TY - THES A1 - Pfeifer, Thomas T1 - Adaptive control of coherent soft X-rays T1 - Adaptive Kontrolle kohärenter weicher Röntgenstrahlung N2 - The availability of coherent soft x-rays through the nonlinear optical process of high-harmonic generation allows for the monitoring of the fastest events ever observed in the laboratory. The attosecond pulses produced are the fundamental tool for the time-resolved study of electron motion in atoms, molecules, clusters, liquids and solids in the future. However, in order to exploit the full potential of this new tool it is necessary to control the coherent soft x-ray spectra and to enhance the efficiency of conversion from laser light to the soft x-ray region in the harmonic-generation process. This work developed a comprehensive approach towards the optimization of the harmonic generation process. As this process represents a fundamental example of \emph{light}--\emph{matter} interaction there are two ways of controlling it: Shaping the generating laser \emph{light} and designing ideal states of \emph{matter} for the conversion medium. Either of these approaches was closely examined. In addition, going far beyond simply enhancing the conversion process it could be shown that the qualitative spectral response of the process can be modified by shaping the driving laser pulse. This opens the door to a completely new field of research: Optimal quantum control in the attosecond soft x-ray region---the realm of electron dynamics. In the same way as it is possible to control molecular or lattice vibrational dynamics with adaptively shaped femtosecond laser pulses these days, it will now be feasible to perform real-time manipulation of tightly bound electron motion with adaptively shaped attosecond light fields. The last part of this work demonstrated the capability of the herein developed technique of coherent soft-x-ray spectral shaping, where a measured experimental feedback was used to perform a closed-loop optimization of the interaction of shaped soft x-ray light with a sulfur hexafluoride molecule to arrive at different control objectives. For the optimization of the high-harmonic-generation process by engineering the conversion medium, both the gas phase and the liquid phase were explored both in experiment and theory. Molecular media were demonstrated to behave more efficiently than commonly used atomic targets when elliptically polarized driving laser pulses are applied. Theory predicted enhancement of harmonic generation for linearly polarized driving fields when the internuclear distance is increased. Reasons for this are identified as the increased overlap of the returning electron wavefunction due to molecular geometry and the control over the delocalization of the initial electronic state leading to less quantum-mechanical spreading of the electron wavepacket during continuum propagation. A new experimental scheme has been worked out, using the method of molecular wavepacket generation as a tool to enhance the harmonic conversion efficiency in `pump--drive' schemes. The latter was then experimentally implemented in the study of high-harmonic generation from water microdroplets. A transition between the dominant laser--soft-x-ray conversion mechanisms could be observed, identifying plasma-breakdown as the fundamental limit of high-density high-harmonic generation. Harmonics up to the 27th order were observed for optimally laser-prepared water droplets. To control the high-harmonic generation process by the application of shaped laser light fields a laser-pulse shaper based on a deformable membrane mirror was built. Pulse-shape optimization resulted in increased high-harmonic generation efficiency --- but more importantly the qualitative shape of the spectral response could be significantly modified for high-harmonic generation in waveguides. By adaptive optimization employing closed-loop strategies it was possible to selectively generate narrow (single harmonics) and broad bands of harmonic emission. Tunability could be demonstrated both for single harmonic orders and larger regions of several harmonics. Whereas any previous experiment reported to date always produced a plateau of equally intense harmonics, it has been possible to demonstrate ``untypical'' harmonic soft x-ray spectra exhibiting ``switched-off'' harmonic orders. The high degree of controllability paves the way for quantum control experiments in the soft x-ray spectral region. It was also demonstrated that the degree of control over the soft x-ray shape depends on the high-harmonic generation geometry. Experiments performed in the gas jet could not change the relative emission strengths of neighboring harmonic orders. In the waveguide geometry, the relative harmonic yield of neighboring orders could be modified at high contrast ratios. A simulation based solely on the single atom response could not reproduce the experimentally observed contrast ratios, pointing to the importance of propagation (phase matching) effects as a reason for the high degree of controllability observed in capillaries, answering long-standing debates in the field. A prototype experiment was presented demonstrating the versatility of the developed soft x-ray shaping technique for quantum control in this hitherto unexplored wavelength region. Shaped high-harmonic spectra were again used in an adaptive feedback loop experiment to control the gas-phase photodissociation reaction of SF$_6$ molecules. A time-of-flight mass spectrometer was used for the detection of the ionic fragments. The branching ratios of particular fragmentation channels could be varied by optimally shaped soft x-ray light fields. Although in one case only slight changes of the branching ratio were possible, an optimal solution was found, proving the sufficient technical stability of this unique coherent soft-x-ray shaping method for future applications in optimal control. Active shaping of the spectral amplitude in coherent spectral regions of $\sim$10~eV bandwidth was shown to directly correspond to shaping the temporal features of the emerging soft x-ray pulses on sub-femtosecond time scales. This can be understood by the dualism of frequency and time with the Fourier transformation acting as translator. A quantum-mechanical simulation was used to clarify the magnitude of temporal control over the shape of the attosecond pulses produced in the high-harmonic-generation process. In conjunction with the experimental results, the first attosecond time-scale pulse shaper could thus be demonstrated in this work. The availability of femtosecond pulse shapers opened the field of adaptive femtosecond quantum control. The milestone idea of closed-loop feedback control to be implemented experimentally was expressed by Judson and Rabitz in their seminal work titled ``Teaching lasers to control molecules''. This present work extends and turns around this statement. Two fundamentally new achievements can now be added, which are ``Teaching molecules to control laser light conversion'' and ``Teaching lasers to control coherent soft x-ray light''. The original idea thus enabled the leap from femtosecond control of molecular dynamics into the new field of attosecond control of electron motion to be explored in the future. The \emph{closed}-loop approach could really \emph{open} the door towards fascinating new perspectives in science. Coming back to the introduction in order to close the loop, let us reconsider the analogy to the general chemical reaction. Photonic reaction control was presented by designing and engineering effective media (catalysts) and controlling the preparation of educt photons within the shaped laser pulses to selectively produce desired photonic target states in the soft x-ray spectral region. These newly synthesized target states in turn could be shown to be effective in the control of chemical reactions. The next step to be accomplished will be the control of sub-femtosecond time-scale electronic reactions with adaptively controlled coherent soft x-ray photon bunches. To that end a time-of-flight high-energy photoelectron spectrometer has recently been built, which will now allow to directly monitor electronic dynamics in atomic, molecular or solid state systems. Fundamentally new insights and applications of the nonlinear interaction of shaped attosecond soft x-ray pulses with matter can be expected from these experiments. N2 - Die Verfügbarkeit kohärenter weicher Röntgenstrahlung durch den nichtlinear-optischen Prozess der Erzeugung hoher Harmonischer von Laserstrahlung erlaubt es, die schnellsten jemals im Labor beobachteten Ereignisse in ihrem Ablauf zu verfolgen. Die in diesem Prozess erzeugten Attosekundenpulse stellen das wichtigste Werkzeug dar, um in Zukunft die zeitaufgelöste Elektronenbewegung in Atomen, Molekülen, Clustern, Flüssigkeiten und Festkörpern zu untersuchen. Um jedoch das volle Potential dieses Werkzeugs zu nutzen, ist es notwendig, den Prozess der Erzeugung hoher Harmonischer in einer Weise zu optimieren, die es ermöglicht, zum einen gezielt Einfluss auf die Eigenschaften der kohärenten weichen Röntgenspektren zu nehmen und zum anderen die Konversionseffizienz bei der Umwandlung von Laserlicht in harmonische Strahlung zu erhöhen. In dieser Arbeit wurde eine umfassende Herangehensweise an das Problem der Optimierung des Erzeugungsprozesses der hohen Harmonischen Strahlung entwickelt. Da der Prozess ein fundamentales Beispiel einer Licht-Materie-Wechselwirkung darstellt, gibt es genau zwei Möglichkeiten, ihn zu kontrollieren: Die Formung des erzeugenden Laser\emph{lichtes} und die Entwicklung idealer \emph{Materie}zustände als Konversionsmedien. Beide Möglichkeiten wurden im Rahmen dieser Arbeit gründlich untersucht. Zusätzlich zur bloßen Steigerung der Ausbeute an Hoher-Harmonischer-Strahlung konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass es möglich ist, die Spektren der erzeugten kohärenten weichen Röntgenstrahlung durch geformte Laserpulse qualitativ zu modifizieren. Dies eröffnet Möglichkeiten für ein grundlegend neues Forschungsgebiet: Optimale Quantenkontrolle im Attosekunden- und weichen Röntgenbereich---dem Bereich elektronischer Dynamik. Auf die gleiche Art und Weise wie es heutzutage möglich ist, Molekül- oder Gitterschwingungsdynamik mit adaptiv geformten Femtosekundenpulsen zu kontrollieren, sind wir ab jetzt in der Lage, mit adaptiv geformten Attosekunden-Lichtfeldern die Bewegung von fest gebundenen Elektronen in Echtzeit zu beeinflussen. Im letzten Teil dieser Arbeit wird das Potential der hierin entwickelten Methode der Formung kohärenter weicher Röntgenspektren demonstriert, indem ein gemessenes experimentelles Rückkopplungssignal benutzt wurde, um eine `closed-loop' Optimierung der Wechselwirkung von geformtem weichen Röntgenlicht mit Schwefelhexafluoridmolekülen für unterschiedliche Kontrollziele durchzuführen. Im Hinblick auf die Entwicklung und Anpassung des Konversionsmediums zur Optimierung des Prozesses der Erzeugung hoher Harmonischer wurden sowohl die Gas- als auch die Flüssigphase sowohl im Experiment als auch in der Theorie erforscht. Es wurde gezeigt, dass molekulare Medien sich effizienter als Atome verhalten, wenn der erzeugungende Laserpuls elliptisch polarisiert ist. In einer theoretischen Untersuchung wird eine Zunahme der Konversionseffizienz für linear polarisierte Erzeugungspulse erwartet wenn der Kernabstand vergrößert wird. Gründe dafür sind zum einen die Zunahme des Überlapps der zum Atom zurückkehrenden Wellenfunktion des Elektrons wegen der Molekülgeometrie. Zum anderen ermöglicht die Variation des Kernabstands die Kontrolle über die Delokalisation des elektronischen Anfangszustands, die zu einem verminderten quantenmechanischen Zerlaufen des Wellenpakets während seiner Propagation im Kontinuum führt. Eine neuartige experimentelle Methode wurde ausgearbeitet, die sich die Technik der Erzeugung molekularer Wellenpakete als Werkzeug zunutze macht, um die Konversionseffizienz der harmonischen Strahlung in einem so genannten `pump--drive' Verfahren zu erhöhen. Dieses wurde dann in einer Untersuchung der Erzeugung hoher Harmonischer an Wasser-Mikrotropfen experimentell implementiert. Dadurch konnte ein Übergang zwischen den beiden dominanten Mechanismen der Umwandlung von Laserstrahlung in weiches Röntgenlicht beobachtet werden, der den Plasma-Durchbruch als die natürliche Grenze bei der Erzeugung von hohen Harmonischen in hochdichten Medien identifizierte. Harmonische bis hin zur 27sten Ordnung wurden für optimal durch den Laser präparierte Wassertropfen nachgewiesen. Um den Prozess der Erzeugung hoher Harmonischer durch geformte Lichtfelder zu kontrollieren, wurde ein auf einem deformierbaren Membranspiegel basierender Laserpulsformer aufgebaut. Mittels Pulsformoptimierung war es ebenfalls möglich, eine Erhöhung der harmonischen Erzeugungseffizienz zu erzielen---wichtiger jedoch: Es konnte die qualitative Form der erzeugten kohärenten weichen Röntgenspektren signifikant modifiziert werden. Durch adaptive Optimierung unter Anwendung von `closed-loop' Strategien war es möglich, selektiv schmal- (einzelne harmonische Ordnungen) und breitbandige harmonische Spektren zu erzeugen. Durchstimmbarkeit wurde demonstriert sowohl für einzelne Harmonische als auch für größere zusammenhängende Bereiche mehrerer harmonischer Ordnungen. Während in allen bislang durchgeführten Experimenten ein Plateau gleichintensiver harmonischer Ordnungen beobachtet wurde, ist es jetzt zum ersten Mal gelungen, ``untypische'' weiche Röntgenspektren zu generieren, bei denen einzelne harmonische Ordnungen ``ausgeschaltet'' sind. Der hohe Grad der Kontrollierbarkeit bereitet den Weg für Experimente zur Quantenkontrolle im weichen Röntgenbereich. Es wurde ebenso gezeigt, dass der Grad der Kontrolle über die Form der weichen Röntgenspektren von der Erzeugungsgeometrie des Umwandlungsprozesses abhängt. In Experimenten zur Umwandlung im Gasstrahl war es nicht möglich die relative Emissionsstärke benachbarter harmonischer Ordnungen zu verändern. Im Gegensatz dazu konnte in der Wellenleitergeometrie die relative Ausbeute benachbarter Ordnungen mit hohem Kontrastverhältnis modifiziert werden. Eine auf der Antwort eines einzelnen Atoms beruhende Simulation konnte die experimentell beobachteten Kontrastverhältnisse nicht ausreichend reproduzieren: Ein Hinweis auf den Einfluss von Propagationseffekten (Phasenanpassung) als Ursache des in Wellenleitern beobachteten hohen Grades an Kontrollierbarkeit, was offene Debatten auf diesem Feld beantwortet. Um das Anwendungspotential der entwickelten Technik zur Formung kohärenter weicher Röntgenspektren im Hinblick auf Quantenkontrollexperimente in der entspechenden diesbezüglich bislang unerforschten Wellenlängenregion aufzuzeigen, wurde ein Prototypexperiment durchgeführt. Hier wurden wiederum mittels adaptiver Rückkopplungsschleife die nun formbaren Röntgenspektren dazu eingesetzt, die Photodissoziationsreaktion von SF$_6$-Molekülen in der Gasphases zu kontrollieren. Ein Flugzeitmassenspektrometer wurde zur Detektion der ionischen Fragmente herangezogen. Das Verzweigungsverhältnis einzelner Fragmentationskanäle konnte durch den Einfluss optimal geformter weicher Röntgenfelder variiert werden. Obwohl in einem Fall nur eine leichte Veränderung möglich war, konnte eine optimale Lösung gefunden werden, wodurch die ausreichende technische Stabilität dieser einzigartigen Methode zur Formung kohärenter weicher Röntgenstrahlung für zukünftige Anwendungen auf dem Gebiet der optimalen Kontrolle bewiesen wurde. Es wurde ferner darauf eingegangen, dass aktive Formung der spektralen Amplitude in kohärenten Spektren von $\sim$10~eV Bandbreite in direktem Zusammenhang steht mit der Formung zeitlicher Eigenschaften der entstehenden weichen Röntgenpulsen auf einer Subfemtosekundenzeitskala. Dies kann durch den Frequenz-Zeit-Dualismus verstanden werden, in dem die Fouriertransformation als Übersetzer fungiert. Eine quantenmechanische Simulation wurde durchgeführt, um das Ausmaß der zeitlichen Kontrolle über die Attosekundenpulsform beim Umwandlungsprozess näher zu beleuchten. Zusammen mit den experimentellen Ergebnissen konnte damit der erste Attosekundenpulsformer in dieser Arbeit demonstriert werden. Die Verfügbarkeit von Femtosekundenpulsformern eröffnete das Gebiet der adaptiven Femtosekunden-Quantenkontrolle. Die bahnbrechende Idee der `closed-loop' Rückkopplungskontrolle, die dazu experimentell implementiert wurde, war von Judson und Rabitz in ihrer wegweisenden Arbeit mit dem Titel ``Teaching lasers to control molecules'' (``Es Lasern beibringen, Moleküle zu kontrollieren'') zum Ausdruck gekommen. Die vorliegende Arbeit kann dieser Idee nun eine erweiterte und eine ``umgekehrte'' Form hinzufügen: ``Teaching molecules to control laser light conversion'' (``Es Molekülen beibringen, Laserlichtkonversion zu kontrollieren'') und ``Teaching lasers to control coherent soft x-ray light'' (``Es Lasern beibringen, kohärentes weiches Röntgenlicht zu kontrollieren''). Die ursprüngliche Idee erlaubte somit nun also auch den Sprung von der Femtosekundenkontrolle molekularer Dynamik hinein in das neue Gebiet der Attosekundenkontrolle elektronischer Bewegung, dessen Erforschung nun unmittelbar bevorsteht. Die Idee der \emph{geschlossenen} Schleife (`closed-loop') konnte damit tatsächlich das Tor \emph{öffnen} hinaus in eine Fülle neuer Perspektiven für die Naturwissenschaft. KW - Ultrakurzer Lichtimpuls KW - Femtosekundenbereich KW - Frequenzvervielfachung KW - Kohärente Anregung KW - Weiche Röntgenstrahlung KW - Kohärente Kontrolle KW - Erzeugung hoher Harmonischer KW - Femtosekunden-Laserpulsformung KW - Atom und Molekülphysik KW - Optik KW - Ultraschnelle Röntgenstrahlung KW - Coherent Control KW - High-Harmonic Generation KW - Femtosecond Laser Pulse Shaping KW - Atomic KW - Molecular and Optical Physics KW - Ultrafast X-Ray Science Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9854 ER - TY - THES A1 - Dem, Claudiu Dorin T1 - Design and construction of a device for light scattering studies on airborne particles T1 - Entwurf und Aufbau von ainem Aerosolanalysegerät N2 - This thesis is concerned with the development of an on-line in-situ device for a chemical characterisation of flowing aerosols. The thesis describes the principles and most important features of such a system, allowing also on-line measurements using Raman spectroscopy as a diagnostic technique An analysis of the effect of forced oscillations on the motion of the particle dispersed in a gas flow is given in Chapter 2. Also the most important particle parameters are introduced. A review of the particle/fluid interaction in laminar air flows and the response of the particle is presented. In Chapter 3 the behaviour of the particle under different external conditions (ion bombardment and electric fields) is extended. A brief review of the most important particle charging theories (diffusion, field, and alternating potential charging) shows, that the effect of the electrical properties (represented by the dielectric constant) of the particles affects the charging process. A non-contact method for particle charge measurement was also presented. In the second part of the chapter, the interaction between the electric field and the charged particle for the purpose of particle trapping is illustrated. The most common systems like the two or four ring electrodynamic balance and the quadrupole trap are pointed out. In Chapter 4 a short review of the possibility of using scattered light to study aerosol particles is presented. First, the conditions and the facilities of using the Mie theory for particle size and refractive index determination are mentioned, then some features concerning the classical treatment of the Raman effect are presented Supported by the theoretical considerations exposed in Chapter 2, 3, and 4 the construction and the tests of different devices are presented in Chapter 5. Following the goal of the thesis, first an overview of the used materials and methods for particle generation is presented. Then, the constructed charging devices are described (from the mechanical and electrical point of view) and compared by measuring the acquired charge on the particle. Charged particles can be trapped in different containers. Two types of axially symmetric electrodynamic balances (two ring or an extended four ring configuration) were presented. For a deeper understanding these systems were studied using analytic and numerical methods. Considering the presented purpose of the work another type of trapping system has been developed, namely the quadrupole trap. A similar theoretical characterisation (in term’s of Mathieu equation) as for the electrodynamic balance was presented pointing out some specific features of this system. The incoming particle stream will be focused to the centre of the system simultaneously also the applied DC and AC potential onto the tube electrodes, yields a stable trapping of one or more particles. Chapter 6 consists of two parts: the system for single particle and for many particles investigation. The individual devices presented in Chapter 5 are now put together. The first part presents the method and the experimental realisation of a set-up for solid particle injection. In order to suppress the phase injection disadvantage found for the electrodynamic balance a developed program processes the information obtained from a particle cloud through an adequate electronic detection system, and reduces the number of particles until just one single particle is trapped. The method for one particle investigation can be extended for many particles. Using the presented set-up the particles are moved from one quadrupole to another and transformed from a particle cloud to a particle stream. A linearity between an external vertical mounted detector and the formed image of the particle stream on the CCD camera has been observed and used for simultaneous detection of many particles by Raman spectroscopy. For both methods Raman results are presented. One limitation of Raman Spectroscopy is the relatively long integration time needed for adequate signal-to-noise ratio. There are two factors which influence the integration time: first the incident radiation and the detector sensitivity, and second the intensity of the Raman bands. Using a CCD detector, the desired detector sensitivity should be achieved. So, the improvement of the signal-to-noise ratio should be the next goal in the system development. In order to reduce the integration time an optical system including optic fibres and the integration of an FT-Raman module operating in the visible region is planed. The goal of this work was to develop and construct an instrument for on-line in-situ single particle investigation by Raman spectroscopy. With the presented experimental set-up and the developed program the purpose of the work, the on-line in-situ near atmospheric pressure aerosol investigation was achieved. The Raman spectroscopy has been used successfully for a chemical characterisation of the aerosol particles. N2 - Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Aufbau eines on-line in-situ Analysegerätes zur chemische Charakterisierung von Aerosolen in Luftströmungen. Die Arbeit beschreibt neben den Grundlagen die wichtigsten Eigenschaften eines solchen Systems für on-line Messungen, das die Raman-Spektroskopie als eine Diagnosetechnik einsetzt. Kapitel 2 beinhaltet eine Analyse der Effekte von erzwungenen Oszillationen auf die Bewegung dispergierter Teilchen im Gasfluss. Dort werden auch die wichtigsten Eigenschaften von Partikeln vorgestellt. Es wird ein Überblick über die Teilchen-Gas Wechselwirkungen in laminarer Strömung gegeben, und die Reaktion des Teilchens in Abhängigkeit von Veränderungen (Kräften) wird diskutiert. In Kapitel 3 wird das Verhalten von Teilchen unter verschiedenen externen Bedingungen (Ionenbeschuss oder elektrisches Feld) weiter erörtert. Ein kurzer Überblick über die wichtigsten Theorien zur Teilchenladung (Diffusions-, Feld-, und alternierende Potentialaufladung) zeigt, dass die elektrischen Eigenschaften (dargestellt durch die dielektrische Konstante) des Teilchens den Ladungsprozess beeinflussen. Darüber hinaus wird eine kontaktlose Messmethode für die Ladung der Teilchen diskutiert. Im zweiten Teil des Kapitels wird die Wechselwirkung zwischen dem elektrischen Feld und dem geladenen Teilchen erläutert, zu dem Zweck, dass man die Teilchen ’’einfängt’’. Die gängigen Systeme wie z.B. die elektrodynamische Waage mit zwei oder vier Ringen und die Quadrupolfalle werden ebenfalls diskutiert. In Kapitel 4 werden die Möglichkeiten zur Untersuchung von Teilchen durch um Analyse des gestreuten Lichts vorgestellt. Zunächst werden die Bedingungen und Möglichkeiten für die Eignung der Mie-Theorie zum Studium von Partikelgröße und Brechungskoeffizient diskutiert; des weiteren wird auf die Eigenschaften des klassischen Raman-Effektes eingegangen. In Kapitel 5 wird die Konstruktion und anschließende Erprobung von Geräten beschrieben. Der Aufbau dieser Geräte erfolgte mit Hilfe der theoretischen Erwägungen aus den Kapiteln 2, 3 und 4. Es wird ein Überblick über die verwendeten Materialien und Methoden für die Teilchenerzeugung gegeben. Dann werden die entwickelten Ladegeräte beschrieben (vom mechanischen und elektronischen Standpunkt aus gesehen), und sie werden untereinander verglichen, indem die erzielte Ladung auf den Teilchen gemessen wird. Geladene Teichen können in verschiedenen Anordnungen gefangen werden. Zwei Arten von achsensymmetrischen elektrodynamischen Waagen (Zwei-Ring- oder eine erweiterte Vier-Ring-Konfiguration) werden vorgestellt. Für ein besseres Verständnis wurden diese Systeme durch analytische und numerische Methoden untersucht. In Anbetracht der Ziele dieser Arbeit wurde eine andere Art von Fangsystem entwickelt, die sogenannte Quadrupolfalle. Eine ähnliche theoretische Charakterisierung wie im Falle der elektrodynamischen Waage wurde vorgenommen und verschiedene spezifische Eigenschaften des Systems dargelegt. Der ankommende Teilchenfluss wird in die Mitte des Systems fokussiert, und unter Berücksichtigung des DC-Potentials auf den Rohrelektroden erhält man ein stabiles „Trapping“ eines oder mehrerer Teilchen. Kapitel 6 beschreibt die Experimentalaufbauten für die Untersuchung von einem oder von mehreren Teilchen. Die einzelnen Geräte, die in Kapitel 5 vorgeführt wurden, werden jetzt zusammengesetzt. Der erste Teil des Kapitels stellt die Methode und den experimentellen Aufbau für die Injektion von Feststoffteilchen vor. Um dem Nachteil der Phaseninjektion im Falle der elektrodynamischen Waage entgegenzukommen, wurde ein Programm entwickelt, das die Informationen (aufgenommen durch ein elektronisches Detektionssystem) von einer Teilchenwolke verarbeitet und das die Zahl der Teilchen reduziert, bis nur ein einziges übrig bleibt. Die Methode für die Ein-Teilchen-Untersuchung kann auch für mehrere Teilchen erweitert werden. Unter Verwendung des beschriebenen Systems werden die Teilchen aus einem Quadrupol in einen anderen bewegt und von einer Teilchenwolke in einen Teilchenstrom umgewandelt. Es wurde eine Linearität zwischen einem extern montierten Detektor und der Abbildung des Teilchenflusses durch ein Spektrometer auf einer CCD-Kamera festgestellt, welche für die gleichzeitige Detektion von mehreren Teilchen mittels Raman-Spektroskopie genutzt wurde. Für beide Methoden werden Raman-Ergebnisse gezeigt. Eine Einschränkung bei der Anwendung der Raman-Spektroskopie besteht in den relativ langen Integrationszeiten, die für ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis gebraucht werden. Es gibt zwei Faktoren, die die Integrationszeit beeinflussen: (1) die einfallende Strahlung und die Detektorempfindlichkeit und (2) die Frequenz und die Intensität der Raman Banden. Durch Verwendung eines CCD-Detektors kann die gewünschte Detektorsensitivität erreicht werden. Der nächste Schritt in der Systementwicklung ist die Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses. Um die Integrationszeit zu verkürzen, ist für zukünftige Arbeiten ein optisches System geplant, das optische Fasern und den Einbau eines FT-Raman-Moduls im sichtbaren Bereich einschließt. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und der Aufbau eines Geräts zur on-line in-situ Untersuchung eines einzelnen Teilchens mit Hilfe der Raman-Spektroskopie. Durch den vorgestellten experimentellen Aufbau und das entwickelte Steuerungsprogramm konnte das Ziel der Arbeit, die in-situ Untersuchung von Aerosolen bei normalem Luftdruck, erreicht werden. Die Raman-Spektroskopie wurde erfolgreich zur chemischen Charakterisierung von Aerosolen eingesetzt. KW - Aerosol KW - Chemische Analyse KW - Raman-Spektroskopie KW - Schwebeteilchen KW - Elektrodynamische Falle KW - Raman Spektroskopie KW - Airborne particles KW - Electrodynamic trap KW - Raman spectroscopy Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9605 ER - TY - THES A1 - Baumeister, Joachim T1 - Agile development of diagnostic knowledge systems T1 - Agile Entwicklung von Wissensbasierten Diagnosesystemen N2 - The success of diagnostic knowledge systems has been proved over the last decades. Nowadays, intelligent systems are embedded in machines within various domains or are used in interaction with a user for solving problems. However, although such systems have been applied very successfully the development of a knowledge system is still a critical issue. Similarly to projects dealing with customized software at a highly innovative level a precise specification often cannot be given in advance. Moreover, necessary requirements of the knowledge system can be defined not until the project has been started or are changing during the development phase. Many success factors depend on the feedback given by users, which can be provided if preliminary demonstrations of the system can be delivered as soon as possible, e.g., for interactive systems validation the duration of the system dialog. This thesis motivates that classical, document-centered approaches cannot be applied in such a setting. We cope with this problem by introducing an agile process model for developing diagnostic knowledge systems, mainly inspired by the ideas of the eXtreme Programming methodology known in software engineering. The main aim of the presented work is to simplify the engineering process for domain specialists formalizing the knowledge themselves. The engineering process is supported at a primary level by the introduction of knowledge containers, that define an organized view of knowledge contained in the system. Consequently, we provide structured procedures as a recommendation for filling these containers. The actual knowledge is acquired and formalized right from start, and the integration to runnable knowledge systems is done continuously in order to allow for an early and concrete feedback. In contrast to related prototyping approaches the validity and maintainability of the collected knowledge is ensured by appropriate test methods and restructuring techniques, respectively. Additionally, we propose learning methods to support the knowledge acquisition process sufficiently. The practical significance of the process model strongly depends on the available tools supporting the application of the process model. We present the system family d3web and especially the system d3web.KnowME as a highly integrated development environment for diagnostic knowledge systems. The process model and its activities, respectively, are evaluated in two real life applications: in a medical and in an environmental project the benefits of the agile development are clearly demonstrated. N2 - Wissensbasierte Diagnosesysteme konnten in den letzten Jahrzehnten sehr erfolgreich eingesetzt werden. Intelligente Systeme sind heute in den verschiedensten Domainen zu finden, werden in komplexe Maschinen eingebettet oder interaktiv im Dialog mit dem Benutzer verwendet. Trotz aller Erfolge ist die Entwicklung eines Wissenssystems immer noch eine komplexe Aufgabe. Dies ist darin begründet, dass ähnlich zu der Erstellung von Individual-Software mit einem hohen innovativen Grad eine präzise Spezifikation zu Anfand des Projekt häufig nicht gegeben werden kann. Vielmehr können notwendige Faktoren, welche den Erfolg des Systems maßgeblich bestimmen, nicht vor der Entwicklung identifiziert werden oder sind Änderungen während der Entwicklungsphase unterworfen. Viele Einflussfaktoren können hierbei nur in Rückkopplung mit dem Benutzer abgewogen werden, welches durch vorläufige Versionen des Systems in frühen Stadien ermöglicht werden kann, z.B. bei interaktiven Systemen durch eine Validierung des Dialoges durch den Benutzer. Diese Arbeit stellt heraus, dass klassische, dokument-zentrierte Ansätze in einem solchen Umfeld nicht anwendbar sind, und schlägt ein agiles Vorgehensmodell zur Entwicklung von wissensbasierten Diagnosesystemen als Lösung vor. Das agile Vorgehensmodell wurde wesentlich durch Ideen des im Software Engineering bekannten eXtreme Programming beeinflusst. Als wichtigstes Ziel dieser Arbeit wird die Vereinfachung des Entwicklungsprozesses für den Fachexperten verfolgt, der im Idealfall das benötigte Wissen selbst formalisiert. Dabei wird der Entwicklungsprozess auf einer übergeordneten Ebene durch die Einführung von Wissenscontainern unterstützt, welche eine organisierte Übersicht auf das im System enthaltene Wissen bieten. Weiterhin werden strukturierte Vorgehensweisen für das Füllen der jeweiligen Container empfohlen. Das tatsächliche Wissen wird von Beginn des Projekts an erfasst und formalisiert; eine kontinuierliche Integration von neuen Wissensinhalten in ein lauffähiges System sorgt für eine frühe und konkrete Rückkopplung mit dem Benutzer. Im Gegensatz zu den verwandten Prototyping Ansätzen wird die Validität und Wartbarkeit des erfassten Wissens durch geeignete Test- und Restrukturierungsmethoden sichergestellt. Zusätzlich werden angepasste Lernmethoden diskutiert, welche den Wissensakquisitionsprozess in vielen Bereichen ergänzen können. Die praktische Bedeutung des Vorgehensmodells ist stark mit der Verfügbarkeit von Werkzeugen verknüpft, welche den Fachexperten bei der Entwicklung direkt unterstützen können. Es wird daher die Systemfamilie d3web und im Speziellen die integrierte Entwicklungsumgebung d3web.KnowME vorgestellt. Das Vorgehensmodell und seine Aktivitäten werden in zwei Praxis-Anwendungen, einem medizinischen und einem geo-ökologischen Projekt, evaluiert. KW - Wissensakquisition KW - Wissensentwicklung KW - Wartung KW - Validation KW - Refaktorisierung KW - knowledge engineering KW - knowledge acquisition KW - maintenance KW - validation KW - refactoring Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9698 ER - TY - THES A1 - Rüter, Katja T1 - The efficiency of routine standards in social comparison T1 - Die Effizienz von Routinestandards bei sozialen Vergleichen N2 - One primary source for self-knowledge is social comparison. Often objective criteria for self-evaluations are not available or useful and therefore comparisons with other people play a crucial role in self-evaluations. But the question is whether social comparisons could indeed provide information about the self without consuming too much cognitive resources or time. Therefore, in this research I wanted to look at practice effects in social comparison and the particular significance of routine standards. Whereas traditional research on standard selection mostly focused on goal-oriented and strategic standard selection processes, this research sets out to integrate social cognitive knowledge, ideas, and methods. Researchers from many different fields agree that people’s behavior and thinking is not fully determined by rational choices or normative considerations. Quite the contrary, factors like knowledge accessibility, habits, procedural practice, stereotyping, categorization, and many more cognitive processes play an important role. The same may be true in social comparison and standard selection. In my research I demonstrate that efficiency concerns play an important role in social comparison. Since people may not be able to engage in a strategic standard selection whenever they engage in social comparison processes, there has to be a more efficient alternative. Using routine standards would be such an alternative. The efficiency advantage of routine standards may thereby be founded not only in the abandonment of a strategic but arduous standard selection process, but also in a higher efficiency of the comparison process itself. I therefore set out to show how the use of routine standards facilitates the social comparison processes. This was done in three steps. First, I replicated and improved our former research (Mussweiler & Rüter, 2003, JPSP) indicating that people really do use their best friends as routine standards to evaluate themselves. Second, I demonstrated that it is more efficient to compare with a routine standard than with another standard. In Studies 2 and 3 I therefore show that comparisons between the self and a routine standard (either a natural routine standard like the best friend or a experimentally induced routine standard based on practice) are faster and more efficient than comparisons with other standards. Finally, I looked at the underlying mechanism of the efficiency advantage of routine standards. The results of Studies 4 and 5 point out, that both general as well as specific practice effects occur with repeated comparisons. Whereas a specific practice effect implies the repeated processing of the same content (i.e., knowledge about the routine standard), general practice effects indicate that the pure process (i.e., comparing the self with a routine standard) becomes more efficient regardless whether new content (i.e., comparison relevant knowledge) has to be processed. Taken together, the efficiency advantage of routine standards during self-evaluation is based not only on the lack of necessity for an arduous standard selection, but is additionally supported by the facilitation of the comparison process itself. The efficiency of routine standards may provide an explanation as to why people base self-evaluations on comparisons with these standards and dispense with strategic considerations to select the most suitable standard. N2 - Menschen haben ein grundlegendes Bedürfnis, sich selbst zu kennen. Dabei führt der Weg zur Selbsterkenntnis häufig über soziale Vergleichsprozesse. Da Eigenschaften und Fähigkeiten in der Regel nicht an absoluten Maßen gemessen werden können, ist der Vergleich mit anderen Menschen ausschlaggebend. Letztendlich bedeutet freundlich, weise oder auch aggressiv zu sein in erster Linie, dass man freundlicher, weiser, oder aggressiver ist als andere. Das stete Streben des Menschen zur Selbsterkenntnis verbunden mit der Notwendigkeit von sozialen Vergleichsprozessen, um ein solches Wissen zur erlangen, birgt gewisse Anforderungen in sich. Nur wenn Vergleichsprozesse in genügenden Maße sparsam, schnell und effizient durchgeführt werden können, bieten sie Menschen eine reelle Möglichkeit sich selbst einzuschätzen. Nicht immer wird die Zeit und die Ruhe gegeben sein, in aller Gründlichkeit die eigene Person zu erforschen. Ganz im Gegenteil, häufig müssen solche Einschätzungen spontan und ohne viel zu überlegen getroffen werden. Es ist daher von großer Bedeutung darzulegen, in wie fern soziale Vergleichsprozesse diesen Anforderungen genügen. Die vorliegende Dissertation beschäftige sich mit eben dieser Frage. Dabei stelle ich zuerst dar, welche spezifischen Prozesse bisher bei sozialen Vergleichen angenommen wurden und beurteile diese nach ihrer Effizienz. In einem zweiten Schritt beziehe ich mich auf Forschung in anderen Bereichen der Sozialpsychologie und weise anhand dessen auf spezifische Mechanismen hin, welche die Effizienz von sozialen Vergleichsprozessen zur Selbsteinschätzung steigern können. Sodann fasse ich kurz bereits veröffentlichte Arbeiten von Thomas Mussweiler und mir (Mussweiler & Rüter, 2003, JPSP) zusammen, die einen ersten Anfang zur experimentellen Überprüfung der angenommenen, effizienten Vergleichsprozesse darstellen. Darauf aufbauend folgt der empirische Teil der Dissertation, in der die Effizienz spezifischer sozialer Vergleiche bei Selbsteinschätzungen nachgewiesen und die der Effizienz zu Grunde liegende Prozesse identifiziert werden. Insgesamt belegen die fünf dargestellten Experimente eindrucksvoll die Effizienzvorteile von Routinestandards bei sozialen Vergleichsprozessen. Mit der Studie 1 wurden frühere Studien (Mussweiler & Rüter, 2003, JPSP) bestätigt, welche besagen, dass bei Selbsteinschätzungen Vergleiche mit Routinestandards durchgeführt werden. Die Routine, immer wieder den selben Standard heranzuziehen, macht eine aufwendige Standardselektion überflüssig und stellt somit einen entscheidenden Schritt in Richtung Effizienz bei sozialen Vergleichsprozessen dar. Darüber hinaus konnte in den restlichen vier Studien gezeigt werden, dass auch der Vergleichsprozess an sich mit Routinestandards schneller und somit effizienter durchgeführt werden kann als mit anderen Standards. Sowohl für Vergleiche mit real exsistierenden Routinestandards (wie z.B. dem besten Freund), als auch mit durch Übung experimentell induzierten Routinestandards benötigten die Versuchspersonen weniger Zeit als für Vergleiche mit Kontrollstandards (Studie 2 & 3). Die Studien 4 & 5 belegen sodann, dass dem Effizienzvorteil von Routinestandards sowohl generelle Übungseffekte mit festem Standard als auch spezifische Übungseffekte bezogen auf das Standard-Wissen zu Grunde liegen. Während spezifische Übungseffekte darauf beruhen, dass die selben Inhalte (hier das Wissen über den Routinestandard) wiederholt verarbeitet werden können, weisen generelle Übungseffekte darauf hin, dass der Prozess an sich (hier der Vergleich zwischen dem Selbst und dem Routinestandard) mit zunehmender Übung schneller durchgeführt werden kann, auch wenn dabei jeweils neue Inhalte (hier vergleichsrelevantes Wissen) verarbeitet werden müssen. Der Vergleich mit Routinestandards ermöglicht es somit, Selbsteinschätzungen durchzuführen, auch wenn dies schnell und ohne großen kognitiven Aufwand geschehen muss. Da die kognitive Kapazität eine knappe Ressource des Menschen ist und damit sparsam umgegangen werden muss, stellen die effizienten Vergleiche mit Routinestandards eine attraktive Alternative zu Vergleichen mit strategisch sinnvollen aber kognitiv aufwendig ausgewählten Standards dar. KW - Soziale Vergleiche KW - Standardselektion KW - Routinestandards KW - Übungseffekte KW - Effizienz KW - Social Comparison KW - Standard Selection KW - Routine Standards KW - Practice Effects KW - Efficiency Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9448 ER - TY - THES A1 - Tyrsin, Oleg T1 - Role of Raf family members in mouse development T1 - Rolle der Raf-Kinase Familie in der Mausentwicklung N2 - Raf Proteine sind Serin/Threonin Kinasen, die als zentrale Elemente des Ras, Raf, Mek, Map Kinase Wegs, an der Weiterleitung von extrazellulären Signalen von der Zellmembran zu nukleären Effektoren beteiligt sind. Auf diese Weise kontrollieren sie elementare Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und das Überleben von Zellen. In Säugetieren wurden drei funktionelle Gene (A-, B- and C-raf) beschrieben. Aus biochemischen Untersuchungen ergibt sich, dass die Isozyme überlappende aber auch differentielle Funktionen übernehmen. Allerdings wurde ein differenziertes Verständnis der jeweiligen spezifischen Rolle dadurch erschwert, dass in den meisten Zelltypen verschiedene Raf-Isozyme expremiert werden und dass wegen der Vielzahl der Aktivatoren und Effektoren eine eindeutige Isoform-Zuordnung schwer möglich war. Aufgrund der Beteiligung an verschiedenen Krankheitsbildern, insbesondere der Tumorentstehung und –progression, ist jedoch die Aufklärung der Isozym-spezifischen Funktionen von vorranginger wissenschaftlicher Bedeutung. B-Raf hat unter den Raf Kinasen die höchste Kinaseaktivität und zeigt antiapoptotische Eigenschaften. B-Raf knockout Mäuse zeigen eine allgemeine Wachstumsverzögerung und sterben zwischen E10,5 und E12,5 aufgrund fehlentwickelter Gefässe in Folge massiver Apoptose differenzierter Endothelzellen. [1]. Um die Lethalität des B-Raf-/- (KO) Phänotyps zu überkommen und um die Redundanz der B-Raf Proteine weiter zu untersuchen, wurden Mäuse generiert, die unter der Kontrolle des B-Raf Promoters statt B-Raf eine A-Raf cDNA exprimieren. Nur in einem Fall entwickelte sich eine ausgewachsene p20 Maus ohne sichtbare Entwicklungsdefekte oder Verhaltensauffälligkeiten. Darüber hinaus wurden lebende Embryonen mit normaler Entwicklung aber reduzierter Grösse mit niedriger Inzidenz zwischen E12,5d und E16,5d beobachtet. In allen diesen Fällen fanden wir ein intaktes Gefäßsystem. Andererseits waren Neurogenese und die Bewegung der neuralen Vorläuferzellen in den überlebenden Embryonen gestört, was in einigen Fällen zu unterentwickelten Hirnregionen führte. Mittels TUNEL bzw. PCNA Assay konnten wir zeigen, dass mehr apoptotische und weniger proliferierende Zellen in ventrikulärer und subventrikulärer Zone der Hirn Ventrikel und im Striatum der KIN Embryonen zu finden sind. Außerdem wurden in einer Reihe von Geweben von E13,5d und in den Lungen von E16,5d Embryonen, vermehrt apoptotische Zellen beobachtet. Dies war in der einen ausgewachsenen KIN Maus nicht der Fall. Diese zeigte einen reduzierten Anteil an neuronalen Vorläuferzellen in der subgranulären Zone des Hippocampus und an reifen Neuronen im Riechkolben. Ansonsten waren aber keine Störungen der Neurogenese in der ausgewachsenen KIN Maus detektierbar. Fibroblasten die aus KIN Embryonen etabliert wurden, zeigten im Vergleich zu Wildtypzellen reduzierte Fähigkeit zur Proliferation und erhöhte Sensibilität gegenüber Apoptoseauslösern. Die erhöhte Apoptosetendenz spiegelte sich auf molekularer Ebene in einer Reduktion an antiapoptotischen Molekülen wieder. Aktive ERK und Akt Kinase sind erniedrigt. Außerdem war von dem bekannten Raf Substrat BAD, weniger an der inaktiven phosphorylierten Form zu beobachten, wodurch bei gleicher Menge Gesamtprotein auf ein Mehr an proapoptotischem unphosphoryliertem BAD geschlossen werden kann. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die Substitution von B-Raf durch die weniger aktive A-Raf Kinase zwar die endotheliale Apoptose verhindern kann, die die Ursache für das frühe Absterben der B-Raf-/- (KO) Mäuse ist, dass aber die normale Entwicklung dennoch entscheidend gestört ist. N2 - Cellular proliferation, differentiation and survival in response to extracellular signals are controlled by the signal transduction pathway of Ras, Raf and MAP kinase. The Raf proteins are serine/threonine kinases with essential function in growth/differentiation/survival - related signal transduction events. In mammals, three functional (A-, B-, and C-Raf) genes were described. Biochemical studies suggest overlapping and differential utilization of Raf isozymes. However, the frequent co-expression of Raf isozymes and their multiple activators and effectors impedes the full understanding of their specific roles. The elucidation of these roles is important due to the involvement of the Ras/Raf/MEK/MAP kinase cascade in human disorders especially in tumor development and progression. B-Raf was shown to posses the strongest kinase activity among Raf kinases and display antiapoptotic properties. Mice deficient in B-Raf show overall growth retardation and die between E10.5 and E12.5 of vascular defects caused by excessive death of differentiated endothelial cells. To elucidate the redundancy of Raf isozymes during embryonic development and to rescue B-Raf-/- (KO) phenotype, B-Raf alleles were disrupted by introducing A-Raf cDNA under the control of endogenous B-Raf promoter. The resulting BRaf A-Raf/A-Raf (KIN) phenotype depends on genetic background. The living embryos displaying normal development but size reduction were found with low incidence at E12.5d-16.5d. All of them displayed the rescue of vascular system. One adult p20 mouse without any visible defects in development and behavior was obtained. On the other hand, the processes of neurogenesis and neural precursors migration in survived embryos were disturbed which led in some cases to underdevelopment of different brain compartments. TUNEL and cell proliferation (PCNA staining) assays revealed more apoptotic (E13.5d) and less proliferating(E12.5d cells within ventricular and sub-ventricular zones of brain ventricles and in striatum of KIN embryos. In addition, more apoptotic cells were detected in many other tissues of E13.5d and in lung of E16.5d KIN embryos but not in adult KIN mouse. p20 KIN mouse demonstrated reduced fraction of neural precursor cells in sub-granular zone of hippocampus and mature neurons in olfactory bulb. The other processes of neurogenesis were not disturbed in adult KIN animal. Fibroblasts obtained from KIN embryos demonstrated less proliferative ability and were more susceptible to apoptotic stimuli compared to WT. This was accompanied by the reduction of active ERK and Akt required for survival, and with decrease of inactive phosphorylated BAD. The kinetic of both ERK and Akt phosphorylation upon serum stimulation was delayed. All these data indicate that moderate A-Raf kinase activity can prevent the endothelial apoptosis but is not enough to completely rescue the other developmental consequences. KW - Maus KW - Embryonalentwicklung KW - Raf Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9453 ER - TY - THES A1 - Kahlenberg, Frank T1 - Structure-property correlations in fluoroaryl functionalized inorganic-organic hybrid polymers for telecom applications T1 - Struktur-Eigenschafts-Beziehungen in Fluoraryl-funktionalisierten anorganisch-organischen Hybridpolymeren für Telecomanwendungen N2 - The development and in-depth characterization of new fluoroaryl functionalized ORMOCER® materials (inorganic-organic hybrid polymers) for optical waveguide applications in telecommunication is presented. The preparation of the materials included precursor silane synthesis, hydrolysis/polycondensation of organoalkoxysilane mixtures, and photolithographic processing of the resulting oligosiloxane resins in order to establish the inorganic-organic hybrid network. During all stages of ORMOCER® preparation, structure-property relations were deduced from characterization data, particularly with respect to low optical loss in the important near-infrared spectral region as well as refractive index. With the aid of molecular modeling, structural characteristics of oligomeric intermediates were visualized, which was found valuable in the fundamental understanding of the material class. The material development started with the syntheses of a variety of commercially unavailable fluorinated and unfluorinated arylalkoxysilanes by means of Grignard and hydrosilylation pathways, respectively. A survey of silane optical properties, particularly their absorptions at the telecom wavelengths 1310 nm and 1550 nm, gave an impulse to the choice of suitable precursors for the preparation of low-loss ORMOCER® resins. Accordingly, precursor silane mixtures and hydrolysis/polycondensation reaction conditions were chosen and optimized with regard to low contents of C-H and Si-OH functions. Thus, absorptions as low as 0.04 dB/cm at 1310 nm and 0.18 dB/cm at 1550 nm, respectively, could be obtained from an oligosiloxane resin based on pentafluorophenyltrimethoxysilane (1) mixed with pentafluorophenyl(vinyl)-dimethoxysilane (5). In order to improve the organic crosslinkability under photolithographic processing conditions, further resins on the basis of the aforementioned were prepared, which additionally incorporated the styrene-analogous precursor 4-vinyltetrafluorophenyl-trimethoxysilane (4). Thus, ORMOCER® resins with low optical losses of 0.28 dB/cm at 1310 nm and 0.42 dB/cm at 1550 nm, respectively, were prepared, which exhibited excellent photopatternability. The manufacture of micropatterns such as optical waveguide structures by UV-photolithography under clean room conditions was the final stage of material synthesis. The optimization of processing parameters allowed the preparation of test patterns for the determination of optical, dielectrical and mechanical properties. A low optical loss of 0.51 dB/cm at 1550 nm could be measured on a waveguide manufactured from a photopatternable fluoroaryl functionalized ORMOCER®. The structural characterization of liquid resins as well as cured ORMOCER® samples was accomplished chiefly with solution and solid state 29Si-NMR spectroscopy, respectively. Particularly for polycondensates incorporating species based on more than one precursor silane, the spectra showed a high degree of complexity. An additional challenge arouse from the partial loss of fluoroaryl groups during ORMOCER® condensation and curing, which resulted in even more condensation products. Thus, in order to provide a basis for resin analysis, first the hydrolysis/condensation reactions of the isolated precursors were investigated under reaction time-resolution with NMR spectroscopy at low temperature. Backed by signal assignments in these single-precursor systems, the respective species could also be identified in the complex resin spectra, allowing for their quantitative interpretation. The structural characterization was rounded out by IR spectroscopy and SAXS analyses. With the help of molecular modeling, the experimental data were finally transferred into a three-dimensional image of an organosiloxane oligomer, which is representative for a photopatternable fluoroaryl functionalized ORMOCER® resin. The combination of low-temperature NMR, which made the characterization of polycondensates possible, with oligomer modeling paved the way to a further understanding of ORMOCER® resin systems. On the basis of this visualization of structural characteristics, e.g. properties such as organic crosslinkability of oligomers were discussed in the light of steric features within the molecular structure. Thus, new possibilities were established for the systematic optimization of ORMOCER® formulations. Structure-property relations with respect to optical loss and refraction, as determined within this work, follow trends, which are in accordance with the literature. Particularly the direct comparison of data derived from analogous fluorinated and unfluorinated ORMOCER® resins showed that fluorination results in significant decrease in NIR optical loss. Additionally, different unfluorinated aryl functionalized systems with varying aliphatic C-H content were compared. In case of a lower aliphatic content, a widening effect on the 1310 nm window was found. This is due to a shift of arylic C-H vibrations (1145 nm) towards lower wavelengths compared to aliphatic C-H (1188 nm). Finally, on the basis of NIR spectra of analogous fluorinated resins with low and high silanol content, respectively, a significant impact of (Si)O-H groups on the 1550 nm window was demonstrated, while the 1310 nm window was unaffected. This is due to O-H vibrations with a maximum at 1387 nm and further bands at higher wavelength. The index of refraction was drastically lowered due to fluorination. Thus, the analogous fluorinated and unfluorinated ORMOCER® resins had indices of 1.497 and 1.570, respectively, in the VIS region. For the fluorinated systems, refraction did not change significantly during organic cross-connection and hardbake. In conclusion, the new fluoroaryl functionalized ORMOCER® systems represent low-loss materials for telecom applications. In addition, in-depth characterization during material development allowed the proposal of structure-property relations, particularly with respect to optical properties, which are of considerable importance for future developments. N2 - Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Entwicklung und detaillierten Charakterisierung von fluorarylmodifizierten ORMOCER®en (anorganisch-organischen Hybridpolymeren) für optische Wellenleiteranwendungen in der Tele- und Datenkommunikation. Die Materialsynthese erstreckte sich von der Darstellung von kommerziell nicht erhältlichen Arylalkoxysilanen, die als molekulare Vorstufen dienten, über deren Hydrolyse/Polykondensationsreaktion bis hin zur abschließenden photochemischen Prozessierung zum Aufbau des hybriden Polymernetzwerkes. Zu jedem dieser Entwicklungsstadien wurden Struktur-Eigenschaftsbeziehungen ermittelt. Hauptaugenmerk hierbei lag auf der optischen Dämpfung im relevanten Nah-Infrarotspektralbereich und der Brechzahl. Details in der Molekülstruktur von oligomeren Zwischenstufen schließlich wurden basierend auf spektroskopischen Daten mit Hilfe von Molecular Modeling visualisiert. Die Synthesen der fluorierten und unfluorierten Arylalkoxysilane stützten sich wesentlich auf Grignard- und Hydrosilylierungsrouten. Bereits die Ermittlung von optischen Eigenschaften der Vorläufersilane lieferte wichtige Impulse für den einzuschlagenden Weg bei der Entwicklung von verlustarmen ORMOCER®-Harzen. Zur Erreichung geringer Schwingungsabsorptionen bei 1310 nm und 1550 nm wurden somit sowohl die initialen Silangemische als auch die Bedingungen der Polykondensationsreaktionen hinsichtlich geringem Gehalt an C-H und Si-OH Gruppen optimiert. Auf diese Weise konnten geringe optische Verluste von 0.04 dB/cm bei 1310 nm und 0.18 dB/cm bei 1550 nm an einem ORMOCER®-Harz gemessen werden, das ausgehend von Pentafluorphenyltrimethoxysilan (1) und Pentafluorphenyl(vinyl)-dimethoxysilan (5) dargestellt wurde. In der Folge wurden weitere Harzsysteme entwickelt, um die organische Vernetzbarkeit der Materialien unter photolithographischen Prozessierungsbedingungen zu erhöhen. Hierzu wurde basierend auf der vorgenannten Silanzusammensetzung das Styrol-analoge 4-Vinyltetrafluorphenyltrimethoxysilan (4) zum Ausgangsgemisch hinzugefügt. Damit konnten ORMOCER®-Harze von ausgezeichneter Photostrukturierbarkeit dargestellt werden, die geringe optische Verluste von bis zu 0.28 dB/cm bei 1310 nm und 0.42 dB/cm bei 1550 nm aufwiesen. Die Materialsynthese wurde vervollständigt durch die photolithographische Darstellung von optischen Wellenleitern und anderen Mikrostrukturen unter Ausbildung des anorganisch-organischen Hybridnetzwerks. Unter Reinraumbedingungen konnten Prozessierungsparameter dahingehend optimiert werden, dass die Präparation von ORMOCER®-Teststrukturen für die optische, dielektrische und mechanische Charakterisierung ermöglicht wurde. An einem optischen Schichtwellenleiter aus einem photostrukturierbaren fluorarylfunktionalisierten ORMOCER® wurde bei 1550 nm eine optische Dämpfung von 0.51 dB/cm gemessen. Die Strukturaufklärung von flüssigen Harzen und ausgehärteten ORMOCER®-Proben erfolgte größtenteils mittels 29Si-NMR Spektroskopie. Die Polykondensatspektren setzten sich aus einer Vielzahl von Signalen zusammen, die einerseits die Ausgangssilangemische und andererseits deren unterschiedliche Kondensationsstufen widerspiegelten. Eine zusätzliche Herausforderung ergab sich aus der partiellen Abspaltung der Fluorarylfunktionalität während der Prozessierung, die zu weiteren Kondensationsprodukten führte. Aufgrund der damit gegebenen Komplexität der Spektren wurden zunächst die Ausgangssilane isoliert einer Hydrolyse/Kondensationsreaktion unterworfen und die Reaktionsgemische zeitaufgelöst mittels Tieftemperatur-Messreihen analysiert. Auf Grundlage der damit getroffenen Signalzuordnungen für die Reaktionsintermediate konnten in der Folge ebenfalls die komplexen Kondensatspektren quantitativ aufgeschlüsselt werden. Die Strukturaufklärung wurde mittels Infrarotspektroskopie und Röntgenkleinwinkelstreuung (im Fall der Harze) vervollständigt. Die Veranschaulichung der molekularen Struktur eines Siloxanoligomers in einem photopolymerisierbaren fluorarylfunktionalisierten ORMOCER®-Harz erfolgte mittels Molecular Modeling. Hierbei ist zu betonen, dass das resultierende Modell wesentlich auf experimentell ermittelten Strukturkenndaten basierte. Mit der Kombination Tieftemperatur-NMR / Harzcharakterisierung / Oligomermodeling wurde somit ein wichtiger Zugang zum weiteren Verständnis von ORMOCER®-Harzsystemen eröffnet. Als Beispiel konnten gestützt auf die Visualisierung von sterischen Charakteristika Eigenschaften wie die organische Vernetzbarkeit des Siloxanoligomers diskutiert werden. Hieraus eröffnen sich zukünftig neue Möglichkeiten zur gezielten Optimierung von ORMOCER®-Formulierungen. Aus Charakterisierungsdaten wurden Struktur-Eigenschaftsbeziehungen hinsichtlich optischer Dämpfung und Brechzahl abgeleitet, die literaturkonformen Trends folgten. Insbesondere im direkten Vergleich von analogen fluorierten und unfluorierten Materialien wurde der Effekt des Ersatzes von C-H durch C-F Bindungen deutlich. Optische Dämpfungswerte im NIR wurden durch Fluorierung signifikant verringert. Darüber hinaus konnte im Vergleich von unfluorierten Hybridpolymeren mit unterschiedlich hohem Anteil an aliphatischen und aromatischen C-H Bindungen gezeigt werden, wie durch einen geringeren Anteil an Aliphaten das Telekommunikationsfenster bei 1310 nm erweitert wird. Dies ist durch die unterschiedliche Lage von Obertonschwingungen für aliphatische (1188 nm) und aromatische C-H (1145 nm) begründet. Schließlich konnte anhand von analogen fluorierten Harzen mit unterschiedlichem Silanolgehalt eine signifikante Erhöhung der Dämpfung bei 1550 nm durch (Si)O-H Obertonschwingungen nachgewiesen werden, während die Absorption bei 1310 nm unbeeinflusst blieb. Hierfür war ein Absorptionsmaximum bei 1387 nm sowie eine Reihe schwächerer Banden bei höheren Wellenlängen verantwortlich. Die Brechzahl der Materialien wurde durch Fluorierung drastisch verringert. So wurden im VIS-Spektralbereich bei analogen fluorierten und unfluorierten Harzen Werte von 1.497 bzw. 1.570 ermittelt. Für den Fall der fluorierten Harzsysteme wurde keine signifikante Brechzahlveränderung im Zuge der organischen Quervernetzung festgestellt. Die neuentwickelten fluorarylfunktionalisierten ORMOCER®e eignen sich im Fazit als niedrig dämpfende Materialien für Telekomanwendungen. Zudem konnten mit Hilfe einer detaillierten Strukturaufklärung Struktur-Eigenschaftsbeziehungen herausgearbeitet werden, die wichtige Impulse für zukünftige Entwicklungen auf dem Gebiet liefern. KW - Ormocer KW - Chemische Synthese KW - ORMOCER KW - Hybridpolymer KW - Sol-Gel KW - Photolithographie KW - 29Si-NMR KW - ORMOCER KW - Hybrid Polymer KW - Sol-Gel KW - Photolithography KW - 29Si-NMR Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9378 ER - TY - THES A1 - Tarcea, Nicolae T1 - Light as a universal tool : Microcapsule sizing by elastic light scattering and mineral investigation by in situ Raman spectroscopy T1 - Licht als Universalwerkzeug : Größenbestimmung der Mikrokapseln mittels elastischer Lichtstreuung und Mineral-Untersuchungen mittels In Situ Ramanspektroskopie N2 - The present work consist of two major parts. The first part, extending over chapters 1, 2, 3 and 4, addresses the design and construction of a device capable of determining the shell thickness and the core size for monolayer spherical particles in a flow. The second part containing chapters 5, 6, 7, 8, 9 and 10, concentrate on the use of Raman spectroscopy as a space application, namely for use as a tool for in situ planetary investigations. This part directly addresses the MIRAS project, a study run under the auspices of Federal Ministry of Education and Research, BMBF and German Aerospace Center, DLR under national registration number 50OW0103. MIRAS stands for "Mineral Investigation by in situ Raman Spectroscopy". Microcapsule Sizing by Elastic Light Scattering The industrial development of processes based on microcapsules depends on the possibility to provide clear and complete information about the properties of these microcapsules. However, the tools for an easy and efficient determination of the microcapsule properties are lacking, several methods being often required to describe adequately the microcapsule behavior. Methods for evaluating the individual size and size distribution of both the core and the shell are required together with methods for measuring the mechanical strength, stability in appli-cation media, permeability of the shell, etc. Elastic light scattering measurements provide a possible way of determining properties such as core size, shell size and refractive index. The design and con-struction of a device capable of measuring the above mentioned parameters for a core-shell particle is the subject of the first part of this thesis. The basic principle of measurement for the device proposed here consists of an-alyzing one particle at a time by recording the elastic light scattering pattern at angles between approx. 