TY  - JOUR
A1  - Rostás, Michael
T1  - The effects of 2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-one on two species of Spodoptera and the growth of Setosphaeria turcica in vitro
N2  - Maize seedlings contain high amounts of glucosidically bound 2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-one (DIMBOA). The effects of DIMBOA on the feeding behaviour and performance of two noctuids, Spodoptera exigua Hübner and S. frugiperda Smith, were compared. The question was raised whether S. frugiperda, preferring maize and other Poaceae, is better adapted to DIMBOA than S. exigua. In addition, the effects of DIMBOA on the mycelial growth of the plant pathogen Setosphaeria turcica Leonard et Suggs (causal agent of northern corn leaf blight) was assessed in vitro. DIMBOA had an antifeedant effect on S. exigua but stimulated feeding in S. frugiperda in dual-choice experiments. In a no-choice setup, larvae of S. exigua gained less biomass and had a prolonged development when feeding on an artificial diet containing DIMBOA. However, pupal weight was not significantly different between treatments. In contrast, larvae of S. frugiperda were not affected by DIMBOA. Strong detrimental effects of DIMBOA were found on the mycelial growth of the pathogen S. turcica.
KW  - Eulen <Schmetterlinge>
KW  - Pilzbefall
KW  - Mais
KW  - DIMBOA
KW  - Abwehr
KW  - DIMBOA
KW  - Performance
KW  - Spodoptera
KW  - Fungus
KW  - Zea mays
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35079
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zhou, Yang
T1  - The Exploitation of Opsin-based Optogenetic Tools for Application in Higher Plants
T1  - Die Nutzung von optogenetischen Werkzeugen auf Opsin-Basis für die Anwendung in höheren Pflanzen
N2  - The discovery, heterologous expression, and characterization of channelrhodopsin-2 (ChR2) – a light-sensitive cation channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii – led to the success of optogenetics as a powerful technology, first in neuroscience. ChR2 was employed to induce action potentials by blue light in genetically modified nerve cells. In optogenetics, exogenous photoreceptors are expressed in cells to manipulate cellular activity. These photoreceptors were in the beginning mainly microbial opsins. During nearly two decades, many microbial opsins and their mutants were explored for their application in neuroscience. Until now, however, the application of optogenetics to plant studies is limited to very few reports. Several optogenetic strategies for plant research were demonstrated, in which most attempts are based on non-opsin optogenetic tools. Opsins need retinal (vitamin A) as a cofactor to generate the functional protein, the rhodopsin. As most animals have eyes that contain animal rhodopsins, they also have the enzyme - a 15, 15'-Dioxygenase - for retinal production from food-supplied provitamin A (beta-carotene). However, higher plants lack a similar enzyme, making it difficult to express functional rhodopsins successfully in plants. But plant chloroplasts contain plenty of beta-carotene. I introduced a gene, coding for a 15, 15'-Dioxygenase with a chloroplast target peptide, to tobacco plants. This enzyme converts a molecule of β-carotene into two of all-trans-retinal. After expressing this enzyme in plants, the concentration of all-trans-retinal was increased greatly. The increased retinal concentration led to increased expression of several microbial opsins, tested in model higher plants. Unfortunately, most opsins were observed intracellularly and not in the plasma membrane. To improve their localization in the plasma membrane, some reported signal peptides were fused to the N- or C-terminal end of opsins. Finally, I helped to identify three microbial opsins -- GtACR1 (a light-gated anion channel), ChR2 (a light-gated cation channel), PPR (a light-gated proton pump) which express and work well in the plasma membrane of plants. The transgene plants were grown under red light to prevent activation of the expressed opsins. Upon illumination with blue or green light, the activation of these opsins then induced the expected change of the membrane potential, dramatically changing the phenotype of plants with activated rhodopsins. 

This study is the first which shows the potential of microbial opsins for optogenetic research in higher plants, using the ubq10 promoter for ubiquitous expression. I expect this to be just the beginning, as many different opsins and tissue-specific promoters for selective expression now can be tested for their usefulness. It is further to be expected that the here established method will help investigators to exploit more optogenetic tools and explore the secrets, kept in the plant kingdom.
N2  - Die Entdeckung, heterologe Expression und Charakterisierung von Channelrhodopsin-2   (ChR2)   -   einem   lichtempfindlichen   Kationenkanal,   der   in   der   Grünalge   Chlamydomonas  reinhardtii  vorkommt  -  führte  zum  Erfolg  der  Optogenetik  als  leistungsfähige  Technologie,  zunächst  in  den  Neurowissenschaften.  ChR2  wurde  eingesetzt,    um    in    genetisch    veränderten    Nervenzellen    durch    blaues    Licht    Aktionspotentiale zu induzieren. Bei der Optogenetik werden exogene Photorezeptoren in Zellen exprimiert, um die zelluläre Aktivität zu manipulieren. Diese Photorezeptoren waren anfangs hauptsächlich mikrobielle Opsine. Im Laufe von fast zwei Jahrzehnten wurden  viele  mikrobielle  Opsine  und  ihre  Mutanten  für  ihre  Anwendung  in  den  Neurowissenschaften  erforscht.  Bis  jetzt  ist  die  Anwendung  der  Optogenetik  in  der  Pflanzenforschung  jedoch  auf  sehr  wenige  Arbeiten  beschränkt.  Es  wurden  mehrere  optogenetische  Strategien  für  die  Pflanzenforschung  aufgezeigt,  wobei  die  meisten  Versuche  auf  optogenetischen  Werkzeugen,  die  nicht  Opsine  sind,  beruhen.  Opsine  benötigen   Retinal   (Vitamin   A)   als   Kofaktor,   um   das   funktionelle   Protein,   das   Rhodopsin, zu generieren. Da die meisten Tiere Augen haben, die tierische Rhodopsine enthalten,  verfügen  sie  auch  über  das  Enzym  -  eine  15,  15'-Dioxygenase  -  zur  Retinalproduktion  aus  mit  der  Nahrung  zugeführtem  Provitamin  A  (Beta-Carotin).  Höheren  Pflanzen  fehlt  jedoch  ein  ähnliches  Enzym,  was  es  schwierig  macht,  funktionale Rhodopsine erfolgreich in Pflanzen zu exprimieren. Aber die Chloroplasten der Pflanzen enthalten reichlich Beta-Carotin. Ich führte ein Gen, das für eine 15, 15'-Dioxygenase mit einem Chloroplasten-Zielpeptid kodiert, in Tabakpflanzen ein. Dieses Enzym  wandelt  ein  Molekül  β-Carotin  in  zwei  Moleküle  all-trans-Retinal  um.  Nach  Expression dieses Enzyms in Pflanzen wurde die Konzentration von all-trans-Retinal stark erhöht. ...
KW  - optogenetics
KW  - opsins
KW  - higher plants
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-236960
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stuntz, Sabine
T1  - The influence of epiphytes on arthropods in the tropical forest canopy
T1  - Der Einfluss von Epiphyten auf Arthropoden in tropischen Baumkronen
N2  - The understanding of the mechanisms underlying the establishment and maintenance of the extraordinary biodiversity in tropical forests is a major challenge for modern biology. In this context, epiphytes are presumed to play an important role. To investigate the biological reality of this persistent yet insufficiently investigated notion, I conducted the present study. The main questions I intended to clarify were: (1) do epiphytes affect arthropod abundance and diversity in tropical tree crowns? and (2) what might be the driving forces behind this potential influence? I studied the arthropod fauna of 25 tree crowns bearing different epiphyte assemblages, and the resident fauna of 90 individual epiphytes. I also quantified the mitigating influence of epiphytes on the microclimate in tree crowns. In total, more than 277,000 arthropods were collected and about 700 morphospecies determined. Epiphytes had a significant moderating influence on canopy microclimate (Chapter 3), both at various microsites within a tree crown and among tree crowns with different epiphyte growth. On hot dry season days, they provided microsites with lower temperatures and reduced evaporative water loss compared to epiphyte-free spaces within the same tree crown. Quantitative sampling of the arthropods inhabiting three different epiphyte species provided compelling evidence for the specificity of epiphyte-associated faunas (Chapter 4). Epiphytes proved to be microhabitats for a diverse and numerous arthropod fauna, and different epiphyte species fostered both taxonomically and ecologically very distinct arthropod assemblages: among epiphyte hosts, the inhabitant faunas showed remarkably little species overlap, and guild composition differed strongly. In the subsequent chapters I investigated if this pronounced effect scaled up to the level of entire tree crowns. Arthropods were captured with three different trap types to obtain an ample spectrum of the canopy fauna (Chapter 2). Four tree categories were classified, three of which were dominated by a different species of epiphyte, and an epiphyte-free control group. On a higher taxonomic level, there were no detectable effects of epiphytes on the fauna: the ordinal composition was similar among tree categories and indifferent of the amount of epiphytes in a tree crown (Chapter 5). I examined three focal groups (ants, beetles and spiders) on species level. The diversity and abundance of ants was not influenced by the epiphyte load of the study trees (Chapter 6). Although many species readily used the epiphytes as nesting site and shelter, they seemed to be highly opportunistic with respect to their host plants. Likewise, the species richness and abundance of beetles, as well as their guild composition were entirely unaffected by the presence of epiphytes in the study trees (Chapter 7). Focusing on herbivorous beetles did not alter these results. Spiders, however, were strongly influenced by the epiphyte assemblages of the host trees (Chapter 8). Overall spider abundance and species richness did not differ among trees, but particular families and guilds exhibited marked differences in abundance between the tree categories. Most remarkable were the substantial differences in spider species composition across trees with different epiphyte assemblages. Conclusion Thus, the prevalent notion that epiphytes positively influence arthropod diversity in tropical canopies seems justified, but not without reservation. Whether an influence of epiphytes on the fauna was discernible depended greatly on (1) the scale of the investigated system: clear faunal distinctions at the microhabitat level were absent or much more subtle at the level of tree crowns. (2) the focal taxa: different arthropod orders allowed for completely different statements concerning the importance of epiphytes for canopy fauna. I therefore recommend a multitaxon approach for the investigation of large-scale ecological questions. In conclusion, I resume that epiphytes are associated with a species-specific inhabiting fauna,and that epiphytes impose an influence on certain, but not all, taxa even at the level of entire tree crowns. Although I could only hypothesize about the potential causes for this influence, this study provided the first comprehensive investigation of the role of epiphytes in determining arthropod abundance and diversity in tropical tree crowns.
N2  - Eines der zentralen Themen der modernen Biologie ist die Erforschung der Ursachen für die außerordentlich hohe Biodiversität tropischer Regenwälder. In diesem Zusammenhang wird den Epiphyten häufig eine bedeutsame Rolle zugeschrieben. In der vorliegenden Studie sollte diese gängige aber unzulänglich belegte Vorstellung erforscht werden. Zwei Fragen standen dabei im Mittelpunkt: (1) Beeinflussen Epiphyten den Arten- und Individuenreichtum in tropischen Baumkronen? (2) Was könnten die treibenden Kräfte für diesen potentiellen Einfluss sein? Um diesen Fragen auf den Grund zu gehen, erforschte ich die Arthropodenfaunen von 25 Baumkronen mit verschiedenem Epiphytenbewuchs, sowie die Zönosen im Inneren von 90 einzelnen Epiphyten. Darüber hinaus quantifizierte ich den mildernden Einfluss von Epiphyten auf das Mikroklima in Baumkronen. Insgesamt wurden mehr als 277.000 Arthropoden gesammelt und ca. 700 Arten (Morphospezies) bestimmt. Die Untersuchungen bestätigten den mäßigenden Einfluss von Epiphyten auf die extremen mikroklimatischen Verhältnisse der Baumkronen (Kapitel 3). An heißen Tagen der Trockenzeit waren in der unmittelbaren Umgebung von Epiphyten deutlich niedrigere Temperaturen sowie geringerer evaporativer Wasserverlust zu verzeichnen, verglichen mit exponierten Mikro-Standorten in derselben Baumkrone. Die quantitative Erfassung der Arthropoden, die verschiedene Epiphyten bewohnten, belegte klar die Spezifität der epiphyten-assoziierten Fauna (Kapitel 4). Epiphyten erwiesen sich als Mikrohabitate für eine diverse und individuenreiche Arthropodengesellschaft. Die Zönosen verschiedener Arten von Epiphyten unterschieden sich erheblich in ihrer Arten- und Gildenzusammensetzung. Parallel dazu erforschte ich, ob sich solchermaßen starke Effekte der epiphytischen Flora auch auf dem Niveau ganzer Baumkronen weiterverfolgen ließen. Arthropoden wurden mittels verschiedener Fallentypen gesammelt, um ein möglichst breites Spektrum der Kronenfauna zu erhalten (Kapitel 2). Ich teilte die Untersuchungsbäume in drei Kategorien mit jeweils unterschiedlichem Epiphytenbewuchs ein und in eine vierte, epiphyten-freie Kontrollgruppe. Auf höherem taxonomischen Niveau ließen sich keinerlei Effekte der Epiphyten auf die Fauna nachweisen (Kapitel 5): die ordinale Zusammensetzung der Arthropoden zeigte sich unabhängig vom Epiphytenbewuchs. Drei Tiergruppen (Ameisen, Käfer und Spinnen) wurden des Weiteren auf Artebene untersucht. Diversität und Abundanz der Ameisen blieben unbeeinflusst vom Epiphytenbewuchs der Bäume (Kapitel 6). Obwohl viele Ameisenarten die Epiphyten als Niststandort und Rückzugsort beanspruchten, schienen sie in Bezug auf ihre Wirtspflanzen eher opportunistisch zu sein. Ebenso waren Diversität, Häufigkeit und Gildenzusammensetzung der Käfer unabhängig von den Epiphyten in den untersuchten Baumkronen (Kapitel 7). Die gesonderte Betrachtung der phytophagen Käfer änderte nichts an diesen Resultaten. Spinnen jedoch wurden deutlich beeinflusst vom Epiphytenbewuchs der Bäume (Kapitel 8). Sowohl auf der Ebene einzelner Familien als auch auf Gilden- und Artniveau waren signifikante Unterschiede zwischen den Kategorien zu verzeichnen. Bemerkenswert war vor allem die unterschiedliche Artenzusammensetzung der Spinnengemeinschaften in Bäumen mit verschiedenem Epiphytenbewuchs. Fazit Die Hypothese, Epiphyten würden die Arthropodendiversität tropischer Baumkronen positiv beeinflussen, scheint gerechtfertigt, allerdings nicht ohne Vorbehalt. Die genannten Ergebnisse ließen zwei Haupttendenzen feststellen. Ob ein Effekt der Epiphyten auf die Fauna erkennbar ist hing ab von 1) dem Maßstab des Untersuchungssystems. Der klare Einfluss der Epiphyten auf Mikrohabitat-Niveau war auf dem Niveau ganzer Baumkronen nicht mehr nachweisbar oder wesentlich schwächer ausgeprägt. 2) den untersuchten Tiergruppen. Verschiedene Tiergruppen ließen sehr unterschiedliche Schlussfolgerungen in bezug auf den Einfluss der Epiphyten auf die Kronenfauna zu. Epiphyten sind mit einer artspezifischen Arthropodenfauna assoziiert, und beeinflussen darüber hinaus einige Tiergruppen auch auf der Ebene ganzer Baumkronen. Die Mechanismen dieser Wirkungen blieben weitgehend unerklärt, und aus meinen Ergebnissen und Hypothesen ergaben sich viele Fragen, die näher erforscht werden müssten. Dennoch ist durch diese Studie zum ersten Mal die Bedeutung von Epiphyten für den Arten- und Individuenreichtum von Arthropoden in tropischen Baumkronen umfassend untersucht worden.
KW  - Tropischer Regenwald
KW  - Epiphyten
KW  - Gliederfüßer
KW  - Baumkrone
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179126
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TY  - THES
A1  - Kuhlmann, Franziska
T1  - The influence of ultraviolet radiation on plant-insect interactions
T1  - Der Einfluss von ultravioletter Strahlung auf Pflanzen-Insekten Interaktionen
N2  - Plants must respond to multiple stimuli in a natural environment. Therefore they need the ability to rapidly reorganise and specifically build up appropriate metabolites to adapt to their environment. Abiotic cues, such as ambient solar radiation, influence the next trophic level directly, but also an altered plant composition triggered by these environmental cues can have an effect on the behaviour of herbivores. The aim of this study was to test effects of the important ultraviolet (UV) radiation on plants and on plant-insect interactions using multi-level investigations. The focus was on the conduction of controlled experiments with broccoli plants in highly engineered greenhouses covered with innovative materials, which only differed in their UV-B transmission. For the first time in this controlled environment the plant-mediated UV-B effects on phloem-feeding aphids were studied. Broccoli plants (Brassica oleracea L. convar. botrytis, Brassicaceae) were under filter tents either exposed to (inclusion, +UV) or not exposed to (exclusion, -UV) UV-A / UV-B radiation. In greenhouses covered with new, innovative materials transmitting high (80%), medium (23%) or low (4%) levels of ambient solar UV-B radiation, in particular the influence of UV-B radiation on broccoli was examined. Plants respond highly specific to environmental stimuli such as UV-B radiation and herbivory. UV-B radiation has a strong impact on the plants’ architecture and flavonoid contents, which can in turn influence plant-insect interactions. Phloem-feeding aphids can be negatively affected by UV-B mediated plant changes. However, a direct effect of UV radiation on the behaviour of herbivores is also evident. Mainly the number, composition and quality of herbivorous species as well as an exceeding of a certain infestation threshold determine the mode of plant changes. In conclusion, UV-B radiation has the potential to harden plants against herbivores and simultaneously increases the concentrations of valuable secondary metabolites for human nutrition in important crop species such as broccoli.
N2  - In ihrer natürlichen Umgebung sind Pflanzen verschiedensten und vor allem wechselnden Umwelteinflüssen ausgesetzt, auf die sie schnell und angemessen reagieren müssen. Das Insektenverhalten der nächsten trophischen Ebene wird direkt durch abiotische Umweltfaktoren, wie zum Beispiel Sonnenstrahlung, sowie durch daraus resultierende Veränderungen in Pflanzen gesteuert. Das Ziel dieser Untersuchung war es, herauszufinden, wie sich ultraviolette (UV) Strahlung auf Pflanzen und Pflanzen-Insekten Interaktionen auswirken kann. Dies wurde auf verschiedensten Ebenen untersucht. Mit Hilfe von speziell angefertigten Gewächshäusern konnten Brokkolipflanzen unter kontrollierten UV-B Bedingungen angezogen werden. Der Einfluss von UV-B Strahlung auf Brokkoli und von UV-B induzierten Effekten in Brokkoli auf phloem-fressende Blattläuse wurde erstmals untersucht. Die Experimente wurden mit Brokkolipflanzen (Brassica oleracea L. convar. botrytis, Brassicaceae) durchgeführt, die in Folienzelten mit unterschiedlicher UV-Strahlungsdurchlässigkeit exponiert wurden. Die Eindeckungen der Folienzelte waren entweder UV-A / UV-B durchlässig (+UV) oder undurchlässig (-UV). Gewächshäuser mit innovativen Eindeckungsmaterialien, die speziell UV-B in hohen (80%), mittleren (23%) oder geringen (4%) Mengen transmittierten, wurden genutzt, um den alleinigen Effekt von UV-B Strahlung auf Pflanzen hervorzuheben. Pflanzen reagieren auf verschiedene Umweltreize wie zum Beispiel UV-B Strahlung und Herbivorie sehr zielgerichtet. UV-B Strahlung hat einen starken Einfluss auf das Pflanzenwachstum und die Flavonoidgehalte, was wiederum Pflanzen-Insekten Interaktionen artspezifisch steuern kann. Phloem-fressende Herbivoren können durch UV-B-induzierte Pflanzenveränderungen negativ beeinflusst werden. Ein direkter UV-Effekt auf das Verhalten von Herbivoren ist jedoch ebenfalls erwiesen. Sowohl die Anzahl, Zusammensetzung und Qualität von Herbivorenarten also auch das Überschreiten einer definierten Befallsschwelle bestimmen das Ausmaß der Pflanzenveränderungen. Zusammenfassend ist zu sagen, dass UV-B Strahlung Pflanzen gegenüber Fraßfeinden abhärten und gleichzeitig die Konzentration wertvoller pflanzlicher Inhaltsstoffe für die menschliche Ernährung in Feldfrüchten erhöhen kann.
KW  - ultraviolette Strahlung
KW  - Pflanzen
KW  - Insekten
KW  - chemische Ökologie
KW  - ultraviolette Strahlung
KW  - Pflanzen
KW  - Insekten
KW  - chemische Ökologie
KW  - ultraviolet radiation
KW  - plant
KW  - insect
KW  - chemical ecology
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39608
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Tome, Filipa
A1  - Nägele, Thomas
A1  - Adamo, Mattia
A1  - Garg, Abhroop
A1  - Marco-Ilorca, Carles
A1  - Nukarinen, Ella
A1  - Pedrotti, Lorenzo
A1  - Peviani, Alessia
A1  - Simeunovic, Andrea
A1  - Tatkiewicz, Anna
A1  - Tomar, Monika
A1  - Gamm, Magdalena
T1  - The low energy signaling network
JF  - Frontiers in Plant Science
N2  - Stress impacts negatively on plant growth and crop productivity, causing extensive losses to agricultural production worldwide. Throughout their life, plants are often confronted with multiple types of stress that affect overall cellular energy status and activate energy-saving responses. The resulting low energy syndrome (LES) includes transcriptional, translational, and metabolic reprogramming and is essential for stress adaptation. The conserved kinases sucrose-non-fermenting-1-related protein kinase-1 (SnRK1) and target of rapamycin (TOR) play central roles in the regulation of LES in response to stress conditions, affecting cellular processes and leading to growth arrest and metabolic reprogramming. We review the current understanding of how TOR and SnRK1 are involved in regulating the response of plants to low energy conditions. The central role in the regulation of cellular processes, the reprogramming of metabolism, and the phenotypic consequences of these two kinases will be discussed in light of current knowledge and potential future developments.
KW  - stress
KW  - metabolism
KW  - T6P
KW  - energy signaling
KW  - TOR
KW  - bZIP
KW  - SnRK1
KW  - messenger-RNA translation
KW  - bZIP transcription fators
KW  - amino-acid-metabolism
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115813
SN  - 1664-462X
VL  - 5
IS  - 353
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Staiger, Simona
A1  - Seufert, Pascal
A1  - Arand, Katja
A1  - Burghardt, Markus
A1  - Popp, Christian
A1  - Riederer, Markus
T1  - The permeation barrier of plant cuticles: uptake of active ingredients is limited by very long-chain aliphatic rather than cyclic wax compounds
JF  - Pest Management Science
N2  - BACKGROUND: The barrier to diffusion of organic solutes across the plant cuticle is composed of waxes consisting of very long-chain aliphatic (VLCA) and, to varying degrees, cyclic compounds like pentacyclic triterpenoids. The roles of both fractions in controlling cuticular penetration by organic solutes, e.g. the active ingredients (AI) of pesticides, are unknown to date. We studied thepermeabilityof isolated leaf cuticularmembranes from Garcinia xanthochymus andPrunus laurocerasus for lipophilic azoxystrobin and theobromine as model compounds for hydrophilic AIs.

RESULTS: The wax of P. laurocerasus consists of VLCA (12%) and cyclic compounds (88%), whereas VLCAs make up 97% of the wax of G. xanthochymus.We showthat treating isolated cuticles with methanol almost quantitatively releases the cyclic fraction while leaving the VLCA fraction essentially intact. All VLCAs were subsequently removed using chloroform. In both species, the permeance of the two model compounds did not change significantly after methanol treatment, whereas chloroform extraction had a large effect on organic solute permeability.

