TY  - THES
A1  - Messer, Kim Sven
T1  - Isolierung, Strukturaufklärung und Beiträge zur Synthese von Naturstoffen aus tropischen Heilpflanzen sowie Etablierung chiraler On-line-Analytik
T1  - Isolation, structural elucidation and contributions to the synthesis of natural products from tropical medical plants as well as establishment of chiral on-line analytics
N2  - Die Natur eröffnet mit der strukturellen Vielfalt ihrer Sekundärmetaboliten einen nahezu unerschöpflichen Pool in der Leit- und Wirkstoffsuche nach pharmazeutisch wirksamen Substanzen. Insbesondere die Alkaloide zeichnen sich durch ihre biologischen Wirksamkeiten aus. Eine noch junge, sehr vielversprechende Substanzklasse stellen die sogenannten Naphthylisochinolin-Alkaloide dar, die bislang ausschließlich in den beiden Pflanzenfamilien der Ancistrocladaceae und Dioncophyllaceae gefunden wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Extrakte von Ancistrocladus congolensis (A.c.), Triphyophyllum peltatum (T.p.) und Dioncophyllum thollonii (D.t.) untersucht. Hierbei gelang die Isolation und Strukturaufklärung des bereits bekannten Korupensamin A (A.c.) sowie von sechs bislang unbekannten Alkaloiden: Ancistrocongolin A-D (A.c.), Habropetalin A (T.p.) und Dioncophyllin E (D.t.). Zu dem letztgenannten wurde ein synthetischer Zugang evaluiert. Alle neu isolierten Naturstoffe wurden einer biologischen Aktivitätstestung zugeführt. Im analytischen Bereich der Arbeit gelang die vollständige Strukturzuordnung des bereits seit mehreren Jahren bekannten Tetralons Isoshinanolon, was somit nun ein einfache Analytik für die Bestimmung der absoluten Konfiguration an die Hand gibt. Des Weiteren wurde die HPLC-CD-Kopplung als schnelle und praktikable chirale on-line-Analytik an mehreren Beispielen (Phyllin, TaClo, Murrastifolin F, Cyclorocaglamid, Thalidomid) sowohl im phytochemischen als auch synthetischen Bereich eingeführt und etabliert.
N2  - Nature with its wide structural diversity of its secondary metabolites offers an almost inexhaustible source of new structures in the search for pharmaceutical active substances. Especially the alkaloids show remarkable biological activity. A young and very promising substance class are the so-called naphthylisoquinoline alkaloids, which are so far exclusively found in the two plant families of the Ancistrocladaceae and Dioncophyllaceae. In this thesis the extracts of Ancistrocladus congolensis (A.c.), Triphyophyllum peltatum (T.p.) and Dioncophyllum thollonii (D.t.) were examined. Hereby the isolation and structural elucidation of the already known korupensamine A (A.c.) and of six so far unknown alkaloids succeeded: Ancistrocongoline A-D (A.c.), habropetaline A (T.p.) and dioncophylline E (D.t.). The synthetic access to the latter was evaluated. All isolated natural products were subjected to biological testing. Regarding the analytical field, the entire identification of the absolute configuration of the tetralone isoshinanolone was achieved, which gives a simple chiral analytical method at hand to determine the absolute configuration. Furthermore, the HPLC-CD coupling was successfully introduced to phytochemical as well as chemical analysis. This was demonstrated with several examples (phylline, TaClo, murrastifoline F, cycloracaglamide, thalidomide), establishing this technique as a fast and practicable chiral on-line analytic device.
