TY - THES A1 - Pfeiffer, Hendrik T1 - Synthesis and biological activity of molybdenum carbonyl complexes and their peptide conjugates T1 - Synthese und biologische Aktivität von Molybdäncarbonylkomplexen und ihren Peptidkonjugaten N2 - Molybdenum carbonyl complexes with different polypyridyl coligands were prepared and conjugated to peptides by mild bioorthogonal coupling reactions like the oxime ligation and a catalyst-free azide-alkyne click reaction utilized for the first time in such a context. The biological activity of some of the new complexes and conjugates, including their CO release properties, cytotoxicity on human cancer cells, and mode of induction of cell death was studied. N2 - Molybdäncarbonylkomplexe mit verschiedenen Polypyridyl-Coliganden wurden synthetisiert und erstmalig in diesem Zusammenhang mittels milder bioorthogonaler Kupplungsreaktionen wie der Oxim-Ligation und der katalysatorfreien Azid- Alkin Click-Reaktion mit Peptiden verknüpft. Die biologische Aktivität einiger der neuen Komplexe und Konjugate, wozu deren Fähigkeit CO freizusetzen, die Cytotoxizität auf menschliche Krebszellen und die Induktion des Zelltods zählen, wurde untersucht. KW - Molybdäncarbonyle KW - Biologische Aktivität KW - Molybdän KW - CORM KW - Cytotoxizität KW - Bioorganometallchemie KW - molybdenum KW - CORM KW - cytotoxicity KW - bioorganometallic chemistry Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71199 ER - TY - THES A1 - Neuenkirchen, Nils T1 - An in vitro system for the biogenesis of small nuclear ribonucleoprotein particles T1 - Die Biogenese kleiner nukleärer Ribonukleinprotein Partikel - ein in vitro System N2 - Most protein-encoding genes in Eukaryotes are separated into alternating coding and non-coding sequences (exons and introns). Following the transcription of the DNA into pre-messenger RNA (pre-mRNA) in the nucleus, a macromolecular complex termed spliceosome removes the introns and joins the exons to generate mature mRNA that is exported to the cytoplasm. There, it can be interpreted by ribosomes to generate proteins. The spliceosome consists of five small nuclear ribonucleic acids (snRNAs) and more than 150 proteins. Integral components of this complex are RNA-protein particles (RNPs) composed of one or two snRNAs, seven common (Sm) and a various number of snRNP-specific proteins. The Sm proteins form a ring-structure around a conserved site of the snRNA called Sm site. In vitro, Sm proteins (B/B', D1, D2, D3, E, F, G) and snRNA readily assemble to form snRNPs. In the context of the cell, however, two macromolecular trans-acting factors, the PRMT5 (protein arginine methyltransferases type 5) and the SMN (survival motor neuron) complex, are needed to enable this process. Initially, the Sm proteins in the form of heterooligomers D1/D2, D3/B and F/E/G are sequestered by the type II methyltransferase PRMT5. pICln, a component of the PRMT5 complex, readily interacts with Sm proteins to form two distinct complexes. Whereas the first one comprises pICln and D3/B the second one forms a ring consisting of pICln, D1/D2 and F/E/G (6S). It has been found that pICln prevents the premature interaction of snRNAs with the Sm proteins in these complexes and thus functions as an assembly chaperone imposing a kinetic trap upon the further assembly of snRNPs. PRMT5 catalyzes the symmetrical dimethylation of arginine residues in B/B', D1 and D3 increasing their affinity towards the SMN complex. Finally, the SMN complex interacts with the pICln-Sm protein complexes, expels pICln and mediates snRNP assembly in an ATP-dependent reaction. So far, only little is known about the action of PRMT5 in the early phase of snRNP assembly and especially how the 6S complex is formed. Studies of this have so far been hampered by the unavailability of soluble and biologically active PRMT5 enzyme. The composition of the SMN complex and possible functions of individual subunits have been elucidated or hypothesized in recent years. Still, the exact mechanism of the entire machinery forming snRNPs is poorly understood. In vivo, reduced production of functional SMN protein results in the neurodegenerative disease spinal muscular atrophy (SMA). How specific SMN mutations that have been found in SMA patients cause the disease remains elusive, yet, are likely to interfere with either SMN complex stability or snRNP assembly. The aim of this work was to establish an in vitro system to recapitulate the cytoplasmic assembly of snRNPs. This was enabled by the recombinant production of all PRMT5 and SMN complex components as well as Sm proteins in a combination of bacterial and insect cell expression systems. Co-expression of human PRMT5 and its direct interaction partner WD45 (WD-repeat domain 45) in Sf21 (Spodoptera frugiperda 21) insect cells resulted for the first time in soluble and biologically active enzyme. Recombinant PRMT5/WD45 formed complexes with Sm protein heterooligomers as well as pICln-Sm protein complexes but not with F/E/G alone. Also, the enzyme exhibited a type II methyltransferase activity catalyzing the mono- (MMA) and symmetrical dimethylation (sDMA) of Sm proteins B, D1 and D3. Two experimental setups were devised to quantitatively analyze the overall methylation of substrates as well as to identify the type and relative abundance of specific methylation types. Methylation of Sm proteins followed Michaelis-Menten kinetics. Complex reconstitutions and competition of the methylation reaction indicate that 6S is formed in a step-wise manner on the PRMT5 complex. The analysis of the methylation type could be applied to deduce a model of sequential MMA and sDMA formation. It was found that large Sm protein substrate concentrations favored monomethylation. Following a distributive mechanism this leads to the conclusion that PRMT5 most likely confers partial methylation of several different substrate proteins instead of processing a single substrate iteratively until it is completely dimethylated. Finally, the human SMN complex was reconstituted from recombinant sources and was shown to be active in snRNP formation. The introduction of a modified SMN protein carrying a mutation (E134K) present in spinal muscular atrophy (SMA) proved that mutated complexes can be generated in vitro and that these might be applied to elucidate the molecular etiology of this devastating disease. N2 - Der Großteil der Protein-kodierenden Gene in Eukaryoten ist in kodierende und nicht-kodierende Regionen unterteilt - sogenannte Exons und Introns. Damit aus einem Gen ein Protein hergestellt werden kann, muss zunächst die genomische DNA im Rahmen der Translation in prä-messenger RNA (prä-mRNA; Boten-RNA) übersetzt werden. Aus dieser prä-mRNA werden anschließend durch einen makromolekularen Komplex (Spleißosom) die Introns entfernt und die kodieren Exons zusammengefügt. Die daraus resultierende gereifte mRNA dient letztendlich den Ribosomen als Vorlage zur Herstellung von Proteinen. Das Spleißosom besteht aus fünf snRNAs (small nuclear ribonucleic acids) und über 150 weiteren Proteinen. Zentrale Komponenten dieses Komplexes sind RNA-Protein Partikel (RNPs), die aus einer bzw. zwei snRNAs, sieben gemeinsamen (Sm) und weiteren snRNP-spezifischen Proteinen bestehen. Die Sm Proteine (B/B', D1, D2, D3, E, F and G) bilden eine Ringstruktur um eine konservierte Sequenz (Sm-site) der snRNA aus. In vitro erfolgt die Ausbildung dieser Struktur spontan. Im zellulären Kontext wird die Zusammenlagerung dieser snRNPs allerdings erst durch zwei makromolekulare, trans-agierende Proteinkomplexe, den PRMT5 und den SMN Komplex, ermöglicht. Zu Beginn interagieren die Sm Proteine als heterooligomere Strukturen bestehend aus D1/D2, D3/B und F/E/G mit der Typ II Methyltransferase PRMT5. pICln, eine Komponente des PRMT5 Komplexes, interagiert mit den Sm Proteinen und bildet zwei spezifische Komplexe aus. Während der erste aus pICln und D3/B besteht, lagern sich im zweiten die Sm proteine D1/D2 und F/E/G mit pICln zu einem Ring zusammen (6S Komplex). Diese Interaktion erzeugt eine kinetische Falle, so dass die Sm Proteine sich nicht mehr spontan an die snRNA anlagern können und somit die snRNP Biogenese verzögert wird. PRMT5 katalysiert die symmetrische Dimethylierung von Argininresten in B/B', D1 und D3, wodurch deren Affinität zum SMN Komplex erhöht wird. Letztendlich assoziert der SMN Komplex mit den zuvor erzeugten pICln-Sm Protein Komplexen, entlässt pICln und ermöglicht im weiteren die Zusammenlagerung von snRNPs in einer ATP-abhängigen Reaktion. Aktuell ist über die Funktion von PRMT5 in der frühen Phase der snRNP Biogenese wenig bekannt. Dies trifft insbesondere auf die Zusammenlagerung des 6S Komplexes zu. Biochemische Untersuchungen waren bis jetzt nahezu unmöglich, da rekombinant hergestelltes Protein entweder unlöslich oder biochemisch inaktiv war. In den vergangenen Jahren wurde viel über die Zusammensetzung des SMN Komplexes sowie über die Funktionen einzelner Untereinheiten herausgefunden aber auch spekuliert. Trotz alledem ist der genaue Mechanismus der snRNP Biogenese noch nahezu unbekannt. In vivo sind verringerte Mengen an funktionalem SMN Protein der Ausschlaggeber für die neurodegenerative Krankheit Spinale Muskelatrophie (SMA). Welchen Effekt Mutationen im SMN Protein haben, die in SMA Patienten festgestellt wurden ist ungewiss. Es ist allerdings zu vermuten, dass diese entweder die Integrität des SMN Komplexes negativ beeinflussen oder störend auf die snRNP Biogenese wirken. Das Ziel dieser Arbeit war es ein in vitro-System zu generieren, um die zytoplasmatische snRNP Biogenese biochemisch zu untersuchen. Dies geschah durch die rekombinante Produktion aller PRMT5 und SMN Komplex Komponenten sowie der Sm Proteine in einer Kombination von bakterieller und Insektenzell-Expression. Durch die Ko-Expression von humanem PRMT5 und dem Interaktionspartner WD45 (WD-repeat domain 45) in Sf21 (Spodoptera frugiperda 21) Insekten Zellen konnte erstmals lösliches und enzymatisch aktives Protein hergestellt werden. Rekombinantes PRMT5/WD45 bildete Komplexe mit heterooligomeren Sm Proteinen sowie pICln-Sm Protein Komplexen, allerdings nicht mit F/E/G. Zusätzlich konnte eine Typ II Methyltransferase Aktivität dadurch nachgewiesen werden, dass die Sm Protein B, D1 und D3 monomethyliert (MMA) und symmetrisch dimethyliert (sDMA) werden können. Zur weiteren Untersuchung wurden zwei experimentelle Ansätze erarbeitet, um die allgemeine Methylierungsaktivität sowie das relative Vorhandensein von Mono- und Dimethylargininen zu bestimmen. Es konnte gezeigt werden, dass die Methylierung der Sm Proteine einer Michael-Menten Kinetik folgt. Die Rekonstitution von PRMT-Sm Protein Komplexen sowie the Methylierungsreaktionen deuten auf eine schrittweise Zusammenlagerung von 6S auf dem PRMT5 Komplex hin. ... KW - Biogenese KW - Small nuclear RNP KW - Methylierung KW - SMN KW - PRMT5 KW - SMN KW - PRMT5 KW - snRNP KW - sDMA KW - arginine methylation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71300 ER - TY - THES A1 - Müller, Stephanie T1 - Identification of early molecular changes associated with Fumonisin B1-induced carcinogenesis in vivo and in vitro T1 - Frühe molekulare Ereignisse im Mechanismus der Kanzerogenität des Mykotoxins Fumonisin B1 N2 - Fumonisin B1 (FB1) is a mycotoxin produced by various Fusarium species and constitutes a major contaminant of maize worldwide. A 2-year carcinogenicity study of the National Toxicology Program (NTP) in Fischer N344 rats showed that male rats were most susceptible to FB1-induced tumor formation in the kidney. Histopathologically, a rare and highly malignant tumor type originating from the proximal tubules of rat kidney with increased potential for invasion and metastasis was identified. However, mechanisms underlying the FB1-induced carcinogenesis in kidneys of male rats are still not clear. Previous studies have shown that FB1-mediated disruption of sphingolipid metabolism via inhibition of ceramide synthase is a primary key event in FB1 toxicity. The disruption of sphingolipid metabolism may cause time- and dose-related changes in the relative balance of various bioactive intermediates. Furthermore, the ability of FB1 to induce renal cell death and subsequent compensatory cell proliferation is well known, but it does not completely explain the invasive growth characteristics and exceptionally high metastatic potential of FB1-induced tumors. Considering the complexity of sphingolipid metabolism and the fact that various sphingolipids (e.g. ceramide, sphingoid bases and their respective 1-phosphates) act on opposing signaling pathways, it is hypothesized that the balance between individual sphingolipids and thus the overall cellular response to FB1 may shift with time and by continuing FB1 exposure, resulting in the disruption of specific cell signaling pathways, which may promote tumor formation in kidney. To identify early FB1-induced gene expression patterns in the kidney, which may be associated with sphingolipid-mediated signaling pathways in cancer, a short-term i.p. study on FB1 in male Sprague Dawley rats was performed and changes in gene expression were analyzed using a qRT-PCR array that comprises 84 relevant genes of 6 pathways pivotally involved in the formation of cancer. Furthermore, apoptosis and cell proliferation as well as changes in specific sphingolipids were investigated in FB1-treated kidneys. As shown by classical histopathology (H&E) and (immuno)-histochemical staining (TUNEL and BrdU), FB1 caused a time- and dose-dependent increase in tubular apoptosis in the cortex and OSOM of the kidney, which was compensated by the induction of proliferation in the affected areas. HPLC-MS/MS analysis of bioactive sphingolipids demonstrated that FB1 induced a marked elevation of the pro-apoptotic sphingoid bases sphinganine and sphingosine, which paralleled the time- and dose-dependent increase in renal tubular apoptosis. With prolonged exposure to FB1, increased metabolic conversion of the accumulated sphinganine to the sphinganine-1-phosphate, a second messenger with anti-apoptotic and proliferative properties, was observed in kidney. This finding was compliant with the increased regenerative cell proliferation in the cortex and OSOM. In addition to effects on sphingoid bases and their 1-phosphate metabolites, this study, for the first time, demonstrated reduced levels of specific ceramides in rat kidney after FB1 exposure. In particular, C16-ceramide, which is a widespread constituent of membrane-bound complex sphingolipids involved in cell adhesion, was time- and dose-dependently decreased after treatment with FB1. Besides its role as component of the cell membrane, C16-ceramide functions as a signaling molecule for the initiation of apoptosis in response to various stress stimuli. Under conditions of chronic FB1 exposure, a significant reduction in pro-apoptotic C16-ceramide together with markedly increased levels of anti-apoptotic and proliferation-promoting sphingoid base 1-phosphates may thus favor resistance to stress-induced apoptosis and facilitate the survival of abnormal cells with potential to initiate tumor formation. Our study also revealed that early exposure to FB1 resulted in increased expression of a plethora of genes involved in tumor initiation as well as tumor progression. While single FB1 exposure was demonstrated to predominately induce gene expression of proto-oncogenic transcription factors (e.g. Fos, Jun, Myc) and apoptotis-related genes (e.g. members of the tumor-necrosis factor family), repeated exposure resulted in marked upregulation of genes mediating cell survival and cell proliferation (e.g. Bcl-XL, Bcl-2, Nfκb1 and Egfr). Moreover, continued exposure to FB1 initiated increased expression of genes critically involved in tumor migration, adhesion, invasion and metastasis. A close correlation was established between gene expression changes in response to FB1 and known signaling pathways mediated by extracellular or intracellular action of sphingoid base 1-phosphates - bioactive lipids that were markedly increased after FB1 treatment. In particular, genes encoding components of the plasminogen activator system were abundantly upregulated. These mediate invasion and metastasis in response to So1P, and may hence particularly promote the formation of highly aggressive and invasive tumors in kidney as observed after chronic exposure to FB1. Thus, it is conceivable that upregulation of a majority of genes in response to FB1 may be a direct or indirect consequence of increased So1P signaling. Another aim of this study was to identify differences in the organ-specific susceptibility for tumor formation by comparing FB1-mediated effects on apoptosis, cell proliferation, sphingolipids, and selected cancer-related genes in kidney and liver. Collectively, the present results revealed that kidney and liver showed marked differences in several endpoints of FB1 toxicity, which seemed to be primarily associated with their different susceptibility to FB1-mediated alterations in sphingolipid metabolism. The strong correlation between histopathological lesions and alterations in sphingolipid metabolism as well as sphingoid base 1-phosphate accumulation and concomitant S1P receptor expression suggested that tumor formation and progression to highly malignant carcinomas seems to be rather favored in kidney compared to liver. However, genes mostly deregulated by FB1 treatment in kidney (PAI-1, Thbs1 and Itga2) were also found to be induced in liver. To verify FB1-induced gene expression in kidney, normal rat tubular epithelial (NRK-52E) cells were analyzed for FB1-induced expression changes of the same cancer-related genes as in vivo. The results of qRT-PCR analysis revealed that gene expression changes in NRK-52E cells after FB1 treatment strongly correlated with those found in rat kidney and paralleled the marked alterations in sphingolipid metabolism. Furthermore, a good correlation between FB1-induced expression changes of cancer-related genes obtained in vivo and in vitro and those known to be mediated by bioactive sphingoid base 1-phosphates in cancer was established. Moreover, experiments modeling the invasive behavior of NRK-52E cells showed that FB1 may enhance cell invasion, which also correlated with both the increase in invasion- and metastasis-associated genes and bioactive sphingoid base 1-phophates. Importantly, NRK-52E cells basally expressed the S1P receptors S1P2 and S1P3, which are known to be involved in tumor migration and invasion. Since these receptors were also identified as most abundant S1PRs in kidneys of male Sprague Dawley rats, they may present important mediators of gene expression and invasion in response to FB1 in vivo. In summary, FB1-mediated disruption of sphingolipid metabolism and subsequent time- and