CONCLUSION: The VLCA wax fractionmakes up the permeability barrier for organic solutes, whereas cyclic compounds even in high amounts have a negligible role. This is of significance when optimizing the foliar uptake of pesticides.
KW  - cuticular permeability
KW  - active ingredients
KW  - very long-chain aliphatic compounds
KW  - cyclic compounds
KW  - pesicicles
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204778
VL  - 75
IS  - 12
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zabka, Vanessa
T1  - The Plasticity of Barley (Hordeum vulgare) Leaf Wax Characteristics and their Effects on Early Events in the Powdery Mildew Fungus (Blumeria graminis f.sp. hordei): Interactive Adaptations at the Physiological and the Molecular Level
T1  - Die Plastizität von Blattwachsen der Gerste (Hordeum vulgare) und deren Effekte auf initiale Ereignisse der Mehltaukrankheit (Blumeria graminis f.sp. hordei): wechselseitige Anpassungen auf physiologischer und molekularer Ebene
N2  - In order to test the effects of environmental factors on different characteristics of plant leaf waxes, barley plants (Hordeum vulgare) were abiotically stress treated (exposure to darkness, heavy metal, high salt concentrations and drought), and biotically stressed by the infection with powdery mildew (Blumeria graminis f.sp. hordei; Bgh). Different wax parameters like amount, chemical composition, and micromorphology of epicuticular wax crystals, were investigated. Etiolated leaves of barley showed distinctly reduced wax amounts and modifications in their relative composition. The alterations of these wax parameters might be a result of a developmental delay, which could have been caused by a decreased availability of energy for cellular processes, due to lack of light. Cadmium exposure led to a 1.5-fold increase of wax amount, while chemical composition was unaffected. In drought- and salt-stressed plants, all investigated leaf wax parameters remained unaltered. In each of the abiotic treatments, the microstructure of epicuticular wax crystals, formed as typical platelets, was not modified. Even after 6d infection with powdery mildew (Bgh), neither locally nor systemically enforced modifications of wax features were revealed.
The analyzed leave surfaces, resulting from these four abiotic and the biotic treatment (phenotypic approach), were compared to altered leaf surfaces’ characteristics of 18 analyzed eceriferum (cer-) wax mutants (genotypic approach). Within the screening, 5 mutants were selected which distinctly differed from the wild-type in wax amount, portions of epi- and intracuticular wax fraction, relative chemical composition, crystal morphology, and surface wettability (hydrophobicity).
Apart from quantitative and qualitative effects on the leaf waxes, environmentally enforced modifications in cuticular waxes might be reflected in molecular processes of wax biogenesis. Therefore, a barley wax-microarray was established. 254 genes were selected, which are putatively involved in processes of de novo fatty acid biosynthesis, fatty acid elongation, and modification, and which are supposed to take part in lipid-trafficking between cell compartments, and transport of wax components to the outer cell surface. The regulations within the expression pattern evoked by the respective treatments were correlated with the corresponding analytical wax data, and the observed molecular effects of a 3d powdery mildew infection were compared with succeeding fungal morphogenesis. Etiolation and cadmium exposition pointed to transcriptional modifications in the de novo fatty acid synthesis, and in the screened, transport-related mechanisms, which correlate with respective alterations in surface wax characteristics. Moderate changes in the gene expression pattern, evoked by drought- and salinity-stress, might give hints for evolved adaptations in barley to such common habitat stresses. Theinvasion of powdery mildew into the epidermal host cells was reflected in the regulation of several genes. Beside other functions, these genes take part in pathogen defense, and intracellular component transport, or they encode transcription factors. The different modifications within the molecular responses evoked by the investigated abiotic treatments, and the effects of powdery mildew infection representing a biotic stressor, were compared between the different treatments.
In order to test the potential impact of different wax parameters on Bgh, conidia germination and differentiation was comparably investigated on leaf surfaces of abiotically stressed wild-type and cer-mutants, isolated cuticles, and further artificial surfaces. The rates of conidial development were similar on each of the leaf surfaces resulting from the abiotic treatments, while a significant reduction of the germination and differentiation success was revealed for the wax mutant cer-yp.949. Compared to the wild-type, developmental rates on isolated cuticles and extracted leaf waxes of the mutant cer-yp.949 indicated a modified embedding of cuticular waxes, and a possibly changed three-dimensional structure of the cer-yp.949 cuticle, which might explain the reduced conidial developmental rates on leaf surfaces of this particular mutant.
Experiments with Bgh conidia on mechanically de-waxed leaf surfaces (selective mechanical removal of the epicuticular leaf waxes with glue-like gum arabic, followed by an extraction of the intracuticular wax portion with chloroform) demonstrated the importance of the wax coverage for the germination and differentiation of the fungal conidia. On all dewaxed leaf surfaces, except those of cer-yp.949, the differentiation success of the germlings was significantly reduced, by about 20% (“wax-effect”). This result was verified through an artificial system with increased conidia developmental rates on glass slides covered with extracted leaf waxes. Further comparative tests with the major components of barley leaf wax, hexacosanol and hexacosanal, showed that the germination and differentiation of powdery mildew conidia not only depends on the different chemistry, but is also influenced by the respective surface hydrophobicity. Compared to hexacosanol, on hexacosanal coated glass surfaces, higher germination and differentiation rates were achieved, which correlated with increased levels of surface hydrophobicity. Developmental rates of conidia on hydrophobic foils demonstrated that hydrophobicity, as a sole surface factor, may stimulate the conidial germination and differentiation processes. Moreover, the survival of conidia on artificial surfaces is determined by additional surface derived factors, e.g. the availability of water, and a pervadable matrix.
N2  - Abiotische und biotische Umweltfaktoren können sowohl die Struktur als auch die chemischen Eigenschaften pflanzlicher Oberflächenwachse beeinflussen. In der vorliegenden Studie wurde vergleichend untersucht, inwiefern sich verschiedene Parameter von Gersten (Hordeum vulgare) Blattwachsen, wie deren Menge, chemische Zusammensetzung und die Morphologie epikutikulärer Wachskristalle unter dem Einfluss unterschiedlicher abiotischer Stressoren (Wachstum in Dunkelheit, Schwermetallbelastung, erhöhte Salzkonzentrationen, Trockenheit) und eines biotischen Stressors, dem Befall von Gerstenmehltau (Blumeria graminis fsp. hordei; Bgh), verändern können. Die Aufzucht ohne natürliches Licht führte zu etiolierten Blättern, die deutlich reduzierte Wachsmengen und quantitative Veränderungen in der Zusammensetzung einzelner Wachskomponenten zeigten. Die Veränderung dieser Wachscharakteristika könnte das Resultat einer pflanzlichen Entwicklungsverzögerung darstellen, die auf den Mangel an Licht, und damit einem Mangel an Energie für die zelluläre Triebkraft zurückzuführen ist. Cadmium-Belastung führte zu einer 1.5-fach erhöhten Wachsauflage der Versuchspflanzen bei unveränderter Chemie. Unter Trocken- und Salzstress zeigten sich keine Veränderungen der untersuchten Wachsparameter. Die plättchenförmige Kristallstruktur der epikutikulären Wachse blieb in jeder der untersuchten abiotischen Behandlungen unverändert.
Um Auswirkungen von biotischem Stress auf die Wachsauflage zu testen, wurde eine Infektion mit Gerstenmehltau (Bgh) vorgenommen. Nach sechstägiger Pilzinfektion konnten hierbei weder lokale, noch systemische Veränderungen der unterschiedlichen Wachsparameter der Gerstenblätter detektiert werden. Zusätzlich zu solchen Blattoberflächen, die aus den vier abiotischen und der biotischen Behandlung resultierten (phänotypischer Ansatz), wurden die Oberflächenwachse von 18 cer-Wachsmutanten untersucht (genotypischer Ansatz). Hieraus wurden diejenigen fünf Mutanten ausgewählt, die die stärksten Abweichungen an Wachsmengen, Mengenverteilung zwischen epi- und intrakutikulärer Wachsfraktion und/ oder Anteilen der Einzelkomponenten, der Morphologie der epikutikulären Wachskristalle, und somit auch in der davon abhängenden Oberflächenbenetzbarkeit (Hydrophobizität) gegenüber dem Wildtyp aufwiesen.
Um zu überprüfen, inwiefern sich die Modifizierung der Oberflächenwachse durch Umweltfaktoren in den zugrunde liegenden molekularen Prozessen der Wachsbiosynthese widerspiegelt, wurde ein Gerstenwachs-Microarray etabliert. Eine Auswahl von 254 Genen wurde zusammengestellt, denen potentiell Funktionen in der Fettsäurebiosynthese, Kettenverlängerung von Fettsäuren und deren Modifikation zu Wachskomponenten, sowie im Transport von Lipid- und Wachskomponenten zwischen den Zellkompartimenten zukommen. Die Veränderung der Expression einzelner Gene während der abiotischen Stress-Behandlungen wurde mit den Daten der Wachsanalyse dieser Behandlungen korreliert, sowie der Einfluss einer dreitägigen Mehltauinfektion auf molekulare Prozesse der Wirtspflanze mit der Pilzmorphogenese kombiniert. Hinweise auf transkriptionelle Veränderungen in der de novo Fettsäuresynthese und den untersuchten Transportmechanismen, die mit den Veränderungen der Oberflächenwachse korrelieren, waren insbesondere unter Cadmiumstress und durch Etiolierung zu verzeichnen. Die durch Trocken- und Salzstress verursachten, moderaten Veränderungen im Expressionsmuster untersuchter Gene könnten auf eine erworbene Toleranz von Gerste gegenüber solcher Art von Umweltstress hinweisen. Das Eindringen des Pilzes in die Epidermis spiegelte sich in zahlreichen Genregulierungen wider, die besonders der Pathogenabwehr und dem intrazellulären Komponententransport dienen, oder Transkriptionsfaktoren codieren. Der Einfluss der untersuchten abiotischen Faktoren und der Pilzbefall als biotischer Stressor lösten unterschiedliche Modifikationen der molekularen Antworten aus, die miteinander verglichen wurden.
Um zu klären welche Wachsparameter die Auskeimung und Differenzierung der Konidien von B. graminis beeinflussen, wurden alle analysierten Blattoberflächen (abiotisch gestresster Wildtyp und cer-Mutanten) und weitere artifizielle Oberflächen in Biotests eingesetzt. Auf allen Blattoberflächen des abiotisch behandelten Wildtyps war die Konidienentwicklung gleichermaßen erfolgreich, während sich innerhalb des genotypischen Ansatzes eine signifikante Reduktion des Keimungs- und Differenzierungserfolgs auf Blättern der Mutante cer-yp.949 zeigte. Durch vergleichende Untersuchungen mit isolierten Kutikeln und extrahierten Blattwachsen von Wildtyp und der Mutante cer-yp.949 konnte gezeigt werden, dass der herabgesetzte Entwicklungserfolg der Konidien auf Blättern der Mutante cer-yp.949 auf eine modifizierte Einbettung der Wachse und eine veränderte dreidimensionale Struktur der cer-yp.949 Kutikula zurückzuführen sein könnte. Untersuchungen zur Entwicklung von Konidien auf sukzessiv entwachsten Blattoberflächen von Wildtyp und Mutanten (zunächst mechanisches Abheben der epikutikulären Wachskristalle durch Gummi arabicum, gefolgt von einer Extraktion der intrakutikulären Wachse mit Chloroform) zeigte die Bedeutung des Vorhandenseins von Wachs für die Auskeimung und Differenzierung der Konidien. Mit Ausnahme der Mutante cer-yp.949 wurde der Differenzierungserfolg der Konidien auf allen Blattflächen durch Wachsextraktion signifikant um ca. 20% reduziert („Wachseffekt“).
Durch die Beschichtung von Glasobjektträgern mit extrahierten Blattwachsen konnte dieses Ergebnis auf ein artifizielles System übertragen und bestätigt werden. Zusätzliche Tests mit den Hauptkomponenten der Gerstenwachse Hexacosanol und Hexacosanal zeigten, dass Auskeimung und Differenzierung von Mehltau-Konidien von der unterschiedlichen Chemie, und auch von der Hydrophobizität der Oberfläche beeinflusst werden. Im Vergleich mit Hexacosanol zeigten Hexacosanal beschichtete Glasoberflächen sowohl den größten Keimungs- und Differenzierungserfolg, als auch die höchste Hydrophobizität. Entwicklungsraten auf hydrophoben Folien bestätigten, dass allein die Hydrophobizität der Oberfläche die Auskeimung und die Differenzierung der Konidien stimulieren kann. Das Überleben der Konidien auf artifiziellen Oberflächen wird darüber hinaus durch weitere Faktoren wie Wasserverfügbarkeit und eine durchdringbare Matrix bestimmt.
KW  - Mehltau
KW  - Gerstenkrankheit
KW  - Konidie
KW  - Keimung
KW  - Morphogenese
KW  - Wachs
KW  - Microarray
KW  - Differentielle Genexpression
KW  - powdery mildew desease
KW  - conidial differentiation
KW  - leaf wax analysis
KW  - microarray
KW  - wax biosynthesis
KW  - gene expression
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26402
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hansjakob, Anton
T1  - The role of cuticular waxes in the prepenetration processes of Blumeria graminis f.sp. hordei
T1  - Der Einfluss kutikulärer Wachse auf die Präpenetrationsprozesse von Blumeria graminis f.sp. hordei
N2  - Der obligat biotrophe Pilz Blumeria graminis f.sp. hordei gilt als Erreger des Gerstenmehltaus, einer destruktiven Erkrankung der Gerste (Hordeum vulgare). Als Folge des Befalls mit B. graminis f.sp. hordei drohen erhebliche Ernteeinbußen. Das kutikuläre Wachs von Gerstenblättern besteht hauptsächlich aus primären Alkoholen (80%), Alkylestern (10%) sowie aus geringfügig vorkommenden Bestandteilen wie Fettsäuren (2%), Alkanen (2%) und Aldehyden (1%). Der initiale Kontakt der asexuellen und durch die Luft verbreiteten Konidien findet auf der Blattoberfläche in einer Umgebung statt, die von den kutikulären Wachsen bestimmt ist, welche Keimung und Differenzierung stimulieren. Während der Keimungs- und Differenzierungsphase durchlaufen die Konidien eine sequenzielle Morphogenese, die so genannten Präpenetrationsprozesse. Dabei bilden die Konidien auf der Pflanzenoberfläche zunächst einen primären, kurzen und im weiteren Verlauf einen sekundären, elongierten Keimschlauch aus. Im Anschluss daran schwillt dieser an und wird letztlich zu einem septierten Appressorium differenziert. Mit Hilfe des Appressoriums dringt der Pilz dann in die Epidermiszelle der Wirtspflanze ein und bildet ein initiales Haustorium, das die Ernährung des Pilzes sicherstellt. Um den Einfluss von einzelnen Wachsbestandteilen der Wirtspflanze auf die Präpenetrationsprozesse systematisch zu untersuchen wurde ein neues in vitro System auf der Basis von Formvar®-Harz etabliert. Dieses System ermöglicht die Erzeugung homogener Oberflächen als Substrate für den Pilz, bei denen sowohl die aufgelagerten Mengen als auch die Oberflächenhydrophobizität unabhängig von den getesteten Substanzklassen und Kettenlängen der Moleküle hochgradig reproduzierbar sind. In diesem System haben langkettige Aldehyde die Keimung und die Differenzierung von B. graminis f.sp. hordei Konidien am wirksamsten induziert, wobei die Raten der Appressorienbildung in Abhängigkeit von der Konzentration und der Kettenlänge im Vergleich zu n-Hexacosanal (C26), das sich als am effektivsten zeigte, abnahmen (C22<<C24<C26>C28>>C30). Die getesteten gerad- und ungeradzahligen Alkane (C24-C33), Fettsäuren (C20-C28), Alkylester (C40-C44) und primären Alkohole (C20-C30) hatten keinen signifikanten Einfluss auf die Keimung und die Appressorienbildung des Pilzes. Der primäre Alkohol n-Hexacosanol (C26) stellte hierbei eine Ausnahme dar, da er die Keimung und die Bildung des Appressorium-Keimschlauchs signifikant erhöhte. Um die Rolle von langkettigen Aldehyden auf einer intakten Pflanzenoberfläche in vivo genauer zu untersuchen wurden B. graminis f.sp. hordei Konidien auf Blätter von glossy11 Mutanten der Nicht-Wirtspflanze Mais (Zea mays) inokuliert. Anders als der Wildtyp weisen glossy11 Blätter keine langkettigen Aldehyde auf. Auf glossy11 Blättern keimten 60% der B. graminis f.sp. hordei Konidien nicht und nur 10% der Konidien entwickelten ein reifes Appressorium, was einer dreimal geringeren Rate als auf Wildtyp-Blättern entspricht. Durch das Besprühen von glossy11 Blätter mit synthetischem n-Hexacosanal oder mit Wachs des Wildtyps wurden die pilzlichen Präpenetrationsprozesse wieder vollständig durchlaufen. Wurden im Gegensatz dazu Blätter des Mais-Wildtyps mit nicht induzierenden n-Alkanen, primären Alkoholen oder langkettigen Fettsäuren besprüht, konnte das den Aldehyd-defizienten Phänotyp von glossy11 imitieren. Während der Präpenetrationsprozesse wird ein Appressorium gebildet, wobei es sich hierbei um eine neu gebildete Zelle handelt. Die Keimung und die anschließende Morphogenese sind wichtige Schritte in der Etablierung der pilzlichen Infektionsstrukturen. Da diese Prozesse in einigen phytopathogenen Pilzen mit dem Zellzyklus gekoppelt sind wurde untersucht, inwieweit die Präpenetrationsprozesse von B. graminis f.sp. hordei mit dem Verlauf des Zellzykluses synchronisiert sind. Hierfür wurde eine Methode basierend auf DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) zur Färbung der Zellkerne für fixierte Präparate von B. graminis f.sp. hordei Konidien entwickelt. Mittels eines pharmakologischen Ansatzes war es auf diese Weise erstmals möglich die Abhängigkeit der Präpenetrationsprozesse von der Mitose in vivo und in vitro zu verfolgen. Sechs Stunden nach der Inokulation trat nach Ausbildung des Appressorium-Keimschlauchs eine Mitose in der einkernigen Konidie auf. Die Hemmung der S-Phase mit Hydroxyharnstoff oder die Hemmung der M-Phase mit Benomyl verhinderten eine Bildung des Appressoriums, nicht aber die Entwicklung des Appressorium-Keimschlauchs. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Mitose und eine abgeschlossene Zytokinese notwendige Voraussetzungen für die Appressoriumsbildung, jedoch nicht für die Morphogenese der Konidie, sind. Als Reaktion auf bestimmte Wachsbestandteile der Wirtspflanze werden pilzliche Gene, die während der Präpenetrationsprozesse eine wichtige Rolle spielen können, differenziell exprimiert. Um solche Gene zu identifizieren wurden cDNA Klonbibliotheken mittels der suppression subtractive hybridization (SSH) 22 Minuten nach der Inokulation erstellt. Das auf Formvar®-Harz basierende in vitro System ermöglichte die selektive Anreicherung von cDNA Sequenzen aus B. graminis f.sp. hordei Konidien, die auf n-Hexacosanal beschichteten Oberflächen inokuliert wurden. Aus einer Reihe von Kandidaten wurde eine cDNA-Sequenz identifiziert, die sowohl auf Gerstenblättern als auch auf mit n-Hexacosanal oder extrahiertem Gerstenwachs beschichteten Oberflächen hochreguliert war. Mittels 3’ und 5’ RACE wurde das n-Hexacosanal induzierte Transkript kloniert. Diese cDNA-Sequenz wies keine Homologien zu bekannten Genen, die Funktionen in der pilzlichen Entwicklung und der Ausbildung von Pathogenität in Pflanzen haben, auf.
N2  - The obligate biotrophic fungus Blumeria graminis f.sp. hordei is the causative agent of barley powdery mildew, a destructive foliar disease. The fungus infests barley (Hordeum vulgare), an important crop plant, which causes remarkable yield losses. Leaf cuticular wax of barley consists mainly of primary alcohols (80%), alkyl esters (10%) and minor constituents such as fatty acids (2%), alkanes (2%) and aldehydes (1%). The asexual airborne conidia have an initial contact to the leaf surface, in an environment dominated by cuticular waxes, which trigger germination and differentiation. The conidia undergo a sequential morphogenesis during that phase, the so-called prepenetration processes. The conidium initially forms a short primary germ tube, followed by a secondary elongated germ tube, which swells and finally forms a septate appressorium. The fungal appressorium infests the epidermal cell of the host plant and establishes an initial haustorium, the feeding structure of the fungus. In order to assess the effects of single host plant wax constituents on the prepenetration processes a novel in vitro assay based on Formvar® resin was established. This system permits the setting up of homogeneous surfaces as substrata, at which the adsorbed amounts and the surface hydrophobicity are highly reproducible, independently of the tested substance classes and chain lengths of the molecules. In this system, very-long-chain aldehydes promoted germination and differentiation of B. graminis f.sp. hordei conidia. The appressorium formation rates were decreasing in a concentration and chain-length dependent manner compared to n-hexacosanal (C26), which was the most effective aldehyde (C22<<C24<C26>C28>>C30). The tested alkanes with even and odd numbers (C24-C33), fatty acids (C20-C28), alkyl esters (C40-C44) and primary alcohols (C20-C30) did not induce germination and appressorium formation. The primary alcohol n-hexacosanol (C26) was an exception, as it was capable of significantly stimulating conidial germination and appressorial germ tube formation. To elucidate the impact of very-long-chain aldehydes on an intact plant surface in vivo, B. graminis f.sp. hordei conidia were inoculated on glossy11 mutant leaves of the non-host plant maize (Zea mays), which are - unlike the wildtype - completely devoid of very-long-chain aldehydes. On glossy11 leaves 60% of B. graminis f.sp. hordei conidia remained ungerminated and 10% developed a mature appressorium, which is three times less than on wildtype plants. Spraying of synthetic n-hexacosanal or wildtype leaf wax on glossy11 leaves fully restored the fungal prepenetration processes. In contrast, spraying of non-inducing n-alkanes, primary alcohols or very-long-chain fatty acids on wildtype leaves of maize mimicked the aldehyde deficient phenotype of glossy11. During the prepenetration processes an appressorium is formed, which is a newly formed specialized cell. Germination and subsequent morphogenesis are linked to the cell cycle in certain phytopathogenic fungi. It was investigated to what extent the prepenetration processes of B. graminis f.sp. hordei are synchronized with cell cycle progression. Hence, a distinct staining procedure of nuclei for fixed samples of B. graminis f.sp. hordei conidia based on DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) was developed. In combination with a pharmacological approach it was possible to trace mitosis in dependency of conidial germination and differentiation in vivo and in vitro. The uninucleate conidium germinated and after formation of the appressorial germ tube, a single mitosis occurred in the primordial conidium six hours after inoculation. The inhibition of S-phase with hydroxyurea or M-phase with benomyl prevented appressorium formation, but not the development of the appressorial germ tube. These results indicate that mitosis and a successful cytokinesis are necessary prerequisites for the appressorium formation but not for conidial morphogenesis. In order to identify genes that are expressed in response to certain host plant wax constituents, which may be critical for the prepenetration phase, cDNA clone libraries were constructed by suppression subtractive hybridization (SSH) after inoculation. The Formvar® resin based in vitro system provided a stable platform to enrich cDNA sequences that were expressed in B.graminis f.sp. hordei conidia incubated on n-hexacosanal coated surfaces for 22 minutes. Among various candidates, a cDNA sequence was identified, which was upregulated on barley leaves and on surfaces coated with n-hexacosanal or extracted barley leaf wax. The hexacosanal responsive transcript was cloned by 3’ and 5’ RACE. The cDNA sequence showed no homologies to genes of known function in fungal development and fungal pathogenicity in plants.
KW  - .
KW  - Gerste
KW  - Erysiphe graminis
KW  - Aldehyde
KW  - Kutikularwachs
KW  - barley
KW  - Blumeria graminis
KW  - very-long-chain aldehydes
KW  - wax
KW  - glossy11
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72840
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schliermann [geb. Stratmann], Anna Theresa
T1  - The Role of FGF Receptor 2 in GDF5 mediated Signal Transduction
T1  - Die Rolle des FGF Rezeptors 2 in GDF5-vermittelter Signaltransduktion
N2  - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are involved in various aspects of cell-cell communication in complex life forms. They act as morphogens, help differentiate different cell types from different progenitor cells in development, and are involved in many instances of intercellular communication, from forming a body axis to healing bone fractures, from sugar metabolism to angiogenesis. If the same protein or protein family carries out many functions, there is a demand to regulate and fine-tune their biological activities, and BMPs are highly regulated to generate cell- and context-dependent outcomes.
Not all such instances can be explained yet. Growth/differentiation factor (GDF)5 (or BMP14) synergizes with BMP2 on chondrogenic ATDC5 cells, but antagonizes BMP2 on myoblastic C2C12 cells. Known regulators of BMP2/GDF5 signal transduction failed to explain this context-dependent difference, so a microarray was performed to identify new, cell-specific regulatory components. One identified candidate, the fibroblast growth factor receptor (FGFR)2, was analyzed as a potential new co-receptor to BMP ligands such as GDF5: It was shown that FGFR2 directly binds BMP2, GDF5, and other BMP ligands in vitro, and FGFR2 was able to positively influence BMP2/GDF5-mediated signaling outcome in cell-based assays. This effect was independent of FGFR2s kinase activity, and independent of the downstream mediators SMAD1/5/8, p42/p44, Akt, and p38. The elevated colocalization of BMP receptor type IA and FGFR2 in the presence of BMP2 or GDF5 suggests a signaling complex containing both receptors, akin to other known co-receptors of BMP ligands such as repulsive guidance molecules. 
This unexpected direct interaction between FGF receptor and BMP ligands potentially opens a new category of BMP signal transduction regulation, as FGFR2 is the second receptor tyrosine kinase to be identified as BMP co-receptor, and more may follow. The integration of cell surface interactions between members of the FGF and BMP family especially may widen the knowledge of such cellular communication mechanisms which involve both growth factor families, including morphogen gradients and osteogenesis, and may in consequence help to improve treatment options in osteochodnral diseases.
N2  - Bone morphogenetic proteins (BMPs) sind oft an interzellulärer Kommunikation beteiligt. Sie sind Morphogene, spielen eine Rolle in der Differenzierung von zahlreichen Zelltypen aus verschiedenen Vorgängerzellen während der Entwicklung, und sind an vielen weiteren Beispielen der Zell-Zell-Kommunikation beteiligt: von der Formation einer Körperachse bis hin zur Heilung von Knochenbrüchen, vom Zuckermetabolismus bis zur Angiogenese. Wann immer dasselbe Protein oder dieselbe Proteinfamilie so viele Funktionen erfüllt, bedarf es der Regulation und Feinabstimmung ihrer diversen biologischen Aktivitäten, und BMPs sind zu dem Erzielen zell- und kontextspezifischer Effekte in ihrer Wirkung entsprechend stark reguliert. 
Nicht in allen Fällen sind die Mechanismen solcher Regulation bisher bekannt. Growth/differentiation factor (GDF)5 (oder BMP14) agiert mit BMP2 auf den chondrogenen ATDC5 Zellen synergistisch, aber antagonisiert BMP2 auf den myoblastischen C2C12 Zellen. Diese kontextabhängige Diskrepanz konnte mithilfe der bekannten Regulatoren von BMP2/GDF5-mediierten Signalen nicht erklärt werden. Daher wurde ein Microarray durchgeführt, um neue, zellspezifische regulatorische Proteine zu identifizieren. Einer der identifizierten Kandidaten, fibroblast growth factor receptor (FGFR)2, wurde auf eine potentielle Funktion als neuer Korezeptor für BMP Liganden wie GDF5 analysiert: Es konnte gezeigt werden, dass FGFR2 BMP2, GDF5 und andere BMP Liganden in vitro direkt binden und die biologische Aktivität von BMP2 und GDF5 in Zellkultursystemen positiv beeinflussen konnte. Diese Beobachtungen waren unabhängig von der Kinaseaktivität des FGFR2, und unabhängig von den intrazellulären Mediatoren SMAD1/5/8, p42/p44, Akt und p38. Die erhöhte Kolokalisation von FGFR2 mit dem BMP Rezeptor IA in der Präsenz von BMP2 oder GDF5 weist darauf hin, dass der entsprechende Signalkomplex möglicherweise beide Rezeptoren gleichzeitig enthält; ähnlich, wie das für andere bekannte Korezeptoren von BMP Liganden wie etwa den repulsive guidance molecules der Fall ist. 
Die unerwartete direkte Interaktion von einem FGF Rezeptor mit BMP-Liganden ist möglicherweise nur ein Beispiel für einen generelleren Mechanismus. Tatsächlich ist FGFR2 bereits die zweite Rezeptortyrosinkinase, die als BMP-Korezeptor identifiziert wurde, und es ist möglich, dass es noch mehr gibt. Speziell im Bezug auf die FGF-BMP Interaktion bergen die hier dargestellten Ergebnisse Potential zu neuen Erkenntnissen. Die Proteinfamilien dieser beiden Wachstumsfaktoren sind häufiger an demselben zellulären Mechanismen beteiligt; etwa an der Entstehung von Morphogengradienten in der Entwicklung oder an der Osteogenese. Die Interaktion der FGF und BMP Proteinfamilien auf der Zelloberfläche könnte eine wertvolle Ergänzung zu der Untersuchung ihres Zusammenspiels im Zellinneren sein, und könnte in diesem Zusammenhang sogar langfristig die Behandlungsmöglichkeiten von osteochondralen Erkrankungen erweitern.
KW  - Molekularbiologie
KW  - FGF signaling
KW  - BMP signaling
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192889
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kumari, Khushbu
T1  - The role of lipid transfer proteins (LTPs) during the fertilization process in Arabidopsis thaliana
T1  - Untersuchungen zur Rolle von Lipidtransferproteinen (LTPs) während des Befruchtungsprozesses in Arabidopsis thaliana
N2  - Double fertilization is a defining characteristic of flowering plants (angiosperms). As the sperm cells of higher plants are non-motile, they need to be transported to the female gametophyte via the growing pollen tube. The pollen-tube journey through the female tissues represents a highly complex process. To provide for successful reproduction it demands intricate communication between the cells of the two haploid gametophytes - the polar growing pollen tube (carrying the two non-motile sperm cells) and the ovule (hosting the egg cell/synergid cells). The polar growth of the pollen tube towards the female gamete is guided by different signaling molecules, including sugars, amino acids and peptides. Some of these belong to the family of lipid transfer proteins (LTPs), which are secreted cysteine-rich peptides. Depending on the plant species several lines of evidence have also suggested potential roles for LTPs during pollen germination or pollen-tube guidance. Although Arabidopsis thaliana has 49 annotated genes for LTPs, several of which are involved in plant immunity and cell-to-cell communication, the role of most members of this family during fertilization is unknown. 
The aim of this project was therefore to systematically identify LTPs which play a role in the fertilization process in A. thaliana, particularly during pollen tube guidance. To identify candidate proteins, the expression profile of LTPs in reproductive tissue was investigated. This was accomplished by in-silico bioinformatic analysis using different expression databases. Following confirmion of these results by qRT-PCR analysis, seven Type-I nsLTPs (LTP1, LTP2, LTP3, LTP4, LTP5, LTP6 and LTP12) were found to be exclusively expressed in pistils. Except for LTP12, all other pistil expressed LTPs were transcriptionally induced upon pollination. Using reporter-based transcriptional and translational fusions the temporal and spatial expression patterns together with protein localizations for LTP2, 3, 4, 5, 6, and 12 were determined in planta. Stable transgenic plants carrying PromLTP::GUS constructs of the six different LTP candidates showed that most of LTPs were expressed in the stigma/stylar region and were induced upon pollination. With respect to protein localization on the cellular level, they split into two categories: LTP2, LTP5 and LTP6 were localized in the cell wall, while LTP3, LTP4 and LTP12 were specifically targeted to the plasma membrane. 
For the functional characterization of the candidate LTPs, several T-DNA insertion mutant plant lines were investigated for phenotypes affecting the fertilization process. Pollen development and quality as well as their in-vitro germination rate did not differ between the different single ltp mutant lines and wildtype plants. Moreover, in-vivo cross pollination experiments revealed that tube growth and fertilization rate of the mutant plants were similar to wildtype plants. Altogether, no discernible phenotype was evident in other floral and vegetative parts between different single ltp mutant lines and wildtype plants. As there was no distinguishable phenotype observed for single ltp-ko plants, double knock out plants of the two highly homologous genes LTP2 (expressed in the female stigma, style and transmitting tract) and LTP5 (expressed in the stigma, style, pollen pollen-tube and transmitting tract) were generated using the EPCCRISPR-Cas9 genome editing technique. Two ltp2ltp5 mutant transgenic-lines (#P31-P2 and #P31-P3) with frameshift mutations in both the genes could be established. Further experiments showed, that the CRISPR/Cas9-mediated knock-out of LTP2/LTP5 resulted in significantly reduced fertilization success. Cell biological analyses revealed that the ltp2ltp5 double mutant was impaired in pollen tube guidance towards the ovules and that this phenotype correlated with aberrant callose depositions in the micropylar region during ovule development. Detailed analysis of in-vivo pollen-tube growth and reciprocal cross pollination assay suggested that, the severely compromised fertility was not caused by any defect in development of the pollen grains, but was due to the abnormal callose deposition in the embryo sac primarily concentrated at the synergid cell near the micropylar end. Aberrant callose deposition in ltp2ltp5 ovules pose a complete blockage for the growing pollen tube to change its polarity to enter the funiculus indicating funicular and micropylar defects in pollen tube guidance causing fertilization failure. 
Our finding suggests that female gametophyte expressed LTP2 and LTP5 play a crucial role in mediating pollen tube guidance process and ultimately having an effect on the fertilization success. In line with the existence of a N-terminal signal peptide, secreted LTPs might represent a well-suited mobile signal carrier in the plant’s extracellular matrix. Previous reports suggested that, LTPs could act as chemoattractant peptide, imparting competence to the growing pollen tube, but the molecular mechanism is still obscure. The results obtained in this thesis further provide strong evidence, that LTP2/5 together regulate callose homeostasis and testable models are discussed. Future work is now required to elucidate the detailed molecular link between these LTPs and their potential interacting partners or receptors expressed in pollen and synergid cells, which should provide deeper insight into their functional role as regulatory molecules in the pollen tube guidance mechanism.
N2  - Die ‚doppelte Befruchtung‘ ist ein charakteristisches Merkmal von Blütenpflanzen (Angiospermen). Da im Gegensatz zu vielen anderen Organismen die Spermien höherer Pflanzen nicht beweglich sind, müssen sie über den wachsenden Pollenschlauch zum weiblichen Gametophyten transportiert werden. Die je nach Pflanze durchaus lange Reise des Pollenschlauchs durch das weibliche Gewebe ist ein sehr komplexer Vorgang. Um eine erfolgreiche Reproduktion zu gewährleisten, ist eine fein abgestimmte Kommunikation zwischen den Zellen der beiden haploiden Gametophyten erforderlich - dem polar wachsenden Pollenschlauch (welcher die beiden nicht beweglichen Spermien trägt) und der Samenanlage (in der sich die Eizellen und Synergiden befinden). Das polare Wachstum des Pollenschlauchs in Richtung des weiblichen Gameten wird von verschiedenen Signalmolekülen gesteuert, darunter Zucker, Aminosäuren und Cystein-reiche Peptide (CRPs). Einige dieser Signalmoleküle gehören zur Familie der Lipidtransferproteine (LTPs), welche ebenfalls zur Klasse der CRPs gehören. Abhängig von der Pflanzenart deuten mehrere Hinweise auf eine mögliche Rolle von LTPs während der Pollenkeimung oder der Pollenschlauch-Navigation hin. Obwohl das Genom von Arabidopsis thaliana für mehr als 49 annotierte LTP-Gene kodiert, von denen einige an der ‚angeborenen Immunitätsreaktion‘ von Pflanzen sowie der Kommunikation von Zelle zu Zelle beteiligt sind, ist die physiologische Rolle der meisten Mitglieder dieser Familie während des Befruchtungsvorgangs bisher unbekannt.
Ziel dieses Projekts war es daher, systematisch solche LTPs zu identifizieren, die eine Rolle bei der Befruchtung von A. thaliana spielen, insbesondere bei der Navigation des Pollenschlauchs zur Eizelle. Um diese LTP Proteine zu identifizieren, wurde zunächst das Expressionsprofil von LTPs in reproduktiven Gewebe untersucht. Dies wurde durch bioinformatische ‚in-silico‘ Analyse unter Verwendung verschiedener Expressionsdatenbanken erreicht. Nach Bestätigung dieser Ergebnisse durch qRT-PCR- Analyse wurde festgestellt, dass sieben Typ-I-LTPs (LTP1, LTP2, LTP3, LTP4, LTP5, LTP6 und LTP12) präferentiell im Stempel exprimiert werden. Mit Ausnahme von LTP12 wurden darüber hinaus alle anderen Stempel-exprimierten LTPs nach Bestäubung auf transkriptioneller Ebene induziert. Unter Verwendung von Reporter-basierten Transkriptions- und Translationsfusionen wurden die zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster zusammen mit Proteinlokalisationen für LTP2, 3, 4, 5, 6 und 12 ‚in planta‘ bestimmt. Stabile transgene Pflanzen, die PromLTP::GUS-Konstrukte der sechs verschiedenen LTP- Kandidaten exprimierten, zeigten, dass die meisten LTPs in der Stigma/Stylar-Region abundant waren und tatsächlich bei der Bestäubung induziert wurden. Die anschließende Proteinlokalisierung auf zellulärer Ebene klassifizierte diese LTPs in zwei Kategorien: LTP2,
LTP5 und LTP6 wurden in der Zellwand lokalisiert, während LTP3, LTP4 und LTP12 spezifisch an der Plasmamembran lokalisierten.
Zur funktionellen Charakterisierung der Kandidaten-LTPs wurden mehrere T-DNA- Insertionsmutanten auf Phänotypen hinsichtlich des Befruchtungsprozesses untersucht. Die Pollenentwicklung sowie die ‚in-vitro‘ Keimrate des Pollens unterschieden sich dabei nicht zwischen den verschiedenen LTP-Mutantenlinien und Wildtyp-Pflanzen. Darüber hinaus ergaben ‚in-vivo‘ Kreuzbestäubungsexperimente, dass das Pollenschlauchwachstum und die Befruchtungsrate der mutierten Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen ähnlich waren. Insgesamt war kein erkennbarer Phänotyp in der Blütenentwickung oder der vegetativen Entwicklung zwischen verschiedenen LTP-Einzel-Mutanten und Wildtyp-Pflanzen erkennbar. Aufgrund möglicher funktioneller Redundanz, und der Tatsache, dass für einzelne LTP ‚knock- out‘ Pflanzen kein unterscheidbarer Phänotyp beobachtet wurde, wurden Verlustmutanten der beiden hoch homologen und ko-exprimierten Gene LTP2 und LTP5 unter Verwendung der EPC-CRISPR-Cas9-Genomeditiertechnik erzeugt. Zwei ltp2ltp5-mutierte transgene Linien (# P31-P2 und # P31-P3) mit In-Frame-Mutationen in beiden Genen konnten dabei etabliert werden. Weitere Experimente zeigten, dass das CRISPR/Cas9-vermittelte Ausschalten von LTP2 und LTP5 zu einem signifikant verringerten Befruchtungserfolg in diesen Linien führte. Zellbiologische Analysen ergaben, dass die ltp2ltp5 Doppelmutante in der Pollenschlauch- Navigation zu den Ovulen hin beeinträchtigt war und dass dieser Phänotyp mit Kalloseablagerungen in der Region der Mikropyle während der Ovulen-Entwicklung in diesen Linien korrelierte. Eine detaillierte Analyse des ‚in-vivo‘ Wachstums der Pollenschläuche sowie eines wechselseitigen Bestäubungstests ergab, dass die stark beeinträchtigte Befruchtung nicht durch einen Entwicklungsdefekt im männlichen Gametophyten, dem Pollen, verursacht wurde. Stattdessen konnte die beeinträchtigte Befruchtung auf die abnormale Kalloseabscheidung im weiblichen Gametophyten, dem Embryosack, zurückgeführt werden. Interessanterweise, konzentrierte sich die Kalloseabscheidung in der ltp2ltp5 Doppelmutante hauptsächlich im Bereich der Synergiden, am mikropylaren Ende des Embryosacks. Für den wachsenden Pollenschlauch stellen diese im Vergleich zum Wildtyp untypischen Kalloseablagerungen in ltp2ltp5-Mutanten in der Nähe der Eizellen möglicherweise eine Blockade für die Perzeption von Ovulen-Signalen dar. Dies behindert die erforderliche Richtungsänderung des polar gerichteten Wachstums und somit die Fähigkeit des Pollenschlauchs, entlang des Funikulus zu wachsen und in die Mikropyle eindringen zu können. Diese Beobachtung zeigt, dass funikuläre und mikropylare Defekte in der Pollenschlauch-Navigation den Befruchtungserfolg vermindern.
Die Ergebnisse dieser Dissertation legen nahe, dass der weibliche Gametophyt, in welchem LTP2 und LTP5 exprimiert werden, eine entscheidende Rolle bei der Regulation der
Pollenschlauch-Navigation spielt und letztendlich auch einen messbaren Einfluss auf den Befruchtungserfolg hat. Aufgrund der Existenz eines N-terminalen Signalpeptids und der damit verbundenen Sekretion in den Apoplasten könnten LTPs als Signalmoleküle in der extrazellulären Matrix der Pflanze fungieren. Frühere Arbeiten deuteten bereits an, dass LTPs als chemoattraktive Peptide wirken könnten und dem wachsenden Pollenschlauch die Kompetenz verleihen könnten, die Signale der Eizellen wahrzunehmen. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus ist jedoch noch immer unbekannt. Die in dieser Dissertation erzielten Ergebnisse liefern jedoch starke Hinweise darauf, dass LTP2/5 zusammen die Homöostase der Kallosebildung regulieren. Mögliche Modelle zur Aktivität von LTPs im Kontext der Regulation der Kallose-Homöostase werden vorgestellt und diskutiert. Zukünftige Arbeiten sind nun erforderlich, um die detaillierte molekulare Verbindung zwischen diesen LTPs und ihren potenziellen Interaktionspartnern oder Rezeptoren, die in Pollen- und Synergidzellen exprimiert werden, aufzuklären. Diese sollten einen tieferen Einblick in die funktionelle Rolle von LTP2 und LTP5 als regulatorische Moleküle für die Pollenschlauch- Navigation geben.
KW  - Fertilization in angiosperm
KW  - Lipid Transfer Protein
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199613
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Röder, Pia V.
A1  - Geillinger, Kerstin E.
A1  - Zietek, Tamara S.
A1  - Thorens, Bernard
A1  - Koepsell, Hermann
A1  - Daniel, Hannelore
T1  - The Role of SGLT1 and GLUT2 in Intestinal Glucose Transport and Sensing
JF  - PLOS ONE
N2  - Intestinal glucose absorption is mediated by SGLT1 whereas GLUT2 is considered to provide basolateral exit. Recently, it was proposed that GLUT2 can be recruited into the apical membrane after a high luminal glucose bolus allowing bulk absorption of glucose by facilitated diffusion. Moreover, SGLT1 and GLUT2 are suggested to play an important role in intestinal glucose sensing and incretin secretion. In mice that lack either SGLT1 or GLUT2 we re-assessed the role of these transporters in intestinal glucose uptake after radiotracer glucose gavage and performed Western blot analysis for transporter abundance in apical membrane fractions in a comparative approach. Moreover, we examined the contribution of these transporters to glucose-induced changes in plasma GIP, GLP-1 and insulin levels. In mice lacking SGLT1, tissue retention of tracer glucose was drastically reduced throughout the entire small intestine whereas GLUT2-deficient animals exhibited higher tracer contents in tissue samples than wild type animals. Deletion of SGLT1 resulted also in reduced blood glucose elevations and abolished GIP and GLP-1 secretion in response to glucose. In mice lacking GLUT2, glucose-induced insulin but not incretin secretion was impaired. Western blot analysis revealed unchanged protein levels of SGLT1 after glucose gavage. GLUT2 detected in apical membrane fractions mainly resulted from contamination with basolateral membranes but did not change in density after glucose administration. SGLT1 is unequivocally the prime intestinal glucose transporter even at high luminal glucose concentrations. Moreover, SGLT1 mediates glucose-induced incretin secretion. Our studies do not provide evidence for GLUT2 playing any role in either apical glucose influx or incretin secretion.
KW  - rat small-intestine
KW  - brush border membrane
KW  - apical GLUT2
KW  - incretin secretion
KW  - diffusive component
KW  - sugar absorption
KW  - mice
KW  - calcium absorption
KW  - phosphorylation
KW  - cotransporter
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117262
VL  - 9
IS  - 2
ER  - 
TY  - THES
A1  - Travers-Martin, Nora Verena
T1  - The role of the glucosinolate-myrosinase system for the interaction of Brassicaceae with the turnip sawfly Athalia rosae(L.)
T1  - Die Rolle des Glucosinolat-Myrosinase Systems bei der Interaktion von Brassicaceae mit der Rübsenblattwespe Athalia rosae (L.)
N2  - Brassicaceae and a few related plant families are characterized by possession of the glucosinolate-myrosinase system. Glucosinolates are amino-acid derived allelochemicals which are hydrolysed upon tissue damage by myrosinase enzymes to produce various degradation products which can be toxic for generalist insects. The larvae of the crucifer-specialist Athalia rosae, the turnip sawfly, sequester glucosinolates into their haemolymph. The role of the glucosinolate-myrosinase system for the interaction of the turnip sawfly with Brassicaceae was examined in this study from two different perspectives: variation within individual plants and between plant species. The plant responses to the feeding by herbivores and the short-term effects this induction had on insect behaviour were investigated in white mustard. Furthermore, plants can use multiple defences. Hence correlations of glucosinolates and myrosinase activities with other defences and nutritional quality and their long-term effects on the development of the insects were investigated in seven different plant species.
N2  - Die Brassicaceen und einige nah verwandte Pflanzenfamilien zeichnen sich durch den Besitz des Glucosinolat-Myrosinase Systems aus. Glucosinolate sind von Aminosäuren abgeleitete Allelochemikalien, die nach Gewebezerstörung von Myrosinaseenzymen hydrolysiert werden. Die entstehenden Abbauprodukte wirken auf generalistische Insekten toxisch. Larven der auf Brassicaceen spezialisierten Rübsenblattwespe, Athalia rosae, sequestrieren Glucosinolate in ihre Hämolymphe. In der vorliegenden Studie wird die Rolle des Glucosinolat-Myrosinase Systems für die Interaktion von Brassicaceen mit der Rübsenblattwespe aus zwei unterschiedlichen Perspektiven untersucht: Variationen innerhalb einzelner Pflanzen und zwischen verschiedenen Pflanzenarten. Die pflanzliche Antwort innnerhalb einzelner Individuen auf Herbivorenfraß und deren kurzzeitige Auswirkungen auf das Insektenverhalten wurden am Weißen Senf untersucht. Des Weiteren nutzen Pflanzen multiple Abwehrmethoden. Daher wurden Korrelationen des Glucosinolat-Myrosinase Systems mit anderen Abwehrmethoden und mit dem Nährstoffgehalt der Pflanzen sowie deren langfristige Effekte auf die Entwicklung der Insekten an sieben verschiedenen Pflanzenarten untersucht.
KW  - Glucosinolate
KW  - Chemische Ökologie
KW  - Myrosinase
KW  - Insekten
KW  - Pflanzen-Insekten Interaktionen
KW  - Glucosinolates
KW  - Myrosinase
KW  - Insects
KW  - Chemical Ecology
KW  - Plant-Insect Interactions
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25335
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Boschert, V.
A1  - Frisch, C.
A1  - Back, J. W.
A1  - van Pee,, K.
A1  - Weidauer, S. E.
A1  - Muth, E.-M.
A1  - Schmieder, P.
A1  - Beerbaum, M.
A1  - Knappik, A.
A1  - Timmerman, P.
A1  - Mueller, T. D.
T1  - The sclerostin-neutralizing antibody AbD09097 recognizes an epitope adjacent to sclerostin's binding site for the Wnt co-receptor LRP6
JF  - Open Biology
N2  - The glycoprotein sclerostin has been identified as a negative regulator of bone growth. It exerts its function by interacting with the Wnt co-receptor LRP5/6, blocks the binding of Wnt factors and thereby inhibits Wnt signalling. Neutralizing anti-sclerostin antibodies are able to restore Wnt activity and enhance bone growth thereby presenting a new osteoanabolic therapy approach for diseases such as osteoporosis. We have generated various Fab antibodies against human and murine sclerostin using a phage display set-up. Biochemical analyses have identified one Fab developed against murine sclerostin, AbD09097 that efficiently neutralizes sclerostin's Wnt inhibitory activity. In vitro interaction analysis using sclerostin variants revealed that this neutralizing Fab binds to sclerostin's flexible second loop, which has been shown to harbour the LRP5/6 binding motif. Affinity maturation was then applied to AbD09097, providing a set of improved neutralizing Fab antibodies which particularly bind human sclerostin with enhanced affinity. Determining the crystal structure of AbD09097 provides first insights into how this antibody might recognize and neutralize sclerostin. Together with the structure–function relationship derived from affinity maturation these new data will foster the rational design of new and highly efficient anti-sclerostin antibodies for the therapy of bone loss diseases such as osteoporosis.
KW  - phage display
KW  - Wnt signalling
KW  - sclerostin
KW  - neutralizing antibody
KW  - osteoporosis
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-177925
VL  - 6
ER  - 
TY  - THES
A1  - Pedrotti, Lorenzo
T1  - The SnRK1-C/S1-bZIPs network: a signaling hub in Arabidopsis energy metabolism regulation
T1  - Das SnRK1-C/S1-bZIP-Netzwerk: ein Signalknoten in der Regulation des Arabidopsis Energie-Metabolismus
N2  - The control of energy homeostasis is of pivotal importance for all living organisms. In the last years emerged the idea that many stress responses that are apparently unrelated, are actually united by a common increase of the cellular energy demand. Therefore, the so called energy signaling is activated by many kind of stresses and is responsible for the activation of the general stress response. In Arabidopsis thaliana the protein family SnF1- related  protein  kinases  (SnRK1)  is  involved  in  the  regulation  of  many  physiological processes  but  is  more  known  for  its  involvement  in  the  regulation  of  the  energy homeostasis in response to various stresses. To the SnRK1 protein family belong SnRK1.1 (also known as KIN10), SnRK1.2 (KIN11), and SnRK1.3 (KIN12). SnRK1 exerts its function regulating directly the activity of metabolic enzymes or those of key transcription factors (TFs). The only TFs regulated by SnRK1 identified so far is the basic leucine zipper (bZIP) 63. bZIP63 belongs to the C group of bZIPs (C-bZIPs) protein family together with  bZIP9, bZIP10, and bZIP25. SnRK1.1 phosphorylates bZIP63 on three amino acids residues, serine (S) 29, S294, and S300. The phosphorylation of tbZIP63 is strongly related to the energy status of the plant, shifting from almost absent during the normal growth to strongly phosphorylated when the plant is exposed to extended dark. bZIPs normally bind the DNA as dimer in order to regulate the expression of their target genes. C-bZIPs preferentially form dimers with S1-bZIPs, constituting the so called C/S1- bZIPs network. The SnRk1 dependent phosphorylation of bZIP63 regulates its activation potential  and  its  dimerization  properties.  In  particular  bZIP63  shift  its  dimerization preferences  according  to  its  phosphorylation  status.  The  non-phosphorylated  form  of bZIP63  dimerize  bZIP1,  the  phosphorylates  ones,  instead,  forms  dimer  with  bZIP1, bZIP11, and bZIP63 its self. Together with bZIP63, S1-bZIPs are important mediator of part of the huge transcriptional reprogramming induced by SnRK1 in response to extended dark. S1-bZIPs regulate, indeed, the expression of 4'000 of the 10'000 SnRK1-regulated genes in response to energy deprivation. In particular S1-bZIPs are very important for the regulation of many genes encoding for enzymes involved in the amino acid metabolism and for their use as alternative energy source. After the exposition for some hours to extended dark, indeed, the plant make use of every energy substrate and amino acids are considered an important energy source together with lipids and proteins. Interestingly, S1- bZIPs regulate the expression of ETFQO. ETFQO is a unique protein that convoglia the electrons provenienti from the branch chain amino acids catabolism into the mitochondrial electron transport chain. The dimer formed between bZIP63 and bZIP2 recruits SnRK1.1 directly on the chromatin of ETFQO promoter. The recruitment of SnRK1 on ETFQO promoter is associated  with  its acetylation on  the lysine 14 of  the histone protein  3 (K14H3). This chromatin modification is normally asociated with an euchromatic status of the DNA and therefore with its transcriptional activation. Beside the particular case of the regulation of ETFQO gene, S1-bZIPs are involved in the regulation of many other genes activated in response of different stresses. bZIP1 is for example an important mediator of the salt stress response. In particular bZIP1 regulates the primary C- and N-metabolism. The expression of bZIP1, in response of both salt ans energy stress seems to be regulated by SnRK1, as it is the expression of bZIP53 and bZIP63.
Beside its involvement in the regulation of the energy stress response and salt response, SnRK1 is the primary activators of the lipids metabolism during see germination. SnRK1, indeed, controls the expression of CALEOSINs and OLEOSINs. Those proteins are very important for lipids remobilization from oil droplets. Without their expression seed germination and subsequent establishment do not take place because of the absence of fuel to sustain these highly energy costly processes, which entirely depend on the catabolism of seed storages.
N2  - Die Kontrolle der Energiehomöostase ist für alle lebenden Organismen von großer Bedeutung. In den letzten Jahren kam die Idee auf, dass viele Stressantworten, die scheinbar unabhängig voneinander sind, durch den Energiebedarf doch miteinander verbunden sind. Das sogenannte Energie-Signaling wird von vielen verschiedenen Stress- Arten aktiviert und ist verantwortlich für die Aktivierung der allgemeinen Stressantwort. In Arabidopsis thaliana ist die Proteinfamilie der SnF1-verwandten Proteinkinasen (SnRK1) an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Auch bei der Regulation der Energiehomöostase als Folge von Stress spielen SnRK1-Kinasen eine wichtige Rolle. Proteine aus der SnRK1-Familie sind SnRK1.1, auch als KIN10 bezeichnet, SnRK1.2 (KIN11) und SnRK1.3 (KIN12). SnRK1-Proteine können die Aktivität von metabolischen Enzyme oder bestimmten Transkriptionsfaktoren (TF) direkt regulieren. Bislang wurde nur für den basischen Leucin-Zipper (bZIP) TF bZIP63 die Regulation durch SnRK1 gezeigt. bZIP63 gehört zur Gruppe C der bZIP Proteinfamilie (C-bZIP). Ebenfalls zu Gruppe C werden bZIP9, bZIP10 und bZIP25 zugeordnet. SnRK1.1 phosphoryliert das bZIP63- Protein an Serin (S) 29, S294 und S300. Der Grad der Phosphorylierung von bZIP63 steht in direktem Zusammenhang mit dem Energiehaushalt der Pflanze. Unter normalen Bedingungen wird bZIP63 kaum phosphoryliert, während bei verlängerter Nacht bZIP63 stark phosphoryliert wird. bZIP TF bilden untereinander Dimere aus und binden so an die DNA um die Expression ihrer Zielgene zu regulieren. C-bZIP TF bilden bevorzugt Dimere mit bZIP TF der Gruppe S1, bekannt als das C/S1-bZIP-Netzwerk. Die SnRK1-abhängige Phosphorylierung von bZIP63 steuert das Aktivierungspotential und die Dimerisierungseigenschaften. Besonders bei bZIP63 ändern sich die Dimerisierungspartner in Abhängigkeit des Phosphorylierungsgrads. Nicht-phosphoryliert dimerisiert bZIP61 mit bZIP1, im phosphorylierten Zustand dagegen bildet bZIP63 Dimere neben bZIP1 auch mit bZIP11 und bZIP63.
S1-bZIP	TF sowie bZIP63	sind wichtige Regulatoren der transkriptionellen Reprogrammierung, die durch SnRK1 bei verlängerter Dunkelheit induziert wird. S1-bZIP TF regulieren die Expression von 4'000 der 10'000 durch SnRK1 regulierten Gene in der Energieverarmungsantwort. Besonders S1-bZIP TF sind sehr wichtig für die Regulation vieler  Gene,  die  für  Enzyme  aus  dem  Aminosäuremetabolismus  codieren  und  als alternative Energiequelle der Pflanze bekannt sind. Wird die Nacht für einige Stunden verlängert, greift die Pflanze auf jede mögliche Energiequelle zurück. Als Energiequelle werden besonders Aminosäuren, aber auch Lipiden und Proteinen herangezogen.
Interessanterweise regulieren S1-bZIP TF die Expression von ETFQO. ETFQO ist ein besonderes Protein, das die Elektronen aus dem Metabolismus verzweigter Aminosäuren in die mitochondriale Elektronentransportkette steuert. Das Dimer aus bZIP63 und bZIP2 rekrutiert SnRK1.1 direkt an das Chromatin des ETFQO-Promotors. Dieser Rekrutierung folgt die Acetylierung des Histonproteins 3 (K14H3) am Lysin 14. Diese Modifikation des Chromatins führt normalerweise zu einem euchromatischen Status der DNA und der nachfolgenden transkriptionellen Aktivierung. Neben der Regulation des  ETFQO-Gens sind S1-bZIP TF auch an der Regulation von vielen anderen Genen in Folge von verschiedenen Stressen beteiligt. bZIP1 ist beispielsweise ein wichtiger Regulator der Antwort auf Salz-Stress. Auch der primäre Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus werden von bZIP1 reguliert. Es wird angenommen, dass die Expression von bZIP1 wie auch von bZIP53 und bZIP63 in der Antwort auf Salzstress und Energieverarmung durch SnRK1 gesteuert wird. Abgesehen von der Regulation der Antwort auf Energieverarmung und Salzstress spielen SnRK1-Proteine auch bei der Aktivierung des Lipidmetabolismus während der Keimung eine Rolle. SnRK1 kontrolliert die Expression von CALEOSINs und OLEOSINs. Diese beiden Proteine sind sehr wichtig für die Mobilisierung von Lipiden aus Öltröpfchen. In Abwesenheit von SnRK1 finden aufgrund von Energiemangel weder die Keimung noch die nachfolgende Entwicklung statt.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Homöostase
KW  - Proteinkinasen
KW  - Stress-Syndrom
KW  - SnRK1
KW  - bZIPs
KW  - mitochondria
KW  - energy metabolism
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116080
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Schmitt, Dominik R.
A1  - Kuper, Jochen
A1  - Elias, Agnes
A1  - Kisker, Caroline
T1  - The Structure of the TFIIH p34 Subunit Reveals a Von Willebrand Factor A Like Fold
JF  - PLoS ONE
N2  - RNA polymerase II dependent transcription and nucleotide excision repair are mediated by a multifaceted interplay of subunits within the general transcription factor II H (TFIIH). A better understanding of the molecular structure of TFIIH is the key to unravel the mechanism of action of this versatile protein complex within these vital cellular processes. The importance of this complex becomes further evident in the context of severe diseases like xeroderma pigmentosum, Cockayne's syndrome and trichothiodystrophy, that arise from single point mutations in TFIIH subunits. Here we describe the structure of the p34 subunit of the TFIIH complex from the eukaryotic thermophilic fungus Chaetomium thermophilum. The structure revealed that p34 contains a von Willebrand Factor A (vWA) like domain, a fold which is generally known to be involved in protein-protein interactions. Within TFIIH p34 strongly interacts with p44, a positive regulator of the helicase XPD. Putative protein-protein interfaces are analyzed and possible binding sites for the p34-p44 interaction suggested.
KW  - sequence motif analysis
KW  - iodides
KW  - protein-protein interactions
KW  - protein domains
KW  - molecular structure
KW  - electron density
KW  - protein structure
KW  - crystal structure
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119471
SN  - 1932-6203
VL  - 9
IS  - 7
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lu, Jinping
T1  - The vacuolar TPC1 channel and its luminal calcium sensing site in the luminal pore entrance
T1  - Der vakuoläre TPC1-Kanal und seine luminale Kalzium-Sensorstelle im luminalen Porenbereich
N2  - The slowly activating vacuolar SV/TPC1 channel is ubiquitously expressed in plants and provides a large cation conductance in the vacuolar membrane. Thereby, monovalent (K+, Na+) and in principle also divalent cations, such as Ca2+, can pass through the channel. The SV/TPC1 channel is activated upon membrane depolarization and cytosolic Ca2+ but inhibited by luminal calcium. With respect to the latter, two luminal Ca2+ binding sites (site 1 Asp240/Asp454/Glu528, site 2 Glu239/Asp240/Glu457) were identified to coordinate luminal Ca2+. In this work, the characteristics of the SV/TPC1 channels in terms of regulation and function were further elucidated, focusing on the TPC1s of Arabidopsis thaliana and Vicia faba. For electrophysiological analysis of the role of distinct pore residues for channel gating and luminal Ca2+ sensing, TPC1 channel variants were generated by site-directed mutagenesis and transiently expressed as eGFP/eYFP-fusion constructs in Arabidopsis thaliana mesophyll protoplasts of the TPC1 loss-of-function mutant attpc1-2. 
1. As visualized by confocal fluorescence laser-scanning microscopy, all AtTPC1 (WT, E605A/Q, D606N, D607N, E605A/D606N, E605Q/D606N/D607N, E457N/E605A/D606N) and VfTPC1 channel variants (WT, N458E/A607E/ N608D) were correctly targeted to the vacuole membrane.
2. Patch-clamp studies revealed that removal of one of the negative charges at position Glu605 or Asp606 was already sufficient to promote voltage-dependent channel activation with higher voltage sensitivity. The combined neutralization of these residues (E605A/D606N), however, was required to additionally reduce the luminal Ca2+ sensitivity of the AtTPC1 channel, leading to hyperactive AtTPC1 channels. Thus, the residues Glu605/Asp606 are functionally coupled with the voltage sensor of AtTPC1 channel, thereby modulating channel gating, and form a novel luminal Ca2+ sensing site 3 in AtTPC1 at the luminal entrance of the ion transport pathway. 
3. Interestingly, this novel luminal Ca2+ sensing site 3 (Glu605/Asp606) and Glu457 from the luminal Ca2+ sensing site 2 of the luminal Ca2+-sensitive AtTPC1 channel were neutralized by either asparagine or alanine in the TPC1 channel from Vicia faba and many other Fabaceae. Moreover, the VfTPC1 was validated to be a hyperactive TPC1 channel with higher tolerance to luminal Ca2+ loads which was in contrast to the AtTPC1 channel features. As a result, VfTPC1 but not AtTPC1 conferred the hyperexcitability of vacuoles. When AtTPC1 was mutated for the three VfTPC1-homologous polymorphic site residues, the AtTPC1 triple mutant (E457N/E605A/D606N) gained VfTPC1-like characteristics. However, when VfTPC1 was mutated for the three AtTPC1-homologous polymorphic site residues, the VfTPC1 triple mutant (N458E/A607E/N608D) still sustained VfTPC1-WT-like features. These findings indicate that the hyperactivity of VfTPC1 is achieved in part by the loss of negatively charged amino acids at positions that - as part of the luminal Ca2+ sensing sites 2 and 3 – are homologous to AtTPC1-Glu457/Glu605/Asp606 and are likely stabilized by other unknown residues or domains. 
4.The luminal polymorphic pore residues (Glu605/Asp606 in AtTPC1) apparently do not contribute to the unitary conductance of TPC1. Under symmetrical K+ conditions, a single channel conductance of about 80 pS was determined for AtTPC1 wild type and the AtTPC1 double mutant E605A/D606A. This is in line with the three-fold higher unitary conductance of VfTPC1 (232 pS), which harbors neutral luminal pore residues at the homologous sites to AtTPC1. 
In conclusion, by studying TPC1 channel from Arabidopsis thaliana and Vicia faba, the present thesis provides evidence that the natural TPC1 channel variants exhibit differences in voltage gating, luminal Ca2+ sensitivity and luminal Ca2+ binding sites.
N2  - Der langsam aktivierende vakuoläre SV/TPC1-Kanal wird in Pflanzen ubiquitär exprimiert und besitzt eine große Kationenleitfähigkeit in der Vakuolen¬membran. Dabei können einwertige (K+, Na+) und im Prinzip auch zweiwertige Kationen, wie Ca2+, den Kanal passieren. Der SV/TPC1-Kanal wird bei Membrandepolarisation und zytosolischem Ca2+ aktiviert, aber durch luminales Calcium gehemmt. In Bezug auf letzteres wurden zwei luminale Ca2+-Bindungsstellen (Seite I Asp240/Asp454/Glu528, Seite II Glu239/Asp240/Glu457) zwecks Koordination von luminalem Ca2+ identifiziert. In dieser Arbeit wurden die Eigenschaften der SV/TPC1-Kanäle in Bezug auf Regulierung und Funktion weiter aufgeklärt, wobei der Schwerpunkt auf den TPC1-Proteinen von Arabidopsis thaliana und Vicia faba lag. Zur elektrophysiologischen Analyse der Rolle verschiedener Porenaminosäuren für das Kanal-Gating und die luminale Ca2+-Erkennung wurden TPC1-Kanalvarianten durch gezielte Mutagenese erzeugt und transient als eGFP/eYFP-Fusionskonstrukte in Mesophyll-Protoplasten der TPC1-Verlust¬mutante attpc1-2 von Arabidopsis thaliana exprimiert.
1. Mittels konfokaler Fluoreszenz-Laser-Scanning-Mikroskopie wurde anhand der eGFP- bzw. eYFP-Fluoreszenzsignale nachgewiesen, dass alle AtTPC1- (WT, E605A/Q, D606N, D607N, E605A/D606N, E605Q/D606N/D607N, E457N/E605A/D606N) und VfTPC1-Kanalvarianten (WT, N458E/A607E/ N608D) korrekt in die Vakuolenmembran eingebaut wurden.
2. Patch-Clamp-Studien zeigten, dass die Entfernung einer der negativen Ladungen an den Positionen Glu605 oder Asp606 bereits ausreichte, um die spannungsabhängige Kanalaktivierung mit höherer Spannungsempfindlichkeit zu fördern. Die kombinierte Neutralisierung dieser Reste (E605A/D606N) war jedoch erforderlich, um die luminale Ca2+-Empfindlichkeit des AtTPC1-Kanals zusätzlich zu reduzieren, was zu hyperaktiven AtTPC1-Kanälen führte. Die Aminosäurereste Glu605/Asp606 sind also funktionell mit dem Spannungssensor des AtTPC1-Kanals gekoppelt und modulieren dadurch das Kanaltor. Sie bilden eine neuartige luminale Ca2+-Sensorstelle 3 in AtTPC1 am luminalen Eingang des Ionentransportweges. 
3. Interessanterweise waren diese Aminosäurereste Glu605/Asp606 der neuartigen luminalen Ca2+-Sensorstelle 3 und Glu457 von der luminalen Ca2+-Sensorstelle 2 des luminalen Ca2+-empfindlichen AtTPC1-Kanals im TPC1-Kanal von Vicia faba und vielen anderen Fabaceae entweder durch Asparagin oder Alanin neutralisiert. Darüber hinaus wurde der VfTPC1 als hyperaktiver TPC1-Kanal mit höherer Toleranz gegenüber luminalen Ca2+-Belastungen validiert, was im Gegensatz zu den Eigenschaften des AtTPC1-Kanals stand. Infolgedessen ist VfTPC1, nicht aber AtTPC1, für die hohe Erregbarkeit der Vakuolen verantwortlich. Wenn AtTPC1 für die drei VfTPC1-homologen polymorphen Stellen mutiert wurde, erhielt die AtTPC1-Dreifachmutante (E457N/E605A/D606N) VfTPC1-ähnliche Eigenschaften. Wenn VfTPC1 jedoch für die drei AtTPC1-homologen polymorphen Stellen mutiert wurde, behielt die VfTPC1-Dreifachmutante (N458E/A607E/N608D) weiterhin VfTPC1-WT-ähnliche Merkmale. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hyperaktivität von VfTPC1 zum Teil durch den Verlust von negativ geladenen Aminosäuren an Positionen erreicht wird, die - als Teil der luminalen Ca2+-Sensorstellen 2 und 3 - homolog zu AtTPC1-Glu457/Glu605/Asp606 sind und wahrscheinlich durch andere unbekannte Reste oder Domänen stabilisiert werden. 
4. Die luminalen polymorphen Porenreste (Glu605/Asp606 in AtTPC1) beeinflussen offenbar nicht die Einzelkanaleitfähigkeit von TPC1. Unter symmetrischen K+-Bedingungen wurde für den AtTPC1-Wildtyp und die AtTPC1-Doppelmutante E605A/D606A eine Einzelkanalleitfähigkeit von etwa 80 pS ermittelt. Dies steht im Einklang mit der dreifach höheren Einzelkanalleitfähigkeit von VfTPC1 (232 pS), der an den homologen Stellen zu AtTPC1 neutrale luminale Porenreste aufweist.
Durch die Untersuchung von TPC1-Kanälen aus Arabidopsis thaliana und Vicia faba konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass diese natürlichen TPC1-Kanalvarianten Unterschiede im Spannungs-Gating, der luminalen Ca2+-Empfindlichkeit und den luminalen Ca2+-Bindungsstellen aufweisen.
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Vicia faba
KW  - vacuole
KW  - SV/TPC1
KW  - luminal Ca2+ sensing sites
KW  - luminale Ca2+-Sensorstellen
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251353
ER  - 
TY  - THES
A1  - von Rüden, Martin Frederik
T1  - The Venus flytrap - Role of oxylipins in trap performance of Dionaea muscipula
T1  - Die Venus Fliegenfalle – Die Rolle von Oxilipinen im Fallenverhalten von Dionaea muscipula
N2  - A part of the plant kingdom consists of a variety of carnivorous plants. Some trap their prey
using sticky leaves, others have pitfall traps where prey cannot escape once it has fallen inside.
A rare trap type is the snap-trap: it appears only twice in the plant kingdom, in the genera
Aldrovanda and Dionaea. Even Charles Darwin himself described Dionaea muscipula, the
Venus flytrap, with the following words “This plant, commonly called Venus' fly-trap, from the
rapidity and force of its movements, is one of the most wonderful in the world”. For a long
time now, the mechanisms of Dionaea’s prey recognition, capture and utilization are of
interest for scientists and have been studied intensively.
Dionaea presents itself with traps wide-open, ready to catch insects upon contact. For this,
the insect has to touch the trigger hairs of the opened trap twice within about 20-30 seconds.
Once the prey is trapped, the trap lobes close tight, forming a hermetically sealed “green
stomach”.
Until lately, there was only limited knowledge about the molecular and hormonal mechanisms
which lead to prey capture and excretion of digestive fluids. It is known that the digestion
process is very water-consuming; therefore, the interplay of digestion-inducing and digestion inhibiting
substances was to be analyzed in this work, to elucidate the fine-tuning of the
digestive pathway. Special attention was given to the impact of phytohormones on mRNA
transcript levels of digestion-related proteins after various stimuli as well as their effect on
Dionaea’s physiological responses.
Jasmonic acid (JA) and its isoleucine-conjugated form, JA-Ile, are an important signal in the
jasmonate pathway. In the majority of non-carnivorous plants, jasmonates are critical for the
defense against herbivory and pathogens. In Dionaea, this defense mechanism has been
restructured towards offensive prey catching. One question in this work was how the
frequency of trigger hair bendings is related to the formation of jasmonates and the induction
of the digestion process. Upon contact of a prey with the trigger hairs in the inside of the trap,
the trap closes and jasmonates are produced biosynthetically. JA-Ile interacts with the COI1-
receptor, thereby activating the digestion pathway which leads to the secretion of digestive
fluid and production of transporters needed to take up prey-derived nutrients. In this work it
could be shown that the number of trigger hair bendings is positively correlated with the level
and duration of transcriptional induction of several digestive enzymes/hydrolases.
Abscisic acid (ABA) acts, along with many other functions, as the plant “drought stress
hormone”. It is synthesized either by roots as the primary sensor for water shortage or by
guard cells in the leaves. ABA affects a network of several thousand genes whose regulation
prepares the plant for drought and initiates protective measurements. It was known from
previous work that the application of ABA for 48 hours increased the required amount of
trigger hair bendings to achieve trap closure. As the digestion process is very water-intensive,
the question arose how exactly the interplay between the jasmonate- and the ABA-pathway
is organized, and if ABA could stop the running digestion process once it had been activated.
In the present work it could be shown that the application of ABA on intact traps prior to
mechanically stimulating the trigger hairs (mechanostimulation) already significantly reduced
the transcription of digestive enzymes for an incubation time as short as 4 h, showing that
already short-term exposure to ABA counteracts the effects of jasmonates when it comes to
initiating the digestion process, but does not inhibit trap closure. Incubation for 24 and 48
hours with 100 μM active ABA had no effect on trap reopening, only very high levels of 200
μM of active ABA inhibited trap reopening but also led to tissue necrosis. As the application
of ABA could reduce the transcription of digestive hydrolases, it is likely that Dionaea can stop
the digestion process, if corresponding external stimuli are received.
Another factor, which only emerged later, was the effect of the wounding-induced systemic
jasmonate burst. As efficient as ABA was in inhibiting marker hydrolase expression after
mechanostimulation in intact plants, the application of ABA on truncated traps was not able
to inhibit mechanostimulation-induced marker hydrolase expression. One reason might be
that the ABA-signal is perceived in the roots, and therefore truncated traps were not able to
react to it. Another reason might be that the wounding desensitized the tissue for the ABAsignal.
Further research is required at this point.
Inhibitors of the jasmonate pathway were also used to assess their effect on the regulation of
Dionaea´s hunting cycle. Coronatine-O-methyloxime proved to be a potent inhibitor of
mechanostimulation-induced expression of digestive enzymes, thus confirming the key
regulatory role of jasmonates for Dionaea´s prey consumption mechanism.
In a parallel project, the generation of in vitro cultures from sterilized seeds and single plant
parts proved successful, which may be important for stock-keeping of future transgenic lines.
Protoplasts were generated from leaf blade tissue and transiently transformed, expressing the
reporter protein YFP after 24 h of incubation. In the future this might be the starting point for
the generation of transgenic lines or the functional testing of DNA constructs.
N2  - Ein Teil des Pflanzenreiches besteht aus einer Vielfalt fleischfressender Pflanzen. Einige fangen
ihre Beute mit klebrigen Blättern, andere haben Grubenfallen, aus denen die Beute nicht mehr
entkommen kann, wenn sie erst einmal hineingefallen ist. Ein seltener Fallentyp ist die
Klappfalle: Sie kommt im Pflanzenreich nur zweimal vor, in den Gattungen Aldrovanda und
Dionaea. Charles Darwin selbst beschrieb Dionaea muscipula, die Venusfliegenfalle, als "eine
der schönsten Pflanzen der Welt". Die Mechanismen der Erkennung, des Fangs und der
Nutzbarmachung von Beutetieren durch Dionaea sind seit langem von Interesse für die
Wissenschaft und wurden intensiv untersucht.
Dionaea hat weit geöffnete Fallen, die bei Kontakt Insekten fangen können. Dazu muss das
Insekt innerhalb von ca. 20-30 Sekunden zweimal die Triggerhaare der geöffneten Falle
berühren. Sobald die Beute gefangen ist, schließen sich die Fallenhälften fest und bilden einen
hermetisch verschlossenen sogenannten „grünen Magen“.
Bis vor einigen Jahren gab es nur wenige Informationen über die molekularen und
hormonellen Mechanismen, die zu Beutefang und Sekretion von Verdauungsflüssigkeiten
führen. Es ist bekannt, dass der Verdauungsprozess sehr viel Wasser verbraucht; daher sollte
in dieser Arbeit das Zusammenspiel von verdauungsauslösenden und verdauungshemmenden
Substanzen untersucht werden, um die Feinabstimmung des Verdauungsweges aufzuklären.
Ein besonderes Augenmerk wurde auf den Einfluss von Phytohormonen auf die mRNATranskriptzahlen
von Verdauungsproteinen nach verschiedenen Stimuli sowie auf deren
Auswirkungen auf die physiologischen Reaktionen von Dionaea gelegt.
Jasmonsäure (JA) und ihre mit Isoleucin konjugierte Form, JA-Ile, sind ein wichtiges Signal in
pflanzlichen Signaltransduktionsprozessen. In der Mehrzahl der nicht-karnivoren Pflanzen
sind Jasmonate entscheidend für die Abwehr von Herbivoren und Pathogenen. In Dionaea
wurde dieser Abwehrmechanismus für den offensiven Beutefang umstrukturiert. Eine Frage
in dieser Arbeit war also, wie die Häufigkeit der Triggerhaarberührungen mit der Bildung von
Jasmonaten und dem Verdauungsvorgang miteinander in Verbindung steht. Beim Kontakt von
Beute mit den Triggerhaaren im Inneren der Falle schließt sich diese, und es werden durch
Biosynthese Jasmonate gebildet. JA-Ile interagiert mit dem COI1-Rezeptor und aktiviert so den
Verdauungsweg, der zur Sekretion von Verdauungsflüssigkeit und zur Produktion von
Transportern führt, welche zur Aufnahme von aus Beute gewonnenen Nährstoffen benötigt
werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der Triggerhaarberührungen
positiv mit der Höhe und der Dauer der Transkriptionsinduktion mehrerer Verdauungsenzyme
bzw. Verdauungshydrolasen korreliert.
Abscisinsäure (ABA) fungiert neben vielen anderen Funktionen als pflanzliches
„Trockenstresshormon“. Es wird entweder von Wurzeln als primärem Sensor für
Wassermangel oder von Schließzellen in den Blättern synthetisiert. ABA beeinflusst ein
Netzwerk von mehreren tausend Genen, deren Regulation die Pflanze auf Dürre vorbereitet und entsprechende Schutzmaßnahmen einleitet.
Aus früheren Arbeiten war bekannt, dass die 48-stündige Inkubation einer Dionaea-Falle mit
ABA die erforderliche Anzahl an Triggerhaarberührungen erhöhte, die für einen Fallenschluss
notwendig sind. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Aufbringen von
ABA auf intakte Fallen vor der mechanischen Stimulierung der Triggerhaare
(Mechanostimulation) die Expression von Verdauungsenzymen bereits bei einer
Inkubationszeit von nur 4 Stunden signifikant reduzierte. Das zeigte eindeutig, dass die
kurzzeitige Einwirkung von ABA bereits die Effekte von Jasmonaten blockiert, wenn es um den
Beginn des Verdauungsprozesses geht, aber keinen Einfluss auf den Fallenschluss hat. Eine
Inkubation für 24 und 48 Stunden mit 100 μM aktiver ABA hatte keine Auswirkung auf das
Wiederöffnen der Falle, nur sehr hohe Konzentrationen von 200 μM aktiver ABA hemmten
das Wiederöffnen der Falle, führten aber auch zu Gewebenekrose. Da ABA die Transkription
der Verdauungsenzyme reduzieren konnte, ist es wahrscheinlich, dass Dionaea den
Verdauungsvorgang stoppen kann, wenn entsprechende externe Signale empfangen werden.
Ein weiterer Einflussfaktor, welcher erst später erkannt wurde, war die Auswirkung des
verwundungsbedingten, sprunghaften systemischen Anstiegs der Jasmonatkonzentration auf
die Wirkung von extern aufgegebenen Phytohormonen. So wirksam ABA bei der Hemmung
der Markerhydrolasen-Expression nach Mechanostimulation in intakten Pflanzen war, so
konnte diese Inhibition nach Anwendung von ABA auf abgeschnittenen Fallen nicht mehr
beobachtet werden. Ein Grund könnte sein, dass das ABA-Signal in den Wurzeln
wahrgenommen wird und daher abgeschnittene Fallen nicht darauf reagieren konnten. Ein
anderer Grund könnte sein, dass die Verwundung das Gewebe für das ABA-Signal
desensibilisiert hat. An dieser Stelle besteht weiterer Forschungsbedarf.
Ebenfalls wurden Inhibitoren des Jasmonat-Weges verwendet, um ihre Wirkung auf die
Regulation des Beutefangzyklus von Dionaea zu untersuchen. Coronatine-O-methyloxim
erwies sich als wirksamer Inhibitor der durch Mechanostimulation induzierten Expression von
Verdauungsenzymen und bestätigte damit die zentrale regulatorische Rolle von Jasmonaten
für den Beutefangmechanismus von Dionaea.
Ein parallel laufendes Projekt war die Erzeugung von in vitro-Kulturen aus sterilisiertem
Saatgut und einzelnen Pflanzenteilen, das sich als sehr erfolgreich erwies, was für die
Erzeugung zukünftiger transgener Linien wichtig sein kann. Ebenfalls wurden Protoplasten aus
Blattgewebe erzeugt, diese wurden transient transformiert und exprimierten YFP nach einer
Inkubationszeit von 24 Stunden. In Zukunft könnte dies der Ausgangspunkt für die
Generierung transgener Linien sein und der Funktionsüberprüfung von DNA-Konstrukten sein.
KW  - Venusfliegenfalle
KW  - Protoplast
KW  - Abscisinsäure
KW  - Jasmonsäure
KW  - Antibiotikum
KW  - Dionaea
KW  - Herbicid
KW  - Celaflor
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-273854
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Kreuzwieser, Jürgen
A1  - Scheerer, Ursel
A1  - Kruse, Jörg
A1  - Burzlaff, Tim
A1  - Honsel, Anne
A1  - Alfarraj, Saleh
A1  - Georgiev, Palmen
A1  - Schnitzler, Jörg-Peter
A1  - Ghirardo, Andrea
A1  - Kreuzer, Ines
A1  - Hedrich, Rainer
A1  - Rennenberg, Heinz
T1  - The Venus flytrap attracts insects by the release of volatile organic compounds
JF  - Journal of Experimental Botany
N2  - Does Dionaea muscipula, the Venus flytrap, use a particular mechanism to attract animal prey? This question was raised by Charles Darwin 140 years ago, but it remains unanswered. This study tested the hypothesis that Dionaea releases volatile organic compounds (VOCs) to allure prey insects. For this purpose, olfactory choice bioassays were performed to elucidate if Dionaea attracts Drosophila melanogaster. The VOCs emitted by the plant were further analysed by GC-MS and proton transfer reaction-mass spectrometry (PTR-MS). The bioassays documented that Drosophila was strongly attracted by the carnivorous plant. Over 60 VOCs, including terpenes, benzenoids, and aliphatics, were emitted by Dionaea, predominantly in the light. This work further tested whether attraction of animal prey is affected by the nutritional status of the plant. For this purpose, Dionaea plants were fed with insect biomass to improve plant N status. However, although such feeding altered the VOC emission pattern by reducing terpene release, the attraction of Drosophila was not affected. From these results it is concluded that Dionaea attracts insects on the basis of food smell mimicry because the scent released has strong similarity to the bouquet of fruits and plant flowers. Such a volatile blend is emitted to attract insects searching for food to visit the deadly capture organ of the Venus flytrap.
KW  - carnivorus plants
KW  - dionaea muscipula
KW  - drosophila melanogaster
KW  - VOC emissions
KW  - nitrogen status
KW  - olfactory bioassay
KW  - plant-animal interaction
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121161
VL  - 65
IS  - 2
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Böhm, Jennifer
A1  - Scherzer, Sönke
A1  - Krol, Elzbieta
A1  - Kreuzer, Ines
A1  - von Meyer, Katharina
A1  - Lorey, Christian
A1  - Mueller, Thomas D.
A1  - Shabala, Lana
A1  - Monte, Isabel
A1  - Salano, Roberto
A1  - Al-Rasheid, Khaled A. S.
A1  - Rennenberg, Heinz
A1  - Shabala, Sergey
A1  - Neher, Erwin
A1  - Hedrich, Rainer
T1  - The Venus Flytrap Dionaea muscipula Counts Prey-Induced Action Potentials to Induce Sodium Uptake
JF  - Current Biology
N2  - Carnivorous plants, such as the Venus flytrap (Dionaea muscipula), depend on an animal diet when grown in nutrient-poor soils. When an insect visits the trap and tilts the mechanosensors on the inner surface, action potentials (APs) are fired. After a moving object elicits two APs, the trap snaps shut, encaging the victim. Panicking preys repeatedly touch the trigger hairs over the subsequent hours, leading to a hermetically closed trap, which via the gland-based endocrine system is flooded by a prey-decomposing acidic enzyme cocktail. Here, we asked the question as to how many times trigger hairs have to be stimulated (e.g., now many APs are required) for the flytrap to recognize an encaged object as potential food, thus making it worthwhile activating the glands. By applying a series of trigger-hair stimulations, we found that the touch hormone jasmonic acid (JA) signaling pathway is activated after the second stimulus, while more than three APs are required to trigger an expression of genes encoding prey-degrading hydrolases, and that this expression is proportional to the number of mechanical stimulations. A decomposing animal contains a sodium load, and we have found that these sodium ions enter the capture organ via glands. We identified a flytrap sodium channel DmHKT1 as responsible for this sodium acquisition, with the number of transcripts expressed being dependent on the number of mechano-electric stimulations. Hence, the number of APs a victim triggers while trying to break out of the trap identifies the moving prey as a struggling Na+-rich animal and nutrition for the plant.
KW  - Venusfliegenfalle
KW  - Dionaea muscipula
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128054
VL  - 26
IS  - 3
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Böhm, Jennifer
A1  - Scherzer, Sönke
A1  - Krol, Elzbieta
A1  - Kreuzer, Ines
A1  - von Meyer, Katharina
A1  - Lorey, Christian
A1  - Mueller, Thomas D.
A1  - Shabala, Lana
A1  - Monte, Isabel
A1  - Solano, Roberto
A1  - Al-Rasheid, Khaled A. S.
A1  - Rennenberg, Heinz
A1  - Shabala, Sergey
A1  - Neher, Erwin
A1  - Hedrich, Rainer
T1  - The Venus flytrap Dionaea muscipula counts prey-induced action potentials to induce sodium uptake
JF  - Current Biology
N2  - Carnivorous plants, such as the Venus flytrap (Dionaea muscipula), depend on an animal diet when grown in nutrient-poor soils. When an insect visits the trap and tilts the mechanosensors on the inner surface, action potentials (APs) are fired. After a moving object elicits two APs, the trap snaps shut, encaging the victim. Panicking preys repeatedly touch the trigger hairs over the subsequent hours, leading to a hermetically closed trap, which via the gland-based endocrine system is flooded by a prey-decomposing acidic enzyme cocktail. Here, we asked the question as to how many times trigger hairs have to be stimulated (e.g., now many APs are required) for the flytrap to recognize an encaged object as potential food, thus making it worthwhile activating the glands. By applying a series of trigger-hair stimulations, we found that the touch hormone jasmonic acid (JA) signaling pathway is activated after the second stimulus, while more than three APs are required to trigger an expression of genes encoding prey-degrading hydrolases, and that this expression is proportional to the number of mechanical stimulations. A decomposing animal contains a sodium load, and we have found that these sodium ions enter the capture organ via glands. We identified a flytrap sodium channel DmHKT1 as responsible for this sodium acquisition, with the number of transcripts expressed being dependent on the number of mechano-electric stimulations. Hence, the number of APs a victim triggers while trying to break out of the trap identifies the moving prey as a struggling Na\(^+\)-rich animal and nutrition for the plant.
KW  - jasmonic acid biosynthesis
KW  - gene expression
KW  - signal transduction
KW  - transporters
KW  - Arabidopsis
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190870
VL  - 26
IS  - 3
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Yamakawa, Hisanori
A1  - Fukushima, Yoshimasa
A1  - Itoh, Shigeru
A1  - Heber, Ulrich
T1  - Three different mechanisms of energy dissipation of a desiccation-tolerant moss serve one common purpose: to protect reaction centres against photo-oxidation
JF  - Journal of Experimental Botany
N2  - Three different types of non-photochemical de-excitation of absorbed light energy protect photosystem II of the sun- and desiccation-tolerant moss Rhytidium rugosum against photo-oxidation. The first mechanism, which is light-induced in hydrated thalli, is sensitive to inhibition by dithiothreitol. It is controlled by the protonation of a thylakoid protein. Other mechanisms are activated by desiccation. One of them permits exciton migration towards a far-red band in the antenna pigments where fast thermal deactivation takes place. This mechanism appears to be similar to a mechanism detected before in desiccated lichens. A third mechanism is based on the reversible photo-accumulation of a radical that acts as a quencher of excitation energy in reaction centres of photosystem II. On the basis of absorption changes around 800 nm, the quencher is suggested to be an oxidized chlorophyll. The data show that desiccated moss is better protected against photo-oxidative damage than hydrated moss. Slow drying of moss thalli in the light increases photo-protection more than slow drying in darkness.
KW  - reaction centre
KW  - photoprotection
KW  - energy dissipation
KW  - energy conservation
KW  - chlorophyll fluorescence
KW  - photosystem II
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-126897
VL  - 63
IS  - 10
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Dorji, Yonten
A1  - Schuldt, Bernhard
A1  - Neudam, Liane
A1  - Dorji, Rinzin
A1  - Middleby, Kali
A1  - Isasa, Emilie
A1  - Körber, Klaus
A1  - Ammer, Christian
A1  - Annighöfer, Peter
A1  - Seidel, Dominik
T1  - Three-dimensional quantification of tree architecture from mobile laser scanning and geometry analysis
JF  - Trees
N2  - Key message
Mobile laser scanning and geometrical analysis revealed relationships between tree geometry and seed dispersal mechanism, latitude of origin, as well as growth.

