TY  - THES
A1  - Scherzer, Sönke
T1  - Biophysikalische Analyse und Rekonstitution des schnellen ABA-Signaltransduktionsweges aus Arabidopsis thaliana
T1  - Biophysical analysis and reconstitution of the fast ABA-signal transduction pathway in Arabidopsis thaliana
N2  - In dieser Arbeit sollte zunächst die Frage geklärt werden, ob es sich bei SLAC1 um den S-typ Anionenkanal handelt, oder ob SLAC1 nur ein essentieller Bestandteil des Anionenkanals ist. Zur funktionellen Charakterisierung des per se inaktiven SLAC1 Proteins, wurde mit der Suche nach SLAC1-aktivierenden Interaktionspartnern begonnen. Zu diesem Zweck bediente man sich der Methode der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BiFC) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Da bereits die Abhängigkeit der Anionenströme in Schließzellen von De- und Phosphorylierungsereignissen bekannt war, galt Ca2+-abhängigen Kinasen der CPK Familie, ABA-aktivierten Kinasen der SnRK Familie und Phosphatasen des PP2C Typs eine besondere Aufmerksamkeit. Mitglieder dieser Familien wurden bereits mit der Regulation des Stomaschlusses in Verbindung gebracht. Bei diesen Experimenten zeigte sich, dass SnRK2.6 (OST1) und mehrere CPKs deutlich mit SLAC1 physikalisch interagierten. Als Folge dieser Interaktion in Oozyten konnten schließlich nach Koexpression von SLAC1 zusammen mit den interagierenden Kinasen typische S-Typ Anionenströme detektiert werden, wie man sie aus Patch-Clamp Experimenten an isolierten Schließzellprotoplasten kannte. Hierbei bewirkten die Kinasen OST1 und CPK23 die größte Anionenkanalaktivierung. Dieses Ergebnis wird durch die BIFC-Experimente gestützt, da OST1 und CPK23 die stärkste Interaktion zu SLAC1 zeigten. Die elektrophysiologische Charakterisierung der SLAC1-Ströme im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten in Kombination mit in vivo Patch-Clamp Untersuchungen wies SLAC1 eindeutig als den lange gesuchten S-Typ Anionenkanal in Arabidopsis Schließzellen aus. Somit ist die direkte S-Typ Anionenkanalaktivierung durch OST1 auf dem Kalzium- unabhängigen und durch CPKs auf dem Ca2+-abhängigen ABA-Signaltransduktionsweg gelungen. Bei der Spezifizierung der einzelnen Kalzium-Abhängigkeiten dieser Kinasen in Oozyten und in in vitro Kinase Assays konnten weiterhin unterschiedliche Affinitäten der CPKs zu Kalzium festgestellt werden. So vermittelten die schwach Kalzium-abhängigen CPK6 und CPK23 bereits ohne einen Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentratiom über das Ruheniveau hinaus schon die Anionenkanalaktivierung. Die stark Kalzium-abhängigen CPK3 und CPK21 hingegen, werden erst aktiv wenn die ABA vermittelte Signaltransduktion zu einem Anstieg der Kalziumkonzentration führt. Da somit die Kinasen OST1, CPK6 und CPK23 ohne dieses Kalziumsignal aktiv sind, benötigen diese einen übergeordneten Regulationsmechanismus. In den BIFC-Experimenten konnte eine deutliche Interaktion der Phosphatasen ABI1 und 2 zu den SLAC1 aktivierenden Kinasen beobachtet werden. Dass diese Interaktion zu einem Ausbleiben der Anionenkanalaktivierung führt, wurde in TEVC-Messungen gezeigt. Mit diesen Erkenntnissen um die ABA-Signaltransduktionskette in Schließzellen konnten in in vitro Kinase Experimenten ihre einzelnen Glieder zusammengesetzt und der ABA-vermittelte Stomaschluss nachvollzogen werden. In dieser Arbeit zeigte sich, dass, das unter Wasserstress-Bedingungen synthetisierte Phytohormon, ABA von Rezeptoren der RCAR/PYR/PYL-Familie percepiert wird. Anschließend bindet die Phosphatase ABI1 an den ABA-RCAR1 Komplex. In ihrer freien Form inhibiert die Phosphatase ABI1 die Kinasen OST1, CPK3, 6, 21 und CPK23 durch Dephosphorylierung. Nach Bindung von ABI1 an RCAR1 sind diese Kinasen von dem inhibierenden ABI1 entlassen. Die Kinasen OST1, CPK6 und CPK23 stellen ihre Aktivität durch Autophosphorylierung wieder her. Die stark Ca2+-abhängigen Kinasen CPK3 und 21 benötigt hierzu noch einen ABA induzierten Ca2+-Anstieg im Zytoplasma. Diese Kinasen phosphorylieren anschließend SLAC1 am N-Terminus. Diese Phosphorylierung bewirkt die Aktivierung von SLAC1 woraufhin Anionen aus der Schließzelle entlassen werden. Das Fehlen dieser negativen Ladungen führt zur Depolarisation der Membran woraufhin der auswärtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK aktiviert und K+ aus der Schließzelle entlässt. Der Verlust an Osmolyten bewirkt einen osmotisch getriebenen Wasserausstrom und das Stoma schließt sich.
N2  - This work should clarify whether SLAC1 is the anion channel itself, or a regulatory component of S-type anion channels. To answer this question we searched for activating interaction partners of SLAC1. For this purpose the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) technique was used following heterologous expression in Xenopus oocytes. Since anion currents of guard cells have been shown to be associated with phosphorylation events we focused on calcium dependent kinases (CPKs), ABA-activated SnRK kinases and PP2C phosphatases. Members of these families were already known to be involved in ABA-dependent stomatal closure. BIFC experiments revealed that SnRK2.6 (OST1) and several CPKs physically interact with SLAC1 in oocytes. Upon coexpression of SLAC1 with these interacting kinases in Xenopus oocytes, SLAC1-related anion currents appeared similar to those observed in guard cells. Strongest anion channel activation was detected by coexpression of SLAC1 and OST1 or CPK23. These findings are supported by BIFC experiments detecting OST1 and CPK23 also as strongest interaction partners of SLAC1. The electrophysiological characterization of SLAC1 currents in Xenopus oocytes, in combination with in vivo patch clamp studies demonstrated that SLAC1 is the major component of S-type anion currents in Arabidopsis guard cells. Furthermore we could show that OST1 mediates direct S-type anion channel activation in a calcium-independent manner whereas CPKs are positive regulators of SLAC1 in the calcium-dependent branch of the ABA signaling pathway. Moreover in vitro kinase assays and TEVC measurements in oocytes revealed that there are two groups of SLAC1 activating CPK kinases with distinct Ca2+ affinities: i) the weak calcium-dependent CPK6 and CPK23 mediate anion channel activation even at the low resting calcium concentrations while ii) the high affinity kinases CPK3 and CPK21 are only active in response to an increase in cytosolic calcium concentration. Since OST1, CPK6 and CPK23 are active even without a preceding calcium signal, a master regulator is necessary which keeps those kinases inactive in the absence of ABA. BIFC experiments revealed a strong interaction of phosphatases ABI1 and 2 towards the SLAC1 activating kinases. Interestingly the integration of ABI1 into the SLAC1/kinase complex prevented SLAC1 activation in oocytes. Taken together our findings allowed us to reconstitute the ABA signaling pathway from the perception of ABA to the activation of S-type anion channel SLAC1, in turn leading to stomatal closure. Under water stress conditions the phytohormone ABA is synthesized and sensed by its receptors (RCAR/PYR/PYL). This allows binding of ABI1 to the active ABA-RCAR1 complex. In its free form ABI1 by dephosphorylation inhibits the kinases OST1, CPK3, 6, 21 and CPK23. After binding of ABI1 to RCAR1, however, these kinases are released from the inhibitory effect of ABI1. The kinases OST1, CPK23 and CPK6 become active by autophosphorylation. The strong Ca2+-dependent kinases CPK3 and CPK21 in addition need an ABA-induced rise in cytosolic calcium concentration to restore their activity. These active kinases phosphorylate SLAC1 at its N-terminus leading to the activation of SLAC1. The release of anions from guard cells depolarizes the guard cell membrane potential whereupon the outward rectifying potassium channel GORK is gated open. Finally the loss of osmolytes causes an osmotic driven water loss, the guard cells shrink and thus the stoma closes.
KW  - Schließzelle
KW  - Abscisinsäure
KW  - Calcium
KW  - OST1
KW  - CPK
KW  - OST1
KW  - CPK
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76199
ER  - 
TY  - THES
A1  - Akindeinde, Saheed Ojo
T1  - Numerical Verification of Optimality Conditions in Optimal Control Problems
T1  - Numerischen Verifizierung von Optimalitätsbedingungen für Optimalsteurungsprobleme
N2  - This thesis is devoted to numerical verification of optimality conditions for non-convex optimal control problems. In the first part, we are concerned with a-posteriori verification of sufficient optimality conditions. It is a common knowledge that verification of such conditions for general non-convex PDE-constrained optimization problems is very challenging. We propose a method to verify second-order sufficient conditions for a general class of optimal control problem. If the proposed verification method confirms the fulfillment of the sufficient condition then a-posteriori error estimates can be computed. A special ingredient of our method is an error analysis for the Hessian of the underlying optimization problem. We derive conditions under which positive definiteness of the Hessian of the discrete problem implies positive definiteness of the Hessian of the continuous problem. The results are complemented with numerical experiments. In the second part, we investigate adaptive methods for optimal control problems with finitely many control parameters. We analyze a-posteriori error estimates based on verification of second-order sufficient optimality conditions using the method developed in the first part. Reliability and efficiency of the error estimator are shown. We illustrate through numerical experiments, the use of the estimator in guiding adaptive mesh refinement.
N2  - Diese Arbeit widmet sich der numerischen Verifizierung von Optimalitaetsbedingungen fuer nicht konvexe Optimalsteuerungsprobleme. Im ersten Teil beschaeftigen wir uns mit der a-posteriori Ueberpruefung von hinreichenden Optimalitaetskriterien. Es ist bekannt, dass der Nachweis solcher Bedingungen fuer allgemeine nicht konvexe Optimierungsproblemem mit Nebenbedingungen in Form von partiellen Differentialgleichungen sehr schwierig ist. Wir stellen eine Methode vor, um die hinreichenden Bedingungen zweiter Ordnung fuer eine allgemeine Problemklasse zu testen. Falls die vorgeschlagene Strategie bestaetigt, dass diese Bedingungen erfuellt sind, koennen a-posteriori Fehlerschaetzungen berechnet werden. Ein wesentlicher Bestandteil unserer Methode ist eine Fehleranalyse fuer die Hessematrix des zugrunde liegenden Optimierungsproblems. Es werden Bedingungen hergeleitet, unter denen die positive Definitheit der Hessematrix des diskreten Problems die positive Definitheit der Hessematrix fuer das kontinuierliche Problem nach sich zieht. Diese Ergebnisse werden durch numerische Experimente ergaenzt. Im zweiten Teil untersuchen wir adaptive (Diskretisierungs-)methoden fuer Optimalsteuerungsprobleme mit endlich vielen Kontrollparametern. Basierend auf dem Nachweis hinreichender Optimalitaetsbedingungen zweiter Ordnung analysieren wir a posteriori Fehlerschaetzungen. Dies geschieht unter der Nutzung der Resultate des ersten Teils der Arbeit. Es wird die Zuverlaessigkeit und Effizienz des Fehlerschaetzers bewiesen. Mittels weiterer numerischer Experimente illustrieren wir, wie der Fehlerschaetzer zur Steuerung adaptiver Gitterverfeinerung eingesetzt werden kann.
KW  - Optimale Kontrolle
KW  - Nichtkonvexe Optimierung
KW  - Numerisches Verfahren
KW  - non-convex optimal control problems
KW  - sufficient optimality conditions
KW  - a-posteriori error estimates
KW  - numerical approximations
KW  - adaptive refinement
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76065
ER  - 
TY  - THES
A1  - Eckert, Lisa
T1  - Familienbasierte Assoziationsstudie des Kandidatengens des synaptosomal-assoziierten Proteins SNAP-25 bei ADHS
T1  - Family-based association study of the candidate gene of the synaptosomal-associated protein SNAP-25 in ADHD
N2  - Eine wesentliche Rolle hinsichtlich der Pathophysiologie der ADHS scheint der komplexe Prozess der Signaltransduktion an der neuronalen Synapse innezuhaben. Dieser wird bewerkstelligt durch ein komplexes Zusammenspiel sogenannter SNARE-Proteine, unter anderem dem synaptosomal-assoziiertem Protein SNAP-25. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung potentiell-funktioneller Varianten des Kandidatengens SNAP-25 auf eine Assoziation mit der ADHS in einer deutschen Stichprobe. Bei den untersuchten Single-Nukleotid-Polymorphsimen handelt es sich dabei um SNP rs6077690 im Promotorbereich und SNP rs363006 in Intron 8 des Kandidatengens SNAP-25, deren Assoziation mit der ADHS in der Fachliteratur beschrieben ist. Desweiteren wurde ein bis lang nicht untersuchter SNP,rs6039769 in diese Studie miteinbezogen.
