate the response of anuran species richness and community composition to logging and conversion to oil palm plantation in northern Borneo (chapter II). I analysed the diet of various frog species and their change with habitat degradation. Furthermore, I assessed the shift in the trophic position of the anuran community as well as the response of anuran phylogenetic, dietary, and functional diversity to logging and conversion to oil palm plantations (chapter III). Finally, the resilience of the predator-prey interaction between an ant-specialist toad and its ant prey was analysed using shifts in species-level interactions (chapter IV). II. This part of the study compares the species richness, relative abundance and community composition of stream anuran assemblages among primary forests, repeatedly logged forests and oil palm plantations. I used a highly standardised sampling setup applying transect-based sampling. Surprisingly, most of the anuran species native to primary forests were able to survive in logged forest streams. In contrast, on average only one third of the forest species richness was found in oil palm plantation streams. However, a high percentage of canopy cover above the plantation streams was able to mitigate this loss substantially. This study demonstrates the high conservation value of logged forests for Southeast Asian anurans. In contrast, the conversion to oil palm plantations leads to a dramatic decline of forest species. However, they have a mainly unused potential to contribute to the protection of parts of the regional anuran biodiversity if conservation-oriented management options are implemented. III. In this part, I analysed the shifts in trophic position and multiple diversity layers of Southeast Asian stream-dependent anuran species across a gradient of disturbance from primary forest through intensively logged forest to oil palm plantation. For this purpose, I identified the diet composition of 59 anuran species by means of stomach flushing. Furthermore, I use diet composition of frog species as well as species traits to calculate dietary and functional diversity, respectively. I found that the trophic position of the entire anuran community is elevated in heavily disturbed habitats. Furthermore, species diversity, phylogenetic species variation, dietary diversity, and functional diversity were reduced. However, beyond the effect of the decreased species richness, only phylogenetic species variability and functional diversity were significantly impacted by land conversion, indicating a non-random loss of phylogenetic groups and functionally unique species. Overall, the observed changes to species interactions and functional composition suggest a greatly modified role of anurans in altered habitats and major foodweb reorganisation. Such far-reaching changes to the way species groups interact are likely to threaten local biodiversity and ecosystem functioning in natural and particularly modified habitats. However, I could also show, that small-scale habitat quality, provided by riparian reserves, is able to mitigate the negative consequences of land conversion considerably. IV. Here I assess how logging of rain forest and conversion to oil palm plantations affect the populations of the ant-specialist giant river toad (Phrynoidis juxtaspera), and availability and composition of its ant prey. I measured canopy cover as an estimate for the degree of disturbance. I found that toad abundance decreased with increasing disturbance. At the same time, ant community composition was altered, and local ground-foraging ant species richness increased with disturbance. However, for a given amount of canopy cover, primary forest supported more ant species than altered habitats. Despite these changes, composition of ants consumed by toads was only weakly affected by habitat change, with the exception of the invasive yellow crazy ant (Anoplolepis gracilipes), which was positively selected in oil palm plantations. This suggests that predator-prey interactions can be mostly maintained with habitat disturbance despite shifts in community composition, and even that some predators are capable of exploiting new prey sources in novel ecosystems. V. I could show that anuran diversity and their trophic interaction is negatively impacted by logging and in particular by conversion to oil palm plantations. From species richness and community composition, my study expanded to phylogenetic, dietary and functional diversity. Furthermore, I investigated the interaction of a particular toad species with its preferred prey (ants), on species level. This increasing degree of detail in my study provided comprehensive results, beyond the detail of many related studies. Overall, conservation of the remaining forest in Southeast Asia is urgently required to protect anuran biodiversity and their trophic interactions. N2 - I. Durch den stetig steigenden Bedarf an vielfältigen Ressourcen stehen heutzutage vor allem tropische Ökosysteme unter enormem Druck hin zu intensiver Landwirtschaft und der Umwandlung von natürlichen Lebensräumen. Getrieben durch die hohe Nachfrage an Tropenhölzern und dem politisch gewollten Anstieg der Palmölproduktion, etablierte sich in Südostasien eine weit verbreitete Landnutzungsumwandlung charakterisiert durch wiederkehrende Holznutzung und die anschließende Umwandlung zu Ölpalmplantagen. Manche Tiergruppen und vor allem Baumarten sind dadurch stark gefährdet. Dennoch können andere Organismengruppen wie Vögel oder Säuger auch in genutzten Wäldern überleben. Auch Ökosystemdienstleistungen, wie Kotbeseitigung oder die Aktivität von Aasfressern bleiben vielfach in genutzten Wäldern erhalten. Im Gegensatz dazu stellen Ölpalmplantagen keinen geeigneten Lebensraum für viele Tier und Pflanzenarten dar und viele Ökosystemserviceleistungen können in diesen Plantagen nicht aufrecht erhalten werden. Ziel dieser Arbeit war die Auswirkungen dieser massiven Habitatumwandlung auf die Artenzahl und die Artenzusammensetzungen von Fröschen und Kröten in Nordborneo zu untersuchen (Kapitel II). Ich untersuchte die Nahrungszusammensetzung von mehreren Froscharten und wie sich diese mit Habitatumwandlung verändert. Zusätzlich habe ich die Stellung von Fröschen in der Nahrungskette sowie ihre phylogenetische, nahrungs- und funktionelle Diversität untersucht (Kapitel III). Schließlich habe die Interaktion von Fröschen mit ihrer Beute (in diesem Fall Ameisen) auch auf Artebene untersucht (Kapitel IV). II. Dieser Teil der Arbeit vergleicht die Artenzahl, relative Häufigkeit und die Artenzusammensetzung der bachlebenden Froscharten zwischen Primärwäldern, genutzten Wäldern und Ölpalmplantagen. Dazu nahm ich die Froschbestände mit einer standardisierten Transektmethode auf. Ich fand heraus, dass die meisten Froscharten aus Primärwäldern auch in forstwirtschaftlich intensiv genutzten Wäldern überleben konnten. Im Gegensatz dazu wiesen Ölpalmplantagen nur durchschnittlich ein drittel der Froscharten aus Wäldern auf. Jedoch konnte dieser Artenschwund durch einen hohen Kronenschluss über den Plantagenbächen reduziert werden. Diese Studie belegt den hohen naturschutzfachlichen Wert von genutzten Wäldern in Südostasien und die geringe Bedeutung von Ölpalmplantagen in diesem Zusammenhang. Jedoch zeigt es auch Wege auf, wie Ölpalmplantagen naturschutzfachlich aufgewertet werden können. III. Dieser Teil der Arbeit befasst sich mit den Auswirkungen der Habitatumwandlung auf die trophischen Interaktionen und mehrere Ebenen der Froschbiodiversität. Dazu untersuchte ich die Nahrungszusammensetzung von 59 Froscharten mittels Magenspülung. Darüber hinaus nutzte ich diese Daten um die Nahrungsvielfalt zu untersuchen und Daten aus der Literatur und die funktionelle Diversität zu erfassen. Dabei fand ich heraus, dass Frösche bei zunehmender Habitatzerstörung eine höhere Stellung in der Nahrungskette einnahmen. Darüber hinaus sank die allgemeine Diversität, die phylogenetische Verwandtschaft, die Nahrungsvielfalt und die funktionelle Diversität der Frösche. Also lässt sich schließen, dass diese tiefgreifenden Veränderungen eine deutlich andere Rolle der Frösche in den umgewandelten Habitaten zur Folge hat. Solche dramatischen Eingriffe in das Nahrungsnetz können negative Auswirkungen auf die Stabilität von Ökosystemen haben, jedoch zeigt sich auch hier, dass diese durch die Erhöhung des Kronenschlusses deutlich abgemildert werden können. IV. In diesem Abschnitt befasse ich mich auf die Auswirkungen der Habitatumwandlung auf die Häufigkeit der Kröte Phrynoidis juxtaspera, ihre Beute (Ameisen), sowie die Interaktion von Räuber und Beute. Dabei fand ich heraus, dass die Kröte in ungestörten Bächen am häufigsten war und gleichzeitig mehr (und andere) Ameisenarten in Ölpalmplantagen vorkamen. Jedoch war die Artenzahl von Ameisen bei konstantem Kronenschluss in Primärwäldern immer höher als in Ölpalmplantagen. Im großen Gegensatz zu diesen Veränderungen, war die Nahrungszusammensetzung der verbleibenden Kröten in den Plantagenbächen kaum unterschiedlich im Vergleich mit Primärwaldbächen. Eine Ausnahme war ein deutlich gestiegener Anteil der invasiven Ameisenart Anoplolepis gracilipes. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Räuber-Beute Interaktion unter Umständen unverändert die Habitatumwandlung überstehen können, aber auch in gewissem Umfang neue Ressourcen erschlossen werden können. V. Mit dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass sich die großflächige Habitatumwandlung von Wäldern hin zu Ölpalmplantagen negativ auf die Froschbiodiversität, wie auch die Räuber-Beute Interaktionen von Fröschen auswirkt. Ausgehend von Artenzahl und Artenzusammensetzung konnte ich in meiner Arbeit darüber hinaus auch die Biodiversität der Frösche auf verschiedenen Ebenen beleuchten und schließlich sogar die Räuber-Beute Interaktion auf Artebene untersuchen. Dadurch konnte ich diesen komplexen Zusammenhang in ganz besonderer Tiefe beleuchten. Insgesamt liefert diese Arbeit einen weiteren wichtigen Beleg dafür, dass Primärwälder, aber neuerdings auch immer mehr genutzte Wälder entscheidend für den Erhalt von tropischer Biodiversität sind. KW - Froschlurche KW - Biodiversität KW - Borneo KW - Ölpalmenanbau KW - Bach KW - amphibia KW - Borneo KW - logging KW - oilpalm plantation KW - frogs KW - stream KW - Rodung KW - Südostasien Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111749 ER - TY - THES A1 - Ewald, Heike T1 - Influence of context and contingency awareness on fear conditioning – an investigation in virtual reality T1 - Der Einfluss von Kontext und Kontingenzbewusstsein auf Furchtkonditionierung – eine Untersuchung in virtueller Realität N2 - Fear conditioning is an efficient model of associative learning, which has greatly improved our knowledge of processes underlying the development and maintenance of pathological fear and anxiety. In a differential fear conditioning paradigm, one initially neutral stimulus (NS) is paired with an aversive event (unconditioned stimulus, US), whereas another stimulus does not have any consequences. After a few pairings the NS is associated with the US and consequently becomes a conditioned stimulus (CS+), which elicits a conditioned response (CR). The formation of explicit knowledge of the CS/US association during conditioning is referred to as contingency awareness. Findings about its role in fear conditioning are ambiguous. The development of a CR without contingency awareness has been shown in delay fear conditioning studies. One speaks of delay conditioning, when the US coterminates with or follows directly on the CS+. In trace conditioning, a temporal gap or “trace interval” lies between CS+ and US. According to existing evidence, trace conditioning is not possible on an implicit level and requires more cognitive resources than delay conditioning. The associations formed during fear conditioning are not exclusively associations between specific cues and aversive events. Contextual cues form the background milieu of the learning process and play an important role in both acquisition and the extinction of conditioned fear and anxiety. A common limitation in human fear conditioning studies is the lack of ecological validity, especially regarding contextual information. The use of Virtual Reality (VR) is a promising approach for creating a more complex environment which is close to a real life situation. I conducted three studies to examine cue and contextual fear conditioning with regard to the role of contingency awareness. For this purpose a VR paradigm was created, which allowed for exact manipulation of cues and contexts as well as timing of events. In all three experiments, participants were guided through one or more virtual rooms serving as contexts, in which two different lights served as CS and an electric stimulus as US. Fear potentiated startle (FPS) responses were measured as an indicator of implicit fear conditioning. To test whether participants had developed explicit awareness of the CS-US contingencies, subjective ratings were collected. The first study was designed as a pilot study to test the VR paradigm as well as the conditioning protocol. Additionally, I was interested in the effect of contingency awareness. Results provided evidence, that eye blink conditioning is possible in the virtual environment and that it does not depend on contingency awareness. Evaluative conditioning, as measured by subjective ratings, was only present in the group of participants who explicitly learned the association between CS and US. To examine acquisition and extinction of both fear associated cues and contexts, a novel cue-context generalization paradigm was applied in the second study. Besides the interplay of cues and contexts I was again interested in the effect of contingency awareness. Two different virtual offices served as fear and safety context, respectively. During acquisition, the CS+ was always followed by the US in the fear context. In the safety context, none of the lights had any consequences. During extinction, a additional (novel) context was introduced, no US was delivered in any of the contexts. Participants showed enhanced startle responses to the CS+ compared to the CS- in the fear context. Thus, discriminative learning took place regarding both cues and contexts during acquisition. This was confirmed by subjective ratings, although only for participants with explicit contingency awareness. Generalization of fear to the novel context after conditioning did not depend on awareness and was observable only on trend level. In a third experiment I looked at neuronal correlates involved in extinction of fear memory by means of functional magnetic resonance imaging (fMRI). Of particular interest were differences between extinction of delay and trace fear conditioning. I applied the paradigm tested in the pilot study and additionally manipulated timing of the stimuli: In the delay conditioning group (DCG) the US was administered with offset of one light (CS+), in the trace conditioning group (TCG) the US was presented 4s after CS+ offset. Most importantly, prefrontal activation differed between the two groups. In line with existing evidence, the ventromedial prefrontal cortex (vmPFC) was activated in the DCG. In the TCG I found activation of the dorsolateral prefrontal cortex (dlPFC), which might be associated with modulation of working memory processes necessary for bridging the trace interval and holding information in short term memory. Taken together, virtual reality proved to be an elegant tool for examining human fear conditioning in complex environments, and especially for manipulating contextual information. Results indicate that explicit knowledge of contingencies is necessary for attitude formation in fear conditioning, but not for a CR on an implicit level as measured by FPS responses. They provide evidence for a two level account of fear conditioning. Discriminative learning was successful regarding both cues and contexts. Imaging results speak for different extinction processes in delay and trace conditioning, hinting that higher working memory contribution is required for trace than for delay conditioning. N2 - Furchtkonditionierung ist ein effizientes Modell für assoziatives Lernen und hat unser Wissen über Prozesse, die der Entstehung und Aufrechterhaltung von pathologischer Furcht und Angst zugrunde liegen, entscheidend vergrößert. In einem differentiellen Furchtkonditionierungparadigma wird ein zunächst neutraler Reiz (NS) gemeinsam mit einem aversiven Ereignis (unbedingter Reiz, US) dargeboten, während ein zweiter Stimulus nicht mit dem Ereignis gepaart wird. Nach mehrmaliger gemeinsamer Darbietung wird der NS mit dem US assoziiert. Dadurch wird er zu einem bedingten Reiz (CS+) und löst eine konditionierte Furchtreaktion (CR) aus. Die Bildung expliziten Wissens über die CS/US-Assoziation während der Konditionierung bezeichnet man als Kontingenzbewusstsein. Befunde über die Rolle dieses Bewusstseins in der Furchtkonditionieung sind uneinheitlich. In Delay-Furchtkonditionierungsstudien konnte die Entwicklung einer CR unabhängig von Kontingenzbewusstsein gezeigt werden. Man spricht von Delay-Konditionierung, wenn der US direkt auf den CS+ folgt. Bei der Trace-Konditionierung liegt zwischen dem CS und dem US ein kurzer zeitlicher Abstand (Trace-Interval). Für Trace-Konditionierung werden mehr kognitive Ressourcen benötigt als für Delay-Konditionierung. Auf einer impliziten Ebene ist Trace-Konditionierung nicht möglich. Die Assoziationen, die während der Furchtkonditionierung gebildet werden, beschränken sich nicht auf Assoziationen zwischen spezifischen Reizen und aversiven Ereignissen. Kontextuelle Reize bilden den Hintergrund des Lernprozesses und spielen sowohl bei der Akquisition als auch bei der Extinktion von Furcht und Angst eine wichtige Rolle. Eine häufige Einschränkung in Furchtkonditionierungsstudien beim Menschen ist der Mangel an ökologischer Validität, besonders hinsichtlich der Kontextinformationen. Der Einsatz von virtuellen Realtitäten (VR) stellt einen vielversprechenden Ansatz dar um komplexe Umgebungen nachzubilden, die nahe an Alltagssituationen sind. Um Hinweisreiz- und Kontextkonditionierung unter Berücksichtigung des Kontingenzbewusstseins zu untersuchen habe ich drei Experimente durchgeführt. Dafür wurde ein Paradigma in virtueller Realität entwickelt, das es ermöglicht, Reize, Kontexte sowie zusätzlich das Timing der Ereignisse exakt zu manipulieren. In allen drei Studien wurden Versuchspersonen durch einen oder mehrere virtuelle Räume geführt, in denen zwei verschiedene Lichter als bedingte Reize und ein elektrischer Reiz als unbedingter Reiz dienten. Furchtpotenzierte Startlereaktionen wurden gemessen als Indikator für implizite Furchtkonditionierung. Um zu überprüfen, ob die Versuchspersonen auch explizites Kontingenzbewusstsein erwoben hatten, wurden subjektive Ratings erfasst. Die erste Studie wurde als Pilotstudie konstruiert, um sowohl das VR Paradigma als auch das Konditionierungsprotokoll zu testen. Zusätzlich hat mich der Effekt des Kontingenzbewusstseins interessiert. Die Ergebnisse zeigten, dass Lidschlag-konditionierung im VR Paradigma möglich ist und dass sie nicht vom Kontingenz-bewusstsein abhängt. Allerdings war evaluative Konditionierung, gemessen durch subjektive Ratings, nur erkennbar bei Personen, die die Assoziation von CS und US explizit gelernt hatten. Um Akquisition und Extinktion sowohl furchtassoziierter Reize als auch furchtassoziierter Kontexte zu untersuchen, wurde in der zweiten Studie ein neues Reiz-Kontext-Generalisierungsparadigma eingesetzt. Neben dem Zusammenspiel von Reizen und Kontexten war ich auch hier an der Rolle des Kontingenzbewusstseins interessiert. Zwei verschiedene virtuelle Büros dienten als Furcht- bzw. Sicherheitskontext. Während der Akquisition folgte auf den CS+ im Furchtkontext immer ein US. Im Sicherheitskontext hatte keines der Lichter Konsequenzen. In der Extinktionsphase wurde zusätzlich ein neuer Kontext eingeführt. In keinem der Kontexte wurde ein US appliziert. Die Versuchspersonen reagierten nur im Furchtkontext mit erhöhter Startlereaktion auf den CS+ im Vergleich zum CS-. Diskriminatives Lernen hat sowohl hinsichtlich der Reize als auch hinsichtlich der Kontexte stattgefunden. Dies wurde bestätigt durch die subjektiven Ratings, allerdings nur bei Probanden mit Kontingenzbewusstsein. Eine Generalisierung der Angst vom Furchtkontext auf den neuen Kontext war nicht abhängig vom Kontingenzbewusstsein, konnte allerdings in der Gesamtgruppe nur tendenziell beobachtet werden. In der dritten Studie betrachtete ich neuronale Korrelate der Extinktion von Furchtgedächtnis mit Hilfe von funktioneller Magnetresonanztomographie (fMRI). Von besonderem Interesse waren dabei die Unterschiede zwischen der Extinktion von Delay- und Trace-Konditionierung. Ich habe das Paradigma aus der Pilotstudie angewendet und zusätzlich das Timing der Reize manipuliert. In der Delay-Konditionierungsgruppe (DCG) wurde der US zeitgleich mit dem Ende des CS+ appliziert, in der Trace-Konditionierungsgruppe (TCG) vier Sekunden nach Ende des CS+. Interessanterweise unterschieden sich die beiden Gruppen in ihrer präfrontalen Aktivierung. In Übereinstimmung mit der Literatur war der ventromediale Präfrontalkortex (vmPFC) in der DCG aktiviert. In der TCG konnte man Aktivierung des dorsolateralen Präfrontalkortex (dlPFC) beobachten. Dies könnte mit erhöhter Beteiligung des Arbeitsgedächtnisses zusammenhängen, die notwendig ist, um das Trace-Interval zu überbrücken und die Informationen im Kurzzeitgedächtnis zu halten. Zusammengefasst hat sich virtuelle Realität als ein elegantes Instrument zur Fuchtkonditionierung beim Menschen herausgestellt, besonders zur Manipulation von Kontextinformation. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass explizites Kontingenzwissen notwendig ist für evaluative Furchtkonditionierung, nicht jedoch für eine implizite CR gemessen an FPS Reaktionen. Außerdem liefern sie Evidenz für den “two level account of fear conditioning”. Die Ergebnisse der Bildgebung sprechen für zwei unterschiedliche Extinktionsprozesse bei Delay- und Trace-Konditionierung und weisen darauf hin, dass für Trace-Konditionierung eine höhere Beteiligung des Arbeitsgedächtnisses notwendig ist als für Delay-Konditionierung. KW - Klassische Konditionierung KW - Angst KW - Virtuelle Realität KW - Schreckreaktion KW - Funktionelle Kernspintomographie KW - Fear conditioning KW - virtual reality KW - contingency awareness KW - contextual conditioning KW - fMRI KW - fear potentiated startle response KW - Assoziation KW - Lernen KW - Kontingenz Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111226 ER - TY - THES A1 - Samtleben, Samira T1 - Investigation of homeostatic calcium fluxes in hippocampal neurons by means of targeted-esterase induced dye loading (TED) T1 - Untersuchung von homöostatischen Kalziumströmen in hippokampalen Neuronen mittels “targeted-esterase induced dye loading (TED)” N2 - Calcium ions can activate intracellular signalling cascades that control key functions in all types of neurons. These functions include neuronal excitability and excitation, synaptic plasticity, cell migration, transmitter release, gene transcription, and apoptosis. The major intracellular neuronal store for calcium is the endoplasmic reticulum (ER), a continuous and dynamic, membranous organelle that extends through all parts of neurons, from axons to dendrites. The calcium concentration in the ER is appr. one thousand fold higher than in the cytosol and this calcium gradient is built up by the sarco-/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump that pumps calcium from the cytosol into the ER. Despite detailed knowledge about various induced calcium signals within neurons, it was still elusive, how resting neurons maintain their ER calcium content at rest. In order to shed light on the calcium homeostasis at rest, the targeted-esterase induced dye loading (TED) technique was improved. TED allows the direct and non-disruptive visualization of ER calcium in presence of extracellular calcium, thus enabling to visualize the dynamic flow of ER calcium. TED is based on the overexpression of an ER-targeted mouse carboxylesterase. Inside the ER the carboxylesterase cleaves the acetoxymethyl ester calcium dye Fluo5N, AM, thereby converting this dye into a calcium sensitive, low-affinity, cell membrane impermeable calcium indicator that is trapped in the ER. When bound to calcium ions and excited by fluorescent light, its fluorescence intensity increases one hundredfold compared to the calcium-free state. It was observed that calcium withdrawal from resting neurons led to a rapid loss of calcium from both the ER and the cytosol, which recovered upon calcium re-addition. It was concluded that a strong calcium influx and efflux must exist under resting conditions that maintain a constant calcium concentration in neurons at rest. TED calcium imaging could visualize this resting calcium influx event. When the inhibitor of store-operated calcium entry (SOCE), SKF-96365, was acutely added to neurons an immediate decline in ER calcium levels was observed, whereas cytosolic calcium levels remained constant. Based on these findings, a novel calcium homeostasis model is proposed in which a strong SOCE-like calcium influx and a corresponding calcium efflux maintain the ER calcium levels at rest. These fluxes are adapted to disturbances in order to maintain a constant calcium level in resting neurons. This study visualizes for the first time the resting calcium flow into the ER. The calcium enters the neurons via a store-operated calcium entry-like mechanism, a form of calcium influx that was thought to be induced by signalling events. N2 - Kalzium kann intrazelluläre Signalkaskaden aktivieren und somit Schlüsselfunktionen in allen Typen von Neuronen kontrollieren. Diese Schlüsselfunktionen umfassen Zellmigration, Freisetzung von Neurotransmittern, synaptische Plastizität, Transkription von Genen und Apoptose. Der wichtigste Speicher für Kalzium in Neuronen ist das endoplasmatische Retikulum (ER); ein kontinuierliches, membranumschlossenes Zellorganell, das sich in alle Teile von Neuronen erstreckt, von Axonen bis zu Dendriten. Im ER ist die Kalziumkonzentration ca. eintausendmal höher als im Zytosol. Dieser Kalziumgradient wird von der sogenannten SERCA, der sarco-/endoplasmic reticulum calcium ATPase, Kalziumpumpe aufrechterhalten, die Kalziumionen aktiv vom Zytosol in das Innere des ER pumpt. Obwohl die einzelnen induzierten Kalziumsignalwege in Neuronen gut untersucht sind, war es lange nicht bekannt wie es Neuronen gelingt die hohe Kalziumkonzentration des ERs in Ruhe aufrechtzuerhalten. Um diese Frage zu klären wurde die sogenannte targeted-esterase induced dye loading (TED) Technik verbessert. TED ermöglicht es ER Kalzium direkt, in intakten Neuronen und in Gegenwart von extrazellulärem Kalzium sichtbar zu machen. Dadurch wird es möglich den Kalziumstrom des ERs direkt zu beobachten. TED beruht darauf, dass eine für das ER bestimmte Carboxylesterase der Maus überexprimiert wird, die sich im ER ansammelt. Im Inneren des ERs wandelt dieses Enzym den synthetischen Kalziumfarbstoff Fluo5N, AM um, der zur Gruppe der Acetoxymethyl-ester gehört. Dadurch wird aus diesem Farbstoff ein kalzium-sensitiver, niedrig-affiner Kalziumindikator, der nicht mehr permeabel für biologische Membranen ist und daher im ER verbleibt. In seiner Kalzium-gebunden Form erhöht sich die Fluoreszenz dieses Indikators einhundertfach im Vergleich zur Kalzium-ungebunden Form, wenn er durch Fluoreszenzlicht angeregt wird. Es wurde beobachtet, dass der Entzug von extrazellulärem Kalzium zu Verlust von Kalzium im ER und Zytosol von Neuronen führt. Bei Rückgabe des Kalziums erholt sich die Kalziumkonzentration wieder. Daraus wurde gefolgert, dass es bei Neuronen in Ruhe einen starken Einstrom und Ausstrom von Kalzium geben muss. Diese Ströme halten den Kalziumgehalt der Neurone konstant. Wenn SKF-96365, ein Inhibitor des sogenannten store-operated calcium entry (SOCE), akut auf die Neurone appliziert wurde, wurde sofort ein Abfall der ER Kalziumkonzentration beobachtet, wohingegen die Kalziumkonzentration des Zytosols gleich blieb. Aufgrund dieser Ergebnisse kann ein neues Kalziumhomöostase-Modell für Neurone vorgeschlagen werden: In ruhenden Neuronen halten ein starker SOCE-ähnlicher Kalziumeinstrom und ein entsprechender Kalziumausstrom den Kalziumgehalt des ERs aufrecht. Diese Ströme werden an Störungen angepasst um eine konstante Kalziumkonzentration zu erreichen. In dieser Studie wird zum ersten Mal der Ruhestrom von Kalzium in das ER sichtbar gemacht. Kalzium gelangt über einen store-operated calcium entry -ähnlichen Mechanismus in die Neurone. Bisher dachte man, dass diese Art von Kalziumeinstrom nur nach Aktivierung von Signalen stattfindet. KW - Calciumhomöostase KW - Nervenzelle KW - neuron KW - calcium homeostasis KW - calcium imaging KW - Calcium Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110332 ER - TY - THES A1 - Premachandran Nair, Anoop Chandran T1 - Identification and functional characterization of TGF-β inducible, immunosuppressive miRNAs in human CD8+ T cells T1 - Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von TGF-β induzierbaren, immunsuppressiven miRNAs in humanen CD8+ T Zellen N2 - While TGF-β is able to regulate miRNA expression in numerous cell types, TGF-β-dependent changes in the miRNA profile of CD8+ T cells had not been studied before. Considering that TGF-β suppresses CD8+ T cell effector functions in numerous ways, we wondered whether induction of immune-regulatory miRNAs could add to the known transcriptional effects of TGF-β on immune effector molecules. In this study, we used miRNA arrays, deep sequencing and qRT-PCR to identify miRNAs that are modulated by TGF-β in human CD8+ T cells. Having found that the TGF-β-dependent downregulation of NKG2D surface expression in NK cells and CD8+ T cells does not go along with a corresponding reduction in mRNA levels, this pathway appeared to be a possible target of TGF-β-inducible miRNAs. However, this hypothesis could not be confirmed by miRNA reporter assays. Instead, we observed that DAP10 transcription is suppressed by TGF-β which in turn negatively affects NKG2D surface expression. In spite of promising preliminary experiments, technical difficulties associated with the transfection of primary NK cells and NK cell lines unfortunately precluded the final proof of this hypothesis. Instead, we focused on the TGF-β-induced changes in the miRNome of CD8+ T cells and confirmed the induction of the miR-23a cluster members, namely miR-23a, miR-27a and miR-24 by three different techniques. Searching for potential targets of these miRNAs which could contribute to the immunosuppressive action of TGF-β in T cells, we identified and confirmed a previously unknown regulation of IFN-γ mRNA by miR-27a and miR-24. Newly generated miRNA reporter constructs further revealed that LAMP1 mRNA is a target of miR-23a. Upon modulation of the miR-23a cluster in CD8+ T cells by the respective miRNA antagomirs and mimics, significant changes in IFN-γ expression confirmed the functional relevance of our findings. Effects on CD107a/LAMP1 expression were, in contrast, rather minimal. Still, overexpression of the miR-23a cluster attenuated the cytotoxic activity of antigen-specific CD8+ T cells. Taken together, these functional data reveal that the miR-23a cluster not only is induced by TGF-β, but also exerts a suppressive effect on CD8+ T-cell effector functions, even in the absence of TGF-β signaling. N2 - Obwohl bekannt war, dass TGF- die miRNA Expression in zahlreichen Zelltypen moduliert, waren TGF- abhängige Veränderung des miRNA Profils in CD8+ T Zellen noch nicht untersucht worden. Da TGF-β die Effektorfunktionen von CD8+ T Zellen aber in vielfältiger Weise inhibiert, fragten wir uns, ob die transkriptionellen Effekte, die TGF-β bekanntermaßen auf Immuneffektormoleküle ausübt, noch durch die Induktion immunregulatorischer miRNAs ergänzt werden. Daher nutzten wir miRNA Arrays, Genomsequenzierungstechniken und Echtzeit-PCR um miRNAs zu identifizieren, welche in humane CD8+ T Zellen von TGF- moduliert werden. Die Beobachtung, dass die TGF--abhängige Herunterregulation der NKG2D Oberflächenexpression in Natürlichen Killerzellen und CD8+ T Zellen nicht mit einer entsprechenden Verringerung der mRNA Menge einhergeht, ließ zudem vermuten, dass dieser Signalweg über miRNAs reguliert werden könnte. Nach verschiedenen miRNA Reporterassays musste diese Hpothese jedoch verworfen werden. Stattdessen zeigte sich, dass TGF- die Transkription von DAP10 inhibiert was wiederum die Oberflächenexpression von NKG2D limitieren sollte. Trotz viel versprechender initialer Experimente scheiterte der letzgültige Beweis dieser Hypothese aber an der ungenügenden Transfizierbarkeit von primären NK Zellen sowie von NK Zelllinien. Daher konzentrierten wir uns im Weiteren auf die durch TGF- induzierten Veränderungen im miRNom von CD8+ T Zellen und konnten mit drei verschiedenen Techniken die Induktion des miR-23a Clusters (mit den einzelnen miRNAs miR-23a, miR-27a und miR-24) bestätigen. Auf der Suche nach potentiellen immunregulatorisch relevanten Zielgenen dieser miRNAs konnten wir erstmals eine Regulation von IFN- durch miR-27a und miR-24 nachweisen. Zu diesem Zweck generierte miRNA Reporterkonstrukte zeigten zudem, dass LAMP1 durch miR-23a reguliert wird. Nach Modulation des miR-23a Clusters durch die entsprechenden miRNA Antagomir und Surrogat-Konstrukte konnten wir auch in CD8+ T Zellen signifikante Veränderungen der IFN-γ Expression nachweisen und somit die funktionelle Relevanz unserer Befunde bestätigen. Die Effekte auf die Expression von CD107a/LAMP1 waren hingegen nur minimal. Trotzdem führte die Überexpression des miR-23a Clusters zu einer Verringerung der zytotoxischen Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T Zellen. Zusammen genommen belegen diese funktionellen Untersuchungen, dass das miRNA-23a Cluster, welches durch TGF-β induziert wird, zur Hemung der Effektorfunktionen in CD8+ T Zellen beiträgt, und zwar sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von TGF-β. KW - Transforming Growth Factor beta KW - Antigen CD8 KW - miRNS KW - Interferon KW - Immunsystem KW - miR-23a cluster KW - T cell cytotoxicity KW - Regulation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109741 ER - TY - THES A1 - Weirather, Johannes T1 - Role of CD4+ T lymphocytes in cardiac wound healing and remodeling after experimental myocardial infarction in mice T1 - Die Bedeutung von CD4+ T-Lymphozyten für die kardiale Wundheilung und Remodeling nach experimentellem Herzinfarkt im Mausmodell N2 - Cardiac healing after myocardial infarction (MI) represents the cardinal prerequisite for proper replacement of the irreversibly injured myocardium. In contrast to innate immunity, the functional role of adaptive immunity in postinfarction healing has not been systematically addressed. The present study focused on the influence of CD4+ T lymphocytes on wound healing and cardiac remodeling after experimental myocardial infarction in mice. Both conventional and Foxp3+ regulatory CD4+ T cells (Treg cells) became activated in heart draining lymph nodes after MI and accumulated in the infarcted myocardium. T cell activation was strictly antigen-dependant as T cell receptor-transgenic OT-II mice in which CD4+ T cells exhibit a highly limited T cell receptor repertoire did not expand in heart-draining lymph nodes post-MI. Both OT-II and major histocompatibility complex class II-deficient mice lacking a CD4+ T cell compartment showed a fatal clinical postinfarction outcome characterized by disturbed scar tissue construction that resulted in impaired survival due to a prevalence of left-ventricular ruptures. To assess the contribution of anti-inflammatory Treg cells on wound healing after MI, the Treg cell compartment was depleted using DEREG mice that specifically express the human diphtheria toxin receptor in Foxp3-positive cells, resulting in Treg cell ablation after diphtheria toxin administration. In a parallel line of experiments, a second model of anti-CD25 antibody-mediated Treg cell immuno-depletion was used. Treg cell ablation prior to MI resulted in adverse postinfarction left-ventricular dilatation associated with cardiac deterioration. Mechanistically, Treg cell depletion resulted in an increased recruitment of pro-inflammatory neutrophils and Ly-6Chigh monocytes into the healing myocardium. Furthermore, Treg cell-ablated mice exhibited an adverse activation of conventional non-regulatory CD4+ and CD8+ T cells that showed a reinforced infiltration into the infarct zone. Increased synthesis of TNFα and IFNγ by conventional CD4+ and CD8+ T cells in hearts of Treg cell-depleted mice provoked an M1-like macrophage polarization characterized by heightened expression of healing-compromising induced NO synthase, in line with a reduced synthesis of healing-promoting transglutaminase factor XIII (FXIII), osteopontin (OPN) and transforming growth factor beta 1 (TGFβ1). Therapeutic Treg cell activation by a superagonistic anti-CD28 monoclonal antibody stimulated Treg cell accumulation in the infarct zone and led to an increased expression of mediators inducing an M2-like macrophage polarization state, i.e. interleukin-10, interleukin-13 and TGFβ1. M2-like macrophage differentiation in the healing infarct was associated with heightened expression of scar-forming procollagens as well as scar-stabilizing FXIII and OPN, resulting in improved survival due to a reduced incidence of left-ventricular ruptures. Therapeutic Treg cell activation and the induction of a beneficial M2-like macrophage polarization was further achieved by employing a treatment modality of high clinical potential, i.e. by therapeutic administration of IL-2/ anti-IL-2 monoclonal antibody complexes. The findings of the present study suggest that therapeutic Treg cell activation and the resulting improvement of healing may represent a suitable strategy to attenuate adverse infarct expansion, left-ventricular remodeling, or infarct ruptures in patients with MI. N2 - Die kardiale Wundheilung nach einem Herzinfarkt ist unabdingbare Voraussetzung um das unwideruflich beschädigte Myokard zu ersetzen. Im Gegensatz zur Rolle der angeborenen Immunität ist zur Bedeutung der adaptiven Immunität für die kardiale Wundheilung nur wenig bekannt. Im Fokus der Studie stand deshalb die Rolle von CD4+ T-Zellen bei der Wundheilung und kardialem Remodeling nach einem experimentellen Herzinfarkt im Mausmodell. Sowohl konventionelle, als auch Foxp3-positive regulatorische CD4+ T Zellen (Treg-Zellen) wurden im Lymphknoten infarzierter Tiere aktiviert und akkumulierten im Infarktareal. Die Aktivierung von CD4+ T Zellen nach MI setzte die Erkennung von Selbstantigenen voraus, da OT-II Tiere, die ein stark eingeschränktes T-Zell-Rezeptor-Repertoire aufweisen, keine T-Zell-Aktivierung zeigten. Sowohl OT-II Tiere, als auch Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Knock-out Mäuse, die kein CD4+ T-Zell Kompartment aufweisen, zeigten einen fatalen klinischen Phänotyp, welcher durch eine gestörte Narbenbildung und damit verbunden einem verstärkten Auftreten linksventrikulärer Rupturen verbunden war. Um den Einfluss anti-inflammatorischer Treg-Zellen auf die kardiale Wundheilung nach Herzinfarkt zu untersuchen, wurde das Treg-Zell Kompartment vor MI Induktion depletiert. Hierzu wurden DEREG Mäuse verwendet, in denen Foxp3-positive Zellen den humanen Diphtherietoxin-Rezeptor exprimieren, sodass nach nach Diphtierietoxin-Applikation die Treg-Zellen spezifisch depletiert werden. In einer dazu parallel verlaufenden Versuchsreihe wurden die Treg-Zellen mittels anti-CD25 monoklonaler Antikörper depletiert. Die Depletion des Treg-Zell Kompartments 2 Tage vor MI Induktion bewirkte ein verschlechtertes links-ventrikuläres Remodeling und damit einhergehend eine signifikante Verschlechterung der Herzfunktion. Mechanistisch führte die Treg-Zell Depletion zu einer verstärkten Rekrutierung pro-inflammatorischer Ly-6Chigh Monozyten und neutrophilen Granulozyten ins Infarktareal. Die Depletion von Treg-Zellen war weiterhin mit einer adversen Aktivierung konventioneller CD4+ und CD8+ T-Zellen assoziiert, die eine verstärkte Infiltration ins infarzierte Myokard zeigten. Die erhöhte Synthese von TNFα und IFNγ in konventionellen T-Zellen führte zu einer M1-Makrophagen Polarisierung, welche durch eine verstärkte Expression der induzierbaren NO Synthase charakterisiert war. Weiterhin exprimierten diese M1 Makrophagen signifikant weniger der für eine geordnete Heilung essentiellen Faktoren Osteopontin, Transglutaminase Faktor XIII und transforming growth factor beta 1 (TGFβ1). Im Gegensatz zu den Depletionsversuchen führte die therapeutische Aktivierung der Treg-Zellen durch einen superagonistischen anti-CD28 monoklonalen Antikörper zu einer verstärkten Rekrutierung von Treg-Zellen ins Infarktareal und bewirkte eine erhöhte Synthese von Interleukin (IL)-10, IL-13 sowie TGFβ1. Die damit einhergehende M2 Makrophagenpolarisierung im Infarktareal war mit einer verstärkten Narbenbildung sowie der Synthese von Osteopontin und Transglutaminase Faktor XIII verbunden, welche sich stabilisierend auf die Narbenbildung auswirken. Folgerichtig zeigten die behandelten Tiere ein verbessertes Überleben aufgrund einer signifikant verringerten Inzidenz linksventrikulärer Rupturen. Alternativ zum superagonistischen anti-CD28 monoklonalen Antikörper wurde ein weiterer klinisch relevanter Ansatz zur therapeutischen Aktivierung von Treg-Zellen verfolgt. Durch die Applikation von IL-2/ anti-IL-2 Antikörper-Komplexen konnte ebenfalls eine M2 Makrophagenpolarisierung hervorgerufen werden, die mit einer verstärkten Narbenbildung einherging. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie deuten darauf hin, dass eine therapeutische Aktivierung von Treg-Zellen bei Infarktpatienten und die dadurch hervorgerufene Verbesserung der Wundheilung potentiell einen geeigneten Ansatz darstellt, durch welchen adverses linksventrikuläres Remodeling sowie Infarktrupturen verhindert werden können. KW - Antigen CD4 KW - T-Lymphozyt KW - Herzinfarkt KW - Wundheilung KW - wound healing KW - Foxp3+CD4+ regulatory T cell KW - myocardial infarction KW - macrophage KW - Maus KW - Myokardinfarkt KW - T-Zelle KW - Makrophagen KW - Heilung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107225 ER - TY - THES A1 - Werner, Christian T1 - Effect of autoantibodies targeting amphiphysin or glutamate decarboxylase 65 on synaptic transmission of GABAergic neurons T1 - Einfluss von Autoantikörpern gegen Amphiphysin oder Glutamatdecarboxylase 65 auf synaptische Transmission GABAerger Neurone N2 - The number of newly detected autoantibodies (AB) targeting synaptic proteins in neurological disorders of the central nervous system (CNS) is steadily increasing. Direct interactions of AB with their target antigens have been shown in first studies but the exact pathomecha-nisms for most of the already discovered AB are still unclear. The present study investigates pathophysiological mechanisms of AB-fractions that are associated with the enigmatic CNS disease Stiff person syndrome (SPS) and target the synaptically located proteins amphiphysin or glutamate decarboxylase 65 (GAD65). In the first part of the project, effects of AB to the presynaptic endocytic protein amphiphysin were investigated. Ultrastructural investigations of spinal cord presynaptic boutons in an es-tablished in-vivo passive-transfer model after intrathecal application of human anti-amphiphysin AB showed a defect of endocytosis. This defect was apparent at high synaptic activity and was characterized by reduction of the synaptic vesicle pool, clathrin coated vesi-cles (CCVs), and endosome like structures (ELS) in comparison to controls. Molecular inves-tigation of presynaptic boutons in cultured murine hippocampal neurons with dSTORM microscopy after pretreatment with AB to amphiphysin revealed that marker proteins involved in vesicle exocytosis (synaptobrevin 2 and synaptobrevin 7) had an altered expression in GA-BAergic presynapses. Endophilin, a direct binding partner of amphiphysin also displayed a disturbed expression pattern. Together, these results point towards an anti-amphiphysin AB-induced defective organization in GABAergic synapses and a presumably compensatory rearrangement of proteins responsible for CME. In the second part, functional consequences of SPS patient derived IgG fractions containing AB to GAD65, the rate limiting enzyme for GABA synthesis, were investigated by patch clamp electrophysiology and immunohistology. GABAergic neurotransmission at low and high activity as well as short term plasticity appeared normal but miniature synaptic potentials showed an enhanced frequency with constant amplitudes. SPS patient IgG after preabsorption of GAD65-AB using recombinant GAD65 still showed specific synaptic binding to neu-rons and brain slices supporting the hypothesis that additional, not yet characterized AB are present in patient IgG responsible for the exclusive effect on frequency of miniature potentials. In conclusion, the present thesis uncovered basal pathophysiological mechanisms underlying paraneoplastic SPS induced by AB to amphiphysin leading to disturbed presynaptic architec-ture. In idiopathic SPS, the hypothesis of a direct pathophysiological role of AB to GAD65 was not supported and additional IgG AB are suspected to induce distinct synaptic malfunction. N2 - Die Anzahl neu charakterisierter Autoantikörper (AAK) gegen synaptische Proteine bei Er-krankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) ist stetig wachsend. Direkte Interaktionen der AAK mit ihren Zielantigenen konnten in ersten Studien belegt werden, jedoch besteht weiterhin Unklarheit über die exakten zugrunde liegenden Pathomechanismen. In der vorliegenden Arbeit wurden pathophysiologische Mechanismen von AAK gegen die synaptisch lokalisierten Proteine Amphiphysin und Glutamatdecarboxylase 65 (GAD65) untersucht, die mit der ZNS Erkrankung Stiff Person Syndrom (SPS) assoziiert sind. Im ersten Projektteil wurden die Effekte von AAK gegen das Endozytoseprotein Amphiphysin analysiert: in einem etablierten in-vivo Tiermodell konnten nach intrathekalem passiven Transfer von AAK gegen Amphiphysin ultrastrukturelle Untersuchungen von präsynaptischen Terminalen im Rückenmark eine Störung der Endozytose aufzeigen. Dieser Defekt, der bei hoher synaptischer Aktivität eintrat, war durch eine Verminderung synaptischen Vesikelpools, Clathrin-ummantelter Vesikel und endosomähnlicher Strukturen charakterisiert. Molekulare Untersuchungen präsynaptischer Terminale kultivierter hippokampaler Zellkulturen mit dSTORM Mikroskopie zeigten, dass an der Exozytose beteiligte synaptische Vesikelproteine (Synaptobrevin 2 und Synaptobrevin 7) ein verändertes Expressionsmuster innerhalb GA-BAerger Synapsen aufweisen. Die Expression von Endophilin, einem direkten Bindungs-partner von Amphiphysin, war ebenso verändert. Zusammengefasst weisen diese Ergebnis-se auf einen Organisationsdefekt GABAerger Synapsen hin, die durch anti-Amphiphysin AAK induziert sind und eine kompensatorische Umverteilung von Endozytoseproteinen vermuten lassen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die funktionellen Effekte von SPS AAK gegen GAD65, dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym der GABA-Synthese, mittels Patch-Clamp Mes-sungen und Immunhistologie untersucht. Die GABAerge synaptische Übertragung bei niedri-ger als auch hoher synaptischer Aktivität sowie die synaptische Kurzzeitplastizität wurden durch die IgG Fraktionen mit GAD65-AAK nicht beeinträchtigt. Die Frequenz von GABAergen Miniaturpotentialen war jedoch bei ansonsten gleichbleibender Amplitude erhöht. SPS-Patienten-IgG zeigte allerdings auch nach Präabsorbtion von GAD65-AAK mit Hilfe von rekombinanten GAD65 eine spezifische Anfärbung neuronaler Synapsen, was die Hypothese von weiteren, funktionell wirksamen, aber noch nicht identifizierten AAK im Patienten-IgG unterstützt. Zusammenfassend konnten in der vorliegenden Arbeit grundlegende pathophysiologische Mechanismen aufgezeigt werden, wie pathogene Antikörper gegen Amphiphysin die Struktur präsynaptischer Boutons beeinträchtigen können. Im Falle des idiopathischen SPS konnte keine unterstützenden Befunde für die Hypothese einer direkten pathophysiologischen Rolle von GAD65 AAK erhoben werden. Nach den vorliegenden Ergebnissen wird das Vorhandensein weiterer, derzeit noch nicht beschriebener IgG AAK postuliert, die die synaptische Fehlfunktion erklären können. KW - Autoaggressionskrankheit KW - Zentralnervensystem KW - Stiff person syndrome KW - autoimmunity KW - glutamate decarboxylase 65 KW - amphiphysin KW - Synapse KW - Glutamat-Decarboxylase