Abstract
The structure and dynamics of a forest are defined by the architecture and growth patterns of its individual trees. In turn, tree architecture and growth result from the interplay between the genetic building plans and environmental factors. We set out to investigate whether (1) latitudinal adaptations of the crown shape occur due to characteristic solar elevation angles at a species’ origin, (2) architectural differences in trees are related to seed dispersal strategies, and (3) tree architecture relates to tree growth performance. We used mobile laser scanning (MLS) to scan 473 trees and generated three-dimensional data of each tree. Tree architectural complexity was then characterized by fractal analysis using the box-dimension approach along with a topological measure of the top heaviness of a tree. The tree species studied originated from various latitudinal ranges, but were grown in the same environmental settings in the arboretum. We found that trees originating from higher latitudes had significantly less top-heavy geometries than those from lower latitudes. Therefore, to a certain degree, the crown shape of tree species seems to be determined by their original habitat. We also found that tree species with wind-dispersed seeds had a higher structural complexity than those with animal-dispersed seeds (p < 0.001). Furthermore, tree architectural complexity was positively related to the growth performance of the trees (p < 0.001). We conclude that the use of 3D data from MLS in combination with geometrical analysis, including fractal analysis, is a promising tool to investigate tree architecture.
KW  - tree architecture
KW  - LiDAR
KW  - fractal analysis
KW  - seed dispersal strategy
KW  - latitude
KW  - tree growth
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-307501
SN  - 0931-1890
SN  - 1432-2285
VL  - 35
IS  - 4
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lindenberg [verh. Schubert], Annekathrin
T1  - Timing of sensory preferences in \(Camponotus\) Ants
T1  - Zeitliche Anpassung sensorischer Präferenzen in \(Camponotus\) Ameisen
N2  - Ants belong to the most successful insects living on our planet earth. One criterion of their tremendous success is the division of labor among workers that can be related to age (age¬– or temporal polyethism) and/ or body size (size–related polymorphism).  Young ants care for the queen and brood in the nest interior and switch to foraging tasks in the outside environment with ongoing age. This highly flexible interior–exterior transition probably allows the ant workers to properly match the colony needs and is one of the most impressive behaviors a single worker undergoes during its life. As environmental stimuli are changing with this transition, workers are required to perform a new behavioral repertoire. This requires significant adaptions in sensory and higher¬–order integration centers in the brain, like the mushroom bodies. Furthermore, foragers need proper time measuring mechanisms to cope with daily environmental changes and to adapt their own mode of life. Therefore, they possess a functional endogenous clock that generates rhythms with a period length of approximately 24 hours. The species–rich genus of Camponotus ants constitute a rewarding model to study how behavioral duties of division of labor were performed and modulated within the colony and how synaptic plasticity in the brain is processed, as they can divide their labor to both, age and body size, simultaneously.
In my PhD thesis, I started to investigate the behavioral repertoire (like foraging and locomotor activity) of two sympatric Camponotus species, C. mus and C. rufipes workers under natural and under controlled conditions. Furthermore, I focused on the division of labor in C. rufipes workers and started to examine structural and ultrastructural changes of neuronal architectures in the brain that are accompanied by the interior–exterior transition of C. rufipes ants. 
In the first part of my thesis, I started to analyze the temporal organization of task allocation throughout the life of single C. rufipes workers. Constant video–tracking of individually labeled workers for up to 11 weeks, revealed an age–related division of labor of interior and exterior workers. After emergence, young individuals are tended to by older ones within the first 48 hours of their lives before they themselves start nurturing larvae and pupae. Around 52% switch to foraging duties at an age of 14–20 days. The workers that switched to foraging 

tasks are mainly media–sized workers and seem to be more specialized than nurses. Variations in proportion and the age of switching workers between and within different subcolonies indicate how highly flexible and plastic the age–related division of labor occurs in this ant species. Most of the observed workers were engaged in foraging tasks exclusively during nighttime. As the experiments were conducted in the laboratory, they are completely lacking environmental stimuli of the ants´ natural habitat. 
I therefore asked in a second study, how workers of the two closely related Camponotus species, C. rufipes and C. mus, adapt their daily activity patterns (foraging and locomotor activity) under natural (in Uruguay, South America) and controlled (in the laboratory) conditions to changing thermal conditions. Monitoring the foraging activity of both Camponotus species in a field experiment revealed, that C. mus workers are exclusively diurnal, whereas C. rufipes foragers are predominantly nocturnal. However, some nests showed an elevated daytime activity, which could be an adaption to seasonally cold night temperatures. To further investigate the impact of temperature and light on the differing foraging activity patterns in the field, workers of both Camponotus species were artificially exposed to different thermal regimes in the laboratory, simulating local winter and summer conditions. Here again, C. mus workers display solely diurnal locomotor activity, whereas workers of C. rufipes shifted their locomotor activity from diurnal under thermal winter conditions to nocturnal under thermal summer conditions. Hence, the combination of both, field work and laboratory studies, shows that daily activity is mostly shaped by thermal conditions and that temperature cycles are not just limiting foraging activity but can be used as zeitgeber to schedule the outside activities of the nests. 
Once an individual worker switches from indoor duties to exterior foraging tasks, it is confronted with an entirely new set of sensory information. To cope with changes of the environmental conditions and to facilitate the behavioral switch, workers need a highly flexible and plastic neuronal system. Hence, my thesis further focuses on the underlying neuronal adaptations of the visual system, including the optic lobes as the primary visual neuropil and the mushroom bodies as secondary visual brain neuropil, that are accompanied with the behavioral switch from nursing to foraging. The optic lobes as well as the mushroom bodies of light–deprived workers show an `experience–independent´ volume increase during the first two weeks of adulthood. An additional light exposure for 4 days induces an `experience–dependent´ decrease of synaptic complexes in the mushroom body collar, 

followed by an increase after extended light exposure for 14 days. I therefore conclude, that the plasticity of the central visual system represents important components for the optimal timing of the interior–exterior transitions and flexibility of the age–related division of labor. These remarkable structural changes of synaptic complexes suggest an active involvement of the mushroom body neuropil in the lifetime plasticity that promotes the interior–exterior transition of Camponotus rufipes ants. Beside these investigations of neuronal plasticity of synaptic complexes in the mushroom bodies on a structural level, I further started to examine mushroom body synaptic structures at the ultrastructural level. Until recently, the detection of synaptic components in projection neuron axonal boutons were below resolution using classical Transmission Electron Microscopy. Therefore, I started to implement Electron Tomography to increase the synaptic resolution to understand architectural changes in neuronal plasticity process. By acquiring double tilt series and consecutive computation of the acquired tilt information, I am now able to resolve individual clear–core and dense–core vesicles within the projection neuron cytoplasm of C. rufipes ants. I additionally was able to reveal single postsynaptic Kenyon cell dendritic spines (~62) that surround one individual projection neuron bouton. With this, I could reveal first insights into the complex neuronal architecture of single projection neuron boutons in the olfactory mushroom body lip region. The high resolution images of synaptic architectures at the ultrastructural level, received with Electron Tomography would promote the understanding of architectural changes in neuronal plasticity.