N2  - This family based study was applied to detect preferential transmission of genetic variants of the candidate gene SNAP-25 in ADHD. As neurotransmission has been suggested to be a crucial factor in the pathophysiology of ADHD, genes encoding for synaptic proteins are supposed to be involved. One of the core proteins of this so called "SNARE-complex" is the synaptosomal-associated protein SNAP-25. According to meta-analyses it is one of the most validated candidate genes in ADHD. This study investigated the association of genetic variants of SNAP25, located in the putative promoter region SNP ( rs6077690 )of SNAP25 and a SNP ( rs363006 ) in intron 8, previously reported to be associated with ADHD. Furthermore another SNP( rs6039769 ), also located in the core promotor region, was checked for association with ADHD.
KW  - Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom
KW  - Kandidatengen
KW  - SNAP-25
KW  - synaptosomal-assoziiertes Protein
KW  - Assoziationsstudie
KW  - family-based association study
KW  - candidate gene
KW  - synaptosomal-associated protein SNAP-25
KW  - ADHD
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75559
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TY  - THES
A1  - Grebner, Christoph
T1  - New Tabu-Search Algorithms for the Exploration of Energy Landscapes of Molecular Systems
T1  - Neue Tabu-Search Algorithmen zur Untersuchung von Energielandschaften molekularer Systeme
N2  - The visualization of energy functions is based on the possibility of separating different degrees of freedom. The most important one is the Born-Oppenheimer-approximation, which separates nucleus and electron movements. This allows the illustration of the potential energy as a function of the nuclei coordinates. Minima of the surface correspond to stable points like isomers or conformers. They are important for predicting the stability or thermodynamical of a system. Stationary points of first order correspond to transition points. They describe phase transitions, chemical reaction, or conformational changes. Furthermore, the partition function connects the potential hypersurface to the free energy of the system. The aim of the present work is the development and application of new approaches for the efficient exploration of multidimensional hypersurfaces. Initially, the Conformational Analysis and Search Tool (CAST) program was developed to create a basis for the new methods and algorithms. The development of CAST in object oriented C++ included, among other things, the implementation of a force field, different interfaces to external programs, analysis tools, and optimization libraries. Descriptions of an energy landscape require knowledge about the most stable minima. The Gradient Only Tabu Search (GOTS) has been shown to be very efficient in the optimization of mathematical test functions. Therefore, GOTS was taken as a starting point. Tabu-Search is based on the steepest descent - modest ascent strategy. The steepest descent is used for finding local minima, while the modest ascent is taken for leaving a minimum quickly. Furthermore, Tabu-Search is combined with an adaptive memory design to avoid cycling or returning. The highly accurate exploration of the phase space by Tabu-Search is often too expensive for complex optimization problems. Therefore, an algorithm for diversification of the search is required. After exploration of the proximity of the search space, the algorithm would guide the search to new and hopefully promising parts of the phase space. First application of GOTS to conformational search revealed weaknesses in the diversification search and the modest ascent part. On the one hand, the original methodology for diversification is insufficiently diverse. The algorithm is considerably improved by combining the more local GOTS with the wider searching Basin Hopping (BH) approach. The second weak point is a too inaccurate and inefficient modest ascent strategy. Analysis of common transition state search algorithms lead to the adaption of the Dimer-method to the Tabu-Search approach. The Dimer-method only requires the first derivatives for locating the closest transition state. For conformational search, dihedral angles are usually the most flexible degrees of freedom. Therefore, only those are used in the Dimer-method for leaving a local minimum. Furthermore, the exact localization of the reaction pathway and the transition state is not necessary as the local minimum position should only be departed as fast as possible. This allows for larger step sizes during the Dimer-search. In the following optimization step, all coordinates are relaxed to remove possible strains in the system. The new Tabu-Search method with Dimer-search delivers more and improved minima. Furthermore, the approach is faster for larger systems. For a system with approximately 1200 atoms, an acceleration of 40 was measured. The new approach was compared to Molecular Dynamics with optimization (MD), Simulated Annealing (SA), and BH with the help of conformational search problems of bio-organic systems. In all cases, a better performance was found. A comparison to the Monte Carlo Multiple Minima/Low Mode Sampling (MCMM/LM) method proved the outstanding performance of the new Tabu-Search approach. The solvation of the chignolin protein further revealed the possibility of uncovering discrepancies between the employed theoretical model and the experimental starting structure. Ligand optimization for improvement of x-ray structures was one further new application field. Besides the global optimization, the search for transition states and reaction pathways is also of paramount importance. These points describe different transitions of stable states. Therefore, a new approach for the exploration of such cases was developed. The new approach is based on a global minimization of a hyperplane being perpendicular to the reaction coordinate. Minima of this reduced phase space belong to traces of transition states between reactant and product states on the unchanged hypersurface. Optimization to the closest transition state using the Dimer-method delivers paths lying between the initial and the final state. An iterative approach finally yields complex reaction pathways with many intermediate local minima. The PathOpt algorithm was tested by means of rearrangements of argon clusters showing very promising results.
N2  - Die visuelle Darstellung von Energiefunktionen basiert auf der Möglichkeit, verschiedene Freiheitsgrade zu separieren. Die wichtigste Näherung ist dabei die Born-Oppenheimer-Näherung. Sie erlaubt damit die Darstellung der potentiellen Energie als Funktion der Kernkoordinaten. Die daraus entstehende mehrdimensionale Hyperfläche entspricht der Summenformel eines beliebigen Systems. Minima der Fläche entsprechen stabilen Punkten wie Isomeren oder Konformeren. Diese sind wichtig für Aussagen über die Stabilität oder die Thermodynamik eines Systems. Stationäre Punkte erster Ordnung entsprechen Übergangsstrukturen und beschreiben Phasenübergänge, chemische Reaktionen aber auch Konformationsänderungen. Über die Zustandssumme ist die Hyperfläche zudem mit der freien Energie verknüpft. Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung und Anwendung neuer Methoden zur effizienten Untersuchung mehrdimensionaler Hyperflächen. Dabei wurde zunächst das Conformational Analysis and Search Tool (CAST)-Programm entwickelt. Die Entwicklung des CAST-Programms in objektorientiertem C++ beinhaltete unter anderem die Implementierung eines Kraftfeldes, verschiedene Schnittstellen zu externen Programmen, Analysealgorithmen und verschiedene Optimierungsmodule. Um Aussagen über eine Energielandschaft treffen zu können, müssen zuerst die stabilsten Minima gefunden werden. Der Gradient Only Tabu Search (GOTS) hat sich als sehr effizient in der Optimierung von mathematischen Funktionen erwiesen. Daher wurde GOTS als Startpunkt verwendet. Tabu-Search basiert auf dem steepest descent – modest ascent Prinzip. Zum Finden neuer Minima wird der steilste Abstieg (steepest descent) verwendet, ein Minimum wird auf dem Weg des geringsten Anstiegs (modest ascent) wieder verlassen. Tabu-Search ist zudem mit einem lernfähigen Speicherdesign kombiniert, wodurch ein Zurück- und im Kreis laufen vermieden wird. Der Phasenraum wird von Tabu-Search sehr genau untersucht, was für komplexere Probleme zu aufwendig wird. Daher bedarf es eines Diversifizierungsschritts, welcher nach Absuchen eines Teils des Phasenraums, die Suche in neue vielversprechende Bereiche bringt. Erste Anwendungen auf Konformationssuchen zeigten, dass GOTS Schwächen im Diversifizierungsschritt und der modest ascent Strategie besitzt. Zum einen ist die ursprünglich verwendete Methodik für die Diversifizierung zu wenig divers. Eine Kombination des mehr lokalen GOTS mit der weiträumiger suchenden Basin Hopping (BH) Methode brachte eine erhebliche Verbesserung. Der zweite Schwachpunkt besteht aus einer zu ungenauen und ineffizienten modest ascent Methode. Daher wurde die Dimer-Methode für Tabu-Search adaptiert. Diese benötigt lediglich die erste Ableitung, um zum Übergangszustand erster Ordnung zu konvergieren. Dabei werden in der Dimer-Methode nur Diederwinkel variiert. Zudem muss der Reaktionspfad und der Übergangszustand nicht exakt getroffen werden, da das Minimum nur möglichst schnell verlassen werden soll. Dies erlaubt größere Schrittweiten in der Dimer-Suche. Im nachfolgenden Optimierungsschritt werden alle Koordinaten relaxiert. Die neue Tabu-Search-Methode mit Dimer-Suche liefert mehr und deutlich verbesserte Minima. Zudem ist sie für größere Systeme deutlich schneller. Für ein System mit circa 1200 Atomen wurde eine Beschleunigung um den Faktor 40 erzielt. Die neue Methode wurde am Beispiel der Konformationssuche von bio-organischen Systemen mit Molekulardynamik mit Optimierung (MD), Simulated Annealing (SA) und BH verglichen, wobei sich in allen Fällen eine bessere Effizienz zeigte. Ein Vergleich zur Monte Carlo Multiple Minima/Low Mode Sampling Methode anhand der Optimierung von peptidischen Ligand-Rezeptor-Komplexen belegte ebenfalls die hervorragende Effizienz des neuen Ansatzes. Die Solvatisierung des Chignolin-Proteins mit Tabu-Search deckte die Möglichkeit auf, Differenzen zwischen der verwendeten theoretischen Methode und der experimentellen Startstruktur aufzudecken. Als weiterer neuer Anwendungsbereich wurde die Optimierung von Ligand-Enzym-Komplexen zur Verbesserung von Röntgenstrukturen untersucht. Neben der globalen Optimierung ist auch die Suche nach Übergangszuständen und Reaktionspfaden von größter Wichtigkeit. Diese beschreiben verschiedene Übergänge zwischen stabilen Zuständen. Daher wurde ein neuer Ansatz zur Untersuchung dieser Fragestellungen entwickelt. Dieser basiert auf einer globalen Minimierung einer Hyperfläche, welche senkrecht zum Reaktionspfad steht. Die Minima des reduzierten Phasenraums gehören zu Spuren zu Übergangszuständen zwischen dem Edukt und dem Produkt. Durch Optimierung dieser Punkte mittels der Dimer-Methode werden also Pfade gefunden, die zwischen Anfangs- und Endpunkt liegen. Ein iteratives Vorgehen liefert letztendlich komplexe Reaktionspfade. PathOpt wurde an Umlagerungen von Argon-Clustern evaluiert, welche sehr vielversprechende Ergebnisse lieferten.