KW - Autoimmunität KW - Endocytose Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105648 ER - TY - THES A1 - Meule, Adrian T1 - Food craving as a central construct in the self-regulation of eating behavior T1 - Craving nach Nahrungsmitteln als zentrales Konstrukt bei der Selbst-Regulation des Essverhaltens N2 - Background: Food craving refers to an intense desire to consume a specific kind of food of which chocolate is the most often craved one. It is this intensity and specificity that differentiates food craving from feelings of hunger. Although food craving and hunger often co-occur, an energy deficit is not a prerequisite for experiencing food craving, that is, it can also occur without being hungry. Food craving often precedes and predicts over- or binge eating which makes it a reasonable target in the treatment of eating disorders or obesity. One of the arguably most extensively validated measures for the assessment of food craving are the Food Cravings Questionnaires (FCQs), which measure food craving on a state (FCQ-S) and trait (FCQ-T) level. Specifically, the FCQ-S measures the intensity of current food craving whereas the FCQ-T measures the frequency of food craving experiences in general. The aims of the present thesis were to provide a German measure for the assessment of food craving and to investigate cognitive, behavioral, and physiological correlates of food craving. For this purpose, a German version of the FCQs was presented and its reliability and validity was evaluated. Using self-reports, relationships between trait food craving and dieting were examined. Cognitive-behavioral correlates of food craving were investigated using food-related tasks assessing executive functions. Psychophysiological correlates of food craving were investigated using event-related potentials (ERPs) in the electroencephalogram and heart rate variability (HRV). Possible intervention approaches to reduce food craving were derived from results of those studies. Methods: The FCQs were translated into German and their psychometric properties and correlates were investigated in a questionnaire-based study (articles #1 & #2). The relationship between state and trait food craving with executive functioning was examined with behavioral tasks measuring working memory performance and behavioral inhibition which involved highly palatable food-cues (articles #3 & #4). Electrophysiological correlates of food craving were tested with ERPs during a craving regulation task (article #5). Finally, a pilot study on the effects of HRV-biofeedback for reducing food craving was conducted (article #6). Results: The FCQs demonstrated high internal consistency while their factorial structure could only partially be replicated. The FCQ-T also had high retest-reliability which, expectedly, was lower for the FCQ-S. Validity of the FCQ-S was shown by positive relationships with current food deprivation and negative affect. Validity of the FCQ-T was shown by positive correlations with related constructs. Importantly, scores on the subscales of the FCQ-T were able to discriminate between non-dieters and successful and unsuccessful dieters (article #1). Furthermore, scores on the FCQ-T mediated the relationship between rigid dietary control strategies and low dieting success (article #2). With regard to executive functioning, high-calorie food-cues impaired working memory performance, yet this was independent of trait food craving and rarely related to state food craving (article #3). Behavioral disinhibition in response to high-calorie food-cues was predicted by trait food craving, particularly when participants were also impulsive (article #4). Downregulation of food craving by cognitive strategies in response to high-calorie food-cues increased early, but not later, segments of the Late Positive Potential (LPP) (article #5). Few sessions of HRV-biofeedback reduced self-reported food cravings and eating and weight concerns in high trait food cravers (article #6). Conclusions: The German FCQs represent sound measures with good psychometric properties for the assessment of state and trait food craving. Although state food craving increases during cognitive tasks involving highly palatable food-cues, impairment of task performance does not appear to be mediated by current food craving experiences. Instead, trait food craving is associated with low behavioral inhibition in response to high-calorie food-cues, but not with impaired working memory performance. Future studies need to examine if trait food craving and, subsequently, food-cue affected behavioral inhibition can be reduced by using food-related inhibition tasks as a training. Current food craving and ERPs in response to food-cues can easily be modulated by cognitive strategies, yet the LPP probably does not represent a direct index of food craving. Finally, HRV-biofeedback may be a useful add-on element in the treatment of disorders in which food cravings are elevated. To conclude, the current thesis provided measures for the assessment of food craving in German and showed differential relationships between state and trait food craving with self-reported dieting behavior, food-cue affected executive functioning, ERPs and HRV-biofeedback. These results provide promising starting points for interventions to reduce food craving based on (1) food-cue-related behavioral trainings of executive functions, (2) cognitive craving regulation strategies, and (3) physiological parameters such as HRV-biofeedback. N2 - Hintergrund: Craving nach Essen bezeichnet ein starkes Verlangen ein bestimmtes Nahrungsmittel zu konsumieren, welches sich meist auf Schokolade bezieht. Diese Intensität und Spezifität unterscheidet Craving nach Nahrungsmitteln von generellen Hungergefühlen. Obwohl Craving und Hunger häufig Hand in Hand gehen, ist ein Energiedefizit keine Voraussetzung dafür, Craving zu erleben; das bedeutet, es kann ebenfalls auftreten, obwohl man nicht hungrig ist. Craving geht häufig Überessen oder Essanfällen voraus, was es zu einem plausiblen Ansatzpunkt in der Therapie von Essstörungen und Adipositas macht. Eines der wohl am umfangreichsten validierten Maße zur Erfassung von Craving nach Nahrungsmitteln sind die Food Cravings Questionnaires (FCQs), die Craving als momentanen Zustand (engl. state, FCQ-S) und überdauerndes Merkmal (engl. trait, FCQ-T) erfassen. Genauer gesagt misst der FCQ-S die Intensität von aktuellem Craving nach Nahrungsmitteln, während der FCQ-T die Häufigkeit des Erlebens von Craving im Allgemeinen erfasst. Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren die Bereitstellung eines deutschen Fragebogens zur Erfassung von Craving nach Nahrungsmitteln und die Untersuchung von kognitiven, behavioralen, und physiologischen Korrelaten von Craving. Hierfür wurde eine deutsche Version der FCQs präsentiert und deren Reliabilität und Validität überprüft. Zusammenhänge zwischen der Häufigkeit des Erlebens von Craving und Diätverhalten wurden mit Selbstberichtsfragebögen getestet. Kognitiv-behaviorale Korrelate von Craving wurden anhand von essensbezogenen Aufgaben zur Erfassung von exekutiven Funktionen untersucht. Psychophysiologische Korrelate von Craving wurden anhand von ereigniskorrelierten Potentialen (EKPs) im Elektroenzephalogramm und der Herzratenvariabilität (HRV) erforscht. Mögliche Interventionsansätze zur Reduktion von Craving wurden aus den Ergebnissen dieser Studien abgeleitet. Methoden: Die FCQs wurden auf Deutsch übersetzt und deren psychometrische Eigenschaften und Korrelate wurden in einer Fragebogenstudie untersucht (Artikel #1 & #2). Der Zusammenhang zwischen momentanem und habituellem Craving mit exekutiven Funktionen wurde anhand von behavioralen Aufgaben zur Erfassung der Arbeitsgedächtnisleistung und Verhaltenshemmung, die sehr schmackhafte Essensreize enthielten, überprüft (Artikel #3 & #4). Elektrophysiologische Korrelate von Craving wurden mit Hilfe von EKPs während einer Aufgabe zur Regulation von Craving getestet (Artikel #5). Schließlich wurde eine Pilotstudie zu den Effekten von HRV-Biofeedback zur Reduktion von Craving durchgeführt (Artikel #6). Ergebnisse: Die FCQs zeigten eine sehr hohe interne Konsistenz, wohingegen deren Faktorenstruktur nur teilweise repliziert werden konnte. Der FCQ-T hatte außerdem eine hohe Retest-Reliabilität, welche erwartungsgemäß geringer für den FCQ-S ausfiel. Validität des FCQ-S zeigte sich durch positive Zusammenhänge mit aktueller Essensdeprivation und momentaner negativer Stimmung. Validität des FCQ-T zeigte sich durch positive Korrelationen mit verwandten Konstrukten. Zudem konnte anhand der Subskalen des FCQ-T zwischen nicht-diäthaltenden und erfolgreichen und erfolglosen diäthaltenden Personen diskriminiert werden (Artikel #1). Weiterhin zeigte sich, dass der Zusammenhang zwischen rigiden Diätstrategien und geringem Diäterfolg durch Werte des FCQ-T vermittelt wurde (Artikel #2). Bezüglich der exekutiven Funktionen ergab sich, dass die Arbeitsgedächtnisleistung durch das darbieten von hochkalorischen Essensreizen vermindert wurde, allerdings war dies unabhängig von habituellem Craving und stand kaum mit momentanem Craving in Verbindung (Artikel #3). Häufiges Erleben von Craving konnte dahingegen eine behaviorale Enthemmung als Reaktion auf hochkalorische Essensreize vorhersagen, insbesondere wenn die Teilnehmer ebenfalls eine hohe Impulsivität berichteten (Artikel #4). Die Herunterregulierung von Craving während der Präsentation hochkalorischer Essensreize mit Hilfe kognitiver Strategien führte zu einer Erhöhung von früheren, nicht jedoch von späteren, Abschnitten des Late Positive Potential (LPP) (Artikel #5). Bereits wenige Übungssitzungen von HRV-Biofeedback resultierten in einer Reduktion selbstberichteter Cravings sowie essens- und gewichtsbezogener Sorgen bei Menschen mit häufigem Erleben von Cravings (Artikel #6). Schlussfolgerungen: Die deutschen FCQs stellen brauchbare Maße mit guten psychometrischen Eigenschaften zur Erfassung von Craving auf aktueller und habitueller Ebene dar. Obwohl momentanes Craving während kognitiven Aufgaben, die sehr schmackhafte Essensreize beinhalten, ansteigt, scheint eine Verminderung der Aufgabenleistung nicht durch das momentane Erleben solcher Cravings vermittelt zu sein. Habituelles Erleben von Craving ist dahingegen mit einer geringen Inhibitionsleistung auf hochkalorische Essensreize assoziiert, allerdings nicht mit einer eingeschränkten Arbeitsgedächtnisleistung. Zukünftige Studien sollten sich der Frage widmen, ob häufiges Erleben von Craving, und entsprechend auch der Einfluss von Essensreizen auf die Verhaltenshemmung, durch essensbezogene Inhibitionstrainings reduziert werden kann. Momentanes Craving und EKPs während der Präsentation von Essensreizen können leicht durch kognitive Strategien moduliert werden. Die LPP stellt hier wohl allerdings kein direktes Maß des Erlebens von Craving dar. Zu guter Letzt könnte HRV-Biofeedback ein nützliches, zusätzliches Therapieelement bei Störungen, die mit häufigem und intensivem Craving nach Nahrungsmitteln einhergehen, darstellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Arbeit Instrumente zur Erfassung von Craving nach Nahrungsmitteln im deutschen Sprachraum bereitgestellt hat und differenzielle Zusammenhänge zwischen momentanem und habituellem Craving mit selbstberichtetem Diätverhalten, durch Essensreize beeinträchtige exekutive Funktionen, EKPs und HRV-Biofeedback, aufgezeigt wurden. Diese Ergebnisse stellen vielversprechende Ansatzpunkte für Interventionen zur Reduktion von Craving nach Nahrungsmitteln dar, die auf (1) essensbezogenen Verhaltenstrainings der exekutiven Funktionen, (2) kognitiven Craving-Regulationsstrategien, und (3) physiologischen Parametern wie beispielsweise HRV-Biofeedback, basieren. KW - Craving KW - Essgewohnheit KW - Nahrung KW - food craving KW - Heißhunger KW - eating behavior KW - self-regulation KW - Essverhalten KW - Selbstregulation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104597 ER - TY - THES A1 - Hertlein, Tobias T1 - Visualization of Staphylococcus aureus infections and antibiotic therapy by bioluminescence and 19F magnetic resonance imaging with perfluorocarbon emulsions T1 - Darstellung von Staphylococcus aureus Infektionen und Antibiotikatherapie durch Biolumineszenzbildgebung und 19F-Kernspintomografie mit Perfluorcarbon-Emulsionen N2 - Staphylococcus aureus is a major threat to public health systems all over the globe. This second most cause of nosocomial infections is able to provoke a wide variety of different types of infection in humans and animals, ranging from superficial skin and skin structure infections to invasive disease like sepsis or pneumonia. But not enough, this pathogen is also notorious in acquiring and/or developing resistance to antimicrobial compounds, thus limiting available treatment options severely. Therefore, development of new compounds and strategies to fight S. aureus is of paramount importance. But since only 1 out of 5 compounds, which entered clinical trials, becomes a drug, the preclinical evaluation of promising compounds has to be reconsidered, too. The aim of this thesis was to address both sides of this problem: first, to improve preclinical testing by incorporating in vivo imaging technologies to the preclinical testing procedure in order to acquire additional and clearer data about efficacy of promising compounds and second, by evaluating lysostaphin, which is a promising, new option to fight S. aureus infections. The first aim of this thesis focused on the establishment of a dual modality in vivo imaging platform, consisting of Bioluminescence Imaging (BLI) and Magnetic Resonance Imaging (MRI), to offer detailed insights into the course and gravity of S. aureus infection in the murine thigh infection model. Since luciferase-expressing S. aureus strains were generated in former studies and enabled thus bioluminescence imaging of bacterial infection, this technology should be implemented into the compound evaluation platform in order to non-invasively track the bacterial burden over time. MRI, in contrast, was only rarely used in earlier studies to visualize and measure the course of infection or efficacy of anti-bacterial therapy. Thus, the first set of experiments was performed to identify benefits and drawbacks of visualizing S. aureus infections in the mouse model by different MR methods. Native, proton-based MR imaging showed in this regard increased T2 relaxation times in the infected thigh muscles, but it was not possible to define a clear border between infected and uninfected tissue. Iron oxide nanoparticles and perfluorocarbon emulsions, two MR contrast agents or tracer, in contrast, offered this distinction. Iron oxide particles were detected in this regard by their distortion of 1H signal in proton-based MRI, while perfluorocarbon emulsion was identified by 19F MRI. Mammals do not harbor sufficient intrinsic amounts of 19F to deliver specific signal and therefore, 19F MR imaging visualizes only the signal of administered perfluorocarbon emulsion. The in vivo accumulation of perfluorocarbon emulsion can be imaged by 19F MRI and overlayed on a simultaneously acquired 1H MR image, which shows the anatomical context in clear detail. Since this is advantageous compared to contrast agent based MR methods like iron oxide particle-based MRI, further experiments were performed with perfluorocarbon emulsions and 19F MRI. Experimental studies to elucidate the accumulation of perfluorocarbon emulsion at the site of infection showed robust 19F MR signals after administration between day 2 and at least day 8 p.i.. Perfluorocarbon emulsion accumulated in all investigated mice in the shape of a ‘hollow sphere’ at the rim of the abscess area and the signal remained stable as long as the infection prevailed. In order to identify the mechanism of accumulation, flow cytometry, cell sorting and histology studies were performed. Flow cytometry and cell sorting analysis of immune cells at the site of infection showed that neutrophils, monocytes, macrophages and dendritic cells carried contrast media at the site of infection with neutrophils accounting for the overwhelming portion of perfluorocarbon signal. In general, most of the signal was associated with immune cells, thus indicating specific immune cell dependent accumulation. Histology supported this observation since perfluorocarbon emulsion related fluorescence could only be visualized in close proximity to immune cell nuclei. After establishing and testing of 19F MRI with perfluorocarbon emulsions as infection imaging modality, the effects of antibiotic therapy upon MR signal was investigated in order to evaluate the capability of this modality for preclinical testing procedure. Thus, the efficacy of vancomycin and linezolid, two clinically highly relevant anti - S. aureus compounds, were tested in the murine thigh infection model. Both of them showed reduction of the colony forming units and bioluminescence signal, but also of perfluorocarbon emulsion accumulation strength and volume at the site of infection, which was visualized and quantified by 19F MRI. The efficacy pattern with linezolid being more efficient in clearing bacterial infection was shown similarly by all three methods. In consequence, 19F MRI with perfluorocarbon emulsion as MR tracer proved to be capable to visualize antibacterial therapy in preclinical testing models. The next step was consequently to evaluate a promising new compound against S. aureus infections. Thus, lysostaphin, an endo-peptidase that cleaves the cell wall of S. aureus, was tested in different concentrations alone or in combination with oxacillin for efficacy in murine thigh and catheter associated infection models. Lysostaphin only in the concentration of 5 mg/kg body weight or combined with oxacillin in the concentration of 2 mg/kg showed strong reduction of bacterial burden by colony forming unit determination and bioluminescence imaging in both models. The perfluorocarbon accumulation was investigated in the thigh infection model by 19F MRI and was strongly reduced in terms of volume and signal strength in both above-mentioned groups. In general, lysostaphin showed comparable or superior efficacy than vancomycin or oxacillin alone. Therefore, further development of lysostaphin for the treatment of S. aureus infections is recommended by these experiments. Overall, the antibiotic efficacy pattern of all applied antibiotic regimens was similar with all three applied methods, demonstrating the usefulness of MRI for antibiotic efficacy testing. Importantly, treatment with oxacillin either alone or in combination with lysostaphin resulted in stronger perfluorocarbon emulsion accumulation at the site of infection than expected compared to the results from bioluminescence imaging and colony forming unit determination. This might be an indication for immunomodulatory properties of oxacillin. Further murine infection experiments demonstrated in this context a differential release of cytokine and chemokines in the infected thigh muscle in dependence of the applied antibacterial therapy. Especially treatment with oxacillin, but to a less degree with minocycline or linezolid, too, exhibited high levels of various cytokines and chemokines, although they reduced the bacterial burden efficiently. In consequence, possible immunomodulatory effects of antibacterial compounds have to be taken into account for future applications of imaging platforms relying on the visualization of the immune response. However, this observation opens a new field for these imaging modalities since it might be extraordinary interesting to study the immunomodulatory effects of compounds or even bacterial factors in vivo. And finally, a two modality imaging platform which combines methods to visualize on the one hand the bacterial burden and on the other hand the immune response offers an innovative, new platform to study host-pathogen interaction in vivo in a non-invasive fashion. In summary, it could be shown that perfluorocarbon emulsions accumulate in immune cells at the site of infection in the murine S. aureus thigh infection model. The accumulation pattern shapes a ‘hollow sphere’ at the rim of the abscess area and its size and perfluorocarbon content is dependent on the severity of disease and/or efficacy of antibiotic therapy. Thus, 19F MRI with perfluorocarbon emulsions is a useful imaging modality to visualize sites and course of infection as well as to evaluate promising antibacterial drug candidates. Furthermore, since the accumulation of tracer depends on immune cells, it might be additionally interesting for studies regarding the immune response to infections, auto-immune diseases or cancer, but also to investigate the efficacy of immunomodulatory compounds and immunization. N2 - Staphylococcus aureus ist als zweithäufigste Ursache nosokomialer Infektionen eine ernste Bedrohung für Gesundheitssysteme weltweit. Dieses Pathogen ist in der Lage eine Vielzahl verschiedener Krankheitsformen, von oberflächlichen Wund- und Gewebsinfektionen bis hin zu invasiven Erkrankungen wie Bakteriämie oder Pneumonie, in Mensch und Tier zu verursachen. Zudem erwies sich dieser Krankheitserreger in der Vergangenheit als höchst anpassungsfähig durch den Erwerb oder die Entwicklung von Resistenzen gegenüber antibakterieller Substanzen, wodurch die Verfügbarkeit wirksamer Therapiemöglichkeiten drastisch eingeschränkt wurde. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer Antibiotika und Behandlungsstrategien gegen S. aureus Infektionen von enormem gesellschaftlichem Interesse. Da aber lediglich eine von fünf Substanzen, die in klinische Studien eintreten, später als Medikament zugelassen wird, sollte die präklinische Evaluierung neuer, vielversprechender Therapeutika ebenso verbessert und überdacht werden. Diese Doktorarbeit addressiert in diesem Zusammenhang beide Facetten: zum einen wurde durch Einbeziehung von in vivo Bildgebungstechnologien ein deutlicheres Bild von der Effizienz neuer Substanzen während der präklinischen Evaluierung ermöglicht, zum anderen wurde mit Lysostaphin eine neuartige Substanzklasse zur Behandlung von S. aureus Infektionen getestet. Primärziel dieser Arbeit war deshalb die Entwicklung und Etablierung einer dualen Bildgebungsplattform bestehend aus Biolumineszenz- (BLI) und Kernspintomografischer (MRI) Bildgebung, um detaillierte Einblicke in Verlauf und Schwere von S. aureus Infektionen im Muskelinfektionsmodell der Maus zu ermöglichen. Die Biolumineszenzbildgebung bakterieller Infektionen wurde durch die Entwicklung von Luziferase-exprimierenden S. aureus Stämmen bereits in früheren Arbeiten ermöglicht und wurde in die Bildgebungsplatform integriert, um die Entwicklung der Bakterienlast nicht-invasiv verfolgen zu können. Kernspintomografie wurde in früheren Arbeiten hingegen kaum zur Darstellung der Effizienz anti-bakterieller Therapien während der Präklinik verwendet. Aus diesem Grund dienten die ersten Experimente zur Erkennung von Vor- und Nachteilen der Darstellung von S. aureus Infektionen im Tiermodell durch verschiedene Kernspintomografische Bildgebungsmethoden. Native, Protonen-basierte Kernspintomografie wies verlängerte T2 Relaxationszeiten im infizierten Muskelgewebe nach, doch eine klare Eingrenzung des infizierten Bereiches war nicht möglich. Die Anwendung von Eisenoxid und Perfluorcarbon Nanopartikeln, zwei Kontrastmittel zur Kernspintomografie, ermöglichte ebendiese. Eisenoxid Nanopartikel wurden durch ihren Signalstöreffekt auf das MR Protonensignal detektiert, während Perfluorcarbon Emulsionen durch 19F basierte Kernspintomografie nachgewiesen wurden. Säugetiere verfügen nicht über ausreichende Mengen von 19F Atomen, um ein spezifisches Signal zu liefern, weshalb 19F Kernspintomografie lediglich applizierte Perfluorcarbon Emulsion in vivo abbilden kann. Dieses Bild kann dann über ein zugleich aufgenommenes Protonen MR Bild gelegt werden, wodurch die Akkumulation des Kontrastmittels im Detail in anatomischer Umgebung dargestellt werden kann. Da es sich hierbei um einen Vorteil gegenüber anderen Kontrastmittel-basierten MR Bildgebungsmethoden wie Eisenoxid Nanopartikel gestützter Kernspintomografie handelt, wurden nachfolgende Experimente mit Perfluorcarbon Emulsionen durchgeführt. Studien zur Bildgebung der Perfluorcarbon Akkumulation am Infektionsherd des Muskelabszessmodels von S. aureus in der Maus zeigten deutliches 19F MR Signal nach Gabe zwischen Tag 2 und Tag 8 p.i.. In allen untersuchten Tieren zeigte sich eine Ansammlung des Kontrastmittels in Form einer Hohlkugel um den Abszessbereich, wobei das Signal während der gesamten Infektion stabil war. Um den Akkumulationsmechanismus zu identifizieren, wurden Durchflusszytometrie-, Zellseparations- und histologische Experimente durchgeführt. In diesem Zusammenhang erwiesen sich Neutrophile, Makrophagen, Monozyten und Dendritische Zellen als Perfluorcarbon-tragende Immunzelltypen, wobei das Gros an Kontrastmittel in Neutrophilen nachgewiesen werden konnte. Im Allgemeinen war der Großteil des Perfluorcarbonsignals mit Immunzellen assoziert, weshalb eine spezifische Immunzell-abhängige Akkumulation wahrscheinlich erscheint. Die histologischen Untersuchungen stützten diese Beobachtung, da die Kontrastmittel assoziierten Fluoreszenzmarker nur in der Nähe von Immunzellnuclei gefunden werden konnten. Die Etablierung von 19F Kernspintomografie mit Perfluorcarbon Emulsionen als Infektionsbildgebungsmethode ermöglichte im nächsten Schritt die Untersuchung von antibakterieller Therapie auf das MR Signal, um die Eignung dieser Methode für die Präklinik zu evaluieren. Deshalb wurden die Wirksamkeit von Vancomycin und Linezolid, zweier klinisch höchst relevanter Antibiotika zur Behandlung von S. aureus Infektionen, im Muskelabszessmodel der Maus untersucht. Beide erwiesen sich als effizient in der Verringerung der bakteriellen Last im infizierten Muskel und des Bakterien-Biolumineszenzsignals, aber auch bei der Reduktion der Stärke und des Volumens der Perfluorcarbon Akkumulation am Infektionsherd, die durch 19F Kernspintomografie dargestellt und vermessen wurde. Alle drei Methoden zeigten dabei das gleiche Effizienzmuster nach dem Linezolid wirksamer bei der Bekämpfung der Infektion war. Folglich erwies sich 19F Kernspintomografie mit Perfluorcarbon Emulsionen als effektiv um den antibakteriellen Effekt von Antibiotika in präklinischen Modellen zu untersuchen. Konsequenterweise wurde im nächsten Schritt eine neuartige Substanz zur Behandlung von S. aureus Infektionen mit Hilfe der Bildgebungsplattform untersucht: Lyostaphin. Diese Endopeptidase schneidet spezifisch die Zellwand von S. aureus und wurde in verschiedenen Konzentrationen oder in Kombination mit Oxacillin im Muskelabszess- oder Katheterinfektionsmodell der Maus gestestet. Lysostaphin in der Konzentration von 5 mg/kg Körpergewicht (Maus) oder Lysostaphin in der Konzentration von 2 mg/kg in Kombination mit Oxacillin führten zu einer starken Verringerung der Bakterienlast und des Biolumineszenzsignals in beiden Modellen. Die Ansammlung von Perfluorcarbon Kontrastmittel war zudem in diesen beiden Gruppen stark reduziert im Vergleich zur Negativkontrolle und den mit Vancomycin und Oxacillin behandelten Tieren. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Lysostaphin eine vergleichbare oder bessere Wirksamkeit als Vancomycin oder Oxacillin alleine lieferte. Aus diesem Grund scheint eine Weiterentwicklung dieser Substanz zur Behandlung von S. aureus empfohlen. Der Nutzen der Bildgebungsplattform wurde in diesen Experimenten zudem dadurch deutlich, dass alle drei Methoden zur Bestimmung der Schwere der Erkrankung ähnliche Wirksamkeiten der Antibiotika anzeigten. Dennoch muss festgestellt werden, dass die Gruppen, die Oxacillin entweder alleine oder in Kombination mit Lysostaphin erhielten, stärkere Perfluorocarbon Akkumulation am Infektionsherd aufwiesen als von den Bakterienlast- oder Biolumineszenz-Ergebnissen zu erwarten gewesen wäre. Ein Grund hierfür könnten mögliche immunomodulatorischen Effekte von Oxacillin sein. Tatsächlich zeigten weitere Experimente Variationen in den Konzentrationen von Cytokinen und Chemokinen im infizierten Muskel in Abhängigkeit der verwendeten Antibiotikatherapie. Besonders die Behandlung mit Oxacillin, in geringerem Maße aber auch mit Minocyclin oder Linezolid, führte zu erhöhten Konzentrationen, wenngleich die Bakterienlast deutlich reduziert werden konnte. Folglich sollten mögliche immuno-modulatorischen Effekte antibakterieller Substanzen bei zukünftiger Anwendung von Bildgebungsplattform, die auf dem Markieren von Immunzellen basieren, mit ins Kalkül gezogen werden. Auf der anderen Seite eröffnet diese Beobachtung ein neues Anwendungsfeld für diese Bildgebungsmethoden, da es außerordentlich interessant erscheint, damit immuno-modulatorische Substanzen oder bakterielle Faktoren in vivo zu untersuchen. Zu guter Letzt, ermöglicht diese Bildgebungsplattform, die Methoden zur Darstellung der bakteriellen Last auf der einen und des Immunsystems auf der anderen Seite verknüpft, eine innovative, neue Möglichkeit Wirt-Pathogen Interaktionen nicht-invasiv und in vivo studieren zu können. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Perfluorcarbon Emulsionen in Immunzellen am Infektionsherd des S. aureus Muskelabszessmodells der Maus akkumulieren. Die Ansammlung formt eine Hohlkugel am Rand des Abszessbereiches, deren Größe und Fluorgehalt von der Schwere der Erkrankung und/oder der Wirksamkeit der angewandten Antibiotikatherapie abhängt. Aus diesem Grund erwies sich 19F Kernspintomografie mit Perfluorcarbon Emulsionen als Kontrastmittel als nützliche Platform zur präklinischen Evaluierung antibakterieller Substanzen. Weiterhin erscheint diese Methode wegen der Akkumulation des Kontrastmittels in Immunzellen, als interessant zum Studium der Immunantwort gegenüber Infektionen, aber auch Krebs oder Autoimmunerkrankungen sowie zur Erforschung von immuno-modulatorischen Substanzen und Impfansätzen. KW - Staphylococcus aureus KW - Kernspintomographie KW - Infektion KW - In vivo Imaging KW - Infection imaging KW - Infektionsbildgebung KW - Antibiotikum KW - Bilderzeugung KW - Molekulare Bildgebung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105349 ER - TY - THES A1 - Li, Xiang T1 - Molecular imaging of inflammation in atherosclerosis: Preclinical study in Apolipoprotein E-Deficient mice and preliminary evaluation in human using positron emission tomography T1 - Molekulare Bildgebung inflammatorischer Prozesse bei Atherosklerose: Präklinische Studie in Apolipoprotein-E Knockout-Mäusen sowie erste Evaluation humaner PET-Studien N2 - Motivation and Aim: Cardiovascular disease has been the leading cause of mortality and morbidity throughout the world. In developed countries, cardiovascular diseases are already responsible for a majority of deaths and will become the pre-eminent health problem worldwide (1,2). Rupture of atherosclerotic plaque accounts for approximately 70% of fatal acute myocardial infarction and sudden heart deaths. Conventional criterias for the diagnosis of “vulnerable plaques” are calcified nodules, yellow appearance of plaque, a thin cap, a large lipid core, severe luminal stenosis, intraplaque hemorrhage, inflammation, thrombogenicity, and plaque injury (3-5). Noninvasive diagnosis of vulnerable plaque still remains a great challenge and a huge research prospect, which triggered us to investigate the feasibility of PET imaging on the evaluation of atherosclerosis. Nuclear imaging of atherosclerosis， especially co-registered imaging modalities, could provide a promising diagnostic tool including both anatomy and activities to identify vulnerable atherosclerotic plaque or early detection of inflammatory endothelium at risk. Furthermore, the development of specific imaging tracers for clinical applications is also a challenging task. The aim of this work was to assess the potential of novel PET imaging probes associated with intra-plaque inflammation on animal models and in human respectively. Methods In this work, several molecular imaging modalities were employed for evaluation of atherosclerosis. They included Positron emission tomography / Computed tomography (PET/CT) for human studies, and micro-PET, autoradiography and high-resolution magnetic resonance imaging (MRI) for animal studies. Radiotracers for PET imaging included the glucose analogue 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG), the somatostatin receptor avide tracer 68Ga-DOTATATE, and the Gallium-68 labeled fucoidan (68Ga-Fucoidan), which was developed as a PET tracer to detect endothelial P-selectin, which overexpressed at early stage of atherosclerosis and endothelial overlying activated plaque. Tracer’s capabilities were firstly assessed on cellular level in vitro. Subsequently, Animal studies were conducted in two animal models: 1, Apolipoprotein E (ApoE-/-) mice having severe atherosclerotic plaque; 2, Lipopolysaccharide (LPS) -induced mice for receiving acute vascular inflammation. Corresponding analyses on protein and histological level were conducted as well to confirm our results. In human study, 16 patients with neuroendocrine tumors (NETs) were investigated on imaging vascular inflammation. These patients had undergone both 68Ga-DOTATATE PET/CT and 18F-FDG PET/CT for staging or restaging within 6 weeks. 16 patients were randomized into two groups: high-risk group and low-risk group. Uptake ratio of both tracers from two groups were compared and correlated with common cardiovascular risk factors. Results and Conclusion In murine study, the expression of somatostatin receptor 2, which is the main bio-target of 68Ga-DOTATATE on macrophage/monocyte was confirmed by flow cytometry and immunohistochemistry. Prospectively, high specific accumulation of 68Ga-DOTATATE to the macrophage within the plaques was observed in aorta lesions by autoradiography and by micro-PET. In study with 68Ga-fucoidan, a strong expression of P-selectin on active endothelium overlying on inflamed plaque but weaker on inactive plaques was confirmed. Specific focal uptake of 68Ga-fucoidan were detected at aorta segments by micro-PET, and correlated with high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), which was used to characterize the morphology of plaques. 68Ga-fucoidan also showed a greater affinity to active inflamed plaque in comparison of inactive fibrous plaque, which was assessed by autoradiography. Specificity of 68Ga-DOTATATE and 68Ga-fucoidan were confirmed by ex-vivo blocking autoradiography and in vivo blocking PET imaging respectively. In human study, focal uptake of both 18F-FDG and 68Ga-DOTATATE was detected. Analyzing concordance of two tracers’ uptake ratio, Out of the 37 sites with highest focal 68Ga-DOTATATE uptake, 16 (43.2%) also had focal 18F-FDG uptake. Of 39 sites with highest 18F-FDG uptake, only 11 (28.2%) had a colocalized 68Ga-DOTATATE accumulation. Correlated tracers’ uptake and calcium burden and risk factors, Mean target-to-background ratio (TBR) of 68Ga-DOTATATE correlated significantly with the presence of calcified plaques (r=0.52), hypertension (r=0.60), age (r=0.56) and uptake of 18F-FDG (r=0.64). TBRmean of 18F-FDG correlated significantly only with hypertension (r=0.58; p<0.05). Additionally, TBRmean of 68Ga-DOTATATE is significant higher in the high risk group while TBRmean of 18F-FDG is not. In conclusion, we evaluated vascular inflammation of atherosclerosis non-invasively using the two PET tracers: 68Ga-DOTATATE and 68Ga-Fucoidan. 68Ga-DOTATATE show specific affinity to infiltrated macrophage within the plaques. 68Ga-Fucoidan may hold the potential to discriminate between active and inactive atherosclerotic plaques in terms of variant accumulation on different-types of plaques. PET as leading molecular imaging technique provides superiority in assessing cellular activity, which is pivotal for understanding internal activity of atherosclerotic plaques. Since diagnosis of atherosclerosis is a complex and multi-dimensional task. More integrated imaging technology such as PET/MRI, faster imaging algorithm, more efficient radiotracer are required for further development of atherosclerosis imaging, N2 - Ziel: Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen die häufigste Todesursache der westlichen Industrieländer dar und führen zu einem zunehmenden Gesundheitsproblem weltweit. (1,2). Ca. 70 % aller akuten Myocardinfarkte sind auf die Ruptur atherosklerotischer Plaques zurück zuführen, deren typische Charakteristika ein kalzifizierter, lipidhaltiger Kern, überzogen von einer dünnen fibrösen Kappe, darstellt. Innerhalb der atherosklerotischer Plaques kommt es zu Makrophageneinlagerung und im weiteren Verlauf zu entzündlichen und angiogentischen Prozesse, die zu Einblutungen führen und die Instabilität der Plaques zur Folge hat (3-5). Die nichtinvasive Diagnostik rupturgefährdeter Plaques stellt immer noch eine große medizinische Herausforderung dar. Die nuklearmedizinische Bildgebung, kombiniert mit MRT/CT zur anatomischen Co-Registrierung, könnte eine verbesserte diagnostische Methode zur Darstellung rupturgefährdeter atherosklerotischen Plaques und frühzeitiger entzündlicher Prozesse darstellen. Ziel dieser Arbeit war es daher, atherosklerosische Plaques mittels Positronen¬emissions¬tomografie (PET) unter Verwendung neuer PET Tracer für die Darstellung von Entzündungs¬prozesse im Tiermodell und der humanen Anwendung zu untersuchen. Material und Methoden: Im Rahmen dieser Arbeit kamen verschiedene bildgebende Verfahren zur Anwendung. Im Einzelnen waren dies PET/CT bei humanen Studien sowie micro-PET, Autoradiografie und hochauflösende Magnetresonanztomografie (MRT) bei Untersuchungen im Tiermodell. Als PET-Tracer wurden das Glukosederivat 18F-Flurodesoxyglukose (18F-FDG), 68Ga-DOTATATE, das an Somatostatin-Rezeptoren bindet sowie Gallium-68 markiertes Fucoidan (68Ga-Fucoidan) verwendet. Bei 68Ga-Fucoidan handelt es sich um einen neu entwickelten PET-Tracer zur Darstellung von P-Selectin, welches an aktivieren Plaques im frühen Stadium der Atherosklerose überexprimiert wird. Die Untersuchungen im Tiermodell fanden sowohl an Apolipoprotein E Knockout-Mäusen (ApoE-/-) als auch an Lipopolysaccharid- (LPS) induzierten Mäusen statt. Des Weiteren wurden uptake-Untersuchungen auf in Zellkulturexperimenten durchgeführt. Zur Bestätigung der der Untersuchungsergebnisse wurden zusätzlich histochemische Untersuchungen durchgeführt. Im Rahmen der humanen Studien wurden 16 Patienten mit neuroendokrinenen Tumoren (NET) hinsichtlich vaskulärer Entzündungsprozesse untersucht. Alle Patienten erhielten ein 68Ga-DOTATATE PET/CT und 18F-FDG PET/CT zum Staging bzw. Restaging innerhalb von 6 Wochen. Die Einteilung der Patienten erfolgte in zwei Gruppen: hohes Risiko und geringes Risiko. Die uptake-Verhältnisse beider Tracer in beiden Gruppen wurden mit einander verglichen und hinsichtlich bekannter cardiocaskulärer Risikofaktoren in Beziehung gesetzt. Ergebnisse und Zusammenfassung: Die Expression der Somatostatin-Rezeptor Subtyps 2, an den 68Ga-DOTATATE an Makrophagen/Monocyten bindet, konnte mittels flow cytometrischer und immunhistochemischer Experimente im Mausmodell bestätigt werden. Mit Hilfe von micro-PET Untersuchungen und Autoradiografie wurde eine hohe spezifische Anreicherung von 68Ga-DOTATATE an Makrophagen innerhalb der Plaques beobachtet.Im Rahmen der Untersuchungen mit 68Ga-Fucoidan konnte eine hohe P-Selectin-Expression an aktiviertem Endothelium, welches die entzündlichen Plaques überlagert festgestellt werden. Bei inaktiven Plaques hingegen zeigte sich eine geringe P-Selectin-Expression. In micro-PET-Studien konnte ein spezifischer fokaler uptake von 68Ga-Fucoidan in der Aorta nachgewiesen werden. Dieser korrelierte mit den zusätzlich durchgeführten MRT-Unter¬suchungen zur Charakterisierung der Plaquemorphologie. Mittels Autoradiografie konnte nachgewiesen werden, dass 68Ga-Fucoidan eine höhere Affinität zu aktivierten entzündlichen Plaques im Vergleich zu inaktivieren fibrösen Plaques zeigt. Die spezifische Bindung von 68Ga-DOTATATE und 68Ga-Fucoidan wurde über Blockadeexperimente mittels Autoradiografie und PET bestätigt. In der humanen Anwendung wurde ein fokaler uptake von 18F-FDG und 68Ga-DOTATATE detektiert. Die Analyse der Übereinstimmung des uptakes beider Tracer ergab: Von 37 spots mit hohem 68Ga-DOTATATE-uptake zeigten 16 (43,2 %) ebenfalls einen fokalen 18F-FDG -uptake. Von 39 spots mit hohem 18F-FDG -uptake zeigten nur 11(28,2%) eine 68Ga-DOTATATE-Anreicherung. Betrachtet man den Tracer-uptake hinsichtlich des Calcium-burden und weiterer Risikofakoren, so ergeben sich folgende Korrelationskoeffizienten: TBRmean of 68Ga-DOTATATE korreliert signifikant mit der Anwesenheit von kalzifizierten Plaques (r=0,52), Blutdruck (r=0,60), Alter (r=0,56) und 18F-FDG uptake (r=0,64). Eine signifikante Korrelation von TBRmean 18F-FDG konnte lediglich beim Risikofaktor Blutdruck (r=0,58, p<0,05) festgestellt werden. Weiterhin zeigte sich, dass der TBRmean von Ga-DOTATATE in der Hoch-Risiko-Gruppe signifikant höher, dies gilt jedoch nicht für TBRmean 18F-FDG. Zusammenfassung: In dieser Arbeit wurden die vaskulären Entzündungsprozessen der Atherosklerose mittels der nichtinvasiven PET unter Verwendung von 68Ga-DOTATATE und 68Ga-Fucoidan untersucht und bewertet. 68Ga-DOTATATE zeigte eine spezifische Affinität zu Makrophagen innerhalb der atherosklerotischen Plaques. Mit 68Ga-Fucoidan konnt zwischen aktiven und inaktiven Plaques unterschieden werden. Die molekulare Bildgebung mittels PET eignet sich hervorragend zur Darstellung und Untersuchung molekularer Prozesse innerhalb atheroskerotischer Plaques. Dennoch sind weiterführende Technologien wie PET/MR, schnellere Algorithmen, hoch spezifische Radiotracer zur Weiterentwicklung der PET-Bildgebung atherosklerotischer Plaques notwendig. KW - Arteriosklerose KW - Entzündung KW - Makrophage KW - Positronen-Emissions-Tomographie KW - Non-invasive imaging KW - Atherosclerosis KW - PET KW - Nuclear imaging KW - Inflammation KW - Positron emission tomography KW - Vulnerable plaque KW - Macrophage Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104622 ER - TY - THES A1 - Moitinho e Silva, Lucas T1 - Exploration of microbial diversity and function in Red Sea sponges by deep sequencing T1 - Untersuchungen zur mikrobiellen Diversität und Funktion in Schwämmen aus dem Roten Meer mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung N2 - Marine sponges (phylum Porifera) are simple, sessile, filter-feeder animals. Microbial symbionts are commonly found in the sponge internal tissue, termed the mesohyl. With respect to the microbial content, sponges are classified as either low-microbial abundance sponges (LMA), or high-microbial abundance sponges (HMA). The HMA/LMA dichotomy was explored in this Thesis using the Red Sea sponges as experimental models. A range of methods encompassing transmission electron microscopy, 16S rRNA gene deep sequencing, and metatranscriptomics was employed towards this goal. Here, particular emphasis was placed on the functional analysis of sponge microbiomes. The Red Sea sponges Stylissa carteri, Xestospongia testudinaria, Amphimedon ochracea, and Crella cyathophora were classified as HMA or LMA sponges using transmission electron microscopy. The diversity, specificity, and transcriptional activity of microbes associated with the sponges S. carteri (LMA) and X. testudinaria (HMA) and seawater were investigated using 16S rRNA amplicon pyrosequencing. The microbial composition of S. carteri was more similar to that of seawater than to that of X. testudinaria, which is consistent with the observation that the sequence data set of S. carteri contained many more possibly seawater sequences (~24%) than the X. testudinaria data set (~6%). The most abundant operational taxonomic units (OTUs) were shared between all three sources (S. carteri, X. testudinaria, seawater), while rare OTUs were unique to any given source. Despite this high degree of overlap, each sponge species contained its own specific microbiota. S. carteri microbiomes were enriched of Gammaproteobacteria and members of the genus Synechococcus and Nitrospira. Enriched members of X. testudinaria microbiomes included Chloroflexi, Deferribacteres, and Actinobacteria. The transcriptional activity of sponge-associated microorganisms was assessed by comparing 16S rRNA gene with transcript amplicons, which showed a good correlation. The microbial functional gene repertoire of sponges and seawater from the Red Sea (X. testudinaria, S. carteri) and the Mediterranean (Aplysina aerophoba, Dysidea avara) were investigated with the environmental microarray GeoChip 4. Amplicon sequencing was performed alongside in order to assess microbial diversity. The typical microbial diversity patterns characteristic of HMA (abundance of Gammaproteobacteria, Chloroflexi, Acidobacteria, Deferribacteres, and others) and LMA sponges (abundance of Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria, Cyanobacteria, and Bacteroidetes) were confirmed. The HMA/LMA dichotomy was stronger than any possible geographic pattern based on microbial diversity (amplicon) and functional genes (GeoChip). However upon inspection of individual genes detected by GeoChip, very few specific differences were discernible, including differences related to microbial ammonia oxidation, ammonification (higher gene abundance in sponges over seawater) as well as denitrification (lower gene abundance). Furthermore, a higher abundance of a gene, pcc, representative of archaeal autotrophic carbon fixation was noted in sponges over seawater. Thirdly, stress-related genes, in particular those related to radiation, were found in lower abundances in sponge microbiomes than in seawater. With the exception of few documented specific differences, the functional gene repertoire between the different sources appeared largely similar. The most actively expressed genes of S. carteri microbiomes were investigated with metatranscriptomics. Prokaryotic mRNA was enriched from sponge total RNA, sequenced using Illumina HiSeq technology, and annotated with the metagenomics Rapid Annotation using Subsystem Technology (MG-RAST) pipeline. High expression of archaeal ammonia oxidation and photosynthetic carbon fixation by members of the genus Synechococcus was detected. Functions related to stress response and membrane transporters were among the most highly expressed by S. carteri symbionts. Unexpectedly, gene functions related to methylotrophy were highly expressed by gammaproteobacterial symbionts. The presence of seawater-derived microbes is indicated by the phylogenetic proximity of organic carbon transporters to orthologs of members from the SAR11 clade. In summary, the most expressed functions of the S. carteri-associated microbial community were revealed and linked to the dominant taxonomic members of the microbiome. In conclusion, HMA and LMA Red Sea sponges were used as models to gain insights into relevant themes in sponge microbiology, i.e. diversity, specificity, and functional activities. Overall, my Thesis contributes to a better understanding of sponge-associated microbial communities, and the implications of this association to marine ecology. N2 - Marine Schwämme (phylum Porifera) sind einfache, sessile, sich mittels Filtration von Meerwasser ernährende Tiere. Das Schwammgewebe, als Mesohyl definiert, ist häufig durch mikrobielle Symbionten besiedelt. Im Hinblick auf die mikrobielle Abundanz werden Schwämme in sogenannte „low-microbial abundance“ (LMA) oder „high microbial abundance“ (HMA) Kategorien unterteilt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die „HMA/LMA-Dichotomie“ anhand von Schwämmen aus dem Roten Meer untersucht. Verschiedene Methoden, wie die Transmissions-Elektronenmikroskopie, 16S rRNA Gen-Hochdurchsatz-Sequenzierung sowie die Metatranskriptomik kamen zum Einsatz. Ein besonderes Augenmerk wurde auf die funktionale Analyse der Schwammsymbionten gelegt. Die Schwämme Stylissa carteri, Xestospongia testudinaria, Amphimedon ochracea und Crella cyathophora aus dem Roten Meer wurden zunächst mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie als HMA oder LMA-Schwämme klassifiziert. Die Diversität, Spezifizität sowie transkriptionelle Aktivität von mit S. carteri (LMA), X. testudinaria (HMA) oder Meerwasser-assoziierten Mikroorganismen wurde mittels 16S rRNA Gen-Ampliconsequenzierung untersucht. Die mikrobielle Zusammensetzung von S. carteri ähnelte mehr der des Meerwassers als der von X. testudinaria, was mit dem Befund übereinstimmt, dass der Sequenzdatensatz von S. carteri deutlich mehr Meerwassersequenzen enthielt (~ 24%) als der von X. testudinaria (6%). Die am häufigsten vorliegenden „operational taxonomic units“ (OTUs) lagen gleichermaßen im Probenmaterial (S. carteri, X. testudinaria, Meerwasser) vor, während die am wenigsten