KW  - Naphthylisochinolinalkaloide
KW  - Struktur
KW  - HPLC
KW  - Naturstoffisolation
KW  - Naphthylisochinolin-Alkaloid
KW  - Tetralon
KW  - HPLC-CD
KW  - Natural product isolation
KW  - Naphthylisoquinoline alkaloid
KW  - Tetralone
KW  - HPLC-CD
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3774
ER  - 
TY  - THES
A1  - Krüger, Reinhard
T1  - Pyrolyse- und Sinterverhalten Sol-Gel-abgeleiteter Al2O3-YAG-Fasern
T1  - Pyrolysis and Sintering Behavior of Sol–Gel-Derived Al2O3-YAG Fibers
N2  - Nichtwäßrige Sol-Gel-Vorstufen, die zu einem Mischgefüge aus Al2O3 und YAG führen (Volumenverhältnis 45 : 55), wurden zu Fasern versponnen, in unterschiedlichen Atmosphären pyrolysiert und abschließend gesintert. Die strukturelle Ent-wicklung während der Pyrolyse der Gel-Fasern wurde in Abhängigkeit von Pyrolysetemperatur (200-850 °C) und -atmosphäre beschrieben. Die Zusammenhänge zwischen den mittels der Pyrolyseparameter variierten amorphen Strukturen und dem daraus resultierenden Kristallisations- und Sinterverhalten sowie den mechanischen Fasereigenschaften wurden gezeigt. Die isotropen Gel-Fasern sind frei von Poren und weisen lokal regelmäßig angeordnete, organische Domänen mit mittleren Abständen von 2 nm innerhalb des anorganischen Matrixgerüsts auf. Während der Pyrolyse auftretende Strukturveränderungen hängen stark von der Atmosphäre und der Temperatur ab. In Luft- und Sauerstoffatmosphäre trat ab 600 °C innerhalb der Fasern lokal eine Kristallisation von YAG und Korund in Form kugeliger Bereiche auf, die zum Bruch der Fasern bereits während der Pyrolyse führten. Die Abgabe organischer Bestandteile erfolgte bei Pyrolyse in Stickstoff im wesentlichen zwischen 300 °C und 500 °C, blieb jedoch auch bei höheren Temperaturen unvollständig. In Wasserdampf-Atmosphäre kam es durch Hydrolysereaktionen zwischen 250 °C und 385 °C zu einer verbesserten Abgabe der organischen Bestandteile. Der Kohlenstoffgehalt sinkt bei 385 °C unter 2 Masse-%. Werden dem Wasserdampf saure Gase wie z.B. Stickoxide zugesetzt, wird um 200 °C die Hydrolyse und Abgabe der Organik zusätzlich verstärkt. Nach Pyrolyse in Stickstoff oder wasserhaltigen Atmosphären blieben die Fasern amorph. Bei Pyrolyse in Stickstoff war die Struktur der Fasern porenfrei, wobei die organischen Pyrolysatreste wie in den Gel-Fasern als regelmäßig angeordnete, isolierte Bereiche innerhalb einer anorganischen Matrix vorlagen. In Wasserdampf bildete sich ab 250 °C aus den organischen Domänen eine geordnete Porenstruktur, die sich mit ansteigender Temperatur vergröberte. Auch in der aus verdampfter Salpetersäure erzeugten Atmosphäre bildeten sich Poren. Die Porendurchmesser und spezifischen Oberflächen der Fasern blieben jedoch geringer als in reinem Wasserdampf. In dem anorganischen Matrixgerüst änderten sich durch die Pyrolyse die Koordinationsverhältnisse der Al-Ionen. Ausgehend von der mehrheitlich 6-fachen Koordination in den Gel-Fasern kam es zunehmend zur Umlagerung in die 4- und 5-fache Koordination. Bei Pyrolyse in reinem Wasserdampf war diese Koordinationsveränderung deutlich schwächer ausgeprägt als in Stickstoff oder der Atmosphäre aus verdampfter Salpetersäure. Während der Sinterung treten intermediär gamma-Al2O3 und hexagonales YAlO3 als metastabile Phasen vor der Kristallisation von YAG auf. Mit der Kristallisation von Korund schließt die Phasenbildung der Al2O3-YAG-Fasern je nach vorangegangener Pyrolysebehandlung zwischen 1275 °C und 1315 °C ab. Die Abweichungen in der Kristallisationstemperatur bzw. Keimbildungsdichte von Korund und im Sinterverhalten ließen sich auf die Unterschiede in den amorphen Strukturen der pyrolysierten Fasern zurückführen. Hohe Anteile 6-fach koordinierter Al-Ionen und eine zu hohen spezifischen Oberflächen führende, feine Porosität erwiesen sich als günstige Strukturmerkmale für pyrolysierte Fasern. Die dabei entstandenen feinkörnigen, homogenen Gefüge konnten dicht gesintert werden und hatten die höchsten Festigkeiten und E-Moduln. Kohlenstoffgehalte bis zu 2 Masse-% wirkten sich in den offenporigen Zwischenprodukten nicht negativ auf das Sinterverhalten aus. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Kristallisation der Sol-Gel-abgeleiteten Fasern und damit auch die Ausbildung der keramischen Gefüge in entscheidendem Maße von den Pyrolysebedingungen abhängen. Bei einheitlicher Synthese der Gel-Fasern lassen sich durch die Pyrolysebehandlung unterschiedliche Strukturen in den amorphen Zwischenprodukten einstellen, die durch ihre spezifisches Kristallisations- und Sinterverhalten zu unterschiedlichen keramischen Gefügen in den Fasern führen. Die Optimierung der Gefüge vorstufenabgeleiteter Keramiken durch Zusatz von Keimen ("Seeding") ist seit längerem bekannt. In Ergänzung dazu bietet die gezielte Wahl der Pyrolysebedingungen eine weitere Möglichkeit zur Steuerung der Gefügeausbildung in Sol-Gel-Keramiken.