dose-related increase in intermediates, such as bioactive sphingoid base 1-phosphates, correlate with early changes in genes and signaling pathways that may mediate loss of growth control, replication, evasion of apoptosis, cell motility and invasion, and thus favor renal tumor formation in response to FB1. However, to clarify whether the obtained gene expression changes in cancer-related genes in kidney are specific to the biological action of sphingoid base 1-phosphates and their respective receptors, further mechanistic studies are necessary. N2 - Fumonisin B1 ist ein Mykotoxin, das von verschiedenen Spezies der Gattung Fusarium produziert wird, und weltweit wesentlich zur Kontamination von Mais beiträgt. Eine zweijährige Kanzerogenitätsstudie des National Toxicology Programs (NTP) zeigte, dass männliche Ratten nach Verabreichung von FB1 am anfälligsten für die Bildung von Nierentumoren waren. Aus histopathologischer Sicht handelte es sich dabei um sehr seltene und hoch maligne Formen von Tumoren des proximalen Tubulus der Niere, die eine verstärkte Neigung zur Invasion und Metastasierung aufwiesen. Jedoch sind bis heute die genauen Mechanismen nicht hinreichend geklärt, die zu einer FB1-induzierten Kanzerogenese in der Rattenniere führen können. Frühere Studien berichteten, dass die durch FB1 vermittelte Störung des Sphingolipidmetabolismus mittels Inhibierung der Ceramidesynthase ein initiales Ereignis in der Toxizität darstellt und zu zeit- und dosisabhängigen Veränderungen im relativen Gleichgewicht verschiedener bioaktiver Zwischenprodukte des Sphingolipidmetabolismus führen kann. Des Weiteren ist bekannt, dass FB1 dazu in der Lage ist, in der Niere Zelltod gefolgt von regenerativer Zellproliferation zu induzieren. Dies erklärt jedoch nicht vollständig, wie die durch FB1 verursachten Tumore ein invasives Wachstum und außergewöhnlich hohes Metastasierungspotential erlangen. Die Komplexität des Sphingolipidmetabolismus und die Tatsache, dass verschiedene Sphingolipide (z.B. Ceramide, Sphingoidbasen und ihre entsprechenden 1-Phosphate) einen Einfluss auf gegensätzliche Signalwege in der Zelle ausüben können, deuten darauf hin, dass das Gleichgewicht zwischen den einzelnen Sphingolipiden und somit die gesamten zellulären Effekte von FB1 über die Zeit und mit zunehmender Exposition gegenüber FB1 zu Störungen spezifischer Signalwegen führen können, die eine Tumorentstehung in der Niere begünstigen. Um frühere Effekte von FB1 auf das Expressionsmuster von Genen in der Niere zu ermitteln, die möglicherweise mit den durch Sphingolipide vermittelten Signalwegen und Krebs verbunden sind, wurde eine Kurzzeitstudie mit FB1 in männlichen Sprague Dawley-Ratten durchgeführt und die Veränderungen der Genexpression von 84 Genen der 6 wichtigsten, krebsrelevanten Signalwege mittels qRT-PCR untersucht. In diesem Zusammenhang wurden in Nieren der FB1-behandelten Tiere auch Untersuchungen zu Apoptose, Zellproliferation sowie zu Veränderungen der spezifischen Sphingolipide durchgeführt. Anhand klassischer histopatholgischer sowie (immun)-histologischer Färbungen konnte gezeigt werden, dass FB1 zu einem zeit- und dosisabhängigen Anstieg von Apoptose in Cortex und OSOM der Niere führte, dem gleichzeitig eine gesteigerte Proliferation in den entsprechenden Bereichen folgte. Die HPLC-MS/MS-Analyse bioaktiver Sphingolipide in der Niere zeigte, dass die Behandlung mit FB1 zeitgleich zu einem Anstieg der pro-apoptotischen Sphingoidbasen Sphinganin und Sphingosin und verstärkter tubulärer Apoptose führte. Mit anhaltender Exposition gegenüber FB1 konnte in der Niere eine Zunahme der metabolischen Umwandlung von Sphinganin in Sphinganine-1-Phosphat, einem sekundären Botenstoff mit anti-apoptotischen und wachstumsfördernden Eigenschaften, beobachtet werden. Diese Beobachtung stimmte auch mit der verstärkten regenerativen Zellproliferation in Cortex und OSOM der Niere überein. Weiterhin konnte mittels Sphingolipidanalyse erstmals gezeigt werden, dass die Exposition gegenüber FB1 zu einer Verminderung spezifischer Zellceramide führte. Insbesondere der Gehalt an C16-Ceramid wurden durch die Behandlung mit FB1 zeit- und dosishängig in der Niere reduziert. Neben seiner Funktion als Bestandteil der Zellmembran spielt C16-Ceramide eine wichtige Rolle als Grundbaustein von komplexen, Zelladhäsion fördernden Sphingolipiden und ist in Gegenwart verschiedener Stressfaktoren auch ein wichtiges Signalmolekül in der Initiierung von Apoptose. Im Fall einer chronischen Exposition gegenüber FB1 könnten demnach stark verminderte Gehalte an pro-apoptotischen C16-Ceramid, verbunden mit drastisch erhöhten Gehalten an anti-apoptotischen und wachstumsfördernden Sphingoidbasen-1-Phosphaten, zu einer Resistenz gegenüber stressbedingter Apoptose führen, die das Überleben initiierter Zellen und damit die Tumorentstehung begünstigen. Weiterhin zeigte unsere Studie, dass bereits eine frühe Exposition gegenüber FB1 die Expression einer Reihe von Genen in der Niere erhöht, die in der Tumorentstehung- sowie Progression eine Rolle spielen. Während die einmalige Verabreichung von FB1 hauptsächlich zu einem Anstieg der Expression von Transkriptionsfaktoren (z.B. Protoonkogene wie Fos, Jun und Myc) und apoptotischen Gene (z.B. Mitglieder der Familie der Tumornekrosefaktorrezeptoren) führte, wurde nach mehrmaliger Exposition eine deutliche Heraufregulierung von Genen beobachtet, die das Wachstum und Überleben von Zellen (z.B. Bcl-XL, Bcl-2, Nfκb1 und Egfr) vermitteln. Des Weiteren führte die längere Exposition zu einem Anstieg der Expression von Genen, die entscheidend an Migration, Adhäsion, Invasion und Metastasierung von Tumoren beteiligt sind. Dabei konnte ein enger Zusammenhang zwischen den FB1-induzierten Genexpressionsveränderungen und bereits bekannten extrazellulären und intrazellulären Signalwegen von bioaktiven Sphingoidbasen-1-Phosphaten hergestellt werden. Dazu zählte vor allem die Erhöhung von Genen, die wichtige Komponenten des ‚Plasminogen-Aktivator‘-Systems kodieren, und in Gegenwart von Sphingosine-1-Phosphat zu einer Erhöhung der Invasivität und Metastasierung, und somit möglicherweise auch zu einer begünstigten Bildung hochaggressiver und invasiver Tumoren in der Niere nach chronischer Exposition gegenüber FB1 beitragen können. Ein weiteres Ziel der Studie war es, mögliche Unterschiede in der organspezifischen Disposition für die Entstehung von Tumoren zu ermitteln, indem die FB1-vermittelten Effekte auf Apoptose, Zellproliferation, Sphingolipide, und ausgewählte krebsrelevante Gene zwischen Niere und Leber verglichen wurden. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass zwischen Niere und Leber deutliche Unterschiede in den verschiedenen Endpunkten der FB1-vermittelten Toxizität existieren, welche hauptsächlich mit der unterschiedlichen Anfälligkeit gegenüber den FB1-induzierten Veränderungen des Sphingolipidmetabolismus in Zusammenhang gebracht werden. Anhand der starken Korrelation zwischen den beobachteten histopathologischen Läsionen und gleichzeitig starken Veränderungen im Sphingolipidmetabolismus, sowie der Akkumulation von Sphingoidbasen-1-Phosphaten und entsprechender Expression der Sphingosine-1-Phosphatrezeptoren in der Niere, lässt sich vermuten, dass die Tumorentstehung- und Progression zu hoch malignen Karzinomen eher in der Niere als in der Leber begünstigt ist. Die durch die FB1-Behandlung am stärksten deregulierten Gene (PAI-1, Thbs1 und Itga2) in der Niere, wurden jedoch auch in der Leber durch FB1 induziert. Um die Genexpressionsveränderungen in der Niere zu verifizieren, wurden Ratten-tubulusepithelzellen (NRK-52E-Zellen) mit FB1 behandelt und Veränderungen in der Expression der gleichen krebsrelevanter Gene, die zuvor in vivo untersucht wurden, analysiert. Die Ergebnisse der qRT-PCR-Analyse zeigten, dass die Genexpressionsveränderungen in NRK-52E-Zellen nach Behandlung mit FB1 sowie die damit verbundenen Veränderungen im Sphingolipidmetabolismus stark mit denen in der Rattenniere korrelierten. Es konnte zudem sowohl in vivo als auch in vitro eine gute Übereinstimmung der FB1-induzierten Veränderungen in der Expression krebsrelevanter Gene gefunden werden, die auch in Signalwegen von Sphingoidbasen-1-Phosphaten und der damit verbundenen Krebsentstehung eine Rolle spielen. Darüber hinaus zeigten Experimente zur Untersuchung der Invasivität von NRK-52E-Zellen, dass diese nach Behandlung mit FB1 ein höheres Invasionspotential aufweisen. Dies korrelierte sowohl mit der Beobachtung von Expressionserhöhungen von invasions- und metastasierungsfördernden Genen als auch dem Anstieg bioaktiver Sphingoidbasen-1-Phosphate. Interessanterweise konnte in der vorliegenden Studie festgestellt werden, dass NRK-52E-Zellen die Sphingosine-1-Phosphatrezeptoren S1P2 und S1P3 expremieren und über diese Rezeptoren möglicherweise Signalwege zur Migration und Invasion anregen können. Da S1P2 und S1P3 auch als Hauptsphingosine-1-Phosphatrezeptoren in der Rattenniere identifiziert wurden, lässt sich vermuten, dass diese nach FB1-Behandlung in vivo wesentlich zur Expression von Genen, die die Invasivität von Zellen erhöhen, beitragen können. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die FB1-vermittelte Störung im Sphingolipidmetabolismus und der damit verbundene zeit- und dosisabhängige Anstieg bioaktiver Intermediate wie den Sphingoidbasen-1-Phosphaten, zu frühen Veränderungen in Genen und Signalwegen führen kann. Diese können Zellwachstum, Inhibierung von Apoptose, Migration und Invasion und somit die Bildung von Nierentumoren nach Exposition gegenüber FB1 fördern. Um jedoch zu klären, ob die ermittelten Genexpressionsveränderungen der untersuchten krebsrelevanten Genen in der Niere spezifisch mit der Wirkung von Sphingoidbasen-1-Phosphaten und deren Rezeptoren zusammenhängen, sind weiterführende mechanistische Studien notwendig. KW - Nephrotoxizität KW - Carcinogenität KW - Fumonisine KW - Fumonisin B1 KW - Mykotoxin KW - mycotoxin KW - fumonisin B1 KW - nephrotoxicity KW - carcinogenicity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71336 ER - TY - THES A1 - Cord, Anna T1 - Potential of multi-temporal remote sensing data for modeling tree species distributions and species richness in Mexico T1 - Eignung multi-temporaler Fernerkundungsdaten für die Modellierung von Artverbreitungsgebieten und Diversität von Baumarten in Mexiko N2 - Current changes of biodiversity result almost exclusively from human activities. This anthropogenic conversion of natural ecosystems during the last decades has led to the so-called ‘biodiversity crisis’, which comprises the loss of species as well as changes in the global distribution patterns of organisms. Species richness is unevenly distributed worldwide. Altogether, 17 so-called ‘megadiverse’ nations cover less than 10% of the earth’s land surface but support nearly 70% of global species richness. Mexico, the study area of this thesis, is one of those countries. However, due to Mexico’s large extent and geographical complexity, it is impossible to conduct reliable and spatially explicit assessments of species distribution ranges based on these collection data and field work alone. In the last two decades, Species distribution models (SDMs) have been established as important tools for extrapolating such in situ observations. SDMs analyze empirical correlations between geo-referenced species occurrence data and environmental variables to obtain spatially explicit surfaces indicating the probability of species occurrence. Remote sensing can provide such variables which describe biophysical land surface characteristics with high effective spatial resolutions. Especially during the last three to five years, the number of studies making use of remote sensing data for modeling species distributions has therefore multiplied. Due to the novelty of this field of research, the published literature consists mostly of selective case studies. A systematic framework for modeling species distributions by means of remote sensing is still missing. This research gap was taken up by this thesis and specific studies were designed which addressed the combination of climate and remote sensing data in SDMs, the suitability of continuous remote sensing variables in comparison with categorical land cover classification data, the criteria for selecting appropriate remote sensing data depending on species characteristics, and the effects of inter-annual variability in remotely sensed time series on the performance of species distribution models. The corresponding novel analyses were conducted with the Maximum Entropy algorithm developed by Phillips et al. (2004). In this thesis, a more comprehensive set of remote sensing predictors than in the existing literature was utilized for species distribution modeling. The products were selected based on their ecological relevance for characterizing species distributions. Two 1 km Terra-MODIS Land 16-day composite standard products including the Enhanced Vegetation Index (EVI), Reflectance Data, and Land Surface Temperature (LST) were assembled into enhanced time series for the time period of 2001 to 2009. These high-dimensional time series data were then transformed into 18 phenological and 35 statistical metrics that were selected based on an extensive literature review. Spatial distributions of twelve tree species were modeled in a hierarchical framework which integrated climate (WorldClim) and MODIS remote sensing data. The species are representative of the major Mexican forest types and cover a variety of ecological traits, such as range size and biotope specificity. Trees were selected because they have a high probability of detection in the field and since mapping vegetation has a long tradition in remote sensing. The result of this thesis showed that the integration of remote sensing data into species distribution models has a significant potential for improving and both spatial detail and accuracy of the model predictions. N2 - Sämtliche aktuell zu beobachtenden Veränderungen in der Biodiversität lassen sich fast ausschließlich auf menschliche Aktivitäten zurückführen. In den letzten Jahrzehnten hat insbesondere die anthropogene Umwandlung bisher unberührter, natürlicher Ökosysteme zur sogenannten ‚Biodiversitätskrise‘ geführt. Diese umfasst nicht nur das Aussterben von Arten, sondern auch räumliche Verschiebungen in deren Verbreitungsgebieten. Global gesehen ist der Artenreichtum ungleich verteilt. Nur insgesamt 17 sogenannte ‚megadiverse‘ Länder, welche 10% der globalen Landoberfläche umfassen, beherbergen fast 70% der weltweiten Artenvielfalt. Mexiko, das Studiengebiet dieser Arbeit, ist eine dieser außerordentlich artenreichen Nationen. Aufgrund seiner großen Ausdehnung und geographischen Komplexität kann eine verlässliche und detaillierte räumliche Erfassung von Artverbreitungsgebieten in Mexiko jedoch nicht nur auf Basis dieser Datenbanken sowie von Feldarbeiten erfolgen. In den letzten beiden Jahrzehnten haben sich Artverbreitungsmodelle (Species distribution models, SDMs) als wichtige Werkzeuge für die räumliche Interpolation solcher in situ Beobachtungen in der Ökologie etabliert. Artverbreitungsmodelle umfassen die Analyse empirischer Zusammenhänge zwischen georeferenzierten Fundpunkten einer Art und Umweltvariablen mit dem Ziel, räumlich kontinuierliche Vorhersagen zur Wahrscheinlichkeit des Vorkommens der jeweiligen Art zu treffen. Mittels Fernerkundung können Umweltvariablen mit Bezug zu den biophysikalischen Eigenschaften der Landoberfläche in hohen effektiven räumlichen Auflösungen bereitgestellt werden. Insbesondere in den letzten drei bis fünf Jahren ist daher die Verwendung von Fernerkundungsdaten in der Artverbreitungsmodellierung sprunghaft angestiegen. Da es sich hierbei jedoch immer noch um ein sehr neues Forschungsfeld handelt, stellen diese meist nur Einzelstudien mit Beispielcharakter dar. Eine systematische Untersuchung zur Modellierung von Artverbreitungsgebieten mit Hilfe von Fernerkundungsdaten fehlt bisher. Diese Forschungslücke wurde in der vorliegenden Arbeit aufgegriffen. Hierzu wurden spezifische Untersuchungen durchgeführt, welche insbesondere folgende Aspekte betrachteten: die sinnvolle Verknüpfung von Klima- und Fernerkundungsdaten im Rahmen von Artverbreitungsmodellen, den quantitativen Vergleich von kontinuierlichen Fernerkundungsdaten und einer bestehenden kategorialen Landbedeckungsklassifikation, die Identifizierung von Kriterien zur Auswahl geeigneter Fernerkundungsprodukte, welche die Eigenschaften der Studienarten berücksichtigen, sowie der Einfluss inter-annueller Variabilität in fernerkundlichen Zeitreihen auf die Ergebnisse und Leistungsfähigkeit von Artverbreitungsmodellen. Die entsprechenden neuen Analysen wurden mit Hilfe des von Phillips et al. (2004) entwickelten Maximum Entropy Algorithmus zur Artverbreitungsmodellierung durchgeführt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein umfangreicherer Datensatz an Fernerkundungsvariablen als in der bisherigen Literatur verwendet. Die entsprechenden Fernerkundungsprodukte wurden spezifisch aufgrund ihrer Eignung für die Beschreibung ökologisch relevanter Parameter, die sich auf die Verbreitungsgebiete von Arten auswirken, ausgewählt. Für den Zeitraum von 2001 bis 2009 wurden zwei Terra-MODIS Standardprodukte mit 1 km räumlicher und 16-tägiger zeitlicher Auflösung zu geglätteten, kontinuierlichen Zeitreihen zusammengefügt. Diese Produkte beinhalten den verbesserten Vegetationsindex (Enhanced Vegetation Index, EVI), Reflexionsgrade und die Landoberflächentemperatur (Land Surface Temperature, LST). Diese hochdimensionalen Zeitreihendaten wurden in insgesamt 18 phänologische sowie 35 statistische Maßzahlen überführt, welche auf der Basis einer umfassenden Sichtung der vorhandenen Literatur zusammengestellt wurden. Die Verbreitungsgebiete von zwölf Baumarten wurden mit Hilfe eines hierarchisch aufgebauten Ansatzes, welcher sowohl Klimadaten (WorldClim) als auch Fernerkundungsdaten des MODIS-Sensors berücksichtigt, modelliert. Die Studienarten sind repräsentativ für die in Mexiko vorkommenden Waldtypen und decken eine breite Spannweite ökologischer Eigenschaften wie Größe des Verbreitungsgebietes und Breite der ökologischen Nische ab. Als Studienobjekte wurden Bäume ausgewählt, weil sie im Feld mit hoher Wahrscheinlichkeit richtig erfasst werden und außerdem die fernerkundungsbasierte Kartierung von Vegetation bereits auf eine Vielzahl an Studien zurückgreifen kann. Durch die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Integration von Fernerkundungsdaten in Artverbreitungsmodelle ein signifikantes Potential zur Verbesserung der räumlichen Detailgenauigkeit und der Güte der Modellvorhersagen bietet. KW - Fernerkundung KW - Biodiversität KW - Landnutzung KW - Zeitreihenanalyse KW - Mexiko KW - Artverbreitungsmodellierung