KW  - Globale Optimierung
KW  - Kraftfeld-Rechnung
KW  - Übergangszustand
KW  - Computational chemistry
KW  - Tabu-Search
KW  - Methodenentwicklung
KW  - Dimermethode
KW  - Basin-Hopping
KW  - Energielandschaft
KW  - Theoretische Chemie
KW  - Tabu-Search
KW  - method development
KW  - dimer method
KW  - basin hopping
KW  - energy landscapes
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75591
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TY  - THES
A1  - Steinbauer, Michael Christoph
T1  - Ionen- und Elektronenimaging reaktiver Moleküle: Ethyl, Propargylen und Fulvenallenyl
T1  - Ion- and electron imaging of reactive molecules: Ethyl, propargylen and fulvenallenyl
N2  - Bei Verbrennungsprozessen im Otto-Motor, beim Raffinationsprozess in Erdölraffinerien, im interstellaren Raum oder in der Chemie der Erdatmosphäre spielen Moleküle, wie sie in dieser Arbeit untersucht wurden, eine wichtige Rolle. Allerdings stellt es eine große Herausforderung dar, solch reaktive Substanzen zu erzeugen und zu handhaben. Um das Ethyl-Radikal, ein wichtiges Intermediat z.B. in der Erzeugung von Ethylen, zu untersuchen, wurde eine bestehende Apparatur modifiziert. Diese ermöglicht es, die Geschwindigkeitsverteilung der Fragmente (Ionen oder Elektronen) zweidimensional aufzuzeichnen, die nach der Anregung mittels Laserlicht durch Photodissoziation entstehen. Diese velocity-map imaging Apparatur wurde in einem ersten Schritt mittels der Photodissoziation von Pyrrol bei 240 nm kalibriert. Cycloheptatrien konnte erfolgreich auf seine Photodissoziation untersucht werden, was als Test des VMI-Experiment genutzt wurde. Die gewonnenen Ergebnisse stimmten mit Resultaten überein, welche durch Doppler-Fragmentspektroskopie in dieser und früheren Arbeiten gewonnen wurden. Zwischen 11 und 13 % der Überschussenergie gehen dabei in die Translation des H-Atoms. • Das Ethyl-Radikal zeigte, als das erste mit unserer VMI-Apparatur untersuchte Radikal, eine interessante Photodissoziation: Wird es bei 250 nm angeregt, ergeben sich zwei Dissoziationskanäle, wobei ein bekannter Kanal nach schneller interner Konversion in den Grundzustand Fragmente mit geringer Translationsenergie erzeugt. Der zweite Kanal zeigt anisotropes Verhalten und erzeugt Wasserstoffatome mit hoher Translationsenergie, die mehr als die Hälfte der Überschussenergie abführen. Die Erklärung dieses Prozesses erweist sich schwierig in Anbetracht von durchgeführten Isotopenmarkierungsexperimenten sowie der beobachteten Ratenkonstanten für die Photodissoziation. Eine Interaktion von Valenz- und Rydbergzuständen im Ethyl-Radikal könnte eine Erklärung darstellen. In Zukunft kann beim VMI-Experiment in Würzburg versucht werden, die Auflösung weiter zu verbessern. Dabei ergäben sich im Idealfall zwei scharfe Ringe der H-Atome durch die Spin-Bahn-Aufspaltung von Brom, welche eine sehr genaue Kalibrierung ermöglichen. Neben den Ergebnissen auf dem Gebiet der Photodissoziation, die mit der VMI-Apparatur erzielt wurden, konnten mittels Synchrotronstrahlung und Aufzeichnen der Photoelektronen mittels VMI und der TPEPICO-Technik die folgenden Ergebnisse erhalten werden: • Von Propargylen, einem von drei C3H2 Isomeren, konnte die adiabatische Ionisierungsenergie (IEad) mit 8.99 eV bestimmt werden. Der Vorläufer Diazopropin, eine sehr instabile Substanz, wurde dazu synthetisiert und mit Synchrotronlicht untersucht. Allerdings war es nicht möglich, die Schwingungen im Kation oder die dissoziative Photoionisation (DPI) des Carbens zu untersuchen, da Diazopropin seinerseits bereits bei Energien von 9 eV durch DPI zerfällt. Allerdings konnte ein Peak im TPES des zyklischen Isomers aus einer früheren Messung eindeutig dem Propargylen zugeordnet werden. Ein Ausweg die DPI zu umgehen stellt die Verwendung eines anderen Vorläufers dar. Beispielsweise wurde dazu Propargylchlorid getestet, welches aber nicht das Propargylen erzeugt, sondern das zyklische Isomer Cyclopropenyliden. Daneben können durch ein Doppel-Imaging Experiment, bei dem die Ionen genauso wie die Elektronen mit einem bildgebenden Detektor aufgezeichnet werden, Ionen mit kinetischer Energie aus DPI von Ionen aus der Ionisation ohne kinetischer Energie unterschieden werden. • Von den substituierten Methyl-Radikalen Brommethyl sowie Cyanomethyl konnte die IEad (8.62 bzw. 10.28 eV) und vom Brommethyl die DPI (AE0K = 13.95 eV) bestimmt werden. Daraus konnte der Einfluss der Substituenten auf die IEad im Vergleich zum Methyl-Radikal (IE = 9.84 eV) gezeigt werden. Das zeigt, dass der Brom-Substituent das Kation, der Cyano-Rest dagegen das Radikal stabilisiert. Ebenso konnten aus den Ergebnissen beim Brommethyl thermodynamische Daten wie die Standardbildungsenthalpie des Radikals (ΔH0f= 174.5 kJ/mol) oder Bindungsenergien gewonnen werden. Letztere betragen 334 kJ/mol für die C-Br Bindung im Brommethyl-Radikal sowie 505 kJ/mol im Kation. • Das Fulvenallen (C7H6) wurde aus Phthalid durch Pyrolyse erzeugt und dessen IEad mit 8.22 eV bestimmt. Schwingungen konnten im Kation aufgelöst und zugeordnet werden. Außerdem konnte erstmals die IEad des Fulvenallenyl-Radikals (C7H5) mit 8.19 eV festgelegt werden. Im Vergleich zu früheren Messungen zeigte sich, dass aus Toluol in der Pyrolyse ebenfalls die beiden C7H5/C7H6 Isomere entstehen. Um verschiedene C7H5/C7H6 Isomere in einem Verbrennungsprozess zu unterscheiden, wäre es vorteilhaft, experimentell bestimmte Ionisierungsenergien von anderen Isomeren zu kennen.
N2  - In the present work several hydrocarbons have been studied for their intrinsic properties like photoionization, photodissociation or dissociative photoionization. These radicals and carbenes are important in several fields of research: combustion processes (Otto engine), refining processes in oil refineries, interstellar space or chemistry in the Earth’s atmosphere. Molecules like the ones presented in this work play an important role in all these fields of science. However, it poses a great challenge to produce and handle such reactive substances. An apparatus was modified to study the ethyl radical, an important intermediate e.g. in the production of ethylene, in more detail. This experiment allows to record the velocity distribution of the fragment ions, which are produced after excitation with laser light. In a first step this VMI machine was calibrated by the measurement of pyrrol’s photodissociation at an excitation wavelength of 240 nm. In a second step the setup was tested with the photodissociation of cycloheptatriene. Results obtained by Doppler fragment spectroscopy in this and older piece of work were confirmed. About 11 to 13 % of the excess energy are converted to translational energy of the H atom. • The ethyl radical’s photodissociation after excitation at 250 nm was quite interesting. This radical, being the first one studied with this VMI apparatus, showed two dissociation channels: One produces slow H-atoms with an isotropic distribution. This channel was known to the literature and explained by a redistribution of energy on the ground state potential energy surface after fast internal conversion. A second dissociation channel was also observed. Fast H atoms with an anisotropic distribution carry away the vast majority of excess energy. Considering some isotopic labeling experiments and rate constants of the dissoziation the explanation of the second channel is quite challenging. An interaction of Rydberg- and valence states could be a possible explanation. In the future, one can try to improve the resolution of the VMI-experiment in Würzburg further. Besides the results obtained with the VMI machine on the photodissociation some more results were obtained with the help of photoelectron VMI, synchrotron radiation and the TPEPICO imaging technique: The adiabatic ionization energy of propargylene - one of three C3H2 isomers - could be determined to be 8.99 eV. Its precursor diazopropyne could be synthesized, but it came out that this substance is very unstable. The experiments were carried out with synchrotron radiation. Because of the precursor’s DPI, the vibrations of the proparglyene cation could not be resolved. However, one peak could be explained in the threshold electron spectrum of cyclopropenylidene in an earlier experiment, which was assigned the propargylene. One way to circumvent the DPI is to use a different precursor. Therefore, propargyl chloride was tested. Unfortunately, it produced the cyclic isomer cyclopropenylidene. If a doubleimaging experiment would be used, in which ions and electrons are detected by VMI, one could distinguish ions with kinetic energy (by DPI) from those without kinetic energy. • The IEad of two substituted methyl radicals could be determined. The cyanomethyl (10.28 eV) and the bromomethyl radical (8.62 eV) showed differences in their photoionization compared to the methyl radical (9.84 eV). This shows the stabilization effect of the cyano substituent on the radical and of the bromine on the cation. The DPI of bromomethyl could be allocated to 13.95 eV. This allowed us to calculate thermodynamic data like the radical’s heat of formation (ΔH0f =174.5 kJ/mol) or dissociation energies of the C-Br bonding. The latter are 334 kJ/mol in the bromomethyl radical respectively 505 kJ/mol in the cation. • Fulvenallen (C7H6) was produced from phthalide by pyrolysis. The IEad of the stable species was determined to be 8.22 eV. A vibrational progression of the cation could be resolved and assigned. Furthermore, the IEad of the radical fulvenallenyl (C7H5) could be determined to be 8.19 eV. Compared to earlier results obtained on the pyrolysis products of toluene it showed that both C7H5/C7H6 isomers are produced. To distinguish different C7H5/C7H6 isomers in combustion processes, experimentally determined IEs of other isomers would be useful. Unfortunately, the precursors for these are connected to time-consuming synthesis. Although fulvenallenyl is of great interest for scientists, only little has been published in literature. Besides the photoionization, a VMI-experiment could allow a closer look on the photodissociation of this radical to verify and improve kinetic models and calculations in the near future. However, one has to know the properties of its excited states.
KW  - Radikal <Chemie>
KW  - Photodissoziation
KW  - Ionisationsenergie
KW  - REMPI
KW  - Synchrotron
KW  - Abstimmbarer Laser
KW  - Ultraviolettlaser
KW  - Laser
KW  - Pyrolyse
KW  - Velocity-Map-Imaging
KW  - dissoziative Photoionisation
KW  - Vakuum Jet-Flash Pyrolyse
KW  - Velocity-Map-Imaging
KW  - dissoziative Photoionisation
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75649
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kunert, Mario
T1  - Angst und Depression in der primärärztliche Versorgung
T1  - Anxiety and depression in the primary care
N2  - Die vorliegende Studie untersucht den Einsatz von Kurz-Screening-Instrumenten (bestehend aus dem PHQ-4, mit seinen beiden Untereinheiten dem GAD-2 und dem PHQ-2) hinsichtlich der Tauglichkeit für einen Routineeinsatz in Hausarztpraxen. Gescreent wurde auf das mögliche Vorliegen einer Angst- und/oder depressive Störungen mit anschließender Validitätsprüfung einer kleineren Stichprobe. Hinsichtlich der Validitätsprüfung konnte zwischen den CIDI- und den Screening-Ergebnissen eine gute Übereinstimmung ermittelt werden (prozentuale Über-einstimmung von 80,8% bei einem Cohen-Kappa von 0,62). Insgesamt betrachtet lässt sich mit einem vertretbaren Mehrbedarf an Zeit für nicht-ärztliche Mitarbeiter ein PHQ-4-Screening in einer Hausarztpraxis durchführen. Durch diese Maßnahme können - bei gleichzeitiger Entlastung des Arztes - wichtige Informationen für eine Krankheitserkennung und für eine ggf. notwendige Therapie gewonnen werden. Über einen Routineeinsatz von Kurz-Screenern in der primär-ärztlichen Versorgung sollte nachgedacht werden.
N2  - The present study investigates the use of short screening instruments (consisting of the PHQ-4, with its two subunits the GAD-2 and PHQ-2), regarding the suitability for routine use in primary care practices. It was screened for the possible presence of anxiety and / or depressive symptoms with a following validity check on a smaller unit. The accordance between CIDI and the screening-results could be rated as good (accordance percentage of 80.8% with a Cohens kappa of 0.62). The PHQ-4 leads to a need of more non-medical employees(more time needed), but overall is the PHQ-4 a pracitable instrument in the primary care. Through a routine use of short-Screenern in the primary health care should be considered.