N2  - Ceramic fibers of Al2O3-YAG composition (volume ratio 45 : 55) were prepared by spinning non-aqueous sol-gel precursors to fibers which were then pyrolyzed in various atmospheres and finally sintered. Structural development of the gel fibers upon pyrolysis at temperatures between 200 °C and 850 °C was described for different atmospheres. Variation of pyrolysis conditions lead to different amorphous structures. A correlation between the amorphous structures and their crystallization and sintering behavior as well as mechanical fiber properties could be established. The gel fibers have an isotropic, pore-free structure which is characterized by an inorganic matrix that contains organic domains in a locally ordered arrangement with mean distances of 2 nm. Alteration of this structure strongly depends on the type of atmosphere and temperature during pyrolysis. In air and oxygen above 600 °C local, spherulitic crystallization of YAG and corundum occurs within the fibers and leads to fracture of the fibers. In nitrogen, organic constituents are mainly removed between 300 and 500 °C, but residues remain even at higher temperatures. Water vapor hydrolyses organic constituents and enhances their release at 200-385 °C. Thus carbon contents drops below 2 wt.-% at 385 °C. Additional acceleration of hydrolysis at ~200 °C can be achieved by addition of acidic gases like nitric oxide to the moist atmosphere. The structure of fibers pyrolysed in nitrogen or moist atmospheres remains amorphous. After pyrolysis in nitrogen the fibers are pore-free and the organic residues still appear as locally ordered domains within an inorganic matrix. In water vapor from 250 °C on, the release of organics leads to the formation of ordered micropores that coarsen with further increasing temperature. In the atmosphere of evaporated nitric acid, pores form too, but pore sizes and specific surface areas of the fibers are lower than in pure water vapor. The coordination of Al-ions in the inorganic network is altered by pyrolysis. Gel fibers mainly contain 6-fold coordinated Al-ions. With increasing temperature a rearrangement of part of the octahedrally coordinated Al-ions to 4- and 5-fold coordination was observed. While this rearrangement was only weakly pronounced for fibers pyrolysed in water vapor, in nitrogen or the atmosphere that was derived from evaporated nitric acid a significantly higher proportion of 6-fold coordinated Al-ions rearranged to lower coordination numbers. During the sintering process gamma-Al2O3 and hexagonal YAlO3 are formed as intermediate metastable phases prior to the crystallization of YAG. Formation of crystalline phases in the Al2O3-YAG fibers completes with the crystallization of corundum at 1275 to 1315 °C depending on pyrolysis conditions. Differences in crystallization temperature and nucleation density of corundum were put down the structural features of pyrolysed, amorphous fibers. A high proportion of 6-fold coordinated Al-ions and a high specific surface caused by fine pores revealed as favorable characteristics of low corundum crystallization temperature and high nucleation density. Such fibers could be fully densified resulting in the highest strength and Young's moduli in the ceramic fibers. Carbon contents up to 2 wt.-% were not deleterious to the densification of pyrolysed fibers with an open porous structure. The results presented in this study show that crystallization and microstructural evolution of sol-gel derived ceramic fibers critically depend on pyrolysis conditions. Different amorphous structures that lead to altered ceramic microstructures can be obtained from uniformly synthesized gel fibers by variation of pyrolysis conditions. Seeding is a well known process for the microstructural optimization of precursor derived ceramics. As a supplement the choice of suitable pyrolysis conditions is a further tool for the microstructure control in sol-gel ceramics.
KW  - Keramikfaser
KW  - Sol-Gel-Verfahren
KW  - Pyrolyse
KW  - Kristallisation
KW  - Sintern
KW  - Mechanische Eigenschaft
KW  - Korund
KW  - YAG
KW  - Mikrostruktur
KW  - Pyrolyse
KW  - Struktur
KW  - Sol-Gel
KW  - Faser
KW  - Al2O3
KW  - pyrolysis
KW  - structure
KW  - sol-gel
KW  - fiber
KW  - Al2O3
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6827
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kaufmann, Benedikt
T1  - Die Struktur der europäischen  Grundfreiheiten - Konvergenz oder Divergenz?