60 and 120 grad. By comparing the experimentally recorded phase functions with the previously calculated phase functions stored in a database, the geometry of the scattering object can be identified. In our case the geometry is characterized by two parameters: the shell thickness and the core radius. In chapter 2 a short overview on the methods used for sizing microparticles is given. Different sizing methods are compared, and the advantages and disadvan-tages for the general problem of sizing are shortly discussed. It is observed that all sizing methods that are based on elastic light scattering theories are ensemble methods. Chapter 3 focusses on the theories used for calculating the theoretical scattering patterns with emphasize on the Mie theory. The generalization of Mie theory for layered particles is shortly presented and the far field intensity approximations are discussed. The last chapter (4) of this first part describes the experimental approach for building an automatic microcapsule sizer. The approach started by O. Sbanski [76] with the development of a software packet for calculating and storing theoret-ical phase functions for core-shell particles was continued with the designing and construction of a measuring device. The hardware construction and the software with all implemented corrections imposed by the individual setup components are described in detail. For the laser, the monochromaticity, the intensity profile of the beam as well as the planarity of the equi-phase fronts are taken into consid-eration. The flow cell with three different designs is described, and the influences of the employed design on the light scattering patterns are discussed together with the optical system used for recording the experimental phase functions. The detection system formed by two identical linear CCD arrays is presented together with the software approach used for data acquisition. Ways of improving the quality and the speed of the analyzing process are discussed. The final section presents measurements run on samples made of homogeneous spheres and also on samples containing industrial microcapsules. Mineral Investigation by in situ Raman Spectroscopy The envisaged future planetary missions require space-born instruments, which are highly miniaturized with respect to volume and mass and which have low needs of power. A micro Raman spectrometer as a stand alone device on a planetary surface (e.g. Mars) offers a wide spectrum of possibilities. It can assess the chemical analysis via determination of the mineral composition, detect organic molecules in the soil, identify the principal mineral phases, etc. The technical developments in the last years have introduced a new generation of small Raman systems suitable for robotic mineral characterization on planetary surfaces [20, 95]. Two different types of spectrometer were considered for the MIRAS study. As supporting laboratory experiments for the MIRAS study, the measure-ments on standard minerals and on SNC Mars meteorites are discussed in chapter 6. The following SNC meteorites have been investigated: Sayh al Uhaymir 060, Dar al Gani 735, Dar al Gani 476, Northwest Africa 856, Los Angeles, Northwest Africa 1068 and Zagami. Pyrite as a hitherto undescribed phase in the picritic (olivin-phyric) shergottite NWA 1068 as well as reduced carbon (e.g. graphite) and anatase in the shergottite Say al Uhaymir 060 are new findings for this class of meteorites. A detailed description of the proposed designs for MIRAS, with the compo-nents used for building the test version on a breadboard is covered in chapter 7. The scientific as well as the mission requirements imposed on the instrument are discussed. The basic design is presented and the main components that are brought together to build the device being the laser unit, the Raman head, the Rayleigh filtering box, and the spectral sensor (spectrometer with a matching de-tector) are described. The two proposed designs, one based on an acousto-optic tunable filter (AOTF) and the other based on a dispersive hadamard transform spectrometer are compared to each other. The actual breadboard setup with the detailed description of the components follows in Section 7.3. Further de-velopment of a Raman spectrometer for planetary investigations is proposed in combination with a microscope as part of the Extended-MIRAS project. The software developed for controlling the breadboard version of MIRAS is described in chapter 8 together with a short description of the structure of a relational database used for in house spectra management. The measuring pro-cedures and the data processing steps are presented. Spectra acquired with the MIRAS breadboard version based on the AOTF are shown in chapter 9. The final chapter addresses a rather different possibility of using Raman spectroscopy for planetary investigations. The chapter summarizes the content of four tech-nical notes that were established within the study contracted by the European Space Agency with firma Kayser-Threde in Munich concerning the possibility of applying Raman spectroscopy in the field of remote imaging. N2 - Die vorliegende Arbeit besteht aus zwei Hauptteilen. Der erste Teil, der die Kapitel 1, 2, 3 und 4 umfasst, beschäftigt sich mit dem Design und Aufbau eines Gerätes, welches in der Lage sein sollte, die Schalendichte und die Kerngröße von geschichteten Kugeln in einer Strömung festzustellen. Der zweite Teil, der aus den Kapiteln 5, 6, 7, 8, 9 und 10 besteht, befasst sich mit der Raman-Spektroskopie als Anwendung in der Raumfahrt, und zwar mit deren Einsatz bei in-situ-planetarischen Erforschungen. Dieser Teil bezieht sich direkt auf das MIRAS-Projekt, eine vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) und dem Deutschen Zentrum für Luft- und Raumfahrt (DLR) unter der nationalen Eintragsnummer 500W0103 geförderte Studie. MIRAS steht für "Mineral Investigations by in situ Raman Spectroscopy". Größenbestimmung der Mikrokapseln mittels elastischer Lichtstreuung Der industrielle Fortschritt der auf Mikrokapseln basierenden Prozesse hängt mit der Möglichkeit zusammen, eindeutige und komplette Informationen über die Eigenschaften dieser Mikrokapseln zu liefern. Es gibt allerdings kaum Instrumente zur schnellen und effizienten Feststellung der Eigenschaften von Mikrokapseln. Zahlreiche Methoden sind häufig notwendig, um das Verhalten von Mikrokapseln ausreichend zu beschreiben. Man braucht Methoden zur Auswertung der indi-viduellen Größe und der Größenverteilung von Kern und Schale sowie zur Messung der mechanischen Eigenschaften, Stabilität in Anwendungsmedien, Schalenper-meabilität usw. Die Messungen des elastischen Streulichts stellen eine mögliche Methode dar, Eigenschaften wie Kerngröße, Schalengröße und Brechungsindex festzulegen. Das Design und der Aufbau eines Gerätes, das die obengennanten Parame-ter für eine Mikrokapsel messen kann, bilden das Thema des ersten Teils dieser Arbeit. Das grundlegende Messprinzip für das hier vorgeschlagene Gerät besteht in der Analyse einzelner Kapseln, indem das Streuungsmuster des elastischen Lichts bei Winkeln zwischen ca. 60 und 120 grad aufgezeichnet wird. Werden die expe-rimentell aufgezeichneten Phasenfunktionen mit den vorher berechneten Streu-ungsmustern in der Datenbank verglichen, so kann die Geometrie des Streuung-sobjektes identifiziert werden. In unserem Fall wird die Geometrie durch zwei Parameter gekennzeichnet: die Schalendichte und den Kernradius. In Kapitel 2 wird ein kurzer Überblick über die Methoden zur Festlegung der Größe von Mikrokapseln gegeben. Es werden verschiedene Methoden miteinander verglichen und Vorteile bzw. Nachteile für das Allgemeinproblem der Größenbes-timmung werden kurz angesprochen. Es wird festgestellt, dass alle Methoden, denen die Theorien der elastischen Lichtstreuung zugrundeliegen, "Ensemble-Methoden" sind. Kapitel 3 beschreibt die Theorien, die oft auf die Berechnung der theoretischen Streuungsmuster angewandt werden, wobei hier die Mie-Theorie im Mittelpunkt steht. Die Erweiterung der Mie-Theorie auf geschichtete Kugeln wird hier kurz geschildert und die Vereinfachungen der Fernfeldstärke werden diskutiert. Das letzte Kapitel (4) dieses ersten Teils befasst sich mit dem experimentellen Projekt zum Aufbau eines automatischen Mikrokapselanalysators. Das von O. Sbanski [76] begonnene Projekt mit der Entwicklung eines Softwarepakets zur Berechnung und Speicherung von theoretischen Phasenfunktionen für Mikrokapseln wurde mit dem Entwurf bzw. dem Aufbau eines Messgerätes fortgesetzt. Die Hardware und die Software mit allen für die individuellen Elemente des Aufbaus benötigten Korrekturen werden ausführlich beschrieben. Für den Laser werden Monochromatizität, Strahlstärkeprofil sowie die Planarität von gleichphasigen Wellenfronten berücksichtigt. Die Strömungszelle mit drei verschiedenen Designs wird geschildert. Einflüsse des eingesetzten Entwurfs auf die Eigenschaften der Lichtstreung sowie das optische, zur Aufzeichnung experimenteller Phasenfunktionen verwendete System werden diskutiert. Das aus zwei identischen linearen CCD-Arrays bestehende Detektionssystem wird zusammen mit der zur Datenaufnahme verwendeten Software präsentiert. Es werden gleichfalls einige Methoden zur Verbesserung der Qualität bzw. Geschwindigkeit des Analyseprozesses angesprochen. Der letzte Teil beschreibt Messungen, welche an homogenen Kugeln sowie industriellen Mikrokapseln durchgeführt wurden. MIRAS - "Mineral Investigation by in situ Raman Spectroscopy" Die für die Zukunft vorausgesehenen planetarischen Missionen benötigen Instru-mente, die in Bezug auf Volumen und Gewicht extrem stark miniaturisiert sind und wenig Energie brauchen. Ein Mikro-Ramanspektrometer als allein operieren-des Gerät auf der planetarischen Oberfläche (z.B. Mars) bietet ein breites Spek-trum von Möglichkeiten an. Es kann die chemische Analyse durch Festlegung der mineralischen Zusammensetzung auswerten, organische Moleküle im Boden ausweisen, die mineralischen Hauptphasen identifizieren usw. Die technischen Entwicklungen der letzten Jahre haben eine neue Generation kleiner Raman-systeme mit sich gebracht, welche für die mineralische Charakterisierung von planetarischen Oberflächen geeignet sind. Für die MIRAS-Studie wurden zwei verchiedene Typen von Spektrometern berücksichtigt. In Kapitel 6 werden die Messungen von Standardmineralien und SNC-Marsmeteoriten als unterstützende Laborexperimente behandelt. Folgende SNC-Meteorite sind untersucht worden: Sayh al Uhaymir 060, Dar al Gani 735, Dar al Gani 476, Northwest Africa 856, Los Angeles, Northwest Africa 1068 und Zagami. Pyrit als eine bis jetzt unbeschriebene Phase in dem Picritic (Olivin-Phyric) Shergottit NWA 1068 sowie reduzierter Kohlenstoff (z.B. Graphit) und Anatase in dem Shergottit Say al Uhaymir 060 sind neue Erkenntnisse für diese Meteoritenklasse. Eine detaillierte Beschreibung der vorgeschlagenen Entwürfe für MIRAS mit den Bauteilen, die zum Aufbau der Testversion eines Breadboard verwendet wurden, wird in Kapitel 7 geliefert. Es werden sowohl die wissenschaftlichen als auch die Missionsanforderungen an das Gerät diskutiert. Der Grundentwurf wird vorgeführt, wobei die einzelnen Hauptbauteile des Gerätes die Laserein-heit, den Ramankopf, das Rayleigh-Filtersystem und das Spektrometer (mit einem passenden Detektor) darstellen. Die zwei vorgeschlagenen Entwürfe, der eine basierend auf einem akusto-optisch einstellbaren Filter (AOTF), der andere hingegen auf einem dispersiven Hadamard-Transformationsspektrometer werden miteinander verglichen. Der tatsächliche Breadboard-Aufbau sowie eine detaillierte Beschreibung der Bauteile folgen in Unterkapitel 7.3. Es wird ein weiteres Entwicklungskonzept für ein Raman-Spektrometer in Bezug auf planetarische Untersuchungen, im Zusammenhang mit einem Mikroskop als Teil des erweiterten MIRAS-Projektes, vorgeschlagen. Das für die Kontrolle der MIRAS Breadboard-Version entwickelte Programm samt der Struktur einer zum internen Spektrummanagement verwendeten rela-tionelen Datenbank werden in Kapitel 8 vorgestellt. Die Messprozeduren und die Datenbearbeitungsvorgänge werden zusammen beschrieben. Die mit der auf AOTF basierenden MIRAS Breadboard-Version aufgenommenen Spektren sind in Kapitel 9 abgebildet. Das letzte Kapitel (10) bezieht sich auf eine etwas andere Möglichkeit, Raman-Spektroskopie bei planetarischen Untersuchungen anzuwen-den. Das Kapitel fasst den Inhalt von vier technischen Beobachtungen zusam-men, welche im Rahmen der von der Firma Kayser Threde in München für die European Space Agency ausgeschriebenen Studie aufgezeichnet wurden. Diese Studie befasst sich mit der Möglichkeit, Raman-Spektroskopie auf das Gebiet der Fernaufnahmen anzuwenden. KW - Mikrokapseln KW - Mie Theorie KW - Raman Spektroskopie KW - MIRAS KW - Mars Meteoriten KW - Microcapsules KW - Mie Theory KW - Raman Spectroscopy KW - MIRAS KW - Mars Meteorites Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9383 ER - TY - THES A1 - Geiger, Lars T1 - The versatile use of Guanidiniocarbonylpyrroles : from self-assembly to peptide recognition T1 - Der vielseitige Einsatz von Guanidiniocarbonylpyrrolen: Von der Selbstassoziation bis zur Peptide-Erkennung N2 - Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Themenschwerpunkte. Ein supramolekulares Projekt beinhaltete die Entwicklung von neuen flexiblen, selbst-aggregierenden Zwitterionen als Bausteine für supramolekulare Polymere. In einem zweiten bioorganischem Teil bestand das Ziel darin, Rezeptoren für Aminosäuren und Dipeptide in Wasser zu entwickeln. Beide Projekte basieren auf dem Guanidiniocarbonylpyrrol als effizientes Bindungsmotiv für die Komplexierung von Carboxylaten in wässrigen Lösungen. Eine notwendige Voraussetzung für die Realisierung dieser Projekte war jedoch zunächst die Entwicklung einer allgemeinen, effizienten und milden Synthese für Guanidiniocarbonylpyrrole. Die bei der zuvor verwendeten Methode aggressiven Reaktionsbedingungen und die problematische Aufreinigung verhinderten eine größere Anwendung dieses Bindungsmotivs in bioorganischen und supramolekularen Projekten. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es mir erfolgreich eine neue Syntheseroute zu entwickeln. Hierbei wurde mono-tBoc-Guanidine mit dem Benzylester mittels PyBOP gekuppelt und nach Entschützung der Benzylschutzgruppe wurde die zentrale Zwischenstufe für die weiteren Synthesen, die tBoc-geschützte Guanidinocarbonylpyrrol-Säure erhalten. Durch diese neuartige Synthese war es möglich, eine Reihe von flexiblen Zwitterionen 3-6 herzustellen und deren Selbst-Aggregation und den Einfluß der Kettenlänge und somit Flexibilität der Alkylkette auf Struktur und Stabilität der gebildeten Aggregate in Lösung sowie auch in der Gasphase zu untersuchen. In DMSO deuten NMR-Verdünnungsreihen darauf hin, dass die flexiblen Zwitterionen mit n = 1, 3 und 5 oligomere Strukturen ausbilden. Im Falle von n = 1 werden hoch stabile helicale und Nanometer große Aggregate in der gebildet. In den Gasphasen-Studien wurde die Stabilität und Zerfallskinetik einer Reihe von Natriumaddukten der Dimere von n = 2, 3 und 5 untersucht. Dieses gelang durch die Methode der „infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry“ (IRMPD-FT-ICR MS). Solche Studien ermöglichen möglicherweise in Zukunft das gezielte Design von supramolekularen Bausteinen. Der bioorganische Teil meiner Arbeit setzte sich aus drei Einzelprojekten zusammen. So synthetisierte ich durch eine fünfstufige Synthesesequenz vier neue Arginin-Analoga, die in Zukunft als Ersatz für Arginin in Peptide eingebaut werden können. Als Testreaktion für die Eignung dieser Verbindungen in einer Festphasenpeptidsynthese, wurde ein Tripetid Ala-AA1-Val (AA: Arginin-Analogon) mit einem eingebauten Arginin-Analogon erfolgreich hergestellt. In einem zweiten Projekt habe ich den Einfluß einer zusätzlichen ionischen Wechselwirkung in unserem Bindungsmotiv untersucht. Dazu wurde ein zweifach-kationischer Rezeptor und der dreifach-geladenen Rezeptor synthetisiert und physikalisch-organisch ihre Bindungseigenschaften mit Hilfe von NMR-Titrationsexperimenten gegen eine Reihe von Aminosäuren untersucht. Der dreifach-kationische Rezeptor 11 zeigte hierbei herausragende Bindungseigenschaften und war um ca. den Faktor 100 besser als für die bisher bekannten Guanidiniocarbonylpyrrole. Die Assoziationskonstanten waren auch fast reinem Wasser mit bis zu Kass = 2000 noch bemerkenswert hoch. Im dritten Projekt habe ich einen de-novo entwickelten Rezeptor für C-terminale Dipeptide in einer beta-Faltblatt Struktur entwickelt.Dieser Rezeptor wurde mittels NMR and UV-Titrationen untersucht. In 40 % Wasser/ 60 % DMSO waren die Bindungskonstanten zu hoch um überhaupt quantifiziert zu werden. Deshalb wurden die Bindungseigenschaften des Rezeptors mittels UV Titrationen in einer Mischung aus 90 % Wasser mit 10 % DMSO gegen eine Reihe von Dipeptiden und Aminosäuren getestet. Die Bindungsdaten zeigen, dass Rezeptor Dipeptide mit ausgezeichneten Bindungskonstanten (Kass > 10000 M-1) komplexiert. Im Gegensatz dazu bindet der Rezeptor 12 Aminosäuren um den Faktor zehn schlechter (Kass > 1000 M-1). Die Komplexstabilität nimmt hierbei in Abhängigkeit von der Seitenkette des Dipeptids in der Reihe Gly < Ala < Val zu, was sich mit der abnehmenden Flexibilität und zunehmenden Hydrophobizität der Seitenkette erklären lässt. Diese Eigenschaften machen den Rezeptor 12 zu dem besten bisher bekannten Dipeptidrezeptor in wässrigen Lösungen. Innerhalb meiner Arbeit gelang es mir somit, nicht nur eine essentiell wichtige, milde und effiziente Synthese für Guanidinocarbonylpyrrole zu entwickeln, sondern es gelang mir ebenso ein neues Bindungsmotiv für die Komplexierung von Aminosäuren in Wasser zu entwickeln. Zusätzlich konnte noch der Dipeptidrezeptor erfolgreich synthetisiert und untersucht werden. Mit Bindungskonstanten für von Kass > 10000 M-1 ist er der derzeit beste Dipeptidrezeptor in wässriger Lösung. N2 - The present thesis encompasses two parts. The first supramolecular part focuses on the development of new flexible self-assembling zwitterions as building blocks for supramolecular polymers. In the second part, the aim was to develop bioorganic receptors for amino acids and dipeptides in aqueous media. Both research projects are based on the guanidiniocarbonyl pyrrole 1 as a new efficient binding motif for the complexation of carboxylates in polar solution.A necessary requirement for the realization of these research projects was to develop an efficient and mild synthetic approach for the cationic guanidiniocarbonyl pyrroles in general. The harsh reaction conditions of the previously used method and the problematic purification of the cationic guanidinocarbonyl pyrroles so far prevented a more extensive exploration in bioorganic and supramolecular research. In the course of this work I successfully developed a new synthesis starting with mono tBoc-protected guanidine that was coupled with a benzyl protected pyrrole carboxylic acid. After deprotection of the benzyl group, a key intermediate in the newly developed synthesis, the tBoc-protected guanidinocarbonyl pyrrole acid, was obtained. This new, mild and extremely efficient synthetic approach for the introduction of acyl guanidines is now the standard procedure in our group for the preparation of both solution and solid-phase guanidiniocarbonyl pyrroles. With this facile method at hand, a new class of flexible zwitterions, in which a carboxylate is linked via an alkyl chain to a guanidiniocarbonyl pyrrole cation was synthesized. The self-aggregation and the influence of the length and therefore flexibility of the alkyl spacer on the structure and stability of the formed aggregates were studied in solution and gas phase. In solution the aggregation was studied by NMR-dilution experiments in DMSO which suggest that flexible zwitterions with n = 1, 3 and 5 form oligomers. For n = 1, highly stable helical aggregates with nanometer size are formed. In the gas phase studies the stability and the fragmentation kinetics of a series of sodiated dimeric zwitterions with n = 2, 3 and 5 were investigated. This was done by infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (IRMPD-FT-ICR-MS). These kinds of studies can be used in the future for a more directed design of supramolecular building blocks The bioorganic research part comprises three different projects. In a first project I synthesized four new arginine analogues which can be implemented in peptides as a substitute for arginine. Therefore, I developed the new multi-step synthesis shown below for these arginine analogues. As a test for their application in normal solid phase synthesis, I successfully prepared a tripeptide sequence Ala-AA1-Val (AA: arginine analogue. In a second project I studied the influence of additional ionic interactions within our binding motif. I synthesized a di-cationic and a tris-cationic receptor and evaluated the binding properties via NMR titration experiments against a variety of amino acids. Especially, the tris-cationic receptor was capable to strongly complex amino acids. The association constants were about a factor of 100 higher than those for the guanidiniocarbonyl pyrroles known so far. Even in 90 %water/10 % DMSO the association constants determined by NMR titration were extremely high with values around Kass = 2000 M-1. In the third project I developed a de-novo designed receptor for C-terminal dipeptides in a beta-sheet conformation based on molecular calculations. This receptor was studied in NMR and also UV titration experiments. In 40 % water/ 60 % DMSO the association constants were too strong to be measured by NMR titration experiments. Therefore, the complexation properties of 12 were studied by UV titration in water (with 10 % DMSO added for solubility reasons) with various dipeptides and amino acids as substrates. The data show that 12 binds dipeptides very efficiently even in water with association constants Kass > 10000 M-1, making 12 one of the most effective dipeptide receptors known so far. In contrast to that, simple amino acids are bound up to ten times less efficiently (Kass > 1000 M-1) than dipeptides. In the series of dipeptides studied the complex stability increases depending on the side chains present in the order Gly < Ala < Val which is a result of the decreasing flexibility of the peptide and the increasing hydrophobicity of the side chains. The binding properties of this receptor are superior to any other dipeptide receptor reported so far. Within my thesis I have not only developed an essential, mild and efficient synthetic approach for guanidiniocarbonyl pyrroles in general, but also a new binding motif for the complexation of amino acids 15, 11 and in addition a dipeptide receptor 12 that is superior to all dipeptides receptors known so far. KW - Guanidinderivate KW - Supramolekulare Chemie KW - Selbstassoziation KW - Bioorganik KW - supramolekulare Chemie KW - molekulare Erkennung KW - Self-Assembly KW - Bioorganic chemistry KW - supramolecular chemistry KW - molecular recognition Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9272 ER - TY - THES A1 - Planchet, Elisabeth T1 - Nitric oxide production by tobacco plants and cell cultures under normal conditions and under stress N2 - Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiges freies Radikal. In tierischen Geweben ist NO an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. In den letzten zehn Jahren wurde immer wahrscheinlicher, dass NO auch in Pflanzen als „second messenger“ fungiert. Besonderes Interesse fanden Berichte, dass NO als intermediäres Signal bei der Induktion der hypersensitiven Antwort (HR) von Pflanzen auf Pathogene involviert ist. Im Gegensatz zu Tieren haben Pflanzen wahrscheinlich eine Reihe verschiedener Systeme, die NO produzieren können. Potentielle Kandidaten dafür sind: cytosolische Nitratreduktase (NR; EC 1.6.6.1), PM-gebundene Nitrit: NO Reduktase (Ni:NOR), NO-Synthase (NOS; EC 1.14.13.39) und Xanthindehydrogenase (XDH; EC 1.1.1.204). Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die NO-Produktion von Pflanzen zu quantifizieren und die beteiligten enzymatischen Schritte zu identifizieren. Als wichtigste Methode zur NO-Messung wurde die Chemilumineszenz verwendet, mit der die NO Emission aus Pflanzen, Zellsuspensionen oder Enzymlösungen in NO-freie Luft oder N2 in Echtzeit verfolgt werden konnte. Wir benutzten für unsere Analyse: Tabak Wildtyp (N. tabacum cv Xanthi oder cv Gatersleben) und Zellsuspensionskulturen davon, NR-freie Mutanten oder WT Pflanzen, die auf Ammonium angezogen wurden um NR-Induktion zu vermeiden, Pflanzen die auf Wolframat an Stelle von Molybdat wuchsen um die Synthese funktionierender MoCo-Enzyme zu unterdrücken, und eine NO-überproduzierende, Nitritreduktase (NiR)-defiziente Transformante. Normale Blätter von nitraternährten Pflanzen zeigten eine typisches NO-Emissionsmuster,bei dem die NO-Emission im Dunkeln niedrig, im Licht viel höher, und unter anoxischen Bedingungen im Dunkeln mit weitem Abstand am höchsten war. Aber selbst nach Erreichen maximaler Raten war die NO-Emission höchstens 1 % der extrahierbaren NR Aktivität. Auch eine Lösung hochgereinigter Nitratreduktase produzierte NO aus den Substraten Nitrit und NADH, und auch hier war die Rate der NO-Emission nur maximal 1% der vorhandenen NR-Aktivität. Dieses übereinstimmende Verhältnis von NR Aktivität und NO-Emission in Blättern, Zellsuspensionen und einer NR-Lösung zeigt an dass die NO-Löschung nur gering war und dass deshalb die NO-Emissionsmessung eine zuverlässige Methode zur Quantifizierung der NO Produktion sein sollte. Die NO-Emission aus einer NiR-defizienten, nitritakkumulierenden Transformante warimmer sehr hoch. NR-freie Pflanzen oder Zellsuspensionen produzierten dagegen normalerweise kein NO, woraus geschlossen werden konnte, dass hier NR die einzige NOQuelle war. Die Rate war in der Regel korreliert mit der Nitritkonzentration, aber cytosolisches NADH erschien als ein weiterer wichtiger limitierender Faktor.Überraschenderweise reduzierten aber auch NR-freie Pflanzen oder Zellkulturen unter anoxischen Bedingungen Nitrit zu NO. Das beteiligte Enzymsystem war kein MoCo-Enzym und war Cyanid-sensitiv. Der pilzliche Elicitor Cryptogein induzierte nach Infiltration in Blätter oder nach Zugabe zu Zellsuspensionen bereits in nanomolaren Konzentrationen den Zelltod. Diese Antwort wurde verhindert oder zumindest stark verzögert durch den NO-Scavenger PTIO oder c-PTIO. Die Schlussfolgerung war zunächst, das NO tatsächlich an der HR-Induktion involviert war. Da aber das Reaktionsprodukt von c-PTIO und NO, c-PTI, den HR ebenfalls verhinderte ohne jedoch NO zu löschen, scheint die weit verbreitete Verwendung von c-PTIO und seinen Derivaten für die Beweisführung einer Beteiligung von NO zumindest fragwürdig. Der HR wurde unterschiedslos sowohl in WT-Pflanzen als auch in NR-freien Pflanzen bzw. Zellsuspensionen induziert. NR ist also offensichtlich für den HR nicht erforderlich. Im Gegensatz zur publizierten Literaturdaten verhinderte auch eine kontinuierliche hohe Überproduktion von NO die Ausprägung des HR nicht. Besonders überraschend war der Befund, dass trotz der Hemmung des HR durch PTIO keinerlei Cryptogein-induzierte NO Produktion in Blättern messbar war. Allerdings wurde in nitraternährten Zellsuspensionskulturen ca. 3-6 h nach Cryptogein-Gabe eine -wenn auch geringe-NOEmission beobachtet, die von einer Nitritakkumulation begleitet war. Beides blieb in Ammonium-ernährten Kulturen aus. Hier schien also eine gewisse Relation zwischen Cryptogein-induzierter NO Emission, NR und Nitrit zu bestehen, die im Detail noch nicht verstanden ist. Da der Zelltod aber auch in NR-freien Zellsuspensionskulturen auftrat, besteht offensichtlich kein kausaler Zusammenhang zwischen dieser NO-Emission, Nitritakkumulation und der Cryptogein-Wirkung. Da NOS-Inhibitoren weder den Zelltod noch die nitritanhängige NO-Emission verhinderten, scheint eine NOS-artige Aktivität ebenfalls keine Rolle zu spielen. Insgesamt werden damit die in der Literatur etablierte Rolle von NO als Signal beim HR und die Rolle von NOS als NO-Quelle stark in Frage gestellt. N2 - Nitric oxide (NO) is a gaseous free radical involved in the regulation of diverse biochemical and physiological processes in animals. During the last decade, evidence has accumulated that NO might also play an important role as a second messenger in plants. Of special interest were observations that NO was involved in a signal chain leading to the hypersensitive response (HR) in incompatible plant-pathogen interactions. In contrast to animals, plants have probably several enzymes that may produce NO. Potential candidates are: Cytosolic nitrate reductase (NR; EC 1.6.6.1), plasma-membrane (PM)-nitrite: NO reductase (Ni:NOR), nitric oxide synthase (NOS; EC 1.14.13.39) and Xanthine dehydrogenase (XDH; EC 1.1.1.204). The major goal of this work was to quantify NO production by plants, and to identify the enzymes responsible for NO production. As a major method, NO production by tobacco leaves or cell suspensions was followed under normal, non-stress conditions, and under biotic stress, through on-line measurement of NO emission into the gas phase (chemiluminescence). Plants used were tobacco wild-type (N. tabacum cv Xanthi or cv Gatersleben), NR-free mutants grown on ammonium in order to prevent NR induction, plants grown on tungstate to inhibit synthesis of functional MoCoenzymes, and a NO-overproducing nitrite reductase (NiR)-deficient transformant. Induction of HR in tobacco leaves and in cell suspensions was achieved using the fungal peptide elicitor cryptogein. Non-elicited leaves from nitrate-grown plants showed a typical NO-emission pattern where NO-emission was low in dark, higher in the light and very high under dark-anaerobic conditions. Even at maximum rates, NO production in vivo was only a few percent of total NR activity (NRA). Consistent with that, with a solution of purified NR as a simple, “low quenching” system, NO-emission was also about 1 % of NRA. Thus, NO scavenging by leaves and stirred cell suspensions appeared small and NO-emission into purified air should give a reliable estimate of NO production. NO-emission was always high in a NiR-deficient transformant which accumulated nitrite, and NO-emission was completely absent in plants or cell suspensions which did not contain NR. Thus, in healthy plants or cell suspensions, NO-emission was exclusively due to the reduction of nitrite to NO, mainly by cytosolic NR. In addition to nitrite, cytosolic NADH appears as an important factor limiting NO production. Unexpectedly, plants (in absence of NR) were able to reduce nitrite to NO under anaerobic conditions through an unknown enzyme system that was not a MoCo-enzyme and was cyanide-sensitive. When infiltrated into leaves at nanomolar concentrations, the fungal elicitor cryptogein provoked cell death in tobacco leaves and cell suspensions. The HR could be prevented by the NO-scavengers PTIO or c-PTIO, suggesting that NO production was indeed required for the HR. However, the product of the reaction of c-PTIO with NO, c-PTI, also prevented cell death without quenching NO emission. Thus, prevention of cell death by c- PTIO is no proof for an involvement of NO. No differences were found in the HR induction between NR-free plants and/or cell suspensions and WT plants. Thus, NR appears not necessary for the HR. Further, and in contrast to literature suggestions, a continuously high NO-overproduction by a NiR-free mutant did not interfere with the development of the HR. Most surprisingly, no additional NO-emission from tobacco leaves was induced by cryptogein at any phase of the HR. In contrast, some NO-emission, paralleled by nitrite accumulation, was detected 3-6 h after cryptogein addition with nitrate grown cell suspensions, but not with NR free, ammonium- grown cells. Thus, induction of NO-emission by cryptogein appeared somehow correlated with NR and nitrite, at least in cell suspensions. But since cryptogein induced the HR even in NR-free cell suspensions, this nitrite-related NO- emission was not required for cell death. NOS inhibitors neither prevented cell death nor did they affect nitrite-dependent NO-emission. Thus, in total these data question the often proposed role of NO as a signal in the HR, and of NOS as source for NO. KW - Tabak KW - Stickstoffmonoxid KW - Nitratreduktase KW - Stickstoffmonoxid KW - Nitratreduktase KW - Nicotiana tabacum KW - Cryptogein KW - Chemilumineszenz KW - Nitric oxide KW - Nitrate reductase KW - Nicotiana tabacum KW - Cryptogein KW - Chemiluminescence Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9339 ER - TY - THES A1 - Kraus, Daniela T1 - Conformal pseudo-metrics and some applications T1 - Konforme Pseudo-Metriken und einige Anwendungen N2 - The point of departure for the present work has been the following free boundary value problem for analytic functions $f$ which are defined on a domain $G \subset \mathbb{C}$ and map into the unit disk $\mathbb{D}= \{z \in \mathbb{C} : |z|<1 \}$. Problem 1: Let $z_1, \ldots, z_n$ be finitely many points in a bounded simply connected domain $G \subset \mathbb{C}$. Show that there exists a holomorphic function $f:G \to \mathbb{D}$ with critical points $z_j$ (counted with multiplicities) and no others such that $\lim_{z \to \xi} \frac{|f'(z)|}{1-|f(z)|^2}=1$ for all $\xi \in \partial G$. If $G=\mathbb{D}$, Problem 1 was solved by K?nau [5] in the case of one critical point, and for more than one critical point by Fournier and Ruscheweyh [3]. The method employed by K?nau, Fournier and Ruscheweyh easily extends to more general domains $G$, say bounded by a Dini-smooth Jordan curve, but does not work for arbitrary bounded simply connected domains. In this paper we present a new approach to Problem 1, which shows that this boundary value problem is not an isolated question in complex analysis, but is intimately connected to a number of basic open problems in conformal geometry and non-linear PDE. One of our results is a solution to Problem 1 for arbitrary simply connected domains. However, we shall see that our approach has also some other ramifications, for instance to a well-known problem due to Rellich and Wittich in PDE. Roughly speaking, this paper is broken down into two parts. In a first step we construct a conformal metric in a bounded regular domain $G\subset \mathbb{C}$ with prescribed non-positive Gaussian curvature $k(z)$ and prescribed singularities by solving the first boundary value problem for the Gaussian curvature equation $\Delta u =-k(z) e^{2u}$ in $G$ with prescribed singularities and continuous boundary data. This is related to the Berger-Nirenberg problem in Riemannian geometry, the question which functions on a surface R can arise as the Gaussian curvature of a Riemannian metric on R. The special case, where $k(z)=-4$ and the domain $G$ is bounded by finitely many analytic Jordan curves was treated by Heins [4]. In a second step we show every conformal pseudo-metric on a simply connected domain $G\subseteq \mathbb{C}$ with constant negative Gaussian curvature and isolated zeros of integer order is the pullback of the hyperbolic metric on $\mathbb{D}$ under an analytic map $f:G \to \mathbb{D}$. This extends a theorem of Liouville which deals with the case that the pseudo-metric has no zeros at all. These two steps together allow a complete solution of Problem 1. Contents: Chapter I contains the statement of the main results and connects them with some old and new problems in complex analysis, conformal geometry and PDE: the Uniformization Theorem for Riemann surfaces, the problem of Schwarz-Picard, the Berger-Nirenberg problem, Wittich's problem, etc.. Chapter II and III have preparatory character. In Chapter II we recall some basic results about ordinary differential equations in the complex plane. In our presentation we follow Laine [6], but we have reorganized the material and present a self-contained account of the basic features of Riccati, Schwarzian and second order differential equations. In Chapter III we discuss the first boundary value problem for the Poisson equation. We shall need to consider this problem in the most general situation, which does not seem to be covered in a satisfactory way in the existing literature, see [1,2]. In Chapter IV we turn to a discussion of conformal pseudo-metrics in planar domains. We focus on conformal metrics with prescribed singularities and prescribed non-positive Gaussian curvature. We shall establish the existence of such metrics, that is, we solve the corresponding Gaussian curvature equation by making use of the results of Chapter III. In Chapter V we show that every constantly curved pseudo-metric can be represented as the pullback of either the hyperbolic, the euclidean or the spherical metric under an analytic map. This is proved by using the results of Chapter II. Finally we give in Chapter VI some applications of our results. [1,2] Courant, H., Hilbert, D., Methoden der Mathematischen Physik, Erster/ Zweiter Band, Springer-Verlag, Berlin, 1931/1937. [3] Fournier, R., Ruscheweyh, St., Free boundary value problems for analytic functions in the closed unit disk, Proc. Amer. Math. Soc. (1999), 127 no. 11, 3287-3294. [4] Heins, M., On a class of conformal metrics, Nagoya Math. J. (1962), 21, 1-60. [5] K?nau, R., L?gentreue Randverzerrung bei analytischer Abbildung in hyperbolischer und sph?ischer Geometrie, Mitt. Math. Sem. Giessen (1997), 229, 45-53. [6] Laine, I., Nevanlinna Theory and Complex Differential Equations, de Gruyter, Berlin - New York, 1993. N2 - Der Ausgangspunkt dieser Arbeit war das folgende freie Randwertproblem f? analytische Funktionen $f$, die auf einem Gebiet $G \subset \mathbb{C}$ definiert sind und in den Einheitskreis $\mathbb{D}= \{z \in \mathbb{C} : |z|<1 \}$ abbilden. Problem 1: Es seien $z_1, \ldots, z_n$ endlich viele Punkte in einem beschr?kten einfach zusammenh?genden Gebiet $G \subset \mathbb{C}$. Existiert eine holomorphe Funktion $f:G \to \mathbb{D}$, die genau und nur in $z_j$ kritische Punkte (mit Vielfachheiten gez?lt) besitzt und $\lim_{z \to \xi} \frac{|f'(z)|}{1-|f(z)|^2}=1$ f? alle $\xi \in \partial G$ erf?lt. F? $G=\mathbb{D}$ wurde Problem 1 von K?nau [5] im Fall eines kritischen Punktes gel?t und f? mehr als einen kritischen Punkt von Fournier and Ruscheweyh [3]. Die Methode, die von K?nau, Fournier and Ruscheweyh benutzt wurde, l?st sich auf allgemeinere Gebiete $G$ ?ertragen, aber nicht auf beliebige beschr?kte einfach zusammenh?gende Gebiete. In dieser Arbeit wird ein Zugang zu Problem 1 dargestellt, der das Randwertproblem der Komplexen Analysis mit einer Reihe offener Probleme in der Konformen Geometrie und der Theorie nicht-linearer PDE in Zusammenhang bringt. Insbesondere wird Problem 1 f? beliebige einfach zusammenh?gende Gebiete gel?t. Es wird gezeigt, dass der gew?lte Zugang weitere Verzweigungen aufweist, z.B. zu einem wohlbekannten Problem von Rellich und Wittich in PDE. Die Arbeit besteht aus zwei Hauptteilen. In einem ersten Schritt werden konforme Metriken in einem beschr?kten regul?en Gebiet $G \subset \mathbb{C}$ mit vorgeschriebener nicht-positiver Gau?cher Kr?mung $k(z)$ und vorgeschriebenen Singularit?en konstruiert, indem das erste Randwertproblem f? die Gau?che Kr?mungsgleichung $\Delta u=-k(z) e^{2u}$ in $G$ mit vorgeschriebenen Singularit?en und stetigen Randwerten gel?t wird. Dies steht in Zusammenhang mit dem Berger-Nirenberg Problem, der Frage, welche Funktionen auf einer Riemannschen Fl?he R als Gau?che Kr?mung einer Riemannschen Metrik auf R auftreten k?nen. Der Spezialfall, dass $k(z)=-4$ und das Gebiet $G$ durch endlich viele analytische Jordankurven berandet ist, wurde von Heins [4] gel?t. In einem zweiten Schritt wird gezeigt, dass jede konforme Pseudo-Metrik auf einem einfach zusammenh?genden Gebiet $G \subseteq \mathbb{C}$ mit konstanter negativer Gau?cher Kr?mung und isolierten Nullstellen ganzzahliger Ordnung die Zur?kholung der hyperbolischen Metrik auf $\mathbb{D}$ unter einer holomorphen Funktion $f:G \to \mathbb{D}$ ist. Dies erweitert einen Satz von Liouville, der den Fall einer nullstellenfreien Pseudo-Metrik behandelt. Die beschriebenen zwei Schritte l?en Problem 1 vollst?dig. Inhaltsangabe: Kapitel I enth?t die Ergebnisse der Arbeit und stellt den Zusammenhang mit alten und neuen Problemen in Komplexer Analysis, Konformer Geometrie, und PDE dar: dem Uniformisierungssatz f? Riemannsche Fl?hen, dem Problem von Schwarz-Picard, dem Berger-Nirenberg Problem, Wittichs Problem, etc.. In Kapitel II wird an grundlegende Ergebnisse gew?nlicher Differentialgleichungen in der komplexen Ebene erinnert. Die Darstellung folgt Laine [6]. Das Material ist reorganisiert und enth?t eine Auflistung der wichtigsten Gesichtspunkte von Riccati und Schwarzschen Differentialgleichungen sowie Differentialgleichungen zweiter Ordnung. In Kapitel III wird das erste Randwertproblem f? die Poisson Gleichung diskutiert. Es wird in gr秤ter Allgemeinheit betrachtet, da es scheinbar in der vorhandenen Literatur nicht in einer befriedigenden Weise behandelt wird, siehe [1,2]. In Kapitel IV werden Pseudo-Metriken in ebenen Gebieten diskutiert. Im Mittelpunkt stehen Metriken mit vorgeschriebenen Singularit?en und vorgeschriebener nicht-positiver Gau?cher Kr?mung. Die Existenz solcher Metriken wird mithilfe der Ergebnisse aus Kapitel III bewiesen. In Kapitel V wird gezeigt, dass sich jede Pseudo-Metrik konstanter Kr?mung als Zur?kholung der hyperbolischen, der euklidischen oder der sph?ischen Metrik unter einer analytischen Funktion darstellen l?st. Hierf? werden die Ergebnisse aus Kapitel II herangezogen. Einige Anwendungen der Ergebnisse befinden sich in Kaptil VI. [1,2] Courant, H., Hilbert, D., Methoden der Mathematischen Physik, Erster/ Zweiter Band, Springer-Verlag, Berlin, 1931/1937. [3] Fournier, R., Ruscheweyh, St., Free boundary value problems for analytic functions in the closed unit disk, Proc. Amer. Math. Soc. (1999), 127 no. 11, 3287-3294. [4] Heins, M., On a class of conformal metrics, Nagoya Math. J. (1962), 21, 1-60. [5] K?nau, R., L?gentreue Randverzerrung bei analytischer Abbildung in hyperbolischer und sph?ischer Geometrie, Mitt. Math. Sem. Giessen (1997), 229, 45-53. [6] Laine, I., Nevanlinna Theory and Complex Differential Equations, de Gruyter, Berlin - New York, 1993. KW - Freies Randwertproblem KW - Pseudometrik KW - konforme Pseudo-Metriken KW - freies Randwertproblem KW - Darstellung vonPseudo-Metriken KW - Poisson Gleichung KW - erstes Randwertproblem in PDE KW - conformal pseudo-metrics KW - representation of pseudo-metrics KW - Poisson equation KW - first boundary value problem in PDE Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9193 ER - TY - THES A1 - Petrovic, Suzana T1 - In vivo analysis of homing pattern and differentiation potential of cells deriving from embryonic and adult haematopoietic regions T1 - In-vivo-Analyse der Besiedelung und der Differenzirung von Zellen die aus embrionalen und hämatopoetischen Regionen stammen N2 - The experimental work of this thesis addresses the questions of whether established cell lines injected into murine blastocysts find their way back home and seed preferentially at the site of their origin. Furthermore, can they change their fate and differentiate to unrelated cell types when exposed to the embryonic environment. This survey was based on the fact that different cell lines have different potentials in developing embryos, dependent on their cellular identity. The cell lines used in this survey were AGM region-deriving DAS 104-4, DAS 104-8 cells, yolk sac-deriving YSE cells and bone marrow-deriving FDCP mix cells. These cells were injected into mouse blastocysts. Donor cells were traced in developing embryos via specific markers. Analysis of the embryos revealed that DAS cells are promiscuous in their seeding pattern, since they were found in all analysed tissues with similar frequencies. YSE cells showed preferences in seeding yolk sac and liver. YSE donor cells in chimaeric tissues were not able to change their immuno-phenotype, indicating that they did not change their destiny. Analysis of adult mice did not reveal any of YSE-derived cells donor contribution. In contrast, FDCP mix cells mostly engrafted haematopoietic tissues, although the embryos analysed by in situ hybridization had donor signals frequently in cartilage primordia, heads, and livers. Analysis of whether FDCPmix-derived cells found in foetal livers were of haematopoietic or hepatocytes nature showed that progeny of injected FDCP mix cells do not differentiate into cells that express a hepatocyte-specific marker. Further analysis showed that FDCPmix-derived donor cells found in brain express neural or haematopoietic markers. In order to reveal if they transdifferentiate to neurons or fuse with neurons/glial cells, nuclear diameters of donor and recipient cells were determined. Comparison of the nuclear diameters of recipient and donor cells revealed no differences. Therefore this suggests that progeny of FDCP mix in brain are not fusion products. Analysis of adult mice tissues revealed that presence of FDCP mix-derived cells was the highest in brains. These results confirmed the assumption that the developmental potential of the analysed cells cannot be easily modified, even when exposed to early embryonic environment. Therefore one can conclude that the analysed cell types had different homing patterns depending on their origins. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde als zentrale Frage untersucht, wie Zellen verschiedener etablierter Zelllinien nach Injektion in murine Blastozysten an der Entwicklung der resultierenden chimären Tiere beitragen. Insbesondere wurde untersucht, ob injizierte Zellen bevorzugt oder ausschließlich Gewebe ihres Ursprungs besiedeln (“Homing“), oder ob Donorzellen auch heterologe Gewebe infiltrieren und gegebenenfalls gar unter dem Einfluß der frühembryonalen Blastozysten-Umgebung ihr Zellschicksal ändern und in andere Zelltypen transdifferenzieren können. Diese Studie basiert auf früheren Arbeiten, in denen gezeigt wurde, daß unterschiedliche Zelllinien - in Abhängigkeit ihrer Identität - verschiedene Entwicklungspotentiale im frühen Embryonalstadium haben. Folgende Zelllinien wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht: DAS 104-4 und DAS 104-8 (beide aus der sogenannten AGM Region isoliert), YSE (aus dem Dottersack) und FDCP mix (aus Knochenmark abstammend). Zellen dieser Zelllinien wurden in Maus Blastozysten injiziert und der Chimärismus in sich entwickelnden Embryonen oder adulten Tieren mit Hilfe von Donorzell-spezifischen Markern analysiert. Die Analyse chimärer Embryonen ergab, daß DAS Zellen diese promiskuitiv besiedeln: DAS Zellen wurden in allen untersuchten Geweben mit ähnlichen Häufigkeiten gefunden. YSE Zellen hingegen wurden bevorzugt in der fötalen Leber und im Dottersack nachgewiesen. YSE Donorzellen in chimären Geweben zeigten keine Änderungen in ihrem Immunphänotyp und damit keine Hinweise auf eine mögliche Transdifferenzierung. In adulten Mäusen konnten keine YSE-abstammende Zellen mehr identifiziert werden. FDCP mix Zellen besiedelten vor allem hämatopoetische Gewebe. In Embryonen wurden allerdings auch häufig Donorzell-spezifische in situ Hybridisierungssignale in Knorpelvorläufergewebe, der Leber und in der Kopfregion erhalten. Die FDCP mix Marker positiven Zellen der fötalen Leber wurden negativ auf die Expression von Hepatozyten-Markern getestet. Dies spricht auch in diesem Fall gegen einen Wechsel der Donorzellidentität und Transdifferenzierung. Im Gegensatz dazu wurden im Gehirn FDCP mix abstammende Spenderzellen identifiziert, die entweder neurale oder hämatopoetische Marker tragen. Die Zellkerndurchmesser wurden für die Donor-abstammenden Zellen und für die endogenen Gehirnzellen bestimmt und wiesen keinen signifikanten Unterschied auf. Dieser Befund läßt vermuten, daß FDCP mix abstammende Zellen mit Expression von neuralen Markern nicht das Produkt von Zellfusion von Donorzellen mit Neuronen oder Gliazellen sind. In der Analyse von adulten Mäusen wurden FDCP mix abstammende Zellen am häufigsten im Gehirn identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen für die analysierten Zelllinien, daß sich deren Entwicklungspotential auch bei Exposition in frühembryonalem Milieu nicht leicht modifizieren läßt. Es wurde weiterhin gezeigt, daß die analysierten Zelltypen in Bezug auf ihren Ursprung ein sehr unterschiedliches “Homing“-Verhalten aufweisen. KW - Zelllinie KW - Zelldifferenzierung KW - Maus KW - Embryonalentwicklung KW - Blastozysten KW - DAS104-4 KW - DAS104-8 KW - YSE KW - FDCPmix KW - Blastocysts KW - DAS104-4 KW - DAS104-8 KW - YSE KW - FDCPmix Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9323 ER - TY - THES A1 - Rouzière, Anne-Sophie T1 - MODULATION OF THE B-CELL REPERTOIRE IN RHEUMATOID ARTHRITIS BY TRANSIENT B-CELL DEPLETION T1 - Veränderung des B-Zell-Repertoirs nach B-Zelldepletion mit Anti-CD20-Antikörpen N2 - Although the role of B-cells in autoimmunity is not completely understood, their importance in the pathogenesis of autoimmune diseases has been more appreciated in the past few years. It is now well known that they have roles in addition to (auto) antibody production and are involved by different mechanisms in the regulation of T-cell mediated autoimmune disorders. The evolution of an autoimmune disease is a dynamic process, which takes a course of years during which complex immunoregulatory mechanisms shape the immune repertoire until the development of clinical disease. During this course, the B-cell repertoire itself is influenced and a change in the distribution of immunoglobulin heavy and light chain genes can be observed. B-cell depletive therapies have beneficial effects in patients suffering from rheumatoid arthritis (RA), highlighting also the central role of B-cells in the pathogenesis of this disease. Nevertheless, the mechanism of action is unclear. It has been hypothesised that B-cell depletion is able to reset deviated humoral immunity. Therefore we wanted to investigate if transient B-cell depletion results in changes of the peripheral B-cell receptor repertoire. To address this issue, expressed immunoglobulin genes of two patients suffering from RA were analysed; one patient for the heavy chain repertoire (patient H), one patient for the light chain repertoire (patient L). Both patients were treated with rituximab, an anti-CD20 monoclonal antibody that selectively depletes peripheral CD20+ B-cells for several months. The B-cell repertoire was studied before therapy and at the earliest time point after B-cell regeneration in both patients. A longer follow-up (up to 27 months) was performed in patient H who was treated a second time with rituximab after 17 months. Heavy chain gene analysis was carried out by nested-PCR on bulk DNA from peripheral B-cells using family-specific primers, followed by subcloning and sequencing. During the study, patient H received two courses of antibody treatment. B-cell depletion lasted 7 and 10 months, respectively and each time was accompanied by a clinical improvement. Anti-CD20 therapy induced two types of changes in this patient. During the early phase of B-cell regeneration, we noticed the presence of an expanded and recirculating population of highly mutated B-cells. These cells expressed very different immunoglobulin VH genes compared before therapy. They were class-switched and could be detected for a short period only. The long-term changes were more subtle. Nevertheless, characteristic changes in the VH2 family, as well as in specific mini-genes like VH3-23, 4-34 or 1-69 were noticed. Some of these genes have already been reported to be biased in autoimmune diseases. Also in autoimmune diseases, in particular in RA, clonal B-cells have been frequently found in the repertoire. B-cell depletion with anti-CD20 antibody resulted in a long term loss of clonal B-cells in patient H. Thus, temporary B-cell depletion induced significant changes in the heavy chain repertoire. For the light chain gene analysis, the repertoire changes were analysed separately for naive (CD27-) and memory (CD27+) B-cells. Individual CD19+ B-cells were sorted into CD27- and CD27+ cells and single cell RT-PCR was performed, followed by direct sequencing. During the study, patient L received one course of antibody treatment. B-cell depletion lasted 10 months and the light chain repertoire was studied before and after therapy. Before therapy, some differences in the distribution of VL and JL genes were observed between naive and memory B-cells. In particular, the predominant usage of Jk-proximal Vk genes by the CD27- naive B-cells indicated that the receptor editing was less frequent in this population compared to memory cells. In VlJl rearrangements also, some evidence for decreased receptor editing was noticed, with the overrepresentation of the Jl2/3 gene segments. The CDR3 regions of naive and memory cells showed different characteristics: the activity of the terminal deoxynucleotidyl transferase and exonuclease in Vl(5’) side was greater in memory cells. Also in the light chain repertoire, we observed some changes induced by the B-cell depletive therapy. There was a tendency of a less frequent usage of Jk-proximal Vk genes in the naive population. Some Vl genes, previously described in autoimmune diseases and connected to rheumatoid factor activity, such as 3p, 3r, 1g, were not found after therapy. The different characteristics of the CDR3 regions of VlJl rearrangements were not observed anymore. Very significantly, the ratio Vk to Vl was shifted toward a greater usage of Vk genes in the naive population after therapy. Taken together, these results indicate that therapeutic transient B-cell depletion by anti-CD20 antibody therapy modulates the immunoglobulin gene repertoire in the two RA patients studied. Measurable changes were observed in the heavy chain as well as in the light chain repertoire, which may be relevant to the course of the disease. This also supports the notion that the composition of the B-cell repertoire is influenced by the disease and that B-cell depletion can reset biases that are typically found in autoimmune diseases. N2 - Obwohl die Rolle der B-Zellen für den Verlauf einer Autoimmunerkrankung noch nicht vollständig klar ist, so hat ihre Bedeutung für die Autoimmunpathogenese in den letzten Jahren zugenommen. Man weiß mittlerweile sehr wohl, dass ihre Rolle über die reine Produktion von (Auto-)antikörpern hinausgeht und sie z.B. an der Regulation T-Zellvermittelter Autoimmunstörungen beteiligt sind. Das B-Zellrepertoire selbst wird im Laufe einer autoimmunen Erkrankung durch solche immunregulatorische Prozesse beeinflusst. B-Zelldepletive Therapien zeigen vorteilhafte Effekte bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis, was wiederum die zentrale Rolle von B-Zellen in der Pathogenese unterstreicht. Nichtsdestotrotz bleibt der genaue Mechanismus unklar. So wird z.B. spekuliert, dass mittels B-Zell-Depletion eine Neugenerierung der humoralen Immunität erreicht wird. Vor diesem Hintergrund untersuchten wir, ob eine vorübergehende B-Zell-Depletion zu Veränderungen im peripheren B-Zellrepertoire führt. Hierfür wurde das B-Zell-Rezeptorrepertoire von zwei Patienten mit Rheumatoider Arthritis im einen Fall bezüglich der schweren Kette (Patient H) und im anderen Fall bezüglich der leichten Kette (Patient L) analysiert. Beide Patienten wurden mit Rituximab, einem monoklonalen anti-CD20 Antikörper, der zu einer selektiven und über mehrere Monate anhaltenden Depletion peripherer CD20+-B-Zellen führt, behandelt. Das B-Zellrepertoire wurde für beide Patienten unmittelbar vor Therapie sowie in der frühen B-Zellregeneration untersucht. Bei Patient H erfolgte eine zweite Behandlung mit Rituximab nach 17 Monaten. Das Follow-up erfolgte in diesem Fall bis Monat 27. Die Analyse der Schwerketten erfolgte mittels nested-PCR mit DNA aus peripheren B-Zellen unter Verwendung familienspezifischer Primer und anschließendem Subklonieren und Sequenzieren. Während der Studie erhielt Patient H zwei Zyklen der Antikörperbehandlung. Die B-Zell-Depletion hielt 7 bzw. 10 Monate an und war zu jedem Zeitpunkt mit einer klinischen Besserung des Patienten verbunden. Die Anti-CD20 Therapie bewirkte zwei Arten von Veränderungen in diesem Patienten. Während der frühen Phase der B-Zellregeneration konnten wir eine ausgedehnte und rezirkulierende Population hochmutierter B-Zellen nachweisen. Diese Zellen exprimierten verglichen mit dem Zeitpunkt vor Therapie sehr unterschiedliche VH Gene. Es handelte sich hierbei um „class-switched“ Zellen, welche nur für kurze Zeit nachweisbar waren. Die Langzeit Veränderungen dagegen waren eher diskret. Nichtsdestotrotz konnten Veränderungen sowohl in der Familie VH2 als auch in spezifischen Mini-Genen wie VH3-23, 4-34 oder 1-69 festgestellt werden. Eine Häufung einiger dieser Gene wurde bereits im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen berichtet. Zusätzlich bewirkte die Rituximabtherapie ein Verschwinden klonaler B-Zellen für die gesamte Periode. Folglich bewirkte die vorübergehende B-Zell-Depletion signifikante Veränderungen im Schwerkettenrepertoire. Für die Genanalyse der leichten Kette wurden die Veränderungen getrennt für naive (CD27-) und Gedächtnis- (CD27+) B-Zellen untersucht. Einzelne CD19+ B-Zellen wurden in CD27- und CD27+-Zellen sortiert und anschließend eine Single-cell-RT-PCR mit direkter Sequenzierung der Produkte durchgeführt. Während der Studie erhielt Patient L eine Behandlung. Die B-Zell-Depletion dauerte 10 Monate und das Leichtkettenrepertoire wurde vor und nach Therapie analysiert. Gewisse Unterschiede bezüglich der Verteilung von VL und JL Genen zwischen den Populationen naiver und Gedächtnis-B-Zellen konnten vor Therapie nachgewiesen werden. Insbesondere die bevorzugte Nutzung von Vκ Genen Jκ-proximal in CD27- naive B-Zellen spricht für ein vermindertes „receptor editing“ in dieser Population. Ferner fanden sich in VλJλ-Rearrangements Hinweise für ein vermindertes „receptor editing“ mit einer Überrepräsentation der Jλ2/3 Gensegmente. Die CDR3-Regionen der naiven und Gedächtnis-B-Lymphozyten zeigten unterschiedliche Eigenschaften: die Aktivität der Terminalen-Deoxynucleotidyl-Transferase und Exonuklease im Vλ-Abschnitt (5´) war höher als in Gedächtniszellen. Die B-Zelldepletive Therapie führtete zu signifikanten Veränderungen. So fand sich die Tendenz einer weniger häufigen Nutzung von Jκ-proximal gelegenen Vκ Gensegmenten in der naiven B-Zellpopulation. Einige Vλ Gene, wie z.B. 3p, 3r oder 1g, welche kürzlich in Verbindung mit Rheumafaktor bei Autoimmunerkränkungen beschrieben wurden, waren nach der Therapie nicht mehr nachweisbar. Ebenso verschwanden die unterschiedlichen Eigenschaften der CDR3-Regionen von VλJλ-Rearrangements. Besonders auffällig war das Verhältnis Vκ zu Vλ zugunsten einer häufigeren Nutzung von Vκ Genen in der naiven Population nach Therapie verschoben. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass mittels therapeutischer und vorüber- gehender B-Zell-Depletion durch anti-CD20-Antikörper das Immunglobulingenrepertoire in den beiden untersuchten Patienten moduliert wurde. Messbare Unterschiede fanden sich sowohl im Schwerketten- als auch im Leichtkettenrepertoire. Es erscheint wahrscheinlich, dass diese Veränderungen mit dem beobachteten therapeutischen Ansprechen in Verbindung stehen. Die Ergebnisse stützen die Annahme, dass die Zusammensetzung des B-Zellrepertoires durch die Krankheit beeinflusst wird und für Autoimmunerkrankungen charakteristische Veränderungen mittels B-Zell-Depletion aufgehoben werden können. KW - Rheumatoide Arthritis KW - B-Lymphozyt KW - Abreicherung KW - B-Zellrepertoire KW - Ig-Gene KW - Rituximab KW - B-Zelldepletive Therapie KW - B-cell repertoire KW - Ig genes KW - rituximab KW - anti-CD20 antibody therapy Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9290 ER - TY - THES A1 - Grozdanov, Lubomir Assenov T1 - Analysis of the genome organization and fitness traits of non-pathogenic Escherichia coli strain Nissle 1917 (O6:K5:H1) T1 - Untersuchungen zur Genomorganisation und zur Fitness des apathogener Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (O6:K5:H1) N2 - In the last years more than one hundred microbial genomes have been sequenced, many of them from pathogenic bacteria. The availability of this huge amount of sequence data enormously increases our knowledge on the genome structure and plasticity, as well as on the microbial diversity and evolution. In parallel, these data are the basis for the scientific “revolution” in the field of industrial and environmental biotechnology and medical microbiology – diagnostics and therapy, development of new drugs and vaccines against infectious agents. Together with the genomic approach, other molecular biological methods such as PCR, DNA-chip technology, subtractive hybridization, transcriptomics and proteomics are of increasing importance for research on infectious diseases and public health. The aim of this work was to characterize the genome structure and -content of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (O6:K5:H31) and to compare these data with publicly available data on the genomes of different pathogenic and non-pathogenic E. coli strains and other closely related species. A cosmid genomic library of strain Nissle 1917 was screened for clones containing the genetic determinants contributing to the successful survival in and colonization of the human body, as well as to mediate this strain’s probiotic effect as part of the intestinal microflora. Four genomic islands (GEI I-IVNissle 1917) were identifed and characterized. They contain many known fitness determinants (mch/mcm, foc, iuc, kps, ybt), as well as novel genes of unknown function, mobile genetic elements or newly identified putative fitness-contributing factors (Sat, Iha, ShiA-homologue, Ag43-homologues). All islands were found to be integrated next to tRNA genes (serX, pheV, argW and asnT, respectively). Their structure and chromosomal localization closely resembles those of analogous islands in the genome of uropathogenic E. coli strain CFT073 (O6:K2(?):H1), but they lack important virulence genes of uropathogenic E. coli (hly, cnf, prf/pap). Evidence for instability of GEI IINissle 1917 was given, since a deletion event in which IS2 elements play a role was detected. This event results in loss of a 30 kb DNA region, containing important fitness determinants (iuc, sat, iha), and therefore probably might influence the colonization capacity of Nissle 1917 strain. In addition, a screening of the sequence context of tRNA-encoding genes in the genome of Nissle 1917 was performed to identify genome wide potential integration sites of “foreign” DNA. As a result, similar “tRNA screening patterns” have been observed for strain Nissle 1917 and for the uropathogenic E. coli O6 strains (UPEC) 536 and CFT073. I. Summary 4 The molecular reason for the semi-rough phenotype and serum sensitivity of strain Nissle 1917 was analyzed. The O6-antigen polymerase-encoding gene wzy was identified, and it was shown that the reason for the semi-rough phenotype is a frame shift mutation in wzy, due to the presence of a premature stop codon. It was shown that the restoration of the O side-chain LPS polymerization by complementation with a functional wzy gene increased serumresistance of strain Nissle 1917. The results of this study show that despite the genome similarity of the E. coli strain Nissle 1917 with the UPEC strain CFT073, the strain Nissle 1917 exhibits a specific set of geno- and phenotypic features which contribute to its probiotic action. By comparison with the available data on the genomics of different species of Enterobacteriaceae, this study contributes to our understanding of the important processes such as horizontal gene transfer, deletions and rearrangements which contribute to genome diversity and -plasticity, and which are driving forces for the evolution of bacterial variants. At last, the fim, bcs and rfaH determinats whose expression contributes to the mutlicellular behaviour and biofilm formation of E. coli strain Nissle 1917 have been characterized. N2 - Bislang wurden die kompletten Genomsequenzen von mehr als 100 Bakterien ermittelt. Mehr als ein Drittel dieser Organismen wird als pathogen eingestuft. Die Verfügbarkeit dieser Sequenzinformation vergrößert unser Wissen über die bakterielle Genomstruktur und – plastizität sowie über mikrobielle Diversität und Evolution. Diese Daten bilden die Grundlage für viele Fortschritte auf dem Gebiet der Biotechnologie, der industriellen-, Umwelt- und medizinischen Mikrobiologie: neuartige Typisierung-, Diagnostik- und Therapieansätze sowie die Entwicklung neuer Medikamente und Impfstoffe basieren auf und profitieren von der ständig zunehmenden Menge an DNA-Sequenzen. Genomanalysen sind zusammen mit anderen molekularbiologischen Methoden wie PCR, DNA-Chiptechnologie, subtraktive Hybridisierung und Proteomanalysen von zunehmender Bedeutung für die Erforschung von Infektionskrankheiten und das öffentliche Gesundheitswesen. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Genomstruktur und des Genominhaltes des apathogenen Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (O6:K5:H1) und der Vergleich mit verfügbaren Daten verschiedener pathogener und apathogener E. coli Stämme sowie anderer eng-verwandter Spezies. Eine Cosmid-Genbank des Stammes Nissle 1917 wurde nach Klonen durchsucht, die für Fitnessfaktoren kodieren, welche zur erfolgreichen Kolonisierung des menschlichen Verdauungstraktes und zum probiotischen Charakter dieses Stammes beitragen. Vier genomische Inseln (GEI I-IVNissle 1917) wurden nachgewiesen und charakterisiert. Auf diesen GEIs befinden sich verschiedene bekannte Fitness-Determinanten (mch/mcm, foc, iuc, kps, ybt), bislang nicht charakterisierte ORFs, mobile genetische Elemente und bislang für den Stamm Nissle 1917 nicht beschriebene Gene, die möglicherweise zur Fitness und Adaptabilität dieses Stammes beitragen. Die GEIs I-IVNissle 1917 sind jeweils mit einem tRNAGen assoziiert und ähneln hinsichtlich ihrer Struktur und chromosomalen Lokalisation entsprechenden Inseln im Genom des uropathogenen E. coli Stammes CFT073 (O6:K2(?):H1). Interessanterweise fehlen auf diesen wichtige Virulenzgene uropathogener E. coli (hly, cnf, prf/pap). Eine etwa 30 kb große Region der GEI IINissle 1917, die von IS2 Elementen flankiert wird, kann spontan deletieren, was zum Verlust verschiedener Fitnessdeterminanten (iuc, sat, iha) führt. Darüber hinaus wurde der chromosomale Sequenzkontext von tRNA-Genen mittels PCR auf die Integration von „Fremd-DNA“ hin untersucht, die durch horizontalen Gentransfer erworben wurde (tRNA Screening), und mit denen anderer apathogener und pathogener E. coli Stämme verglichen. Der genomweite Anteil an tRNA-Gen-assoziierter, möglicherweise horizontal erworbener DNA, die im I. Summary 2 apathogenen E. coli K-12 Stamm MG1655 fehlt, unterschied sich dabei nicht bedeutend im Stamm Nissle 1917 und den uropathogenen E. coli O6 Stämmen CFT073 und 536. Die Verbreitung von DNA-Regionen der GEIs des Stammes Nissle 1917 wurde mittels PCR bei apathogenen E. coli-Isolaten sowie bei uropathogenen E. coli O6:K5-Isolaten untersucht. Nur zwei UPEC O6:K5-Isolate enthielten alle GEI-Bereiche, die in diese Untersuchung einbezogen waren, unterschieden sich jedoch vom Stamm Nissle 1917 durch ihre Phänotypen. Die Makrorestriktionsanalyse der Genomstruktur des E. coli Stammes Nissle 1917 zeigte, daß letztere der des uropathogenen E. coli Stammes CFT073 sehr ähnelt. Um die Ursache für den semi-rauhen Phänotyp des Stammes Nissle 1917 zu untersuchen, wurden die wa* und wb* Determinanten dieses Stammes, die für die LPS-Biosynthese verantwortlich sind, kloniert und sequenziert. Das bislang unbekannte Serotyp O6-spezifische O-Antigenpolymerase-kodierende Gen wzy des Stammes Nissle 1917 wurde charakterisiert und mit dem des rauhen O6 Stammes 536 verglichen. Eine Punktmutation, die zu einem vorzeitigen Translationsstop der wzy-Transkripte des Stammes Nissle 1917 führt, wurde als Ursache für den semi-rauhen Phänotyp und damit auch die Serumsensitivität dieses Stammes verantwortlich gemacht. Zur Untersuchung der Kolonisierungsfähigkeit des E. coli Stammes Nissle 1917 wurden verschiedene Faktoren, die an der Biofilmbildung bzw. am multizellulären Verhalten beteiligt sind, sequenziert und näher analysiert. Die Seqenzierung der fim Determinante zeigte, daß das fimB Gen, das für die Expression der Typ 1-Fimbrien benötigt wird, durch die Insertion eines IS-Elementes inaktiviert wurde. Untersuchungen zum multizellulären Verhalten zeigten, daß der Stamm Nissle 1917 den sogenannten „rdar“ Morphotyp, hervorgerufen durch Expression von Curli-Fimbrien und Cellulose, bei 30 °C und bei 37 °C exprimiert, nicht jedoch die uropathogenen E. coli Stämme 536 und CFT073. Das Cellulosebiosynthese-Operon (bcs) sowie das Gen rfaH, das für einen Transkriptionsantiterminator kodiert, wurden im Stamm Nissle 1917 inaktiviert, um deren Bedeutung für den „rdar“ Morphotyp zu untersuchen. Während Cellulose für die Expression des „rdar“ Morphotyps benötigt wird, hatte die rfaHInaktivierung keinen Einfluß auf dieses mulizelluläre Verhalten des E. coli Stammes Nissle 1917. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß der apathogene E. coli Stamm Nissle 1917 durch eine spezifische Kombination phänotypischen Eigenschaften gekennzeichnet ist, die ihn von anderen bislang untersuchten E. coli Stämmen unterscheidet. An der Evolution dieses Stammes, möglicherweise aus einem pathogenen „Vorfahren“, waren vielfältige Gentransfer- und Deletionsprozesse sowie Punktmutationen beteiligt. KW - Escherichia coli KW - Genanalyse KW - Escherichia coli KW - Genomorganisation KW - Escherichia coli KW - genome organization Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9304 ER - TY - THES A1 - Henn, Julian T1 - The electron density : a bridge between exact quantum mechanics and fuzzy chemical concepts T1 - Die Elektronendichte: Eine Brücke zwischen exakter Quantenmechanik und unscharfen chemischen Konzepten N2 - Summary The nature of the chemical bond is a topic under constant debate. What is known about individual molecular properties and functional groups is often taught and rationalized by explaining Lewis structures, which, in turn, make extensive use of the valence concept. The valence concept distinguishes between electrons, which do not participate in chemical interactions (core electrons) and those, which do (single, double, triple bonds, lone-pair electrons, etc.). Additionally, individual electrons are assigned to atomic centers. The valence concept is of paramount success: It allows the successful planning of chemical syntheses and analyses, it explains the behavior of individual functional groups, and, moreover, it provides the “language” to think of and talk about molecular structure and chemical interactions. The resounding success of the valence concept may be misleading to forget its approximative character. On the other hand, quantum mechanics provide in principle a quantitative description of all chemical phenomena, but there is no discrimination between electrons in quantum mechanics. From the quantum mechanical point of view there are only indistinguishable electrons in the field of the nuclei, i.e., it is impossible to assign a given electron to a particular center or to ascribe a particular purpose to individual electrons. The concept of indistinguishability of micro particles is founded on the Heisenberg uncertainty relation, which states, that wavepackets diverge in the 6N dimensional phase space, such that individual trajectories can not be identified. Hence it is a deep-rooted and approved physical concept. As an introduction to the present work density partitioning schemes were discussed, which divide the total molecular density into chemically meaningful areas. These partitioning schemes are intimately related to either the concepts of bound atoms in a molecule (as in the Atoms In Molecules theory (AIM) according to Bader or as in the Hirshfeld partitioning scheme) or to the concept of chemical structure in the sense of Lewis structures, which divide the total molecular density into core and valence density, where the valence density is split up again into bonding and non-bonding electron densities. Examples are early and recent loge theories, the topological analysis by means of the Electron Localization Function (ELF), and the Natural Bond Orbital (NBO) approach. Of these partitioning schemes, the theories according to Bader (AIM), to Becke and Edgecomb (ELF) and according to Weinhold (NBO and Natural Resonance Theory, NRT), respectively, were reviewed in detail critically. Points of criticism were explicated for each of the mentioned theories. Since theoretically derived electron densities are to be compared to experimentally derived densities, a brief introduction into the theory of X-ray di®raction experiments was given and the multipole formalism was introduced. The procedure of density refinement was briefly discussed. Various suggestions for improvements were developed: One strategy would be the employment of model parameters, which are to a maximum degree mutually orthogonal, with the object of minimizing correlations among the model parameters, e.g., to introduce nodal planes into the radial functions of the multipole model. A further suggestion involves the guidance of the iterative refinement procedure by an extremum principle, which states, that when di®erent solutions to the least squares minimization problem are available with about the same statistical measures of quality and with about the same residual density, then the solution is to prefer, which yields a minimum density at the bond critical point (BCP) and a maximum polarity in terms of the ratio of distances between the BCP and the nuclei. This suggestion is based on the well known fact, that the bond polarity (in terms of the ratio of distances between the BCP and the respective nuclei) is underestimated in the experiment. Another suggestion for including physical constraints is the explicit consideration of the virial theorem, e.g., by evaluating the integration of the Laplacian over the entire atomic basins and comparing this value to zero and to the value obtained from the integration of the electron gradient field over the atomic surface. The next suggestion was to explicitly use the electrostatic theorem of Feynman (often also denoted as Hellmann-Feynman theorem), which states, that the forces onto the nuclei can be calculated from the purely classical electrostatic forces of the electron distribution and the nuclei distribution. For a stationary system, these forces must add to zero. This also provides an internal quality criterion of the density model. This can be performed in an iterative way during the refinement procedure or as a test of the final result. The use of the electrostatic theorem is expected to reduce significantly correlations among static density parameters and parameters describing vibrations, since it is a valuable tool to discriminate between physically reasonable and artificial static electron densities. All of these mentioned suggestions can be applied as internal quality criteria. The last suggestion is based on the idea to initiate the experimental refinement with a set of model parameters, which is, as much as possible close to the final solution. This can be achieved by performing periodic boundary conditions calculations, from which theoretically created files are obtained, which contain the Miller indices (h, k, l) and the respective intensity I. This file is used for a model parameter estimation (refinement), which excludes vibrations. The resulting parameters can be used for the experimental refinement, where, in a first step, the density parameters are fixed to determine the parameters describing vibrations. For a fine tuning, again the electrostatic theorem and the other above mentioned suggestions could be applied. Theoretical predictions should not be biased by the method of computation. Therefore the dependence of the density analyzing tools on the level of calculation (method of calculation/basis set) and on the substituents in complex chemical bonding situations were evaluated in the second part of the present work. A number of compounds containing formal single and double sulfur nitrogen bonds was investigated. For these compounds, experimental data were also available. The calculated data were compared internally and with the experimental results. The internal comparison was drawn with regard to questions of convergency as well as with regard to questions of consistency: The resulting molecular properties from NBO/NRT analyses were found to be very stable, when the geometries were optimized at the respective level of theory. This stability is valid for variations in the methods of calculation as well as for variations in the basis set. Only the individual resonance weights of the contributing Natural Lewis Structures differed considerably depending on the level of calculation and depending on the substituents. However, the deviations were in both cases to a large extent within a limit which preserves the descending order of the leading resonance structure weights. The resulting bond orders, i.e., the total, covalent and ionic bond order from NRT calculations, were not affected by the shift in the resonance weights. The analysis of the bond topological parameters resulted in a discrimination between insensitive parameters and sensitive parameters. The stable parameters do neither depend strongly on the method of calculation nor on the basis set. Only minor variation occurs in the numerical values of these parameters, when the level of calculation is changed or even when other functional groups (H, Me, or tBu) are employed, as long as the methods of calculation do not drop considerably below a standard level. The bond descriptors of the sulfur nitrogen bonds were found to be also stable with respect to the functional groups R = H, R = Me, and R = tBu. Stable parameters are the bond distance, the density at the bond critical point (BCP) and the ratio of distances between the BCP and the nuclei A and B, which varies clearly when considering the formal bond type. For very small basis sets like the 3-21G basis set, this characteristic stability collapses. The sensitive parameters are based on the second derivatives of the density with respect to the coordinates. This is in accordance with the well known fact, that the total second derivative of the density with respect to the coordinates is a strongly oscillating function with positive as well as negative values. A profound deviation has to be anticipated as a consequence of strong oscillations. lambda3, which describes the local charge depletion in the direction of the interaction line, is the most varying parameter. A detailed analysis revealed that the position of the BCP in the rampant edge of the Laplacian distribution is responsible for the sensitivity of the numerical value of lambda3 in formal double bonds. Since the slope of the Laplacian assumes very high values in its rampant edge, a tiny displacement of the BCP leads already to a considerable change in lambda3. This instability is not a failure of the underlying theory, but it yields de facto to a considerable dependence of sensitive bond topological properties on the method of calculation and on the applied basis sets. Since the total second derivative is important to judge on the nature of the bond in the AIM theory (closed shell interactions versus shared interactions), the changes in lambda3 can lead to differing chemical interpretations. The comparison of theoretically derived bond topological properties of various sulfur nitrogen bonds provides the possibility to measure the self consistency of this data set. All data sets clearly exhibit a linear correlation between the bond distances and the density at the BCP on one hand and between the bond distances and the Laplacian values at the BCP on the other hand. These correlations were almost independent of the basis set size. In this context, the linear regression has to be regarded exclusively as a descriptive statistics tool. There is no correlation anticipated a priori. The formal bond type was found to be readily deducible from the theoretically obtained bond topological descriptors of the model systems. In this sense, the bond topological properties are self consistent despite of the numerical sensitivity of the derivatives, as exemplified above. Often, calculations are performed with the experimentally derived equilibrium geometries and not with optimized ones. Applying this approach, the computationally costly geometry optimizations are saved. Following this approach the bond topological properties were calculated using very flexible basis sets and employing the fixed experimental geometry (which, of course, includes the application of tBu groups). Regression coe±cients similar to those from optimized geometries were obtained for correlations between bond distances and the densities at the BCP as well as for the correlation between bond distances and the Laplacian at the BCP, i.e. the approach is valid. However, the data points scattered less and the coe±cient of correlation was clearly increased when geometry optimizations were performed beforehand. The comparison between data obtained from theory and experiment revealed fundamental discrepancies: In the data set of bond topological parameters from the experiment, the behavior of only 2 out of 3 insensitive parameters was comparable to the behavior of the theoretically obtained values, i.e. theoretical and experimental bond distances as well as theoretical and experimental densities at the BCP correlate. From the theoretically obtained data it was easy to deduce the formal bond type from the position of the BCP, since it changed in a systematic manner. The respective experimentally obtained values were almost constant and did not change systematically. For the SN bonds containing compounds, the total second derivative assumes exclusively negative values in the experiment. Due to the different internal behavior, experimentally and theoretically sensitive bond topological values could not be compared directly. The qualitative agreement in the Laplacian distribution, however, was excellent. In the third and last part of this work, the application to chemical systems follows. Formal hypervalent molecules, i.e. molecules where some atoms are considered to hold more than 8 electrons in their valence shell, were investigated. These were compounds containing sulfur nitrogen bonds (H(NtBu)2SMe, H2C{S(NtBu)2(NHtBu)}2, S(NtBu)2 and S(NtBu)3) and a highly coordinated silicon compound. The set of sulfur nitrogen compounds also contained a textbook example for valence expansion, the sulfur triimide. For these molecules, experimental reference values were available from high resolution X-ray experiments. The experimental results were in the case of the sulfur triimide not unique. Furthermore, from the experimental bond topological data no definite conclusion about the formal bonding type could be drawn. The situation of sulfur nitrogen bonds in the above mentioned set of molecules was analyzed in terms of a geometry discussion and by means of a topological analysis. The methyl-substituted isolated molecules served as model compounds. For the interpretation of the bonding situation additional NBO/NRT calculations were preformed for the sulfur nitrogen compounds and an ELF calculation and analysis was performed for the silicon compound. The ELF analysis included not only the presentation and discussion of the ELF-isosurfaces (eta = 0.85), but also the investigation of populations of disynaptic valence basins and the percentage contributions to these populations of the individual atoms when the disynaptic valence basins are split into atomic contributions according to Bader’s partitioning scheme. The question of chemical interest was whether hypervalency is present in the set of molecules or not. In the first case the octet rule would be violated, in the second case Pauling’s verdict would be violated. While the concept of hypervalency is well established in chemistry, the violation of Pauling’s verdict is not. The quantitative numbers of the sensitive bond topological values from theory and experiment were not comparable, since no systematic relationship between the experimentally and theoretically determined sensitive bond descriptors was found. However, the insensitive parameters are in good agreement and the qualitative Laplacian distribution is, with few exceptions, in excellent agreement. The formal bonding type was deduced from experimental and theoretical topological data by considering the number and shape of valence shell charge concentrations in proximity to the sulfur and nitrogen centers. The results from NBO/NRT calculations confirmed the findings. All employed density analyzing tools AIM, ELF and NBO/NRT coincided in describing the bonding situation in the formally hypervalent molecules as highly polar. A comparison and analysis of experimentally and theoretically derived electron densities led consistently to the result, that regarding this set of molecules, hypervalency has to be excluded unequivocally. N2 - Zusammenfassung Die Natur der chemischen Bindung ist ein viel und häufig auch sehr kontrovers diskutiertes Thema. In der Chemie werden Moleküleigenschaften und Eigenschaften funktionaler Gruppen oft anhand von Lewis-Strukturen rationalisiert. Lewis-Strukturen bauen auf dem Valenzkonzept auf, welches besagt, dass man zwischen Elektronen unterscheiden kann, die an chemischen Reaktionen nicht teilnehmen (Kernelektronen) und solchen, die sich z.B. als bindende Elektronen oder als nicht-bindende Elektronen an chemischen Prozessen beteiligen. Zusätzlich ermöglicht das Valenzkonzept die Zuordnung individueller Elektronen zu einzelnen atomaren Zentren im Molekül. Das Valenzkonzept ist sehr erfolgreich und überaus praktisch. Es erlaubt die zuverlässige Planung von chemischen Synthesen und Analysen, mit ihm lässt sich das charakteristische Verhalten funktioneller Gruppen erkl¨ ären. Das Valenzkonzept stellt eine Sprache bereit, in der es sich sehr gut über Molekülstrukturen und chemische Wechselwirkungen nachdenken und kommunizieren lässt. Der überwältigende Erfolg des Valenzkonzepts kann irrtümlich dazu verleiten dessen approximativen Charakter zu vergessen. In der Quantenmechanik hingegen, die eine physikalische Grundlage aller chemischen Prozesse darstellt und die im Prinzip alle chemischen Phänomene quantitativ beschreiben kann, gibt es keine Unterscheidungsmöglichkeit der Elektronen. Im Gegensatz zum Valenzkonzept geht die Quantenmechanik von ununterscheidbaren Elektronen aus, die sich im Feld der Kerne bewegen. Das bedeutet, dass es quantenmechanisch unmöglich ist individuelle Elektronen einzelnen Zentren oder bestimmten Aufgaben zuzuordnen. Die Ununterscheidbarkeit von Mikroteilchen beruht letztendlich auf der Heisenbergschen Unschärferelation, die besagt, dass Wellenpakete in einem 6N-dimensionalen Phasenraum (3N Ortskoordinaten und 3N Impulskoordinaten von N Teilchen) auseinanderlaufen, so dass im Gegensatz zur klassischen Mechanik keine Teilchen anhand ihrer individuellen Bahnen verfolgt und identifiziert werden k¨onnen. Im einleitenden ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Analysemethoden vorgestellt, die die Partitionierung einer Gesamtelektronendichte in chemisch relevante Bereiche erlauben. Sie sind eng verknüpft entweder mit dem Konzept des im Molekül gebundenen Atoms (Baders Atoms in Molecules, AIM und Hirshfelds Partitionierungsschema) oder mit dem Konzept der chemischen Struktur im Sinne von Lewis-Strukturen, in denen die Gesamtdichte in Kern- und Valenzdichte unterteilt ist und diese wiederum in Bindungselektronendichte und nicht-bindende Elektronendichte. Beispiele hierfür sind frühe und auch aktuelle "Loge" Theorien, die topologische Analyse der Electron Localization Function (ELF) und die Natural Bond Orbital (NBO) Analyse. Aus den vorgestellten Partitionierungsschemata wurden die Theorien von Bader (AIM), Becke und Edgecomb (ELF) und Weinhold (NBO und Natural Resonance Theory, NRT) detaillierter vorgestellt und Kritikpunkte erläutert. Da in der vorliegenden Arbeit berechnete Elektronendichten mit experimentell bestimmten Elektonendichten verglichen werden, wurde eine kurze Einführung in Röntgenbeugungsexperimente und in das Multipolmodell gegeben. Es folgte eine kurze Beschreibung der Dichteverfeinerung und einige Verbesserungsorschläge: Eine mögliche Strategie mit dem Ziel, Korrleationen zwischen den Modellparametern zu minimieren, ist die Verwendung von Modellparametern, die zu einem maximalen Grade wechselseitig orthogonal sind. Ein Beispiel hierfür sind die Radialfunktionen des Multipolmodells, die zu einem erheblichen Teil denselben Raumbereich beschreiben, da sie keine Knotenflächen aufweisen. Mit der Einführung von Knortenflächen werden Korrelationen zwischen einzelnen Multipolpopulationen und Skalierungsfaktoren, sowie zwischen Schwingungen beschreibenden Parametern und Parametern, die die statische Elektronendichteverteilung beschreiben verringert. Ein weiterer Vorschlag beruht auf der Anwendung eines Extremalprinzips. Dieses tritt in Kraft, wenn es zu dem Kleinst-Quadrate Minimierungsproblem verschiedene Lösungen gibt, die sich anhand ihrer statistischen Gütemaße und ihrer Residualdichten nicht wesentlich unterscheiden. Das Extremalprinzip besagt, dass diejenige Lösung zu bevorzugen ist, die die kleinsten Dichtewerte am bindungskritischen Punkt ausfweist und die zugleich am stärksten polar ist. Die Polarität der Bindung wird in diesem Zusammenhang durch das Verhältnis der Abstände vom bindungskritschen Punkt zu den Kernorten ausgedrückt. Dieser Vorschlag beruht auf der bekannten Tatsache, dass experimentelle Ergebnisse eine Tendenz zum Unterschätzen der Bindungspolarität aufweisen. Eine weitere Möglichkeit zur Berücksichtigung physikalischer Randbedingungen ist die explizite Einbindung des Virialtheorems, d.h., die Integration der zweiten Ortsableitung über das atomare Bassin und die Integration des Elektronendichtegradienten auf der das Bader-Atom begrenzenden Fläche müssen beide identisch verschwinden. Die Abweichung voneinander und vom Wert Null kann als internes Gütekriterium des Dichtemodells dienen. Ein weiterer Vorschlag involviert das elektrostatische Theorem von Feynman, das oft auch Hellmann-Feynman Theorem genannt wird. Es besagt, dass die elektrostatischen Kräfte, die auf die Kerne im Molekül wirken ganz einfach klassisch berechnet werden dürfen und für eine stabile Born-Oppenheimer-Konfiguration der Kerne identisch verschwinden. Hiermit ergibt sich eine einfache Möglichkeit, eine gegebene statische Kern- und Elektronendichteverteilung auf ihre physikalische Plausibilität hin zu untersuchen. Dies kann iterativ im Verfeinerungsprozess geschehen oder als Test des finalen Modells. Darüberhinaus darf man von der Verwendung des elektrostatischen Theorems eine weitgehende Entkopplung von dichte- und schwingungsbeschreibenden Parametern erwarten, da im elektrostatischen Theorem statische Gleichgewichtsverteilungen vorausgesetzt wurden. Weiterhin könnten als Startwerte für die experimentelle Verfeinerung Modellparameter verwendet werden, die schon so nah wie möglich an der Lösung des Kleinst-Quadrate Problems liegen. Das wird erreicht, indem mit Berechnungen, die periodische Randbedingungen berücksichtigen, ein h, k, l, I-File erzeugt wird (also Reflexindizierung und Intensitäten), welches als Grundlage einer konventionellen hochauflösenden Verfeinerung verwendet wird. Der Vorteil dieses Files ist, dass es weder von Schwingungen noch von Rauschen berührt wird. Die resultierenden Modellparameter werden dann zur Verfeinerung eines Modells aufgrund der experimentellen h, k, l, I-Daten verwendet, wobei im ersten Schritt nur schwingungsbeschreibende Terme verfeinert werden. Wenn das Ergebnis noch nicht zufriedenstellend ist, können die oben genannten Verbesserungsvorschläge zur Feinabstimmung herangezogen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde im Rahmen einer Evaluierungstudie die Methoden-, Basissatz-, und Substituentenabhängigkeit ausgewählter Analysewerkzeuge in der Beschreibung komplexer chemischer Bindungen untersucht. Als Testsysteme dienten eine Reihe von Schwefel Sticksto®verbindungen mit formalen Einfach- und Doppelbindungen, die zudem inter- und intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden. Für diese Testsysteme liegen experimentelle Vergleichswerte vor. Die berechneten Daten wurden sowohl miteinander als auch mit den experimentell bestimmten Werten verglichen. Der interne Vergleich wurde sowohl im Hinblick auf Konvergenz- als auch auf Konsistenzfragen gezogen. Die berechneten Eigenschaften aus der NBO/NRT Analyse sind für auf dem jeweiligen Berechnungsniveau optimierte Molekülgeometrien generell sehr stabil, sowohl was die Basissatz- als auch die Methodenabhängigkeit betrifft. Eine Ausnahme sind die Resonanzgewichte der natürlichen Lewis-Strukturen aus NRT Rechnungen. Die numerischen Werte der Resonanzstrukturen zeigten zum Teil erheblich unterschiedliche Werte. Die Schwankungen sind jedoch weitgehend innerhalb der Grenze, die eine Vertauschung in der Reihenfolge der führenden Gewichte ausschließt. Die Bindungseigenschaften, wie z.B. die totale, kovalente und ionische Bindungsordnung sind von den Gewichtungsunterschieden nicht betroffen. Die Analyse der bindungstopologischen Daten führte zu einer Unterscheidung zwischen stabilen und sensitiven Parametern. Die stabilen Parameter sind in erster Näherung methoden- und basissatzunempfindlich. Sie variieren wenig, wenn Basissätze und Rechenmethoden gewechselt werden oder wenn bei der Berechnung unterschiedliche Substituenten verwendet werden, solange die verwendeten Methoden ein Standard-Niveau nicht unterscheiden. Mit Bezug auf die verschiedenen Substituenten R = H, Me und R = tBu haben sich die die Schwefel Stickstoffbindungen beschreibenden Parameter als unempfindlich herausgestellt. Die stabilen Parameter sind die Bindungslänge, die Dichte am bindungskritischen Punkt und das Verh¨altnis der Abstände des bindungskritischen Punktes zu den Kernen A und B der Bindungspartner, welche auffällig mit dem formalen Bindungstyp korrelieren. Für sehr kleine Basissätze, wie z.B. den 3-21G Basissatz, ist die Stabilität der Abstandsverhältnisse nicht mehr gegeben. Die sensitiven Parameter beruhen auf der zweiten Ortsableitung. Dies ist im Einklang mit der Tatsache, dass die zweite Ortsableitung eine stark oszillierende Funktion ist, weswegen für die zweite Ortsableitung größere numerische Schwankungen zu erwarten sind. Der am stärksten veränderliche Parameter ist lambda3. Eine genaue Analyse ergab, dass die Sensitivität von lambda3 in formalen Doppelbindungen auf die Lage des bindungskritischen Punktes in einer steilen Flanke der zweiten Ortsableitung zurückzuführen ist. Da die Steigung des Laplacewertes in der Flanke sehr groß wird, genügt schon eine winzige Verschiebung des bindungskritischen Punktes, um erhebliche Veränderungen im Wert von lambda3 herbeizuführen. Diese Instabilität darf nicht zu Kritik an der Theorie führen, jedoch verursacht sie de facto eine erhebliche Methoden- und Basissatzabhängigkeit der sensitiven topologischen Parameter. Da innerhalb der AIM-Theorie das Vorzeichen des Laplacewertes am bindungskritischen Punkt über die Natur der chemischen Wechselwirkung entscheidet (“closed-shell interactions” versus “shared interactions”) kann diese Interpretation sich von einem Berechnungsniveau zum anderen unterscheiden. Der Vergleich bindungstopologischer Daten von unterschiedlichen Schwefel Stickstoffbindungen, bietet die Möglichkeit zur Überprüfung der Konsistenz des Datensatzes. Die Datensätze zeigen eine lineare Korrelation zwischen den Bindungslängen und der jeweiligen Dichte am bindungskritischen Punkt sowie zwischen den Bindungslängen und der totalen zweiten Ableitung am bindungskritischen Punkt, nahezu unabhängig von der Güte der verwendeten Basissätze. Die lineare Regression ist hierbei lediglich als einfachste Anwendung deskriptiver Statistik zu betrachten und beinhaltet keine Modellbildung. Die bindungstopologischen Daten aus den Modellrechnungen lassen im Allgemeinen auf den zugrundeliegenden formalen Bindungstyp schließen. Es wurde festgestellt, dass die bindungstopologischen Daten aus den Modellrechnungen in diesem Sinne konsistent sind, trotz der oben genannten numerischen Instabilitäten der zweiten Ortsableitungen. In der Fachliteratur wird oft von Rechnungen berichtet, die mit der festgehaltenen experimentellen Gleichgewichtsgeometrie durchgef¨uhrt wurden, woduch die aufwendige Geometrioptimierung umgangen werden kann. Dieser Annäherung folgend, wurden die bindungstopologischen Eigenschaften der Schwefel Stickstoffverbindungen unter Benutzung von sehr flexiblen Basissätzen und bei festgehaltener experimenteller Geometrie berechnet. Die Regressionskoeffizienten betreffend die Korrelation zwischen Bindungsabstand und Dichte am b indungskritischen Punkt (BCP) sowie zwischen Bindungsabstand und Laplacewert am BCP waren denen von optimierten Geometrien sehr ähnlich, was die oben eingeführte Näherung rechtfertigt. Allerdings waren die Korrelationskoe±zienten bei gleichem Basissatz und bei gleicher Rechenmethode im Fall von zuvor optimierten Geometrien deutlich erhöht. Der Vergleich der Theoriewerte mit den experimentell erhaltenen Daten zeigt wesentliche Unterschiede zwischen beiden auf: Von den 3 stabilen Parametern aus der Analyse der theoretisch bestimmten Bindungscharakteristika erscheinen nur 2 auch in den experimentellen Daten als stabil, d.h., die theoretischen und experimentellen Bindungsabstände sowie die theoretischen und experimentellen Dichten am bindungskritischen Punkt korrelieren jeweils miteinander. Aus den theoretischen Daten (Verhältnis der Bindungspfadlängen vom bindungskritischen Punkt zu den Kernen der Bindungspartner) ließ sich der formale Bindungstyp leicht erschließen, während die entsprechenden Werte in den experimentell erhaltenen Daten keinen Rückschluss auf den formalen Bindungstyp erlaubten, da sie sich nicht systematisch änderten. Die totale zweite Ortsableitung der Dichte nimmt in den experimentellen Daten der Schwefel Stickstoffverbindungen ausschließlich negative Werte an. Durch diesen Unterschied im internen Verhalten der sensitiven Parameter am BCP konnte kein systematischer Zusammenhang zwischen diesen experimentell und theoretisch erhaltenen Werten gefunden werden. Die qualitative Übereinstimmung in der Verteilung der Laplacewerte war jedoch exzellent. Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit folgen die Anwendungen auf chemische Fragestellungen. Es wurden formal hypervalente Moleküle, d.h.Verbindungen, in welchen manche Atome formal von mehr als 8 Valenzelektronen umgeben sind, untersucht. Es handelt sich um eine Reihe von Schwefel Sticksto®verbindungen (H(NtBu)2SMe, H2C{S(NtBu)2(NHtBu)}2, S(NtBu)2 und S(NtBu)3) und um eine Siliziumverbindung mit 6-fach koordiniertem Si. Unter den untersuchten Schwefel Stickstoffverbindungen ist auch ein Lehrbuchbeispiel für Valenzaufweitung, das Schwefeltriimid. Für diese Verbindungen lagen experimentelle Daten aus einer hochauflösenden Multipolverfeinerung vor. Der experimentelle Befund war besonders im Hinblick auf das Schwefeltriimid nicht eindeutig. Weiterhin konnte, wie bereits oben erwähnt von den bindungstopologischen Daten nicht auf den zugrundeliegenden formalen Bindungstyp geschlossen werden. Die Bindungssituation der interessierenden Schwefel Stickstoffbindungen wurde zunächst anhand der Geometrie und dann aufgrund der topologischen Eigenschaften der Elektronendichte diskutiert. Die methylsubstituierten isolierten Moleküle dienten dabei als Modell. Zur Interpretation der SN Bindungssituation wurden zusätzlich NBO/NRT Berechnungen durchgeführt und für die hochkoordinierte Siliziumverbindung wurden zusätzlich ELF Berechnungen angewendet. Die ELF Analyse umfasste nicht nur die Berechnung und Darstellung von ELF-Isofl ächen (eta = 0.85), sondern auch die Berechnung und Aufteilung der Elektronenpopulation der disynaptischen Valenzbassins, wobei zur Aufteilung das Partitionierungsschema von Bader verwendet wurde. Die chemisch relevante Fragestellung war dabei ob bei den betrachteten Molekülen Hypervalenz vorliegt oder nicht. Im Falle vorliegender Hypervalenz wäre die Oktettregel verletzt, wenn keine Hypervalenz vorliegen würde müssten formale Ladungen eingeführt werden, was eine Verletzung des Verdiktes von Pauling darstellt. Wie oben beschrieben, konnten die empfindlichen bindungstopologischen Werte von Theorie und Experiment nicht direkt miteinander verglichen werden, da kein systematischer Zusammenhang zwischen ihnen zu bestehen scheint. Die unempfindlichen Parameter waren jedoch in guter Übereinstimmung und die qualitative Laplaceverteilung in den meisten Fällen exzellent. Der formale Bindungstyp wurde aus den experimentell und theoretisch zugänglichen Daten abgeleitet, indem die Anzahl und Lage der Valenzschalen-Ladungskonzentrationen (Valence shell charge concentrations, VSCC) in der Umgebung der Schwefel und Stickstoffkerne beschrieben und verglichen wurde. Die Berechnungen an den Modellsystemen bekräftigten den Befund. Alle Methoden, die zur Analyse der Dichte herangezogen wurden, namentlich die AIM Theorie, die ELF Analyse, die NBO und die NRT Berechnungen führten übereinstimmend zu dem Ergebnis, dass die betreffenenden Bindungen als zu einem hohen Grad polar zu beschreiben sind. Der Vergleich und die Analyse von theoretischen und experimentellen Dichten führte damit gleichermaßen zu dem Ergebnis, dass Hypervalenz in dem betrachteten Satz von Molekülen definitiv ausgeschlossen werden muss. KW - Elektronendichtebestimmung KW - Vergleich KW - Chemische Bindung KW - Theorie KW - Elektronendichte KW - topologische Analyse KW - Dichtebestimmung in Theorie und Experiment KW - Electron density KW - topological analysis KW - experimental and theoretical determination of electron density Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9003 ER - TY - THES A1 - Rapp, Ulrike T1 - Achieving protective immunitity against intracellular bacterial pathogens : a study on the efficiency of Gp96 as a vaccine carrier T1 - Immunisierung gegen intrazelluläre Bakterien mit Hilfe von HSP-Fusionsproteinen N2 - Protective vaccination against intracellular pathogens using HSP fusion proteins in the listeria model. N2 - Impfschutz gegen intrazelluläre Pathogene durch Immunisierung mit HSP-Fusionsproteinen im listerien Modell. KW - Listeria monocytogenes KW - Immunisierung KW - Hitzeschock-Proteine KW - Hitzeschockproteine KW - Immunsierung KW - Intrazelluläre Pathogene KW - Heat Shock Proteins KW - Immunization KW - Intracellular Pathogens Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9096 ER - TY - THES A1 - Wollmershäuser, Timo T1 - A theory of managed floating T1 - Eine Theorie des Managed Floatings N2 - After the experience with the currency crises of the 1990s, a broad consensus has emerged among economists that such shocks can only be avoided if countries that decided to maintain unrestricted capital mobility adopt either independently floating exchange rates or very hard pegs (currency boards, dollarisation). As a consequence of this view which has been enshrined in the so-called impossible trinity all intermediate currency regimes are regarded as inherently unstable. As far as the economic theory is concerned, this view has the attractive feature that it not only fits with the logic of traditional open economy macro models, but also that for both corner solutions (independently floating exchange rates with a domestically oriented interest rate policy; hard pegs with a completely exchange rate oriented monetary policy) solid theoretical frameworks have been developed. Above all the IMF statistics seem to confirm that intermediate regimes are indeed less and less fashionable by both industrial countries and emerging market economies. However, in the last few years an anomaly has been detected which seriously challenges this paradigm on exchange rate regimes. In their influential cross-country study, Calvo and Reinhart (2000) have shown that many of those countries which had declared themselves as ‘independent floaters’ in the IMF statistics were charaterised by a pronounced ‘fear of floating’ and were actually heavily reacting to exchange rate movements, either in the form of an interest rate response, or by intervening in foreign exchange markets. The present analysis can be understood as an approach to develop a theoretical framework for this managed floating behaviour that – even though it is widely used in practice – has not attracted very much attention in monetary economics. In particular we would like to fill the gap that has recently been criticised by one of the few ‘middle-ground’ economists, John Williamson, who argued that “managed floating is not a regime with well-defined rules” (Williamson, 2000, p. 47). Our approach is based on a standard open economy macro model typically employed for the analysis of monetary policy strategies. The consequences of independently floating and market determined exchange rates are evaluated in terms of a social welfare function, or, to be more precise, in terms of an intertemporal loss function containing a central bank’s final targets output and inflation. We explicitly model the source of the observable fear of floating by questioning the basic assumption underlying most open economy macro models that the foreign exchange market is an efficient asset market with rational agents. We will show that both policy reactions to the fear of floating (an interest rate response to exchange rate movements which we call indirect managed floating, and sterilised interventions in the foreign exchange markets which we call direct managed floating) can be rationalised if we allow for deviations from the assumption of perfectly functioning foreign exchange markets and if we assume a central bank that takes these deviations into account and behaves so as to reach its final targets. In such a scenario with a high degree of uncertainty about the true model determining the exchange rate, the rationale for indirect managed floating is the monetary policy maker’s quest for a robust interest rate policy rule that performs comparatively well across a range of alternative exchange rate models. We will show, however, that the strategy of indirect managed floating still bears the risk that the central bank’s final targets might be negatively affected by the unpredictability of the true exchange rate behaviour. This is where the second policy measure comes into play. The use of sterilised foreign exchange market interventions to counter movements of market determined exchange rates can be rationalised by a central bank’s effort to lower the risk of missing its final targets if it only has a single instrument at its disposal. We provide a theoretical model-based foundation of a strategy of direct managed floating in which the central bank targets, in addition to a short-term interest rate, the nominal exchange rate. In particular, we develop a rule for the instrument of intervening in the foreign exchange market that is based on the failure of foreign exchange market to