KW - Maximum Entropy Algorithmus KW - MODIS KW - Modellierung KW - Remote sensing KW - Species distribution modeling KW - Maximum Entropy algorithm KW - MODIS KW - Mexico Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71021 ER - TY - THES A1 - Güthlein, Frank T1 - Übergangsmetallkatalysierte Synthese von Diboranen(4) T1 - Transition Metal catalyzed Synthesis of Diboranes(4) N2 - Die Diborane(4) Bis(catecholato)diboran und Bis(pinakolato)diboran können durch homogene und heterogene Katalysatoren durch eine Dehydrokupplungsreaktion ausgehend von Catecholboran und Pinakolboran dargestellt werden. Der effizienteste Katalysator für diese Reaktion ist Platin auf Aluminiumoxid, wobei Umsatzzahlen von maximal 11600 und Umsatzfrequenzen von 444 1/h erreicht werden. N2 - The diboranes(4) bis(catecholato)diborane and bis(pinacolato)diborane are synthesized under homogeneous and heterogeneous catalytic conditions starting from catecholborane and pinacolborane via a dehydrocoupling reaction. The most efficient catalyst is platinum on alumina, affording a maximum turnover number of 11600 and a maximum turnover frequency of 444 1/h. KW - Heterogene Katalyse KW - Homogene Katalyse KW - Diborane KW - Bis(catecholato)diboran KW - Bis(pinakolato)diboran KW - Diboran(4) KW - Catalysis KW - Diborane(4) Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71013 ER - TY - THES A1 - Frölich, Nadine T1 - Analyse der µ-Opiatrezeptoraktivierung und Signaltransduktion in lebenden Zellen mittels FRET-Mikroskopie T1 - Analysis of µ-opioid receptor activation and signal transduction in living cells using FRET microscopy N2 - Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer ist ein Phänomen, welches erstmals 1948 von Theodor Förster beschrieben wurde. Mit der Entwicklung von Fluoreszenzproteinen konnten in Kombination mit Mikroskopietechniken Einblicke in zellbiologische Vorgänge gewonnen werden, die durch biochemische oder physiologische Experimente nicht möglich sind. Dabei spielt die hohe zeitliche und räumliche Auflösung eine wichtige Rolle. Auf dem Forschungsgebiet der GPCR, welche die größte Gruppe von Membranproteinen bei den Säugetieren darstellen, wurden insbesondere Erkenntnisse über Konformationsänderungen der Rezeptoren, die Kinetik der Rezeptoraktivierung und die Interaktion mit intrazellulären Signalproteinen gewonnen. Der µ-Opioidrezeptor gehört zur Familie der GPCR und stellt aufgrund seiner analgetischen Wirkungen eine wichtige pharmakologische Zielstruktur dar. Das Ziel dieser Arbeit war sowohl den Rezeptor als auch seine Signalwege mittels FRET-Mikroskopie zu untersuchen. Zunächst sollte ein intramolekularer FRET-Sensor des µ-Opioidrezeptors entwickelt werden, dazu wurden basierend auf den Kenntnissen über die Tertiärstruktur und dem Aufbau bereits bekannter GPCR-Sensoren verschiedene Rezeptorkonstrukte kloniert. Bei den Konstrukten wurden entweder zwei Fluoreszenzproteine oder ein Fluoreszenzprotein und ein Fluorophor-bindendes Tetracysteinmotiv kombiniert. Auch die Positionen der eingefügten Sequenzen wurden in den intrazellulären Domänen variiert, da der Rezeptor auf die Modifikationen mit beeinträchtigter Membranlokalisation reagierte. Durch die Optimierung wurden Rezeptoren konstruiert, die an der Zellmembran lokalisiert waren. Jedoch zeigte keines der Rezeptorkonstrukte Funktionalität im Hinblick auf die Rezeptoraktivierung. Im zweiten Teil wurden die pharmakologischen Effekte der Metabolite von Morphin am humanen µ-Opioidrezeptor systematisch analysiert. Dazu wurde die Fähigkeit der Metabolite, Gi-Proteine zu aktivieren und β-Arrestin2 zu rekrutieren, mittels FRET-basierter Messungen an lebenden Zellen untersucht. Außerdem wurde die Affinität der Metabolite zum humanen µ Opioidrezeptor anhand der Verdrängung eines radioaktiven Liganden analysiert. Meine Experimente identifizierten eine Gruppe mit stark agonistischen und eine mit schwach agonistischen Eigenschaften. Die starken Partialagonisten aktivieren den Rezeptor bereits bei nanomolaren Konzentrationen, während die schwachen Metabolite den Rezeptor erst bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich aktivieren. Die Metabolite Normorphin, Morphin-6-Glucuronid und 6-Acetylmorphin zeigen geringere Potenz als Morphin bei der Gi-Aktivierung aber überraschenderweise höhere Potenz und Effizienz für die β-Arrestin-Rekrutierung. Dies deutet auf eine bevorzugte Aktivierung von β-Arrestin2 hin. Die aus diesen Studien gewonnenen Ergebnisse liefern Hinweise darauf, welche Metabolite bei der Signalverarbeitung am µ Opioidrezeptor in vivo beteiligt sind. N2 - Fluorescence resonance energy transfer was first described by Theodor Förster in 1948. The discovery and development of intrinsic fluorescent proteins revolutionized cell and molecular biology. The FRET-technique allows the analysis of protein-protein interactions and intramolecular conformational changes. In this method, its high temporal and spatial resolution plays a crucial role. Especially in the research field of GPCR, which are the largest family of membrane proteins in mammals, insights into receptor conformational changes, kinetics of receptor activation and the interaction with intracellular proteins were obtained. The µ-opioid receptor belongs to the GPCR family and is involved in analgesia. Therefore, the receptor is an important pharmacological target. Its pharmacological properties were extensively analyzed in the current thesis by FRET. Engineering of an intramolecular MOR-biosensor was initially planned. Based on the knowledge about the tertiary receptor structure and earlier GPCR-sensors, different receptor constructs were cloned. For each receptor construct either two fluorescent proteins or one fluorescent protein and one fluorophore binding tetracysteine motif were combined. The insertion of the additional amino acid sequences prevented the membrane localization for some constructs. Hence, the insertion site of the amioacid sequences was varied in the intracellular loops. Ultimately, the optimization resulted in some membrane localized receptor constructs with the tetracysteine motif in the third intracellular loop. Nevertheless, none of the receptor constructs was functional in terms of measurable conformational change upon receptor activation. In the second part of this thesis, the pharmacological effects of morphine and its metabolites were studied. The analgesic effects of morphine are mainly mediated via the activation of the µ opioid receptor. This receptor activates inhibitory G-proteins and induces the recruitment of β-arrestin2. Therefore I analyzed activation of these two pathways induced by morphine metabolites using FRET-microscopy in living cells. Furthermore, radioligand binding studies were used to determine the affinity of each compound to the human µ-opioid receptor. This approach identified two groups of metabolites, which were classified into strong and weak ligands. Strong partial agonists showed efficacies in the nanomalar range. In contrast, weak metabolites activated µ opioid receptor pathways in the micromolar range. Normorphine, morphine-6-glucuronide and 6 acetylmorphine had lower potencies regarding Gi-protein activation but higher potencies and efficacies for β-arrestin2 recruitment than morphine. These findings indicate that these metabolites are biased towards β-arrestin2 pathways. KW - Opiatrezeptor KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Morphin KW - Stoffwechsel KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Mikroskopie KW - Metabolite von Morphin KW - Metabolismus KW - Metabolites of morphine Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71009 ER - TY - THES A1 - Förtsch, Christina T1 - Pneumolysin: the state of pore-formation in context to cell trafficking and inflammatory responses of astrocytes T1 - Pneumolysin: Einfluss der Porenbildung auf zelluläre Transportprozesse und inflammatorische Antworten in Astrozyten N2 - Pneumolysin, a protein toxin, represents one of the major virulence factors of Streptococcus pneumoniae. This pathogen causes bacterial meningitis with especially high disease rates in young children, elderly people and immunosuppressed patients. The protein toxin belongs to the family of cholesterol-dependent cytolysins, which require membrane cholesterol in order to bind and to be activated. Upon activation, monomers assemble in a circle and undergo conformational change. This conformational change leads to the formation of a pore, which eventually leads to cell lysis. This knowledge was obtained by studies that used a higher concentration compared to the concentration of pneumolysin found in the cerebrospinal fluid of meningitis patients. Thus, a much lower concentration of pneumolysin was used in this work in order to investigate effects of this toxin on primary mouse astrocytes. Previously, a small GTPase activation, possibly leading to cytoskeletal changes, was found in a human neuroblastoma cell line. This led to the hypothesis that pneumolysin can lead to similar cytoskeletal changes in primary cells. The aim of this work was to investigate and characterise the effects of pneumolysin on primary mouse astrocytes in terms of a possible pore formation, cellular trafficking and immunological responses. Firstly, the importance of pore-formation on cytoskeletal changes was to be investigated. In order to tackle this question, wild-type pneumolysin and two mutant variants were used. One variant was generated by exchanging one amino acid in the cholesterol recognising region, the second variant was generated by deleting two amino acids in a protein domain that is essential for oligomerisation. These variants should be incapable of forming a pore and were compared to the wild-type in terms of lytic capacities, membrane binding, membrane depolarisation, pore-formation in artificial membranes (planar lipid bilayer) and effects on the cytoskeleton. These investigations resulted in the finding that the pore-formation is required for inducing cell lysis, membrane depolarisation and cytoskeletal changes in astrocytes. The variants were not able to form a pore in planar lipid bilayer and did not cause cell lysis and membrane depolarisation. However, they bound to the cell membrane to the same extent as the wild-type toxin. Thus, the pore-formation, but not the membrane binding was the cause for these changes. Secondly, the effect of pneumolysin on cellular trafficking was investigated. Here, the variants showed no effect, but the wild-type led to an increase in overall endocytotic events and was itself internalised into the cell. In order to characterise a possible mechanism for internalisation, a GFP-tagged version of pneumolysin was used. Several fluorescence-labelled markers for different endocytotic pathways were used in a co-staining approach with pneumolysin. Furthermore, inhibitors for two key-players in classical endocytotic pathways, dynamin and myosin II, were used in order to investigate classical endocytotic pathways and their possible involvement in toxin internalisation. The second finding of this work is that pneumolysin is taken up into the cell via dynamin- and caveolin-independent pinocytosis, which could transfer the toxin to caveosomes. From there, the fate of the toxin remains unknown. Additionally, pneumolysin leads to an overall increase in endocytotic events. This observation led to the third aim of this work. If the toxin increases the overall rate of endocytosis, the question arises whether toxin internalisation favours bacterial tissue penetration of the host or whether it serves as a defence mechanism of the cell in order to degrade the protein. Thus, several proinflammatory cytokines were investigated, as previous studies describe an effect of pneumolysin on cytokine production. Surprisingly, only interleukin 6-production was increased after toxin-treatment and no effect of endocytotic inhibitors on the interleukin 6-production was observed. The conclusion from this finding is that pneumolysin leads to an increase of interleukin 6, which would not depend on the endocytotic uptake of pneumolysin. The production of interleukin 6 would enhance the production of acute phase proteins, T-cell activation, growth and differentiation. On the one hand, this activation could serve pathogen clearance from infected tissue. On the other hand, the production of interleukin 6 could promote a further penetration of pathogen into host tissue. This question should be further investigated. N2 - Das Protein-Toxin Pneumolysin ist einer der entscheidenden Virulenzfaktoren von Streptococcus pneumoniae. Dieses Protein-Toxin gehört zur Familie der cholesterinabhängigen Zytolysine, die Membrancholesterol für ihre Aktivierung und Bindung benötigen. Nach der Membranbindung ordnen sich die Toxinmonomere kreisförmig an und ändern ihre Konformation, wodurch eine Pore entsteht, die dann zu einer Lyse der Zelle führt. Vor kurzem wurde nach Pneumolysinbehandlung in einer humanen Neuroblastomzelllinie eine Aktivierung kleiner GTPasen gefunden, die für zytoskelettale Veränderungen entscheidend sind (z.B. Zellbewegungen). Deshalb wurde die Hypothese aufgestellt, dass Pneumolysin diese zytoskelettalen Veränderungen auch in primären neuronalen Zellen auslösen könnte. Das Ziel dieser Arbeit war, die Effekte von Pneumolysin auf primäre Mausastrozyten im Hinblick auf Porenbildung, zelluläre Transportprozesse und immunologische Antworten zu untersuchen. Im ersten Teil wird die Bedeutung der Porenbildung auf zytoskelettale Veränderungen untersucht. Hierbei wurden lytische Fähigkeiten, Membranbindung, Membrandepolarisation, Porenbildung im künstlichen Bilayer und Effekte auf das Zytoskelett untersucht. Sowohl der Wildtyp als auch die Varianten zeigten die gleiche Stärke an Membranbindung. Diese Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Porenbildung für die Zell-Lyse, Membrandepolarisation und zytoskelettale Veränderungen in Mausastrozyten wichtig ist und führt zu der Schlussfolgerung, dass nicht die Membranbindung, sondern die Porenbildung entscheidend für die beobachteten zytoskelettalen Veränderungen ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt des Pneumolysin auf zelluläre Transportprozesse untersucht. Erneut zeigten die Pneumolysinvarianten keine Wirkung, während der Wildtyp die Gesamtrate der Endozytose erhöhte. Weiterhin wurde nur der Wildtyp internalisiert. Um einen möglichen Mechanismus für die Internalisierung des Toxins vorschlagen zu können, wurde Pneumolysin als GFP-markiertes Toxin genutzt. Weiterhin wurden einige Marker für unterschiedliche endozytotische Transportprozesse genutzt um eine Ko-lokalisation mit Pneumolysin-GFP zu ermöglichen. Des Weiteren wurden Inhibitoren für zwei Schlüsselproteine endozytotischer Vorgänge, Dynamin und Myosin II, genutzt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass Pneumolysin wahrscheinlich durch dynamin- und caveolin-unabhängige Pinozytose in die Zelle aufgenommen wird. Dieser Mechanismus führt zu der Bildung von Caveosomen, deren weiterer Transport, und somit das Schicksal des internalisierten Toxins, bis heute noch nicht aufgeklärt ist. Die Beobachtung, dass Pneumolysin die Gesamtrate an Endozytose erhöht, führte zum dritten Teil dieser Arbeit. Wenn das Toxin die Gesamtrate an Endozytose erhöht, stellt sich die Frage, ob dieser Vorgang der Zerstörung des Toxins – also einer Abwehr der Zelle – dient, oder ob diese Internalisierung eine Strategie des Pathogens ist, um tiefer in das Wirtsgewebe einzudringen. Aktuelle Studien belegen, dass Pneumolysin einen Einfluss auf inflammatorische Antworten des Immunsystems hat. Aus diesem Grund wurden unterschiedliche proinflammatorische Zytokine untersucht. Überraschenderweise zeigte sich nur eine Erhöhung des Interleukin 6 nach der Toxinbehandlung. Weiterhin hatten die Endozytoseinhibitoren keinen Effekt auf die Produktion dieses proinflammatorischen Zytokins. Pneumolysin führt also zu einem Anstieg der Interleukin 6 Produktion, diese Produktion ist jedoch unabhängig von der Internalisierung dieses Toxins. Die Produktion dieses Interleukins würde zur Produktion der Akute-Phase Proteine, der Aktivierung der T-Zell Antwort, zu Wachstum und Zelldifferenzierung führen. Einerseits könnte diese Aktivierung die Infektion durch das Pathogen bekämpfen. Andererseits könnte S. pneumoniae die erhöhte Produktion durch PLY an Interleukin 6 nutzen um weiter in das Wirtsgewebe vordringen zu können. Diese Frage sollte noch durch weitere Experimente untersucht werden. KW - Streptococcus pneumoniae KW - Toxin KW - Hirnhautentzündung KW - Entzündung KW - Astrozyt KW - Pore KW - Pneumolysin KW - Meningitis KW - Inflammation KW - Zelltransport KW - Porenbildung KW - Pneumolysin KW - Meningitis KW - Inflammation KW - cellular-trafficking KW - Pore-formation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70892 ER - TY - THES A1 - Hupp, Sabrina T1 - Modulation of Actin Dynamics by the Cholesterol-Dependent Cytolysin Pneumolysin - a novel mechanism beyond pore formation T1 - Einfluß des CDCs Pneumolysin auf die Aktin-Dynamik - neue Eigenschaften eines Poren-bildenden Toxins N2 - Streptococcus pneumoniae is one of the major causes of bacterial meningitis, which mainly affects young infants in the developing countries of Africa, Asia (esp. India) and South America, and which has case fatality rates up to 50% in those regions. Bacterial meningitis comprises an infection of the meninges and the sub-meningeal cortex tissue of the brain, whereat the presence of pneumolysin (PLY), a major virulence factor of the pneumococcus, is prerequisite for the development of a severe outcome of the infection and associated tissue damage (e. g. apoptosis, brain edema, and ischemia). Pneumolysin belongs to the family of pore forming, cholesterol-dependent cytolysins (CDCs), bacterial protein toxins, which basically use membrane-cholesterol as receptor and oligomerize to big aggregates, which induce cell lysis and cell death by disturbance of membrane integrity. Multiple recent studies, including this work, have revealed a new picture of pneumolysin, whose cell-related properties go far beyond membrane binding, pore formation and the induction of cell death and inflammatory responses. For a long time, it has been known that bacteria harm the tissues of their hosts in order to promote their own survival and proliferation. Many bacterial toxins aim to rather hijack cells than to kill them, by interacting with cellular components, such as the cytoskeleton or other endogenous proteins. This study was able to uncover a novel capacity of pneumolysin to interact with components of the actin machinery and to promote rapid, actin-dependent cell shape changes in primary astrocytes. The toxin was applied in disease-relevant concentrations, which were verified to be sub-lytic. These amounts of toxin