In my PhD thesis, I demonstrate that the temporal organization within Camponotus colonies involves the perfect timing of different tasks. Temperature seems to be the most scheduling abiotic factors of foraging and locomotor activity. The ants do not only need to adapt their behavioral repertoire in accordance to the interior–exterior switch, also the parts in the peripheral and central that process visual information need to adapt to the new sensory environment.
N2  - Ameisen gehören zu den erfolgreichsten Insekten unserer Erde. Hauptverantwortlich für ihren enormen Erfolg ist die Arbeitsteilung der Arbeiterinnenkaste. Ameisenarbeiterinnen können sich ihre Aufgaben abhängig ihrer Körpergröße teilen (Größenpolymorphismus), indem unterschiedlich große Tiere verschiedenen Aufgaben in der Kolonie nachgehen. Zusätzlich kann die Arbeitsteilung aber auch altersbedingt sein (auch genannt Alters– oder zeitlicher Polyethismus): Junge Ameisen kümmern sich um die Königin und Brut innerhalb des Nestes, bevor sie mit zunehmendem Alter das Nest verlassen und zu Futtersammlerinnen (Furageuren) werden. Der extrem anpassungsfähige Wechsel von Innen¬– zu Außendiensttieren ist einer der erstaunlichsten Verhaltensweisen, die Arbeiterinnen an den Tag legen und ermöglicht es ihnen, den unterschiedlichen Bedürfnissen ihrer Kolonie nachzugehen. Der Übergang der Ammentätigkeit zum Furagieren ist mit beträchtlichen Veränderungen der sensorischen Umgebung der einzelnen Arbeiterinnen verbunden und erfordert eine Verhaltensanpassung an diese neuen Gegebenheiten. Wenn sich die Verhaltensweisen der Arbeiterinnen ändert, führt das zu Anpassungen der sensorischen und höheren Verschaltungszentren in bestimmten Gehirnarealen. Eines dieser sensorischen Verarbeitungszentren sind die Pilzkörper. Außerdem müssen Furageure in der Lage sein, tägliche Veränderungen ihrer Umwelt wahrzunehmen, um ihre Verhaltensweisen stets optimal an die sich ändernde Umwelt anzupassen. Dafür brauchen sie eine funktionierende innere Uhr, die rhythmisch mit einer Periodenlänge von ca. 24 Stunden läuft. Die artenreiche Gattung der Camponotus Ameisen ist ein geeigneter Organismus, um die Verhaltensweisen die mit der Arbeitsteilung der Arbeiterinnenkaste einhergehen, zu untersuchen, da sowohl der Größenpolymorphismus als auch der Alterspolyethismus zeitgleich in dieser Gattung auftauchen können. Dadurch eignen sich Camponotus Ameisen auch hervorragend, um strukturelle Veränderungen synaptischer Komplexe im Gehirn, die sich durch die Arbeitsteilung ändern können, zu untersuchen.
In meiner Doktorarbeit habe ich damit angefangen, die Verteilung von bestimmten Aufgaben (Ammen und Furageure) von C. rufipes Arbeiterinnen zu untersuchen. Mithilfe von Videoaufnahmen über elf Wochen, konnte ich sowohl eine altersabhängige, als auch 

eine größenabhängige Arbeitsteilung zwischen Ammen und Furageuren für diese Art zeigen. Frisch geschlüpfte Tiere wurden innerhalb der ersten 48 Stunden von anderen Ammen umsorgt, bevor sie selbst zu Ammen wurden und Aufgaben wie Brutpflege übernommen haben. Nach rund 14–20 Tagen sind 53% der Ammen zu Furageuren gewechselt. Zusätzlich zu der altersabhängigen Arbeitsteilung konnte ich zeigen, dass die Körpergröße der Ammen deutlich breiter gestreut ist als die der Furageure, was in einer höheren Spezialisierung der Furageure resultiert. Proportionale Unterschiede des Alters und der Größe der Tiere, die diesen Wechsel vollzogen haben zeigen, wie hoch flexibel und anpassungsfähig die Arbeitsteilung innerhalb der Arbeiterinnenkaste sein kann. Die meisten der beobachteten Furageure waren außerdem fast ausschließlich nachtaktiv. Da ich diese Experimente im Labor durchgeführt habe, fehlt es komplett an der natürlichen sensorischen Umgebung der Tiere. 
In dem zweiten Teil meiner Doktorarbeit habe ich mich damit beschäftigt, ob sich tägliche Aktivitätsmuster (Furagier– und Bewegungsaktivität) von Arbeiterinnen zweier nah verwandter Camponotus Arten (C. rufipes und C. mus) unter natürlichen Bedingungen (in Uruguay, Südamerika) und unter kontrollierten Bedingungen (im Labor), in Abhängigkeit von den abiotischen Faktoren Licht und Temperatur, verändern können. Meine Ergebnisse zeigen, dass C. mus Arbeiterinnen unter natürlichen Bedingungen strikt tagaktiv sind, wohingegen C. rufipes Arbeiterinnen vornehmlich nachts furagierten. Ein paar C. rufipes Nester zeigten allerdings eine erhöhte Furagieraktivität tagsüber, was auf die saisonal kalten Nächte zurückzuführen sein könnte. Um den Einfluss von Licht und Temperatur, der sich auf die Furagieraktivität im Feld gezeigt hat, genauer untersuchen zu können, wurden Arbeiterinnen beider Camponotus Arten verschiedenen Licht– und Temperaturbedingungen im Labor ausgesetzt. Auch hier zeigten Arbeiterinnen der Gattung C. mus eine strikt tagaktive Bewegungsaktivität, wohingegen C. rufipes Arbeiterinnen von tagaktiv unter Winter Temperaturbedingungen zu nachaktiv unter Sommer Temperaturbedingungen wechselten. Die Kombination aus den Ergebnissen der Feld– und Laborstudien zeigen deutlich, dass die generelle Aktivität der beiden Arten hauptsächlich durch Licht und Temperatur beeinflusst wird und dass Temperaturzyklen nicht nur ein limitierender Faktor der Furagieraktivität sind, sondern auch als Zeitgeber dienen können um Aktivität generell zu regulieren.


Wenn der Übergang von Innen– zu Außendiensttieren stattgefunden hat, ändert sich die komplette sensorische Umgebung der Furageure. Um diese Veränderungen verarbeiten zu können, brauchen Arbeiterinnen ein hoch anpassungsfähiges und flexibles neuronales System. Daher beschäftigte ich mich in meiner Doktorarbeit außerdem mit den zugrundeliegenden neuronalen Anpassungen der visuellen Verarbeitungsregionen im Gehirn, wie die optischen Loben und die Pilzkörper, die mit dem Wechsel von Ammen zu Furageuren einhergehen. Ich konnte zeigen, dass die optischen Loben und die Pilzkörper von im Dunkeln gehaltenen Arbeiterinnen eine `Erfahrungs–unabhängige´ Volumenszunahme innerhalb der ersten zwei Wochen nach dem Schlupf zeigen. Eine folgende Lichtexposition von vier Tagen führte zu einer `Erfahrungs–abhängigen´ Abnahme der synaptischen Strukturen im Pilzkörper, die allerdings durch eine länger anhaltende Lichtexposition von 14 Tagen wieder anstieg. Diese Plastizität des zentralen visuellen Nervensystems repräsentiert eine wichtige Komponente für die optimale zeitliche Anpassung des Wechsels von Ammen zu Furageuren und die enorme Flexibilität der altersabhängigen Arbeitsteilung. Außerdem scheinen die Pilzkörper durch diese beeindruckenden strukturellen Veränderungen der synaptischen Komplexe aktiv an dieser neuronalen Plastizität beteiligt zu sein und daher den Übergang von Innen– zu Außendiensttieren in C. rufipes Ameisen zu unterstützen. Neben meinen Untersuchungen zur neuronalen Plastizität synaptischer Komplexe im Pilzkörper auf der strukturellen Ebene, habe ich damit begonnen, diese Plastizität der neuronalen Komplexe auch auf Ultrastruktur Ebene zu untersuchen. Durch die zu geringe Auflösungsmöglichkeit der klassischen Transmissions Elektronenmikroskopie, konnten bisher einzelne synaptischer Komponenten in den axonalen Endigungen der Projektionsneurone nicht detektiert werden. Deswegen habe ich damit angefangen, die Methode der Elektronen Tomographie zu etablieren um die Auflösung synaptischer Komplexe zu verbessern. Mit dieser höheren Auflösung ist es möglich, bauliche Veränderungen der synaptischen Komplexe in Plastizitätsprozessen besser zu verstehen. Mit der Durchführung von `double tilt´ Serien und der anschließenden Verarbeitung der erhaltenen Bildinformation, war es mir möglich, einzelne `clear–core´ und `dense–core´ Vesikel innerhalb des Zytoplasmas der Projektionsneurone von C. rufipes Ameisen detektieren. Außerdem konnte ich mit dieser Methode einzelne postsynaptische dendritische Dornen der Kenyon Zellen (~62) identifizieren, die ein einzelnes Endknöpfchen eines Projektionsneurons umgeben.  In diesem Teil meiner Arbeit konnte ich erste Einblicke in die komplexe neuronale Bauweise einzelner Endigungen der Projektionsneurone in der 

olfaktorischen Region der Pilzkörper zeigen. Die hochauflösenden Bilder synaptischer Komplexe auf dem Ultrastruktur Level, die man mit der Elektronen Tomographie erzielen kann, bringen das Verständnis baulicher Veränderungen innerhalb der neuronales Plastizität voran.
In meiner Doktorarbeit konnte ich zeigen, dass die zeitliche Organisation verschiedener Aufgaben innerhalb der Kolonien von Camponotus Ameisen einer perfekten Zeitplanung bedarf. Hier scheinen die abiotischen Faktoren Temperatur und Licht den größten Einfluss auf die Furagieraktivität und die generelle Aktivität zu haben. Die Ameisenarbeiterinnen müssen nicht nur ihre Verhaltensweise nach dem Übergang von Ammen zu Furageuren anpassen, es müssen sich auch die Teile des Gehirns, die für die Verarbeitung visueller Reize zuständig sind, dieser neuen sensorischen Umgebung anpassen.
KW  - Rossameise
KW  - Pilzkörper
KW  - Arbeitsteilung
KW  - Furagieraktivität
KW  - foraging activity
KW  - Neuronales visuelles System
KW  - neuronal visual system
KW  - Camponotus rufipes
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160948
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rudolf, Ronald
T1  - Transcriptional Regulation of and by NFATc1 in Lymphocytes
T1  - Transkriptionelle Regulation von und durch NFATc1 in Lymphozyten
N2  - The transcription factor NFATc1 has been shown to regulate the activation and differentiation of T-cells and B-cells, of DCs and megakaryocytes. Dysregulation of NFAT signaling was shown to be associated with the generation of autoimmune diseases, malignant transformation and the development of cancer [71]. The primary goal of this work was to gain insights on Nfatc1 induction and regulation in lymphocytes and to find new direct NFATc1 target genes. Three new BAC -transgenic reporter mouse strains (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) were applied to analyze Nfatc1 induction and regulation in primary murine B- and T-cells. As a result, we were able to show the persistent requirement of immunoreceptor-signaling for constant Nfatc1 induction, particularly, for NFATc1/αA expression. Furthermore, we showed that NF-κB inducing agents, such as LPS, CpG or CD40 receptor engagement, in combination with primary receptor-signals, positively contributed to Nfact1 induction in B-cells [137]. We sought to establish a new system which could help to identify direct NFATc1 target genes by means of ChIP and NGS in genom-wide approaches. We were able to successfully generate a new BAC-transgene encoding a biotinylatable short isoform of NFATc1, which is currently injected into mice oocyte at the TFM in Mainz. In addition, in vivo biotinylatable NFATc1–isoforms were cloned and stably expressed in the murine B-cell lymphoma line WEHI-231. The successful use of these cells stably overexpressing either the short NFATc1/αA or the long NFATc1/βC isoform along with the bacterial BirA biotin ligase was confirmed by intracellular stainings, FACS analysis, confocal microscopy and protein IP. By NGS, we detected 2185 genes which are specifically controlled by NFATc1/αA, and 1306 genes which are exclusively controlled by NFATc1/βC. This shows that the Nfatc1 locus encodes “two genes” which exhibit alternate, in part opposite functions. Studies on the induction of apoptosis and cell-death revealed opposed roles for the highly inducible short isoform NFATc1/αA and the constantly expressed long isoform NFATc1/βC. These findings were confirmed by whole transcriptome-sequencing performed with cells overexpressing NFATc1/αA and NFATc1/βC. Several thousand genes were found to be significantly altered in their expression profile, preferentially genes involved in apoptosis and PCD for NFATc1/βC or genes involved in transcriptional regulation and cell-cycle processes for NFATc1/αA. In addition we were able to perform ChIP-seq for NFATc1/αA and NFATc1/βC in an ab-independent approach. We found potential new target-sites, but further studies will have to address this ambitious goal in the future. In individual ChIP assays, we showed direct binding of NFATc1/αA and NFATc1/βC to the Prdm1 and Aicda promoter regions which are individually controlled by the NFATc1 isoforms.
N2  - Der Transkriptionsfaktor NFATc1 wurde als Regulator der Aktivierung und Differenzierung für T-Zellen, B-Zellen, Dendritische-Zellen und Megakaryozyten beschrieben. Autoimmunerkrankungen und die Entstehung von Krebs wurden mit Fehlregulationen der NFAT-Signalwege in Verbindung gebracht [71]. Ziel dieser Arbeit war der Gewinn neuer Erkenntnisse über die Induktion und Regulation von NFATc1 in Lymphozyten. Darüber hinaus sollten Gene, welche direkt durch NFATc1 gebunden und reguliert werden, identifiziert werden. Um die Induktion und Regulation von NFATc1 in primären T- und B-Zellen untersuchen zu können, wurden drei BAC transgene Reporter Maus Linien (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) verwendet. Dadurch war es uns möglich zu zeigen, dass es einer ununterbrochenen Antigen-Rezeptor Stimulation bedarf, um NFATc1, im Besonderen die Transkription der kurzen Isoform NFATc1/αA, dauerhaft zu induzieren. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass Induktoren wie LPS, CpG oder auch die Stimulation des CD40-Rezeptors, die die Expression des Transkriptionsfaktors NF-B zur Folge haben, einen positiven Einfluss auf die Nfatc1-Induktion haben [137]. Unser Interesse lag darin, ein System zu etablieren, dass es uns ermöglichen sollte, neue NFATc1-Zielgene durch ChIP assays und Genom-weite Sequenzierungen zu ermitteln. Es ist uns gelungen, ein neues BAC-Transgen, welches für eine in vivo biotinylierbare Variante des NFATc1/αA Proteins kodiert, zu erzeugen. Dieses Konstrukt wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt - in Zusammenarbeit mit der Universität Mainz (TFM) - in die Vorkerne von Maus-Eizellen injiziert. Ferner wurden biotinylierbare NFATc1-Isoformen kloniert und mit Hilfe retroviraler Plasmide stabil in WEHI-231 B-Lymphom-Zellen integriert. Durch intrazellulare Färbungen, FACS-Analysen, Konfokalmikroskopie und Immunpräzipitationen konnten wir eine erfolgreiche in vivo Biotinylierung in NFATc1/αA- und NFATc1/βC-exprimierenden WEHI-231 Zellen nachweisen. Mittels Next-Generation-Sequencing, in Kollaboration mit TRON, Univ. Mainz, konnten wir 2185 Gene, die spezifisch durch NFATc1/αA kontrolliert wurden, und 1306 Gene, die ausschließlich durch die Überexpression von NFATc1/βC reguliert wurden, identifizieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass im Nfatc1 Locus „zwei Gene“ mit alternativer, zum Teil gegensätzlicher Funktion, kodiert sind. Untersuchungen zu Apoptose und Zelltod haben entgegengesetzte Eigenschaften der stark induzierbaren, kurzen Isoform NFATc1/αA und der stetig exprimierten langen Isoform NFATc1/βC aufgezeigt. Daten von Sequenzierungen des gesamten Transkriptoms, die mit NFATc1/αA und -βC überexprimierenden WEHI-231 Zellen durchgeführt wurden (TRON, Mainz), bestätigten diese Befunde. Es zeigte sich, dass es wesentliche Veränderungen der Expressionsprofile Tausender von Genen gab. In WEHI-231-Zellen, die NFATc1/βC überexprimierten, waren viele dieser Gene an Apoptose und Zelltod beteiligt. Demgegenüber waren in NFATc1/αA-Zellen vor allem Gene betroffen, die an transkriptionaler Regulation und dem Zellzyklus beteiligt waren. Überdies war es uns möglich, ChIPseq Assays für NFATc1/αA und NFATc1/βC in einem Antikörper-unabhängigen Ansatz durchzuführen. Dadurch konnten wir neue NFATc1-Bindungstellen identifizieren. Es bedarf jedoch noch weiterer Untersuchungen, um diese Ergebnisse der Genom-weiten ChIPseq Assays zu bestätigen. Durch weitere ChIP Experimente konnten wir eine direkte Bindung von NFATc1/αA und NFATc1/βC an die regulatorischen Regionen der Prdm1- und Aicda-Gene nachweisen. Die Transkription beider Gene wurde durch die Überexpression von NFATc1/αA und -βC deutlich reguliert und spielt offenbar bei der Bildung von Plasma-B-Zellen, die für die Antikörper-Produktion verantwortlich sind, eine wesentliche Rolle.
KW  - Lymphozyt
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - Lymphozyten
KW  - NFATc1
KW  - Lymphocytes
KW  - NFATc1
KW  - Genregulation
KW  - Maus
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83993
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ferber, Elena
T1  - Transkriptionelle, metabolische und physiologische Anpassung nach Selbstintoxikation mit reaktiven Sekundärstoffen: die Glukosinolat-Bombe in Arabidopsis thaliana
T1  - Transcriptional, metabolic and physiological adaptation after self-intoxication with reactive secondary substances: the glucosinolate bomb in Arabidopsis thaliana
N2  - In Brassicaceae werden bei einer Gewebszerstörung unreaktive Glukosinolate durch das Enzym Myrosinase hydrolysiert. Es entstehen reaktive Substanzen wie Isothiocyanate (ITCs). Da diese Reaktion sehr schnell erfolgt wird sie auch als Senföl-Glukosid-Bombe bezeichnet. In Arabidopsis thaliana erfolgt nach Verwundung und Pathogeninfektion eine massive Akkumulation des ITCs Sulforaphan (SF), welches eine reaktive elektophile Spezies (RES) darstellt. Zu der Gruppe der RES zählen auch einige Oxylipine mit einer α,β-ungesättigten Carbonylgruppen wie 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) oder Phytoprostan A1 (PPA1). Die Fähigkeit der kovalenten Modifikation von Peptiden und Proteinen gilt als essentiell sowohl für die toxischen als auch die Gen-induzierenden Eigenschaften der RES. Neben ihrer Reaktivität spielt auch die Lipophilie eine Rolle für die Fähigkeit über Membranen zu diffundieren und unspezifisch an Proteine zu binden. 
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptomanalysen an Arabidopsis-Keimlingen mit sub-toxischen Konzentrationen von SF, Benzylisothiocyanat (BITC) und dem Oxylipin Prostaglandin A1 (PGA1) zeigten, dass strukturell sehr verschiedene RES einen gemeinsamen Satz von 55 Genen induzieren. Unter diesen befanden sich verschiedene Hitzeschock-, Stressassoziierte- und Detoxifizierungsgene. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung über eine Muster-spezifische Erkennung der RES erfolgt. Als einen möglichen Mechanismus der RES-vermittelten Geninduktion wird die Regulation durch die Veränderung des zellulären Redox-Potentials als Folge kovalenter Modifikation von GSH durch RES diskutiert. Die Untersuchung der GSH-Gehalte sowie des Redox-Potential nach Behandlung mit sub-toxischen RES-Konzentrationen in Arabidopsis-Keimlingen zeigte jedoch unter den getesteten Bedingungen keine Veränderung. 
Neben dem Erkennungs- und Signaltransduktionsmechanismus ist auch die biologische Bedeutung von RES für die Vermittlung einer Stresstoleranz noch weitgehend unklar. Durch die Untersuchung der Genexpression in Arabidopsis-Pflanzen nach Verwundung konnte gezeigt werden, dass eine wundinduzierte Akkumulation von SF zur Induktion einiger Gene der Hitzeschockreaktion (HSR) im Wildtyp, jedoch nicht in der myrosinase-defiziten tgg1tgg2-Mutante führte. Auch in der Transkriptomanalyse war nach RES-Gabe ebenfalls eine starke Induktion hitze-responsiver Gene, deren Regulation über den Masterregulator dem Hitzeschock-TF A1 vermittelt wird, zu beobachten. Besonders die Induktion der HSPs, welche als Chaperone fungieren und damit Thiolgruppen von Proteinen vor Modifikation schützen können, haben vermutlich bei chemischer Intoxikation protektive Eigenschaften für die Zellen. Tatsächlich zeigte sich unter den gewählten Bedingungen die hsfa1a,b,d,e-Mutante empfindlicher gegenüber ITCs als der Wildtyp. Die Fähigkeit, eine HSR ausbilden zu können, scheint in Arabidopsis bei chemischer Intoxikation eine bedeutende Rolle zu spielen. Eine Vorbehandlung mit RES wie SF, BITC oder dem HSP90-Inhibitor Radicicol in Arabidopsis-Keimlingen konnte eine Schutzwirkung vor chemischer Intoxikation vermitteln. Dies erfolgte jedoch nicht nach Behandlung mit moderater Hitze (zwei Stunden, 37 °C). Somit scheint die HSR alleine nicht ausreichend für den Aufbau eines effektiven Schutzes vor BITC-Intoxikation zu sein.
Als metabolische Antwort von Arabidopsis-Keimlingen auf Intoxikation mit RES konnte eine konzentrationsabhängige Senkung der maximalen Quantenausbeute am Photosystem II (PSII), sowie gleichzeitig eine Akkumulation an TAG-Spezies beobachtet werden. Diese metabolische Reaktion ist in der Literatur bereits als Schutz gegen Hitzestress beschrieben. Die Bedeutung der TAG-Akkumulation nach chemischem ITC-Stress ist noch unklar.
N2  - In Brassicaceae, unreactive glucosinolates are hydrolyzed by the enzyme myrosinase during tissue destruction. Reactive substances such as isothiocyanates (ITCs) are formed. Since this reaction takes place very quickly, it is also called mustard oil bomb. In Arabidopsis thaliana, after wounding and pathogen infection, a massive accumulation of the ITC Sulforaphan (SF) occurs, which is a reactive electophilic species (RES). The group of RES also includes some oxylipins with a α,β-unsaturated carbonyl group such as 12-oxo-phytodienoic acid (OPDA) or phytoprotane A1 (PPA1). The ability to covalently modify peptides and proteins is considered essential for the toxic and gene inducing properties of RES. In addition to their reactivity, lipophilia also plays a role in the ability to diffuse across membranes and bind unspecifically to proteins. 
The transcriptome analyses performed on Arabidopsis-seedlings with sub-toxic concentrations of SF, benzylisothiocyanate (BITC) and oxylipin prostaglandin A1 (PGA1) showed that structurally very different RES induce a common set of 55 genes. Among the induced genes were several heat shock, stress associated and detoxification genes. These observations suggest that activation is via pattern-specific recognition of RES. As a possible mechanism of RES-mediated gene induction, regulation by alteration of the cellular redox potential as result of covalent modification of GSH by RES is discussed. However, the study of GSH levels and redox potential after treatment with sub-toxic RES concentrations in Arabidopsis-seedlings showed no change under the tested conditions. 
In addition to the recognition and signal transduction mechanism for RES, the biological significance of RES for the mediation of stress tolerance is still largely unclear. By studying the gene expression of Arabidopsis-plants after wounding, it was shown that wound induced accumulation of SF led to the induction of some genes of heat shock response (HSR) in the wild type, but not in the myrosinase-deficient tgg1tgg2-mutant. Also in transcriptome analysis a strong induction of heat-responsive genes could be observed after RES administration, whose regulation is mediated by the master regulator of the heatshock-TF A1 (HSFA1). In particular, the induction of HSPs, which act as chaperones and can thus protect thiol groups of proteins from modification, presumably have protective properties for the cells during chemical intoxication. In fact, under the conditions tested, the hsfa1a,b,d,e-mutants were more sensitive to ITCs than the wild type. The ability to form HSR seems to play an important role in chemical intoxication in Arabidopsis. Pretreatment with RES such as SF, BITC or the HSP90 inhibitor radicicol in Arabidopsis-seedlings could mediate a protective effect against chemical intoxication. However, this was not done after treatment with moderate heat (two hours, 37 °C). Thus, HSR alone does not seem to be sufficient to provide effective protection against BITC intoxication.
As a metabolic response of Arabidopsis-seedlings to intoxication with RES, a concentration-dependent reduction of the maximum quantum yield at the photosystem II (PSII), as well as an accumulation of TAG species could be observed. This metabolic reaction is already described in the literature as protection against heat stress. The significance of TAG accumulation after chemical stress in the form of ITC intoxication is still unclear.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Glucosinolate
KW  - Isothiocyanate
KW  - reaktive elektrophile Spezies
KW  - Sulforaphan
KW  - Schmalwand <Arabidopsis>
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185116
ER  - 
TY  - THES
A1  - Krause, Diana
T1  - Transport der Hauptosmotika an der vakuolären Membran von Schließzellen
T1  - Transport of the main osmotic substances on the vacuolar membrane of guard cells
N2  - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden neue Einblicke bezüglich des Transport-prozesses vakuolärer Protonenpumpen, Zuckertransporter und des SV-Kanals von Arabidopsis thaliana gewonnen: 1. Mittels Patch-clamp-Technik wurden ATP- und Pyrophosphat-induzierte Pump-ströme an Mesophyllvakuolen des Wildtyps gemessen. Die durch ATP hervor-gerufenen Pumpströme konnten durch den spezifischen V-ATPase-Inhibitor Concanamycin A vollständig inhibiert werden. Messungen an der V-ATPase-Doppelmutante vha-a2-vha-a3 hingegen zeigten eine kaum vorhandene ATPase-Aktivität auf. Die vakuoläre Pyrophosphatase-Aktivität der vha-a2-vha-a3-Mutante war mit dem WT vergleichbar und konnte die verminderten Pumpströme der V-ATPase nicht kompensieren. Zudem wurde an A. thaliana WT-Pflanzen die Expressionsrate und Pumpstromdichte der V-ATPase von Schließzellen und Mesophyllzellen untersucht. Dabei konnte bei Schließzellen eine höhere Expressionsrate sowie Pumpleistung im Vergleich zu Mesophyllzellen detektiert werden, wodurch an der vakuolären Membran von Schließzellen eine starke protonenmotorische Kraft generiert werden kann. 2. Des Weiteren wurden die Transporteigenschaften des im Tonoplasten lokalisierten Transportproteins AtINT1 an Arabidopsis Mesophyllzellen des Wildtyps näher untersucht. Unter inversen pH-Wert-Bedingungen konnte AtINT1 als Symporter identifiziert werden, welcher myo-Inositol H+-gekoppelt aus der Vakuole in das Cytosol transportiert. 3. Überdies wurde eine elektrophysiologische Charakterisierung des AtSUC4-Transporters durchgeführt. Unter einem physiologischen Protonengradienten konnte bei WT- und Atsuc4.1-Vakuolen ausschließlich ein Saccharose/H+ ge-triebener Antiportmechanismus detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten 60 % der AtSUC4-ÜE unter inversen pH-Gradienten während Saccharose-Applikation Ströme, die auf einen Saccharose/H+-Symportmechanismus hinweisen. Bei der Atsuc4.1-Verlustmutante hingegen konnten unter gleichen Lösungsbedingungen ausschließlich Ströme detektiert werden, die mit einem Saccharose/H+-gekoppelten Antiportmechanismus in Einklang zu bringen sind. Durch die Erkenntnisse der Arbeitsgruppe unter Norbert Sauer, Universität Erlangen, wird die Vermutung untermauert, dass AtSUC4 Saccharose im Symport mit H+ aus der Vakuole in das Cytosol transportiert und somit eine Rolle bei der Remobilisierung der in der Vakuole gespeicherten Saccharose übernimmt. 4. Darüber hinaus konnten Studien am nichtselektiven spannungsabhängigen „slow-vacuolar-channel“ (SV-Kanal) von Arabidopsis Mesophyllvakuolen durchgeführt werden. Dabei wurde das 14-3-3-Protein GRF6 als regulatorisches Protein identifiziert, welches die SV-Kanalaktivität stark verringert. Die gain-of-function Mutante fou2 mit der Punktmutation D454N im TPC1-Kanalprotein zeigt abweichende Kanaleigenschaften zum WT auf. Das Aktivie-rungspotential des fou2-SV-Kanals liegt bei 30 mV negativeren Membranspan-nungen, was die Offenwahrscheinlichkeit des SV-Kanals unter physiologischen Membranspannungen erhöht. Die fou2-Mutation beeinflusst außerdem die luminale Ca2+-Bindestelle des SV-Kanals, wodurch die Affinität bzgl. luminalem Ca2+ geringer ist und die fou2-SV-Kanalaktivität bei hohen luminalen Ca2+-Konzentrationen bestehen bleibt. Die absolute Offenwahrscheinlichkeit des WT-SV-Kanals nimmt mit Ansäuern des vakuolären Lumens im Gegensatz zum fou2-SV-Kanal stark ab, die Einzelkanalleitfähigkeit des WT- als auch des fou2-SV-Kanals dagegen zu. Anhand der durchgeführten Messungen konnte eine regulatorische, vakuolär gelegene Ca2+-Bindestelle des TPC1-kodierten Kanals lokalisiert und charakterisiert werden, welche sich vermutlich nahe am Spannungssensor befindet und unter physiologischen Membranspannungen einen einwärtsgerichteten Kationenstrom ermöglicht. 5. Ferner wurden SV-Kanäle von Schließzellen untersucht und deren spezifische Eigenschaften mit Mesophyll-SV-Kanälen verglichen. In Schließzellen liegt neben einer erhöhten Transkriptmenge des single-copy Gens TPC1 eine höhere Stromdichte des SV-Kanals vor. Unter einwärtsgerichtetem K+-Gradienten liegt das Aktivierungspotential von Schließzell-SV-Kanäle um 30 mV negativer als bei Mesophyllvakuolen, was unter physiologischen Membranspannungen zu einem ausgeprägtem K+-Einstrom führt. Darüber hinaus zeigte der Schließzell-SV-Kanal eine höhere Permeabilität von Na+- gegenüber K+-Ionen (1,3:1) auf. Während Schließzell- und Mesophyll-SV-Kanäle eine vergleichbare luminale Ca2+-Sensitivität aufweisen, zeigen Schließzell-SV-Kanäle eine höhere cytosoli-sche Ca2+- und vakuoläre pH-Sensitivität auf. Sequenzanalysen der TPC1-cDNA zeigten, dass die Zelltypspezifischen Unterschiede des SV-Kanals nicht durch posttranskriptionale Modifikation hervorgerufen werden.
N2  - As an output of this dissertation, the following new insights into vacuolar transport pro-cesses of proton pumps, sugar transporters and slow vacuolar channels (SV-channels) via the patch clamp technique were gained: 1. The vacuolar V-ATPase of A. thaliana mesophyll cells of the WT as well as of the double mutant vha-a2-vha-a3 were analyzed. The specific V-ATPase-inhibitor concanamycin A inhibits the WT V-ATPase activity completely. In vha-a2-vha-a3 mutant the V-ATPase activity was completely absent and shows no ATP induced H+ currents. However, the vacuolar vha-a2-vha-a3 pyrophosphatase current density was indistinguishable from the WT and could not compensate the missing V-ATPase pump currents. Additionally, the V-ATPase expression rate and H+ currents of A. thaliana guard cells and mesophyll cells were examined. In guard cells the expression rate as well as the pump currents were higher compared to mesophyll cells which resulted in a stronger proton motive force. 2. Furthermore, the transport mechanism of the vacuolar membrane protein AtINT1 was studied on Arabidopsis WT mesophyll cells. At high vacuolar and low cytoplasmic pH values AtINT1 could be identified as an H+/inositol symporter. These data was confirmed by further measurements of the mutant lines Atint1.1 and Atint1.2. After application of myo-inositol the currents were completely absent in Atint1.1 and strongly reduced in the Atint1.2 mutant. 3. Besides transport characteristics of the tonoplast localized AtSUC4 protein was analyzed. After application of cytosolic sucrose, WT as well as Atsuc4.1 vacuoles showed an H+/sucrose driven Antiport mechanism in presence of physiological H+-gradient. However, in the presence of an inverse pH gradient, 60 % of the AtSUC4-overexpressing mutant showed sucrose induced currents indicating an H+/sucrose Symport mechanism of the AtSUC4 transport protein. Corresponding currents could not be detected in AtSUC4 less vacuoles (Atsuc4.1). In the inverse system sucrose induced currents of the Atsuc4.1 mutant were in accordance with an H+/sucrose coupled antiport mechanism. These patch clamp measurements confirm the findings of the working group of Norbert Sauer, University of Erlangen. AtSUC4 acts as a symporter by transporting sucrose coupled with H+ out of the vacuole into the cytosol and therefore plays a role in the remobilization of stored vacuolar sucrose. 4. Additionally the non-selective voltage dependent slow vacuolar channel (SV channel) of Arabidopsis mesophyll vacuoles was electrophysiologically characterized. Thereby the 14-3-3 protein GRF6 could be identified as a regulatory protein of the SV channel, which down-regulates the SV channel activity. The gain-of-function mutant fou2 containing the point mutation D454N on the vacuolar lumen side of the SV channel protein, shows different channel proper-ties compared to WT. The fou2 channel activation was shifted to 30 mV more negative membrane potentials which resulted in higher open probability than WT SV channels. The fou2 mutation also affected the luminal Ca2+ binding site of the SV channel and lowered the affinity to vacuolar Ca2+. fou2 channel activity remained high even at inhibitory vacuolar Ca2+ concentrations. The WT SV channel open probability decreased strongly with luminal acidification in contrast to fou2. However, the single channel conductance of WT and fou2 SV channels increased. The regulatory vacuolar Ca2+ binding site of the TPC1 channel seems to be located nearby the voltage sensor and enables a pronounced fou2 inward current under physiological membrane voltages. 5. The A. thaliana guard cell SV channel features were compared with mesophyll cells. In guard cells the transcript number of the single copy gene TPC1 was elevated which resulted in a higher SV current density than in mesophyll cells. When the K+ gradient was directed out of the vacuolar lumen the guard cell SV channel activated at about 30 mV less negative voltages compared to mesophyll cells and mediated distinct inward currents. The guard cell SV channel showed permeability for Na+ over K+ (1,3:1). SV channels from guard cells and mesophyll cells exhibited comparable luminal Ca2+ sensitivities. However, the guard cell SV channel is more sensitive to cytosolic Ca2+ and vacuolar pH. Sequence analyses of the TPC1 cDNA showed that the varying features of the guard cell and mesophyll cell SV channels are not related to posttranscriptional modifications.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Schließzelle
KW  - Vakuole
KW  - Saccharose
KW  - Inosite
KW  - Spannungskontrollierter Ionenkanal
KW  - Protonenpumpe
KW  - AtTPC1
KW  - AtSUC4
KW  - Protonenpumpe
KW  - Vakuole
KW  - Schließzelle
KW  - AtTPC1
KW  - AtSUC4
KW  - proton pump
KW  - vacuole
KW  - guard cell
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75043
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fiebig, Juliane
T1  - Twisted gastrulation - ein BMP-Modulatorprotein mit dualer Funktionalität
T1  - Twisted gastrulation - a BMP-specific modulator with dual functionality
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind extrazellulär vorkommende Wachstumsfaktoren und werden der Superfamilie der Transforming Growth Factors β (TGF-β) zugeordnet. Entgegen ihrem Namen spielen sie nicht nur eine Rolle bei der Ausbildung und Regeneration der Knochenmatrix, sondern regulieren bereits während der Embryonalentwicklung zahlreiche Abläufe. Unter anderem sind sie an der Festlegung der Körperachsen und Entwicklung der Organanlagen beteiligt. Später steuern sie das Wachstum von Organen und Geweben und sind schließlich im adulten Organismus für deren Homöostase und Regeneration verantwortlich. Bei fast allen Mitgliedern der TGF-β Superfamilie erfolgt die Signalbildung nach derzeitigem Kenntnisstand durch die Bindung an transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, die in zwei Untergruppen unterteilt werden können. Dabei werden von einem Liganden jeweils zwei Typ I- und zwei Typ II-Rezeptoren gebunden, wodurch ein aktiver Komplex entsteht, der im Inneren der Zelle eine Signalkaskade auslöst.
Um die vielseitigen Aufgaben der BMPs spezifisch vermitteln zu können, gibt es zahlreiche Mechanismen, die Signalbildung stringent neben der Ligand-Rezeptor-Interaktion zu regulieren. Die Small Mothers Against Decapentaplegic (Smad)-Signalkaskade im Zellinneren wird beispielsweise durch die Interaktion der inhibitorischen Smads mit rezeptor-regulierten Smads oder durch den proteasomalen Abbau der rezeptor-regulierten Smads durch die Bindung von Ubiquitin-Ligasen der Smurf-Familie beeinflusst. Auch auf Membranebene besteht die Möglichkeit der negativen Signalmodulation durch Pseudorezeptoren oder der Verstärkung der Signalbildung durch positive Effektoren wie beispielsweise aktivitätssteigernde Co-Rezeptoren. 
Ein Charakteristikum der TGF-β Superfamilie stellt jedoch die Vielzahl an sekretierten, löslichen Modulatorproteinen dar. Die meist glykosylierten Proteine üben, bis auf wenige Ausnahmen, einen antagonistischen Effekt auf die BMPs aus. Bei dem BMP-spezifischen Modulatorprotein Twisted gastrulation handelt es sich um ein extrazelluläres Glykoprotein, das im Gegensatz zu den meisten anderen BMP-Modulatoren jedoch eine duale Funktion als Besonderheit aufweist. Es zeigt zum einen eine anti-BMP-Wirkung, indem es den BMP-inhibierenden Einfluss von Chordin durch Bildung eines stabilen ternären Komplexes verstärkt; andererseits kann Twisted gastrulation in Gegenwart spezifischer Metalloproteasen eine proteolytische Spaltung von Chordin und die anschließende Freisetzung von aktivem BMP fördern und so eine BMP-Aktivität vermittelnde Wirkung aufweisen. Twisted gastrulation hat keine beziehungsweise nur eine äußerst geringe Homologie zu anderen (Modulator)Proteinen. Um daher den komplexen Wirkmechanismus detailliert molekular beschreiben zu können, ist die Aufklärung der Struktur /Funktions-beziehungen essentiell. 
Im Rahmen dieser Arbeit konnten unterschiedliche Expressionsstrategien für die rekombinante Herstellung von Twisted gastrulation etabliert werden, welche eine umfassende Charakterisierung des Proteins in vitro ermöglichen. Erste Kristallisationsversuche von isoliertem Twisted gastrulation für die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur mittels Röntgenbeugung verliefen ohne Erfolg, allerdings gelang die Präparation stabiler ternärer Proteinkomplexe für weiterführende Kristallisationsansätze. Hochdurchsatzverfahren für die Expression und Interaktionsanalyse erlauben zudem die Untersuchung einer Vielzahl von Twisted gastrulation-Proteinvarianten. Auf diese Weise konnten Aminosäuren identifiziert werden, die an der Wechselwirkung von Twisted gastrulation mit seinem Interaktionspartner BMP 2 beteiligt sind. Dies ermöglichte eine detaillierte Lokalisation des Bindeepitops im N-terminalen Bereich von Twisted gastrulation. Dabei konnte auch gezeigt werden, dass die Glykosylierung von Twisted gastrulation für die Wechselwirkung mit BMP-2 von Bedeutung ist. 
Eine experimentelle Strukturanalyse von Twisted gastrulation für die detaillierte Aufklärung des Mechanismus der Interaktion mit BMP-2 und anderen Modulatorproteinen bleibt allerdings weiterhin aufgrund der Einzigartigkeit dieses Modulatorproteins zwingend erforderlich. Für eine Fortsetzung der Untersuchungen bietet der stabile ternäre Komplex eine gute Voraussetzung in Hinblick auf weitere Kristallisationsansätze.
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are secreted growth factors belonging to the superfamily of Transforming Growth Factors β (TGF-β). In contrast to their name they are not only involved in bone morphogenesis and regeneration, but also regulate numerous events during embryonic development. Furthermore, they play a key role in body axis determination, embryonic patterning as well as organogenesis,  later in the adult organism these factors control organ and tissue homeostasis and regeneration. At the current state of research all classical members of the TGF-β family signal through transmembrane serine/threonine kinase receptors, which can be subdivided into type I- and type II-receptors. For receptor activation the ligand induces receptor heteromerisation forming an active complex containing type I- and type II-receptors which subsequently triggers intracellular signaling cascades.
To ensure highly specific signaling a complex network of regulatory mechanisms has evolved. The Small Mothers Against Decapentaplegic (Smad) signaling cascade for example is modulated by inhibitory Smads interacting with the receptor-regulated Smads or through proteasomal degradation of the receptor-regulated Smads by binding to ubiquitin-ligases of the Smurf-family. In the membrane, pseudoreceptors such as BAMBI lacking a kinase domain or GPI-anchored co-receptors such as the RGM-receptor family or Cripto can positively or negatively regulate BMP/TGF-β signaling.
A highlight of the TGF-β superfamily is the multitude of different secreted soluble modulator proteins. Most present glycoproteins, which act as BMP-antagonists by interfering with BMP-signaling. The BMP-specific modulator Twisted gastrulation is such an extracellular glycoprotein, which however features an unique dual function. On the one hand, by forming a stable ternary complex it strongly enhances the BMP-antagonizing (anti-BMP) activity of another BMP-modulator Chordin. On the other hand, upon proteolytic processing of Chordin in this ternary complex in the presence of specific metalloproteases such as Tolloid, Twisted gastrulation facilitates the dissociation of the ternary complex releasing active BMP an thereby exerts a pro (moting) BMP-activity. 
Twisted gastrulation exhibits very low if at all any homology to other proteins and seems also unique among the large variety of BMP-modulator proteins. To understand its dual mode of action on a molecular level analysis of the structure/function-relationship is a pre-requisite.
In this project we have established different strategies for recombinant production of Twisted gastrulation for a comprehensive in vitro characterization. Although crystallization of Twisted gastrulation for X-ray diffraction analysis failed, we could successfully prepare stable ternary complexes consisting BMP-2, a type II-receptor and Twisted gastrulation which are ideally suited for protein crystallization. High-throughput expression and interaction-analysis schemes allowed us to study a multitude of single amino acid variants of Twisted gastrulation. This resulted in the identification of several amino acid residues in Twisted gastrulation, which form the binding epitope for BMP-2 confirming its supposed location in the N-terminal half of Twisted gastrulation. We could also show that the N-glycosylation of Twisted gastrulation is involved in high-affinity BMP binding and required for its BMP-modulatory activity in vivo. 
For a full analysis of its molecular mechanism of BMP-2 interaction and its interplay with other modulator proteins, a structure analysis of Twisted gastrulation is required in the near future. Providing efficient recombinant sources and the preparation of stable ternary complexes will likely facilitate this.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Twisted gastrulation
KW  - Bone Morphogenetic Proteins
KW  - Transforming Growth Factor
KW  - Gastrulation
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107270
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Cicova, Zdenka
A1  - Dejung, Mario
A1  - Skalicky, Tomas
A1  - Eisenhuth, Nicole
A1  - Hanselmann, Steffen
A1  - Morriswood, Brooke
A1  - Figueiredo, Luisa M.
A1  - Butter, Falk
A1  - Janzen, Christian J.
T1  - Two flagellar BAR domain proteins in Trypanosoma brucei with stage-specific regulation
JF  - Scientific Reports
N2  - Trypanosomes are masters of adaptation to different host environments during their complex life cycle. Large-scale proteomic approaches provide information on changes at the cellular level, and in a systematic way. However, detailed work on single components is necessary to understand the adaptation mechanisms on a molecular level. Here, we have performed a detailed characterization of a bloodstream form (BSF) stage-specific putative flagellar host adaptation factor Tb927.11.2400, identified previously in a SILAC-based comparative proteome study. Tb927.11.2400 shares 38% amino acid identity with TbFlabarin (Tb927.11.2410), a procyclic form (PCF) stage-specific flagellar BAR domain protein. We named Tb927.11.2400 TbFlabarin-like (TbFlabarinL), and demonstrate that it originates from a gene duplication event, which occurred in the African trypanosomes. TbFlabarinL is not essential for the growth of the parasites under cell culture conditions and it is dispensable for developmental differentiation from BSF to the PCF in vitro. We generated TbFlabarinL-specific antibodies, and showed that it localizes in the flagellum. Co-immunoprecipitation experiments together with a biochemical cell fractionation suggest a dual association of TbFlabarinL with the flagellar membrane and the components of the paraflagellar rod.
KW  - parasite biology
KW  - protein translocation
KW  - Trypanosoma brucei
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-181021
VL  - 6
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Tian, Yuehui
A1  - Gao, Shiqiang
A1  - von der Heyde, Eva Laura
A1  - Hallmann, Armin
A1  - Nagel, Georg
T1  - Two-component cyclase opsins of green algae are ATP-dependent and light-inhibited guanylyl cyclases
JF  - BMC Biology
N2  - Background:
The green algae Chlamydomonas reinhardtii and Volvox carteri are important models for studying light perception and response, expressing many different photoreceptors. More than 10 opsins were reported in C. reinhardtii, yet only two—the channelrhodopsins—were functionally characterized. Characterization of new opsins would help to understand the green algae photobiology and to develop new tools for optogenetics.