häufigen OTUs jeweils spezifisch für eine Probe waren. Trotz der hohen Gemeinsamkeiten enthielt jede Schwammart ein eigenes Bakterienprofil. Die Mikrobiome von S. carteri waren durch Gammaproteobacteria, sowie Vertreter der Gattung Synechococcus und Nitrospira angereichert. Häufige Vertreter des X. testudinaria Mikrobioms waren Chloroflexi, Deferribacteres und Actinobacteria. Die transcriptionelle Aktivität von Schwamm-assoziierten Mikroorganismen wurde auf der Basis von 16S rRNA-Genen und 16S rRNA-Transkripten verglichen und zeigte eine gute Korrelation. Das funktionale Genrepertoire von Schwämmen und Meerwasser aus dem Roten Meer (X. testudinaria, S. carteri) und dem Mittelmeer (Aplysina aerophoba, Dysidea avara) wurde mittels des Mikroarrays GeoChip 4 verglichen. Die Ampliconsequenzierung wurde begleitend zur Charakterisierung der mikrobiellen Diversität durchgeführt. Die charakteristischen Diversitätsmuster von HMA-Schwämmen (Gammaproteobacteria, Chloroflexi, Acidobacteria, Deferribacteres und weitere) und LMA-Schwämmen (Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria, Cyanobacteria, Bacteroidetes) konnten bestätigt werden. Die HMA/LMA-Dichotomie war sowohl im Bezug auf die Diversität (Amplikon-Daten) als auch auf das funktionale Genrepertoire (GeoChip) deutlich stärker ausgeprägt als ein mögliches geographisches Muster. Jedoch konnten nach Analyse einzelner Gene nur wenige spezifische Unterschiede definiert werden. Diese betrafen beispielsweise die mikrobielle Ammonium-Oxidation, Ammonifikation (höhere Genabundanz in Schwämmen als Meerwasser) oder die Denitrifikation (niedrigere Genabundanz in Schwämmen als Meerwasser). Weiterhin wurde eine höhere Genabundanz des pcc -Gens in Schwämmen als im Meerwasser beschrieben. Dieses Gen gilt als Indikator für archaeale, autotrophe Kohlenstoff-Fixierung. Drittens wurde eine niedrige Genabundanz von Stress-Genen, insbesondere im Bezug auf UV-Strahlung, in Schwämmen als im Meerwasser beobachtet. Von wenigen spezifischen Ausnahmen abgesehen war das funktionale Genrepertoire zwischen dem Probenmaterial jedoch sehr ähnlich. Die am häufigsten exprimierten Gene des S. carteri Mikrobioms wurden mittels Metatranskriptomik untersucht. Zu diesem Zweck wurde die prokaryotische mRNA aus der Gesamt-Schwamm RNA angereichert, mittels Illumina HiSeq-Technologie sequenziert und mittels der MG-RAST-Software annotiert. Die mit am häufigsten exprimierten Gene betrafen die archaeale Ammonium-Oxidation und die photosynthetische Kohlenstoff-Fixierung durch Synechococcus. Weiterhin waren Stress- und Membrantransport-relevane Gene mit am häufigsten exprimiert. Unerwartet war der Befund, dass Methylotrophie-verwandte Gene ebenfalls sehr häufig exprimiert wurden. Das Vorliegen von Meerwasserbakterien ist durch die phylogenetische Nähe von organischen Kohlenstoff-Transportern zu Genen der SAR11-Klade belegt. Zusammenfassend wurden in dieser Studie die am häufigsten transkribierten Funktionen des S. carteri Mikrobioms beschrieben und bezüglich ihrer taxonomischen Zugehörigkeit analysiert. Zusammenfassend wurden HMA und LMA-Schwämme aus dem Roten Meer als experimentelle Modellsysteme verwendet, um Einblicke in für die Schwamm-Mikrobiologie relevante Fragen bezüglich der mikrobiellen Diversität, Spezifität und funktionalen Aktivität zu gewinnen. Diese PhD-Arbeit trägt zu einem verbesserten Verständnis der Mikrobiologie von Schwämmen sowie deren Bedeutung für die marine Ökologie im Allgemeinen bei. KW - Meeresschwämme KW - Rotes Meer KW - Bakterien KW - Marine sponge KW - Symbiosis KW - Red Sea KW - Deep sequencing KW - Bacteria KW - Microbial community KW - Diversity KW - Metatranscriptomics KW - Function Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103836 ER - TY - THES A1 - Zude, Ingmar T1 - Characterization of virulence-associated traits of Escherichia coli bovine mastitis isolates T1 - Charakterisierung Virulenz-assozierter Eigenschaften von Escherichia coli Isolaten boviner Mastitis N2 - Bacterial mastitis is caused by invasion of the udder, bacterial multiplication and induction of inflammatory responses in the bovine mammary gland. Disease severity and the cause of disease are influenced by environmental factors, the cow’s immune response as well as bacterial traits. Escherichia coli (E. coli) is one of the main causes of acute bovine mastitis, but although pathogenic E. coli strains can be classified into different pathotypes, E. coli causing mastitis cannot unambiguously be distinguished from commensal E. coli nor has a common set of virulence factors been described for mastitis isolates. This project focussed on the characterization of virulence- associated traits of E. coli mastitis isolates in comprehensive analyses under conditions either mimicking initial pathogenesis or conditions that E. coli mastitis isolates should encounter while entering the udder. Virulence-associated traits as well as fitness traits of selected bovine mastitis or faecal E. coli strains were identified and analyzed in comparative phenotypic assays. Raw milk whey was introduced to test bacterial fitness in native mammary secretion known to confer antimicrobial effects. Accordingly, E. coli isolates from bovine faeces represented a heterogeneous group of which some isolates showed reduced ability to survive in milk whey whereas others phenotypically resembled mastitis isolates that represented a homogeneous group in that they showed similar survival and growth characteristics in milk whey. In contrast, mastitis isolates did not exhibit such a uniform phenotype when challenged with iron shortage, lactose as sole carbon source and lingual antimicrobial peptide (LAP) as a main defensin of milk. Reduced bacterial fitness could be related to LAP suggesting that bacterial adaptation to an intramammary lifestyle requires resistance to host defensins present in mammary secretions, at least LAP. E. coli strain 1303 and ECC-1470 lack particular virulence genes associated to mastitis isolates. To find out whether differences in gene expression may contribute to the ability of E. coli variants to cause mastitis, the transcriptome of E. coli model mastitis isolates 1303 and ECC-1470 were analyzed to identify candidate genes involved in bacterium-host interaction, fitness or even pathogenicity during bovine mastitis. DNA microarray analysis was employed to assess the transcriptional response of E. coli 1303 and ECC-1470 upon cocultivation with MAC-T immortalized bovine mammary gland epithelial cells to identify candidate genes involved in bacterium-host interaction. Additionally, the cell adhesion and invasion ability of E. coli strain 1303 and ECC-1470 was investigated. The transcriptonal response to the presence of host cells rather suggested competition for nutrients and oxygen between E. coli and MAC-T cells than marked signs of adhesion and invasion. Accordingly, mostly fitness traits that may also contribute to efficient colonization of the E. coli primary habitat, the gut, have been utilized by the mastitis isolates under these conditions. In this study, RNA-Seq was employed to assess the bacterial transcriptional response to milk whey. According to our transcriptome data, the lack of positively deregulated and also of true virulence-associated determinants in both of the mastitis isolates indicated that E. coli might have adapted by other means to the udder (or at least mammary secretion) as an inflammatory site. We identified traits that promote bacterial growth and survival in milk whey. The ability to utilize citrate promotes fitness and survival of E. coli that are thriving in mammary secretions. According to our results, lactoferrin has only weak impact on E. coli in mammary secretions. At the same time bacterial determinants involved in iron assimilation were negatively regulated, suggesting that, at least during the first hours, iron assimilation is not a challenge to E. coli colonizing the mammary gland. It has been hypothesized that cellular iron stores cause temporary independency to extracellular accessible iron. According to our transcriptome data, this hypothesis was supported and places iron uptake systems beyond the speculative importance that has been suggested before, at least during early phases of infection. It has also been shown that the ability to resist extracytoplasmic stress, by oxidative conditions as well as host defensins, is of substantial importance for bacterial survival in mammary secretions. In summary, the presented thesis addresses important aspects of host-pathogen interaction and bacterial conversion to hostile conditions during colonization of the mastitis inflammatory site, the mammary gland. N2 - Bei der bakteriellen Mastitis handelt es sich um eine Infektion der bovinen Milchdrüse, ausgelöst durch Eintritt und Wachstum der Bakterien im Euter der Kuh. Krankheitsverlauf und Ursache werden beeinflusst durch Umweltfaktoren, das Immunsystem des Wirtes und die Eigenschaften des bakteriellen Erregers. Die Spezies Escherichia coli (E. coli) ist einer der häufigsten Erreger der akuten bovinen Mastitis. Generell können pathogene E. coli -Stämme entsprechend ihres Infektionsortes in verschiedene Pathotypen klassifiziert werden, die durch eine individuelle Kombination verschiedener Virulenzfaktoren gekennzeichnet sind. Eine eindeutige Unterscheidung von E. coli –Mastitiserregern und kommensalen E. coli -Stämmen ist bisher nicht beschrieben. Diese Studie befasst sich mit der Charakterisierung virulenz-assozierter Eigenschaften von E. coli –Isolaten der bovinen Mastitis. Dazu wurden Untersuchungen unter Bedingungen durchgeführt, die denen während der Anfangsphase der Mastitis entsprechen. Die Virulenz und Fitness-assoziierten Eigenschaften ausgewählter E. coli Mastitis- und Fäkalisolate wurden in vergleichenden phenotypischen Assays identifiziert und analysiert. Zur Untersuchung der bakteriellen Fitness in Milchdrüsensekreten wurde native Molke mit antimikrobiellen Eigenschaften von Rohmilch genutzt. Dabei stellte sich heraus dass E. coli Fäkalisolate eine heterogene Gruppe bilden. Innerhalb dieser Gruppe wiesen einige Isolate eine verminderte Überlebensrate auf. Andere Fäkalisolate zeigten eine höhere Überlebensrate, ähnlich der Überlebensrate von Mastitiserregern. Im Gegensatz zum ihrem grundsätzlich guten Überleben in Molke zeigten Mastitisisolate keine einheitlichen phänotypischen Merkmale bei Wachstum mit 1) Lactose als einziger Kohlenstoffquelle, 2) Eisenlimitierung, oder 3) unter Einfluss von lingualem antimikrobiellem Peptid (LAP), einem bedeutenden Defensin der Wirtsantwort im Euter. Die verminderte Fähigkeit in Milchdrüsensekreten zu überleben korrelierte mit der konzentrationsabhängigen Überlebensfähigkeit in Gegenwart von LAP. Dies lässt vermuten dass eine Anpassung der Bakterien an die Lebensbedingungen in der bovinen Milchdrüse der Resistenz gegenüber Defensinen (u.a. LAP) bedarf. Den Mastitis-isolaten E. coli 1303 und ECC 1470 fehlen diverse Virulenzgene die bereits mit Mastitis assoziiert werden konnten. Um zu bestimmen ob Unterschiede in der Genexpression beider E. coli Isolate dazu beitragen Mastitis auszulösen, wurden Transkriptomanalysen durchgeführt. Dabei sollten vor allem Kandidatengene bestimmt werden, die an der Wirt-Pathogen-Interaktion beteiligt sind oder zur bakteriellen Fitness oder Virulenz der Erreger beitragen. Auf der Basis von DNA Microarrays wurde die Genexpression von E. coli 1303 und ECC 1470 in Gegenwart von immortalisierten Zellen des bovinen Milchdrüsenepithels (MAC-T) bestimmt. Zusätzlich wurde die Fähigkeit zur Zelladhäsion und Internalisierung beider Isolate untersucht. Die bakterielle Transkriptionsantwort in Gegenwart der Wirtszellen ergab, dass Erreger und Wirtszellen eher um den Bedarf an Nährstoffen und Sauerstoff konkurrierten, anstatt deutliche Anzeichen der Zelladhäsion oder Invasion zu zeigen. Beide Isolate nutzten vornehmlich Fitnesseigenschaften, die auch bei der Besiedlung des Darms als dem primären Habitat von E. coli verwendet werden. In dieser Studie wurde außerdem die Genexpression von E. coli 1303 und ECC 1470 in Reaktion auf Molke aus Rohmilch mittels Gesamt-Transkriptom-Sequenzierung (RNA Seq) untersucht. Die Transkriptomanalyse ergab keine wirklich deregulierten virulenz-assozierten Gene in einer der beiden E. coli Mastitis Isolate. Ferner konnten Eigenschaften identifiziert werden, die zum Wachstum und Überleben in nativer Molke beitragen. Die Fähigkeit, Citrat zu verwerten, begünstigt das erfolgreiche Überleben in Milchdrüsensekten und stellt einen wichtigen Fitnessfaktor dar. Unsere Transkriptomdaten bestätigen dass Lactoferrin nur geringen Einfluss auf das Wachstum, von E. coli in Milchdrüsensekreten, hat. Die Expression bakterieller Determinanten, die an der Aufnahme von Eisen beteiligt sind, wurde herunterreguliert. Dies lässt darauf schließen dass Eisenaufnahme in den ersten Stunden der Kolonisierung durch die Erreger keine essentielle Fitnesseigenschaft darstellt. Vermutlich reicht die intrazelluläre Menge an Eisen aus, um eine zeitweise Unabhängigkeit von extrazellular verfügbarem Eisen zu ermöglichen. Diese These konnte durch unsere Transkriptomdaten gestützt werden und stellt eine wichtige Entdeckung in Bezug auf die Verfügbarkeit von Eisen während der Kolonisierung der Milchdrüse dar. Unsere Daten zeigen, dass die Resistenz gegenüber extrazellulärem Stress durch oxidative Bedingungen und Defensine des Wirtes von großer Bedeutung für das bakterielle Überleben in Milchdrüsensekreten ist. Die vorliegende Thesis befasst sich mit wichtigen Aspekten der Wirt-Pathogen-Interaktion und der Anpassung an die antimikrobiellen Bedingungen während der Kolonisierung der Milchdrüse als Ort der Infektion. KW - Escherichia coli KW - mastitis KW - infection KW - virulence KW - transcriptome analysis KW - Kuh KW - Brustdrüsenentzündung KW - Virulenz Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100934 ER - TY - THES A1 - Kumari, Geeta T1 - Molecular Characterization of the Induction of Cell Cycle Inhibitor p21 in Response to Inhibition of the Mitotic Kinase Aurora B T1 - Untersuchungen zur Induktion des Zellzyklusinhibitors p21 nach Inhibition der Mitotischen Kinase Aurora B N2 - Aurora B ist eine mitotische Kinase, die entscheidende Funktionen in der Zellteilung ausübt. Aurora B ist außerdem in einer Vielzahl von Krebsarten mutiert oder überexprimiert. Daher ist die Aurora B Kinase ein attraktives Ziel für die Tumortherapie. Gegenwärtig werden Aurora B-Inhibitoren zur Behandlung von soliden Tumoren und Leukämien in verschiedenen klinischen Studien getestet. Es fehlen jedoch Informationen, welche molekularen Mechanismen den beschriebenen Phänotypen wie Zellzyklusarrest, Aktivierung des Tumorsuppressors p53 und seines Zielgens p21 nach Aurora B-Hemmung zugrunde liegen. Hauptziel dieser Arbeit war es die Mechanismen der p21-Induktion nach Hemmung von Aurora B zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass nach Hemmung von Aurora B die p38 MAPK phosphoryliert und somit aktiviert wird. Experimente mit p38-Inhbitoren belegen, dass p38 für die Induktion von p21 und den Zellzyklusarrest benötigt wird. Die Stabilisierung von p53 nach Aurora B-Inhibition und die Rekrutierung von p53 an den p21-Genpromotor erfolgen jedoch unabhängig vom p38-Signalweg. Stattdessen ist p38 für die Anreicherung der elongierenden RNA-Polymerase II in der kodierenden Region des p21-Gens und für die Bildung des p21 mRNA Transkripts notwendig. Diese Daten zeigen, dass p38 transkriptionelle Elongation des p21-Gens nach Aurora B Hemmung fördert. In weiteren Untersuchungen konnte ich zeigen, dass die Aurora B-Hemmung zu einer Dephosphorylierung des Retinoblastoma-Proteins führt und dadurch eine Abnahme der E2F-abhängigen Transkription bewirkt. Dies löst indirekt einen Zellzyklusarrest aus. Weiterhin konnte mit Hilfe von synchronisierten Zellen gezeigt werden, dass p21 nach Durchlaufen einer abnormalen Mitose induziert wird, jedoch nicht nach Aurora B-Hemmung in der Interphase. Interessanterweise werden p38, p53 und p21 schon bei partieller Inhibition von Aurora B aktiviert. Die partielle Inhibition von Aurora B führt zu chromosomaler Instabilität aber nicht zum Versagen der Zytokinese und zur Bildung polyploider Zellen. Damit korreliert die Aktivierung des p38-p53-p21-Signalweges nicht mit Tetraploidie sondern mit vermehrter Aneuploidie. Die partielle Hemmung von Aurora B führt außerdem zur vermehrten Entstehung von reaktive Sauerstoffspezies (ROS), welche für die Aktivierung von p38, p21 und für den Zellzyklusarrest benötigt werden. Basierend auf diesen Beobachtungen kann folgendes Modell postuliert werden: Die Hemmung von Aurora B führt zu Fehlern in der Chromosomenverteilung in der Mitose und damit zu Aneuploidie. Dies führt zu vermehrter Produktion von ROS, möglicherweise durch proteotoxischer Stress, hervorgerufen durch die Imbalanz der Proteinbiosynthese in aneuploiden Zellen. ROS bewirkt eine Aktivierung der p38 MAPK und trägt damit zur Induktion von p21 und dem resultierenden Zellzyklusarrest bei. Aneuploidie, proteotoxischer und oxidativer Stress stellen Schlüsselmerkmale von Tumorkrankungen dar. Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit könnte die Kombination von Aurora B-Hemmstoffen mit Medikamenten, die gezielt aneuploide Zellen angreifen, in Tumorerkrankungen therapeutisch wirksam sein. N2 - Aurora B is a mitotic kinase that is essential for cell division. Because it is mutated or overexpressed in a range of cancer types, it has been suggested as a novel therapeutic target. Currently chemical inhibitors against Aurora B are in various phases of clinical trials for treatment of solid tumors and leukemia. Information regarding the molecular requirements for the reported phenotypes of Aurora B inhibition such as cell cycle arrest, activation of the tumor suppressor p53 and its target p21 are not well understood. In this study, I investigated the requirements for p21 induction after Aurora B inhibition. I found that p38 is phosphorylated and activated when Aurora B is inhibited. Experiments with chemical inhibitors against p38 indicate that p38 is required for p21 induction and cell cycle arrest in response to Aurora B inhibition. p53 induction after impairment of Aurora B function and the recruitment of p53 to its binding site in the p21 gene promoter occur independently of p38 signaling. Instead, I found that p38 is required for the enrichment of the elongating RNA Polymerase II in the coding region of the p21 gene. Furthermore, p38 is required for formation of the full-length p21 mRNA transcript. These data indicate that p38 promotes the transcriptional elongation of p21 gene in response to Aurora B inhibition. In further experiments I could show that the p21 causes cell cycle arrest due to a decrease in E2F-dependent transcription by promoting the dephosphorylation of the retinoblastoma protein. Using synchronized cells I could show that the induction of p21 in response to Aurora B inhibition requires transition through an aberrant mitosis and does not occur in cells that are arrested in interphase. Interestingly, p38, p53 and p21 are already induced by partial inhibition of Aurora B, which results in aneuploidy but not in cytokinesis failure and in tetraploidy. This supports the notion that activation of p38-p53-p21 signaling correlates with aneuploidy but not with tetraploidy or binucleation. Partial inhibition of Aurora B also leads to increased generation of reactive oxygen species (ROS), which are required for the activation of p38, p21 and cell cycle arrest. Based on these observations I propose the following model: Inhibition of Aurora B leads to chromosome missegregation resulting in aneuploidy. This results in increased generation of ROS (reactive oxygen species) possibly through proteotoxic stress caused by an imbalance of protein synthesis in aneuploid cells. ROS triggers the activation of p38, which then stimulates the transcriptional elongation of p21 resulting in cell cycle arrest. Aneuploidy, proteotoxic stress and oxidative stress are hallmarks of cancer cells. Based on my results reported in this study, I suggest that the combination of Aurora B inhibitors with drugs that specifically target aneuploid cells might be a novel strategy for cancer therapy, as this is a lethal combination for proliferation of cancer cells. KW - Zellzyklus KW - Biomedicine KW - Inhibitor KW - Cell Cycle KW - Aneuploidy KW - Aurora B Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101327 ER - TY - THES A1 - Ganesan, Jayavarshni T1 - The role of microRNA-378 in cardiac hypertrophy T1 - Untersuchungen zur Rolle der MikroRNA-378 bei kardialer Hypertrophie N2 - MicroRNAs are endogenous ≈22 nt long non coding RNA molecules that modulate gene expression at the post transcriptional level by targeting mRNAs for cleavage or translational repression. MicroRNA-mRNA interaction involves a contiguous and perfect pairing within complementary sites usually in the 3’ UTR of the target mRNA. Heart failure is associated with myocyte hypertrophy and death, due to compensatory pathological remodeling and minimal functional repair along with microRNA deregulation. In this study, we identified candidate microRNAs based on their expression strength in cardiomyocytes and by their ability to regulate hypertrophy. Expression profiling from early and late stages of heart failure showed several deregulated microRNAs. Of these microRNAs, miR-378 emerged as a potentially interesting microRNA that was highly expressed in the mouse heart and downregulated in the failing heart. Antihypertrophic activity of miR-378 was first observed by screening a synthetic miR library for morphologic effects on cardiomyocytes, and validated in vitro proving the tight control of hypertrophy by this miR. We combined bioinformatic target prediction analysis and microarray analysis to identify the targets of miR-378. These analyses suggested that factors of the MAP kinase pathway were enriched among miR-378 targets, namely MAPK1 itself (also termed ERK2), the insulin-like growth factor receptor 1 (IGF1R), growth factor receptor bound protein 2 (GRB2) and kinase suppressor of ras 1 (KSR1). Regulation of these targets by miR-378 was then confirmed by mRNA and protein expression analysis. The use of luciferase reporter constructs with natural or mutated miR-378 binding sites further validated these four proteins as direct targets of miR-378. RNA interference with MAPK1 and the other three targets prevented the prohypertrophic effect of antimiR-378, suggesting that they functionally relate to miR-378. In vivo restoration of disease induced loss of miR-378 in a pressure overload mouse model of hypertrophy using adeno associated virus resulted in partial attenuation cardiac hypertrophy and significant improvement in cardiac function along with reduced expression of the four targets in heart. We conclude from these findings that miR-378 is an antihypertrophic microRNA in cardiomyocytes, and the main mechanism underlying this effect is the suppression of the MAP kinase-signaling pathway on four distinct levels. Restoration of disease-associated loss of miR-378 through cardiomyocyte-targeted AAV-miR-378 may prove as an effective therapeutic strategy in myocardial disease. N2 - MicroRNAs sind ca. 22 Nukleotide lange endogene, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die die Expression von Genen posttranskriptionell regulieren, indem sie den Abbau der Ziel-mRNA herbeiführen oder deren Translation hemmen. Die Interaktion von microRNA und mRNA erfolgt durch perfekt komplementäre Bindung in der 3’-untranslatierten Region der Ziel-mRNA. Eine Deregulation der Expression verschiedener microRNAs lässt sich bei Herzinsuffizienz beobachten. Im insuffizienten Herzen laufen kompensatorische pathologische Remodellingprozesse ab und es kommt unter anderem zu Hypertrophie und Apoptose von Kardiomyozyten. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir Kandidaten-microRNAs nach folgenden Kriterien identifiziert: 1) Expr e s s ions s t ä rke in Ka rdiomyozyt en, 2) Fähigke i t zur Regul a t ion von Kardiomyozytenhypertrophie im Screening einer synthetischen microRNA-Bibliothek auf Kardiomyozytengröße und 3) Regulation ihrer Expression in frühem und späten Stadium eines murinen Herzinsuffizienzmodells. Aus den resultierenden Kandidaten-microRNAs wurde im folgenden miR-378 näher untersucht. MiR-378 war im gesunden Mausherz stark exprimiert. Die Expression nahm bei Herzinsuffizienz ab. Weiterhin hatte die Überexpression von miR-378 in neonatalen Kardiomyozyten einen antihypertrophen Effekt. Im Gegenzug führte die Expression von antimiR-378 zu einer verstärkten Hypertrophie. Zur Target-Suche wurden zum einen bioinformatische Vorhersage-Datenbanken verwendet und zum anderen ein Microarray durchgeführt. Diese Analysen zeigten eine Anreicherung von Faktoren des MAP-Kinase- Signalweges: Mitogen-aktivierte Proteinkinase 1 (MAPK1, auch als ERK2 bezeichnet), Insulinähnlicher Wachstumsfaktorrezeptor 1 (IGF1R), Wachstumsfaktorbindeprotein 2 (GRB2) und Kinasesuppressor von Ras 1 (KSR1). Die Regulation dieser Targets durch miR-378 wurde durch Bestimmung der mRNA- und Proteinexpression nach Überexpression bzw. Inhibition von miR-378 bestätigt. Durch Luziferaseassays mit Reporterkonstrukten, die jeweils die exakten oder mutierte Bindungsstellen der vier Targets enthielten, konnte gezeigt werden, dass die mRNAs der vier Faktoren direkte Targets von miR-378 darstellen. Durch siRNA-mediierte Herabregulation der Zielproteine konnte der prohypertrophe Effekt von antimiR-378 inhibiert werden. Daraus lässt sich schließen, dass der Hypertrophie-Phänotyp direkt auf miR-378 zurückzuführen ist. Schließlich wurde der Effekt von miR-378 im murinen Herzinsuffizienzmodell (Konstriktion der Aorta, TAC) untersucht. TAC führte zu einer Abnahme der Expression von miR-378 im Herzen. Durch Adenoassoziierten Virus (AAV) vermittelte exogene Expression von miR-378 wurde das Expressionslevel des gesunden Herzens im TAC-Modell wiederhergestellt und die Expression der vier Targets herabgesetzt. Dies resultierte in weniger ausgeprägten Kardiomyozytenhypertrophie sowie in einer signifikanten Verbesserung der Herzfunktion. Aus diesen Daten schließen wir, dass miR-378 einen antihypertrophen Effekt auf Kardiomyozyten hat, der wesentlich durch die Suppression des MAP-Kinase-Signalweges an vier Angriffspunkten vermittelt wird. Die Wiederherstellung des “gesunden” Expressionsniveaus von miR-378 im kranken Herzen durch Kardiomyozyten-spezifische Expression mit AAV-miR-378 könnte eine Therapieoption bei Herzerkrankungen sein. KW - Hypertrophie KW - Herzinsuffizienz KW - miRNS KW - Herzmuskelzelle KW - Cardiomyocytes KW - Gene therapy KW - MicroRNA KW - Cardiac hypertrophy KW - Hypertrophy Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100918 ER - TY - THES A1 - Biehl, Stefanie T1 - The Impact of Adult Attention Deficit/ Hyperactivity Disorder, Methylphenidate, and the COMT Val158Met Polymorphism on Selective Attention and Working Memory T1 - Der Einfluss von Aufmerksamkeitsdefizit-/ Hyperaktivitätsstörung bei Erwachsenen, Methylphenidat, und des COMT Val158Met Polymorphismus auf selektive Aufmerksamkeit und Arbeisgedächtnis N2 - Theories of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) aetiology have placed a focus on impaired behavioural inhibition presumably leading to executive function (EF) deficits. Neuroimaging studies report neurophysiological findings consistent with these hypothesised impairments, and investigations of functional brain activation from a network perspective report hypoactivation in the frontoparietal network as well as hyperactivation in the dorsal attention network. Studies investigating the acute effects of stimulant medication on EF show an improvement on behavioural EF measures including working memory. In addition, methylphenidate (MPH) was shown to up-regulate the task-positive/ frontoparietal network in children and adolescents with ADHD. So far, there are only few studies investigating the impact of ADHD on behavioural and neurophysiological EF measures as well as the effect of several weeks of stimulant medication in adult patients. The importance of the catechol-O-methyltransferase (COMT) enzyme for subcortical and cortical dopaminergic and noradrenergic functioning furthermore led to studies investigating a potential interactive impact of COMT genotype and ADHD on neuropsychological functioning, with a particular focus on working memory. The results of these studies were very heterogeneous. In addition, as none of the studies compared the results of ADHD patients to those of a healthy control group, possible differential effects of COMT in patients and healthy controls could not be examined. The aim of this dissertation was to investigate selective attention properties of the central executive component during a working memory task and to transfer this task to fMRI. A third study then aimed to investigate the effects of adult ADHD (aADHD), MPH, and COMT genotype on working memory with a particular focus on activation of the task-positive network during the analysis of the fMRI data. The first study (EEG) could replicate and extend the results from previous research. This study could furthermore connect the overall activation in frontal areas to suppression efficiency in posterior visual areas as well as establish the impact of hyperactive/ impulsive ADHD symptoms on task performance. The second study (fMRI) allowed the successful transfer of the paradigm to fMRI, and the further replication and extension of previous findings. In addition, this study showed the sensitivity of the task to the effects of the COMT genotype. The third study (fMRI) was one of the first studies that exploratorily investigated the effects COMT in a sample of aADHD patients and a comparable healthy control group. This study showed an interactive effect of these two factors on neuropsychological measures as well as on fMRI activation during a classic n-back working memory task. In addition, this task led to more activation in the task-positive network of the aADHD group compared to a healthy control group in the absence of performance differences, pointing towards compensatory activation in the aADHD group. Furthermore, activation in the frontal cortex was increased in patients taking MPH compared to a placebo. The fMRI data from the selective attention task moreover showed decreased activation in the right DLPFC of the patient group, which was associated with reduced suppression efficiency across all participants. The clinical effect of MPH in the third study was visible but did not reach significance, which is probably attributable to a lack of experimental power. The studies in this dissertation could successfully replicate and extend previous findings. A goal for future studies should be the further investigation of the interactive effects of COMT genotype and aADHD on neuropsychological test results and fMRI activation, but also on medication response and adverse effects. In this context, the adaptation of a network perspective during the analysis of fMRI data seems to be the best way to detect existing between-group differences. N2 - Theorien zur Ätiologie der Aufmerksamkeitsdefizit-/ Hyperaktivitätsstö-rung (ADHS) konzentrieren sich oft auf defizitäre Prozesse der Verhaltensinhibition, die wiederum zu Defiziten der Exekutivfunktionen (EF) führen. Übereinstimmend mit diesen Beeinträchtigungen berichteten Neuroimaging-Studien von Hypoaktivierung im frontoparietalen Netzwerk sowie Hyperaktivierung im dorsalen Aufmerksamkeitsnetzwerk. Studien zur Wirkung von Stimulanzien zeigten eine Verbesserung von EF-Maßen einschließlich des Arbeitsgedächtnisses sowie eine Hochregulierung des aufgabenpositiven/ frontoparietalen Netzwerks durch Methylphenidat (MPH). Bis jetzt untersuchten nur wenige Studien die Auswirkungen von ADHS auf neurophysiologische und Verhaltensmaße der EF sowie den Effekt von länger andauernder Stimulanziengabe bei erwachsenen Patienten. Die Wichtigkeit des Enzyms Catechol-O-Methyltransferase (COMT) für subkortikale und kortikale dopaminerge und noradrenerge Funktionen führte darüber hinaus zu Studien, die eine potentielle Interaktion in der Wirkung des COMT Genotyps und ADHS auf neuropsychologische Funktionen und insbesondere auf das Arbeitsgedächtnis untersuchten. Die Ergebnisse dieser Studien waren recht heterogen. Da zudem keine der Studien die Ergebnisse der ADHS-Patienten mit denen einer gesunden Kontrollgruppe verglich, konnten möglicherweise vorhandene unterschiedliche Einflüsse von COMT bei Patienten und gesunden Kontrollprobanden nicht angemessen ermittelt werden. Das Ziel dieser Dissertation waren zunächst die Untersuchung von selektiven Aufmerksamkeitsprozessen, die durch die Zentrale Exekutive vermittelt werden, sowie die Übertragung der dazu verwendeten Arbeitsgedächtnisaufgabe ins fMRT. Eine dritte Studie strebte die Untersuchung der Auswirkungen von ADHS bei Erwachsenen (aADHS), MPH und COMT Genotyp auf das Arbeitsgedächtnis an. Ein besonderer Fokus bei der Analyse der fMRT-Daten lag hierbei auf der Aktivierung des aufgabenpositiven Netzwerks. Die erste Studie (EEG) konnte bisherige Forschungsergebnisse replizieren und erweitern. Zudem konnte diese Studie die Gesamtaktivierung in frontalen Bereichen mit der Unterdrückungseffizienz in posterioren visuellen Bereichen in Verbindung bringen sowie einen Einfluss von hyperaktiv/ impulsiver ADHS-Symptomatik auf die Verhaltensleistung feststellen. Die zweite Studie (fMRT) zeigte eine erfolgreiche Übertragung des Paradigmas auf das fMRT und eine weitergehende Replizierung und Erweiterung vorheriger Forschungsergebnisse. Es konnte außerdem die Sensitivität der Aufgabe für die Effekte des COMT Genotyps gezeigt werden. Die dritte Studie (fMRT) war eine der ersten Studien, die exploratorisch die Effekte von COMT in einer Stichprobe von aADHS-Patienten und einer vergleichbaren gesunden Kontrollgruppe untersuchte. Hier zeigte sich eine Interaktion von COMT Genotyp und aADHS auf die erhobenen neuropsychologischen Maße sowie auf die fMRT-Aktivierung während einer n-back Arbeitsgedächtnisaufgabe. Die Aufgabe führte zu mehr Aktivierung im aufgabenpositiven Netzwerk der aADHS-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Da keine Leistungsunterschiede zwischen den Gruppen zu erkennen waren, weist diese Hyperaktivierung auf eine kompensatorische Aktivierung in der aADHS-Gruppe hin. Zudem zeigte sich eine erhöhte Aktivierung im Frontalkortex bei Patienten, die MPH statt einem Placebo einnahmen. Die fMRT-Daten der Aufgabe zur selektiven Aufmerksamkeit zeigten außerdem eine reduzierte Aktivierung im rechten DLPFC der Patientengruppe, die über alle Probanden hinweg mit einer reduzierten Unterdrückungseffizienz assoziiert war. Der klinische Effekt von MPH in der Patientenstichprobe war sichtbar, erreichte aber keine Signifikanz, was vermutlich auf eine zu geringe experimentelle Power zurückzuführen ist. Die Studien in dieser Dissertation konnten vorherige Befunde erfolgreich replizieren und erweitern. Ein Ziel für zukünftige Studien sollte die weitergehende Untersuchung dieser Fragestellungen sein. Vor allem in Bezug auf eine Interaktion von COMT Genotyp und aADHS auf neuropsychologische Testergebnisse und fMRT-Aktivierung, aber auch auf Medikamenten-Response und Nebenwirkungen ist dies von großer Bedeutung. Die Übernahme einer Netzwerkperspektive bei der Analyse von fMRT-Daten scheint zudem der beste Weg, existierende Unterschiede zwischen den Gruppen zu finden. KW - Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom KW - adult attention deficit hyperactivity disorder (aADHD) KW - COMT polymorphism KW - methylphenidate KW - working memory KW - Erwachsener KW - Methylphenidat KW - Catecholmethyltransferase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100959 ER - TY - THES A1 - Merker, Sören T1 - Genome-wide screenings in attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD): investigation of novel candidate genes SLC2A3 and LPHN3 T1 - Genomweite Untersuchungen des Aufmerksamkeitsdefizit/ Hyperaktivitätssyndroms (ADHS): Analyse der neuen Kandidatengene SLC2A3 und LPHN3 N2 - Attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) is a highly prevalent childhood-onset neurodevelopmental disorder that involves a substantial risk of persisting into adolescence and adulthood. A number of genome-wide screening studies in ADHD have been conducted in recent years, giving rise to the discovery of several variants at distinct chromosomal loci, thus emphasising the genetically complex and polygenic nature of this disorder. Accordingly, promising novel candidate genes have emerged, such as the gene encoding the glucose transporter isoform 3 (SLC2A3) and the gene encoding the latrophilin isoform 3 (LPHN3). In this thesis, both genes were investigated in form of two separated projects. The first focused on SLC2A3 polymorphisms associated with ADHD and their potential physiological impact. For this purpose, gene expression analyses in peripheral cell models were performed as well as functional EEG measurements in humans. The second project concerned the murine gene Lphn3 including the goal of developing a mouse line containing a genetically modified Lphn3 with conditional knockout potential. In this respect, a specific DNA vector was applied to target the Lphn3 gene locus in murine embryonic stem (ES) cells as a prerequisite for the generation of appropriate chimeric mice. The results of the first project showed that SLC2A3 duplication carriers displayed increased SLC2A3 mRNA expression in peripheral blood cells and significantly altered event-related potentials (ERPs) during tests of cognitive response control and working memory, possibly involving changes in prefrontal brain activity and memory processing. Interestingly, ADHD patients with the rs12842 T-allele, located within and tagging the SLC2A3 gene, also exhibited remarkable effects during these EEG measurements. However, such effects reflected a reversed pattern to the aforementioned SLC2A3 duplication carriers with ADHD, thus indicative of an opposed molecular mechanism. Besides, it emerged that the impact of the aforementioned SLC2A3 variants on different EEG parameters was generally much more pronounced in the group of ADHD patients than the healthy control group, implying a considerable interaction effect. Concerning the second project, preliminary results were gathered including the successful targeting of Lphn3 in murine ES cells as well as the production of highly chimeric, phenotypically unremarkable and mostly fertile mouse chimeras. While germline transmission of the modified Lphn3 allele has not yet occurred, there are still several newborn chimeric mice that will be tested in the near future. In conclusion, the findings suggest that SLC2A3 variants associated with ADHD are accompanied by transcriptional and functional changes in humans. Future research will help to elucidate the molecular network and neurobiological basis involved in these effects and apparently contributing to the complex clinical picture of ADHD. Moreover, given the increasing number of publications concerning latrophilins in recent years and the multitude of research opportunities provided by a conditional knockout of Lphn3 in mice, the establishment of a respective mouse line, which currently is in progress, constitutes a promising approach for the investigation of this gene and its role in ADHD. N2 - Das Aufmerksamkeitsdefizit/Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) ist eine hoch prävalente und bereits in der Kindheit beginnende Neuroentwicklungsstörung, die eine erhebliche Persistenz ins Jugend- und Erwachsenenalter aufweist. In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl von genomweiten Studien zu ADHS durchgeführt, welche zur Identifizierung zahlreicher genetischer Varianten an unterschiedlichen chromosomalen Loci geführt und somit die genetisch komplexe polygene Natur dieser Störung zur Geltung gebracht haben. Auf diese Weise traten auch neue Kandidatengene zutage, wie zum Beispiel das Gen für die Glukosetransporter-Isoform-3 (SLC2A3) und das Gen, welches Latrophilin-3 kodiert (LPHN3). Innerhalb dieser Thesis wurden beide Gene in Form von zwei voneinander getrennten Projekten untersucht. Das erste Projekt beschäftigte sich mit humanen ADHS-assoziierten SLC2A3-Polymorphismen und ihrer potentiellen physiologischen Bedeutung. Für diesen Zweck wurden Genexpressionsanalysen in peripheren Zellmodellen sowie funktionelle EEG-Messungen im Menschen durchgeführt. Im zweiten Projekt ging es um das murine Gen Lphn3 mit dem Ziel, eine Mauslinie zu entwickeln, die ein genetisch verändertes Lphn3 mit konditionalem Knockout-Potenzial aufweist. In diesem Zusammenhang wurde ein spezifischer DNA-Vektor verwendet, der auf den Lphn3-Genlocus in murinen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) abzielte, was eine Voraussetzung für die Erzeugung von geeigneten chimären Mäusen darstellt. Die Ergebnisse des ersten Projektes legten nahe, dass SLC2A3-Duplikationsträger erhöhte SLC2A3-mRNA-Expression in peripheren Blutzellen aufweisen sowie signifikant veränderte ereigniskorrelierte Potentiale während eines Tests kognitiver Reaktionskontrolle sowie eines Arbeitsgedächtnis-Tests, was möglicherweise von veränderter präfrontaler Hirnaktiviät bzw. Gedächtnis-Prozessierung begleitet wird. Interessanterweise zeigten ADHS-Patienten mit T-Allel des im SLC2A3-Gen liegenden SNPs rs12842 ebenfalls deutliche Effekte während dieser EEG-Messungen, allerdings in entgegengesetzter Form zu den zuvor genannten SLC2A3-Duplikationsträgern mit ADHS, was auf einen gegensätzlichen molekularen Mechanismus hindeutet. Zudem stellte sich heraus, dass der Einfluss der zuvor genannten SLC2A3-Varianten auf verschiedene EEG-Parameter innerhalb der ADHS-Gruppe generell deutlich stärker ausgeprägt war als in der gesunden Kontrollgruppe, also einen beachtlichen Interaktionseffekt impliziert. Bezüglich des zweiten Projektes konnten bisher Zwischenergebnisse erzielt werden: das erfolgreiche Targeting des Lphn3-Gens in murinen ES-Zellen sowie die Produktion hochchimärer, phänotypisch unauffälliger und größtenteils fertiler Maus-Chimären. Obgleich die Keimbahntransmission des modifizierten Lphn3-Allels bislang noch nicht eingetreten ist, gibt es noch eine Reihe an neugeborenen chimären Mäusen, die in nächster Zeit erst noch getestet werden müssen. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Variationen des SLC2A3-Gens, die mit ADHS assoziiert sind, mit transkriptionellen und funktionellen Veränderungen im Menschen einhergehen. Zukünftige Forschungsarbeiten werden dabei helfen, die molekularen Netzwerke und neurobiologischen Grundlagen zu verdeutlichen, die an diesen Effekten beteiligt sind und offenbar zu dem komplexen klinischen Bild von ADHS beitragen. Angesichts der steigenden Zahl an Publikationen über Latrophiline in den letzten Jahren und der unzähligen Forschungsmöglichkeiten, die ein konditionaler Knockout von Lphn3 in Mäusen bietet, stellt die derzeit laufende Etablierung einer entsprechenden Mauslinie einen vielversprechenden Ansatz dar, dieses Gen und seine Rolle für ADHS zu untersuchen. KW - Genexpression KW - Glucosetransportproteine KW - Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom KW - Latrophilin receptor KW - Knockout-Maus KW - ADHD KW - Genetics KW - Glucosetransporter Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100129 ER - TY - THES A1 - El-Mesery, Mohamed T1 - Development of CD40-targeted bifunctional scFv-TRAIL fusion proteins that induce TRAILR1- and TRAILR2-specifc cell death and dendritic cells activation T1 - Entwicklung CD40 gerichteter bifunktioneller scFv-TRAIL Fusionsproteine die TRAILR1- und TRAILR2-spezifischen Zelltod und dendritischen Zellaktivierung induzieren N2 - TRAIL is a member of TNF superfamily and mediates apoptosis by binding to two DRs, TRAILR1 and TRAILR2. Despite the fact that there are other TRAILRs, TRAILR1 and TRAILR2 receive the major research interest due to their ability to trigger apoptosis and their possible use as targets in tumor therapy. Due to the potential advantages of TRAILR1- or TRAILR2-specific targeting, we investigated recently published TRAIL DR-specific mutants, one conferring specificity for TRAILR1 (TRAILmutR1) and one for TRAILR2 (TRAILmutR2). It was well proved in this work that TRAILmutR1 shows specific binding to TRAILR1 and no specific binding to TRAILR2. TRAILmutR2 vice versa shows specific binding to TRAILR2 and no significant binding to TRAILR1. Moreover, these mutants were able to induce caspase activation and cell death in a TRAILR1/2-specific manner. Moreover, the enhancement of TRAILR2-induced apoptosis by secondary oligomerization of soluble wild-type TRAIL was confirmed for the TRAILR2-specifc TRAIL mutant and similar findings were made with the TRAILR1-specific TRAIL mutant. The soluble form of TRAIL exhibits weak apoptotic activity as compared to transmembrane TRAIL. Therefore, there is the challenge in clinical research to improve the activity of soluble TRAIL. A second strategy besides the above mentioned oligomerization to improve soluble TRAIL activity is anchoring of the molecule to the cell surface, e.g. through the genetic fusion with a scFv domain recognizing a cell surface antigen. In this work, we generated fusion proteins of TRAIL, TRAILmutR1 and TRAILmutR2 with a scFv recognizing CD40 (scFv:G28). Initially, we analyzed the functionality of both the TRAIL domain and the scFv:G28 domain of the corresponding fusion proteins. TRAIL functionality was well proved through its ability to induce cell death in TRAIL sensitive cells such as Jurkat cells, provided that scFv:G28-TRAIL fusion proteins were oligomerized by anti-Flag mAb M2. Concerning the scFv:G28 domain, the fusion proteins showed enhanced binding affinity to cell lines expressing CD40 as compared to their parental CD40-negative cells. Consistent with previous studies investigating TRAIL fusion proteins with other cell surface antigen-targeting scFvs, the scFv:G28 fusion proteins with TRAIL, TRAILmutR1 and TRAILmutR2 showed enhanced induction of cell death in a CD40-dependent manner. Moreover, our results revealed that these fusion proteins have a significant paracrine apoptotic effect on CD40-negative bystander cells upon anchoring to CD40-positive cells which are TRAIL resistant. Thus, the current work provides for the first time scFv fusion proteins of TRAIL and TRAILR1- and TRAILR2-specific TRAIL mutants with CD40-restricted activity. These fusion proteins provide the advantage of attenuating the off-target effects and the potential side effects of per se highly active TRAIL variants on one hand due to the CD40-binding dependent enhancement of activity and on the other hand due to the differential use of TRAILR1 and TRAILR2. CD40 represents a tumor associated marker which is expressed on many tumor cells but also on immune cells. Therefore, the last part of this work focused on the analysis of the ability of scFv:G28-TRAIL fusion proteins to induce CD40 signaling both in tumor cells and also in immune cells. It turned out that the scFv:G28-TRAIL fusion proteins are able to induce CD40 signaling in CD40-positive tumor cells but especially also in immune cells such as iDCs leading to their maturation and further activation of immune responses. Taken together, this work provides novel bifunctional scFv-TRAIL fusion proteins which combine the induction of apoptosis via TRAIL DR with stimulation of CD40 signaling which possibly enhances antitumor immunity. N2 - TRAIL ist ein Mitglied der TNF-Superfamilie und vermittelt Apoptose durch die Aktivierung der Todesrezeptoren, TRAILR1 und TRAILR2. Obwohl es weitere TRAIL-Rezeptoren gibt, liegt das Hauptaugenmerk auf den beiden Apoptose induzierenden Rezeptoren TRAILR1 und TRAILR2 auf Grund ihrer möglichen Anwendung in der Tumortherapie. Wegen der möglichen Vorteile eines spezifischen TRAILR1- und TRAILR2-Targetings, haben wir kürzlich publizierte TRAIL-Todesrezeptor spezifische TRAIL Mutanten untersucht, von denen eine spezifisch für TRAILR1 (TRAILmutR1) und die andere spezifisch für TRAILR2 (TRAILmutR2) ist. Es konnte in dieser Arbeit sehr gut belegt werden, dass TRAILmutR1 spezifisch an TRAILR1 bindet und keine Bindung an TRAILR2 zeigte. Dem entsprechend zeigte die Variante TRAILmutR2 nur eine spezifische Bindung an TRAILR2 und keine signifikante Bindung an TRAILR1. Des Weiteren waren die Mutanten in der Lage, die Caspase-Aktivierung und den Zelltod TRAILR1/2-abhängig zu induzieren. Außerdem konnte eine Erhöhung der TRAILR2-induzierten Apoptose durch eine sekundäre Oligomerisierung der TRAILR2-spezifische TRAIL-Mutante erzielt werden. Ähnliche Ergebnisse zeigte die TRAILR1-spezifische TRAIL-Mutante. Um die Aktivität des löslichen TRAIL Oligomerisierung unabhängig zu erhöhen, wurden in dieser Arbeit TRAIL-Fusionsproteine mit einem scFv (scFv:G28), der CD40 erkennt generiert. In Übereinstimmung mit früheren Studien, die mit TRAIL-Fusionsproteinen von anderen Zelloberflächenantigen-spezifischen scFvs wurden, zeigten die CD40-spezifischen scFv:G28 Fusionsproteine mit TRAIL, TRAILmutR1 und TRAILmutR2 eine verstärkte CD40-abhängige Induktion des Zelltods. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass diese Fusionsproteine nach Bindung an CD40-positive Zellen einen parakrinen apoptotischen Effekt, auf umliegende CD40-negative Zellen haben. Diese Arbeit beschreibt somit zum ersten Mal scFv-TRAIL Fusionsproteine mit einer CD40-abhängigen TRAILR1- und TRAILR2-spezifischen Aktivität. CD40 repräsentiert einen tumorassoziierten Marker, der in vielen Tumorzellen aber auch in Zellen des Immunsystems exprimiert wird. Aus diesem Grund fokussierte sich der zweite Teil dieser Arbeit auf die Analyse der Fähigkeit der scFv:G28-TRAIL Fusionsproteine, CD40-Signaling sowohl in Tumor- als auch in Immunzellen zu stimulieren. Es konnte festgestellt werden, dass die scFv:G28-TRAIL Fusionsproteine in der Lage sind, CD40-Signaling in CD40-positiven Tumorzellen, aber auch in Immunzellen, z.B. in iDCs, in denen die ScFv-TRAIL Fusionsproteine die Reifung und Aktivierung induzieren ohne Zelltod auszulösen. Zusammengefasst beschreibt diese Arbeit neue bifunktionelle scFv-TRAIL Fusionsproteine, die die Induktion der Apoptose via TRAIL-Todesrezeptoren und die Stimulation des kostimulatorischen CD40-Moleküls kombinieren, was zu einer synergistischen dualen Antitumor-Aktivität führen kann. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Antigen CD40 KW - CD40-targeted bifunctional scFv-TRAIL fusion proteins KW - development KW - TRAIL mutants KW - CD40 gerichteter bifunktioneller scFv-TRAIL Fusionsproteine KW - Entwicklung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100114 ER - TY - THES A1 - Karunakaran, Mohindar Murugesh T1 - Evolution of Vγ9Vδ2 T-cells T1 - Die Evolution der Vγ9Vδ2 T-Zellen N2 - Human Vγ9Vδ2 T cells are the major subset of blood γδ T cells and account for 1-5% of blood T cells. Pyrophosphorylated metabolites of isoprenoid biosynthesis are recognized by human Vγ9Vδ2 T cells and are called as phosphoantigens (PAg). Isopentenyl pyrophosphate (IPP) and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP) are among the few well studied PAg. IPP is found in all organisms while HMBPP is a precursor of IPP found only in eubacteria, plants and apicomplexaen parasite. Interestingly, the PAg reactive Vγ9Vδ2 T cells are so far identified only in human and higher primates but not in rodents. Hence, Vγ9Vδ2 T cells are believed to be restricted to primates. With regard to PAg recognition, a Vγ9JP recombined TCRγ chain and certain CDR3 motifs of the TCR chain are mandatory. The BTN3A1 molecule is essential for a response to PAg. BTN3 is a trans-membrane protein belonging to butyrophilin family of proteins. Though BTN3A1 was found to be essential for PAg presentation, the exact molecular basis of PAg presentation still remains unclear. This thesis presents new data on the evolution of Vγ9Vδ2 TCR and its ligands (BTN3) as well as the genetic basis of PAg presentation to Vγ9Vδ2 TCR. The comprehensive analysis of genomic database sequences at NCBI and other public domain databases revealed for the first time that Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes emerged and co-evolved along with the placental mammals. Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes are scattered across mammalian species and not restricted to primates. But interestingly, all three genes are highly conserved between phylogenetically distinct species. Moreover, the distribution pattern of Vγ9, Vδ2 TCR genes and BTN3 genes suggests a functional association between these genes representing the TCR - ligand relationship. Alpaca (Vicugna pacos), a member of the camelid family, is one among the 6 candidate non-primate species which were found to possess functional Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes. From peripheral lymphocytes of alpaca, Vγ9 chain transcripts with a characteristic JP rearrangement and transcripts of Vδ2 chains with a CDR3 typical for PAg-reactive TCR were identified. The transduction of αβ TCR negative mouse thymoma BW cells with alpaca Vγ9 and Vδ2 TCR chains resulted in surface expression of the TCR complex as it was deduced from detection of cell surface expression of mouse CD3. Cross-linking of alpaca Vγ9Vδ2 TCR transductants with anti-CD3ε led to IL-2 production which confirmed that alpaca Vγ9 and Vδ2 TCR chains pair to form a functional TCR. Besides the conservation of human like Vγ9 and Vδ2 TCR chains, alpaca has conserved an orthologue for human BTN33A1 as well. Interestingly, the predicted PAg binding sites of human BTN3A1 was 100% conserved in deduced amino acid sequence of alpaca BTN3A1. All together alpaca is a promising candidate for further studies as it might have preserved Vγ9Vδ2 T cells to function in surveillance of stress and infections. This thesis also provides the sequence of Vγ9Vδ2 TCR of African green monkey (Chlorocebus aethiops), which was previously unknown. Moreover, our data indicates the lack of any species specific barrier which could hinder the PAg presentation by African monkey derived COS cells to human Vγ9Vδ2 TCR and vice versa of human cells to African green monkey Vγ9Vδ2 TCR which was in contradiction to previously reported findings. Apart from the above, the thesis also presents new data on the genetic basis of PAg presentation to Vγ9Vδ2 T cells, which revealed that human chromosome 6 is sufficient for the presentation of exogenous and endogenous PAg. By employing human/mouse somatic hybrids, we identified the role of human chromosome 6 in PAg presentation and in addition, we observed the lack of capacity of human chromosome 6 positive hybrids to activate Vγ9Vδ2 TCR transductants in the presence of the alkylamine sec-butylamine (SBA). Investigation of Chinese hamster ovary (CHO) cells containing the human chromosome 6 also yielded similar results. This suggests that aminobisphosphonates (zoledronate) and alkylamines employ different mechanisms for activation of Vγ9Vδ2 T cells although both have been described to act by inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase activity which is known to increase intracellular levels of the IPP. In conclusion, this thesis suggests that Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes controlling Vγ9Vδ2 TCR- ligand relationship emerged and co-evolved along with placental mammals; and also identified candidate non-primate species which could possess Vγ9Vδ2 T cells. Furthermore, it suggests alpaca as a promising non-primate species to investigate the physiological function of Vγ9Vδ2 T cells. With respect to PAg antigen presentation it was shown that chromosome 6 is essential and sufficient for exogenous and endogenous PAg presentation. Moreover, the alkylamine SBA and aminobisphosphonate zoledronate may engage different cellular mechanism to exert inhibition over IPP consumption. The thesis raises interesting questions which need to be addressed in future: 1) What are the environmental and evolutionary factors involved in preservation of Vγ9Vδ2 T cells only by few species? 2) What could be the functional nature and antigen recognition properties of such a conserved T cell subset? 3) What is the genetic and molecular basis of the differential capacity of human chromosome 6 bearing rodent-human hybridoma cells in activating Vγ9Vδ2 T cells in presence of SBA and aminobisphosphonates? N2 - Vγ9Vδ2 T Zellen stellen im Menschen die größte Population an γδ T Zellen im Blut dar. Ihr Anteil an den Blut-T Zellen beträgt 1-5%. Humane Vγ9Vδ2 T Zellen erkennen als Phosphoantigene (PAg) bezeichnete pyrophosphorylierte Metabolite der Isoprenoidbiosynthese wobei Isopentenylpyrophosphat (IPP) und (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphat (HMBPP) zu den wenigen gut erforschten PAg gehören. IPP ist in allen Organismen zu finden während HMBPP ein IPP Vorläufer ist, der nur in Eubakterien, Pflanzen und Apikomplexa vorkommt. Interessanterweise wurden PAg-reaktive Vγ9Vδ2 T Zellen bisher nur im Menschen und höheren Primaten gefunden, aber nicht in Nagern. Daher wurde angenommen, dass Vγ9Vδ2 T Zellen eine exklusiv in Primaten vorkommende Population darstellt. Hinsichtlich der PAg-Bindung sind TCR  Ketten mit einer Rekombination von Vγ9 und JP zwingend notwendig und bestimmte CDR3 Motive der V2 TCR Kette, wobei die Erkennung der PAg von der Präsenz des BTN3A1 Moleküls abhängt. BTN3 ist ein Transmembranprotein und gehört zur Butyrophilinfamilie. Obwohl gezeigt wurde, das BTN3A für die PAg-Präsentierung unerlässlich ist, ist deren molekularer Mechanismus noch immer unklar. Die vorgelegte Arbeit beinhaltet sowohl neue Daten über die Evolution des Vγ9Vδ2 TCR und dessen Liganden (BTN3), als auch über die genetischen Grundlagen der PAg-Präsentierung. Eine umfassende Analyse genomischer Datenbanksequenzen des NCBI sowie anderer öffentlicher Datenbanken zeigte erstmals, dass Vγ9, Vδ2 und BTN3 Gene zusammen mit den höheren Säugetieren (Placentalia) entstanden und sich gemeinsam weiter entwickelten. Vγ9, Vδ2 und BTN3 Gene existieren über die gesamten Placentalia verteilt und nicht allein in Primaten. Erstaunlicherweise sind alle drei Gene auch zwischen phylogenetisch unterschiedlichen Spezies hoch konserviert und das Verteilungsmuster von Vγ9, Vδ2 und BTN3 Genen lässt auf eine funktionale Verbindung dieser Gene schliessen, wie sie die TCR/Ligand Interaktion darstellt. Weitergehende Analysen resultierten in der Identifizierung von sechs möglichen Kandidatenspezies, die nicht zu den Primaten gehören und funktionelle Vγ9, Vδ2 und BTN3 Gene besitzen. Hierzu gehört auch das Alpaka (Vicugna pacos), ein Mitglied der Famile der Kamele. Aus periphären Alpakalymphozyten wurden TCR-γ-Kettentranskripte mit charakteristischem Vγ9JP Rearrangement sowie TCR-δ-Kettentranskripte mit für PAg-reaktive Zellen typischen CDR3 amplifiziert. Die Transduktion der Alpaka-Vγ9 und Vδ2 Ketten in die TCR-negativen Maus T-Zell Hybridomlinie BW resultierte in einer Oberflächenexpression des TCR Komplex wie aus der Zelloberflächenexpression von Maus CD3 geschlossen werde konnte. Die Aktivierung dieses TCR Komplexes mittels anti-CD3ε Antikörpern führte zur Produktion von IL-2 durch die TCR-Transduktante, was die funktionelle Paarung der Alpaka Vγ9 und Vδ2 TCR-Ketten bestätigte. Neben den Vγ9 und Vδ2 TCR-Kettengenen existiert im Alpakagenom ebenso ein konserviertes Ortholog des humanen BTN3. Interessanterweise sind die mutmaßlichen PAg-Bindungsstellen des humanen BTN3A1 in dessen abgeleiteter Aminosäuresequenz zu 100% konserviert. Diese Daten machen das Alpaka zu einen vielversprechenden Kandidaten für weitere Untersuchungen, da hier möglicherweise die Population der Vγ9Vδ2 Zellen in ihrer Funktion zur Überwachung von Stress und Infektionen erhalten geblieben ist. Ebenso liefert diese Arbeit die Sequenz des Vγ9Vδ2 TCR der Grünen Meerkatze (Chlorocebus aethiops), welche zuvor nicht bekannt war. Darüber hinaus wurde keine Speziesspezifität in der Präsentierung von PAg durch COS Zellen der Grünen Meerkatze für den humanen Vγ9Vδ2 TCR oder umgekehrt der Präsentierung von PAg durch Meerkatzenzellen für humane Vγ9Vδ2 TCRs gefunden, was im im Widerspruch zu bisher veröffentlichten Ergebnissen steht. Zudem liefert diese Arbeit auch neue Ergebnisse zur genetischen Grundlage der PAg- Präsentierung für die Vγ9Vδ2 T Zellen. Hier zeigte sich, dass das humane Chromosom 6 für die Präsentierung exogener sowie endogener PAg ausreicht. Durch die Generierung somatischer Mensch/Maus Hybride konnten wir die Rolle des humanen Chromosom 6 in der Phosphoantigenpräsentierung ermitteln und zudem beobachten, dass Chromosom 6 positive Hybride nicht in der Lage waren, Vγ9Vδ2 TCR Transduktanten in Anwesenheit des Alkylamins sec-Butylamin (SBA) zu aktivieren. Desweiteren brachten Versuche mit Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), die das humane Chromosom 6 enthielten, ähnliche Ergebnisse. Dies legt nahe, dass Aminobisphosphonate (Zoledronat) und Alkylamine unterschiedliche Mechanismen der Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen nutzen obwohl für beide beschrieben ist, dass sie durch Inhibition der Farnesylpyrophosphatsynthase wirken, die wiederum zum Anstieg des intrazellulären IPP-Spiegels führt. Zusammengefasst legt diese Arbeit die Co-Evolution der die Vγ9Vδ2 TCR/Ligand Interaktion kontrollierenden Vγ9, Vδ2 und BTN3 Gene in Placentalia nahe und identifiziert nicht den Primaten zugehörige Spezies als Kandidaten, die Vγ9Vδ2T Zellen besitzen könnten, von denen das Alpaka als vielversprechend für die Untersuchung der physiologischen Rolle von Vγ9Vδ2 T Zellen vorgeschlagen wird. Hinsichtlich der PAg-Präsentierung bestätigen die vorliegenden Ergebnisse, dass das humane Chromosom 6 zugleich nötig und ausreichend ist, endogene sowie exogene PAg zu präsentieren. Zudem könnten das Alkylamin SBA und Aminobiosphonat Zoledronat verschiedene Mechanismen zur Inhibierung des IPP Verbrauchs nutzen. Diese Ergebnisse werfen einige Fragen auf, die es in Zukunft zu beantworten gilt: 1) Was sind die Umwelt- und Evolutionsfaktoren, die dazu geführt haben, dass Vγ9Vδ2 T Zellen nur in wenigen Spezies erhalten blieben? 2) Was könnte die funktionale Natur und die Antigenbindungseigenschaften einer solchen konservierten T Zell Population sein? 3) Was ist die genetische und molekulare Grundlage für die unterschiedliche Fähigkeit von das humane Chromosom 6 tragenden Mensch-Nager Hybridomazellen, Vγ9Vδ2 T Zellen in Anwesenheit von SBA und Aminobisphosphonaten zu aktivieren? KW - Evolution KW - γδ T cells KW - Vγ9Vδ2 T cells KW - Alpaca KW - Chromosome 6 KW - BTN3A1 and Phospho-antigen presentation KW - T-Lymphozyt KW - Chromosom 6 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99871 ER - TY - THES A1 - Morowski, Martina T1 - Relevance of platelet count and ITAM-signalling pathway in murine models of haemostasis, thrombosis and thrombo-inflammation T1 - Relevanz der Thrombozytenzahl und des ITAM-Signalwegs in Mausmodellen der Hämostase, Thrombose und Thromboinflammation N2 - Platelets are important players in haemostasis and their activation is essential to limit post-traumatic blood loss upon vessel injury. On the other hand, pathological platelet activation may lead to thrombosis resulting in myocardial infarction and stroke. Platelet activation and subsequent thrombus formation are, therefore, tightly regulated and require a well-defined interplay of platelet surface receptors, intracellular signalling molecules, cytoskeletal rearrangements and the activation of the coagulation cascade. In vivo thrombosis and haemostasis models mimic thrombus formation at sites of vascular lesions and are frequently used to assess thrombotic and haemostatic functions of platelets. In this dissertation, different in vivo models were used in mice to address the question at what level a reduced platelet count (PC) compromises stable thrombus formation. To study this, mice were rendered thrombocytopenic by low-dose anti-GPIbα antibody treatment and subjected to a tail bleeding time assay as well as to four different in vivo thrombosis models. Haemostasis and occlusive thrombus formation in small vessels were only mildly affected even at severe reductions of the PC. In contrast, occlusive thrombus formation in larger arteries required higher PCs demonstrating that considerable differences in the sensitivity for PC reductions exist between these models. In a second part of this study, mice were rendered thrombocytopenic by injection of high-dose anti-GPIbα antibody which led to the complete loss of all platelets from the circulation for several days. During recovery from thrombocytopenia, the newly generated platelet population was characterised and revealed a defect in immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-signalling. This defect translated into impaired arterial thrombus formation. To further investigate ITAM-signalling in vivo, genetically modified mice were analysed which display a positive or negative regulation of platelet ITAM-signalling in vitro. Whereas mice lacking the adapter Grb2 in platelets showed a delayed thrombus formation in vivo after acetylsalicylic acid treatment, Clp36ΔLIM bone marrow chimeric mice and SLAP/SLAP2-deficient mice displayed pro-thrombotic properties in vivo. Finally, mice lacking the adapter protein EFhd2 were analysed in vitro and in vivo. However, EFhd2-deficient platelets showed only a minor increase in the procoagulant activity compared to control. N2 - Thrombozyten sind wichtige Zellen für die Hämostase, die bei einer Verletzung der Gefäßwand aktiviert werden, um den Blutverlust zu begrenzen. Auf der anderen Seite kann die pathologische Aktvierung von Thrombozyten jedoch zu Thromboseereignissen und in Konsequenz zu Schlaganfall und Herzinfarkt führen. Die Aktivierung von Thrombozyten und die nachfolgende Thrombusbildung sind daher streng reguliert und setzen ein enges Zusammenspiel von Thrombozytenoberflächenrezeptoren, intrazellulären Signalmolekülen, Zytoskelettumstrukturierungen und die Aktivierung der Koagulationskaskade voraus. In vivo Thrombose- und Hämostase-Modelle ahmen die Thrombusbildung in Gefäßen nach und werden häufig benutzt um die hämostatische und thrombotische Funktion von Thrombozyten zu untersuchen. In dieser Dissertation wurden verschiedene in vivo Modelle in Mäusen genutzt, um zu klären, ab welcher Thrombozytenzahl eine stabile Thrombusbildung beeinträchtigt ist. Für diese Untersuchung wurden Mäuse mit geringen Dosen anti-GPIbα Antikörper behandelt, die zu einer Reduktion der Thrombozytenzahl führen. Anschließend wurden die Mäuse in einem Blutungszeitmodel und vier verschiedenen thrombotischen Modellen untersucht. Hämostase oder okklusive Thrombusbildung in kleinen Gefäßen waren auch bei einer sehr starken Reduktion der Thrombozytenzahl kaum beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu war für eine normale Thrombusbildung in größeren Gefäßen eine höhere Thrombozytenzahl nötig. Verschiedene in vivo Modelle zeigen daher eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber einer Reduktion der Thrombozytenzahl. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Mäuse mit einer hohen Dosis anti-GPIbα Antikörper behandelt, die zu einem völligen, mehrtägigen Verlust aller Thrombozyten im Blutkreislauf führte. Während sich die Thrombozytenzahl erholte, wurden neu generierte Thrombozyten charakterisiert, die einen deutlichen Defekt im ITAM-Signalweg zeigten. Dieser Defekt führte zu einer verminderten arteriellen Thrombusbildung. Um Auswirkungen eines Defektes im ITAM-Signalweg detaillierter in vivo zu untersuchen, wurden genetisch veränderte Mäuse, die in vitro eine reduzierte oder verstärkte ITAM-Signaltransduktion in Thrombozyten zeigen, untersucht. Während Mäuse, die in Thrombozyten kein Grb2 exprimieren nach Acetylsalicylsäurebehandlung in vivo eine verlangsamte Thrombusbildung zeigten, war die Thrombusbildung in Clp36ΔLIM Knochenmarkchimären und SLAP/SLAP2-defizienten Mäusen beschleunigt. Darüber hinaus wurden EFhd2-defiziente Mäuse in vitro und in vivo analysiert. EFhd2-defiziente Thrombozyten zeigten jedoch nur eine geringe Steigerung in der prokoagulatorischen Aktivität im Vergleich zu Kontrolltieren. KW - Thrombozyt KW - Platelet count KW - ITAM-signalling KW - Murine models of thrombosis and haemostasis KW - Maus KW - Blutstillung KW - Thrombose Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99193 ER - TY - THES A1 - Thielmann, Ina T1 - Function and regulation of phospholipase D in blood platelets: in vitro and in vivo studies in mice T1 - Funktion und Regulation von Phospholipase D in Thrombozyten: in vitro und in vivo Studien in Mäusen N2 - Summary Platelet activation and aggregation are crucial for primary hemostasis but can also result in occlusive thrombus formation. Agonist induced platelet activation involves different signaling pathways leading to the activation of phospholipases (PL) which produce second messengers. While the role of PLCs in platelet activation is well established, less is known about the relevance of PLDs. In the current study, the function and regulation of PLD in platelets was investigated using genetic and pharmacological approaches. In the first part of this thesis, adhesion, activation and aggregation of platelets from mice lacking PLD2 or both PLD1 and PLD2 were analyzed in vitro and in vivo. While the absence of PLD2 resulted in slightly reduced PLD activity in platelets, it had no detectable effect on the platelet function in vitro and in vivo. However, the combined deficiency of both PLD isoforms resulted in defective alpha-granule release and protection in a model of ferric chloride induced arteriolar thrombosis, effects that were not observed in mice lacking only one PLD isoform. These results revealed, for the first time, redundant roles of PLD1 and PLD2 in platelet alpha-granule secretion and indicate that this may be relevant for pathological thrombus formation. Thus, PLD might represent a promising target for antithrombotic therapy. Thus, this hypothesis was tested more directly in the second part of this thesis. The effects of pharmacological inhibition of PLD activity on hemostasis, thrombosis and thrombo-inflammatory brain infarction in mice were assessed. Treatment of platelets with the reversible, small molecule PLD inhibitor 5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI) led to a specific blockade of PLD activity that was associated with reduced -granule release and integrin activation. Mice that received FIPI at a dose of 3 mg/kg displayed reduced occlusive thrombus formation upon chemical injury of carotid arteries or mesenterial arterioles. Similarly, FIPI-treated mice had smaller infarct sizes and significantly better motor and neurological function 24 hours after transient middle cerebral artery occlusion. This protective effect was not associated with major intracerebral hemorrhage or prolonged tail bleeding times. Thus, pharmacological PLD inhibition might represent a safe therapeutic strategy to prevent arterial thrombosis or ischemic stroke. After revealing a central role for PLD in thrombo-inflammation, the regulation of PLD activity in platelets was analyzed in the last part of the thesis. Up to date, most studies made use of inhibitors potentially exerting off-target effects and consequently PLD regulation is discussed controversially. Therefore, PLD activity in mice genetically lacking potential modulators of PLD activity was determined to address these controversies. These studies revealed that PLD is tightly regulated during initial platelet activation. While integrin outside-in signaling and Gi signaling was dispensable for PLD activation, it was found that PLC dependent pathways were relevant for the regulation of PLD enzyme activity. N2 - Zusammenfassung Thrombozytenaktivierung und -aggregation sowie die anschließende Thrombusbildung sind essentielle Prozesse während der primären Hämostase. Andererseits kann unkontrollierte Thrombozytenaktivierung zum Gefäßverschluss und somit zu Schlaganfall oder Herzinfarkt führen. Verschiedene Signalwege, die für die Thrombozytenaktivierung von Bedeutung sind, führen zur Aktivierung von Phospholipasen (PL), die daraufhin sekundäre intrazelluläre Botenstoffe generieren. Während die Rolle von PLCs für die Thrombozytenaktivierung bekannt ist, ist die Relevanz der PLDs noch ungeklärt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Regulation von PLD in der Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung mittels genetisch veränderter Mäuse. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Adhäsion, Aktivierung und Aggregation von Pld2-/- und Pld1-/-/Pld2-/- Thrombozyten in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Abwesenheit von PLD2 zu einer verminderten PLD Aktivität in Thrombozyten führte. Dies hatte allerdings keinen erkennbaren Effekt auf die Funktion der Thrombozyten in vitro und in vivo. Die PLD doppel-defizienten Thrombozyten hingegen wiesen Defekte bei der Sekretion der α-Granula auf, was zur Bildung von instabilen FeCl3-induzierten Thromben in einem in vivo Thrombosemodell führte. Diese Effekte waren in den einzeldefizienten Mäusen nicht vorhanden, was auf redundante Funktionen von PLD1 und PLD2 in diesem Prozess schließen lässt. Interessanterweise wurden keine hämostatischen Defekte durch die Doppeldefizienz hervorgerufen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass PLD eine neue potentielle antithrombotische Zielstruktur darstellt. Diese Hypothese wurde im zweiten Teil der Arbeit weiter überprüft. Der Effekt einer PLD Hemmung durch den reversiblen PLD Inhibitor 5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI) auf Hämostase und Thrombose wurde untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Mäusen mit FIPI zu einer spezifischen Blockade von PLD führte, die die alpha-Degranulierung und Integrinaktivierung, im ähnlichen Ausmaß wie in den doppeldefizienten Mäusen, beeinträchtigte. Des Weiteren zeigten Mäuse, die mit 3 mg/kg FIPI behandelt wurden, starke Defekte in der arteriellen Thrombusbildung in Makro- und Mikrogefäßen. FIPI vermittelte PLD Inhibition führte außerdem zu einem Schutz der Mäuse in einem Modell des ischämischen Schlaganfalls, ohne intrazerebrale Blutungen hervorzurufen. Diese Ergebnisse etablieren FIPI als potentiellen antithrombotischen Wirkstoff für eine effektive und sichere Behandlung von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen. Da PLD eine zentrale Rolle während der Thrombusbildung hat, wurde im letzten Teil der Arbeit auf die Regulation von PLD während der Thrombozytenaktivierung eingegangen. Bisherige Studien verwendeten häufig Inhibitoren, die zu unspezifischen Effekten führen können. Daher wird die Regulation von PLD in der Literatur kontrovers diskutiert. Die Untersuchung der PLD Aktivität in verschiedenen knockout Mauslinien stellt einen nützlichen Ansatz dar, um die kontrovers diskutierte PLD Regulation aufzuklären. Zu diesem Zweck wurde die PLD Aktivität in genetisch veränderten Mäusen, denen potentielle Regulatoren von PLD fehlen, gemessen. Im Zuge diesen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass integrinabhängige- und Gi-vermittelte Signalwege keinen Einfluss auf die Regulation von PLD hatten, während PLC vermittelte Signale von Bedeutung waren. KW - Phospholipase D KW - Thrombozyt KW - Thrombose KW - Schlaganfall KW - Hämsotase KW - Phospholipase D KW - Thrombose KW - Hämostase KW - Schlaganfall KW - Blutstillung KW - Maus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99179 ER - TY - THES A1 - Wang, Ying T1 - Immune and peripheral endogenous opioid mechanisms of electroacupuncture analgesia T1 - Immunologische und periphere endogene Opioidmechanismen bei Analgesie durch Elektroakupunktur N2 - A precious treasure in traditional Chinese medicine (TCM), acupuncture played a vital and irreplaceable role in contributing to people’s health in the thousands of years of Chinese history, and in 2010 was officially added to the “Representative List of the Intangible Cultural Heritage of Humanity” by the United Nations. Because of the side-effects of long-term drug therapy for pain, and the risks of dependency, acupuncture has been widely accepted as one of the most important alternative choice therapies for treating varieties of acute and chronic pain-related disorders. The clinical application and scientific mechanism research of acupuncture have therefore increased intensively in the last few decades. Besides hand acupuncture, other treatment approaches e.g. electroacupuncture (EA) have been widely accepted and applied as an important acupuncture-related technique for acupuncture analgesia (AA) research. The involvement of opioid peptides and receptors in acute AA has been shown via pre-EA application of opioid receptor/peptide antagonists. However, existing publications still cannot illuminate the answer to the following question: how does sustained antinociception happen by EA treatment? The hypothesis of opioid peptide-mediated tonic AA might be able to answer the question. In the first part of this thesis, the institution of a reproducible acupuncture treatment model as well as the endogenous opioid-related mechanisms was demonstrated. An anatomically-based three-dimensional (3D) rat model was established to exhibit a digital true-to-life organism, accurate acupoint position and EA treatment protocol on bilateral acupoint GB-30 Huantiao. The optimal EA treatment protocol (100 Hz, 2-3 mA, 0.1 ms, 20 min) at 0 and 24 h after induction of inflammatory pain by complete Freund’s adjuvant (CFA) on conscious free-moving rats was then established. EA elicited significant sustained mechanical and thermal antinociception up to 144 h. Post-EA application of opioid receptors (mu opioid receptor, MOR; delta opioid receptor, DOR) antagonists naloxone (NLX) and naltrindole (NTI), or opioid peptide antibodies anti-beta-endorphin (anti-END), met-enkephalin (anti-ENK) or -dynorphin A (anti-DYN) could also block this effect at a late phase (96 h) of CFA post-EA, which suggested opioid-dependent tonic analgesia was produced by EA. Meanwhile, EA also reduced paw temperature and volume at 72-144 h post CFA indicating anti-inflammatory effects. Nociceptive thresholds were assessed by paw pressure threshold (Randall-Sellito) or paw withdrawal latency (Hargreaves) and an anti-inflammatory effect was evaluated by measurement of plantar temperature and volume of inflamed paw. The second part of the thesis further suggests the correlation between the chemokine CXCL10 (= interferon-gamma inducible protein 10, IP-10) and opioid peptides in EA-induced antinociception. Based on a comprehensive Cytokine Array of 29 cytokines, targeted cytokines interleukin (IL)-1alpha, interleukin (IL)-1beta, tumor necrosis factor (TNF)-alpha, interleukin (IL)-4, interleukin (IL)-13, interferon (IFN)-gamma as well as CXCL10 were selected and quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and real time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) quantification confirmed upregulation of CXCL10 mRNA at both 72 and 96 h. The following hyperalgesic assessment suggested the antinociceptive effect of CXCL10. The double immunostaining localizing opioid peptides with macrophages expressed the evident upregulation of CXCR3-receptor of CXCL10 in EA treated samples as well as the significant upregulation or downregulation of opioid peptides by repeated treatment of CXCL10 or antibody of CXCL10 via behavioral tests and immune staining. Subsequent immunoblotting measurements showed non-alteration of opioid receptor level by EA, indicating that the opioid receptors did not apparently contribute to AA in the present studies. In vitro, CXCL10 did not directly trigger opioid peptide END release from freshly isolated rat macrophages. This might implicate an indirect property of CXCL10 in vitro stimulating the opioid peptide-containing macrophages by requiring additional mediators in inflammatory tissue. In summary, this project intended to explore the peripheral opioid-dependent analgesic mechanisms of acupuncture with a novel 3D treatment rat model and put forward new information to support the pivot role of chemokine CXCL10 in mediating EA-induced tonic antinociception via peripheral opioid peptides. N2 - Als wertvoller Schatz in der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) spielt die Akupunktur eine wichtige und unersetzliche Rolle für die Gesundheit der Menschen in der über tausendjährigen Geschichte von China und wurde im Jahr 2010 offiziell in das "Weltkulturerbe" der Vereinten Nationen aufgenommen. Aufgrund der Nebenwirkungen von Langzeittherapien zur Schmerzbehandlung und dem Risiko der Abhängigkeit wird Akupunktur weithin als eine wichtigste Alternative für die Behandlung von akuten und chronischen Schmerzen eingesetzt. Die klinische Anwendung und Forschung in der Akupunktur wurden in den letzten Jahrzehnten intensiv vorangetrieben. Neben Handakupunktur gibt es noch andere Behandlungsmöglichkeiten, wie z.B. die Elektroakupunktur (EA). EA ist vor allem eine allgemein akzeptierte und wichtige akupunkturbezogene Technik für die Akupunkturanalgesie (AA) in der Forschung. Die Beteiligung von Opioidpeptiden und Opioidrezeptoren in der akuten AA wurde mittels Anwendung von Opioidrezeptorantagonisten/Opioidpeptidantikörpern appliziert vor EA gezeigt. Nach dem aktuellen Forschungsstand kann man jedoch nicht die Frage beantworten, wie die längerfristige (tonische) Antinozizeption nach EA-Behandlung funktioniert. Mit einer Hypothese zur Opioidpeptid vermittelten tonischen AA könnte man die Frage hierzu beantworten. In der vorliegenden Arbeit wurden in einem Modell der Akupunktur zum ersten Mal endogene Opioid-vermittelte Mechanismen reproduzierbar nachgewiesen. Es wurde ein dreidimensionales (3D) anatomisch-basiertes Rattenmodell entworfen, um am wachen Tier ein genaue Akupunkturbehandlung (EA) an den Akupunkten GB-30 Huantiao beidseitig durchzuführen. Darüber hinaus wurde ein optimiertes Behandlungsprotokoll von EA (100 Hz, 2-3 mA, 0.1 ms, 20 min) bei Ratten 0 und 24 h nach intraplantarer Injektion von komplettem Freunds Adjuvans (CFA) etabliert. Nozizeptive Schwellen wurden mittels Pfotendruckschwelle (Randall-Sellito) oder Pfotenrückzugslatenzzeit (Hargreaves) gemessen und die entzündungshemmende Wirkung durch Messung der Pfotentemperatur und Volumen der entzündeten Pfote ausgewertet. EA bewirkte eine signifikante mechanische und thermische Antinozizeption, welche bis zu 144 h anhielt. Die antinozizeptive Wirkung durch EA war nach Injektion von Opioidrezeptorantagonisten (mu opioid receptor, MOR; delta opioid receptor, DOR) Naloxon (NLX) und Naltrindol (NTI) oder Antikörpern gegen die Opioidpeptide beta-Endorphin (anti-END), Met-Enkephalin (anti-ENK) oder Dynorphin A (anti-DYN) während der späten Entzündungsphase (96 h) mit CFA blockierbar. Dies lässt auf eine durch EA induzierte tonische Analgesie schließen. Darüber hinaus reduzierte EA auch die erhöhte Pfotentemperatur und das erhöhte Pfotenvolumen, welche sehr typisch ist für eine 96-144 h Entzündung mit CFA. Dies spricht für eine entzündungshemmende Wirkung von EA. Nachfolgend wurde die Beteiligung von Opioidpeptiden und dem Chemokin CXCL10 (= Interferon-gamma induziertes Protein 10, IP-10) sowie die Korrelationen zwischen beiden geklärt. Basierend auf umfangreichenden Zytokinarrays mit 29 Zytokinen, wurden die Zytokine Interleukin (IL)-1alpha, Interleukin (IL)-1beta, Tumornekrosefaktor (TNF)-alpha, Interleukin (IL)-4, Interleukin (IL)-13, Interferon (IFN)-gamma und CXCL10 gezielt ausgewählt und im Enzym Immunoassay (ELISA) sowie durch eine Echtzeit Reverse Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) quantifiziert. Die Quantifizierung auf mRNA-Ebene zeigte eine Hochregulation von CXCL10 bei 96 h und zum früheren Zeitpunkt von 72 h. Nachfolgende Schmerzschwellenmessungen wiesen auf eine antinozizeptive Wirkung von CXCL10 hin. Eine Doppelimmunfärbung zeigte die Lokalisation von Opioidpeptiden in Makrophagen. Nachweislich wurde die Expression des CXCR3-Rezeptor von CXCL10 in EA behandelten Pfoten erhöht. Ebenso kam es zu einer signifikanten Hochregulation von Opioidpeptiden durch wiederholte Behandlung mit CXCL10 bzw. Herunterregulation der Opioidpeptide nach wiederholter Behandlung mit anti-CXCL10 Antikörper. Dies wurde sowohl in Verhaltenstests als auch in der Immunfärbung zu beobachtet. Immunoblotting zeigte keine Veränderung der Expression von Opioidrezeptoren nach EA, was schließen lässt, dass die Menge an Opioidrezeptoren in den vorliegenden Untersuchungen keine Rolle spielen. Da CXCL10 in vitro keine direkten Effekt auf die Freisetzung des Opioidpeptides beta-END aus frisch isolierten Rattenmakrophagen hat, liegt die Vermutung nahe, dass CXCL10 in vitro eine indirekte Rolle als Mediator zukommt und indirekt die Opioidpeptidfreisetzung aus Makrophagen in entzündlichen Gewebe stimuliert wird. Zusammenfassend wurden in dem hier vorgestellten Projekt die Opioidpeptid-abhängigen analgetischen und peripheren Mechanismen der Akupunktur mit einem neuartigem 3D-Behandlungsmodell der Ratte untersucht und eine Schlüsselrolle des Chemokins CXCL10 bei der Vermittlung der EA-induzierten tonischen Antinozizeption in Abhändigkeit von peripheren Opioidpeptiden. (Translated by Dr. Dagmar Hackel and revised by Priv.-Doz. Dr. Heike Rittner) KW - Elektroakupunktur KW - electroacupuncture KW - peripheral analgesia KW - Chemokin CXCL10 KW - Analgesie KW - Cytokine KW - Ratte KW - opioid peptide KW - cytokines KW - Periphere Analgesie KW - Opioidpeptide Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98326 ER - TY - THES A1 - Blanco Redondo, Beatriz T1 - Studies of synapsin phosphorylation and characterization of monoclonal antibodies from the Würzburg Hybridoma Library in Drosophila melanogaster T1 - Untersuchungen der Phosphorylierung von Synapsin und Charakterisierung monoklonaler Antikörper der Würzburg Hybridoma Library in Drosophila melanogaster N2 - Synapsins are conserved synapse-associated hosphoproteins involved in the fine regulation of neurotransmitter release. The aim of the present project is to study the phosphorylation of synapsins and the distribution of phospho-synapsin in the brain of Drosophila melanogaster. Three antibodies served as important tools in this work, a monoclonal antibody (3C11/α-Syn) that recognizes all known synapsin isoforms and two antisera against phosphorylated synapsin peptides (antiserum PSyn(S6) against phospho-serine 6 and antiserum PSyn(S464) against phospho-serine 464). These antisera were recently generated in collaboration with Bertram Gerber and Eurogentec. ... N2 - Synapsine sind konservierte, Synapsen-assoziierte Phosphoproteine, die an der Feinregulation der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind. Das Ziel des Projektes ist, die Phosphorylierung der Synapsine und die Verteilung des Phospho-Synapsins im Gehirn von Drosophila melanogaster zu untersuchen. Aus diesem Grunde wurden drei bestimmte Antikörper in dieser Arbeit verwendet: Ein monoklonaler Antikörper (3C11/α-Syn), der alle bekannten Isoformen von Synapsin erkennt, und zwei Antiseren gegen phosphorylierte Synapsinpeptide (das Antiserum PSyn(S6) gegen Phosphoserin 6 und das Antiserum PSyn(S464) gegen Phosphoserin 464). Diese Antiseren wurden unlängst in Zusammenarbeit mit Bertram Gerber und Eurogentec hergestellt. KW - Synapsine KW - neuroscience KW - Taufliege KW - Monoklonaler Antikörper KW - Neurowissenschaften Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-93766 ER - TY - THES A1 - Hein, Melanie T1 - Functional analysis of angiogenic factors in tumor cells and endothelia T1 - Funktionelle Analyse angiogener Faktoren in Tumorzellen und Endothelien N2 - Tumor angiogenesis is essential for the growth of solid tumors as their proliferation and survival is dependent on consistent oxygen and nutrient supply. Anti-angiogenic treatments represent a therapeutic strategy to inhibit tumor growth by preventing the formation of new blood vessels leading to starvation of the tumor. One of the best characterized anti angiogenic therapeutics is the monoclonal antibody bevacizumab (Avastin), which targets and neutralizes VEGF leading to disruption of the VEGF signaling pathway. Until today, bevacizumab has found its way into clinical practice and has gained approval for treatment of different types of cancer including colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer and renal cell carcinoma. Signaling of VEGF is mediated through VEGF receptors, mainly VEGFR2, which are primarily located on the cell surface of endothelial cells. However, there has been evidence that expression of VEGF receptors can also be found on tumor cells themselves raising the possibility of autocrine and/or paracrine signaling loops. Thus, tumor cells could also benefit from VEGF signaling, which would promote tumor growth. The aim of this study was to investigate if bevacizumab has a direct effect on tumor cells in vitro. To this end, tumor cell lines from the NCI-60 panel derived from four different tumor types were treated with bevacizumab and angiogenic gene and protein expression as well as biological outputs including proliferation, migration and apoptosis were investigated. Most of the experiments were performed under hypoxia to mimic the in vivo state of tumors. Overall, there was a limited measurable effect of bevacizumab on treated tumor cell lines according to gene and protein expression changes as well as biological functions when compared to endothelial controls. Minor changes in terms of proliferation or gene regulation were evident in a single tumor cell line after VEGF-A blockade by bevacizumab, which partially demonstrated a direct effect on tumor cells. However, the overall analysis revealed that tumor cell lines are not intrinsically affected in an adverse manner by bevacizumab treatment. Besides the functional analysis of tumor cells, embryonic stem cell derived endothelial cells were characterized to delineate vascular Hey gene functions. Hey and Hes proteins are the best characterized downstream effectors of the evolutionary conserved Notch signaling pathway, which mainly act as transcriptional repressors regulating downstream target genes. Hey proteins play a crucial role in embryonic development as loss of Hey1 and Hey2 in mice in vivo leads to a severe vascular phenotype resulting in early embryonic lethality. The major aim of this part of the thesis was to identify vascular Hey target genes using embryonic stem cell derived endothelial cells utilizing a directed endothelial differentiation approach, as ES cells and their differentiation ability provide a powerful in vitro system to study developmental processes. To this end, Hey deficient and Hey wildtype embryonic stem cells were stably transfected with an antibiotic selection marker driven by an endothelial specific promoter, which allows selection for endothelial cells. ESC-derived endothelial cells exhibited typical endothelial characteristics as shown by marker gene expression, immunofluorescent staining and tube formation ability. In a second step, Hey deficient ES cells were stably transfected with doxycycline inducible Flag-tagged Hey1 and Hey2 transgenes to re-express Hey proteins in the respective cell line. RNA-Sequencing of Hey deficient and Hey overexpressing ES cells as well as ESC-derived endothelial cells revealed many Hey downstream target genes in ES cells and fewer target genes in endothelial cells. Hey1 and Hey2 more or less redundantly regulate target genes in ES cells, but some genes were regulated by Hey2 alone. According to Gene Ontology term analysis, Hey target genes are mainly involved in embryonic development and transcriptional regulation. However, the response of ESC-derived endothelial cells in regulating Hey downstream target genes was rather limited when compared to ES cells, which could be due to lower transgene expression in endothelial cells. The limited response also raises the possibility that target gene regulation in endothelial cells is not only dependent on Hey gene functions alone and thus loss or overexpression of Hey genes in this in vitro setting does not influence target gene regulation. N2 - Tumorangiogenese ist essential für das Wachstum von Tumoren, da ihr Überleben und ihre Proliferation von einer dauerhaften Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen abhängig sind. Anti-angiogene Therapeutika inhibieren das Wachstum von Tumoren, indem sie die Bildung von neuen Blutgefäßen unterbinden, was zu einem „Verhungern“ des Tumors führt. Zu den am besten untersuchten anti-angiogenen Therapeutika gehört der monoklonale Antikörper Bevacizumab (Avastin), welcher den Wachstumsfaktor VEGF bindet und neutralisiert, was schließlich zu einer Unterbrechung des VEGF-Signalweges führt. Bevacizumab wird aktuell zur Behandlung verschiedener Tumortypen, unter anderem Colonkarzinom, nicht kleinzelliges Lungenkarzinom, Brustkrebs und Nierenzellkarzinom in der Praxis angewandt. VEGF bindet an VEGFR2 und andere VEGF-Rezeptoren, welche primär an der Oberfläche von Endothelzellen lokalisiert sind. Dennoch gibt es Hinweise, dass die Expression von VEGF-Rezeptoren nicht ausschließlich auf Endothelzellen begrenzt ist, sondern auch auf Tumorzellen nachgewiesen werden konnte. Die tumorale Expression von VEGF-Rezeptoren ermöglicht eine direkte autokrine und/oder parakrine Stimulation von Tumorzellen. Tumorzellen könnten dadurch selbst vom VEGF-Signalweg profitieren, was das Tumorwachstum fördern würde. Das Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob Bevacizumab in vitro einen direkten Einfluss auf Tumorzellen ausübt. Dazu wurden verschiedene Tumorzelllinien von vier unterschiedlichen Tumortypen aus der NCI-60 Sammlung mit Bevacizumab behandelt und anschließend die Gen- und Proteinexpression von angiogenen Markern sowie biologische Funktionen wie Proliferation, Migration und Apoptose untersucht. Die Experimente wurden hauptsächlich unter Hypoxie durchgeführt, um den in vivo Status von Tumoren nachzuahmen. Insgesamt war ein direkter Effekt von Bevacizumab auf Tumorzellen im Vergleich zu Endothelzellen nicht nachweisbar. Gen- und Proteinexpression sowie biologische Funktionen waren in Tumorzellen nach Bevacizumab Behandlung bis auf wenige Ausnahmen unverändert. Geringe Veränderungen in der Proliferationsrate sowie in der Genregulation nach Inhibition von VEGF durch Bevacizumab konnten jeweils in einer einzelnen Zelllinie nachgewiesen werden, wodurch zumindest teilweise eine direkte Wirkung von Bevacizumab auf Tumorzellen gezeigt werden konnte. Dennoch zeigt die umfassende Analyse der verschiedenen Tumorzellen, dass die Bevacizumab-Behandlung sich insgesamt nicht negativ auf Tumorzellen auswirkt und diese nicht intrinsisch beeinflusst werden. Neben der funktionellen Analyse von Tumorzellen wurden Endothelzellen, die aus embryonalen Stammzellen gewonnen wurden, charakterisiert, um anhand derer die Rolle der Hey Gene in der vaskulären Entwicklung näher zu bestimmen. Hey und Hes Proteine sind die am besten charakterisierten nachgeschalteten Effektoren des evolutionär konservierten Notch-Signalweges. Als Transkriptionsfaktoren sind Hey Proteine an der Regulation von Zielgenen beteiligt, wobei sie meist als transkriptionelle Repressoren fungieren. Hey Proteine spielen eine sehr wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung, da der gemeinsame Verlust von Hey1 und Hey2 in Mäusen in vivo einen vaskulären Phenotyp hervorruft, der in sehr früher embryonaler Letalität endet. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, vaskuläre Hey Zielgene mit Hilfe von Endothelzellen, die aus embryonalen Stammzellen differenziert wurden, zu identifizieren. Die Fähigkeit embryonaler Stammzellen verschiedene Zelltypen zu bilden, liefert dabei ein wertvolles in vitro System, um entwicklungsbiologische Prozesse zu analysieren. Dazu wurden Hey-defiziente und Hey-Wildtyp embryonale Stammzellen mit einem antibiotischen Selektionsmarker versehen, dessen Expression von einem Endothel spezifischen Promoter kontrolliert wird und daher die Selektion von Endothelzellen erlaubt. Die differenzierten Endothelzellen wiesen typische endotheliale Charakteristika auf, was durch Markergen-Expression, Immunfluoreszenzfärbungen und der Bildung netzwerkähnlicher Strukturen gezeigt werden konnte. In einem zweiten Schritt wurden Doxyzyklin-induzierbare Flag-markierte Hey1 bzw. Hey2 Konstrukte stabil in Hey-defiziente Zellen integriert, um Hey1 bzw. Hey2 kontrollierbar zu re-exprimieren. Die Zielgensuche mittels RNA-Seq Analyse lieferte viele Hey Zielgene in embryonalen Stammzellen, jedoch weitaus weniger Zielgene in ausdifferenzierten Endothelzellen. Zusammengefasst zeigten Hey1 und Hey2 eine redundante Regulation von Zielgenen in embryonalen Stammzellen, wobei einige wenige Gene alleine durch Hey2 reguliert wurden. Die Gen-Ontologie Analyse zeigte, dass diese Zielgene hauptsächlich an der embryonalen Entwicklung und der transkriptionellen Regulation von anderen Genen beteiligt sind. Dennoch war die Anzahl der Hey regulierten Gene in Endothelzellen weitaus geringer als in embryonalen Stammzellen. Das könnte auf eine geringere Transgen-Expression in Endothelzellen im Vergleich zu embryonalen Stammzellen zurückzuführen sein. Die weitaus geringere Anzahl an Hey Zielgenen in Endothelzellen lässt außerdem vermuten, dass die Regulation von Zielgenen in Endothelzellen nicht ausschließlich von der Funktion der Hey Gene abhängig ist. Die Regulation von Hey Zielgenen in Endothelien wurde durch den Verlust bzw. die Überexpression von Hey1 und Hey2 in dem angewandten in vitro System nur geringfügig beeinflusst. KW - Krebs KW - Angiogenese KW - Cancer KW - Angiogenesis KW - Bevacizumab KW - Monoklonaler Antikörper KW - Antiangiogenese Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-93863 ER -