induced a rapid actin cortex collapse in horizontal direction towards the cell core, whereat membrane integrity was preserved, indicating an actin severing function of pneumolysin, and being consistent with cell shrinkage, displacement, and blebbing observed in live cell imaging experiments. In contrast to neuroblastoma cells, in which pneumolysin led to cytoskeleton remodeling and simultaneously to activation of Rac1 and RhoA, in primary astrocytes the cell shape changes were seen to be primarily independent of small GTPases. The level of activated Rac1 and RhoA did not increase at the early time points after toxin application, when the initial shape changes have been observed, but at later time points when the actin-dependent displacement of cells was slower and less severe, probably presenting the cell’s attempt to re-establish proper cytoskeleton function. A GUV (giant unilamellar vesicle) approach provided insight into the effects of pneumolysin in a biomimetic system, an environment, which is strictly biochemical, but still comprises cellular components, limited to the factors of interest (actin, Arp2/3, ATP, and Mg2+ on one side, and PLY on the other side). This approach was able to show that the wildtype-toxin, but not the Δ6 mutant (mutated in the unfolding domain, and thus non-porous), had the capacity to exhibit its functions through a membrane bilayer, meaning it was able to aggregate actin, which was located on the other side of the membrane, either via direct interaction with actin or in an Arp2/3 activating manner. Taking a closer look at these two factors with the help of several different imaging and biochemical approaches, this work unveiled the capacity of pneumolysin to bind and interact both with actin and Arp2 of the Arp2/3 complex. Pneumolysin was capable to slightly stabilize actin in an actin-pyrene polymerization assay. The same experimental setup was applied to show that the toxin had the capacity to lead to actin polymerization through activation of the Arp2/3 complex. This effect was additionally confirmed with the help of fluorescent microscopy of rhodamine (TRITC)-tagged actin. Strongest Arp2/3 activation, and actin nucleation/polymerization is achieved by the VCA domain of the WASP family proteins. However, addition of PLY to the Arp2/3–VCA system led to an enhanced actin nucleation, suggesting a synergistic activation function of pneumolysin. Hence, two different effects of pneumolysin on the actin cytoskeleton were observed. On the one hand an actin severing property, and on the other hand an actin stabilization property, both of which do not necessarily exclude each other. Actin remodeling is a common feature of bacterial virulence strategies. This is the first time, however, that these properties were assigned to a toxin of the CDC family. Cytoskeletal dysfunction in astrocytes leads to dysfunction and unregulated movement of these cells, which, in context of bacterial meningitis, can favor bacterial penetration and spreading in the brain tissue, and thus comprises an additional role of pneumolysin as a virulence factor of Streptococcus pneumonia in the context of brain infection. N2 - S. pneumoniae gehört zur Gruppe der Pathogene, die bakterielle Meningitis verursachen, eine Infektion, die hauptsächlich bei Neugeborenen und Kleinkindern in den Entwicklungsländern von Afrika, Asien und Südamerika auftritt, und in diesen Regionen Sterblichkeitsraten von bis zu 50% aufweist. Meningitis ist eine Infektion der Hirnhäute und dem sich direkt darunter befindlichen Cortex-Gewebe. Pneumolysin (PLY), ein Haupt-Pathogenitätsfaktor des sog. Pneumococcus, ist hauptsächlich verantwortlich für einen schweren Verlauf der Infektion und für Gewebeschädigungen, wie Apoptose, Hirnödemen und Ischämie. Pneumolysin gehört zur Familie der Cholesterol-abhängigen Cytolysine (CDCs), bakteriellen Protein-Toxinen, die an Membran-Cholesterol binden, sich zu großen Aggregaten zusammenschließen und durch die Beeinträchtigung der Membranintegrität (Porenbildung) Zell-Lyse und Zelltod verursachen. Zahlreiche neuere Studien, darunter auch diese Arbeit, haben ein neues Bild von Pneumolysin aufgezeigt, dessen Eigenschaften weit über die Membranbindung, die Poren-Bildung und die Induktion von Zelltod und inflammatorischen Prozessen hinausgehen. Es ist weithin bekannt, dass Bakterien das Gewebe ihres Wirts schädigen, um ihre eigene Vermehrung und ihre Ausbreitung zu begünstigen. In diesem Zusammenhang fungieren bakterielle Toxine als Pathogenitätsfaktoren, die mit zellulären Komponenten, wie dem Zytoskelett und anderen Zytosol-Proteinen interagieren, was allerdings bevorzugt zu Zellveränderungen, und seltener zum Zelltod führt. Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass Pneumolysin schnelle, und zum Teil gravierende, Aktin-abhängige Zellstruktur-Veränderungen in primären Astrozyten hervorruft. Hierbei wurde das Toxin in Konzentrationen appliziert, die im Liquor von Meningitis-Patienten detektiert werden können, und die zusätzlich als sub-lytisch für Astrozyten in Zellkultur verifiziert wurden. Diese Toxin-Mengen führten zu einem schnellen, horizontalen Aktinkortex-Kollaps, wobei die Membranintegrität erhalten blieb. Dies deutete auf eine „Severing“-Funktion (das Abtrennen oder Zerschneiden von Aktinfilamenten) von Pneumolysin hin, was mit den Beobachtungen übereinstimmt, die in Experimenten mit lebendigen Zellen gemacht wurden (Zellveränderungen, Zellbewegungen und „Blebbings“). Im Gegensatz zu Neuroblastoma Zellen, in denen Pneumolysin Zytoskelett-Veränderungen, und gleichzeitig die Aktivierung von Rac1 und RhoA verursachte, waren die Zell-Veränderungen bei Astrozyten primär unabhängig von der Aktivierung kleiner GTPasen. Obwohl gezeigt werden konnte, dass die Veränderungen vom Aktin-Zytosklett abhängig waren, war das Level an Rac1 und RhoA in den frühen Phasen nach der Toxin-Gabe nicht erhöht. Eine Aktivierung der GTPasen konnte dahingegen zu späteren Zeitpunkten detektiert werden, in denen die Zellbewegung abgeschwächt und verlangsamt war. Die späte Aktivierung kann als Reaktion der Zelle auf die vom Toxin ausgelösten Veränderungen gesehen werden, die zu einer Wiederherstellung der normalen Zytoskelett-Funktion führen soll. GUV-Experimente ermöglichten eine genauere Betrachtung der Pneumolysin-Effekte in einem biomimetischen, jedoch strikt biochemischen Ansatz, der alle zellulären Komponenten enthält, die untersucht werden sollen (Pneumolysin, Aktin, Arp2/3, ATP, und Mg2+). Im GUV-System befand sich das Toxin im Inneren der Vesikel, und Aktin in der extra-vesikulären Suspension, einem Verhältnis genau umgekehrt zum zellullären System. Zusätzlich wurden Arp2/3 und ATP/Mg2+, für die Aktin-Polymerisierung essentielle Faktoren, in der Aktin-Suspension zur Verfügung gestellt. Die GUV-Experimente konnten zeigen, dass Wildtyp-Pneumolysin, allerdings nicht seine Mutante Δ6-PLY (Mutation in der sog. unfolding domain, und deshalb nicht Poren-bildend), seine Effekte auf das Aktin-Zytoskelett durch die Membran-Barriere hindurch, in einer Membran-gebundenen Form ausüben kann. Aktin wurde an den Stellen höchster Toxinbindung aggregiert, was entweder über eine direkte Interaktion von PLY mit Aktin, oder über eine Aktivierung des Aktin-Effektors Arp2/3 durch Pneumolysin erklärt werden kann. Weitere biochemische Ansätze (wie enzyme-linked sorbent assays, ELSAs) und Mikroskopie-Techniken (Immunocyto-Chemie) konnten beweisen, dass Pneumolysin sowohl mit Aktin, als auch mit Arp2 (einer Komponente des heptameren Arp2/3 Proteinkomplexes) direkt interagieren kann. Aktin-Pyren Experimente und Fluoreszenzmikroskopie (von TRITC-markiertem Aktin) wiesen auf eine Kapazität von Pneumolysin hin, Aktin direkt zu stabilisieren, und über die Aktivierung von Arp2/3 eine Aktin-Polymerisierung hervorrufen zu können. KW - Hirnhautentzündung KW - Bakteriengift KW - Perforine KW - Actin KW - Meningitis KW - Meningitis KW - Bacterial Toxins KW - Pneumolysin KW - Actin KW - Pore formation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70889 ER - TY - THES A1 - Dang, Nghia Duc T1 - Konzeption und Evaluation eines hybriden, skalierbaren Werkzeugs zur mechatronischen Systemdiagnose am Beispiel eines Diagnosesystems für freie Kfz-Werkstätten T1 - Conception and evaluation of a hybrid, scalable tool for mechatronical system diagnosis on the example of a diagnostic system for independent car repair shops N2 - Die Entwicklung eines wissensbasierten Systems, speziell eines Diagnosesystems, ist eine Teildisziplin der künstlichen Intelligenz und angewandten Informatik. Im Laufe der Forschung auf diesem Gebiet wurden verschiedene Lösungsansätze mit unterschiedlichem Erfolg bei der Anwendung in der Kraftfahrzeugdiagnose entwickelt. Diagnosesysteme in Vertragswerkstätten, das heißt in Fahrzeughersteller gebundenen Werkstätten, wenden hauptsächlich die fallbasierte Diagnostik an. Zum einen hält sich hier die Fahrzeugvielfalt in Grenzen und zum anderen besteht eine Meldepflicht bei neuen, nicht im System vorhandenen Fällen. Die freien Werkstätten verfügen nicht über eine solche Datenbank. Somit ist der fallbasierte Ansatz schwer umsetzbar. In freien Werkstätten - Fahrzeughersteller unabhängigen Werkstätten - basiert die Fehlersuche hauptsächlich auf Fehlerbäumen. Wegen der wachsenden Fahrzeugkomplexität, welche wesentlich durch die stark zunehmende Anzahl der durch mechatronische Systeme realisierten Funktionen bedingt ist, und der steigenden Typenvielfalt ist die geführte Fehlersuche in freien Werkstätten nicht immer zielführend. Um die Unterstützung des Personals von freien Werkstätten bei der zukünftigen Fehlersuche zu gewährleisten, werden neue Generationen von herstellerunabhängigen Diagnosetools benötigt, die die Probleme der Variantenvielfalt und Komplexität lösen. In der vorliegenden Arbeit wird ein Lösungsansatz vorgestellt, der einen qualitativen, modellbasierten Diagnoseansatz mit einem auf heuristischem Diagnosewissen basierenden Ansatz vereint. Neben der Grundlage zur Wissenserhebung werden in dieser Arbeit die theoretische Grundlage zur Beherrschung der Variantenvielfalt sowie die Tests für die erstellten Diagnosemodelle behandelt. Die Diagnose ist symptombasiert und die Inferenzmechanismen zur Verarbeitung des Diagnosewissens sind eine Kombination aus Propagierung der abweichenden physikalischen Größen im Modell und der Auswertung des heuristischen Wissens. Des Weiteren werden in dieser Arbeit verschiedene Aspekte der Realisierung der entwickelten theoretischen Grundlagen dargestellt, zum Beispiel: Systemarchitektur, Wissenserhebungsprozess, Ablauf des Diagnosevorgangs in den Werkstätten. Die Evaluierung der entwickelten Lösung bei der Wissenserhebung in Form von Modellerstellungen und Modellierungsworkshops sowie Feldtests dient nicht nur zur Bestätigung des entwickelten Ansatzes, sondern auch zur Ideenfindung für die Integration der entwickelten Tools in die existierende IT-Infrastruktur. N2 - The development of a knowledge-based system - in particular a diagnostic system - is a branch of artificial intelligence and applied computer science. Throughout the research in this field, various approaches have been developed with varying degrees of success in the application in automotive diagnostics. Diagnostic systems in authorized garages i.e. in garages bound to vehicle manufacturers mainly apply case-based diagnosis. In those cases first the variance of vehicles is limited and second there is a reporting obligation of new, yet not existing cases within the system. The independent repair shops do not have such a database. Thus, the case-based approach is difficult to implement. In independent garages - car manufacturer independent garages - the troubleshooting is mainly based on fault trees. Because of the growing complexity of vehicles, which is mainly due to the rapidly increasing number of functions realized by mechatronic systems and the increasing variety of vehicle types, guided troubleshooting for independent garages is not always productive. To ensure the support of the staff of independent garages in the future troubleshooting, new generations of multivendor diagnostic tools are needed to solve the problems of the variety and complexity. In the present paper an approach is presented which combines a qualitative, model-based diagnostic approach to a heuristic diagnostic knowledge-based approach. In addition to the basis for knowledge collection in this study the theoretical basis for the control of the variety and the tests for the generated diagnosis models are discussed. The diagnosis is symptom-based and the inference mechanisms for processing of diagnostic knowledge are a combination of propagation of the different physical parameters in the model and the evaluation of heuristic knowledge. Furthermore, various aspects of the implementation of the developed theoretical basis are presented in this thesis, for example: system architecture, knowledge collection process, the course of action of the diagnostic process in the workshops. The evaluation of the developed solution for the collection of knowledge in the form of preparation of models and modeling workshops, as well as field tests not only serves to validate the developed approach, but also to find ideas for the integration of the developed tools into the existing IT infrastructure. KW - Diagnosesystem KW - Künstliche Intelligenz KW - Modellbasierte Diagnose KW - Werkstattdiagnose KW - hybride Diagnose KW - skalierbare Diagnose KW - Inferenz KW - Angewandte Informatik KW - aftermarket diagnostic KW - model-base diagnosis KW - hybrid Diagnostic Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70774 ER - TY - THES A1 - Dill, Holger T1 - Functional characterization of the microRNA-26 family in zebrafish neurogenesis T1 - Funktionelle Charakterisierung der microRNA-26 Familie während der Zebrafisch Neurogenese N2 - Formation oft the central nervous system (CNS) from multipotent neuronal stem cells (NSCs) requires a tightly controlled, step-wise activation of the neuronal gene expression program. Expression of neuronal genes at the transition from neural stem cell to mature neuron (i. e. neuronal cell differentiation) is controlled by the Repressor element 1 (RE1) silencing transcription factor (REST) complex. As a master transcriptional regulator, the REST-complex specifically inhibits expression of neuronal genes in non-neuronal tissues and neuronal progenitor cells. Differentiation of NSCs to mature neurons requires the activation of genes controlled by the REST-complex, but how abrogation of REST-complex mediated repression is achieved during neurogenesis is only poorly understood. MicroRNAs (miRNAs) are a class of small regulatory RNAs that posttranscriptionally control target gene expression. Binding of miRNAs to target sequences in the 3’UTR of mRNAs, leads either to degradation or translational inhibition of the mRNA. Distinct neuronal miRNAs (e.g. miR-124) were shown to modulate REST-complex activity by silencing expression of REST-complex components. Interestingly, these miRNAs are also under transcriptional control of the REST-complex and inactivation of the REST-complex precedes their expression. Hence, additional factors are required for derepression of neuronal genes at the onset of neurogenesis. In this study function of the miR-26 family during neurogenesis of the zebrafish (Danio rerio) was analyzed. Computational target prediction revealed a number of REST-complex components as putative miR-26 targets. One of these predicted target genes, the C-terminal domain small phosphatase 2 (Ctdsp2) was validated as an in vivo target for miR-26b. Ctdsps are important cofactors of REST and suppress neuronal gene expression by dephosphorylating the C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II (Pol II). Interestingly, miR-26b is encoded in an intron of the ctdsp2 primary transcript and is cotranscribed together with its host gene. Hence, miR-26b modulates expression of its host gene ctdsp2 in an intrinsic negative autoregulatory loop. This negative autoregulatory loop is inactive in NSCs because miR-26b biogenesis is inhibited at the precursor level. Generation of mature miR-26b is activated during neurogenesis, where it suppresses Ctdsp2 protein expression and is required for neuronal cell differentiation in vivo. Strikingly, miR-26b is expressed prior to miR-124 during neuronal cell differentiation. Thus, it is reasonable to speculate about a function of miR-26b in early events of neurogenesis. In line with this assumption, knockdown of miR-26b in zebrafish embryos results in downregulation of REST-complex controlled neuronal genes and a block in neuronal cell differentiation, most likely due to aberrant regulation of Ctdsp2 expression. This is evident by reduced numbers of secondary motor neurons compared to control siblings. In contrast, motor neuron progenitor cells and glia cells were not affected by depletion of miR-26b.This study identifies the ctdsp2/miR-26b autoregulatory loop as the first experimentally validated interaction between an intronic miRNA and its host gene transcript. Silencing of ctdsp2 by miR-26b in neurons is possible because biogenesis of the ctdsp2 mRNA and mature mir-26b is uncoupled at the posttranscriptional level. Furthermore the obtained data indicate a cell type specific role for miR-26b in vertebrate neurogenesis and CNS development. N2 - Die Entwicklung des Zentralen Nervensystems (ZNS) aus multipotenten neuronalen Stammzellen erfordert eine stufenweise und genau regulierte Aktivierung der neuronalen Genexpression. Bei der Differenzierung neuronaler Stammzellen zu Neuronen wird die Expression neuronaler Gene durch den sogenannten „Repressor element 1 (RE1) silencing transcription factor (REST)”-Komplex gesteuert. Der REST-Komplex unterdrückt spezifisch in proliferierenden neuronalen Vorläuferzellen die Expression neuronaler Gene. Während der neuronalen Zelldifferenzierung wird die Expression dieser Gene jedoch benötigt. Wie die Inaktivierung neuronaler Gene durch den REST-Komplex während des Prozesses der Neurogenese aufgehoben wird ist bislang nicht genau bekannt. MicroRNAs (miRNAs) sind kleine regulatorische RNAs, die die Expression ihrer Zielgene auf posttranskriptioneller Ebene regulieren. Dazu binden miRNAs an Zielsequenzen in 3’UTRs von mRNAs, was zu einer Inhibition der Translation oder Abbau der mRNA führt. Auch Komponenten des REST-Komplexes stehen unter Kontrolle bestimmter neuronaler miRNAs (z.B. miR-124). Erstaunlicherweise stehen diese miRNAs selber wiederum unter der transkriptionellen Inhibition des REST-Komplexes und können daher nicht für die Inaktivierung des REST-Komplexes zu Beginn der Neurogenese verantwortlich sein. Übereinstimmend damit konnte beobachtet werden, dass der REST-Komplex aus differenzierenden Zellen entfernt wird, bevor