Results:
Here we report the characterization of a novel opsin family from these green algae: light-inhibited guanylyl cyclases regulated through a two-component-like phosphoryl transfer, called “two-component cyclase opsins” (2c-Cyclops). We prove the existence of such opsins in C. reinhardtii and V. carteri and show that they have cytosolic N- and C-termini, implying an eight-transmembrane helix structure. We also demonstrate that cGMP production is both light-inhibited and ATP-dependent. The cyclase activity of Cr2c-Cyclop1 is kept functional by the ongoing phosphorylation and phosphoryl transfer from the histidine kinase to the response regulator in the dark, proven by mutagenesis. Absorption of a photon inhibits the cyclase activity, most likely by inhibiting the phosphoryl transfer. Overexpression of Vc2c-Cyclop1 protein in V. carteri leads to significantly increased cGMP levels, demonstrating guanylyl cyclase activity of Vc2c-Cyclop1 in vivo. Live cell imaging of YFP-tagged Vc2c-Cyclop1 in V. carteri revealed a development-dependent, layer-like structure at the immediate periphery of the nucleus and intense spots in the cell periphery.

Conclusions:
Cr2c-Cyclop1 and Vc2c-Cyclop1 are light-inhibited and ATP-dependent guanylyl cyclases with an unusual eight-transmembrane helix structure of the type I opsin domain which we propose to classify as type Ib, in contrast to the 7 TM type Ia opsins. Overexpression of Vc2c-Cyclop1 protein in V. carteri led to a significant increase of cGMP, demonstrating enzyme functionality in the organism of origin. Fluorescent live cell imaging revealed that Vc2c-Cyclop1 is located in the periphery of the nucleus and in confined areas at the cell periphery.
KW  - chlamydomonas reinhardtii
KW  - volvox carteri
KW  - two-component system
KW  - chlamyopsin
KW  - optogenetics
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-177516
VL  - 16
IS  - 144
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Karimi, Sohail M.
A1  - Freund, Matthias
A1  - Wager, Brittney M.
A1  - Knoblauch, Michael
A1  - Fromm, Jörg
A1  - M. Mueller, Heike
A1  - Ache, Peter
A1  - Krischke, Markus
A1  - Mueller, Martin J.
A1  - Müller, Tobias
A1  - Dittrich, Marcus
A1  - Geilfus, Christoph-Martin
A1  - Alfaran, Ahmed H.
A1  - Hedrich, Rainer
A1  - Deeken, Rosalia
T1  - Under salt stress guard cells rewire ion transport and abscisic acid signaling
JF  - New Phytologist
N2  - Soil salinity is an increasingly global problem which hampers plant growth and crop yield. Plant productivity depends on optimal water-use efficiency and photosynthetic capacity balanced by stomatal conductance. Whether and how stomatal behavior contributes to salt sensitivity or tolerance is currently unknown. This work identifies guard cell-specific signaling networks exerted by a salt-sensitive and salt-tolerant plant under ionic and osmotic stress conditions accompanied by increasing NaCl loads.
We challenged soil-grown Arabidopsis thaliana and Thellungiella salsuginea plants with short- and long-term salinity stress and monitored genome-wide gene expression and signals of guard cells that determine their function.
Arabidopsis plants suffered from both salt regimes and showed reduced stomatal conductance while Thellungiella displayed no obvious stress symptoms. The salt-dependent gene expression changes of guard cells supported the ability of the halophyte to maintain high potassium to sodium ratios and to attenuate the abscisic acid (ABA) signaling pathway which the glycophyte kept activated despite fading ABA concentrations.
Our study shows that salinity stress and even the different tolerances are manifested on a single cell level. Halophytic guard cells are less sensitive than glycophytic guard cells, providing opportunities to manipulate stomatal behavior and improve plant productivity.
KW  - soil
KW  - stomata
KW  - abscisic acid (ABA)
KW  - glycophyte Arabidopsis
KW  - guard cell
KW  - halophyte Thellungiella/Eutrema
KW  - ion transport
KW  - salt stress
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259635
VL  - 231
IS  - 3
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kasang, Christa
T1  - Untersuchung der Effekte von Prednisolon auf die HIV-Progression und Ermittlung der Medikamentenresistenz in antiretroviral-unbehandelten HIV-Patienten in Tansania
T1  - Progression of HIV disease under corticosteroid treatment and occurrence of antiretroviral drug resistances in therapy naive HIV infected patients in Tanzania
N2  - Die Progression der HIV Infektion ist vermutlich bedingt von einer unspezifischen generalisierten Immunaktivierung des Patienten (Sousa, Carneiro et al. 2002; Hazenberg, Otto et al. 2003). Somit könnte ein immunsuppressives Medikament wie das Kortisonpräparat Prednisolon die Progression der Erkrankung verlangsamen. Im Rahmen nicht-kontrollierter Studien konnte die Stabilisierung der CD4+ T-Lymphozyten in HIV-Patienten durch den Einsatz von Kortison beobachtet werden (Andrieu, Lu et al. 1995; Lu, Salerno-Goncalves et al. 1995). Dieser Effekt konnte auch mit niedrig dosiertem Prednisolon (5 mg/Tag) nachgewiesen werden (Ulmer, Muller et al. 2005). Jedoch zeigen neuere Ergebnisse, dass der CD4+ T-Lymphozytenwert bei Studien zu Immunmodulatoren kein verlässlicher Surrogatmarker für die Progression ist (Abrams, Levy et al. 2009). In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob sich zum Einen der stabilisierende Effekt von niedrig dosiertem Prednisolon (5 mg pro Tag) auf CD4+ T-Lymphozyten in einer kontrollierten Studie bestätigt, ob zum Zweiten die CD4+ T-Lymphozytenstabilisierung auf eine Senkung der Immunaktivierung zurückgeführt werden kann und ob zum Dritten die CD4+ TLymphozytenstabilisierung die klinische Krankheitsprogression verlangsamt. Im Rahmen der ProCort-Studie sollte außerdem eine Bestimmung der Prävalenz medikamentenresistenter HIV-Infektionen bei ART unbehandelten Patienten erfolgen. Hierbei wurden die WHO Kriterien überprüft, die als Einschlusskriterien für Patienten in Resistenz-Überwachungsstudien ein Höchstalter von 25 Jahren festgelegt hat. In unserer Untersuchung wurden demgegenüber Proben von Patienten mit höherem Alter und bereits therapierten Partnern analysiert.Methoden: Im Rahmen einer doppelblinden randomisierten klinischen Studie (ProCort1) im Bugando Medical Center (BMC) in Mwanza, Tansania, wurden 326 HIV-Patienten eingeschlossen, die zuvor noch nie mit ART behandelt wurden und einen CD4+ TLymphozytenwert von mindestens 300/μl aufwiesen. In 14 Visiten wurden, während einer zweijährigen Behandlungsdauer entweder mit 5mg Prednisolon täglich oder mit Placebo, die CD4+ T-Lymphozytenwerte und das Auftreten von Progression der HIV-Infektion bestimmt. Primärer Studienendpunkt war die Krankheitsprogression, definiert als ein Unterschreiten von 200 CD4-Zellen/μl oder dem Auftreten AIDS-definierender Erkrankungen. Um die immunologische Wirkungsweise von Prednisolon in HIV-infizierten Patienten zu untersuchen wurden sowohl in den tansanischen Studienpatienten als auch in einer mit 5 mg Prednisolon behandelten deutschen Kohorte die Lymphozytenaktivierungsmarker CD38/HLADR auf CD3/CD8-Zellen, der Monozytenaktivierungsmarker sCD14 und der Entzündungsmarker suPAR bestimmt. Um die Prävalenz der HIV Medikamentenresistenz (HIVDR) in der ProCort Studienpopulation zu ermitteln wurden 88 Proben der ART unbehandelten Patienten sequenziert. Ergebnisse: Die Ergebnisse der ProCort Studie zeigten eine statistisch signifikante Stabilisierung der CD4+ T-Lymphozytenwerte im Vergleich zum Ausgangswert durch Einsatz einer niedrig dosierten Prednisolonbehandlung (5 mg täglich). In der Intent to treat Analyse wurde ein Zugewinn von +20,1 Zellen/μl pro Jahr für den Prednisolonarm (p < 0.0001) im Vergleich zu -54,2 Zellen/μl pro Jahr für den Placeboarm (p < 0.0001) bestimmt. Die CD4+ T-Lymphozytenwerte zum Zeitpunkt der Startvisite waren im Prednisolonarm statistisch signifikant niedriger (Mean 512.14 Zellen/μl ± S.E.M. 13.39) als im Placeboarm (Mean 554.40 ± S.E.M 15.75; p = 0.042). Dies bedeutet eine schlechtere Ausgangslage für die mit Prednisolon behandelten Patienten. Trotzdem entwickelten nur vier Patienten mit Prednisolonbehandlung im Vergleich zu 11 Patienten mit Placebobehandlung AIDS, was eine statistisch signifikante Verringerung der Progressionsrate bedeutet (p=0.0196). In 16 Patienten versus 18 Patienten fielen die CD4+ T-Lymphozytenwerte unter die Werte von 200 Zellen/μl. Die Behandlung mit Prednisolon war nicht mit einer höheren Rate von unerwünschten Ereignissen oder höherer Viruslast assoziiert.
N2  - Background: A combination-therapy approach with antiretroviral substances (ARVs), also called antiretroviral therapy (ART) is at present, the best and almost the only treatment option for HIV infected individuals. While combination ART is the best treatment to prevent the onset of AIDS in HIV infection, it is still not available for millions of patients in resourcelimited areas, despite the substantial improvements achieved in the past 10 years. There is a justified concern of the acceleration of HIV-drug-resistance (HIVDR) development caused by first-line ART medication available in countries with restricted resources, as the ART available often has low genetic barriers causing resistance mutations (Barth, Wensing et al. 2008). There is a strong need for treatment that is inexpensive and effective of delaying the progress of the illness in the asymptomatic phase. HIV-associated general immune activation is a strong predictor for HIV disease progression, suggesting that chronic immune activation may drive HIV pathogenesis (Sousa, Carneiro et al. 2002; Hazenberg, Otto et al. 2003). Therefore immunomodulating agents like the corticosteroid prednisolone may decelerate HIV disease progression. This is the rationale for the use of prednisolone in HIV therapy. In nonrandomised monocentric observational studies it was shown that certain corticosteroids has a stabilizing effect on the CD4+T-lymphocytes in HIV-infected patients (Andrieu, Lu et al. 1995; Lu, Salerno-Goncalves et al. 1995). This effect could also be proven with low dose prednisolone (5 mg daily) (Ulmer, Muller et al. 2005). However, recent studies demonstrate that the CD4+T-lymphocytes are not stable predicting markers for HIV progression (Abrams, Levy et al. 2009). This thesis examines, first if the CD4+T-lymphocytes stabilizing effect of 5 mg prednisolone can be proven in a double-blind controlled randomized clinical trial, second if this effect is dependent of the reducing generalized immune activation and third if the CD4+T-lymphocytes stabilizing effect reduces the clinical progression of HIV infection. A study to identify the prevalence of HIVDR was also conducted within the ProCort study. To validate the current WHO tHIVDR survey criteria, focused on patients age below 25 years, our study included also patients over 25 years with partners already on treatment as well. Methods:The ProCort Study (Progression of HIV-Disease under Low Dose Corticosteroids) was designed as a double blinded randomized clinical trial including 326 ART-naïve patients in Bugando Medical Centre in Mwanza, Tansania, with a minimum cell count of 300 CD4+Tlymphocytes per μl. Patients were treated with either 5mg prednisolone daily or with placebo for two years. The CD4+T-lymphocytes were measured in 14 visits and progression factors were evaluated. Progression was defined as qualifying for start of ART either due to CD4 Cell 11 count below 200 cells per μl or due to developing AIDS defining symptoms. Immune activation markers were determined both for the ProCort patients and for a German cohortstudy group receiving 5 mg Prednisolon. The lymphocyte activation marker CD3/CD8/CD38/HLADR, monocyte activation marker sCD14 and markers for inflammation suPAR was targeted during the study. To identify the HIVDR in the ProCort study population sequencing was conducted in 88 sequentially enrolled ART-naïve patients. Results:The results of the ProCort study showed a statistical significant stabilizing effect of CD4+T-lymphocyte count compared to baseline counts in 5 mg prednisolone treated patients. In an intent-to-treat analysis, average changes in CD4+T-lymphocyte counts versus baseline were +20,1 cells/μl per year for prednisolone (P = 0.0002) and -54,2 cells/μl per year for placebo (P = 0.0027). The Baseline CD4+T-lymphocyte count recovery were significantly lower in the prednisolone arm (mean 512.14 cells/μl ± S.E.M. 13.39) than in the placebo arm (554.40 ± 15.75 P = 0.042) which implies a disadvantage for this group. However, only four patients treated with prednisolone and 11 patients treated with placebo developed stage C opportunistic diseases (Kaplan Meyer analysis, p = 0.0196 Gehan-Breslow-Wilcoxon test). For the CD4+T-lymphocyte counts 16 patients, compared to 18 patients in the placebo group? fall under 200 cell/μl. Prednisolone treatment was not associated with an increase in adverse events or HIV viral load. A statistically significant reduction in immune activation markers were obtained by 5 mg prednisolone therapy in both the German and the Tanzanian study group. In the Tanzanian study group the lymphocyte activation change to baseline, determined by CD38/HLADR-expression on CD8+ T lymphocytes, showed a significantly reduction of activation in prednisolone-treated patients compared to an increase in the untreated patients (-4.101% compared to 2.637%, p = 0.0018). The analysis of the immune system activation markers for inflammation (suPAR) showed a significant reduced difference to baseline in prednisolone-treated patients compared to untreated patients (-0.147 ng/ml, compared to 0,325 ng/ml, p<0.0001). In the results for monocytes activation markers for soluble CD14 just failed the significant difference between prednisolone and placebo treated patients (4.030 ng/ml, vs. 3.513 ng/ml, p=0.062). In the German Study cohort lymphocyte activation determined by CD38-expression on CD8+ T lymphocytes was significantly lower in prednisolone-treated patients compared to untreated patients (55.40% versus 73.34%, p = 0.0011). Similarly, we detected for monocyte activation markers lower levels of sCD14 (3.6 ng/ml vs. 6.11 ng/ml, p = 0.0048), and of LBP (2.18 ng/ml compared to 3.45 ng/ml; p = 0.0386) and for inflammation markers suPAR antigen (2.17 ng/ml vs. 2.56 ng/ml, p = towards lower levels of sCD40L (2.70 pg/ml vs. 3.60 pg/ml, p = 0.0782). 12 Viral load in both groups were similar (0.8 x 105 copies/ml compared to 1.1 x 105 copies/ml, p = 0.3806) (Kasang, Ulmer et al. 2012). By sequencing the HIV samples of ProCort patients we identified the HIV-1 subtype frequency A1: 34%, A1D: 7%, C: 26%, CRF10_CD: 4%, D: 28%, B: 1%. Twenty patients of the 88 were aged <25 years (meeting the WHO-initiated transmitted HIVDR surveillance criteria) and 68 patients were aged 25–63 years. The frequency of HIVDR in the study population was 14.8% (95%; CI 0.072–0.223) and independent of NVP-resistance induced by prevention of mother-to-child transmission programs. Patients >25 years had a significantly higher HIVDR frequency than younger patients (19.1%, versus 0%, P = 0.0344). ART-naïve patients aged over 25 years exhibited significantly higher HIVDR than younger patients. Detection of traces of ARVs in individuals with HIVDR suggests that besides transmission, undisclosed misuse of ARVs may constitute a significant factor in the generation of the observed high HIVDR rate. Discussion: The results in the context of the ProCort Study showed that treatment with 5 mg per day prednisolone for two years in ART-naive HIV patients is safe in an African setting and was associated with a significant increase of CD4+T-lymphocyte counts compared to the placebo group. In addition, prednis olone-treated patients developed significantly fewer AIDSdefining conditions, indicating that prednisolone slows HIV disease progression. This can be explained by the justified reduction of general immune activation in low-dose prednisolone treated patients. We suggest low-dose prednisolone as a treatment option for asymptomatic HIV infection in resource-limited settings. Additionally it should be clarified if low-dose prednisolone therapy is also an option for an ART combined treatment. So far, the reported prevalence of HIVDR in eligible patient populations is below 5% across Sub-Saharan Africa (WHO 2012). Our study identified that patients over 25 years of age showed a significant higher prevalence of HIVDR than younger patients (p=0.0344). By phylogenetic alignment for two samples of treated partners and untreated patients we demonstrate a transmission of HIVDR probably achieved by treatment to the therapy naïve patient. Detection of traces of ARVs in some other individuals with HIVDR suggests that besides transmission, undisclosed misuse of ARVs may constitute a significant factor in the generation of the observed high HIVDR rate. The current WHO HIVDR survey that is solely focused on the transmission of HIVDR and that excludes patients over 25 years of age may therefore result in substantial underestimation of the prevalence of HIVDR in the therapynaïve population. A modification of WHO HIVDR survey criteria is strongly recommended
KW  - Retroviren
KW  - HIV
KW  - Tansania
KW  - Immunsystem
KW  - Resistenz
KW  - AIDS
KW  - Prednisolon
KW  - Glucocorticosteroide
KW  - Immunaktivierung
KW  - HIVDR
KW  - klinische Studie
KW  - Tanzania
KW  - HIV
KW  - Immunactivation
KW  - Resistances
KW  - Prednisolone
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85638
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rienmüller, Florian Christian
T1  - Untersuchung der oxidativen und pH-abhängigen Regulation der vakuolären Protonen-ATPase und calciumabhängigen vakuolären Membranleitfähigkeiten von Arabidopsis thaliana
T1  - Investigation of the oxidative and pH dependent regulation of vacuolar proton-ATPase and calcium dependent vacuolar membrane conductance of Arabidopsis thaliana
N2  - Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten neue Erkenntnisse zur oxidativen, pH- und ATP-abhängigen Regulation der V-ATPase-Funktion in Mesophyllvakuolen von A. thaliana erarbeitet werden. Dazu wurden Patch-Clamp-Experimente an der vakuolären Protonen-ATPase durchgeführt, die eine elektrophysiologische Untersuchung der Protonentransporteigenschaften und deren Regulation ermöglichten. Zusätzlich gestattete die Anwendung von intrazellulären Mikroelektroden zusammen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren an intakten Wurzelrhizodermiszellen von A. thaliana Keimlingen die in vivo Untersuchung von vakuolären Membranleitfähigkeiten und deren Regulation durch cytosolisches Calcium.
Durch die Patch-Clamp-Technik konnte die Spannungsabhängigkeit der V-ATPase bei verschiedenen luminalen pH-Werten erfasst werden. Mit Hilfe thermodynamischer Berechnungen konnte daraus eine Abnahme der Protonentransportrate pro hydrolysiertem ATP-Molekül bei gleichzeitigem Anstieg der vakuolären Protonenkonzentration berechnet werden. Durch die Kombination verschiedener pH-Werte in Cytosol bzw. Vakuole und zusätzlich ansteigenden ATP-Konzentrationen konnten tiefere Einblicke in die pH-abhängige Regulation der V-ATPase-Aktivität erlangt werden. Es konnte aufgezeigt werden, dass eine Abweichung des vakuolären pH-Wertes wesentlich stärker auf die ATP-Bindungsaffinität und Transportkapazität des Enzyms wirkt, als Änderungen der Protonenkonzentration auf cytosolischer Seite. Daraus konnte abgeleitet werden, dass cytosolische bzw. luminale pH-Änderungen auf das gesamte Membran-durchquerende Enzym wirken und jeweils auf die andere Membranseite der V-ATPase weitergegeben werden. Zusätzlich wurden die in dieser Arbeit erhobenen Daten zur V-ATPase im Rahmen einer Zusammenarbeit von Prof. Dr. Ingo Dreyer (Universidad Politecnica, Madrid, Spanien) für die Erstellung eines mathematischen Modells genutzt. Es untermauert einen Rückkopplungsmechanismus der Protonenkonzentration auf die maximale Protonentransportrate (vmax) und die ATP-Affinität (Km) und schlägt eine pH-abhängige Dissoziation der Protonen von der V-ATPase, auch unter ungünstigen intrazellulären Bedingungen, vor. Die Ausweitung der Regulationsstudien unter Einbeziehung verschiedener Mutanten konnte in Zusammenarbeit mit Jun. Prof. Dr. Thorsten Seidel und Mitarbeitern (Universität Bielefeld, Deutschland) eine oxidative Inhibierung der V-ATPase-Aktivität durch den Wegfall von Disulfidbrücken innerhalb des Pumpproteins erfassen und mögliche Auswirkungen von Disulfidbindungen auf die Protonenkopplungsrate aufzeigen. 
Mit Hilfe von intrazellulären Mikroelektroden konnte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass vakuoläre Leitfähigkeiten von Atrichoblasten in A. thaliana durch Stressfaktoren – verursacht durch den Einstich von intrazellulären Mikroelektroden – deutliche Veränderungen zeigen. Durch die Kombination der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren konnte eine Methode zur simultanen Aufzeichnung von Calciumänderungen und elektrischen Membranleitfähigkeiten an Trichoblastenvakuolen entwickelt werden. Dadurch konnte in weiterführenden Untersuchungen in vivo nachgewiesen werden, dass ein transienter Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration zu einer reversiblen Zunahme der Ströme von vakuolären Membranleitfähigkeiten führt, deren unbekannter Ursprung allerdings bereits bekannten Transportproteinen noch zugeordnet werden muss.
N2  - This dissertation provides new insights into the oxidative, pH- and ATP-dependent regulation of the V-ATPase function in A. thaliana. For this purpose the proton transport and its regulation was examined electrophysiologically by patch-clamp experiments on mesophyll cells. Additionally intracellular microelectrodes combined with the application of fluorescence imaging on intact root epidermal cells of A. thaliana seedlings allowed investigation of vacuolar membrane conductance and their regulation via cytosolic calcium in vivo.
The voltage dependency of the V-ATPase was recorded at various luminal pH values by the patch-clamp technique. Furthermore thermodynamic calculations showed a decrease of the proton transport rate per hydrolyzed ATP molecule due to an increase of the vacuolar proton concentration. Different cytosolic and vacuolar pH-values combined with increasing ATP-concentrations also provided deeper insights into the principles of the pH dependent regulation of the V-ATPase activity. 
Changes in the cytosolic and luminal pH values on either side of the membrane were found to affect the entire function of the enzyme and thus seem to be transferred to the other side within the V-ATPase. Additionally the data of this dissertation was used by Prof. Dr. Ingo Dreyer (University Politecnica, Madrid, Spain) in the context of cooperation to create a mathematic model. It confirms a feedback system of the proton concentration on the maximum proton transport rate (vmax) and the ATP binding affinity (Km). This model proposes a pH-dependent dissociation of the protons from the V-ATPase also under unfavorable intracellular conditions. Further examinations of the V-ATPase regulation with different mutants in collaboration with Jun. Prof. Dr. Thorsten Seidel and co-workers (University of Bielefeld, Germany) revealed oxidative inhibition of V-ATPase activity due to the removal of disulfide-bond formation within the pump protein. Additionally a possible effect of disulfide-bridge formation on proton coupling rate was shown.
The intracellular microelectrode measurements on intact root cells in the second part demonstrate that changes in the vacuolar membrane conductance of A. thaliana atrichoblasts are related to stress factors caused by the impalement of the electrodes. Further studies by a new method combining the application of fluorescence imaging with the two-electrode voltage-clamp allowed recording of calcium changes and electric membrane conductance within trichoblasts simultaneously. As a result it could be shown that a transient rise of cytosolic calcium is linked to increasing currents of vacuolar membrane conductances in vivo. The unknown origin of these conductances however has to be dedicated to known transport proteins.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - oxidative and pH dependent regulation
KW  - Biomembran
KW  - V-ATPasen
KW  - Leitfähigkeit
KW  - vacuolar proton-ATPase
KW  - calcium dependent membrane conductance
KW  - oxidative and pH dependent regulation
KW  - oxidative und pH-abhängige Regulation
KW  - calciumabhängige Membranleitfähigkeiten
KW  - Arabidopsis thaliana
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104891
ER  - 
TY  - THES
A1  - Grun, Christoph
T1  - Untersuchung enzymatisch und nicht-enzymatisch gebildeter Oxylipine in Arabidopsis thaliana in der kompatiblen und der inkompatiblen Interaktion mit Pseudomonas syringae
T1  - Encymatically and not encymatically formed oxylipins in  Arabidopsis thaliana in compatible und not compatible interaction with Pseudomonas syringae
N2  - 1. OH-FS wurden in vitro hergestellt, um als Standardsubstanzen zur gaschromato-graphischen Identifizierung von OH-FS in Pflanzenmaterial eingesetzt zu werden. 2. Für die Untersuchung der Oxylipin-Gehalte in A. thaliana wurden der virulente Pst-Stamm DC3000 sowie der avirulente Stamm avrRPM1 verwendet, um die kompatible Interaktion mit der inkompatiblen Interaktion vergleichen zu können. Die Konzentrationen der Oxylipine sowie SA wurden innerhalb einer Versuchsdauer von 60 h verfolgt. Dabei wurden PPF1 sowie 12- und 16-OH-FS, als Vertreter der nicht-enzymatisch entstandenen Oxylipine, 9- und 13-OH-FS, sowohl als enzymatisch als auch nicht-enzymatisch entstandene Oxylipine, sowie JA und deren Vorstufe OPDA als enzymatisch gebildete Phytohormone untersucht. Es wurden monophasische Konzentrationsanstiege, bei allen untersuchten Substanzen, in der kompatiblen Interaktion ermittelt, wohingegen die Konzentrationsanstiege in der inkompatiblen Interaktion biphasisch waren. In beiden Interaktionen wurden nach 48 bis 60 h Konzentrationsmaxima der freien sowie der veresterten OH-FS und PPF1 nachgewiesen, ein früher Konzentrationsanstieg nach 5 bis 10 h konnte ausschließlich in der inkompatiblen Interaktion ermittelt werden. Die gleichzeitige Akkumulation von 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS und PPF1 deutet auf eine parallel ablaufende Oxylipin-Synthese durch enzymatische, Photo-oxidative und über freie Radikale vermittelte Prozesse hin. Die Akkumulation veresterter OH-FS und PPF1 erfolgte in beiden Interaktionen 5 bis 12 h früher als die Konzentrationsanstiege der freien OH-FS und PPF1. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass nicht-enzymatische Oxylipine in Membranen gebildet werden können und anschließend vermutlich durch eine Lipase frei gesetzt werden. In der inkompatiblen Interaktion konnte ein erstes frühes Konzentrationsmaximum von JA und OPDA nach 5 h beobachtet werden, während späte Maxima in beiden Interaktionen nach 24 bis 36 h erfolgten. Somit akkumulierten die OH-FS und PPF1 in der inkompatiblen Interaktion zeitgleich mit den Jasmonaten nach 5 h. 3. Bei einer Kälteexposition von A. thaliana bei 4°C über 2 h wurde jeweils ein 3,3-facher Konzentrationsanstieg der freien und der veresterten enzymatisch gebildeten 13-OH-FS nachgewiesen. Darüberhinaus wurde ein 4,6-facher Anstieg der enzymatisch entstandenen 9-OH-FS ermittelt. Die nicht-enzymatisch gebildeten 12- und 16-OH-FS zeigten dagegen keine signifikanten Konzentrationsanstiege über die basalen Konzentrationen hinaus. Die angewendeten Stressbedingungen bewirken demnach ausschließlich eine enzymatische Bildung von OH-FS in A. thaliana. 4. Zur Untersuchung der OH-FS-Synthese in der inkompatiblen Interaktion in Abhängigkeit von der bei der Pflanzenanzucht eingesetzten Lichtstärke wurden A. thaliana bei Licht und in Dunkelheit mit Pst avrRPM1 infiziert. Nach 10 h wurde eine 1,1- bis 3,7-fach stärkere Bildung der freien sowie eine 2,0- bis 3,4-fach stärkere Akkumulation der veresterten 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS bei den Pflanzen ermittelt, die bei Licht angezogen wurden. Die Lichtintensität, der Pflanzen während der Infektion mit Pst ausgesetzt sind, hat demnach große Bedeutung für die Entstehung enzymatisch und nicht-enzymatisch gebildeter OH-FS. Ein 4,9-facher Anstieg veresterter 15-OH-FS, ein Marker für eine photooxidative OH-FS-Entstehung, auch bei Dunkelheit widersprach der Hypothese, dass 15-OH-FS ohne Lichteinwirkung nicht gebildet werden können und deutet auf eine bisher unbekannte Licht-unabhängige Entstehung von 1O2 bzw. von 15-OH-FS hin. 5. Die Bestimmung von OH-FS in Blättern und Wurzeln von unbehandelten A. thaliana-Pflanzen ergab eine 13- bis 31-fach höhere Konzentration veresterter 9-, 10-, 12-, 13- und 16-OH-FS in den Blättern. Darüberhinaus wurde eine 111-fach höhere Konzentration von veresterten 15-OH-FS in Blättern im Vergleich zu Wurzeln nachgewiesen. 15-OH-FS wurden als selektiver Marker für eine Photo-oxidative OH-FS-Bildung durch 1O2 verwendet. Mit 0,57 µg/g TG kommt 15-OH-FS allerdings auch im Wurzelgewebe vor, was einen Hinweis darauf darstellt, dass neben einem Licht-abhängigen Hauptweg auch ein Licht-unabhängiger Entstehungsmechanismus von 15-OH-FS bzw. 1O2 existiert. Alternativ wäre es denkbar, dass ein Transport von 15-OH-FS von den Blättern in die Wurzeln stattfindet. 6. Eine Untersuchung der Gehalte an OH-FS und PPF1 in NahG-, lsd1-, atrbohD- und atrbohF-Mutanten ergab 48 h nach Infiltration von Pst avrRPM1 keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den Pflanzen des jeweiligen Wildtyps Col-0 und WS. Unter den gewählten Versuchsbedingungen bewirken die genetischen Defekte der untersuchten Mutanten keine veränderte Akkumulation enzymatisch sowie nicht-enzymatisch gebildeter Oxylipine.
N2  - 1. To obtain reference-substances for the identification of OH-FA in plant material by GC-MS, OH-FA were made in vitro. 9- and 13-hydroxy-octadecadienoic acids were formed from linoleic acid, 9- and 13-hydroxy-octadecatrienoic acids from &#61537;-linolenic acid by LOX-catalized reaction. 2. In order to compare the concentrations of oxylipins in A. thaliana during compatible and incompatible interaction, a virulent Pst-strain DC3000 and an avirulent strain avrRPM1 were utilized. The concentrations of oxylipins and salicylic acid were investigated within 60 h after inoculation. F1-phytoprostanes, 12- and 16-OH-FA were used as markers for non-enzymatically formed oxylipins. Concentrations of 9- and 13-OH-FA, either enzymatically or non-enzymatically formed, were measured as well as phytohormones, jasmonic acid and its precursor 12-oxo-phytodienoic acid. Within the compatible interaction an increase of the amount of all measured compounds was observed. In contrast, during incompatible interaction the increases of all measured substances was seperated into two phases. In both interactions, free and esterified OH-FA- and PPF1-concentrations exhibited maxima after 48 to 60 h, an early increase after 5 to 10 h was exclusively found in the incompatible interaction. The concurrent accumulation of 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FA und PPF1 indicates that enzymatically, Photo-oxidative, and free-radical catalyzed synthesis of oxylipins takes place simultaneously. In both interactions the accumulation of esterified OH-FA and PPF1 occurred 5 - 12 h earlier than the increase of the concentrations of free OH-FA and PPF1. These results confirm the hypothesis that oxylipins are formed non-enzymatically from lipids inside cell membranes and are subsequently released by lipases. An early increase of JA- and OPDA-concentrations after 5 h was found in the incompatible interaction, while late maxima occurred in both interactions after 24 to 36 h. Therefore, OH-FA- and PPF1-accumulation took place at the same time as the increase of jasmonates after 5 h. 3. When A. thaliana plants were chilled for 2 h at 4°C an 3,3-fold incrceased formation of both, the enzymatically formed free and esterified 13-OH-FA was detected. The amount of enzymatically formed free 9-OH-FA increased 4,6-fold. In contrast, the amount of non-enzymatically formed 12- and 16-OH-FA did not increase significantly indicating that the applied mild stress conditions triggered exclusively enzymatical OH-FA-formation. 4. In order to get information about OH-FA-formation with regard to light intensity A. thaliana was infected by Pst avrRPM1 and cultivated either in the dark or in the light. When plants were cultivated in the light after 10 h an 1,1- to 3,7- fold increased formation of free and an 2,0- to 3,4-fold increased accumulation of esterified 9-, 10-, 12-, 13-, 15- und 16-OH-FA could be detected. Therefore, the light intensity during an infection with Pst avrRPM1 is an important factor for the formation of enzymatically as well as non-enzymatically formed OH-FA in planta. The 4,9-fold increase of esterified 15-OH-FA (a marker for photooxidative formation of OH-FA) in the dark contradicted the hypothesis that its formation is impossible without the impact of light. In contrast the accumulation of 15-OH-FA in the dark points to a light-independent 1O2- and subsequent 15-OH-FA-formation by a so far unknown mechanism. 5. Determination of the concentrations of OH-FA in leaves and roots of untreated plants of A. thaliana showed 13- to 31-fold higher amounts of esterified 9-,10-, 12-, 13 und 16-OH-FA in the leaves. Moreover, the amounts of esterified 15-OH-FA exceeded in leaves by the factor 111 in comparison to roots. 15-OH-FA was used as a selective marker for Photo-oxidative formation of OH-FA by 1O2. Though, 15-OH-FA occurred to an amount of 0,57 µg/g (dry weight) in roots as well. This indicates that, apart from an primarily used light depending mechanism, a second path for the formation of 15-OH-FA respectively 1O2 exists which does not depend on light strength. An alternative explanation could be the transport of 15-OH-FA from leaves to roots. 6. Compared to the wildtype plants no significant differences in the increase of OH-FA and PPF1 could be detected in NahG-, lsd1-, atrbohD and atrbohF-mutants 48 h after infiltration of Pst avrRPM1. Under the utilized conditions the genetic defects of the analyzed mutants did not cause a modified accumulation of both, enzymatically and not enzymatically formed oxylipins.
KW  - Lipid-Peroxide
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Pseudomonas syringae
KW  - Oxylipine
KW  - Arabidopsis
KW  - thaliana
KW  - Pseudomonas
KW  - syringae
KW  - Oxylipines
KW  - Arabidopsis
KW  - thaliana
KW  - Pseudomonas
KW  - syringae
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20804
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TY  - THES
A1  - Konrad, Kai Robert
T1  - Untersuchung zu den frühen ABA-induzierten elektrischen Reaktionen in Schließzellen von Vicia faba
T1  - Investigation of the early ABA-induced electric responses of Vicia faba guard cells
N2  - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Perzeption und frühe Signaltransduktion des Phytohormons ABA in Schließzellprotoplasten von Vicia faba mittels der Patch-Clamp-Technik untersucht. Es wurde entdeckt, dass der ABA-Signaltransduktionskette zur Aktivierung von Plasmamembran-ständigen Anionenkanälen voraussichtlich eine Proteinkinase beinhaltet und durch eine cytosolische ABA-Perzeption ausgelöst wird. Die durch ABA-bewirkte Anionenkanal-Aktivierung verursacht in Schließzellen eine Plasmamembran-Depolarisation. Basierend auf der ABA-induzierten Schließzellen-Depolarisation wurde zudem eine Methode etabliert, um mit dem Spannungs-sensitiven Farbstoff DiBAC4(3) in Populationen von intakten Vicia faba-Schließzellprotoplasten Membranpotential-Änderungen zu quantifizieren.
N2  - Within the framework of this dissertation the perception and early signal transduction chain of the phytohormon ABA was investigated with the Patch-Clamp-technique in Vicia faba guard cell protoplasts. It was discovered that the ABA-signalling chain to activate plasma-membrane anion channels likely implied a protein kinase and was triggered through a cytosolic ABA-perception. The ABA-induced anion channel activation leads to plasma membrane depolarization. Based on the ABA-evoked depolarization response a method was developed to monitor and quantify membrane potential changes in populations of Vicia faba guard cell protoplasts with the voltage-sensitive dye DiBAC4(3).
KW  - Schließzelle
KW  - Membranpotenzial
KW  - Anionentranslokator
KW  - Ackerbohne
KW  - Abscisinsäure
KW  - DiBAC4(3)
KW  - guard cell
KW  - anion channel
KW  - membrane potential
KW  - abscisic acid
KW  - DiBAC4(3)
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27216
ER  - 
TY  - THES
A1  - Steinmeyer, Ralf
T1  - Untersuchungen und Simulationen zur Koordination der Ionenflüsse bei der Schließzellbewegung in Vicia faba und Arabidopsis thaliana
T1  - Studies and Simulations about the Coordination of Ion Fluxes during the Guard Cell Movement in Vicia faba and Arabidopsis thaliana
N2  - Trotz der bereits lange gut bekannten Funktion der Stomata und der einzelnen, an der Funktion beteiligten Transportproteine, fehlen Funktionsmodelle, die diese schließzellspezifsch in einen Zusammenhang bringen und ihre Koordination untersuchen. Ergebnisse - Der einwärts gleichrichtende Kaliumkanal aus Arabidopsis thaliana, KAT1 ist sowohl molekularbiologisch, als auch elektrophysiologisch gut charakterisiert. Ein „ausschalten“ dieses Kanals sollte die Stomaöffnung deutlich verlangsamen oder vermindern. Es wurde aber unter verschiedenen Bedingungen, weder mit Licht als Öffungsreiz, noch mit Fusicoccin, kein Unterschied zwischen Wildtyp und KAT1::En-1 Mutante gefunden. - Einige Publikationen schlagen Zucker, vornehmlich Glukose als osmotisch aktive Substanz zur Stomaöffnung vor, da im Tagesgang bei längerer Stomaöffnung auch die Zuckerkonzentration zunimmt. Die Zuckeraufnahme wurde mit einem fluoreszierenden Glukose-Derivat gemessen und als lichtabhängig gefunden. Weiterhin wurde die Aufnahme besonders durch CCCP gehemmt, was auf eine Abhängigkeit von einem Protonengradienten hindeutet. - Die Aufnahme von Glukose wurde weiterhin mit einer Knockout-Mutante des AtSTP1 Protonen/Zucker-Kotransporters getestet. Die deutliche Verminderung des Anteils der fluoreszierenden Zellen gegenüber dem Wildtyp unter den gleichen Bedingungen zeigt eine Beteiligung dieses Kotransporters an der Glukose-Aufnahme. - Schließzellen in der intakten Pflanze wurden auf den Verlauf ihres Membranpotentials in CO2-freier Luft bei Licht/Dunkel Wechseln untersucht. Ein großer Teil dieser Zellen zeigte eine wiederholbare Hyperpolarisation im Licht und Depolarisation im Dunklen. Als Auslöser dieser Änderung in der Membranspannung wurde hauptsächlich die (In-)Aktivierung eines instantanen positiven Stromes in der Größÿe von etwa 35 pA festgestellt, vermutlich die H+-ATPase. - Die Abhängigkeiten des Anionenkanals, der einwärts und auswärts gleichrichtenden Kaliumkanäle und der Protonenpumpe von internen und externen Ionenkonzentrationen, dem pH-Wert und der Membranspannung wurden in einer biophysikalischen Simulation vereint. Zusammen mit den jeweiligen Leitfähigkeiten und Literaturdaten der Konzentrationsverläufe ergibt sich ein realistisches Modell der Flüsse zur Stomabewegung. - Aus dem Modell ergeben sich zwei wesentliche Voraussagen für das Zusammenwirken der Transportproteine: 1. Bei der Stomaöffnung muss die H+-ATPase zur Beendigung der Öffnung wieder deaktiviert werden, anderenfalls steigt die interne Kaliumkonzentration und das Membranpotential fällt auf Werte, die in Messungen nie gefunden wurden. Eine Desensitisierung der H+-ATPase wurde zwar nach Blaulicht-Pulsen bereits gemessen, jedoch nicht bei andauernder Beleuchtung. 2. Der bisher in Schließzellen noch nicht elektrophysiologisch nachgewiesene Protonen/Chlorid Kotransporter zum Import von Chlorid muss nicht nur während der Stomaöffnung aktiv sein, sondern erhält auch eine Rolle beim Stomaschluss. Da die cytosolische Chloridkonzentration deutlich unter der von Kalium liegt, würde die für den Efflux der beiden Ionen nötige Depolarisation bereits enden, wenn die Chloridkonzentration deutlich sinkt, also bevor auch die Konzentration von Kalium soweit abgenommen hätte, dass die Spaltöffnung geschlossen wäre. - Zur Messung interner Ionenkonzentrationen in intakten Schlieÿzellen wurden verschiedene Methoden der Beladung mit fluoreszierenden Indikatorfarbsto#en getestet. Die Beladung durch niedrigen pH, niedrige Temperatur oder der Farbstoffe als Acetoxymethyl-Ester kann bei Schließzellen von Vicia faba als nicht praktikabel angesehen werden. Lediglich eine Detergenz unterstützte Farbstoffbeladung wurde in der Literatur gefunden. - Zur parallelen Anwendung elektrophysiologischer Messungen und fluoreszenzbasierter Bestimmung von Ionenkonzentrationen wurde eine Technik der Druckinjektion über einen Kanal einer Doppel-Elektrode getestet. Diese Methode erlaubt die Farbstoffinjektion, allerdings hat sich die Spannungs-Klemm-Technik mit der für einen einzelnen Kanal einer Einstichelektrode notwendigen gepulsten Technik als nicht praktikabel erwiesen, da die Membranspannung vermutlich aufgrund nicht kompensierbarer Kapazitäten nicht die vorgegebenen Werte erreichte.
N2  - While the function of stomata as well as of the different proteins involved in ion fluxes across the plasma membrane are well understood, a guard cell specific model for the concerted function and coordination is still missing. Results - KAT1, the inward rectifying potassium channel from Arabidopsis thaliana is well characterized in terms of structure and electrophysiological function. A knock-out mutant of this channel should be restrained in stomatal opening. Nevertheless under different conditions, with light or fusicoccin as opening stimulus, no difference could be found between wild type and KAT1::En-1 mutant plants. - Glucose is found to accumulate in guard cells during the day when stomata are opened and it is thus suggested to contribute to the osmotical pressure for opening. The uptake of a fluorescent glucose derivative was found to be light dependent and impaired by addition of CCCP which eliminates the proton gradient across the plasma membrane. - A knock-out mutant of the proton/sugar cotransporter protein AtSTP1 showed a significant reduction of cells showing 2-NBDG fluorescence as compared to the wild type. This shows a prominent contribution of this transporter to the uptake of glucose. - Changes of the free running membrane potential upon light/dark transitions were measured in guard cells of intact Vicia faba plants. A majority of these cells showed repeatable hyperpolarizations in light and depolarizations in darkness. These changes in potential were mainly driven by the (in-)activation of an instantaneous positive current of about 35 mA, most probably the H+-ATPase. - In a biophysical simulation, the dependence of anion channel, inward as well as outward rectifying potassium channels and proton pump on cytosolic and apoplastic ion concentrations, pH and membrane potential were included to build a model of ion fluxes for stomatal movements. Also included were literature values for channel conductance and the kinetics of concentrations during stomatal movements. - From this model, two main predictions were made for the cooperation of transport proteins in stomatal movements: 1. At the end of the opening phase of stomata, the H+-ATPase must be deactivated, since otherwise the cytosolic potassium concentration would rise and the membrane potential would decrease both to values that were never reproduced in measurements. A desensitization of the H+-ATPase was already found after pulses of blue light, but never upon permanent white light. 2. The proton/chloride cotransporter not only needs to be active during stomal opening for chloride uptake, but also during closure. Since in guard cells of open stomata, the concentration of potassium is higher than that of chloride, a 1:1 efflux of both ions would soon end the depolarization needed for further potassium efflux. To overcome this, a chloride cycle is suggested, where the cotransporter is active and keeps the net efflux of chloride small. - Different loading techniques were tested for fluorescent calcium indicator dyes. Incubation at low pH, for the free acid form as well as low temperature for the acetoxymethyl-ester forms of the dyes were shown to be impossible in Vicia faba guard cells. During the work on this thesis, one example for a detergent-aided loading of free acid dyes was published. - For parallel recording of electrophyiological parameters and cytosolic ion concentrations, an injection technique was tested that operates by regulated air pressure on one barrel of a double-barreled pipette. The other barrel was used for measurements of the membrane potential. Experiments with a discontinuous voltage clamp amplifier failed, since the target voltage was not reached probably due to non-compensable, variable pipette capacities.
KW  - Ackerbohne
KW  - Schließzelle
KW  - Ionenkanal
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Schließzelle
KW  - Ionenkanal
KW  - Apoplast
KW  - Membranpotential
KW  - guard cell
KW  - ion channel
KW  - apoplast
KW  - membrane potential
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17098
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TY  - THES
A1  - Scheerer, Jochen
T1  - Untersuchungen zum Einfluss exogener und endogener Faktoren auf den Pilocarpingehalt von Pilocarpus microphyllus Stapf ex Wardleworth unter natürlichen Bedingungen
N2  - Mit dieser Arbeit sollten, vor anwendungsbezogenem Hintergrund, die Einflüsse endogener und exogener Faktoren auf den Pilocarpingehalt von P. microphyllus Stapf unter natürlichen Bedingungen untersucht werden. Die Bestimmung der Pilocarpingehalte der entsprechenden Proben erfolgte mit Hilfe von HPLC –Analysen der, zuvor durch Festphasenextraktion aufgereinigten, Pflanzenextrakte. Mit dem Ziel, Pflanzenmaterial gleicher genetischer Herkunft untersuchen zu können, wurde versucht, die Pflanzen über Keimlinge und Sprosstecklinge zu vermehren. Während erstere Versuche zu Keimraten von bis zu mehr als 80 Prozent führten, blieben die Bemühungen einer Stecklingsvermehrung trotz unterschiedlicher Ansätze erfolglos. Im Zusammenhang mit Untersuchungen zum Einfluß endogener Faktoren auf den Pilocarpingehalt in den Blättern, wurden vegetative Merkmale (Blüten, Knospen, Früchte und Blattaustriebe) den jeweiligen Gehalten gegenübergestellt. In einem Zeitraum von zehn Monaten konnten bei keiner der Versuchspflanzen ein Zusammenhang zwischen dem jeweiligen vegetativen Zustand und der Menge an Pilocarpin in den Blättern festgestellt werden. Während der vegetative Zustand von P.microphyllus Stapf keine offensichtlichen Auswirkungen auf den Pilocarpingehalt der Blätter hatte, ergaben die Versuchsreihen zum Blattalter einen deutlichen Einfluß dieses endogenen Faktors. In zahlreichen Analysen konnte gezeigt werden, daß junge Blätter durchschnittlich 70 Prozent mehr Pilocarpin enthalten als alte Blätter der jeweils selben Pflanze. Pilocarpin wurde in unterschiedlichen Konzentrationen in allen Teilen von P. microphyllus Stapf nachgewiesen. In Langzeitbeobachtungen über den Zeitraum eines Jahres, konnten in allen Fällen Schwankungen im Pilocarpingehalt der Blätter beobachtet werden. Bis auf eine Ausnahme verliefen diese Änderungen nach einem ähnlichen Muster, welches sich jedoch nicht mit klimatischen Faktoren in einen logischen Zusammenhang bringen ließ. Als ein exogener Faktor mit deutlichem Einfluß auf den Pilocarpingehalt der Blätter, wurden die Strahlungsverhältnisse identifiziert. Bei vergleichenden Analysen von Versuchspflanzen, welche in einem Schattenbeet wuchsen, mit solchen, die der vollen Sonneneinstrahlung ausgesetzt waren, wurde deutlich, daß die Schattenpflanzen durchschnittlich etwa 37 Prozent mehr Pilocarpin enthielten. In einem Düngungsversuch konnte gezeigt werden, daß sich die Nährstoffversorgung entscheidend auf den Pilocarpingehalt auswirken kann. Nach dreimaliger Zugabe eines Düngers, welcher vor allem die Phosphat- und Kaliumversorgung der Pflanzen verbesserte, wurden Mengen an Pilocarpin gefunden, welche um bis zu knapp 300 Prozent über den Werten vor der Düngung lagen. Experimente mit unterschiedlichen Methoden zur Trocknung von geernteten Pilocarpusblättern ergaben, daß die Art der Trocknung einen entscheidenten Einfluß auf den Gehalt an Pilocarpin in den Blättern nach der Ernte hat. Unter günstigen Lagerbedingungen konnten Pilocarpusblätter für mindestens ein Jahr ohne größere Verluste an Pilocarpin aufbewahrt werden. Im Laufe dieser Arbeit ergaben sich aus den Chromatogramspektren der verschiedenen Analysen Hinweise auf verschiedene, möglicherweise chemische, Varietäten innerhalb der Art P.microphyllus Stapf.
N2  - In this dissertation the influence of endogenous and exogenous factors that possibly affect on the content of Pilocarpine in P. microphyllus Stapf under natural conditions has been analyzed. An HPLC method was developed to determine the content of Pilocarpine in respective plant extracts, which had been conditioned previously by solid phase extraction. To obtain genetically identical plant material, attempts were made to propagate plants by seedlings and stem-cuttings. The seedling experiments resulted in germination rates of more than 80 per cent, meanwhile various cutting attempts did not lead to any success. In studies regarding the influence of endogenous factors on the content of Pilocarpine in the leaves, vegetative features (flowers, buds, and fruits) were compared with the respective Pilocarpine contents. During a 10 months observation period no correlation could be determined between the vegetative characteristics and the content of Pilocarpine. Unlike vegetative features, the age of the leaves was determined as an endogenous factor with a significant influence on the Pilocarpine content. In numerous analyses it could be shown that young leaves contain in average 70 per cent more Pilocarpine than old ones of the same plant. Pilocarpine was found in all parts of P. microphyllus Stapf. In observations made during a period of time of one year, fluctuations of the Pilocarpine content in the leaves were found in all cases. Besides one exception, those fluctuations showed a similar pattern. However, no correlation with climatic factors could be found. Radiation conditions were identified as an external factor with significant influence on the Pilocarpine content of the leaves. In analysis comparing leaves of plants growing in full sunlight and those growing under shade, the average content of Pilocarpine of the latter was 37 per cent higher. In an experiment with a fertilizer it could be shown that the nutrient supply has a significant importance on the Pilocarpine content. After a three times application of a fertilizer, which mainly improved the phosphate and potassium supply of the plants, up to 300 per cent more Pilocarpine was found compared with contents before the application. Experiments with different drying techniques of harvested leaves revealed that the applied drying method has a decisive influence on the Pilocarpine content of the leaves. Under suitable conditions it has been possible to store dried Pilocarpus leaves for at least one year without important loss in Pilocarpine. Based on the chromatograms obtained during this dissertation, indications for different, possibly chemical, varieties of the species P.microphyllus Stapf were revealed.
KW  - Parna´iba <Region>
KW  - Pilocarpus microphyllus
KW  - Pilocarpin
KW  - Jaborandi
KW  - Pilocarpus
KW  - Pilocarpin
KW  - Glaukom
KW  - Xerostomia
KW  - Jaborandi
KW  - Pilocarpus
KW  - pilocarpine
KW  - glaucoma
KW  - xerostomia
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181463
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TY  - THES
A1  - Hose, Eleonore
T1  - Untersuchungen zum radialen Abscisinsäure- und Wassertransport in Wurzeln von Helianthus annuus L. und Zea mays L.
N2  - Mit den Experimenten dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ein Phytohormon wie Abscisinsäure mit dem "Solvent-drag" des Wasserflusses apoplastisch durch den Wurzelzellwandbereich in die Xylemgefäße transportiert werden kann. Es konnte ein Bypass-Fluss für ABA durch den gesamten Zellwandapoplasten, auch durch lipophile Barrieren wie Exo- und Endodermis nachgewiesen werden. Dies ist durch die speziellen Moleküleigenschaften von Abscisinsäure möglich: (i) der geringe Durchmesser des Moleküls (8 - 11 nm) und (ii) die hohe Lipophilie von ABA bei schwach sauren pH-Werte. Mit einer Penetration apoplastischer Barrieren ist demnach zu rechnen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Ausbildung solcher lipophilen Zellwandnetze einen signifikanten Einfluss auf den apoplastischen ABA-Transport besitzt. Die Ausbildung einer Exodermis in Mais, wie sie unter natürlichen Bedingungen zu beobachten ist, konnte den ABA-Fluss in das Xylem um die Faktoren 2 bis 4 reduzieren. Da gleichzeitig eine Verminderung der hydraulischen Wurzelleitfähigkeit um denselben Betrag auftrat, blieb das Wurzel-Spross-ABA-Signal, die Phytohormonkonzentration, im Xylem gleich. Die zu den Stomata geleitete Information über den Wasserzustand der Wurzel änderte sich also nicht. Im natürlichen System ist sogar eine Verstärkung des Signals zu erwarten, da eine Exodermis nicht als Aufnahme-Barriere für gewebeproduzierte ABA wirkt. Gleichzeitig verringert sie den Verlust von apoplastischer ABA an die Rhizosphäre. Außerdem wird der Wasserverlust aus dem Gewebe durch eine Exodermis signifikant reduziert wird. Somit sind solche Wurzeln gut an die Bedingungen eines eintrocknenden Bodens angepasst. Apoplastische Barrieren sind demnach, neben membran-lokalisierten Tranportern, wichtige Parameter für die Beurteilung von Wurzeltransporteigenschaften für Wasser und darin gelöste Substanzen. Der Beitrag der apoplastischen Komponente zum Gesamt-ABA-Transport ist abhängig von der untersuchten Pflanzenart, der aktuellen Transpirations- oder Wasserflussrate und von Umwelteinflüssen wie erhöhter ABA-Konzentration im Wurzelgewebe (z.B. durch Trockenstress), pH-Wert der Rhizosphäre und den Ernährungsbedingungen der Pflanze. Erhöhter radialer Wasserfluss, erhöhte ABA-Wurzelgewebegehalte und niedriger pH-Wert der Rhizosphäre verstärken den apoplastischen Bypass-Fluss unter physiologischen Bedingungen. Geringe Wassertransportraten, niedrige ABA-Konzentrationen im Gewebe, alkalische pH-Werte der Rhizosphäre und Ammoniumernährung verstärken dagegen den symplastischen Beitrag zum ABA-Transport. In der vorliegenden Arbeit konnten die sich widersprechenden Theorien bezüglich des ABA-Effektes auf die hydraulische Leitfähigkeit von Wurzeln erklärt werden. ABA erhöht über einen Zeitraum von 2 Stunden die Zellleitfähigkeit (Lp) mit einem Maximum 1 Stunde nach ABA-Inkubation. Dies wirkt sich in einem verstärktem Lpr von intakten Wurzelsystemen aus, das einem ähnlichen Zeitmuster folgt. Pflanzen sind demnach in der Lage, mittels ABA den zellulären Wassertransportweg reversibel zu optimieren, um so unter mildem Trockenstress, wie er in einem gerade eintrocknenden Boden auftritt, die Pflanze mit ausreichend Wasser zu versorgen. Tritt ein länger andauernder Wassermangel ein, versperrt die Pflanze diesen Weg wieder. Dieser transiente Effekt erklärt auch die aus der Literatur bekannten stimulierenden und inhibierenden ABA-Wirkungen. Durch den verstärkten Wasserfluss zu Beginn der Stresssituation erzeugt ABA auf diese Weise ein sich selbst verstärkendes, wurzelbürtiges Hormonsignal in den Spross. Das Blatt erreicht in effektiver Weise eine ABA-Menge, die ausreichend ist, um die Stomata zu schließen. Es folgt eine Reduktion der Transpiration. Eine weiter andauernde Erhöhung des symplastischen Wassertransportweges wäre ohne physiologische Bedeutung. Regulierende Membranstrukturen für diesen Vorgang könnten ABA-sensitive Wasserkanäle (Aquaporine) der Plasmamembran sein. Es wurde gezeigt, dass der Rezeptor für diesen Vorgang innerhalb von corticalen Maiswurzelzellen lokalisiert und hochspezifisch für (+)-cis-trans-ABA ist. Die Signaltransduktion für diesen Kurzzeiteffekt erfolgt nicht mittels verstärkter Aquaporintranskription, könnte aber über ABA-induzierte Aktivierung (Phosphorylierung), oder Einbau von Aquaporinen in die Zellmembran ablaufen. Der Abscisinsäure-Transport ist ein komplexer Vorgang. Er wird beeinflusst durch Umwelteinflüsse, Wurzelanatomie, ist gekoppelt mit dem Wasserfluss und durch sich selbst variierbar. Herkömmliche Vorstellungen einer simplen Hormondiffusion können diesen regulierbaren Vorgang nicht mehr beschreiben. Pflanzen besitzen ein ABA-Transportsystem, das schnell, effektiv und an sich verändernde Umweltbedingungen adaptierbar ist.
N2  - The experimental work of the presented study has been able to show, for the first time, that a phytohormone like ABA can be transported apoplastically into xylem vessels by solvent-drag of the water flow. For ABA, a bypass-flow throughout the whole cell wall apoplast, including lipophilic barriers like exo-and endodermis, could be demonstrated. This may be due to the particular properties of the 264 Da ABA-molecule: (i) the small diameter of the molecule (8 to 11 nm) and (ii) the high lipophily of the uncharged ABA under physiological conditions. Conclusively, a penetration of apoplastic barriers is supposed to be possible. Furthermore, this study shows the development of such lipophilic cell wall-nets should have significant influence on apoplastic ABA-transport-properties. The formation of an exodermis in maize, as it occurs under natural conditions, was able to reduce the ABA-flow into the xylem by factors of 2 up to 4. As, simultaneously, the root-hydraulic conductivity was decreased by the same rate, the root-to-shoot ABA-signal, the phytohormone concentration in the xylem, remained constant. The information about the root-water-status addressed to the guard cells has not changed, therefore. In the natural environment even an increase of this signal is to be expected, as exodermal layers are no uptake-barriers for the tissue-produced ABA. On the contrary, an exodermis will retard the leakage of ABA to the rhizosphere. At the same time, roots are more effectively adapted to drought because water loss from exodermal roots is also reduced significantly. Apoplastic barriers are, therefore, beside membrane-located transport-proteins, the important parameters for determining root-transport-properties for water and solutes. The contribution of the apoplastic component to the entire ABA-transport depends on the plant species investigated, the actual transpiration- or water-flow rate and on external conditions like high ABA-concentrations in the root tissue (e.g. after drought), pH of the rhizosphere, and the nutrient status of the plant. Increased radial water-flow, raised ABA-contents of the root tissue, and a low pH of the rhizosphere intensified the apoplastic bypass-flow under physiological conditions. Low water-transport rates, low ABA tissue-contents, alkaline pH-values in the rhizosphere and ammonium as the only N-source, on the other hand, increased the symplastic contribution to the ABA-transport. In the presented study, the controversal dispute concerning the ABA-effect on root hydraulic conductivity could be settled. ABA raises cell hydraulic conductivity (Lp) for 2 h with a maximum after 1 h of ABA-application. This results in an increased Lpr (hydraulic conductivity of intact root systems), directed by a similar time-pattern. So, by ABA plants are able to reversibly optimise the cellular transport path of water to support the plant under mild drought stress with sufficient water. However, if water deficiency continues, plants again close this additional symplastic pathway. This transient ABA-effect explains both stimulating and inhibiting ABA-actions, as known from literature. At the beginning of a stress situation ABA induces by an increased water flow a self-intensifying root-to-shoot-signal. Thus, in an effective way the leaf achieves a sufficient amount of ABA in order to close the stomata. A reduction in transpiration follows. Further continuous stimulation of the symplastic water transport path would be without any physiological meaning. Membrane structures, responsible for regulating this mechanism may be ABA-responsive water channels (aquaporins) in the plasma membrane. It has been shown that the receptor for regulating these channels is localised inside the cortical cells of maize roots and highly specific for (+)-cis-trans-ABA. Signal transduction for this short-time effect is not mediated by intensified aquaporin-transcription, but there may be evidence of ABA-induced regulation by channel activation (phosphorylation) or by incorporation of aquaporins into cell membranes. The transport of abscisic acid is a complex process modified by environmental conditions, root anatomy, coupled with the water flow, and variable by itself. Customary ideas about a simple hormone diffusion are not apt to describe this complex process anymore. Plants possess an ABA-transport system, which is fast, effective, and adaptable to changing environmental conditions.
KW  - Sonnenblume
KW  - Wurzel
KW  - Wassertransport
KW  - Abscisinsäure
KW  - Stofftransport <Biologie>
KW  - Mais
KW  - Abscisinsäure
KW  - ABA
KW  - Aquaporin
KW  - Exodermis
KW  - Hydraulische Leitfähigkeit
KW  - Wassertransport
KW  - Wurzel
KW  - Helianthus annuus
KW  - Zea mays
KW  - Abscisic acid
KW  - ABA
KW  - aquaporin
KW  - exodermis
KW  - hydraulic conductivity
KW  - water transport root
KW  - Helianthus annuus
KW  - Zea mays
KW  - Nicotiana tabacum
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1421
ER  - 
TY  - THES
A1  - Glöckner, Volker
T1  - Untersuchungen zur Diversität, Abundanz und vertikalen Weitergabe von Bakterien in marinen Schwämmen
T1  - Investigation of the diversity, abundance and vertical transmission of bacteria in marine sponges
N2  - Marine Schwämme (Phylum Porifera) gehören mit ihrem ersten Auftreten im Präkambrium vor ungefähr 580 Millionen Jahren zu den ältesten Vertretern der Metazoen weltweit. Ähnlich lange leben sie wahrscheinlich schon in Symbiose mit Mikroorganismen. In der vorliegenden Doktorarbeit soll der karibische Schwamm Ectyoplasia ferox als Modellsystem zur Erforschung der Schwamm-assoziierten mikrobiellen Konsortien, deren Weitergabe und Interaktionen mit dem Schwamm, vorgestellt werden. Mit Hilfe von 16S rRNA-Genbanken sowie der denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) konnte gezeigt werden, dass Symbionten aus sechs der in E. ferox gefundenen acht Phyla sowie der „sponge-associated unclassified lineage” SAUL vertikal an die nächste Schwammgeneration weitergegeben werden. Mittels phylogenetischer Analysen wurden insgesamt 21 „vertical transmission“ (VT) Cluster identifiziert, von denen 19 in „sponge specific“ Cluster (SSC) bzw. „sponge coral“ Clustern (SCC) lagen. Daraus kann man schließen, dass ein Großteil des mikrobiellen Konsortiums von E. ferox über die reproduktiven Stadien weitergegeben wird. Auch konnten zwei Cyanobakterien identifiziert werden, die nicht in den reproduktiven Stadien vorhanden waren und höchstwahrscheinlich horizontal aus dem umgebenden Meerwasser aufgenommen wurden. Eine Reduzierung von 50% der Symbionten im Mesohyl nach dem „spawning“ zeigte erstmalig experimentell auf, dass Schwammsymbionten aus dem Schwamm in das umgebende Meerwasser gelangen können. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der „presence vs. activity“-Vergleich zur Feststellung der metabolischen Aktivität von Bakterien auf die DGGE-Methode übertragen. Es konnte gezeigt werden, dass die meisten mikrobiellen Symbionten im Adult-Schwamm, Embryo- sowie Larvalstadium metabolisch aktiv waren. Erste Versuche die Anzahl von Symbionten in den Larven von E. ferox mittels Antibiotika zu reduzieren, verliefen positiv. So wiesen die mit Antibiotika behandelten Larven in der DGGE eine deutliche Reduzierung der Bandenintensität auf. Die Verfügbarkeit aller reproduktiver Stadien von E. ferox sowie die Möglichkeit die Larven im Labor experimentell zu manipulieren, machen E. ferox zu einem geeigneten Modellschwamm für zukünftige Studien bezüglich der vertikalen Weitergabe von Symbionten.
N2  - Marine sponges (Phylum: Porifera) first appeared during Precambrian times 580 million years ago and are therefore the oldest metazoans on earth. It is most likely that they are living together in symbiosis with microorganisms from that day on. In this doctoral thesis I introduce the Caribbean sponge Ectyoplasia ferox as a model system for detailed investigations of the sponge associated microbial community, their mode of transmission to the next generation and interactions with their host sponge. The application of 16S rRNA gene clone libraries and denaturing gradient gel electrophoreses (DGGE) revealed that symbionts from six out of eight bacterial phyla as well as the ‘sponge-associated unclassified lineage’ (SAUL) were vertically transmitted to the next sponge generation. Phylogenetic analysis identified 21 vertical transmission (VT) clusters, from which 19 VT-clusters were affiliated with sponge-specific clusters (SSC) and sponge-coral clusters (SCC), respectively. This indicated that the majority of the microbial consortia of E. ferox has been passed on vertically via reproductive stages to the next generation. Furthermore two cyanobacterial clades were identified, which were absent from the reproductive stages and therefore seem to have be acquired horizontally from the surrounding seawater. Spawning led to a reduction of 50% of the sponge symbionts in the mesohyl, presenting for the first time experimental evidence, as to how sponge symbionts could end up in surrounding seawater. Moreover the presence vs. activity comparison that was undertaken to assess the metabolic activity of bacteria inside reproductive stages has been applied to DGGE for the first time. The results showed that most of the symbionts were metabolically active in the adult sponge as well as in the embryos and larvae. Initial experiments to reduce the amount of symbiotic bacteria inside larvae were positive. In the antibiotic treated larvae, the DGGE pattern showed a significantly reduced banding pattern intensity. The availability of E. ferox and its reproductive stages, as well as the possibility to maintain and to manipulate larvae in the laboratory makes E. ferox a suitable model-system for future research on vertical transmission.
KW  - Meeresschwämme
KW  - Bakterien
KW  - vertikale Weitergabe
KW  - Schwammsymbionten
KW  - Mikroorganismen
KW  - Symbionten
KW  - vertical transmission
KW  - sponge
KW  - microorganism
KW  - symbionts
KW  - Symbiose
KW  - Vertikale Übertragung
KW  - Schwamm
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79327
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kolb, Christiane
T1  - Untersuchungen zur Erfassung und Bewertung der UV-Abschirmung bei Kulturvarietäten verschiedener Nutzpflanzenarten
T1  - Investigations on recording and evaluation of UV-screening in varieties of different crops
N2  - In dieser Arbeit wurden unter naturnahen Bedingungen die Effekte von UV-Strahlung auf die Akkumulation löslicher phenolischer Komponenten und die epidermale UV-Transmission in vivo bei Kulturvarietäten di- und monokotyler Arten untersucht. Durch die Versuchsanordnungen konnten die Effekte der spektralen Bereiche der UV-A- und UV-B-Strahlung von denen des sichtbaren Bereichs getrennt betrachtet werden. Visuelle Schadensevaluierungen und die Erfassung der variablen Chlorophyllfluoreszenz dienten der Beurteilung einer durch Strahlungseinflüsse bedingten Schädigung der untersuchten Organe. In kurzfristigen Experimenten erfolgte bei unter Schwachlichtbedingungen angezogenen Pflanzen eine rasche Verringerung der epidermalen UV-Transmission, die durch UV-Strahlung induziert oder verstärkt wurde. Dies stimmte für alle untersuchten Arten (Vitis vinifera, Hordeum vulgare, Avena sativa und Triticum aestivum) überein. Hingegen war in keinem Fall eine durch UV verstärkte Inhibierung der Photosynthese, bestimmt über die variable Chlorophyllfluoreszenz (FV/FM), zu erkennen. Zwischen der epidermalen Transmission für UV-A- und UV-B-Strahlung wurde bei allen drei monokotylen Arten ein strikt linearer Zusammenhang festgestellt. Dieser Zusammenhang bestand jedoch nicht für die untersuchten Organe in V. vinifera. Bei Vitis vinifera und Hordeum vulgare wurde über HPLC- Analytik eine positive Wirkung besonders der UV-B-Strahlung auf die Akkumulation der Flavonoide sowohl kurz- als auch langfristig nachgewiesen. Bei V. vinifera wurden die für Blätter bereits festgestellten Zusammenhänge (Kolb et al., 2001) an Beeren untersucht. Es wurden einerseits allgemeine Reaktionsmuster auf kurz- und langfristige UV- Exposition erfasst, und andererseits zwei Kulturvarietäten (cv. Bacchus und Silvaner) verglichen, deren Anfälligkeit für ein strahlungsbedingtes Schadsymptom unterschiedlich war. In allen Experimenten konnten ohne UV-Strahlung keine nennenswerten Mengen an Flavonoiden gebildet werden. Die löslichen Hydroxyzimtsäurederivate (HZS) hingegen waren bei den Beeren von der Art der Exposition weitgehend unabhängig. Die Identität der phenolischen Komponenten wurde über HPLC, UV-Spektroskopie, sowie Massenspektrometrie abgeklärt. Ihre Lokalisation in mehreren Zelllagen der Beerenhaut wurde durch Epifluoreszenzmikroskopie gezeigt. Der Einfluss des physiologischen Stadiums der Beeren auf die Akkumulation einzelner phenolischer Komponenten wurde durch Verwendung verschiedener Reifeindikatoren belegt. Im Vergleich zu den Blättern wurden Unterschiede bezüglich der Akkumulation der HZS festgestellt, während für die Akkumulation der Flavonoide weitgehend Übereinstimmung herrschte. Anders als bei den Blättern konnte bei den Beeren die fluorometrisch bestimmte epidermale Transmission nur zum Teil auf die Absorption der phenolischen Extrakte zurückgeführt werden. Die qualitativen Substanzmuster stimmten zwischen den Beeren der beiden Sorten überein, es konnten aber signifikante Unterschiede bezüglich der Quantität einzelner Komponenten festgestellt werden. Zwei bisher unter "Sonnenbrand" zusammengefasste Schadbilder konnten voneinander getrennt dargestellt werden. Eines der beiden wurde eindeutig durch UV- Strahlung induziert, wobei UV-B die Intensität verstärkte. Das Ziel, einen praxisrelevanten Bezug zwischen dem Schadbild der nicht-parasitär bedingten Blattverbräunung (NBV) bei Gerste und der Akklimatisation an verschiedene Strahlungsbedingungen herzustellen, bedingte eine Festlegung auf ausdifferenzierte Blätter adulter Pflanzen anstelle von Primärblättern. Die Auswahl der Kulturvarietäten bei H. vulgare erfolgte im Hinblick auf unterschiedliche Anfälligkeit für NBV. Zwischen den Sorten konnte jedoch bezüglich der Anpassungsfähigkeit der epidermalen UV-Transmission an die unterschiedlichen Strahlungsbedingungen kein eindeutiger Unterschied ermittelt werden. Die epidermale UV-Transmission in vivo wurde bei H. vulgare ebenfalls mit der Absorption von Extrakten löslicher phenolischer Komponenten in Beziehung gesetzt und mit der für die Blätter von V. vinifera gefundenen Relation verglichen. Übereinstimmend konnten ca. 80% der Transmissionseigenschaften über die Absorption der Extrakte erklärt werden. Dennoch bestanden deutliche Unterschiede in der Art der Relationen. Über HPLC-Analytik und UV-Spektroskopie wurden bei H. vulgare die löslichen phenolischen Komponenten in Derivate einzelner Flavonoide unterteilt. Die löslichen HZS hatten im Gegensatz zu V. vinifera nur einen geringen Anteil an der Gesamtmenge der phenolischen Substanzen. Das Substanzmuster der beiden Varietäten stimmte überein; teilweise auftretende Konzentrationsunterschiede bezüglich der Flavonoide insgesamt bzw. einzelner Komponenten waren zwischen den verschiedenen Experimenten nicht konsistent. Ein Zusammenhang zwischen der UV-Exposition und dem Auftreten oder der Intensität des Schadbildes NBV konnte nicht festgestellt werden.
