TY - THES A1 - Johne, Julia T1 - Pathologische Aktivierung des Gerinnungsfaktors XII - Heparin-Protamin-Komplikationen T1 - Pathological activation of the coagulation factor XII - adverse effects of heparin-protamine N2 - Protamin antagonisiert die antikoagulierende Wirkung von Heparin. Nach intravenöser Protaminapplikation treten als häufige unerwünschte Wirkungen ein systemischer Blutdruckabfall, Herzfrequenzabfall sowie eine Erhöhung des pulmonalarteriellen Widerstandes auf. Die Protamin-assoziierten Nebenwirkungen sind zum Teil lebensbedrohlich. Der ihnen zugrunde liegende Mechanismus wurde in der vorliegenden Arbeit auf Zellkultur- und Gesamttierebene analysiert sowie mögliche Therapieoptionen aufgezeigt. Heparin-Protamin-Komplexe aktivieren auf Endothelzellen den Blutgerinnungsfaktor XII. Aktiver Faktor XII startet über sein Substrat Plasmakallikrein die Freisetzung des Peptidhormons Bradykinin aus hochmolekularem Kininogen. Funktions-inhibierende Antikörper oder pharmakologische Inhibitoren von Plasmakallikrein oder Faktor XII blockierten die Heparin-Protamin induzierte Bradykininbildung auf Zellen. Stickstoffmonoxid-spezifische Fluorophore zeigten, dass Bradykinin-Bindung an Kinin B2 Rezeptoren die endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase aktiviert. B2 Rezeptorantagonisten blockierten die Heparin-Protamin induzierte Stickstoff-monoxidbildung. Die intravenöse Infusion von Protamin in heparinisierte Wildtypmäuse senkte den systemischen Blutdruck und die Herzfrequenz. Im Gegensatz dazu waren Faktor XII und B2 Rezeptor Gen-defiziente Mäuse oder Tiere, die Faktor XII Inhibitoren oder B2 Rezeptorantagonisten infundiert bekamen, vor Heparin-Protamin-Effekten geschützt. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Heparin-Protamin-Komplikationen durch eine Faktor XII-getriebene Bradykininbildung verursacht werden. Eine Blockade der Bradykininbildung oder -wirkung eröffnet eventuell eine Möglichkeit, die Heparin-Protamin-Nebenwirkungen auch beim Patienten zu therapieren. N2 - Protamine is the antidot for anticoagulant effects of heparin. Intravenous application of protamine may cause systemic hypotension, heart rate decrease and increase in pulmonary pressure. Adverse effects associated with protamine are common and potentially life-threatening. This work characterizes the pathomechanism of heparin-protamine-effects in cell culture and in transgenic mice and suggests therapeutic options to block the adverse effects. Heparin-protamine-complexes activate blood coagulation factor XII on endothelial cells. Active factor XII initiates the generation of the vasoactive peptide hormone bradykinin from high molecular weight kininogen by plasmakallikrein action. Antibodies or low molecular weight inhibitors that interfere with factor XII or plasmakallikrein activity blocked heparin-protamine-induced bradykinin effects on cells. Nitric oxide-specific dyes revealed that bradykinin-binding to kinin B2 receptors activates the endothelial nitric oxide synthase. B2 receptor antagonists interfered with heparin/protamine-driven nitric oxide generation. Intravenous application of protamine into heparinized wildtype mice reduced systemic blood pressure and heart rate. Factor XII or B2 receptor deficient mice were protected from heparin-protamine-effects. Consistently, pharmacological targeting of B2 receptors or factor XII inhibited protamine associated cardiovascular effects in heparinized wildtype mice. Together, this work demonstrates that heparin-protamine-adverse effects are due to factor XII activation that culminates in the generation of bradykinin. Inhibition of bradykinin formation or signaling may offer novel strategies to block adverse heparin-protamin-effects in patients. KW - Blutgerinnung KW - Stickstoffmonoxid KW - Gerinnungsfaktor XII KW - Bradykinin KW - Protamin KW - Kontaktphasensystem KW - Endothel KW - Protamine KW - contact activation system KW - endothelium Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30311 ER - TY - THES A1 - Jurak Begonja, Antonija T1 - NO/cGMP and ROS Pathways in Regulation of Platelet Function and Megakaryocyte Maturation T1 - NO/cGMP und ROS Singnalwege in Regulation der Plättchen Funktion und Megakaryozyten Entwicklung N2 - Blutplättchen spielen unter physiologischen Bedingungen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der Hämostase. So verhindern sie ein andauerndes Bluten von Wunden, indem sie in Blutgefässen zwischen normalen Zellen des Endothels und beschädigten Bereichen unterscheiden und sich dort gezielt anheften können. Das Zusammenspiel der Plättchenagonisten und den dazugehörigen Rezeptoren wird durch intrazelluläre Signalmoleküle kontrolliert, die die Aktivierung der Blutplättchen regulieren. Äusserst wichtige intrazellulare Signalmoleküle stellen dabei die zyklischen Nukleotide cGMP und cAMP dar, die bei der Hemmung der Plättchen beteiligt sind. Die Bildung von cGMP und cAMP in den Blutplättchen wird durch die aus dem Endothel freigesetzten Moleküle NO und Prostacyclin (PGI2) stimuliert, die ihrerseits Blutplättchen hemmen, indem sie Proteinkinase G (PKG) und Proteinkinase A (PKA) aktivieren. Neuerdings wird vorgeschlagen, dass es sich bei ROS („reactive oxygen species“) um einen neuen Modulator bei der Signaltransduktion zwischen verschiedenen Zelltypen handelt. Die hier zusammengefasste Arbeit beschreibt die Rolle der ROS-Produktion bei der Aktivierung von Blutplättchen, die Beziehung zwischen dem NO/cGMP/PKG I Signalweg und der ROS bzw. MAP-Kinase Signaltransduktion, und die Rolle von zyklischen Nukleotiden bei der Entwicklung von Megakaryozyten und Blutplättchen. Werden Blutplättchen durch unterschiedliche Einflüsse aktiviert, so produzieren sie über die Aktivierung von NAD(P)H-Oxidase nur intrazelluläres aber nicht extrazelluläres ROS. Dabei beinflusst das in den Blutplättchen produzierte ROS signifikant die Aktivierung von αIIbβ3 Integrin, nicht jedoch die Sekretion von alpha- bzw. dichten Granula oder die Gestalt der Blutplättchen. Die Thrombin-induzierte Integrin αIIbβ3-Aktivierung ist nach Behandlung der Blutplättchen mit Hemmstoffen der NAD(P)H-Oxidase oder Superoxid-Fängern signifikant reduziert. Diese Inhibitoren reduzieren auch die Aggregation der Blutplättchen bzw. die Thrombusbildung auf Kollagen, wobei diese Effekte unabhängig vom NO/cGMP Signalweg vermittelt werden. Sowohl ADP, das von dichten Granula der Blutplättchen sezerniert wird und zur Aktivierung von P2Y12-Rezeptoren führt, als auch die Freigabe von Thromboxan A2 stellen wichtige, vorgeschaltete Vermittler bei der p38 MAP Kinase-Aktivierung durch Thrombin dar. Jedoch spielt die p38 MAP-Kinase-Aktivierung keine signifikante Rolle bei der Thrombin-induzierten Kalzium-Mobilisierung, P-Selektin Exprimierung, αIIbβ3 Integrin Aktivierung oder Aggregation der Blutplättchen. Abschliessend kann festgestellt werden, dass sich die Aktivierung der PKG insgesamt klar hemmend auf die p38 and ERK MAP-Kinasen in menschlichen Blutplättchen auswirkt. Desweiteren zeigt diese Studie, dass zyklische Nukleotide nicht nur die Blutplättchen hemmen, sondern auch einen Einfluss auf die Entwicklung der Megakaryozyten und Blutplättchen haben, aber auf unterschiedliche Weise. cAMP ist an der Differenzierung von embryonalen hämatopoietischen Zellen zu Megakaryozyten beteiligt, wobei cGMP keine Rolle bei diesem Prozess spielt. Während PKA in embryonalen Zellen schon vertreten ist, steigt beim Reifungsprozess der Megakaryozyten die Expression von Proteinen, die bei der cGMP Signalverbreitung („soluble guanylyl cyclase“, sGC; PKG) mitwirken, stetig an. In der letzten Phase der Reifung von Megakaryozyten, die durch die Freisetzung der Blutplättchen charakterisiert ist, zeigen cGMP und cAMP leicht divergierende Effekte: cGMP verstärkt die Bildung von Blutplättchen, während cAMP dieselbe reduziert. Dies deutet auf einen fein abgestimmten Prozess hin, abhängig von einem