guarantee a reliable relationship between the exchange rate and other fundamental variables. N2 - Auf modelltheoretischer Ebene wird die Diskussion geld- und währungspolitischer Strategien von den beiden Randlösungen absolut fester Wechselkurse und frei-flexibler Wechselkurse geprägt. In der Realität allerdings stellen diese beiden Strategien eher die Ausnahme als die Regel dar. Während die traditionelle einseitige Wechselkursanbindung zunehmend an Bedeutung verliert, entscheidet sich eine wachsende Anzahl von Ländern, insbesondere kleine und offene Emerging Market Volkswirtschaften, für eine zunehmende Flexibilisierung ihres Wechselkursregimes. Allerdings ist die Bereitschaft, den Wechselkurs vollkommen den freien Kräften des Marktes zu überlassen, sehr eingeschränkt. Dafür sprechen insbesondere zwei stilisierte Fakten: Zum einen greifen Notenbanken direkt am Devisenmarkt mit sterilisierte Käufen und Verkäufen von Fremdwährung ein. Zum anderen versuchen Notenbanken indirekt mit ihrem Zinsinstrument Einfluss auf den Verlauf des Wechselkurses zu nehmen, indem sie auf seine Veränderungen mit Anpassungen der Zinsen reagieren. Während die Literatur in beiden Fällen von einem System des Managed Floatings spricht, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit Ersteres als direktes Managed Floating, und Letzteres als indirektes Managed Floating bezeichnet. Gemeinsames Merkmal beider Formen des Managed Floatings ist, dass für sie im Rahmen makroökonomischer Modelle offener Volkswirtschaften keine Rechfertigung abzuleiten ist. Insbesondere Neukeynesianische bzw. Neokeynesianische Modelle, auf deren Grundlage moderne Geldpolitik diskutiert wird, kommen zu dem Ergebnis, dass eine geeignete Zinspolitik auf Basis frei-flexibler Wechselkurse (also ohne direkte Devisenmarktinterventionen und ohne indirekte Beeinflussung durch Zinsen) zu einer bestmöglichen Stabilisierung der Volkswirtschaft beiträgt. Die entscheidende Annahme, die diesem Ergebnis zugrunde liegt, ist, dass sich der Wechselkurs auf effizienten Devisenmärkten und gemäß eines klar definierten Wechselkursmodells bildet. Normalerweise wird daher in den meisten Modellen die Gültigkeit der ungedeckten Zinsparität unterstellt. Empirische Untersuchungen kommen allerdings regelmäßig und mit überraschender Eindeutigkeit zu dem Befund, dass der Zusammenhang zwischen Zinsen und Wechselkurs entsprechend der ungedeckten Zinsparität bei flexiblen Wechselkursen statistisch nicht nachweisbar ist, und sprechen daher gar von einer Anomalie des Devisenmarktes. Berücksichtigt man diese Anomalie bei der Modellierung geldpolitischer Entscheidungen, kehrt sich die Überlegenheit frei-flexibler Wechselkurse gegenüber den beiden Formen des Managed Floatings ins Gegenteil um. Dieses zentrale Ergebnis, das eine ökonomische Ratio für das beobachtete Verhalten vieler Notenbanken in kleinen und offenen Volkswirtschaften liefert, wird in zwei Schritten hergeleitet. Zum einen lässt sich durch die Berücksichtigung von Wechselkursunsicherheit die Strategie des indirekten Managed Floatings begründen. Wechselkursunsicherheit wird definiert als die (nicht quantifizierte) Wahrscheinlichkeit, dass anstelle der ungedeckten Zinsparität ein anderes Wechselkursmodell das tatsächliche Zusammenspiel zwischen den beiden Finanzmarktgrößen Zins und Wechselkurs bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass sich Zinsregeln, die neben der Inflationsrate und der Outputlücke (wie unter frei-flexiblen Wechselkursen) auch auf den zeitgleichen und den zeitverzögerten realen Wechselkurs reagieren, als äußerst robust gegenüber einem hohen Maß an Wechselkursunsicherheit erweisen. Zum anderen lassen sich durch Abweichungen von der ungedeckten Zinsparität direkte sterilisierte Devisenmarktinterventionen begründen. Neben dem Geldmarktzins können Notenbanken somit gleichzeitig und unabhängig vom Geldmarktzins den Wechselkurs steuern. Allerdings muss für die Wechselkurssteuerung – ebenso wie für die Zinssteuerung – ein geeignetes Steuerungssystem (Strategie) entworfen werden, dass der Notenbank klare Handlungsweisungen liefert. In der vorliegenden Arbeit werden zunächst die Wirkungskanäle sterilisierter Interventionen diskutiert. Anschließend wird eine geldpolitische Regel auf der Basis eines aus Geldmarktzins and Wechselkurs zusammengesetzten Operating Targets, des sog. Monetary Conditions Indexes, entworfen. Es zeigt sich, dass eine Strategie des direkten Managed Floatings bei entsprechendem Einsatz der beiden Notenbankinstrumente zu denselben Ergebnissen (gemessen am Stabilisierungsziel der Notenbank) führt, wie sie sich auch unter frei-flexiblen Wechselkursen bei Gültigkeit der ungedeckten Zinsparität ergeben würden. Sterilisierte Devisenmarktinterventionen stellen somit ein zusätzliches Instrument der Geldpolitik dar, dass die aus der Wechselkursunsicherheit resultierenden negativen Auswirkungen auf die geldpolitischen Endziele kompensiert. KW - Managed Floating KW - Devisenmarktinterventionen KW - Inflation Targeting KW - Zinsregeln KW - Monetary Conditions Index KW - managed floating KW - foreign exchange market interventions KW - inflation targeting KW - interest rate rules KW - monetary conditions index Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8676 ER - TY - THES A1 - Lin, Chia-Huey T1 - Functional characterization of rat CTLA-4 and CD25+CD4+ regulatory T cells T1 - Funktionelle Chracterisierung der Ratte CTLA-4 und CD25+CD4+ regulatorischen T Zellen N2 - Summary: In the present work, two important negative regulators of T cell responses in rats were examined. At the molecular level, rat CTLA-4, a receptor important for deactivating T cell responses, was examined for the expression pattern and in vitro functions. For this purpose, anti-rat CTLA-4 mAbs were generated. Consistent with the studies in mice and humans, rat CTLA-4 was detectable only in CD25+CD4+ regulatory T cells in unstimulated rats, and was upregulated in all activated T cells. Cross-linking rat CTLA-4 led to the deactivation of anti-TCR- and anti-CD28 stimulated (costimulation) T cell responses such as reduction in activation marker expression, proliferation, and cytokine IL-2 production. Although T cells stimulated with the superagonistic anti-CD28 antibody alone without TCR engagement also increased their CTLA-4 expression, a delayed kinetics of CTLA-4 upregulation was found in cells stimulated in this way. The physiological relevance of this finding needs further investigation. At the cellular level, rat CD25+CD4+ regulatory T cells were examined here in detail. Using rat anti-CTLA-4 mAbs, the phenotype of CD25+CD4+ regulatory T cells was investigated. Identical to the mouse and human Treg phenotype, rat CD25+CD4+ T cells constitutively expressed CTLA-4, were predominantly CD45RC low, and expressed high level of CD62L (L-selectin). CD25+CD4+ cells proliferated poorly and were unable to produce IL-2 upon engagement of the TCR and CD28. Furthermore, rat CD25+CD4+ cells produced high amounts of anti-inflammatory cytokine IL-10 upon stimulation. Importantly, freshly isolated CD25+CD4+ T cells from naïve rats exhibited suppressor activities in the in vitro suppressor assays. In vitro, CD25+CD4+ regulatory T cells proliferated vigorously upon superagonistic anti-CD28 stimulation and became very potent suppressor cells. In vivo, a single injection of CD28 superagonist into rats induced transient accumulation and activation of CD25+CD4+ regulatory T cells. These findings suggest firstly that efficient expansion of CD25+CD4+ cells without losing their suppressive effects (even enhance their suppressive activities) can be achieved with the superagonistic anti- CD28 antibody in vitro. Secondly, the induction of disproportional expansion of CD25+CD4+ cells by a single injection of superagonistic anti-CD28 antibody in vivo implies that superagonistic anti-CD28 antibody may be a promising candidate in treating autoimmune diseases by causing a transient increase of activated CD25+CD4+ T cells and thus tipping ongoing autoimmune responses toward selftolerance. N2 - Zusammenfassung: In der vorliegenden Arbeit wurden zwei wichtige negative Regulatoren von T Zellantworten in der Ratte untersucht. Auf molekularer Ebene wurde Ratten-CTLA-4, ein für die Deaktivierung von T-Zellimmunantworten wichtiger Rezeptor, hinsichtlich seines Expressionsmusters und seiner in vitro Funktionen untersucht. Zu diesem Zweck wurden spezifische monoklonale Antikörper gegen Ratten-CTLA-4 erzeugt. In Übereinstimmung mit anderen Untersuchungen in Mensch und Maus war CTLA-4 konstitutiv nur in CD25+CD4+ regulatorischen T-Zellen exprimiert, nach Stimulierung war es in allen aktivierten T-Zellen nachweisbar. Kreuzvernetzung von CTLA-4 führte zur Inhibition von mit anti-TCR- und anti-CD28-Antikörpern stimulierten (Kostimulation) TZellantworten, insbesondere zur Verminderung der Expression von Aktivierungsmarkern, der Proliferation und der Produktion von IL-2. Obwohl T-Zellen mit superagonistischem Anti-CD28-Antikörper ohne T-Zellrezeptor stimulation ihre CTLA-4-Expression ebenfalls steigerten, wurde eine verzögerte Kinetik für die Hochregulation von CTLA-4 in diesen Zellen festgestellt. Die physiologische Bedeutung dieses Befundes bedarf noch weiterer Untersuchungen. Auf zellulärer Ebene wurden CD25+CD4+ regulatorische T-Zellen detailliert analysiert. Der Phänotyp CD25+CD4+ regulatorischen T-Zellen wurde charakterisiert. Wie in Mensch und Maus exprimierten die regulatorischen T-Zellen der Ratte konstitutiv CTLA-4, in größerem Umfang CD62L (L-Selectin), aber nur wenig CD45RC. CD25+CD4+ Zellen proliferierten nach Stimulation von CD28 und T-Zellrezeptor nur schwach und produzierten kein IL-2, im Gegensatz dazu aber große Mengen an IL-10. Hervorzuheben ist, dass für frisch isolierte CD25+CD4+ T-Zellen aus naiven Ratten Suppressoraktivität durch in vitro-Suppressionsassays nachgewiesen werden konnte. In vitro proliferierten CD25+CD4+ regulatorische T-Zellen nach superagonistischer anti-CD28-Stimulation äußerst stark und wurden zu potenten Suppressorzellen. Eine einzelne Injektion von superagonistischem Anti-CD28-Antikörper resultierte in einer transienten Akkumulation von CD25+CD4+ regulatorischen T-Zellen in vivo und induzierte deren Aktivierung. Diese Ergebnisse weisen zum einen darauf hin, dass eine effiziente Expansion von CD25+CD4+ Zellen ohne Verlust ihrer supprimierenden Effekte durch superagonistischen Anti-CD28-Antikörper in vitro erzielt werden kann. Zum anderen läßt die Induktion einer disproportionalen Expansion von CD25+CD4+ Zellen durch eine einzige Injektion des CD28-Superagonisten den Schluss zu, dass dieser Antikörper ein vielversprechender Kandidat zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten sein könnte, der über eine transiente Zunahme von aktivierten CD25+CD4+ T-Zellen eine bestehende Autoimmunantwort hin zur Selbsttoleranz lenkt. KW - Ratte KW - T-Lymphozyt KW - Desaktivierung KW - CTLA-4 KW - Regulatorische T Zellen KW - CD28 superagonist KW - Ratte KW - Toleranz KW - CTLA-4 KW - CD25+CD4+ regulatory T cells KW - CD28 superagonist KW - rat KW - peripheral tolerance Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8521 ER - TY - THES A1 - Hülsewig, Oliver T1 - Bank lending and monetary policy transmission in Germany T1 - Kreditvergabe der Banken und geldpolitische Transmission in Deutschland N2 - This study investigates the credit channel in the transmission of monetary policy in Germany by means of a structural analysis of aggregate bank loan data. We base our analysis on a stylized model of the banking firm, which specifies the loan supply decisions of banks in the light of expectations about the future course of monetary policy. Using the model as a guide, we apply a vector error correction model (VECM), in which we identify long-run cointegration relationships that can be interpreted as loan supply and loan demand equations. In this way, the identification problem inherent in reduced form approaches based on aggregate data is explicitly addressed. The short-run dynamics is explored by means of innovation analysis, which displays the reaction of the variables in the system to a monetary policy shock. The main implication of our results is that the credit channel in Germany appears to be effective, as we find that loan supply effects in addition to loan demand effects contribute to the propagation of monetary policy measures. N2 - Die vorliegenden Arbeit untersucht die Existenz des Kreditkanals in der geldpolitischen Transmission in Deutschland im Rahmen einer strukturellen Analyse von aggregierten Kreditmarktdaten. Die Analyse stützt sich auf ein Modell des Bankenverhaltens, welches die Kreditvergabeentscheidungen der Banken vor dem Hintergrund zukünftig erwarteter geldpolitischer Maßnahmen beleuchtet. Mit Hilfe eines Vektorfehlerkorrekturmodells (VECM) werden Langfristbeziehungen, die als Kreditangebots- und Kreditnachfragegleichungen interpretiert werden können, durch die Wahl von Restriktionen auf Kointegrationsvektoren hergeleitet. Auf diese Weise wird das Identifikationsproblem, welches bei Schätzungen von reduzierten Formen auf der Basis von aggregierten Daten auftritt, explizit angegangen. Die kurzfristige Dynamik des VECM wird anhand von Impuls-Antwort-Funktionen und Varianzzerlegungen dargestellt, die den Einfluss eines geldpolitischen Schocks auf die Variablen des Systems beschreiben. Die empirischen Ergebnisse deuten auf die Relevanz des Kreditkanals in Deutschland hin, da Kreditangebotseffekte zusätzlich zu Kreditnachfrageeffekten einen Einfluss auf die Übertragung von geldpolitischen Maßnahmen haben. KW - Kreditvergabe KW - geldpolitische Transmission KW - Kreditkanal KW - Vektorfehlerkorrekturmodell KW - Bank lending KW - monetary policy transmission KW - credit channel KW - vector error correction model Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8686 ER - TY - THES A1 - Kleen, Thomas Oliver T1 - Dissociated expression of granzyme B and IFN-gamma by T lymphocytes in HIV-1 infected individuals and its implications for Tc1 effector diversity T1 - Seperate Expression von Ganyme B und IFN-gamma durch T-Zellen in HIV Infizierten und die Implikationen für Tc1 Effektor Diversität N2 - A CD8+ cell-mediated host defense relies on cognate killing of infected target cells and on local inflammation induced by the secretion of IFN-g. Using assays of single cell resolution, it was studied to what extent these two effector function of CD8+ cells are linked. Granzyme B (GzB) is stored in cytolytic granules of CD8+ cells and its secretion is induced by antigen recognition of these cells. Following entry into the cytosol GzB induces apoptosis in the target cells. It was measured whether GzB release by individual CD8+ cells is accompanied by the secretion of IFN-gƒnƒnand of other cytokines. HIV peptide libraries were tested on bulk peripheral blood mononuclear cells and on purified CD4+ and CD8+ cells obtained from HIV infected individuals. The library included a panel of previously defined HLA class I restricted HIV peptides and an overlapping 20-mer peptide-series that covered the entire gp120 molecule. To characterize the in vivo differentiation state of the T-cells, freshly isolated lymphocytes were tested in assays of 24h duration. The data showed that only ~20% of the peptides triggered the release of both GzB and IFN-g from CD8+ cells. The majority of the HIV peptides induced either GzB or IFN-g, ~40% in each category. The GzB positive, IFN-g negative CD8+ cells did not produce IL-4 or IL-5, which suggests that they do not correspond to Tc2 cells but represent a novel Tc1 subclass, which was termed Tc1c. Also the IFN-g positive, GzB negative CD8+ cell subpopulation represents a yet undefined CD8+ effector cell lineage that was termed Tc1b. Tc1b and Tc1c cells are likely to make different, possibly antagonistic contributions to the control of HIV infection. Since IFN-g activates HIV replication in latently infected macrophages, the secretion of this cytokine by Tc1b cells in the absence of killing may have adverse effects on the host defense. In contrast, cytolysis by Tc1c cells in the absence of IFN-g production might represent the protective class of response. Further studies in the field of Tc1 effector cell diversity should lead to valuable insights for management of infections and developing rationales for vaccine design. N2 - Im Verlauf von Infektionskrankheiten basiert die Verteidigung durch CD8+-Zellen auf der direkten Tötung von infizierten Zellen über die Perforin/Granzyme-Kaskade und auf der Entzündungsbildung verursacht durch die Sekretion von Interferon-Gamma (IFN-g). In der vorliegenden Arbeit wurde die Granzyme B (GzB) Sezernierung als direkter Nachweis für das Abtöten von Zellen und parallel die Produktion von IFN-g durch HIV peptid-spezifische T-Zellen in chronisch HIV-infizierten Patienten gemessen. Eine Auswahl von in vorhergehenden Arbeiten definierten HLA-Klasse-I spezifischen HIV-Peptiden und eine HIV-Peptide-Bibiliotek, bestehend aus sich überlappenden 20-mer Peptiden, die das gesamte Gp120 Molekül von HIV-1 darstellten, wurden benutzt, um T-Lymphozyten aus frisch von HIV-infizierten Patienten gewonnenen mononukleären Zellen aufgereinigte CD8+-Zellen zu stimulieren. ELISPOT-Assays wurden benutzt, um die Sekretion von GzB und IFN-g mit einer Auflösung auf der Ebene der Einzelzelle zu messen. Nur ~20% der Peptide lösten die Freisetzung von sowohl GzB als auch IFN-g von CD8+ Zellen aus. Die Mehrheit der Peptide induzierte entweder GzB oder IFN-g, je ~40% in der jeweiligen Kategorie. Granzyme B-positive Zellen produzierten in parallel gemessen kein IL-4 oder IL-5. Da sie aus diesem Grunde keine Tc2 Zellen darstellen, wurden sie als neue Untergruppe Tc1c definiert. Diese GzB+/IFN-g- CD8+ Zellen vermutlich eine durch Apoptose induziertes Absterben von infizierten Zellen auslösen, ohne gleichzeitig eine Entzündungsreaktion zu verursachen. Die GzB-/IFN-g+ CD8+-Zellen stellen ebenfalls eine neue bisher unbeschriebene Zelluntergruppe dar und wurden als Tc1b Zellen bezeichnet. Diese könnten Entzündungsreaktion verursachen, ohne gleichzeitig direkt das Abstreben von Zellen zu induzieren und im Verlauf der HIV Infektion eine antagonistische Rolle zu den Tc1c Zellen einnehmen. Diese Tc1-CD8+ Effektorzell-diversität könnte die Implementierung und Feineinstellung von fundamental verschieden Verteidigungsstrategien gegen HIV und andere Infektionskrankheiten ermöglichen. Die hier vorgelegten Studien liefern eindeutige Indizien dafür, dass es in HIV-Infizierten eine signifikante Population von GzB sezernierenden CD8+-Zellen gibt, die weder IFN-g noch IL-4 oder IL-5 produzieren und daher in der Lage sind, mit Hilfe der Perforin/Granzyme-Kaskade zu töten, ohne dabei klassische Tc1 oder Tc2-Zellen darzustellen. Die höhere Sensitivität des GzB ELISPOT-Assays Zytotoxizität im Vergleich zum Chromium-Release-Assay zu messen, bietet eine hilfreiche Methode zum besseren Verständnis CD8+-Zell vermittelter Immunität. Die Ergebnisse führen zu der Schlussfolgerung, dass es im Menschen die von uns erstmals beschriebenen GzB+/IFN-g- und GzB-/IFN-g+ Untergruppen von CD8+-Zellen gibt. Aufgrund der verschiedenen Effektorfunktionen die diese vermutlich ausüben, erscheint es wichtig ihre jeweiligen Anteile im Kampf gegen HIV und andere Infektionskrankheiten zu ermitteln. Bei der Beurteilung von Immunantworten, ausgelöst durch experimentelle HIV-Impfstoffe, dürfte es sich als ausgesprochen wichtig erweisen, diese GzB produzierenden CD8+-Zellen neben den konventionell gemessenen IFN-g sezernierden CD8+-Zellen zu berücksichtigen. Diese Vorgehensweise sollte wertvolle Einblicke gewähren, in wie weit der jeweilige Phänotyp von Effektorzellen den höheren oder effektiveren Schutz gewährt und daher wertvolle Hilfe beim Management von Infektionen und im Bereich des Impfstoffdesign liefern. KW - Antigen CD8 KW - Flymphozyt KW - HIV-Infektion KW - granzyme B KW - Interferon gamma KW - HIV KW - AIDS KW - Cytotoxizität KW - Granzyme B KW - Interferon gamma KW - HIV KW - AIDS KW - Cytotoxicity Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8460 ER - TY - THES A1 - Ramirez Pineda, José Robinson T1 - Dendritic cells activated by CpG motifs are potent inducers of a Th1 immune response that protects mice against leishmaniasis T1 - CpG-aktivierte dendritische-Zellen induzieren eine Th1 immunantwort die Mäuse gegen Leishmaniose schütz N2 - The present investigation report a protocol to obtain dendritic cells (DC) that protects mice against fatal leishmaniasis. DC were generated from bone marrow precursors, pulsed with leishmanial antigen and activated with CpG oligodeoxinucleotides. Mice that were vaccinated with these cells were strongly protected against the clinical and parasitological manifestations of leishmaniasis and developed a Th1 immune response. protection was solid and long-lasting, and was also dependent of the via of administration. Whe the mechanism of protection was studied, it was observed that the availability of the cytokine interleukin-12 at the time of vaccination was a key requirement, but that the source of this cytokine is not the donor cells but unidentified cells from the recipients. N2 - En esta tesis se reporta un prtocolo para obtener celulas dendriticas (CD) que inducen una respuesta protectora contra la leishmaniasis en ratones susceptibles. Las CD se generaron de precursores de medula osea, se pulsaron con antigeno de Leishmania y se activaron con oligonucleotidos que contienen motivos CpG. Cuando los ratones se vacunan con estas celulas se observa una fuerte proteccion clinica y parasitologica contra la leishmaniasis. Los ratones se protegen debido a que desarrollan una respuesta inmune de tipo Th1, en contraste con la respuesta Th2 desarrollada por los ratones control. La proteccion fue solida y duradera y fue dependiente de la via de administracion de las CD. Cuando se estudio el mecanismo de proteccion, se encontro que se requiere la presencia de la citokina interleukina 12 en el momento de la vacunacion, y que la fuente de esta citokina no son las celulas donadoras, sino celulas de los ratones recipientes. KW - Leishmaniose KW - Dendritische Zelle KW - Immunreaktion KW - Dendrtitischer Zellen KW - Th1 immunantwort KW - leishmaniose KW - CpG KW - Dendritic cells KW - Th1 response KW - leishmaniasis KW - CpG Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8410 ER - TY - THES A1 - Karch, Oliver T1 - Where am I? - Indoor localization based on range measurements T1 - Wo bin ich? - Lokalisation mit Hilfe von Entfernungsmesswerten N2 - Nowadays, robotics plays an important role in increasing fields of application. There exist many environments or situations where mobile robots instead of human beings are used, since the tasks are too hazardous, uncomfortable, repetitive, or costly for humans to perform. The autonomy and the mobility of the robot are often essential for a good solution of these problems. Thus, such a robot should at least be able to answer the question "Where am I?". This thesis investigates the problem of self-localizing a robot in an indoor environment using range measurements. That is, a robot equipped with a range sensor wakes up inside a building and has to determine its position using only its sensor data and a map of its environment. We examine this problem from an idealizing point of view (reducing it into a pure geometric one) and further investigate a method of Guibas, Motwani, and Raghavan from the field of computational geometry to solving it. Here, so-called visibility skeletons, which can be seen as coarsened representations of visibility polygons, play a decisive role. In the major part of this thesis we analyze the structures and the occurring complexities in the framework of this scheme. It turns out that the main source of complication are so-called overlapping embeddings of skeletons into the map polygon, for which we derive some restrictive visibility constraints. Based on these results we are able to improve one of the occurring complexity bounds in the sense that we can formulate it with respect to the number of reflex vertices instead of the total number of map vertices. This also affects the worst-case bound on the preprocessing complexity of the method. The second part of this thesis compares the previous idealizing assumptions with the properties of real-world environments and discusses the occurring problems. In order to circumvent these problems, we use the concept of distance functions, which model the resemblance between the sensor data and the map, and appropriately adapt the above method to the needs of realistic scenarios. In particular, we introduce a distance function, namely the polar coordinate metric, which seems to be well suited to the localization problem. Finally, we present the RoLoPro software where most of the discussed algorithms are implemented (including the polar coordinate metric). N2 - Heutzutage spielen autonome Roboter bei einer wachsenden Zahl von Anwendungsgebieten eine entscheidende Rolle. Sie werden überall dort anstelle von menschlichen Arbeitskräften eingesetzt, wo die jeweiligen Aufgaben für Menschen zu gefährlich, unangenehm, monoton oder schlicht zu teuer sind. Dabei sind die Autonomie und Mobilität des Roboters sehr oft grundlegend für eine gute Problemlösung. Ein solcher Roboter sollte also zumindest die Frage "Wo bin ich?" zufriedenstellend beantworten können. Diese Arbeit behandelt das Problem der Selbstlokalisation in einer Gebäudeumgebung mit Hilfe von Entfernungsmesswerten. Das heißt, ein Roboter - ausgestattet mit einem Entfernungssensor - wacht innerhalb eines Gebäudes auf und muss mit Hilfe seiner Sensordaten und einer Karte seiner Einsatzumgebung seine Position bestimmen. Wir betrachten eine idealisierte Variante dieser Aufgabe, die ein rein geometrisches Problem zum Inhalt hat, und untersuchen ein Verfahren von Guibas, Motwani und Raghavan aus dem Gebiet der Algorithmischen Geometrie, welches dieses löst. Hierbei spielen sogenannte Sichtbarkeitsskelette (vergröberte Darstellungen von Sichtbarkeitspolygonen) eine entscheidende Rolle. Im Hauptteil der Arbeit analysieren wir die Strukturen und die auftretenden Komplexitäten im Rahmen dieses Verfahrens. Es stellt sich heraus, dass die Hauptschwierigkeiten sogenannte überlappende Einbettungen von Skeletten in das Kartenpolygon zur Ursache haben, für die wir einige einschränkende Sichtbarkeitsbedingungen zeigen. Gestützt auf diese Resultate können wir die auftretenden Komplexitätsschranken dahingehend verbessern, dass wir diese nicht nur in Abhängigkeit der Gesamtzahl aller Kartenecken angeben, sondern in Abhängigkeit der Zahl der konkaven Ecken. Dies hat ebenfalls Auswirkungen auf die Worst-Case-Schranken für die Preprocessing-Komplexität des Verfahrens. Der zweite Teil der Arbeit vergleicht die anfangs gemachten idealisierenden Annahmen mit den Gegebenheiten realer Umgebungen und adressiert die auftretenden Probleme. Um diese zu umgehen verwenden wir das Konzept sogenannter Distanzfunktionen, welche die Ähnlichkeit zwischen den Sensordaten und der Karte modellieren, und passen das Verfahren auf geeignete Weise an die Bedürfnisse realistischer Szenarien an. Insbesondere führen wir eine Distanzfunktion ein - die Polarkoordinatenmetrik - welche sich für das Lokalisationsproblem besonders gut zu eignen scheint. Schlussendlich stellen wir die Software RoLoPro vor, in der die meisten der diskutierten Algorithmen (einschließlich der Polarkoordinatenmetrik) implementiert sind. KW - Autonomer Roboter KW - Mobiler Roboter KW - Lokalisation KW - Lokalisation KW - Autonomer Roboter KW - Sichtbarkeit KW - Ähnlichkeitsmaß KW - Algorithmische Geometrie KW - Localization KW - Autonomous Robot KW - Visibility KW - Similarity Measure KW - Computational Geometry Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8442 ER - TY - THES A1 - Hupp, Thomas T1 - Ab Initio Treatment of Complex Systems Kohn-Sham Orbitals for Multi Reference Methods and the Base Pairing Properties of Xanthine T1 - Ab initio Behandlung komplexer Systeme Kohn-Sham Orbitale für Multireferenzverfahren und die Basenpaarungseigenschaften von Xanthin N2 - Die vorliegende Arbeit besteht aus zwei Teilen. Der erste untersucht die Eignung von LHF-Orbitalen für Multireferenzverfahren. Das Ziel dieses Teils ist eine effizientere Berechnung angeregter Zustände, was zur spektroskopischen Charakterisierung vieler organischer und bioorganischer Moleküle wichtig ist. Der zweite Teil befasst sich mit bioorganischen Fragestellungen und untersucht die Paarungseigenschaften der Purinbase Xanthin. Es wird unter anderem die unerwartet hohe Stabilität der Xanthin Selbstpaarung in Alanyl-PNA erklärt und es wird untersucht, auf welche Weise Xanthin in der DNA mutagene Fehlpaarungen mit Thymin eingehen kann. Teil1: Im Unterschied zu HF- und Standard-DFT-Methoden führt der LHF-Ansatz zu einem vollständig gebundenen Orbitalspektrum, da Coulomb-Selbstwechselwirkungen im LHF-Ansatz exakt korrigiert werden. Durch die Korrektur der Coulomb-Selbstwechselwirkungen sind im LHF-Ansatz auch die Energien der besetzten Orbitale nicht wie in Standard-DFT-Methoden zu höheren Werten verschoben, so dass das Koopmans' Theorem gültig bleibt und die besetzten LHF-Orbitale etwas kompakter als Standard-DFT-Orbitale sind. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass beide Eigenschaften deutliche Vorteile für MR-Verfahren darstellen. Die virtuellen LHF-Orbitale sind gut optimiert und erlauben eine effizienteBeschreibung sowohl angeregter Zustände als auch statischer Korrelationseffekte in MRCI und MRPT2-Ansätzen. Weiterhin führt die kompaktere Struktur der besetzten LHF-Orbitale zu einer besseren Beschreibung des kationischen Rumpfes von Rydbergzuständen. Andererseits wurden zu beiden genannten Vorteilen auch jeweils ein Beispielmolekül gefunden, in dem die Vorteile nicht zum Tragen kommen, und zu deren Beschreibung Orbitale aus HF- oder Standard-DFT-Methoden besser geeignet sind. Diese Beispiele zeigen, dass jeder Einzelfall für sich getestet werden muss, auch wenn die angeregten Zustände der meisten Moleküle sehr gut mit LHF-Orbitalen beschrieben werden können. Teil 2: Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die Paarungseigenschaften von Xanthin und Xanthinderivaten untersucht. Ziel dieses Teils war es, eine Erklärung für die unerwartet hohe Stabilität des Xanthin Alanyl-PNA Selbstpaarung zu finden. Weiterhin wurde untersucht, weshalb Xanthin, das in der DNA u.a. unter chemischem Stress gebildet wird, mutagene Fehlpaarungen mit der Pyrimidinbase Thymin eingehen kann. Stabilität der Xanthin Alanyl PNA: Zunächst wurde durch den Vergleich experimenteller und berechneter 13C-NMR-Spektra das Regiosomer von Xanthin bestimmt, welches zu der ungewöhnlich hohen Stabilität der Xanthin-Xanthin-Selbstpaarung in Alanyl-PNA verantwortlich ist. Zur Untersuchung der Stabilität der Xanthin-Selbstpaarung wurde ein stark vereinfachendes Modell aufgestellt,in dem die Stabilit� at der PNA-Duplexe nur über die Energiebeiträge aus den Wasserstoffbrücken (EDim) und der Basenstapelung (EStap) bestimmt wird. Die Dimerisierungs- und Stapelungsenergien unterschiedlicher Paarungen wurden mit DFT- und MP2-Methoden bestimmt. Solvenseffekte wurden über ein Kontinuummodell erfasst und der Einfluss des peptidischen Rückgrats auf die Stapelungsgeometrie wurde durch Kraftfeldmethoden berücksichtigt. Während die einzelnen Energiekomponenten aus den H-Br� ucken und der Basenstapelung keinen eindeutigen Zusammenhang zu den Schmelztemperaturen erkennen lassen, korreliert die Summe aus beiden linear mit den experimentell ermittelten Tm-Werten. Dies bedeutet, dass die Beiträge aus der Entropie, der molekularen Wasserumgebung und der Rückgratspannung sich entweder aufheben oder f� ur alle behandelten Systeme sehr ähnlich sind. Die Stabilität der Xanthin-Xanthin- und die der 2,6-Diaminopurin-Xanthin-Paarung, ergibt sich durch einen erhöhten Stapelungsbeitrag der Purinpaarungen, während die Wasserstoffbrücken der Xanthin Selbstpaarung nur wenig zur Stabilisierung des Xanthin-Xanthin und des Xanthin-Diaminopurin-Alanyl-PNA-Doppelstrangs beitragen. Paarungseigenschaften von N9-Xanthin: Zur Untersuchung der Paarungseigenschaften von N9-Xanthin wurden zun� achst H-verbrückte Homodimere von Xanthin untersucht. Hierbei wurden extreme Variationen in den Bindungsstärken der einzelnen H-Brücken gefunden, die sich zwischen -4 bis -11 kcal/mol in der Gasphase und -2.5 bis -5 kcal/mol im Solvens betragen. Durch Vergleich mit Modellsystemen konnte die starke Varianz der H-Brückenstärke auf anziehende bzw. abstoßende sekundäre elektrostatische Wechselwirkungen zurückgeführt werden. Weiterhin wurde das Homodimer von Hypoxanthin untersucht, bei dem die H-Brücken durch eine Erhöhung der Aromatizität im Pyrimidinring zusätzlich verstärkt werden, was zu einer deutlichen Stabilisierung des Dimers führt. Elektronische Effekte müssen vor allem deshalb berücksichtigt werden, da sie im Unterschied zu rein elektrostatischen Effekten deutlich weniger von der Solvensumgebung beein usst werden. Mutagenität von Hypoxanthin und Xanthin: Zur Erklärung der Mutagenität von Hypoxanthin und Xanthin wurden verschiedene neutrale und anionische Watson-Crick Basenpaarungen von Hypoxanthin und Xanthin mit Pyrimidinbasen berechnet. Hierbei wurden u. a. auch tautomere und anionische Formen von Xanthin berücksichtigt. Zur Bewertung der erhaltenen Dimerisierungsenergien wurden die Paarungen danach klassifiziert, ob ihre Geometrien mit denen der kanonischen Basenpaarungen deckungsgleich sind, oder ob sie in einer verzerrten Watson-Crick Geometrie vorliegen, was die Einbaurate in die DNA aufgrund des räumlichen Anspruchs der DNA-Polymerase vermindert. Die Rechnungen zeigen, dass Xanthin nur mit Cytosin Watson-Crick-Paarungen eingehen kann, welche jedoch nur sehr schwach gebunden sind. In der neutralen Form scheint eine dreizähnige Basenpaarung unter Beteiligung einer tautomeren Form des Xanthins etwas stabiler zu sein als die zweizähnige Paarung von Diketoxanthin mit Cytosin. Da die Dimerisierungsenergie sowohl der neutralen als auch der anionischen Basenpaarung nur wenig unter 0 kcal/mol liegt, ist der Einbau der Xanthin-Cytosin-Paarung in die DNA zwar aufgrund der günstigen Geometrie möglich, wird aber nicht durch einen Energiebeitrag aus den H-Brücken verstärkt. Die im Vergleich zur Guanin-Cytosin Paarung deutlich geringere Aromatizität von Xanthin zu Cytosin ist im Einklang mit dem experimentellen Befund, dass die Cytosin-Xanthin Paarung deulich langsamer als die Guanin-Cytosin Paarungen in die DNA eingebaut werden. Während die Rechnungen nur eine geringe Aromatizität von Xanthin zu Cytosin vorhersagen, scheint das Anion von Xanthin in der Lage zu sein, eine sehr stabile Basenpaarung mit Thymin einzugehen. Allerdings muss die Dimerisierungsenergie die schlechtere Anpassung in die Bindungstasche der DNA-Polymerase ausgleichen, da die Paarung in einer etwas verzerrten Watson-Crick Geometrie vorliegt. Insgesamt wird die Paarung daher nicht schneller in die DNA eingebaut, wie erwartet aufgrund der H-Brückenstärken, stattdessen besitzt sie eine ähnliche Einbaurate wie die geometrisch günstigere aber weniger stabile Xanthin-Cytosin Paarung. N2 - The present work consists of two parts. The first one deals with theoretical questions and tests the performance of orbitals obtained from a self-interaction free KS method, the LHFapproach, in multireference ab initio methods. The purpose of this part is to enable a more efficient computation of excitation energies, which is important for the spectroscopic characterization of many organic and bioorganic molecules. The second part focuses on bioorganic questions and studies the base pairing properties of the purine base xanthine in order to explain, e.g., the unusually high stability of selfpairing xanthine alanyl-PNA double strands and the mutagenicity of xanthine formed in DNA. Part1: In contrast to HF- and standard DFT-methods, the LHF-approach leads to a fully bound virtual orbital spectrum, because Coulomb self interactions are exactly canceled in the LHFansatz. Furthermore, the energies of the occupied orbitals are not upshifted, like it is the case for standard DFT-methods, so that Koopmans' theorem remains valid. In line with this, also the occupied LHF-orbitals are somewhat more compact than standard DFT-orbitals. The present work shows that both properties are of great benefit for MR methods. The virtual LHF-orbitals are well optimized and allow an efficient description of excited states and static correlation in both MRCI- and MRPT2-approaches. Furthermore, the higher compactness of the occupied LHF- compared to standard DFT-orbitals leads to a better description of the center ion of Rydberg states. However, for each of the two advantages mentioned at least one example molecule has been found, for which LHF-orbitals actually perform worse than HF-and/or standard DFT-orbitals. This shows, that even though LHF virtual orbitals allow an excellent MRCI- and MRPT2-description for the electronically excited states of a large number of molecules, this cannot be generalized and their performance needs to be tested for each individual case. In the second part of the present work, the base pairing properties of xanthine and xanthine derivatives were studied. The purpose of this part was to find an explanation for the unexpectedly high stability of the xanthine alanyl PNA double strand. Furthermore, it was analyzed, why xanthine, that is formed from guanine in DNA under chemical stress, is able to form mismatched base pairs with the pyrimidine base thymine. Stability of xanthine alanyl PNA: In the first step, the regioisomer present in the considered alanyl PNA was identified to be the N7-regioisomer of xanthine by a theoretical analysis of the 13C-NMR spectrum. To analyze the stability of the xanthine self-pairing, a simplified model was set up, in which the stability of the PNA double strand was explained solely by the energy contributions from H-bonding and base stacking. For that purpose, the dimerization and stacking energies for the xanthine-xanthine, guaninecytosine, adenine-thymine and xanthine-2,6-diaminopurine base pairs were computed using DFT and MP2 methods. Solvent effects were taken into account by the conductor like screening model. The influence of the peptide backbone on the stacking geometry was considered by force field optimizations. While the individual contributions from hydrogen bonding and stacking do not correlate with the melting temperature Tm, the sum of both correlates linearly with Tm. This correlation is somewhat surprising, because this means that the effects of the entropy and the molecular water environment either cancel or are similar for all systems compared. In this model, the stability of the xanthine selfpairing mainly stems from an enlarged stacking interaction, while the H-bonds give only minor contributions to the stability of the xanthine selfpaired double strand of alanyl-PNA. Base pairing properties of N9-Xanthine: The computation of the base pairing properties of N9-xanthine revealed a strong variation in the individual H-bond strengths for the selfpairing of xanthine, that range from -4 to -11 kcal/mol in the gas phase and -2.5 to -5 kcal/mol in polar solvent. By comparison with model systems it was shown that the strong variance of the H-bond strength is mainly due to attractive or repulsive secondary electrostatic interactions. For the homodimer of hypoxanthine it was shown that the increase of aromaticity in the pyrimidine ring upon dimer formation leads to a strengthening of the hydrogen bonds. Mutagenicity of hypoxanthine and xanthine: Several neutral and anionic Watson-Crick base pairs of xanthine were computed with MP2- and DFT-methods in order to explain the mutagenicity of hypoxanthine and xanthine. Also basepairs involving tautomeric forms of xanthine and hypoxanthine were considered. To evaluate the dimerization energies found, the dimers were classified into pairings that have the exact geometry of the canonical base pairs and those that realize a distorted Watson-Crick pairing mode. The computations show that a stable pairing which realizes the exact geometry of a canonical Watson Crick base pairing is only possible for the pairing of xanthine to cytosine, however, the base pairs are only weakly bound. The dimerization energies of both the neutral and the anionic pairing is around 0 kcal/mol, so that the xanthine-cytosine base pairs are incorporated into DNA solely because the base pairs fulfill the geometric demands of DNA polymerase, but it does not profit from any additional stabilization due to hydrogen bonding. The bonding that in the Watson-Crick pairing mode xanthine has almost no affinity to cytosine is in correspondence with the experimental result that the cytosine-xanthine base pair is incorporated into DNA at a much lower rate than the cytosine-guanine base pair, which has a very strong hydrogen bonding. While the affinity of xanthine to cytosine is very low, the computations predict that xanthine is able to form a stable Watson-Crick pairing with thymine. However, the pairing has a somewhat distorted Watson-Crick geometry, so that its high stability is outbalanced by the worsened fit to the binding pocket of DNA-polymerase. As a consequence, the xanthinethymine pairing is incorporated into DNA not at a faster, but only at a rate comparable to that of the xanthine-cytosine pairing. KW - Kohn-Sham Orbitale KW - MRCI KW - angeregte Zustände KW - Basenpaarung KW - Xanthin KW - Kohn-Sham Orbitals KW - MRCI KW - excited states KW - Base pairing KW - xanthine Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8244 ER - TY - THES A1 - Noskov, Andrey T1 - Structural and functional studies of the Interleukin-5 receptor system T1 - Struktur und Funktionsanalyse des Interleukin-5 Rezeptor Systems N2 - The aim of current work was contribution to the long-term ongoing project on developing human IL-5 agonists/antagonists that intervene with or inhibit IL-5 numerous functions in cell culture and/or in animal disease models. To facilitate design of an IL-5 antagonist variant or low-molecular weight mimetics only capable of binding to the specific receptor alpha chain, but would lack the ability to attract the receptor common β-chain and thus initiate receptor complex activation it is necessary to gain the information on minimal structural and functional epitopes. Such a strategy was successfully adopted in our group on example of Interleukin 4. To precisely localize minimal structural epitope it is essential to have structure of the ligand in its bound form and especially informative would be structure of complex of the ligand and its specific receptor alpha chain. For this purpose large quantities (tens of milligrams), retaining full biological activity IL-5 and extracellular domain of IL-5 specific receptor α-chain were expressed in a bacterial expression system (E.coli). After successful refolding proteins were purified to 95-99% Stable and soluble receptor:ligand complex was prepared. Each established purification and refolding procedures were subjected to optimization targeting maximal yields and purity. Produced receptor:ligand complex was applied to crystallization experiments. Microcrystals were initially obtained with a flexible sparse matrix screening methodology. Crystal quality was subsequently improved by fine-tuning of the crystallization conditions. At this stage crystals of about 800x150x30µm in size can be obtained. They possess desirable visible characteristics of crystals including optical clarity, smooth facecs and sharp edges. Crystals rotate plane polarized light reflecting their well internal organization. Unfortunately relative slimness and sometimes cluster nature of the produced crystals complicates acquisition of high-resolution dataset and resolution of the structure. With some of obtained crystals diffraction to a resolution up to 4Å was observed. N2 - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, einen Beitrag zum langfristigen Projekt der Entwicklung humaner IL-5 Agonisten/Antagonisten zu leisten, die im tierischen Krankheitsmodell oder in der Zellkultur in die verschiedenen Funktionen des IL-5 eingreifen oder sie inhibieren. Um das Design eines IL-5 Antagonisten oder einer Mimetika mit geringem Molekulargewicht zu vereinfachen, die nur an die spezifische α-Rezeptorkette bindet, nicht jedoch an die gemeinsame β-Kette und somit die Aktivierung des Rezeptorkomplexes initiieren, ist es notwendig, Informationen über minimale strukturelle und funktionelle Epitope zu erhalten. Diese Strategie wurde in unserer Arbeitsgruppe erfolgreich am Beispiel von Interleukin 4 angewandt. Um minimale strukturelle Epitope präzise zu lokalisieren, ist es es notwendig, die Struktur des Liganden in seiner gebundenen Form zu kennen. Besonders informativ wäre die Struktur des Komplexes aus Ligand und spezifischer Rezeptor α-Kette. Zu diesem Zweck wurden große Mengen (einige 10 mg) IL-5 mit vollständiger biologischer Funktionaltät und der extrazellulären Domäne der IL-5 spezifischen Rezeptor α-Kette in einem bakteriellen Expressionssystem (E. coli) exprimiert. Nach erfolgreicher Faltung wurden die Proteine zu einer Reinheit von 95-99% aufgereinigt und ein stabiler und löslicher Rezeptor:Ligandenkomplex erzeugt. Die erfolgreiche Aufreinigung und Faltungsprozedur wurde bezüglich maximaler Menge und Reinheit optimiert. Mit den produzierten Rezeptor:Ligandenkomplexen wurden Kristallisationsexperimente durchgeführt. Zunächst wurden mit einer flexiblen Sparse-Matrix Screening Methode Mikrokristalle erzeugt. Die Qualität der Kristalle wurde dann durch Feinabstimmung der Kristallisationsbedingungen verbessert. In diesem Stadium wurden Kristalle von etwa 800x150x30µm Größe erzeugt, die die gewünschten optischen Eigenschaften wie glatte Oberflächen und scharfe Kanten besaßen. Die Kristalle drehen die Polarisationsebene linear polarisierten Lichtes, was ihren gleichmäßigen Aufbau zeigt. Leider verkompliziert die geringe Dicke und das teilweise Auftreten von Clustern die Aufnahme hochauflösender Daten und damit Auflösung der Struktur. Mit einigen der erhaltenen Kristalle wurde eine Beugung bis zur Auflösung von 4 Å beobachtet. KW - Interleukin 5 KW - Rezeptor KW - Struktur KW - Interleukin-5 KW - Rezeptor KW - Asthma KW - X-ray KW - Protein-Kristallisierung KW - Interleukin-5 KW - receptor KW - asthma KW - X-ray KW - protein crystallization Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8195 ER - TY - THES A1 - Majidifard, Mahmoud Reza T1 - Biostratigraphy, lithostratigraphy, ammonite taxonomy and microfacies analysis of the Middle and Upper Jurassic of northeastern Iran T1 - Biostratigraphie, Lithostratigraphie, Ammoniten-Taxonomie und Mikrofazies-Analyse des Mittel- und Oberjura in Nordost-Iran N2 - The Middle and Upper Jurassic sedimentary successions of Alborz in northern Iran and Koppeh Dagh in northeastern Iran comprise four formations; Dalichai, Lar (Alborz) and Chaman Bid, Mozduran (Koppeh Dagh). In this thesis, the biostratigraphy, lithostratigraphy, microfacies, depositional environments and palaeobiogeography of these rocks are discussed with special emphasis on the abundant ammonite fauna. They constitute a more or less continuous sequence, being confined by two tectonic events, one at the base, in the uppermost part of the Shemshak Formation (Bajocian), the so-called Mid-Cimmerian Event, the other one at the top (early Cretaceous), the so-called Late-Cimmerian Event. The lowermost unit constitutes the uppermost member of a siliciclastic and partly continental depositional sequence known as Shemshak Formation. It contains a fairly abundant ammonite fauna ranging in age from Aalenian to early Bajocian. The following unit (Dalichai Formation) begins everywhere with a significant marine transgression of late Bajocian age. The following four sections were measured: The Dalichai section (97 m) with three members; the Golbini-Jorbat composite section (449 m) with three members of the Dalichai Formation (414 m) and two members of the Lar Formation (414 m); the Chaman Bid section (1556 m) with seven members, and the Tooy-Takhtehbashgheh composite section (567 m) with three members of the Chaman Bid Formation (567 m) and four members of the Mozduran Formation (1092 m). Altogether, 80 species of ammonites from the Dalichai and Chaman Bid formations belonging to 30 genera and 16 families are described. Among the taxa Phylloceratidae are most abundant, followed by Ataxioceratidae, Perisphinctidae, and Cardioceratidae. Pachyceratidae are the least common family. The ammonite fauna is of low diversity and is concentrated in several levels. Some of the ammonite genera and species are recorded from Iran for the first time. These include Pachyceras lalandei, Cardioceras praecordatum, Microbajocisphinctes sp., Geyssantia geyssanti, Larcheria schilli, Passendorferia sp., Sequeirosia sp., Phanerostephanus subsenex, Nothostephanus sp., Nannostephanus cf. subcomutus, Parawedekindia callomoni, Physodoceras sp., Extrenodites sp.. Biostratigraphically, thirty ammonite zones have been recognized for the Middle and Upper Jurassic successions at the four studied sections. Based on ammonites, the Dalichai Formation ranges from the Upper Bajocian to Callovian (Dalichai section) and from the Upper Bajocian to Lower Tithonian (Golbini-Jorbat section), the Chaman Bid Formation ranges from the ?Bathonian to Lower Tithonian (Chaman Bid section) and from the Upper Bajocian to Middle Kimmeridgian (Tooy-Takhtehbashgheh section), the Lar Formation ranges from the Middle to Upper Tithonian (Golbini-Jorbat section), and the Mozduran Formation from the Upper Kimmeridgian to ?Tithonian. Forty-four Microfacies types are briefly described. They were grouped into 16 facies associations, which then were interpreted in terms of their palaeoenvironments. They are part of a carbonate system consisting of a platform and adjacent slope to basin. Five major environments are represented: Tidal flat, shelf lagoon, and platform margin barrier as parts of the carbonate platform, and slope to basin representing open marine conditions. The sediments of the Dalichai and Chaman Bid formations are the slope and basinal sediments of the diachronous Lar and Mozduran formations, which formed an extensive carbonate platform in the Middle and Upper Jurassic. N2 - In der sedimentären Abfolge des Mittel- und Oberjura im Alborz (nördlicher Iran) und im Koppeh Dagh (nordöstlicher Iran) werden vier Formationen ausgeschieden: Dalichai- und Lar-Formation im Alborz und Chaman Bid- und Mozduran-Formation im Koppeh Dagh. Die Biostratigraphie, Lithostratigraphie, Mikrofazies, Ablagerungsbedingungen und Paläobiogeographie der Abfolgen werden diskutiert, unter besonderer Berücksichtigung der reichen Ammonitenfauna. Die Abfolgen stellen eine mehr oder wenig kontinuierliche sedimentäre Sequenz dar, die an der Basis und am Top von bedeutenden überregionalen tektonischen Unconfomities begrenzt wird, verursacht durch die Mittel-Cimmerischen Bewegungen im Bajoc und die Spät-Cimmerischen Bewegungen in der frühen Kreide. Die folgenden vier Profile wurden bearbeitet: das Dalichai-Typprofil (97 m) mit drei Membern; das zusammengesetzte Golbini-Jorbat-Profil (449 m) mit drei Membern der Dalichai-Formation (414 m) und zwei Membern der Lar-Formation (414 m); das Chaman Bid-Typprofil (1556 m) mit sieben Membern, und das zusammengesetzte Tooy-Takhtehbashgheh-Profil (567 m) mit drei Membern der Chaman Bid-Formation (567 m) und vier Membern der Mozduran-Formation (1092 m). Insgesamt werden 80 Ammonitenarten aus der Dalichai- und der Chaman Bid-Formation beschrieben, die zu 30 Gattungen und 16 Familien gehören. Die Phylloceratidae zeigen die höchste Abundanz, gefolgt von den Ataxioceratidae, Perisphinctidae und Cardioceratidae. Die Pachyceratidae sind die am wenigsten häufige Familie. Die Ammonitenfauna ist gering divers und an bestimmte Horizonte gebunden. Die folgenden Ammoniten-Gattungen und -Arten werden zum ersten mal aus dem Iran beschrieben: Pachyceras lalandei, Cardioceras praecordatum, Microbajocisphinctes sp., Geyssantia geyssanti, Larcheria schilli, Passendorferia sp., Sequeirosia sp., Phanerostephanus subsenex, Nothostephanus sp., Nannostephanus cf. subcomutus, Parawedekindia callomoni, Physodoceras sp., Extrenodites sp.. 30 Ammoniten-Biozonen konnten in der Mittel- bis Oberjura-Abfolge erkannt werden. Basierend auf der Ammoniten-Biostratigraphie kann die stratigraphische Reichweite der Formationen präzisiert werden: die Dalichai-Formation reicht vom Oberbajoc bis zum Callov (Dalichai-Profil) und vom Oberbajoc bis zum Untertithon (Golbini-Jorbat-Profil); die Chaman Bid-Formation reicht vom ?Bathon bis ins Untertithonian (Chaman Bid-Profil) und vom Oberbajoc bis Mittelkimmeridge (Tooy-Takhtehbashgheh-Profil); die Lar-Formation reicht vom Mittel- bis ins Obertithon (Golbini-Jorbat-Profil); die Mozduran-Formation reicht vom Oberkimmeridge bis zum ?Tithon. 44 Mikrofaziestypen, gruppiert in 16 Fazies-Assoziationen, werden kurz beschrieben und im Hinblick auf ihre Bildungsbedingungen interpretiert. Sie dokumentieren ein Karbonatsystem bestehend aus einer Plattform, einem Hang und einem Becken. Fünf Hauptablagerungsbereiche können ausgeschieden werden: Karbonatwatten, Schelflagune und Plattformrand als Teile der ehemaligen Karbopnatplattform sowie Hang und Becken des offenmarinen Bereiches. Die Sedimente der Dalichai- und Chaman Bid-Formationen repräsentieren Hang- und Becken-Sedimente einer sich diachron in Mittel- und Oberjura bildenden Karbonatplattform, die durch die Lar- und Mozduran-Formationen dokumentiert wird. KW - Chorasan KW - Jura KW - Ammoniten KW - Biostratigraphie KW - Lithostratigraphie KW - Jura KW - Iran KW - Ammoniten KW - (Bio-)Stratigraphie KW - Mikrofaziesanalyse KW - Jurassic KW - Iran KW - ammonites KW - (bio-)stratigraphy KW - microfacies analysis Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8045 ER - TY - THES A1 - Musch, Patrick T1 - Large-Scale Applications of Multi-Reference Methods in Chemistry and Development of a Multi-Reference Moller-Plesset Perturbation Theory Program T1 - Anwendung von Multireferenz-Methoden in der Chemie und Entwicklung eines Multireferenz Moller-Plesset-Störungstheorie-Programmes N2 - The first part of this work focuses on the characterization of systems which complex electronic structures require the application of multi-reference methods. The anti-tumor efficacy of the natural product Neocarzinostatin is based on the formation of diradicals and causes DNA cleavage and finally cytolysis. Computations on model systems performed in the present work show the influence of structural features on the mode of action and the efficacy of this antitumor-antibiotic. The cyclization of systems related to the enyne-cumulene framework like the enyne-allenes was investigated earlier and relations to the more unusual class of enyne-ketenes are analyzed. The class of enyne-ketenes (and also the enyne-allenes) show a broad spectrum of possible intermediates (diradicals, zwitterions, allenes). The electronic structures of these intermediates are also possible for the (heteroatom substituted) 1,2,4-cyclohexatriene and a model for their energetic sequence based on high-level multi-reference computations is proposed. In all three projects the application of multi-reference approaches is necessary to obtain a comprehensive picture of the reactivity and electronic structure but also shows up the limits inherently existing in the currently available programs with respect to the size of the molecules. In the second part, algorithms for a multi-reference Moller-Plesset perturbation theory (MR-MP2) program, designed to perform large-scale computations, were developed and implemented. The MR-MP2 approach represents the most cost-effective multireference ansatz and requires an efficient evaluation of the Hamilton matrix for which an algorithm is designed to instantly recognize only non-vanishing matrix elements and to employ the recurring interaction patterns of the Hamilton matrix. The direct construction of the Hamilton matrix is additionally parallelized to work on cluster environments. N2 - Der erste Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von Systemen, deren komplexe elektronische Struktur die Anwendung von Multireferenz-Methoden erfordert. Die Antitumor-Wirkung des Naturstoffes Neocarzinostatin beruht auf der Bildung von Diradikalen und führt zur Spaltung der DNS und löst den Zelltod aus. Berechnungen an Modellsystemen zeigen den Einfluss der Strukturmotive auf die Wirkungsweise und die Wirksamkeit des Antitumor-Antibiotikums. Die Cyclisierung von Systemen, wie die Eninallene, die dem Enincumulen-Grundgerüst des aktivierten Neocarzinostatin-Chromophors verwandt sind, wurden schon in früheren Arbeiten untersucht und die Verwandtschaft zur ungewöhnlicheren Substanzklasse der Eninketene wird in dieser Arbeit analysiert. Diese Verbindungsklasse und die der Eninallene zeigen ein breites Spektrum an möglichen Intermediaten, wie Diradikale, Carbene, Zwitterionen und Allene, deren elektronische Strukturen auch bei (heterosubstituierten) 1,2,4 Cyclohexatrienen auftreten. Für diese Verbindungen wird ein Modell für die energetische Abfolge der elektronischen Strukturen auf Basis von hochwertigen Multireferenz-Rechnungen vorgeschlagen. In den drei aufgeführten Projekten ist die Anwendung von Multireferenz-Ansätzen notwendig um ein umfassendes Bild der Reaktivitäten und elektronischen Strukturen zu erhalten, zeigen im Hinblick auf große Moleküle aber auch die inhärenten Grenzen in den zur Zeit verfügbaren Programme auf. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Algorithmen für ein Multireferenz-Moller-Plesset-Störungstheorie-Programmes (MR-MP2) entwickelt und implementiert. Der MR-MP2-Ansatz stellt den effizientesten Multireferenz-Ansatz dar und setzt eine geschickte und schnelle Berechnung der Hamilton-Matrix voraus. Hierfür ist ein Algorithmus konzipiert worden, der zum einen verschwindende Matrixelemente sofort erkennt und die sich wiederholenden Muster innerhalb der Hamilton-Matrix zu Nutze macht. Die Konstruktion der Hamilton-Matrix für das direkte Verfahren ist zudem für Clusterumgebungen parallelisiert. KW - Theoretische Chemie KW - Organische Chemie KW - Multireferenz KW - Moller-Plesset KW - Antitumor-Antibiotikum KW - Theoretical Chemistry KW - Organic Chemistry KW - Multi Reference KW - Moller-Plesset KW - Antitumor-antibitioc Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7741 ER - TY - THES A1 - Kocher, Nikolaus T1 - Experimental charge density studies of highly polar bonds T1 - Experimentelle Bestimmung der Elektronendichteverteilung Stark Polarer Bindungen N2 - The main aim of this work was the classification of highly polar E–N (E = Al, Si, P) and Li–E’ (E’ = C, N, O) bonds in terms of ionic (closed-shell) or covalent (shared) interactions. To answer this question the experimentally determined electron density was analyzed using Bader’s theory of ‘Atoms in Molecules’ (AIM). This allows a quantitative evaluation of properties derived from the electron density, such as the Laplacian, the ellipticitiy and the ratio of the highest charge concentration perpendicular to the bond path, to the largest charge depletion along the bonding vector. Most of these properties were monitored along the entire bonding region and not limited to the BCP as in former studies. The analyses are completed by the calculation of the electronic energy densities Hl at the BCPs and the integration of atomic basins also defined within the AIM theory. The electrostatic potential (ESP) was computed from the multipole parameters to reveal preferred reactive sites of the structures under investigation. Apart from that, the multipole formalism was applied to problematic crystal structures in order to open this method for twinned samples or those including disordered groups in the molecule. N2 - Die zentrale Fragestellung der Arbeit war die Klassifizierung der stark polaren Bindungen E–N (E = Al, Si, P) sowie Li–E’ (E’ = C, N, O) im Hinblick auf ionische und kovalente Wechselwirkungen. Um diese Frage zu beantworten wurde die experimentell bestimmte Elektronendichte mit der ‚Atoms in Molecules’ Theorie von Bader analysiert. Sie ermöglicht eine quantitative Auswertung von Eigenschaften wie dem Laplacian, der Elliptizität oder dem Verhältnis der Eigenwerte, die aus der Elektronendichte erhalten werden. Die meisten dieser elektronischen Eigenschaften wurden entlang des gesamten Bindungspfades untersucht; die Analyse war nicht, wie in früheren Arbeiten auf die bindungskritischen Punkte (BCPs) beschränkt. Die Untersuchungen wurden durch die Berechnung der Energiedichte Hl am BCP und die Integration der atomaren Basins vervollständigt. Weiterhin wurde aus den Multipolpopulationen das Elektrostatische Potential bestimmt, um reaktive Zentren der untersuchten Verbindungen zu quantifizieren. Das Multipolmodell wurde auch auf Kristalle mit problematischer Elektronendichteverteilung angewendet, um die Methode für verzwillingte Kristalle bzw. solche mit fehlgeordneten Gruppen zu erschließen. KW - Elektronendichte KW - Chemische Bindung KW - Räumliche Verteilung KW - Elektronendichteverteilung KW - Multipolverfeinerung KW - Topologie KW - AIM KW - molekulare Eigenschaften KW - charge density KW - electron density distribution KW - multipole refinement KW - topology KW - molecular properties Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7614 ER - TY - THES A1 - Attia, Mohamad Ibrahim T1 - Design, synthesis and pharmacological evaluation of certain GABAB agonists T1 - Design, Synthese und pharmakologische Untersuchungen der GABAB-Agonisten N2 - Ziel dieser Arbeit war die Synthese von (RS)-5-Amino-3-aryl(methyl)-pentansäure Hydrochloride, 3-Aminomethyl-5-chlor-benzolsäure Hydrochlorid und(RS)-4-Amino-3-(4´-ethynyl(jod)-phenyl)-butansäure Hydrochloride und die Testung der pharmakologischen Aktivität dieser Verbindungen. Die synthetisierten Verbindungen wurden als GABAB-Rezeptor Agonisten, in einem auf Ca2+-Messungen basierenden Funktional-Assay (in vitro tsA Zellen mit GABAB1b/GABAB2/Gαq-z5 transfektiert), getestet und daraus ein Struktur-Aktivitäts Modell abgeleitet. Im allgemein Teil dieser Arbeit wird ein Überblick, über die Neurotransmitter- Rezeptoren (Liganden gesteuerte Ionen-Kanal-Rezeptoren und G Protein-gekoppelte Rezeptoren) des zentralen Nervensystems und deren Agonisten und Antagonisten, gegeben. Eine ausführliche Diskussion zur Synthesestrategie der Verbindungen der Zwischenstufen und der Ausgangsmaterialien wird in den Schemata 2-6 beschrieben. Die synthetisierten Verbindungen wurden als GABAB Agonisten geprüft. Zusätzlich wurden diese im 3D Homologie Modell mit FlexiDock Programm gedockt. Daraus wurde ein Modell zur Voraussage der Aktivität von Analogen und Homologen des Baclofens abgeleitet. Letztendlich wurde ein Pharmakophor-Modell für GABAB Agonisten mit DISCO (DIStance COmparisons) Programm erstellt. N2 - Synthesis of (RS)-5-amino-3-aryl (methyl)-pentanoic acid hydrochlorides, 3 aminomethyl-5-chloro-benzoic acid hydrochloride and (RS)-4-amino-3-(4`-ethynyl(iodo)-phenyl)-butanoic acid hydrochlorides have been accomplished. The aim of their synthesis was to evaluate their GABABR agonist activity and to derive a model which will correlate their structure with the observed pEC50. The GABABR agonist activity of the prepared compounds has been determined in functional assay based on calcium measurement in vitro using tsA cells transfected with GABAB1b/GABAB2/Gαq-z5. Reviews on the neurotransmitter receptors (ligand-gated ion channel receptors and G protein-coupled receptors), their agonists and antagonists have been given in the general part of this work. A detailed discussion on the strategy followed for the synthesis of the designed compounds as well as the starting materials and intermediates has been described and illustrated in Schemes 2-6. The synthesized compounds were evaluated for their GABABR agonist activity. Furthermore, these compounds were docked in the available 3D homology model of GABABR using the program FlexiDock implemented in SYBYL software. Subsequently, we derived a predictive model which correlates the experimentally determined pEC50 with the calculated binding energy of certain baclofen analogues and homologues. In addition, we used the program DISCO (DIStance COmparisons) implemented in SYBYL software to find the pharmacophore features of GABAB agonists. KW - Baclofen KW - Analoga KW - GABA-Rezeptor-Agonist KW - Pharmakologie KW - GABAB KW - Sythese KW - Baclofen KW - Pharmakologie KW - Molekular Modeling KW - GABAB KW - synthesis KW - baclofen KW - pharmacology KW - molecular modeling Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7551 ER - TY - THES A1 - Roth, Martin T1 - Functional and developmental characterisation of matrix binding sites in decapentaplegic T1 - Funktionelle und entwicklungsspezifische Charakterisierung von Matrix-Bindungsstellen von decapentaplegic N2 - In the last years it became evident that many cytokines do not only bind to their specific cell surface receptors but also interact with components of the extracellular matrix. Mainly in Drosophila, several enzymes were identified, that are involved in glycosaminoglycan synthesis. Mutations in these enzymes mostly result in disturbances of several signaling pathways like hedgehog, wingless, FGF or dpp. In most cases it was, due to these pleiotropic effects, not possible to examine the relevance of matrix interactions for single pathways. The aim of this work was to examine the relevance of matrix interactions for the TGF-ß superfamily member DPP. Based on the fact that DPP is highly homologous to human BMP-2, the basic N-terminus of mature DPP was mutated, which has been shown to contain a heparin-binding site in BMP-2. Thus, a wildtype variant (D-MYC), a deletion variant (D-DEL), which lacked the whole basic part of the N-terminus and a duplication variant (D-DUP), which contained a second copy of the basic core moitiv, were generated. In order to characterise the variants biochemically, they were expressed in E.coli and refolded in a bioactive form. In chicken limbbud assay, the deletion variant was much more active than the wildtype variant, comparable to data of BMP-2. By means of biacore mesurements with the immobilised ectodomain of the high affinity type I receptor thick veins, it could be demonstrated, that the variants differ only in matrix binding and not in their receptor affinity. Different matrix binding was shown by Heparin FPLC. The biological relevance of the matrix interaction of DPP was examined in transgenic flies. To allow expression of the different variants under the control of various Gal4 driver lines, they were cloned behind an UAS-promoter site. In early tracheal development, a strong dependence of DPP signaling on matrix binding was observed. While ectopic expression of the deletion variant caused only minor defects, the branching pattern was strongly disturbed by overexpression of wildtype and duplication variant. Ubiquitous expression of the variants in the wing imaginal disc caused overproliferation of the disc and expansion of the omb target gene expression. The extent of phenotypes correlated with the matrix binding ability of the variants. Corresponding disturbances of the wing vein pattern was observed in adult flies. By the crossing of different dpp allels, transheterozygous animals were created, that lack dpp only in imaginal discs. Expression of the variants under the control of a suitable dpp-Gal4 driver line revealed insights into the biological relevance of matrix binding on DPP gradient formation and specific target gene activation in wing imaginal discs. It was shown, that all variants were able to generate a functional DPP gradient with correct expression of the target genes omb and spalt. Again a correlation between extent of target gene domains and matrix binding ability of the corresponding variants was found. Thus by mutating the N-terminus of DPP, it could be shown that this is responsible for DPP`s matrix interaction. Also the relevance of matrix binding of DPP in different tissues was examined. It turned out, that the reorganisation of tracheal branching by DPP strongly depends on matrix interactions wheras the establishing of a gradient in wing imaginal discs depends only gradually on matrix interactions. Based on these data a model for the action of DPP/TGFßs as morphogens was established. While a deletion of matrix binding leads to a decrease in specific bioactivity of the cytokine, the latter is increased by additional matrix binding sites. N2 - In den letzten Jahren wurde deutlich, daß viele Zytokine nicht nur mit ihren spezifischen Zelloberflächen-Rezeptoren interagieren, sondern auch Affinität zu Komponenten der Extrazellulären Matrix zeigen. Vor allem in Drosophila konnten viele Enzyme zur Synthese von Glukosaminoglykanen identifiziert werden. Mutationen in diesen Enzymen führen in der Regel zu Störungen verschiedener Signalwege, wie z.B. hedgehog, wingless, FGF oder dpp. Aufgrund dieser pleiotropen Effekte, war es meist nicht möglich, die Bedeutung der Matrix-Interaktionen für bestimmte Zytokine zu untersuchen. In dieser Arbeit sollte die Bedeutung der Matrix-Interaktion für das TGF-ß-Superfamilienmitglied DPP unter-sucht werden. Ausgehend von der hohen Homologie zwischen humanem BMP-2 und DPP wurde der basische N-Terminus von DPP, der im BMP-2 für die Heparininteraktion verantwortlich ist, verändert. Es wurde neben einer Wildtypvariante (D-MYC) eine Deletionsvariante (D-DEL) generiert, die keine basischen Aminosäuren im N-Terminus aufweist, sowie eine Duplikationsvariante (D-DUP), die eine zweite Kopie des basischen Hauptmotivs im N-Terminus enthält. Zur biochemischen Charakterisierung wurden die Varianten sowie wildtypisches DPP in E.coli exprimiert und in eine bioaktive Form zurückgefaltet. Im Limbbud-Test zeigte sich vergleichbar zum BMP-2 eine stark erhöhte Aktivität der Deletionsvariante gegenüber Wildtyp-DPP. Durch Biacore-Messungen an der immobilisierten Ektodomäne des hochaffinen DPP TypI-Rezeptors Thick veins konnte gezeigt werden, daß alle Varianten gleiche Rezeptoraffinität haben und sich nur in der Matrixbindung unterscheiden. Letzteres wurde durch eine analytische FPLC mit Heparin als Matrix gezeigt. Die biologische Relevanz der Matrixbindung wurde in transgenen Fliegen untersucht. Hierbei wurden die DPP-Varianten hinter einen UAS-Promoter kloniert, um jene unter der Kontrolle verschiedener Gal4-Treiberlinien exprimieren zu können. In der frühen Tracheenentwicklung zeigte sich eine sehr starke Matrix-Abhängigkeit der DPP-Wirkung. Während ektopische Expression der Deletionsvariante fast keine Störung der Zellmigration verursachte, war das Muster der Tracheenäste bei ektopischer Expression von D-MYC als auch D-DUP massiv gestört. Ubiquitäre Expression der Varianten in der Flügelimaginalscheibe verursachte Überproliferation und eine Ausdehnung der Expressionsdomäne des omb-Genes. Die Stärke der Phänotypen korrelierte dabei mit der Matrixbindung der Varianten. Entsprechende Störungen des Venenmusters konnten in Flügeln adulter Tiere festgestellt werden. Durch Kreuzung zweier dpp-Allele konnten transheterozygote Fliegen gewonnen werden, die keine dpp-Expression in den Imaginalscheiben zeigen. Die Expression der Varianten unter Kontrolle eines geeigneten dpp-Gal4-Treibers in diesen Fliegen gab Aufschluß über die tatsächliche Relevanz der DPP-Matrix-Interaktion für die Ausbildung eines DPP-Gradienten und spezifische Aktivierung verschiedener Targetgene in der Flügelscheibe. Es wurde gezeigt, daß alle Varianten dazu in der Lage sind, einen DPP-Gradienten mit entsprechender Expression der Targetgene omb und spalt zu erzeugen. Wieder wurde eine Korrelation zwischen Ausdehnung der Targetgen-Domänen und der Matrixbindung der Varianten beobachtet. Somit konnte durch Mutation des N-Terminus des DPP-Proteins gezeigt werden, daß dieser für die Matrixinteraktion von DPP verantwortlich ist. Auch wurde Aufschluß über die Bedeutung der Matrixinteraktion an verschiedenen DPP-Wirkungsorten gewonnen. Die Abhängigkeit des DPP-Signalpotentials von der Matrixbindung differiert zwischen verschiedenen Gewebetypen. Während die Wirkung von DPP in der Restrukturierung der trachealen Migration sehr stark von einer Matrixbindung abhängt, sieht man in bei der Proliferation und Musterbildung in der Imaginalscheibe nur graduelle Effekte. Diese Daten führten zur Etablierung eines Models für den Wirkungsmechanismus von DPP/TGFß Molekülen als morphogene Faktoren. Während eine Deletion von Matrixbindung zu einem Verlust der spezifischen biologischen Aktivität führt, wird durch zusätzliche Matrixbindung eine erhöhte Aktivität erreicht. KW - Taufliege KW - Transforming Growth Factor beta KW - Extrazellulärraum KW - extrazelluläre Matrix KW - decapentaplegic KW - Drosophila KW - Glucosaminoglykane KW - extracellular matrix KW - decapentaplegic KW - Drosophila KW - glucosaminoglycans Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7542 ER - TY - THES A1 - Schulz, Heidi T1 - Towards a comprehensive description of the human retinal transcriptome: identification and characterization of differentially expressed genes T1 - Identifizierung und Charakterisierung von differenziell exprimierten Genen - ein Beitrag zur umfassenden Beschreibung des Transkriptoms der menschilchen Netzhaut N2 - The human retina is a multilayered neuroectodermal tissue specialized in the transformation of light energy into electric impulses which can be transmitted to the brain where they are perceived as vision. Since the retina is easily accessible and functional aspects are directly recordable, the study of this tissue has been at the forefront of neuroscience research for over a century. Studies have revealed that the distinct functions of the retina require a large degree of differentiation which is achieved by the coordinated function of approximately 55 different cell types. The highly structured anatomy and the functional differentiation of the retina is a result of its distinctive transcriptome and proteome. Due to the complexity of the retina it has been difficult to estimate the number of genes actively transcribed in this tissue. Great efforts in the elucidation of retinal disease genes have led to the identification of 139 retina disease loci with 90 of the corresponding genes cloned thus far . In contrast to the success in the hereditary disorders, efforts to identify the genetic factors conferring manifestations known as age-related macular degeneration (AMD) have revealed sparse results. AMD is a retinal disease affecting a significant percentage of the older population. This disorder is likely due to exogenic as well as genetic factors. To further our understanding of retinal physiology and facilitate the identification of genes underlying retinal degenerations, particularly AMD, our efforts concentrated on the systematic analysis of the retinal transcriptome. Since approximately half of all retinal degeneration-associated genes identified to date are preferentially expressed in retina, it is plausible that the investigation of gene expression profiles and the identification of retina-expressed transcripts could be an important starting point for characterizing candidate genes for the retinal diseases. The expressed sequence tags approach included the assessment of all retinal expressed sequence tags (EST) clusters indexed in the UniGene database and of 1080 single-pass ESTs derived from an in-house generated human retina suppression subtracted hybridization (SSH) cDNA library. In total, 6603 EST clusters were evaluated during this thesis and detailed in-silico analysis was performed on 750 EST clusters. The expression of the genes was evaluated using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), followed by confirmation using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR), as well as conventional and virtual Northern blot analysis. The expression profiling of 337 selected EST clusters led to the identification of 111 transcripts, of which 60 are specific or abundant to the retina, 3 are expressed at high levels in the retinal pigment epithelium (RPE), and 48 are expressed in brain as well as in retina. The EST approach used to select candidate transcripts allowed us to assess the effectiveness of the two available resources, the UniGene database and the retinal SSH (retSSH) cDNA library. From the results obtained, it is evident that the generation of suppression subtracted libraries to identify cell-specific transcripts constitutes the most straight-forward and efficient strategy. In addition to the high percentage of candidate genes that are identified from an SSH cDNA library, it has the added benefit that genes expressed at low levels can be identified. Furthermore, comparison of our retina-enriched gene set with previously published studies demonstrated only limited overlap of the identified genes further confirming the valuable source of retinal genes from our retinal SSH cDNA library. The effort of our and other groups has resulted in the establishment of the full-length coding sequence of 55 of the 111 genes uniquely or preferentially expressed in the retina. Using various methods such as bioinformatical analysis, EST assembly, cDNA library screening, and rapid amplification of cDNA ends (RACE) a number of genes were cloned in the scope of this thesis including C1orf32, C4orf11, C7orf9, C12orf7, C14orf29, DAPL1, and GRM7. Bioinformatic analyses and cDNA library screening were used to isolate the full-length cDNA sequence and determine the genomic organization of C7orf9, also identified as RFRP. This 1190 bp retina-specific transcript from chromosome 7p15.3 encodes a precursor protein for at least two small neuropeptides, referred to as RFRP-1 and RFRP-3. Since C7orf9 is localized in the critical region for dominant cystoid macular dystrophy (CYMD) its role in the pathology was investigated. Southern blot analysis and sequencing of samples from two affected individuals of the original pedigree used to localize the disease gene excluded the gene from involvement in this disease. Multiple isoforms of the C12orf7 gene were assembled from a number of clones identified from library screenings, PCR amplifications, and RACE experiments. The gene variants, transcribed from chromosome 12q13.13, have been found to be expressed exclusively in retina. Because of the multiple alternative splicing of the gene, we can only speculate about the nature of the protein it encodes. The longest transcript, which includes all six exons plus the last intervening sequence, encodes a 471 aa protein which contains a nuclear localization signal and five ankyrin repeats. The existence of many isoforms is also observed in mouse suggesting that they may have a relevant role in cellular physiology. Five novel splice variants of the glutamate metabotropic receptor 7 (GRM7) resulting from the use of alternative 3’-end exons were identified and characterized. One of the novel variants, GRM7_v3, encodes a 924 aa protein and is therefore the longest putative GRM7 protein reported to date. Even though they are not retina-specific, the isoforms are preferentially expressed in the nervous system. Although the functional properties of the specific carboxyl-termini are still unclear, it is known that axon targeting of GRM7_v1 is mediated by the last 60 aa of the protein. Hence the novel isoforms may direct the protein to specific subcellular localizations. The C1orf32 gene, preferentially expressed in retina, is organized in 10 exons and is transcribed from chromosome 1q24.1. Bioinformatic analyses of the 639 aa putative protein not only identified the mouse and rat orthologous genes but also the LISCH7 gene as a potential member of the same family. Since the LISCH7 protein has been shown to function as a low density lipoprotein receptor, the C1orf32 protein may be involved in retinal lipid homeostasis. Disturbances in lipid metabolism have been proposed as one of the pathways involved in AMD etiology. Thus, the role of C1orf32 in this complex disease should be investigated. Expression analyses of the death-associated protein-like 1 (DAPL1) gene revealed that it is expressed in both the retina and the RPE at high levels. The 552 bp transcript encodes a 107 aa putative protein and is transcribed from chromosome 2q24.1. In-silico analyses identified an additional 12 related proteins from various species which share high similarity constituting a novel protein family. The similarity to the death-associated-protein (DAP) is particularly interesting since this protein has been found to be indispensable for programmed cell death. Therefore, DAPL1 is an excellent candidate for retinal disease as apoptosis is generally the ultimate cause in retinal degeneration. The retina-specific C4orf11 and C14orf29 genes localized on chromosome 4q21.22 and 14q22.1, respectively, are both transcribed in more than one isoform. The encoded proteins do not contain any known domains but because of their retina-specific expression they may be important for proper retinal physiology. As part of the long-term goals of the project, several of the cloned genes are being genotyped to construct single nucleotide polymorphism (SNP) maps. Projects to investigate haplotype frequencies of candidate genes in large cohorts of controls and AMD patients are ongoing. Thus, by establishing a collection of 111 genes expressed exclusively or preferentially in the retina, the present work has laid the foundation for future research in retinal diseases. N2 - Die menschliche Retina ist ein mehrschichtiges neuroektodermales Gewebe, das auf die Umwandlung von Lichtenergie in elektrische Impulse spezialisiert ist. Diese Impulse werden zum Gehirn weitergeleitet, wo sie als Bilder gesehen werden. Da die Retina experimentell leicht zugänglich ist und funktionelle Aspekte direkt untersucht werden können, nehmen Experimente an diesem Gewebe in der neurologischen Forschung seit mehr als einem Jahrhundert einen Spitzenplatz ein. Es wurde gezeigt, dass die unterschiedlichen Funktionen der Retina durch eine enorme Differenzierung in mehr als 55 Zelltypen, die koordiniert miteinander in Kontakt treten, ermöglicht wird. Die hohe strukturelle und funktionelle Komplexität der Retina wiederum ist das Resultat ihres Transkriptoms und ihres Proteoms. Die Komplexität der Retina erschwert es, die Zahl aktiv transkribierter Gene in diesem Gewebe zu schätzen. Durch die vielfältigen Bemühungen, Gene zu identifizieren, die mit retinalen Erkrankungen in Zusammenhang stehen, konnten bisher 139 Genloci mit retinalen Krankheiten in Verbindung gebracht werden und in 90 Fällen wurden die jeweiligen Gene bereits kloniert . Während auf dem Gebiet der hereditären Erkrankungen damit bereits große Erfolge erzielt wurden, sind die Resultate, was komplexe Erkrankungen wie die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) betrifft, noch spärlich. AMD ist eine retinale Erkrankung, die einen signifikanten Prozentsatz der älteren Bevölkerung betrifft. Es wird angenommen, dass sowohl exogene als auf genetische Faktoren als Auslöser beteiligt sind. Um die Physiologie der Retina besser zu verstehen und die Identifikation von Genen, die in retinale Erkrankungen involviert sind, zu ermöglichen, wurde in dieser Arbeit ein Schwerpunkt auf die systematische Analyse des retinalen Transkriptoms gelegt. Etwa die Hälfte aller Gene, die bei retinalen Erkrankungen eine Rolle spielen und bis heute identifiziert wurden, werden überwiegend in der Retina exprimiert. Das Erstellen von Genexpressionsprofilen und die Identifikation von retina-spezifischen Transkripten ist daher der erste wichtige Schritt für die Charakterisierung von Kandidatengenen für retinale Erkrankungen. Zu diesem Zweck wurde eine „Expressed Sequence Tags“ (ESTs) Analyse durchgeführt, in der alle Retina „Clusters“ der UniGene Datenbank sowie 1080 einzelne ESTs einer laboreigenen, suppressiv-subtraktiv hybridisierten (SSH) cDNA Bank der menschlichen Retina bewertet. Insgesamt wurden 6603 EST „Clusters“ während dieser Arbeit untersucht und für 750 eine detaillierte in-silico Analyse angeschlossen. Die Expression der Gene wurde mittels reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht und mit quantitativer RT-PCR (qRT-PCR) bestätigt. Außerdem wurden konventionelle und virtuelle Northern Blot Hybridisierungen zur Aufklärung der Expressionsprofile eingesetzt. Die Expressionsprofile von 337 EST „clustern“ führte zur Identifikation von 111 Transkripten, von denen 60 abundant oder spezifisch in der Retina exprimiert werden, drei eine hohe Expression im retinalen Pigmentepithel (RPE) zeigen und 48 sowohl in der Retina als auch im Gehirn vorkommen. Die Bewertung der ESTs zur Auswahl von Kandidatengenen erlaubte einen direkten Vergleich der beiden genutzten Datenressoucen, der UniGene Datenbank und der retinalen SSH (retSSH) cDNA Bank. Die Resultate zeigten, dass die Generierung einer SSH Bank zur Identifikation zellspezifischer Transkripte die effektivere Methode darstellt. Durch die Nutzung dieser cDNA Bank konnte nicht nur ein Großteil der Kandidatengene, sondern auch Gene mit einer niedrigen Expression identifiziert werden. Außerdem zeigt die cDNA Bank eine Anreicherung an Retina-Transkripten. Somit stellt die retSSH cDNA Bank eine wertvolle Quelle zu Identifizierung neuer retinaler Gene dar. Durch diese und andere Arbeiten konnte die vollständige kodierende Sequenz von 55 der 111 retinaspezifischen oder –abundanten Gene ermittelt werden. Mittels verschiedener Methoden wie bioinformatische Analysen, „EST assembly“, cDNA Bank „screening“ und „RACE-Experimenten“ konnten im Lauf dieser Arbeit mehrere Gene, darunter C1orf32, C4orf11, C7orf9, C12orf7, C14orf29, DAPL1 und GRM7, kloniert werden. Mit bioinformatischen Analysen und cDNA Bank „screening“ wurde die Volllänge cDNA Sequenz und die genomische Organisation von C7orf9 (alias RFRP), ermittelt. Das 1190 bp retinaspezifische Transkript auf Chromosom 7p15.3 kodiert ein Vorläuferprotein für mindestens zwei kleine Neuropeptide, RFRP-1 und RFRP-3. Da C7orf9 in einer kritischen Region für die dominante zystoide Makuladystrophie liegt, wurde eine mögliche Rolle für die Pathologie der Krankheit untersucht. Mittels Southern Blot Hybridisierungen und der Sequenzierung von C7orf9 zweier betroffener Patienten des gleichen Stammbaums, der für die Lokalisierung des Krankheitsgens verwendet worden war, konnte eine Beteiligung des Genes am Krankheitsbild ausgeschlossen werden. Mehrere Isoformen des C12orf7 Gens konnten mit Hilfe verschiedener Klone aus cDNA Bank „screeining“, PCR Amplifikationen und „RACE-Experimenten“ identifiziert werden. Die von Chromosom 12q13.13 transkribierten Genvarianten zeigen eine retinaspezifische Expression. Aufgrund der vielfältigen Spleißvarianten des Gens kann über die Eigenschaften des kodierten Proteins nur spekuliert werden. Das längste Transkript, das alle sechs Exone und die letzte Intron-Sequenz enthält, kodiert ein Protein mit 471 AS, das ein Kernlokalisierungssignal und fünf Ankyrin „Domains“ aufweist. Die Existenz mehrere Isoformen wurde auch in der Maus nachgewiesen, was auf eine funktionelle Relevanz in der Physiologie der Zelle hinweist. Fünf neue Spleißvarianten des Glutamat metabotropen Rezeptors 7 (GRM7) mit alternativen Exonen am 3´Ende wurden identifiziert und charakterisiert. Eine der neuen Varianten, GRM7_v3 kodiert ein 924 AS-langer Protein und stellt damit das mutmaßlich längste GRM7 Protein dar. Die Isoformen werden nicht retinaspezifisch, sondern verstärkt in neuronalen Gewebe exprimiert. Obwohl die funktionellen Eigenschaften der spezifischen Carboxyl-Enden noch nicht geklärt sind, ist bekannt, dass „axon-targeting“ von GRM7_v1 von den letzten 60 AS des Proteins vermittelt wird. Die neuen Isoformen könnten daher eine Rolle im subzellulären Transport des Proteins spielen. Das C1orf32 Gen, das vorwiegend in der Retina exprimiert wird, besitzt zehn Exone und liegt auf Chromosom 1q24.1. Mit bioinformatische Analysen konnten nicht nur die orthologen Gene des putativen Proteins mit 639 AS in Maus und Ratte, sondern auch das LISCH7 Gen als potentielles Mitglied der Genfamilie identifiziert werden. Für LISCH7 ist eine Funktion als „low density lipoprotein receptor“ bekannt, das C1orf32 Protein ist damit möglicherweise in den retinalen Fettstoffwechsel involviert. Störungen im Fettstoffwechsel sind als Ursache für AMD vorgeschlagen worden, die Rolle von C1orf32 in dieser komplexen Krankheit sollte deshalb untersucht werden. Expressionsanalysen des „death-associated protein-like 1“ (DAPL1) Gens zeigten eine hohe Expression sowohl in Retina als auch im retinales Pigmentepithel. Das 552 bp Transkript kodiert ein Protein mit 107 AS und liegt auf Chromosom 2q24.1. In-silico Analysen identifizierten 12 weitere verwandte Proteine verschiedener Spezies, die eine hohe Ähnlichkeit aufweisen und eine neue Proteinfamilie darstellen. Vor allem die Ähnlichkeit mit dem „death-associated“ Protein, das für den programmierten Zelltod essentiell ist, ist von besonderem Interesse. Apoptose ist meist der ultimative Grund der retinalen Degeneration und somit stellt DAPL1 ein ausgezeichnetes Kandidatengen für Retinopathien dar. C4orf11, lokalisiert auf Chromosom 4q21.22 und C14orf2, lokalisiert auf Chromosom 14q22.1, sind retinaspezifische Genen und werden in mehren Isoformen transkribiert. Die kodierten Proteine enthalten keine bekannten Domänen, wegen ihrer retinaspezifischen Transkription kann allerdings eine wichtige Rolle für die Funktion der Retina nicht ausgeschlossen werden. Als eines der langfristigen Ziele dieses Projekts wurden mehrere der geklonten Gene genotypisiert um „single nucleotide polymorphism“ (SNP) Karten zu erstellen. Die derzeitigen Projekte untersuchen die Haplotypfrequenzen der Kandidatengene in großen Kohorten von AMD Patienten und nicht betroffenen Kontrollpersonen. Die Kollektion von 111 retinaspezifischen oder –abundanten Genen, die in dieser Arbeit identifiziert und charakterisiert wurden, hat damit eine wichtige Grundlage für die weitere Erforschung retinaler Erkrankungen gelegt. KW - Netzhaut KW - Transkription KW - Gen KW - Netzhaut KW - Transkriptome KW - Retina KW - Transcriptome KW - Retina Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7278 ER - TY - THES A1 - Kilic, Mehtap T1 - Formation of caspase activating complexes and activation of caspase-12 during apoptosis in AKR-2B mouse fibroblasts T1 - Formation des Caspase Aktivierenden Komplexes und Aktivierung von Caspase-12 wahrend der Apoptose von AKR-2B Maus Fibroblasten N2 - Der Zelltod kann in Dichte-arretierten AKR-2B Mausfibroblasten durch Entzug des Serums oder Behandlung mit Anisomycin induziert werden. Der Zelltod zeigt zwar die für die Apoptose typischen morphologischen Veränderungen der Zelle wie Zellfragmentierung und Chromatinkondensation jedoch fehlen andere apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder Änderung des Membranpotentials der Mitochondria. Während der Apoptose wurde eine beachtliche DEVDase Aktivität nach- gewiesen, die einem einzelnen Enzym zugeordnet werden konnte. Dieses Enzym hatte typische Eigenschaften von Effektor-Caspasen, wie die der Caspase-3, besaß jedoch einen ungewöhnlich hohen KM Wert von 100 µM, und die Molmasse der großen Untereinheit betrug 19 kDa anstelle der erwarteten 17 kDa. Mit Hilfe des rekombinanten mCaspase-3 Proteins wurde dieses Enzym in der vorliegenden Untersuchung als Caspase-3 identifiziert. Die N-terminale Sequenzierung des mCaspase-3 Proteins ergab, daß sich die Spaltstelle seiner Prodomäne von der des humanen homologen Proteins unterschied (Asp-9 von Asp-28). Somit betrug die Molmasse der großen Untereinheit der aktiven Caspase-3 19 kDa. Darüberhinaus stimmte der KM-Wert der rekombinanter mCaspase-3 von ~100 µM mit der überein, die in Zellextrakten bestimmt wurde. Die Affinitätmarkierung in Kombination mit einer 2D-Gelelektrophorese bestätigte, daß tatsächlich Caspase-3 als Haupt-Effektor-Caspase in AKR-2B-Zellen während der Apoptose aktiviert wird. Im Folgenden wurde untersucht, welcher Signalwege in AKR-2B-Zellen, denen Serum aus dem Nährmedia entzogen wurden war oder die mit Anisomycin behandelt worden waren, zur Aktivierung der Caspase-3 führt. Da eine Beteiligunug des Rezeptor-vermittelte Signalweges bereits zuvor ausgeschlossen worden war,wurde überprüft, ob der mitochondrial vermittelte Signalweg bei der Aktivierung von Caspase-3 ein Rolle spielt. Gelfiltrations- experimente ergaben, daß Caspase-3 als freies Enzym und nur in geringen Mengen innerhalb unterschiedlich große Komplexe der Molmassen 600 kDa und 250 kDa eluiert wird. Obwohl die apparenten Molmassen der Caspase-3-haltigen Komplexe mit kürzlich veröffentlichten Daten übereinstimmten, enthielten sie weder Apaf-1 noch Caspase-9. Dies deutet daraufhin, daß der mitochondrial-vermittelte Signalweg ebenfalls nicht an der Caspase-3 Aktivierung beteiligt ist. Darüberhinaus wurde ein neuer Caspase-6 enthaltender Komplex (450 kDa) nach Serumentzug in AKR-2B-Zellen gefunden, der sich deutlich von Caspase-3 haltigen Komplexen unterscheidet. Caspase-3 ist für die meisten morphologische Veränderungen während der Apoptose verantwortlich. Wahrend der Apoptose in der AKR-2B-Zellen zwar Caspase-3 als Haupt-Effektor-Caspase identifiziert worden war, jedoch keine intranukleosomale Fragmentierung nachgeweisen werden konnen, da bei wurde die intrazelluläre Lokalisation der Caspase-3 untersucht. Durch Überexpression eines Caspase-3-GFP Fusionskonstruktes in AKR-2B Zellen wurde die Procaspase-3 im Cytoplasma lokalisiert, während die aktive Caspase-3 vorwiegend in membranumhüllten Vesikeln und zum Teil im Cytoplasma aktiviert wurde. Ebenfalls wurde eine mögliche Beteiligung von Caspase-12 und eine ER-Streß vermittelte Signalleitung an der Apoptose in AKR-2B-Zellen untersucht. Kinetische Untersuchungen zeigten, daß Caspase-12 im Fall von Serumentzug oder Behandlung mit Anisomycin zeitgleich mit Caspase-3 aktiviert wurde, was zur Bildung von zwei Spaltprodukte der Molmassen 47 kDa und 35 kDa führte. Gelfiltrationsexperimente ergaben, daß Caspase-12 als freies Enzym während der Apoptose auftritt. Bis zu diesem Zeitpunkt wurde in allen Publikationen beschrieben, daß Caspase-12 in Folge von ER-Streß aktiviert wird. Nach Serumentzug oder Zugabe von Anisomycin zu AKR-2B-Zellen wurde jedoch kein Anstieg der Synthese des Chaperon-Proteins Grp78, einem Marker für ER-Streß, beobachtet. Dies zeigt, daß beide Behandlungen nicht zur ER-Streß führen. Im Gegensatz dazu erzeugten bekannte Indikatoren von ER Streß wie Thapsigargin und A23187 (ionophor) ER-Streß in AKR-2B-Zellen, was zu unspezifischem Abbau der Caspase-12 führte. Darum ist es unwahrscheinlich, daß in AKR-2B- Zellen Caspase-12 bei ER-Streß aktiviert wird. Zusammenfassend zeigten diese Daten, daß Caspase-12 in AKR-2B-Zellen über Signalwegen aktiviert wird, die ER stress un- abhängig sind und zeigen daß Caspase-3 bei der Aktivierung von Caspase-12 beteiligt ist somit liefern die vorliegenden Untersuchungen einen Hinweis darauf daß neben den klassischen Signalwege weitere Signalwege existieren, die zur Apoptose führten. N2 - Density arrested AKR-2B cells die rapidly in response to serum starvation or treatment by Anisomycin. Cell death is associated with typical hallmarks of apoptosis including membrane blebbing and chromatin condensation but lacks energy dissipation in mitochondria and intranucleosomal fragmentation. During apoptosis a considerable DEVDase activity has been detected which seemed to be represented by a single enzyme. This enzyme had typical effector caspase characteristics, like caspase-3, but exhibited an unusual high KM values of ~100 µM and its large subunit exhibited a molecular weight of 19 kDa, instead of expected 17 kDa. In the present study, this enzyme was identified to be caspase-3 with the help of the generation of recombinant mcaspase-3 protein. N-terminal sequencing of the recombinant mcaspase-3 protein revealed that its prodomain cleavage site differs from that in the human homologue (Asp-9 instead of Asp-28). Thus the large subunit of active caspase-3 was found to be 19 kDa. Furthermore the KM value of recombinant mcaspase-3 was ~100 µM in perfect agreement with that found in cell extracts. Affinity labeling in combination with 2D-GE confirmed that indeed caspase-3 is activated as the main executioner in AKR-2B cells during apoptosis. Since the receptor mediated pathway has already been excluded previously [129], a possible involvement of mitochondria mediated pathway in the activation of caspase-3 was examined. Gel filtration experiments revealed that caspase-3 is mainly eluted as free enzyme and in lower levels within the differently sized high molecular weight complexes of ~600 kDa and 250 kDa in response to serum starvation or Anisomycin treatment. Though the apparent molecular weight of the complexes containing caspase-3 are in accordance with recently published data, they were devoid of Apaf-1 and caspase-9. Apparently, mitochondria mediated pathway is also not involved since neither formation of high molecular weight complexes of Apaf-1 nor cleavage of caspase-9 was observed. Thus, the activation of caspase-3 is caused by a noncanonical pathway during apoptosis. In addition a new 450 kDa complex containing activated caspase-6 was found in response to serum starvation which is clearly separated from caspase-3 containing complexes. Generally caspase-3 has been found to be responsible for most of the morphological changes during apoptosis. One of those is intranucleosomal fragmentation. Although caspase-3 was found to be the main executioner caspase in AKR-2B cells the lack of the intranucleosomal fragmentation led to examine its localization. As detected by overexpression of the Caspase-3-GFP fusion construct in AKR-2B, procaspase-3 was localized in the cytoplasm, wheras the active caspase-3 was mainly found in the membrane blebs and partially in the cytoplasm. Clearly no nuclear localization of active caspase-3 was detected. These data gave first hints on the mechanism of degradation of AKR-2B cells demonstrating that cytoplasmic membrane is the primary site of activation of caspase-3. The possible role of caspase-12 and ER stress mediated pathway of apoptosis was also examined in AKR-2B cells. Kinetic studies showed that caspase-12 is activated at the same time together with caspase-3 in response to serum starvation or Anisomycin treatment resulting in two cleavage products of 47 kDa and 35 kDa, respectively. It was therefore examined whether these two caspases were eluted in the same complexes. Gel filtration experiments revealed that caspase-12 is released as free enzyme during apoptosis. To date all the studies have identified that caspase-12 is specifically activated in response to ER stress. After serum starvation or Anisomycin addition there was no increase of the protein expression level of the chaperone protein Grp 78 which is known to be higly elevated in response to ER stress indicating that both treatments did not lead to ER stress. In contrast treatment with ER stressor substances i.e. Thapsigargin, A23187 (ionophore) induced an ER stress in AKR-2B which lead to unspecifically degradation of caspase-12. Thus it is unlikely that caspase-12 is activated in response to ER stress in AKR-2B cells. However, after the in vitro addition of recombinant caspase-3 to cytosolic extracts caspase-12 is cleaved into 47 kDa and 35 kDa fragments similiar to those observed in vivo. In conclusion the present data demostrated that caspase-12 is activated in AKR-2B cells during apoptosis triggered through pathways that do not involve (the) ER stress and provided evidence that caspase-3 might be involved in activation of caspase-12. Thus the present study in AKR-2B cells gives hints for the existence of additional pathways for apoptosis other than the classical ones. KW - Apoptosis KW - Caspasen KW - Apoptose KW - Casapse KW - AKR-2B KW - Fibroblasten KW - Apoptosis KW - Caspases KW - AKR-2B KW - fibroblasts Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7190 ER - TY - THES A1 - Pavel, Ioana-Emilia T1 - Vibrational spectroscopy and density functional theory calculations, a powerful approach for the characterization of pharmaceuticals and new organometallic complexes T1 - Schwingungsspektroskopie und Dichtefunktionaltheorie-Rechnungen, ein vielversprechender Ansatz zur Charakterisierung von Pharmazeutika und neuer metallorganischer Komplexe. N2 - In the current work, several well-known pharmaceuticals (1,4-dihydrazinophthalazine sulfate, caffeine, and papaverine hydrochloride) and new organometallic compounds (nickel(II) cupferronato complexes NiL2An, L = PhN2O2-, n = 1, A = o-phenanthroline (1), o,o’-bipyridine (2) and n = 2, A = H2O (3), o-NH2Py (4), o-C6H4(NH2)2 (5); silylene-bridged dinuclear iron complexes [Cp(OC)2Fe]2SiX2 (X = H (6), F (7), Cl (8), Br (9), I (10)); 3-silaoxetane 3,3-dimethyl-2,2,4,4-tetraphenyl-1-oxa-3-silacyclobutane (11) and 3-silathietane 3,3-dimethyl-2,2,4,4-tetraphenyl-1-sila-3-thiacyclobutane (12) compounds), which have successfully been characterized by using vibrational spectroscopy in conjunction with accurate density functional theory (DFT) calculations, are presented. The DFT computed molecular geometries of the species of interest reproduced the crystal structure data very well and in conjunction with IR and Raman measurements helped us to clarify the structures of the compounds, for which no experimental data were available; and this, especially for the new organometallic compounds, where the X-Ray analysis was limited by the non-availability of single crystals (3, 5, 10). Furthermore, a natural population analysis (NPA) and natural bond orbital (NBO) calculations together with a detailed analysis of the IR and Raman experimental as well as calculated spectra of the new organometallic compounds, allowed us to study some special bonding situations (1-12) or to monitor the structural changes observed with the change in temperature during the Raman experiments (11, 12). By combining these two methods (DFT and vibrational spectroscopy), the auspicious results obtained on the organometallic compounds 6-12 and overall in literature, made us confident of the power of theoretical calculations in aiding the interpretation of rich SERS spectra by solving some interesting issues. Consequently, the Raman and SERS spectra of well-known pharmaceuticals (1,4-dihydrazinophthalazine sulfate, caffeine, and papaverine hydrochloride) or new potentially biological active organometallic complexes (1-5), that were synthetized by our coworkers, were discussed with the assistance of the accurate results obtained from DFT calculations (structural parameters, harmonic vibrational wavenumbers, Raman scattering activities), and many previous incomplete assignments have been analyzed and improved. This allowed us to establish the vibrational behavior of these biological compounds near a biological artificial model at different pH values or concentrations (Ag substrate), taking into account that information about the species present under particular conditions could be of great importance for the interpretation of biochemical processes. The total electron density of molecules and the partial charges situated on selected atoms, which were determined theoretically by NPA, allowed us to establish the probability of different atoms acting as an adsorptive site for the metal surface. Moreover, a closer examination of the calculated orbitals of molecules brought further arguments on the presence or absence of the photoproducts at the Ag surface during the irradiation (1,4-dihydrazinophthalazine sulfate). Overall, the results provide a benchmark illustration of the virtues of DFT in aiding the interpretation of rich vibrational spectra attainable for larger polyatomic adsorbates by using SERS, as well as in furnishing detailed insight into the relation between the vibrational properties and the nature of the Ag substrate-adsorbate bonding. Therefore, we strongly believe that theoretical calculations will become a matter of rapidly growing scientific and practical interest in SERS. N2 - In der vorliegenden Arbeit werden allgemein bekannte Pharmazeutika (1,4-Dihydrazin-phtalazinsulfat, Koffein und Papaverinhydrochlorid) und mehrere neue metallorganische Verbindungen (Nickel(II)-Kupferron-Komplexe NiL2An, L = PhN2O2-, n = 1, A = o-phenanthrolin (1), o,o’-bipyridine (2) and n = 2, A = H2O (3), o-NH2Py (4), o-C6H4(NH2)2 (5); Silicium-verbrückte dinucleare Eisen-Komplexe [Cp(OC)2Fe]2SiX2 (X = H (6), F (7), Cl (8), Br (9), I (10)); 3-Silaoxetan 3,3-Dimethyl-2,2,4,4-tetraphenyl-1-oxa-3-silacyclobutan (11) und 3-Silathietan 3,3-Dimethyl-2,2,4,4-tetraphenyl-1-sila-thiacyclobutan (12) Verbindungen) vorgestellt, die erfolgreich unter Verwendung schwingungsspektroskopischer Methoden in Verbindung mit genauen DFT Rechnungen charakterisiert worden sind. Die mittels DFT berechneten Molekülgeometrien der uns interessierenden Substanzen gaben die Daten, die aus Kristallstrukturanalyse erhalten worden sind, sehr gut wieder und halfen uns zusammen mit IR- und Raman-Messungen die Strukturen der Verbindungen aufzuklären, für die bisher keine experimentellen Daten erhältlich waren. Besondere Aufmerksamkeit wurde denjenigen neuen Metallorganika geschenkt, deren Röntgenstrukturanalyse (3, 5, 10) auf Grund der Fehlens von Einkristallen eingeschränkt war. Desweiteren erlaubten uns “natural population analysis” (NPA)- und ” natural bond orbital“ (NBO)-Analysen, ebenso wie detallierte Auswertungen der experimentellen und berechneten Spektren (IR, Raman) der metallorganischen Verbindungen, die Untersuchung spezieller Bindungssituationen (1-12) und die strukturellen Änderungen (11, 12) zu verfolgen, die mit der Variation der Temperatur während der Raman-Messungen einhergehen. Die vielversprechenden Ergebnisse der Untersuchungen an metallorganischen Verbindungen 6-12 sowie entsprechende bisher publizierte Ergebnisse, die durch Kombination dieser zwei Methoden (DFT und Schwingungsspektroskopie) erhalten worden sind, machten uns zuversichtlich, dass theoretische Berechnungen bei der Auswertung auch komplexer SERS-Spektren durch Lösung einiger interessanter Probleme sehr behilflich sein könnten. Folglich konnten die Raman- und SERS-Spektren von bekannten Pharmazeutika (1,4-Dihydrazin-phtalazinsulfat, Koffein und Papaverinhydrochlorid) oder von neuen, potentiell biologisch aktiven Organometall-Komplexen (1-5), die von Mitarbeitern anderer Institute synthetisiert worden sind, unter Zuhilfenahme genauer Ergebnisse aus DFT-Rechnungen (strukturelle Parameter, harmonische Schwingungswellenzahlen, Raman-Streuaktivitäten) interpretiert werden. So war es möglich, viele bisher unvollständig zugeordnete Schwingungen zuzuordnen und zu erklären. Dies erlaubte uns, das Schwingungsverhalten dieser biologischen Substanzen innerhalb eines künstlichen biologischen Modells (Ag-Substrat) bei verschiedenen pH-Werten und Konzentrationen zu ermitteln. Informationen über das Verhalten solcher Verbindungen unter besonderen Bedingungen könnten bei der Interpretation biologischer Prozesse eine wichtige Rolle spielen. Die totale Elektronendichte dieser Moleküle und die Partialladung an unterschiedlichen Atomen, die durch NPA bestimmt wurden, ermöglichten uns, die Adsorptionswahrscheinlichkeit verschiedener Atome an bestimmten Stellen der Metalloberfläche zu ermitteln. Ferner lieferte eine genauere Betrachtung der berechneten Molekülorbitale weitere Hinweise auf das Auftreten oder Fehlen von Photoprodukten auf der Silberoberfläche während der Bestrahlung (1,4-Dihydrazin-phtalazinsulfat). Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse die Vorteile von DFT-Rechnungen bei der Interpretation komplexer Schwingungsspektren größerer polyatomarer Adsorbate auf, die nur unter Ausnützung des SERS-Effekts aufgenommen werden können. Auch tragen sie dazu bei, einen detaillierten Einblick in den Zusammenhang zwischen den Schwingungseigenschaften und der Natur der Silbersubstratadsorbat-Bindung zu liefern. Demzufolge sind wir davon überzeugt, dass theoretische Methoden einen größeren Stellenwert bei einem schnell wachsenden wissenschaftlichen und praktischen Interesse an SERS gewinnen werden. KW - Arzneimittel KW - Oberflächenverstärkter Raman-Effekt KW - Dichtefunktionsformalismus KW - Infrarot- und Raman-Spektroskopie KW - SERS KW - DFT KW - Pharmazeutika KW - neue metallorganische Komplexe KW - Infrared and Raman spectroscopy KW - SERS KW - DFT KW - pharmaceuticals KW - new organometallic complexes Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7186 ER - TY - THES A1 - Drüppel, Kirsten T1 - Petrogenesis of the Mesoproterozoic anorthosite, syenite and carbonatite suites of NW Namibia and their contribution to the metasomatic formation of the Swartbooisdrif sodalite deposits T1 - Petrogenese der mesoproterozoischen Anorthosite, Syenite und Karbonatite NW-Namibias und ihr Einfluss auf die metasomatische Bildung der Sodalith-Vorkommen von Swartbooisdrif N2 - During the Mesoproterozoic large volumes of magma were repeatedly emplaced within the basement of NW Namibia. Magmatic activity started with the intrusion of the anorthositic rocks of the Kunene Intrusive Complex (KIC) at 1,385-1,347 Ma. At its south-eastern margin the KIC was invaded by syenite dykes (1,380-1,340 Ma) and younger carbonatites (1,140-1,120 Ma) along ENE and SE trending faults. Older ferrocarbonatite intrusions, the ‘carbonatitic breccia’, frequently contain wallrock fragments, whereas subordinate ferrocarbonatite veins are almost xenolith-free. Metasomatic interaction between carbonatite-derived fluids and the neighbouring and incorporated anorthosites led to the formation of economically important sodalite deposits. Investigated anorthosite samples display the magmatic mineral assemblage of Pl (An37-75) ± Ol ± Opx ± Cpx + Ilm + Mag + Ap ± Zrn. Ilmenite and pyroxene are surrounded by narrow reaction rims of biotite and pargasite. During the subsolidus stage sporadic coronitic garnet-orthopyroxene-quartz assemblages were produced. Thermobarometry studies on amphiboles yield temperatures of 985-950°C whereas the chemical composition of coronitic garnet and orthopyroxene indicate a subsolidus re-equilibration of the KIC at conditions of 760 ± 100°C and 7.3 ± 1 kbar. In the syenites Kfs, Pl, Hbl and/or Cpx crystallized first, followed by a second generation of Kfs, Hbl, Fe-Ti oxides and Ttn. Crystallization of potassium feldspar occurred under temperatures of 890-790°C. For the crystallization of hastingsite pressures of 6.5 ± 0.6 kbar are obtained. In order to constrain the source rocks of the two suites, oxygen isotope analyses of feldspar as well as geochemical bulk rock analyses were carried out. In case of the anorthosites, the general geochemical characteristics are in excellent agreement with their derivation from fractionated basaltic liquids, with the d18O values (5.88 ± 0.19 ‰) proving their derivation from mantle-derived magmas. The results obtained for the felsic suite, provide evidence against consanguinity of the anorthosites and the syenites, i.e. (1) compositional gaps between the geochemical data of the two suites, (2) trace element data of the felsic suite points to a mixed crustal-mantle source, (3) syenites do not exhibit ubiquitous negative Eu-anomalies in their REE patterns, which would be expected from fractionation products of melts that previously formed plagioclase cumulates and (4) feldspar d18O values from the syenites fall in a range of 7.20-7.92 ‰, which, however, is about 1.6 ‰ higher than the average d18O of the anorthosites. Conformably, the crustal-derived felsic and the mantle-derived anorthositic suite are suggested to be coeval but not consanguineous. Their spatial and temporal association can be accounted for, if the heat necessary for crustal melting is provided by the upwelling and emplacement of mantle-derived melts, parental to the anorthosites. In order to constrain the source of the 1,140-1,120 Ma carbonatites and to elucidate the fenitizing processes, which led to the formation of the sodalite, detailed mineralogical and geochemical investigations, stable isotope (C,O,S) analyses and fluid inclusion measurements (microthermometrical studies and synchrotron-micro-XRF analyses) have been combined. There is striking evidence that carbonatites of both generations are magmatic in origin. They occur as dykes with cross-cutting relationships and margins disturbed by fenitic aureoles, and contain abundant flow-oriented xenoliths. The mineral assemblage of both carbonatite generations of Ank + Cal + Ilm + Mag + Bt ± Ap ± pyrochlore ± sulphides in the main carbonatite body and Ank + Cal + Mag ± pyrochlore ± rutile in the ferrocarbonatite veins, their geochemical characteristics and the O and C isotope values of ankerite (8.91 to 9.73 and –6.73 to –6.98, respectively) again indicate igneous derivation, with the 18O values suggesting minor subsolidus alteration. NaCl-rich fluids, released from the carbonatite melt mainly caused the fenitization of both, the incorporated and the bordering anorthosite. This process is characterized by the progressive transformation of Ca-rich plagioclase into albite and sodalite. Applying conventional geothermobarometry combined with fluid-inclusion isochore data, it was possible to reconstruct the P-T conditions for the carbonatite emplacement and crystallization (1200-630°C, 4-5 kbar) and for several mineral-forming processes during metasomatism (e.g. formation of sodalite: 800-530°C). The composition and evolutionary trends of the fenitizing solution were estimated from both the sequence of metasomatic reactions within wallrock xenoliths in the carbonatitic breccia and fluid inclusion data. The fenitizing solutions responsible for the transformation of albite into sodalite can be characterised as of NaCl-rich aqueous brines (19-30 wt.