N2  - Eine eigene Dogmatik und Strukturierung der europäischen Grundfreiheiten hat sich erst im Laufe der Zeit und einer immer stärker werdenden europäischen Integration entwickelt. Umstritten war und ist dabei jedoch nicht nur die Struktur der Grundfreiheiten, sondern auch deren Konvergenz bzw. Divergenz untereinander. Sowohl die Rechtsprechung durch den EuGH als auch das deutsche Schrifttum betonen dabei mittlerweile immer mehr die gemeinsamen Grundsätze und allgemeinen Lehren hinsichtlich der Auslegung der einzelnen Grundfreiheiten mit der Tendenz zu einer übergreifenden Konvergenz der Grundfreiheiten. 
Aufgrund der nach wie vor hohen und wohl noch steigenden Bedeutung der Grundfreiheiten für die Rechtspraxis ist eine umfassende strukturelle und dogmatische Durchleuchtung der Grundfreiheiten aus rechtswissenschaftlicher Sicht angebracht. Die vorliegende Arbeit setzt hieran an und untersucht unter Heranziehung sowohl der maßgeblichen EuGH-Rechtsprechung als auch der einschlägigen Literatur, inwiefern sich bezüglich der Grundfreiheiten eine Konvergenz oder Divergenz feststellen lässt sowie ob sich aus einer möglichen Konvergenz ein eigener Argumentationstyp hinsichtlich der Auslegung der Grundfreiheiten ableiten lässt.
T3  - Würzburger Online-Schriften zum Europarecht - 5 
KW  - Grundfreiheiten
KW  - Konvergenz
KW  - Europarecht
KW  - Rechtsdogmatik
KW  - Grundfreiheiten
KW  - Konvergenz
KW  - Struktur
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107231
ER  - 
TY  - THES
A1  - Imes, Dennis
T1  - Aufklärung der molekularen Struktur und Funktion des R-Typ Anionenkanals QUAC1 in Schließzellen
T1  - Molecular structure and function analyses of the R-type anion channel QUAC1 in guard cells
N2  - Zum Gasaustausch mit Ihrer Umgebung besitzen höhere Pflanzen stomatäre Komplexe. Die Turgor-getrieben Atmungsöffnungen in der Epidermis der Blätter werden von zwei Schließzellen umsäumt. Um bei Trockenheit einen exzessiven Verlust von Wasser zu verhindern, synthetisieren/importieren Schließzellen das Stresshormon ABA (Abszisinsäure), das über eine schnelle ABA-Signalkaskade plasmamembrangebundene Ionenkanäle steuert. Dabei wird der Stomaschluss durch die Aktivität von R-(rapid) und S-(slow)Typ Anionenkanälen initiiert. Obwohl die R- und S-Typ Anionenströme in Schließzellen seit Jahrzehnten bekannt waren, konnte erst kürzlich das Gen identifiziert werden, das für den S-Typ Anionenkanal (SLAC1, Slow activating Anion Channel 1) kodiert. Daraufhin wurde schnell der Zusammenhang zwischen dem Stresshormon ABA, der ABA-Signalkette und der Aktivität des SLAC1 Anionenkanals im heterologen Expressionssystem der X. laevis Oozyten als auch in Schließzellprotoplasten aufgeklärt. Es konnte gezeigt werden, dass ABA durch einen zytosolischen Rezeptor/Phosphatasekomplex (RCAR1/ABI1) erkannt wird und die Aktivität von kalziumabhängigen Kinasen (CPK-Familie) sowie kalziumunabhängigen Kinasen der SnRK2-Familie (OST1) steuert. In Anwesenheit von ABA phosphorylieren diese Kinasen SLAC1 und sorgen so für die Aktivierung von Anionenströmen und damit für die Initiierung des Stomaschlusses.