Stimulus, der von den benachbarten Zellen des Sinusoid-Endothels stammen könnte. Die Ergebnisse dieser Dissertation tragen zu einen besseren Verständnis der Regulation von Blutplättchen sowie der möglichen molekularen Mechanismen bei, die eine Rolle bei der Reifung von Megakaryozyten im vaskularen Mikroumfeld des Knochenmarks innehaben. N2 - In physiological conditions platelets have a major role in maintaining haemostasis. Platelets prevent bleeding from wounds by distinguishing normal endothelial cells in vasculature from areas with lesions to which they adhere. Interaction of platelet agonists and their receptors is controlled by intracellular signaling molecules that regulate the activation state of platelets. Very important intracellular signaling molecules are cyclic nucleotides (cGMP and cAMP), both involved in inhibition of platelet activation. Formation of cGMP and cAMP in platelets is stimulated by endothelial-derived NO and prostacyclin (PGI2), which then mediate inhibition of platelets by activating protein kinase G (PKG) and protein kinase A (PKA). Recently, it has been suggested that reactive oxygen species (ROS) represent new modulators of cell signaling within different cell types. The work summarized here describes the involvement of platelet ROS production in platelet activation, the relation of NO/cGMP/PKG I pathway to ROS and to mitogen-activated protein kinases (MAP kinase) signaling, and the involvement of cyclic nucleotides in megakaryocyte and platelet development. Platelets activated with different agonists produce intracellular but not extracellular ROS by activation of NAD(P)H oxidase. In addition, ROS produced in platelets significantly affects αIIbβ3 integrin activation but not alpha/dense granule secretion and platelet shape change. Thrombin induced integrin αIIbβ3 activation is significantly decreased after pretreatment of platelets with NAD(P)H oxidase inhibitors and superoxide scavengers. These inhibitors also reduce platelet aggregation and thrombus formation on collagen under high shear and achieve their effects independently of the NO/cGMP pathway. ADP secreted from platelet dense granules with subsequent activation of P2Y12 receptors as well as thromboxane A2 release are found to be important upstream mediators of p38 MAP kinase activation by thrombin. However, p38 MAP kinase activation does not significantly contribute to calcium mobilization, P-selectin expression, αIIbβ3 integrin activation and aggregation of human platelets in response to thrombin. Finally, PKG activation does not stimulate, but rather inhibit, p38 and ERK MAP kinases in human platelets. Further study revealed that cyclic nucleotides not only inhibit platelet activation, but are also involved, albeit differentially, in megakaryocyte and platelet development. cAMP is engaged in haematopoietic stem cell differentiation to megakaryocytes, and cGMP has no impact on this process. While PKA is already present in stem cells, expression of proteins involved in cGMP signaling (soluble guanylyl cyclase, sGC; PKG) increases with maturation of megakaryocytes. In the final step of megakaryocyte maturation that includes release of platelets, cGMP and cAMP have mild but opposing effects: cGMP increases platelet production while cAMP decreases it indicating a finely regulated process that could depend on stimulus coming from adjacent endothelial cells of sinusoids in bone marrow. The results of this thesis contribute to a better understanding of platelet regulation and of the possible molecular mechanisms involved in megakaryocyte maturation in bone marrow vascular microenvironment. KW - Thrombozyt KW - Megakaryozyt KW - Signaltransduktion KW - Stickstoffmonoxid KW - Cyclo-GMP KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Plättchen KW - NO KW - cGMP KW - ROS KW - Megakaryozyten KW - Platelets KW - NO KW - cGMP KW - ROS KW - Megakaryocytes Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21954 ER -