TY - THES A1 - Zavala Góngora, Ricardo T1 - Isolierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von TGF-Beta-Signaltransduktionskomponenten des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis T1 - Structural and functional characterization of TGFß signaling systems in Echinococcus multilocularis N2 - Die molekularen Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion bei der durch den Zestoden Echinococcus multilocularis ausgelösten Erkrankung der alveolären Echinokokkose sind bislang ungeklärt. Zudem liegen keine Daten über Entwicklungs- und Differenzierungsmechanismen dieses Parasiten vor, die für die Entwicklung neuer Antiparasitika genutzt werden könnten. Ein bei der Evolution der Metazoen bereits frühzeitig entstandener Signaltransduktionsmechanismus zur Steuerung von Entwicklungsvorgängen ist das TGFβ/BMP-System, das aus strukturell verwandten Zytokinen der TGFβ (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, oberflächenständigen Rezeptoren der TGFβ-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) und intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie besteht. Außer an Entwicklungsvorgängen tierischer Organismen könnte diesem System eine wichtige Rolle bei der Wirt-Helminth-Kommunikation während Infektionsprozessen zukommen, wie in vorherigen Studien am Nematoden Brugia malayi und am Trematoden Schistosoma mansoni gezeigt werden konnte. Erste, wichtige Schritte zur Charakterisierung von TGFβ und BMP-Signalsystemen in Zestoden wurden in der vorliegenden Arbeit getan. Aufbauend auf einem vorherigen Bericht zu einem Transmembranrezeptor (EmRSK1) und einem Smad-Homologen (EmSmadA) aus Echinococcus multilocularis wurde die Liste der TGFβ/BMP Signaltransduktionsfaktoren in E. multilocularis in dieser Arbeit deutlich erweitert und erstmals umfangreiche funktionelle Studien durchgeführt. Die hier charakterisierten Faktoren umfassen zwei weitere Serin/Threonin-Kinasen der TGFβ/BMP-Rezeptorfamilie (EmRSK2, EmRSK3) sowie intrazelluläre Transduktoren der R-Smad-Subfamilie (EmSmadB, EmSmadC) und ein Homologes zur MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), genannt EmTAK1. Zudem konnte erstmals für einen parasitären Helminthen ein Zytokin der BMP-Subfamilie, EmBMP, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen legen nahe, dass E. multilocularis sowohl ein TGFβ wie auch ein BMP-Signalsystem exprimiert. Ersteres wird sehr wahrscheinlich durch die Kinase EmRSK2 und den Smad-Faktor EmSmadC gebildet, letzteres durch EmRSK1 und EmSmadB. EmSmadA nimmt eine Sonderstellung ein, da es sowohl durch TGFβ- wie auch durch BMP-Rezeptoren aktiviert werden kann. Die genaue Rolle von EmRSK1 und EmTAK1 wäre durch weitere Untersuchungen zu klären. Signifikante funktionelle Homologien zwischen den TGFβ/BMP-Signalsystemen des Parasiten und Säugern konnten nachgewiesen werden, die sich u.a. darin äußern, dass die Echinococcus Smad-Proteine durch entsprechende Rezeptoren des Menschen aktiviert werden können. Darüber hinaus konnten jedoch auch einige deutliche Unterschiede zwischen den Systemen aus Parasit und Wirt nachgewiesen werden, die sich als Angriffspunkte zur Entwicklung von Chemotherapeutika eignen könnten. So fehlt den Smad-Faktoren EmSmadA und EmSmadC eine MH1-Domäne, die sonst unter allen R-Smads hoch konserviert ist. Zudem sind einige bislang noch nie beschriebene, strukturelle Besonderheiten der Echinococcus TGFβ/BMP-Rezeptoren zu verzeichnen. Auch die Regulation dieser Faktoren und die Kreuz-Interaktion mit weiteren intrazellulären Signalwegen (z.B. der MAP Kinase Kaskade) scheint in E. multilocularis anders zu verlaufen als bislang für Vertebraten, Insekten oder Nematoden beschrieben. Schließlich konnte, als sehr wichtiger Befund, auch nachgewiesen werden dass mindestens ein Rezeptor des Parasiten, EmRSK1, mit einem Zytokin des Wirts (BMP2) in vitro funktionell interagiert. Da BMP2 in Zellkultursystemen, die das Wachstum des Parasiten am befallenen Wirtsorgan nachstellen, einen deutlichen Effekt auf E. multilocularis ausübt, könnte die hier beschriebene EmRSK1/BMP2 – Interaktion von entscheidender Bedeutung für die Wirt-Parasit-Interaktion bei der alveolären Echinokokkose sein. N2 - Up to now, the molecular mechanisms of the interactions between host and parasite in the disease of alveolar echinococcosis, caused by the cestode Echinococcus multilocularis, are not understood. Furthermore there are not data available about the mechanisms of development and differentiation in this parasite that could be used for the design of novel antiinfectives. One of the signaling systems which emerged very early in metazoan evolution and which presumably controls developmental processes in all animals is the TGFβ signal transduction system. This system consists of various factors: structurally related cytokines of the TGFβ (transforming growth factor β) and the BMP (bone morphogenetic protein) family, surface associated receptors of the TGFβ receptor family (type I and type II) and intracellular signal transduction factors of the Smad family. In addition to their crucial role in animal development, TGFβ/BMP systems could also play an important role in the communication between host and helminths during an infection, as has been shown previous studies on the nematode Brugia malayi and the trematode Schistosoma mansoni. In this study, the initial steps towards a characterization of TGFβ/BMP signaling in the third large group of parasitic helminths, the cestodes, have been made. Adding to a previous report on a transmembrane receptor (EmRSK1) and a Smad homologue (EmSmadA) from E. multilocularis, this work significantly extends the list of known TGFβ/BMP signaling factors from Echinococcus and provides, for the first time, functional studies on these systems. The newly characterized factors comprise two further serin/threonin kinases of the TGFβ/BMP receptor family (EmRSK2, EmRSK3), two further intracellular transducing factors belonging to the subfamiliy of R-smads (EmSmadB, EmSmadC) and one homologue of the MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), which was designated EmTAK1. Furthermore, and for the first time in a parasitic helminth, a cytokine of the BMP subfamily was characterized on the molecular level. Structural and functional studies suggested that E. multilocularis expresses both a TGFβ and a BMP signaling system. The kinase EmRSK2 and the Smad factor EmSmadC are most probably components of the first, EmRSK1 and EmSmadB parts of the latter system. Surprisingly, EmSmadA seems to constitute an unusual Smad since it can be activated by both TGFβ and the BMP receptors upon expression in mammalian cells. The precise roles of EmRSK3 and EmTAK1 have to be determined in future studies. In the present work, significant structural and functional homologies between the TGFβ/BMP systems of E. multilocularis and its mammalian hosts have been detected. Upon expression in human cells, the Echinococcus Smad proteins were, for example, able to functionally interact with the corresponding receptors from Homo sapiens. On the other hand, the E. multilocularis TGFβ/BMP signaling factors also displayed several biochemical differences to those of the host, which could be exploited for the development of antiparasitic drugs. One of these differences is the lack of a usually conserved MH1 domain in EmSmadA and EmSmadC. Moreover, the Echinococcus TGFβ/BMP receptors display several structural features which have not yet been detected in other members of the protein superfamily. Likewise, the regulation of TGFβ/BMP pathways in Echinococcus as well as their cross-interaction with other signaling pathways (e.g. the MAP kinase cascade) seems to differ from the situation in vertebrates, insects and nematodes. Finally, this work also provides evidence that at least one host cytokine, BMP-2, can functionally interact with a receptor of the parasite, EmRSK1. This interaction could be highly relevant for host-parasite interaction mechanisms in alveolar echinococcosis since BMP-2 also exerts clear effects on Echinococcus growth and differentiation in an in vitro cultivation system that mimicks the situation at the affected organ during an infection. KW - Fuchsbandwurm KW - Ontogenie KW - Signaltransduktion KW - Echinococcus KW - TGFß KW - BMP KW - Smad KW - Zestode KW - Echinococcus KW - TGFß KW - BMP KW - Smad KW - cestode Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17755 ER - TY - THES A1 - Wollny, Claudia T1 - Der p97-Kofaktor UBXD1 ist ein neuer Regulator des NF-kB-Signalweges T1 - The p97-cofactor UBXD1 is a new regulator of NF-kB-signaling N2 - Die essenzielle, Ubiquitin-selektive ATPase p97 reguliert eine Vielzahl unterschiedlicher Prozesse in Eukaryoten. Dazu zählen Proteinqualitätskontrolle, DNA-Reparatur, Signaltransduktion, Zellzykluskontrolle, Autophagie sowie das endolysosomale System. Diese unterschiedlichen Funktionen von p97 werden durch die Bindung von Kofaktoren engmaschig gesteuert und kontrolliert. Die größte und am besten untersuchte Gruppe von p97-Kofaktoren sind die Proteine der UBX Familie. Diese zeichnen sich durch den Besitz einer UBX-Domäne aus, welche die Bindung an p97 vermittelt. Das in höheren Eukaryoten konservierte Familienmitglied UBXD1 besitzt darüber hinaus mit einer PUB-Domäne und einem VIM-Motiv noch mindestens zwei weitere p97-Bindemodule. UBXD1 kann an Vesikel des endolysosomalen Degradationssytems lokalisieren, seine genauen zellulären Funktionen sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung von humanem UBXD1. Dafür wurden Kandidaten eines zuvor durchgeführten Yeast-Two-Hybrid-Screens auf ihre Two Hybrid-Interaktion mit unterschiedlichen UBXD1-Varianten getestet. Darüber hinaus wurde durch Immunpräzipitationsexperimente untersucht, ob die Kandidatenproteine auch in Säugerzellen mit UBXD1 interagieren. Als vielversprechende neue Bindungspartner von UBXD1 wurden so die Ubiquitin-Ligase TRIAD3A und das Ubiquitin-editierende Protein A20 identifiziert. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen UBXD1 und A20 von einer funktionellen PUB Domäne und dem siebten Zinkfinger Motiv von A20 abhängig ist. Da sowohl TRIAD3A als auch A20 negative Regulatoren des NF B Signalweges sind, wurde daraufhin untersucht, ob auch UBXD1 eine Funktion in diesem Signalweg besitzt. Tatsächlich war in UBXD1-depletierten HeLa 57A-Zellen die NF B-abhängige Expression eines Reportgens nach Aktivierung des Signalweges durch TNF, IL-1, Doxorubicin und H2O2 stark reduziert. Dabei spricht die verringerte Aktivierung nach unterschiedlichen Stimuli für eine generelle Rolle von UBXD1 im NF B Signalweg. Durch quantitative Echtzeit-PCR konnte gezeigt werden, dass in HeLa- und HEK293T-Zellen nach UBXD1-Depletion auch die Expression endogener NF B Zielgene verringert ist. Da in UBXD1-depletierten Zellen nach Stimulation mit TNF oder IL-1 bereits die Kerntranslokation des NF B-Transkriptionsfaktor p65 reduziert ist, ist davon auszugehen, dass UBXD1 an einer früheren Phase der Aktivierung des Signalweges beteiligt ist. Möglicherweise ist dies darauf zurückzuführen, dass UBXD1 bekannte Funktionen von A20 reguliert und etwa die Bindung von A20 an Vesikel des endolysosomalen Systems oder an lineare Ubiquitinketten beeinflusst. Diese Arbeit beschreibt somit eine neue Funktion des p97-Kofaktors UBXD1 im NF B-Signalweg. N2 - The essential, ubiquitin-selective ATPase p97 regulates a variety of cellular processes in eukaryotes. Among others, these include protein quality control, DNA repair, signal-transduction, cell cycle control, autophagy and the endolysosomal system. The distinct functions of p97 are tightly controlled by regulatory cofactors. UBX domain-containing proteins are the largest and best studied group of p97 cofactors . They are characterized by a UBX domain, which mediates binding to p97. The family-member UBXD1 is highly conserved in higher eukaryotes and possesses at least two additional p97 binding modules, a PUB domain and a VIM motif. While UBXD1 can localize to vesicles of the endolysosomal degradation system, its exact cellular function is still poorly understood. The aim of this study was the functional characterisation of human UBXD1. To that end, candidates of a previous yeast two-hybrid screen were tested for their two-hybrid interaction with different UBXD1 variants. Immunoprecipitation experiments were used to analyse if the candidates also interact with UBXD1 in mammalian cells. This led to the identification of the ubiquitin-ligase TRIAD3A and the ubiquitin-editing protein A20 as promising new binding partners of UBXD1. Moreover, it could be demonstrated that the interaction between UBXD1 and A20 depends on a functional PUB domain and the seventh zinc finger motif of A20. Because both TRIAD3A and A20 are negative regulators of the NF-B signaling pathway, it was subsequently tested if UBXD1 also has a function in NF-B signaling. Indeed, UBXD1-depleted HeLa 57A cells showed a strongly reduced NF B dependent expression of a reporter gene after activation of the signaling pathway by TNF, IL-1, Doxorubicin and H2O2. The reduced activity observed after various stimuli argues for a general role of UBXD1 in the NF-B signaling pathway. Quantitative real-time PCR demonstrated that the expression of endogenous NF-B target genes in HeLa and HEK293T cells was also reduced upon UBXD1-depletion. Since the nuclear translocation of the NF-B subunit p65 upon stimulation with TNF or IL-1was also reduced in UBXD1-depleted cells, UBXD1 is likely to participate in an earlier phase of NF-B activation. It is possible that UBXD1 regulates a known function of A20 and influences for example the binding of A20 to endocytic vesicles or to linear ubiquitin chains. In summary, this work describes a novel function of the p97 cofactor UBXD1 as a positive regulator of the NF-B signaling pathway. KW - Ubiquitin KW - UBXD1 KW - Signaltransduktion KW - Cofaktor KW - p97 KW - Signalweg KW - Zellbiologie Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-132430 ER - TY - THES A1 - Wobbe, Thomas T1 - Beeinflussung der Signaltransduktion des humanen Parathormon (PTH)-2 Rezeptors mittels Einzel- und Kombinationsmutationen T1 - Signaling characteristics of the human type 2 receptor for parathyroid hormone using receptor chimeras N2 - Parathormon (PTH) aktiviert am PTH-1 Rezeptor (P1R) mindestens zwei Signalwege: Über Guanosintriphosphat-bindende Proteine (Gs) kommt es intrazellulär zu einem Anstieg von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und zu einer Aktivierung der Proteinkinase A (PKA). Gq Protein-vermittelt erfolgt eine Aktivierung der Phospholipase C (PLC) und ein intrazellulärer Anstieg des Inositoltriphosphat (IP3). Der verwandte PTH-2 Rezeptor (P2R) wird einerseits durch seinen vermutlich physiologischen Liganden, das tuberoinfundibuläre Peptid (TIP39), und andererseits durch PTH aktiviert. Im Gegensatz zum P1R zeigt der P2R nur eine Ankopplung an den cAMP Signalweg und keine an den PLC Signalweg. Voruntersuchungen hatten gezeigt, dass intrazelluläre Abschnitte der zweiten und dritten Schleife sowie Bereiche des C-Terminus des P1R für die Aktivierung des PLC Signalweges verantwortlich sind. In der vorliegenden Dissertation erfolgte eine stufenweise Angleichung intrazellulärer Abschnitte des P2R an den P1R. Die generierten Hybridrezeptoren wurden hinsichtlich ihres Signaltransduktionsverhaltens untersucht. Mit der Bestimmung der akkumulierten Gesamtinositole und des intrazellulären Calciums [Ca]i konnte gezeigt werden, dass trotz einer 95%-igen Übereinstimmung der intrazellulären Aminosäuresequenzen der P2R-Hybridrezeptoren mit denen des P1R, die Ankopplung an den PLC Signalweg nicht übertragen werden kann. Diese Ergebnisse wurden für Stimulationen mit PTH und TIP39 nachgewiesen. Durch Hemmung der Proteinkinasen A und C konnte, wie erwartet, am P1R ein verstärktes IP3 Signal beobachtet werden. Eine Aktivierbarkeit des PLC Signalweges wurde auch hierbei für die Hybridrezeptoren nicht gesehen. Für die Aktivierung des cAMP Signalweges der Hybridrezeptoren konnte beobachtet werden, dass diese sich weitestgehend in Anlehnung zum P2R verhalten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass für eine effiziente Ankopplung an den cAMP Signalweg alle aus dem P1R in den P2R einfügten Teilabschnitte (zweite, dritte Schleife und C-Terminus) zusammenwirken. Der Hybridrezeptor, an dem alle drei Teilabschnitte ausgetauscht wurden, führte zu einer signifikant besseren Ankopplung an den cAMP Signalweg, als die Einzelmutation des C-Terminus. Die Messung zum cAMP Signalweg wurden mit den Liganden TIP39 und PTH durchgeführt. Für die Aktivierung des Gs Protein-vermittelten cAMP Signalweg am P1R oder P2R sind daher vermutlich Interaktionen verschiedener Rezeptorabschnitte verantwortlich. Insgesamt konnten in dieser Arbeit weitere wichtige Erkenntnisse bezüglich unterschiedlicher Aspekte der Signaltransduktion des P1R und des P2R gewonnen werden. N2 - Activation of the phospholipase C (PLC) pathway upon stimulation with PTH is unique to the PTH-1 receptor (P1R) and is virtually absent in the PTH-2 receptor (P2R). The sites of P1R mutations known to reduce PLC signaling may achieve this indirectly by disturbing coupling at other sites. We therefore chose a more stringent approach and attempt to reestablish PLC signaling in the closely (70%) related P2R by gradually adapting the P2Rs cytosolic interface to a P1R-like sequence by engineering hybrid P1R/P2R constructs. Key differing regions of the P1R´s second loop (DT272-273:EK), third loop (IW344-345:LR), and C-terminal tail (T440-end: K-end) were put into the P2R. A fourth chimeric P1R/P2R receptor, combining all these changes, thus had a > 90% sequence identity with the cytosolic interface of the P1R. All mutants were expressed on the cell surface of stably transfected HEK 293 cells, using a radioreceptor assay with [125I]-Nle8,21-Tyr34-rat PTH(1-34), with a similar density of 1.1 to 2.5 mio receptors/cell. Activation of the PLC pathway was assessed by: 1) accumulation of total inositol phosphates in myo[3H]-inositol-prelabeled cells. No increase was detectable in the P2R or any of the receptor chimeras, even after enhancing the possible response by blockade of protein kinases A and C, despite an up to 13-fold increase with the P1R upon PTH stimulation. 2) Similarly, a PTH-induced increase in intracellular calcium (detected by fluo-3) of the wildtype P1R with as little as 1 nM hPTH(1-34) was completely absent in all mutants as well as in the P2R. The PTH-induced max. response of the cyclic AMP pathway was virtually identical for the P1R and P2R. However, the max. response of the mutant with the P1R tail sequence was reduced to only 35% (PTH) and 26% (TIP39) of the P2R response. Surprisingly, this signaling loss could be overcome by introducing more P1R sequence into the second and third cytoplasmic loop of this P1R/P2R hybrid receptor thus regaining a max. cAMP response of 64% (PTH) and 85% (TIP39). Presumably, an interaction of P1R sequences seems to result in a more effective coupling to the cAMP signaling pathway. In conclusion, these results suggest that the activation of the IP / intracellular calcium signaling pathway by the P1R is highly dependent on a P1R-like intracellular contact interface, which can not be mimicked easily even in the presence of > 90% of P1R sequence in the cytosolic interface of the P2R. KW - Parathormon KW - Epithelkörperchen KW - Signaltransduktion KW - Cyclo-AMP KW - Inosittriphosphate KW - Ligand KW - Rezeptor-Kinasen KW - Wirkstoff-Rezep KW - PTH-1 Rezeptor KW - PTH-2 Rezeptor KW - TIP39 KW - Calcium KW - GPCR KW - PTH-1 receptor (P1R) KW - PTH-2 receptor (P2R) KW - PLC signaling KW - cAMP signaling pathway Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27880 ER - TY - THES A1 - Weißenburg, Mandy T1 - Analyse dehnungsabhängiger Veränderungen der Signaltransduktion im humanen Myokardgewebe und ihre möglichen Auswirkungen auf die Entstehung und Aufrechterhaltung einer Herzhypertrophie T1 - Analysis of stretch induced changes in the signalling pathways and their affects on the onset of cardiac hypertrophy in human myocard N2 - Die Herzhypertrophie ist eine der bedeutendsten und schwerwiegendsten klinischen Komplikationen vieler kardiovaskulärer Erkrankungen. Sie stellt eine Anpassungsreaktion des Herzens an erhöhte kardiale Belastungen dar. Jedoch kommt es dabei an einem nicht definierten Punkt der Hypertrophie- Genese zu einer Verselbstständigung der daran beteiligten Mechanismen und die Hypertrophie ist progredient. Durch das Versagen reaktiver Kompensationsmöglichkeiten kommt es durch eine relative Koronarinsuffizienz vermehrt zu ischämischen Ereignissen und einer daraus resultierenden erhöhten Mortalität. Das Interesse viel versprechende Therapieansätze aufzuspüren ist bei Medizinern und Pharmazeuten immens groß, da die Zahl betroffener Patienten von Tag zu Tag wächst. Um die Präventionsmöglichkeiten der Herzhypertrophie zu verbessern, ist es daher essentiell, ihren molekularen und biochemischen Entstehungsmechanismus und dessen Aufrechterhaltung zu verstehen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit dem Einfluss mechanischer Dehnung und anderer Stressoren, wie beispielsweise Phorbol-Ester an der Entstehung der kardialen Hypertrophie im humanen Myokard. Dabei wurden einige Proteinkinasen möglicher beteiligter Signaltransduktionskaskaden untersucht und besonderes Augenmerk auf den Einfluss der MAP- Kinasen gelegt. Zum ersten Mal wurde für derartige Untersuchungen mit humanem atrialen Herzmuskelgewebe gearbeitet, das im Rahmen von kardiochirurgischen Operationen gewonnen wurde. Das Modell der isolierten und intakten Muskelfaser erwies sich in der Versuchsdurchführung als überaus geeignet, da es zum einen eine elektrische Stimulation der humanen Herzmuskelstreifen ermöglichte und es zum anderen die Gelegenheit bot, dehnungsabhängige Versuche an den Muskelstreifen durchzuführen. Dabei wurden mehrere Versuchsgruppen gebildet, welche sich vor allem im Dehnungsgrad und der Versuchszeit unterschieden. Als weiteres Unterscheidungsmerkmal wurden einige Muskelstreifen- Gruppen sowohl elektrisch stimuliert und somit zur isometrischen Kontraktion gebracht und zusätzlich mechanisch gedehnt während bei anderen Muskelstreifen nur der Einfluss der mechanischen Dehnung ohne zusätzliche elektrische Stimulation untersucht wurde. Die Dehnungsgrade wurden in drei Stufen unterteilt: in den ungedehnten Zustand, den optimal vorgedehnten Zustand und den Überdehnungszustand. Die Versuchszeit differierte zwischen zehnminütigen bis hin zu sechzigminütigen Versuchen. Die dehnungsabhängigen Veränderungen der, an den untersuchten Signaltransduktionswegen beteiligten Proteinkinasen wurden in Western Blot- Analysen gezeigt. Dabei erwies sich die Stress- aktivierte p38 MAP- Kinase als ausgesprochen dehnungsabhängig im humanen Myokard. Speziell auf die Überdehnungsreize reagierte die p38 MAP- Kinase mit einer signifikanten Aktivitätssteigerung. Da es derzeit noch widersprüchliche Angaben über die Beteiligung der aktivierten p38 MAP- Kinase an der Entstehung der Herzhypertrophie gibt, handelt es sich bei den vorliegenden Ergebnissen um relevante neue Aspekte im Bereich des humanen kardialen Gewebes. Als weiteres wichtiges Ergebnis der vorliegenden Arbeit gilt die dehnungsinduzierte Aktivierung der p70S6- Kinase im humanen Myokard. Da sie eine wichtige Rolle in der Regulation der Transkription und besonders der Translation von Proteinen spielt und somit einen entscheidenden Einfluss auf die Proteinexpression in der Zelle hat, kann die p70S6-Kinase vermutlich als wichtiger Baustein in der Entstehung der Herzhypertrophie angesehen werden. Die Auswirkungen der mechanischen Dehnung auf die Aktivierung der ERKs 1/2, die in bereits veröffentlichten Untersuchungen an Kardiomyozyten als eindeutig Hypertrophie auslösend beschrieben wurden, waren in der vorliegenden Arbeit am humanen Herzmuskelgewebe nicht verifizierbar. N2 - Cardiac hypertrophy is one of the most important clinical complications of many cardiovascular disorders. It is an adaptive process of the heart to an increased hemodynamic overload. The hypertrophied heart has been shown to have impaired contractile as well as relaxing functions and loss of reactive compensatory mechanisms. This leads to relative coronary insufficiency, an increase in infarctions and higher mortality of ischemic heart disease. Therefore the development of prevention and treatment of cardiac hypertrophy is an important theme for cardiologists and pharmacologists. For preventing cardiac hypertrophy it is mandatory to understand the cellular and molecular mechanisms by which cardiac hypertrophy is induced and maintained. This dissertation tried to elucidate the influences of mechanical loading by stretching cardiac muscle tissue and other stress-factors like phorbol esters on the onset of cardiac hypertrophy in human myocard. The investigation was concentrated on a selection of protein kinases which in recent studies have been observed to be part of important cellular signalling pathways, especially focusing on the role of MAP kinase pathways. For the first time the observations were made by using human atrial heart muscle fibers from patients undergoing cardiac surgery because of aortic valve disease or coronarsclerosis. The model of isolated and intact muscle fibers was used because on the one hand there was the possibility for electrical stimulation resulting in muscle contraction and on the other hand there was the opportunity for controlled stretching studies. For the different investigations it was necessary to create several study groups consisting of different stretching levels und different periods of stretching. For further differentiation some study groups consisting of several muscle fibers were both electrically stimulated with the result of isometric contractions and stretched while in other groups just the influence of mechanical stretching without electrical stimulation was investigated. The following stretching levels were used: the slag length, the level without any stretching, the optimal stretched length with the most force under optimal contraction conditions and the over stretch level with worse force conditions. The study time distinguished between ten minutes and one hour. Differences in the quantity of exprimed protein kinases depending on different stretching levels were shown in western blot analyses. As one of the main result of this dissertation it could be shown that the stress activated p38 MAP kinase was strongly activated in stretched human myocard, especially over stretch conditions lead to a significant increase of activity. Since only few and controversial data exist about the involvement of activated p38 MAP kinase on the onset of cardiac hypertrophy the results found here by the investigation of human cardiac tissue were relevant new aspects. The stretch- induced activation of p70S6 kinase in human myocard represented another important result of this dissertation. The p70S6 kinase plays an important role in the regulation of translation and transcription of proteins and it has a great influence on the protein expression of cells. Therefore p70S6 kinase probable takes part in the development of cardiac hypertrophy. In recently published data it was suggested that ERKs 1/2 are also involved in the development of cardiac hypertrophy induced by mechanical stretching in cardiac myocytes. In our investigations on human cardiac tissue we could not confirm this suggestion. KW - Herzhypertrophie KW - humanes Myokard KW - Signaltransduktion KW - MAP- Kinasen KW - Stress- aktivierten Proteinkinasen KW - Cardiac hypertrophy KW - human myocard KW - signalling pathways KW - MAP kinases KW - Stress activated protein kinases Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22448 ER - TY - THES A1 - Wegert, Jenny T1 - WTX-Mutationsscreen und funktionelle Analyse des Retinsäure-Signalwegs in Wilms Tumoren T1 - WTX-mutation screening and functional analysis of the retinoic acid signaling pathway in Wilms tumors N2 - Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, ist einer der häufigsten bösartigen Tumoren im Kindesalter. Er entsteht aus embryonalem undifferenziertem Nierengewebe und tritt meist als unilateraler und sporadischer Tumor auf. In 10-15% der Wilms Tumoren finden sich WT1- und/oder CTNNB1-Mutationen. Während diese schon länger als genetische Ursachen des Nephroblastoms bekannt sind, wurde erst kürzlich WTX als drittes Gen beschrieben, welches eine Rolle in der Tumorentstehung spielt. Für einen Großteil der WT ist die genetische Ursache jedoch unklar. Da die bisher publizierten WTX-Mutationsraten auf Untersuchungen kleiner Gruppen basieren und sich stark unterscheiden, sollten in dieser Arbeit WTX-, CTNNB1- und WT1-Mutationen in einem großen WT-Set bestimmt werden. Verluste genetischen Materials in der WTX-Region traten in 17% der Fälle auf und waren zwischen den Geschlechtern gleich verteilt. Die Sequenzierung von WT-Proben zeigte, dass nur 2% von WTX-Punktmutationen betroffen sind. In weiteren 11,5% der Proben konnte keine WTX-Expression nachgewiesen werden. Die WTX-Veränderungen traten z. T. gemeinsam mit WT1- und/oder CTNNB1-Mutationen auf. Die unvollständige WTX-Deletion in einigen WT legte die Vermutung nahe, dass innerhalb eines Tumors eine Heterogenität in Bezug auf den WTX-Status möglich ist. Dieser Verdacht konnte durch die detaillierte Untersuchung verschiedener Regionen solcher Tumoren erhärtet werden: Hierzu wurden histologisch unterschiedliche Bereiche auf den Anteil einer WTX-Mutation bzw. eines WTX-LOH hin untersucht. Obwohl alle Regionen des jeweiligen Tumors einen kompletten LOH auf Chromosom 11 aufwiesen, waren die WTX-Veränderungen unterschiedlich stark ausgeprägt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass WTX-Veränderungen keine notwendigen und frühen Ereignisse in der Tumorentstehung sind, sondern erst später auftreten und nur einen Teil der Tumorzellen betreffen können. Die Vermutung, dass WTX-Mutationen keinen direkten Einfluss auf die Tumorentwicklung und prognose haben, wird durch das Fehlen eines signifikanten Zusammenhangs zwischen WTX-Deletion bzw. WTX-Expression und den klinischen Eigenschaften der WT gestützt. Um die Rolle von Genen, die potentiell an der Entstehung und Entwicklung des Nephroblastoms beteiligt sind, zu untersuchen oder mögliche neue Therapiestrategien zu überprüfen, sind in vitro-Modelle nötig. Da ein solches für Wilms Tumoren nicht etabliert ist, wurden Primärkulturen aus verschiedenen WT-Proben angelegt. Kulturen aus Tumorgewebe von 12 Patienten mit unterschiedlichen genetischen Veränderungen konnten als echte Tumorzellen validiert werden. Zwei Zelltypen ließen sich morphologisch und immunhistochemisch unterscheiden: Zum einen runde, langsam wachsende Zellen mit Epithelcharakter und zum anderen fibroblastenähnliche Zellen, welche weniger differenziert waren und häufig für viele Passagen kultiviert werden konnten. Somit wurde ein Set verschiedener WT-Primärkulturen etabliert, welches nun für in vitro-Experimente zur Untersuchung grundlegender Mechanismen der WT-Entstehung oder zum Test neuer Therapieansätze eingesetzt werden kann. Frühere Microarray-Analysen deuteten auf eine Deregulation des Retinsäure (RA)-Signalwegs in fortgeschrittenen Wilms Tumoren hin. Diese Ergebnisse sollten in einem großen unabhängigen Proben-Set mittels Realtime-RT-PCR validiert werden. Eine Deregulation des RA-Signalwegs und die Überexpression von NMYC wurden für Tumoren der Hochrisikogruppe im Vergleich zu Tumoren mit geringem/mittlerem Risiko nachgewiesen. So stellte sich die Frage, ob Patienten mit fortgeschrittenem WT von einem Retinsäure-Einsatz in der Therapie profitieren könnten. Um dies zu beantworten, wurde der Effekt von verschiedenen Retinoiden auf WT-Primärkulturen untersucht. Die WT-Zellen wurden mit all-trans RA (ATRA), 9cisRA, dem synthetischen Retinoid Fenretinid (4HPR) und Kombinationen von ATRA bzw. 4HPR und einem HDAC-Inhibitor (SAHA) behandelt. Gene, welche in Hochrisiko-WT differenziell reguliert waren, wurden untersucht und zeigten nach RA-Behandlung eine entgegengesetzte Expression. In sechs der sieben verwendeten Primärkulturen wurde eine RA-vermittelte Proliferationsreduktion nachgewiesen. Für die Kombinationen von Retinoiden mit SAHA wurden keine synergistischen Effekte beobachtet. Während Fenretinid in den meisten Kulturen Apoptose induzierte, verursachten ATRA und 9cisRA morphologische Veränderungen, welche auf Differenzierungsvorgänge hindeuteten. Eine Microarray-Analyse ATRA-behandelter WT-Zellen zeigte die differenzielle Regulation vieler Gene, welche eine Rolle in der Bildung der extrazellulären Matrix oder bei Differenzierungsvorgängen von Knochen-, Knorpel-, Nerven- oder Muskelgewebe spielen. Diese Befunde bieten einen weiteren Hinweis darauf, dass Retinoide für den Einsatz in der Therapie des Nephroblastoms geeignet sein könnten. N2 - Wilms tumor (WT) – or nephroblastoma – is one of the most common solid tumors in childhood. It arises from embryonal blastema and most frequently presents as a unilateral and sporadic tumor. Mutations in WT1 and CTNNB1 are well established as causal alterations in about 10-15 % of cases. Recently, WTX (Wilms tumor gene on the X-chromosome), a gene implicated in WNT signaling, has been identified as a third WT gene, but for the majority of nephroblastomas the genetic etiology is still unclear. Published WTX mutation rates in Wilms tumors are still based on smaller cohorts and differ significantly. Therefore, the WTX, CTNNB1 and WT1 mutation state was determined in a large set of 429 Wilms tumors. Genomic WTX alterations were identified in 17% of WT, equally distributed between males and females. Analysis of 104 WT samples for WTX point mutations revealed a frequency of only 2%. An additional 11,5% of tumor samples lacked expression of WTX mRNA. These WTX alterations can occur in parallel to WT1 or CTNNB1 mutations. Incomplete deletion of WTX in several cases suggested heterogeneity of WTX alterations in tumors and this was corroborated by analysis of different regions of such tumors. In cases with heterozygous point mutations or LOH, separate tumor fragments or microdissected regions with different histology were analyzed. Despite complete allele losses at chromosome 11 varying ratios of WTX mutation were detected. This suggests that WTX alteration is not an essential and early mutation needed to drive tumorigenesis, but rather a late event that may affect only a fraction of cells with unclear clinical relevance. This hypothesis is supported by the fact that there is no significant correlation between WTX deletion status or expression level and clinical parameters suggesting that WTX mutations apparently have little direct impact on tumor behavior and presentation. As there is no in vitro model for nephroblastoma that could be used to investigate genes playing a role in development and progression of WT or to test new treatment strategies, primary cultures were generated from fresh tumor tissue. Cultures from tumor samples of 12 patients with different genetic alterations could be validated as tumor derived cells. Two different cell types could be distinguished by immunohistochemistry and cell morphology: large round, slowly growing cells with epithelial characteristics and fibroblast-like cells that are less differentiated and some of which could be kept in culture for many passages before getting senescent. In this way a set of primary WT-cells could be established that is suitable for in vitro approaches to study mechanisms of nephroblastoma development or to test new therapy strategies. Prior microarray analyses suggested a deregulation of the retinoic acid (RA) pathway in advanced Wilms tumors. This should be validated in a large independent tumor set of 163 WT by realtime-RT-PCR. Deregulation of RA signaling and overexpression of NMYC was found in high risk tumors as opposed to tumors with low/intermediate risk and suggested a beneficial impact of retinoic acid on advanced nephroblastoma. To investigate whether retinoids could be employed as a novel therapeutic agent in WT primary WT-cells were treated with all-trans-RA (ATRA), 9cisRA, the synthetic retinoid fenretinide and combinations of retinoids and the HDAC inhibitor SAHA. Expression of genes deregulated in high risk tumors were analyzed and showed opposite changes upon treatment suggesting a positive effect of retinoids. For six of seven primary cultures tested cell growth was reduced upon retinoid administration. No additional synergistic effect could be observed for the combination of retinoids with the HDAC inhibitor SAHA. While fenretinide induced apoptosis in several cultures tested, ATRA and 9cisRA caused morphological changes suggesting differentiation upon treatment. Microarray analysis of ATRA treated WT-cells revealed differential expression of many genes involved in the formation of the extracellular matrix and osteogenic, neuronal or muscle differentiation processes. These findings provide further evidence of a potential utility of retinoids in Wilms tumor treatment. KW - Nephroblastom KW - Genmutation KW - Retinoesaeure KW - Signaltransduktion KW - Wilms Tumor KW - WTX KW - Primärkultur KW - Nephroblastoma KW - Wilms tumor KW - WTX KW - primary cell culture KW - retinoic acid Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52822 ER - TY - THES A1 - Weber, Judith T1 - Immunhistochemische Analysen zur Expression von cellular FLICE (FADD-like-IL-1β-converting enzyme)-inhibitory protein (cFLIP) in epithelialen und melanozytären Tumoren der Haut T1 - Immunohistochemical analysis of cellular FLICE (FADD-like-IL-1β-converting enzyme)-inhibitory protein (cFLIP) in melanocytic and epithelial skin lesions N2 - Die Resistenz von Tumorzellen gegenüber Apoptose stellt einen zentralen Baustein in der Pathogenese von Tumorerkrankungen dar. cFLIP inhibiert rezeptornah die Todesrezeptor-vermittelte Apoptose und spielt somit eine bedeutende Rolle als Regulator der Apoptose. Eine verstärkte Expression von cFLIP kann folglich hinweisend auf eine Fehlregulation der Apoptose bei der Entstehung und Progression von Tumoren sein. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von cFLIP in kutanen epithelialen und melanozytären Tumoren mit formalinfixierten und paraffinierten Gewebeproben untersucht. Bei der zunächst durchgeführten Charakterisierung der käuflich erhältlichen monoklonalen cFLIP-Antikörper mittels cFLIP-überexprimierenden HaCaT-Keratinozyten wurde überraschenderweise die fehlende Spezifität eines Antikörpers (KlonEPR8438(2)) nachgewiesen, was zur Folge hatte, dass der Hersteller die Produktion nach Mitteilung der Befunde eingestellt hat. Daher wurden die weiteren Untersuchungen unter Verwendung des Antikörper-Klons G11, der sowohl im Western Blot als auch immunhistochemisch die beiden cFLIP-Splicevarianten cFLIPL und cFLIPS spezifisch nachweist, durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass cFLIP in epithelialen Hauttumoren in erheblichem Maß exprimiert wird. In jeweils 40% der untersuchten aktinischen Keratosen und Morbi Bowen konnte cFLIP nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu zeigte sich in den fortgeschrittenen Formen epithelialer Hauttumoren eine deutlich höhere Expressionsrate. Eine Expression wiesen zudem 100% der untersuchten Keratoakanthome und 95% der Plattenepithelkarzinome (mit überwiegend gutem Differenzierungsgrad) auf. Dementsprechend war es nicht verwunderlich, dass alle untersuchten Metastasen von Plattenepithelkarzinomen cFLIP überexprimierten. Die Analyse melanozytärer Läsionen ergab, dass cFLIP in melanozytären Nävi wie auch superfiziell spreitenden Melanomen, Lentigo-maligna-Melanomen und akral lentiginösen Melanomen nur in einer sehr geringen Anzahl der untersuchten Präparate überexprimiert wurde. Erstaunlicherweise konnte jedoch in 65% der nodulären Melanome sowie in 60% der Melanommetastasen cFLIP nachgewiesen werden. Bezüglich der Expression von cFLIP im Primärtumor sowie der Metastase desselben Patienten konnte kein eindeutiger Trend festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die frühe Hemmung des extrinsischen Apoptoseweges durch das antiapoptotische Protein cFLIP an der Entstehung, dem Wachstum und möglicherweise der Metastasierung epithelialer Hauttumore beteiligt sein dürfte. Die auffallend hohe Expressionsrate im nodulären Melanom sowie den untersuchten Melanommetastasen könnte einen zukünftigen therapeutischen Angriffspunkt darstellen. N2 - It is already known, that cFLIP is an effective inhibitor of death receptor-mediated apoptosis. Due to its ability to block one of the most proximal steps of the extrinsic apoptotic cascade, every kind of dysregulation concerning cFLIP may have serious consequences for tissue homeostasis. Therefore, it is possible that cFLIP-mediated prevention of death receptor-mediated apoptosis represents one critical step during the development of malignancy. In the present study, the expression of cFLIP was examined by immunohistochemistry in a panel of 110 epithelial and 140 melanocytic skin lesions. Therefore, we used the purchased monoclonal mouse antibody clone G11 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg). cFLIP expression was undetectable in all analyzed basal cell carcinomas, whereas both actinic keratosis and Bowen’s disease (8/20 (40%)) were positive for cFLIP. Consistent to previous data, all 20 (100 %) keratoacanthomas were positive for cFLIP, too. Furthermore, almost all (19/20 (95%)) squamous cell carcinomas were positive for cFLIP as well as 10/10 (100 %) metastases of squamous cell carcinomas. Melanocytic nevi expressed cFLIP (7/20 (35 %)). In Melanoma, cFLIP expression was different in melanoma subtypes and type of tissue. While only 15% of superficial spreading melanomas and 10 % of lentigo-maligna melanomas were positive, 25% of acral lentiginous melanomas were positive for cFLIP expression. The majority (13/20 (64 %)) of nodular melanomas and of melanoma metastases (12/20 (60 %)) were positive for cFLIP. Additionally, we examined cFLIP expression in ten primary melanomas as well as one of their regional lymph node/skin metastases. Due to the small sample size and the heterogeneity of analyzed primary melanomas/metastases a connection between expression of cFLIP in primary tumors and metastases could neither be proved nor denied and needs to be elucidated in more detail. In conclusion, our study confirms that cFLIP expression is selectively detected in different melanocytic and epithelial skin lesions. In respect to the high proportion of melanoma metastase and metastases of squamous cell carcinomas, our findings demonstrate that cFLIP may be implicated in tumor development and progression and therefore could serve as a biomarker or as a target for future therapies. KW - Melanom KW - Plattenepithelcarcinom KW - Apoptose KW - Signaltransduktion KW - Immunhistochemie KW - cFLIP KW - Apoptoseresistenz KW - extrinsischer Signalweg Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209918 ER - TY - THES A1 - Warnke, Clemens T1 - Mechanismen TNF-induzierter Genexpression T1 - Mechanisms of TNF-induced gene expression N2 - TNF wird zunächst als TypII-Transmembranprotein (mTNF) gebildet und erst anschließend durch spezifische Spaltung durch die Metalloprotease TACE zum löslichen Zytokin sTNF prozessiert. Da mTNF der alleinige Hauptaktivator des TNFR2 ist und sich bisherige Untersuchungen zum TNF-Signaling weitgehend auf sTNF konzentrierten, ist vergleichsweise wenig über TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bekannt. An TNFR1 sind dagegen beide TNF-Varianten bioaktiv. Trotz intensiver Untersuchung des TNFR1-Signaling sind jedoch auch hier viele Fragen noch unbeantwortet. Derzeit existieren deshalb zum TNFR1-Signaling zwei verschiedene Modellvorstellungen nebeneinander. Im ersten Modell, dem Modell der Kompartmentalisation, bindet TRADD erst nach Rezeptorinternalisierung an TNFR1, genauso wie FADD und Caspase-8. Die Rezeptorinternalisierung nach Ligandenbindung gilt hier daher als Voraussetzung für die TRADD-Rekrutierung und für die Apoptoseinduktion. Im zweiten Modell, dem Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe, bindet TRADD dagegen bereits im membrangebundenen Signalkomplex an TNFR1. Anschließend dissoziiert TRADD vom Rezeptor, um im Zytoplasma einen zweiten, apoptoseinduzierenden Komplex mit FADD und Caspase-8 zu formen. Um mehr über TNFR2 zu erfahren und um das TNFR1-Signaling besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Signaltransduktion und die Geninduktion über TNFR1 und TNFR2 nach Stimulation mit mTNF untersucht. Ziel war es letztlich, eine Methode zu etablieren, die es erlaubt, membrangebundene TNFR1- und TNFR2-Signalkomplexe getrennt zu isolieren. Dazu wurden zunächst nicht zu sTNF spaltbare TNFR1- bzw. TNFR2-spezifische mTNF-Varianten mit GST-Tag hinsichtlich Rezeptorbindung und Rezeptoraktivierung näher charakterisiert. Die selektive Bindung dieser mTNF-Varianten an TNFR1 bzw. TNFR2 konnte gezeigt werden. Auch der Nachweis ihre Funktionalität in Versuchen zur IL8-Induktion war möglich. Mit Hilfe der TNFR1-spezifischen mTNF-Variante gelang im GST-Fishing die Koimmunopräzipitation von TNFR1, TRADD und TRAF2 und damit die Isolierung des membrangebundenen Signalkomplexes des TNFR1. Mit Hilfe einer TNFR2-spezifischen Variante konnten dagegen TNFR2 und TRAF2 koimmunopräzipitiert werden, TRADD dagegen nicht. Somit ließen sich mit den rezeptorspezifischen Varianten von mTNF die Rezeptorsignalkomplexe des TNFR1 und TNFR2 getrennt isolieren. Interessant war dabei insbesondere die TRADD-Rekrutierung an TNFR1 im membrangebundenen TNFR1-Signalkomplex. Da die Internalisierung von TNFR1 nach mTNF-Stimulation schwer vorstellbar ist, bindet TRADD offensichtlich an TNFR1, ohne dass eine Rezeptorinternalisierung Voraussetzung wäre. Damit erscheint das Modell der Kompartmentalisation zumindest für mTNF wenig plausibel. Dagegen sind die bisher für mTNF erhobenen Daten mit einer TRADD-Dissoziation vom Rezeptor vereinbar, weshalb ein Modell zweier sequentiell arbeitender Signalkomplexe durchaus auch für mTNF Gültigkeit besitzen könnte. N2 - In this dissertation, membrane bound TNF and its receptor selective muteins are shown to induce gene expression and to selectively bind to TNFR1 and TNFR2. Furthermore, in GST-Fishing experiments membrane bound TNF induced signal transduction leading to NFkB and apoptosis induction was further investigated. Two existing different models of TNFalpha induced apoptosis in the literature were compared, the model of two sequential signaling complexes and the model of compartmentalisation. In this dissertation, it was shown that the model of two sequential signaling complexes is more likely to be able to explain membrane bound TNF induced apoptosis. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Apoptosis KW - Entzündung KW - Zytokine KW - cytokine KW - NFkB KW - Signaltransduktion KW - cytokine KW - tnf KW - apoptosis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23989 ER - TY - THES A1 - Wangorsch, Gaby T1 - Mathematical modeling of cellular signal transduction T1 - Mathematische Modellierung der zellulären Signaltransduktion N2 - A subtly regulated and controlled course of cellular processes is essential for the healthy functioning not only of single cells, but also of organs being constituted thereof. In return, this entails the proper functioning of the whole organism. This implies a complex intra- and inter-cellular communication and signal processing that require equally multi-faceted methods to describe and investigate the underlying processes. Within the scope of this thesis, mathematical modeling of cellular signaling finds its application in the analysis of cellular processes and signaling cascades in different organisms. ... N2 - Das fein regulierte und kontrollierte Ablaufen zellulärer Prozesse ist essentiell für das gesunde Funktionieren einzelner Zellen, sowie der aus ihnen bestehenden Organe. Diese wiederum bedingen das Funktionieren des gesamten Organismus. Genauso vielschichtig wie die Kommunikation und Signalverarbeitung innerhalb und zwischen den Zellen, sind die Methoden um diese Vorgänge zu beschreiben und zu untersuchen. Die mathematische Modellierung zellulärer Signalverarbeitung findet im Rahmen dieser Arbeit Anwendung in der Analyse zellulärer Prozesse und Signalkaskaden in verschiedenen Organismen.... KW - Mathematische Modellierung KW - Thrombozyt KW - Systembiologie KW - Mathematische Modellierung KW - Mathematical modeling KW - platelets KW - signaling pathway KW - systems biology KW - Signaltransduktion Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87746 ER - TY - THES A1 - Wagner, Martin T1 - Untersuchungen zu den kostimulatorischen Signalwegen PD-1/PD-L1 und CD137/CD137L beim kolorektalen Karzinom T1 - Studies on the costimulatory pathways PD-1/PD-L1 and CD137/CD137L in colorectal carcinoma N2 - Kostimulatorische Signalwege spielen beim Zustandekommen einer T-Zell-gebundenen Effektor-Immunantwort eine entscheidende Rolle. In dieser Arbeit wurde die Expression der Signalwege PD-1/PD-L1 und CD137/CD137L im kolorektalen Karzinom untersucht. Hierzu wurde die Expression in den Karzinomen SW480, SW620 und HT-29 mittels qRT-PCR, Western Blot und FACS analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass PD-1 und CD137 sowie deren Rezeptoren PD-L1 und CD137L im Kolonkarzinom auf Gen- und Proteinebene exprimiert werden. Zunehmendes Tumorzellwachstum sowie mangelnde Nährstoffversorgung führten zu deutlichen Veränderungen im Expressionsmuster, wobei sich zwischen den Kolonkarzinomen SW480/SW620 und dem Kolonkarzinom HT-29 Unterschiede aufzeigen ließen. Durch die Untersuchungen für diese Arbeit konnten wertvolle Informationen über das Expressionsverhalten der untersuchten kostimulatorischen Signalwege gewonnen werden. Eine mögliche Schlussfolgerung ist, dass eine inhibierende PD-1/PD-L1- als auch eine CD137/CD137L-Tumorzell-vermittelte Therapie die Tumorimmunantwort gegen das kolorektale Karzinom stärken und damit das Überleben betroffener Patienten verbessern könnte. N2 - Costimulatory pathways are important for the development of a T-cell-bound effector immune response. This work investigated the expression of the signals PD-1/PD-L1 and CD137/CD137L in colorectal carcinoma. For this purpose, the expression in the carcinomas SW480, SW620 and HT-29 was analyzed with qRT-PCR, Western Blot and FACS. It could be shown that PD-1 and CD137 as well as their receptors PD-L1 and CD137L are expressed in colon carcinoma at gene and protein level. Increasing tumor cell growth and lack of nutrient supply led to significant changes in the expression pattern. However differences between the colon carcinomas SW480 / SW620 and the colon carcinoma HT-29 were measured. The investigations for this work provided valuable information about the expression behavior of the studied costimulatory pathways. Both inhibitory PD-1/PD-L1 and CD137/CD137L tumor cell-mediated therapy could potentially enhance the tumor immune response against colorectal carcinoma and thus improve the survival of affected patients. KW - Kolonkarzinom KW - CD137-Antigen KW - Signaltransduktion KW - PD-1-Antigen KW - Kostimulatorische Signalwege Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184343 ER - TY - THES A1 - Vögtle, Timo T1 - Studies on receptor signaling and regulation in platelets and T cells from genetically modified mice T1 - Studien zur Signaltransduktion und Regulierung von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen genetisch veränderter Mäuse N2 - Receptors with tyrosine-based signaling motifs control essential functions of hematopoietic cells, including lymphocytes and platelets. Downstream of the platelet receptor glycoprotein (GP) VI and the T cell receptor (TCR) the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) initiates a signaling cascade that involves kinases, adapter and effector proteins and finally leads to cellular activation. This thesis summarizes the results of three studies investigating different aspects of receptor signaling and regulation in platelets and T cells. In the first part, the impact of constitutive Ca2+ influx on TCR signaling and T cell physiology was investigated using a transgenic mouse line with a mutation in the Ca2+ sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1). The elevated cytoplasmic Ca2+ level resulted in an altered phosphorylation pattern of the key enzyme phospholipase (PL) Cγ1 in response to TCR stimulation, but without affecting its enzymatic activity. Withdrawal of extracellular Ca2+ or inhibition of the phosphatase calcineurin restored the normal phosphorylation pattern. In addition, there was a decrease in the release of Th2-type cytokines interleukin 4, 5 and 13 upon stimulation in vitro. The second part of the thesis deals with the role of the adapter protein growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in platelets using a megakaryocyte/platelet-specific knockout mouse line. Loss of Grb2 severely impaired signaling of GPVI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), a related hemITAM receptor. This was attributed to defective stabilization of the linker for activation of T cells (LAT) signalosome and resulted in reduced adhesion, aggregation, Ca2+ mobilization and procoagulant activity downstream of (hem)ITAM-coupled receptors in vitro. In contrast, the signaling pathways of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the integrin αIIbβ3, which do not utilize the LAT signalosome, were unaffected. In vivo, the defective (hem)ITAM signaling caused prolonged bleeding times, however, thrombus formation was only affected under conditions where GPCR signaling was impaired (upon acetylsalicylic acid treatment). These results establish Grb2 as an important adapter protein in the propagation of GPVI- and CLEC-2-induced signals. Finally, the proteolytic regulation of the immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)-bearing receptor CD84 in platelets was investigated. This study demonstrated that in mice CD84 is cleaved by two distinct and independent proteolytic mechanisms upon platelet activation: shedding of the extracellular part, which is exclusively mediated by a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 and cleavage of the intracellular C-terminus by the protease calpain. Finally, the analysis of soluble CD84 levels in the plasma of transgenic mice revealed that shedding of CD84 by ADAM10 occurs constitutively in vivo. N2 - Rezeptoren mit Tyrosin-basierten Signaltransduktionsmotiven sind von fundamentaler Bedeutung für die Funktion hematopoietischer Zellen wie Lymphozyten und Thrombozyten. Unterhalb des Glykoproteins (GP) VI auf Thrombozyten und des T-Zell Rezeptors (TZR) auf T-Zellen initiiert das immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) eine Signalkaskade, die Kinasen, Adapter- und Effektorproteine mit einbezieht und schlussendlich zur Aktivierung der Zelle führt. Die hier vorgelegte Arbeit fasst die Ergebnisse dreier Studien zusammen, die sich mit verschiedenen Aspekten der Signaltransduktion und Regulation von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen befasst. Im ersten Teil wurde der Einfluss eines konstitutiven Ca2+-Einstroms auf die TZR Signalkaskade und T-Zell Funktion untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einer Mutation im Ca2+-Sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) verwendet. Die erhöhte zytoplasmatische Ca2+-Konzentration veränderte das Phosphorylierungsmuster der Phospholipase (PL) Cγ1, ein Schlüsselenzym der Signalkaskade, nach Stimulation des TZRs. Die enzymatische Aktivität der PLCγ1 blieb hierbei jedoch unverändert. In der Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ oder bei Inhibition der Phosphatase Calcineurin war das Phosphorylierungsmuster hingegen wieder normal. Darüber hinaus zeigten die T Zellen nach Stimulation in vitro eine verringerte Produktion von Interleukinen des Th2-Typs (Interleukin-4, 5 und 13). Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Funktion des Adapterproteins growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in Thrombozyten, die unter Zuhilfenahme einer Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Knockout Mauslinie untersucht wurde. Hierbei zeigte es sich, dass der Verlust von Grb2 die Signaltransduktion von GPVI und des verwandten hemITAM-Rezeptors C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) schwer beeinträchtigt. Dies konnte auf eine mangelnde Stabilisierung des linker for activation of T cells (LAT) Signalosoms zurückgeführt werden und resultierte in einer verminderten Adhäsion, Aggregation, Ca2+-Mobilisierung und prokoagulatorischen Aktivität nach Aktivierung (hem)ITAM gekoppelter Rezeptoren in vitro. Im Gegensatz hierzu blieben die Signaltransduktionswege G-protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) und des Integrins αIIbβ3, die das LAT Signalosom nicht nutzen, unbeeinflusst. In in vivo Studien verursachte die beeinträchtigte (hem)ITAM Signaltransduktion eine verlängerte Blutungszeit der Mäuse, während die Entstehung von Thromben nur bei gleichzeitiger Hemmung von GPCR-Signalwegen (durch Acetylsalicylsäuregabe) vermindert war. Diese Ergebnisse etablieren Grb2 als ein wichtiges Adapterprotein in der Signaltransduktionskaskade von GPVI und CLEC-2. Schließlich wurde im dritten Teil dieser Arbeit die proteolytische Regulation des Rezeptors CD84, der ein immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM) enthält, untersucht. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass CD84 in Mausthrombozyten durch zwei verschiedene und unabhängige proteolytische Mechanismen geschnitten wird: Zum einen durch Shedding des extrazellulären Teils, was ausschließlich durch die a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 bewerkstelligt wird, und zum anderen durch das Schneiden des intrazellulären C Terminus durch die Protease Calpain. Des Weiteren zeigte eine Untersuchung von Plasmaproben transgener Mäuse, dass das Shedding von CD84 durch ADAM10 konstitutiv in vivo erfolgt. KW - Thrombozyt KW - T-Lymphozyt KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - Calcium KW - Platelet KW - Thrombose KW - T cell KW - receptor signaling KW - calcium KW - ITAM KW - Hämostase KW - Metalloproteinasen KW - Adapterprotein Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97114 ER - TY - THES A1 - Voss, Jan T1 - Substratspezifität und Signaltransduktion zellulärer und onkogener Abl-Tyrosinkinasen T1 - Substrate specificities and signalling pathways of physiological and oncogenic Abl tyrosin kinases N2 - Deregulierte Überaktivierung von Tyrosinkinasen der Abl-Familie spielen eine wesentliche Rolle in verschiedenen Leukämieformen beim Menschen. Neben der schon seit vielen Jahren für die CML als ursächlich anerkannten Fusionskinase p210Bcr-Abl sind weitere Fusionskinasen unter Beteiligung der Abl-Kinase in Formen der sowohl CML als auch der ALL und CMML beschrieben worden. Diese seltener auftretenden Abl-Fusionskinasen umfassen sowohl Bcr-Abl Proteine anderer Größe (p165Bcr-Abl, p190Bcr-Abl und p230Bcr-Abl) als auch die Tel-Abl Fusionskinasen, die anstelle von Teilen des Bcr-Proteins Teile des Tel-Proteins beinhalten. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kinasespezifität der onkongenen Fusionstyrosinkinasen Bcr-Abl und Tel-Abl mit der der physiologischen Kinasen c-Abl und Arg verglichen. Mittels kurzer Peptide, deren Aminosäuresequenzen Phosphorylierungsepitopen in Substratproteinen der Kinasen der Abl-Famile entsprechen, konnte eine verminderte katalytische Spezifität der onkogenen Kinasen Bcr-Abl und Tel-Abl gezeigt werden. Der zweiten Teil der hier dargestellten Ergebnisse fokussiert auf Signaltransduktionsereignisse, die in Tel-Abl exprimierenden Zellen auftreten, und vergleicht diese mit der für Bcr-Abl bekannten Signaltransduktion. Ähnlich wie Bcr-Abl konnte auch Tel-Abl in Proteinkomplexen mit dem Adapterprotein CRKL, ein Protein, das in Bcr-Abl-transformierten Zellen konstitutiv Tyrosin-phosphoryliert ist, nachgewiesen werden. Des weiteren wurde gezeigt, daß in den Tel-Abl exprimierenden Zellen die Adapterproteinen c-CrkII und CRKL phosphoryliert sind und mit vielen anderen tyrosinphosphorylierten Proteinen Komplexe bilden. Schließlich wurden einige Signaltransduktionsschritte beschrieben, die sowohl in Zellen, die Tel-Abl exprimieren, als auch in Zellen mit Bcr-Abl-Expression aktiviert sind. Mittels eines Ras×GPT-spezifischen Präzipitationsassys konnte eine konstitutive Anhebung des GTP-belandenen Anteils des GTPase Ras in den Zellen mit Expression der leukämischen Abl-Formen gezeigt werden. Sowohl die mitogene Kinase MAPK/Erk als auch die Kinase Akt/PKB, welche die Apotptose blockiert, werden ebenfalls durch Tel-Abl aktiviert. Die Ergebnisse der hier dargestellten Arbeit zeigen, daß die leukämischen Abl-Fusionsproteine eine katalytische Spezifität aufweisen, die sich von der der physiologischen Abl-Kinasen unterscheidet und daß Tel-Abl zumindest einige der Signaltransduktionswege zu aktivieren vermag, welche auch durch das onkogene Protein Bcr-Abl aktiviert werden. N2 - Inappropriate activation of Abl family kinases plays a crucial role in different human leukaemias. In addition to the well known oncoproteins p190Bcr-Abl and p210Bcr-Abl, Tel-Abl, a novel fusion protein resulting from a different chromosomal translocation, has recently been described. In this study, the kinase specificities of the Bcr-Abl and Tel-Abl proteins were compared to the physiological Abl family kinases c-Abl and Arg (abl related gene). Using short peptides which correspond to the target epitopes in known substrate proteins of Abl family kinases, we found a higher catalytic promiscuity of Bcr-Abl and Tel-Abl. Similar to Bcr-Abl, Tel-Abl was found in complexes with the adapter protein CRKL. In addition, c-Crk II and CRKL are tyrosine phosphorylated and complexed with numerous other tyrosine phosphorylated proteins in Tel-Abl expressing cells. GTPase analysis with a Ras-GTP-specific precipitation assay showed constitutive elevation of GTP-loaded Ras in cells expressing the leukaemic Abl proteins. The mitogenic MAPK/Erk kinases as well as Akt/PKB, a kinase implicated to negatively regulate apoptosis, were also constitutively activated by both Bcr-Abl and Tel-Abl. The results indicate that the leukaemic Abl-fusion proteins have catalytic specificities different from the normal kinases c-Abl and Arg and that Tel-Abl is capable to activate at least some pathways which are also upregulated by Bcr-Abl. KW - Bcr-Abl KW - Tel-Abl KW - Substratspezifität KW - Signaltransduktion KW - Bcr-Abl KW - Tel-Abl KW - substrate specificity KW - signal transduction Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12819 ER - TY - THES A1 - Thangaraj Selvaraj, Bhuvaneish T1 - Role of CNTF-STAT3 signaling for microtubule dynamics inaxon growth and maintenance: Implications in motoneuron diseases T1 - Die Funktion des CNTF-STAT3 Signalweges für die Microtubuli Dynamik in Axonalem Wachstum und Axon Erhalt: Implikationen für Motoneuronenerkrankungen N2 - Neurotrophic factor signaling modulates differentiation, axon growth and maintenance, synaptic plasticity and regeneration of neurons after injury. Ciliary neurotrophic factor (CNTF), a Schwann cell derived neurotrophic factor, has an exclusive role in axon maintenance, sprouting and synaptic preservation. CNTF, but not GDNF, has been shown to alleviate motoneuron degeneration in pmn mutant mice carrying a missense mutation in Tbce gene, a model for Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). This current study elucidates the distinct signaling mechanism by which CNTF rescues the axonal degeneration in pmn mutant mice. ... N2 - Neurotrophe Faktoren beeinflussendie die neuronale Differenzierung, das Wachstum und die Stabilisierung von Axonen sowie Synaptische Plastizität und die Regeneration von Neuronen nach Verletzung. Der von Schwannzellen synthetisierte neurotrophe Faktor Ciliary neurotrophic factor (CNTF) spielt eine wichtige Rolle bei der axonalen Erhaltung sowie bei der Induktion und Reduktion von axonalen Verzweigungen. Die Behandlung der pmn Mausmutante mit CNTF, aber nicht mit GDNF führt zu einem späteren Krankheitsbeginn und verminderten Fortschreiten der Motoneuronendegeneration. Diese Mausmutante, die eine Punktmutation im Tbce Gen trägt, dient als Modell für die Amyotrophe Lateralsklerose. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die zugrunde liegenden Signalkaskaden aufzudecken, die den CNTF-vermittelten Effekt auf den Krnakheitsverlauf bei der pmn Maus verursachen. ... KW - Ciliary neurotrophic factor KW - STAT KW - CNTF KW - STAT3 KW - Stathmin KW - Microtubules KW - Signaltransduktion KW - Motoneuron KW - Krankheit Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76889 ER - TY - THES A1 - Thakar, Juilee T1 - Computational models for the study of responses to infections T1 - Bioinformatische Modelle zur Analyse der Immunantwort auf Infektionen N2 - In diesem Jahrhundert haben neue experimentelle Techniken und Computer-Verfahren enorme Mengen an Information erzeugt, die bereits viele biologische Rätsel enthüllt haben. Doch die Komplexität biologischer Systeme wirft immer weitere neue Fragen auf. Um ein System zu verstehen, bestand der Hauptansatz bis jetzt darin, es in Komponenten zu zerlegen, die untersucht werden können. Ein neues Paradigma verknüpft die einzelnen Informationsteile, um sie auf globaler Ebene verstehen zu können. In der vorgelegten Doktorarbeit habe ich deshalb versucht, infektiöse Krankheiten mit globalen Methoden („Systembiologie“) bioinformatisch zu untersuchen. Im ersten Teil wird der Apoptose-Signalweg analysiert. Apoptose (Programmierter Zelltod) wird bei verschiedenen Infektionen, zum Beispiel bei Viruserkrankungen, als Abwehrmaßnahme eingesetzt. Die Interaktionen zwischen Proteinen, die ‚death’ Domänen beinhalten, wurden untersucht, um folgende Fragen zu klären: i) wie wird die Spezifität der Interaktionen erzielt? –sie wird durch Adapter erreicht, ii) wie werden Proliferation/ Überlebenssignale während der Aktivierung der Apoptose eingeleitet? – wir fanden Hinweise für eine entscheidende Rolle des RIP Proteins (Rezeptor-Interagierende Serine/Threonine-Proteinkinase 1). Das Modell erlaubte uns, die Interaktions-Oberflächen von RIP vorherzusagen. Der Signalweg wurde anschließend auf globaler Ebene mit Simulationen für verschiedene Zeitpunkte analysiert, um die Evolution der Aktivatoren und Inhibitoren des Signalwegs und seine Struktur besser zu verstehen. Weiterhin wird die Signalverarbeitung für Apoptosis-Signalwege in der Maus detailliert modelliert, um den Konzentrationsverlauf der Effektor-Kaspasen vorherzusagen. Weitere experimentelle Messungen von Kaspase-3 und die Überlebenskurven von Zellen bestätigen das Modell. Der zweite Teil der Resultate konzentriert sich auf das Phagosom, eine Organelle, die eine entscheidende Rolle bei der Eliminierung von Krankheitserregern spielt. Dies wird am Beispiel von M. tuberculosis veranschaulicht. Die Fragestellung wird wiederum in zwei Aspekten behandelt: i) Um die Prozesse, die durch M. tuberculosis inhibiert werden zu verstehen, haben wir uns auf das Phospholipid-Netzwerk konzentriert, das bei der Unterdrückung oder Aktivierung der Aktin-Polymerisation eine große Rolle spielt. Wir haben für diese Netzwerkanalyse eine Simulation für verschiedene Zeitpunkte ähnlich wie in Teil eins angewandt. ii) Es wird vermutet, dass Aktin-Polymere bei der Fusion des Phagosoms mit dem Lysosom eine Rolle spielen. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde ein in silico Modell von uns entwickelt. Wir fanden heraus, dass in der Anwesenheit von Aktin-Polymeren die Suchzeit für das Lysosom um das Fünffache reduziert wurde. Weiterhin wurden die Effekte der Länge der Aktin-Polymere, die Größe der Lysosomen sowie der Phagosomen und etliche andere Modellparameter analysiert. Nach der Untersuchung eines Signalwegs und einer Organelle führte der nächste Schritt zur Untersuchung eines komplexen biologischen Systems der Infektabwehr. Dies wurde am Beispiel der Wirt-Pathogen Interaktion bei Bordetella pertussis und Bordetella bronchiseptica dargestellt. Die geringe Menge verfügbarer quantitativer Daten war der ausschlaggebende Faktor bei unserer Modellwahl. Für die dynamische Simulation wurde ein selbst entwickeltes Bool’sches Modell verwendet. Die Ergebnisse sagen wichtige Faktoren bei der Pathologie von Bordetellen hervor, besonders die Bedeutung der Th1 assoziierten Antworten und dagegen nicht der Th2 assoziierten Antworten für die Eliminierung des Pathogens. Einige der quantitativen Vorhersagen wurden durch Experimente wie die Untersuchung des Verlaufs einer Infektion in verschiedenen Mutanten und Wildtyp-Mäusen überprüft. Die begrenzte Verfügbarkeit kinetischer Daten war der kritische Faktor bei der Auswahl der computer-gestützten Modelle. Der Erfolg unserer Modelle konnte durch den Vergleich mit experimentellen Beobachtungen belegt werden. Die vergleichenden Modelle in Kapitel 6 und 9 können zur Untersuchung neuer Wirt-Pathogen Interaktionen verwendet werden. Beispielsweise führt in Kapitel 6 die Analyse von Inhibitoren und inhibitorischer Signalwege aus drei Organismen zur Identifikation wichtiger regulatorischer Zentren in komplexen Organismen und in Kapitel 9 ermöglicht die Identifikation von drei Phasen in B. bronchiseptica und der Inhibition von IFN-γ durch den Faktor TTSS die Untersuchung ähnlicher Phasen und die Inhibition von IFN-γ in B. pertussis. Eine weitere wichtige Bedeutung bekommen diese Modelle durch die mögliche Identifikation neuer, essentieller Komponenten in Wirt-Pathogen Interaktionen. In silico Modelle der Effekte von Deletionen zeigen solche Komponenten auf, die anschließend durch experimentelle Mutationen weiter untersucht werden können. N2 - In this century new experimental and computational techniques are adding an enormous amount of information, revealing many biological mysteries. The complexities of biological systems still broach new questions. Till now the main approach to understand a system has been to divide it in components that can be studied. The upcoming new paradigm is to combine the pieces of information in order to understand it at a global level. In the present thesis we have tried to study infectious diseases with such a global ‘Systems Biology’ approach. In the first part the apoptosis pathway is analyzed. Apoptosis (Programmed cell death) is used as a counter measure in different infections, for example viral infections. The interactions between death domain containing proteins are studied to address the following questions: i) How specificity is maintained - showing that it is induced through adaptors, ii) how proliferation/ survival signals are induced during activation of apoptosis – suggesting the pivotal role of RIP. The model also allowed us to detect new possible interacting surfaces. The pathway is then studied at a global level in a time step simulation to understand the evolution of the topology of activators and inhibitors of the pathway. Signal processing is further modeled in detail for the apoptosis pathway in M. musculus to predict the concentration time course of effector caspases. Further, experimental measurements of caspase-3 and viability of cells validate the model. The second part focuses on the phagosome, an organelle which plays an essential role in removal of pathogens as exemplified by M. tuberculosis. Again the problem is addressed in two main sections: i) To understanding the processes that are inhibited by M. tuberculosis; we focused on the phospholipid network applying a time step simulation in section one, which plays an important role in inhibition or activation of actin polymerization on the phagosome membrane. ii) Furthermore, actin polymers are suggested to play a role in the fusion of the phagosome with lysosome. To check this hypothesis an in silico model was developed; we find that the search time is reduced by 5 fold in the presence of actin polymers. Further the effect of length of actin polymers, dimensions of lysosome, phagosome and other model parameter is analyzed. After studying a pathway and then an organelle, the next step was to move to the system. This was exemplified by the host pathogen interactions between Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica. The limited availability of quantitative information was the crucial factor behind the choice of the model type. A Boolean model was developed which was used for a dynamic simulation. The results predict important factors playing a role in Bordetella pathology especially the importance of Th1 related responses and not Th2 related responses in the clearance of the pathogen. Some of the quantitative predictions have been counterchecked by experimental results such as the time course of infection in different mutants and wild type mice. All these computational models have been developed in presence of limited kinetic data. The success of these models has been validated by comparison with experimental observations. Comparative models studied in chapters 6 and 9 can be used to explore new host pathogen interactions. For example in chapter 6, the analysis of inhibitors and inhibitory paths in three organism leads to the identification of regulatory hotspots in complex organisms and in chapter 9 the identification of three phases in B. bronchiseptica and inhibition of IFN-γ by TTSS lead us to explore similar phases and inhibition of IFN-γ in B. pertussis. Further an important significance of these models is to identify new components playing an essential role in host-pathogen interactions. In silico deletions can point out such components which can be further analyzed by experimental mutations. KW - Bordetella pertussis KW - Infektion KW - Apoptosis KW - Signaltransduktion KW - Bioinformatik KW - Tuberkelbakterium KW - Biologische Kaskaden KW - Bordetellae KW - M. tuberculosis KW - Apoptose KW - Biological cascades KW - Bordetellae KW - M. tuberculosis KW - Apoptosis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17266 ER - TY - THES A1 - Strehl, Amrei T1 - Studies on regulation and signaling of the platelet glycoproteins GPV and GPVI T1 - Studien zur Regulation und Signaltransduktion der Plättchenglykoproteine GPV und GPVI N2 - Bei Verletzung einer Gefäßwand kommen Blutplättchen in Kontakt mit den Substanzen des Subendothels; Die Plättchen werden dadurch aktiviert, sie aggregieren und verschließen die Wunde, wodurch ein hoher Blutverlust verhindert wird. Unter pathologischen Bedingungen, bei Aufbrechen eines artherosklerotischen Plaques an der Gefäßwand, können sich jedoch große Plättchenaggregate, die Thromben, formen, die das Gefäß verschließen, den Blutfluss stoppen und somit zu Schlaganfall und Herzinfarkt führen können. Die kontrollierte Regulation und Signaltransduktion von bzw. durch Plättchenoberflächenrezeptoren ist wesentlich für das Funktionieren der Zellen und die intakte Balance zwischen physiologischer Plättchen-Aktivierung und der pathologischen Bildung eines Thrombus. In der vorliegenden Arbeit wird über wichtige Aspekte dieser Signalwege, die in drei Unterprojekten untersucht worden sind, berichtet. In dem ersten Unterprojekt wurde die Regulation von Plättchenoberflächenrezeptoren, den Glykoproteinen (GP) V und VI, bei Mäusen analysiert. Hier wird beschrieben, dass GPV und GPVI von der Plättchenoberfläche durch Metalloproteinasen geschnitten werden. Während physiologischer Stress, wie das Entkoppeln der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien, das Schneiden von GPVI durch eine unbekannte Proteinase auslöst, verursacht die Aktivierung von Plättchen mit bestimmten Agonisten das Schneiden von GPV. Die dafür verantwortliche Metalloproteinase wurde als ADAM17 identifiziert. In dem zweiten Unterprojekt wurde die Rolle der Protein Kinase C (PKC) in der Plättchenaktivierung einerseits und