N2  - In this study, the effects of UV radiation on accumulation of soluble phenolic compounds and on epidermal UV transmittance in vivo were investigated under close to nature conditions. Varieties of different crop species, of both dicots and monocots, were examined. The experimental design allowed to distinguish between effects of UV-B, UV-A and visible radiation. Inhibition of photosynthesis, measured by FV/FM, and observable damage caused by exposure to the different light regimes were determined. In plants grown under shaded conditions in the greenhouse, short time outdoor exposure resulted in fast reduction of epidermal UV transmittance. This effect was spe-cifically enhanced by UV radiation and was observed in all species investigated (V. vinifera, H. vulgare, A. sativa and T. aestivum). In contrast, inhibition of photosynthesis did not occur in all species. A good correlation was found between epidermal transmittance for UV-B and UV-A radiation in all of the monocot species investigated. This correlation, however, was not observed in V. vinifera. Flavonoid contents were determined in V. vinifera and H. vulgare by HPLC. Flavonoid synthesis was particularly enhanced by exposure to UV-B radiation. For V. vinifera, the study concentrated on long and short term effects of UV exposure on grapes and the data were related to recently reported UV effects on grape leaves (Kolb et al., 2001). Two white grapevine varieties (cv. Bacchus and cv. Silvaner) were compared. The two varieties differ in their sensitivity for "sunburn" a syndrome which typically occurs during periods of high light intensities. Phenolic compounds were examined by HPLC analysis, UV spectroscopy, and mass spectrometry. Phenolics of berries of the two varieties were similar and agreed with the phenolic substances determined in leaves. In all experiments, the amounts of flavonoids synthesised in absence of UV radiation were negligible. Under outdoor conditions, however, significant differences between the two berry types in the amount of phenolic compounds were determined. It was also shown that these variations are modulated by the prevailing developmental stage of grapes. Similar to leaves, UV-B radiation stimulated flavonoid synthesis in grapes. Different from leaves, synthesis of soluble hydroxycinnamic acids was not stimulated by high visible radiation. Furthermore, in leaves fluorescence microscopy demonstrated that phenolics are especially concentrated in the epidermal layer, whereas in grapes, phenolics appear to occur at elevated concentrations in several layers of the skin. The relationship between fluorometrically determined UV absorbance of grape skins and UV absorbance of extracted phenolics was statistically significant, but not all of the variations in absorbance by skin could be explained by phenolics. In leaves, damage during outdoor exposure was clearly enhanced by UV radiation. In grapes, sunburn, which was originally considered as a homogeneous syndrome after exposure to strong radiation, could be divided in two classes of stress reactions. One of these can be seen as strictly UV related, while the other is only enhanced by UV radiation, and occurred also under visible light conditions. Further studies investigated relations between the PLS (physiological leaf spot) syndrome occurring in fully developed leaves of barley and UV radiation. The crop varie-ties investigated showed a different sensitivity for PLS. However, acclimation to the different light conditions, determined as UV transmittance, revealed no clear difference between the cultivars. The relationship between fluorometrically determined UV absorbance of barley leaves and UV absorbance of extracted phenolics were examined. Similar as observed with V. vinifera leaves, about 80% of the variations of epidermal UV transmittance were explained by soluble phenolics. In H. vulgare, soluble phenolic compounds as identified by UV/VIS spectroscopy could be divided in two different groups of flavonoids while, in contrast to V. vinifera, soluble hydroxycinnamic acids are minor compounds in H. vulgare. HPLC profiles were similar for the two varieties of H. vulgare, and concentrations of flavonoids were almost comparable in both varieties in all experiments. These data together with UV exclusion experiments showed that PLS is not caused by UV-radiation.
KW  - Getreide
KW  - Weinrebe
KW  - Ultraviolett
KW  - Abschirmung
KW  - Flavonoide
KW  - Ultraviolett
KW  - Vitis
KW  - Gerste
KW  - Fluorimetrie
KW  - flavonoids
KW  - ultraviolet
KW  - Vitis
KW  - barley
KW  - fluorometry
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5365
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TY  - THES
A1  - Rümer, Stefan
T1  - Untersuchungen zur oxidativen Bildung von Stickstoffmonoxid in Pflanzen sowie zur Visualisierung von Stickstoffmonoxid mittels Fluoreszenzfarbstoffen
T1  - Oxidative NO formation in plants and visualisation of nitric oxide with fluorescence indicators?
N2  - Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiges, relativ stabiles Radikal, das in Pflanzen u. a. durch Reduktion aus Nitrit unter Katalyse des Enzyms Nitratreduktase gebildet wird. In tierischen Organismen wird NO dagegen über einen oxidativen Syntheseweg aus der Ami-nosäure L-Arginin katalysiert durch verschiedene Isoformen der NO-Synthasen (NOS) hergestellt. Es besitzt im tierischen System vielfältige Funktionen u. a. als Neurotransmitter sowie Blutfluss und -druck regulierendes Agens. Im Pflanzenreich werden NO u. a. Aufgaben bei der Regulierung von Spaltöffnungen, der Abwehr von Pathogenen sowie der Differenzierung der Xylemelemente zugeschrieben. Die vorliegende Arbeit verfolgte zwei Ziele: - Erforschung alternativer oxidativer Synthesewege von NO in Pflanzen und - Untersuchung der NO-Spezifität der DAF-Fluoreszenzfarbstoffe ausgehend Diskrepanzen zwischen Daten aus Floureszenzanalysen und der Gasphasen-Chemilumineszenz in früheren Arbeiten unserer Arbeitsgruppe und zahlreichen weiteren Publikationen. a) NO-Produktion aus Hydroxylaminen Hydroxylamin ist ein Zwischenprodukt bei der bakteriellen Denitrifizierung und wurde auch als Intermediat bei der Nitratreduktion in Pflanzen diskutiert. Hier wird gezeigt, dass Tabaksuspensionzellen in der Lage waren, exogenes Hydroxylamin schon in sehr niedrigen Konzentrationen (4 µM) zu NO zu oxidieren. Auch ein anderes HA-Derivat, nämlich der Hemmstoff der Alternativen Oxidase (AOX) in Mitochondrien, Salicylhydroxamsäure (SHAM), wurde zu NO oxidiert. Die Vermutung, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) könn-ten bei diesem Oxidationsprozess eine Rolle spielen, wurde überprüft: Nach Einwirkung des ROS-abbauenden Enzyms Superoxid-Dismutase (SOD) konnte aber überraschender-weise keine Verminderung, sondern eher eine Steigerung der NO-Emission beobachtet werden. Die Rolle der SOD in diesem Reaktionsprozess ist daher noch nicht verstanden. b) NO-Detektion mittels Fluoreszenzindikatoren Zur Visualisierung und Lokalisierung von NO in tierischen und pflanzlichen Zellen und Geweben (in situ) mittels mikroskopischer (LSM) oder fluorimetrischer Methoden werden Fluoreszenzfarbstoffe, z. B. DAF-2 oder DAF-FM verwendet. Diese Farbstoffe reagieren mit NO zu stark fluoreszierenden Triazol-Derivaten. Eine Situation, in der Pflanzen u. a. mit NO-Freisetzung reagieren, ist der Pathogenbefall. Wir untersuchten die Reaktion von Tabaksuspensionszellen auf den pilzlichen Elicitor Cryptogein, ein Protein des Oomyceten Phytophthora cryptogea. Im Filtrat der Zellen, die mit Cryptogein behandelt wurden, zeigte sich nach Zugabe von DAF-Farbstoffen ein starker Fluoreszenzanstieg. Um die fluoreszenzerhöhenden Stoffe zu charakterisieren, wurde das Filtrat vor der DAF-Zugabe verschiedentlich behandelt. Bei Zugabe von KCN bzw. Katalase zum Überstand, verringerte sich der Fluoreszenzanstieg. Gleichzeitige Behandlung der Zellen mit Cryptogein sowie dem NADPH-Oxidase-Inhibitor DPI unterband den Fluoreszenzanstieg im Überstand nahezu komplett. Enzym-Assays mit Amplex Rot zeigten die Anhäufung von H2O2 im Filtrat der elicitierten Zellen. Neben ROS werden von Pflanzenzellen auch Peroxidasen in den Apoplasten sekretiert, die mit Hilfe von H2O2 für eine verstärkte Quervernetzung der Zellwand sorgen. Sowohl in unbehandelten Kontrollzellen als auch in elicitierten Zellen wurde Peroxidase-Aktivität nachgewiesen. Nach Zugabe von H2O2 und DAF-2 zum Filtrat von Kontrollzellen ergab sich ein Fluoreszenzanstieg ähnlich dem im Filtrat von behandelten Zellen. Mit Hilfe eines einfachen In-vitro-Systems aus Meerettich-Peroxidase (MR-PO), Wasser-stoffperoxid (H2O2) und DAF-2 konnten noch höhere Fluoreszenzwerte erzielt werden, was die Vermutung der Fluoreszenzerhöhung ohne Anwesenheit von NO erhärtete. Um diese nicht aus einer Reaktion mit NO resultierenden DAF-Produkte näher zu charak-terisieren, wurden Trennungen mittels Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschro-matographie mit Fluoreszenzdetektion (RP-HPLC-FL) und Massenspektrometrie (UPLC-MS) durchgeführt. Dabei wurden tatsächlich zwei neue Reaktionsprodukte festgestellt, die sich eindeutig von DAF-2T unterschieden. Letzteres konnte nur bei Hinzufügen des NO-Donors DEA-NO detektiert werden. Zur Erfassung von intrazellulären Reaktionsprodukten von DAF wurden die chromatogra-phischen Trennmethoden auch auf Extrakte von mit DAF-2 DA aufgeladenen und danach elicitierten Zellen angewandt. Bei dieser Auftrennung tauchten noch mehr DAF-Reaktionsprodukte auf. Die Hauptfluoreszenz, die auch bei nicht inkubierten Zellen auf-trat, konnte auf eine Reihe sehr früh eluierender Substanzen zurückgeführt werden. Die zwei DAF-Derivate aus dem Überstand inkubierter Zellen bzw. der In-vitro-Reaktion (MR-PO+H2O2+DAF-2) tauchten jedoch überhaupt nicht auf. Vorläufige massenspektrometrische Analysen legen nahe, dass es sich bei den in Abwe-senheit von NO gebildeten zwei Verbindungen um isomere Dimere von DAF-2 handelt.
N2  - Nitric oxide is a diatomic, gaseous, relatively stable radical that is mainly synthesized via a reduction of nitrate/nitrite or via an oxidation of amino groups. The latter pathway has been attributed a major role in NO production from the amino acid L-arginine catalysed by three different isoforms of NO-synthases (NOS). In animals, NO fulfils a variety of well-known functions e. g. as neurotransmitter, blood-flow and -pressure regulating agent. In the plant kingdom, it plays a role in the regulation of stomatal movement, in the defense against pathogens and in xylogenesis. Major aims of this work were: - to search for alternative oxidative pathways for nitric oxide from reduced nitrogen compounds and - to unravel previous inconsistencies described in our group on NO production in plants as detected by gas phase chemiluminescence or by fluorescing NO specific dyes. a) NO production by oxidation of hydroxylamine (HA) Hydroxylamine was discussed as an intermediate in nitrate reduction in plants and appears conjugated to carbonyl compounds as oximes. Here it is shown that tobacco suspension cells are able to oxidize exogenous hydroxylamine to nitric oxide when applied in concen-trations as low as 4 µM. This was also observed after addition of another hydroxylamine, salicylhydroxamic acid (SHAM), which is a frequently applied inhibitor of mitochondrial Alternative Oxidase (AOX). Preliminary observations suggest that reactive oxygen species (ROS) play a role as oxidants. Addition of superoxide dismutase (SOD), an enzyme de-grading ROS, led to an even higher output of NO from hydroxylamine, which may indicate an involvement of H2O2. b) DAF-fluorescence without NO Fluorescent dyes (DAF-2, DAF-FM, DAR-4M) have been used widely to visualize NO production in tissues and single cells, mostly in connection with the LSM technique. By reaction with NO, these dyes form stable and highly fluorescing triazol-derivatives (e. g. DAF-2T). Much of the present knowledge on NO in plants is based on the use of these dyes. One important example out of many is the induction of NO production by treating plants with compounds (elicitors) provoking a hypersensitive response in specific target plants. Here, the system tobacco and the elicitor cryptogein, a peptide secreted from the oomycete Phytophthora cryptogea was used. This elicitor is specific for tobacco, and in-duces programmed cell death in tobacco suspension cells. When DAF-2 was added to a filtrate of cells preincubated with cryptogein, a strong fluo-rescence increase was observed. Addition of potassium cyanide (KCN) or catalase lowered this increase. Simultaneous treatment of cells with cryptogein and DPI, an NADPH-oxidase inhibitor, abolished fluorescence almost completely. Assays using the H2O2-sensitive dye amplex red indicated an accumulation of H2O2 in the filtrate of elicited cells. Besides ROS, plants secrete peroxidase enzymes into the apoplast which catalyze the crosslinking of cell wall polymers using H2O2. Peroxidase activity was observed both in the filtrate of control cells and cryptogein-treated cells. Addition of H2O2 and DAF-2 to the filtrate of untreated cells gave a fluorescence increase similar to that observed after addi-tion of DAF-2 to the filtrate of cryptogein-elicited cells, which was a first hint that fluores-cence could be induced without NO. An in-vitro-system consisting of horseradish-peroxidase (MR-PO), H2O2 and DAF-2 re-sulted in strong fluorescence increase, confirming that fluorescence took place even in the complete absence of NO. To further characterize suspected novel DAF-derivatives not related to NO, they were analysed by reverse-phase high-pressure liquid chromatography with fluorescence detection (RP-HPLC-FL) and mass spectrometry (UPLC-MS). Indeed, two new DAF-reaction products were discovered which could be clearly separated from DAF-2T. The reaction product of DAF-2 and NO was detected only when the NO-donor DEA-NO was added to the reaction mixture of the in-vitro-system (HR-PO + H2O2 + DAF-2), revealing three peaks, the two novel DAF-derivatives and DAF-2T. In order to elucidate intracellular reaction products formed inside DAF-2 DA preloaded cells during elicitation, extracts of suspension cells were also submitted to RP-HPLC-FL. In this case, a larger number of DAF-derivatives were found. Even in non-incubated cells, bulk fluorescence originated from a group of early eluting novel compounds. However, none of them could be matched with the two derivatives found in the cell filtrate or in vitro. Preliminary mass spectrometrical analyses suggest the two novel, highly fluorescing compounds formed in the absence of NO in vitro or the filtrate of elicited cells to represent isomeric dimers of DAF-2 which are linked via the amino-groups after reduction.
KW  - Stickstoffmonoxid
KW  - Synthese
KW  - Pflanzen
KW  - Nachweis
KW  - oxidative NO-Bildung
KW  - DAF
KW  - Fluoreszenz
KW  - Hydroxylamin
KW  - Salicylhydroxamsäure
KW  - nittric
KW  - oxide DAF
KW  - fluorescence
KW  - hydroxylamine
KW  - oxidative NO-formation
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77115
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schäfer, Barbara
T1  - Untersuchungen zur Regulation der Invertaseaktivität und zu Invertaseinhibitoren aus Pflanzenextrakten
T1  - Investigations about Changes in Activities of Invertases and about Invertase Inhibitors
N2  - Die Spaltung verschiedener Zuckerverbindungen ist ein elementarer Vorgang in allen Lebewesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Enzyme untersucht, die Saccharose, einen wichtigen Energieträger und Botenstoff, in Fructose und Glucose spalten. Sie liefert einen umfassenden Überblick saccharosespaltender Enzyme und deren Inhibitoren, der erstmals die Gebiete der β-Fructofuranosidasen und der α-Glucosidasen vereinigt. Invertasen (β-Fructofuranosidasen, Abspaltung der Fructose) spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden auf vielfältige Art und Weise reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen in der Aktivität durch verschiedene Einflüsse in vitro untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Temperaturoptima der Invertasen erstaunlich hoch liegen. Das Verhalten der getesteten alkalischen / neutralen Invertase aus Lolium temulentum unterschied sich bei vielen Tests von dem der anderen eingesetzten Invertasen. Auch in Tieren bzw. im Menschen sind saccharosespaltende Enzyme, hier bezeichnet als Sucrasen bzw. α-Glucosidasen (Abspaltung der Glucose), an vielen wichtigen Vorgängen beteiligt, etwa der Glykosilierung von Proteinen oder der Verdauung. Die humane Sucrase-Isomaltase aus dem Dünndarm ist ein Target in der Diabetestherapie. Erstmals konnte die humane Sucrase als aktive Untereinheit in der Hefe Pichia pastoris exprimiert werden. Neben den Enzymen selbst wurden das Wirkspektrum und die Wirkstärke verschiedener Inhibitoren untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass Acarbose, ein Pseudotetrasaccharid, das in der Diabetestherapie verwendet wird, auch pflanzliche Invertasen hemmt. Die in ihrer Struktur zueinander sehr ähnlichen Iminozucker DMDP, Miglitol und Calystegin B2 unterschieden sich erheblich in ihrer Hemmaktivität. DMDP ist dabei am potentesten, Miglitol führt teilweise zu einer erhöhten Invertaseaktivität und Calystegin B2 verfügt nur über ein beschränktes Hemmspektrum. Pflanzliche proteinogene Invertaseinhibitoren hemmten auch die humane Sucrase und die Hefeinvertase; wurden die Inhibitorproteine in P. pastoris exprimiert und dabei glykosiliert, hatten sie keine Hemmaktivität. Als einziger Inhibitor zeigte Miglitol der getesteten alkalischen / neutralen Invertase gegenüber ein Verhalten, das als selektiv bezeichnet werden kann, da die Hemmung mit Konzentrationen, die um den Faktor 1000 niedriger waren als bei anderen Invertasen, eintrat. Für die Suche nach neuen Inhibitoren wurden ein Screening und eine Literaturrecherche zum Thema Pflanzen in der Diabetestherapie bzw. pflanzliche Glucosidasehemmstoffe durchgeführt. Die Literaturrecherche weist darauf hin, dass eine große Anzahl an Pflanzen potentielle Wirkstoffe beinhalten könnte. Das Screening nach neuen Hemmstoffen wurde größtenteils mit Pflanzenextrakten aus der Traditionellen Chinesischen Medizin durchgeführt. Dabei wurden hemmende Extrakte entdeckt, die weiter auf ihre aktiven Komponenten hin untersucht werden sollten.
N2  - The cleavage of different sugars is a fundamental process in all living organisms. In this thesis, enzymes which cleave sucrose – an important messenger molecule and energy carrier - in glucose and fructose were analyzed. It shows a broad overview of sucrose cleaving enzymes, which for the first time, combines α-glucosidases and β-fructofuranosidases and their inhibitors. Invertases (β-fructofuranosidases, fructose split-off) play a pivotal role in plant metabolism and are regulated in varied manners. Investigations about the changes in activities of different invertase preparations by different influences were done in vitro. It could be shown that temperature optimum of invertases is impressingly high. The behavior of alkaline / neutral invertase differentiates in many tests from that of others invertases. Also in animals and human beings, sucrose cleaving enzymes, named α-glucosidase or sucrase (glucose split-off), are part of important processes like glycosilation of proteins or digestion. The human sucrase-isomaltase from small intestine is a target in diabetes therapy. As an active subunit the sucrase could be expressed in the yeast Pichia pastoris for the first time. Aside from the enzymes, the spectrum of activity and the potency of different invertase inhibitors were analyzed. It could be shown that acarbose, which is used in diabetes therapy, can also inhibit plant invertases. DMDP, miglitol and calystegine B2, structurally similar imino sugars, differ extensively in their potency. DMDP is the most potent inhibitor, Miglitol partly increases invertase activity and calystegin B2 inhibits only some enzymes. Proteinaceous invertase inhibitors inhibit humane sucrase and yeast invertase as well as plant invertases; in P. pastoris expressed and glycosylated inhibitors showed no potency. As the only inhibitor, miglitol could selectively inhibit the alkaline / neutral invertase, inhibition occured at concentrations 1000 times lower than with other invertases. The search for new invertase inhibitors comprised a screening of different extracts and a literature research dealing with plants in diabetic therapy and plant derived glucosidase inhibitors. A large number of plants with potential active ingredients were investigated. The screening for new invertase inhibitors was mainly conducted with extracts of plants from traditional chinese medicine. As result, inhibitory extracts were found which should be further investigated.
KW  - Invertase
KW  - Inhibitor
KW  - Diabetes
KW  - Pflanzen
KW  - Alpha-Glucosidase
KW  - Invertase
KW  - Inhibitor
KW  - Alpha-Glucosidase
KW  - Diabetes
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71469
ER  - 
TY  - THES
A1  - Findling, Simone
T1  - Untersuchungen zur Relevanz der reversiblen Methylierung von Jasmonsäure in Solanum lycopersicum
T1  - Analysis of the relevance of the reversible methylation of jasmonic acid in Solanum lycopersicum
N2  - Jasmonate sind wichtige zelluläre Mediatoren, die eine essentielle Rolle in der Pflanzen-entwicklung und Abwehr von biotischem und abiotischem Stress spielen. Jasmonsäure (JA) als zentrales Intermediat kann dabei auf unterschiedlichste Art und Weise metaboli-siert werden. Eine Möglichkeit der Metabolisierung ist die Veresterung der JA zu Methyljasmonat (MeJA) durch die Jasmonsäure-Carboxyl-Methyltransferase (JMT). Interessanterweise ist diese Reaktion reversibel, da die Methyljasmonatesterase (MJE) die Hydrolyse zu JA katalysiert. Obwohl die Funktion diverser Metabolite, wie die des biologisch aktivsten Metaboliten JA-Isoleucin, aufgeklärt wurde, ist die Rolle der reversiblen Methylierung noch weitestgehend unklar. Aufgrund der differenten physikochemischen Eigenschaften von JA und MeJA wird diskutiert ob MeJA von JA unterschiedliche biologische Eigenschaften aufweist und/oder als transzelluläres oder systemisches Signal fungiert. Anhand der Generierung transgener Pflanzen, in denen die Umwandlung zwischen JA und MeJA gestört ist, sollten diese Hypothesen überprüft werden. Dazu wurden Tomatenlinien hergestellt, die die Enzyme der reversiblen Methylierung (JMT, MJE) überexprimieren (JMT-OE, MJE-OE) sowie Linien, in denen durch ,,Post transcriptional gene silencing“ die MJE verringert exprimiert wird. Basierend auf MJE-RNAi-Linien, die eine reduzierte in vitro MeJA-Hydrolyseaktivität auf-weisen, sollte durch exogene Applikation von MeJA analysiert werden, ob MeJA selbst biologische Aktivitäten aufweist oder zunächst mittels MJE in JA umgewandelt werden muss. Es war kein reproduzierbarer Unterschied der Reaktion auf die MeJA-Applikation über die wässrige Phase und über die Gasphase zwischen Kontroll- und MJE-RNAi-Linien festzustellen. Um zu eruieren, ob MeJA als transzelluläres, parakrines Signal agiert, wurden die Gen-expression und das Oxylipinprofil in verwundeten Blättern der transgenen Linien unter-sucht. Ob MeJA als systemisches Signal dient, sollte anhand der Verwundung von Pfropfkombinationen aus Kontrolllinie als Unterlage und MJE-RNAi als Spross anhand der Analyse der Genexpression in distalen Bereichen festgestellt werden. Die Ergebnisse der Studien deuten daraufhin, dass MeJA weder als transzelluläres Signal noch als sys-temisches Signal bei der Verwundungsantwort agiert. Zudem kann ausgeschlossen wer-den, dass die MJE in distalen Bereichen der Pflanze in der Perzeption des systemischen Signals involviert ist. Da Jasmonate an der Abwehr von Pathogenen beteiligt sind, wurde die Empfindlichkeit gegenüber dem nekrotrophen Pilz S. sclerotiorum getestet. Alle transgenen Linien mit Veränderung der reversiblen Methylierung wiesen erhöhte Läsionsgrößen, stärkeres Pilzwachstum und erhöhte JA-Isoleucin und 12-OH-JA-Isoleucin Spiegel auf. Allerdings war keine Korrelation zwischen den erhöhten JA-Isoleucin Spiegeln und der Expression von Abwehrgenen wie PINII und JA-Biosyntheseenzymen wie AOC zu verzeichnen. Somit scheint die reversible Methylierung eine Rolle in der Pathogenabwehr gegenüber S. sclerotiorum zu spielen jedoch sind die Mechanismen, die zur erhöhten Suszeptibilität der Linien führen, noch unklar.
N2  - Jasmonates are essential cellular mediators that play an important role in development and defense of biotic and abiotic stress stimuli. Jasmonic acid (JA) as central intermedi-ate can be metabolised in different ways. One possibility is the esterification of JA via jasmonic acid carboxyl methyltransferase (JMT) to methyl jasmonate (MeJA). Interest-ingly, this reaction is reversible as methyl jasmonate esterase (MJE) is able to hydrolyse MeJA into JA. Although the function of several JA metabolites such as JA-isoleucine, the biological most active one was elucidated, the in vivo function of reversible methylation is still unknown. Because JA and MeJA harbour different physicochemical properties, MeJA is assumed to function as transcellular and/or even systemic signal. This hypothe-sis was addressed by the analysis of transgenic plants disturbed in JA and MeJA conver-sion. Tomato plants overexpressing the enzymes of the reversible methylation as well as transgenic plants with reduced MJE expression induced via post transcriptional gene silencing of MJE were generated. Based upon MJE-RNAi-lines with reduced MeJA in vitro cleaving activity, it was analysed if MeJA is biologically active per se or if it only exerts its effects after hydrolysis to JA. There was no reproducible difference between control line and MJE-RNAi-line observed in response to MeJA application by vapor and liquid phase. To evaluate the role of MeJA as transcellular or paracrine signal, wounded leaves of all transgenic lines were analysed with respect to changes in gene expression and oxylipin profile. To analyse if MeJA may act as a systemic signal, wounding experiments with grafting combinations of wildtype stock and MJE-RNAi scion were performed and distal gene expression was observed. The experimental results suggest that MeJA acts neither as transcellular nor as systemic signal. Furthermore, it can be excluded that MJE is involved in the perception of the systemic signal in distal tissues of the plant. Because jasmonates are involved in pathogen defense, the susceptibility against the necrotrophic pathogen S. sclerotiorum was also tested. All transgenic lines with alterations in reversi-ble methylation exhibit a higher lesion diameter, enhanced growth of fungi and higher JA-isoleucine and 12-OH-JA-isoleucine levels. However, there was no correlation be-tween high JA-isoleucine levels and expression of defense genes such as PINII and JA-biosynthesis genes, e.g. AOC. Hence, reversible methylation seems to be involved in the pathogen response towards S. sclerotiorum but the mechanisms responsible for the higher susceptibility are still unknown.
KW  - Jasmonsäure
KW  - Methyljasmonat
KW  - JMT
KW  - Solanum lycopersicum
KW  - MJE
KW  - Sclerotinia
KW  - Verwundung
KW  - jasmonic acid
KW  - methyl jasmonate
KW  - Solanum lycopersicum
KW  - MJE
KW  - Sclerotinia
KW  - Tomate
KW  - Sclerotinia sclerotiorum
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74595
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bonfig, Katharina Barbara
T1  - Untersuchungen zur Rolle des Kohlenhydratmetabolismus während Pflanze-Pathogen-Interaktionen und der Keimlingsentwicklung
T1  - Studies on the role of carbohydrate metabolism during plant-pathogen-interactions and seedling development
N2  - Invertasen sind Schlüsselenzyme in der Kohlenhydratverteilung und haben möglicherweise auch während einer Pathogeninfektion eine zentrale Bedeutung. In vorliegender Arbeit wurde zunächst die Regulation verschiedener Stoffwechselwege in Arabidopsis thaliana nach Infektionen mit einem virulenten oder avirulenten Stamm von Pseudomonas syringae untersucht. Mit Hilfe der Chlorophyllfluoreszenz-Bildgebung konnten räumliche und zeitliche Veränderungen der Photosynthese verfolgt werden. Verschiedene Parameter waren unterschiedlich reguliert. In beiden Interaktionen waren Effekte nur lokal um die Infektionsstellen erkennbar und qualitativ ähnlich. Unterschiede waren im zeitlichen Eintreten und Verlauf sichtbar. Die Methode schien geeignet für die sensitive, nicht-invasive Pathogenfrüherkennung vor dem Auftreten sichtbarer Symptome. Die Regulation verschiedener Gene innerhalb von Source-Sink-Übergängen und die Aktivität von Invertasen war in den beiden Interaktionen qualitativ unterschiedlich. Die Infektion mit virulenten Bakterien resultierte in einer Repression photosynthetischer Gene. Die Aktivität vakuolärer Invertasen stieg vorübergehend nach Infektion mit virulenten Bakterien an, während sie nach Infektion mit avirulenten Bakterien sank. Die Aktivität extrazellulärer Invertasen war in beiden Interaktionen reprimiert. Die erfolgreiche Generierung verschiedener Bakterienstämme von P. syringae, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, kann bei der weiteren Charakterisierung von Pflanze-Pathogen-Interaktionen helfen. Die Regulation von Invertasen erfolgt auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Um die Funktion von Invertasen in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, wurde zunächst die Regulation von Invertasen durch endogene proteinogene Invertaseinhibitoren untersucht. In Übereinstimmung mit in silico Expressionsdaten konnte durch Untersuchung von Reportergenlinien und in Northern Blot Analysen eine starke Expression von Invertaseinhibitoren in Blättern von A. thaliana festgestellt werden. Nach Applikation biotischer und abiotischer Stressfaktoren wurde diese Expression nahezu vollständig reprimiert. Die indirekte Bestimmung der Invertaseinhibitoraktivität durch Messung der Invertaseaktivität in Mischextrakten zeigte, dass diese nach einer Pathogeninfektion vollständig reprimiert war. In funktionellen Ansätzen wurden transgene Pflanzen generiert, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle induzierbarer Promotoren exprimieren. Die Induktion der Invertaseinhibitorexpression änderte die Sensitivität gegenüber verschiedenen Pathogenen nicht signifikant. In einem pharmakologischen Ansatz wurde der chemische Inhibitor Acarbose zur Hemmung der Invertaseaktivität in A. thaliana verwendet. Eine Behandlung von Blättern bei gleichzeitiger Infektion mit Bakterien verursachte eine erhöhte Sensitivität der Pflanzen gegenüber der Infektion, eine stärkere Repression verschiedener Chlorophyllfluoreszenzparameter sowie ein erhöhtes Bakterienwachstum im Vergleich zu einer Infektion mit den Bakterien allein. Keine Effekte wurden auf transkriptioneller Ebene bei der Untersuchung von Genen verschiedener Stoffwechselwege gefunden. Die Invertaseaktivität nach zusätzlicher Behandlung mit Acarbose war tendenziell niedriger als die Aktivität nach einer Pathogeninfektion alleine. Acarbose erhöhte die Spiegel an Salicylsäure unabhängig von einer Pathogeninfektion. Da das Bakterienwachstum in Mutanten des Salicylsäure-vermittelten Abwehrweges bei zusätzlicher Behandlung mit Acarbose ebenfalls erhöht war, kann eine Beteiligung dieses Abwehrweges am Acarboseeffekt bisher ausgeschlossen werden. Invertasen sind neben ihrer Beteiligung an der Abwehr für die Regulation von Entwicklungsprozessen wichtig. In einem funktionellen Ansatz mit Pflanzen, die Invertaseinhibitoren induzierbar produzieren, wurde die Funktion von Invertasen getestet. Zur Generierung spezifischer Effekte wurden die Inhibitoren unter Kontrolle synthetischer Promotoren in A. thaliana exprimiert. Unerwarteterweise war das Wachstum putativ transgener Keimlinge jedoch im 4-Blatt-Stadium arretiert. Eine Analyse der Aktivität der ß-Glucuronidase in den entsprechenden Reporterlinien zeigte eine Korrelation zwischen der Wachstumsarretierung und einer hohen Aktivität dieser Promotoren unter verschiedenen in vitro Bedingungen. Dieser negative Effekt der Invertaseinhibition auf das Keimlingswachstum wurde in transgenen Tabakpflanzen bekräftigt, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors exprimierten. Eine erfolgreiche Induktion des Promotors resultierte in einer Reduktion des Frischgewichtes der Keimlinge. Mittels in silico Expressionsdaten und Northern Blot Analysen konnte für A. thaliana eine spezifische und starke Expression verschiedener Invertaseisoformen in Keimlingen nachgewiesen werden. Diese komplementären Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Invertaseaktivität für eine normale Keimlingsentwicklung.
N2  - Invertases are key metabolic enzymes in carbohydrate partitioning which may also play an important role during pathogen infection. In this study, the regulation of different metabolic pathways in Arabidopsis thaliana plants after infection by a virulent and an avirulent strain of Pseudomonas syringae was investigated. With help of chlorophyll fluorescence imaging spatio-temporal changes in photosynthesis were monitored. The monitored chlorophyll fluorescence parameters were showing differential regulation. The effects were restricted to the vicinity of the infection site and did not spread to uninfected areas of the leaf. Qualitatively similar changes in photosynthetic parameters were observed in both interactions. Major differences between the responses to both strains were evident in the onset and time course of changes. Changes could be detected by chlorophyll fluorescence imaging before symptoms were visible by eye. In contrast to photosynthesis, the regulation of marker genes for source/sink relations and the activities of invertase isoenzymes showed qualitative differences between both interactions. Inoculation of the virulent but not the avirulent strain resulted in downregulation of photosynthetic genes and upregulation of vacuolar invertases. The activity of vacuolar invertases transiently increased upon infection with the virulent strain but decreased with the avirulent strain while extracellular invertase activity was downregulated in both interactions. As an advanced tool for the characterization of the interaction between A. thaliana and P. syringae bacteria expressing the green fluorescing protein were generated. Invertases are regulated on transcriptional and posttranscriptional level. To understand the function of invertases in plant-pathogen-interactions, the regulation of endogenous proteinaceous invertase inhibitors was investigated. According to expression profiling the analysis of reporter gene lines and Northern Blot analyses revealed a strong expression of invertase inhibitors in source leaves of A. thaliana. After application of biotic and abiotic stress factors this expression was completely repressed. Indirect determination of invertase inhibitor activity by measurement of invertase activity in mixed extracts revealed a complete repression of inhibitor activity after pathogen infection. In functional approaches transgenic plants were generated, expressing invertase inhibitor proteins under control of inducible promoters. However, no effect of the induction of inhibitor expression on the sensitivity to different pathogens could be observed so far. In a pharmacological approach acarbose war used as an invertase inhibitor. Simultaneous treatment of plants with acarbose and bacteria revealed an increased sensitivity of the plant towards the bacterial infection and a stronger repression of chlorophyll fluorescence parameters compared to plants treated with bacteria alone. No effects on photosynthesis, carbohydrate metabolism and defence could be observed on transcriptional level. A tendency of lowered invertase activity could be observed after treatment with acarbose and bacteria compared to bacterial treatment alone. Acarbose treatment enhanced the levels of salicylic acid independent of bacterial infection. The acarbose-mediated increase in sensitivity was also detectable in sid2 and cpr6 mutants indicating that the effect of acarbose is independent of the salicylic acid mediated defence pathway. Invertases are important enzymes in higher plants, which are involved in regulating developmental processes and responses to external factors. In a functional approach the role of invertases was investigated using transgenic plants ectopically expressing inhibitor proteins to decrease invertase activity. For generating specific effects, these inhibitor proteins were expressed in A. thaliana under the control of synthetic promoters consisting of tetramers of pathogeninducible elements, which were reported to yield low constitutive expression. Unexpectedly, seedling growth of putative transgenic plants was arrested at the four-leaf stage. Analysis of ß-glucuronidase activity of corresponding reporter gene lines showed a correlation of the growth arrest with high activity of these promoters in seedlings grown under tissue culture conditions. The negative effect of invertase inhibition on seedling growth was substantiated by transgenic tobacco plants expressing an invertase inhibitor under control of a tetracycline inducible promoter. Ectopic induction of the invertase inhibitor during early seedling development resulted in a reduced fresh weight of seedlings. Expression profiling and Northern Blot analyses further supported the importance of invertase in Arabidopsis thaliana seedling development. Different invertases were specifically and strongly expressed. These complementing results show that invertase activity is required for normal seedling development.
KW  - Invertase
KW  - Invertaseinhibitor
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Pseudomonas syringae
KW  - invertase
KW  - invertase inhibitor
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Pseudomonas syringae
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32488
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gueta, Ronnie
T1  - Untersuchungen zur Struktur und Funktion von Channelrhodopsinen
T1  - Structural and functional analysis of channelrhodopsins
N2  - Die zur Gruppe der mikrobiellen Rhodopsine gehörenden lichtaktivierbaren Ionenkanäle Channelrhodopsin 1 (ChR1) und Channelrhodopsin 2 (ChR2) aus dem Augenfleck von C. rheinhardtii sind Bestandteile des visuellen Systems und an der Phototaxis beteiligt. Sie bestehen aus einem zytosolisch gelegenen C Terminus, dessen Funktion noch ungeklärt ist und einem, für die Kanalaktivität verantwortlichen, N terminalen Bereich aus sieben Transmembranhelices. Der lichtsensitive Kofaktor all trans Retinal ist kovalent an einen Lysinrest (K257) der siebten Transmembranhelix gebunden. Bei einer Belichtung mit Blaulicht isomerisiert das Chromophor zur 13 cis Form, was eine Konformationsänderung und das Öffnen des Kanals zur Folge hat. Im Zuge dessen strömen ein und zweiwertige Kationen in die Zelle und eine Depolarisation findet statt. Um einen tieferen Einblick in Struktur und funktionelle Mechanismen zu bekommen, wurden Wildtyp und Mutanten von Ch1 und ChR2 heterolog in Oozyten von X. laevis exprimiert. In Bakteriorhodopsin bilden die Seitenketten von T90 und D115 eine für Stabilität und Funktion wichtige Wasserstoffbrücke aus. Durch elektrophysiologische, fluoreszenzmikroskopische und biochemische Verfahren wurden Mutanten der entsprechenden Reste in ChR2 (C128, D156) untersucht. Diese zeigten eine deutlich verlangsamte Kinetik und eine 10 bis 100fache Erhöhung der Lichtempfindlichkeit. Die identischen Auswirkungen von Mutationen beider Reste deuten auf eine Bindung mit funktioneller Bedeutung zwischen C128 und D156 hin. Im Falle von ChR2 C128T, C128A und D156A konnte der Kanal nach Anregung mit Blaulicht, durch grünes und violettes Licht vorzeitig geschlossen werden. Diese Lichtqualitäten entsprechen den Absorptionswellenlängen zweier Intermediate des Photozyklus von ChR2 (P390 und P520). Durch Veränderung des externen pH-Wertes konnten Hinweise auf eine protonenabhängige Gleichgewichtsreaktion dieser Intermediate gefunden werden. Auch in dem für Protonen höher leitfähigen ChR1 konnten Hinweise auf eine Interaktion zwischen den Resten C167 und D195 gefunden werden. Elektrische Messungen von Mutanten zeigten eine deutliche Erhöhung des Photostroms bei verhältnismäßig geringem Anstieg der Schließzeit. Der Einfluss dieser Mutationen auf die Kinetik war somit weniger ausgeprägt als bei ChR2. Einen besonderen Stellenwert unter allen Channelrhodopsin Mutanten nehmen ChR2 D156C und ChR1 D195C ein. Mit einem Photostrom von 5 µA bei ChR1 D195C und bis zu 50 µA bei ChR2 D156C konnten für diese die höchsten Photoströme aller bisher charakterisierten ChR1 bzw. ChR2 Varianten nachgewiesen werden. Durch fluoreszenzmikroskopische Quantifizierung konnte für alle im Rahmen dieser Arbeit erstellten ChR1 und ChR2 Mutanten eine erhöhte Proteinmenge sowohl in Anwesenheit als auch Abwesenheit zusätzlichen all trans Retinals während der Inkubation nachgewiesen werden. Die Fluoreszenzintensitäten korrelierten hierbei mit der Höhe der Stromamplituden und erreichten ein Maximum bei ChR2 D156C. Biochemische Experimente mit der Gesamtmembranfraktion von ChR2 exprimierenden Oozyten lieferten Hinweise auf eine dimere Quartärstruktur von Channelrhodopsinen, was durch die Kristallstruktur einer Chimäre aus ChR1 und ChR2 von (Kato et al., 2012) bestätigt wurde. Unter der Annahme, dass die Poren in den Proteomeren gebildet werden, konnte eine gegenseitige Beeinflussung der Regionen in heterodimeren Kanälen aus ChR2 Wildtyp und Mutanten aufgrund kinetischer Unterschiede bei kurzer und langer Belichtung oder der Verwendung von unterschiedlichen Lichtintensitäten nachgewiesen werden. Eine Voraussetzung für diesen Effekt ist eine synchrone Anregung beider Untereinheiten. Die Interaktion von Channelrhodopsin Untereinheiten konnte in vivo mithilfe der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation nachgewiesen werden. Dabei zeigte sich, dass die Wechselwirkung nicht nur auf identische Untereinheiten in Homodimeren beschränkt ist, sondern auch bei Heterodimeren aus verschiedenen ChR2 Untereinheiten und sogar zwischen ChR2 und ChR1 möglich ist.
N2  - The microbial type rhodopsins Channelrhodopsin 1 (ChR1) and Channelrhodopsin 2 (ChR2) are located in the eyespot of the green algae Chlamydomonas rheinhardtii. They are light activated cation channels and play an important role in phototaxis. They are comprised of a cytosolic C terminal part of unknown function and a transmembranal N terminal part responsible for channel activity. The latter consists of seven transmembrane helices and the chromophore all trans Retinal, which is bound covalently as a Schiff base to a lysine residue. When activated with blue light, the chromophore isomerizes to the 13 cis state, followed by a conformational change of the protein and opening of the channel. The resulting influx of mono and divalent cations leads to a depolarization of the cell. To get a deeper insight in structure and function of ChR1 and ChR2, wildtype and mutants have been heterologously expressed in oocytes of Xenopus laevis. In bacteriorhodopsin, a hydrogen bond between the amino acids T90 and D115 is vital for protein stability and proper pump function. Mutants of the corresponding amino acids in ChR2 (C128, D156) were generated and analyzed electrophysiologically. They displayed a significant deceleration of closing time and a 10 100fold increase in light sensitivity. The identical impact of these mutations on kinetics suggests an interaction between these residues, probably also by the formation of a hydrogen bond. In the case of ChR2 C128T, C128A and D156A closing could be accelerated via green and violet light application. These wavelengths correspond to the absorption wavelengths of the photointermediates P390 and P520 in the photocycle of ChR2. Furthermore, a possible proton-dependent equilibrium between these intermediates was identified by varying external proton concentrations. Electrophysiological analyses of C167 and D195 mutants in ChR1 hinted towards an interaction similar to the one between the homologous residues C128 and D156 in ChR2. Both, ChR1 C167 and ChR1 D195 displayed increased current amplitudes, accompanied by only a small increase in closing time. The impact of these mutations on channel kinetics was less pronounced than in ChR2. The mutants ChR2 D156C and ChR1 D195C are of particular importance. Photocurrent amplitudes of 5 µA for ChR1 and 50 µA for ChR2 at 100 mV render these mutants the ones with the highest current amplitudes of all channelrhodopsin variants characterized up till now. In comparison to wildtype channelrhodopsins, quantification by fluorescence microscopy revealed an increased protein amount in oocytes expressing ChR1 and ChR2 mutants, both in absence and presence of additional all trans Retinal during incubation. The fluorescence intensities correlated to the increased photocurrent amplitudes, reaching a maximum in the ChR2 D156C mutant. Immunoblot experiments with total membrane fractions of oocytes expressing ChR2, bacteriorhodopsin and halorhodopsin hinted towards a dimeric quartenary structure of the channel. This has been confirmed by the recently published crystal structure of a chimaeric ChR1/ChR2 protein (Kato et al., 2012). Assuming the pore in a channel dimer is formed by the protomers, interference or crosstalk between the subunits has been identified. Oocytes expressing mixtures of channelrhodopsins demonstrated differences in kinetics when illumination length and light intensity was varied. A prerequisite for this effect is a simultaneous excitation of both subunits. The interaction of channelrhodopsin-subunits in vivo has been demonstrated by bimolecular fluorescence complementation assays. It was shown, that oligomerization is not restricted to identical subunits in a homodimer but also possible between different ChR2 variants in a heterodimer and even between ChR1 and ChR2.
KW  - Ionenkanal
KW  - Chlamydomonas reinhardii
KW  - Glatter Krallenfrosch
KW  - Rhodopsin
KW  - Channelrhodopsin
KW  - Kationenkanal
KW  - Channelrhodopsin
KW  - Cation channel
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85693
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TY  - THES
A1  - Dunkel, Marcel
T1  - Untersuchungen zur Translokation und Funktion von Tandem-Poren Kaliumkanälen der TPK-Familie aus Arabidopsis thaliana
T1  - Targeting and function of Arabidopsis thaliana tandem pore potassium channels belonging to the TPK family
N2  - • Die Modellpflanze der Pflanzenphysiologen, Arabidopsis thaliana, besitzt mindestens 15 verschiedene kaliumselektive Kanäle, von denen 5 der Strukturklasse der Tandemporen-Kaliumkanäle angehören und daher TPK-Kanäle genannt werden. • Tandemporenkanäle findet man nur bei eukaryontischen Organismen. Die pflanzlichen Tandemporen Kaliumkanäle haben einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung und unterscheiden sich von den Tierischen und denen der Pilze und Einzeller. Die pflanzlichen TPK-Kanäle lassen sich wiederum in die TPK1-Unterfamilie und die TPK2-Unterfamilie unterteilen. Die weitere Evolution der TPK2-Unterfamilie von A. thaliana, TPK2, TPK3, TPK4 und TPK5, lässt sich eindeutig auf bestimmte Duplikationsereignisse im Genom von A. thaliana und dessen Ahnen zurückführen. Auch der Ein-Poren Kaliumkanal KCO3 geht sehr wahrscheinlich auf die Duplikation des TPK2 und einer anschließenden Deletion und nicht auf einen der prokaryontischen Ein-Poren-Kaliumkanal-Prototypen zurück. • Vier der A. thaliana TPK-Kanäle (TPK1, 2, 3 und 5) lokalisieren in der Vakuolenmembran, während einer, TPK4, zum großen Teil im ER, aber auch in der Plasmamembran zu finden ist. Die Translokation des TPK1 folgt dem sekretorischen Pfad vom ER, durch den Golgi und möglichen intermediären Kompartimenten hin zur Membran der lytischen Vakuole. Von entscheidender Bedeutung ist dabei der zytoplasmatische Carboxy-Terminus (CT) des TPK1. Deletionsmutanten des TPK1 CT zeigen, dass die Translokation mindestens zwei Sortierungsschritten, am Ausgang des ER und des Golgi, unterliegt. Fehlt der CT komplett bleibt der Kanal im ER. Die Sortierungssignale des TPK1 CT konnten auf die EF-Hand Domäne I eingegrenzt werden. Anschließende Punktmutationen in diesem Bereich konnten zeigen, dass TPK1 in der eigentlich für die Ca2+ Bindung zuständigen Domäne ein di-azidisches ER-Export Motiv bestehend aus Asparaginsäure, Leucin und Glutaminsäure enthält. Andere Arbeiten legen nahe, dass der Mechanismus des ER-exports von TPK1 auf der Interaktion mit COPII Vesikelhüllproteinen beruht; TPK1 also in Vesikel sortiert wird, die sich am ER abschnüren und mit dem cis-Golgi fusionieren. Der Vergleich mit anderen pflanzlichen TPK Kanälen lässt vermuten, dass TPK1 Orthologe, nicht aber die A. thaliana Homologen ein di-azidisches ER-Exportmotiv besitzen. Die Translokation des TPK3 erwies sich dementsprechend als unabhängig von dessen CT. Weitere Experimente schließen außerdem eine Beteiligung der 14-3-3 Bindung an der Translokation aus. • TPK4 ist der einzige TPK der heterolog in Xenopus Oozyten funktionell exprimiert werden kann. Wie Mutationen an einem essentiellen Aspartat (Asp86, Asp200) in der Pore zeigten, sind beide tandem repetierten Porendomänen einer Kanaluntereinheiten an der Porenbildung beteiligt. Somit formt sich TPK4 ähnlich wie die tierischen TPK-Kanäle voraussichtlich aus zwei Untereinheiten. Ein Austausch der zweiten Porendomäne von TPK4 konnte zeigen, dass TPK2, TPK3 und TPK5, mit ihrer zweiten Porendomäne und TPK4 mit seiner ersten Porendomäne den TPK4 zu einem funktionellen Kaliumkanal komplementieren können. Da keine der TPK4 Eigenschaften, außer geringfügig die relative Permeabilität für Rb+, verändert wurde, kann man absehen, dass die homologen TPK2, TPK3 und TPK5 als instantan aktivierte, spannungsunabhängige Kaliumkanäle der Vakuolenmembran fungieren. Dazu kommt wahrscheinlich ähnlich wie bei TPK1 ein 14-3-3 und Ca2+ abhängiges Öffnen und Schließen. • Weiterführende elektrophysiologische Untersuchungen am TPK4 zeigten eine Beteiligung einer transmembranen Asparaginsäure (Asp110) an der Kaliumpermeation und der schwachen Einwärtsgleichrichtung. Der Aspartatrest ist in die wassergefüllte Aussparung der zytoplasmatischen Porenhälfte orientiert. Damit kann er über ionische Wechselwirkungen sowohl Kalium in der Pore konzentrieren als auch potentielle Kanalblocker wie Mg2+ oder Polyamine binden. Die Konservierung des Aspartats unter anderem bei TPK2, TPK3 und TPK5 deutet daraufhin, dass auch die vakuolären TPK-Kanäle eine Einwärtsgleichrichtung vermitteln, die auf einem spannungsabhängigen Block von zytoplasmatischer Seite basiert. • Im Gegensatz zum zytoplasmatischen Block ist das Schließen des TPK4 durch zytoplasmatische Ansäuerung spannungsunabhängig und ist daher von einer Protonierungsreaktion abhängig. Über zahlreiche Deletionen und Chimären des TPK4 wurde der Bereich, in dem sich pH-Sensor und pH-Tor befinden, auf den Bereich zwischen transmembranen und zytoplasmatischen Domänen eingegrenzt. Darüber hinaus fungieren Histidine nicht als pH-Sensor.
N2  - • The model plant Arabidopsis harbours 15 genes encoding potassium selective channels. Five of them belong to the structural class of tandem-pore K+ channels and are therefore called TPK channels. • Blast searches revealed the occurrence of TPK channels in many eucaryots, but not in procaryots. Plant TPK channels cluster in a phylogenetic analysis and branch into a TPK1- and a TPK2-subfamily. The evolution Arabidopsis TPK2-subfamily members (TPK2, TPK3, TPK4, and TPK5) can be attributed to distinct large-scale duplication events in ancestral genomes. Further more phylogenetic analysis showed the relatedness of the one-pore potassium channel KCO3 to TPK2. • The trafficking of the four vacuolar membrane intrinsic TPK channels (TPK1, TPK2, TPK3, and TPK5) utilizes the secretory path, from the endoplasmic reticulum (ER), via Golgi apparatus and maybe intermediate compartments to the lytic vacuole. The carboxy terminus (CT) of TPK1 was critically involved in both ER and Golgi sorting steps. The minimal requirement for vacuolar localisation was the proximal CT up to the Ca2+-binding EF-hand I. Due to mutational analyses one of several di-acidic motifs consisting of aspartate, leucin, and glutamate (aa 296-298) could be identified as the essential ER-export motif. By this TPK1 likely interacts with the coat of COPII vesicles, which adopt the ER to Golgi transport. Like TPK1 the orthologs of the TPK1-subfamily, but not the Arabidopsis homologs, exhibit the same di-acidic motif. In agreement vacuolar trafficking of TPK3 was independent of its CT. • TPK4 is the solely plasma membrane integral AtTPK channel and thus its currents can be recorded at the plasma membrane of Xenopus leavis oocytes. Mutation of in plant TPK channels perfectly conserved pore aspartates (D86N; D200N) knock-out TPK4 channel function and suggest a dimeric assembly similar to that of animal tandem-pore channels. Employing TPK4 as matrix for the expression of the pore domains of the vacuolar TPKs in Xenopus oocytes, I could show the capability of TPK2, TPK3 and TPK5 to complement TPK4. Therefore these channels probably form instantaneous, voltage-independent and potassium selective channels in the vacuolar membrane. Existence of one 14-3-3 binding motif each and one EF-hand (except TPK5) implicates Ca2+ and 14-3-3 dependent activation of those channels like seen for TPK1. • Further combination of structural, mutational and electrophysiological analyses led to the identification of another pore aspartat (Asp 110) essential for the potassium permeation and responsible for the inward rectification. The charged side chain of this Asp 110 faces the water cavity and thus could concentrate and coordinate potassium in the pore as well as interact with cationic blockers like e.g. Mg2+ or polyamine. Again, conservation among the Arabidopsis TPK2-subfamily members suggests that the vacuolar TPKs (except TPK1) are regulated by cytoplasmic blockers and exhibit weak inward rectifiying properties, too. • In contrast to inward rectification current reduction due to cytoplasmic acidification is voltage-independent and thus likely protonation dependent. Due to chimera and deletion mutants of TPK4 the possible sites of the pH-Sensor as well as the gate could be narrowed down to a few residues in the transition zone of transmembrane and cytoplasmic domains, but the essential residues remain elusive.
KW  - Vakuole
KW  - Translokation
KW  - Endoplasmatisches Retikulum
KW  - Kaliumkanal
KW  - TPK
KW  - KCO
KW  - ER-Export
KW  - diazidisches Motiv
KW  - DEVC
KW  - particle bombardment
KW  - double electrode voltage clamp
KW  - targeting
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34743
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Kunz, Tobias C.
A1  - Götz, Ralph
A1  - Gao, Shiqiang
A1  - Sauer, Markus
A1  - Kozjak-Pavlovic, Vera
T1  - Using Expansion Microscopy to Visualize and Characterize the Morphology of Mitochondrial Cristae
JF  - Frontiers in Cell and Developmental Biology
N2  - Mitochondria are double membrane bound organelles indispensable for biological processes such as apoptosis, cell signaling, and the production of many important metabolites, which includes ATP that is generated during the process known as oxidative phosphorylation (OXPHOS). The inner membrane contains folds called cristae, which increase the membrane surface and thus the amount of membrane-bound proteins necessary for the OXPHOS. These folds have been of great interest not only because of their importance for energy conversion, but also because changes in morphology have been linked to a broad range of diseases from cancer, diabetes, neurodegenerative diseases, to aging and infection. With a distance between opposing cristae membranes often below 100 nm, conventional fluorescence imaging cannot provide a resolution sufficient for resolving these structures. For this reason, various highly specialized super-resolution methods including dSTORM, PALM, STED, and SIM have been applied for cristae visualization. Expansion Microscopy (ExM) offers the possibility to perform super-resolution microscopy on conventional confocal microscopes by embedding the sample into a swellable hydrogel that is isotropically expanded by a factor of 4–4.5, improving the resolution to 60–70 nm on conventional confocal microscopes, which can be further increased to ∼ 30 nm laterally using SIM. Here, we demonstrate that the expression of the mitochondrial creatine kinase MtCK linked to marker protein GFP (MtCK-GFP), which localizes to the space between the outer and the inner mitochondrial membrane, can be used as a cristae marker. Applying ExM on mitochondria labeled with this construct enables visualization of morphological changes of cristae and localization studies of mitochondrial proteins relative to cristae without the need for specialized setups. For the first time we present the combination of specific mitochondrial intermembrane space labeling and ExM as a tool for studying internal structure of mitochondria.
KW  - Expansion microscopy
KW  - mitochondria
KW  - cristae
KW  - structured illumination microscope
KW  - ultrastructure
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208296
SN  - 2296-634X
VL  - 8
ER  - 
TY  - THES
A1  - Beck, Sebastian
T1  - Using optogenetics to influence the circadian clock of \(Drosophila\) \(melanogaster\)
T1  - Die Verwendung der Optogenetik zur Beeinflussung der circadianen Uhr von \(Drosophila\) \(melanogaster\)
N2  - Almost all life forms on earth have adapted to the most impactful and most predictable recurring change in environmental condition, the cycle of day and night, caused by the axial rotation of the planet. As a result many animals have evolved intricate endogenous clocks, which adapt and synchronize the organisms’ physiology, metabolism and behaviour to the daily change in environmental conditions. The scientific field researching these endogenous clocks is called chronobiology and has steadily grown in size, scope and relevance since the works of the earliest pioneers in the 1960s.
The number one model organism for the research of circadian clocks is the fruit fly, Drosophila melanogaster, whose clock serves as the entry point to understanding the basic inner workings of such an intricately constructed endogenous timekeeping system. In this thesis it was attempted to combine the research on the circadian clock with the techniques of optogenetics, a fairly new scientific field, launched by the discovery of Channelrhodopsin 2 just over 15 years ago. Channelrhodopsin 2 is a light-gated ion channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. In optogenetics, researches use these light-gated ion channels like Channelrhodopsin 2 by heterologously expressing them in cells and tissues of other organisms, which can then be stimulated by the application of light. This is most useful when studying neurons, as these channels provide an almost non-invasive tool to depolarize the neuronal plasma membranes at will. The goal of this thesis was to develop an optogenetic tool, which would be able to influence and phase shift the circadian clock of Drosophila melanogaster upon illumination. A phase shift is the adaptive response of the circadian clock to an outside stimulus that signals a change in the environmental light cycle. An optogenetic tool, able to influence and phase shift the circadian clock predictably and reliably, would open up many new ways and methods of researching the neuronal network of the clock and which neurons communicate to what extent, ultimately synchronizing the network.
The first optogenetic tool to be tested in the circadian clock of Drosophila melanogaster was ChR2-XXL, a channelrhodopsin variant with dramatically increased expression levels and photocurrents combined with a prolonged open state. The specific expression of ChR2-XXL and of later constructs was facilitated by deploying the three different clock-specific GAL4-driver lines, clk856-gal4, pdf-gal4 and mai179-gal4. Although ChR2-XXL was shown to be highly effective at depolarizing neurons, these stimulations proved to be unable to significantly phase shift the circadian clock of Drosophila. The second series of experiments was conducted with the conceptually novel optogenetic tools Olf-bPAC and SthK-bPAC, which respectively combine a cyclic nucleotide-gated ion channel (Olf and SthK) with the light-activated adenylyl-cyclase bPAC. These tools proved to be quite useful when expressed in the motor neurons of instar-3 larvae of Drosophila, paralyzing the larvae upon illumination, as well as affecting body length. This way, these new tools could be precisely characterized, spawning a successfully published research paper, centered around their electrophysiological characterization and their applicability in model organisms like Drosophila. In the circadian clock however, these tools caused substantial damage, producing severe arrhythmicity and anomalies in neuronal development. Using a temperature-sensitive GAL80-line to delay the expression until after the flies had eclosed, yielded no positive results either. The last series of experiments saw the use of another new series of optogenetic tools, modelled after the Olf-bPAC, with bPAC swapped out for CyclOp, a membrane-bound guanylyl-cyclase, coupled with less potent versions of the Olf. This final attempt however also ended up being unsuccessful. While these tools could efficiently depolarize neuronal membranes upon illumination, they were ultimately unable to stimulate the circadian clock in way that would cause it to phase shift. 
Taken together, these mostly negative results indicate that an optogenetic manipulation of the circadian clock of Drosophila melanogaster is an extremely challenging subject. As light already constitutes the most impactful environmental factor on the circadian clock, the combination of chronobiology with optogenetics demands the parameters of the conducted experiments to be tuned with an extremely high degree of precision, if one hopes to receive positive results from these types of experiments at all.
N2  - Nahezu alle Lebewesen der Erde haben sich an den Tag-Nacht-Zyklus angepasst, die einflussreichste und verlässlichste wiederkehrende Veränderung der Umwelt-bedingungen, verursacht durch die axiale Rotation des Planeten. Daraus resultierend haben viele Tiere komplizierte innere Uhren entwickelt, welche ihre Physiologie, ihren Stoffwechsel und ihr Verhalten an die tägliche Veränderung der natürlichen Bedingungen anpassen. Das Wissenschaftsfeld, das sich der Erforschung dieser inneren Uhren widmet, wird Chronobiologie genannt und hat seit der Arbeit der ersten Pioniere ab 1960 stetig an Größe und Relevanz gewonnen. Der prominenteste Modellorganismus für die Erforschung der circadianen Uhr ist Drosophila melanogaster, deren Uhr als Ansatzpunkt dient, die grundlegenden Vorgänge eines derart komplexen, endogenen Taktsystems zu verstehen. 
In dieser Thesis wurde versucht die Forschung an der circadianen Uhr mit den Techniken der Optogenetik zu kombinieren, eines jungen Forschungsfeldes, welches durch die Entdeckung von Channelrhodpsin 2 vor über 15 Jahren eröffnet wurde. Channelrhodopsin 2 ist ein Licht-gesteuerter Ionenkanal, der in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii entdeckt wurde. In der Optogenetik nutzen Forscher diese Licht-gesteuerten Ionenkanäle, indem sie sie in den Zellen anderer Organismen exprimieren, welche dann durch Licht stimuliert werden können. Dies ist besonders nützlich bei der Untersuchung von Neuronen, da diese Kanäle ein nahezu nicht-invasives Werkzeug zur Depolarisation neuronaler Membranen bieten. Das Ziel dieser Thesis war es, ein optogenetisches Werkzeug zu entwickeln, welches die circadiane Uhr von Drosophila melanogaster durch Licht manipulieren und deren Phase verschieben kann. Eine Phasenverschiebung ist die adaptive Antwort der circadianen Uhr auf einen äußeren Reiz, welcher eine Veränderung des natürlichen Lichtzyklus signalisiert. Ein optogenetisches Werkzeug, das die Phase der inneren Uhr verlässlich verschieben kann, würde viele neue Möglichkeiten zur Erforschung des neuronalen Uhrnetzwerks eröffnen und wie die Neuronen miteinander kommunizieren um das Netzwerk zu synchronisieren. 
Das erste optogenetische Werkzeug das in der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster getestet wurde war „ChR2-XXL“, eine Channelrhodopsin-Variante mit erhöhter Expression und Photoströmen, gepaart mit einem verlängerten geöffneten Zustand. Die spezifische Expression von ChR2-XXL und auch die späterer Konstrukte wurde durch die Verwendung der drei Uhr-spezifischen GAL4-Treiberlinien clk856-gal4, pdf-gal4 und mai179-gal4 bewerkstelligt. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass ChR2-XXL höchst effektiv die Depolarisierung von Neuronen bewirkt, waren diese Stimulationen jedoch nicht in der Lage die Phase der circadianen Uhr von Drosophila signifikant zu verschieben. Die zweite Serie an Versuchen wurde mit den konzeptionell neuartigen optogenetischen Werkzeugen Olf-bPAC und SthK-bPAC durchgeführt, welche jeweils einen durch zyklische Nukleotide gesteuerten Ionenkanal (Olf und SthK) mit der Licht-gesteuerten Adenylatcyclase bPAC kombinieren. Diese Werkzeuge erwiesen sich als äußert nützlich, solange sie in den Motoneuronen von Drosophila-Larven im dritten Larvenstadium exprimiert wurden, wo sie bei Beleuchtung die Larven sowohl paralysierten, als auch deren Körperlänge beeinflussten. Auf diese Weise konnten diese neuen Werkzeuge präzise charakterisiert werden, was in der erfolgreichen Veröffentlichung eines Forschungsartikels mündete, welcher hauptsächlich von der elektrophysiologischen Charakterisierung der Werkzeuge handelte und von deren Anwendungsmöglichkeiten in Modellorganismen wie Drosophila. In der circadianen Uhr verursachten diese Werkzeuge jedoch substantielle Schäden und produzierten schwere Arrhythmie und Anomalien in der neuronalen Entwicklung. Die Verwendung einer temperatur-sensitiven GAL80-Linie um die Expression zu verzögern, erzeugte ebenfalls keinerlei positive Ergebnisse. Für die letzte Serie an Experimenten wurde eine weitere Reihe neuer optogenetischer Werkzeuge verwendet, orientiert an Olf-bPAC und SthK-bPAC, wobei bPAC durch die membrangebundene Guanylatcyclase „CyclOp“ ausgetauscht wurde, welche wiederrum mit weniger wirkstarken Olf-Varianten kombiniert wurde. Dieser letzte Ansatz scheiterte jedoch ebenfalls. Obwohl diese neuen Werkzeuge in der Lage waren die Neuronenmembran bei Beleuchtung effektiv zu depolarisieren, vermochten sie es letztendlich nicht eine Phasenverschiebung zu bewirken.
Zusammengenommen zeigen diese überwiegend negativen Ergebnisse, dass die optogenetische Manipulation der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster ein extrem anspruchsvolles Thema ist. Da Licht bereits ohnehin den einflussreichsten Umweltfaktor für die circadiane Uhr darstellt, verlangt die Kombination von Chronobiologie und Optogenetik eine extrem präzise Feinabstimmung der Versuchsparameter, um überhaupt darauf hoffen zu dürfen, positive Ergebnisse mit derlei Versuchen zu erzeugen.
KW  - Chronobiologie
KW  - Optogenetik
KW  - Taufliege
KW  - Optogenetics
KW  - Chronobiology
KW  - Channelrhodopsin
KW  - Drosophila melanogaster
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184952
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Böhm, J.
A1  - Scherzer, S.
A1  - Shabala, S.
A1  - Krol, E.
A1  - Neher, E.
A1  - Mueller, T. D.
A1  - Hedrich, R.
T1  - Venus flytrap HKT1-type channel provides for prey sodium uptake into carnivorous plant without conflicting with electrical excitability
JF  - Molecular Plant
N2  - The animal diet of the carnivorous Venus flytrap, Dionaea muscipula, contains a sodium load that enters the capture organ via an HKT1-type sodium channel, expressed in special epithelia cells on the inner trap lobe surface. DmHKT1 expression and sodium uptake activity is induced upon prey contact. Here, we analyzed the HKT1 properties required for prey sodium osmolyte management of carnivorous Dionaea. Analyses were based on homology modeling, generation of model-derived point mutants, and their functional testing in Xenopus oocytes. We showed that the wild-type HKT1 and its Na\(^+\)- and K\(^+\)-permeable mutants function as ion channels rather than K\(^+\) transporters driven by proton or sodium gradients. These structural and biophysical features of a high-capacity, Na\(^+\)-selective ion channel enable Dionaea glands to manage prey-derived sodium loads without confounding the action potential-based information management of the flytrap.
KW  - sodium channel
KW  - HKT1
KW  - Dionaea muscipula
KW  - action potential
KW  - glands
KW  - sodium uptake
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189803
VL  - 9
IS  - 3
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wittek, Anke
T1  - Vergleichende elektrophysiologische Untersuchungen zweier Saccharose/H +-Symporter, ZmSUT1 (Zea mays) und UmSrt1 (Ustilago maydis)
T1  - Comparative electrophysiological studies of two suc/H+-symporter ZmSUT1 (Zea mays) and UmSrt1 (Ustilago maydis)
N2  - Bei der Betrachtung des Pathosystems Ustilago maydis/Zea mays kommen sich Proteine unterschiedlicher Organismen sehr nahe. Die derzeitige Hypothese zur lokalen Szenerie in der ausgebildeten Interaktionszone von Pflanze und Pilz spricht zwei SUC-Transportern dabei wichtige Rollen in der Pflanze/Pilz Interaktion zu. UmSrt1, der erste beschriebene pilzliche SUC-Transporter aus dem Maispathogen Ustilago maydis (Wahl et al., 2010) und ZmSUT1, der aus Zea mays stammende low affinity SUC-Transporter (Carpaneto et al., 2005) werden als Gegenspieler im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC beschrieben (Wahl et al., 2010).
ZmSUT1 ist in der Plasmamembran der Geleitzellen lokalisiert und dort für die Beladung des Phloems mit SUC aus dem Apoplasten zuständig. UmSrt1, für den eine Lokalisation in der Plasmamembran in Hefen gezeigt werden konnte, sorgt als „high affinity“ Transporter mit dem Import extrazellulärer SUC für die Kohlenhydratversorgung der pilzlichen Entwicklung und Ernährung (Wahl et al., 2010). 

Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren vergleichende elektrophysiologische Charakterisierungen der SUC-Transporteigenschaften von ZmSUT1 und UmSrt1. Durch heterologe Expression der Proteine in Xenopus Oozyten und anschließende Messungen unter Verwendung der DEVC-Technik wurden die Eigenschaften des SUC-Transports beider SUC-Transporter im Hinblick auf ihre Konzentrations-, pH-, Spannungsabhängigkeit, sowie auf die Substratspezifität hin untersucht. Diese vergleichenden Studien zur Charakterisierung beider Transportproteine ergaben ihren physiologischen Aufgaben entsprechende Unterschiede. ZmSUT1 konnte ein Verhalten als „low affinity/high capacity“ Transporter mit Affinitäten gegenüber SUC im millimolaren Bereich mit einer spannungsunabhängigen Transportaktivität bestätigt werden. Zudem konnte die Transportaktivität als stark H+-abhängig beschrieben werden (Carpaneto et al., 2005), deren Optimum  nahe des physiologischen Bereichs des Apoplasten bestimmt werden konnte. Des Weiteren wurden Untersuchungen zur Substratspezifität angefertigt, die ZmSUT1 eindeutig eine Typ-II SUT Zugehörigkeit (Sivitz et al., 2005; Reinders et al., 2006; Sun et al., 2010) mit einem engen Substratspektrum belegen.
Für UmSrt1 dagegen wurde ein Transportverhalten als „high affinity/low capacity“ Transporter mit höheren Affinitäten gegenüber SUC im mikromolaren Bereich ermittelt (Wahl et al., 2010). Darüber hinaus beschreiben die Ergebnisse dieser Arbeit eine weitestgehend H+-unabhängige Transportaktivität in einem weiten pH-Wert Bereich. Im Profil der Substratspezifität zeigte sich neben SUC als primärem Substrat ein eher unspezifischer Transport weiterer Mono-, Di- und Trisaccharide. Die postulierte SUC-Spezifität von UmSrt1 (Wahl et al., 2010) konnte mit den vorliegenden Ergebnissen nicht bestätigt werden. Mit einem effektivem Import von SUC mittels UmSrt1 in den Pilz umgeht U. maydis die Hydrolyse von SUC im pflanzlichen Apoplasten und damit die Bildung extrazellulärer Glukose, die ein Signal in der pflanzlichen Pathogenabwehr darstellt (Herbers et al., 1996b; Ehness et al., 1997; Kocal et al., 2008). Somit scheint es für Ustillago maydis möglich zu sein, eine von der Wirtspflanze Zea mays weitestgehend „unbemerkte“ Aufnahme von Kohlenhydraten über einen breiten pH-Wert Bereich bewerkstelligen zu können. Die vielfach höheren Affinitäten gegenüber SUC und H+ verschaffen UmSrt1 im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC einen klaren Vorteil gegenüber ZmSUT1. Diese Daten deuten darauf hin, dass U. maydis auch unter Stressbedingungen der Pflanze und damit resultierenden Schwankungen der H+-Konzentrationen in der Lage ist, den SUC-Import für seine eigene Ernährung sicher zu stellen.