KW  - Angst
KW  - Depression
KW  - Screening
KW  - Hausarzt
KW  - Primäre Gesundheitsversorgung
KW  - Composite international diagnostic interview
KW  - PHQ-4
KW  - PHQ
KW  - Kurzscreener
KW  - anxiety
KW  - depression
KW  - primary care
KW  - screening
KW  - PHQ-4
KW  - PHQ
KW  - CIDI
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74584
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heffels, Karl-Heinz
T1  - Functional nanofibres for regenerative medicine
T1  - Funktionelle Nanofasern für die regenerative Medizin
N2  - This thesis concerned the design and examination of a scaffold for tissue engineering applications. The template for the presented scaffold came from nature itself: the intercellular space in tissues that provides structure and support to the cells of the respective tissue, known as extracellular matrix (ECM). Fibres are a predominant characteristic feature of ECM, providing adhesion sites for cell-matrix interactions. In this dissertation a fibrous mesh was generated using the electrospinning technique to mimic the fibrous structure of the ECM. Two base polymers were explored: a biodegradable polyester, poly(D,L-lactide-co-glycolide); and a functional PEG-based star polymer, NCO-sP(EO-stat-PO). This topic was described in three major parts: the first part was materials based, concerning the chemical design and characterisation of the polymer scaffolds; the focus was then shifted to the cellular response to this fibrous scaffold; and finally the in vivo performance of the material was preliminarily assessed. The first steps towards an electrospun mesh started with adjusting the spinning parameters for the generation of homogeneous fibres. As reported in Chapter 3 a suitable setup configuration was on the one hand comprised of a spinning solution that consisted of 28.5 w/v% PLGA RG 504 and 6 w/v% NCO-sP(EO-stat-PO) in 450 µL acetone, 50 µL DMSO and 10 µL of an aqueous trifluoroacetic acid solution. On the other hand an ideal spinning behaviour was achieved at process parameters such as a flow rate of 0.5 mL/h, spinneret to collector distance of 12-16 cm and a voltage of 13 kV. The NCO-sP(EO-stat-PO) containing fibres proved to be highly hydrophilic as the functional additive was present on the fibre surface. Furthermore, the fibres featured a bulk degradation pattern as a consequence of the proportion of PLGA. Besides the morphologic similarity to ECM fibres, the functionality of the electrospun fibres is also decisive for a successful ECM mimicry. In Chapter 4, the passive as well as active functionality of the fibres was investigated. The fibres were required to be protein repellent to prevent an unspecific cell adhesion. This was proven as even 6.5 % sP(EO-stat-PO) in the PLGA fibres reduced any unspecific protein adsorption of bovine serum albumin and foetal calf serum to less than 1 %. However, avidin based proteins attached to the fibres. This adhesion process was avoided by an additional fibre surface treatment with glycidol. The active functionalisation of NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres was investigated with two fluorescent dyes and biocytin. A threefold, chemically orthogonal, fibre modification was achieved with these dyes. The chapters about the chemical and mechanical properties laid the basis for the in vitro chapters where a specific fibre functionalisation with peptides was conducted to analyse the cell adhesion and biochemical expressions. Beginning with fibroblasts in Chapter 5 the focus was on the specific cell adhesion on the electrospun fibres. While NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres without peptides did not allow any adhesion of fibroblasts, a fibre modification with GRGDS (an adhesion mediating peptide sequence) induced the adhesion and spreading of human dermal fibroblasts on the fibrous scaffolds. The control sequence GRGES that has no adhesion mediating qualities did not lead to any cell adhesion as observed on fibres without modifications. While the experiments of Chapter 5 were a proof-of-concept, in Chapter 6 a possible application in cartilage tissue engineering was examined. Therefore, primary human chondrocytes were seeded on fibrous scaffolds with various peptide sequences. Though the chondrocytes exhibited high viability on all scaffolds, an active interaction of cells and fibres was only found for the decorin derived sequence CGKLER. Live-cell-imaging revealed both cell attachment and migration within CGKLER-modified meshes. As chondrocytes undergo a de-differentiation towards a fibroblast-like phenotype, the chondrogenic re-differentiation on these scaffolds was investigated in a long term cell culture experiment of 28 days. Therefore, the glycosaminoglycan production was analysed as well as the mRNA expression of genes coding for collagen I and II, aggrecan and proteoglycan 4. In general only low amounts of the chondrogenic markers were measured, suggesting no chondrogenic differentiation. For conclusive evidence follow-up experiments are required that support or reject the findings. The success of an implant for tissue engineering relies not only on the response of the targeted cell type but also on the immune reaction caused by leukocytes. Hence, Chapter 7 dealt with primary human macrophages and their behaviour and phenotype on two-dimensional (2D) surfaces compared to three-dimensional (3D) fibrous substrates. It was found that the general non-adhesiveness of NCO-sP(EO-stat-PO) surfaces and fibres does not apply to macrophages. The cells aligned along the fibres on surfaces or resided in the pores of the meshes. On flat surfaces without 3D structure the macrophages showed a retarded adhesion kinetic accompanied with a high migratory activity indicating their search for a topographical feature to adhere to. Moreover, a detailed investigation of cell surface markers and chemokine signalling revealed that macrophages on 2D surfaces exhibited surface markers indicating a healing phenotype while the chemokine release suggested a pro-inflammatory phenotype. Interestingly, the opposite situation was found on 3D fibrous substrates with pro-inflammatory surface markers and pro-angiogenic cytokine release. As the immune response largely depends on cellular communication, it was concluded that the NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres induce an adequate immune response with promising prospects to be used in a scaffold for tissue engineering. The final chapter of this thesis reports on a first in vivo study conducted with the presented electrospun fibres. Here, the fibres were combined with a polypropylene mesh for the treatment of diaphragmatic hernias in a rabbit model. Two scaffold series were described that differed in the overall surface morphology: while the fibres of Series A were incorporated into a thick gel of NCO-sP(EO-stat-PO), the scaffolds of Series B featured only a thin hydrogel layer so that the overall fibrous structure could be retained. After four months in vivo the treated defects of the diaphragm were significantly smaller and filled mainly with scar tissue. Thick granulomas occurred on scaffolds of Series A while the implants of Series B did not induce any granuloma formation. As a consequence of the generally positive outcome of this study, the constructs were enhanced with a drug release system in a follow-up project. The incorporated drug was the MMP-inhibitor Ilomastat which is intended to reduce the formation of scar tissue. In conclusion, the simple and straight forward fabrication, the threefold functionalisation possibility and general versatile applicability makes the meshes of NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA fibres a promising candidate to be applied in tissue engineering scaffolds in the future.
N2  - Diese Dissertation beschäftigte sich mit der Entwicklung und Untersuchung eines Gerüsts zur Geweberegeneration. Der interzelluläre Raum, der in Geweben für die Gewebestruktur verantwortlich ist, wurde als Vorbild aus der Natur für das entwickelte Gerüst verwendet. Fasern sind in dieser extrazellulären Matrix (EZM) ein charakteristischer Bestandteil, die Adhäsionssequenzen für Zell-Matrix-Interaktionen enthalten und zur strukturellen Organisation der Gewebe beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurden Faservliese mit Hilfe des elektrostatischen Verspinnens hergestellt, um die natürlichen Fasern der EZM zu imitieren. Zwei Polymere bildeten die chemische Grundlage für diese Fasern: Ein bioabbaubarer Polyester, Poly(D,L-Laktid-co-Glykolid) (PLGA) und ein funktionales auf Polyethylenglykol basierendes, sternförmiges Polymer, NCO-sP(EO-stat-PO). Der erste Teil des in drei Hauptteile untergliederten Themas beschäftigte sich mit dem chemischen Design und der Fasercharakterisierung im Sinne der Materialeigenschaften. Der zweite Teil betrachtet die Auswirkungen der Fasern auf zellulärer Ebene, während der dritte Teil einen ersten Eindruck über die in vivo Reaktion auf die Materialien vermittelt. Die ersten Schritte in Richtung eines elektrostatisch gesponnenen Vlieses begannen mit der Erforschung geeigneter Einstellungen für eine homogene Faserproduktion. Kapitel 3 thematisiert geeignete Spinnparameter, zu denen auf der einen Seite eine spinnfähige Lösung gehörte, die aus 28.5 w/v% PLGA RG 504 und 6 w/v% NCO-sP(EO-stat-PO) in 450 µL Aceton, 50 µL DMSO und 10 µL trifluoressigsaurer wässriger Lösung besteht. Auf der anderen Seite wurden Prozessparameter gefunden, wie zum Beispiel eine Flussrate von 0.5 mL/h und ein Kollektor-Abstand von 12-16 cm, die bei einer Potentialdifferenz von 13 kV ein stabiles Spinnverhalten garantierten. Fasern mit dem Additiv NCO-sP(EO-stat-PO) zeigten eine äußerst starke Hydrophilie, da das Additiv während des Spinnprozesses an die Faseroberfläche segregierte. Des Weiteren sind die Fasern dank des PLGA-Anteils nach einem Volumenabbaumechanismus unter physiologischen Bedingungen degradierbar. Neben der morphologischen Ähnlichkeit zwischen natürlichen Fasern der EZM und elektrogesponnenen Fasern ist die Funktionalität der synthetischen Fasern entscheidend für eine erfolgreiche Imitation der EZM. Kapitel 4 betrachtet deswegen sowohl die passive als auch aktive Funktionalität der Fasern. Unter passive Funktionalität fällt das proteinabweisende Verhalten, welches eine unspezifische Zelladhäsion verhindert. Es wurde gezeigt, dass ein Anteil von 6.5 % sP(EO-stat-PO) in den PLGA-Fasern ausreicht, um die unspezifische Adhäsion von Albumin aus Rinderserum und fötalem Kälberserum auf weniger als 1 % zu senken. Dennoch adhärierten avidinbasierte Proteine auf den Fasern, was jedoch durch eine Behandlung mit Glycidol unterbunden werden konnte. Die aktive Funktionalisierung wurde exemplarisch mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen und Biocytin untersucht. Mit diesen Modellmolekülen wurde eine dreifache, chemisch orthogonale Fasermodifizierung erreicht. Die Kapitel über die chemischen und mechanischen Eigenschaften haben die Grundlage für in vitro Zellversuche gelegt, bei denen eine Faserfunktionalisierung mit Peptidsequenzen durchgeführt wurde, um eine spezifische Zelladhäsion zu erreichen und die biochemische Reaktion der Zellen zu untersuchen. In Kapitel 5 lag der Fokus auf der spezifischen Adhäsion von humanen dermalen Fibroblasten an den elektrogesponnenen Fasern. Während NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA Fasern ohne Peptide keine Zelladhäsion zuließen, induzierte eine Fasermodifikation mit GRGDS, einer adhäsionsvermittelnden Peptidsequenz, sowohl die Adhäsion als auch Ausbreitung der Fibroblasten auf den Fasern. Eine Kontrollsequenz ohne adhäsionsvermittelnde Eigenschaften (GRGES), führte, wie auch Fasern ohne Peptide, zu keiner Zelladhäsion. Die Experimente von Kapitel 6 gingen über das reine Machbarkeitskonzept von Kapitel 5 hinaus, indem eine mögliche Anwendung im Bereich der Knorpelregeneration untersucht wurde. Daher wurden primäre humane Chondrozyten auf Faservliesen ausgesät, die mit unterschiedlichen Peptiden modifiziert wurden. Trotz einer allgemein sehr guten Vitalität der Zellen auf allen Fasertypen, zeigten die Chondrozyten nur auf Vliesen mit der aus Decorin abgeleiteten CGKLER-Sequenz eine aktive Interaktion. Diese konnte mit dem Live-Cell-Imaging-Verfahren anhand der Zelladhäsion und Zellmigration beobachtet werden. Da Chondrozyten in der 2D-Expansionszellkultur einer Dedifferenzierung in Richtung eines Fibroblasten ähnlichen Zelltypen unterliegen, wurde eine 28-tägige Studie durchgeführt, um das Redifferenzierungsverhalten auf den Fasergerüsten zu untersuchen. Dazu wurde sowohl die Glykosaminoglykanproduktion analysiert als auch die mRNA Expression der Gene, die die Kollagen I und II, Aggrecan und Proteoglykan 4 Produktion regulieren. Die chondrogenen Marker wurden in diesen Versuchen nur geringfügig ausgeschüttet, was in Anbetracht der großen Varianzen in den Messwerten auf keine Redifferenzierung schließen lässt. Für eine abschließende Beurteilung werden Folgeexperimente empfohlen, die die gemachten Beobachtungen bestärken oder widerlegen. Der Erfolg eines Implantats zur Geweberegeneration beruht nicht nur auf der gewünschten Reaktion des Zielzelltyps, sondern auch auf der Immunreaktion des Organismus, welche durch Leukozyten gesteuert wird. Folglich beschäftigte sich Kapitel 7 mit dem Verhalten und den Phänotypen primärer humaner Makrophagen auf dreidimensionalen Fasergerüsten und zweidimensionalen Oberflächen im Vergleich zueinander. Bei den Versuchen zeigte sich, dass die generelle Nicht-Adhäsivität von NCO-sP(EO-stat-PO) Oberflächen für Makrophagen nicht zutrifft. Die Zellen richteten sich an den Fasern auf den Oberflächen aus oder saßen in den Poren der Vliese. Auf flachen Oberflächen ohne dreidimensionale Struktur wiesen die Makrophagen ein verzögertes Adhäsionsverhalten auf und migrierten stark über die Oberfläche auf der Suche nach topographischen Unebenheiten, um dort adhärent zu werden. Des Weiteren zeigte eine detaillierte Untersuchung der Oberflächenmarker und der Zytokinausschüttung, dass Makrophagen auf 2D-Oberflächen gemäß der Oberflächenmarker einen entzündungs-hemmenden Phänotypen aufwiesen, während die Zytokinausschüttung einen entzündungs-fördernden Phänotypen suggerierte. Interessanterweise bot sich das entgegengesetzte Bild auf 3D-Faseroberflächen. Hier wurde die Erkenntnis gewonnen, dass die Morphologie einen größeren Einfluss auf die Zellreaktion hat als die Oberflächenchemie. Da die Immunantwort eines Organismus auf ein Implantat stark von der interzellularen Kommunikation abhängt, wurde gefolgert, dass die NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA Fasern eine adäquate Immunantwort hervorrufen mit vielversprechenden Aussichten, die Fasergerüste im Bereich der Geweberegeneration einzusetzen. Das letzte Kapitel der Dissertation berichtet über eine erste in vivo Studie der hier vorgestellten Fasern. Mit den Fasern wurde ein bestehendes Behandlungskonzept für Hernien des Zwerchfells erweitert und die Leistungsfähigkeit in einem Kaninchenmodell überprüft. Zwei Gerüsttypen wurden untersucht, die sich in der Oberflächenmorphologie maßgeblich unterschieden: In Serie A wurden die elektrogesponnenen Fasern in ein Gel aus NCO-sP(EO-stat-PO) gebettet, während die Fasern in Serie B nur mit einer dünnen Gelschicht bedeckt wurden, so dass die topografische Faserstruktur erhalten blieb. Nach 4 Monaten in vivo waren die behandelten Zwerchfelldefekte signifikant kleiner und überwiegend mit Narbengewebe gefüllt. Die ausgeprägte Granulombildung bei Fasergerüsten der Serie A konnte in der darauffolgenden Studie (Serie B) minimiert werden. Das gute Abschneiden dieser Studien wurde zum Anlass genommen, die Vliese weiterzuentwickeln und eine Medikamentenfreisetzung (Ilomastat) zu integrieren, um die Narbenbildung zu minimieren. Zusammenfassend beschreibt diese Dissertation einen einfachen und direkten Weg, Fasern für eine gezielte Geweberegeneration zu erzeugen, die dreifach funktionalisierbar und vielseitig anwendbar sind. Dies macht Fasergerüste auf der Basis von NCO-sP(EO-stat-PO)/PLGA zu einem vielversprechenden Kandidaten um in der Geweberegeneration eingesetzt zu werden.