Die genetische Herkunft der ABA-induzierten R-Typ Ströme in Schließzellen war zu Beginn der vorliegenden Arbeit noch nicht bekannt. R-Typ Ströme zeichnen sich durch eine strikte Spannungsabhängigkeit und sehr schnellen Aktivierungs- sowie Deaktivierungskinetiken aus. Die Charakterisierung von Verlustmutanten des Schließzell-exprimierten Gens ALMT12 (Aluminium-aktivierter Malattransporter 12) konnte in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Martinoia (Zürich) erste Hinweise auf die Beteiligung dieses Gens an der Stomabewegung demonstrieren. Anschließende Patch-Clamp Untersuchungen an Schließzellprotoplasten aus Wildtyppflanzen und ALMT12-Verlustmutanten zeigten, dass ALMT12 für die Malat-aktivierte R-Typ Anionenstromkomponente verantwortlich ist. Deshalb wurde der Anionenkanal QUAC1 (Quickly activating Anion Channel 1) benannt - in Anlehnung an die Benennung des Anionenkanals SLAC1. Mit der Identifizierung von QUAC1 in planta war es nun meine Aufgabe, die elektrischen Eigenschaften von ALMT12/QUAC1 und dessen Aktivitätskontrolle durch die ABA-Signalkaskade im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten zu untersuchen.
Protein-Protein Interaktionsstudien mit der Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenz-Technik, sowie die Beobachtung von markant erhöhten QUAC1 Anionenströmen in Anwesenheit der SnRK2 Kinase OST1 und den Calcium-abhängigen Kinasen CPK2 und CPK20, ließen den Schluss zu, dass QUAC1, ebenso wie SLAC1, unter der Kontrolle des schnellen ABA-Signalwegs steht. Eine zusätzliche Expression des negativen Regulators ABI1 unterdrückte die aktivierenden Eigenschaften der QUAC1-aktivierenden Kinasen, was die Hypothese der Koregulation von S- und R-Typ Anionenkanälen durch die gleiche ABA-Signalkaskade weiter unterstützt. 
Zur weiteren Aufklärung der elektrischen Eigenschaften von QUAC1 wurden tiefgreifende elektrophysiologische Untersuchungen mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemmen Technik durchgeführt. Durch die Wahl von geschickten Spannungsprotokollen konnte sowohl die schnelle Aktivierungskinetik als auch die schnelle Deaktivierungskinetik von QUAC1 bestimmt und quantifiziert werden. Diese Stromantworten waren sehr ähnlich zu den R-Typ Strömen, die man von Patch-Clamp Untersuchungen an Schließzellprotoplasten kannte, was ein weiteres Indiz dafür war, dass es sich bei QUAC1 tatsächlich um eine Komponente des R-Typ Kanals aus Schließzellen handelt. Weiterführende Untersuchungen bezüglich der Spannungsabhängigkeit und der Selektivität von QUAC1 charakterisierten das Protein als einen Depolarisations-aktivierten Anionenkanal mit einer starken Präferenz für Dicarbonsäuren wie Malat und Fumarat. Zudem konnte auch eine Leitfähigkeit für Sulfat und Chlorid nachgewiesen werden. Interessanterweise erwies sich Malat nicht nur als ein permeierendes Ion, sondern auch als ein regulierendes Ion, welches das spannungsabhängige Schalten von QUAC1 maßgeblich beeinflusst. Extrazelluläres Malat verschob die Offenwahrscheinlichkeit von QUAC1 sehr stark zu negativeren Membranspannungen, so dass der Anionenkanal bereits bei typischen Ruhespannungen von Schließzellen (ca. -150 mV) aktiviert werden konnte. Eine Beladung von QUAC1-exprimierender Oozyten mit Malat bewirkte zum einen höhere Anioneneffluxströme, aber auch eine Verschiebung der spannungsabhängigen Offenwahrscheinlichkeit zu negativeren Membranpotentialen.
Struktur-Funktionsanalysen sollten die umstrittene Topologie von ALMT-ähnlichen Proteinen beleuchten und die molekulare Herkunft der Phosphorylierungsaktivierung aufzeigen, sowie die Malatabhängigkeit und die starke Spannungsabhängigkeit von QUAC1 aufklären. Es zeigte sich jedoch schnell, dass Punktmutationen und Deletionen im C-Terminus von QUAC1 sehr häufig zu nicht-funktionellen Mutanten führten. Diese Tatsache weist darauf hin, dass es sich um einen hoch-strukturierten und funktionell sehr wichtigen Bereich des Anionenkanals handelt. Auch die Topologie des Anionenkanalproteins wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Sowohl die Lage des N- und C-Terminus (extrazellulär oder intrazellulär), als auch die Anzahl der membrandurchspannenden Domänen war nicht abschließend geklärt. Deshalb wurde in einem Fluoreszenz-basiertem Ansatz die Lage der Termini bestimmt. Im Rahmen meiner Arbeit konnte somit eindeutig gezeigt werden, dass sich beide Termini im Zytosol der Zelle befinden. Auf Grundlage von Modellen aus der Literatur und meiner Topologiebestimmungen konnte schließlich ein erweitertes Modell zur Struktur von QUAC1 entwickelt werden. Dieses Modell kann in Zukunft als Ausgangspunkt für weiterführende Struktur-Funktionsanalysen dienen.