in der Plättchen pro-koagulanten Aktivität andereseits untersucht. Die Konformationsänderung/Aktivierung von alphaIIbeta3-Integrinen und Sekretion von Granula sind charakteristisch für die Plättchenaktivierung. Calcium-(Ca2+)-abhängige Phosphatidylserin (PS)- Expression auf der Plättchenoberfläche hingegen ist kennzeichnend für die pro-koagulante Aktivität. Der Beitrag von PKC zu den beschriebenen Plättchenzuständen war bisher unklar. In diesem Projekt wurde zum ersten Mal gezeigt, dass PKC eine doppelte Funktion in den Plättchen besitzt: einerseits fördert PKC die Plättchen-Aktivierung und –Aggregation, andererseits unterdrückt PKC die pro-koagulant Aktivität. In dem dritten Unterprojekt wurde die Rolle der kleinen GTPase Rac1 in der Plättchen- Aktivierung und -Aggregation in vitro und in vivo an konditionalen Rac1 Mäusen analysiert. Es wird berichtet, dass Rac1 für die GPVI abhängige Aktivierung von alphaIIbbeta3-Integrinen und dem Freisetzen von Ca2+ in der Zelle, notwendig ist, sowie für GPVI abhängige Plättchen-Aggregation und Thrombus Bildung. Hiermit wird die GTPase Rac1 zum ersten Mal in den Signalweg unterhalb von GPVI eingeordnet und ihr zudem dort eine essentielle Rolle zugeteilt. N2 - Platelets are crucial to inhibit extensive blood loss at sites of vascular injury. However, under pathological conditions such as rupture of an atherosclerotic plaque, activated platelets form aggregates that may occlude the vessel. This can lead to heart attack and stroke. Various and complex signaling pathways in the cell are involved in the steps of platelet adhesion, activation and aggregation. Single aspects of these processes were studied in three different subprojects in this work. The Glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex is responsible for the first contact of platelets with the vessel wall. Subsequently, GPVI can bind to collagen of the subendothelium, which initiates a signaling cascade leading to platelet activation, aggregation, characterized by integrin activation and granule secretion and platelet procoagulant activity. The latter is characterized by exposed phosphatidylserine (PS) on the platelet surface, which enhances thrombin generation and thereby the coagulation cascade. A controlled regulation of GP receptors on the platelet surface is vital for an intact response of the cell to platelet agonists. In the first subproject described here the regulation of GPV and GPVI on mouse platelets was investigated and it was found that both receptors are shed from the platelet surface in a metalloproteinase dependent manner. However, GPVI is shed upon mitochondrial injury, while GPV cleavage could be observed upon platelet stimulation. The metalloproteinase responsible for GPVI shedding remains unknown whereas the metallproteinase that sheds GPV was identified in this work as being ADAM17. This shows that the expression of both receptors underlies a controlled mechanism regulated through distinct metalloproteinases. In the second subproject the role of protein kinase C (PKC) in platelet activation and procoagulant response was investigated using PKC specific inhibitors. It was found that PKC blockage reduced platelet activation but enhanced platelet procoagulant activity. This is the first time that a dual role in platelet activation and procoagulant activity is defined for PKC. In the third project the role of the small GTPase Rac1 in platelet signaling was studied using conditional Rac1 knock out mice. It is reported here that Rac1 lies downstream of GPVI and is involved in integrin activation and cytsolic Ca2+ changes in vitro and platelet adhesion and thrombus formation in vivo. This is the first time that Rac1 is demonstrated to have a pivotal role in GPVI signaling and furthermore points to a novel, unknown pathway downstream of GPVI. KW - Thrombozyt KW - Membranglykoproteine KW - Proteinkinase C KW - Signaltransduktion KW - Blutplättchen KW - Glykoprotein-Shedding KW - Protein Kinase C KW - Koagulation KW - Rac1 KW - platelets KW - glycoprotein-shedding KW - protein kinase C KW - coagulation KW - Rac1 Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22283 ER - TY - THES A1 - Stolzenberger, Sascha T1 - Spezifische Hemmung der allergieassoziierten Interleukin-4 Signaltransduktion N2 - Das Cytokin Interleukin-4 (IL-4) ist ein essentieller Faktor bei der Entstehung von Sofort-Typ Allergien. Die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor und die anschließende Phosphorylierung des IL-4 aktivierten Transkriptionsfaktors Stat6 ist ein Schlüsselereignis bei der allergischen Immunantwort. In der vorliegenden Arbeit werden Ergebnisse zur Hemmung der Stat6 vermittelten Signaltransduktion des IL-4 Rezeptors vorgestellt. Dazu wurde ein Vektorsystem etabliert, bei dem ein von dem Drosophila-Transkriptionsfaktor Antennapedia abgeleitetes 16 AS langes Peptid benutzt wird. Dieses Antennapediapeptid kann Plasmamembranen lebender Zellen energie- und rezeptorunabhängig durchqueren und dabei andere hydrophile Moleküle mittransportieren. Stat6 bindet über eine SH2 Domäne an phosphorylierte Reste von IL4Ra und bildet, nachdem es selbst phosphoryliert ist, mit anderen Stat6-Molekülen aktive Dimere. Ein aus der Stat6-Bindestelle des IL-4Ra abgeleitetes phosphoryliertes Peptid (Stat6BP) wurde mit Hilfe des Antennapediapeptids in verschiedene humane und murine Zellinien transportiert. Für Stat6BP konnte mit Hilfe von spezifischer Immunpräzipitation und Western-Blot gezeigt werden, dass es IL-4 induzierte Phosphorylierung und Aktivierung von Stat6 transient hemmen kann. Durch zusätzliche Applikation des Tyrosinphosphataseinhibitors Natriumpervanadat gelang es, die hemmende Wirkung von Stat6BP zu verlängern. Unter gleichen Bedingungen konnte auch gezeigt werden, dass Stat6BP spezifisch die Aktivierung von Stat6 hemmt, da die durch IL-4 oder IL-3 induzierte Phosphorylierung des eng verwandten Stat5 völlig unbeeinträchtigt bleibt. Ferner wurde durch das Peptid die Expression eines Stat6 kontrollierten Reportergens gehemmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde außerdem die Rolle der Src-Typ Kinasen p56lck und p59fyn in der IL-4 Signaltransduktion in unterschiedlichen T-Zellinien untersucht. Es zeigte sich, dass die Aktivierung der beide Kinasen stark von der getesteten Zellinie abhängt. In einigen T-Zellinien aktiviert IL-4 eher p56lck, in anderen eher p59fyn. N2 - Interleukin-4 (IL-4) is the major factor in the development of allergic diseases like hay fever or asthma. The most important cytoplasmic event following stimulation with IL-4 is the activation of the transcription factor Stat6 (signal transducer and activator of transcription 6). Stat6 binds via a single SH2 domain first to tyrosine-phosphorylated motifs in the IL-4Ra-chain, and then to another Stat6 molecule, which results in the formation of active dimers. Since Stat6 is exclusively used by the IL-4 receptor, it is a promising approach to specifically disrupt IL-4 signal- transduction by inhibiting Stat6 activation. A vector system was established for the delivery of hydrophilic agents into living cells. To this purpose, a 16 amino acid membrane-permeable peptide derived from the Drosophila transcription factor Antennapedia was used. The Antennapedia peptide has been shown to internalize into living cell in a receptor- and energy-independent manner. In this thesis it is shown that a peptide derived from the Stat6-binding region of IL-4Ra (Stat6BP) is an effective inhibitor when it is delivered into cells by coupling with the Antennapedia peptide. Stat6BP completely inhibited IL-4 dependent phosphorylation of Stat6 in different human and murine cell lines, while IL-3 and IL-4 dependent phosphorylation of Stat5 was not affected. The inhibitory effect of Stat6BP was transient, but could be prolonged by treating the cells with the phospatase inhibitor sodium pervanadate. Transcription from a reporter gene construct with a Stat6-dependent promoter was inhibited by Stat6BP as well, indicating that the peptide is a suitable inhibitor for cellular responses downstream from Stat6 phosphorylation. Another aim of this study was to investigate the role of the src-kinases p56lck and p59fyn in IL-4 signaltransduction. The results indicate, that the activation of both kinases is celline dependent. In some T-cellines p56lck was activated dominantly, in others p59fyn. KW - Interleukin 4 KW - Allergie KW - Signaltransduktion KW - Molekularbiologie KW - IL-4 KW - Interleukin-4 KW - Allergie KW - Peptide KW - STAT6 KW - Signaltransduktion KW - IL-4 KW - Interleukin-4 KW - Allergy KW - Peptid KW - Stat6 KW - Signaltransduction Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2375 ER - TY - THES A1 - Stark, Felix T1 - Funktionelle Untersuchungen zur Regulation der Protein Kinase CK2 durch Polyamine in Drosophila melanogaster und deren physiologische Bedeutung T1 - Functional analysis of the regulation of the protein kinase CK2 by polyamines in Drosophila melanogaster and its psyiological meaning N2 - Die heterotetramere Proteinkinase CK2 nimmt aufgrund der großen Anzahl und Diversität ihrer Substrate, sowie aufgrund ihrer Eigenschaft Signalwege miteinander zu vernetzen eine Sonderstellung innerhalb der Kinasen ein. CK2 beeinflusst Proliferation, Differenzierung und Apoptose, Prozesse an denen auch Polyamine und der MAPK-Signalweg beteiligt sind. Eine vor kurzem durchgeführte Arbeit beschreibt die Bindung von CK2 an das Gerüstprotein KSR und die Verstärkung des MAPK-Signalwegs durch Phosphorylierung von Raf-Proteinen in Vertebraten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CK2 auch in Drosophila mit KSR interagiert und das einzige in Drosophila vorhandene Raf-Potein (DRaf) in vitro phosphoryliert. Im Gegensatz zur Phosphorylierung der humanen B-Raf und C-Raf Proteine an Serin 446 bzw. Serin 338 innerhalb der „negative charge regulatory region“ (N-Region), führten Kinasereaktionen und Massenspektrometrische Untersuchungen zur Identifizierung von Serin 11 als CK2 Phosphorylierungsstelle in DRaf, während ein zu Serin 446 in B-Raf äquivalentes Serin in der N-Region in Drosophila nicht durch CK2 phosphoryliert wird. Durch Überexpression von DRaf sowie von zwei DRaf-Varianten bei denen Serin 11 durch Alanin oder Aspartat substituiert wurde (DRafS11A und DRafS11D) konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden, dass die Ladung an der Aminosäureposition 11 die Funktion von DRaf beeinflusst, wobei eine negative Ladung an dieser Stelle zur Phosphorylierung und Aktivierung der Effektorkinase Erk führt. Die Phosphorylierung durch CK2 ist unabhängig von regulatorischen Botenstoffen ("second messengers"), wird aber durch Bindung von Polyaminen moduliert. Intrazelluläre Polyamine entstammen zum grossen Teil dem zellulären Aminosäurekatabolismus und beeinflussen die Phosphorylierung von DRaf durch CK2 in vitro, wobei Spermin ein effizienter Inhibitor der Reaktion ist, während die Effekte von Putrescin und Spermidin gering sind. Auch in Drosophila Schneider S2 Zellen und in adulten weiblichen Fliegen hat Spermin einen inhibitorischen, CK2-abhängigen Effekt auf die Aktivierung von Erk. Ausserdem konnte gezeigt werden, dass Putrescin und Spermidin in der Lage sind die Aktivierung von Erk, im Vergleich zu Zellen die nur mit Spermin behandelt wurden, zu erhöhen. Das spricht dafür, dass die Phosphorylierung von DRaf und die davon abhängige Aktivierung von Erk durch CK2 von der Menge und Relation der verschiedenen Polyamine zueinander abhängt. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass der Polyaminmetabolismus über CK2 mit dem MAPK-Signalweg verknüpft ist. Nachdem Polyamine durch Aminosäurekatabolismus enstehen, kann auf diese Weise der MAPK-Signalweg in Abhängigkeit der Verfügbarkeit zellulärer Aminosäuren reguliert werden. Vorversuche zeigten eine Beeinflussung von Proliferation und Apoptose durch CK2 und Polyamine. Weitere Untersuchungen sind aber nötig um spezifische Einflüsse von Polyaminen und CK2 auf zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose aufzudecken. N2 - Because of its high number and diversity of substrates, as well as its ability to cross-link signalling pathways, the heterotetrameric protein kinase CK2 has an exceptional position within kinases. CK2 influences proliferation, differentiation and apoptosis, processes in which also polyamines and the MAPK-signalling pathway are involved. A recent publication delineates binding of CK2 to the scaffold protein KSR and the enhancement of the MAPK-signalling pathway by phosphorylation of Raf-proteins in vertebrates. In my thesis I could show that CK2 also interacts with KSR in Drosophila and phosphorylates the only existing Raf protein in Drosophila (DRaf) in vitro. In contrast to the phosphorylation of human B-Raf- and C-Raf-proteins on serine 446 respectively serine 338 within the "negative charge regulatory region" (N-region), kinase reactions and mass spectrometric analyses led to the identification of serine 11 as phosphorylation site in DRaf, whereas a serine in the N-region, which corresponds to serine 446 of B-Raf, is not phosphorylated by CK2 in Drosophila. In cell culture experiments overexpression of DRaf and two DRaf-variants, in which serine 11 was substituted by alanine or aspartate (DRafS11A and DRafS11D), revealed the charge at amino acid position 11 to affect the function of DRaf, with a negative charge leading to phosphorylation and activation of the effector kinase Erk. Phosphorylation by CK2 is independent of second messengers, whereas it is modified by binding of polyamines. Intracellular polyamines mainly derive from cellular amino acid catabolism and modulate the phosphorylation of DRaf by CK2 in vitro with spermine being an efficient inhibitor of the reaction, whereas the effects of putrescine and spermidine are minor. In Drosophila Schneider S2 cells and adult flies spermine inhibits the activation of Erk in a CK2-dependent way. Furthermore administration of putrescine and spermidine in combination with spermine leads to enhanced Erk activation in cells compared to cells that are treated with spermine. These results suggest that phosphorylation of DRaf and the subsequent activation of Erk by CK2 are dependent on the amount and relative concentrations of polyamines. Altogether the results of this work demonstrate a role for CK2 in linking polyamine metabolism to the MAPK-signalling pathway. Since polyamines derive from amino acid catabolism, the MAPK-signalling pathway can be regulated dependent on the availability of cellular amino acids. Preliminary experiments point to CK2- and polyamine-dependent effects on proliferation and apoptosis. Further investigations are necessary to reveal specific effects of polyamines and CK2 on cellular processes like proliferation, differentiation and apoptosis. KW - Protein Kinase CK2 KW - Polyamine KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Taufliege KW - Raf KW - MAPK-Signalweg KW - Drosophila melanogaster KW - DRaf KW - protein kinase CK2 KW - polyamines KW - MAPK signalling pathway KW - Drosophila melanogaster KW - DRaf Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57522 ER - TY - THES A1 - Sibilski, Claudia T1 - Identification and characterization of the novel mKSR1 phosphorylation site Tyr728 and its role in MAPK signaling T1 - Identifizierung und Charakterisierung der neuartigen mKSR1-Phosphorylierungsstelle Tyr728 und deren Rolle in der MAPK-Signalkaskade N2 - In mammals, KSR1 functions as an essential scaffold that coordinates the assembly of RAF/MEK/ERK complexes and regulates intracellular signal transduction upon extracellular stimulation. Aberrant activation of the equivalent MAPK signaling pathway has been implicated in multiple human cancers and some developmental disorders. The mechanism of KSR1 regulation is highly complex and involves several phosphorylation/dephosphorylation steps. In the present study, a number of novel in vivo phosphorylation sites were detected in mKSR1 by use of mass spectrometry analysis. Among others, Tyr728 was identified as a unique regulatory residue phosphorylated by LCK, a Src kinase family member. To understand how phosphorylation of Tyr728 may regulate the function of KSR1 in signal transduction and cellular processes, structural modeling and biochemical studies were integrated in this work. Computational modeling of the mKSR1(KD) protein structure revealed strong hydrogen bonding between phospho-Tyr728 and the residues surrounding Arg649. Remarkably, this pattern was altered when Tyr728 was non-phosphorylated or substituted. As confirmed by biochemical analysis, Arg649 may serve as a major anchor point for phospho-Tyr728 in order to stabilize internal structures of KSR1. In line with the protein modeling results, mutational studies revealed that substitution of Tyr728 by phenylalanine leads to a less compact interaction between KSR1 and MEK, a facilitated KSR1/B-RAF binding and an increased phosphorylation of MEK in complex with KSR1. From these findings it can be concluded that phospho-Tyr728 is involved in tightening the KSR1/MEK interaction interface and in regulating the phosphorylation of KSR1-bound MEK by either RAF or KSR1 kinases. Beside the Tyr728, Ser722 was identified as a novel regulatory phosphorylation site. Amino acid exchanges at the relevant position demonstrated that Ser722 regulates KSR1-bound MEK phosphorylation without affecting KSR1/MEK binding per se. Due to its localization, Ser722 might consequently control the catalytic activity of KSR1 by interfering with the access of substrate (possibly MEK) to the active site of KSR1 kinase. Together with Ser722, phosphorylated Tyr728 may further positively affect the kinase activity of KSR1 as a consequence of its vicinity to the activation and catalytic loop in the KSR1(KD). As revealed by structural modeling, phospho-Tyr728 builds a hydrogen bond with the highly conserved Lys685. Consequently, phospho-Tyr728 has a stabilizing effect on internal structures involved in the catalytic reaction and possibly enhances the phosphate transfer within the catalytic cleft in KSR1. Considering these facts, it seems very likely that the LCK-dependent phosphorylation of Tyr728 plays a crucial role in the regulation of KSR1 catalytic activity. Results of fractionation and morphology analyses revealed that KSR1 recruits LCK to cytoskeleton for its phosphorylation at Tyr728 suggesting that this residue may regulate cytoskeleton dynamics and, consequently, cell motility. Beside that, phosphorylation of Tyr728 is involved in the regulation of cell proliferation, as shown by a significantly reduced population doubling time of KSR1-Y728F cells compared to cells expressing wild type KSR1. Taken together, tyrosine phosphorylation in KSR1 uncovers a new link between Src family kinases and MAPK signaling. Tyr728, the novel regulatory phosphorylation site in murine KSR1, may coordinate the transition between the scaffolding and the catalytic function of KSR1 serving as a control point used to fine-tune cellular responses. N2 - KSR1 fungiert bei Säugetieren als zentrales Gerüstprotein, welches die Anordnung von RAF/MEK/ERK-Komplexen koordiniert und die intrazelluläre Signalweiterleitung nach extrazellulärer Stimulation reguliert. Eine abweichende Aktivierung des entsprechenden MAPK-Signalwegs wurde mit vielen humanen Krebsformen und einigen Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht. Der Mechanismus der KSR1-Regulierung ist hochgradig komplex und involviert mehrfach Schritte der Phosphorylierung/Dephosphorylierung. In der vorliegenden Studie wurden etliche neue in-vivo-Phosphorylierungsstellen in mKSR1 mittels massenspektrometrischer Analyse entdeckt. Neben anderen wurde Tyr728 als besonderer regulatorischer Rest identifiziert, welcher durch LCK, einem Mitglied der Src-Kinase-Familie, phosphoryliert wird. Um zu verstehen wie die Phosphorylierung von Tyr728 die Funktion von KSR1 innerhalb der Signalweiterleitung und zellulärer Prozesse regulieren könnte, wurden strukturelle Modellierungen und biochemische Untersuchungen in diese Arbeit integriert. Die Computermodellierung der mKSR1(KD)-Proteinstruktur zeigte starke Wasserstoff- brückenbindungen zwischen Phospho-Tyr728 und den Resten in der Umgebung von Arg649 auf. Dieses Muster war auffällig verändert, wenn Tyr728 nicht phosphoryliert oder substituiert war. Wie anhand biochemischer Analyse untermauert wurde, könnte Arg649 für phospho-Tyr728 als Hauptankerpunkt dienen, um interne Strukturen in KSR1 zu stabilisieren. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Proteinmodellierung enthüllten die Mutationsstudien, dass die Substitution von Tyr728 mit Phenylalanin zu einer weniger kompakten Interaktion zwischen KSR1 und MEK, einer erleichterten KSR1/B-RAF-Bindung und einer ansteigenden Phosphorylierung von MEK im Komplex mit KSR1 führt. Anhand dieser Erkenntnisse kann man rückschließen, dass Phospho-Tyr728 in die Verstärkung der Interaktionen innerhalb der KSR1/MEK-Grenzfläche und in die Regulierung der Phosphorylierung von KSR1-gebundenem MEK durch entweder RAF- oder KSR1-Kinasen involviert ist. Neben Tyr728 wurde Ser722 als eine neuartige regulatorische Phosphorylierungsstelle identifiziert. Aminosäureaustausche an der betreffenden Position demonstrierten, dass Ser722 die Phosphorylierung von KSR1-gebundenem MEK reguliert ohne die KSR1/MEK-Bindung selbst zu beeinträchtigen. Bedingt durch seine Lokalisierung könnte Ser722 folglich die katalytische Aktivität von KSR1 kontrollieren, indem es den Zugang des Substrates (möglicherweise MEK) zur aktiven Seite der KSR1-Kinase behindert. Zusammen mit Ser722 könnte phosphoryliertes Tyr728 ferner die Kinaseaktivität von KSR1 positiv beeinflussen, infolge von dessen Nähe zur Aktivierungs- und katalytischen Schleife in der KSR1(KD). Wie mittels Strukturmodellierung offengelegt wurde, bildet Phospho-Tyr728 eine Wasserstoffbrücke mit dem hochgradig konservierten Lys685 aus. Folglich hat Phospho-Tyr728 einen stabilisierenden Effekt auf interne Strukturen, welche in die katalytische Reaktion involviert sind, und erleichtert möglicherweise den Phosphattransfer innerhalb der katalytischen Spalte in KSR1. In Anbetracht dieser Fakten scheint es sehr wahrscheinlich, dass die LCK-abhängige Phosphorylierung von Tyr728 eine äußerst wichtige Rolle in der Regulierung der katalytischen Aktivität von KSR1 spielt. Die Ergebnisse der Fraktionierungs- und Morphologieanalysen enthüllten, dass KSR1 für die Phosphorylierung an Tyr728 LCK zum Zytoskelett rekrutiert, was darauf hindeutet, dass dieser Rest die Dynamik des Zytoskeletts und folglich Zellmotilität regulieren könnte. Darüber hinaus ist die Phosphorylierung von Tyr728 in die Regulierung der Zellproliferation involviert, wie anhand einer bedeutend reduzierten Populationsverdopplungszeit von KSR1-Y728F-Zellen im Vergleich zu Zellen, welche wildtypisches KSR1 exprimieren, gezeigt wurde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Tyrosin-Phosphorylierung in KSR1 eine neue Verknüpfung zwischen Kinasen der Src-Familie und der MAPK-Signalwirkung enthüllt. Tyr728, die neuartige regulatorische Phosphorylierungsstelle in Maus-KSR1, könnte den Übergang zwischen der Gerüst- und der katalytischen Funktion von KSR1 koordinieren und damit als Kontrollpunkt dienen, um zelluläre Reaktionen fein abzustimmen. KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Regulation KW - tyrosine phosphorylation KW - KSR1 KW - LCK KW - MAPK KW - phosphorylation KW - signaling Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114672 ER - TY - THES A1 - Seibold, Marcel T1 - Funktionelle Charakterisierung des Ras family small GTP binding protein RAL im Multiplen Myelom T1 - Functional characterization of the Ras family small GTP binding protein RAL in multiple myeloma N2 - Die monoklonale Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark ist charakteristisch für das multiple Myelom (MM) und kann bei Erkrankten zu Störungen in der Hämatopoese sowie zu Knochenläsionen und Niereninsuffizienz führen. Die Weiterentwicklung und der Einsatz neuer Therapieoptionen konnten das Überleben von MM-Patienten zwar erheblich verbessern, jedoch gilt diese Krankheit weiterhin als unheilbar. Onkogene Mutationen und das Knochenmarkmikromilieu führen in MM-Zellen zur Entstehung eines onkogenen Signalnetzwerks, das das Wachstum und Überleben der Zellen aufrechterhält. Mutationen der GTPase RAS treten bei bis zu 50 % der MM-Patienten auf und tragen zum Überleben von MM-Zellen bei. Trotz der Häufigkeit und Bedeutsamkeit von onkogenem RAS, auch in anderen Tumorentitäten, ist die GTPase nach wie vor therapeutisch nicht angreifbar. Die GTPase RAL aus der Familie der RAS-GTPasen wird als Downstream-Effektor von RAS angesehen, der damit ebenfalls zur Aufrechterhaltung des Tumorzellüberlebens beitragen könnte. In einigen Tumorentitäten konnte bisher gezeigt werden, dass eine Überexpression von RAL in den Tumorzellen vorliegt und die Proliferation und Apoptose von Tumorzellen durch RAL beeinflusst wird. Daher stellte sich die Frage, ob RAL im MM ebenfalls das Überleben von Tumorzellen beeinflusst und ob eine direkte Verbindung zwischen onkogenem RAS und RAL besteht. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle von RAL sowie dessen Zusammenhang mit onkogenem RAS im MM untersucht. Hierbei konnte eine Überexpression von RAL in MM-Zellen im Vergleich zu MGUS oder normalen Plasmazellen beobachtet werden. In Knockdown-Analysen wurde gezeigt, dass RAL überlebensnotwendig für MM-Zellen ist. Dabei wurde in Western Blot-Analysen festgestellt, dass diese Überlebenseffekte unabhängig von MAPK/ERK-Signaling vermittelt werden. Es konnte teilweise jedoch eine Abhängigkeit von der AKT-Aktivität beobachtet werden. Da RAL-Knockdown Einfluss auf das Überleben von MM-Zellen hat, wurde eine pharmakologische Inhibition von RAL durch den Inhibitor RBC8 untersucht. RBC8 zeigte in höheren Dosen nur bei einem Teil der MM-Zelllinien eine Wirkung auf das Zellüberleben sowie auf die RAL-Aktivierung. Die Weiterentwicklung potenter RAL-Inhibitoren ist daher für eine klinische Translation einer RAL-Inhibition von großer Bedeutung. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen onkogenem RAS und der RAL-Aktivierung wurden RAL-Pulldown-Analysen nach Knockdown von onkogenem RAS durchgeführt. In diesen Experimenten wurde keine Abhängigkeit der RAL-Aktivierung von onkogenem RAS festgestellt. Darüber hinaus zeigten Genexpressionsanalysen nach RAS- bzw. RAL-Knockdown unterschiedliche Genexpressionsprofile. In Massenspektrometrie-Analysen wurden mögliche Effektoren, die mit RAL an der Beeinflussung des Zellüberlebens beteiligt sein könnten, untersucht. Hierbei wurden die Komponenten des Exozyst-Komplexes EXO84 und SEC5 als Interaktionspartner von RAL identifiziert. Nachdem gezeigt wurde, dass RAL ausschlaggebend für das Überleben von MM-Zellen ist, wurde eine Kombination von RAL-Knockdown mit klinisch relevanten Wirkstoffen analysiert. Diese zeigte bei der Kombination mit PI3K oder AKT-Inhibitoren verstärkte Effekte auf das Zellüberleben der MM-Zellen. Zusammenfassend wurde die Bedeutung von RAL für das Überleben von Tumorzellen im MM gezeigt und RAL als potentielles therapeutisches Target im MM beschrieben, welches unabhängig von onkogenem RAS reguliert wird. N2 - Multiple myeloma (MM) is a hematologic neoplasia which is characterized by monoclonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow leading to hematopoetic failure, bone lesions and renal failure. Although continuous development of existing therapeutics and new therapeutic options vastly improved MM patient survival, MM still remains an incurable disease. Oncogenic mutations and the bone marrow microenvironment contribute to a signaling network which sustains MM cell proliferation and survival. Within this network mutations of the RAS oncogene account for up to 50 % of MM patients. Despite its prevalence and importance not only in MM, RAS still remains undruggable. The GTPase-family Member RAL is considered as a RAS effector which might also influence maintainance of tumor cell survival. In several tumor entities RAL is overexpressed in tumor cells and influences proliferation and apoptosis. Therefore, in MM RAL might also be controlled by oncogenic RAS and mediate cell survival of tumor cells. In this work, RAL’s functional role as well as the potential interconnection with oncogenic RAS was investigated. In MM cells RAL is ovexpressed compared to non-malignant MGUS or plasma cells. Knockdown analyses showed that RAL is essential for MM cell survival. These survival effects are transferred independently of MAPK/ERK signaling as shown by Western Blot analysis. However, to some extent RAL influenced MM cell survival dependently of AKT activity. Because RAL knockdown had a significant effect on MM cell survival a pharmacological inhibition was tested using the inhibitor RBC8. In a portion of MM cell lines RBC8 exerts effects on cell survival. But the effects of RBC8 on RAL activation were only visible at higher concentrations as shown by pulldown assays. Thus, subsequent development of potent RAL inhibitors is of major importance for clinical translation. To investigate whether RAL is directly activated by oncogenic RAS, RAL pulldown assays were performed after knockdown of oncogenic RAS. Strikingly, there was no direct connection between the presence of oncogenic RAS and RAL activation. Furthermore, gene expression profiles after RAS or RAL knockdown showed differing expression signatures. Potential effectors of RAL which might also influence MM cell survival were investigated in mass spectrometric analyses where the exocyst complex components EXO84 and SEC5 were identified as RAL interaction partners. Since RAL is of importance for MM cell survival, RAL knockdown was combined with clinically relevant agents. There was an enhanced induction of apoptosis upon combination of PI3K or AKT inhibitors with RAL knockdown. Taken together, the influence of RAL as a crucial mediator of MM cell survival was shown in this work. Therefore, RAL represents a potential therapeutic target which is regulated independently of oncogenic RAS. KW - Kleine GTP-bindende Proteine KW - Signaltransduktion KW - Plasmozytom KW - RAL KW - Multiples Myelom KW - Zellüberleben KW - Knochenmark Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208003 ER - TY - THES A1 - Schär, Jennifer T1 - Molekulare Charakterisierung der Response-Regulatoren ArsR (HP0166), HP1043 und HP1021 von Helicobacter pylori T1 - Molecular characterisation of the response regulators ArsR, HP1043, HP1021 of Helicobacter pylori N2 - Bakterien müssen ständig in der Lage sein auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren zu können. Zur Wahrnehmung dieser Veränderungen haben sich unterschiedliche Signaltransduktionssysteme entwickelt. Ein weit verbreiteter und gut charakterisierter Mechanismus zur Signaltransduktion sind die so genannten Zwei-Komponentensysteme. Im Genom von H. pylori konnten nur wenige Bestandteile von Zwei-Komponentensystemen identifiziert werden. Dazu zählen neben dem Chemotaxis-System lediglich drei Histidin-Kinasen, ArsS, CrdS und FlgS, und fünf Response-Regulatoren HP1021, HP1043, ArsR, CrdR und FlgR, die vermutlich Transkriptions-regulatorische Funktionen haben. Zwei der Response-Regulatoren, HP1043 und ArsR als essentiell für das Überleben von H. pylori, während HP1021 einen deutlichen Einfluss auf das Zellwachstum hat, da ein Wachstums-Defekt zu erkennen ist, wenn das entsprechende Gen hp1021 deletiert wird. Eine Deletion von arsS, dem Gen der zugehörigen Histidin-Kinase von ArsR, hat unter Standard-Wachstumsbedingungen keine Auswirkung auf das Zellwachstum von H. pylori. Diese Beobachtung spricht für die Hypothese, dass der Response-Regulator ArsR die Transkription zweier unterschiedlicher Sets von Zielgenen kontrolliert. Demzufolge reguliert der Response-Regulator ArsR nach Säure-induzierter Phosphorylierung durch ArsS die Transkription von Genen, die zur Säureresistenz beitragen, während ArsR im nicht-phosphorylierten Zustand die Transkription von weiteren Zielgenen kontrolliert, von denen mindestens eines für das Zellwachstum essentiell sein sollte. Das durch ArsR~P kontrollierte Regulon konnte bereits weitgehend charakterisiert werden allerdings sind die Zielgene des unphosphorylierten Regulators bislang unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte die zuvor beschriebene Hypothese bestätigt werden, da gezeigt wurde, dass ein Derivat von ArsR, mit einer Mutation der Phosphorylierungsstelle D52 zu N52, das wildtypische Protein bezüglich des Zellwachstums unter Standardbedingungen funktionell ersetzen kann. Für die Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 konnte bislang keine zugehörige Histidin-Kinase identifiziert werden und interessanterweise findet man in der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren atypische Abweichungen von der Konsensus-Sequenz. Um die Bedeutung dieser atypischen Primärsequenzen für die Funktion dieser Response-Regulatoren zu untersuchen wurden mutierte H. pylori-Stämme konstruiert, die ausschließlich Derivate von HP1021 bzw. HP1043 exprimieren, die in ihrer Receiver-Sequenz der Konsensus-Sequenz entsprachen. Da diese Mutanten sich bezüglich ihres Zellwachstums nicht vom Wildtyp unterscheiden, konnte nachgewiesen werden, dass die atypischen Receiver-Sequenzen der beiden Response-Regulatoren nicht entscheidend für die Funktionen der Response-Regulatoren sind. Weiterhin konnten Indizien dafür gesammelt werden, dass HP1021 und HP1043 hinsichtlich ihrer Aktivierung vermutlich vom üblichen Zwei-Komponentenparadigma abweichen. Derivate von HP1021 und HP1043 mit Mutationen ihrer putativen atypischen Phosphorylierungsstelle sind in der Lage ihre wildtypischen Pendants hinsichtlich der bekannten Phänotypen funktionell zu ersetzen. Somit ist eine Phosphorylierung der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren keine Voraussetzung für ein normales Zellwachstum von H. pylori. Diese Hypothese wird gestützt durch die Beobachtung, dass ein Ortholog von HP1043 aus C. jejuni CJ0355, das natürlicherweise an der potentiellen Phosphorylierungsstelle einen nicht phosphorylierbaren Aminosäurerest trägt, HP1043 in seiner Funktion ersetzen kann. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro keine Phosphorylierung durch radioaktiv markiertes Acetylphosphat stattfindet und dass ein H. pylori-Stamm mit einer Deletion der Gene pta und ackA, welche Proteine kodieren, die bei der Synthese von zellulärem Acetylphosphat benötigt werden, einen normalen Wachstums-Phänotyp zeigt. Zusätzlich konnten in einer massenspektrometrischen Analyse des Proteins HP1021, welches nach Zweidimensionaler Gelelektrophorese von Gesamtzellproteinlysaten aus H. pylori isoliert wurde, keine Hinweise auf eine Serinphosphorylierung entdeckt werden. Es ist daher fraglich ob in vivo eine funktionell relevante Phosphorylierung stattfindet. Die Mechanismen zur Modulation der Regulator-Aktivität von HP1043 und HP1021 bleiben unklar. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass eine strikte Transkriptionskontrolle nicht für die Zellwachstums-assoziierten Funktionen von HP1021 von Bedeutung ist. Dagegen wurden Hinweise darauf erzielt, dass die Expression von HP1043 auf einem posttranskriptionellen und/oder auf einem posttranslationellen Level reguliert wird. Es waren bislang keine Zielgene von HP1021 bekannt. Durch vergleichende Zweidimensionale Gelelektrophorese der H. pylori Stämme 26695 und 26695 1021Δ konnten einige potentielle Zielgene des Response-Regulators HP1021 identifiziert werden. N2 - Bacteria need to react instantaneously on changes in their environment. For the sensing of environmental changes many different signaltransduction-systems have been evolved and the most widespread and well-characterised mechanism for signal transduction among the bacteria are the so called two-component systems. The genome of Helicobacter pylori encodes only a few proteins which are part of a two-component system. In addition to the chemotaxis-system there are just three histidine kinases, ArsS (HP0165), CrdS (HP1364) and HP0244, and five response regulators HP1021, HP1043, ArsR (HP0166), CrdR (HP1365) and HP0703, which are probably involved in transcriptional regulation (Alm et al., 1999; Tomb et al., 1997). Interestingly two of the response regulators, HP1043 and ArsR (HP0166) proved to be essential for the survival of H. pylori, while the response regulator HP1021 has a distinct influence on the cell-growth, as indicated by a severe growth defect when hp1021 is deleted (Beier & Frank, 2000; McDaniel et al., 2001; Schär, 2001). Under standard growth-conditions, the deletion of arsS (hp0165), encoding the cognate histidine kinase of ArsR (HP0166), has no effect on the cell-growth of H. pylori. This observation argues for the hypothesis that the response regulator ArsR (HP0166) controls the transcription of two different sets of target-genes. Upon acid-induced phosphorylation via ArsS (HP0165), the response regulator ArsR (HP0166) regulates the transcription of genes which are involved in acid resistance mechanisms, while in an unphosphorylated state ArsR (HP0166) controls other target genes, of which at least one is essential for cell-growth. The regulon controlled by ArsR~P (HP0166~P) has been extensively studied (Dietz, 2002; Forsyth et al., 2002; Pflock et al., 2004; Pflock et al., 2006; Pflock et al., 2005), while target genes of the unphosphorylated response regulator are so far unknown. In this work this hypothesis could be proven. It was shown that a derivative of ArsR (HP0166), with a mutation of the phosphorylation site D52 to N52, is able to substitute the wildtype protein functionally with respect to cell-growth. In the case of the response regulators HP1021 and HP1043 no cognate histidine kinases have been identified so far (Beier & Frank, 2000). Interestingly the receiver domains of the response regulators differ from the consensus sequence at highly conserved aminoacid residues. To investigate the importance of the atypical primary sequences for the function of HP1021 and HP1043, mutated H. pylori strains expressing exclusively derivatives of HP1021 or HP1043 with receiver sequences matching the consensus sequence were constructed. As these mutants did not show differences in cell-growth in comparison to the wildtype strain, it was proven that the atypical receiver sequences are not crucial for cell growth. Furthermore, indications could be found that HP1021 and HP1043 presumably differ from the common two component paradigm regarding their activation. Derivatives of HP1021 and HP1043 with mutations in their putative phosphorylation sites could functionally complement their wildtype counterparts with regards to cell growth. Therefore the phosphorylation of the receiver domain of these response regulators is not a pre-requisite for normal cell growth of H. pylori. In line with this hypothesis it could be demonstrated that there is no in vitro phosphorylation of the receiver domain of HP1021 and HP1043 with radioactive labelled acetylphosphate and that a H. pylori strain which a deletion of the genes pta and ackA, encoding proteins involved in the synthesis of acetylphosphate in the cell, showed a normal growth-phenotype. Moreover, when the protein HP1021, which was isolated by two-dimensional gelelectrophoreses, was analysed by mass spectrometry no evidence of a serine phosphorylation was obtained. Aditionally the observation that deletion of hp1043 can be complemented by the C. jejuni ortholog cj0355 encoding a response regulator protein with an asparagine residue replacing the consensus phosphate-accepting aspatic acid residue supports this hypothesis. Therefore it is questionable whether in vivo there is a phosphorylation which is functional relevant at all at the receiver domain. The mechanisms by which the activity of the Response-Regulators HP1021 and HP1043 is modulated still remain unclear. Here it could be demonstrated that strict transcriptional control of its expression is not relevant for the cell-growth associated function of HP1021. In contrast there are hints that the expression of HP1043 is controlled on a post-transcriptional and/or a post-translational level. Up to now no target genes of HP1021 were known. Using comperative two-dimensional gelelectrophoresis some potential target genes have been identified, among others HP0695, FadA and the Catalase. KW - Helicobacter pylori KW - Signaltransduktion KW - Genregulation KW - Response-Regulator KW - Helicobacter pylori KW - Zwei-Komponentensystem KW - essentiell KW - orphan KW - response regulator KW - Helicobacter pylori KW - two component system KW - essential KW - orphan Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21855 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Nadine T1 - Eine vergleichende biophysikalische Analyse von Hitze- und Trockentoleranzstrategien der Wüstenpflanze Phoenix dactylifera und Nutzpflanzen der gemäßigten Klimazonen T1 - A comparative biophysical analysis of heat and drought tolerance strategies of the desert plant Phoenix dactylifera and crops of temperate climates N2 - Der Klimawandel geht einher mit einem Anstieg der globalen Durchschnittstemperatur und einem dadurch induzierten Wassermangel. Diese beiden abiotischen Stressfaktoren führen zu einer Reduzierung der landwirtschaftlichen Erträge und Biomassen von Kulturpflanzen. Daher ist eine Anpassung der betroffenen Pflanzenarten an das sich ändernde Klima erforderlich, um die landwirtschaftliche Produktivität in Zukunft aufrechtzuerhalten. Gegenwärtig ist unser Wissen über Strategien zur Toleranz gegenüber abiotischem Stress sowie über Genom- und Transkriptionsinformationen auf wenige Modellorganismen von Angiospermen beschränkt, so dass diese Informationen die Basis für die Forschung an Trockenheit und Hitzestress darstellen. Die Untersuchung der Stressadaption innerhalb und zwischen verschiedenen Pflanzengattungen ist von besonderer Relevanz. Vor diesem Hintergrund habe ich im Rahmen meiner Doktorarbeit die Überlebensstrategie der extremophilen Wüstenpflanze Phoenix dactylifera (Dattelpalme) im Vergleich zu zwei Mesophilen, der Kulturpflanze Hordeum vulgare (Gerste) und der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, untersucht. Dattelpalmen sind nicht sukkulente Wüstenpflanzen, die auch unter extremen Trocken- und Hitzebedingungen in den Wüsten der Arabischen Halbinsel wachsen und ertragreich Früchte produzieren. In Phoenix dactylifera ist bislang weder die Molekularbiologie und –physiologie der Schließzellen, vor allem der Anionenkanäle, verstanden, noch wurde der Hitzeschutz ihrer Zuckertransportproteine untersucht. Um die stomatäre Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure) zu verstehen, klonierten wir die Hauptkomponenten des schnellen ABA-Signalwegs von Schließzellen und analysierten den Öffnungsmechanismus der Anionenkanäle aus der Dattelpalme und der Gerste vergleichend zu dem Anionenkanal aus Arabidopsis im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Beide monokotyledonen Pflanzenarten (Gerste und Dattelpalme) besitzen stomatäre Komplexe, die aus Schließzellen und Nebenzellen bestehen. Dies unterscheidet die Monokotyledonen von den Dikotyledonen, die normalerweise Stomakomplexe aufweisen, die nur aus einem Paar Schließzellen gebildet werden. Interessanterweise schlossen sich Dattelpalmen- und Gerstenstomata als Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat. Der heterolog-exprimierte Anionenkanal PdSLAC1 wird durch die ABA-Kinase PdOST1 aktiviert und diese Aktivierung wird durch die Koexpression der PP2C-Phosphatase ABI1 gehemmt. Daher wird PdSLAC1 wie seine Orthologen aus Gerste und Arabidopsis durch ein ABA-abhängiges Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsnetzwerk gesteuert. PdOST1 aktivierte den Anionenkanal PdSLAC1 jedoch nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat - eine elektrische Eigenschaft, die PdSLAC1 mit HvSLAC1 der Gerste gemein hat, sich jedoch von AtSLAC1 unterscheidet. Angesichts der Tatsache, dass in Gegenwart von Nitrat ABA den Stomaschluss verstärkt und beschleunigt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass bei Dattelpalmen und Gerste Nitrat als Ligand zum Öffnen von SLAC1 benötigt wird. Dies initiiert die Depolarisation der Schließzellen und leitet schließlich den Stomaschluss ein, um den Wasserverlust der Pflanzen unter Trockenstressbedingungen zu minimieren. Um die monokotyledone spezifische Nitratabhängigkeit von SLAC1 zu verstehen, führten wir ortsgerichtete Mutagenesestudien auf Basis eines 3D-Modells durch, welche zudem vergleichende Studien an Chimären von Monokotylen- und Dikotylen-SLAC1 Anionenkanälen umfassten. Unsere Struktur-Funktions-Forschung identifizierte zwei Aminosäurenreste auf der Transmembrandomäne 3 (TMD3), die eine wesentliche Rolle bei der Nitrat-abhängigen Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen monokotyledoner Pflanzen spielen. Die phylogenetische Analyse ergab schließlich, dass während der Evolution die für Monokotlyedonen spezifische Nitrat-abhängige Regulierung erst nach der Trennung in Monokotyledonen und Dikotyledonen auftrat. Durch die Nitrat-sensitive Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen beruht der schnelle Stomaschluss von Monokotyledonen auf dem Zusammenspiel des Trockenstresshormons ABA und dem Stickstoffhaushalt der Pflanze. Da der ABA-Signalweg von Arabidopsis umfassend untersucht wurde, könnte die Entdeckung des monokotyledonen spezifischen Nitrat-abhängigen Motivs in TMD3 nun als Stellschraube zur Verbesserung der Züchtungsprogramme dikotyledoner Nutzpflanzen dienen. Wüstenpflanzen leiden nicht nur unter Trockenheit, sondern auch unter extremem Hitzestress. Wir konnten zeigen, dass hitzebelastete Dattelpalmen große Mengen der flüchtigen Kohlenwasserstoffverbindung Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) produzieren und emittieren. Durch die vorübergehende Freisetzung von Isopren kann die Pflanze die Photosynthese auch bei extremen Temperaturen betreiben. Es ist jedoch nicht bekannt, ob und wie Isopren in Hitzeperioden auch Transportprozesse durch biologische Membranen schützt. Um den Einfluss von Isopren auf den Transmembrantransport zu untersuchen, identifizierten und klonierten wir den Protonen-gekoppelten Saccharosetransporter 1 (PdSUT1) der Dattelpalme und verglichen seine elektrischen Eigenschaften mit ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Interessanterweise waren das elektrische Verhalten, die kinetischen Eigenschaften und die Temperaturabhängigkeit beider Transporter ähnlich. Die Anwendung von Isopren veränderte jedoch massiv die Affinität von ZmSUT1 zu seinem Substrat Saccharose, während die Affinität des Transporters der Dattelpalme nur schwach beeinflusst wurde. Es wird angenommen, dass die Membranfluidität unter Hitzestress erniedrigt ist, welches durch Interkalierung von Isopren mit den Fettsäureketten biologischer Membrane einhergeht. Dies und die Unempfindlichkeit von PdSUT1 gegenüber Isopren deuten darauf hin, dass der Saccharosetransporter PdSUT1 aus der Wüstenpflanze auch bei hohen Temperaturen Saccharose mit hoher Affinität transportiert. Zukünftige Studien müssen nun klären, ob der flüchtige Kohlenwasserstoff Isopren einen direkten Einfluss auf den Transporter selbst hat oder Isopren in die Membran integriert und damit indirekt die Eigenschaften von Transportproteinen beeinflusst. Unabhängig von der Wirkungsweise von Isopren sollte nicht unerwähnt bleiben, dass PdSUT1 gegenüber Isopren weniger empfindlich ist als sein Ortholog ZmSUT1 aus Mais. Dies kann auf eine Anpassung des Saccharosetransporters an die extremen Hitzeperioden und die damit einhergehende Isoprenemission von Dattelpalmen zurückzuführen sein. N2 - Low water availability and heat stress present major barriers to achievíng high biomass and full yield potential in crops. Global climate change is accompanied by a subtle increase in the severity of these abiotic stresses. Thus, the adaptation of crop species to the changing climate is required in order to sustain agricultural productivity in the future. Currently, our knowledge of plant strategies for abiotic stress tolerance as well as genomic and transcriptional information is limited to a few model angiosperms, providing a starting point for the understanding of responses to drought and/or heat stress, within and across species. In the framework of my PhD thesis, we followed a different strategy to learn about abiotic stress tolerance: we studied the survival strategy of the extremophilic desert plant Phoenix dactylifera (date palm) in comparison to the crop Hordeum vulgare (barley) and the model plant Arabidopsis thaliana, both from temperate zones. Date palms grow and produce fruits even under extreme drought and heat conditions in the deserts of the Arabian Peninsula. Neither the molecular biology and physiology of guard cells nor the heat protection of transport protein mediated sugar and ion transport processes have been studied so far in this non-succulent desert plant, Phoenix dactylifera. To understand the stomatal response to the water stress phytohormone ABA (abscisic acid), we cloned the major components for guard cell fast abscisic acid signaling and analysed the anion channel opening mechanism of the date palm side by side with barley and Arabidopsis in Xenopus oocytes. Both monocot plant species (barley and date palm) possess stomatal complexes consisting of guard cells and subsidiary cells. This distinguishes monocot species from dicots, which usually exhibit stomatal complexes formed by a pair of guard cells only. Interestingly, date palm and barley stomata closed in response to the drought stress hormone ABA only in the presence of extracellular nitrate. Heterologously expressed Phoenix SLAC1-type anion channel PdSLAC1 is activated by the ABA kinase PdOST1 and this activation is inhibited by the coexpression of PP2C phosphatase ABI1 – thus like its counterparts from barley and Arabidopsis, PdSLAC1 is controlled by an ABA-dependent phosphorylation/dephosphorylation network. However, PdOST1 did activate the desert plant anion channel PdSLAC1 only in the presence of extracellular nitrate – an electrical property that PdSLAC1 shares with the barley SLAC1 but distinguishes both monocot SLAC1 channels from AtSLAC1. Given that, in the presence of nitrate, ABA enhanced and accelerated stomatal closure, our findings indicate that the guard cell osmotic motor driving stomatal closure in date palm and barley uses nitrate as the signal to open the major anion channel SLAC1. This initiates guard cell depolarization and finally stomatal closure to prevent plant wilting under drought stress conditions. To understand the monocot-specific SLAC1 nitrate dependency, we performed a 3D-model- based site-directed mutagenesis study including chimeric channels between monocot and dicot SLAC1 anion channels. Our structure-function research identified two residues on transmembrane domain 3 (TMD3) that play an essential role in nitrate-dependent gating of monocot SLAC1-type anion channels. Phylogenetic analysis finally revealed that during evolution the monocot specific nitrate-dependent gating was established after the split between monocots and dicots. Thus, the success of monocot species may in part rely on the integration of drought signals (ABA) and the nitrogen nutrition status of the plant via nitrate-sensitive gating of SLAC1 anion channels. Since the Arabidopsis ABA-signaling pathway has been extensively studied, the discovery of the monocot-specific nitrate dependent motif on TMD3 could now serve as a set screw to improve the breeding programs of dicot agricultural crops. Desert plants not only suffer from drought but also from extreme heat stress. We could show that heat-stressed date palms produce and emit high amounts of the volatile hydrocarbon compound isoprene (2-Methyl-1,3-Butadien). The temporary release of isoprene allows the plant to perform photosynthesis even under extreme temperatures. However, it is not known whether and how isoprene also protects transport processes across biological membranes in periods of heat. To study the influence of isoprene on transmembrane transport, we identified and cloned the date palm proton-coupled sucrose transporter 1 (PdSUT1) and compared its electrical properties with ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) in the heterologous expression system of Xenopus oocytes. Interestingly, the electrical behavior, the kinetic properties and the temperature dependence of both carriers were similar. However, the response to isoprene application massively altered the affinity of ZmSUT1 to its substrate sucrose while the affinity of the date palm transporter was only weakly affected. The intercalation of isoprene with the fatty acid chains of biological membranes is believed to decrease the membrane fluidity under heat stress. This and the insensitivity of PdSUT1 towards isoprene may indicate that the desert plant sucrose transporter PdSUT1 transports sucrose with high affinity even at high temperatures. Future studies must now clarify whether the volatile hydrocarbon isoprene has a direct influence on the carrier itself or isoprene integrates into the membrane and thus indirectly influences the properties of transport proteins. Regardless of the mode of action of isoprene, it remains to be noted that PdSUT1 is less sensitive to isoprene than its orthologue from maize. This may be an adaptation of the sucrose carrier to the extreme heat periods and the accompanying isoprene emission from date palms. KW - Dattelpalme KW - Gerste KW - Elektrophysiologie KW - Hitzestress KW - Schließzelle KW - Anionenkanal KW - Zuckertransporter KW - SLAC1 KW - SUT1 KW - Signaltransduktion KW - ZmSUT1 KW - Phoenix dactylifera KW - Hordeum vulgare KW - Zea mays Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186491 ER - TY - THES A1 - Schwärzel, Martin T1 - Localizing engrams of olfactory memories in Drosophila T1 - Lokalisation von Duftgedächtnissen in Drosophila N2 - Zars and co-workers were able to localize an engram of aversive olfactory memory to the mushroom bodies of Drosophila (Zars et al., 2000). In this thesis, I followed up on this finding in two ways. Inspired by Zars et al. (2000), I first focused on the whether it would also be possible to localize memory extinction.While memory extinction is well established behaviorally, little is known about the underlying circuitry and molecular mechanisms. In extension to the findings by Zars et al (2000), I show that aversive olfactory memories remain localized to a subset of mushroom body Kenyon cells for up to 3 hours. Extinction localizes to the same set of Kenyon cells. This common localization suggests a model in which unreinforced presentations of a previously learned odorant intracellularly antagonizes the signaling cascades underlying memory formation. The second part also targets memory localization, but addresses appetitive memory. I show that memories for the same olfactory cue can be established through either sugar or electric shock reinforcement. Importantly, these memories localize to the same set of neurons within the mushroom body. Thus, the question becomes apparent how the same signal can be associated with different events. It is shown that two different monoamines are specificaly necessary for formation of either of these memories, dopamine in case of electric shock and octopamine in case of sugar memory, respectively. Taking the representation of the olfactory cue within the mushroom bodies into account, the data suggest that the two memory traces are located in the same Kenyon cells, but in separate subcellular domains, one modulated by dopamine, the other by octopamine. Taken together, this study takes two further steps in the search for the engram. (1) The result that in Drosophila olfactory learning several memories are organized within the same set of Kenyon cells is in contrast to the pessimism expressed by Lashley that is might not be possible to localize an engram. (2) Beyond localization, a possibible mechanism how several engrams about the same stimulus can be localized within the same neurons might be suggested by the models of subcellular organisation, as postulated in case of appetitive and aversive memory on the one hand and acquisition and extinction of aversive memory on the other hand. N2 - Troy Zars und seine Mitarbeiter konnten für das olfaktorische Elektoschockgedächtnis von Drosophila zum ersten mal die Spur eines Duftgedächtnisses in den Pilzkörpern (PK) lokalisieren. Darauf aufbauend stelle ich nun in dieser Arbeit zwei Fragen: 1. Wäre es möglich auch den Prozess der Auslöschung dieses Gedächtnissen zu lokalisieren? Obwohl die Verhaltensphysiologie der Gedächtnisauslöschung sehr gut charakterisiert sind weiss man sehr wenig über die daran beteiligten molekularen Signalmechanismen und Strukturen. In Anlehnung an die Arbeit von Zars et al. (2000) kann ich zeigen, dass sowohl die Speicherung wie auch die Auslöschung dieses Gedächt-nisses in den gleichen Kenyonzellen der PK geschieht. Diese gemeinsame zelluläre Lokalisierung legt ein Model nahe, in dem die wiederholte Präsentation des mit Elektro-schock assoziierten Duftes während der Auslöschung, intrazellulär auf die gleichen Signalwege wirkt die auch für die Bildung des Duftgedächtnisses notwendig sind. 2. Wäre es möglich auch die Spur eines attraktive Duftgedächtnisses zu lokalisieren? Ich kann zeigen, dass Gedächtnisse über den gleichen Duft sowohl attraktiv als auch repulsiv sein können, je nachdem ob Zucker oder Elektroshock während der pavlovschen Konditionierung benutzt wird. Beide Gedächtnisse sind im gleichen Satz von Kenyonzellen lokalisiert. Dies wirft die Frage auf, wie das gleiche Duftsignal mit zwei verschiedenen Ereignissen (Zucker und Elektroschock) assoziiert werden kann. Es zeigt sich, dass zwei unterschiedliche Monoamine jeweils spezifisch für das Anlegen eines der beiden Gedächtnisse verantwortlich sind; Dopamin für das Electroschockgedächtnis und Octopamin für das Zuckergedächtnis. Berücksichtigt man wie Duftreize in den PK kodiert sind, ergibt sich ein Model bei dem zwar beide Spuren in einer Zelle lokalisiert sind, diese jedoch durch die Nutzung unterschiedlicher subzellulärer Bereiche voneinander getrennt werden. Jeweils einer dieser Bereiche wäre durch Dopamin moduliert, der andere durch Octopamin. Das Fazit dieser Studie ist, dass zwei wichtige Punkte bei der Lokalisierung von Gedächtnis-spuren aufgezeigt wurden. (1) Die Tatsache, dass beim Duftlernen von Drosophila mehrere Spuren verschiedener Duftgedächtnisse lokalisiert worden sind widerlegt die von Lashley aufgestellte Behauptung, dass Gedächtnisse nicht lokalisierbar sind. (2) Verschiedene Spuren können für den gleichen Duft in den gleichen Zellen angelegt werden, sofern man eine subzelluläre Organisation annimmt, wie sie sowohl für Zucker- und Elektroschockgedächtnis, als auch Gedächtnisbildung und Auslöschen vorgeschlagen werden KW - Taufliege KW - Gedächtnis KW - Lernen KW - Signaltransduktion KW - Gedächtnis KW - Verhalten KW - Catecholamine KW - Signaltransduktion KW - Lernen KW - Memory KW - Behaviour KW - catecholamines KW - signaltransduction KW - learning Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5065 ER - TY - THES A1 - Schwarz, Ulrike T1 - Biochemische und Molekularbiologische Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen Humanen Thrombozyten und Endothelzellen T1 - Biochemical and Molecular Characterization of Interactions Between Human Platelets and Endothelial Cells N2 - Der Blutkreislauf ist als wichtigstes Transportsystem im menschlichen Körper essentiell für die Versorgung der Gewebe und Organe mit Sauerstoff, Nährstoffen, Hormonen etc. Zwei Zelltypen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines funktionell intakten Blutgefäßsystems spielen, sind Thrombozyten, die zentralen Mediatoren der Blutgerinnung, und Endothelzellen, welche die luminale Seite der Gefäßwände auskleiden. Diese beiden Zellen sind aber auch wesentlich an der Pathologie der Atherosklerose und kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt. Durch direkte und indirekte Interaktionen beeinflussen sich diese beiden Zelltypen gegenseitig und regulieren ihre Aktivität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Analysenmethode entwickelt, welche den Funktionszustand der Thrombozyten quantitativ erfaßt. Sowohl die Aktivierung als auch die Hemmung humaner Thrombozyten wird durch die Phosphorylierung spezifischer Signalproteine reguliert. Basierend auf der Verwendung phosphorylierungsspezifischer Antikörper und der Durchflußzytometrie wurde eine Methode etabliert, welche die Proteinphosphorylierung auf Einzelzellebene erfaßt, schnell quantifizierbare Ergebnisse liefert und für die Analyse im Vollblut geeignet ist. Da die Sekretion von Endothelfaktoren den Phosphorylierungszustand dieser Proteine in den Thrombozyten beeinflußt, kann die Methode auch dazu verwendet werden, indirekt Rückschlüsse auf den Funktionszustand der Endothelzellen zu gewinnen. In einer ersten klinischen Anwendung wurde die Methode eingesetzt, um den Therapieverlauf der antithrombotischen Medikamente Ticlopidin und Clopidogrel, welche gezielt die ADP-induzierte Thrombozytenaktivierung hemmen, zu verfolgen und das Antwortverhalten von Patienten auf diese Medikamente zu messen. Mehrere Personen, bei denen Ticlopidin und Clopidogrel keine Wirkung zeigten, wurden gefunden, ein Hinweis darauf, daß eine Resistenz gegen Thienopyridine vorkommt. Es ist bekannt, daß Endothelfaktoren bestimmte Aspekte der Thrombozytenaktivierung hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der p38 und p42 Mitogen-aktivierten Proteinkinasen, die im Verlauf der Thrombozytenaktivierung von zahlreichen Agonisten induziert wird, ebenfalls durch die endothelialen Vasodilatatoren NO (Stickstoffmonoxid) und Prostaglandin gehemmt wurde. Außerdem hemmten diese Substanzen die Translokation der inflammatorischen Moleküle P-Selektin und CD40 Ligand (CD40L) aus intrazellulären Speicherorganellen auf die Thrombozytenoberfläche. P-Selektin und CD40L werden auf aktivierten Thrombozyten exprimiert und sind direkt an der Interaktion von Thrombozyten mit Leukozyten und Endothelzellen beteiligt. Um die Auswirkung von CD40L, P-Selektin und weiteren Faktoren aktivierter Thrombozyten auf humane Endothelzellen zu untersuchen, wurde mit Hilfe von cDNA-Arrays die differentielle Genexpression in Endothelzellen nach Koinkubation mit aktivierten Thrombozyten analysiert. Neben einer bereits bekannten Hochregulierung von Faktoren, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, wurde eine verstärkte Expression von Transkriptionsfaktoren (c-Jun, Egr1, CREB2), Wachstumsfaktoren (PDGF) sowie von Adhäsionsrezeptoren für extrazelluläre Matrixproteine (Integrin av, Integrin b1) gefunden. Diese Faktoren weisen darauf hin, daß aktivierte Thrombozyten die Migration und Proliferation der Endothelzellen anregen und damit die Wundheilung, aber auch pathophysiologische Prozesse wie die Ausbildung atherosklerotischer Plaques induzieren könnten. N2 - The blood circulation is the human body's main transport system and is essential for supplying tissues and organs with oxygen, nutrients, hormones, etc. Blood platelets, the central mediators of coagulation, and endothelial cells which line the inner wall of blood vessels, play important roles in the maintenance of functionally intact blood vessels. On the other hand, these cells also participate in the pathogenesis of atherosclerosis and cardiovascular diseases. These two cell types mutually influence each other and regulate their activity via direct and indirect interactions. In this work, a method which allows quantitative analysis of platelet function was developed. Platelet activation and inhibition is regulated by phosphorylation of specific signaling proteins. Based on the use of phosphorylation-specific antibodies and flow cytometry, a method was established which measures protein phosphorylation in single cells, gives fast and quantitative results, and is also suitable for analysis of whole blood samples. Since secretion of endothelial cell factors influences the phosphorylation state of these proteins, the method may also be used to get indirect information about the functional integrity of endothelial cells. In a first clinical application, this method was used to monitor the progression of a therapy with the anti-thrombotic drugs ticlopidine and clopidogrel which selectively inhibit ADP-induced platelet activation, and to determine the patients' responsiveness to these drugs. Several non-responders were identified, indicating the existence of a thienopyridine resistance. Endothelial cell factors are known to inhibit different aspects of platelet activation. In this work, phosphorylation of platelet p38 and p42 mitogen-activated protein kinases, which is induced by various platelet activators, was found to be inhibited by the endothelium-derived vasodilators nitric oxide (NO) and prostacyclin. Furthermore, these endothelial cell factors inhibited translocation of the inflammatory molecules P-selectin and CD40 ligand (CD40L) from intracellular granules to the platelet surface membrane. P-selectin and CD40L are expressed on activated platelets and are directly involved in the interaction of platelets with leukocytes and endothelial cells. To study effects of P-selectin, CD40L, and other parameters of activated platelets on human endothelial cells, cDNA Arrays were used to analyze differential gene expression in endothelial cells after coincubation with activated platelets. Besides the already known up-regulation of certain inflammatory factors, a number of additional genes which belong mainly to the group of transcription factors (c-Jun, Egr1, CREB2) and growth factors (PDGF) and of adhesion receptors for extracellular matrix proteins (integrin av, integrin b1) was found to be up-regulated by activated platelets. Expression of these genes indicates that activated platelets may induce migration and proliferation of endothelial cells and thereby initiate wound healing, but may also have pathophysiological effects like the development of atherosclerotic plaques. KW - Thrombozyt KW - Endothelzelle KW - Genexpression KW - Phosphorylierung KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyten KW - Endothelzellen KW - Durchflußzytometrie KW - Proteinphosphorylierung KW - Signaltransduktion KW - Genexpression KW - cDNA-Arrays KW - Atherosklerose KW - platelets KW - endothelial cells KW - flow cytometry KW - protein phosphorylation KW - signal transduction KW - gene expression KW - cDNA arrays KW - atherosclerosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2030 ER - TY - THES A1 - Schul, Daniela T1 - Spatio-temporal investigation and quantitative analysis of the BMP signaling pathway T1 - Raum-Zeitliche Untersuchung und quantitative Analyse des BMP-Signaltransduktionsweges N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are key regulators for a lot of diverse cellular processes. During embryonic development these proteins act as morphogens and play a crucial role particularly in organogenesis. BMPs have a direct impact on distinct cellular fates by means of concentration-gradients in the developing embryos. Using the diverse signaling input information within the embryo due to the gradient, the cells transduce the varying extracellular information into distinct gene expression profiles and cell fate decisions. Furthermore, BMP proteins bear important functions in adult organisms like tissue homeostasis or regeneration. In contrast to TGF-ß signaling, currently only little is known about how cells decode and quantify incoming BMP signals. There is poor knowledge about the quantitative relationships between signal input, transducing molecules, their states and location, and finally their ability to incorporate graded systemic inputs and produce qualitative responses. A key requirement for efficient pathway modulation is the complete comprehension of this signaling network on a quantitative level as the BMP signaling pathway, just like many other signaling pathways, is a major target for medicative interference. I therefore at first studied the subcellular distribution of Smad1, which is the main signal transducing protein of the BMP signaling pathway, in a quantitative manner and in response to various types and levels of stimuli in murine c2c12 cells. Results indicate that the subcellular localization of Smad1 is not dependent on the initial BMP input. Surprisingly, only the phospho-Smad1 level is proportionally associated to ligand concentration. Furthermore, the activated transducer proteins were entirely located in the nucleus. Besides the subcellular localization of Smad1, I have analyzed the gene expression profile induced by BMP signaling. Therefore, I examined two endogenous immediate early BMP targets as well as the expression of the stably transgenic Gaussia Luciferase. Interestingly, the results of these independent experimental setups and read-outs suggest oscillating target gene expression. The amplitudes of the oscillations showed a precise concentration-dependence for continuous and transient stimulation. Additionally, even short-time stimulation of 15’ activates oscillating gene-expression pulses that are detectable for at least 30h post-stimulation. Only treatment with a BMP type I receptor kinase inhibitor leads to the complete abolishment of the target gene expression. This indicated that target gene expression oscillations depend directly on BMP type I receptor kinase activity. N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) stellen wichtige Regulatoren für eine Vielzahl von verschiedenen zellulären Prozessen dar. Während der Embryonalentwicklung agieren diese Proteine als Morphogene und spielen daher eine entscheidende Rolle für diesen Prozess, vor allem in der Organogenese. Durch Konzentrationsgradienten üben BMPs einen direkten Einfluss auf verschiedene zelluläre Schicksale im entwickelnden Embryo aus. Aufgrund dieser Gradienten gelangen vielfältige Signalinformationen zu den verschiedenen Zellen, welche die extrazelluläre Information in verschiedene Genexpressionsprofile und Zellschicksalsentscheidungen umwandeln. Darüber hinaus tragen BMPs wichtige Funktionen im erwachsenen Organismus, wie z.B. Gewebshomöostase oder -regeneration. Im Gegensatz zu dem verwandten TGF-ß Signaltransduktionsweg ist derzeit nur wenig über die zelluläre Übersetzung und Quantifizierung eingehender BMP-Signale bekannt. Es gibt wenige Kenntnisse über die quantitative Beziehung zwischen Signaleingang, Überträgerproteinen, ihren Zuständen sowie intrazellulären Positionen, und schließlich ihre Fähigkeit Signaleingänge systemisch zu integrieren und qualitative Antworten der Zelle zu produzieren. Eine wesentliche Voraussetzung für die effiziente Signaltransduktions-modulierung ist das vollständige Verständnis des Signalnetzwerkes auf einer quantitativen Ebene, da der BMP-Signalweg, wie auch viele andere Signalwege, ein wichtiges Ziel für medizinische Anwendungen und Medikamentenentwicklung ist. Daher untersuchte ich zunächst die subzelluläre Verteilung der wichtigsten Signalweiterleitungsproteine des BMP-Signalweges, der Smad1-Proteine, auf quantitativer Ebene und deren Reaktion auf verschiedene Stimulierungsarten und BMP-Konzentrationsstufen in murinen c2c12-Zellen. Die Ergebnisse zeigen, dass die subzelluläre Lokalisation von Smad1 unabhängig von der BMP-Konzentration ist und nur das phospho-Smad1 Level proportional zur Konzentration des Liganden steigt. Darüber hinaus befanden sich die aktiven Überträgerproteine nach Stimulierungvollständig im Zellkern. Neben der subzellulären Lokalisation von Smad1, habe ich das Genexpressionsprofil von BMP-Zielgenen analysiert. Ich untersuchte zwei endogene und frühe BMP-Zielgene sowie die Expression der stabil transgenen Gaussia Luciferase. Interessanterweise deuten die Ergebnisse dieser zwei unabhängigen Versuchsaufbauten und Detektionsmethoden auf eine oszillierende Expression der Zielgene hin. Die Amplituden der Schwingungen zeigten eine deutliche Konzentrationsabhängigkeit bei kontinuierlicher und transienter Stimulation. Außerdem aktiviert eine Kurzzeitstimulierung von 15 Minuten ebenfalls ein oszillierendes Genexpressionsprofil, welches für mindestens 30 Stunden nach der Stimulierung nachweisbar ist. Nur die Behandlung mit einem BMP Typ-I-Rezeptorkinaseinhibitor führt zur vollständigen Aufhebung der Zielgenexpression. Infolgedessen sind die Oszillationen der Zielgenexpression direkt von der Aktivität der BMP Typ-I-Rezeptorkinase abhängig. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Signaltransduktion KW - BMP-Signaltransduktionsweg KW - Analyse KW - BMP signaling pathway KW - analysis Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-84224 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Marc T1 - Die Rolle mitogener und stressinduzierter MAPK-Signalwege in der Regulation von keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen T1 - The role of mitogenic and stress-induced MAPK pathways in the regulation of growth and differentiation of keratinocytes N2 - Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält. N2 - Abnormal proliferation and differentiation processes play an important role in the pathogenesis of various skin diseases. The intracellular signaling mechanisms governing the balance between growth and differentiation of keratinocytes are still largely unknown. In this thesis the role of mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades in keratinocyte growth and differentiation was analysed. Induction of keratinocyte differentiation by elevation of extracellular calcium levels resulted in a rapid and transient activation of the Raf/MEK/Erk (MAPK) pathway but did not increase activity of the stress-activated Jnk or p38 MAPKs. Calcium-induced Erk activation differed in kinetics from mitogenic Erk activation by epidermal growth factor (EGF) and and could be modulated by alterations of intracellular calcium levels. While EGF-induced Erk activation was mediated by the small GTPase Ras, calcium-induced Erk activity occurred independently of active Ras. This suggests that proliferative and differentiation-inducing stimuli use alternative mechanisms to activate the Raf/MEK/Erk pathway. Despite the transient nature of Erk activation, calcium-induced expression of the cell cycle inhibitor protein p21 and the differentiation marker involucrin were sensitive to MEK inhibition which implies a role for the Raf/MEK/Erk pathway in early stages of keratinocyte differentiation. The two calcium binding S100 proteins additionally studied here, MRP8 and MRP14, seem to represent important convergent points between calcium and MAPK signaling. In vitro both proteins are expressed in a differentiation-dependent manner in keratinocytes. Elevation of intracellular calcium levels as well as activation of stress-activated MAPKs resulted in translocation of MRP8/MRP14 complexes to the cytoskeleton. When expression of MRP8 and MRP14 was analysed in serial paraffin- or kryo-sections of healthy or diseased skin, signals in normal skin were largely restricted to differentiating cells of the hair follicle, however, additionally a strong induction of MRP8/14 expression was observed in differentiating epidermal layers of hyperproliferative or tumorigenic skin. In this thesis important novel signaling interactions were identified which provide new basic insights into the molecular mechanisms involved in the regulation of skin homeostasis which is essential for the maintenance of the multiple functions of the epidermis. KW - Keratinozyt KW - Zelldifferenzierung KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Keratinozyten KW - Differenzierung KW - Calcium KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - S100-Protein KW - Raf/MEK/ERK KW - Keratinocyte KW - differentiation KW - calcium KW - MAPK KW - signal transduction KW - S100 protein KW - Raf/MEK/ERK Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2013 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Enrico T1 - Ein neuer und ungewöhnlicher Signalweg erlaubt physiologischen Konzentrationen von Erythropoetin mitogene Kinasen in primären erythroiden Vorläuferzellen zu aktivieren T1 - A novel and unusual pathway allows physiological concentrations of erythropoietin to activate mitogenic kinases in primary erythroid progenitor cells N2 - Die Stimulation primärer erythroider Vorläuferzellen (PEPs) mit Erythropoetin (Epo) führt zur Aktivierung der mitogenen Kinasen („extracellular signal-regulated kinases“ (Erks) und „mitogen-activated protein kinase/Erk-activating kinases“ (MEKs)). Der Mechanismus der Aktivierung war bisher unklar. Mehrere wissenschaftliche Gruppen haben zudem unerwartet herausgefunden, dass eine Verkürzung und Mutation des zytoplasmatischen Endes des Epo-Rezeptors (EpoR), welche zum Verlust der Bindungsmöglichkeiten für verschiedene Signalproteine führt, anscheinend nur einen geringen Effekt auf das EpoR-Signalsystem hat. Diese Ergebnisse werden durch Viabilität und normaler Erythrozytenzahl von mutierten Mäusen unterstützt. Ein neuer Signalweg, der in biochemischen Studien mit aus menschlichem Nabelschnurblut gewonnenen PEPs gefunden wurde, könnte diese überraschenden Ergebnisse erklären. Wir zeigen zum ersten mal, dass Ras und das Klasse 1b Enzym der Familie der Phosphatidylinositol-3-Kinasen (PI3K), PI3Kg, nach Stimulation mit einer physiologischen Konzentration von Epo aktiviert werden. Überraschenderweise kann in PEPs die Epo-induzierte Ras-, MEK- und Erk-Aktivierung durch drei strukturell unterschiedliche PI3K-Inhibitoren blockiert werden. Überdies ist die Erk-Aktivierung in PEPs unempfindlich gegenüber Inhibierung der Raf-Kinasen, wird aber durch Proteinkinase C (PKC)-Inhibitoren unterdrückt. Im Gegensatz dazu ist die durch Stammzellfaktor („stem cell factor“ (SCF)) induzierte Erk-Aktivierung empfindlich gegenüber Raf-Inhibierung, jedoch unempfindlich gegenüber PI3K- und PKC-Inhibitoren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung von MEKs und Erks in PEPs durch geringe Konzentrationen an Epo nicht durch die klassische Signalkaskade „Src homology 2 domain-containing transforming protein C“ (Shc), „growth factor receptor bound protein 2“ (Grb2), „son of sevenless“ (Sos), Ras, Raf, MEK und Erk erfolgt, sondern durch einen PI3K-abhängigen und Raf-unabhängigen Signalweg, welcher PKC-Aktivität benötigt, reguliert wird. N2 - Stimulation of primary erythroid progenitors (PEPs) with erythropoietin (Epo) leads to the activation of the mitogenic kinases (extracellular signal-regulated kinases (Erks) and mitogen-activated protein kinase/Erk-activating kinases (MEKs)). So far, it has been unclear how this is mechanistically accomplished. Moreover, several research groups unexpectedly found that truncation and mutation of the cytoplasmic tail of the Epo receptor (EpoR), which prevents binding of numerous signal-transducing proteins, had apparently little effect on EpoR signalling. These results are supported by viability and normal erythrocyte counts of mutant mice. A novel pathway, now unraveled by biochemical studies in human cord blood-derived PEPs, might explain these puzzling findings. We show, for the first time, that Ras and the class Ib enzyme of the phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) family, PI3Kg, are activated in response to physiological Epo concentrations. Surprisingly, Ras, MEK and Erk activation by Epo in PEPs can be blocked by three structurally different PI3K inhibitors. Furthermore, Erk activation in PEPs is insensitive to the inhibition of Raf kinase but suppressed upon protein kinase C (PKC) inhibition. In contrast, Erk activation induced by stem cell factor (SCF), which activates c-Kit in the same cells, is sensitive to Raf inhibitors and insensitive to PI3K and PKC inhibitors. These results indicate that the activation of MEKs and Erks by minimal concentrations of Epo in PEPs does not occur through the classical cascade Src homology 2 domain-containing transforming protein C (Shc), growth factor receptor bound protein 2 (Grb2), son of sevenless (Sos), Ras, Raf, MEK and Erk. Instead, MEKs and Erks are activated via PI3K, through a Raf-independent signalling pathway which requires PKC activity. KW - Erythropoietin KW - Signaltransduktion KW - Protoonkogen KW - Erythropoetin KW - Epo KW - erythroide Vorläufer KW - PI3-K KW - Erk KW - erythropoietin KW - Epo KW - erythroid progenitors KW - PI3-K KW - Erk Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10429 ER - TY - THES A1 - Sauter, Angela T1 - Die Bedeutung von ABA-Konjugaten als hormonelles Langstreckensignal in Pflanzen T1 - The implication of ABA-conjugates for long distance signalling in plants N2 - Abscisinsäure-Glucoseester (ABA-GE) kann nach der vorliegenden Untersuchung nicht mehr ausschließlich als Endmetabolit der Abscisinsäure (ABA) gelten. Der unter Stressbedingungen im Xylem verstärkt transportierte ABA-GE trägt in Kombination mit einer extrazellulären ß-D-Glucosidaseaktivität im Blattapoplast zu einer Stabilisierung und Intensivierung des ABA-Langstreckensignals bei. N2 - The results presented in this study support te idea that abscisic acid glucose ester (ABA-GE) can not be considered exclusively as a final metabolite of ABA. While stress conditions intensify the ABA-GE-concentration in the xylem, and the existance of ß-D-glucosidase activity in the leaf apoplast suggest that ABA-GE stabilises and intensifies the ABA long-distance signal. KW - Abscisinsäure KW - Wurzel KW - Spross KW - Signaltransduktion KW - ABA-Konjugate KW - ABA-GE KW - Wurzel-Spross-Stresssignal KW - Xylem KW - ß-D-Glucosidase KW - ABA-conjugates KW - ABA-GE KW - root-to-shoot stress signal KW - xylem KW - ß-D-glucosidase Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3892 ER - TY - THES A1 - Salzmann, Steffen T1 - Regulation der TNF-Rezeptor Signaltransduktion durch das Zytokin TWEAK T1 - Regulation of the TNF-receptor signaltransduction through the cytokine TWEAK N2 - Das pleiotrope Zytokin TNF (tumor necrosis factor) kann an den TNF-Rezeptor 1 (TNFR1) und den TNF-Rezeptor 2 (TNFR2) binden und mit deren Hilfe seine biologischen Funktionen über verschiedene Signalwege, wie z.B. NFB- und MAPK-Aktivierung bzw. Apop¬toseinduktion, vermitteln. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des TNFR2 zur proteasomalen Degradation des Adaterproteins TRAF2 führt und dadurch die TNFR1-induzierte Apoptose verstärkt wird. TWEAK (tumor necrosis like weak inducer of apoptosis), das ebenfalls der TNF-Ligandenfamilie angehört und die Interaktion mit dessen Rezeptor Fn14 (fibroblast growth factor-inducible 14), der wie der TNFR2 zur Untergruppe der TRAF-bindenden Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie gehört, zeigten in verschiedenen Arbeiten auch eine TRAF2-degradierende Wirkung. In der vorliegenden Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass dies auch im Falle des TWEAK/Fn14-Systems mit einem verstärkenden Effekt auf die TNFR1-vermittelte Apoptose einhergeht. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass TWEAK zusätzlich auch die TNFR1-induzierte Nekrose verstärkt, die den Zelltod durch andere Mechanismen als bei der Apoptose induziert. Von anderen Arbeiten unserer Gruppe war bekannt, dass lösliches TWEAK (sTWEAK) und membranständiges TWEAK (mTWEAK) bezüglich der TRAF2-Depletion wirkungs¬gleich sind. Da der apoptotische Fn14-TNFR1-„crosstalk“ auf der Depletion von TRAF2-Komplexen beruht wurden auch keine signifikanten Unterschiede zwischen sTWEAK und mTWEAK in Bezug auf die Verstärkung der TNFR1-induzierten Apoptose beobachtet. Interessanter¬weise zeigte sich in der vorliegenden Arbeit jedoch, dass sTWEAK den klassischen NFB-Signalweg gar nicht bzw. nur schwach aktiviert, wohingegen mTWEAK diesen stark induziert. Bei der Aktivierung des alternativen NFB-Signalweges hingegen ließen sich keine Unterschiede zwischen sTWEAK und mTWEAK erkennen. Die Aktivierung eines Signalweges wird also durch die Oligomerisierung des Liganden nicht moduliert, demgegenüber aber erwies sich die Aktivierung eines anderen Signalweges als stark abhängig von der Liganden-Oligomerisierung. Vor dem Hintergrund, dass das Adapterprotein TRAF1 (TNF-receptor-associated factor 1) Heterotrimere mit TRAF2 bildet, wurde weiterhin untersucht, ob dieses Molekül einen Einfluss auf die Aktivität der TWEAK-induzierten Signalwege hat. Tatsächlich zeigte sich in TRAF1-exprimie¬renden Zellen eine Verstärkung der TWEAK-induzierten Aktivierung des klassischen NFB-Signalweges Zukünftige Studien müssen nun aufklären, inwieweit die hier gefundenen Mecha-nismen das Zusammenspiel von TNF und TWEAK in vivo bestimmen. N2 - The pleiotropic cytokine TNF (tumor necrosis factor) binds to two receptors, TNF-receptor 1 (TNFR1) and TNF-receptor 2 (TNFR2). TNF elicits its biological functions through different signaling pathways, e.g. NFB- and MAPK-activation and induction of apoptosis. Previous studies revealed that activation of TNFR2 leads to protea¬somal degradation of the adaptor protein TRAF2 and enhanced TNFR1-induced apoptosis. TWEAK (tumor necrosis like weak inducer of apoptosis), a member of the TNF-ligand family and Fn14 which belongs like TNFR2 to the TRAF-binding subgroup of the TNF-receptor family, showed also a TRAF2-degrading effect. In the present thesis it is shown that this is also associated with an enhancement of TNFR1-mediated apoptosis. Furthermore, it was shown that TWEAK also amplifies TNFR1-induced necrosis, a form of cell death that is induced independently and by different mechanisms than apoptosis. In earlier studies in our group it was found that soluble TWEAK (sTWEAK) and membrane bound TWEAK (mTWEAK) have the same TRAF2-depleting effect. Because the apoptotic crosstalk of Fn14 and TNFR1 bases on the depletion of TRAF2-containing complexes, there were no significant differences observed between sTWEAK and mTWEAK concerning the enhancement of TNFR1-induced apoptosis. Interestingly, it was shown in this thesis that sTWEAK can activate the classical NFB pathway not or just weak, whereas mTWEAK can do this very efficiently. However there were no differences between sTWEAK and mTWEAK in the activa¬tion of the alternative NFB pathway. Thus the activation of one type of signaling pathway is therefore not modulated through ligand oligomerisation, but in contrast the activation of another pathway turned out to be strongly dependent of ligand oligomerisation. It is known that the adaptor protein TRAF1 (TNF-receptor-associated factor 1) builds heterotrimers with TRAF2. It was furthermore investiga-ted, whether this molecule has an influence on the activity of TWEAK-induced pathways. Actually there was increased activity in TWEAK-mediated classical NFB signaling observed in TRAF1-expressing cells. Further studies have to clarify to which extend the here found mechanisms affect the TNF-TWEAK interplay in vivo. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Signaltransduktion KW - TNF KW - TWEAK Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52525 ER - TY - THES A1 - Roos, Claudia T1 - Characterization of tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis (TWEAK)-induced signaling pathways T1 - Charakterisierung TWEAK induzierter Signalwege N2 - TWEAK ist ein typischer Vertreter der TNF Ligandenfamilie. TWEAK wird als Typ II Transmembranprotein exprimiert, kann jedoch durch proteolytische Prozessierung auch als lösliches Protein freigesetzt werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass oligomerisiertes TWEAK in Hinblick auf die Aktivierung des klassischen NFκB Signalweges deutlich aktiver ist als lösliches, trimeres TWEAK. Jedoch sind beide TWEAK-Varianten in der Lage, die Depletion von TRAF2 und die Prozessierung von p100, beides Kennzeichen für die Aktivierung des alternativen NFκB Signalweges, zu induzieren. Ebenso wie andere lösliche TNF-Liganden, die ihren entsprechenden Rezeptor nur schwach aktivieren, erlangt lösliches TWEAK durch Oligomerisierung vergleichbare Aktivität zum membrangebundenen Liganden. TRAF2 spielt eine Schlüsselrolle in der TWEAK-vermittelten NFκB Aktivierung. Durch Depletion oder Degradation von TRAF2 fällt die Entscheidung, ob lediglich der alternative oder beide, der klassische und der alternative NFκB Signalweg aktiviert werden. Die Blockade des TWEAK-Rezeptors Fn14 inhibiert die Aktivierung der NFκB Signalwege, ungeachtet welche Form von TWEAK zur Stimulation genutzt wird. Das weist darauf hin, dass die unterschiedlichen Aktivitäten der beiden TWEAK-Varianten in der Induktion des klassischen und alternativen NFκB Signalweges nicht durch die Nutzung verschiedener Rezeptoren verursacht sind. Damit wird in dieser Arbeit anhand von TWEAK zum ersten mal gezeigt, dass ein TNF Ligand in unterschiedlichen Varianten qualitativ unterschiedliche Aktivitäten des entsprechenden TNF Rezeptors auslöst. N2 - TWEAK is a typical member oft he TNF ligand family. Therefore it is initially expressed as a type II transmembrane protein, but a soluble variant can be released by proteolytic processing. In this work it is shown that oligomerized TWEAK is more competent than soluble, trimeric TWEAK regarding the activation of classical NFκB signaling pathway. However, both TWEAK variants are able to induce depletion of TRAF2 and processing of p100, which are hallmarks for the activation of the noncanonical NFκB pathway. Like other solube TNF ligands with no or poor activity on their corresponding receptor, TWEAK gains high activity upon oligomerization resembling the activity of the transmembrane ligand. TRAF2 has a key role in TWEAK-induced NFκB signaling. Depletion or degradation of TRAF2 is crucial for activation of the noncanonial or both, the classical and the noncanonical NFκB pathway. Blocking the TWEAK receptor Fn14 inhibits the activation of NFκB signaling, irrespective of the TWEAK form used for stimulation. This indicates that the different activities of the two TWEAK variants in activation of classical and noncanonical NFκB signaling are not caused by the use of different receptors. Therefore this study on TWEAK is the first reported case where one TNF ligand in different variants induces qualitatively different activities of the corresponding TNF receptor. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Signaltransduktion KW - Fn14 KW - NFkappaB KW - p100 KW - TRAF2 KW - TWEAK KW - Fn14 KW - NFkappaB KW - p100 KW - TRAF2 KW - TWEAK Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45295 ER - TY - THES A1 - Romfeld, Lars T1 - Charakterisierung der Rolle des Proteins p8 in der proliferationsassoziierten Signaltransduktion in Insulin produzierenden beta-Zellen des endokrinen Pankreas T1 - Characterization of protein p8 in proliferation-associated signal transduction of insulin producing pancreatic beta cells N2 - Ein möglicher Ansatz neuer Therapiestrategien für Diabetes mellitus besteht zum einen in der Differenzierung von Stammzellen zu insulinproduzierenden Zellen und zum anderen in der Beschleunigung der Zellproliferation ebensolcher Zellen. In zahlreichen Studien wurden bereits mitogene Signaltransduktionswege in beta-Zellen des endokrinen Pankreas unter dem Einfluss diverser Nährstoffe untersucht. Das Protein p8, ursprünglich im Umfeld einer experimentell induzierten akuten Pankreatitis im Rattenmodell als Stressantwort beschrieben, ist an einem glukoseabhängigen Zellwachstum in der insulinproduzierenden beta-Zelle des endokrinen Pankreas beteiligt. Insofern ist es nur schlüssig, die Rolle des Proteins p8 im Rahmen der proliferationsassoziierten Signaltransduktion zu untersuchen. Zur näheren Charakterisierung von p8 wurden von unserer Arbeitsgruppe Wildtyp-INS-1-Zellen (WT-INS-1), als Modell für die beta-Zelle des endokrinen Pankreas, mit einem durch IPTG induzierbaren, p8-exprimierenden System ausgestattet (p8-INS-1). Dieses System wurde in der vorliegenden Arbeit zunächst auf seine Funktionalität hin überprüft. Unter anderem konnte p8-cDNA in den stabil transfizierten p8-INS-1-Zellen und in den mit obigem Plasmid transient transfizierten WT-INS-1-Zellen dargestellt werden, wobei letztere WT-INS-1-Zellen stärker signalisierten und somit ein höheres „output“ an p8 zu generieren scheinen. In Immunoblotanalysen ergab sich ein ähnliches Bild. Durch p8-Überexpression kommt es zu einem zunehmenden Signal des Proteins p8 innerhalb der p8-INS-1-Zellen. Jedoch erscheint dieses Signal in WT-INS-1-Zellen noch stärker. Ebenso ließen sich mehrfach Doppelbanden sowohl bei p8-INS-1-Zellen als auch bei WT-INS-1-Zellen bei 14 kDa und 22 kDa darstellen. Das differenzierte Expressionsmuster beider Zelllinien im Rahmen dieser Immunoblotanalysen legt den Schluss nahe, dass eine Erhöhung des p8-Levels, sei es nun durch Induktion per IPTG-Gabe oder durch Wachstumsfaktoren, zu einem veränderten Molekulargewicht des Proteins p8 führt. Das Protein p8 unterliegt somit ständigen Veränderungen im Rahmen der Protein-Protein-Interaktion. Im Vordergrund stehen Phosphorylierungen als Aktivierungsinitiatoren und Ubiquitinierung mit synergistischer Proliferationszunahme unter p8-Überexpression und gleichzeitiger Proteasomhemmung. Gerade in Phasen erhöhten Zellstresses (Hypo- und Hypernutrition) lassen sich durch p8-Überexpression erhöhte Wachstumsraten nachweisen, während im physiologischen Bereich nur bei gleichzeitiger Proteasomhemmung Wachstumssteigerungen durch p8-Überexpression erreicht werden können. Dies unterstreicht einmal mehr die Rolle von p8 als Stressprotein. Nichtsdestotrotz übertreffen die Proliferationsraten der p8-INS-1-Zellen die der WT-INS-1-Zellen unter den verschiedensten Stimulationsbedingungen bei weitem. So konnte gezeigt werden, dass in den p8-INS-1-Zellen eine progrediente, glukoseabhängige Proliferation vorliegt, welche sich durch Gabe von IGF-1 oder foetalem Kälberserum (FBS) zu einem signifikanten synergistischen Wachstum ausweiten lässt. Und auch hier erzeugt p8 als Stressprotein bei p8-INS-1-Zellen im glukosefreiem Medium bei alleiniger Stimulation mit Wachstumsfaktoren signifikante Wachstumsraten im Vergleich zu WT-INS-1-Zellen. Die Umsetzung der Stimulation durch Glukose und Wachstumsfaktoren auf die p8-vermittelte Proliferation vollzieht sich innerhalb der Signaltransduktion. Mit Phosphatidylinositol-3´-Kinase (PI3´K) als Schlüsselprotein innerhalb der mitogenen Signaltransduktion und Proteinkinase C (PKC alpha, beta, gamma) konnten durch Co-Immuno-präzipitationen, GST-Pull-Downs, Immunoblotanalysen aber auch Inhibitionsversuche wichtige Interaktionspartner von p8 identifiziert werden. Weitere Bindungspartner des Proteins p8 resultierten durch Inhibitionsversuche mit Proteinkinasen wie PKCzeta und PKA, aber auch p38 MAPK als Vertreter des MAPK-Signalweges. Dabei zeigt sich ein relativ gleiches Bild mit tendenziell eher mäßigen Proliferationshemmung im niedrigen bis normalen Glukosebereich, welche sich unter p8-Überexpression verstärkt. Verschiedene Regelkreise zur Feinsteuerung der p8-vermittelten Proliferation scheinen hier denkbar. Sollte p8 neben der Zellproliferation auch zu einer Aktivierung der genannten Proteine führen, könnte die Inhibition dieser Proteine ihrerseits die p8-vermittelte Proliferation hemmen. Auf Proteinebene ließ sich die Verbindung zwischen p8 und MAPK p38, PKCzeta, PKA und PKB nicht nachweisen, erscheint aber wegen der Primärstrukturen der Proteine, sowie Erkenntnissen aus der bisherigen Literatur und auch aufgrund der Versuche mit Proteininhibitoren im Rahmen dieser Arbeit wahrscheinlich. Weitergehende Untersuchungen sollten daher noch erfolgen. Die vorgestellten Ergebnisse sind ein Beitrag zum besseren Verständnis der Rolle des Proteins p8 innerhalb der mitogenen Signaltransduktion als eine Voraussetzung für einen kurativen Ansatz des Diabetes mellitus Typ I. N2 - One possible approach for new strategies in therapy of diabetes mellitus is on one side the differentiation of stem cells to insulin producing cells and on the other side the acceleration of cell proliferation in such cells. There have been many studies in which mitogenic signal transduction in pancreatic beta cells under the influence of various nutrients and growth factors was examined. Protein p8, first described as overexpressed in experimentally induced acute pancreatitis, is involved in glucose dependent cell proliferation in the pancreatic beta cell. So it is quite logical to examine the role of protein p8 in proliferation-associated signal transduction. For more detailed characterization of p8 we transfected in our working group wild type-INS-1-cells (WT-INS-1), as a model for the pancreatic beta cell, with an IPTG-inducable and p8-overexpressing system (p8-INS-1). In the present study, this system was first controlled with regard to functionality. It worked to detect the p8-overexpressing plasmide p8pOPRSVI and the LAC-repressor in p8-INS-1-cells. In addition, p8-cDNA has been displayed in stable transfected p8-INS-1-cells and also in transiently transfected WT-INS-1-cells (with the plasmide p8pOPRSVI), whereas transiently transfected WT-INS-1-cells showed stronger signal and seemed to generate more “output” of p8. In immunoblot analysis there was a similar pattern. With p8-overexpression you see a progressive signal of protein p8 in p8-INS-1-cells. In WT-INS-1-cells this signal was even stronger. Furthermore there have been multiple double bands both in p8-INS-1-cells and WT-INS-1-cells at 14 kDa and 22 kDa. That differentiated pattern of expression of both cell lines allows the conclusion that an enlargement of p8-level by IPTG-induction or growth factors leads to a change in molecular weight of protein p8. Thus protein p8 is subject to permanent change in context of protein-protein-interaction. The focus is thereby on phosphorylation as an initiator of activation and ubiquitination with synergistic augmentation of proliferation under p8-overexpression and inhibition of proteasome at the same time. While episodes of higher cell stress (hypo- and hypernutrition) increased proliferation rates can be demonstrated, at a physiological level increased growth rates can only be achieved by p8-overexpression and concomitant inhibition of proteasome. This underlines once more the role of protein p8 as stress protein. Nevertheless, proliferation rates of p8-INS-1-cells exceed those of WT-INS-1-cells by far relating to the most different conditions of stimulation. Therefore it could be demonstrated that there is a progressive glucose-dependant proliferation in p8-INS-1-cells which can be enlarged by IGF-1 or foetal bovine serum (FBS) to a significant synergistic growth. Moreover, p8 as a stress protein induces significant growth rates in p8-INS-1-cells versus WT-INS-1-cells by only stimulation with growth factors and without any glucose. The transposition of the stimulation by glucose and growth factors to a p8-mediated proliferation is subsequently performed within the signal transduction. By using co-immunoprecipitation, GST-pull-downs and immunoblot analysis Phosphatidylinositol-3´-kinase (PI3´K), as a key protein in mitogenic signal transduction, and proteinkinase C (PKC alpha, beta, gamma) have been identified as important interaction partners of p8. Further binding partners of protein p8 resulted by experimental inhibition of proteinkinases like PKCzeta and PKA, but also p38 MAPK as representative of the MAPK-mediated signal transduction. Thereby you can see a quite homogeneous image of a rather moderate inhibition of proliferation at lower or physiological glucose levels which is increased when overexpressing p8. Different regulator circuits for fine tuning of the p8-mediated proliferation seem to be thinkable. If the activation of p8 should lead to an activation of the named proteins, apart from cell proliferation, the inhibition of these proteins could also inhibit the p8-mediated proliferation. Unfortunately, the direct protein-protein-connection between p8 and MAPK p38, PKCzeta, PKA or PKB couldn´t be verified in this present examination. But due to the primary structure of these proteins as well as findings in previous literature and also because of the experiments with proteininhibitors in the present examination, this aspect seems to be most likely. In this regard further studies should be carried out. The presented results contribute to a better understanding of the role of protein p8 within the mitogenic signal transduction as a requirement for a curative therapy of diabetes mellitus type I. KW - B-Zelle KW - Signaltransduktion KW - Insulin-like Growth Factor I KW - Proliferation KW - Protein p8 KW - pankreatische beta-Zelle KW - proliferationsassoziierte Signaltransduktion KW - protein p8 KW - Insulin-like Growth Factor I KW - pancreatic beta cell KW - mitogenic signal transduction Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45318 ER - TY - THES A1 - Rennefahrt, Ulrike T1 - Die Rolle einer konstitutiv-aktiven MAP-Kinase SAPK-Beta bei der zellulären Transformation, Proliferation und Apoptose von NIH-3T3-Fibroblasten T1 - The role of a constitutively active MAP kinase SAPKbeta in cellular transformation, proliferation and apoptosis of NIH 3T3 fibroblasts N2 - Bei c-Jun N-terminalen Kinasen (JNKs) (auch als Stress-aktivierte Proteinkinasen SAPKs bezeichnet), handelt es sich um Mitglieder der Mitogen-aktivierten Proteinkinase Familie (MAPK), die die Genexpression als eine Antwort auf eine Vielzahl von physiologischen und nicht-physiologischen Stimuli regulieren. Gendeletionsexperimente (knockout) und der Einsatz von dominant-negativen Mutanten wiesen auf eine Funktion von SAPK/JNKs bei Prozessen der zellulären Differenzierung, dem Überleben und/oder Apoptose sowie onkogener Transformation hin. Direkte Analysen des transformierenden Potentials von SAPK/JNKs wurden bislang durch das Fehlen von konstitutiv-aktiven Mutanten verhindert. Erst unlängst konnte durch die Fusion der MAP Kinase mit seiner direkten, in der Kaskade vorgeschalteten, Aktivatorkinase solche Mutanten bereitgestellt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein SAPKb-MKK7 Hybridprotein generiert, mit dessen Hilfe das transformierende Potential von aktiviertem SAPKb charakterisiert werden konnte. Die induzierte Expression von SAPKb-MKK7 führte zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten. Darüber hinaus bildeten diese Zellen kleine Foci aus transformierten Zellen, wuchsen in Soft-Agar und vergleichbar mit onkogenem Ras oder Raf, resultierte auch die Expression von aktiviertem SAPKb in der Zerstörung des F-Aktins. Des Weiteren steigerte die Expression von SAPKb-MKK7 die Proliferationsraten von NIH 3T3 Zellen. Im Gegensatz zu den akut transformierenden Onkogenen wie ras oder raf, ist SAPKb-MKK7 jedoch nicht in der Lage, das Überleben der transformierten Zellen zu bewirken. Unsere Daten schlagen daher vor, das konstitutiv-aktives SAPK/JNK zwar die Hauptaspekte zellulärer Transformation verursacht, aber nicht imstande ist, alle Veränderungen zu induzieren, die benötigt werden, um einen vollständig transformierten Phänotypen zu etablieren, weshalb insgesamt gesehen, sein transformierendes Potential deutlich schwächer ausgeprägt ist. Wir haben zusätzlich damit begonnen, dass tumorgene Potential von SAPKb-MKK7 direkt im Nacktmausmodell zu verifizieren. Die Injektion von SAPKb-MKK7 exprimierenden Fibroblasten resultierte in der Etablierung eines gut definierten Fibrosarkoms, wobei die Latenzzeit länger war als bei v-Raf transformierten Zellen. Somit ist die Expression von aktiviertem SAPK/JNK ausreichend, um die Tumorentwicklung in vivo zu initieren, auch wenn die lange Latenzzeit auf die Notwendigkeit zusätzlicher genetischer Veränderungen hinweist. N2 - The c-Jun N-terminal kinases (JNKs) (also known as stress-activated protein kinases, SAPKs), members of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) family, regulate gene expression in response to a variety of physiological and environmental stimuli. Gene knockout experiments and the use of dominant interfering mutants have pointed to a role of SAPK/JNKs in the processes of cell differentiation, survival and/or apoptosis as well as oncogenic transformation. Direct analysis of the transforming potential of JNKs has been hampered so far by the lack of constitutively active forms of these kinases. Recently such mutants have become available by fusion of the MAPK with its direct upstream activator kinase. In the context of this PhD thesis a constitutively active SAPKb-MKK7 hybrid protein was generated and used to characterize the transforming potential of activated SAPKb. Inducible expression of SAPKb-MKK7 caused morphological transformation of NIH 3T3 fibroblasts. Additionally, these cells formed small foci of transformed cells, grew anchorage-independent in soft agar and similar to oncogenic Ras and Raf, expression of activated SAPKb resulted in the degradation of F-actin stress fibers. Furthermore, expression of SAPKb-MKK7 increased proliferation rates of NIH 3T3 cells. However, in contrast to the classical oncogenes like ras and raf, SAPKb-MKK7 is not able to selectively support the survival of the transformed cells. Therefore, our data suggest that constitutive SAPK/JNK activation elicits major aspects of cellular transformation, but is unable to induce the complete set of changes which are required to establish the fully transformed phenotype. We have also begun to directly determine the tumorigenic potential of SAPKb-MKK7 in the nude mouse. Injection of SAPKb-MKK7 expressing fibroblasts resulted in the establishement of a well defined fibrosarcoma, albeit at much later timepoints than in the case of v-Raf transformed cells. The long latency with which they develop tumors suggests the requirement of further genetic alterations. Thus expression of activated SAPK/JNK is sufficient to initiate tumor development in vivo. KW - MAP-Kinase KW - Zelldifferenzierung KW - SAPK KW - JNK KW - Signaltransduktion KW - Transformation KW - Fibroblasten KW - SAPK KW - JNK KW - signal transduction KW - transformation KW - fibroblasts Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4158 ER - TY - THES A1 - Reichel, Sonja T1 - Klonierung der cDNA des Protein A Kinase-Adaptor-Proteins-2 und Untersuchungen zur Regulation seiner mRNA in humanen fötalen Osteoblasten T1 - Clonig of the cDNA of Protein A Kinase-Adapter Protein-2 and Examination of the Regulation of its mRNA N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die vollständige cDNA-Sequenz des Proteinkinase A-Ankerproteins-2 (AKAP-2, 7,5kB) ermittelt. Zu diesem neuen humanen Gen sind bis dato außer einem unvollständigem Datenbankeintrag noch keine experimentellen Daten zur cDNA, mRNA oder zum Protein veröffentlicht. Mittels Northernblot wurde die Regulation der Expression der mRNA von AKAP-2 in humanem osteoblastären hFOB-Zellen sowie ihre Expression in unterschiedlichen Geweben untersucht: In hFOB-Zellen wird die mRNA bereits basal in geringem Maße exprimiert und kann schnell und transient induziert werden.Das Maximum der Induktion sowohl durch TNFa als auch durch TPA erfolgt nach fünf Stunde, v.a. durch veränderte Transskription. Dies entspricht der Kinetik eines sogenannten schnell induzierbaren Gens. Beide Stoffe wirken u.a. über den Transkriptionsfaktor NFkB. Andere Faktoren wie die Phosphatidylinositol-3-Kinase und cAMP dagegen scheinen keine Relevanz für die Expressionsinduktion der mRNA zu haben. TNFa spielt im Knochenstoffwechsel eine wichtige Rolle bei Osteoklastenaktivierung, Knochenresorption und bei der Entstehung von Osteoporose. AKAP-2 wird in Osteoblasten, aber auch in undifferenzierten monozytären Zellen, Vorläufern von Osteoklasten, exprimiert. AKAP-2 könnte also bei der interzellulären Kommunikation zwischen Osteoblasten und Osteoklasten von Bedeutung sein. Bisher wurden Vertreter der Familie der Proteinkinase A-Ankerproteine noch nicht in Knochengewebe nachgewiesen. Ihre Bedeutung für die Organfunktion ist vielfältig. Auf zellulärem Niveau kommt es durch Bindung der PKA in der Nähe der Adenylatzyklase und des hier entstehenden cAMP zu einer lokal erhöhten Wirkung von cAMP-vermittelten Signalen. Da die Expression der mRNA von AKAP-2 selbst unabhängig von cAMP ist, scheint es sich hier um eine Kreuzungsstelle verschiedener Signaltransduktionswege zu handeln, bei der von TNFa aktivierte zweite Botenstoffe bzw. Transkriptionsfaktoren (z.B. NFkB), die PKC und möglicherweise weitere, hier jedoch nicht weiter identifizierte Zytokine und Wachstumsfaktoren zur vermehrten Bereitstellung eines Ankerproteins der PKA führen. N2 - Here we describe for the first time identification of the complete sequence of the cDNA of the protein A kinase adaptor protein 2 (AKAP-2, 7,5kB). Exept an uncomplete database entry no experimental data exist to date for the cDNA, mRNA or for coded protein of this new human gene. By northern blot analyses we examined the regulation of the mRNA expression of AKAP-2 in the human foetal osteoblast cell-line hFOB and the expression in different tissues: In hFOB-cells the basal expression level of the mRNA which can be rapidliy and transiently induced is small. Maximal induction by TNFa and TPA is found after 5 hours, most by enhanced transcription. Both TNFa and TPA use NFkB dependent and independent signalling mechanisms. Phosphatidylinositol-3-kinase and cAMP are likely not to have any effect on the mRNA level. TNFa plays an important role in osteoclast activation, bone resorption and osteoporose development. The mRNA of AKAP2 is expressed in osteoblasts but also in undifferentiated monocytes, precursors of osteoclasts. AKAP-2 could be important for cell-cell-communication between osteoblasts and osteoclasts. This is the first identification of a member of the AKAP-familiy in bone. AKAPs have many roles in organ function. By collocation of PKA and adenylatcyclase the effect the produced cAMP can locally be augmented. As the expression of the mRNA of AKAP-2 seems to be independently of cAMP, it may be a cross-link between different signalling pathways: TNFa activated second messengers or transcription factors (i.e. NFkB), the PKC and other not yet identified cytokines lead to an augmented expression of a protein A kinase adaptor protein. KW - Proteinkinase A-Ankerprotein 2 KW - TNFa KW - TPA KW - Osteoblast KW - Regulation von mRNA KW - Signaltransduktion KW - protein A kinase adaptor protein 2 KW - TNFa KW - TPA KW - osteoblast KW - regulation of mRNA KW - signal transduction Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1274 ER - TY - THES A1 - Poppe, Heiko Anton T1 - Bestimmung der Substrat- und Inhibitorspezifität von Phosphodiesterasen mittels Mikrokaloriemetrie T1 - Phosphodiesterase activity and specificity measured using microcalorimetry N2 - Neben den cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkanäle CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor“ Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinität für ihr Zielprotein, über ihre Hydrolysestabilität gegenüber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am häufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln häufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Veränderungen der intrazellulären cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP – eine unerwünschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Domänen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivität, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des für ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates. N2 - cAMP and cGMP are critical second messengers that regulate multiple targets including different cAMP/cGMP-dependent protein kinases (PKA/PKGs), exchange proteins directly activated by cAMP (Epacs), phosphodiesterases (PDEs) and cyclic nucleotide-gated ion channels (CNGs). Second and third generation cyclic nucleotide analogs are widely used to elucidate specificity of cellular signaling, mediated by these target proteins. However, the selectivity and stability of these analogs need to be fully understood in order to properly interpret results and rigorously assess the mechanisms by which these analogs work in the cell. To better understand the selectivity and cross-reactivity of these analogs I measured the activation or inhibitory activity of 13 commonly-used cyclic nucleotide analogs 8 different PDEs. To measure their stability to hydrolysis I utilized isothermal microcalorimetry, a method that allows to evaluate whether or not an analog can function as a substrate or inhibitor for PDEs. I demonstrate that indeed some of these analogs can be hydrolyzed by multiple PDEs and others are competitive inhibitors. Herein I provide Ki data for all of the non-hydrolyzable analogs and Km and Vmax values for all of the hydrolyzable analogs. Each of these values, as well as their mode of inhibition can be determined in a single experiment. The data strongly implied that several of these analogs might, in addition to their primary effects, also cause elevation of cAMP or cGMP indirectly by inhibiting PDEs in the cell. Such an effect could of course cloud interpretation of the use of these analogs. Similarly, those that are PDE substrates also might have their duration of action substantially reduced. To illustrate this point we show that Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS, a highly specific non-hydrolyzable Epac activator in vitro, can under certain conditions enhance cGMP/PKG and cAMP/PKA signaling pathways in intact platelets. Specifically we found enhanced VASP phosphorylation at both PKA and PKG phosphorylation sites after the addition of Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS. These data indicate that this “selective Epac activator” is able to indirectly activate the cAMP/PKA and cGMP/PKG signalling pathways presumably through inhibition of platelet PDE5 and/or PDE3. The data together allow to provide recommendations for how best to probe the different cyclic nucleotide signalling pathways using cyclic nucleotide analogs. In summary, the data provide evidence that most cAMP and cGMP analogs have multiple targets. Therefore, interpretation of any effects these analogs have in cells should take into consideration their possible cross-target reactivities. KW - Cyclisches Nucleotid Phosphodiesterase <3 KW - 5-> KW - Proteinkinase A KW - Hydrolyse KW - Mikrokalorimetrie KW - Cyclo-GMP KW - Cyclo-GMP-Derivate KW - Dissoziationskonstante KW - Enzymkinetik KW - Inhibition KW - Cyclo-AMP KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyt KW - Immunoblot KW - Stickst KW - Proteinkinase G KW - Adenylatcyclase KW - Epac KW - Linear Mixed Inhibition KW - GAF Domaine KW - Proteinkinase G KW - Adenylylcyclase KW - Epac KW - Linear mixed inhibition KW - Gaf domaine Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34477 ER - TY - THES A1 - Philipp, Melanie T1 - Die Rolle von alpha2-adrenergen Rezeptoren während der Embryonalentwicklung der Maus T1 - The role of alpha2-adrenergic receptors during murine development N2 - Alpha2-Rezeptoren, die weiter in alpha2A, alpha2B und alpha2C unterteilt werden, gehören zur Gruppe der adrenergen Rezeptoren innerhalb der Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Sie sind maßgeblich an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Vieles, was heute über alpha2-Rezeptoren bekannt ist, wurde mithilfe von alpha2-defizienten Mäusen, sogenannten „Knock-Out“-Mäusen (KO) herausgefunden, von denen bislang drei Einzel-KOs und der Doppel-KO der Subtypen A und C existieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch Kreuzung der vorhandenen KO-Linien Mauslinien generiert, die defizient für alpha2A und alpha2B, für alpha2B und alpha2C oder alle drei alpha2-Rezeptoren sind. Während alpha2AB-KO-Mäuse ungefähr entsprechend der Mendelschen Verteilung geboren wurden, zeigte sich, dass alpha2BC-KO-Mäuse teilweise und alpha2ABC-KO-Mäuse sogar komplett embryonal letal waren. Die morphologischen Unter-suchungen legten den Zeitpunkt der embryonalen Letalität der alpha2ABC-KO-Mäuse auf den Tag E10,5 der Embryonalentwicklung fest und konnten zeigen, dass diese Letalität in einem Vaskularisierungsdefekt innerhalb der extraembryonalen Organe Plazenta und Dottersack begründet lag. Diese Organe stellen die Versorgung des Embryos mit Nährstoffen und Sauerstoff sicher und sorgen somit für dessen Entwicklung. Durch RT-PCR-Experimente konnte die mRNS für alle drei alpha2-Rezeptorsubtypen an Tag E10,5 sowohl im Embryo als auch in Plazenta und Dottersack nachgewiesen werden. Autoradiographische Experimente und Radioligandenbindungsstudien an Plazenten machten deutlich, dass der Großteil an alpha2-Rezeptoren im embryonalen Teil der Plazenta exprimiert wird, nämlich in den Riesenzellen und in der sich daran anschließenden Spongiotrophoblastschicht, und dass hierbei alpha2-Rezeptoren vom B-Subtyp vorherrschen. In den genannten Zellen konnte mittels Immunhistochemie eine alpha2-Rezeptor-vermittelte Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 gezeigt werden, die auch in kultivierten WT-Dottersäcken beobachtet werden konnte. Unter basalen Bedingungen zeigte sich, dass die ERK1/2-Phosphorylierung in Gewebe von alpha2ABC-KO-Embryonen drastisch vermindert war, während andere Signalwege, die von alpha2-Rezeptoren angestoßen werden können, nicht beeinträchtigt waren. Versuche in einem Zellkulturmodell und mit kultivierten WT-Dottersäcken ergaben eine physiologisch relevante Wechselwirkung zwischen dem alpha2B-Rezeptor und dem PDGFbeta-Rezeptor, einer Rezeptortyrosinkinase, als deren Mechanismus sich in Co-Kultur-Experimenten mit alpha2B-Rezeptor-transfizierten Zellen und alpha2ABC-defizienten Dottersäcken die Transaktivierung von Rezeptortyrosinkinasen herausstellte. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass a2-Rezeptoren bei der Maus über eine Transaktivierung von ERK1/2 die Vaskularisierung der Plazenta und des Dottersacks bedingen und damit eine normale Embryonalentwicklung sicherstellen. N2 - alpha2-Receptors belong to the familiy of adrenergic receptors within the superfamily of G-protein coupled receptors. They are involved in the regulation of many physiological processes. Most of the known functions have been investigated using mice deficient in alpha2-receptors. To date, single knockout mouse lines exist for each subtype of alpha2-receptors and also the alpha2AC-knockout. In this study the remaining double knockouts and the triple-knockout were generated by crossing the existing knockout mice. While mice deficient for the alpha2A- and the alpha2B-receptor were born with the expected Mendelian ratio, embryonic lethality occurred in the alpha2BC-knockout mice, and this was complete in mice lacking all three alpha2-receptors. Morphological examinations revealed that alpha2ABC-mice die around midgestation because of a defect in vascularisation in the extra-embryonic organs placenta and yolk sac. These are the organs which support the embryo with nutrients and oxygen and are therefore essential for embryonic development. RT-PCR-experiments detected mRNA for all three subtypes of alpha2-receptors on day E10.5 of embryonic development in embryo, placenta and yolk sac. Autoradiography and radioligand binding studies showed that most of the alpha2-receptors are expressed in the embryonic part of the placenta, in particular in giant cells and the underlying spongiotrophoblast layer. The alpha2B-receptor is the main subtype in these tissues. Immunohistochemistry of stimulated placenta slices demonstrated alpha2-receptor mediated phosphorylation of the MAP-kinase ERK1/2, which was also observed in cultivated yolk sacs of WT-mice. In freshly prepared tissue of alpha2ABC-knockout embryos ERK1/2-phosphorylation was dramatically decreased, while other signaling pathways of alpha2-receptors were unaffected. Experiments using cell culture and cultivated yolk sacs of WT-mice revealed a physiologically relevant interaction between alpha2B-receptors and PDGFbeta-receptors, a receptor tyrosine kinase. The mechanism of this interaction was illucidated in co-culture experiments of alpha2B-receptor transfected cells and alpha2 ABC-knockout yolk sacs as a G-protein coupled receptor initiated transactivation of receptor tyrosine kinases. In this study it was demonstrated that in mice alpha2-receptors are responsible for the vascularisation of placenta and yolk sac by transactivation of ERK1/2, and that they are, therefore, necessary for proper embryonic development. KW - Maus KW - Embryonalentwicklung KW - Alpha-2-Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - MAP-Kinase KW - alpha2-adrenerge Rezeptoren KW - Plazenta KW - MAP-Kinase KW - Gefäßentwicklung KW - alpha2-adrenergic receptors KW - placenta KW - Map-kinase KW - vasculogenesis Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5186 ER - TY - THES A1 - Peterson, Lisa T1 - CEACAM3-mediated phagocytosis of human-specific bacterial pathogens involves the adaptor molecule Nck N2 - Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAMs) are exploited by human-specific pathogens to anchor themselves to or invade host cells. Interestingly, human granulocytes express a specific isoform, CEACAM3, that can direct efficient, opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria, Moraxella and Haemophilus species. As opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria depends on Src-family protein tyrosine kinase (PTK) phosphorylation of the CEACAM3 cytoplasmic domain, we hypothesized that an SH2-containing protein might be involved in CEACAM3-initiated, phagocytosis-promoting signals. Accordingly, we screened glutathione-S-transferase (GST) fusion proteins containing SH2 domains derived from a panel of signaling and adapter molecules for their ability to associate with CEACAM3. In vitro pull-down assays demonstrated that the SH2 domain of the adapter molecule Nck (GST-Nck SH2), but not other SH2 domains such as the Grb2 SH2 domain, interact with CEACAM3 in a phosphotyrosine-dependent manner. Either deletion of the cytoplasmic tail of CEACAM3, or point-mutation of a critical arginine residue in the SH2 domain of Nck (GST-NckSH2R308K) that disrupts phosphotyrosine binding, both abolished CEACAM3-Nck-SH2 interaction. Upon infection of human cells with CEACAM-binding Neisseria, full-length Nck comprising an SH2 and three SH3 domains co-localized with tyrosine phosphorylated CEACAM3 and associated bacteria as analyzed by immunofluorescence staining and confocal microscopy. In addition, Nck could be detected in CEACAM3 immunoprecipitates confirming the interaction in vivo. Importantly, overexpression of a GFP-fusion protein of the isolated Nck SH2 domain (GFP-Nck-SH2), but not GFP or GFP-Nck SH2 R308K reduced CEACAM3-mediated phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria suggesting that the adaptor molecule Nck plays an important role in CEACAM3-initiated signaling leading to internalization and elimination of human-specific pathogens. KW - Adaptorproteine KW - Signaltransduktion KW - Phagozytose KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Carcino-embryonales Antigen KW - Angeborene Immunität KW - Src-Proteine KW - Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen KW - CEACAM3 KW - Nck KW - ITAM KW - CEACAM3 KW - Nck KW - ITAM KW - gonococci KW - phagocytosis Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46378 ER - TY - THES A1 - Pei, Geng T1 - The Role of Raf-mediated Signalling Pathways for Motoneuron T1 - Die Rolle von Raf-vermittelten Signalwegen bei Entwicklung und Überleben von Motoneuronen N2 - The transmission of proliferative and developmental signals from activated cell-surface receptors to initiation of cellular responses in the nucleus is synergically controlled by the coordinated action of a diverse set of intracellular signalling proteins. The Ras/Raf/MEK/MAPK signalling pathway has been shown to control the expression of genes which are crucial for the physiological regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Within this signalling cascade, the Raf protein family of serine/threonine kinases serves as a central intermediate which connects to many of other signal transduction pathways. To elucidate the signalling functions of the different Raf kinases in motoneurons during development, the expression, distribution and subcellular localization of Rafs in the spinal cord and the facial nucleus in brainstem of mice at various embryonic and postnatal stages were investigated. Moreover, we have investigated the intracellular redistribution of Raf molecules in isolated motoneurons from 13 or 14 day old mouse embryos, after addition or withdrawal of neurotrophic factors to induce Raf kinases activation in vitro. Furthermore, in order to investigate the potential anti-apoptotic function of Raf kinases on motoneurons, we isolated motoneurons from B-raf-/- and c-raf-1-/- mouse embryos and analysed the survival and differentiation effects of neurotrophic factors in motoneurons lacking B-Raf and c-Raf-1. We provide evidence here that all three Raf kinases are expressed in mouse spinal motoneurons. Their expression increases during the period of naturally occurring cell death of motoneurons. In sections of embryonic and postnatal spinal cord, motoneurons express exclusively B-Raf and c-Raf-1, but not A-Raf, and subcellularly Raf kinases are obviously colocalized with mitochondria. In isolated motoneurons, most of the B-Raf or c-Raf-1 immunoreactivity is located in the perinuclear space but also in the nucleus, especially after activation by addition of CNTF and BDNF in vitro. We found that c-Raf-1 translocation from the cytosol into the nucleus of motoneurons after its activation by neurotrophic factors is a distinct event. As a central finding of our study, we observed that the viability of isolated motoneurons from B-raf but not c-raf-1 knockout mice is lost even in the presence of CNTF and other neurotrophic factors. This indicates that B-Raf but not c-Raf-1, which is still present in B-raf deficient motoneurons, plays a crucial role in mediating the survival effect of neurotrophic factors during development. In order to prove that B-Raf is an essential player in this scenario, we have re-expressed B-Raf in mutant sensory and motor neurons by transfection. The motoneurons and the sensory neurons from B-raf knockout mouse which were transfected with exogenous B-raf gene revealed the same viability in the presence of neurotrophic factors as primary neurons from wild-type mice. Our results suggest that Raf kinases have important signalling functions in motoneurons in mouse CNS. In vitro, activation causes redistribution of Raf protein kinases, particularly for c-Raf-1, from motoneuronal cytoplasm into the nucleus. This redistribution of c-Raf-1, however, is not necessary for the survival effect of neurotrophic factors, given that B-raf-/- motor and sensory neurons can not survive despite the presence of c-Raf-1. We hypothesize that c-Raf-1 nuclear translocation may play a direct role in transcriptional regulation as a consequence of neurotrophic factor induced phosphorylation and activation of c-Raf-1 in motoneurons. Moreover, the identification of target genes for nuclear translocated c-Raf-1 and of specific cellular functions initiated by this mechanism awaits its characterization. N2 - Die Vermittlung von wachstumsfördernden und entwicklungsspezifischen Signalen von aktivierten Zelloberflächenrezeptoren führt zur Initiation von Transkriptionsprogrammen im Zellkern, die durch das koodinierte Zusammenwirken von intrazellulären Signalproteinen synergistisch gesteuert werden. Der Ras/Raf/MEK/MAPK-Weg steuert die Expression von Genen für die physiologische Regulation der Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose. Innerhalb dieser Signalkaskade stellen die Serin/Threonin Kinasen der Raf Familie eine zentrale Zwischenstufe dar, die Verbindungen zu vielen anderen Signaltransduktionswegen herstellt. Um die Funktionen der verschiedenen Raf-Kinasen in Motoneuronen während der Entwicklung aufzuklären, wurden die Expression, Verteilung und subzelluläre Lokalisation der Raf-Isoformen in spinalen Motoneuronen und im Nucleus Fazialis der Maus während der Embryonalentwicklung und postnatal untersucht. Desweiteren haben wir die intrazelluläre Umverteilung der Raf-Moleküle in isolierten Motoneuronen von 13 oder 14 Tage alten Mäusembryonen untersucht. Um die Rolle der Raf-Kinasen nach Zugabe oder Entzug von neurotrophen Faktoren bei Motoneuronen zu untersuchen, analysierten wir die Überlebens-und Differenzierungseffekte von neurotrophen Faktoren bei Motoneuronen von B-raf oder c-raf-1 defizienten Mäusen. Wir zeigen in dieser Arbeit, daß alle drei Raf-Kinasen in spinalen Motoneuronen der Mäuse exprimiert sind. Ihre Expression steigt während der Zeit des natürlich auftretenden Zelltods. An Schnitten von embryonalem und postnatalem Rückenmark exprimieren Motoneurone ausschließlich B-Raf and c-Raf-1, aber nicht A-Raf. Raf-Kinasen sind offensichtlich an Mitochondrien lokalisiert. In isolierten Motoneuronen findet man B-Raf und c-Raf-1, Immunreaktivität vor allem im perinukleären Bereich, aber auch im Zellkern, vor allem nach Aktivierung durch Zugabe von CNTF und BDNF in vitro. Wir haben gefunden, daß die Translokation von c-Raf-1 vom Zytosol in den Nukleus von Motoneuronen nach Aktivierung durch neurotrophe Faktoren ein spezifischer Vorgang ist. Als zentralen Befund dieser Arbeit beobachteten wir, daß Motoneurone von B-raf-/-, aber nicht von c-raf-1-/-, Embryonen nicht lebensfähig sind, auch nicht in Gegenwart von CNTF oder anderer neurotropher Faktoren. Dies bedeutet, daß B-Raf und nicht c-Raf-1, welches noch immer in B-raf defizienten Motoneuronen präsent ist, eine entscheidende Rolle als Vermitter des Überlebenseffektes von neurotrophen Faktoren spielt. Um zu beweisen, daß B-Raf hierbei eine essentielle Komponente darstellt, haben wir in B-raf defizienten sensorischen und Motoneuronen B-Raf durch Transfektion exprimiert. Erfolgreich mit B-raf Plasmid transfizierte B-raf-/- sensorische und Motoneurone zeigten dieselbe Überlebensfähigkeit in Gegenwart von neurotrophen Faktoren wie primäre Neurone von Wildtyp-Mäusen. Diese Arbeit zeigt daher, daß Raf-Kinasen wichtige Funktionen in Motoneuronen der Maus haben. Die Aktivierung von Raf-Kinasen in vitro führt zur Änderung ihrer subzellulären Verteilung, vor allem von c-Raf-1 vom Zytoplasma in den Kern. Diese Umverteilung von c-Raf-1 ist jedoch nicht notwendig für den Überlebenseffekt von neurotrophen Faktoren, vor allem, wenn man in Betracht zieht, daß B-raf defiziente sensorische und Motoneuronen trotz der Gegenwart von c-Raf-1 nicht überleben. Wir nehmen an, daß die nukleäre Translokation von c-Raf-1 eine direkte Rolle bei der transkriptionellen Regulation durch neurotrophe Faktoren spielt. Die Indentifizierung von c-Raf-1 regulierten Zielgenen und von durch diese beeinflussten zellulären Funktionen ist eine Aufgabe für die Zukunft. KW - Maus KW - Motoneuron KW - Zelldifferenzierung KW - Raf KW - Signaltransduktion KW - Raf-Kinasen KW - Motoneuron KW - Raf-Kinase KW - Zentrales Nervensystem KW - motoneuron KW - Raf KW - CNS Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1846 ER - TY - THES A1 - Ok [geb. Hofmann], Claudia Barbara T1 - Isoform-spezifische Analyse der PI3-Kinase (Klasse I) im Multiplen Myelom T1 - Isoform-specific analysis of the PI3-kinase (class I) in multiple myeloma N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist eine unheilbare Erkrankung, die aus einer klonalen Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark hervorgeht. Dabei liegt ein komplexes Signalnetzwerk vor, das zum Überleben und Wachstum der MM-Zellen führt. Das MM ist durch eine enorme genetische und phänotypische Heterogenität gekennzeichnet. Die konstitutive Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs spielt bei ungefähr der Hälfte der Patienten mit MM eine wichtige Rolle für das Überleben der MM-Zellen und ist daher ein potentieller therapeutischer Ansatzpunkt. Isoform-spezifische Untersuchungen der katalytischen Untereinheiten der Klasse I-PI3K (p110α, p110β, p110γ, p110δ) sollten zur Erkenntnis führen, welche dieser Isoformen für das MM Zellüberleben wichtig sind, um spezifischere Behandlungen mit möglichst geringen Nebenwirkungen zu erlauben. Dafür wurden zunächst Isoform-spezifische Knockdown-Experimente mit MM Zelllinien durchgeführt und sowohl deren Überleben als auch die Aktivierung der nachgeschalteten Komponenten im PI3K Signalweg untersucht. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden sowohl MM Zelllinien als auch Primärzellen mit Isoform-spezifischen PI3K-Inhibitoren behandelt (BYL 719 für p110α, TGX 221 für p110β, CAY10505 für p110γ und CAL 101 für p110δ) und in gleicher Weise untersucht. In beiden Versuchsansätzen stellte sich die katalytische Untereinheit p110α als wichtigste Isoform für das Überleben von MM Zellen mit konstitutiv phosphoryliertem Akt Signal heraus. Weder der Knockdown noch die pharmakologische Inhibition der anderen drei Isoformen (p110β, p110γ, p110δ) führten in MM-Zelllinien zur Beeinträchtigung des Zellüberlebens. Auch reagierten die Primärzellen von MM Patienten größtenteils nicht mit Apoptose auf eine Behandlung mit TGX 221, CAY10505 oder CAL 101. Aufbauend auf der postulierten Bedeutung von p110α, wurde der dafür spezifische Inhibitor BYL 719 mit bereits klinisch etablierten Therapeutika in Kombination verwendet, woraus eine im Vergleich zur Einzelbehandlung verstärkte Apoptose resultierte. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass PI3K/p110α eine therapeutisch nutzbare Zielstruktur zur Behandlung des Multiplen Myeloms darstellt. Daher scheinen weitergehende prä-klinische Studien mit p110α Inhibitoren erfolgversprechend. N2 - Multiple myeloma (MM) is an incurable disease, which results from clonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow. Thereby, a complex signaling network regulates the survival and growth of MM cells. This malignant hematological disease is characterized by profound genetic and phenotypical heterogeneity. The PI3K/Akt signaling pathway is constitutively activated in about 50% of patients with MM and therefore plays an important role for the survival of MM cells. Accordingly, treatment of MM patients with the most isoform-specific drugs may be a desirable goal to achieve therapeutic utility with a minimum of undesired side effects. Therefore, an isoform-specific analysis of the catalytic subunits of the PI3K class I (p110α, p110β, p110γ, p110δ) was undertaken to reveal their individual role(s) for MM cell survival. Initially, isoform-specific knockdown experiments in MM cell lines were performed to assess their survival and the activation states of down-stream components of the PI3K pathway. These experiments were then complemented using isoform-specific pharmacological inhibitors (BYL 719 for p110α, TGX 221 for p110β, CAY10505 for p110γ and CAL 101 for p110δ) in MM cells and primary MM cells. Cell lines with constitutively phosphorylated Akt reduced this signal after p110α knockdown or pharmacologic inhibition and these treatments also affected their survival. Conversely, neither knockdown nor drug-mediated inhibition of any of the other three p110 isoforms influenced MM cell survival. In addition, whereas most primary MM samples were sensitive against BYL-719 only a few samples displayed apoptotic effects when treated with TGX 221, CAY10505 or CAL-101. These results showed that p110α is the major contributor of PI3K-mediated cell survival, and therefore the inhibitor BYL 719 was tested in combination with clinically relevant therapeutics for MM. Such treatment led to increased rates of apoptosis in MM cell lines in comparison to the respective single drug treatments. Taken together, we assume that PI3K/p110α is a therapeutically valuable target structure for the treatment of MM that would warrant more extensive pre-clinical studies. KW - Phosphatidylinositolkinase KW - Isomer KW - Signaltransduktion KW - Plasmozytom KW - p110alpha KW - BYL-719 KW - Carfilzomib KW - Melphalan KW - Lenalidomid KW - Pomalidomid KW - Bortezomib KW - synergistische Effekte KW - Phospho-Akt KW - Zellüberleben KW - pi3kinase KW - Multiples Myelom KW - Knochenmark KW - Isoform Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108466 ER - TY - THES A1 - Neufeld, Bernd T1 - Neue Interaktionspartner der MAPKAP-Kinasen 3pK und MK2 T1 - New interaction partners of the MAPKAP-kinases 3pK and MK2 N2 - Auf der Suche nach physiologischen Substraten der MAPK-aktivierten Proteinkinasen (MAPKAP-Kinasen), 3pK und MAPKAP-K2 (MK2), wurden Mitglieder eines Säuger-Polycomb-Komplexes, HPH2 und das Protoonkoprotein Bmi1, als Interaktionspartner identifiziert. Proteine aus der Polycomb-Gruppe (PcG) sind dafür bekannt, multimere, Chromatin-assoziierte Proteinkomplexe zu bilden. Diese wirken als transkriptionelle Repressoren und spielen als solche eine wichtige Rolle sowohl in der Regulation von Entwicklungsprozessen als auch in der Kontrolle der zellulären Proliferation. HPH2 bindet im Hefe two-hybrid-System sowohl an 3pK als auch an MK2. Die Kinasen coimmunpräzipitieren auch mit den PcG-Proteinen. Weiterhin wurde festgestellt, daß nicht aktivierte und DNA-assoziierte 3pK, ähnlich wie Bmi1, in einem in vivo Repressionsassay als transkriptioneller Repressor wirkt. Dies unterstellt, daß 3pK, wie Bmi1, fähig sein muß, andere PcG-Proteine an das Zielgen zu rekrutieren, wo sich dann ein biologisch funktioneller Repressionskomplex rekonstituiert. Bmi1 ist ein Phosphoprotein und beide MAPKAP-Kinasen konnten in dieser Arbeit als in vitro Bmi1-Kinasen identifiziert werden. Da der Phosphorylierungsstatus von Bmi1 mit seiner Dissoziation und der anderer PcG-Proteine vom Chromatin korreliert, könnten die MAPKAP-Kinasen Regulatoren einer phosphorylierungs-abhängigen PcG-Komplex/Chromatin-Interaktion sein. 3pK und MK2 wurden hier als die ersten Kinasen identifiziert, die in Assoziation mit Proteinen von PcG-Komplexen vorliegen, was ein funktionelles Zusammenwirken von MAPK-Signaltransduktionsnetzwerk und der Regulation der PcG-Funktion nahe legt. Ein weiterer durch das two-hybrid-System und Coimmunpräzipitationsexperimente identifizierter Interaktionspartner beider hier analysierter MAPKAP-Kinasen ist der basische Helix-Loop-Helix- (bHLH) Transkriptionsfaktor E47. Dieses E2A-kodierte Protein bindet als Homo- bzw. Heterodimer mit gewebespezifischen bHLH-Proteinen an sogenannte E-Box-DNA-Motive und ist so in die Regulation gewebespezifischer Genexpression und Zelldifferenzierung involviert. In dieser Arbeit konnten 3pK und MK2 als in vitro Kinasen des in Zellen phosphoryliert vorliegenden Transkriptionsfaktors identifiziert werden. Weiterhin führte die transiente Expression jeder dieser Kinasen in einem Reportergenassay mit einem E-Box-Promotorkonstrukt zu einer Repression der transkriptionellen Aktivität von E47. Der bHLH-Transkriptionsfaktor E47 interagiert also mit beiden MAPKAP-Kinasen, 3pK und MK2, was die Kinasen als neu identifizierte Regulatoren der E47-abhängigen Genexpression präsentiert. Mit dieser Arbeit ist ein erster Aufschluß der physiologischen Aktivität der MAPKAP-Kinasen 3pK und MK2 als transkriptionelle Regulatoren gelungen. N2 - SUMMARY In a search for physiological substrates for the MAPK-activated protein kinases (MAPKAP kinases), 3pK and MAPKAPK-2 (MK2), constituents of a mammalian polycomb complex, HPH2 and the proto-oncoprotein Bmi1 were identified as interaction partners. Polycomb group (PcG) proteins are characterised to form large multimeric, chromatin-associated protein complexes with repressive transcriptional function. PcG complexes have an important role in the regulation of developmental processes and in the control of cellular proliferation. HPH2 binds to either kinase in a yeast two-hybrid assay and both, 3pK and MK2 are shown here to coimmunoprecipitate with HPH2 and Bmi1 or Bmi1 from mammalian cell lysates, respectively. Further, non-activated and DNA-bound 3pK could be identified as a transcriptional repressor of a chromatin-embedded gene in an artificial repression assay similar to the function of Bmi1. This suggests, that non-activated and DNA-bound 3pK, like Bmi1, must be able to recruit other PcG proteins to the target gene to reconstitute a functional repressive complex. Bmi1 is a phosphoprotein and both, 3pK and MK2 were identified in this paper to be in vitro Bmi1-kinases. Since the Bmi1 phosphorylation status was shown to be correlated with its dissociation from chromatin, it is likely that the MAPKAP kinases might be regulators of phosphorylation-dependent PcG-complex/chromatin interaction. In summary, the MAPK-activated protein kinases 3pK and MK2 are the first kinases identified to be assembled with members of PcG-protein complexes, suggesting a link of the MAPK signalling network to the regulation of PcG complex function. Another new interaction partner of both MAPKAP kinases which was identified by means of the two-hybrid system and coimmunoprecipitation experiments is the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor E47. This E2A-encoded protein is known to be involved in the regulation of tissue-specific gene expression and cell differentiation. E47 is a phosphoprotein, and 3pK and MK2 were identified as E47-kinases in vitro. Further, expression of either kinase results in a repression of the transcriptional activity of overexpressed E47 in transient reporter gene assays with an E-box containing promoter construct. In summary, the MAPK-activated protein kinases 3pK and MK2 were identified to be assembled with the bHLH transcription factor E47 suggesting that these kinases are regulators of E47 activity and E47 dependent gene expression. These results provide first evidence for the physiological function of the MAPKAP kinases 3pK and MK2 as transcriptional regulators. KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Molekularbiologie KW - intrazelluläre Signaltransduktion KW - MAPK-Signalwege KW - MAPKAP-Kinase KW - 3pK KW - MK2 KW - Polycomb KW - HPH2 KW - Bmi1 KW - Molecular biology KW - intracellular signal transduction KW - MAPK-Signalwege KW - MAPKAP kinase KW - 3pK KW - MK2 KW - Polycomb KW - HPH2 KW - Bmi1 KW - bHLH transcription factor Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1765 ER - TY - THES A1 - Nething, Katja T1 - Beteiligung der Plasmamembran Ca2+-ATPase an Wachstumsregulation und Signaltransduktion im Überexpressionsmodell und im Myokard transgener Ratten T1 - Role of the plasma membrane calcium ATPase in growth regulation and signal transduction in the myocardium of transgenic rats N2 - Einleitung: Die Plasmamembran Ca2+-ATPase (PMCA) ist ein ubiquitär in eukaryonten Zellen vorkommendes Enzym, das Kalziumionen aus der Zelle transportiert. In Myokardzellen ist ihre Funktion trotz eingehender biochemischer Charakterisierung unklar. Die frühere Hypothese einer Zuständigkeit für die Feinabstimmung der [Ca2+]iz wurde in neuerer Zeit ergänzt durch die vermutete Rolle der PMCA in der Regulation von Zellparametern wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Unterstützt wird dies durch die Lokalisation der ATPase in Caveolae, spezifischen Membraninvaginationen, in denen wichtige Zentren der zellulären Signalverarbeitung gesehen werden. Ziel: Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion der Plasmamembran Ca2+-ATPase, insbesondere eine mögliche Beteiligung des Enzyms an der Übermittlung zellulärer Signale im Rahmen von Apoptose und Wachstum, weiter aufgeklärt werden. Methoden: Die Experimente zur Apoptose in dUTP-nick-end-labeling (TUNEL)-Technik wurden zum einen an einer Myoblastenlinie, zum anderen an transgenen Ratten mit hPMCA 4CI-Überexpression durchgeführt. Die Proteinsyntheseraten neonataler Kardiomyozyten wildtypischer bzw. überexprimierender Tiere mittels 3H-Leucin-Inkorporation in Ruhe und unter Stimulation mit hypertrophieinduzierenden Substanzen wurden verglichen. Ergänzend zu diesen funktionellen Versuchen fanden Immunfluoreszenzanalysen an neonatalen Kardiomyozyten der hPMCA 4CI-überexprimierenden Rattenlinie 1142 statt. Ergebnisse: In der L6-Myoblastenlinie beeinflußte die Überexpression der Plasmamembran Ca2+-ATPase die Apoptose nicht, ebenso in ruhenden neonatalen Kardiomyozyten. Phenylephrin und Isoproterenol steigerten die Syntheseaktivität in den überexprimierenden Herzmuskelzellen signifikant gegenüber Wildtypkontrollen. NOS-Inhibition mit L-NAME induzierte in den neonatalen Kardiomyozyten Hypertrophie. Die Kombination von L-NAME und Isoproterenol ergab in beiden Zellgruppen gegenüber dem Einzelstimulus verdoppelte Proteinsyntheseraten, wobei die Myozyten der Linie 1142 signifikant stärker ansprachen. Zusammenfassung: Überexpression der Plasmamembran Ca2+-ATPase moduliert myozytäres Wachstum, wobei ein Einfluß auf den b-adrenergen und NO Signalweg vorliegt. Die mittels Immunfluoreszenz nachgewiesene Lokalisation der PMCA in Caveolae läßt eine Interaktion des Enzyms mit anderen Signaltransduktionsmolekülen in diesen Subkompartimenten vermuten. N2 - Introduction: The plasma membrane calcium ATPase (PMCA) is a calcium-extruding enzyme controlling calcium homeostasis in all eucaryontic cells. Especially in excitable cells like cardiomyocytes its exact function still remains unclear. The former hypothesis of a role in fine tuning of outward calcium currents has to be questioned. Several recent studies indicate that the sarcolemmal Ca2+-pump might play a role in regulating myocardial growth and/or differentiation, possibly through modulation of caveolar signal transduction. Objective: To test whether the PMCA might be involved in cellular processes other than beat-to-beat regulation of contraction/relaxation cycle, especially in growth regulation, apoptosis and signal transduction. Methods: Analysis of apoptosis was performed on L6-myoblasts with stable PMCA-overexpression and neonatal cardiomyocytes from transgenic rats, using the TUNEL-technique according to the manufacturer’s protocol. Growth experiments include several different approaches, comparing unstimulated versus stimulated cardiomyocytes. Stimuli used are catecholamines and L-NAME, an inhibitor of NO synthase. Protein synthesis rate of the cells was assessed via 3H leucine incorporation, serving as a measure for hypertrophy. In addition to these experiments, immunostaining and confocal laser microscopy were performed on the primary cell culture of cardiac myocytes. Results: Overexpression of PMCA did not exert significant effects on apoptosis nor in L6 myoblasts neither in cardiomyocytes. Growth experiments revealed significant higher protein synthesis rates in cardiomyocytes from transgenic rats under catecholamine stimulation with phenylephrine and isoproterenol. L-NAME induces hypertrophy in neonatal cardiomyocytes, combination of isoproterenol and L-NAME produces protein synthesis rates twice as high, predominantly in transgenic cells. Immunostaining showed colocalization of PMCA with caveolin 3, which locates the transgenic enzyme to caveolae. Conclusion: Overexpression of plasma membrane calcium ATPase modulates myocyte growth, with effect on beta-adrenergic and NO pathway. In view of these results and recent findings about caveolae, one could hypothesize that the PMCA exerts its effects by interacting with other signal transduction molecules in these highly specific subcellular compartments. KW - Plasmamembran Ca2+-ATPase KW - Überexpression KW - Signaltransduktion KW - kardiale Hypertrophie KW - transgene Ratten KW - Plasma membrane Ca2+-ATPase KW - overexpression KW - signal transduction KW - cardiomyocyte growth KW - transgenic rat Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7498 ER - TY - THES A1 - Nekhoroshkova, Elena T1 - A-RAF kinase functions in ARF6 regulated endocytic membrane traffic T1 - Die Rolle der A-RAF-Kinase in ARF6 reguliertem endocytotischem Membrantransport N2 - Extracellular signals are translated and amplified via cascades of serially switched protein kinases, MAP kinases (MAPKs). One of the MAP pathways, the classical RAS/RAF/MEK/ERK pathway, transduces signals from receptor tyrosine kinases and plays a central role in regulation of cell proliferation. RAF kinases (A-, B- and C-RAF) function atop of this cascade and convert signals emanating from conformational change of RAS GTPases into their kinase activity, which in turn phosphorylates their immediate substrate, MEK. Disregulated kinase activity of RAF can result in tumor formation, as documented for many types of cancer, predominantly melanomas and thyroid carcinomas (B-RAF). A-RAF is the least characterized RAF, possibly due to its low intrinsic kinase activity and comparatively mild phenotype of A-RAF knockout mice. Nevertheless, the unique phenotype of araf -/- mice, showed predominantly neurological abnormalities such as cerebellum disorders, suggesting that A-RAF participates in a specific process not complemented by activities of B- and CRAF. Here we describe the role of A-RAF in membrane trafficking and identify its function in a specific step of endocytosis. This work led to the discovery of a C-terminally truncated version of A-RAF, AR149 that strongly interfered with cell growth and polarization in yeast and with endocytosis and actin polymerization in mammalian cells. As this work was in progress two splicing isoforms of ARAF, termed DA-RAF1 and DA-RAF2 were described that act as natural inhibitors of RAS-ERK signaling during myogenic differentiation (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 contains the first 153 aa of A-RAF and thus is nearly identical with AR149. AR149 localized specifically to the recycling endosomal compartments as confirmed by colocalization and coimmunoprecipitation with ARF6. Expression of AR149 interferes with recycling of endocytosed transferrin (Tfn) and with actin polymerization. The endocytic compartment, where internalized Tfn is trapped, was identified as ARF6- and RAB11- positive endocytic vesicles. We conclude that the inhibition of Tfn trafficking in the absence of A-RAF or under overexpression of AR149 occurs between tubular- and TGNassociated recycling endosomal compartments. siRNA-mediated depletion of endogenous A-RAF or inhibition of MEK by U0126 mimic the AR149 overexpression phenotype, supporting a role of ARAF regulated ERK signalling at endosomes that is controlled by AR149 and targets ARF6. Our data additionally suggest EFA6 as a partner of A-RAF during activation of ARF6. The novel findings on the A-RAF localization and the interaction with ARF6 have led to a new model of ARAF function were A-RAF via activation of ARF6 controls the recycling of endocytic vesicles.Endocytosis and rapid recycling of synaptic vesicles is critically important for the physiological function of neurons. The finding, that A-RAF regulates endocytic recycling open a new perspective for investigation of the role of A-RAF in the nervous system. N2 - Extrazelluläre Signale werden über eine Serie von nacheinander geschalteten Proteinkinasen, den MAP-Kinasen (MAPK) weitergeleitet und multipliziert. Einer der MAPK-Signalwege, der RAS/RAF/MEK/ERK-Signaltransduktionsweg, leitet Signale von Tyrosinkinaserezeptoren weiter und spielt eine zentralle Role in der Regulation der Zellproliferation. RAF Kinasen (A-, B-, und CRAF) stehen am Anfang der Kaskade. Sie wandeln die signalbedingte strukturellen Änderungen der RAS-GTPase in ihre Kinaseaktivität um und phosphorylieren ihr direktes Substrat, MEK. Eine Störung in der Regulation der Kinaseaktivität des RAF-Proteins kann zur Tumorbildung führen, wie es bei vielen Krebsarten, vor allem Melanom und Schilddrüsenkarzinom (B-RAF), dokumentiert ist. A-RAF ist die bislang am wenigsten charakterisierte RAF-Kinase, möglicherweise aufgrund sihrer nidrigen intrinsischen Kinaseaktivität. Weiterhin weist die A-RAF defficiente Maus einen relativ milden hauptsächlich neuronalen Phänotyp auf, der sich unter anderem auch in einer Fehlfunktion des Cerebellums manifestiert. Dieser einzigartige Phänotyp weist darauf hin, dass eine Reihe zellulärer Prozesse spezifisch durch A-RAF und nicht durch aktiveren B- und C-RAF vermittellt wird. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle des A-RAF-Proteins im intrazellulären Membrantransport analysiert und eine spezifische A-RAF Funktion by endozytotischen Prozessen identifiziert. Diese Arbeit führte zur Entdeckung einer C-terminal verkürtzten Form von A-RAF, AR149, welche das Wachstum und die Polarisation von Hefezellen beeinträchtigt. In Säugetierzellen wirkt AR149 störend auf die Endozytose und die Aktinpolymerisation. Während des Entstehungsprozesses dieser Studie, wurden parallel zwei Spleißisoformen des A-RAF-Proteins, DARAF1 und 2, publiziert, die als natürliche Inhibitoren des RAS-RAF-MEK-ERK-Signalwegs in der myogenen Differenzierung agieren (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 beinhaltet die ersten 153 Aminosäuren des A-RAF Proteines und ist damit fast identisch mit AR149. Eigene Kolokalisierungund Koimmunopräzipitationsexperimente mit ARF6 weisen darauf hin, dass AR149 spezifisch in ARF6-positiven Recycling-Endosomen lokalisiert ist. Expression des AR149 Proteins bechindert das Recycling von endozytiertem Transferrin und die Aktin Polimerisation. Die endosomalen Kompartimente in denen internalisiertes Transferrin gefangen vor liegt, konntenals ARF6- und RAB11-positive endozytotische Vesikeln characterisiert werden. Diese Ergebnisse lassen auf eine durch A-RAF Überexpression bzw. durch die Abwesenheit an A-RAF vermittelte Blokade des intrazellulären Transferrintransportes zwischen den tubulären- und Trans-Golgi-Netzwerk-assoziirten endosomalen Recycling-Kompartimenten schließen. Inhibierung der endogenen A-RAF-Expression durch siRNA oder Hemmung der MEK-Aktivität durch U0126 haben den selben Effekt wie AR149. Auf der Basis dieser Ergebnisse wird ein neues Modell für die Rolle der A-RAF regulierten ERK Signallwirkung auf Endosomen vorgestellt, bei dem das Zielprotein die ARF6 GTPase durch 3 AR149/DA-RAF2 negativ reguliert wird. Daruber hinaus deuten unsere Daten darauf hin, dass EFA6, ein GEF-Faktor von ARF6, als Kooperationspartner von A-RAF bei der ARF6-Aktivierung fungiert. Endocytose und das schnelle Recycling von synaptischen Vesikeln ist von besonderer Bedeutung für die Funktion von Neuronen. Aus dem Befund, dass A-RAF ein Regulator des endocytotischen Recyclings ist ergibt sich dacher eine neue Perspektieve für die Untersuchung der A-RAF Funktion im Nervensystem. KW - Raf-Kinasen KW - Endocytose KW - Onkologie KW - Signaltransduktion KW - Carcinogenese KW - ARF6 GTPase KW - Recycling- Endosomen KW - ERK KW - A-RAF KW - Signal-Übertragung KW - A-RAF KW - signal transduction KW - mitogen cascade KW - membrane trafficking KW - endocytic recycling Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-44566 ER - TY - THES A1 - Müller-Botz, Stephan T1 - Mechanismus der schnellen Geninduktion von Egr-1 durch Östrogen am Herzen : Ein Steroidhormon geht neue Wege T1 - Mechanisms of estrogen induced rapid gene activation of Egr-1 in the myocardium : a new pathway of steroid hormons N2 - Östrogen bewirkt in physiologischer Konzentration in Kardiomyozyten eine schnelle Induktion des Egr-1-Promotors. Dieser Effekt wird über die Östrogenrezeptoren ER alpha und ER beta vermittelt. Überraschenderweise erfolgt die östrogenabhängige Genregulation von Egr-1 aber nicht über den klassischen Signalweg mittels Bindung des Östrogenrezeptors an östrogenresponsive Elemente (ERE), sondern findet unter Bindung von Serumfaktor an serumresponsive Elemente (SRE) des Egr-1-Promotors unter Mitbeteiligung des ERK1/2-Signalweges statt. Am Beispiel der Egr-1-Induktion durch Östrogen ließ sich die Bedeutung serumresponsiver Elemente (SRE) für die Genregulation durch Östrogen aufzeigen. In der vorliegenden Arbeit konnte damit ein neuartiger Signalweg bei der östrogenabhängigen schnellen Genaktivierung in Kardiomyozyten gezeigt werden. N2 - The myocardium is a target tissue for estrogen. Here, we have identified rapid non-nuclear estrogen effects on the expression of the early growth response gene-1 (Egr-1) in cardiomyocytes. Egr-1 mRNA and protein were rapidly and strongly induced by estrogen in an estrogen receptor-dependent manner via the extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2. A promoter analysis study of a 1.2-kilobase Egr-1 promoter fragment revealed that the serum response elements (SREs) but not the estrogen response elements or AP-1 sites are responsible for Egr-1 induction by estrogen, identifying a novel mechanism of estrogen receptor-dependent gene activation in the myocardium. Both estrogen receptor-alpha and -beta induced the Egr-1 promoter via the SREs. These results identify SREs as important promoter control elements for an estrogen receptor-dependent mechanism of gene activation in the myocardium. KW - Östrogene KW - Östrogenrezeptor KW - Genexpression KW - Gentransfer KW - Signaltransduktion KW - Herzmuskel KW - Herzmuskelzelle KW - Genregulation KW - Steroidhormon KW - Adeno KW - Estrogen receptor KW - cardiomyocytes KW - rapid gene induction KW - serum responsive element Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51730 ER - TY - THES A1 - Mönch, Romana T1 - The Growth Factor PDGF and its Signaling Pathways in Colorectal Cancer T1 - Der Wachstumsfaktor PDGF und seine Signalwege im Kolorektalkarzinom N2 - A successful therapy for colorectal cancer (CRC), one of the most common malignancies worldwide, requires the greatest possible research effort. Of critical importance is an understanding of the relevant intracellular networks of signaling cascades, their activation, and the resulting cellular changes that are a prerequisite for a more successful CRC therapy. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and the appropriate VEGF receptors represent molecular targets that have already been successfully implemented in the clinic (i.e. using monoclonal antibodies, tyrosine kinase inhibitors). However, for platelet derived growth factor (PDGF) and the relevant PDGF receptors, there are currently no clinically approved molecular therapeutics available. However, there are preliminary data to show that PDGF and its associated signaling pathways play an important role in CRC progression. In particular, the PI3K/Akt/mTOR pathway is emerging as an important intracellular partner of PDGF with which to control proliferation, migration, and angiogenesis in tumor cells. Therefore it was the objective of this work to investigate the multifactorial influence of PDGF on proliferation and metabolism, depending on CRC mutation status. The intention was to identify new therapeutic targets for future cancer therapy through analyses of PDGF-induced intracellular changes. For this purpose two human colorectal cancer cell lines were analyzed at gene and/or protein level for components of the PI3K/Akt/mTOR and MAPK signaling pathway, c-Myc, p53, and HIF1α (hypoxia-inducible-factor 1α). Changes in proliferation and metabolism, either during stimulation with PDGF and/or PI3K/Akt/mTOR inhibition, were also investigated. Experiments conducted at protein level during PDGF stimulation and/or PI3K/Akt/mTOR inhibition revealed changes in signaling pathways and crosstalk. The influence of the tumor suppressors (retinoblastoma, Rb), oncogenes (c-Myc, p53mut), and HIF1α during stimulation with PDGF, and their interactions in the tumor cell with respect to proliferation and glycolysis warrant further examination in terms of clinical treatment options. Investigations at the gene level of ex vivo samples (UICC I-IV) complete the study with regards to the clinical relevance of PDGF. PDGF stimulation increases tumor cell proliferation in HT29 cells via the PI3K/Akt/mTOR pathway rather than the MAPK pathway. However, if the PI3K/Akt/mTOR pathway is pharmacologically blocked, PDGF stimulation is mediated by inhibitory crosstalk through the MAPK pathway. Further analyses revealed that specific Akt inhibition impedes tumor cell growth, while PI3K inhibition had little effect on proliferation. Inhibitory crosstalk was found to be responsible for these different effects. Careful intervention strategies are therefore required if future therapies intend to make use of these specific signaling pathways. One aim of future research should be to gain a better understanding of the crosstalk between these signaling pathways. In this fashion, “over-inhibition” of the signal pathways, which would result in additional clinical side effects for patients, could be prevented. In late stage UICC, more mutation events occur, with tumorigenicity promoted by an increased mutation rate. Given that PDGF is increasingly expressed in the late UICC stages, our data would indicate that PDGF's effects are amplified with increasing malignancy. The activating effect of PDGF on the PI3K/Akt/mTOR pathway and subsequent changes in the activity of p53mut, Rb, c-Myc, and HIF1α, lead to an unfavorable prognosis for colon cancer patients. PDGF acts on colon cancer cells in an Akt-activating, glycolysis-dependent manner. PDGF increases glycolysis and the ability of CRC cells to adjust their energy metabolism. These activities should be taken as possible starting points with which to design therapeutic interventions for CRC therapy. PDGF, as another representative of the growth factor family, seems to play a similar role to VEGF in CRC. The data from this study underline the importance of the PDGF - PI3K/Akt/mTOR pathway-axis and its potential as a possible target in colorectal cancer. Thus PDGF represents an attractive therapeutic target, besides the VEGF/EGFR-based therapies already used in CRC. N2 - Die erfolgreiche Therapie von Darmkrebs, eine der häufigsten malignen Erkrankungen weltweit, erfordert den größtmöglichen Forschungsaufwand. Von entscheidender Bedeutung ist das Verständnis der maßgeblichen intrazellulären Vernetzungen der Signalkaskaden, deren Aktivierung und die daraus resultierenden zellulären Veränderungen als Vorrausetzung einer erfolgreicheren Darmkrebstherapie. Der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und die entsprechenden VEGF Rezeptoren stellen molekulare Ziele dar, die im Kolorektalkarzinom bereits erfolgreich in die Klinik implementiert wurden (wie zum Beispiel monoklonale Antikörper oder Tyrosinkinaseinhibitoren). Für den Wachstumsfaktor Platelet Derived Growth Factor (PDGF) und den entsprechenden PDGF Rezeptoren stehen jedoch noch keine klinisch zugelassenen molekularen Therapeutika zu Verfügung. Allerdings zeigen erste Daten, dass PDGF und seine zugehörigen Signalwege auch eine wichtige Rolle in der Tumorprogression spielen. Insbesondere der PI3K/Akt/mTOR Signalweg kristallisiert sich als wichtiger intrazellulärer Partner von PDGF heraus, um die Proliferation, Migration und Angiogenese in Tumorzellen zu steuern. Deshalb war es Ziel dieser Arbeit, den multifaktoriellen Einfluss von PDGF auf die Proliferation und den Metabolismus, abhängig vom Mutationsstatus, im CRC näher zu untersuchen. Neue therapeutische Angriffsziele für eine zukünftige Tumortherapie sollen durch Analyse der PDGF-bedingten intrazellulären Veränderungen gefunden werden. Hierfür wurden zwei humane Kolorektalkarzinom Zelllinien auf Gen- und/oder Proteinebene auf Komponenten des PI3K/Akt/mTOR- und des MAPK-Signalwegs, auf c-Myc, p53 und HIF1α (Hypoxia-inducible-factor 1α) analysiert. Ferner wurden Änderungen der Proliferation und des Metabolismus jeweils unter Stimulation mit PDGF bzw. PI3K/Akt/mTOR Inhibition untersucht. Durchgeführte Proteinuntersuchungen unter PDGF Stimulation bzw. PI3K/Akt/mTOR Inhibition offenbarten Veränderungen in den Signalwegen und des Crosstalks. Auch die Beeinflussung der Tumor Suppressoren (Retinoblastoma, Rb), Onkogenen (c-Myc, p53mut) und HIF1α unter PDGF Stimulation und deren Zusammenspiel in der Tumorzelle hinsichtlich Proliferation und Glykolyse rechtfertigen im Hinblick auf klinische Therapiemöglichkeiten weitere Untersuchungen. Die Genuntersuchung von ex vivo Gewebeproben (UICC I-IV) komplettieren die Untersuchung unter Beachtung der klinischen Relevanz von PDGF. Die PDGF Stimulation steigert die Tumorzellproliferation in den HT29 Kolonkarzinom Zellen über den PI3K/Akt/mTOR Signalweg anstatt über den MAPK Signalweg. Allerdings wird die Stimulation mit PDGF durch den inhibitorischen Crosstalk über den MAPK Signalweg vermittelt, sollte der PI3K/Akt/mTOR Signalweg durch pharmakologische Inhibition blockiert sein. Die weitergehende Analyse hat gezeigt, dass eine spezifische Akt Inhibition das Tumorzellwachstum hemmt, während eine PI3K Inhibition kaum Einfluss auf die Proliferation besitzt. Der inhibitorische Crosstalk ist für diese unterschiedlichen Effekte verantwortlich. Sorgfältige Interventionsstrategien sind daher erforderlich, wenn man diese spezifischen Signalwege zukünftig therapeutisch ausnutzen möchte. Daher sollte ein besseres Verständnis der Crosstalks zwischen diesen Signalwegen Ziel zukünftiger Forschung sein. Auf diese Weise könnte auch eine „Über-Inhibition“ der Signalwege verhindert werden, die zusätzliche klinische Nebenwirkungen für die Patienten zur Folge hätte. In den späten UICC Stadien treten vermehrt Mutationen auf, die die Kanzerogenität mit steigender Mutationsrate fördert. Angesichts der Tatsache, dass PDGF in den späten UICC Stadien verstärkt exprimiert wird, deuten unsere Daten darauf hin, dass die Effekte von PDGF die erhöhte Malignität verstärken. Der aktivierende Effekt von PDGF auf den PI3K/Akt/mTOR Signalweg und nachfolgende Aktivitätsänderungen von p53mut, Rb, c-Myc und HIF1α führen zu einem ungünstigen Verlauf bei Patienten mit Kolorektalkarzinom. PDGF wirkt auf Darmkrebszellen in einer Akt- aktivierenden, Glykolyse-abhängigen Art und Weise. PDGF steigert die Glykolyse und die Fähigkeit der kolorektalen Karzinomzellen, ihren Energiemetabolismus unter PDGF Stimulation anzupassen. Diese Aktivitäten sollten als mögliche therapeutisch nutzbare Ausgangspunkte verwendet werden, um Therapieansätze für das kolorektale Karzinom zu entwerfen. PDGF, als weiterer Vertreter aus der Familie der Wachstumsfaktoren, scheint eine vergleichbare Rolle wie VEGF im kolorektalen Karzinom zu spielen. Die Daten dieser Studie unterstreichen die Wichtigkeit der PDGF - PI3K/Akt/mTOR Signalwegsachse und deren Potential für ein mögliches Angriffsziel im kolorektalen Karzinom. PDGF stellt somit ein interessantes therapeutisches Ziel neben der bereits genutzten VEGF/EGFR – basierten Therapie im kolorektalen Karzinom dar. KW - PDGF KW - PI3K/Akt/mTor pathway KW - Proliferation KW - metabolism KW - PDGFR KW - Dickdarmkrebs KW - Signaltransduktion KW - Platelet-derived Growth Factor Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139100 ER - TY - THES A1 - Mischnik, Marcel T1 - Systembiologische Analyse der ADP- und Prostaglandin-vermittelten Signaltransduktion humaner Thrombozyten T1 - Systems biological analysis of ADP and prostaglandin mediated signal transduction in human thrombocytes N2 - Thrombozyten (Blutplättchen) sind die Vermittler der zellulären Hämostase. Ihre Fähigkeit zu Aggregieren und sich an das umgebende Gewebe verletzter Blutgefässe anzulagern, wird durch ein komplexes intrazelluläres Signaltransduktionsnetzwerk bestimmt, das sowohl aktivierende, als auch inhibierende Subnetzwerke beinhaltet. Das Verständnis dieser Prozesse ist von hoher medizinischer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die thrombozytäre Signaltransduktion sowohl mittels eines Boole'schen, als auch verschiedener dynamischer Modelle analysiert. Die Boole'sche Modellierung führte zu interessanten Erkenntnissen über das Zusammenwirken einzelner Subnetzwerke bei der Vermittlung irreversibler Plättchenaktivierung und zeigte Mechanismen der Interaktion mit dem hemmenden Prostaglandinsystem auf. Das Modell beinhaltet unter Anderem wichtige Systemkomponenten wie Calciumsignalgebung, Aktivierung von Schlüsselkinasen wie Src und PKC, Integrin-vermitteltes outside-in sowie inside-out Signalgebung und autokrine ADP- und Thromboxan-Produktion. Unter Verwendung dieses Boole'schen Ansatzes wurde weiterhin das System-eigene Schwellenwertverhalten analysiert. Dabei stellte sich eine umgekehrt proportionale Abhängigkeit des relativen aktivierenden Reizes, der notwendig ist um den Schwellenwert zu überschreiten, vom absoluten hemmenden Input heraus. Das System adaptiert demnach an höhere Prostaglandinkonzentrationen durch eine Erhöhung der Sensitivität für Aktivatoren wie dem van-Willebrandt-Faktor und Kollagen, und ermöglicht somit auch unter lokal hemmenden Bedingungen eine Plättchen-vermittelte Hämostase. Der nächste Schritt bestand in der Implementierung eines Differentialgleichungs-basierten Modells der thrombozytären Prostaglandin-Signaltransduktion, um einen detaillierten Überblick über die Dynamik des inhibierenden Netzwerkteils zu erhalten. Die kinetischen Parameter dieses Modells wurden teilweise der Literatur entnommen. Der andere Teil wurde anhand einer umfassenden Kombination dosis- und zeitabhängiger cAMP und phospho-VASP Messdaten geschätzt. Der Prozess beinhaltete mehrere Iterationen aus Modellvorhersagen einerseits und experimentellem Design andererseits. Das Modell liefert die quantitativen Effekte der Prostaglandinrezeptoren IP, DP1, EP3 und EP4 und des ADP-Rezeptors P2Y12 auf die zugrunde liegende Signalkaskade. EP4 zeigt den stärksten Effekt in der aktivierenden Fraktion, wohingegen EP3 einen stärkeren inhibitorischen Effekt ausübt, als der durch Clopidogrel hemmbare ADP-Rezeptor P2Y12. Weiterhin wurden die Eigenschaften des negativen feedback-loops der PKA auf den cAMP-Spiegel untersucht, und eine direkte Beeinflussung der Adenylatzyklase durch die PKA festgestellt, in Form einer Reduzierung der maximalen katalytischen Geschwindigkeit. Die Identifizierbarkeit der geschätzten Parameter wurde mittels profile-Likelihood-Schätzung untersucht. In einem dritten Schritt wurde ein sowohl die aktivierenden, als auch die hemmenden Netzwerkteile umfassendes dynamisches Modell implementiert. Die Topologie dieses Modells wurde in Anlehnung an die des Boole'schen Modells auf der Basis von a priori Wissen festgelegt. Die Modellparameter wurden anhand von Western-Blot, Calcium- und Aggregationsmessungen geschätzt. Auch hier wurde die Identifizierbarkeit der Modellparameter durch profile-likelihood-Schätzung überprüft. Die bei niedrigen Ligandenkonzentrationen auftretende Reversibilität der Plättchen-Aggregation konnte mittels dieses Modells reproduziert werden. Jedoch zeigte sich bei mittleren ADP-Konzentrationen ein Fließgleichgewicht in einem teilweise aktivierten Zustand, und damit kein bistabiles Schwellenwertverhalten. Inwiefern dieses Verhalten durch einen Umgebungs-basierteren Mechanismus des Alles-Oder-Nichts-Verhaltens begründet wird, bei dem der Übergang von reversibler zu irreversibler Aggregation mehr durch parakrine Effekte des gesammten Thrombus bestimmt wird, als durch spezifische Signaltransduktionseigenschaften der einzelnen Zelle, müssen zukünftige Experimente zeigen. Insgesamt geben die erstellten Modelle interessante Einblicke in die Funktionsweise der Thrombozyten und ermöglichen die Simulation von pharmakologischen und genetischen Einflüssen, wie Rezeptormodulationen und knock-outs. Sie geben damit Implikationen zur Entstehung und Behandlung pathophysiologischer Zustände, und wertvolle Denkanstöße für die weitere Forschung. N2 - Platelets represent the key-players in mammalian wound-healing. Their ability to aggregate and attach to the surrounding tissue of damaged blood vessels is thereby mediated by a complex signal -transduction network that comprises both activatory and inhibitory components. Due to its medical relevance and the lack of profound understanding, the network constitutes a convenient target for modeling. In a first step, a Boolean implementation of platelet signal transduction, comprising both activating and inhibiting networks components was established. This led to important information, on how the function of different subnetworks coalesce to fully activate the platelet and to promote irreversible aggregation. These include calcium signalling, activation of key-kinases like Akt, Src and PKC, Integrin outside-in as well as inside-out signalling and autocrin ADP and thromboxane production. In addition, using this data-free approach, the systems inherent threshold behaviour was analysed. The model revealed, that the relative activating strength, that transgresses the threshold, decreases with elevating PGI inputs and is also dependent on auto- and parakrin effects. Thus, the system adapts for higher prostaglandin-concentrations by increasing its sensitivity for activators like vWF and collagen, and thereby commits thrombocyte-dependent active processes such as wound healing even if subsequently blood prostaglandin-levels are higher in later time points. Secondly, an ordinary-differential-equation based model of platelet prostaglandin signalling was established, to get a detailed view of the dynamics governing the inhibiting network part. The kinetic parameters of the model were partly taken from literature and in part estimated along a comprehensive combination of time-course and dose-response measurements of cAMP and phosphorylated VASP. The process involved an iterative cycle between model predictions and experimental design. The model delivered the quantitative effects of the prostaglandin receptors IP, DP1, EP3, EP4 and the ADP receptor P2Y12 on the underlying signalling cascade. EP4 showed the strongest effect in the activating fraction, whereas EP3 turned out to exert a greater inhibiting impact than the commonly established pharmacological target P2Y12. Furthermore, the nature of the double-negative feedback loop constituted by PKA was examined, which disclosed a direct influence of PKA on adenylate cyclase, reducing its maximum catalytic speed. The identifiablility of all kinetic parameters was analysed via profile likelihood estimation. Finally, a dynamical model comprising both activating ADP-signalling through P2Y1 and P2Y12 receptors, and the inhibiting prostaglandin-pathway was implemented. The topology of this larger model was established on the basis of a priori knowledge. Model parameters were fitted along time-resolved Western-Blot, calcium and aggregation measurements. The identifiability of the model parameters was again check by means of profile likelihood estimation. Reversibility of platelet activation at low ADP concentrations could be reproduced by this model. However, at medium concentrations the system appears to assume a steady-state in a partly activated condition, thus not providing for a bistable threshold behaviour. If this behaviour is based on a more enviroment-based character of the observed point-of-no-return behaviour, in which the transition from reversible to irreversible aggregation is rather due to parakrin effects evoked by the entire cell array, than due to specific network properties present in the single cell, has to be investigated by further experiments. All in all, the models show interesting properties of platelet signal transduction, and give valuable implications for medical treatment and future research. KW - Thrombozyt KW - Modellierung KW - ADP KW - Prostaglandine KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyten KW - Modellierung KW - ADP KW - Prostaglandine KW - platelets KW - ADP KW - prostaglandin KW - modeling KW - boolean KW - ODE Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78807 ER - TY - THES A1 - Läsker, Katharina T1 - The influence of the short-chain fatty acid butyrate on "Signal transducer and activator of transcription 3" (STAT3) and selected inflammatory genes in the colon carcinoma cell line CACO-2 cultured in 2D and 3D T1 - Der Einfluss der kurzkettigen Fettsäure Butyrat auf "Signal Übermittler und Aktivator der Transkription 3" (STAT3) und ausgewählte an der Entzündung beteiligte Gene in der Dickdarmkrebszelllinie CACO-2 im 2D- und 3D Modell N2 - A disturbance in the symbiotic mutualism between the intestinal microbiome and the human host’s organism (syn. dysbiosis) accompanies the development of a variety of inflammatory and metabolic diseases that comprise the Metabolic Syndrome, chronic inflammatory gut diseases like Crohn’s disease, Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and cardiovascular diseases, among others. The changed uptake and effectiveness of short chain fatty acids (SCFAs) as well as an increase of the intestinal permeability are common, interdependent disease elements in this regard. Short chain fatty acids are end-products of intestinal bacterial fermentation and affect the mucosal barrier integrity via numerous molecular mechanisms. There is evidence to suggest, that SCFAs have a modulating influence on Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in intestinal epithelial cells. STAT3 is a central gene-transcription factor in signaling pathways of proliferation and inflammation. It can be activated by growth factors and other intercellular signaling molecules like the cytokine Oncostatin M (OSM). The mode of STAT3’s activation exhibits, finally, a decisive influence on the immunological balance at the intestinal mucosa. Therefore, the posttranslational modification of STAT3 under the influence of SCFAs is likely to be a very important factor within the development and -progression of dysbiosis-associated diseases. In this study, a clear positive in vitro-effect of the short chain fatty acid butyrate on the posttranslational serine727-phosphorylation of STAT3 and its total protein amount in the human adenocarcinoma cell line CACO2 is verified. Moreover, an increased gene expression of the OSM-receptor subunit OSMRβ can be observed after butyrate incubation. Histone deacetylase inhibition is shown to have a predominant role in these effects. Furthermore, a subsequent p38 MAPK-activation by Butyrate is found to be a key molecular mechanism regarding the STAT3-phosphorylation at serine727-residues. To consider the portion of butyrate receptor signaling in this context in future assays, a CACO-2 cell 3D-culture model is introduced in which an improvement of the GPR109A-receptor expression in CACO-2 cells is accomplished. N2 - Eine Störung der symbiotischen Wechselbeziehung zwischen dem Darmmikrobiom und dem Wirtsorganismus (syn. Dysbiose) begleitet die Entwicklung vieler verschiedener entzündlicher und metabolischer Erkrankungen. Zu ihnen zählen unter anderem das Metabolische Syndrom, chronisch entzündliche Darmerkrankungen wie M. Crohn, die Nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) und kardiovaskuläre Erkrankungen. Eine veränderte Aufnahme und Wirkung von kurzkettigen Fettsäuren (Short-chain fatty acids = SCFAs) und eine Schwächung der Darmbarriere bedingen sich in diesem Zusammenhang gegenseitig. Kurzkettige Fettsäuren sind Endprodukte des bakteriellen Stoffwechsels und beeinflussen die Integrität der Darmbarriere über eine Vielzahl molekularer Mechanismen. Es gibt Hinweise darauf, dass kurzkettige Fettsäuren einen modulierenden Einfluss auf „Signal transducer and activator of transcription 3“ (STAT3) in intestinalen epithelialen Zellen ausüben. STAT3 ist hier ein zentraler Gentranskriptionsfaktor in proliferations- und entzündungsregulierenden Zellsignalwegen. Er kann durch Wachstumsfaktoren und andere interzelluläre Botenstoffe, wie beispielsweise das Zytokin Oncostatin M (OSM), aktiviert werden. Die Art der Aktivierung von STAT3 wirkt sich nicht zuletzt entscheidend auf die immunologische Balance an der Darmbarriere aus. Die Modifikation von STAT3 durch kurzkettige Fettsäuren ist aufgrund dessen mit hoher Wahrscheinlichkeit ein sehr wichtiger Faktor im Hinblick auf Entstehung und Progression der im Zusammenhang mit einer Dysbiose stehenden Erkrankungen. In dieser Arbeit kann eine klare Steigerung der posttranslationalen Phosphorylierung von STAT3 an den Serin-Molekülendungen der Position 727 sowie eine Steigerung der Gesamtproteinmenge von STAT3 in der humanen Karzinomzellline CACO2 in vitro durch Butyrat-Inkubation gezeigt werden. Weiterhin wird unter Butyrat-Einfluss auch die Genexpression der OSM-Rezeptor-Untereinheit OSMRβ gesteigert. Diese Effekte können größtenteils auf den Mechanismus der Histondeacetylase-Hemmung durch Butyrat zurückgeführt werden. Die in der Folge erhöhte P38 MAPK-Phosphorylierung durch Butyrat ist in Bezug auf die Serin727-Phosphorylierung an STAT3 entscheidend beteiligt. Um in künftigen Assays auch den möglichen Einfluss der Butyrat-Rezeptor-Wirkung in diesem Zusammenhang besser zu erfassen, wird ein 3D-Zellkultur Ansatz getestet und in diesem eine verbesserte Expression des Butyrat-Rezeptors GPR109A in CACO-2-Zellen erreicht. KW - Butyrate KW - Signaltransduktion KW - Darmepithel KW - Cytokine KW - MAP-Kinase KW - butyrate KW - signal transduction KW - p38 MAPK KW - STAT3 KW - intestinal barrier KW - 3 dimensional cell culture model KW - CACO-2 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-300389 ER - TY - THES A1 - Lutz, Marion T1 - Effects of nerve growth factor on TGF-Beta,Smad signal transduction in PC12 cells T1 - Einfluß von NGF auf die TGF-ß/Smad Signaltransduktion in PC12 Zellen N2 - Transforming growth factor-ß (TGF-ß) is a multifunctional cytokine that is engaged in regulating versatile cellular processes that are pivotal for development and homeostasis of most tissues in multicellular organisms. TGF-ß signal transduction is initially propagated by binding of TGF-ß to transmembrane serine/threonine kinase receptors, designated TßRI and TßRII. Upon activation, the receptors phosphorylate Smad proteins which serve as downstream mediators that enter the nucleus and finally trigger transcriptional responses of specific genes. During the past years, it became evident that signaling cascades do not proceed in a linear fashion but rather represent a complex network of numerous pathways that mutually influence each other. Along these lines, members of the TGF-ß superfamily are attributed to synergize with neurotrophins. Together, they mediate neurotrophic effects in different populations of the nervous system, suggesting that an interdependence exists between TGF-ßs on the one hand and neurotrophins on the other. In the present work, the crosstalk of NGF and TGF-ß/Smad signaling pathways is characterized in rat pheochromocytoma cells (PC12) which are frequently used as a model system for neuronal differentiation. PC12 cells were found to be unresponsive to TGF-ß due to limiting levels of TßRII. However, stimulation with NGF results in initiation of Smad-mediated transcription independent of TGF-ß. Binding of NGF to functional TrkA receptors triggers activation of Smad3. This NGF-dependent Smad activation occurs by a mechanism which is different from being induced by TGF-ß receptors in that it provokes a different phosphorylation pattern of R-Smads. Together with an inferior role of TßRI, Smad3 is proposed to serve as a substrate for cellular kinases other than TßRI. Based on the presented involvement of components of both, the MAPK/Erk and the TAK1/MKK6 cascade, signal mediators of these pathways rank as candidates to mediate direct activation of Smad3. Smad3 is subsequently translocated to the nucleus and activates transcription in a Smad4-dependent manner. Negative regulation is provided by Smad7 which was found to act as a potent inhibitor of Smad signaling not only in TGF-ß- but also in NGF-mediated cascades. The potential of NGF to activate the Smad pathway independent of TGF-ß might be of special importance in regulating expression of genes that are essential for the development and function of neuronal cells or of other NGF-sensitive cells, in particular those which are TGF-ß-resistant. N2 - Das multifunktionelle Zytokin TGF-ß ist an der Regulation vielfältiger zellulärer Prozesse beteiligt. Diese sind für die Entwicklung und die Homöostase der meisten Gewebe vielzelliger Organismen essenziell. Die TGF-ß Signaltransduktionskaskade wird durch die Bindung des Zytokins an spezifische transmembrane Serin/Threonin-Kinase Rezeptoren (TßRI und TßRII) initiiert. Eine solche Rezeptoraktivierung führt zur Phosphorylierung von Smad Proteinen. Diese dienen der Signalweiterleitung, indem sie anschließend in den Zellkern translozieren und dort die Transkription spezifischer Zielgene modulieren. In den letzten Jahren wurde deutlich, dass Signalkaskaden nicht nur linear weitergeleitet werden, sondern dass vielmehr ein komplexes Netzwerk aus zahlreichen, sich gegenseitig regulierenden, Signalwegen existiert. In diesem Zusammenhang wird auch den Mitgliedern der TGF-ß Superfamilie zugeschrieben, dass sie mit Neurotrophinen kooperieren und somit deren Effekte in unterschiedlichen neuronalen Zellpopulationen unterstützen. In der vorliegenden Arbeit wurde der "crosstalk" von NGF- und TGF-ß/Smad-Signalwegen charakterisiert. Als Zellsystem dienten dazu Ratten Pheochromocytoma Zellen (PC12), die weithin als Modellsystem für neuronale Differenzierung verwendet werden. Basierend auf der Expression limitierender Mengen an TßRII, zeigen PC12 Zellen keine Responsivität gegenüber TGF-ß. Stimulation mit NGF hingegen resultiert - unabhängig von TGF-ß - in der Initiation von Smad-vermittelter Transkription. Die initiale Bindung von NGF an TrkA Rezeptoren führt zur Aktivierung von Smad3. Diese NGF-induzierte Smad-Aktivierung unterscheidet sich von der durch TGF-ß-Rezeptoren initiierten Aktivierung hinsichtlich des Phosphorylierungsmusters der R-Smads. Da weiterhin gezeigt werden konnte, dass die TGF-ß Rezeptoren für NGF-induzierte Ereignisse eine untergeordnete Rolle spielen, wird angenommen, dass Smad3 ein Substrat für andere zelluläre Kinasen als TßRI ist. Die hier nachgewiesene Beteiligung der MAPK/Erk Kaskade sowie des TAK1/MKK6 Signalwegs an der Weiterleitung des NGF-Signals machen deren Signalmoleküle zu potenziellen Kinasen für die direkte Aktivierung von Smad3. Im Anschluß daran erfolgt die nukleäre Translokation des Smad3 und spezifische Promotoraktivierungen unter Beteiligung von Smad4. Abschließend konnte gezeigt werden, dass das Smad7 Protein, nicht nur nach TGF-ß- sondern auch nach NGF-Stimulation als effektiver Inhibitor der Smad Signalkaskade wirkt. Die bislang unbekannte Fähigkeit, den Smad-Signaltransduktionsweg unabhängig von TGF-ß zu aktivieren, schreibt NGF eine besondere Bedeutung für die Genregulation in neuronalen Zellpopulationen oder anderen NGF-sensitiven - insbesondere TGF-ß-resistenten - Zellen zu. KW - Transforming growth factor beta KW - Nervenwachstumsfaktor KW - Signaltransduktion KW - TGF-ß KW - NGF KW - Signaltransduktion KW - TGF-ß KW - NGF KW - signal transduction KW - crosstalk Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4248 ER - TY - THES A1 - Lind, Christof Martin T1 - Während der Evolution von Landpflanzen geriet der Anionenkanal SLAC1 unter die Kontrolle des ABA-Signalwegs T1 - During the evolution of land plants the anion channel SLAC1 became a part of the ABA signaling pathway N2 - Die ersten Landpflanzen standen vor der Herausforderung sich mit der wechselnden Verfügbarkeit von Wasser an Land arrangieren zu müssen. Daraus ergab sich die Notwendigkeit den Wasserverlust zu minimieren und dennoch ausreichend CO2 für die Photosynthese aufzunehmen (Raven, 2002). Im Laufe der Evolution der Pflanzen entstanden mehrere Anpassungen an diese neuen Gegebenheiten, die schließlich auch zur Entstehung von regulierbaren Öffnungen, den Stomata, in der Blattepidermis führte. Zwei Schließzellen umschließen das Stoma und regulieren über die Aufnahme oder Abgabe von osmotisch-aktiven Teilchen ihren Turgordruck und damit die Öffnungsweite des Stomas. Das Kation Kalium und die Anionen Chlorid und Nitrat repräsentieren die Hauptosmotika, die je nach Bedarf durch Transportproteine über die Plasmamembran der Schließzellen geschleust werden. In den Samenpflanzen wie zum Beispiel der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, ist der Signalweg in Schließzellen, der bei Trockenheit zu einem schnellen Schluss des Stomas führt bereits sehr gut untersucht. Bei Wassermangel synthetisiert die Pflanze das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure). Das Hormon wird durch ABA-Rezeptoren erkannt und resultiert schließlich in der Aktivität der Proteinkinase OST1. Daraufhin reguliert diese Kinase zum einen die Transkription ABA-abhängiger Gene, die der Pflanze eine langfristige Adaptation an Trockenheit und Austrocknungstoleranz verleiht. Zum anderen, phosphoryliert OST1 den Anionenkanal SLAC1 und aktiviert ihn so. Die Aktivität des Kanals initiiert schließlich den Stomaschluss durch einen Ausstrom von Anionen aus den Schließzellen, der mit einer Depolarisation der Schließzellmembran einhergeht. Der ABA-Signalweg, der zur transkriptionellen Regulation von Genen und der damit verbunden Trockentoleranz führt ist ein sehr stark konservierter und evolutiv sehr alter Signalweg, der in allen Geweben von Pflanzen bei Trockenheit beschritten wird. Der schnelle ABA-Signalweg, der die Aktivität der SLAC1 Anionenkanäle reguliert, ist auf Schließzellen begrenzt. Da sich Schließzellen aber erst spät in der Evolution von Landpflanzen etablierten, erhob sich die Frage, wann in der Evolution geriet SLAC1 unter die Kontrolle das ABA-Signalwegs? Geht diese Regulation von SLAC1 mit der Entstehung von Schließzellen einher oder bestand dieser Regulationsmechanismus bereits in Pflanzen, die keine Schließzellen besitzen. Zur Beantwortung dieser Frage untersuchte ich die einzelnen Komponenten des Signalwegs und ihre Beziehungen zu einander im heterologen Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyten. Im Laufe dieser Arbeit wurden Schlüsselelemente des ABA-Signalwegs aus sechs verschiedenen Versuchspflanzen kloniert und in Oozyten charakterisiert. Für die Untersuchung der Evolution des schnellen ABA-Signalwegs wurden die sechs Versuchspflanzen aus je einem rezenten Vertreter der Grünalgen (Klebsormidium nitens), der Lebermoose (Marchantia polymorpha), der Laubmoose (Physcomitrella patens), der Lycophyten (Selaginella moellendorffii) und der Farne (Ceratopteris richardii) ausgewählt und mit der Samenpflanze Arabidopsis thaliana verglichen. Die sechs Pflanzengruppen spalteten sich an unterschiedlichen Zeitpunkten im Laufe der pflanzlichen Evolution von der Entwicklung der restlichen Pflanzen ab und erlauben so einen bestmöglichen Einblick in den jeweiligen Entwicklungsstand der Landpflanzen während der Entstehung der einzelnen Pflanzenfamilien. Obwohl sich die ersten Stomata erst in den Laubmoosen entwickelten, besitzen schon die Grünalgen OST1-Kinasen und SLAC1-Kanäle. Interessanterweise konnte wir zeigen, dass schon die frühen OST1-Kinasen aus Algen und Moosen dazu in der Lage sind, in den höher entwickelten Samenpflanzen die Rolle in der Regulation der ABA-abhängigen Expression von Genen zu übernehmen. Außerdem zeigte sich im Laufe meiner biophysikalischen Untersuchungen, dass alle dreizehn getesteten OST1-Kinasen aus den sechs unterschiedlichen Versuchspflanzenarten in Lage sind, den Anionenkanal SLAC1 aus Arabidopsis in Xenopus Oozyten zu aktivieren. Diese Austauschbarkeit von den AtSLAC1-aktivierenden Kinasen deutet auf eine sehr starke Konservierung der Struktur und Funktion von OST1 hin. Anders verhielt es sich bei der funktionellen Analyse der Anionenkanäle aus den verschiedenen Versuchspflanzen: Hier bildete nur der evolutionär gesehen jüngsten SLAC-Kanal AtSLAC1 aus Arabidopsis ein funktionelles Pärchen mit OST1. Die SLAC1 Kanäle aus der Grünalge, dem Lebermoos, den Lycophyten und dem Farn blieben ohne messbare Aktivität bei einer Co-expression mit den verschiedenen OST1 Kinasen. Nur beim Laubmoos (Physcomitrella patens) konnte noch ein funktionelles Kinase-Anionenkanal Pärchen gefunden werden. Struktur-Funktionsuntersuchungen erlaubten mir schließlich zu zeigen, dass bestimmte funktionelle Domänen sowohl im N-terminus als auch im C-terminus von SLAC1 erforderlich sind, um eine Aktivierung des Kanals durch OST1 Kinasen sicherzustellen. N2 - Since the beginnings of the colonization of the land, plants had to overcome numerous obstacles. In this new environment the major challenge was the preservation of water supply despite the severe changes in the availability of water. Due to these new requirements plants had to balance water loss and the necessary uptake of CO2 for photosynthesis. Along the evolution of land plants they evolved numerous adaptations to the new environment like the cuticle and adjustable stomata. The stomata are small pores embedded in the epidermis of the leaves. A pair of guard cells regulates the aperture of the pore (stoma) via their turgor pressure. Potassium and the counter ions chloride and nitrate are the major osmolytes driving the opening and closing of the stoma. Specialized transport proteins regulate the ion fluxes across the plasma membrane of guard cells. In seed plants like the model plant Arabidopsis thaliana, the control of guard cells under drought stress conditions is well understood. Upon water shortage the plants produce the phytohormone ABA (abscisic acid). Following the perception of ABA by its receptors, the phytohormone activates the protein kinase OST1. The activated kinase on the one hand controls the expression of ABA dependent genes that lead to drought-adaptation and tolerance. On the other hand, the OST1 kinase phosphorylates and activates SLAC1-type anion channels. In turn, the activation of SLAC1 leads to the release of anions, thereby initiating guard cell depolarization which leads to the release of anions together with potassium. This depolarization step represents the initiation of ABA-dependent stomatal closure. The transcriptional ABA signaling pathway that regulates gene expression and the adaptation to drought stress is a very ancient and conserved pathway. It can be found in all plant tissues during periods of water shortage. In contrast, the ABA pathway leading to the activation of SLAC1 is restricted to guard cells only. Guard cells evolved rather late during the evolution of land plants. Therefore, the question arises, when did the ancient ABA signaling pathway co-opt SLAC1? Did the control of SLAC1 activity through the ABA-signaling pathway already exist before the stomata appeared in early land plants or did it co-evolve with stomata rather recently? To answer these questions, we investigated the relationship between the single components of the signaling cascade in the heterologous expression system of Xenopus laevis oocytes. To investigate the evolution of fast ABA signaling, we cloned the key players of the signaling cascade from six different model plants and functionally characterized the ABA-signaling components in oocytes. The model plants were chosen from green algae (Klebsormidium nitens), liverworts (Marchantia polymorpha), mosses (Physcomitrella patens), lycophytes (Selaginella moellendorffii) and ferns (Ceratopteris richardii) and their ABA-signaling components were compared to those of the seed plant Arabidopsis thaliana. These plant families diverged during evolution of land plants at distinct evolutionary steps. Thus these plant species should allow us insights into the evolution of land plants. Although the first stomata were found in mosses, already the green algae Klebsormidium nitens expressed SLAC1-type anion channels and the OST1 kinase. Gene expression studies with Arabidopsis protoplasts revealed that already the OST1 kinase of green algae is able to regulate ABA-dependent gene expression in seed plants. This indicates that the substrate specificity of OST1 kinases remained highly conserved during evolution. This notion was reinforced by biophysical investigations in the oocyte system. All thirteen tested OST1 kinases originating from the six model plants were capable to activate the evolutionary youngest SLAC channel AtSLAC1 from Arabidopsis in the heterologous expression system. Thus the structure and function of OST1 kinases is highly conserved during the evolution of land plants. In contrast, SLAC1 channels originating from ferns, lycophytes, liverworts and algae could not be activated by any of the OST1 kinases. Only the SLAC1 channel and the OST1 kinase of the seed plant Arabidopsis thaliana formed a functional anion channel/kinase-pair. Apart from Arabidopsis SLAC1, only the moss (Physcomitrella patens) PpSLAC1 could be activated by the Arabidopsis and one of the moss OST1 kinases. Subsequent detailed structure-function analysis revealed several essential domains in the anion channel’s N-terminus and C-terminus which are important for the functional interaction between SLACs and OSTs. KW - Evolution KW - Abscisinsäure KW - ABA KW - OST1 KW - Signaltransduktion KW - Anionentranslokator KW - Spaltöffnung KW - SLAC1 Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141669 ER - TY - THES A1 - Lies, Barbara Christiane T1 - Untersuchung zur NO/cGMP-Signaltransduktion in der glatten Muskulatur von NO-GC-defizienten Mäusen T1 - Investigation of NO/cGMP signaltransduction in smooth muscle of NO-GC-deficient mice N2 - Die Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaltransduktion besitzt eine entscheidende Rolle bei der Tonusregulation der glatten Muskulatur. Dabei ist NO neben seiner herausragenden Bedeutung für das vaskuläre System einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Gastrointestinaltrakt. Die Wirkung von NO beruht hauptsächlich auf der Aktivierung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). Im Gastrointestinaltrakt ist die Expression von NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) und Fibroblasten-ähnlichen Zellen (FLC) nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des NO/cGMP-Signalweges für die Regulation von Kontraktion und Relaxation innerhalb dieser drei Zelltypen anhand von zellspezifischen GCKO-Tieren untersucht. SMC- und ICC-spezifische GCKO-Tiere waren bereits vorhanden. FLC-spezifische GCKO-Tiere wurden generiert und mit den vorhandenen ICC- und SMC-GCKO-Linien gekreuzt, um Doppel- und Tripel-Knockout-Tiere zu erhalten. FLC-GCKO-Tiere zeigen eine NO-induzierte Relaxation glattmuskulären Gewebes, die der von WT-Tieren gleicht. Auch Gewebe von FLC/ICC- und FLC/SM-GCKO-Tieren kann durch NO relaxiert werden. Erst die Deletion der NO-GC in allen drei Zelltypen (Tripel-GCKO) führt zu einer Unterbrechung der NO-Relaxation, wie sie aus GCKO-Tieren bekannt ist. Überraschenderweise zeigt sich bei FLC-GCKO-Tieren eine beschleunigte Darmpassagezeit. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die NO-GC in allen drei Zelltypen des Gastrointestinaltrakts an der nitrergen Signaltransduktion beteiligt ist, wenn auch auf unterschiedliche Weise. Es besteht demnach eine Interaktion zwischen den verschiedenen Zelltypen, die durch weiterführende Versuche mit den vorhandenen Doppel-Knockout-Tieren sowie der Tripel-GCKO-Linie nähergehend untersucht werden muss. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Rolle der NO-GC im unteren Harntrakt. Dort liegt die NO-GC in verschieden Zelltypen vor. In Urethra-Gewebe wird die NO-GC ausschließlich in SMC exprimiert, während sie in der Harnblase einzig in interstitiellen Zellen, nicht aber in SMC, befindet. Funktionell hat dies zur Folge, dass die NO-induzierte Urethra-Relaxation ausschließlich von glatten Muskelzellen vermittelt wird. Die Harnblasenmuskulatur hingegen zeigt keine Relaxation auf NO-Gabe hin. Die Identifizierung der NO-GC-exprimierenden interstitiellen Zellen sowie ihre Funktion sind bislang ungeklärt. In einem dritten Projekt wurden Untersuchungen zur Effektivität der NO-GC-Inhibitoren ODQ und NS2028 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem Einsatz der Inhibitoren nicht von einer vollständigen Hemmung der NO-GC ausgegangen werden sollte. Drei Faktoren beeinflussen nachhaltig die Inhibitor-Effektivität: (1) die Klasse des NO-Donors, (2) die Inkubationszeit mit dem Inhibitor und dem NO-Donor sowie (3) die Stärke der Vorkontraktion bei Versuchen mit Glattmuskelgewebe. Die Wahl dieser Parameter bestimmt, in welchem Ausmaß ODQ und NS2028 die NO-stimulierte NO GC inhibieren können. Aus diesem Projektteil resultiert, dass man den Einsatz dieser Inhibitoren nicht, wie vielfach in der Literatur vorzufinden, als Beweis für cGMP unabhängige Effekte nutzen sollte. N2 - The nitric oxide (NO)/cGMP signal transduction has a prominent role in the control of smooth muscle tone. Besides its outstanding function in vascular relaxation NO is a major inhibitory neurotransmitter in the gastrointestinal (GI) tract. It acts predominantly via NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) which consists of two subunits (α and ß). Deletion of the ß1 subunit in the mouse leads to a global NO-GC knockout (GCKO). In the GI tract, expression of NO-GC is detected in smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC) and fibroblast-like cells (FLC). Using cell-specific knock-out mice the impact of NO/cGMP-signaling on regulation of contraction and relaxation in the respective GI cell types was investigated. SMC- and ICC-specific GCKO mice already existed in our lab whereas FLC-specific GCKO mice were generated and then crossed to obtain double and triple mutants. GI smooth muscle from FLC-GCKO mice shows a WT-like relaxation towards NO. Also tissue from FLC/ICC- and FLC/SM-GCKO mice can be relaxed by addition of NO. Only deletion of NO-GC in all three cell types leads to an abolished relaxation as seen in GCKO tissue. Surprisingly, FLC-GCKO mice show an accelerated gut transit time in comparison to WT animals. These results lead to the conclusion that NO-GC in all three GI cell types mediates nitrergic signaling in smooth muscle, even though in different ways. There seems to be an interaction of the three cell types which needs to be further attended to by investigation of the double- and triple-GCKO mutants. The second part of this project engaged in the investigation of NO-GC in the lower urinary (LU) tract. Here, expression of NO-GC is detected in urethra and urinary bladder. Urethral NO-GC is expressed in SMC whereas in the urinary bladder NO-GC expression can only be detected in interstitial cells. As a consequence, NO-induced urethral relaxation is exclusively dependent on SMC. Bladder smooth muscle does not reveal NO-mediated relaxation. The identification and function of the NO-GC expressing interstitial cells remains to be further investigated. Investigation of the NO-GC inhibitors ODQ and NS2028 shows that their efficiency is dependent on three different factors: (1) class of NO donor, (2) incubation time of the inhibitor and the NO donor and (3) the strength of pre-contraction when using smooth muscle tissue. The choice of these parameters determines to which extent ODQ and NS2028 are able to inhibit NO-GC. For that reason use of these inhibitors should not be taken as proof of cGMP-independent effects. KW - Glatte Muskulatur KW - Gastrointestinaltrakt KW - NO-sensitive Guanylyl-Cyclase KW - unterer Harntrakt KW - NO-sensitive guanylyl cyclase KW - lower urinary tract KW - gastrointestinal tract KW - smooth muscle KW - Maus KW - Knockout KW - Stickstoffoxide KW - Cyclo-GMP KW - Signaltransduktion Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85499 ER - TY - THES A1 - Latz, Andreas T1 - Lokalisation, Funktion und Regulation pflanzlicher Tandem-Poren-Kaliumkanäle in Arabidopsis thaliana T1 - Localization, function and regulation of plant tandem-pore potassium-channels in Arabidopsis thaliana N2 - Lokalisation - Alle TPKs bis auf TPK4, der in der Plasmamembran lokalisiert ist, sind im Tonoplasten lokalisiert. - Das 14-3-3-Bindemotiv bzw. der komplette N-Terminus spielt im Gegensatz zu den tierischen TPK´s keine Rolle beim Targeting (und evtl. auch beim Assembly), da ein Austausch der N-Termini bzw. Mutationen im 14-3-3- Bindemotiv keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation hat. - Im C-Terminus ist möglicherweise ein strukturelles Motiv bzw. eine Erkennungssequenz für das Targeting in unterschiedliche Zielmembranen lokalisiert. Eventuell ist hier auch eine Assembly-Domäne für den Zusammenbau der unterschiedlichen Kanaluntereinheiten vorhanden. TPK4 - Der Kaliumkanal TPK4 wird nach Agro-Infiltration in dem pflanzlichen Expressionssystem Nicotiana benthamiana exprimiert. - TPK4 ist auch in diesem Expressionssystem in der Plasmamembran der Zelle lokalisiert. - Die Ströme, welche aus Mesophyllzellen von TPK4 infiltrierten Blättern abgeleitet wurden, gleichen denen, von TPK4 exprimierenden Oocyten von Xenopus laevis. Somit hat TPK4 in beiden Expressionssystemen die gleichen elektrophysiologischen Eigenschaften. TPK1 - TPK1 bindet über die C-terminalen EF-Hände Calcium und wird durch diese Interaktion aktiviert. - TPK1 interagiert phosphospezifisch und isotypspezifisch mit dem 14-3-3- Protein GRF6. Diese Interaktion führt zur Aktivierung des Kanals. - Die Kinasen CPK3 und CPK29, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 phosphorylieren um eine Interaktion mit 14-3-3-Proteinen zu ermöglichen, gehören zur Familie der CDPKs - Diese Kinasen sind selbst Calcium aktiviert und aller Wahrscheinlichkeit nach unter physiologischen Bedingungen inaktiv. Erst ein Anstieg der freien Calciumkonzentration führt zur Aktivierung der Kinase in der Zelle und damit zur Aktivierung des Kanals. - Das 14-3-3-Bindemotiv ist das einzige Target der CDPK´s im N-Terminus von TPK1 - Die Phosphatase, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 dephosphoryliert gehört zur Familie der PP2A-Proteinphosphatasen. - Es ist möglich, dass die Kinase und damit auch der Kanal durch Salzstress und durch Kaliumunterversorgung aktiviert werden und somit die Signalkaskade für die Aktivierung von TPK1 über Kinasen/14-3-3/Calcium in einen stressphysiologischen Kontext involviert ist. - tpk1.3- und cpk3.1-Verlustmutanten zeigen eine Reduktion in der Keimungsrate unter Salzstress und limitierten Kaliumangebot. Es kann über einen funktionalen Komplex bestehend aus TPK1 und TPC1 zur Aufrechterhaltung der Na+/K+-Homeostase und der elektroneutralen Aufnahme von Na+ in die Vakuole unter Salzstressbedingungen spekuliert werden. N2 - Localization - All TPK´s with the exception of TPK4 are located in the tonoplast. TPK4 however is localized in the plasmamembrane. - The 14-3-3 binding motif and the whole N-terminus does not play a role in the targeting process because swapping the N-termini has no effect on the targeting - The C-terminus might harbour a targeting motif as well as an assembly domain TPK4 - TPK4 is expressed in Nicotiana benthamiana after agro-infiltration and is localized in the plasmamembrane. - The electrophysiological properties of TPK4 expressed in tobacco are similar to TPK4 expressed in oocytes of Xenopus laevis. TPK1 - TPK1 interacts with the 14-3-3 protein GRF6 in a phosphospecific and isotypspecific manner. - Interaction of TPK1 with GRF6 leads to channel activation. - The kinases CPK3 and CPK29 are able to phosphorylate the 14-3-3 binding motif of TPK1 in vitro. - These kinases are activated by elevated levels of free cytosolic calcium. - The phosphatase responsible for the dephosphorylation of the 14-3-3 binding domain of TPK1 belongs to the family of the PP2A proteinphosphatases. - It is possible that the kinases are activated under salt stress conditions and thereby phosphorylate the 14-3-3 binding domain of TPK1 leading to the interaction with GRF1 and activation of TPK1. - Germination is reduced under salt stress conditions and limited K+ supply in tpk1.3 and cpk3.1 knockout plants. KW - Ackerschmalwand KW - Signaltransduktion KW - Vakuole KW - Kaliumkanal KW - Salzstress KW - 14-3-3 KW - Calcium KW - Proteinkinase KW - 14-3-3 . calcium KW - protein kinase Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24915 ER - TY - THES A1 - König, Anika T1 - The role of the transcriptional regulators NFATc1 and Blimp-1 in follicular T-cells T1 - Die Rolle der Transkriptionsregulatoren NFATc1 und Blimp-1 in follikulären T-Zellen N2 - The defense against invading pathogens is, amongst other things, mediated via the action of antibodies. Class-switched antibodies and antibodies of high affinity are produced by plasma cells descending from germinal center B (GCB) cells. GCB cells develop in the germinal center (GC), a specialized microstructure found in the B-cell follicle of secondary lymphoid organs. GCB-cell maturation and proliferation are supported by follicular T- helper (Tfh) cells. On the other hand, follicular regulatory T (Tfr) cells control this process in quantity and quality preventing, for instance, the formation of autoantibodies directed against endogenous structures. The development of GCB, Tfh and Tfr cells essentially depends on the migration into the GC, which is mediated via the expression of the chemokine receptor CXCR5. One transcription factor highly expressed in follicular T cells, comprising Tfh and Tfr cells, is NFATc1. Tfr cells additionally express the transcriptional repressor Blimp-1, which is not expressed in Tfh cells. We found that NFATc1 is transactivating Cxcr5 via response elements in the promoter and enhancer in vitro. Blimp-1 binds to the same elements, transactivating Cxcr5 expression in cooperation with NFATc1, whilst mediating Cxcr5- repression on its own. In Tfr cells Blimp-1 suppresses CXCR5 expression in the absence of NFATc1. Blimp-1 itself is necessary to restrict Tfr-cell frequencies and to mediate Tfr- cell function as in mice with Blimp-1-ablated Tregs high frequencies of Tfr cells do not reduce GCB- or Tfh cell frequencies. NFATc1 and Blimp-1 double deficient Tfr cells show additional loss of function, which becomes visible in clearly expanded antibody titers. To evaluate the function of NFATc1 in Tfr cells, we not only deleted it, but also overexpressed a constitutive active form of NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatory T cells (Tregs). The latter is leading to an upregulation of CXCR5 per cell, without changing Tfh or Tfr-cell frequencies. However, the high density of surface CXCR5 enhances the migration of Tfr cells deep into the GC, which results in a tighter control of the antigen- specific humoral immune response. Additionally, caNFATc1/aA increases the expression of genes coding for Tfr effector molecules like Il1rn, Il10, Tigit and Ctla4. Interestingly, this part of the transcriptional change is dependent on the presence of Blimp-1. Furthermore, Blimp-1 regulates the expression of multiple chemokine receptor genes on the background of caNFATc1/aA. In contrast, when caNFATc1/aA is overexpressed in all T cells, the frequencies of Tfh- and GCB cells are dominantly reduced. This effect seems to stem from the conventional T- cell (Tcon) side, most probably originating from increased secretion of interleukin-2 (IL- 2) via the caNFATc1/aA overexpressing Tcons. IL-2 is known to hinder the germinal center reaction (GCR) and it might in its abundance not be neutralizable by Tfr cells. Taken together, NFATc1 and Blimp-1 cooperate to control the migration of Tfr cells into the GC. Tfr cells in the GC depend on NFATc1 and Blimp-1 to perform their proper function. Overexpression of caNFATc1 in Tregs strengthens Tfr function in a Blimp-1-dependent manner, whilst overexpression of caNFATc1 in all T cells dominantly diminishes the GCR. N2 - Die Abwehr von Krankheitserregern durch das Immunsystem wird unter anderem (u.a.) durch die Wirkung von Antikörpern vermittelt. Antikörper, welche einen Klassenwechsel und eine hohe Affinität aufweisen, werden von Plasmazellen gebildet, welche sich von Keimzentrums-B (GCB) -Zellen ableiten. GCB-Zellen evolvieren innerhalb des Keimzentrums (GC), einer Mikrostruktur, welche sich innerhalb des B-Zellfollikels sekundärer lymphoider Organe bildet. Die GCB-Zell-Reifung und -Proliferation wird durch follikuläre T-Helfer (Tfh) -Zellen unterstützt und durch follikuläre regulatorische T (Tfr) -Zellen kontrolliert, wodurch u.a. die Bildung von Autoantikörpern, welche körpereigene Strukturen angreifen, unterbunden wird. Die Entwicklung von GCB-, Tfh- und Tfr-Zellen ist in entscheidender Weise abhängig von der Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 und der damit verbundenen Migration in das GC. NFATc1 ist ein Transkriptionsfaktor, welcher in follikulären T-Zellen, bestehend aus Tfh- und Tfr-Zellen, stark exprimiert wird. Im Gegensatz zu Tfh-Zellen exprimieren Tfr-Zellen zusätzlich den Transkriptionsrepressor Blimp-1. Wir haben herausgefunden, dass NFATc1 die Expression von Cxcr5 über die Bindung an Elemente innerhalb des Cxcr5-Promotors und -Enhancers in vitro transakiviert. Blimp-1 bindet an selbige Elemente und transaktiviert in Kooperation mit NFATc1 die Cxcr5-Expression, während es die Cxcr5- Expression alleine hemmt. In Tfr-Zellen supprimiert Blimp-1 die CXCR5-Expression in Abwesenheit von NFATc1. Blimp-1 beschränkt darüber hinaus das Vorkommen von Tfr-Zellen und spielt eine Rolle in der Effektorfunktion von Tfr-Zellen. Dies wird deutlich da das verstärkte Tfr-Zell-Vorkommen in Mäusen mit Blimp-1 defizienten Tregs nicht zu einer Reduktion der GCB-oder Tfh-Zellen führt. Der Verlust der Effektorfunktion akkumuliert in NFATc1 und Blimp-1 doppel-defizienten Tfr-Zellen, was sich in einem deutlichen Anstieg der Antikörpertiter im Serum immunisierter Tiere zeigt. Zur Überprüfung der Funktion von NFATc1 in Tfr-Zellen untersuchten wir sowohl dessen Deletion, als auch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form von NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatorischen T-Zellen (Tregs). Letztere steigert die CXCR5- Expression pro Zelle ohne das Vorkommen von Tfh- oder Tfr-Zellen zu verändern. Jedoch führte die erhöhte Oberflächenexpression von CXCR5 zu einer verstärkten Migration der Tfr-Zellen in das GC, was in einer verstärkten Kontrolle der antigenspezifischen Antikörpertiter resultierte. Darüber hinaus erhöht caNFATc1/aA in Abhängigkeit von Blimp-1, die Expression der Gene Il1rn, Il10, Tigit und Ctla4, welche mit der Effektorfunktion von Tfr-Zellen assoziiert werden. Blimp-1 wirkt auf dem Hintergrund der Überexpression von NFATc1 vor allem regulierend auf die Expression von Chemokinrezeptorgenen. Im Gegensatz zur Überexpression von caNFATc1/aA in Tregs allein, führt selbige Veränderung in allen T-Zellen zu einer deutlichen Reduktion des Vorkommens von Tfh- und GCB-Zellen nach Immunisierung. Dieser Effekt scheint durch konventionelle T-Zellen (Tcons) vermittelt zu sein und entsteht vermutlich durch eine erhöhte Sekretion von Interleukin-2 (IL-2) durch die caNFATc1/aA überexprimierenden Tcons. Dieses IL-2 scheint in seiner Menge nicht durch die vorliegenden Tfr-Zellen neutralisierbar zu sein und die Keimzentrumsreaktion (GCR) zu hemmen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass NFATc1 und Blimp-1 kooperieren, um die Migration von Tfr-Zellen in das GC zu kontrollieren. Tfr-Zellen im GC sind in der Erfüllung ihrer ordnungsgemäßen Funktion abhängig von NFATc1 und Blimp-1. Die Überexpression von caNFATc1 in Tregs stärkt die Funktion von Tfr-Zellen in einer Blimp-1-abhängigen Weise, während die Überexpression von caNFATc1 in allen T-Zellen die GCR extrem minimiert. KW - Signaltransduktion KW - NFATc1 KW - follikuläre regulatorische T-Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Blimp-1 KW - CXCR5 KW - germinal center KW - follicular regulatory T cell KW - Keimzentrumsreaktion KW - Zellmigration KW - Immunisierung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209727 ER - TY - THES A1 - Kwon, Soon Hwan T1 - Untersuchung zur Rolle von Notch1 in T-Zellentwicklung und Lymphomgenese T1 - Analysis to the role of Notch1 in t-cell development and lymphomagenesis N2 - Notch Proteine gehören zu einer Familie hochkonservierter Transmembranrezeptoren, die bei Entwicklungsprozessen, beispielsweise im hämatopoetischen System, eine bedeutende Rolle spielen. So konnte eine Beteiligung von Notch und seinen Liganden bei der Differenzierung lymphatischer Zellen im Knochenmark, Thymus sowie in peripheren Organen gezeigt werden. Insbesondere unterdrückt Notch1 nach Ligandenbindung die Bildung von B-Zellen im Thymus und fördert stattdessen die Entwicklung von T-Zellen. Durch Aktivierung der γ-Sekretase wird die intrazelluläre Domäne von Notch1 freigesetzt und transloziert in den Kern. Dort wirkt Notch1 zusammen mit Proteinen der CSL Familie als Transkriptionsfaktor und reguliert so die Expression von Zielgenen wie beispielsweise HES1. Weiterhin kann die Signaltransduktion von Notch1 im Zytosol durch Wechselwirkung mit Proteinen wie Numb oder Deltex1 moduliert werden. Angesichts der Fähigkeit, die Proliferation unreifer Zellen aufrecht zu erhalten, kann eine aberrante Expression von Notch1 zur Entstehung von Neoplasien beitragen. Numb wird eine wichtige Rolle in der Regulation von Notch1 zugeschrieben, doch seine genaue Funktion in der T-Zellentwicklung ist unklar. Die Klonierung aller vier in der Ratte exprimierten Isoformen erlaubte erstmals deren detaillierte Charakterisierung. Die differentielle Expression und die preferentielle Interaktion von Numb i/o mit Notch1 deuten darauf hin, dass den verschiedenen Splice-Varianten nicht nur in der T-Zellentwicklung sondern auch in der Kontrolle von Notch1 unterschiedliche Funktionen zukommen. Diese Schlussfolgerung wird durch eine spezifische Expression der Numb Isoformen in humanen T-ALL Zelllinien weiter unterstützt. Transgene Ratten welche die intrazelluläre Domäne von Notch1 (N1IC) unter der Kontrolle des proximalen lck-Promoters überexprimieren (NICA), sind ein geeignetes Werkzeug, um die Rolle von Notch1 für die Genexpression und die Lymphomgenese zu untersuchen. Junge NICA-Ratten exprimieren N1IC spezifisch in Thymozyten, nicht jedoch in peripheren T-Zellen. In Folge dessen kommt es zu einer starken Expression bekannter Notch1 Zielgene, unter anderem dem präTα Rezeptor. Dies wiederum führt zur Substitution klassischer T-Zellrezeptor-Komplexe durch den präT-Zellrezeptor, was in adulten Tieren zur Entwicklung von thymischen Lymphomen beiträgt. Die Lymphomzellen in NICA-Ratten exprimieren das N1IC-Transgen sowohl im primären Tumor als auch nach Infiltration peripherer Organe. Dabei könnte die beobachtete Hochregulation von Notch3 ein möglicher Mechanismus der Tumorgenese in NICA-Ratten darstellen. Um die Ursache der Lymphomgenese besser zu verstehen, wurde eine genomweite Expressionsanalyse der Tumore mittels SAGE und Affymetrix DNA-Chips durchgeführt. Dabei wurden zahlreiche potentiell bedeutende Gene identifiziert, welche bei der Notch1-vermittelten Lymphomgenese eine Rolle spielen könnten. Die Beobachtung, dass ein Teil dieser Gene auch in humanen T-ALL-Zelllinien verändert ist, unterstreicht deren Bedeutung auch für die Pathogenese des Menschen. Eines der in NICA-Lymphomen am stärksten veränderten Gene wurde bislang weder in der Literatur noch in Sequenzdatenbanken beschrieben. Dieses von uns als Nip1 bezeichnete Protein ähnelt einem Enzym aus dem Isoprenoid-Stoffwechsel und ist vor allem im Thymus exprimiert. Ein anderes interessantes Kandidatengen ist CD30, ein Transmembran-Rezeptor welcher bei Hodgkin Lymphomen beschrieben wurde. Neben T-ALL wurde auch bei Hodgkin Lymphomen eine wichtige Rolle von Notch1 berichtet. Dabei könnte dessen hohe Expression im Zusammenhang mit der Transformation und dem Verlust der B-Zell-Identität dieser Tumore stehen. Um dies näher zu untersuchen, wurde Notch1 mittels RNAi bzw. durch Überexpression des negativen Regulators Deltex1 in Hodgkin-Zelllinien inaktiviert. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse unterstützen die These, dass nach Repression der Notch1 Aktivität die Expression B-Zellspezifischer Marker wieder gewonnen werden kann. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine bedeutende Funktion von Notch1 bei der T-Zellentwicklung und der Entstehung von Lymphomen hin. Dabei scheint insbesondere die Interaktion mit Proteinen wie Numb und Deltex1 sowie die Regulation der Genexpression wichtig zu sein. Die gewonnenen Daten könnten in Zukunft einen neuen Ansatzpunkt zur Entwicklung verbesserter Strategien zur Therapie von Krebserkrankungen des hämatopoetischen System bilden. N2 - Notch proteins belong to a family of highly conserved transmembrane receptors, which play an important role in development processes such as in the hematopoietic system. Participation of Notch and its ligands could be demonstrated during differentiation of lymphatic cells in the bone marrow, thymus as well as in peripheral organs. After ligand binding, Notch1 particularly suppresses the formation of B-cells in the thymus while promoting the development of T-cells. The intracellular domain of Notch1 is released by activated γ-secretase and translocates into the nucleus. There, Notch1 and proteins of the CSL family act as a transcription factor and regulate the expression of target genes, for example HES1. Furthermore, signal transduction by Notch1 is modulated within the cytosol by interaction with proteins such as Numb or Deltex1. In view of the ability to maintain the proliferation of immature cells, aberrant Notch1 expression can also contribute to the formation of neoplasias. Numb is attributed an important role in the regulation of Notch1, but its exact function in T-cell development remains unclear. Cloning of all four Numb iso-forms in the rat permitted for the first time their detailed characterisation. The differential expression and the preferential interaction of Numb i/o with Notch1 indicate that the different splice variants not only play distinct roles in T-cell development but also in the control of Notch1 function. The observation that the Numb iso-forms in human T-ALL cell lines are also differentially expressed further supports this conclusion. Transgenic rats (NICA) which overexpress the intracellular domain of Notch1 under the control of the proximal lck promoter (N1IC), are a suitable tool to study the role that Notch1 has for gene expression and lymphomagenesis. Young NICA rats specifically express N1IC in thymocytes but not in peripheral T-cells. This leads to a strong expression of Notch1 target genes, e.g. the preTα chain. Consequently, classical TCR complexes are substituted by the preT cell receptor, which presumably contributes to the development of thymic lymphomas in adult animals. The lymphoma cells in NICA rats express the N1IC transgene both in the primary tumor and after infiltration of peripheral organs. In this context, the observed upregulation of Notch3 could represent a possible mechanism of tumorigenesis in NICA rats. In order to understand the cause of the lymphomagenesis, a genome-wide expression analysis of the tumors was accomplished by means of SAGE and Affymetrix DNA chips. Numerous potentially meaningfull genes were identified, which could play a role for Notch1-dependent lymphomagenesis. The observation that part of these genes is also altered in human T-ALL cell lines, underlines their meaning also for human pathogenesis. One of the genes that was most strongly upregulated in NICA lymphomas has so far neither been described in literature nor in sequence data bases. This protein, designated Nip1, resembles an enzyme from the isoprenoid metabolism and is particularly expressed in the thymus. Another interesting candidate gene is CD30, a transmembrane receptor which was described in Hodgkin lymphoma. Besides T-ALL, an important role of Notch1 was also reported in the context of Hodgkin lymphomas. Its high expression is potentially related to the transformation and loss of the B-cell identity of these tumor. In order to examine this in more detail, Notch1 was inactivated in Hodgkin lymphoma cell lines by means of RNAi and by overexpression of the negative modulator Deltex1. The results that have hereby been obtained are in support of the the notion that expression of B-cell specific markers can be regained after repression of Notch1 activity. In summary, the results of this work point towards an important function of Notch1 during T-cell development and the formation of lymphomas. In particular, interaction with proteins such as Numb and Deltex1 as well as regulation of gene expression appear to be important for these Notch1 functions. In the future, the obtained data could form a basis for the development of improved strategies to treat malignancies of the hematopoietic system. KW - Gen notch KW - T-Lymphozyt KW - Lymphom KW - Signaltransduktion KW - T-Zellentwicklung KW - Lymphomgenese KW - Signaltransduktion KW - t cell development KW - lymphomagenesis KW - signaltransduction Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16909 ER - TY - THES A1 - Kumar, Andreas T1 - Expression und Aufreinigung von intrazellulären Anteilen des Interleukin-4-Rezeptors als GST-Fusionsproteine und Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen T1 - Expression and Purification of Intracellular Parts of the Interleukin-4-Receptor as GST-Fusion-Proteins and Detection of Protein-Protein-Interactions N2 - In dieser Doktorarbeit wurden zwei intrazelluläre Anteile des IL-4 Rezeptors als GST-Fusionsproteine exprimiert. GST-E1, in dem das cytoplasmatische membranproximale 1/3 von IL-4Ralpha (173 AS) einschließlich des Box 1 Motivs an GST fusioniert ist, konnte nach differenzierter De- und Renaturierung und Bindung an Glutathion-Sepharose Matrix in elektrophoretisch reiner Form aufgereinigt werden. GST-gammainP5D4, in dem die intrazelluläre Domäne von gamma c an GST gebunden vorliegt, konnte nur als heterogenes Gemisch mit 4 C-terminal verkürzten Fraktionen erhalten werden. Mit diesen rekombinanten Fusionsproteinen wurden Immunpräzipitationsversuche in Lysaten IL-4R-transfizierter Ba/F3 Zellen vor und nach Stimulation mit IL-4 durchgeführt. Für GST-E1 wurde eine Wechselwirkung mit Jak1 nachgewiesen, die dem bisherigen Kenntnisstand entspricht; für GST-ginP5D4 hingegen konnte eine Wechselwirkung mit Jak3 nicht gezeigt werden. Beide Proteine sind in der Lage, STAT5 zu präzipitieren; diese Bindung erscheint unabhängig von der IL-4 Stimulation der Zellen und läßt neue Spekulationen über den Mechanismus der Signaltransduktion durch STAT5 zu. Danach könnten nach den hier gewonnenen Informationen beide IL-4-Rezeptorketten jeweils ein STAT5 Molekül zur STAT5-Dimerisirerung nach Rezeptoraktivierung beitragen. Es ist somit gelungen, ein in-vitro-Modell zur Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen am IL-4 Rezeptor zu etablieren, welches für weitere Untersuchungen eingesetzt werden kann. N2 - Two intracellular parts of the interleukin-4-receptor were expressed as GST-fusion-proteins. GST-E1, which comprises the cytoplasmic membrane-proximal 1/3 of IL-4Ralpha (173 AS) including the box1-motif fused to GST, could be purified electrophoretically clean after differential denaturation and renaturation and specific binding to Glutathion-Sepharose Matrix. GSTgammainP5D4, which comprises the intracellular domain of gamma c fused to GST, could only be purified as a heterogenous mixture with 4 C-terminally truncated proteins. Immunoprecipitation experiments were performed in lysates of IL-4R transfected Ba/F3 cells before and after stimulation with IL-4. For GST-E1, an interaction with Jak1 was shown, reflecting the current state of knowledge; however, an interaction with Jak3 could not be shown for GSTgamma in P5D4. Both proteins are able tp precipitate STAT5; this binding appears independet of IL-4 stimulation of the cells and allows for new speculations on the signal transduction mechanism by STAT5. According to the information gained in this work, both IL-4-receptor chains could contribute one STAT5 molecule to STAT5 dimerisation after receptor activation. Therefore, the goal was achieved to establish an in-vitro-model for the detection of protein-protein interactions on the interleukin-4-receptor, which can be used for further investigations. KW - Interleukin-4 KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - GST-Fusionsprotein KW - Jak/ STAT KW - Interleukin-4 KW - receptor KW - signal transduction KW - GST fusion protein KW - Jak/ STAT Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5338 ER -