% NaCl eq.), that contained only minor amounts of Sr, Ba, Fe, Nb, and LREE. N2 - Die mesoproterozoische Entwicklung Namibias ist durch wiederholte magmatische Aktivität gekennzeichnet. Zunächst erfolgte vor 1385-1347 Ma die Platznahme von Anorthositen des Kunene-Intrusiv-Komplexes (KIK) innerhalb von hochgradig metamorphen Gesteinen des Epupa-Komplexes. Der KIK wurde nahe seiner südöstlichen Begrenzung von zahlreichen Störungen durchschlagen. In diese SE-NW und ENE-WSW streichenden Schwächezonen intrudierten Syenite (ca. 1380-1340 Ma) sowie jüngere Karbonatite (ca. 1140-1120 Ma). Hierbei erfolgte zunächst die Platznahme einer ersten Ferrokarbonatit-Generation, die in hohem Maße durch Anorthosit-Xenolithe kontaminiert ist („karbonatitische Brekzie“). Diese wird von jüngeren und annähernd Xenolith-freien Ferrokarbonatit-Adern durchschlagen. Metasomatische Wechselwirkungen den Karbonatit-Magmen und angrenzenden Anorthositen und Anorthosit-Xenolithen führten zur Bildung ökonomisch bedeutsamer Sodalith-Vorkommen. Die typische primär-magmatische Mineralogie in den Gesteinen des KIK umfasst: Pl (An37-75) ± Ol ± Opx ± Cpx + Fe-Ti-Oxide + Ap ± Zrn. Säume von Amphibol und Biotit umgeben Pyroxen und Ilmenit. Geothermometrische Untersuchungen ergaben Temperaturen von 985-950°C für die Kristallisation von Amphibol. Eine Reequilibrierung der Anorthosite unter granulit- bis amphibolitfaziellen Bedingungen (760 ± 100°C; 7.3 ± 1 kbar) wurde für Orthopyroxen-Granat-Quarz-Koronen um Olivin festgestellt. In den Syeniten kristallisierten zunächst Kfs, Pl, Cpx und Hbl, gefolgt von einer zweiten Generation von Kfs, Hbl, Fe-Ti-Oxiden und Ttn. Die Kristallisation von K-Feldspat fand unter Temperaturbedingungen von 890-790°C statt. Für die Kristallisation von Hastingsit wurden Drucke von 6.5 ± 0.6 kbar ermittelt. Mit dem Ziel, die Natur der Magmenquelle der Anorthosite und Syenite zu charakterisieren wurden geochemische Untersuchungen durchgeführt, sowie die Sauerstoff-Isotopie von Feldspat-Separaten bestimmt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen belegen, dass es sich bei den Stamm-Magmen der Anorthosite um fraktionierte basaltische Magmen handelt. Die d18O-Daten (5.61-6.13 ‰) legen nahe, dass diese Schmelzen durch partielle Aufschmelzung des Erdmantels entstanden sind. Die für die Syenite ermittelten Ergebnisse belegen, dass es sich bei Anorthositen und Syeniten um chemisch unabhängige Systeme handelt, da (1) keine chemische Kontinuität zwischen Anorthositen und Syeniten vorliegt, (2) die Spurenelementgehalte der Syenite auf eine gemischte Kruste-Mantel-Quelle hindeuten, (3) Chondrit-normierte Seltenerd-Element-Muster der Syenite keine negative Eu-Anomalie aufweisen, und (4) die d18O-Werte von Feldspat der Syenite mit 7.20-7.92 ‰ etwa 1.6 ‰ höher liegen als die der Anorthosite. Dementsprechend liegt die enge räumliche und zeitliche Assoziation von Anorthosite und Syeniten vermutlich darin begründet, dass der Aufstieg und die Platznahme der Stamm-Magmen der Anorthosite zum partiellen Aufschmelzen der Unterkruste und somit zur Bildung potentieller Stamm-Magmen der Syenite führten. Um eine umfassende Vorstellung über die genetische und zeitliche Stellung der Karbonatite und über die Sodalith-bildenden Vorgänge zu gewinnen, wurden verschiedene Untersuchungsmethoden angewendet (petrographische und Mikrosonden-analytische Bearbeitung von Dünnschliffen, Bestimmung der Gesamtgesteins-Geochemie, mikrothermometrische Untersuchungen sowie Synchrotron-XRF(SRXRF)-Untersuchungen von Fluid-Einschlüssen, Laser-ICPMS und SRXRF-Analysen der Spurenelement-Gehalte ausgesuchter Minerale sowie O-, C- und S-Isotopenanalytik). Die für die Karbonatite gewonnenen Ergebnisse belegen eindeutig, dass es sich hierbei um magmatische Kristallisationsprodukte fraktionierter Mantelschmelzen darstellen: Die Karbonatite treten als Gänge auf, welche ältere Gesteinseinheiten durchschlagen. Gesteine im Kontakt zu den Karbonatiten haben eine metasomatische Überprägung erfahren; Nebengesteinsklasten werden von Karbonat-reichen Lagen umflossen. Die Mineralogie beider Karbonatit-Generationen, i.e. (1) Ank + Cal + Mag + Bt ± Ilm ± Ap ± Pyrochlor ± Sulfide in der karbonatitischen Brekzie und (2) Ank + Cal + Mag ± Pyrochlor ± Rutil der Ferrokarbonatit-Adern, ihre geochemischen Signaturen sowie die O- und C-Isotopie von Ankerit (8.91-9.73 ‰ d18O und –6.73 bis –6.98 ‰ d13C) bestätigen diese Interpretation, wobei die O-Isotopendaten eine schwache hydrothermale Alteration der Karbonatite nahe legen. Die Ergebnisse von konventioneller Geothermometrie in Kombination mit den für Fluid-Einschlüsse kalkulierten Isochoren belegen, dass die Platznahme der Karbonatite unter P-T-Bedingungen von 4-5 kbar und 1200-630°C erfolgte. Unter Temperaturen von 800-530°C bewirkte die Zirkulation NaCl-reicher wässriger Fluide (19-30 Gew.% NaCl äquivalent) die Umwandlung von Albit der eingeschlossenen Anorthosit-Bruchstücke in Sodalith. Wie SRXRF-Analysen belegen, enthielten die fenitisierenden Fluide zudem geringe Konzentrationen an Sr, Ba, Fe, Nb und SEE. KW - Namibia KW - Mesoproterozoikum KW - Anorthosit KW - Syenit KW - Karbonatit KW - Gesteinsbildung KW - Anorthosit KW - Karbonatit KW - Namibia KW - Sodalith KW - Syenit KW - anorthosite KW - carbonatite KW - Namibia KW - sodalite KW - syenite Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6987 ER - TY - THES A1 - Abdel Rahman, Faisal Mirghani T1 - Systematic analysis of genes expressed in the retinal pigment epithelium (RPE) and identification of candidates for genetic susceptibility to age-related macular degeneration (AMD) N2 - Age related macular degeneration (AMD) is the leading cause of visual impairment in the elderly and the major cause of blindness in the developed world. To date, the molecular mechanisms underlying the disease are not well understood although in recent years a primary involvement of the retinal pigment epithelium (RPE) has become evident. The aim of the present study is to systematically analyse genes which are differentially expressed in the RPE, and to assess their possible association with mechanisms and pathways likely to be related to retinal disease, in particular AMD. Towards this goal, 2379 expressed sequence tags (ESTs) were established from an inhouse generated RPE cDNA library. This library was constructed by using the suppression subtraction hybridization (SSH) technique which normalises redundant sequences and ensures enrichment of rare transcripts. In a first phase, 1002 ESTs were sequenced and subjected to comprehensive alignment with public nucleotide and protein databases. A search of the 1002 ESTs against the human genome draft sequence yielded 168 known genes, 51 predicted genes, 15 unknown transcripts and 41 clones with no significant similarity. Reverse Northern blot hybridization was performed for 318 EST clusters to identify abundantly expressed genes in the RPE and to prioritize subsequent analyses. Representative clones were spotted onto a nylon membrane and hybridized with cDNA probes of driver (heart and liver) and tester (RPE) used in the cDNA library construction. Subsequently, 107 EST clusters were subjected to Northern blot hybridizations. These analyses identified 7 RPE-specific, 3 retina-specific, 7 RPE/retina-specific, and 7 tissue restricted transcripts, while 29 EST clusters were ubiquitously expressed, and evaluation was not possible for another 54 EST clusters. Of the 24 transcripts with specific or restricted expression, 16 clones were selected for further characterization. The predicted gene MGC2477 and 2 novel isoforms of the human transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 3 (TRPM3) were cloned and further described in detail. In addition, polymorphic variations for these 2 genes as well as for the human MT-Protocadherin gene were determined. For MGC2477, 15 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified, with 13 having a frequency of the minor allele greater than 20%. 10 of the 15 SNPs have not been reported in so far in public SNP repertoires. Partial assessment of the TRPM3 gene yielded 35 SNPs. Of these, 30 (85.7%) were highly frequent (0.17-0.5%), and 14 (40%) were novel. The MT-Protocadherin gene revealed 35 SNPs, including 28 (80%) with high frequency of the minor allele. 23 (65.7%) were novel SNPs. These SNPs will be used to construct the most common haplotypes. These will be used in case/control association studies in 400 AMD patients and 200 ethnically and aged matched controls to assess a possible contribution of these genes in the etiology of AMD. N2 - Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache von gravierenden Einschränkungen des Sehvermögens im fortgeschrittenen Lebensalter. In den Industriestaaten ist die AMD zudem die Hauptursache für Altersblindheit. Die molekularen Mechanismen, die zur Entstehung der AMD führen, sind bisher nur unzureichend bekannt. In den letzten Jahren hat es sich jedoch herausgestellt, dass das retinale Pigmentepithel (RPE) eine primäre Rolle in der Pathogenese der AMD spielt. Ziel dieser Arbeit war die systematische Analyse von Genen, welche im RPE differentiell exprimiert werden. Entsprechende Kandidatengene sollten auf deren mögliche Beteiligung an der Entstehung von Erkrankungen der Retina, insbesondere der AMD, untersucht werden. Zunächst wurden 2379 ESTs aus einer innerhalb der Arbeitsgruppe generierten RPE cDNA Bibliothek definiert. Die dazu verwendete cDNA Bibliothek wurde durch die Suppressions- Subtraktions Hybridisierungs-Technik (SSH) konstruiert. Diese Technik gestattet eine Normalisierung gegenüber redundanten Sequenzen und begünstigt gleichzeitig die Anreicherung von seltenen Transkripten. In einer ersten Phase wurden 1002 ESTs sequenziert und einer umfassenden bioinformatischen Analyse mit Hilfe der verfügbaren DNA- und Protein Datenbanken unterzogen. Der Vergleich der 1002 ESTs mit der Draft Sequenz des menschlichen Genoms ergab den Hinweis auf 168 bereits bekannte Gene, 51 mögliche Gene, 15 völlig unbekannte Transkripte und 41 nicht weiter zuordenbare cDNA Klone. 318 EST Cluster wurden einer reversen Northen-Blot Analyse unterzogen um hochexprimierte Gene zu identifizieren und damit Prioritäten für die weiteren Analysen zu setzen. Im Rahmen der Northern-Analyse wurden repräsentative Klone von 107 EST-Klustern mit cDNA Sonden der ursprünglichen cDNA-Bibliothek hybridisiert. Als Ergebnis dieser Analyse fanden sich 7 RPE-spezifische, 3 Retina-spezifische, 7 sowohl RPE- als auch Retinaspezifische sowie 7 auf einzelne Gewebe limitierte Transkripte. 29 EST Cluster erwiesen sich als ubiquitär exprimiert, und 54 Kluster konnten nicht näher zugeordnet werden. Von den 24 Transkripten mit spezifischer oder zumindest begrenzter Expression wurden 16 Klone zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Aus diesen Material wurden im Rahmen dieser Arbeit das Kandidatengen MGC2477 sowie 2 neue Isoformen des menschlichen TRPM3-Gens kloniert und näher charakterisiert. Weiterhin wurden polymorphe Varianten dieser beiden Isoformen und des menschlichen MTProtocadherin- Gens definiert. Im Gen MGC2477 wurden 15 SNPs identifiziert, wovon die Allelhäufigkeit des selteneren Allels bei 13 der SNPs über 20% lag. Für 10 der insgesamt 15 vii SNPs dieses Gens fanden sich bisher keine Einträge in den entprechenden Datenbanken. Die SNP-Suche wurde auch für das TRPM3-Gen durchgeführt und ergab 35 SNPs, wovon 30 (85,7%) als hochfrequent eingestuft werden konnten. 14 dieser 35 SNPs waren bisher nicht in den Datenbanken verzeichnet. Beim MT-Protocadherin-Gen fanden sich ebenfalls 35 SNPs, wobei 80% eine hohe Frequenz des selteneren Allels aufwiesen. In diesem Fall handelte es sich bei 23 der insgesamt 35 SNPs um bisher unbekannte Allele. Diese SNPs bilden den Ausgangspunkt zur Konstruktion der häufigsten Haplotypen der genannten Gene. Mit der Charakterisierung der Einzel-Nukleotid Polymorphismen der Kandidatengene wurde die Grundlage zur Durchführung von Fall/Kontrollstudien gelegt, in deren Rahmen die Bedeutung der jeweiligen Kandidatengene in der Pathogense der AMD untersucht werden kann. KW - Senile Makuladegeneration / Pigmentepithel / Genexpression KW - RPE KW - AMD KW - RPE specific genes Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7053 ER - TY - THES A1 - Nedvetsky, Pavel I. T1 - Regulation of the nitric oxide receptor, soluble guanylyl cyclase T1 - Regulation des Rezeptor des Stickstoffoxides löslicher Guanylylcyclase N2 - Soluble guanylyl cyclase (sGC) is the best established receptor for nitric oxide (NO) and regulates a great number of important physiological functions. Surprisingly, despite the wellappreciated roles of this enzyme in regulation of vascular tone, smooth muscle cell proliferation, platelet aggregation, renal sodium secretion, synaptic plasticity, and other functions, extremely little is known about the regulation of sGC activity and protein levels. To date, the only well-proven physiologically relevant sGC regulator is NO. In the present study, some additional possibilities for sGC regulation were shown. Firstly, we evaluated the ability of different NO donors to stimulate sGC. Significant differences in the sGC stimulation by SNP and DEA/NO were found. DEA/NO stimulated sGC much stronger than did SNP. Interestingly, no correlation between the sGC protein and maximal activity distribution was found in rat brain regions tested, suggesting the existence of some additional regulatory mechanisms for sGC. The failure of SNP to stimulate sGC maximally might be one of the reasons why the lack of correlation between the distribution of sGC activity and proteins in brain was not detected earlier. Prolonged exposure of endothelial cells to NO donors produced desensitization of the cGMP response. This desensitization cannot be explained by increased PDE activity, since PDE inhibitors were not able to prevent the NO donor-induced decrease of the maximal cGMP response in endothelial cells. The failure of SH-reducing agents to improve the cGMP response after its desensitization by NO suggests that a SH-independent mechanism mediates NO effects. Demonstration that the potency of the recently described activator of oxidized (heme-free) sGC, BAY58-2667, to stimulate sGC increases after prolonged exposure of the cells to an NO donor, DETA/NO, suggests that oxidation of heme may be a reason for NOinduced desensitization of sGC and decrease in sGC protein level. Indeed, the well-known heme-oxidizing agent ODQ produces a dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells and BAY58-2667 prevents this effect. Although the mechanism of sGC activation and stabilization by BAY58-2667 is unknown, this substance is an interesting candidate to modulate sGC under conditions where sGC heme iron is oxidized. Very little is known about regulation of sGC by intracellular localization or translocation between different intracellular compartments. In the present study, an increase in sGC sensitivity to NO under membrane association was demonstrated. Treatment of isolated lung with VEGF markedly increased sGC in membrane fractions of endothelial cells. Failure of VEGF to stimulate sGC membrane association in cultured endothelial cells allows us to propose a complex mechanism of regulation of sGC membrane association and/or a transient character of sGC membrane attachment. A very likely mechanism for the attachment of sGC to membranes is via sGCinteracting proteins. These proteins may participate also in other aspects of sGC regulation. The role of the recently described sGC interaction partner, Hsp90, was investigated. Shortterm treatment of endothelial cells with an Hsp90 inhibitor does not affect NO donor or calcium ionophore-stimulated cGMP accumulation in the cells. However, inhibition of Hsp90 results in a rapid and dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells. These effects were unrelated to changes in sGC transcription, since inhibition of transcription had much slower effect on sGC protein levels. In contrast, inhibitors of proteasomes abolished the reduction in sGC protein levels produced by an Hsp90 inhibitor, suggesting involvement of proteolytic degradation of sGC proteins during inhibition of Hsp90. All these data together suggest that Hsp90 is required to maintain mature sGC proteins. In conclusion, in the present study it was demonstrated that multiple mechanisms are involved in the regulation of sGC activity and its sensitivity to NO. Oxidation of sGC heme by NO seems to be one of the mechanisms for negative regulation of sGC in the presence of high or prolonged stimulation with NO. Another possible means of regulating sGC sensitivity to NO is via the intracellular translocation of the enzyme. It has been also demonstrated here that attachment of sGC to the membrane fraction results in an apparent increase in the enzyme sensitivity to NO. Additionally, Hsp90 was required to maintain sGC protein in endothelial and other cell types. However, we could not find any acute affect of Hsp90 on sGC activity, as reported recently. All these findings demonstrate that the regulation of sGC activity and protein level is a much more complex process than had been assumed earlier. N2 - Lösliche Guanylylcyclase (sGC) ist der Hauptrezeptor für Stickstoffmonooxid (NO), der sich an der Regulation zahlreicher physiologischer Funktionen beteiligt. Trotz ihrer sehr gut untersuchten Rolle in der Regulation der Blutgefässenrelaxation, synaptische Plastizität, Aggregation der Trombozyten, renale Sekretion und anderen wichtigen Funktionen, ist die Regulation der sGC selber noch nicht ausreichend verstanden. Der einzige, zur Zeit bekannte, physiologische Regulator der sGC ist NO. In der vorgelegten Arbeit wurde die Existenz anderer Möglichkeiten der sGC Regulation gezeigt. Zuerst, wurde die Fähigkeit verschiedener NO Donoren sGC zu stimulieren untersucht. DEA/NO stimulierte sGC viel stärker als SNP. Interessanterweise, wurde keine Korrelation zwischen der Verteilung des sGC Proteins und der Enzymaktivität unter Vmax- Bedingungen in verschiedenen Rattenhirnregionen gefunden. Das deutet auf zusätzliche Regulationsmechanismen hin. Die fehlende Fähigkeit von SNP sGC maximal zu stimulieren könnte ein Grund dafür sein, warum dieses Phänomen nicht schon früher gezeigt wurde. Langfristige Behandlung von Endothelzellen mit NO Donoren produzierte eine Desensitisierung der nachfolgenden cGMP Antwort. Diese Desensitisierung kann nicht durch erhöhte Phosphodiesterase-Aktivität erklärt werden, da Phosphodiesterasenhemmer die durch NO Donor verursachte Abnahme der cGMP Antwort nicht rückgängig macht. SHreduzierende Substanzen waren nicht in der Lage die cGMP Antwort zu verbessern, was zur Annahme führt, dass SH-Gruppenoxidation keine wichtige Rolle bei der Wirkung von NO auf sGC spielt. Es müssen daher andere Regulationsmechanismen vorhanden sein. Oxidation des Häms scheint ein möglicher Mechanismus der NO-induzierten sGC Desensitisierung. Einkürzlich beschriebener Aktivator der oxidierten (bzw. Häm-freien) sGC, BAY58-2667, stimulierte sGC nach Vorbehandlung mit NO Donoreb stärker als ohne Vorbehandlung. Es wird vermutet, dass oxidierte sGC verstärkt abgebaut wird was die durch NO oder Häm oxidierende Substanzen induzierte sGC Proteinabnahme erklären würde. Tatsächlich, nahm sGC Proteinlevel nach der Behandlung mit der Häm oxidierenden Substanz, ODQ, ab. BAY58-2667 verhinderte diesen Effekt. Ferner erhöht die Membranassoziation von sGC derer Empfindlichkeit gegenüber NO. Die Membranassoziation der sGC in Endothelzellen ist reguliert. Behandlung isolierter Lunge mit VEGF erhöht den Anteil an membrangebundener sGC in Endothelzellen dramatisch. In kultivierten Endothelzellen könnte VEGF die Membranassoziation jedoch nicht stimulieren, was einen komplexen Mechanismus der Membranassoziation der sGC in vivo vermuten lässt. Wenig ist bekannt über die Interaktionen von sGC mit anderen Protein und der möglichen Rolle dieser Interaktionen bei der Regulation des Enzyms. Proteininteraktionen scheinen aber ein möglicher Mechanismus für die Membranassoziation der sGC zu sein. Aus diesem Grund wurde die Rolle eines vor kurzem beschriebenen sGC-bindenden Proteins, Hsp90, auf die sGC Regulation untersucht. Kurzfristige Behandlung der Endothelzellen mit Hsp90 Inhibitoren hat keine Auswirkung auf NO Donor- und Calciumionophore-stimulierte cGMP-Produktion. Langfristige Hemmung von Hsp90 führte dagegen zur schnellen und deutlichen Abnahme des sGC Proteins. Dieser Effekt ist nicht durch eine Veränderung der Translation zu erklären, weil Tranlationshemmer einen viel langsameren sGC Abfall verursachten. Im Gegenteil, konnte ein Proteasomeninhibitor, MG132, die Effekte von Hsp90 Hemmern rückgängig machen. Das lässt eine proteolytische Abbau der sGC für die Effekte von Hsp90 Hemmer verantwortlich machen. Diese Daten deuten darauf hin, dass Hsp90 für Aufrechterhaltung des Enzyms notwendig ist. Zusammenfassend, wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass sGC Aktivität und ihre Empfindlichkeit gegenüber ihren Aktivator NO durch multiple Faktoren beeinflusst werden kann. Oxidation des Häms durch NO könnte ein Mechanismus der negativen Regulation der sGC bei dauernd erhöhter Konzentration von NO sein. Ein zusätzlicher Mechanismus der Regulation der Empfindlichkeit der sGC gegenüber NO scheint die intrazellulare Translokation zu sein. Wir konnten hier zeigen, das die Membranassoziation der sGC ihre Empfindlichkeit gegenüber NO erhöht. Auch dieProteinlevel der sGC scheinen unter Kontrolle verschiedener Faktoren zu sein. Einer davon ist Hsp90, der für die Aufrechterhaltung des sGC Proteins sowohl in Endothelzellen als auch in anderen Zelltypen notwendig ist. Alle diese Daten zeigen, dass Regulation der sGC ein viel komplexerer Vorgang ist als bis her angenommen wurde und eröffnen interessante neue Forschungsrichtungen innerhalb dieses wichtigen Signalweges. KW - Guanylatcyclase KW - Regulation KW - lösliche Guanylylcyclase KW - cGMP KW - Häm KW - Hsp90 KW - soluble guanylyl cyclase KW - cGMP KW - heme KW - Hsp90 Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7046 ER - TY - THES A1 - Fadl El Mola, Faisal Mohamed T1 - Bioinformatic and molecular approaches for the analysis of the retinal pigment epithelium (RPE) transcriptome N2 - There is substantial interest in the identification of genes underlying susceptibility to complex human diseases because of the potential utility of such genes in disease prediction and therapy. The complex age-related macular degeneration (AMD) is a prevalent cause of legal blindness in industrialized countries and predominantly affects the elderly population over 75 years of age. Although vision loss in AMD results from photoreceptor cell death in the central retina, the initial pathogenesis likely involves processes in the retinal pigment epithelium (RPE) (Liang and Godley, 2003). The goal of the current study was to identify and characterize genes specifically or abundantly expressed in the RPE in order to determine more comprehensively the transcriptome of the RPE. In addition, our aim was to assess the role of these genes in AMD pathogenesis. Towards this end, a bovine cDNA library enriched for RPE transcripts was constructed in-house using a PCR-based suppression subtractive hybridization (SSH) technique (Diatchenko et al., 1996, 1999), which normalizes for sequence abundance and achieves high enrichment for differentially expressed genes. CAP3 (Huang and Madan, 1999) was used to assemble the high quality sequences of all the 2379 ESTs into clusters or singletons. 1.2% of the 2379 RPE-ESTs contains vector sequences and was excluded from further analysis. 5% of the RPE-ESTs showed homology to multipe chromosomes and were not included in further assembly process. The rest of the ESTs (2245) were assembled into 175 contigs and 509 singletons, which revealed approximately 684 unique genes in the dataset. Out of the 684, 343 bovine RPE transcripts did not align to their human orthologues. A large fraction of clones were shown to include a considerable 3´untranslated regions of the gene that are not conserved between bovine and human. It is the coding regions that can be conserved between bovine and human and not the 3’ UTR (Sharma et al., 2002). Therefore, more sequencing from the cDNA library with reclustering of those 343 ESTs together with continuous blasting might reveal their human orthologoues. To handle the large volume of data that the RPE cDNA library project has generated a highly efficient and user-friendly RDBMS was designed. Using RDBMS data storage can be managed efficiently and flexibly. The RDBMS allows displaying the results in query-based form and report format with additional annotations, links and search functions. Out of the 341 known and predicted genes identified in this study, 2 were further analyzed. The RPE or/and retina specificity of these two clones were further confirmed by RT-PCR analysis in adult human tissues. Construction of a single nucleotide polymphism (SNP) map was initiated as a first step in future case/control association studies. SNP genotyping was carried out for one of these two clones (RPE01-D2, now known as RDH12). 12 SNPs were identified from direct sequencing of the 23.4-kb region, of which 5 are of high frequency. In a next step, comparison of allele frequencies between AMD patients and healthy controls is required. Completion of the expression analysis for other predicted genes identified during this study is in progress using real time RT-PCR and will provide additional candidate genes for further analyses. This study is expected to contribute to our understanding of the genetic basis of RPE function and to clarify the role of the RPE-expressed genes in the predisposition to AMD. It may also help reveal the mechanisms and pathways that are involved in the development of AMD or other retinal dystrophies. N2 - Es besteht ein grosses medizinisches Interesse an der Identifizierung von Genen, welche an der Entstehung komplexer, häufiger Krankheiten des Menschen beteiligt sind. Eine solche Krankheit ist die alters-korrelierte Makuladegeneration (AMD). Die AMD ist eine der häufigsten Ursachen für den Verlust der Sehfähigkeit im Alter von über 75 Jahren. Obwohl die Erblindung bei der AMD letztlich durch das Absterben von Photorezeptor-Zellen in der zentralen Retina bedingt wird, gibt es genügend Hinweise dafür, dass die Pathogenese der AMD ihren Ausgang vom retinalen Pigmentepithel (RPE) nimmt (Liang and Godley, 2003). Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung von RPE-spezifischen Genen als Beitrag zur umfassenden Charakterisierung des RPE-Transkriptoms. Darüberhinaus war es Ziel der Arbeit, die mögliche Rolle der RPE-spezifischen Gene bei der Entstehung der AMD zu explorieren. Ausgangspunkt der Arbeit war eine RPE-spezifische, bovine cDNA Bibliothek, welche in der Arbeitsgruppe auf der Grundlage der SSH-Technik (Diatchenko et al, 1996, 1999) hergestellt worden war. Die SSH-Technik gestattet die Anreicherung von differentiell exprimierten Genen bei gleichzeitiger Normalisierung redundanter Sequenzen. Mit Hilfe des Software-Programms CAP3 (Huang and Madan, 1999) wurden insgesamt 2379 ESTs gruppiert und geordnet. 1,2% der 2379 RPE-ESTs enthielten Vektor Sequenzen und wurden daher von der weiteren Analyse ausgeschlossen. 5% der RPE-ESTs wiesen Homologien zu multiplen Chromosomen auf und wurden daher ebenfalls von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Die übrigen 2245 ESTs wurden in 175 Contigs und 509 Singletons gruppiert, woraus sich Hinweise auf insgesamt 684 putative Einzelgene ergaben. 343 dieser 684 Klone zeigten jedoch keine Homologien zu humanen orthologen Sequenzen. Ursache für die fehlende Homologie muss in der grossen Zahl der Klone gesehen werden, bei welchen nur die 3´untranslatierten verglichen wurden. Im Gegensatz zu den kodierenden Sequenzabschnitten kommt es in den nicht-kodierenden Regionen in der Regel zu einer relativ raschen evolutionären Divergenz und damit zum Verlust der Homologie (Sharma et al, 2002). Durch zusätzliche Sequenzierung und Sequenzvergleiche der kodierenden Bereiche dieser 343 Klone lassen sich möglicherweise weitere RPE-spezifische Gene finden. Um die grosse Anzahl der im Rahmen des RPE-Projektes generierten Daten bearbeiten zu können wurde eine sehr effiziente und Benutzer-freundliche Datenbank auf Grundlage des RDBMS-Moduls etabliert. Dieses System gestattet die interaktive Bearbeitung der gespeicherten Daten im Query-Format. Darüberhinaus können die Daten in beliebiger Weise annotiert und verbunden werden. Nach Abzug der 343 nicht-homologen cDNA Klone von den 684 putativen Einzelsequenzen verblieben 341 Kandidaten-Sequenzen. 2 dieser Sequenzen wurden als putative neue RPE-spezifische Gene einer weiteren Analyse zugeführt. Dabei wurde zunächst die RPE- bzw. Retina-Spezifität dieser Kandidaten-Sequenzen mit Hilfe der RT-PCR Analyse bestätigt. Als Basis für zukünftige Fall-Kontroll- und Assoziationsstudien wurde eine SNP-Genotypisierung eines dieser zwei Klone (ursprüngliche Bezeichnung: RPE01-D2; derzeitige Bezeichnung: RDH12) durchgeführt. Die direkte Sequenzanalyse umfasste 23.4 kb und ergab insgesamt 12 SNPs, von denen sich 5 als hoch-informativ erwiesen. Auf dieser Grundlage können zukünftig Allel-Frequenzen zwischen Kontrollpersonen und AMD-Patienten ermittelt und verglichen werden. Zukünftig werden darüberhinaus real-time PCR Methoden zur Expressionsanalyse der verbliebenen Kandidaten-Klone eingesetzt. Zusammenfassend liefert die vorliegende Arbeit einen Beitrag zum Verständnis der genetischen Grundlagen der RPE-Funktionen und trägt zur Aufklärung der Rolle von RPE-spezifischen Genen bei der Disposition zur AMD bei. Zusätzlich ergaben sich Hinweise auf Kandidatengene, welche möglicherweise in der Pathogenese der AMD eine Rolle spielen. KW - Senile Makuladegeneration KW - Netzhaut KW - Pigmentepithel KW - Molekulargenetik KW - RPE KW - Bioinformatics KW - Age-related macular degeneration KW - Molecular approaches Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6877 ER - TY - THES A1 - Kittisak Sripha, T1 - NOVEL HETEROCYCLIC RING SYSTEMS DERIVED FROM CARACURINE V AS LIGANDS FOR THE ALLOSTERIC SITE OF MUSCARINIC M 2 RECEPTORS T1 - Neue heterozyklische Ringsysteme abgeleitet von Caracurine V als Liganden für die allosteriche Bindungstelle der Muscarin-M2-Rezeptoren N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Gebiet allosterischer Modulation des muscarinischen M2 Rezeptors. Allosterische Liganden beeinflussen das Bindungsverhalten eines orthosterischen Liganden (Agonisten oder Antagonisten) an die klassische Bindungsstelle des muscarinischen Rezeptors, indem sie seine Affinität entweder erhöhen(positive Kooperativität) oder erniedrigen (negative Kooperativität). Die allosterische Bindungsstelle befindet sich extrazellulär am Eingang der Rezeptor-Bindungstasche. Sie ist weniger konserviert als die orthosterische Bindungsdomäne, die tiefer im Rezeptorkanal zwischen den sieben transmembranalen Domänen lokalisiert ist. Demzufolge ist die Entwicklung subtyp-spezifischer allosterisch wirkenden Liganden leichter als subtypspezifischer Agonisten oder Antagonisten. Die Subtypselektivität kann darüber hinaus über unterschiedliche Kooperativitäten zwischen dem orthosterischen und allosterischen Liganden an verschiedenen muscarinischen Subtypen erreicht werden. Ein am M1-Rezeptor mit Acetylcholin positiv kooperativer allosterer Modulator, der sich an anderen muscarinischen Subtypen neutral kooperativ verhält, könnte z.B. für die Therapie von Morbus Alzheimer eingesetzt werden. Bisquartäre Ammoniumsalze des Strychnos-Alkaloids Caracurin-V gehören zu den potentesten allosterischen M2-Liganden. Die relative Stellung der aromatischen Indolringe und der Abstand zwischen den positiv geladenen Stickstoffatomen (ca. 10) in dem sehr starren Caracurin-V-Ringsystem definieren den Pharmakophor für potente allosterische Modulatoren. Caracurin-V-Salze sind strukturell sehr verwandt mit den starken Muskelrelaxantien Toxiferin-I und Alcuronium und besitzen vermutlich selbst neuromuskulär-blockierende Eigenschaften, was ihre Anwendung in der pharmakologischen Forschung einschränken würde. Reduktion des Caracurin-V-Ringsystems auf die wesentlichen Pharmakophorelemente könnte zu allosterisch wirksamen Verbindungen mit vernachlässigbarer muskelrelaxierender Wirkung führen. Ziel dieser Arbeit war die Synthese und pharmakologische Testung von Derivaten eines neuen, von Caracurin V abgeleiteten, heterocyclischen Ringsystems. Das neue gewünscht 6,7,14,15-Tetrahydro[1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]-diindole-Ringsystem(6) wurde in einer intermolekularen N-Alkylierung von zwei Molekülen Bromethylindol 5 aufgebaut. Die Ausgangsverbindung 5 konnte aus dem Indolylessigsäuremethylester 3 durch Reduktion der Estergruppe zum Alkohol und anschließende Substitution durch Brom dargestellt werden. Der bekannte Ester 3 wurde ausgehend von Tryptamin erhalten. Die dreistufige Synthese umfasste N-Dibenzylierung, Einführung der Malonestergruppe am C-2 von Indol und anschließende Demethoxycarbonylierung. Die Totalsynthese des neuen Pentacyclus ist im Schema 24 dargestellt. Die 3D-Struktur des neuen Ringgerüstes konnte mit Hilfe von NMR-Spektroskopie und semiempirischen Rechnungen (AM1) aufgeklärt werden. Verbindung 6 liegt in Lösung in einer verdrehten Wanne-Konformation mit unsymmetrisch angeordneten Seitenketten vor. Um den Einfluss der Seitenkettenlänge des neuen Ringsystems auf die allosterische Wirksamkeit zu untersuchen, war es geplannt, die Ethylamin-Gruppen durch Methylamin-Einheiten zu ersetzen. Der entsprechende Syntheseplan bestand darin, das unsubstituierte Ringsystem in einer doppelten Mannich-Reaktion zu aminomethylieren. Der Ausgangsstoff für die Dimerisierung, Bromethylindol 32, wurde aus Indol-2-carbonsäure hergestellt. Die Synthese umfasste folgende Reaktionsschritte: Reduktion der Carboxylgruppe und Benzoylierung des resultierenden Alkohols, nucleophile Substitution mit Kaliumcyanid, alkalische Hydrolyse des Cyanids zu Indolacetessigsäure, erneute Reduktion zum Alkohol und abschließende Substitution mit Brom. Da Dimerisierungsversuche von 32 nur zur Bildung des HBr-Eliminierungsproduktes 33 führten, wurde das entsprechende Tosylat als Ausgangsstoff eingesetzt. Überraschenderweise entstand nicht das erwartete Diazocinodiindol-Ringgerüst, sondern ausschließlich ein isomeres, noch nicht bekanntes 6,7,14,15-Tetrahydro-15aH-azocino[1,2-a:6,5-b]diindol-Ringsystem 35. Die Bildung des neuen unsymmetrischen Ringsystems ist auf den ambidenten Charakter des Indolylanions zurückzuführen, das entweder am Sticksoff oder an C3 alkyliert werden kann. Umsetzung von 35 nach Mannich lieferte das bisaminoalkylierte Produkt 37, neben einer kleinen Menge der monoalkylierten Verbindung 36. Die Totalsynthese des zweiten Ringsystems ist im Schema 25 dargestellt. Um potentere Verbindungen zu erhalten, wurden beide Endstufen 6 bzw. 37 mit Methyliodid zu 14 bzw. 38 quaternisiert. 37 wurde zusätzlich mit Allylgruppen zu 39 substituiert. Die pharmakologische Testung von 14, 37, und 38 erfolgte über Radioligandbindungsstudien an Membransuspensionen der Herzventrikel des Hausschweins. Der allostere Effekt der Testverbindungen wurde über die Hemmung der Dissoziation von [3H]-N-Methylscopolamin([3H]-NMS) von den damit gesättigten Rezeptoren gemessen. Die erhaltenen EC50,diss-Werte geben die Konzentration des allosteren Modulators an, bei der die [3H]-NMS-Dissoziation auf die Hälfte des Kontrollwertes reduziert ist. Sie sind ein Maß für die Affinität der Testsubstanzen zur allosterischen Bindungsstelle des M2 Rezeptors. Für die einzige Verbindung mit dem Diazocinodiindole-Ringsystem 14 wurde ein EC50,diss-Wert von 54 nM gemessen. Da 14 über vier Benzylsubstituenten verfügt, kann seine Bindungsaffinität am besten mit der von Dibenzylcaracurinium-Dibromid verglichen werden, die ganz ähnlich ist (69 nM). Aufgrund der Tatsache, dass die Verkleinerung des NSubstituenten am Caracurin-V-Gerüst zur erheblichen Steigerung der allosterischen Potenz führte, ist zu erwarten, dass der Austausch der voluminösen Benzylgruppen von 14 durch z.B. Methyl- oder Allylsubstituenten, eine deutliche Affinitätssteigerung bewirken würde. Damit scheint die allosterische Potenz des neuen Ringsystems mindestens genauso gut zu sein, wie die von Caracurin V. Die beiden Vertreter des Azocinodiindol-Ringsystems, 38 und 39, sind bereits mit den Gruppen substituiert, die die beste allosterische Potenz bei dem Caracurin-V-Ringsystem zeigten (Methyl- und Allyl). Ihre EC50,diss-Werte (35 nM für 38, 48 nM für 39) sprechen jedoch für eine ca. 4-fach schwächere Bindungsaffinität als die der entsprechenden Caracurine, was vermutlich auf einen anderen Abstand zwischen den quartären Stickstoffatomen und eine andere relative Stellung der Indolaromaten in den beiden Ringsystemen zurückzuführen ist. Anders als die entsprechenden Caracurin-V-Salze, sind 38 und 39 negativ kooperativ mit dem Antagonisten [3H]NMS. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass von den beiden neu synthetisierten heterocyclischen Ringsystemen das direkt von Caracurin V abgeleitete Tetrahydro- [1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]diindol eine bessere und vielversprechende Leitstruktur für die Entwicklung neuer potenter allosterischen Liganden des M2-Rezeptors darstellt. Weitere synthetische Arbeiten an dem Ringsystem wie z.B. Variation des Sticksstoffsubstituenten und der Seitenkettenlänge sollten zu einer Steigerung der Bindungsaffinität in den subnanomolaren Bereich führen. Darüber hinaus sind die Ergebnisse der pharmakologischen Testung an dem muskulären Typ des nicotinischen Acetylcholinrezeptors abzuwarten. N2 - The study deals with the area of the allosteric modulation of the muscarinic M2 receptors. The allosteric modulators have an influence on binding of orthosteric ligands (agonists and antagonists) to the classical orthosteric binding site of the muscarinic M2-receptors. The modulators are able to enhance (positive cooperativity) or decrease (negative cooperativity)the affinity of ligands to the orthosteric binding site. The allosteric binding site is located at the entrance of the receptor binding pocket. It is less conserved than the orthosteric binding site which is located in a narrow cavity created by the seven transmembrane domains. Consequently, development of subtype selective allosteric ligands is easier than subtypeselective muscarinic agonists or antagonists. Furthermore, subtype selectivity can be achieved by differently cooperative interactions between the allosteric and orthosteric ligand at different receptor subtypes. For example, the allosteric modulators that are positively cooperative with ACh at M1 receptors and neutrally cooperative at the other receptor subtypes could be beneficial for treatment of the Alzheimer’s disease. Bisquaternary analogues of the Strychnos alkaloid caracurine V are among the most potent allosteric modulators of muscarinic M2-receptors. The very rigid ring skeleton comprises the pharmacophoric elements of two positively charged nitrogens at an approximate distance of 10 surrounded by two aromatic ring systems in a distinct spatial arrangement. Owing to the close structural relationship of caracurine V salts to the strong muscle relaxants toxiferine and alcuronium, they are likely to exhibit neuromuscular blocking activity, which would limit their usefulness as research tools and make the therapeutical use impossible. Reduction of the caracurine V ring skeletons to structural features responsible for good allosteric potency could possibly lead to compounds with negligible neuromuscular blocking activity and very high affinity to the allosteric binding site at M2 receptor. Thus, the aim of this study was to synthesize and pharmacologically evaluate analogues of a novel heterocyclic ring system, which comprises the pharmacophoric elements mentioned previously. The key step of the synthesis of the desired 6,7,14,15-tetrahydro[1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]-diindole ring system (6) involved the intermolecular double N-alkylation of the bromoethylindole (5), which was prepared from the known indolyl methylacetate (3) by reduction of the ester group to alcohol and subsequent substitution by bromine. 3 could be prepared in three steps involving N,N-dibenzylation of tryptamine followed by introduction of the dimethyl malonate moiety at C-2 of indole ring and a subsequent demethoxycarbonylation. The total synthesis of 6,7,14,15-tetrahydro[1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]diindole ring system (6) is shown in Scheme 24. In order to examine the influence of the length of the side-chain on muscarinic activity,exchange of the ethylamine moieties of 14 by the methylamino groups was planned. This should be accomplished by dimerization of the unsubstituted 2-bromoethylindole (32), and subsequent Mannich aminomethylation of the resulting unsubstituted pentacyclic ring. The total synthesis of the 6,7,14,15-tetrahydro-15aH-azocino[1,2-a:6,5-b]diindole ring system(35) is shown in Scheme 25. 32 was prepared from indole-2-carboxylic acid in six steps involving reduction of the acid to the corresponding alcohol 26, benzoylation of 26 followed by nucleophilic substitution with KCN, hydrolysis of the cyanide 28 to indolyl acetic acid 29,reduction of 29 to the corresponding alcohol 30, and finally bromination of 30 to give the bromide 32. Since dimerization attempts of 32 provided only 2-vinylindole (33), the tosylate 34 was used as starting material for the intermolecular alkylation to give exclusively an isomeric pentacyclic ring system, 7,14,15-tetrahydro-15aH-azocino[1,2-a:6,5-b]diindole (35). The formation of the novel, asymmetric ring skeleton can be explained by the ambident nucleophilic character of the indolyl anion that can be alkylated either at nitrogen or at C-3 of indole ring. 35 was subjected to a Mannich reaction to give 2,13-dimethylaminoalkylated product 37 as well as small amounts of the 13-monosubstituted compound (36). The geometry of novel ring systems 6 was elucidated by means of NMR spectroscopy and semiempirical calculations. The diazocinodiindole ring skeleton of 6 exists in chloroform solution at room temperature in a twisted-boat conformation, as indicated by 600 MHz ROESY experiment, vicinal coupling constants within the eight-membered ring, and AM1 calculations. In order to obtain potent allosteric ligands, the new heterocycles 6 and 37 were quarternized with methyliodide to the corresponding ammonium salts 14 and 38, respectively. Additionally, the N,N -diallylsalts of 37 (compound 39) was prepared. The allosteric effect of 14, 38, and 39 on the dissociation of the orthosteric radioligand [3H]Nmethylscopolamine([3H]NMS) and their effects on [3H]NMS equilibrium binding were studied in homogenates of porcine heart ventricles. The concentration of an allosteric agent for a half-maximum effect on orthosteric ligand dissociation (EC50,diss) corresponds to a 50 % occupancy of the liganded receptors by the respective allosteric test compounds. Due to the presence of two benzyl groups on each nitrogen in the side chains of 14, its binding affinity can be best compared with that of N,N -dibenzylcaracurinium V dibromide (EC50,diss = 69 nM). Compound 14 exhibited the comparable affinity to N,N -dibenzylcaracurinium V dibromide with EC50,diss = 54 nM. This result suggested that replacement of the bulky benzyl groups of 14 by smaller substitutents will probably increase the allosteric potency, since dimethyl- and diallylcaracurinium salts showed a 5-fold increase of binding affinity relative to the dibenzyl analogue. Even though the new azocinodiindole ring system of 38 and 39, is not included in the caracurine V ring skeleton, it comprises the essentially pharmacophoric elements of allosteric potency. Due to the different spatial arrangements of the aromatic rings, as well as to different internitrogen distances in both ring systems, compound 38 and 39 exhibited 4-fold lower M2 binding affinity (EC50,diss = 35 and 48 nM, respectively) than the corresponding caracurine V analogues. This study deals with the synthesis of the first representative (Compound 6) of a novel pentacyclic ring system derived from caracurine V. The high allosteric potency of its dimethyl analogue reveals the [1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]-diindole ring system as a new promising lead structure for allosteric modulators of muscarinic M2 receptors. Future research will be focused on structural modifications of the new ring system in order to increase the affinity to the muscarinic receptors. Furthermore, the binding affinities of the new synthesized compounds to the muscle type of nicotinic ACh-receptor should reveal structural features responsible for the muscarinic/nicotinic selectivity. KW - Muscarinrezeptor KW - Allosterischer Effektor KW - Strychnosalkaloide KW - Analoga KW - Chemische Synthese KW - Allosterisch Modurator KW - Muscarinrezeptor KW - Tetrahydro[1 KW - 5]diazocino[1 KW - 2-a:6 KW - 5-a']diindol KW - Tetrahydro-15aH-azocino[1 KW - 2-a:6 KW - 5-b']diindol KW - Allosteric Modulator KW - Muscarinic receptor KW - Tetrahydro[1 KW - 5]diazocino[1 KW - 2-a:6 KW - 5-a']diindole KW - Tetrahydro-15aH-azocino[1 KW - 2-a:6 KW - 5-b']diindole Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6841 ER - TY - THES A1 - García Arguinzonis, Maísa Inés T1 - Analysis of signal transduction pathways and the cytoskeleton in VASP-deficient cell lines and mouse models N2 - The mammalian Vasodilator Stimulated Phosphoprotein (VASP) is a founding member of the Ena/VASP family of proteins that includes Drosophila Enabled (ena), the mammalian Ena homologue (Mena) and the Ena-VASP-like protein (Evl). VASP was initially discovered and characterized as a substrate for cGMP- and cAMP-dependent protein kinases (cGKs and cAKs). Ena/VASP proteins are involved in Actin-filament formation, plasma membrane protrusion, acceleration of Actin-based motility of Listeria and the establishment of cell-cell adhesion. Moreover, Ena/VASP proteins have been implicated as inhibitory factors in repulsive axon guidance and inhibition of plasma membrane activity and random motility in fibroblast. In order to study the physiological function of VASP, VASP-deficient mice had been generated in the laboratory by homologous recombination. VASP-/- mice showed hyperplasia of megakaryocytes in the bone marrow and spleen and a two-fold increase in thrombin- and collagen-induced platelet activation. To further investigate the cellular function of VASP, I established cardiac fibroblast cell lines derived from both wild type and VASP-/- mice. Both cell lines presented similar growth rates and normal contact dependent-growth inhibition but showed differences in morphology, migration and adhesion. Adherent VASP-/- cells, despite normal Mena and Evl expression levels, were highly spread. VASP-/- cells covered about twice the substrate surface area as wild type cells, while the cell volumes were unchanged. This shape difference suggests that VASP is involved in the regulation of spreading. Since the small GTPases Rac and Cdc 42 and their effector p21-activated kinase (Pak) are key regulators of lamellipodia formation and cell spreading, I analyzed this signalling pathway in VASP-/- cells stimulated with Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) or fetal calf serum. In wild type cells Rac and Pak were rapidly and transiently activated by PDGF or serum; however, in the absence of VASP both Rac and Pak activation was dramatically prolonged. The Rac/Pak pathway is known to play an essential role in cell motility. VASP deficient cells showed compromised migration and reorientation in a wound healing assay, probably due to enhanced Rac activity. The spreading phenotype, compromised migration and the effect observed on the Rac and Pak activities were reverted in VASP-/- cells stably transfected with full lenght human VASP, indicating a VASP dependent modulation of the Rac/Pak pathway and Rac/Pak regulated processes. Moreover, adhesion and detachment of VASP-deficient cells were significantly slower when compared to wild type cells. Preincubation of VASP+/+ cells with a cGMP analog accelerated adhesion. This acceleration did not take place in the VASP-/- cells, suggesting a VASP dependent effect. The second part of this work focused on VASP function in platelets. On the one hand I investigated the possibility of VASP-dependent Rac regulation in mouse platelets. Murine platelets are a good model for studying Rac regulation since they express high levels of VASP but not Mena/Evl and since VASP-deficient platelets show an increased platelet activation. Rac was activated by platelet agonists which was inhibited by preincubation with cGMP and cAMP analogs. Initial results which need to be extended showed that the cGMPcaused inhibition of Rac activation was VASP-dependent. Finally, in vivo platelet adhesion (platelet-vessel wall interactions) was studied using VASP-deficient mice. These studies demonstrated in-vivo that VASP down regulates platelet adhesion to the vascular wall under both physiological and pathophysiological conditions. N2 - Das Säugerprotein Vasodilator Stimulated Phosphoprotein (VASP) ist ein Gründungsmitglied der Ena/VASP Proteinfamilie, die das Drosophila Enabled (ena), das homologe Säugerprotein ena (Mena) und das Ena-VASP-like Protein (Evl) einschließt. VASP wurde ursprünglich als ein Substrat von cGMP- und cAMP abhängigen Proteinkinasen (cGKs und cAKs) entdeckt und charakterisiert. Ena/VASP Proteine sind bei der Polymerisation von Aktinfilamenten, bei der Protrusion von Plasmamembranen, der Beschleunigung von Aktinbasierter Beweglichkeit von Listerien und bei der Ausbildung von Zell-Zell-Adhäsionen beteiligt. Außerdem wurde gezeigt, dass Ena/VASP-Proteine hemmende Faktoren bei der repulsiven Axonführung sind und sowohl die Plasmamembranaktivität als auch die ungerichtete Fibroblastenbeweglichkeit hemmen. Um die physiologische Funktion von VASP zu untersuchen, wurden VASP-defiziente Mäuse im Labor durch homologe Rekombination generiert. VASP-/- Mäuse zeigten eine Hyperplasie der Megakaryozyten im Knochenmark und in der Milz sowie eine zweifache Erhöhung der durch Thrombin und Kollagen induzierten Plättchen-Aktivierung. Um die zelluläre Funktion von VASP weiter aufzuklären, etablierte ich kardiale Fibroblasten- Zelllinien sowohl von Wildtyp als auch von VASP-/- Mäusen. Beide Zelllinien zeigten gleiche Wachstumsraten und eine normale, kontaktabhängige Wachstumshemmung, hatten aber Unterschiede in ihrer Morphologie, Wanderung und Adhäsion. Adhärente VASP-/- Zellen waren trotz normaler Mena und Evl Expression stark ausgebreitet. VASP-/- Zellen bedeckten eine ungefähr zweimal so große Substratoberfläche wie Wildtyp-Zellen, während das Zellvolumen unverändert war. Diese Formunterschiede lassen vermuten, dass VASP bei der Regulation der Ausbreitung involviert ist. Da die kleinen GTPasen Rac und Cdc 42 und ihr Effektorsystem p21-aktivierte Kinase (Pak) Schlüsselregulatoren der Lamellipodienformierung und der Zellausdehnung sind, untersuchte ich diesen Signalweg in VASP-/- Zellen, die mit Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) oder fetalem Kälberserum stimuliert wurden. In Wildtypzellen wurden Rac und Pak schnell und transient durch PDGF oder Serum aktiviert, in der Abwesenheit von VASP war die Aktivierung von Rac und Pak jedoch dramatisch verlängert. Der Rac/Pak Signalweg ist dafür bekannt, dass er eine essentielle Rolle bei der Zellbeweglichkeit spielt. VASP defiziente Zellen zeigten, wahrscheinlich wegen der erhöhten Rac Aktivität, eine veränderte Wanderung und Reorientierung in einem Wundheilungs-Versuch. Der ausgebreitete Phänotyp, die veränderte Wanderung und die beobachteten Effekte bei den Rac und Pak Aktivitäten wurden in VASP-/- Zellen, die stabil mit humanem VASP transfiziert wurden, normalisiert, was eine VASP abhängige Steuerung des Rac/Pak Signalwegs und der Rac/Pak regulierten Prozesse vermuten läßt. Weiterhin waren die Adhäsion und die Ablösung von VASP-defizienten Zellen signifikant langsamer als in den Wildtyp-Zellen. Die Vorinkubation von VASP+/+ Zellen mit einem cGMP-Analog beschleunigte die Adhäsion. Diese Beschleunigung fand in VASP-/- Zellen nicht statt, was einen VASP-abhängigen Effekt vermuten läßt. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die VASP Funktion in Thrombozyten. Einerseits untersuchte ich die VASP-abhängige Regulation von Rac in murinen Thrombozyten. Diese sind dafür besonderes gut geeignet, da sie VASP aber nicht Mena/Evl exprimieren und da VASP-defiziente Thrombozyten verstärkt aktiviert werden. Rac wurde durch Thrombozyten-Agonisten aktiviert, was durch eine Präinkubation mit cGMP- und cAMP-Analoga gehemmt wurde. Erste Ergebnisse, die noch einer weiteren Bestätigung bedürfen, zeigten, daß die cGMP-vermittelte Hemmung der Rac-Aktivierung VASP-abhängig war. Abschließend wurde auch die in-vivo Plättchen-Adhäsion (Thrombozyten-Gefäßwand- Interaktion) unter Einsatz von VASP-defizienten Mäusen untersucht. Diese Ergebnisse zeigten für in-vivo-Bedingungen, daß VASP die Thrombozyten-Adhäsion an die Gefäßwand sowohl unter physiologischen als auch pathophysiologischen Bedingungen unterdrückt. KW - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein KW - Maus Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6195 ER - TY - THES A1 - Jovcic, Alexander T1 - Applications of aerobic and anaerobic bacteria in the fields of biological degradation of contaminants and biological wastewater treatment T1 - Applikation von aeroben und anaeroben Bakterien in den Bereichen biologischer Schadstoffabbau und biologische Abwasserreinigung N2 - In the work here presented four distinctly different problems were investigated. The first problem was an investigation into the degradation of Dichloroethylene (DCE) and 1,1-bis (p-Chlorophenyl)-2-dichloroethylene (DDE) utilising pure bacterial cultures. The second investigation dealt with the degradation of DDE and polychlorinated Biphenyl’s (PCB’s) utilising anaerobic sediments and soils from New Zealand. The third investigation worked on the Granulation of anaerobic River-sediments in Upflow Anaerobic Sludge Blanket (UASB) Reactors. The last investigation describes the commissioning of an industrial aerobic Wastewater Treatment Plant and the Implementation of biological Nitrogen- and Phosphate removal in this Wastewater Treatment Plant. Since the chemical Structure of DCE and DDE have certain similarities, Bacteria that were capable of degrading DCE, were tested here, whether they would also be able to degrade DDE utilising a co-metabolic pathway. In the experiments the aerobic bacteria Methylosinus trichosporium and Mycobacterium vaccae and the anaerobic bacteria Acetobacterium woodii and Clostridium butyricum were used. Approximately 60% of the added DCE was degraded by M. vaccae, while M. trichosporium degraded approximately 50%. A. woodii and C. butyricum degraded 40% and 30% respectively of the added DCE. Further experiments with these cultures and DDE lead to a microbial degradation of DDE to an extent of 34.6% for M. vaccae, 14.1% for C. butyricum, 2.2% for A. woodii and 10.5% for M. trichosporium. Additional experiments, utilising [14C]-DDE, showed that the DDE had not been degraded but were attached to the bacterial cells. The second investigation utilised anaerobic soils and sediments from New Zealand to study the anaerobic co-metabolic degradation of DDE and PCB’s. The soils and sediments originated from the River Waikato, from Wastewater Ponds in Kinleith, Marine-Sediments from Mapua, and a variety of soils comtaminated with Pentachlorophenyl (PCP). The cultures from these soils and sediments were raised on a variety of Carbon- and Energy-sources. Beside DDE, Aroclor 1260, and a mix of four pure PCB-Congeneres (one Tetra-, one Hexa, one Hepta- and one Deca-Chlorobiphenyl) were used to test for the reductive dechlorination. The cultivation process of the baceria lasted six months. Samples of the cultures were taken after zero, three and six months. These samples were tested for the increase of cell-protein, the degradation of carbon- and energy-sources, and the removal of the added polychlorinated chemicals. The organochlorines were analysed using reversed phase HPLC and FID-GC. When a change in the Chromatogram was detected the respective cultures were further analysed using ECD-GC and GC-MS. The results showed that the culutres grew under these conditions, but no degradation of DDE and the PCB-Mix could be detected, and only small changes in the composition/chromatograms of Aroclor 1260 were found. The third investigation worked on the Granulation of River-Sediments in UASB-Reactors. Sediments from the River Waikato in New Zealand and the River Saale in Germany were used. In both cases the Granulation process was successful, which was demonstrated by microscopic comparisons of the Sediments and the resulting Granules. The two main bacterial cultures detected were Methanosarcina- and Methanothrix-like cultures. The main carbon- and energy-source was Lactic Acid, which was used at a concentration of 21,8 g COD/L. The Granulation-Process was a combination of using high a COD-Concentration combined with a low Volumetric Loading-Rate. Comparisons of the specific degradation-rates of a variety of carbon- and energy-sources between the Sediments and the Granules, showed no increased degradation rates in regard to the same cell-mass, but the increased bio-mass in the Granules allowed for higher degradation-rates within the UASB-reactors. The fourth investigation describes the commissioning of an industrial Wastewater Treatment Plant for a Dairy-Site in Edendale, Southland, New Zealand. This Plant consists of a DAF-Unit (Dissolved Air Flotation), two Extended Aeration Lagoons with Activated Sludge and two Clarifiers, one for the Activated Sludge and the second for the dosing of Aluminium-Sulphate and the removal of Phosphat-Sulphate. Biological processes for the removal of carbon- and energy-sources were optimised and biological processes for the reduction of Nitrogen- and Phosphate-Concentrations within the wastewater were implemented and optimised. Bilogical removal rates for COD of 95% and above, for Nitrogen of 85-92% and Phosphate of 64-83% were achieved. N2 - In der hier vorgelegten Arbeit wurden vier distinkt verschiedene Probleme untersucht. Das erste Problem war die Untersuchung in den Abbau von Dichloroethylene (DCE) und 1,1-bis (p-chlorophenyl)-2-dichloroethylene (DDE) mithilfe von reinen bakteriellen Kulturen. Die zweite Untersuchung beschaeftigte sich mit dem Abbau von DDE und polychlorinierten Biphenylen (PCB’s) mithilfe von anaeroben Sedimenten und Erden aus New Zealand. Die dritte Untersuchung behandelt die Granulation von anaeroben Fluss-sedimenten in Upflow Anaerobic Sludge Blanket (UASB) Reaktoren. Die letzte Untersuchung behandelt das Anfahren einer industriellen aeroben Abwasser-anlage und die Implementierung von biologischem Stickstoff- und Phosphat-abbau in dieser Abwasser-anlage. Da die chemische Struktur von DCE und DDE gewisse Aehnlichkeiten besitzt, wurden hier wurden Bakterien untersucht, die in der Lage sind DCE abzubauen, ob diese DDE in einer cometabolischen Reaktion abbauen koennen. In den Experimenten wurden die aeroben Bakterien Methylosinus trichosporium und Mycobacterium vaccae und die anaeroben Bakterien Acetobacterium woodii und Clostridium butyricum benutzt. Ungefaehr 60% des hinzugefuegten DCE’s wurde von M. vaccae abgebaut, whaerend M. trichosporium ca 50% abbaute. A. woodii und C. butyricum bauten jeweils 40% und 30% des zugefuegten DCE’s ab. Weiterfuehrenden Experimente mit den obigen Kulturen und zugefuegtem DDE fuehrte zu einem mikrobiologischen Abbau von DDE in den Kulturen von 34.6% fuer M. vaccae, 14.1% fuer C. butyricum, 12.2% fuer A. woodii und 10.5% fuer M. trichosporium. Weitere Experimente, bei denen [14C]-DDE benutzt wurde, ergaben, dass das DDE nicht abgebaut worden war, sondern es stellte sich heraus, dass das DDE an die Bakterienzellen angelagert worden war. Die zweite Untersuchung benutzte anaerobe Erden und Sedimente aus New Zealand um den anaeroben cometabolischen Abbau von DDE und PCB’s zu studieren. Die Erden und Sedimente stammten von dem Fluss Waikato, aus Abwasser-Teichen in Kinleith, Meeresboden-Sedimenten aus Mapua, und verschiedene Erden die mit Pentachlorophenyl (PCP) kontaminiert waren. Die Kulturen aus diesen Erden und Sedimenten wurde mit verschiedenen Kohlenstoff- und Energie-Quellen aufgezogen. Neben DDE wurden Aroclor 1260 und ein Mix aus vier reinen PCB-Congeneren (ein Tetra-, ein Hexa, ein Hepta- und ein Deca-Chlorobiphenyl) fuer die reduktive Dechlorinierung benutzt. Die Aufzucht der Bakteria dauert sechs Monate, Proben wurden am Start der Kultivierung, nach drei und nach sechs Monaten genommen. Diese Proben wurden fuer die Veraenderung des Zellproteins, den Abbau der Kohlenstoof- und Energie-Quellen, und das Verschwinden der zugefuegten polychlorinierten Chemikalien ananlysiert. Die Organochlorine wurden mithilfe von reversed HPLC und dann FID-GC untersucht. Wenn eine Veraenderung in den Chromatogrammen auftrat wurden die entsprechenden Kulturen mithilfe von ECD-GC und GC-MS weitergehend untersucht. Die Resultate zeigten ein wachsen der Kulturen an, aber keinen Abbau von DDE und dem PCB-Mix, und nur geringe Veraenderungen der Komposition von Aroclor 1260. Die dritte Untersuchung befasste sich mit der Granulierung von anaeroben Fluss-sedimenten in UASB Reaktoren. Dafuer wurden Sedimente von dem Waikato in New Zealand und der Saale in Deutschland benutzt. In beiden Faellen war die Granulation erfolgreich, was durch mikroskopische Vergleiche von den Sedimenten und den Granules festgestellt werden konnte. Die zwei hauptsaechlichen Bakterien Kulturen waren Methanosarcina und Methanothrix aehnliche Kulturen. Die Haupt-Kohlenstoff- und Energie-Quelle war Lactic Acid und wurde mit einer Konzentration von 21,8 g COD/L verwendet. Der Granulations-Prozess war eine Kombination von einer hohen COD-Konzentration verbunden mit einer niedrigen volumetrischen Ladungs-Rate. Vergleiche der spezifischen Abbauraten von verschiedenen Kohlenstoff- und Energie-Quellen zwischen den Sedimenten und den Granules, ergab keine erhoehten Abbauraten in Bezug auf die gleiche Zellmasse, aber die erhoehte Biomasse in den Granules sorgt fuer groessere Abbauraten in den UASB Reaktoren. Die vierte Untersuchung befasste sich mit dem Anfahren einer industriellen Abwasser-Anlage fuer eine Molkerei in Edendale, Southland, New Zealand. Diese Anlage besteht aus einer DAF-Unit (Dissolved Air Flotation), zwei Abwasser-Teichen mit aktiver Schlammbehandlung und zwei Klaerbecken, eines fuer die Aktiv-Schlamm-Beseitigung und das zweite fuer die Dosierung von Aluminiumsulphat und die Entfernung von Phosphat-Sulphat. Biologische Verfahren zum Abbau von Kohlenstoff-Verbindugen wurden optimiert und biologische Verfahren zur Verringerung von Stickstoff- und Phospaht-Konzentrationen im Abwasser wurden implementiert und optimiert. Biologische Abbau-Raten fuer COD von ueber 95%, fuer Stickstoff 85-92% und Phosphat 64-83% wurden erreicht. KW - Biologische Abwasserreinigung KW - Bakterien Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6702 ER - TY - THES A1 - Groß, Michaela T1 - Genomic changes in Fanconi anemia: implications for diagnosis, pathogenesis and prognosis T1 - Genomische Veränderungen bei Fanconi-Anämie N2 - Fanconi anemia (FA) is a genetically and phenotypically heterogenous autoso- mal recessive disease associated with chromosomal instability, progressive bone marrow failure, typical birth defects and predisposition to neoplasia. The clinical phenotype is similar in all known complementation groups (FA-A, FA-B, FA-C,FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F and FA-G). The cellular phenotype is characterized by hypersensitivity to DNA crosslinking agents (MMC,DEB), which is exploited as a diagnostic tool. Alltogether, the FA proteins constitute a multiprotein pathway whose precise biochemical function(s) remain unknown. FANCA, FANCC, FANCE, FANCF and FANCG interact in a nuclear complex upstream of FANCD2. Complementation group FA-D1 was recently shown to be due to biallelic mutations in the human breast cancer gene 2 (BRCA2). After DNA damage, the nuclear complex regulates monoubiquitylation of FANCD2, result- ing in targeting of this protein into nuclear foci together with BRCA1 and other DNA damage response proteins. The close connection resp. identity of the FA genes and known players of the DSB repair pathways (BRCA1, BRCA2, Rad51) firmly establishs an important role of the FA gene family in the maintenance of genome integrity. The chapter 1 provides a general introduction to the thesis describing the current knowledge and unsolved problems of Fanconi anemia. The following chapters represent papers submitted or published in scientific literature. They are succeeded by a short general discussion (chapter 7). Mutation analysis in the Fanconi anemia genes revealed gene specific mutation spectra as well as different distributions throughout the genes. These results are described in chapter 1 and chapter 2 with main attention to the first genes identified, namely FANCC, FANCA and FANCG. In chapter 2 we provide general background on mutation analysis and we report all mutations published for FANCA, FANCC and FANCG as well as our own unpublished mutations until the year 2000. In chapter 3 we report a shift of the mutation spectrum previously reported for FANCC after examining ten FA-patients belonging to complementation group C. Seven of those patients carried at least one previously unknown mutation, whereas the other three patients carried five alleles with the Dutch founder mu- tation 65delG and one allele with the Ashkenazi founder mutation IVS4+4A>T, albeit without any known Ashkenazi ancestry. We also describe the first large deletion in FANCC. The newly detected alterations include two missense mu- tations (L423P and T529P) in the 3´-area of the FANCC gene. Since the only previously described missense mutation L554P is also located in this area, a case can be made for the existence of functional domain(s) in that region of the gene. In chapter 4 we report the spectrum of mutations found in the FANCG gene com- piled by several laboratories working on FA. As with other FA genes, most muta- tions have been found only once, however, the truncating mutation, E105X, was identified as a German founder mutation after haplotype analysis. Direct compar- ison of the murine and the human protein sequences revealed two leucine zipper motifs. In one of these the only identified missense mutation was located at a conserved residue, suggesting the leucine zipper providing an essential protein-protein interaction required for FANCG function. With regard to genotype-phenotype correlations, two patients carrying a homozygous E105X mutation were seen to have an early onset of the hematological disorder, whereas the missense mutation seems to lead to a disease with later onset and milder clinical course. In chapter 5 we explore the phenomenon of revertant mosaicism which emerges quite frequently in peripheral blood cells of patients suffering from FA. We de- scribe the types of reversion found in five mosaic FA-patients belonging to com- plementation groups FA-A and FA-C. For our single FA-C-patient intragenic crossover could be proven as the mechanism of self-correction. In the remaining four patients (all of them being compound heterozygous in FANCA), either the paternal or maternal allele has reverted back to WT sequence. We also describe a first example of in vitro phenotypic reversion via the emergence of a compensat- ing missense mutation 15 amino acids downstream of the constitutional mutation explaining the MMC-resistance of the lymphoblastoid cell line of this patient. In chapter 6 we report two FA-A mosaic patients where it could be shown that the spontaneous reversion had taken place in a single hematopoietic stem cell. This has been done by separating blood cells from both patients and searching for the reverted mutation in their granulocytes, monocytes, T- and B-lymphocytes as well as in skin fibroblasts. In both patients, all hematopoietic lineages, but not the fibroblasts, carried the reversion, and comparison to their increase in erythrocyte and platelet counts over time demonstrated that reversion must have taken place in a single hematopoietic stem cell. This corrected stem cell then has been able to undergo self-renewal and also to create a corrected progeny, which over time repopulated all hematopoietic lineages. The pancytopenia of these patients has been cured due to the strong selective growth advantage of the corrected cells in vivo and the increased apoptosis of the mutant hematopoietic cells. N2 - Fanconi Anämie (FA) stellt eine sowohl genetisch als auch phänotypisch hetero- gene, autosomal rezessive Erkrankung dar. Charakteristische Merkmale dieser Erkrankung sind die chromosomale Instabilität, ein fortschreitendes Knochen- marksversagen, multiple kongenitale Abnormalitäten und eine Prädisposition zu diversen Neoplasien. Dieser klinische Phänotyp ist bei allen bisher bekannten Komplementationsgruppen (FA-A, FA-B, FA-C, FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F and FA-G) ähnlich, ebenso wie der zelluläre Phänotyp, der durch Hy- persensitivität zu DNA-quervernetzenden Substanzen, wie MMC und DEB, gekennzeichnet ist. Diese Hypersensitivität wird dementsprechend in der FA-Diagnostik verwandt. Alle FA-Proteine arbeiten in einem "Multiprotein- Pathway" zusammen, dessen exakte biochemische Funktion noch nicht geklärt ist. FANCA, FANCC, FANCE, FANCF und FANCG interagieren in einem nukleären Komplex, der nach DNA-Schädigung die Monoubiquitylierung von FANCD2 reguliert, woraufhin man FANCD2 zusammen mit BRCA1 und anderen DNA-Reparaturproteinen in nukleären Foci detektieren kann. Die Komplemen- tationsgruppe FA-D1 wurde kürzlich biallelischen Mutationen im menschlichen Brustkrebsgen BRCA2 zugeordnet. Die enge Verbindung zwischen den FA- Genen und den Doppelstrangbruch(DSB)-Reparaturgenen (BRCA1, BRCA2, Rad51) deutet auf eine wichtige Rolle der FA-Genfamilie in der Erhaltung der genomischen Stabilität hin. Kapitel 1 gibt eine allgemeine Einleitung dieser Promotionsarbeit. Es liefert Hintergrundinformationen zu Fanconi Anämie basierend auf Publikationen bis einschließlich Mai 2002. In den darauffolgenden Kapiteln 2-6 sind eigene Veröf- fentlichungen zur Fanconi Anämie wiedergegeben, die entweder schon publiziert oder zur Veröffentlichung eingereicht worden sind. Zusätzlich zu den Diskussionsabschnitten in den einzelnen Veröffentlichungen werden diese fünf Arbeiten in Kapitel 7 kurz gemeinsam diskutiert. Die Mutationsanalyse in den diversen FA-Genen lieferte genspezifische Mutations- spektren sowie genspezifische Mutations-Verteilungen. Diese werden in Kapitel 1 und 2 beschrieben, wobei Kapitel 2 nur auf die zuerst entdeckten FA-Gene, FANCC, FANCA und FANCG, eingeht. In Kapitel 2 werden allgemeine Hinter- grundinformationen zur Mutationsanalyse geliefert und alle bis zum Jahr 2000 für FANCA, FANCC und FANCG publizierten Mutationen sowie unsere eigenen bis dato unveröffentlichten Veränderungen dargestellt. In Kapitel 3 berichten wir über eine bemerkenswerte Verschiebung des bisher beschriebenen FANCC-Mutationsspektrums. Von den zehn von uns untersuchten FA-C-Patienten trugen acht zumindest eine neue Mutation, wohingegen die drei restlichen Patienten fünf 65delG-Allele und ein IVS4+4A>T-Allel besaßen. Inter- essanterweise fanden wir auch erstmals große Deletionen im FANCC-Gen, deren Existenz bisher nur für FANCA beschrieben war. Weiterhin werden zwei bisher nicht bekannte Missense Mutationen (L423P und T529P) im 3´-Bereich des Gens beschrieben. In dieser Region findet sich auch der bisher einzige pathogene Aminosäureaustausch, L554P, was auf die Existenz einer funktionellen Domäne in dieser Genregion hindeutet. Außerdem scheinen unsere neu detektierten Muta- tionen vielmehr verstreut im Gen vorzuliegen als dies bisher angenommen worden war. Denn die bisher beschriebenen Veränderungen betreffen vor allem den Exon-bereich 5-6 sowie das amino- und carboxyterminale Ende von FANCC. Kapitel 4 beschreibt das Mutationsspektrum für FANCG, zusammengetragen von verschiedenen FA-Arbeitsgruppen. Wie in den anderen FA-Genen traten die meisten Mutationen auch hier nur einmal auf. Allerdings konnte die trunkierende Mutation, E105X, nach einer Haplotyp-Analyse als deutsche Gründermutation beschrieben werden. Ein direkter Vergleich der Proteinsequenzen von Men- sch und Maus ergab Hinweise auf konservierte Genabschnitte sowie auf zwei Leuzin-Zipper-Motive. Die einzige beschriebene Missense Mutation befindet sich in einem konservierten Bereich eines dieser beiden Leuzin-Zipper, was auf eine wichtige Rolle dieses Motivs für FANCG in Bezug auf Protein-Protein- Interaktionen schließen läßt. Obwohl die Anzahl der Patienten mit vergleichbaren Mutationen zu gering für statistisch signifikante Aussagen war, so fiel doch auf, dass bei den beiden Patienten mit einer homozygoten E105X-Mutation wesentlich früher hämatologische Probleme auftraten als bei dem Patienten mit der heterozygoten Missense Mutation, für den ein milder klinischer Verlauf sowie ein späteres Einsetzen hämatologischer Probleme berichtet wurde. Kapitel 5 und 6 behandeln das Phänomen des reversen Mosaizismus, der sehr häu- fig im Blut von FA-Patienten zu diagnostizieren ist. In Kapitel 5 beschreiben wir die Reversionsmechanismen von fünf Patienten, von denen einer der Komplemen- tationsgruppe C und die anderen vier der Komplementationsgruppe A angehören. Der Mechanismus, welcher der Selbstkorrektur des FA-C-Patienten zugrunde lag, konnte als intragene Rekombination definiert werden. Bei den verbleibenden vier compound heterozygoten FA-A-Patienten war jeweils eine Rückmutation zum Wildtyp auf dem mütterlichen bzw. väterlichen Allel ursächlich für die phäno- typische Gesundung der Blutzellen. Desweiteren beschreiben wir eine in vitro-Reversion in der lymphoblastoiden Linie eines unserer Patienten erstmals den Mechanismus einer sekundären Missense Mutation 15 Aminosäuren nach der kon- stitutionellen Mutation. Diese "kompensatorische" Mutation ist für die MMC- Resistenz der Zellinie verantwortlich. 4 von 5 der untersuchten Mosaik-Patienten zeigten eine eindeutige Verbesserung ihrer Blutwerte. Die Diagnose "Mosaizis-mus" verbessert offenbar die Prognose des Krankheitsbildes vor allem dann, wenn die Reversion eines Allels in einem frühen Stadium der Hämatopoiese auftritt. In Kapitel 6 berichten wir von zwei Mosaik-Patienten, bei denen untersucht wurde, wann in der Hämatopoiese die Reversion stattgefunden haben muss. Es konnte gezeigt werden, dass die Reversion in einer einzelnen hämatopoietischen Stammzelle erfolgte. Der Nachweis wurde durch die Isolierung einzelner Blutzell- typen, wie Granulozyten, Monozyten, T- und B-Zellen, aus dem peripheren Blut unserer Patienten sowie durch das Vorhandensein bzw. Nichtvorhanden- sein der Reversion in diesen Zellen geführt. Zum Vergleich wurden Hautfibrob- lasten herangezogen, da diese bei Mosaizismus im Blut nicht revertiert sind. In beiden Patienten trugen alle isolierten Blutzellen, nicht jedoch die Hautzellen, die Reversion. Dies und ein zusätzlicher Vergleich mit den zu diesem Zeit- punkt angestiegenen Erythrozyten- und Thrombozytenzahlen zeigten, dass die Reversion in einer einzigen hämatopoietischen Stammzelle stattgefunden haben muss. Dieser revertierten Stammzelle sind alle jeweils phänotypisch korrigierten Blutzellen zuzuschreiben, die dann die gesamte Hämatopoiese übernahmen und aufgrund eines in vivo Wachstumsvorteils sowie der erhöhten Apoptoserate der mutierten Zellen die Panzytopenie beider Patienten im Sinne einer "natürlichen" oder "spontanen" Gentherapie zur Ausheilung brachten. KW - Fanconi-Anämie KW - Genmutation KW - Fanconi Anämie KW - Mutationen KW - Mosaizismus KW - Reversion KW - Fanconi anemia KW - mutations KW - mosaicism KW - reversion Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6579 ER - TY - THES A1 - Schulte, Valerie T1 - In vitro and in vivo studies on the activating platelet collagen receptor glycoprotein VI in mice T1 - Glykoprotein VI, der aktivierende Kollagenrezeptor auf Blutplättchen - In vitro und in vivo Studien im Mausmodell N2 - The work summarized here focused on the characterization of the murine platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI and was performed to evaluate its potential as an antithrombotic target. The first mAb against (mouse) GPVI, JAQ1, was generated and used to demonstrate that GPVI requires the FcRgamma-chain for its expression and function and that this receptor is the central molecule in collagen-induced platelet activation. Blocking the major collagen binding site on GPVI with JAQ1 revealed the presence of a second activatory epitope within collagen. Additionally, the collagen receptor integrin alpha2beta1 was found to be required for activation via this second pathway but not to be essential for collagen-induced activation of normal platelets. In studies with mice expressing reduced levels of the GPVI-FcRgamma-complex, differential responses to GPVI ligands were observed. Most importantly, the striking difference between platelet responses to collagen and the GPVI specific synthetic collagen related peptide (CRP) confirmed the supportive role of other collagen receptor(s) on platelets. Irrespective of yet undefined additional receptors, studies with mice deficient in GPVI (FcRgamma-chain) or alpha2beta1 showed that GPVI, but not alpha2beta1 is essential for platelet-collagen interaction. Based on these results, the model of platelet attachment to collagen was revised establishing GPVI as the initial activating receptor which upregulates the activity of integrins, thus enabling firm attachment of platelets to the ECM. While the mAb JAQ1 had only limited inhibitory effects on collagen-induced activation in vitro, its in vivo application to mice resulted in completely abolished platelet responses to collagen and the GPVI specific agonists CRP and convulxin. This effect was found to be due to antibody-induced irreversible down-regulation of GPVI on circulating platelets for at least two weeks. Further studies revealed that GPVI depletion occurs independently of the targeted epitope on the receptor and does not require the divalent form of IgG as it was also induced by mAbs (JAQ2, JAQ3) or the respective Fab fragments directed against epitopes distinct from the major collagen binding site. The internalization of GPVI in vivo resulted in a long-term protection of the mice from lethal collagen-dependent thromboembolism whereas it had only moderate effects on the bleeding time, probably because the treatment did not affect other activation pathways. These results establish GPVI as a potential pharmacological target for the prevention of ischemic cardiovascular diseases and may open the way for a completely new generation of antithrombotics. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob der thrombozytäre Kollagenrezeptor Glykoprotein (GP) VI eine geeignete Zielstruktur für neue Antithrombotika darstellt. Dazu wurden monoklonale Antikörper (mAk) gegen murines GPVI hergestellt (JAQ1, 2 und 3) und deren in vitro und in vivo Effekte im Maussystem untersucht. Es wurde erstmals gezeigt, dass die Expression und Funktion von GPVI auf Thrombozyten von der Assoziation mit der signaltransduzierenden Fc Rezeptor gamma-Kette abhängt. Obwohl GPVI als zentraler Kollagenrezeptor auf Thrombozyten identifiziert wurde, hat die Blockade der Hauptbindestelle für Kollagen mit JAQ1 die Aktivierung nicht vollständig inhibiert, was erstmals die Existenz zweier unabhängiger aktivierender Motive im Kollagen zeigte. Der Kollagenrezeptor Integrin alpha2beta1 ist essentiell für eine Aktivierung durch diesen alternativen Signalweg, nicht jedoch für die Kollagen-induzierte Aktivierung normaler Thrombozyten. Die Präsenz anderer Kollagenrezeptoren neben GPVI wurde in Untersuchungen an Thrombozyten mit reduzierten Expressionsraten des GPVI-FcRgamma-Komplexes bestätigt. Unabhängig davon wurde jedoch anhand von GPVI-, FcRgamma- und alpha2beta1-defizienten Mäusen belegt, dass GPVI, nicht aber wie zuvor angenommen alpha2beta1 der zentrale Kollagenrezeptor auf Thrombozyten ist. Diese Ergebnisse wurden in einem veränderten Modell der Thrombozyten-Kollagen Interaktion zusammengefasst, in dem GPVI als der initiale Rezeptor zur Integrinaktivierung und somit zur festen Adhäsion der Thrombozyten an die EZM etabliert wird. Im Gegensatz zu den in vitro Resultaten mit JAQ1 waren Thrombozyten von anti-GPVI-behandelten Mäusen weder durch Kollagen noch durch andere GPVI Liganden aktivierbar. Es zeigte sich, dass die Antikörper in vivo die Internalisierung sowie den proteolytischen Abbau des Rezeptors induzierten. Dieser Effekt war unabhängig von der Bindungsstelle auf GPVI und konnte auch mit monovalenten anti-GPVI Fab Fragmenten erzielt werden. Während der mindestens zweiwöchigen GPVI-Defizienz der zirkulierenden Thrombozyten waren die JAQ1-behandelten Mäuse vor Kollagen-induzierter Thromboembolie geschützt. Darüber hinaus hatte die GPVI-Depletion nur geringe Effekte auf die Blutungszeit, wahrscheinlich weil diese Behandlung keine anderen Aktivierungswege beeinflusste. Diese Ergebnisse zeigen, dass GPVI ein viel versprechendes pharmakologisches Zielprotein für die prophylaktische Therapie kardiovaskulärer Krankheiten ist, das als Grundlage zur Entwicklung neuer Antithrombotika dienen kann. KW - Maus KW - Kollagen KW - Rezeptor KW - Antithrombotikum KW - Kollagen KW - Glykoprotein VI KW - Maus KW - Plättchen KW - Antithrombotika KW - Collagen KW - Glycoprotein VI KW - Mouse KW - Platelets KW - Antithrombotics Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6564 ER - TY - THES A1 - Mody, Karsten T1 - Patterns of arthropod distribution and determinants of arthropod assemblage composition in a natural West African savannah T1 - Verteilungsmuster von Arthropoden und zugrunde liegende Bestimmungsfaktoren in einer naturnahen westafrikanischen Savanne N2 - This study investigated patterns of arthropod community organisation and the processes structuring these communities on a range of different tree species in a natural West African savannah (Comoé National Park, Côte d'Ivoire). It described and analysed patterns of arthropod distribution on the level of whole communities, on the level of multiple-species interactions, and on the level of individual insect species. Community samples were obtained by applying (i) canopy fogging for mature individuals of three tree species (Anogeissus leiocarpa, Burkea africana, Crossopteryx febrifuga) and (ii) a modified beating technique allowing to sample the complete arthropod communities of the respective study plants for medium-sized (up to 3 m) individuals of two other species (Combretum fragrans, Pseudocedrela kotschyi). General information on ant-plant interactions was retrieved from ant community comparisons of the mature savannah trees. In addition, ant-ant, ant-plant and ant-herbivore interactions were studied in more detail considering the ant assemblages on the myrmecophilic tree Pseudocedrela kotschyi. Herbivore-plant interactions were investigated on a multiple-species level (interrelationships between herbivores and Pseudocedrela trees) and on a species level (detailed studies of interrelationships between herbivorous beetles and caterpillars and the host tree Combretum fragrans). The studies on individual herbivore species were complemented by a study on an abundant ant species, clarifying not only the relationship between host plant and associated animal but allowing also to look at interactive (competitive) aspects of community organisation. The study demonstrated for the first time that (i) the structure of beetle communities on tropical trees can be strongly dependent on the host tree species, (ii) individual trees can host specific arthropod communities whose characteristic structure is stable over years and is strongly determined by the individual tree's attributes, (iii) ants can express a pronounced fidelity to single leaves as foraging area and can thereby determine distribution patterns of other ants, (iv) intraspecifically variable palatability of plants for insect herbivores can be stable over years and can influence the distribution of herbivores that can distinguish between individual hosts according to palatability and (v) intraspecific host plant change can positively affect fitness of herbivores if host plant quality is variable. In general, the present study contributes to our knowledge of anthropogenically unaltered processes affecting community assembly in a natural environment. The fundamental understanding of these processes is crucial for the identification of anthropogenic alterations and the establishment of sustainable management measures. The study points out the important role local factors can play for the distribution of organisms and thereby for community organisation. It emphasises the relevance of small scale heterogeneity of the abiotic and biotic environment to biodiversity and the need to consider these factors for development of effective conservation and restoration strategies. N2 - In dieser Arbeit wurden die Arthropodengemeinschaften von fünf Baumarten in einer westafrikanischen Savanne (Comoé Nationalpark, Elfenbeinküste) untersucht. Die Zusammensetzung dieser Gemeinschaften sowie verschiedene Prozesse, die zur ihrer Strukturierung beitragen, wurden dabei auf drei verschiedenen Ebenen beschrieben und analysiert: auf der Ebene von Arthropodengemeinschaften (Gemeinschaftsniveau), auf der Ebene von Interaktionen zwischen mehreren Arthropodenarten (Interaktionsniveau) und auf der Ebene individueller Insektenarten (Artniveau). Die Erfassung der Arthropodengemeinschaften erfolgte zum einen durch Kronenbenebelung ("canopy fogging") ausgewachsener Bäume der drei Arten Anogeissus leiocarpa, Burkea africana und Crossopteryx febrifuga. Zum anderen wurde eine modifizierte Klopftechnik eingesetzt, die eine Erfassung von kompletten Arthropodengemeinschaften kleiner bis mittelgroßer (bis 3 m) Individuen der Baumarten Combretum fragrans und Pseudocedrela kotschyi ermöglichte. Eine genauere Analyse von Ameisengemeinschaften der adulten Savannenbäume lieferte generelle Informationen zu Ameisen-Pflanzen-Beziehungen. Zusätzlich wurden die Interaktionen zwischen Ameisen und Pflanzen sowie zwischen Ameisen und herbivoren Insekten anhand der mit dem myrmekophilen Savannenbaum Pseudocedrela kotschyi assoziierten Ameisengemeinschaften genauer untersucht. Die Wechselbeziehungen zwischen Herbivoren und Pflanzen wurden sowohl auf dem Interaktionsniveau (Beziehungen zwischen Herbivoren und Pseudocedrela-Bäumen) als auch auf der Ebene individueller Arten analysiert (detaillierte Untersuchungen zur Wechselbeziehung zwischen herbivoren Käfern und Raupen und ihrer Futterpflanze Combretum fragrans). Die an individuellen Herbivorenarten gewonnenen Erkenntnisse wurden durch eine Untersuchung einer häufig auf den Pseudocedrela-Bäumen anzutreffenden Ameisenart ergänzt. Diese Studie führte nicht nur zu einem besseren Verständnis der Wechselbeziehungen zwischen Wirtspflanze und assoziiertem Insekt, sondern ermöglichte es auch, interaktive (konkurrenzgesteuerte) Aspekte der Organisation von Arthropodengemeinschaften zu verstehen. Die vorgestellten Untersuchungen zeigten erstmals, dass (i) die Zusammensetzung von Käfergemeinschaften auf tropischen Bäumen stark von der Art der Wirtspflanze abhängig sein kann, (ii) individuelle Bäume spezifische Arthropodengemeinschaften beherbergen können, deren charakteristische Zusammensetzung über Jahre hinweg stabil ist und stark von den individuellen Baummerkmalen beeinflusst wird, (iii) Ameisen eine deutliche Ortstreue zu einzelnen Blättern als Fouragierbereich ausbilden können, und dadurch die Verteilungsmuster anderer Ameisen bestimmen können, (iv) individuelle Unterschiede artgleicher Pflanzen in ihrer Nahrungsqualität für herbivore Insekten über Jahre stabil sind und sich die Verteilung von bestimmten Herbivoren auf den Pflanzen dieser Nahrungsqualität anpasst, (v) ein Wechsel von artgleichen Wirtspflanzen die Fitness von Herbivoren positiv beeinflussen kann, wenn die Futterqualität der Wirtspflanzen sehr variabel ist. Insgesamt weist diese Studie besonders darauf hin, dass sehr kleinräumig wirkende, lokale Faktoren einen entscheidenden Einfluss auf die Verteilung von Organismen und die Zusammensetzung ökologischer Gemeinschaften ausüben. Sie betont die Relevanz einer kleinräumigen Umweltheterogenität für die Biodiversität eines Gebiets und verdeutlicht anhand erstmals festgestellter Zusammenhänge von Pflanzeneigenschaften und Arthropodenverteilung, dass die Heterogenität abiotischer und biotischer Umweltparameter bei der Entwicklung von nachhaltigen Management-Praktiken und von Naturschutz- und Restaurationskonzepten berücksichtigt werden muss. KW - Savanne KW - Baumkrone KW - Gliederfüßer KW - Arthropodengemeinschaft KW - Tier-Pflanze-Interaktionen KW - Ameisen KW - Diversität KW - Naturschutz KW - arthropod community KW - animal-plant interactions KW - ants KW - diversity KW - conservation Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6202 ER - TY - THES A1 - Bertram, Silke T1 - Late Quaternary sand ramps in south-western Namibia - Nature, origin and palaeoclimatological significance T1 - Quartäre Sandrampen in Südwest-Namibia - Charakteristik, Entstehung und paläoklimatische Bedeutung N2 - Sand ramps have been (and still are) neglected in geomorphological research. Only recently any awareness of their potential of being a major source of palaeoenvironmental information, thanks to their multi-process character, has been developed. In Namibia, sand ramps were terra incognita. This study defines, classifies and systematizes sand ramps, investigates the formative processes and examines their palaeoenvironmental significance. The study region is located between the coastal Namib desert and the Great Escarpment, between the Tiras Mountains to the north and the Aus area to the south. Two lines of work were followed: geomorphological and sedimentological investigations in the field, assisted by interpretation of satellite images, aerial photographs and topographic maps, and palaeopedological and sedimentological analytical work in the laboratory. Two generations of sand ramps could be identified. The older generation, represented by a single sand ramp within the study region, is characterized by the presence of old basal sediments. The bulk of the sand ramps is assigned to the young generation, which is divided into three morpho-types: in windward positions voluminous ramps are found, in leeward positions low-volume ramps exist, either of very high or very low slope angle. The most distinct characteristic of sand ramp sediments is their formation by interacting aeolian deposition and fluvial slope wash. The last period of deposition, which shaped all the entire young sand ramps, but also the upper part of the old ramp, is suggested to have occurred after c. 40 ka BP, implying a highly dynamic climatic system during that time, with seasonal aridity and low-frequency, but high-intensity rainfall. A phase of environmental stability followed, most likely around 25 ka BP, supporting growth of vegetation, stabilization and consolidation of the sediments as well as soil formation. Subsequently, the profile was truncated and a desert pavement formed, under climatic conditions comparable to those of the present semi-desert. The ramps were then largely cut off from the bedrock slopes, implying a change towards higher ecosystem variability. As the final major process, recent and modern aeolian sands accumulated on the upper ramp slopes. A luminescence date for the recent sand places their deposition at about 16 ka BP, close to the Last Glacial Maximum. Regarding the source of the sands, a local origin is proposed. For the sand ramp of the old generation the "basic cycle" of initial deposition, stabilization and denudation occurred twelve times, including a phase of calcrete and/or root-cast formation in each of them, adding up to around 60 changes in morphodynamics altogether. At least nine of these cycles took place between 105 ka BP and the LGM, indicating that the general cooling trend during the Late Pleistocene was subject to a high number of oscillations of the environmental conditions not identified before for southern Namibia. Due to the high resolution obtained by the study of sand ramp sediments, but also due to the very special situation of the study area in a desert margin, 100 km from the South Atlantic and in the transition zone between summer and winter rainfall, correlation with stratigraphies (of mostly lower resolution) established for different regions in southern Africa did not appear promising. In conclusion, sand ramps generally serve as a valuable tool for detailed deciphering of past morphodynamics and thereby palaeoenvironmental conditions. For south-west Namibia, sand ramps shed some more light on the Late Quaternary landscape evolution. N2 - In der geomorphologischen Forschung haben Sandrampen bislang wenig Beachtung gefunden, erst in jüngster Zeit ist auf ihr Potential als Speicher von Paläoumweltbedingungen hingewiesen worden. In Namibia waren Sandrampen terra incognita. Die vorliegende Studie definiert, klassifiziert und systematisiert Sandrampen in Südwest-Namibia, sie entschlüsselt ihre Bildungsprozesse und untersucht ihre paläoklimatische Bedeutung. Das Arbeitsgebiet liegt zwischen der küstenparallelen Namib und der Großen Randstufe, zwischen den Tirasbergen im Norden und der Gegend um Aus im Süden. Methodisch standen geomorphologische und sedimentologische Untersuchungen im Gelände im Vordergrund, unterstützt durch die Interpretation von Satellitenbildern, Luftbildern und topographischen Karten. Zahlreiche Substratproben wurden im Labor paläopedologisch und sedimentologisch analysiert. Es konnten zwei Sandrampen-Generationen identifiziert werden. Die ältere Generation, im Arbeitsgebiet durch nur eine Rampe vertreten, zeichnet sich durch das Vorkommen alter basaler Sedimente aus. Alle anderen Rampen sind der jüngeren Generation zuzuordnen und lassen sich in drei Morpho-Typen unterteilen: In Luv-Positionen finden sich voluminöse Rampen, während im Lee geringmächtige Rampen von entweder extrem steiler oder sehr geringer Hangneigung ausgebildet sind. Das auffälligste Merkmal der Sandrampen ist ihre Bildung durch die Interaktion von äolischer Deposition und Hangspülung. Die letzte Depositionsphase, in der die gesamten Körper der jungen Sandrampen abgelagert und die basalen Sedimente der alten Generation überlagert wurden, hat vermutlich nach 40 ka BP stattgefunden. Dies impliziert ein hochdynamisches klimatisches System zu dieser Zeit, mit saisonaler Aridität und seltenen, aber intensiven Regenfällen. Es folgte eine Phase der Ökosystemstabilität, vermutlich um 25 ka BP, in der es zu Vegetationsentwicklung und Bodenbildung sowie zu Stabilisierung und Konsolidierung der Sedimente kam. Eine anschließende Profilkappung mit Wüstenpflasterbildung geschah dann unter ähnlichen klimatischen Bedingungen wie in der heutigen Halbwüste. Danach wurden die Sandrampen fast überall von den Hängen abgeschnitten, was einer Änderung zu höherer Variabilität im Ökosystem zuzusprechen wäre. Die jüngste wesentliche Überprägung bestand in der Ablagerung subrezenter und moderner äolischer Sande in den obersten Bereichen der Sandrampen. Lumineszenzdatierungen stellen die subrezenten Sande ins letzte Hochglazial (~ 16 ka BP). Dem Sandrampensand wird eine lokale Herkunft zugesprochen. Für die Sandrampe der älteren Generation wiederholte sich der Zyklus von Deposition, Stabilisierung und Denudation insgesamt zwölfmal, inklusive je einer Phase von Kalkkrusten- und/oder Wurzelpseudomorphosenbildung. Insgesamt sind rund 60 Prozesswechsel dokumentiert. Mindestens neun dieser Zyklen verliefen zwischen 105 ka BP und dem letzten Hochglazial. Der generelle Abkühlungstrend während des Spätpleistozäns war also einer bedeutenden Anzahl von Schwankungen unterworfen, die bislang für Südnamibia nicht bekannt waren. Aufgrund der hohen zeitlichen Auflösung, die sich aus den Sandrampensedimenten erschließt, aber auch durch die besondere Lage des Arbeitsgebietes in einer Wüstenrandregion, 100 km vom Südatlantik entfernt und in der Übergangszone von Sommer- und Winterniederschlag, wurden Korrelationen mit Stratigraphien (von meist geringerer Auflösung), die für andere Regionen im südlichen Afrika aufgestellt worden sind, als wenig sinnvoll erachtet. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass sich Sandrampen generell sehr gut zur Entschlüsselung paläomorphodynamischer Prozesse eignen und damit wesentlich zur Rekonstruktion von Paläoumweltbedingungen beitragen. Für Südwest-Namibia liefern Sandrampen neue, detaillierte Informationen zur spätquartären Landschaftsgeschichte. KW - Namibia KW - Sand KW - Rampe KW - Geomorphologie KW - Sandrampen KW - Namibia KW - Geomorphologie KW - Landschaftsgeschichte KW - Trockengebiete KW - Sand ramps KW - Namibia KW - Geomorphology KW - Landscape evolution KW - Drylands Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6176 ER - TY - THES A1 - Krapf, Carmen T1 - Ephemeral river systems at the Skeleton Coast, NW-Namibia - Sedimentological and geomorphological studies on the braided river dominated Koigab Fan, the Cenozoic succession in the Uniabmond area and comparative studies on fluvio-aeolian interaction between ephemeral rivers and the Skeleton Coast Erg T1 - Ephemere Fluss-Systeme an der Skelettküste, NW Namibia N2 - The Skeleton Coast forms part of the Atlantic coastline of NW Namibia comprising several ephemeral rivers, which flow west-southwest towards the Atlantic Ocean. The area is hyper-arid with less than 50 mm average annual rainfall and a rainfall variability of 72%. Therefore, the major catchment areas of the rivers are about 100-200 km further inland in regions with relatively high annual rainfall of 300-600 mm. The coastal plain in the river downstream areas is characterized by a prominent NNW trending, 165 km long belt of 20-50 m high, locally compound, barchanoid and transverse dunes. This dune belt, termed Skeleton Coast Erg, starts abruptly with a series of barchans and large compound dunes 15 km north of the Koigab River and extends from 2-5 km inland sub-parallel to the South Atlantic margin of NW Namibia over a width of 3-20 km. As the SSE-NNW trending dune belt is oriented perpendicular to river flow, the dunefield dams and interacts with the west-southwestward flowing ephemeral river systems. This study focused on three main topics: 1) investigation and classification of the Koigab Fan, 2) the investigation of the Cenozoic succession in the Uniabmond area and 3) comparative studies of fluvio-aeolian interaction between five ephemeral rivers and the Skeleton Coast Erg. Sedimentological and geomorphological investigations show that the Koigab Fan represents a yet undocumented type of a braided fluvial fan system, which operates in an arid climatic, tropical latitude setting, is dominated by ephemeral mixed gravel/sand braided rivers, lacks significant vegetation on the fan surface, has been relatively little affected by human activity, is a perfect study site for recording various types of fluvio-aeolian interaction and thereby acts additionally as a model for certain Precambrian and Early Palaeozoic fan depositional systems deposited prior to the evolution of land plants. The Cenozoic succession in the Uniabmond area consists of three major unconformity-bounded units, which have been subdivided into the Red Canyon, the Whitecliff, and the Uniabmond Formation. The Tertiary Red Canyon Fm. is characterized by continental reddish sediments documenting an alluvial fan and braided river to floodplain depositional environment. The Whitecliff Fm. displays a wide variety of continental and marine facies. This formation provides the possibility to examine fluvio-aeolian interactions and spectacular, steep onlap relationships towards older sediments preserved in ancient seacliffs. The Whitecliff Fm. has been subdivided into four sedimentary cycles, which resulted from sea level changes during the Plio- to Middle Pleistocene. The following Uniabmond Fm. provides a unique insight into the depositional history of the NW Namibian coast during the Last Pleistocene glacial cycle. The formation has been subdivided into four units, which are separated by unconformities controlled by sea level changes. Unit 1 represents deposits of an Eemian palaeo-beach. The overlying Units 2-4 build up the sedimentary body of the Uniab Fan, again a braided river dominated fan, which is nowadays degraded and characterized by deeply incised valleys, deflation surfaces and aeolian landforms. The Uniabmond Fm. is overlain by the dunes of the Skeleton Coast Erg, whose development is related to the Last Glacial Maximum (LGM). The damming of river flow by aeolian landforms has been previously recognized as one of several principal types of fluvio-aeolian interaction. Five ephemeral rivers (from S to N: Koigab, Uniab, Hunkab, Hoanib, Hoarusib), which variously interact with the Skeleton Coast Erg, were chosen for the purpose of this study to consider the variability of parameters within these fluvio-aeolian systems and the resulting differences in the effectiveness of aeolian damming. The fluvio-aeolian interactions between the rivers and the dune field are controlled by the climate characteristics and the geology of the river catchment areas, the sediment load of the rivers, their depositional architecture, the longitudinal river profiles as well as the anatomy of the Skeleton Coast Erg. Resulting processes are 1) aeolian winnowing of fluvially derived sediments and sediment transfer into and deposition in the erg; 2) dune erosion during break-through resulting in hyperconcentrated flow and intra-erg mass flow deposits; 3) the development of extensive flood-reservoir basins caused by dune damming of the rivers during flood; 4) interdune flooding causing stacked mud-pond sequences; and 5) the termination of the erg by more frequent river floods. N2 - Das hyperaride Gebiet der Skelettküste im NW Namibias ist durch eine Vielzahl ephemerer Flußsysteme und einen über 165 km langen, NNW-streichenden Dünengürtel, den Skelettküsten-Erg, charakterisiert. Der Erg verläuft nahezu orthogonal zu den westwärts, zum Atlantik entwässernden ephemeren Flußsystemen, deren Haupteinzugsgebiete etwa 150-300 km östlich der Küste liegen. Bei ihrem unregelmäßigen Abkommen auf dem Weg zum Atlantischen Ozean müssen die meisten dieser westwärts entwässernden Riviere den Dünengürtel passieren. Aus diesem Grund wurde dieses Gebiet ausgewählt, um vergleichende sedimentologische und geomorphologische Studien durchzuführen, die sich auf folgende frei Schwerpunkte konzentrierten: 1) die Untersuchung und Klassifizierung des Koigab Fans und dessen Rolle für den Sedimenteintrag in den Skelettküsten Erg; 2) die detaillierte Aufnahme und Untersuchung der känozoischen Sedimente im Mündungsbereich des Uniab Riviers und deren Rolle bei der Interpretation von Plio- und Pleistozänen Meeresspiegelschwankungen; und 3) die Erlangung eines grundlegenden Verständnis der zugrundeliegenden Kontrollparameter für die Variabilität von fluvio-äolischen Interaktionen und der daraus resultierenden Sedimentkörpergeometrien. Im Mündungsbereich des Koigab Riviers befindet sich der Koigab Fan. Dieser ist mit einer Länge von 15 km und einer Breite von 21 km der größte aktive Fan der Skelettküste, der durch einen der westsüdwestwärts entwässernden ephemeren Flußsystemen gebildet wurde. Sedimentologische und geomorphologische Studien an dessen Ablagerungen ergaben, dass es sich bei ihm um einen bis jetzt noch nicht dokumentierten Fan-Typ innerhalb der bestehenden Fan-Klassifikationen handelt. Der Koigab Fan repräsentiert einen von verflochtenen ephemeren Flußrinnen aufgebauten Fan, der keine Anzeichen von Schuttstömen (debris flows) oder mäandrierenden Flußrinnen aufweist. Der Koigab-Fan stellt daher ein Endglied innerhalb des von Stanistreet & McCarthy (1993) zur Fan-Klassifikation aufgestellten Dreieckdiagramms dar. Dem Koigab-Fan kommt eine besondere Bedeutung zu, da er in Bezug auf Größe und Gradienten eine Brücke zwischen der Gruppe kleiner, steil abfallender Fans und den mit nur geringem Gefälle versehenen Mega-Fans schlägt. Trotz seiner Position in den Tropen liegt der Koigab-Fan in einem ariden Gebiet und ist durch eine ausgeprägte Vegetationsarmut gekennzeichnet. Sedimentologische Untersuchungen an seinen Ablagerungen können daher auch als Analogbeispiele für vegetationsfreie früh-proterozoische und früh-paläozoische Fan-Systeme verwendet werden. Zudem stellt der Koigab Fan eine wesentliche Sedimentquelle für den Skelettküsten Erg dar, was mit Hilfe von Schwermineral- und Korngrößenanalysen nachgewiesen werden konnte. Die im Mündungsbereich des Uniab Riviers anstehenden Sedimente stellen die am vollständigsten erhaltene und am besten aufgeschlossene känozoische Sedimentabfolge entlang der Küste NW-Namibias dar. Im Rahmen des Promotionsprojektes wurde diese Abfolge erstmals vollständig sedimentologisch bearbeitet und anhand markanter Diskordanzen in drei Formationen unterteilt: die Red Canyon, Whitecliff und Uniabmond Formation. Die tertiäre Red Canyon Fm. ist durch Rotsedimente charakterisiert, die in einem alluvial-fluvialen Milieu abgelagert wurden. Die überlagernde Whitecliff Fm. wird aus vier sedimentären Einheiten aufgebaut. Die älteste und die jüngste Einheit enthalten marine und äolische Ablagerungen, in denen fossile Strandniveaus überliefert sind. Diese können herangezogen werden um die Whitekliff Fm. in das späte Pliozän bis ins mittlere Pleistozän einzustufen. Mit den Sedimenten der Uniabmond Fm. ist höchst wahrscheinlich der letzte glaziale Zyklus des Pleistozäns überliefert. Die jüngsten Sedimente der Uniabmond Fm. werden direkt von dem Skelettküsten Erg überlagert, dessen Bildung mit dem letzten glazialen Meeresspiegel-Tiefstand zusammenfällt. Das Aufstauen von Flüssen durch Dünen stellt einen Haupttyp fluvio-äolischer Interaktion dar. Fünf ephemeren Flusssystemen, die unterschiedlich mit dem Skelettküsten Erg in Interaktion treten, wurden innerhalb dieser Studie eingehen untersucht, um die Bandbreite fluvio-äolischer Interaktionen und deren zugrundeliegenden Kontrollparameter zu erfassen. Die fluvio-äolischen Interaktionen zwischen den Flüssen und dem Dünenfeld werden kontrolliert durch Klimacharakteristika, die Geologie des Einzugsgebietes, die Sedimentfracht der Flüsse, ihre Ablagerungsarchitektur und die Anatomie des Skelettküsten Ergs. Die zu beobachtenden Prozesse sind 1) äolische Verfrachtung von fluvial antransportiertem Sediment und dessen Ablagerung in dem Erg; 2) die Erosion und Aufarbeitung von Dünen während Durchbruchsereignissen; 3) die Bildung ausgedehnter Stauseen; 4) die Flutung von Interdünenbereichen mit der Ablagerung von Ton-Silt-Abfolgen; und 5) die Termination des Ergs durch häufiger auftretende Fluten. KW - Namibia KW - Flusssystem KW - Fluviale Sedimentation KW - Geomorphologie KW - ephemere Fluss-Systeme KW - Skelettküste KW - Koigab Fan KW - Uniabmond KW - fluvio-äeolische Interaktion KW - Ephemeral rivers KW - Skeleton Coast KW - Koigab Fan KW - Uniabmond succession KW - fluvio-aeolian interaction Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6013 ER - TY - THES A1 - Visan, Ion Lucian T1 - P0 specific T-cell repertoire in wild-type and P0 deficient mice N2 - Zusammenfassung Das Myelinprotein P0 stellt eine zentrale Komponente für die Stabilität und Funktionalität der Myelinscheiden des peripheren Nervensystems dar. Mutationen des P0-Proteins führen zu verschiedenen, schwer behindernden peripheren Neuropathien wie der Charcot-Marie-Tooth- oder der Dejerine-Sotas-Erkrankung. Wir haben das Tiermodell der P0-Knock-Out-Mäuse verwendet, um im Vergleich zu den C57BL/6-Wildtyp-Tieren Selektionsmechanismen des P0-spezifischen T-Zell-Repertoires zu untersuchen. Dazu wurde eine Reihe von überlappenden 20-mer-Peptiden benutzt, die die gesamte Aminosäuresequenz von P0 abdeckten. Mit Hilfe dieser Peptide wurde ein sog. „Epitop-Mapping“ der H2-Ab-restringierten T-Zell-Antwort durchgeführt. Auf diese Weise konnte das P0-Peptid 5 (Aminosäure 41-60) in der extrazellulären P0-Domäne als immunogene Determinante identifiziert werden. Dieses immunogene Peptid wurde dann für Untersuchungen der Toleranzmechanismen verwendet und zeigte, dass in P0-Knock-Out-Mäusen ein hochreaktives P0-spezifisches T-Zell-Repertoire vorliegt, während es in Wildtyp-Tieren inaktiviert ist und so Selbsttoleranz erzeugt wird. Die Toleranzerzeugung in Wildtyp- und heterozygoten P0 +/- Mäusen hängt nicht von der Gen-Dosis ab. P0 ist ein gewebespezifisches Antigen, dessen Expression normalerweise auf myelinisierende Schwann-Zellen beschränkt ist. Die klassischen Vorstellungen zu Toleranzmechanismen gegenüber gewebsspezifischen Antigenen schrieben diese vor allem peripheren Immunmechanismen zu. Durch den erstmaligen Nachweis von intrathymischer Expression gewebsspezifischer Antigene wie P0 konnten wir bestätigen, dass für P0 offensichtlich die Expression deutlich weiter verbreitet ist, insbesondere auch auf Thymus-Stroma-Zellen. Unter Verwendung von Knochenmarkschimären haben wir weitere Untersuchungen durchgeführt, wie Knochenmarks-abstammende Zellen im Vergleich zu nicht-hämatopoetischen Zellen Toleranz gegenüber P0 erzeugen können. Unsere Befunde zeigen, dass Knochenmarks-abhängige Zellen nicht ausreichen, um völlige Toleranz zu erzeugen. Zusätzlich wurde eine P0-Expression auf anderen Geweben wie dem Thymus benötigt, um komplette Toleranz zu erhalten. Wir identifizierten ein kryptisches P0-Peptid 8 und zwei subdominante P0-Peptide 1 und 3. Während das Peptid 8 sowohl in Wildtyp- als auch Knock-Out-Mäusen erkannt wurde, wurden die Peptide 1 und 3 in Wildtyp-Mäusen nicht als Immunogen erkannt. Die genannten Peptide wurden verwendet, um eine experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) zu erzeugen. Mit keinem der experimentellen Ansätze konnten wir klinische Zeichen einer EAN generieren, allerdings mit dem Peptid 3 doch Entzündung im peripheren Nerven beobachten. Es werden zukünftig weitere Untersuchungen benötigt, um P0-spezifische T-Zell-Linien zu etablieren und so mit höherer Effizienz eine EAN zu erzeugen. Unsere Untersuchungen sprechen dafür, dass bei gentherapeutischen Ansätzen bei erblichen Neuropathien vorsichtig und schrittweise vorgegangen werden muss, da mit sekundärer Autoimmunität und damit Inflammation im peripheren Nerven zu rechnen ist. N2 - Summary Myelin protein zero (P0) is a key myelin component in maintaining the integrity and functionality of the peripheral nervous system. Mutated variants are the cause for several disabilitating peripheral neuropathies such as Charcot-Marie-Tooth disease or Dejerine –Sotas syndrome. Using P0 knockout mice - a mouse model for these diseases - together with their wt counterparts on C57BL/6 background we studied the shaping of the T-cell repertoire specific for P0 in the presence and in the absence of this protein during the ontogeny of T-cells. Our approach was to use a series of overlapping 20-mer peptides covering the entire amino acid sequence of P0. This series of P0 peptides was employed for epitope mapping of the H2-Ab restricted T cell response. Thus, P0 peptide 5 (P0 41-60) in the extracellular domain of P0 was identified as the main immunogenic peptide. The immunogenic peptide containing the core immunodominant determinant in the P0 sequence was employed in studies of tolerance, revealing a highly reactive P0 specific T-cell repertoire in P0 ko mice while in wt mice the high avidity repertoire was inactivated in order to ensure self tolerance. In wild type and heterozygous P0 mice tolerance is not dependent on gene dosage. P0 is a tissue specific antigen whose expression is limited to myelinating Schwann cells. The classical view on tolerance to tissue specific antigens attributed this role to peripheral mechanisms. Driven by the finding that intrathymic expression of tissue-specific antigens is a common occurrence, we confirmed that “promiscuous” expression on thymic stroma holds true also for myelin P0. In addition, using bone marrow chimeras we investigated the capacity of bone marrow derived cells versus nonhematopoietic cells to induce tolerance towards P0. Our findings show that bone marrow derived cells although tolerogenic to some degree are not sufficient to mediate complete tolerance. P0 expression on cells with origin other than bone marrow showed to be sufficient and necessary to induce sound tolerance. We identified one cryptic (P0 peptide 8) and two subdominant epitopes (P0 petides 1, and 3). P0 peptide 8 was reactive in both wt and P0 ko mice. Peptides 1 and 3 were immunogenic in P0 ko but not in wt mice. Several P0 peptides including the immunogenic peptide 5 were involved in direct and adoptive transfer EAN studies. None of them induced clinical signs of EAN. Immunization with P0 peptide 3 did induce inflammation of the peripheral nerves reflected by the infiltration of macrophages and CD3 positive cells. More studies involving highly P0 specific T-cell lines are needed to characterize the P0 induced EAN. Our findings may have direct implications for secondary autoimmunity and inflammation in peripheral nerves developing after correcting the P0 genetic defect by gene therapy in aforementioned diseases. KW - Myelin KW - Genmutation KW - T-Lymphozyt KW - autoimmunität KW - T-zell epitope KW - T-zell repertoir KW - toleranz KW - MPZ (P0) KW - autoimmunity KW - T-cell epitope KW - T-cell repertoire KW - tolerance KW - MPZ (P0) Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5734 ER - TY - THES A1 - Krämer, Franziska T1 - Molecular and Biochemical Investigations into VMD2, the gene associated with Best Disease T1 - Molekulare und biochemische Untersuchungen zur Charakterisierung des Morbus Best Gens, VMD2 N2 - Best disease (OMIM 153700) is an early-onset, autosomal dominant maculopathy characterized by egg yolk-like lesions in the central retina. The disease gene, the vitelliform macular dystrophy gene type 2 (VMD2), encodes a 585-aa VMD2 transmembrane protein, termed bestrophin. The protein is predominantly expressed on the basolateral side of the retinal pigment epithelium (RPE) and is thought to be involved in the transport of chloride ions. Bestrophin as well as three closely related VMD2-like proteins (VMD2L1-L3) contain multiple putative transmembrane (TM) domains and an invariant tripeptide (RFP) motif in the N-terminal half of the protein. This and the tissue-restricted expression to polarized epithelial cells are typical features of the VMD2 RFP-TM family. Best disease is predominantly caused by missense mutations, clustering in four distinct „hotspots“ in the evolutionary highly conserved N-terminal region of the protein. To further augment the spectrum of mutations and to gain novel insights into the underlying molecular mechanisms, we screened VMD2 in a large cohort of affected patients. In total, nine novel VMD2 mutations were identified, raising the total number of known Best disease-related mutations from 83 to 92. Eight out of nine novel mutations are hotspot-specific missense mutations, underscoring their functional/structural significance and corroborating the dominant-negative nature of the mutations. Of special interest is a one-basepair deletion (Pro260fsX288) encoding a truncated protein with a deletion of an important functional domain (TM domain four) as well as the entire C-terminal half of bestrophin. For the first time, a nonsense mutation leading