die genannten neuronalen miRNAs exprimiert werden. Diese Umstände legen die Existenz weiterer, bis jetzt unbekannter Faktoren nahe, die die Expression des REST-Komplexes selber inhibieren und so die Neurogenese erlauben Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Funktion der miR-26 Familie während der Neurogenese des Zebrafisches (Danio rerio) untersucht. Eine bioinformatische Zielgenvorhersage für die miR-26 Familie ergab, dass unter anderem zahlreiche bekannte Komponenten des REST-Komplexes unter den Kandidatengenen sind. Für eines dieser vorhergesagten Zielgene, die sogenannte „C-terminal domain small phosphatase 2 (Ctdsp2)” wurde daraufhin gezeigt, dass seine Expression in der Tat durch die miR-26b inhibiert wird. Ctdsps sind wichtige Kofaktoren des REST-Komplexes und unterdrücken die Expression neuronaler Gene, indem die die C-terminale Domäne (CTD) der RNA Polymerase II dephosphorylieren und diese dadurch inaktivieren. In diesem Zusammenhang von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, dass die miR-26b in einem Intron des ctdsp2 Gens kodiert ist und mit ctdsp2 zusammen transkribiert wird. Folglich beeinflusst die miR-26b die Expression ihres eigenen „Host genes“ in einer Art autoregulativer Rückkopplungsschleife. Die beschriebene negative Regulation ist in neuronalen Stammzellen nicht aktiv, da dort die Biogenese der miR-26b auf Vorläuferebene angehalten wird. Reife miR-26b wird erst während der Neurogenese produziert, wo sie daraufhin die Expression von Ctdsp2 Protein verhindert. Während der neuronalen Zelldifferenzierung wird die miR-26b deutlich früher exprimiert als zum Beispiel die miR-124. Daher liegt es nahe eine Funktion der miR-26b während früher Prozesse in der Neurogenese anzunehmen. In Übereinstimmung mit dieser Annahme führt ein „Knockdown“ der miR-26b zu einer schwächeren Expression von neuronalen Genen, die unter der Kontrolle des REST-Komplex stehen. Weiterhin führt ein reduziertes Maß an miR-26b zu fehlerhafter oder gänzlich ausbleibender neuronaler Zelldifferenzierung. Dies konnte anhand einer verringerten Anzahl differenzierter spinaler Motorneuronen aufgezeigt werden. Die Vorläufer dieser Motorneuronen und Gliazellen waren hingegen vom miR-26b-„Knockdown“ nicht beeinflusst. Die hier präsentierte Studie zeigt erstmals in experimenteller Weise das Vorhandensein einer direkten Interaktion zwischen einer intronischen miRNA und ihrem eigenen Primärtranskript. Die negative Regulation der Ctdsp2 Expression in Neuronen wird erst dadurch möglich, dass die Biogenese der ctdsp2 mRNA und der reifen miR-26b durch einen posttranskriptionellen Mechanismus voneinander getrennt werden. Weiterhin legen die Daten aus dieser Studie nahe, dass die miR-26b in der Tat eine spezifische Funktion in der Entwicklung des ZNS von Vertebraten hat. KW - Zebrabärbling KW - Neurogenese KW - miRNS KW - Zelldifferenzierung KW - miR-26b KW - ctdsp2 KW - REST Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70757 ER - TY - THES A1 - Alcantarino Menescal, Luciana T1 - In vivo characterization of genetic factors involved in Xmrk driven melanoma formation in Medaka (Oryzias latipes): a closer look at braf, Stat5 and c-myc T1 - In vivo Charakterisierung genetischer Faktoren mit Einfluss auf Xmrk induzierte Melanome in Medaka (Oryzias latipes): Untersuchung von braf, Stat5 und c-myc. N2 - Melanoma arises from the malignant transformation of melanocytes and is one of the most aggressive forms of human cancer. In fish of the genus Xiphophorus, melanoma development, although very rarely, happens spontaneously in nature and can be induced by interspecific crossing. The oncogenic receptor tyrosine kinase, Xmrk, is responsible for melanoma formation in these fishes. Since Xiphophorus are live-bearing fishes and therefore not compatible with embryonic manipulation and transgenesis, the Xmrk melanoma model was brought to the medaka (Oryzias latipes) system. Xmrk expression under the control of the pigment cell specific mitf promoter leads to melanoma formation with 100% penetrance in medaka. Xmrk is an orthologue of the human epidermal growth factor receptor (EGFR) and activates several downstream signaling pathways. Examples of these pathways are the direct phosphorylation of BRAF and Stat5, as well as the enhanced transcription of C-myc. BRAF is a serine-threonine kinase which is found mutated at high frequencies in malignant melanomas. Stat5 is a transcription factor known to be constitutively activated in fish melanoma. C-myc is a transcription factor that is thought to regulate the expression of approximately 15% of all human genes and is involved in cancer progression of a large number of different tumors. To gain new in vivo information on candidate factors known to be involved in melanoma progression, I identified and analysed BRAF, Stat5 and C-myc in the laboratory fish model system medaka. BRAF protein motifs are highly conserved among vertebrates and the results of this work indicate that its function in the MAPK signaling is maintained in medaka. Transgenic medaka lines carrying a constitutive active version of BRAF (V614E) showed more pigmented skin when compared to wild type. Also, some transiently expressing BRAF V614E fishes showed a disrupted eye phenotype. In addition, I was able to identify two Stat5 copies in medaka, named Stat5ab/a and Stat5ab/b. Sequence analysis revealed a higher similarity between both Stat5 sequences when compared to either human Stat5a or Stat5b. This suggests that the two Stat5 copies in medaka arose by an independent duplication processes. I cloned these two Stat5 present in medaka, produced constitutive active and dominant negative gene versions and successfully established transgenic lines carrying each version under the control of the MITF promoter. These lines will help to elucidate questions that are still remaining in Stat5 biology and its function in melanoma progression, like the role of Stat5 phosphorylation on tumor invasiveness. In a third project during my PhD work, I analysed medaka C-myc function and indentified two copies of this gene in medaka, named c-myc17 and c-myc20, according to the chromosome where they are located. I produced conditional transgenic medaka lines carrying the c-myc17 gene coupled to the hormone binding domain of the estrogen receptor to enable specific transgene activation at a given time point. Comparable to human C-myc, medaka C-myc17 is able to induce proliferation and apoptosis in vivo after induction. Besides that, C-myc17 long-term activation led to liver hyperplasia. In summary, the medaka models generated in this work will be important to bring new in vivo information on genes involved in cancer development. Also, the generated transgenic lines can be easily crossed to the melanoma developing Xmrk medaka lines, thereby opening up the possibility to investigate their function in melanoma progression. Besides that, the generated medaka fishes make it possible to follow the whole development of melanocytes, since the embryos are transparent and can be used for high throughput chemical screens. N2 - Melanome entstehen durch die krankhafte Transformation von Melanozyten und sind eine der aggressivsten Krebsarten beim Menschen. In Fischen der Gattung Xiphophorus können, wenn auch sehr selten, spontan Melanome entstehen oder durch spezielle Artenkreuzungen induziert werden. Grundlage für das Entstehen der Melanome in diesen Fischen ist die Rezeptortyrosinkinase Xmrk. Da alle Xiphophorus-Arten lebendgebärend sind und keine Manipulationen an Embryonen vorgenommen werden können, wurde ein Xmrk Melanommodel für Medaka (Oryzias latipes) etabliert. Die Expression von Xmrk in Pigmentzellen dieser Fischart resultiert mit 100%iger Penetranz in Melanomen. Das Xmrk ist ein Ortholog des menschlichen „epidermal growth factor“ (EGFR) und aktiviert verschiedene nachgeschaltete Signalwege. Beispiele für diese Aktivierungen sind die Phosphorylierung von BRAF, Stat5 und die erhöhte Expression von c-myc. BRAF ist eine Serin-Threoninkinase, welche oft in malignen Melanomen mutiert ist. Stat5 ist ein Transkriptionsfaktor, welcher dauerhaft in Fischtumoren aktiviert ist. C-myc ist ein Transkriptionsfaktor, welcher etwa 15% aller menschlichen Gene sowie die Entstehung vieler menschlicher Tumore reguliert. Um neue Einsichten in die Funktion der Kanidatengene im Prozess der Melanomentstehung in vivo zu erlangen, habe ich Orthologe von BRAF, Stat5 und C-myc bei Medaka identifiziert und analysiert. Die Domänen des BRAF Proteins sind hoch konserviert in allen Vertebraten. Weiterhin deuten die Ergebnisse meiner Arbeit auf eine Beibehaltung der Funktionen im MAPK Signalweg hin. Transgene Medakalinien, welche eine dauerhaft aktive Version des BRAF Gens (V614E) exprimieren, weisen einerseits eine stärkere Hautpigmentierung auf. Weiterhin treten in diesen Fischen Veränderungen der Augen auf. In einem weiteren Projekt meiner Arbeit gelang es mir, zwei Kopien des Stat5 Gens im Medaka zu identifizieren, Stat5ab/a und Stat5ab/b. Sequenzanalysen zeigten eine höhere Übereinstimmung zwischen den beiden Genkopien, als zwischen denen von Medaka und Menschen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die beiden Medaka Gene durch eine unabhängige Duplikation entstanden. In meiner Arbeit habe ich beide Gene des Medakas kloniert und jeweils eine konstitutiv aktive und eine dominant negative Version der Gene hergestellt. Weiterhin konnte ich erfolgreich für jede Genversion eine transgene Medakalinie etablieren, welche die verschiedenen Genvarianten unter der Kontrolle des pigmentzellspezifischen Promoters des mitf Gens exprimieren. Diese Linien werden in Zukunft helfen, den Einfluss von Stat5 Signalen auf den Prozess der Melanomverbreitung und dessen Invasivität zu erklären. In einem dritten Projekt meiner Doktorarbeit untersuchte ich das Vorkommen und die Funktion der C-myc Gene des Medakas. Ich konnte zwei Genkopien identifizieren, c-myc17 und c-myc20, welche auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind. Ich konnte induzierbare, stabil transgene Linien herstellen, welche ein Fusionsprotein aus C-myc17 und der Hormonbindungsdomäne des Östrogenrezeptors von Maus exprimiert. Diese Linie ermöglichte eine induzierbare Aktivität des Transgens. Vergleichbar zum menschlichen MYC ist C-myc17 fähig, nach Aktivierung Proliferation und Apoptose in vivo auszulösen. Dauerhafte Aktivierung über einen längeren Zeitraum führt in diesen Linien zu Hyperplasie in Leber. Die verschiedenen Fischmodelle, die während dieser Arbeit generiert wurden, werden essentiell sein, um neue Einsichten in die Rolle diese Faktoren während der Krebsentwicklung in vivo zu erlangen. Weiterhin ermöglichen diese transgenen Linien durch einfaches Auskreuzen auf Xmrk Linien, deren Einfluss auf die Verbreitung von Melanomen zu untersuchen. Letztendlich sind mit diesen Linien auch Untersuchungen der Entwicklung von Pigmentzellen über Zeit möglich, da die Embryonen transparent sind und sich für chemisches Hochdurchsatz-Screening eignen. KW - Japankärpfling KW - Melanom KW - Myc KW - Molekulargenetik KW - melanoma KW - medaka KW - BRAF KW - Stat5 KW - c-myc KW - melanoma KW - medaka KW - BRAF KW - Stat5 KW - c-myc Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70762 ER - TY - THES A1 - Kubisch, Alexander T1 - Range border formation in the light of dispersal evolution T1 - Die Ausbildung von Verbreitungsgrenzen unter Berücksichtigung der Evolution des Ausbreitungsverhaltens N2 - Understanding the emergence of species' ranges is one of the most fundamental challenges in ecology. Early on, geographical barriers were identified as obvious natural constraints to the spread of species. However, many range borders occur along gradually changing landscapes, where no sharp barriers are obvious. Mechanistic explanations for this seeming contradiction incorporate environmental gradients that either affect the spatio-temporal variability of conditions or the increasing fragmentation of habitat. Additionally, biological mechanisms like Allee effects (i.e. decreased growth rates at low population sizes or densities), condition-dependent dispersal, and biological interactions with other species have been shown to severely affect the location of range margins. The role of dispersal has been in the focus of many studies dealing with range border formation. Dispersal is known to be highly plastic and evolvable, even over short ecological time-scales. However, only few studies concentrated on the impact of evolving dispersal on range dynamics. This thesis aims at filling this gap. I study the influence of evolving dispersal rates on the persistence of spatially structured populations in environmental gradients and its consequences for the establishment of range borders. More specially I investigate scenarios of range formation in equilibrium, periods of range expansion, and range shifts under global climate change ... N2 - Die Frage nach den Ursachen für die Ausbildung von Verbreitungsgrenzen ist ein zentrales Thema ökologischer Forschung. Dabei wurde die Bedeutung geographischer Barrieren als natürliche Grenzen der Ausbreitung von Populationen früh erkannt. Jedoch findet man oft auch in sich graduell ändernden Landschaften, in denen keine Barrieren zu finden sind, sehr scharfe Verbreitungsgrenzen. Mechanistische Erklärungen hierfür unterscheiden zwischen solchen Umweltgradienten, welche entweder die Variabilität der biotischen und abiotischen Umgebung in Raum und Zeit oder die Fragmentierung von Habitat beeinflussen. Dabei wird die spezifische Lage der Verbreitungsgrenze von weiteren Mechanismen beeinflusst, wie Allee-Effekten (d.h. verringerte Wachstumsraten bei kleiner Populationsgröße oder -dichte), zustands- bzw. kontextabhängigem Dispersal und biologischen Interaktionen. Dispersal, das heißt Ausbreitung im Raum mit potentiellen Konsequenzen für den Genaustausch zwischen Populationen, stand im Fokus vieler Studien, die sich mit der Ausbildung von Verbreitungsgrenzen beschäftigt haben. Es ist bekannt, dass das Ausbreitungsverhalten von Populationen sehr variabel ist und selbst innerhalb kurzer Zeit evolvieren kann. Trotzdem haben sich erst wenige Studien mit den Folgen der Evolution des Ausbreitungsverhaltens für biogeographische Muster befasst. Die vorliegende Dissertation verfolgt das Ziel, diese Lücke zu füllen. Ich untersuche den Einfluss evolvierender Emigrationsraten auf das Überleben von räumlich strukturierten Populationen, sowie dessen Konsequenzen für die Etablierung und Dynamik von Verbreitungsgebieten. Dafür ziehe ich verschiedene Szenarien heran. Diese bilden die Verbreitung von Arten im Gleichgewicht, während Phasen der Expansion des Verbreitungsgebietes, sowie im Kontext des globalen Klimawandels ab ... KW - Areal KW - Verhalten KW - Evolution KW - Simulation KW - Verbreitungsgrenzen KW - Ausbreitung KW - Invasion KW - range formation KW - dispersal KW - evolution KW - individual-based simulation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70639 ER - TY - THES A1 - Gerend, Jennifer T1 - U.S. and German Approaches to Regulating Retail Development: Urban Planning Tools and Local Policies T1 - Standortplanung im Einzelhandel in den USA und in Deutschland: Steuerungselemente und Standortpolitik N2 - This dissertation examines retail development regulation in the U.S. and in Germany, comparing the various urban planning tools and policies in use by municipal governments. These similarities and differences are explored through research into three case study cities in each country, with special attention paid to how these governments regulate large-scale or "big box" retail. N2 - Diese Dissertation untersucht die Standortplanung im Einzelhandel in den USA und in Deutschland. In den USA wie auch in Deutschland gibt es eine Raumplanung auf staatlicher Ebene und auf der Ebene der Länder- bzw. Bundesstaaten und der Kommunen, deren jeweiligen Möglichkeiten der Steuerung sehr unterschiedlich sind. Diese Unterschiede werden in der Dissertation vorgestellt. Anschließend werden anhand von jeweils drei Beispielen in den beiden Ländern die spezifischen stadtplanerischen Instrumente und Möglichkeiten der Steuerung unter besonderer Berücksichtigung der Ansiedlung von großflächigen Einzelhändlern und Einkaufszentren untersucht und dargestellt. KW - Einzelhandel KW - Handelsgeographie KW - Stadtplanung KW - Standortpolitik KW - Deutschland KW - USA KW - City Planning in the USA Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70257 ER - TY - THES A1 - Stich, Dominik T1 - Zur Exziton- und Ladungsträgerdynamik in einwandigen Kohlenstoffnanoröhren T1 - Exciton and charge carrier dynamics in single-wall carbon nanotubes N2 - In dieser Dissertation wurde die Exziton- und Ladungsträgerdynamik in halbleitenden und metallischen einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWNTs) mittels zeitkorreliertem Einzelphotonenzählen (TCSPC) und transienter Absorptionsspektroskopie untersucht. Die Experimente wurden an Tensid- oder DNA-stabilisierten SWNT-Proben in Suspension durchgeführt, in denen durch Dichtegradientenultrazentrifugation (DGU) halbleitende (6,5)-Röhren oder metallische (9,9)-Röhren angereichert wurden. Für die Herstellung der metallischen SWNT-Proben wurde das DGU-Verfahren optimiert. Metallische SWNT-Proben wiesen eine Verunreinigung von etwa 3% halbleitenden SWNTs auf. Von den angereicherten metallischen SWNTs war die (9,9)-Röhre mit einem relativen Anteil von 40% die vorherrschende Chiralität. Für transiente Absorptionsmessungen wurden die metallischen SWNT-Proben zudem durch Filtration aufkonzentriert. Halbleitende (6,5)-Proben wurden mit einem standardmäßig verwendeten Rezept hergestellt. Mit TCSPC-Messungen an (6,5)-Proben wurde erstmals gezeigt, dass halbleitende SWNTs neben der kurzlebigen Fluoreszenz des S1-Exzitons, die auf der ps-Zeitskala abläuft, auch eine langlebig Fluoreszenzkomponente aufweisen. Diese klingt mit t^−1 ab und stammt ebenfalls aus dem S1-Exzitonzustand. Das relative Gewicht der langlebigen Komponente an der Quantenausbeute beträgt (7 ± 2)%. Bei der langlebige Fluoreszenzkomponente handelt es sich um verzögerte Fluoreszenz. Diese entsteht durch die Wiederbesetzung des S1-Zustands aus einem tiefergelegenen Triplettzustand. Der vorherrschende Zerfall des Tripletts skaliert mit t^-0,5 und ist auf das nicht-Fick’sche Diffusionsverhalten der Tripletts zurückzuführen, die an Störstellen gefangen werden und abreagieren. Wird vor dem Übergang in den Grundzustand ein weiteres Triplett eingefangen, so kommt es zu einer Triplett-Triplett-Annihilation, die eine Wiederbesetzung des S1-Zustandes bewirkt. Für die transienten Absorptionsexperimente wurde ein Messaufbau verwirklicht, der Anregung und Abfrage im VIS und NIR Spektralbereich mit einer Zeitauflösung von bis zu 50 fs ermöglicht. Die Detektion des Abfragelichts