KW  - Nanofaser
KW  - Gewebe
KW  - Regeneration
KW  - Extrazelluläre Matrix
KW  - Polymere
KW  - Elektrostatisches Verspinnen
KW  - Geweberegeneration
KW  - Fibroblasten
KW  - Makrophagen
KW  - Chondrozyten
KW  - Wirkstofffreisetzung
KW  - Oberflächenfunktionalisierung
KW  - Electrospinning
KW  - tissue engineering
KW  - surface functionalisation
KW  - drug release
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75684
N1  - Die Arbeit wurde am Lehrstuhl für Funktionswerkstoffe der Medizin und der Zahnheilkunde angefertigt
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmidt, Lisa Luise
T1  - Untersuchungen zum Einfluss der antiretroviralen Kombinationstherapie (HAART) auf das sexuelle Risikoverhalten von HIV-positiven Patienten in der Provinz Western Cape, Südafrika
T1  - The influence of antiretroviral combination therapy (HAART) on the sexual risk behaviour of HIV-positive patients in the province of Western Cape, South Africa
N2  - Untersuchungen zum Einfluss der antiretroviralen Kombinationstherapie (HAART)auf das sexuelle Risikoverhalten von HIV-positiven Patienten in der Provinz Western Cape, Südafrika
N2  - The influence of antiretroviral combination therapy (HAART) on the sexual risk behaviour of HIV-positive patients in the province Western Cape, South Africa
KW  - HIV
KW  - HIV-Infektion
KW  - Kombinationstherapie
KW  - Risikoverhalten
KW  - Westkap <Südafrika
KW  - Provinz>
KW  - Südafrika
KW  - Südafrika <Staat>
KW  - HAART
KW  - sexuelles Risikoverhalten
KW  - HIV-positive Patienten
KW  - HIV
KW  - HIV-infection
KW  - HAART
KW  - antiretroviral combination therapy
KW  - Western Cape
KW  - South Africa
KW  - sexual risk behaviour
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74799
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heinzel, Sebastian
T1  - Multimodal neuroimaging of prefrontal cortex (dys)function: EEG, fNIRS, fNIRS-fMRI and Imaging Genetics approaches
T1  - Multimodale funktionelle Bildgebung von (Dys)funktionen des präfrontalen Kortex: EEG, fNIRS, fNIRS-fMRT und Imaging Genetics Ansätze
N2  - The present cumulative dissertation comprises three neuroimaging studies using different techniques, functional tasks and experimental variables of diverse nature to investigate human prefrontal cortex (PFC) (dys)function as well as methodological aspects of functional near-infrared spectroscopy (fNIRS). (1) Both dopamine (DA) availability (“inverted U-model”) and excitatory versus inhibitory DA receptor stimulation (“dual-state theory”) have been linked to PFC processing and cognitive control function. Electroencephalography (EEG) was recorded during a Go/NoGo response inhibition task in 114 healthy controls and 181 adult patients with attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD). As a neural measure of prefrontal cognitive response control the anteriorization of the P300 centroid in NoGo- relative to Go-trials (NoGo anteriorization, NGA) was investigated for the impact of genetic polymorphisms modulating catechol-O-methyltransferase efficiency (COMT, Val158Met) in degrading prefrontal DA and inhibitory DA receptor D4 sensitivity (DRD4, 48bp VNTR). Single genes and ADHD diagnosis showed no significant impact on the NGA or behavioral measures. However, a significant COMT×DRD4 interaction was revealed as subjects with relatively increased D4-receptor function (DRD4: no 7R-alleles) displayed an “inverted U”-relationship between the NGA and increasing COMT-dependent DA levels, whereas subjects with decreased D4-sensitivity (7R) showed a U-relationship. This interaction was supported by 7R-allele dose-effects and also reflected by an impact on task behavior, i.e. intraindividual reaction time variability. Combining previous theories of PFC DA function, neural stability at intermediate DA levels may be accompanied by the risk of overly decreased neural flexibility if inhibitory DA receptor function is additionally decreased. The findings of COMT×DRD4 epistasis might help to disentangle the genetic basis of dopaminergic mechanisms underlying prefrontal (dys)function. (2) While progressive neurocognitive impairments are associated with aging and Alzheimer's disease (AD), cortical reorganization might delay difficulties in effortful word retrieval, which is one of the earliest cognitive signs of AD. Therefore, cortical hemodynamic responses were measured with fNIRS during phonological and semantic verbal fluency, and investigated in 325 non-demented, healthy subjects (age: 51-82 years). The predictive value of age, sex, verbal fluency performance and years of education for the cortical hemodynamics was assessed using multiple regression analyses. Age predicted bilaterally reduced inferior frontal junction (IFJ) and increased middle frontal and supramarginal gyri activity in both task conditions. Years of education as well as sex (IFJ activation in females > males) partly predicted opposite effects on activation compared to age, while task performance was not a significant predictor. All predictors showed small effect sizes (-.24 < β < .22). Middle frontal and supramarginal gyri activity may compensate for an aging-related decrease in IFJ recruitment during verbal fluency. The findings of aging-related (compensatory) cortical reorganization of verbal fluency processing might, in combination with other (risk) factors and using longitudinal observations, help to identify neurodegenerative processes of Alzheimer's disease, while individuals are still cognitively healthy. (3) Individual anatomical or systemic physiological sources of variance may hamper the interpretation of fNIRS signals as neural correlates of cortical functions and their association with individual personality traits. Using simultaneous fNIRS and functional magnetic resonance imaging (fMRI) of hemodynamic responses elicited by an intertemporal choice task in 20 healthy subjects, variability in crossmodal correlations and divergence in associations of the activation with trait "sensitivity to reward" (SR) was investigated. Moreover, an impact of interindividual anatomy and scalp fMRI signal fluctuations on fNIRS signals and activation-trait associations was studied. Both methods consistently detected activation within right inferior/middle frontal gyrus, while fNIRS-fMRI correlations showed wide variability between subjects. Up to 41% of fNIRS channel activation variance was explained by gray matter volume (simulated to be) traversed by near-infrared light, and up to 20% by scalp-cortex distance. Extracranial fMRI and fNIRS time series showed significant temporal correlations at the temple. Trait SR was negatively correlated with fMRI but not fNIRS activation elicited by immediate rewards of choice within right inferior/middle frontal gyrus. Higher trait SR increased the correlation between extracranial fMRI signal fluctuations and fNIRS signals, suggesting that task-evoked systemic arousal-effects might be trait-dependent. Task-related fNIRS signals might be impacted by regionally and individually weighted sources of anatomical and systemic physiological error variance. Traitactivation correlations might be affected or biased by systemic physiological arousal-effects, which should be accounted for in future fNIRS studies of interindividual differences.
N2  - Die vorliegende kumulative Dissertation umfasst drei funktionelle Bildgebungsstudien, welche mit unterschiedlichen methodischen Verfahren, Versuchsaufgaben und experimentellen Variablen Hirnfunktionen des präfrontalen Kortex sowie methodische Aspekte der funktionellen Nahinfrarotspektroskopie (fNIRS) untersuchten. (1) Sowohl die präfrontale Dopamin (DA)-Verfügbarkeit (“inverted U-model”) als auch das Verhältnis der Stimulation von exzitatorischen und inhibitorischen DA- Rezeptoren (“dual-state theory”) wurde mit präfrontaler Verarbeitung und Funktionen wie kognitiver Kontrolle in Verbindung gebracht. Während der Bearbeitung einer Aufgabe zur motorischen Antworthemmung wurden die elektrischen Hirnsignale mittels Elektroenzephalographie (EEG) bei 114 gesunden Probanden und 181 adulten Patienten mit Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung abgeleitet. Als neuronales Maß der präfrontalen kognitiven Antwortkontrolle wurde die Anteriorisierung der P300-Zentroide während NoGo- relativ zu Go-Aufgabenbedingungen verwendet (NoGo-Anteriorisierung, NGA). Die NGA wurde hinsichtlich eines Einflusses von genetischen Polymorphismen untersucht, welche den DA Abbau durch die Katechol-O-Methyltransferase (COMT, Val158Met) bzw. die DA D4-Rezeptorsensitivität (DRD4, 48 bp VNTR) modulieren. Während die NGA weder Gen-Haupteffekte noch Unterschiede zwischen Gesunden und Patienten zeigte, war eine signifikante epistatische COMT×DRD4 Interaktion zu beobachten. Personen mit relativ gesteigerter D4-Rezeptorsensitivität (kein 7R-Allel) zeigten einen umgekehrten U-Zusammenhang zwischen der NGA und steigender COMT-abhängiger DA-Verfügbarkeit, wohingegen Personen mit relativ verringerter D4-Rezeptorsensitivität (7R-Allel) einen U-Zusammenhang zeigten. Diese Gen-Gen Interaktion zeigte DRD4 7R-Alleldosis-Effekte und spiegelte sich auch behavioral in der intraindividuellen Go-Reaktionszeitvariabilität wider. Neuronale Stabilität bei mittlerer DA-Verfügbarkeit könnte mit einem erhöhen Risiko verringerter Flexibilität einhergehen, wenn zusätzlich die inhibitorische DA D4-Rezeptorfunktion eingeschränkt ist. Über die gezeigte Interaktion genetischer Einflussvariablen vereinigen die Ergebnisse bestehende Theorien zur DA-Verfügbarkeit bzw. dem Verhältnis DA-abhängiger neuronaler Erregung und Hemmung mit Einfluss auf präfrontale kognitive Kontrolle. (2) Alterungsprozesse und die Alzheimer-Demenz sind mit Beeinträchtigungen neurokognitiver Funktionen verbunden, wobei eine verringerte Wortflüssigkeit zu den frühesten Symptomen der Alzheimer-Demenz gehört. Kompensatorische Prozesse, welche diesen Symptomen (zunächst) entgegenwirken, können sich in einer Reorganisation kortikaler Verarbeitung zeigen. Zur Untersuchung dieser Prozesse wurden kortikale hämodynamische Antworten während der phonologischen und semantischen Wortflüssigkeit wurden bei 325 nicht-dementen gesunden Personen (Alter: 51-82 Jahre) mittels fNIRS untersucht. Der prädiktive Wert von Alter, Geschlecht, Wortflüssigkeitsleistung und der Ausbildungsjahre der Versuchspersonen bezüglicher der kortikalen hämodynamischen Antworten wurde mittels multipler Regression untersucht. Das Alter war ein signifikanter Prädiktor reduzierter bilateraler Aktivität im Übergangsbereich vom inferior frontalen Gyrus zum temporalen Pol (IFT) und gesteigerter bilateraler Aktivität im mittleren frontalen und supramarginalen Gyrus. Die Ausbildungsjahre und das Geschlecht (IFT-Aktivität bei Frauen höher als bei Männern) zeigten teilweise dem Alter entgegengesetzte Effekte, während die Wortflüssigkeitsleistung keinen signifikanten Einfluss hatte. Alle Prädiktoren zeigten nur kleine Effektstärken (-.24 < β < .22). Die gesteigerte Aktivität im mittleren frontalen und supramarginalen Gyrus könnte einen Kompensationsprozess für gesenkte IFT Aktivität mit steigendem Altern darstellen. Diese Belege einer (kompensatorischen) kortikalen Reorganisation der Verarbeitung von Wortflüssigkeit könnten, in Kombination mit weiteren (Risiko-)Faktoren und im Rahmen longitudinaler Untersuchungen, dazu beitragen neurodegenerative Prozesse einer Alzheimer-Demenz zu erkennen, bevor erste kognitive Symptome erkennbar sind. (3) Einflüsse individueller Anatomie und systemischer physiologischer Artefakte können die Validität der Interpretation von fNIRS Signalen als Korrelate kortikaler Hirnaktivität und Korrelationen dieser Aktivität mit individuellen (Persönlichkeits-)Maßen einschränken. Zur Untersuchung dieser Problematik wurde eine simultane Messung hämodynamischer Antworten mit fNIRS und funktioneller Magnetresonanztomographie (fMRT) bei 20 gesunden Versuchspersonen durchgeführt, während eine Entscheidungsaufgabe zwischen Geldbeträgen unterschiedlicher Höhe und Aushändigungszeitpunkte durchgeführt wurde. Beide Methoden zeigten konsistente Aktivierung im rechten inferioren/mittleren frontalen Gyrus. Korrelationen der fNIRS mit den fMRT Zeitreihen zeigten jedoch eine hohe Variabilität zwischen den Versuchspersonen. Bis zu 41% der Varianz der fNIRS-Aktivität wurde durch das simulierte individuelle Volumen der von fNIRS erfassten grauen Hirnsubstanz eines Messkanals, und bis zu 20% durch den Abstand zwischen Kopfoberfläche und Kortex, aufgeklärt. Die fMRT-Zeitreihen in der Haut zeigten zudem signifikante Korrelationen mit dem fNIRS-Signal in der Schläfenregion. Während fMRT eine signifikante negative Korrelation der inferioren/mittleren frontalen Gyrus-Aktivität mit dem Persönlichkeitsmerkmal "Belohnungssensitivität" zeigte, war die Korrelation bei fNIRS nicht signifikant. Eine erhöhte Belohnungssensitivität erhöhte zudem die Korrelation zwischen fNIRS und fMRT in der Haut, welches auf eine durch Erregung erhöhte systemisch-physiologische Reaktion in Abhängigkeit des Persönlichkeitsmerkales hindeuten könnte. Die mit fNIRS aufgezeichneten hämodynamischen Antworten unterliegen regionaler und individuell-gewichteter anatomischer und systemisch-physiologischer Fehlervarianz und zukünftige fNIRS-Studien zu interindividuellen Unterschieden sollten diesen Umstand berücksichtigen.