Diese Arbeit hat somit gezeigt, dass das Gen QUAC1 tatsächlich eine Komponente der R-Typ Ströme in Schließzellen kodiert. Ebenso wie SLAC1 steht der Malat-induzierte Anionenkanal QUAC1 unter der Kontrolle der schnellen ABA-Signalkaskade. In Zukunft bleibt zu klären, welche weiteren Gene für die R-Typ Kanalproteine in Schließzellen kodieren und welche strukturelle Grundlage für die besonderen Eigenschaften von QUAC1 hinsichtlich seiner schnellen Kinetiken, seiner Selektivität und Aktivierbarkeit durch Malat.
N2  - Higher plants are able to exchange gases with their environment. This gas exchange is accomplished by the stomatal complex, which consist of two tugor-driven guard cells (GC) that surround a pore in the epidermis. Under drought conditions, guard cells produce and import the plant stress hormone abscisic acid (ABA). ABA is able to activate plasma membrane localized ion channels via the fast ABA-signal cascade, which leads to a closure of the stoma and thus minimizes the loss of water. The stomatal closure is initialized by the R-(rapid) and S-(slow) type anion channels. Although R- and S-type anion channels in guard cells have been known for over a decade, the gene which decodes the S-type anion channel SLAC1 (Slow activating Anion Channel 1) has only recently been identified. Consequently, the relationship between the plant hormone ABA, the ABA-signal-transduction-chain, and the activity of SLAC1 could be clarified in rapid succession in the heterologous expression system of X. laevis oocytes as well as in GC-protoplasts. It could be shown that ABA is recognized by a cytosolic receptor/phosphatase complex (RCAR/ABI1). This complex in turn regulates the activity of calcium dependent kinases of the CPK-family as well as the calcium independent kinases of the SnRK2-family (OST1). In the presence of ABA, these kinases activate SLAC1 by phosphorylation, and by this activate anion currents across the plasma membrane, ultimately leading to closure of the stomates.
The genetic origin of the ABA induced R-type currents in guard cells was unknown at the beginning of this thesis. R-type currents are characterized by strong voltage-dependent behavior and fast activation- and deactivation-kinetics. In cooperation with the workgroup of Martinoia (Zürich), knock-out plants missing the guard cell gen ALMT12 (Aluminum activated Malate Transporter 12) were characterized. This work delivered the first hints that ALMT12 is involved in the stomatal movement. Subsequent patch-clamp studies on GC-protoplasts from WT and ALMT12 knock-out mutants revealed that ALMT12 is responsible for the malate-activated component of the R-type anion currents. Therefore, the anion-channel was named QUAC1 (Quick activating Anion Channel) in dependence on the naming of SLAC1. With the identification of QUAC1 in planta it was my duty to research the electrical properties of ALMT12/QUAC1 as well as the activation by the ABA-signal-transduction-chain in the heterologous expression system of X. laevis oocytes.

Protein-protein interaction studies via bimolecular fluorescence complementation (BIFC) as well as significantly higher QUAC1 anion currents in the presence of the SnRK2 kinase OST1 and the calcium-dependent-kinases CPK2 and CPK20 led to the conclusion that QUAC1 is under the control of the fast ABA signaling pathway, as it was shown before for SLAC1. Furthermore expression of the negative regulator ABI1 inhibited the activating properties of the QUAC1-activating kinases. These findings support further the hypotheses of the simultaneous regulation of S- and R-type anion channels by the ABA-signaling pathway. 
To further elucidate the electrical properties of QUAC1, electrophysiological investigations were performed with the two-electrode-voltage-clamp technique (TEVC). In this way, the fast activation and deactivation of QUAC1 could be identified and quantified by carefully chosen voltage-clamp protocols. These current responses of QUAC1 closely resembled the R-type currents known from former patch-clamp studies from GC-protoplasts. This further supported the conclusion that QUAC1 is indeed a component of the R-type channels of guard cells. Additional investigations of the voltage-dependence and selectivity of QUAC1 characterized the protein as a depolarization-activated anion channel with strong preference for bicarbonate acids like malate and fumarate. Furthermore, a conductance for sulfate and chloride could also be shown. Interestingly, malate was not only able to permeate the channel, it was also able to alter the voltage-dependence of QUAC1. External malate strongly shifted the open probability of QUAC1 to negative membrane voltages. By this shift the anion channel could be activated at typical guard cell membrane potentials (approx. 150 mV). Loading of QUAC1 expressing oocytes with malate produced enhanced anion efflux currents and shift the voltage-dependent open probability to negative membrane potentials.