erfolgt spektral aufgelöst mit einer CCD-Kamera. Der Aufbau ermöglicht Nachweisempfindlichkeiten von bis zu 0,2 mOD bei einer Integrationszeit von einer Sekunde. Durch unterschiedliche Modulation von Anregungs- und Abfragestrahl ist eine Detektion auf der Differenzfrequenz der Modulationen möglich, wodurch Einflüsse des Anregungslichts im Abfragespektrum effizient unterdrückt werden. In transienten Absorptionsexperimenten wurde die Exziton- und Ladungsträgerdynamik der (9,9)-Röhre untersucht. Die transienten Absorptionsdaten wurden mit einer globalen Fitroutine angepasst, der ein Vierniveausystem zugrunde lag. Aus dem globalen Fit sind die Photoanregungsspektren (PAS) - die Beiträge der drei angeregten Niveaus zu den transienten Absorptionsspektren - sowie die Zerfallszeiten zugänglich. Die PAS sind durch die Exzitonresonanz gekennzeichnet. Breite PB-Banden aufgrund der Besetzungsänderung der linearen E00-Bänder sind im Gegensatz zu transienten Absorptionsmessungen an Graphen oder Graphit nicht erkennbar. Die PAS des schnellen und mittleren Zerfalls sind ähnlich und weisen eine starkes PB-Signal bei der Energie des M1-Exzitons der (9,9)-Röhre auf, das von PA-Banden bei höheren undtieferen Energien begleitet wird. Der langsame Zerfall ist hingegen durch eine blauverschobene PB-Bande gekennzeichnet, die nur auf der niederenergetischen Seite mit einem PA-Signal einhergeht. Die Zerfallszeiten nehmen mit steigender Anregungsleistung zu und liegen im Bereich von 30 fs bis 120 fs, 500 fs bis 1000 fs und 40 ps. Die schnelle Zerfallskomponente wird mit der Dissoziation der Exzitonen sowie der Thermalisierung der freien Ladungsträgen in den linearen Leitungsbändern zu einer heißen Ladungsträgerverteilung assoziiert. Die mittlere Zerfallskomponente beschreibt die Abkühlung und Rekombination der freien Elektronen und Löcher. Entscheidender Mechanismus ist hierbei die Streuung an hochenergetischen optischen Phononmoden. Die langsame Zerfallskomponente kann durch langlebige, wahrscheinlich an Störstellen gefangene Ladungsträger erklärt werden, deren elektrische Felder durch den Stark-Effekt das ableitungsähnliche transiente Absorptionsspektrum erzeugen. Mittels transienter Absorptionsmessungen an (6,5)-Röhren wurde aus dem anregungsleistungsabhängigen maximalen PB-Signal des S1-Exzitons die Größe des S1-Exzitons zu (7,2 ± 2,5) nm bestimmt. Aus dem Vergleich der leistungsabhängigen maximalen PB-Signale bei Anregung in das S1- und das S2-Exziton ergibt sich, dass die Konversionseffizienz aus dem S2- in den S1-Zustand 1 ± 0,1 beträgt und innerhalb der experimentellen Zeitauflösung von 60 fs vollständig abläuft. Die Exzitongröße in metallischen (9,9)-Röhren wurde bei Exzitonlebensdauern von 15 fs bis 30 fs zu etwa 7 nm bis 12 nm abgeschätzt. N2 - Within the course of this work, the electron- and exciton-dynamics in metallic and semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) were examined by timecorrelated single-photon counting (TCSPC) spectroscopy and transient absorption spectroscopy. In the experiments surfactant- or DNA-stabilized SWNT-suspensions were used in which the semiconducting (6,5)-chirality or the metallic (9,9)-chirality were enriched by means of density gradient ultracentrifugation. The preparation method for metallic samples was optimized. It yields samples that contain 40% of the predominant (9,9)-chirality and show a contamination with semiconducting SWNTs of only 3%. Metallic SWNT samples for transient absorption experiments were concentrated by filtration. Semiconducting (6,5)-samples were prepared following a standard recipe. TCSPC-measurements on (6,5)-samples revealed that semiconducting SWNTs also exhibit a long-lived fluorescence component besides the short-lived fluorescence of the S1-exciton which emits on the ps-timescale. The long-lived component shows a t^−1 powerlaw decay behavior. It also stems from the S1-exciton state and accounts for (7 ± 2) % of the total quantum yield. The long-lived component is due to delayed fluorescence which is caused by the repopulation of the S1-exciton state from a lower-lying triplet state. The decay of the triplet state scales with t^−0,5 and is due to non-Fickian diffusion of the triplets which eventually get trapped at defect sites and decay. In the case that a second triplet is captured at an already occupied defect site, triplet-triplet-annihilation occurs, which leads to the reoccupation of the S1-exciton state. A transient absorption experiment was set up which allows pumping and probing in the visible and near-infrared spectral range with a temporal resolution of up to 60 fs. The spectrally resolved probe light is detected by a CCD-camera. The experimental setup reaches a detection sensitivity of up to 0,2 mOD at an integration time of one second. The experimental setup also allows for the detection on the difference frequency of the modulated pump- and probe-beams. This strongly suppresses contributions of stray light from the pump beam in the transient absorption spectrum. The exciton and charge carrier dynamics in metallic (9,9)-SWNTs were investigated with transient absorption measurements. A global fit routine, based on a four level model, was applied to the data. The decay times as well as the photo excitation spectra – the contributions of each of the three excited levels to the transient absorption spectra - are directly accessible from the global fit. All photo excitation spectra are dominated by PA- and PB-contributions from the exciton resonance. Broad PB-features due to the population of the linear E00-bands, as evidenced in graphene or graphite, were not found. The photo excitation spectra of the fast and medium decay component are similar. Both exhibit a strong PB-signal at the energy of the M1-excitons of the (9,9)-tube, which is accompanied by PA-Bands on the high and the low energy sides. The slow decay component is characterized by a blue-shifted PB-peak with a PA-band on the low energy side only. The decay times increase with rising excitation power and are in the range of 30 fs to 120 fs, 500 fs to 1000 fs, and 40 ps, respectively. The fast decay is associated with rapid exciton dissociation and thermalization of the charge carriers in the linear bands. The medium decay is governed by cooling of the hot charge carrier distribution and recombination of electrons and holes. Both processes are mediated by high energy optical phonons. The slow decay originates from long-lived charge carriers, likely trapped at defect sites. The derivative-like photo excitation spectrum is a sign of the Stark-effect, caused by the electric field of the charge carriers. Using transient absorption measurements, the size of the S1-exciton in (6,5)-tubes was determined from the excitation dependent maximum of the S1-PB-signal to be (7,2 ± 2,5) nm. Comparing the excitation dependent maximum PB-signal after exciting the S1- or the S2-exciton-states shows that the conversion efficency from the S2- into the S1-exciton state is 1 ± 0,1 and is completed within the experimental temporal resolution of 60 fs. The exciton size in metallic (9,9)-tubes is in the range from 7 nm to 12 nm for excitonic lifetimes of 15 fs to 30 fs. KW - Kohlenstoff-Nanoröhre KW - Verzögerte Fluoreszenz KW - Exziton KW - Kohlenstoffnanoröhre KW - metallisch KW - Exziton KW - verzögerte Fluoreszenz KW - single-wall carbon nanotube KW - metallic KW - exciton KW - delayed fluorescence Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70193 ER - TY - THES A1 - von der Heide, Inga T1 - Untersuchung zu dem Einfluss einer Immunonutrition mit Glutamin, Omega-3-Fettsäuren und antioxidativen Vitaminen auf dem postoperativen Verlauf kardiochirurgischer Patienten T1 - The influence of an immunonutrition with glutamine, omega-3-fatty acids and antioxidative vitamins on the postoperative progress of cardiosurgical patients N2 - Ob eine Immunonutrition einen Nutzen in der Versorgung schwer kranker oder chirurgischer Patienten bringt, ist Thema kontroverser Diskussionen. Dabei scheint unklar, welches Patientenklientel von welcher Zusammensetzung verschiedener immunmodulatorischer Substanzen am meisten profitiert. Zudem ist nicht einheitlich geklärt, zu welchen Zeitpunkten und über welche Zeiträume die Immunmodulation den größten Nutzen bringt. Die hier durchgeführte Studie wurde konzipiert, um zu untersuchen, ob die Patienten, die einer aortokoronaren Bypassoperation unter Einsatz der Herz-Lungen-Maschine zugeführt werden, eine Verbesserung ihres klinischen Outcomes zeigen, wenn sie immunmodulatorische Substanzen perioperativ erhalten. Die konkreten Fragestellungen für diese Arbeit lauten daher: 1) Kann die Immunonutrition mit Glutamin, ௰-3-Fettsäuren und antioxidativ wirksamen Vitaminen die Inzidenz von postoperativen Infektionen bei Patienten, die einer aortokoronaren Bypassoperation zugeführt werden, verringern? 2) Verkürzt sich die Liegedauer der Patienten auf der Intensivstation und nach Verlegung auf Normalstation postoperativ bei regelmäßiger Einnahme der immunmodulierenden Substanzen über den Zeitraum des stationären Aufenthaltes? 3) Verbessert sich das klinische Outcome der Patienten durch die perioperative Substitution insgesamt, durch ein selteneres Auftreten von häufigen Komplikationen und Kreislaufinstabilitäten? Zu diesem Zweck wurde eine Kohortenstudie mit 137 Patienten durchgeführt, wovon sich 97 Patienten in der Kontrollgruppe und 40 in der Experimentalgruppe befanden. Die Patienten der Experimentalgruppe erhielten ab dem Tag ihrer stationären Aufnahme 2 unterschiedliche Substanzen zur oralen Einnahme verabreicht. Die eine enthielt einen hohen Anteil an Glutamin und antioxidativ wirksamen Substanzen (Glutamine Plus®) und die andere einen hohen Gehalt an ௰-3-Fettsäuren (Supportan® Drink). Das Glutamine Plus® wurde morgens und abends, der Supportan® Drink mittags verabreicht. Die Substitution erfolgte über den kompletten stationären Aufenthalt, abgesehen von dem Tag der Operation selber. Die Blutentnahmen für die entsprechenden infektiologischen Parameter erfolgten zu den Zeitpunkten präoperativ, 6 Stunden nach Ende der Operation, 2 Tage postoperativ und vor der Entlassung. Es zeigte sich, dass die Patienten, die die Substanzen erhielten, weniger postoperative Infektionen entwickelt hatten, als die Patienten in der Kontrollgruppe. Das wurde aus einer signifikanten PCT-Erhöhung in der Kontrollgruppe abgeleitet. Allerdings hatte diese postoperative Komplikation keine Auswirkung auf die Liegezeit der Patienten auf der Intensivstation oder auf die Dauer des stationären Aufenthaltes nach Verlegung von der Intensivstation auf eine periphere Station zur Folge. Ebenfalls zeigten sich keine Unterschiede zwischen den beiden Kohorten in der Notwendigkeit einer antibiotischen Therapie, sowie im Auftreten von Kreislaufinstabilitäten oder den häufigsten Komplikationen. N2 - The influence of an immunonutrition with glutamine, omega-3-fatty acids and antioxidative vitamins on the postoperative progress of cardiosurgical patients KW - Glutamin KW - Omega-3-Fettsäure KW - antioxidative Vitamine KW - Immunonutrition KW - Immunonutrition KW - glutamine KW - omega-3-fatty acids KW - antioxidative vitamins Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70591 ER - TY - THES A1 - Kühner, Felix T1 - Untersuchungen zum Uridinplasmaspiegel bei chronischer Infektion mit Hepatitis C, Hepatitis B, bei alkoholischer und nichtalkoholischer Fettlebererkrankung sowie bei gesunden Probanden T1 - Evaluation of uridine plasma levels in patients with chronic hepatitis C and B, alcoholic and non-alcoholic fatty liver as in healthy controls N2 - HINTERGRUND: Die Leber nimmt bei der Regulierung und Aufrechterhaltung des Uridinplasmaspiegels eine zentrale Rolle ein. Die Synthese von Uridin hängt dabei wesentlich von der intakten Funktion hepatozytärer Mitochondrien und des mitochondrialen Enzymes Dihydroorotatdehydrogenase (DHODH) ab. Bei Patienten unter HIV-Therapie zeigten sich in Studien verminderte Uridinplasmaspiegel, wobei die dafür verantwortlich gemachte therapieassoziierte mitochondriale Toxizität durch Uridinsupplementation reduziert werden konnte. Schädigungen von Leber und Mitochondrien im Rahmen chronischer Lebererkrankungen wie Hepatitis C (CHC), B (CHB), alkoholischer und nichtalkoholischer Fettleber (AFLD und NAFLD) könnten ebenfalls zu einem Abfall des Uridinplasmaspiegels führen. METHODIK: Nach Etablierung einer HPLC-Methodik zur Evaluation von Uridin im menschlichen Serum wurden Uridinplasmaspiegel von Patienten mit oben genannten Erkrankungen mit denjenigen einer gesunden Kontrollgruppe verglichen. Ferner wurden die Spiegel mit Demografie, Genotypen, Viruslasten, antiviraler Therapie und Therapiedauer sowie mit sonographischen wie histologischen Leberbefunden und Laborparametern korreliert. ERGEBNISSE: Sämtliche 130 Patienten zeigten einen signifikant niedrigeren Uridinplasmaspiegel als die aus 14 Probanden bestehende gesunde Kontrollgruppe, lagen jedoch noch im physiologischen Normbereich gesunder Erwachsener. In absteigender Reihenfolge zeigten die grössten Unterschiede die Gruppen mit chronischer Hepatits C (n = 69), Hepatitis B (n = 37) sowie AFLD/AFLD (n = 24). Demographische Faktoren, chronischer Alkoholkonsum, histologischer Grad der Leberentzündung und -fibrose, sowie Diabetes mellitus zeigten keinen Einfluss. Spezifika der Virushepatitiden zeigten, abgesehen von der Viruslast bei CHC mit Tendenz zu eher niedrigen Uridinplasmasppiegeln bei hohen Lasten ebenfalls keine Signifikanzen. Eine Leberverfettung zeigte hinsichtlich des Uridinplasmaspiegels lediglich im Vergleich der Gruppe AFLD/NAFLD zur Kontrollgruppe signifikant reduzierte Werte. In Bezug auf das absolute wie relative Vorliegen einer Leberzirrhose zeigten sich ebenfalls signifikant erniedrigte Spiegel, und auch bei Korrelation des Child-Pugh-Index sowie laborchemischen Lebersynthesemarkern zeigten sich mit Zunahme der Leberschädigung reduzierte Uridinspiegel. SCHLUSSFOLGERUNG: Der Uridinplasmaspiegel scheint bei chronischen Lebererkrankungen wie Hepatitis C und B sowie alkoholischer und nichtalkoholischer Fettleber relativ erniedrigt zu sein, ebenso bei der Leberzirrhose. Um den Einfluss einer Mitochondrienschädigung genauer einzuordnen wären zukünftige Untersuchungen unter Einbezug oxidativer Marker ebenso interessant wie Überlegungen, Uridin bei fortgeschrittenen chronischen Lebererkrankungen zu substituieren. N2 - BACKGROUND: The liver plays a pivotal role in regulating and maintaining uridine levels in plasma. Synthesis of uridine is mainly depending on the intact function of mitochondria and the mitochondrial enzyme dihydroorotate dehydrogenase in liver cells. HIV therapy associated mitochondrial toxicity, affecting reduced uridine plasma levels could be diminished by uridine supplementation. Moreover, in cases of liver or mitochondrial damage induced by chronic liver diseases such as hepatitis C (CHC) and B (CHB), alcoholic and non-alcoholic induced fatty liver (AFLD and NAFLD) can result in reduced uridine levels in plasma. METHODS: An HPLC-based method for evaluating uridine levels in human serum was established and utilized to compare uridine levels in patients suffering from the aforementioned diseases with controls. Moreover, uridine levels were evaluated with regard to (a) demographic data, (b) genotypes, (c) viral load, (d) antiviral treatment, (e) treatment duration, (f) sonographic and histological findings, and (g) laboratory values. RESULTS: Uridine levels in plasma of all 130 patients were significantly reduced compared to those of the 14 healthy individuals, however, were still within the physiological range observed in healthy adults. Maximum deviations decreased in the following order: Hepatitis C (n=69), hepatitis B (n=37) and AFLD/NAFLD (n=24). Demographic factors, chronic alcoholic diseases, histological grade of liver inflammation and fibrosis, as well as diabetes mellitus; had no impact on uridine plasma levels. Apart from CHC, which tends to reduce levels of uridine in plasma with a high viral load; specifics of the infectious hepatitis indicated no significant change. In cases of fatty liver, only when comparing the AFLD/NAFLD group to controls, significantly reduced levels of uridine in plasma could be confirmed. Additionally, in the case of existent relative or absolute cirrhosis, as well as with an increasing Child-Pugh-Index and decreasing liver synthesis products, significant reduced uridine plasma levels could be detected. CONCLUSION: The present data indicates reduced levels of uridine in plasma in cases of chronic liver diseases (such as hepatitis C and B), alcoholic and non-alcoholic steatohepatitis, as well as cirrhosis. To assess the impact of mitochondrial damage, future investigations should include oxidative markers and evaluate the potential of substituting uridine in cases of advanced chronic liver diseases. KW - Uridin KW - Hepatitis C KW - Hepatitis B KW - Fettleber KW - Leberzirrhose KW - Dihydroorotat-Dehydrogenase KW - Pyrimidin-Synthese KW - Alkoholische Fettlebererkrankung KW - Nichtalkoholische Fettlebererkrankung KW - Uridine KW - Pyrimidine Synthesis KW - Hepatitis C KW - Hepatitis B KW - Alcoholic and Non-Alcoholic Steatohepatitis Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70179 ER - TY - THES A1 - Hubertus, Klaus Valentin T1 - Sensitive Messung von Superoxidanionen in kardiovaskulären Geweben T1 - Sensitive Measurement of superoxide anion in cardiovascular tissue N2 - Superoxidanionen (O2˙‾) sind eine von mehreren sogenannten reaktiven Sauerstoffspezies, die im menschlichen Körper intra-, aber auch extrazellulär vorkommen. Verschiedene Enzyme, z.B. in der mitochondrialen Atmungskette, die NADPH-Oxidase oder endotheliale NO-Synthasen bilden O2˙‾. Da es sich um eine sehr reaktive Substanz handelt, die mit der DNA sowie mit Proteinen und Lipiden interagiert und diese schädigen kann, spielt sie bei kardiovaskulären Erkrankungen wie etwa der chronischen Herzinsuffizienz, Hypertonie oder Arteriosklerose eine große Rolle, ist aber auch an vielen anderen Erkrankungen wie z.B. dem Diabetes mellitus pathophysiologisch beteiligt. Dies macht verständlich, dass es für die Forschung von entscheidender Bedeutung ist, Methoden zu entwickeln, die zur Erkennung und Quantifizierung von O2˙‾ geeignet sind. Bereits heute gibt es verschiedene Methoden, O2˙‾ nachzuweisen. Jede dieser Methoden hat jedoch ihre ganz spezifischen Vor- aber auch Nachteile. Wir haben eine neue, einfache, sehr schnelle und sensitive HPLC-Methode mit einem internen Standard entwickelt, mit der die O2˙‾-Produktion in Endothelzellen und aortalem Gewebe gut zu messen ist. Sie beruht auf der Tatsache, dass Dihydroethidium (DHE) mit O2.