KW  - Präfrontaler Kortex
KW  - Dopamin
KW  - Bildgebendes Verfahren
KW  - Funktionelle Bildgebung
KW  - Kognitive Kontrolle
KW  - Genomische Bildgebung
KW  - Prefrontal cortex
KW  - functional neuroimaging
KW  - cognitive control
KW  - dopamine
KW  - imaging genetics
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75710
N1  - Die gedruckte Ausgabe dieser kumulativen Dissertation enthält die verwendeten Artikel im Volltext.
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zidorn, Wilfried
T1  - Alliances and R&D activites in the Biotechnology Industry
T1  - Allianzen und F&E Aktivitäten in der Biotechnologieindustrie
N2  - This dissertation is divided into three studies by addressing the following constitutive research questions in the context of the biotechnology industry: (1) How do different types of inter-firm alliances influence a firm’s R&D activity? (2) How does an increasing number and diversity of alliances in a firm’s alliance portfolio affect its R&D activity? (3) What is the optimal balance between exploration and exploitation? (1) To answer these research questions the first main chapter analyzes the impact of different types of alliances on the R&D activities of successful firms in the biotechnology industry. Following the use of a new approach to measuring changes in research activities, the results show that alliances are used to specialize in a certain research field, rather than to enter a completely new market. This effect becomes smaller when the equity involvement of the partners in the alliance project increases. (2) The second main chapter analyzes the impact on innovation output of having heterogeneous partners in a biotechnology firm’s alliance portfolio. Previous literature has stressed that investment in the heterogeneity of partners in an alliance portfolio is more important than merely engaging in multiple collaborative agreements. The analysis of a unique panel dataset of 20 biotechnology firms and their 8,602 alliances suggests that engaging in many alliances generally has a positive influence on a firm’s innovation output. Furthermore, maintaining diverse alliance portfolios has an inverted U-shaped influence on a firm’s innovation output, as managerial costs and complexity levels become too high. (3) And the third main chapter investigates whether there is an optimal balance to be found between explorative and exploitative innovation strategies. Previous literature states that firms that are ambidextrous (i.e., able to focus on exploration and exploitation simultaneously) tend to be more successful. Using a unique panel dataset of 20 leading biotechnology firms and separating their explorative and exploitative research, the chapter suggests that firms seeking to increase their innovation output should avoid imbalances between their explorative and exploitative innovation strategies. Furthermore, an inverted U-shaped relationship between a firm’s relative research attention on exploration and its innovation output is found. This dissertation concludes with the results of the dissertation, combines the findings, gives managerial implications and proposes areas for potential further research.
N2  - In einer sich ständig verändernden Welt, die dominiert wird durch dynamisches Wachstum und Technologietransfer, spielt die Forschung und Entwicklung (F&E) eines Unternehmens eine zentrale Rolle. Der einfache Zugang zu Informationen, insbesondere für Unternehmen in technologiegetriebenen Industrien, kann über Erfolg und Misserfolg entscheiden und dadurch signifikante Wettbewerbsvorteile generieren. Da Wissen zu jeder Zeit und an verschiedenen Orten auf dieser Welt generiert wird, ist es für ein einzelnes Unternehmen unmöglich auf dieses breite Spektrum an Information durch eigenständige F&E zuzugreifen. Um diesen Zugang zu erweitern, kooperieren Unternehmen, insbesondere im Hochtechnologiebereich, entlang ihrer Wertschöpfungskette mit nationalen und internationalen Unternehmen aus wettbewerbsnahen und –fremden Industrien sowie staatlichen und privaten Forschungseinrichtungen. Diese Allianzen helfen Unternehmen den wechselnden Umwelteinflüssen, gekennzeichnet durch radikale und inkrementelle Innovationen, dem Kampf um Marktanteile und Änderungen der regulatorischen Rahmenbedingungen entgegenzutreten und ermöglichen dadurch schnell und flexibel auf diese exogenen Einflüsse zu reagieren. Ziel dieser Dissertation ist es, die F&E Prozesse von Unternehmen in der Biotechnologieindustrie darzustellen und dabei zu analysieren, inwiefern Unternehmen verschiedene Arten von Allianzen nutzen, um diese Prozesse zu optimieren. Nach Beschreibung der Forschungsrelevanz und der damit verbundenen Analyse von Studien zu F&E, Wissensgenerierung, Allianzen und der Biotechnologieindustrie folgen drei empirische Hauptteile. Der erste Teil beschreibt, inwiefern Unternehmen verschiedene Typen von Allianzen nutzen können, um sich auf bestimmte Technologiebereiche zu spezialisieren. Die Ergebnisse zeigen, dass Biotechnologieunternehmen, die oft und gezielt mit anderen Unternehmen kooperieren, einen spezialisierteren Technologiefokus haben, als Unternehmen, die von diesem strategischen Instrument nur selten Gebrauch machen. Der zweite Teil geht auf den Einfluss von Allianzportfolios auf F&E Prozesse innerhalb eines Biotechnologieunternehmens ein. Damit Unternehmen nicht wiederholt auf redundantes Wissen stoßen, müssen diese mit heterogenen Partnern kooperieren. Um die F&E Erträge zu maximieren, ist es dabei essentiell, dass Unternehmen den Überblick zum einen über die Anzahl der Allianzen und zum anderen über deren Diversität behalten. Die Ergebnisse zeigen, dass Unternehmen zwar von beiden Kooperationsstrategien einzeln betrachtet profitieren, allerdings in Kombination schnell an einen Punkt gelangen, ab welchem negative F&E Erträge eintreten. Der dritte Teil beschäftigt sich mit der explorativen und exploitativen Wissensgenerierung innerhalb Biotechnologieunternehmen. Exploration bezieht sich hierbei auf experimentelle Forschung und der Schaffung von neuem Wissen, wohingegen Exploitation die Erweiterung und Verbesserung von bereits bestehendem Wissen beschreibt. Vorhergegangene Studien beschreiben, dass Unternehmen am meisten von einer effektiven Verbindung der beiden Forschungsstrategien profitieren, ermitteln allerdings nicht, bei welcher Gewichtung ein Unternehmen den höchsten technologischen Nutzen hat. Ziel dieses Teils ist es, diesen Extrempunkt für Unternehmen der Biotechnologie zu ermitteln. Die Ergebnisse zeigen, dass Biotechnologieunternehmen am meisten von einem Gleichgewicht zwischen Exploration und Exploitation profitieren, dabei allerdings minimal mehr Ressourcen der experimentellen Forschungen zusprechen. Dieses Optimum müsste sich jedoch verschieben, sobald sich Rahmenbedingungen wie Wettbewerb, Industriedynamik oder regulatorische Vorgaben ändern. Daher zeigt diese Dissertation, dass Unternehmenskooperation eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung sowie dem Überleben von Biotechnologieunternehmen spielt und eine Balance zwischen Exploration und Exploitation zu einem großen Teil die nachhaltige Wettbewerbsfähigkeit von Biotechnologieunternehmen bestimmen kann.
KW  - Biotechnologische Industrie
KW  - Forschung und Entwicklung
KW  - Unternehmenskooperation
KW  - Biotechnologie
KW  - Alliances
KW  - Innovation
KW  - Biotechnology
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75483
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TY  - THES
A1  - Masic, Anita
T1  - Signaling via Interleukin-4 Receptor alpha chain during dendritic cell–mediated vaccination is required to induce protective immunity against Leishmania major in susceptible BALB/c mice
T1  - Die auf dendritischen Zellen basierende Immunisierungsstrategie gegen Leishmania major in BALB/c Mäusen ist abhängig von der Stimulation der Interleukin-4 Rezeptor alpha Kette
N2  - Cutaneous leishmaniasis is endemic in tropical and subtropical regions of the world. Effective vaccination strategies are urgently needed because of the emergence of drug-resistant parasites and severe side effects of chemotherapy. The research group of Heidrun Moll previously established a DC-based vaccination strategy to induce complete and long-lasting immunity to experimental leishmaniasis using LmAg-loaded and CpG ODN-activated DC as a vaccine carrier. Prevention of tissue damages at the site of L. major inoculation can be achieved if the BALB/c mice were systemically given LmAg-loaded BMDC that had been exposed to CpG ODN. The interest in further exploring the role of IL-4 aroused as previous studies allowed establishing that IL-4 was involved in the redirection of the immune response towards a type 1 profile. Thus, wt BALB/c mice or DC-specific CD11ccreIL-4Rα-/lox BALB/c mice were given either wt or IL-4Rα-deficient LmAg-loaded BMDC exposed or not to CpG ODN prior to inoculation of 2 x 105 stationary phase L. major promastigotes into the BALB/c footpad. The results provide evidence that IL4/IL-4Rα-mediated signaling in the vaccinating DC is required to prevent tissue damages at the site of L. major inoculation, as properly conditioned wt DC but not IL-4Rα-deficient DC were able to confer resistance. Furthermore, uncontrolled L. major population size expansion was observed in the footpad and the footpad draining LN in CD11ccreIL-4Rα-/lox mice immunized with CpG ODN-exposed LmAg-loaded IL-4Rα-deficient DC, indicating the influence of IL-4R-mediated signaling in host DC to control parasite replication. In addition, no footpad damage was observed in BALB/c mice that were systemically immunized with LmAg-loaded wt DC doubly exposed to CpG ODN and recombinant IL-4. Discussing these findings allow the assumption that triggering the IL4/IL4Rα signaling pathway could be a precondition when designing vaccines aimed to prevent damaging processes in tissues hosting intracellular microorganisms.