Structure function analysis were performed to clarify the controversial topology of ALMT like proteins and the molecular origin of the phosphorylation activation. Furthermore, this should elucidate the origin of the malate dependence and the strong voltage dependence of QUAC1. It soon became evident that point mutations and deletions in the C-terminus of QUAC1 very often lead to nonfunctional mutants. This points toward a highly structured and functionally important region of the anion channel. In addition, the topology of the anion-channel-protein is controversially debated in literature. Neither the position of the C- and N-terminus (intra- or extracellular) nor the number of transmembrane domains has been conclusively established. Due to this, the position of the C- and N-termini were localized by a fluorescence based experiment. As part of this work, it could be shown explicitly that both termini reside in the cytosol of the cell. Based on models from the literature and my own topology studies, an enhanced structure model for QUAC1 could be generated. This model will serve as a starting point for future structure function analysis.
This work has thus shown that the gene QUAC1 indeed encodes a component of the R-type currents in guard cells. Like SLAC1, the malate-induced anion channel QUAC1 is under the control of the fast ABA-signal-cascade. Future works must establish which further genes encode R-type channel proteins and which structural attributes are responsible for the special traits of QUAC1: its fast kinetics, its selectivity and its activation by malate.
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Schließzelle
KW  - Anionentranslokator
KW  - Abscisinsäure
KW  - Struktur
KW  - Funktion
KW  - R-Typ
KW  - Anionenkanal
KW  - QUAC1
KW  - TEVC
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136860
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TY  - THES
A1  - Bedenk, Kristina
T1  - Biochemische und strukturelle Charakterisierung der Genexpressionsmaschinerie des Vaccinia Virus
T1  - The biochemical and structural characterization of the gene expression machinery of the Vaccinia virus
N2  - Die Familie der Pockenviren zeichnet sich durch ein komplexes DNA Genom aus und hat großes medizinisches Potential. Am eindrucksvollsten ist dies für das Vaccinia-Virus (VACV) belegt, welches nicht nur als Pocken-Impfstoff eingesetzt wird, sondern auch als onkolytisches Virus in der Tumorbiologie. VACV hat einen außergewöhnlichen Replikationszyklus, welcher ausschließlich im Zytoplasma der Wirtszelle stattfindet. Somit ist die gesamte virale Genexpressionsmaschinerie völlig unabhängig von kernvermittelten Reaktionen des Wirts und somit auch aus Sicht der Grundlagenforschung von größtem Interesse. Die Schlüsselkomponente der viralen Genexpression ist die makromolekulare DNA-abhängige RNA Polymerase (vvRPO), deren Untereinheiten allesamt Virus-kodiert sind. Zwar wurden in den letzten Jahren Protokolle zur biochemischen und funktionellen Charakterisierung der vvRPO etabliert, ein detailliertes Wissen über deren Zusammenlagerung in vivo und die räumlichen und zeitlichen Interaktionen mit den Transkriptions- bzw. Prozessierungsfaktoren sind aber weitgehend unbekannt. 
Diese Arbeit umfasst Untersuchungen zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung der vvRPO und seiner assoziierten Faktoren. Grundlage hierfür war die Etablierung eines Reinigungsprotokolls mithilfe eines neu konstruierten rekombinanten VACV (GLV-1h439). Diese Strategie erlaubte es hoch-molekulare native vvRPO Komplexe zu isolieren. Ein transkriptions-inaktiver Komplex (Komplex I) mit einer kalkulierten Masse von 575 kDa bestand aus den acht Untereinheiten des vvRPO Holoenzyms und den Polymerase-assoziierten Faktoren RAP94 und D6. Ein zweiter, transkriptionell aktiver Komplex (Komplex II) mit einer Masse von 803 kDa enthielt, neben dem Holoenzym der vvRPO, noch weitere Faktoren, die primär die Erkennung der DNA-Matrize und die Prozessierung der naszierenden RNA vermitteln. Hierbei handelt es sich um RAP94, das virale Capping Enzym bestehend aus den zwei Untereinheiten D1 und D12, A7 und dem Terminationsfaktor NPH I. Interessanterweise enthielt dieser Komplex zusätzlich mit E11 eine bislang unbekannte weitere Protein-Komponente, sowie tRNAGln und tRNAArg. Der isolierte Kompelx II ist daher ein Ribonukleoprotein (RNP).