- zu 2-Hydroxyethidium (2-OH-E+) reagiert. Nach Trennung mittels HPLC wurde die Menge an entstandenem 2-OH-E+ durch einen elektrochemischen Detektor gemessen. Die Proben wurden durch isokrate Elution aufgetrennt, was bisher bei der Detektion von 2-OH-E+, DHE und O2˙‾ mit vielen Nachteilen verbunden war. Durch eine spezielle mobile Phase, die ein Ionen-Paar-Reagens enthielt, konnte diese Form der Elution nun auch zur Erkennung von O2˙‾ angewandt werden. DHE und seine Reaktionsprodukte konnten nicht nur eindeutig aufgetrennt werden, sondern die Auftrennung erfolgte auch sehr schnell in nur etwa 15min, was gegenüber älteren Methoden einen eindeutigen Zeitvorteil bringt. Anstatt zwei benötigten wir darüber hinaus nur eine Pumpe, was ebenfalls ein Vorteil der isokraten Elution ist. Wir erreichten auch über längere Messreihen stabile Bedingungen, da für die isokrate Elution die mobile Phase nicht verändert werden muss. Des Weiteren haben wir 3,4-Dihydroxyzimtsäure als internen Standard eingeführt, der sich hinsichtlich seiner Retentionszeit als sehr geeignet erwies und mit einem elektrochemischen Detektor klar und eindeutig nachweisbar war. Dies bietet große Vorteile gegenüber Methoden ohne internen Standard. Veränderungen der Konzentrationen von DHE, 2-OH-E+ und Ethidium aufgrund von Verdampfen des Lösungsmittels Methanol können ebenso erkannt werden wie Ungenauigkeiten während der Präparation sowie Schwankungen im HPLC-System, wie sie etwa bei langen Messreihen durch Auswaschungs-Effekte oder Verunreinigungen auftreten können. Da sich die Konzentration des internen Standards 3,4-Dihydroxyzimtsäure stets mitverändert, können die Messwerte normalisiert werden und somit die Verfälschungen aufgehoben werden. Dem zu Folge sind Messungen mit einem internen Standard gegenüber solchen ohne internen Standard deutlich valider. Sowohl die Stimulation von humanen aortalen Endothelzellen (HAEC) mit Glukose bzw. Tumornekrosefaktor α, als auch die Infusion von Angiotensin II bei männlichen Mäusen mit anschließender Untersuchung der Aorta führt bekanntermaßen zu einem Anstieg von O2˙‾. Dieser Effekt konnte nun auch mit unserer neu etablierten HPLC-Methode nachgewiesen werden. Ebenfalls war ein Anstieg des aortalen O2˙‾-Spiegels bei Ratten nach induziertem Myokardinfarkt bereits in mehreren früheren Arbeiten beschrieben worden. Dieser lag auch bei Messung mit unserer neu etablierten HPLC-Methode eindeutig vor. Die Signale waren hierbei für die untersuchten Substanzen 2-OH-E+, DHE sowie für den internen Standard 3,4-Dihydroxyzimtsäure eindeutig und gut voneinander getrennt. Zusammenfassend konnte somit gezeigt werden, dass sich anhand mehrerer etablierter in vitro und in vivo Modelle erhöhter Sauerstoffradikal-Produktion der Anstieg von O2˙‾ auch mit unserer neuen Variante der HPLC mit isokrater Elution, internem Standard und Messung mittels elektrochemischem Detektor nachweisen ließ. Es handelt sich um eine zuverlässige und sensitive Methode, die zusätzliche Vorteile für die Messung von O2˙‾ mit sich bringt. N2 - A new method of measuring superoxid anion in cardiovasvascular tissue. KW - HPLC KW - Sensitivität KW - Hyperoxidion KW - Superoxidanion KW - Dihydroethidium KW - HPLC KW - Sensitivity KW - Hyperoxidion Dihydroethidine Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70162 ER - TY - THES A1 - Gamon, Daniela T1 - Synthese und Reaktivität neuartiger Borolverbindungen T1 - Synthesis and reactivity of novel borole-derivatives N2 - Nach der ersten erfolgreichen Synthese eines freien Borols im Jahr 1969 folgte bis auf wenige Ausnahmen eine lange Periode in der der Chemie der freien Borole wenig Beachtung geschenkt wurde. Dies ist nur wenig verständlich, wenn man in Betracht zieht, dass Borole aufgrund ihres 4 Elektronensystems zu den kleinesten Hückel Antiaromaten zählen und zudem als eine der Lewis acidesten Verbindungsklassen angesehen werden. Sie weisen außerdem starke Absorptionen im sichtbaren Bereich auf, welche maßgeblich von den Substituenten am Borzentrum beeinflusst werden. Durch sorgfältige elektronische Abstimmung können nahezu alle Farben des sichtbaren Spektrums eingestellt werden (Abbildung 81). Im Jahr 2008 gelang in der Arbeitsgruppe von H. Braunschweig die erste strukturelle Charakterisierung von Pentaphenylborol (15). Außerdem wurde mit der Synthese des 1 Chlor 2,3,4,5 tetraphenylborols (26) der Grundstein für eine Reihe weitere Borol Derivate gelegt. Des Weiteren konnte das Substitutionsmuster mit der Synthese von [1-Ferrocenyl-2,3,4,5-tetraphenylborol] (25) auf Metallkomplexe ausgeweitet werden. Mit den beiden Bis- und Trisborolen 47 und 49 konnte gezeigt werden, dass Borole über einen konjugierten organischen spacer verknüpft werden können.[39,124,140] Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde in der vorliegenden Arbeit die Synthese neuer Borol Derivate angestrengt. Außerdem konnten Beiträge zu Koordinations- und Reduktionschemie der bereits bekannten und neuartigen Borol-Systeme geleistet werden. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf eine mögliche Anwendung von nicht standardmäßigen Analysemethoden wie Cyclovoltammetrie, ESR-Spektroskopie, Raman-Spektroskopie und UV Vis Spektroskopie gelegt. Eine Einstufung der Lewis-Säure Stärke der verschiedenen Borol Derivate erfolgte durch Basenübertragungsreaktionen. N2 - After the first successful synthesis of free boroles in the late 1960s, borole chemistry did not attract much attention over a period of nearly 40 years apart from a few exceptions, even though boroles offer unique properties such as extreme Lewis acidity and strong absorption in the visible region of the spectrum (figure 90). These properties are significantly affected by the substituent at the boron center. Absorptions within the whole range of the visible spectrum can be obtained by careful adjustment of the electronic characteristics of the substituent. In 2008 the first example for a solid state structure of a free borole was contributed by the group of H. Braunschweig. Furthermore, with the synthesis of 1 chloro 2,3,4,5 tetraphenylborole (26) the basis for a range of novel borole derivatives was established. The substitution pattern at the boron center was extended to metal-complexes by the synthesis of 1 ferrocenyl 2,3,4,5 tetraphenylborole (25). In case 47 and 49 it was possible to connect borole moieties over a conjugated spacer. [39,124,140] Based on these results this work contains the syntheses of novel borole derivatives as well as contributions to the coordination and reduction chemistry of known and novel boroles. Additionally, the possibility to use non-standard analytic methods such as cyclic voltammetry, EPR spectroscopy, Raman spectroscopy and UV-vis spectroscopy was of special interest. Rating of Lewis acidities was achieved by base transfer reactions. KW - Borolderivate KW - Borol KW - antiaromaten KW - boroles KW - antiaromates Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70065 ER - TY - THES A1 - Schriefer, Eva-Maria T1 - Molekulare und biochemische Charakterisierung der β-Laktamasen von Yersinia enterocolitica und deren Sekretionsverhalten T1 - Molecular and biochemical characterization of β-lactamases in Yersinia enterocolitica and their secretion behaviour N2 - In dieser Arbeit wurden zwei Aspekte der Yersinia β-Laktamasen bearbeitet: (1) Charakterisierung der β-Laktamasen hinsichtlich β-Laktam-Antibiotikaresistenz, Sekretion und Thermostabilität. (2) Untersuchung der Sekretionsfähigkeit von verschiedenen thermostabilen β Laktamasen über das Yersinia T3SS. Im ersten Teil wurden β Laktamase-Deletionsmutanten im Y. enterocolitica Serotyp O:8 Stamm WA-314 hergestellt, um den Einfluss der chromosomalen β Laktamasen auf die in vitro-Resistenz zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass WA-314 konstitutiv BlaA produziert und BlaA somit – unter nicht-induzierbaren Bedingungen – der dominante Faktor in der in vitro-Resistenz gegenüber Penicillinen mit erweitertem Wirkungsspektrum (z.B. Ampicillin) und Cephalosporinen der 1. Generation (z.B. Cefazolin) ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die zweite chromosomale β Laktamase AmpC (BlaB) unter Zugabe von subinhibitorischen Konzentrationen von Imipenem stark induziert wird. Keine der β Laktamasen ist in der Lage, in vitro-Resistenz gegenüber Carbapenemen und Monobactamen zu vermitteln. Die Konstruktion und Bestimmung der in vitro Antibiotika-Empfindlichkeit der β Laktamase-Deletionsmutanten dient als Grundlage für nachfolgende Untersuchungen im Mausinfektionsmodell. Weiterhin wurden die Transporteigenschaften beider β Laktamasen untersucht. In Gram-negativen Bakterien sind reife β Laktamasen im Periplasma lokalisiert und müssen somit nach der Synthese im Cytosol über die Cytoplasmamembran transportiert werden. Bis auf drei Ausnahmen (β Laktamasen aus Mycobacterium smegmatis, M. tuberculosis und Stenotrophomonas maltophila) sind bisher nur Sec-abhängige β Laktamasen beschrieben worden. Mittels Fusionsproteinen bestehend aus β Laktamase-Signalpeptiden und GFP konnte in dieser Arbeit eindeutig gezeigt werden, dass es sich bei Yersinia BlaA um ein Tat-Substrat handelt, bei Yersinia AmpC hingegen um ein Sec-Substrat. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal eine Tat-abhängige β Laktamase bei einer Bakterienart aus der Familie der Enterobacteriaceae nachgewiesen werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die β Laktamase BlaA nicht diffus im Periplasma, sondern auf bestimmte Bereiche im Periplasma lokalisiert verteilt ist. Allerdings konnte die Art der Lokalisierung bisher nicht genau spezifiziert werden. Die cytosolische Faltung und die Tat-abhängige Translokation von BlaA lassen vermuten, dass eine besondere Thermostabilität von BlaA vorliegt. Deshalb wurde das BlaA-Enzym hinsichtlich seiner Thermostabilität und temperaturabhängigen enzymatischen Aktivität untersucht. Im Vergleich zur E. coli β Laktamase TEM-1 und der hitzestabilen TEM-1-Variante MEGA zeigte BlaA eine erhöhte Thermostabilität und einen starken Anstieg der Aktivität in einem Temperaturbereich zwischen 30 °C und 45 °C. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde geprüft, ob die charakterisierten Yersinia β Laktamasen als Reporterkonstrukte zur Untersuchung des Typ III Sekretionssystems (T3SS) geeignet sind. Y. enterocolitica besitzt ein pYV Virulenzplasmid, auf dem der vollständige Satz der Gene für das Ysc-T3SS und die Effektor-Yops (Yersinia outer protein) lokalisiert sind. Injektion der Yops in eukaryotische Zielzellen ermöglicht das extrazelluläre Überleben der Yersinien im Wirtsorganismus. Bei YopE handelt es sich um ein gut charakterisiertes Effektor-Yop, dessen N Terminus fusioniert an den reifen Teil der β Laktamase TEM-1 bereits vielfach als Reporterkonstrukt eingesetzt wurde. Unter Verwendung des fluoreszierenden β Laktamase-Substrats CCF4-AM kann die Translokation von YopEi-TEM-1 in Zielzellen in Zellkultur-Experimenten und im Mausinfektionsmodell visualisiert werden. In dieser Arbeit sollte deshalb die T3SS-Sekretionsfähigkeit von YopE-β Laktamase-Fusionsproteinen in Abhängigkeit von der „Schmelztemperatur“ (temperaturabhängige Stabilität, TM) untersucht werden. Yop-Substrate werden im ungefalteten Zustand (YscN wirkt dabei vermutlich als ATP-abhängige „Unfoldase“) über das Ysc-„Injektisom“ transloziert. YopEi-TEM-1 wird effizient sekretiert und transloziert (TM (TEM-1) = 50,8 °C). YopE-Fusionsproteine mit thermostabilen TEM-1 Varianten, YopEi-RLT bzw. YopEi-MEGA (TM (RLT) = 60,4 °C; TM (MEGA) = 69,2 °C) werden hingegen nur schwach bzw. nicht sekretiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Sec-abhängige β Laktamase AmpC als YopE-Fusionsprotein (YopEi-AmpC) effizient T3SS-abhängig sekretiert und transloziert werden kann; das native Tat-Substrat BlaA (YopEi-BlaA) kann jedoch weder sekretiert noch transloziert wird. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die ATPase YscN nicht in der Lage ist, BlaA und die thermostabilen TEM-1-Varianten zu entfalten und über das T3SS zu sekretieren und zu translozieren. RLT und MEGA können hingegen mithilfe ihrer nativen Signalsequenz über das Sec-System (und somit im ungefalteten Zustand) transloziert werden. N2 - In this work, two aspects concerning the Yersinia β lactamases have been processed: (1) Characterization of the β lactamases in regard of β lactam antibiotic resistance, secretion and thermostability. (2) Analysis of the secretability of different thermostable β lactamases via the Yersinia T3SS. In the first part of this work we described the β lactam sensitivity pattern of the highly mouse pathogenic Y. enterocolitica strain WA 314 by creating a set of β lactamase deletion mutants and their subsequent characterization in vitro. In accordance to previous studies on biovar 1B, serovar O:8 strains, WA 314 produces both enzymes BlaA and AmpC (BlaB) and latter one is inducible using subinhibitory concentrations of imipenem. BlaA is dominant in providing in vitro-resistance towards extended-spectrum β lactams (e.g. ampicillin) and 1st generation cephalosporins (e.g. cefazolin). None of the β lactamases is able to mediate in vitro-resistance towards carbapenems and monobactams. The construction of β lactamase deletion mutants and their in vitro-characterization is the basis for their subsequent analysis within a murine infection model. Furthermore, we investigated the export mechanism of both β lactamases. In Gram-negative bacteria β lactamases are localized in the periplasmic space to be able to cleave the amide bond of the β lactam ring resulting in inactivation of the antibiotic. Proteins are translocated across the inner membrane either via the general secretory pathway (Sec system) or via the twin arginine pathway (Tat system). To date, only three β lactamases have been described as Tat-dependently translocated namely BlaC from Mycobacterium tuberculosis, BlaS from M. smegmatis and L2 from the plant pathogen Stenotrophomonas maltophila. In silico studies and experimental approaches lead to the assumption that the majority of β lactamases is translocated in a Sec-dependent manner. Analysis of β lactamase signal sequence-GFP fusion proteins revealed that Yersinia AmpC is a Sec-substrate whereas Yersinia BlaA is a Tat-substrate. Thus, BlaA of Y. enterocolitica is the first reported β lactamase within the family of Enterobacteriaceae which is secreted by the Tat system. Interestingly, closely related blaA genes are widely distributed within all Y. enterocolitica biovars and several environmental Yersinia species. It is generally accepted that Tat-dependent substrates rapidly fold in the cytoplasma. To compare the BlaA protein stability with that of the Sec-dependent β-lactamases of the TEM-1 family we determined thermal unfolding transitions and temperature dependent enzymatic activities. In contrast to TEM-1 β lactamase, BlaA shows an entire different activity profile with steep increase of activity in the temperature range of 30 °C to 45 °C and steep decrease between 50 °C to 60 °C. In the second part, the Yersinia β lactamases AmpC and BlaA characterized in this work were tested for suitablility as reporter constructs for analyzing the Ysc-T3SS. Y. enterocolitica harbors a pYV virulence plasmid which encodes genes for components of the Ysc-T3SS secretion machinery and the effector Yops (Yersinia outer protein). Injection of Yops into the eukaryotic host cell enables the extracellular survival of Yersinia within the host organism. YopE is a well described effector Yop and YopE-β lactamase (TEM-1) fusion proteins have been successfully applied to analyze translocation of YopE in cell culture experiments and in the murine mouse infection model by using the fluorescent β lactamase substrate CCF4-AM. In this work, we aimed to analyze the T3SS-dependent secretability of YopE-β-lactamase fusion proteins in dependency on the melting temperature (temperature dependent stability, TM). It has been described that Yop substrates are translocated in an unfolded conformation via the Ysc-“injectisom” (YscN has been discussed as an ATP-dependent unfoldase). YopEi-TEM-1 is efficiently secreted and translocated (TM (TEM-1) = 50.8 °C). However, YopE fusion proteins with heat stable TEM-1 variants, YopEi-RLT and YopEi-MEGA (TM (RLT) = 60.4 °C; TM (MEGA) = 69.2 °C), were weakly secreted or secretion is completely abolished, respectively. Furthermore we could show that a YopE fusion protein with the Sec-dependent β lactamase AmpC (YopEi-AmpC) is efficiently secreted and translocated via the T3SS. In contrast, the Tat-dependent β lactamase BlaA (YopEi-BlaA) can neither be secreted nor translocated T3SS-dependently. A putative explanation for that observation would be that the ATPase YscN is unable to unfold BlaA and the heat stable TEM-1 variants and therefore secretion and translocation is prevented. Interestingly, native RLT and MEGA β lactamases can be translocated in an unfolded conformation via the Sec system. KW - Yersinia enterocolitica KW - Lactamase KW - Typ III Sekretionssystem KW - Yersinia enterocolitica KW - beta-lactamase Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69580 ER - TY - THES A1 - Adler, Melanie T1 - New approaches to improve prediction of drug-induced liver injury T1 - Neue Ansätze zur verbesserten Vorhersage arzneimittelinduzierter Leberschäden N2 - Das häufige Scheitern neuer Arzneistoffkandidaten aufgrund von Lebertoxizität in präklinischen und klinischen Studien stellt ein erhebliches Problem in der Entwicklung von neuen Arzneimitteln dar. Deshalb ist es wichtig, neue Ansätze zu entwickeln, mit deren Hilfe unerwünschte Wirkungen von Arzneimitteln früher und zuverlässiger erkannt werden können. Um die Vorhersage von Lebertoxizität in präklinischen Studien zu verbessern, wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei wesentliche Ansätze gewählt: 1) die Evaluierung neuer Biomarker, durch die Lebertoxizität zuverlässiger und empfindlicher detektiert werden könnte und 2.) wirkmechanistische Untersuchungen mittels Toxcicogenomics für ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der Arzneimittel-induzierten Toxizität. Ein Ziel dieser Arbeit war, die Fähigkeit einiger neuer potenzieller Biomarker (NGAL, Thiostatin, Clusterin und PON1) zu bewerten, Arzmeimittel-induzierte Lebertoxizität in Ratten frühzeitig zu erkennen. Die Ergebnisse zeigen, dass PON1 und Clusterin infolge eines durch die verabreichten Arzneistoffkandidaten verursachten Leberschadens nicht konsistent verändert waren. Diese beiden Marker sind daher, verglichen mit bestehenden klinisch-chemischen Markern, nicht für eine sichere Vorhersage von Arzneistoff-induzierten Leberschäden geeignet. Bei Thiostatin und NGAL zeigte sich hingegen ein zeit- und dosisabhängiger Anstieg im Serum und Urin behandelter Tiere. Diese Veränderungen, die gut mit der mRNA Expression im Zielorgan übereinstimmten, korrelierten mit dem Schweregrad der Arzneistoff-induzierten Leberschäden. Die Analyse