N2  - Die kutane Leishmaniose ist vor allem in den tropischen und subtropischen Regionen endemisch. Die Notwendigkeit der Erforschung und Etablierung einer Impfstoffstrategie basiert auf dem Auftreten von starken Nebenwirkungen während einer medikamentösen Behandlung, als auch auf die Entwicklung von Resistenzen des Parasiten gegenüber herkömmlichen Behandlungsmethoden. Die Arbeitsgruppe um Heidrun Moll etablierte eine auf dendritischen Zellen (DZ) basierende Immunisierungsstrategie, welche langlebige Immunität gegen experimentelle Leishmaniose vermittelt. Dabei dienen CpG ODN-stimulierte DZ als Adjuvans für L.-major–Antigene (LmAg). Die durch Infektion mit Leishmania-Parasiten hervorgerufene Gewebeschädigung kann in BALB/c-Mäusen verhindert werden, vorausgesetzt eine systemische Verabreichung von LmAg-beladenen und CpG ODN-aktivierten DZ erfolgte eine Woche vor der Infektion. Es konnte gezeigt werden, dass der Schutz durch die Induktion einer von Interleukin (IL)-12 und Interferon (IFN)-gamma dominierten T-Helfer (Th)1-Immunantwort herbeigeführt wurde und kranke Kontrollmäuse eine IL-4-dominierte Th2 Immunantwort aufwiesen. Mittlerweile zeigen zahlreiche Studien, dass IL-4 nicht ausschließlich eine krankheitsfördernde Funktion innehat, sondern auch die Fähigkeit zur Einleitung eine Typ-1-Immunantwort besitzt. Auf Grund dieser Studien wurde das Augenmerk auf die Rolle von IL-4 in der DZ-basierten Immunisierung gegen Leishmaniose in BALB/c Mäusen gelegt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Notwendigkeit der Stimulation der IL-4 Rezeptor alpha (IL-4Rα) Kette auf DZ, während einer DZ-basierten Immunisierung gegen Leishmaniose in BALB/c Mäusen gezeigt. Um dies zu erreichen, wurden Wildtyp (wt)-BALB/c-Mäuse oder DZ-spezifische CD11ccreIL-4Rα-/lox BALB/c Mäuse entweder mit wt oder IL-4Rα-defizienten LmAg-beladenen DZ mit oder ohne Aktivierung durch CpG ODN, eine Woche vor der Infektion mit 2x105 L. major Promastigoten in den Hinterfuß, immunisiert. Die in dieser Doktorarbeit gezeigten Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Stimulation der IL-4Rα-Kette auf den als Adjuvans eingesetzten DZ erforderlich ist, um eine Gewebsschädigung an der Infektionsstelle zu verhindern, da konditionierte wt DZ, nicht aber IL-4Rα-defiziente DZ in der Lage sind, Schutz gegen Leishmaniose zu vermitteln. Des Weiteren konnte eine unkontrollierte Ausdehnung von Leishmania-Parasiten im infizierten Fuß und in den angrenzenden Lymphknoten von CD11ccreIL-4Rα-/lox Mäusen beobachtet werden, welche mit CpG ODN-aktivierten und LmAg-beladenen IL-4Rα-defizienten DZ immunisiert wurden. Dieser Befund zeigt den Einfluss der Stimulation der IL-4Rα-Kette auf wirtsansässigen DZ im Hinblick auf die Eindämmung der Parasitenreplikation und Parasitenverbreitung. Zusätzliche Analysen in BALB/c-Mäusen, welche mit LmAg-beladenen, CpG ODN- und rekombinanten IL-4-stimulierten DZ immunisiert wurden, zeigten einen resistenten klinischen Verlauf der Infektion. Die hier gezeigten Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass die durch die IL-4/IL-4Rα-Kette ausgelösten Signale in den DZ eine Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche Immunisierung sind und sollten deswegen unbedingt bei der Entwicklung eines Impfstoffes gegen die gewebsschädigenden Folgen einer Leishmaniose oder anderer durch intrazelluläre Mikroorganismen verursachten Infektionen berücksichtigt werden.
KW  - Leishmania major
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Immunisierung
KW  - murine leishmaniasis
KW  - IL-4 Rezeptor alpha
KW  - Leishmania major
KW  - murine leishmaniasis
KW  - dendritic cells
KW  - IL-4
KW  - IL-4 receptor alpha chain
KW  - vaccine
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75508
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TY  - THES
A1  - Luitz, David J.
T1  - Numerical methods and applications in many fermion systems
T1  - Numerische Methoden und Anwendungen in Vielfermionensystemen
N2  - This thesis presents results covering several topics in correlated many fermion systems. A Monte Carlo technique (CT-INT) that has been implemented, used and extended by the author is discussed in great detail in chapter 3. The following chapter discusses how CT-INT can be used to calculate the two particle Green’s function and explains how exact frequency summations can be obtained. A benchmark against exact diagonalization is presented. The link to the dynamical cluster approximation is made in the end of chapter 4, where these techniques are of immense importance. In chapter 5 an extensive CT-INT study of a strongly correlated Josephson junction is shown. In particular, the signature of the first order quantum phase transition between a Kondo and a local moment regime in the Josephson current is discussed. The connection to an experimental system is made with great care by developing a parameter extraction strategy. As a final result, we show that it is possible to reproduce experimental data from a numerically exact CT-INT model-calculation. The last topic is a study of graphene edge magnetism. We introduce a general effective model for the edge states, incorporating a complicated interaction Hamiltonian and perform an exact diagonalization study for different parameter regimes. This yields a strong argument for the importance of forbidden umklapp processes and of the strongly momentum dependent interaction vertex for the formation of edge magnetism. Additional fragments concerning the use of a Legendre polynomial basis for the representation of the two particle Green’s function, the analytic continuation of the self energy for the Anderson Kane Mele Model, as well as the generation of test data with a given covariance matrix are documented in the appendix. A final appendix provides some very important matrix identities that are used for the discussion of technical details of CT-INT.
N2  - In der vorliegenden Dissertation werden verschiedene Themen aus dem Feld der stark korrelierten Viel-Fermionensysteme präsentiert. Zunächst wird in Kapitel 3 eine Monte Carlo Methode (CT-INT), welche der Autor implementiert, angewandt und erweitert hat, auf detaillierte Weise eingeführt. Das nachfolgende Kapitel diskutiert wie die Zweiteilchen Greensche Funktion in CT-INT berechnet werden kann und wie exakte Frequenzsummen ausgewertet werden können. Dies wird in einem Vergleich mit Daten aus exakter Diagonalisierung demonstriert. Abschließend wird die Verbindung zur dynamischen Cluster Näherung am Ende von Kapitel 4 aufgezeigt, wo diese Methoden von außerordentlicher Bedeutung sind. In Kapitel 5 wird eine umfangreiche CT-INT Studie eines stark korrelierten Josephson Kontakts vorgestellt. Insbesondere wird die Verbindung zwischen dem Phasenübergang erster Ordnung von einem Kondoregime zu einem Regime mit lokalem magnetischem Moment mit der Phasenverschiebung um pi des Josephson-Stroms herausgearbeitet. Es wird gezeigt, wie der Übergang zu einem realen experimentellen System durchgeführt werden kann, wobei besondere Sorgfalt auf die Entwicklung einer Strategie zur Extraktion der Modellparameter aus den experimentellen Daten gelegt wurde. Als Endergebnis demonstrieren wir, dass es es möglich ist, experimentelle Daten mit Hilfe einer numerisch exakten Modellrechnung zu reproduzieren. Als letztes Projekt wird eine Untersuchung des Randmagnetismus von Graphen vorgestellt. Dazu wird ein allgemeines effektives Modell eingeführt, welches einen komplizierten Wechselwirkungshamiltonian enthält. Hierfür wird eine Studie mit Hilfe von exakter Diagonalisierung des Hamiltonians in verschiedenen Parameterbereichen erarbeitet, wodurch wir argumentieren können, dass das Verbot von Umklappprozessen und die starke Impulsabhängigkeit der Wechselwirkung für die Bildung des Randmagnetismus verantwortlich sind. Zusätzlich dokumentieren einige Fragmente im Anhang theoretische Arbeiten zur Benutzung einer Basis von Legendre Polynomen zur Darstellung der Zweiteilchen Greenschen Funktion, zur analytischen Fortsetzung der Selbstenergie für das Anderson Kane Mele Modell sowie zur Erstellung von Testdaten mit einer analytisch bestimmbaren Kovarianzmatrix. Ein Anhang mit einigen Matrix Identitäten die wichtig für die Diskussion der technischen Details von CT-INT sind schließt diese Arbeit ab.
KW  - Fermionensystem
KW  - DCA
KW  - CT-INT
KW  - QMC
KW  - Monte Carlo
KW  - Strong correlations
KW  - Numerisches Verfahren
KW  - Festkörpertheorie
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75927
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TY  - THES
A1  - Filser, Jörg
T1  - Mislokalisation von Nup214/CAN auf beiden Seiten des Kernporenkomplexes in akuten myeloischen Leukämien – Eine erstmalige Darstellung des DEK-CAN Fusionsproteins auf der nukleoplasmatischen Seite des Zellkerns
T1  - Mislocalization of NUP214/CAN on both sides of the nuclear pore complex in acute myeloid leukaemia – First description of a nucleoplasmic localisation of the DEK-CAN fusion protein
N2  - Das elementare Kennzeichen der eukaryontischen Zelle ist der Zellkern, in welchem die Erbinformation in Form der DNA vorliegt. Dieser ist von einer äußeren Kernhülle umgeben, welche kontinuierlich in das endoplasmatische Retikulum übergeht. An der inneren Kernhülle setzt die Kernlamina an. Unterbrochen wird die Kernhülle durch die Kernporen. Diese bestehen aus Untereinheiten, welche als Nukleoporine bezeichnet werden. Eine wesentliche Aufgabe der Kernporen ist der Transport von Makromolekülen, welche durch spezifische Transportsignalsequenzen gekennzeichnet sind. Es mehren sich die Hinweise, dass die Nukleoporine nicht allein für den Kerntransport verantwortlich sind, sondern auch regulatorische Eigenschaften bei Mitose, der Expression von Proteinen und der Stabilisierung des Genoms übernehmen. Nach der Entdeckung der Philadelphia Translokation bei der chronisch myeloischen Leukämie wurden eine Reihe weiterer chromosomaler Translokationen im Rahmen von hämatologischen Neoplasien beschrieben. Hierbei sind auch Nukleoporine involviert. Es entstehen Fusionsproteine, welche ein neues Verteilungsmuster der Proteine erzeugen und möglicherweise auch neue Funktionen innehaben. Nup214/CAN ist ein Onkogen, welches in akuten myeloischen Leukämien mit einer chromosomalen Translokation einhergeht t(6;9). Diese Translokation t(6;9) ist mit einer schlechteren Prognose für den Patienten verbunden. Der genaue onkogene Mechanismus ist noch nicht ausreichend verstanden. Ziel dieser Doktorarbeit war die Frage, welches Verteilungsmuster Nup214 als Fusionsprotein mit einer veränderten NLS in Leukämiezellen der chromosomalen Translokation t(6;9) aufweist, zu beantworten. Zu diesem Zweck wurden die Fusionsproteinfragmente DEK, CAN Mitte und CAN 80/81 in E. coli exprimiert, aufgereinigt und der Herstellung eines spezifischen Antikörpers zugeführt. Hierzu wurden die mit den Proteinfragmenten transfizierten E. coli amplifiziert. Nach Lyse der Zellen wurden die Proteinfragmente elektrophoretisch getrennt und den ermittelten Molekulargewichten zugeordnet. Mit Hilfe einer Affinitätschromatographie und einem Proteintransfer auf Nitrozellulosemembran wurde mit polyvalentem Serum eine Affinitätsreinigung des Antikörpers durchgeführt. Dadurch konnten spezifische Antikörper generiert werden, welche in der Immunfloureszenz die physiologischen Verteilungsmuster zeigten. In einem nachfolgenden Schritt konnte in Kooperation mit dem Biologischen Institut Basel mittels Immuno-Gold-Lokalisation von Nup214/CAN in Leukämiezellen mit einer chromosomalen Translokation t(6;9) erstmalig die Lokalisation des Proteins auf zytoplasmatischer und nukleoplasmatischer Seite einer Kernpore gezeigt werden. Dies legt die Vermutung nahe, dass es durch diese Mislokalisation zu einer Störung des nukleären Transports kommen kann, der wiederum zu einem Wachstumsvorteil oder einer Inhibition der Apoptose der Leukämiezellen führt.