Das Gebiet posttranslationaler Modifikationen von SUC-Transportern ist weitestgehend unerforscht. In planta Versuche deuteten darauf hin, dass Redox-aktive Substanzen den Zuckertransport beeinflussen. Im Oozytensystem wurde deshalb die Aktivität von ZmSUT1 in Anwesenheit der Redox-aktiven Substanzen GSH, GSSG, H2O2 und DTT getestet. Der geringfügige Einfluss dieser Substanzen auf SUC-induzierte Ströme von ZmSUT1 deuten jedoch darauf hin, dass SUC-Transporter nicht ein direktes Ziel von Redox-Veränderungen darstellen. 

Um die Struktur des pflanzlichen SUC-Transporters ZmSUT1 näher zu beleuchten und die an der Bindung von SUC involvierten Aminosäuren zu identifizieren, wurde auf der Basis der bereits bekannten Struktur von LacY aus E.coli, ebenfalls einem Vertreter der MFS, ein 3D-Modell für ZmSUT1 erstellt. Die AS, die in LacY an der Bindung des Substrats beteiligt sind, wurden bereits identifiziert (Vadyvaloo et al., 2006). Darauf aufbauend wurden im Rahmen einer Mutagenesestudie gezielt AS im Protein ZmSUT1 ausgewählt, die in verwandten SUC-Transportern konserviert und in homolgen Positionen zu den in LacY bereits identifizierten AS vorliegen. In diesen ausgewählten Positionen wurden mittels gerichteter Mutagenese acht Mutanten generiert. Die elektrophysiologische Charakterisierung dieser ZmSUT1-Mutanten identifizierte zwei Mutanten, die in der SUC-/H+-Translokation gestört waren sowie zwei WT-ähnliche. Es konnten vier Mutanten mit erniedrigten Affinitäten gegenüber SUC identifiziert werden, von denen zwei zusätzlich Veränderungen in ihrer Substratspezifität aufweisen. Diese vier AS werden als mögliche Kandidaten angesehen, an der Bindung und/oder Translokation von SUC beteiligt zu sein.
N2  - Within the Ustilago maydis/Zea mays pathosystem suc transport proteins of different organisms are coming close to each other and compete for sugar in the plant apoplast. It could be shown that two suc transport proteins play an important role in the plant/fungal interaction-zone. UmSrt1, the first described fungal suc-transporter of Ustilago maydis (Wahl et al., 2010), and ZmSUT1, a low affinity transporter from Zea mays (Carpaneto et al., 2005) are thought to have the role of opposing players in extracellular suc-transport (Wahl et al., 2010).
ZmSUT1 is localized in the plasma membrane of companion cells and there it is responsible for loading the phloem with suc from the apoplast. The high affinity transporter UmSrt1, whose localization in the yeast plasma membrane has been shown, ensures the carbohydrate supply needed for fungal growth and development by importing extracellular suc (Wahl et al., 2010).

The topic of this dissertation is an electrophysiological characterization of the suc-transport performance of ZmSUT1 and UmSrt1 in terms of concentration-, pH- and voltage-dependence as well as substrate specificity. These characterizations have been measured by the heterologous expression of the proteins in Xenopus oocytes and subsequent measurements via DEVC-technique. The results of these comparative studies characterize both transport proteins and present differences originating from their physiological responsibilities. ZmSUT1 was shown to be a „low affinity/high capacity“ transporter with affinities for suc and H+ in millimolar ranges and a voltage-independent transport activity. A strong H+-dependent transport activity had been shown by Carpaneto et al. (2005). This dissertation adds the finding that the optimum corresponds with the physiological environment of the apoplast. Further experiments regarding substrate specificity of ZmSUT1 have been conducted and show clearly that this protein belongs to the type-II SUT`s (Sivitz et al., 2005; Reinders et al., 2006; Sun et al., 2010; Sun et al., 2012) with a narrow spectrum of selectivity. 
On the other hand, for UmSrt1 a „high affinity/low capacity“ performance with values for suc affinity in micromolar ranges could be confirmed (Wahl et al., 2010). Furthermore the results of this dissertation show a H+-independent transport activity over a broad pH range. In addition to suc as the primary substrate, a broad substrate specificity involving mono-, di, and trisaccharides was shown for UmSrt1. The postulated high suc specificity for UmSrt1 (Wahl et al.) could not be confirmed. Efficient import of suc into the fungus, U. maydis seem to avoid extracellular glucose production by suc hydrolysis and therewith plant defence responses (Herbers et al., 1996b; Ehness et al., 1997; Kocal et al., 2008). For U. maydis it seems to be possible to import carbohydrates in an undetected way by UmSrt1 over a broad pH range. UmSrt1 exhibits high affinities for suc and H+, which leads to a more efficient transport of sugar compared to ZmSUT1. Thus U. maydis is able to import suc for its own feeding even under stress conditions when oscillating apoplastic H+-concentrations may occur.

Up to now the posttranslational modifications of suc-transporters are nearly unexplored. In planta it was shown that redox-active substances reduce the sugar import markedly. To test whether suc-transporters are regulated by redox-active substances, such as GSH, GSSG, H2O2 and DTT, we expressed ZmSUT1 in oocytes and monitored its activity in response to the latter substances. Since ZmSUT1 activity was only weakly influenced by redox-active substances, the redox-status of plant cells seem not to regulate SUC-transporter directly.

In order to examine the structure of the plant suc-transporter ZmSUT1 and further characterize the suc bindingsite by identification of involved amino acids, a 3-D model was prepared. The basis of the 3-D model was the known structure of LacY from E. coli, which also is an MFS-member. The amino acids, which in LacY are responsible for substrate binding, have already been identified (Vadyvaloo et al., 2006). According to the model, amino acids in homologous positions to those identified in LacY were selected for a mutagenesis study of ZmSUT1. Mutations were introduced in selected positions by targeted mutagenesis and eight mutants were generated. The results of electrophysiological characterization of the mutants showed two mutants with disturbance in suc-/H+-translocation and two others with a WT-like transport profile. Furthermore four mutants with modified affinity for suc have been identified. Whilst all of these four mutants show a lower affinity for suc, two of them additionally showed a modified profile in their substrate specificity. These four mutants are considered to be possible candidates regarding the involvement of theses amino acids in binding and translocation of suc.
KW  - Saccharose
KW  - corn
KW  - Mais
KW  - Ustilago zeae
KW  - sucrose
KW  - transporter
KW  - Stofftransport <Biologie>
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85279
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lu, Jinping
A1  - Dreyer, Ingo
A1  - Dickinson, Miles Sasha
A1  - Panzer, Sabine
A1  - Jaślan, Dawid
A1  - Navarro-Retamal, Carlos
A1  - Geiger, Dietmar
A1  - Terpitz, Ulrich
A1  - Becker, Dirk
A1  - Stroud, Robert M.
A1  - Marten, Irene
A1  - Hedrich, Rainer
T1  - Vicia faba SV channel VfTPC1 is a hyperexcitable variant of plant vacuole two pore channels
JF  - eLife
N2  - To fire action-potential-like electrical signals, the vacuole membrane requires the two-pore channel TPC1, formerly called SV channel. The TPC1/SV channel functions as a depolarization-stimulated, non-selective cation channel that is inhibited by luminal Ca\(^{2+}\). In our search for species-dependent functional TPC1 channel variants with different luminal Ca\(^{2+}\) sensitivity, we found in total three acidic residues present in Ca\(^{2+}\) sensor sites 2 and 3 of the Ca\(^{2+}\)-sensitive AtTPC1 channel from Arabidopsis thaliana that were neutral in its Vicia faba ortholog and also in those of many other Fabaceae. When expressed in the Arabidopsis AtTPC1-loss-of-function background, wild-type VfTPC1 was hypersensitive to vacuole depolarization and only weakly sensitive to blocking luminal Ca\(^{2+}\). When AtTPC1 was mutated for these VfTPC1-homologous polymorphic residues, two neutral substitutions in Ca\(^{2+}\) sensor site 3 alone were already sufficient for the Arabidopsis At-VfTPC1 channel mutant to gain VfTPC1-like voltage and luminal Ca\(^{2+}\) sensitivity that together rendered vacuoles hyperexcitable. Thus, natural TPC1 channel variants exist in plant families which may fine-tune vacuole excitability and adapt it to environmental settings of the particular ecological niche.
KW  - A. thaliana
KW  - Brassicaceae
KW  - Fabaceae
KW  - pore
KW  - potassium channel
KW  - voltage gating
KW  - vacuolar calcium sensor
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350264
VL  - 12
ER  -