to a 50 % non-functional protein has been identified suggesting that on rare occassions Best disease may be caused by haploinsufficiency. Molecular diagnostics strongly requires a reliable classification of VMD2 sequence changes into pathogenic and non-pathogenic types. Since the molecular pathomechanism is unclear at present, the pathogenicity of novel sequence changes of VMD2 are currently assessed in light of known mutations. We therefore initiated a publicly accessible VMD2 mutation database (http://www.uni-wuerzburg.de/humangenetics/vmd2.html) and are collecting and administrating the growing number of mutations, rare sequence variants and common polymorphisms. Missense mutations may disrupt the function of proteins in numerous ways. To evaluate the functional consequences of VMD2 mutations in respect to intracellular mislocalization and/or protein elimination, a set of molecular tools were generated. These included the establishment of an in vitro COS7 heterologous expression assay, the generation of numerous VMD2 mutations by site-directed mutagenesis as well as the development of bestrophin-specific antibodies. Surprisingly, membrane fractionation/Western blot experiments revealed no significant quantitative differences between intact and mutant bestrophin. Irrelevant of the type or location of mutation, incorporation of mutant bestrophin to the membraneous fraction was observed. Thus, impaired membrane integration may be ruled out as causative pathomechanism of Best disease consistent with a dominant-negative effect of the mutations. In a different approach, efforts were directed towards identifying and characterizing the VMD2 RFP-TM protein family in mouse. While clarification of the genomic organization of murine Vmd2 was required as basis to generate Vmd2-targeted animals (see below), the study of closely related proteins (Vmd2L1, Vmd2L2 and Vmd2L3) may provide further clues as to the function of bestrophin. For this, biocomputational as well as RT PCR analyses were performed. Moreover, the novel genes were analyzed by real time quantitative RT PCR, displaying predominant expression in testis, colon and skeletal muscle of Vmd2, Vmd2L1 and Vmd2L3 transcripts, respectively as well as in eye tissue. Interestingly, neither an ORF was determined for murine Vmd2L2 nor was the transcript present in a panel of 12 mouse tissues, suggesting that murine Vmd2L2 may represent a functionally inactive pseudogene. The murine Vmd2L3 gene, as its human counterpart, is a highly differentially spliced transcript. Finally, generating mouse models of Best disease will provide essential tools to investigate the pathophysiology of bestrophin in vivo. We have initiated the generation of two different mouse lineages, one deficient of Vmd2 (knock-out) and the other carrying a human disease-related mutation (Tyr227Asn) in the orthologous murine gene (knock-in). Genetic engineering of both constructs has been achieved and presently, four ES clones harboring the homologous recombination event (Vmd2+/-) have been isolated and are ready for the subsequent steps to generate chimeric animals. The resulting mouse lineages will represent two key models to elucidate the functional role of bestrophin in Best disease, in RPE development and physiology. N2 - Morbus Best (OMIM 153700) ist eine autosomal dominant vererbte Makulopathie mit juvenilem Beginn. Charakteristisch sind Eidotter-ähnliche Läsionen im zentralen Bereich der Retina. Das krankheitsverursachende Gen, das vitelliforme Makuladystrophie-Gen Typ 2 (VMD2), kodiert für ein 585 Aminosäuren langes Transmembranprotein. Das als Bestrophin bezeichnete Protein ist vorwiegend auf der basolateralen Seite des retinalen Pigmentepithels (RPE) exprimiert und wahrscheinlich am Transport von Chloridionen beteiligt. Bestrophin wie auch die drei eng-verwandten VMD2-ähnlichen Proteine (VMD2L1-L3) gehören zur Familie der VMD2 RFP-TM Proteine und sind durch putative Transmembrandomänen (TM) und ein invariantes Tripeptid (RFP) gekennzeichnet. Morbus Best wird hauptsächlich durch „missense“ Mutationen verursacht die in vier Bereichen („hotspots“) akkumulieren. Um das Mutationsspektrum zu erweitern und darüber hinaus den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus weitergehend aufzuklären, wurde das VMD2 Gen in betroffenen Patienten untersucht. Insgesamt wurden neun bisher nicht beschriebene Mutationen identifiziert, wodurch sich die Anzahl der bekannten krankheitsassoziierten Mutationen auf 92 erhöhte. Wie die meisten der bisher bekannten Mutationen befinden sich acht „missense“ Mutationen in den sogenannten „hotspots“ des Gens. Dies unterstreicht die funktionelle bzw. strukturelle Bedeutung der betroffenen Regionen sowie den dominant-negativen Effekt der Mutationen. Bemerkenswert ist eine atypische 1-Basenpaar-Deletion (Pro260fsX288) in Exon 7. Denn erstmals wurde eine „nonsense“ Mutation im VMD2 Gen identifiziert, die 50 % nicht-funktionelles Protein zur Folge hat. In seltenen Fällen scheint daher die durch „nonsense“ Mutationen bedingte Haploinsuffizienz der Krankheit zugrunde liegen. Die molekulare Diagnostik verlangt eine zuverlässliche Einteilung der VMD2 Sequenzänderungen in pathogene und nicht-pathogene Gruppen. Da der molekulare Pathomechanismus zurzeit weitgehend ungeklärt ist, wird die Pathogenität neuer Sequenzänderungen aufgrund bereits bekannter Mutationen eingestuft. Es wurde daher eine öffentlich zugängliche VMD2 Mutationsdatenbank eingerichtet (http://www.uni-wuerzburg.de/humangenetics/vmd2.html), in der die wachsende Zahl an Mutationen, Sequenzvarianten und Polymorphismen gesammelt und verwaltet wird. „Missense“ Mutationen können die Proteinfunktion auf verschiedene Weise beeinträchtigen. Geeignete molekulare Assays wurden daher etabliert, um die funkionellen Auswirkungen der VMD2 Mutationen in Hinblick auf die intrazelluläre Lokalisation zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein heterologes COS7 Expressionssystem entwickelt, es wurden verschiedene Mutationen mittels „site-directed mutagenesis“ generiert sowie Bestrophin-spezifische Antikörper hergestellt. Überraschenderweise konnte anhand von Membranfraktionierungs- und Westernblot-Analysen keine signifikanten quantitativen Unterschiede zwischen intakten und mutierten Bestrophin nachgewiesen werden. Unabhängig von Art oder Position der Mutation konnte der Einbau von mutiertem Bestrophin in die Membran gezeigt werden. Die Experimente deuten erstmalig darauf hin daß eine fehlerhafte Membranintegration als kausaler krankheitsverursachender Mechanismus ausgeschlossen werden kann. Dies liegt in Übereinstimmung mit dem dominant-negativen Effekt der Mutationen. In einem alternativen Ansatz wurde die VMD2 RFP-TM Proteinfamilie im Mausgenom identifiziert und charakterisiert. Während die Aufklärung der genomischen Struktur des Vmd2 Gens die Grundlage zur Herstellung Vmd2 transgener Mäuse darstellte (siehe unten), gewährte die Charakterisierung der eng verwandten Vmd2L1-L3 Mausgene weitere Einblicke in die Funktion des Bestrophins. Hierzu wurden bioinformatische sowie RT PCR Analysen durchgeführt. Darüber hinaus wurde die präferientielle Expression der jeweiligen Transkripte in Testis, Kolon und Skelettmuskel sowie Augengewebe anhand von „real-time quantitative“ RT PCR nachgewiesen. Interessanterweise stellt Vmd2L2 wahrscheinlich ein funktionell inaktives Pseudogen dar. Ähnlich wie sein humanes Gegenstück wird das Maus Vmd2L3- Transkript auf mRNA Ebene differentiell prozessiert. Mausmodelle für Morbus Best stellen grundlegende Hilfsmittel dar, die Pathophysiology von Bestrophin in vivo zu untersuchen. Es wurde die Herstellung zweier verschiedener Mauslinien initiiert: zum einen ein Vmd2-defizientes „knock-out“ Modell, zum anderen eine „knock-in“ Maus, die eine humane krankheitsassoziierte Mutation (Tyr227Asn) im mausorthologen Gen trägt. Die entsprechenden Konstrukte wurden hergestellt und in ES Zellen eingeschleust. Ausgehend von bislang vier isolierten ES Klonen, die den Vmd2+/- Genotyp tragen, können nun in nachfolgenden Schritten chimäre Tiere generiert werden. Die resultierenden Mauslinien repräsentieren neue experimentelle Ansätze, die funktionelle Rolle des Bestrophins in Morbus Best sowie in der Entwicklung und Physiologie des RPEs aufzukären. KW - Best-Krankheit KW - Genmutation KW - Morbus Best KW - BMD KW - VMD2 KW - Makuladegeneration KW - Mausmodell KW - Best Disease KW - BMD KW - VMD2 KW - macular degeneration KW - mouse model Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5761 ER - TY - THES A1 - Herold, Andrea T1 - The role of human and Drosophila NXF proteins in nuclear mRNA export T1 - Die Rolle von humanen und Drosophila-NXF-Proteinen beim Export von mRNAs aus dem Kern N2 - A distinguishing feature of eukaryotic cells is the spatial separation of the site of mRNA synthesis (nucleus) from the site of mRNA function (cytoplasm) by the nuclear envelope. As a consequence, mRNAs need to be actively exported from the nucleus to the cytoplasm. At the time when this study was initiated, both human TAP and yeast Mex67p had been proposed to play a role in this process. Work presented in this thesis (section 2.1) revealed that TAP and Mex67p belong to an evolutionarily conserved family of proteins which are characterized by a conserved modular domain organization. This family was termed nuclear export factor (NXF) family. While the yeast genome encodes only one NXF protein (Mex67p), the genomes of higher eukaryotes encode several NXF proteins. There are two nxf genes in C. elegans and A. gambiae, four in D. melanogaster, and at least four in H. sapiens and M. musculus. It was unclear whether, apart from TAP and Mex67p, other members of this family would also be involved in mRNA export. In the first part of this thesis (2.1), several human NXF members were tested for a possible function in nuclear mRNA export. They were analyzed for their interaction with RNA, nucleoporins and other known TAP partners in vitro, and tested for their ability to promote nuclear export of a reporter mRNA in vivo. Using these assays, human NXF2, NXF3 and NXF5 were all shown to interact with the known NXF partner p15. NXF2 and NXF5 were also found to bind directly to RNA, but only NXF2 was able to bind directly to nucleoporins and to promote the nuclear export of an (untethered) reporter mRNA. Thus NXF2 possesses many and NXF3 and NXF5 possess some of the features required to serve as an export receptor for cellular mRNAs. As NXF2 and NXF3 transcripts were mainly found in testis, and the closest orthologue of NXF5 in mouse has the highest levels of expression in brain, these NXF members could potentially serve as tissue-specific mRNA export receptors. In the second part of this work (2.2), the role of different Drosophila NXF proteins and other export factors in mRNA export was investigated using double-stranded RNA interference (RNAi) in Drosophila Schneider cells. Three of the four predicted Drosophila NXF members (NXF1-3) were found to be expressed in this cell line and could be targeted by RNAi. Depletion of endogenous NXF1 inhibited growth and resulted in the nuclear accumulation of polyadenylated RNA. Fluorescence in situ hybridization revealed that export of both heat shock and non-heat shock mRNAs, including intron-containing and intronless mRNAs, was inhibited. Depleting endogenous NXF2 or NXF3 had no apparent phenotype. These results suggested that NXF1 (but not NXF2-NXF4) mediates the export of bulk mRNA in Drosophila cells. We and others have shown that human NXF proteins function as heterodimers bound to the small protein p15. Accordingly, silencing of Drosophila p15 resulted in a block of mRNA export which was indistinguishable from the export inhibition seen after targeting NXF1. These observations indicated that neither NXF1 nor p15 can promote export in the absence of the other subunit of the heterodimer. NXF1:p15 heterodimers are implicated in late steps of mRNA export, i.e. in the translocation of mRNP export cargoes across the nuclear pore complex. The mechanism by which NXF1:p15 dimers are recruited to the mRNA is unclear. A protein that is thought to play a role in this process is the putative RNA helicase UAP56. Similar to NXF1 and p15, UAP56 was shown to be essential for mRNA export in Drosophila. UAP56 is recruited cotranscriptionally to nascent transcripts and was suggested to facilitate the interaction of NXF1:p15 with mRNPs. Even though both NXF1:p15 heterodimers and UAP56 had been implicated in general mRNA export, it was unclear whether there are classes of mRNAs that require NXF1:p15, but not UAP56 or vice versa. It was also unclear what fraction of cellular mRNAs is exported by NXF1:p15 dimers and UAP56, and whether mRNAs exist that reach the cytoplasm through alternative routes, i.e. by recruiting other export receptors. To address these issues we performed a genome-wide analysis of nuclear mRNA export pathways using microarray technology (2.2.2). We analyzed the relative abundance of nearly half of the Drosophila transcriptome in the cytoplasm of Drosophila Schneider cells depleted of different export factors by RNAi. We showed that the vast majority of transcripts were underrepresented in the cytoplasm of cells depleted of NXF1, p15 or UAP56 as compared to control cells. Only a small number of mRNAs were apparently not affected by the depletions. These observations, together with the wide and similar effects on mRNA levels caused by the depletion of NXF1, p15 or UAP56, indicate that these proteins define the major mRNA export pathway in these cells. We also identified a small subset of mRNAs which appeared to be exported by NXF1:p15 dimers independently of UAP56. In contrast, no significant changes in mRNA expression profiles were observed in cells depleted of NXF2 or NXF3, suggesting that neither NXF2 nor NXF3 play an essential role in mRNA export in Drosophila Schneider cells. Crm1 is a transport receptor implicated in the export of a variety of non-mRNA and protein cargoes. In addition, human Crm1 has been suggested to be involved in the export of a specific mRNA species, serving as a "specialized" mRNA export receptor. A role of human Crm1 in the export of bulk mRNA is considered unlikely. We analyzed the role of Drosophila Crm1 in mRNA export by inhibiting Crm1 with the drug leptomycin B in Schneider cells. Subsequent microarray analysis demonstrated that the inactivation of Crm1 resulted in decreased cytoplasmic levels of less than 1% of all mRNAs, indicating that Crm1 is indeed not a major mRNA export receptor. The genome-wide analysis also revealed a feedback loop by which a block to mRNA export triggers the upregulation of genes involved in this process. This thesis also includes two sections describing projects in which I participated during my Ph.D., but which were not the main focus of this thesis. In section 2.3, the role of the different TAP/NXF1 domains in nuclear mRNA export is discussed. Section 2.4 describes results that were obtained as part of a collaboration using the RNAi technique in Schneider cells to study the function of Cdc37. N2 - Bedingt durch die räumliche Trennung von Transkription und Translation müssen mRNAs in eukaryotischen Zellen aktiv vom Kern in das Cytoplasma transportiert werden. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass das menschliche Protein TAP und Mex67p aus Hefe an diesem Prozess beteiligt sind. Mit Hilfe von Datenbankrecherchen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden (Kapitel 2.1), dass TAP und Mex67p zu einer Proteinfamilie von verwandten Proteinen gehören, deren Mitglieder sich durch eine konservierte, modulartige Domänenstruktur auszeichnen. Dieser bis dahin unbekannten Familie wurde die Bezeichnung "Nuclear Export Factor (NXF)"-Familie zugewiesen. Während das Hefegenom für nur ein NXF-Protein (Mex67p) kodiert, finden sich in den Genomen höherer Eukaryoten mehrere nxf-Gene. So konnten in C. elegans und A. gambiae zwei nxf-Gene und in D. melanogaster, H. sapiens und M. musculus vier nxf-Gene identifiziert werden. Es war jedoch unklar, ob diese bis dahin uncharakterisierten NXF-Proteine - ähnlich wie TAP und Mex67p - an mRNA-Exportprozessen beteiligt sind. Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit (2.1) untersucht, inwieweit verschiedene menschliche NXF-Proteine die typischen Charakteristika von mRNA-Exportrezeptoren aufweisen. Hierzu wurde analysiert, ob die einzelnen humanen NXF-Proteine in der Lage sind, mit RNA, Kernporenproteinen und anderen schon bekannten TAP-Interaktoren in vitro zu interagieren. Zudem wurden verschiedene menschliche NXF-Proteine auf ihre Fähigkeit getestet, den Export einer Reporter-mRNA in vivo zu stimulieren. Mit Hilfe dieser Experimente konnte nachgewiesen werden, dass NXF2, NXF3 und NXF5 in der Lage sind, mit dem TAP-Interaktor p15 zu interagieren, aber nur NXF2 und NXF5 direkt an RNA binden können. Ausschließlich NXF2 war in der Lage, direkt an Kernporenproteine zu binden und den Export der getesteten Reporter-mRNA zu stimulieren. NXF2 besitzt also die typischen Eigenschaften eines mRNA-Exportrezeptors, während bei NXF3 und NXF5 nur einige dieser Eigenschaften nachgewiesen werden konnten. Da in Säugetieren eine gewebespezifische Expression verschiedener TAP-Homologe nachgewiesen wurde, könnte es sich bei diesen NXF-Mitgliedern um gewebespezifische Exportfaktoren handeln. So wurden z.B. humane NXF2- und NXF3-Transkripte vor allem in Hodengewebe detektiert, während das nächstverwandte Ortholog von menschlichem NXF5 in Maus am stärksten in Hirngewebe exprimiert wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit (2.2) wurde die mögliche Beteiligung von Drosophila-NXF-Proteinen an mRNA-Exportprozessen mit Hilfe von RNA-Interferenz (RNAi) in Drosophila-Schneiderzellen untersucht. Die Analyse wurde dabei auf nur drei der vier NXF-Proteine (NXF1-3) beschränkt, da das vierte (NXF4) in diesen Zellen nicht exprimiert ist bzw. nicht nachgewiesen werden konnte. Die Depletion von endogenem NXF1 durch RNAi verursachte einen Wachstumsstopp der Zellen sowie eine Akkumulierung von polyadenylierten RNAs im Kern. Mit Hilfe von in-situ-Hybridisierung konnte gezeigt werden, dass in Zellen, in denen NXF1 depletiert worden war, der Export von Hitzeschock-mRNAs und Nicht-Hitzeschock-mRNAs blockiert war. Hierbei waren sowohl intronlose, als auch intronhaltige Transkripte betroffen. Die Depletion von endogenem NXF2 oder NXF3 hatte keine offensichlichen Auswirkungen auf den Phänotyp der Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass NXF1 (nicht aber NXF2-NXF4) für den Export des Großteils von mRNAs in Drosophila-Schneiderzellen verantwortlich ist. Es war postuliert worden, dass menschliche NXF-Proteine nur als Heterodimere (komplexiert mit dem Protein p15) aktiv sind. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Depletion von p15 mit Hilfe von RNAi in Drosophila-Schneiderzellen - ähnlich wie die Depletion von NXF1 - eine Blockierung des Exports von mRNAs zur Folge hat. Die nahezu identischen Effekte nach der Depletion von NXF1 oder p15 legen den Schluss nahe, dass keines der zwei Proteine ohne das andere mRNAs exportieren kann, die Bildung eines Heterodimers also auch in Drosophila essentiell ist. NXF1:p15-Heterodimere spielen eine Rolle bei späten Vorgängen des Kernexports, da sie die Translokation von mRNPs durch die Kernpore hindurch vermitteln. Unklar ist jedoch, wie NXF1:p15-Dimere an das mRNA-Substrat binden. Es war postuliert worden, dass die RNA-Helikase UAP56 dabei eine Rolle spielt. UAP56 ist ähnlich wie NXF1 und p15 essentiell für den Export von mRNAs in Drosophila. Es bindet schon während der Transkription an die RNA und könnte die Interaktion von NXF1:p15 mit dem Transkript erleichtern. Obgleich NXF1:p15 und UAP56 eindeutig als essentielle Exportfaktoren identifiziert worden waren, war die Frage, inwieweit alle mRNA-Exportvorgänge NXF1, p15 und UAP56 benötigen, noch unbeantwortet. Beispielsweise könnten mRNAs existieren, die NXF1 und p15 benötigen, nicht aber UAP56 (oder umgekehrt). Zudem könnten mRNAs existieren, die ganz ohne die Hilfe von NXF1, p15 und UAP56 exportiert werden können, z.B. indem sie andere Exportfaktoren nutzen. Um diese Frage zu beantworten, wurde eine auf Microarrays basierende "large scale"-Analyse durchgeführt (2.2.2). Dabei wurden die relativen Häufigkeiten von etwa der Hälfte aller Drosophila-Transkripte im Cytoplasma von Drosophila-Schneiderzellen bestimmt, in denen verschiedene Exportfaktoren mit Hilfe von RNAi inhibiert worden waren. Mit diesem Ansatz konnte gezeigt werden, dass im Cytoplasma von Zellen, in denen die Expression von NXF1, p15 oder UAP56 durch RNAi inhibiert worden war, der Großteil aller Transkripte im Vergleich zu Kontrollzellen unterrepräsentiert war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl NXF1:p15 also auch UAP56 essentiell für den Export der meisten mRNAs sind. Es konnte aber auch eine geringe Anzahl von Transkripten identifiziert werden, deren Abundanz im Cytoplasma sich durch die Depletion dieser drei Proteine nicht veränderte. Diese Transkripte könnten u.U. mit Hilfe von alternativen Exportrezeptoren in das Cytoplama gelangen. Des weiteren wurde eine kleine Gruppe mRNAs gefunden, die von NXF1:p15-Dimeren ohne die Hilfe von UAP56 exportiert werden. Im Gegensatz dazu konnten keine signifikanten Änderungen der mRNA Expressionsprofile in Schneiderzellen nachgewiesen werden, in denen NXF2 oder NXF3 mit Hilfe von RNAi depletiert worden waren. Dies legt den Schluss nahe, dass weder NXF2 noch NXF3 eine essentielle Aufgabe beim Export von mRNAs in diesen Zellen haben. Das Protein Crm1 ist ein Transportrezeptor, der am Export von einer Vielzahl von RNA- und Proteinsubstraten beteiligt ist. Menschliches Crm1 wurde als potentieller mRNA-Exportrezeptor für einzelne mRNAs mit spezifischen Eigenschaften gehandelt. Eine Beteiligung am generellen Export von mRNAs wurde aber als unwahrscheinlich angesehen. In dieser Arbeit wurde eine mögliche Beteiligung von Drosophila-Crm1 an mRNA-Exportprozessen untersucht (2.2.2). Durch eine Behandlung mit Leptomycin B wurde Crm1 in Drosophila-Zellen inhibiert. Die nachfolgenden Analysen mit Hilfe von Microarrays konnten bestätigen, dass Crm1 auch in Drosophila kein genereller mRNA Exportfaktor ist, da weniger als 1% aller Transkripte signifikant niedrigere Level im Cytoplasma aufwiesen. Zudem konnten bisher keine Transkripte identifiziert werden, die eindeutig von Crm1, aber ohne die Beteiligung von NXF1:p15 exportiert werden. In der auf Microarrays basierenden Analyse konnte außerdem ein "feedback loop" nachgewiesen werden, der im Falle einer Exportinhibierung zu einer Hochregulierung von Genen führt, die eine Rolle bei Kernexportprozessen spielen. Zudem werden in dieser Arbeit zwei Projekte beschrieben, an denen ich während meiner Doktorarbeit beteiligt war, die aber nicht das Hauptthema meiner Promotion waren. Kapitel 2.3 beschreibt die Analyse der Rolle der verschiedenen TAP/NXF1-Domänen beim mRNA-Kernexport. Kapitel 2.4 enthält Daten, die im Rahmen einer Kooperation erzielt wurden, bei der die Funktion von Cdc37 mit Hilfe von RNAi in Drosophila-Schneiderzellen untersucht wurde. KW - Zellkern KW - Messenger-RNS KW - Export KW - Proteine KW - Kernexport KW - mRNA KW - NXF KW - nuclear export KW - mRNA KW - NXF Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5601 ER - TY - THES A1 - Wolf, Katarina T1 - Migration of tumor cells and leukocytes in extracellular matrix : proteolytic and nonproteolytic strategies for overcoming tissue barriers T1 - Migration von Tumorzellen und Leukozyten in extrazellulärer Matrix : proteolytische und nicht-proteolytische Strategien zur Überwindung von Gewebsbarrieren N2 - The extracellular matrix within connective tissues represents a structural scaffold as well as a barrier for motile cells, such as invading tumor cells or passenger leukocytes. It remains unclear how different cell types utilize matrix-degrading enzymes for proteolytic migration strategies and, on the other hand, non-proteolytic strategies to overcome 3D fibrillar matrix networks. To monitor cell migration, a 3D collagen model in vitro or the mouse dermis in vivo were used, in combination with time-lapse video-, confocal- or intravital multiphoton-microscopy, and computer-assisted cell tracking. Expression of proteases, including several MMPs, ADAMs, serine proteases and cathepsins, was shown by flow cytometry, Western blot, zymography, and RT-PCR. Protease activity by migrating HT-1080 fibrosarcoma cells resulting in collagenolysis in situ and generation of tube-like matrix defects was detected by three newly developed techniques:(i) quantitative FITC-release from FITC-labelled collagen, (ii) structural alteration of the pyhsical matrix structure (macroscopically and microscopically), and (iii) the visualization of focal in situ cleavage of individual collagen fibers. The results show that highly invasive ollagenolytic cells utilized a spindle-shaped "mesenchymal" migration strategy, which involved beta1 integrindependent interaction with fibers, coclustering of beta1 integrins and matrix metalloproteinases (MMPs) at fiber bundling sites, and the proteolytic generation of a tube-like matrix-defect by MMPs and additional proteases. In contrast to tumor cells, activated T cells migrated through the collagen fiber network by flexible "amoeboid" crawling including a roundish, elliptoid shape and morphological adaptation along collagen fibers, which was independent of collagenase function and fiber degradation. Abrogation of collagenolysis in tumor cells was achieved by a cocktail of broad-spectrum protease inhibitors at non-toxic conditions blocking collagenolysis by up to 95%. While in T cells protease inhibition induced neither morphodynamic changes nor reduced migration rates, in tumor cells a time-dependent conversion was obtained from proteolytic mesenchymal to non-proteolytic amoeboid migration in collagen lattices in vitro as well as the mouse dermis in vivo monitored by intravital microscopy. Tumor cells vigorously squeezed through matrix gaps and formed constriction rings in regions of narrow space, while the matrix structure remained intact. MMPs were excluded from fiber binding sites and beta1 integrin distribution was non-clustered linear. Besides for fibrosarcoma cells, this mesenchymal-toameboid transition (MAT) was confirmed for epithelial MDA-MB-231 breast carcinoma cells. In conclusion, cells of different origin exhibit significant diversity as well as plasticity of protease function in migration. In tumor cells, MAT could respresent a functionally important cellular and molecular escape pathway in tumor invasion and migration. N2 - Die extrazelluläre Matrix (EZM) des Bindegewebes stellt sowohl ein strukturelles Gerüst als auch eine Barriere für migrierende Zellen dar, wie z.B. invadierende Tumorzellen oder zirkulierende Leukozyten. Es ist bisher unklar, wie diese verschiedenen Zelltypen matrix-degradierende Enzyme für eine proteolytische Migrationsstrategie benutzen bzw. ob und wie sie ohne deren Hilfe durch das Gewebe gelangen. Um Zellmigration in EZM zu untersuchen, wurde ein dreidimensionales Kollagenmodell in vitro wie auch Maus-Dermis in vivo eingesetzt und Zellmigration mittels Zeitraffer-Video-, Konfokal- und Multiphoton-Mikroskopie sowie computer-gestützter Zelltracking-Analyse dargestellt. Expression von Proteasen verschiedener Klassen, wie der MMPs, ADAMs, Serinproteasen und Cathepsine, wurde mittels Durchfluss-Zytometrie, Western blot, Zymographie oder RT-PCR detektiert. Gegen Kollagen gerichtete zelluläre Protease-Aktivität wurde mit Hilfe drei neu entwickelter Techniken dargestellt: (i)quantitative Messung von löslichem FITC aus FITC-markiertem fibrillären Kollagen, (ii) mikro-und makroskopische Reorganisation der physikalischen Matrix-Struktur, und (iii) Visualisierung der Topologie fokaler Degradation von Matrixfasern. Die Ergebnisse zeigen, dass hochinvasive spindelförmige HT-1080 Fibrosarkomzellen eine sogenannte "mesenchymale" Migrationsstrategie mit folgenden Charakteristika entwickelten: (i) beta1 Integrin-abhängige Interaktion mit Kollagenfasern, (ii) das "Co-clustering" von beta1 Integrinen und Matrix-Metalloproteinasen an Faserzugstellen und (iii) eine röhrenförmige, durch Proteasen verursachte Matrixdefektbildung. Im Gegensatz zu proteolytischen Tumorzellen migrierten T-Zellen rundlich-elliptoid mittels flexibler Morphodynamik, ähnlich wie Amöben, durch das Kollagennetzwerk und orientierten sich entlang Kollagenfasern, wobei sie keine biochemisch und strukturell detektierbare Faserdegradation zeigten. Um Tumorzell-vermittelte Kollagenolyse zu hemmen, wurde ein Cocktail, bestehend aus Breitspektrum-Protease-Inhibitioren, etabliert, der die Kollagenolyse unter nicht-toxischen Bedingungen um bis zu 98% blockierte. Während in T-Zellen keine morphodynamischen Veränderungen detektiert wurden, entwickelten Tumorzellen eine Verschiebung von proteolytisch mesenchymaler zu unverminderter nicht-proteolytisch amöboider Migration (mesenchymale-amöboide Transition - MAT) aus, sowohl in Kollagenmatrices in vitro als auch in Maus-Dermis in vivo, dargestellt mittels Intravital-Multiphoton-Mikroskopie. Die Tumorzellen "quetschten" sich dabei durch Lücken in der Matrix und bildeten sogenannte Konstriktionsringe aus, während die Matrixstruktur intakt blieb. MMPs lokalisierten nicht mehr an Faser-Kontakstellen auf der Zelloberfläche, und beta1 Integrine lagen nicht mehr geclustert vor. Neben HT-1080 Fibrosarkomzellen wurde MAT auch für MDA-MB-231 Brustkrebszellen epithelialer Herkunft nach Protease-Blockade detektiert. Somit entwickeln migrierende Zellen verschiedener Herkunft eine signifikante Diversität wie auch Plastizität bei der Migration durch EZM aus, resultierend aus der Funktionalität von Matrix-Proteasen. In Tumorzellen könnte MAT einen funktionell wichtigen zellulären und molekularen Anpassungsmechanismus für die Tumorinvasion und -migration darstellen. KW - Zellmigration KW - Grundsubstanz KW - Tumorzelle KW - Leukozyt KW - Zellmigration KW - Invasion KW - Karzinomzellen KW - Leukozyten KW - Matrixproteasen KW - Kollagenasen KW - Proteaseinhibitoren KW - cell migration KW - invasion KW - carcinoma cells KW - leukozytes KW - matrix proteases KW - collagenases KW - protease inhibitors Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5670 ER - TY - THES A1 - Tsai, Chyn-Bey T1 - Molecular cloning and characterization of nitrate reductase from Ricinus communis L. heterologously expressed in Pichia pastoris N2 - Zusammenfassung Hintergrund: In einer vorhergehenden Studie wurde gezeigt, dass die Nitratreduktase (NR, EC 1.6.6.1) aus Blättern von Ricinus communis L. im Vergleich zu NRs der meisten anderen höheren Pflanzen durch verschiedene Faktoren unterschiedlich reguliert wird. Die Aktivität ist ungewöhnlich Mg2+-sensitiv, zeigt ein verändertes pH-Profil und ist nur gering ATP-abhängig inaktivierbar. Das Ziel dieser Arbeit war, die abweichenden Eigenschaften von Ricinus NR, aus molekularer und physiologischer Sicht detaillierter aufzuklären. Zu diesem Zweck wurde das NR Gen von R. communis geklont, heterolog exprimiert und charakterisiert. Ergebnisse: Die abgeleitete Proteinsequenz zeigte, dass Ricinus NR hohe Ähnlichkeit mit anderem NRs teilte, abgesehen von der N-terminalen Region. In der N-terminalen Region besitzt die Ricinus NR eine säurehaltige Sequenz, die nur in den höheren Pflanzen konserviert ist. In der Moco-bindenden Region waren einige in 17 Pflanzen NRs konservierte Aminosäurepositionen verändert. Zu diesen Positionen gehörten His103, Gln123, Val266 und Ala284, die Asparagin, Arginin, Aspartat und Prolin in den anderen Pflanzen ersetzten. Auch an der Dimerisierungs- und Hinge 1-Region, zeigte die Ricinus NR eine veränderte Aminosäuresequenz. Anstatt Isoleucin und Glycin, besaß die Ricinus NR an den Stellen 460 und 498 Asparagin und Alanin. Durch ein Arg an der Stelle 482 kommt es zu einer zusätzliche Trypsinschnittstelle innerhalb des 481KRHK484-Motivs (die meisten NR besitzen hier KPHK). Zusätzlich enthält die Ricinus NR eine Serinphosphorylierungsstelle (Ser-526) innerhalb des möglichen 14-3-3 Bindemotivs 523KSVS*TP528, was eine allgemeine Eigenschaft von Nitratreduktasen ist. Im C-Terminus von Ricinus NR bestätigte die Sequenz 886CGPPP890, dass die Ricinus NR ein NADH-spezifisches Enzym ist. Die Ricinus NR und Arabidopsis NR2 (AtNR2) wurden in Pichia pastoris funktionell exprimiert und die Eigenschaften miteinander verglichen. Die rekombinante Ricinus NR (RcNR) selbst wurde nicht durch die Inkubation mit MgATP inhibiert, ebenso AtNR2. Da der Hefeextrakt vermutlich die Faktoren zur Regulierung der NR nicht enthält, wurden entsalzte Blattextrakte von Arabidopsis (ADL), Spinat (SDL) und Ricinus (RDL) zugesetzt, die Kinasen und 14-3-3 Proteine enthielten. Damit keine endogenen NRs sich im Extrakt befinden wurden die Blätter vor Extraktion 4 Tage im Dunkeln gehalten. In Bezug auf die Inhibierung der NR durch ATP wurde festgestellt, dass die RcNR gegenüber einer solchen Inhibierung unempfindlich ist, AtNR2 dagegen in jedem Fall durch ATP inaktiviert wird. Bei Kombination von RcNR mit NR-freien Extrakten aus Pflanzen zeigte sich die erhöhte Mg2+-Sensitivität nur, wenn man RcNR mit RDL inkubierte, nicht aber wenn man RcNR mit SDL oder ADL inkubierte. Es liegt auf der Hand, dass ein oder einige Faktoren in RDL vorkommen, die mit RcNR interagieren und seine hohe Mg2+-Sensitivität hervorrufen. Außerdem, ergab eine Inkubation von AtNR2 mit unterschiedlichen NR-freien Blattextrakten eine bedeutende Aktivierung der Enzymaktivitäten, sowohl in Anwesenheit von Mg2+ als auch EDTA. Dies wurde jedoch nicht für die RcNR festgestellt. Nach Verwendung von Ammoniumsulfat zur Fraktionierung des RDL, fand man zusätzlich heraus, dass ungefähr 0,2 mg des Proteins der Fraktion die mit 0-35% Ammoniumsulfat gefällt wurde ausreichten die maximale Hemmung des RcNR hervorzurufen. Schlussfolgerungen: Die Unempfindlichkeit gegenüber ATP erscheint eine angeborene Eigenschaft von Ricinus NR, während die hohe Mg2+-Sensitivität von einem oder einigen Faktoren in den Blättern von Ricinus abhängt. Diese(r) bis jetzt unbekannte Faktor(en) war Hitze-sensitiv und konnte durch Ammoniumsulfat ausgefällt werden. Er scheint spezifisch auf die rekombinante Ricinus-NR einzuwirken, und liefert eine Mg2+-Sensitivität vergleichbar dem authentischen Blattenzym. Außerdem gibt es vermutlich auch positiv regulierende Faktor(en) für die Nitratreduktase aus Blättern höherer Pflanzen. N2 - Summary Background: In a previous study, nitrate reductase (NR, EC 1.6.6.1) from leaves of Ricinus communis L. showed different regulatory properties from most other higher plants NR's by an unusually strong Mg2+-sensitivity, a different pH-activity profile and only little ATP-dependent inactivation. The aim of this work was to elucidate the deviating properties of Ricinus NR in more details, from both molecular and physiological aspects. For that purpose, the NR gene from R. communis was cloned, expressed heterologously and characterized. Results: The deduced protein sequence showed that Ricinus NR shared high similarity with other NRs, apart from the N-terminal region. In the N-terminal region, the Ricinus NR possesses an acidic stretch which is conserved only in higher plants. Within the Moco-binding domain the Ricinus NR contained few amino acid residues which were unique in comparison with 17 plant NRs, including His103, Gln123, Val266 and Ala284 where other NRs possess asparagine, arginine, aspartate and praline. In the Dimer interface and Hinge 1 regions, the Ricinus NR also had some unique residues like Asn460 and Ala498 where other NRs have isoleucine and glycine instead. The Ricinus NR possesses an Arg482 which provides an additional predicted Trypsin cleavage site within 481KRHK484 (while most of plant-NRs possess KPHK). Additionally, the Ricinus NR contains a serine phosphorylation site (Ser-526) within the potential 14-3-3 binding motif 523KSVS*TP528, which is a common characteristic of nitrate reductases. In the C-Terminus of Ricinus NR a sequence 886CGPPP890 confirmed that Ricinus NR is a NADH-specific enzyme. Functional Ricinus NR protein was expressed in Pichia pastoris and compared with the features of Arabidopsis NR2 synthesized by the same expression system (AtNR2). The recombinant Ricinus NR (RcNR) itself was unresponsive to the incubation with MgATP, and so was AtNR2. As yeast extracts might lack factors required for NR regulation, desalted leaf extracts containing NR kinases and 14-3-3s were prepared from 4-day darkened (and therefore NR-free) leaves of Arabidopsis (ADL), spinach (SDL) and Ricinus (RDL), and added to the assay of RcNR and AtNR2 to check for ATP-dependent inactivation and Mg2+-sensitivity. When RcNR was combined with the NR-free extracts described above, it's unusually high Mg2+-sensitivity was restored only by incubation with RDL, but it remained unresponsive to ATP. In contrast, AtNR2 became inactive when incubated with the protein mixtures and ATP. It is obvious that one or some factors existing in RDL could interact with RcNR and therefore provide its high Mg2+-sensitivity. Interestingly, incubation of AtNR2 with different NR-free leaf extracts gave a significant activation of the enzyme activities, both in Mg2+ and EDTA, which were not observed in the case of RcNR. Moreover, using ammonium sulfate to fractionation the RDL revealed that about 0.2 mg of the protein factor(s) from 0-35% of ammonium sulfate precipitation was sufficient to provide the maximum inhibition of the RcNR. Conclusions: The insensitivity to ATP appears an inherent property of Ricinus NR, whereas the high Mg2+-sensitivity depends on one or several factors in Ricinus leaves. This as yet unknown factor(s) was boiling-sensitive and could be precipitated by ammonium sulfate. It appeared to interact specifically with recombinant Ricinus-NR to provide the Mg2+-sensitivity of the authentic leaf enzyme. Presumably, there is also a positive regulatory factor(s) for nitrate reductase existing in the leaves of higher plants. KW - Rizinus KW - Nitratreduktase KW - Enzymatische Regulation KW - Nitratreduktase KW - Ricinus communis KW - 14-3-3s KW - Pichia pastoris KW - Nitrate Reductase KW - Pichia pastoris KW - Ricinus communis KW - 14-3-3s Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5544 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Markus T1 - Signal transduction during defense response and source-sink transition in tomato T1 - Signaltransduktion während source-sink-Übergang und Pathogenabwehr in Tomate N2 - Plants have evolved an elaborate system to cope with a variety of biotic and abiotic stresses. Typically, under stress conditions an appropriate defense response is invoked which is accompanied by changes in the metabolic status of the plant. Photosynthesis is downregulated and sucrose is imported into the tissue, which provides a faster and more constant flux of energy and carbon skeletons to perform the defense response. Interestingly, these processes are co-ordinately regulated and the signal transduction chains underlying these cellular programs appear to share at least some common elements. Both the induction of sink metabolism and defense response is dependent on signal transduction pathways involving protein phosphorylation. Furthermore, regulation of extracellular invertase (INV) and phenylalanine ammonia lyase (PAL) which are markers for sink metabolism and defense response is preceded by the transient activation of MAP kinases. In depth analysis of MAP kinase activation by partial purification led to the discovery that, depending on the stimulus, different subsets of MAP kinases are activated. This differential MAPK activation is likely to possess a signal encoding function. In addition, the partial purification of MAP kinases was found to be suitable to address specific cellular functions to individual MAP kinase isoenzymes. By this way, LpWIPK was identified as the major MAP kinase activity induced after stimulation of tomato cells with different elicitors. LpWIPK is thus considered as a key regulator of defense response together with sink induction in tomato. A study using nonmetabolisable sucrose analogs revealed that the regulation of photosynthesis is not directly coupled to this signal transduction pathway since it is independent of MAP kinase activation. Nonetheless, downregulation is induced by the same stimuli that induce the defense response and sink metabolism and it will therefore be interesting to uncover the branch points of this signalling network in the future. MAP kinases are not only central components regulating the response to biotic stresses. In addition to e.g. pathogens, MAP kinases are as well involved in signal transduction events invoked by abiotic stresses like cold and drought. In a recent study, we could show that a MAP kinase is activated by heat stress, under conditions a plant will encounter in nature. This previously unknown MAP kinase is able to specifically recognise the heat stress transcription factor HsfA3 as a substrate, which supports a role of this MAP kinase in the regulation of the heat stress response. Moreover, the observation that HsfA3 is phosphorylated by the heat activated MAP kinase in vitro provides a promising basis to identify HsfA3 as the first physiological substrate of a plant MAP kinase. Intracellular protons have been implicated in the signal transduction of defense related signals. In a study using Chenopodium rubrum cells, we could show that cytosolic changes in pH values do not precede the regulation of the marker genes INV and PAL. Depending on the stimulus applied, cytosolic acidification or alkalinisation can be observed, which excludes a role for protons as signals in this pathway. Together with the concomitant changes of the pH value of the extracellular space, these variations can thus be considered as terminal part of the defense response itself rather than as a second messenger. WRKY transcription factors have only recently been identified as indirect targets of a central plant MAP kinase cascade. In addition, the identification of cognate binding sites in the promoters of INV and PAL supports a role for these proteins in the co-ordinate regulation of defense response and sink induction. A novel elicitor responsive WRKY transcription factor, LpWRKY1, was cloned from tomato and characterised with respect to its posttranslational modification. This immediate early transcription factor is transiently induced upon pathogen attack and the induction is dependent on phosphorylation. Furthermore, it was shown for the first time with respect to WRKY transcription factors, that LpWRKY1 is phosphorylated in vivo. Analysis of the role of this phosphorylation by in gel assays using recombinant WRKY protein as the substrate revealed two protein kinases that are transiently activated during the defense response to phosphorylate LpWRKY1. This data demonstrates that WRKY proteins require phosphorylation to modulate their DNA binding or transactivating activity. N2 - Pflanzen haben ein aufwendiges System entwickelt um auf verschiedene Umweltreize zu reagieren. Meist wird unter Stressbedingungen ein passendes Abwehrprogramm aktiviert. Gleichzeitig wird die Photosynthese im jeweils betroffenen Gewebe abgeschaltet und stattdessen Saccharose importiert. Dieser Source-Sink Übergang stellt sicher, dass Energie und Kohlenstoffbausteine für die Abwehr schnell zur Verfügung stehen. Diese beiden Prozesse sind koordiniert reguliert und die zugrundeliegenden Singnaltransduktionswege scheinen wenigstens einige Komponenten gemeinsam zu haben. Sowohl die Induktion des Sink Metabolismus (gemessen an der Induktion der extrazellulären Invertase, INV) als auch des Abwehrprogramms (gemessen an der Induktion der Phenylalanin Ammonia-Lyase, PAL) sind von Phosphorylierungen abhängig. Außerdem geht der Induktion beider Gene die transiente Aktivierung von MAP Kinasen voran. Eine genauere Analyse der MAP Kinase Aktivierung durch partielle Reinigung zeigte, dass abhängig vom Stimulus mehrere MAP Kinasen aktiviert werden. Diese differentielle MAP Kinase Aktivierung stellt somit eine Möglichkeit der Signalcodierung dar. Die partielle Reinigung der MAP Kinasen wurde auch verwendet, um einzelnen MAP Kinase Isoenzymen spezifische zelluläre Funktionen zuzuweisen. Dadurch konnte LpWIPK (wound induced protein kinase) als Hauptaktivität nach Stimulation on Tomatenzellen mit Elicitoren bestimmt werden. LpWIPK könnte also sowohl die Pathogenabwehr als auch den source-sink Übergang gleichzeitig steuern. Allerdings ist die Regulation der Photosynthese unabhängig von diesem Signaltransduktionsweg. Eine Untersuchung mit nichtmetabolisierbaren Saccharose-Analoga zeigte, dass die Regulation der Photosynthese unabhängig von einer MAP Kinase Aktivierung stattfindet. Das abschalten der Photosynthese wird durch die gleichen Stimuli hervorgerufen, die auch Pathogenabwehr und Sink Metabolismus induzieren. Eine Interaktion der beiden Signaltransduktionswege ist somit wahrscheinlich. MAP Kinases spielen nicht nur bei der Antwort auf biotischen Stress eine wichtige Rolle. Zusätzlich werden MAP Kinasen auch durch abiotischen Stress wie Kälte und Dürre aktiviert. Kürzlich konnten wir zeigen, dass Hitzestress unter natürlichen Bedingungen ebenfalls eine MAP Kinase aktiviert. Diese bisher unbekannte MAP Kinase akzeptiert den Hitzestress Transkriptionsfaktor HsfA3 als in vitro Substrat. Dies unterstützt die Vermutung, dass diese MAP Kinase eine Rolle in der Regulation der Hitzestress Antwort spielt. Außerdem stellt die Beobachtung, dass die hitzeaktivierte MAP Kinase HsfA3 in vitro phosphoryliert eine vielversprechende Ausgangssituation dar, um HsfA3 als erstes physiologisches MAP Kinase Substrat in Pflanzen zu identifizieren. Intrazelluläre pH Änderungen wurden als Komponenten der Signaltransduktion für die Pathogenabwehr diskutiert. In Zellen von Chenopodium rubrum konnten wir zeigen, dass solche Änderungen nicht in Zusammenhang mit der Induktion der beiden Markergene INV und PAL stehen. Die Änderung des intrazellulären pH Wertes erfolgt nach der Induktion der Markergene, und kann je nach Stimulus Alkalisierung oder Ansäuerung zur Folge haben. Diese Beobachtungen schließen eine Rolle der pH Änderungen in der Signaltransduktion von Stressreizen aus. Die gefundenen pH Wert Änderungen sind somit eher als Teil der Pathogenabwehr und nicht als vorgelagerte Komponente zu verstehen. WRKY Transkriptionsfaktoren wurden erst kürzlich als indirekte Ziele einer MAP Kinase Kaskade beschrieben. Außerdem finden sich in den Promotoren von INV und PAL Bindestellen für WRKY Transkriptionsfaktoren, was eine Beteiligung dieser Proteine an der koordinierten Regulation von Abwehr und Sink Metabolismus wahrscheinlich macht. Ein neuer WRKY Transkriptionsfaktor, LpWRKY1 wurde aus Tomate kloniert und in Hinblick auf mögliche posttranslationelle Modifikationen charakterisiert. Dieser Trankriptionsfaktor zählt zu den schnellen frühen Genen und wird in Antwort auf Elicitoren transient induziert. Die Induktion des Faktors in abhängig von Phosphorylierungen. Es konnte weiterhin erstmalig gezeigt werden, dass LpWRKY1 in vivo phosphoryliert wird. Eine weitere Analyse durch in gel Kinase Tests mit rekombinantem LpWRKY1 als Substrat zeigte, dass zwei Proteinkinasen während der Abwehrantwort transient aktiviert werden und LpWRKY1 phosphorylieren. Diese Daten legen nahe, dass die DNA Bindeaktivität oder die Transaktivierungsaktivität von WRKY Transkriptionsfaktoren durch Phosphorylierung gesteuert wird. KW - Tomate KW - WRKY KW - MAP Kinase KW - Signaltransduktion KW - tomato KW - WRKY KW - MAP kinase KW - signal transduction Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5421 ER - TY - THES A1 - Visan, Ioana Andreea T1 - The CD23 receptor-regulation of expression and signal transduction N2 - Bisher sind zwei Isoformen des humanen CD23 (CD23a und CD23b) beschrieben. Beide unterscheiden sich lediglich in 6-7 Resten im N-terminalen, zytoplasmatischen Anteil. CD23a wird ausschließlich auf B-Zellen exprimiert, während CD23b sowohl auf B-Zellen als auch auf Monozyten, eosinophilen Granulozyten, Makrophagen und zahlreichen anderen Zelltypen durch Stimulation mit IL-4 induziert werden kann. Die beiden Isoformen vermitteln wahrscheinlich unterschiedliche Funktionen. CD23a gilt als Isoform, welche vornehmlich mit der Endozytose von IgE-Immunkomplexen und der Vermittlung von Antigen-Präsentation auf B-Zellen assoziiert ist. CD23b besitzt ein Phagozytose-Motiv und scheint bei der Phagozytose IgE besetzter Partikel, der Freisetzung von Zytokinen und der Bildung von Peroxiden eine Rolle zu spielen. Frühere Untersuchungen legen die Vermutung nahe, dass die beiden Isoformen zwei getrennte Signalübertragungswege miteinander verbinden. Die Gegenüberstellung von Ereignissen, welche in Zellen, die nur eine einer oder beide Isoformen von CD23 besitzen, stattfinden, legt die Vermutung nahe, dass CD23b cAMP und iNOS hochreguliert, wohingegen CD23a einen Anstieg des intrazellulären Kalziums vermittelt. Im ersten Teil unserer Untersuchungen haben wir die Regulation der B-Zell-spezifischen Expression von CD23a analysiert. Pax-5 ist ein auf B-Zellen beschränkter Transkriptionsfaktor, welcher für die frühe und späte B-Zellentwicklung von entscheidender Bedeutung ist. Mögliche Pax-5 Bindungsstellen wurden in den proximalen Abschnitten des CD23a Promotors vermutet. Die Analyse des CD23a Promotors ergab drei mutmaßliche Pax-5 Bindungsstellen mit mehr als 50% Homologie zur Konsensus-Sequenz. Eine dieser Bindungsstellen, namens CD23-1, kann mit einer hochaffinen Pax-5 Bindungsstelle konkurrieren oder direkt das Pax-5 Protein in Elektromobilitäts Experimenten (EMSA) binden. Das Einfügen von Mutationen an dieser Stelle verhindert die Bindung. Ein weiterer Versuch, bei dem die gesamte Länge des CD23a Promotors durch überlappende Peptide in einem kompetitiven Verfahren gegenüber hoch affinen Bindungsstellen getestet wurde, zeigt ebenso CD23-1 als die einzige Stelle, welche direkt Pax-5 binden kann. In weiteren Experimenten führte die Expression von Pax-5 in 293 Zellen zu einer 7fachen Aktivierung eines CD23a Kernpromotor Konstrukts. Die Kotransfektion zusammen mit STAT6 zeigte, dass Pax-5 mit diesem Transkriptionsfaktor kooperiert, indem es die Transkriptionsrate eines vergrößerten CD23a Promotorkonstrukts erhöht. Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, dass die ektope Expression von Pax-5 in der monozytären Zelllinie U-937, die normalerweise nur die CD23b Isoform exprimiert, dann zu einer Expression von CD23a nach Stimulation mit IL-4 und PMA führte. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Pax-5 in der auf B-Zellen beschränkten Expression der CD23 Isoform eine Schlüsselrolle zukommt. Im zweiten Teil des Projekts haben wir ein “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ (Cyto-Trap von Stratagene) verwendet, um nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern für den CD23 Rezeptor zu suchen. Das System wurde modifiziert um eine hohe Effizienz an Transformation zu erzielen. Unterschiedliche „Köder“-Vektorkonstrukte wurden hergestellt. Das Screening wurde mittels einer humanen Milzbibliothek mit dem Zielvektor des Systems durchgeführt. Die anfangs benutzten Konstrukte –pSosCD23a und pSosCD23b – exprimierten sehr kurze (22 Aminosäuren) zytoplasmatischen Reste der Isoformen am C-terminalen Ende des Fusionsproteins (humanes SOS). Verbesserte Konstrukte (pSos CD23a+Linker und pSosCD23b+Linker) exprimierten den zytoplasmatischen Anteil von CD23a/b am N-terminalen Ende des humanen SOS und hatten folglich den N-terminalen Anteil als Andockstelle frei, entsprechend den Bedingungen in vivo. Eine flexible Verbindungsregion trennte die Fusionsproteine, um auf diese Weise die kurze Aminosäurekette deutlich „sichtbar“ werden zu lassen. Annähernd drei Millionen Klone wurden mittels der verschiedenen Konstrukte untersucht. Dabei konnte keine tatsächlich positive Interaktion gefunden werden. Stattdessen fand sich eine vergleichsweise hohe Zahl falsch-positiver Klone. Diese wiederum wurden in einem zweiten “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ getestet. In Zukunft wird ein neues Konstrukt als Köder verwendet werden. Hierbei wurde ein Tyrosin-Rest im zytoplasmatischen Anteil von CD23a durch Glutamat ersetzt. Das System wurde bereits dazu verwendet, die Interaktion zwischen CD23 und p59fyn - einem Mitglied der Src-Familie von Proteinkinasen, welches mit CD23a assoziiert sein soll – zu testen. Jedoch konnte im CytoTrap “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ keine Wechselwirkung nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigt das zentrale Ergebnis der Arbeit, dass Pax-5 der Schlüsselregulator ist, der die B-Zell-spezifische Expression von CD23a ermöglicht. Zusätzlich wurde ein “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ etabliert, mit dem zytoplasmatische Interaktionspartner für die CD23 Isoformen gefunden werden können. N2 - Two isoforms of human CD23 (CD23a and CD23b) have been described. They differ by only 6-7 residues in the N-terminal cytoplasmic tail. CD23a is restrictively expressed on B-cells while CD23b is inducible on B-cells, as well as monocytes, eosinophils, macrophages and a variety of other cell types, after IL-4 stimulation. The two isoforms seems to have different functions. CD23a appears to be the isoform associated with endocytosis of IgE immune complexes and mediating antigen presentation on B-cells. CD23b has a phagocytosis motif and seems to be involved in the phagocytosis of IgE-coated particles, cytokine release and the generation of superoxides. Previous studies indicate that the two isoforms connect to different signal transduction pathways. Comparing the cells that express only one or both CD23 isoforms suggests that CD23b is involved in upregulating cAMP and iNOS, whereas CD23a mediates an increase in intracellular calcium. In the main part of the study we investigated how the CD23a B-cell specific expression is regulated. Pax-5 is a B-cell restricted transcription factor with an essential role in early and late B-cell development. Putative Pax-5 binding sites have been predicted in the CD23a proximal promoter. Analyses of the CD23a promoter revealed three putative Pax-5 binding sites with more than 50% homology to the consensus sequence. One of these sites, named CD23-1 can compete a high affinity Pax-5 binding site or can directly bind Pax-5 protein in electrophoretic mobility shift assays. Introducing mutations into this site abrogates the binding. A different approach, in which overlapping peptides covering the length of the CD23a promoter were tested in competition assays against a high affinity binding site, also revealed CD23-1 as the only site that directly binds Pax-5 protein. Expression of Pax-5 in 293 cells resulted in a 7-fold activation of a CD23a core promoter construct. Co-transfection together with STAT6 showed that Pax-5 cooperates with this transcription factor in enhancing the level of transcription of a CD23a extended promoter construct. Most importantly, ectopic expression of Pax-5 in the monocytic cell line U-937 that regularly expresses only the CD23b isoform enabled a significant CD23a expression after stimulation with IL-4 and PMA. Our results suggest that Pax-5 is a key regulator of the B-cell restricted expression of the CD23a isoform. In the second part of the project, we used a yeast two-hybrid system (CytoTrapTM from Stratagene) in order to look for cytoplasmic interaction partners for the CD23 receptor. The system was established in order to reach a high efficiency of transformation and different bait vector constructs were made. The screening was performed using a human spleen library cloned in the target vector of the system. The first bait constructs used (pSosCD23a and pSosCD23b) expressed the very short (22 amino acids) cytoplasmic tails of the isoforms at the C-terminal end of the fusion protein (human SOS). Improved bait constructs, (pSosCD23a+Linker and pSos CD23b+Linker) expressed the cytoplasmic tail of CD23a/b at the N-terminal side of the human SOS and had in consequence the N-terminal part free as a bait, as it occurs in vivo. A flexible linker region separated the fusion proteins in order to make the small amino acid bait chain more obvious. Approximately three million library clones were screened with these various constructs. No “true positive” interaction was detected. A relatively high number of “false positive” clones were obtained and checked in another two-hybrid system. A new bait construct, in which the tyrosine residue in the cytoplasmic tail of CD23a was replaced by a glutamic acid residue will be used for future screening. The system was also used in order to test the interaction between CD23 and p59fyn, a member of the Src family of protein kinases that was mentioned to associate with CD23a. No interaction was detected by using the CytoTrap two-hybrid system. In conclusion, the key result of the study demonstrates that Pax-5 is a main regulator of the B-cell specific expression of the CD23a isoform. In addition, a two-hybrid system was established and employed in order to look for cytoplasmic interaction partners for CD23. KW - Antigen CD23 KW - Promotor KW - Genregulation KW - CD23 KW - Pax-5 KW - Zwei-Hefen-Hybrid-System KW - Promotor Regulation KW - CD23 KW - Pax-5 KW - promoter regulation KW - two-hybrid system Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5556 ER -