mittels ROC zeigte, Thiostatin im Serum, nicht aber NGAL, ein besserer Indikator für Arzneimittel-induzierte hepatobiliäre Schäden ist als die routinemäßig verwendeten klinische-chemischen Marker, wie z.B. die Leberenzyme ALP, ALT und AST. Thiostatin wird jedoch als Akute-Phase-Protein in einer Vielzahl von Geweben exprimiert und kann somit nicht spezifisch als Lebermarker betrachtet werden. Dennoch zeigen unsere Ergebnisse, dass Thiostatin als sensitiver, minimal-invasiver diagnostischer Marker für Entzündungsprozesse und Gewebeschäden eine sinnvolle Ergänzung in der präklinischen Testung auf Lebertoxizität darstellt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mittels RNA-Interferenz das pharmakologische Target des Arzneistoffkandidaten BAY16, der Glukagonrezeptor, auf mRNA-Ebene gehemmt und anhand von Genexpressionsanalysen untersucht, ob die pharmakologisch-bedingte Modulation des Glukagonrezeptors eine Rolle in der Toxizität von BAY16 spielt. Desweiteren sollten diese Arbeiten Aufschluss geben, welche molekularen Veränderungen auf die pharmakologische Wirkung des Arzneistoffs zurückzuführen sind, und daher für den Mechanismus der Toxizität möglicherweise wenig relevant sind. Während BAY16 in Konzentrationen von 75 µM starke zytotoxische Wirkungen aufwies, hatte die siRNA vermittelte Depletion des Glukagonrezeptors keinen Einfluss auf die Vitalität primärer Rattenhepatozyten. Daraus lässt sich ableiten, dass die Hepatotoxiziät von BAY16 in vitro und in vivo nicht mit der pharmakologischen Modulation des Glukagonrezeptors assoziiert ist. Diese Ergebnisse wurden durch die Tatsache gestützt, dass die meisten der durch BAY16 induzierten Genexpressionsveränderungen unabhängig von der pharmakologischen Modulation des Glucagonrezeptors auftraten. Diese beobachteten off-target-Effekte beinhalteten Veränderungen im Fremdstoffmetabolismus, oxidativer Stress, erhöhte Fettsäuresynthese und Veränderungen im Cholesterol- und Gallensäuremetabolismus. Obwohl Veränderungen in diesen molekularen Mechanismen zum Fortschreiten eines Leberschadens beitragen können, ist es anhand dieser Daten nicht möglich einen eindeutigen Mechanismus für die Toxizität von BAY16 abzuleiten. In dieser Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass die Anwendung der siRNA-Technologie einen neuen methodischen Ansatz darstellt, um Mechanismen arzneimittelbedingter Toxizität besser verstehen zu können. N2 - The high failure rate of new drug candidates in preclinical or clinical studies due to hepatotoxicity represents a considerable problem in the drug development. Hence, there is an urgent need to develop new approaches for early and reliable prediction of drug-induced hepatotoxicity that enables a better identification of drug candidates with high potential for toxicity at early stages of drug development. Therefore, the aim of this work was to improve the prediction of drug-induced liver injury in preclinical studies through evaluation of more reliable and sensitive biomarkers of hepatotoxicity and a better understanding of the underlying mechanistic basis for drug-induced toxicity. First, the ability of a set of potential markers (NGAL, thiostatin, clusterin, PON1) to detect early signs of liver injury was assessed in rats treated with drug candidates that were dropped from further development, in part due to toxic adverse effects in the liver. In summary, PON1 and clusterin were not consistently altered in response to liver injury and thus provide no additive information to the traditional liver enzymes in detecting drug-induced hepatotoxicity. In contrast, thiostatin and NGAL were increased in serum and urine of treated animals in a time- and dose-dependent manner. These changes correlated well with mRNA expression in the target organ and generally reflected the onset and degree of drug-induced liver injury. Receiver-operating characteristics analyses supported serum thiostatin, but not NGAL, as a better indicator of drug-induced hepatobiliary injury than conventional clinical chemistry parameters, such as ALP, ALT and AST. Although thiostatin, an acute phase protein expressed in a range of tissues, may not be specific for liver injury, our results indicate that thiostatin may serve as a sensitive, minimally-invasive diagnostic marker of inflammation and tissue damage in preclinical safety assessment. In the second part of this work, combined application of genomics profiling technology and RNAi to inhibit the pharmacological target of a drug candidate BAY16, a glucagon receptor (GCGR) antagonist, was used to determine if interference with the pharmacological target plays a role in the toxic response to BAY16, and to narrow down those molecular changes that are associated with toxicity, and not the pharmacological action of BAY16. In contrast to Bay 16, which was found to be cytotoxic at concentrations of 75 µM, silencing of the glucagon receptor did not affect cell viability in primary rat hepatocytes. Thus, it can be concluded that hepatotoxicity of Bay 16 was not related to the drugs inhibitory effect on the glucagon receptor in vitro and in vivo. These findings were supported by the fact that most of BAY16-induced changes in gene expression occurred independently of the pharmacological modulation of GCGR. These off-target effects include altered xenobiotic metabolism, oxidative stress, increased fatty acid synthesis, and alterations in cholesterol and bile acid metabolic processes. Although it was not possible to draw a final conclusion about the mechanism of BAY16 hepatotoxicity, changes in these molecular mechanisms appear contribute to progression of hepatic injury. With regard to drug safety assessment in preclinical studies, the utilization of siRNA technology in vitro represents a new approach to improve mechanistic understanding of the nature of drug’s toxicity, being either chemically mediated or due to primary or secondary pharmacological mode of action. KW - Biomarker KW - Leber KW - Hepatotoxizität KW - Lebertoxizität KW - biomarker KW - liver KW - hepatotoxicity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69512 ER - TY - THES A1 - Duelli, Michael T1 - Heuristic Design and Provisioning of Resilient Multi-Layer Networks T1 - Heuristische Planung und Betrieb von ausfallsicheren Mehrschichtnetzen N2 - To jointly provide different services/technologies, like IP and Ethernet or IP and SDH/SONET, in a single network, equipment of multiple technologies needs to be deployed to the sites/Points of Presence (PoP) and interconnected with each other. Therein, a technology may provide transport functionality to other technologies and increase the number of available resources by using multiplexing techniques. By providing its own switching functionality, each technology creates connections in a logical layer which leads to the notion of multi-layer networks. The design of such networks comprises the deployment and interconnection of components to suit to given traffic demands. To prevent traffic loss due to failures of networking equipment, protection mechanisms need to be established. In multi-layer networks, protection usually can be applied in any of the considered layers. In turn, the hierarchical structure of multi-layer networks also bears shared risk groups (SRG). To achieve a cost-optimal resilient network, an appropriate combination of multiplexing techniques, technologies, and their interconnections needs to be found. Thus, network design is a combinatorial problem with a large parameter and solution space. After the design stage, the resources of a multi-layer network can be provided to traffic demands. Especially, dynamic capacity provisioning requires interaction of sites and layers, as well as accurate retrieval of constraint information. In recent years, generalized multiprotocol label switching (GMPLS) and path computation elements (PCE) have emerged as possible approaches for these challenges. Like the design, the provisioning of multi-layer networks comprises a variety of optimization parameters, like blocking probability, resilience, and energy efficiency. In this work, we introduce several efficient heuristics to approach the considered optimization problems. We perform capital expenditure (CAPEX)-aware design of multi-layer networks from scratch, based on IST NOBEL phase 2 project's cost and equipment data. We comprise traffic and resilience requirements in different and multiple layers as well as different network architectures. On top of the designed networks, we consider the dynamic provisioning of multi-layer traffic based on the GMPLS and PCE architecture. We evaluate different PCE deployments, information retrieval strategies, and re-optimization. Finally, we show how information about provisioning utilization can be used to provide a feedback for network design. N2 - Um in einem Netz verschiedene Dienste/Schichten, z.B. IP und Ethernet oder IP und SDH/SONET, parallel anbieten zu können, müssen Komponenten mehrerer Technologien an den Standorten verbaut und miteinander verbunden werden. Hierbei kann eine Technologie eine Transportschicht für andere Technologien fungieren und die Zahl der verfügbaren Ressourcen durch Multiplex Techniken erhöhen. Durch die Bereitstellung eigener Switching Funktionalität erzeugt jede Technologie Verbindungen in einer logischen Schicht. Dies führt zu der Bezeichnung Mehrschichtnetz (engl. multi-layer network). Die Planung solcher Netze hat das Verbauen und Verbinden von Komponenten zum Ziel, so dass gegebene Verkehrsströme realisiert werden können. Um Unterbrechungen der Verkehrsströme aufgrund von Fehlern in den Netzkomponenten zu verhinden, müssen Schutzmechanismen eingebaut werden. In Mehrschichtnetzen können solche Schutzmechanismen in jeder beliebigen Schicht betrachtet werden. Allerdings birgt die hierarchische Struktur von Mehrschichtnetzen das Risiko von shared risk groups (SRG). Um ein Kosten-optimales ausfallsicheres Netz zu erhalten, muss eine passende Kombination aus Multiplex Techniken, Technologien und deren Verbindungen gefunden werden. Die Netzplanung ist daher ein kombinatorisches Problem mit einem großen Parameter- und Lösungsraum. Nach der Planungsphase können die Ressourcen eines Mehrschichtnetzes für Verkehrsströme vorgehalten werden. Die Betrachtung von dynamischer Kapazitätsanforderungen erfordert die Interaktion von Knoten und Schichten sowie akkurate Gewinnung von Informationen zur Auslastung. In jüngster Zeit sind das Generalized Multiprotocol Label Switching (GMPLS) und das Path Computation Element (PCE) als mögliche Lösungsansätze für diese Herausforderungen entstanden. Wie in der Planung beinhaltet auch der Betrieb von Mehrschichtnetzen eine Vielzahl von Optimierungsparametern, wie die Blockierungswahrscheinlichkeit, Ausfallsicherheit und Energie-Effizienz. In dieser Arbeit, führen wir verschiedene effiziente Heuristiken ein, um die betrachteten Optimierungsprobleme anzugehen. Wir planen Mehrschichtnetze von Grund auf und minimieren hinsichtlich der Anschaffungskosten basierend auf den Kosten- und Komponenten-Daten des IST NOBEL Phase 2 Projekts. Wir berücksichtigen Anforderungen der Verkehrsströme und Ausfallsicherheit in verschiedenen Schichten und in mehreren Schichten gleichzeitig sowie verschiedene Netzarchitekturen. Aufsetzend auf dem geplanten Netz betrachten wir den Betrieb von Mehrschichtnetzen mit dynamischen Verkehr basiert auf der GMPLS und PCE Architektur. Wir bewerten verschiedene PCE Installationen, Strategien zur Informationsgewinnung und Re-Optimierung. Abschließend, zeigen wir wie Information über die Auslastung im Betrieb genutzt werden kann um Rückmeldung an die Netzplanung zu geben. T3 - Würzburger Beiträge zur Leistungsbewertung Verteilter Systeme - 02/12 KW - Mehrschichtsystem KW - Planung KW - Ressourcenmanagement KW - Ausfallsicheres System KW - Mehrschichtnetze KW - Pfadberechnungselement KW - Ausfallsicherheit KW - Multi-Layer KW - Design KW - Resilience KW - Resource Management KW - Path Computation Element Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69433 ER - TY - THES A1 - Staykov, Nikola T1 - The Role of the GABPα/β Transcription Factor In the Proliferation of NIH-3T3 Cells T1 - Die Rolle des GABPα/β Transkriptionsfaktors bei der Proliferation von NIH-3T3 Zellen N2 - SUMMARY GABP is a heterodymeric member of Ets-family transcription factors. It consists of two subunits – GABPa which contains DNA binding domain and GABPb, which provides transcriptional activation domain and nuclear localization signal. GABPa/b complex is essential for transcriptional activation of multiple lineage-restricted and housekeeping genes, several viral genes, and in some cases might function as transcriptional repressor. Large variety of data indicates involvement of GABP in the complex regulation of cell growth, specified by quiescence, stimulation/proliferation, apoptosis and senescence. Expression level of GABPa subunit is rapidly increased when resting cells enter S-phase, and GABPa/b complex is critical to promote the continuity of the cell cycle. Conditional inactivation of GABPa expression in mouse embryonic fibroblasts results in a complete block of proliferation and acquisition of senescence-like phenotype. However, the influence of GABP on the other cell growth determinant – the apoptosis – remains largely obscure. Therefore we aimed to investigate the influence of GABPa/b expression level on the cell growth in vitro. Using siRNA approach we achieved efficient but only transient down-regulation of GABPa expression which precluded further cell growth studies. Persistent increase of the expression of GABPb subunit only resulted in a positive effect on the cell growth speed. Simultaneous conditional overexpression of both GABPa and GABPb subunits though, strongly reduced the growth of the affected cell cultures in reversible and in expression level dependent manner. Interestingly, GABPa/b overexpressing cells did show neither cell cycle arrest nor massive induction of apoptosis. However, more detailed analyses revealed that dampened apoptotic processes were taking place in GABPa/b−overexpressing cells, starting with a prominent activation of caspase-12. Interestingly, activation of downstream effector caspases was rather suppressed explaining a weak increase of apoptotic cells in GABPa/b overexpressing cultures. This effect suggests that the activation of caspase-12 by elevated amounts of exogenous GABPa/b reflects the normal physiological mechanism of caspase-12 regulation. N2 - ZUSAMMENFASSUNG GABP ist ein heterodimerisches Mitglied aus der Familie der Ets- Transkriptionsfaktoren. Es besteht aus zwei Untereinheiten – GABPa, welche die DNA-Bindedomäne enthält, sowie GABPb, welche sowohl die Transkriptions-Aktvierungsdomäne als auch das Kernimportsignal umfasst. GABPa/b ist für die Transkriptions-Aktivierung mehrerer differenzierungstypischer als auch sog. Housekeeping Gene, sowie einiger viraler Gene essentiell und kann, in einigen Fällen, auch als Transkriptionsrepressor fungieren. Eine Vielzahl von Daten deutet darauf hin, dass GABP in der komplexen Kontrolle des Wachstums von Zellen ein wichtige Rolle zukommt. Dies zeigt sich z. B. im Einfluss von GABP auf zelluläre Vorgänge wie der Stimulation/Proliferation, Apoptose und Seneszenz. So steigt z. B. der Spiegel der GABPa Untereinheit rapide an, nachdem ruhende Zellen die G0-Phase verlassen und in die S-Phase eintreten. Der aus beiden Untereinheiten gebildete Komplex ist dann für die Progression der Zellen durch den gesamten Zellzyklus von entscheidender Bedeutung. Die Unterdrückung der Expression der GABPa Untereinheit in embryonalen Mausfibroblasten hingegen führt zu einem vollkommenen Proliferations-Stopp dieser Zellen und induziert in diesen einen Seneszenz-artigen Phänotyp. Andererseits ist über den Einfluss von GABP auf andere wichtige das Zellwachstums beeinflussende Faktoren wie z. B. der Apoptose bislang noch recht wenig bekannt. Daher lag es im Fokus dieser vorliegenden Arbeit, den Einfluss der GABPa/b-Spiegels auf das Zellwachstum in vitro näher zu untersuchen. Mithilfe von siRNA-Ansätzen gelang uns die effiziente Herunterregulierung von GABPa. Diese war jedoch nur von vorübergehender Natur, so dass weitere Studien zum Zellwachstum nicht möglich waren. Die stabile Überexpression der GABPb Untereinheit führte dagegen nur zu einem Anstieg der Zellwachstumsgeschwindigkeit. Wurden jedoch sowohl beide Untereinheit gleichzeitig überexprimiert, so resultierte dies in einer deutlichen, Expressionsspiegel-abhängigen und reversiblen Wachstumshemmung der Zellen. Bemerkenswerterweise zeigte die GABPa/b-überexprimierende Zellpopulation weder einen erhöhten Anteil an G0-Phase noch war eine deutlich ausgeprägte Zunahme der Apoptose-Rate zu verzeichnen. In weiteren Experimenten konnte dennoch eine leichte Erhöhung der Apoptose-Rate in den überexprimierenden Zellen gezeigt werden, was sich durch die deutliche Aktivierung von Caspase-12 belegen ließ. Die Aktivierung von Effektor-Caspasen der Caspase-12 schien allerdings nicht zu erfolgen, was den nur schwach ausgeprägten Charakter der Apoptose zu erklären vermag. Diese Beobachtungen suggerieren, dass die Aktivierung der Caspase-12 durch erhöhte Mengen von exogenem GABPa/b den normalen physiologischen Mechanismus der Caspase-12 Regulation widerspiegelt. KW - Proliferation KW - Transkriptionsfaktor KW - Zellzyklus KW - GABP KW - Caspase 12 KW - NIH-3T3 KW - Apoptosis KW - GABP KW - Caspase 12 KW - NIH-3T3 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67655 ER - TY - THES A1 - Kochler, Yvonne T1 - Der zeitliche Verlauf von Parametern des Zellzyklus bei Patienten mit Fanconi Anämie T1 - Development of Cell Cycle Parameter in Patients with Fanconi Anemia N2 - Es werden die Parameter Summe-G2/GF und G0/G1 der hochauflösenden, zweiparametrigen Zellzyklusanalyse von Lymphozyten bei Fanconi-Anämie-Patienten, bei denen mehrere Meßwerte vorliegen, im Hinblick auf Schwankungen untersucht. Nach Auswertung der Daten stellen die Werte keine konstanten Parameter für den einzelnen Patienten dar. Die Langzeitanalyse des Zellzyklusverhaltens peripherer Blutlymphozyten reflektiert jedoch weitgehend die klinische Situation der Patienten. N2 - Two Parameter - Sum of G2/GF and G0/G1 - of twoparametric, high definition Cellcycle Analyses from Lymphocytes of Fanconi-Anemia-Patients were examined over the time. After Evaluation of Data it became clear, that Sum G2/GF and G0/G1-Parameter are not constant for each Patient over the time. But the longtime Analyses of peripheric Lymphocytes showed that they almost represent the clinical Situation of a Patient. KW - Fanconi-Anämie KW - Änderung KW - Zellzyklus KW - Parameter KW - G0/G1 KW - Summe G2/GF KW - Fanconi Anemia KW - Development KW - Parameter KW - Cellcycle Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67204 ER -