Die Verfügbarkeit von hoch-reinen vvRPO Komplexen erlaubte es erstmals deren strukturelle Architektur zu untersuchen. Hierfür wurden drei experimentelle Ansätze, die klassische Röntgenstrukturanalyse, die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Quervernetzungssstudien miteinander kombiniert. Die Strukturen der Komplexe I und II haben eine Auflösung von 11-12 Å, wobei auffällig war, dass beide eine markante strukturelle Ähnlichkeit zur eukaryotischen RNA Polymerase II aufwiesen. Darüber hinaus  gelang es zusätzliche Bereiche im Komplex II zu definieren, welche die Polymerase-assoziierten Prozessierungsfaktoren beherbergen. Zudem konnte die atomare Struktur von E11, mittels Röntgenstrukturanalyse bei einer Auflösung von 1,9 Å, gelöst werden. Das E11 Protein besitzt ein neuartiges Faltungsmuster und weist einen intensiven Dimerisierungskontakt auf, welcher sich über vier ß-Faltblätter ausbildet.
Die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten legen die Grundlage für ein detailliertes Verständnis der räumlichen Organisation der viralen Transkriptonsmaschinerie. Darüber hinaus werden sie funktionelle Studien ermöglichen, welche die Rolle der einzelnen Proteine, sowie der tRNAs bei der mRNA Synthese klären helfen.
N2  - Poxviruses comprise a diverse family of complex DNA-genome viruses with great medical potenial. This is exemplified by vaccinia virus, which not only served as a vaccine against smallpox but is also used as a promising tool in viral anti-cancer therapies. 
A key feature that distinguishes the poxvirus family from other DNA viruses is their replication cycle, which is confined to the cytoplasm. This results in a high level of independence from the host cell, which supports transcription and replication events only in the nucleus. Accordingly, virus specific, rather than host cell enzymes mediate most processes including DNA replication and mRNA synthesis. The key component of viral gene expression is the DNA-dependent RNA polymerase (vvRPO), which constitutes the  virus-encoded macromolecular machine ensuring viral mRNA synthesis. Although this enzyme has been studied in some details in the past years, neither its mode of assembly in vivo nor its spatio-temporal association with transcription and processing factors has been understood in detail. 
In this thesis I present work that focuses on the structural and functional characterization of vvRPO and its associated factors. To gain insights into the structure and the assembly of the VACV transcription system we established an efficient purification protocol by generating recombinant virus strains expressing tagged subunits of vvRPO (GLV-1h439). These recombinant virus strains enabled the isolation of high molecular weight vvRPO complexes. Complex I, which was transcriptionally inactive in vitro displayed a calculated mass of about 575 kDa, consisted of eight subunits of the vvRPO holoenzym and two additional polymerase-associated factors termed RAP94 and D6. A second, transcriptionally active complex (complex II) with a mass of 803 kDa, was related to the first one. It consisted apart from the factors of the holoenzyme already found in complex I additional factors that mediate primarily binding of the polymerase to its DNA template and the processing of nascent RNA. These factors comprise the viral capping enzyme (D1, D12), A7 and the termination factor NPH I. Interestingly, complex II contained in addition the viral protein E11, thus far not connected to viral transcription als well as tRNAGln, tRNAArg). Complex II is hence a ribonucleoprotein (RNP).
 The availability of highly pure vvRPO complexes allowed for the first time to investigate their structure. To this end, three experimental approaches, the classic X-ray crystallography, cryo-electron microscopy (cryo-EM) and chemical crosslinking were combined. Structures of both polymerase complexes were obtained at a resolution of 11-12 Å and revealed a striking structural similarity to eukaryotic RNA polymerase II. Moreover, it was possible to allocate positions in the structure of complex II that are likely to harbour the polymerase-associated processing factors. In addition we were able to solve atomic structure of E11 by X-ray crystallography at a resolution of 1.9 Å. Interestingly, the structure of E11 showed a novel folding pattern that forms a dimer, which is mostly composed of four ß-sheets.
These studies provide the basis for a detailed investigation of the architecture of the viral transcriptional machinery. Furthermore, the pave the way for functional studies aimed at elucidating the function of individual proteins and tRNA in the generation of viral mRNA.
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Genexpressionsmaschinerie
KW  - RNA-Polymerase
KW  - Struktur
KW  - Genexpression
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135538
ER  -