N2  - The cell nucleus is the fundamental hallmark in eukaryotic cells. It is surrounded by the outer nuclear membrane, which pass into the endoplasmic reticulum. The inner nuclear membrane is lined with the lamina. Nuclear pore complexes interrupt the nuclear membrane. Subunits are called nucleoporines. One major task is the transport of macromolecules with a determined transport sequence. There is evidence, that nucleoporines are not only responsible for the nucleocytoplasmatic transport. They are also involved in mitosis, stabilisation of the genome or protein expression. After discovery of the Philadelphia translocation in chronic myeloid leukaemia a number of other chromosomal translocation in haematological neoplasm were depicted. New types of fusion proteins Nucleoporines are described, which have a new distribution pattern and also might have new functions. The nuclear pore protein Nup214/CAN is an oncogene in acute myeloid leukaemia characterized by a (6;9)(p23;q34) chromosomal translocation. The detailed oncogenic mechanism is still not well known. The objective of this thesis was the distribution pattern of Nup214 in leukaemoid blasts. For this purpose fragments of the fusion protein DEK, CAN Mitte, and CAN 80/81 were expressed in E.coli in order to generate a specific purified antibody. For this transfected E.coli were multiplied. After lysis protein fragments of the fusion protein were electrophoretically separated and then matched to the calculated molecular weight. After affinity chromatographic purification and protein transfer via Western Blot affinity purification was performed. With this procedure affinity purified antibodies were assembled. In cooperation with the Biological Institute Basel, Switzerland in leukaemia cells with a (6;9)-translocation, but not in controll cells, antibodies labelled both sides of the nuclear pore complex, indicating a localization of the oncogenic DEK-CAN fusion protein on the nucleoplasmic side of the NPC. This can be seen to imply, that mislocalization of Nup214/CAN in the fusion protein to the nucleoplasmic surface of the pore might disturb transport equilibrium and therefore benefit cell growth or lead to inhibition of apoptosis.
KW  - Kernpore
KW  - Nucleoporine
KW  - Nup214
KW  - akute myeloische Leukämie
KW  - Kerntransport
KW  - Immunfluoreszenz
KW  - mono spezifischer Antikörper
KW  - Kernpore
KW  - Nucleoporine
KW  - Nup214
KW  - akute myeloische Leukämie
KW  - Kerntransport
KW  - Immunfluoreszenz
KW  - mono spezifischer Antikörper
KW  - nuclear pore complex
KW  - nucleoporine
KW  - Nup214
KW  - acute myeloid leukaemia
KW  - nucleocytoplasmatic transport
KW  - /immunofluorescence
KW  - mono specific antibody
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75977
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TY  - THES
A1  - Östreicher, Sebastian
T1  - Synthese und Eigenschaften neuartiger Di-, Tri- und Tetrametalloboridokomplexe
T1  - Synthesis and Characterisation of Novel Di-, Tri-, and Tetrametalloborido Complexes
N2  - Unter Ausnutzung der Reaktivität von Borylanionen wurden neuartige Übergangsmetallboridokomplexe synthetisiert, bei denen ein "nacktes" Boratom als Ligand für bis zu vier Übergangsmetalle vorliegt. Strukturelle und bindungstheoretische Eigenschaften der Boridokomplexe wurden mit gängigen metallorganischen Analysemethoden sowie mit DFT-Methoden untersucht. Dabei zeigte sich, dass die erhaltenen Tetrametalloboridokomplexe eine planare Koordinationsgeometrie um das Borzentrum aufweisen und damit ein Äquivalent zu anti van't Hoff/Le Bel-Verbindungen des Kohlenstoffs darstellen.
N2  - Exploiting the reactivity of boryl anions, novel transition metal borido complexes were synthesised. Borido complexes feature a "naked" boron atom that serves as a ligand for up to four metals. Structucal characterisation of the boridokomplexes was carried out by means of common analytical methods as well as DFT-calculations. Tetrametalloborido complexes showed a remarkably planar geometry around the boron center and can therefore be considered as anti van't Hoff/Le Bel compounds.
KW  - Übergangsmetall
KW  - Mehrkernige Komplexe
KW  - Bor-Übergangsmetallverbindungen
KW  - Boridokomplexe
KW  - Borylanionen
KW  - anti-van't Hoff/Le Bel Verbinfungen
KW  - transition metal boron complexes
KW  - borido complexes
KW  - boryl anions
KW  - anti van't Hoff/Le Bel-compounds
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73943
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TY  - THES
A1  - Hemer, Sarah
T1  - Molecular characterization of evolutionarily conserved signaling systems of Echinococcus multilocularis and their utilization for the development of novel drugs against Echinococosis
T1  - Molekulare Charakterisierung evolutionsgeschichtlich konservierter Signalsysteme und deren Nutzung für die Entwicklung neuer Medikamente gegen Echinococcose
N2  - Alveolar echinococcosis (AE), a severe and life-threatening disease is caused by the small fox tapeworm Echinococcus multilocularis. Currently, the options of chemotherapeutic treatment are very limited and are based on benzimidazole compounds, which act merely parasitostatic in vivo and often display strong side effects. Therefore, new therapeutic drugs and targets are urgently needed. In the present work the role of two evolutionarily conserved signalling pathways in E. multilocularis, namely the insulin signalling cascade and Abl kinases, has been studied in regard to host-parasite interaction and the possible use in anti-AE chemotherapy.
N2  - Die alveoläre Echinokokkose ist eine ernste und lebensgefährliche Erkrankung, die durch den kleinen Fuchsbandwurm ausgelo ̈st wird. Die gegenwärtigen chemotherapeutischen Behandlungsmöglichkeiten beschränken sich auf die Behandlung mit Benzimidazolen, die in vivo nur parasitostatische Wirkung besitzen und häufig sehr starke Nebenwirkungen aufweisen. Aus diesem Grund besteht ein dringendes Bedürfnis nach neuen Medikamenten und Angriffszielen für diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle zweier evolutionsgeschichtlich konservierter Signalsysteme, der Insulin Signalweg und die Abl Kinasen in E. multilocularis in Hinblick auf die Wirt-Parasiten Interaktion und dem mo ̈glichen Nutzen in der AE Chemotherapie untersucht.
KW  - Fuchsbandwurm
KW  - Insulin
KW  - Chemotherapie
KW  - Echinococcus
KW  - Insulin
KW  - Chemotherapie
KW  - Imatinib
KW  - Abl
KW  - Echinococcus
KW  - Insulin
KW  - Chemotherapy
KW  - Abl
KW  - Imatinib
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74007
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TY  - THES
A1  - Rauert-Wunderlich, Hilka
T1  - Apoptoseregulation durch TNF im Multiplen Myelom
T1  - Regulation of apoptosis via TNF in multiple myeloma
N2  - Der Tumornekrosefaktor (TNF) entfaltet seine vielfältigen biologischen Aktivitäten durch die Stimulation der beiden TNF-Rezeptoren TNFR1 und TNFR2. Die TNFR1-vermittelte Signaltransduktion ist in vielen Details gut verstanden, wohingegen die TNFR2-vermittelte Signaltransduktion bis heute kaum untersucht ist. Mit Hilfe einer in unserer Gruppe entwickelten hochaktiven TNFR2-spezifischen TNF-Variante sowie einer bereits länger bekannten TNFR1-spezifischen TNF-Variante wurde in dieser Arbeit die TNF-Signaltransduktion insbesondere im Mutiplen Myelom untersucht. Mit Hilfe der beiden TNF-Varianten konnte gezeigt werden, dass die alleinige Stimulation des TNFR2 die Aktivierung des alternativen NFkappaB-Signalweges vermittelt, wohingegen TNFR1 nicht dazu in der Lage ist. So zeigte sich im Einklang mit der inhibitorischen Funktion des Adapterproteins TRAF2 in der Signaltransduktion des alternativen NFkappaB-Signalweges, dass die TNFR2-Stimulation in einer TRAF2-Depletion resultiert. Dies führt weiterhin zur Akkumulation von NIK und der Prozessierung von p100 zu seiner aktiven Form p52, den klassischen biochemisch nachweisbaren Ereignissen der Aktivierung des alternativen NFkappaB-Signalweges. Aufgrund der Rolle des NFkappaB-Systems im Multiplen Myelom (MM) und der stimulierenden Wirkung des TNFR1 und TNFR2 auf das NFkappaB-System wurde die Expression und Funktion dieser beiden Rezeptoren auf Myelomzelllinien untersucht. Insbesondere wurde analysiert, welchen Effekt eine spezifische Stimulation der beiden TNF-Rezeptoren auf die apoptotische Sensitivität von Myelomzellen hat. Mit einer Ausnahme wiesen alle untersuchten Myelomzelllinien eine eindeutige TNFR2-Oberflächenexpression auf, die TNFR1-Expression hingegen war heterogen. Die TNFR1-Stimulation in den TNFR1-positiven Zelllinien zeigte keinen wesentlichen Einfluss auf die Zellviabilität. Allerdings resultierte eine Vorstimulation mit TNF in einer gesteigerten Sensitivität für den CD95L-induzierten Zelltod, schützte aber gleichzeitig vor der TRAIL-vermittelten Induktion der Apoptose. Der gegenläufige Effekt der TNF-Vorstimulation auf den CD95L- und TRAIL-induzierten Zelltod konnte auf die Hochregulation der CD95-Oberflächenexpression und der gesteigerten Expression des antiapoptotischen cFLIPLong-Proteins zurückgeführt werden. Beide Effekte basieren auf der TNF-induzierten Aktivierung des klassischen NFkappaB-Signalweges. Im CD95L-induzierten Zelltod überkompensierte die Induktion der CD95-Expression offensichtlich die Hochregulation von cFLIPLong und resultierte in gesteigertem Zelltod. Der TRAIL-induzierte Zelltod hingegen wurde durch die TNF-Vorstimulation abgeschwächt, da hier lediglich die durch den klassischen NFkappaB-Signalweg vermittelte gesteigerte Expression des antiapoptotischen cFLIPLong eine Rolle spielte. Desweiteren zeigten die Analysen in dieser Arbeit, dass die TNFR2-Stimulation zu einer Depletion von TRAF2 und z. B. in JJN3-Zellen zu einer Sensitivierung für den TNFR1-induzierten Zelltod führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten in der Summe somit, dass das TNF-TNFR-Signaling durch verschiedene Mechanismen Einfluss auf den Ausgang der extrinsischen Apoptoseinduktion hat, und dass der Effekt von TNF auf das Überleben von MM-Zellen kontextabhängig ist.
N2  - TNF mediates its biological functions by stimulation of the two TNF receptors TNFR1 and TNFR2. TNFR1-mediated signaling has already been studied in detail, whereas TNFR2-mediated signal transduction is poorly understood. In this work a newly developed TNFR2-specific variant and an established TNFR1-specific variant was used to study TNF signaling especially in myeloma cells. With the help of these TNF-variants it is shown here that TNFR2, but not TNFR1, induces activation of the alternative NFkappaB-pathway. Thus in consent with the inhibitory function of TRAF2 in alternative NFkappaB signal transduction, stimulation of TNFR2 resulted in depletion of TRAF2, accumulation of NIK and p100 processing to p52, the biochemical hallmarks of this pathway. Due to the relevance of the NFkappaB-system for multiple myeloma (MM) and the NFkappaB stimulatory activities of TNFR1 and TNFR2, the expression of these two receptors and their effect on apoptotic sensitivity was analyzed in myeloma cell lines. A huge majority of myeloma cell lines express TNFR2 whereas TNFR1 expression is rather restricted. Stimulation of TNFR1 in the TNFR1-positive subset of MM cell lines showed nearly no impact on cellular viability. However, TNF stimulation enhanced CD95L-induced cell death and in parallel reduced the TRAIL-mediated induction of apoptosis. This opposed regulation of TRAIL- and CD95L-induced cell death by TNF based on upregulation of the death receptor CD95 via the classical NFkappaB-pathway and by upregulation of the antiapoptotic protein cFLIPLong via the same pathway. The induction of CD95 expression appeared to overcompensate the upregulation of cFLIPLong and consequently TNF-induced NFkappaB activation resulted, in context of CD95 signaling, in apoptosis enhancement. TRAIL-mediated cell death induction, however, was reduced after TNF prestimulation, due to the fact that here only upregulation of cFLIPLong was relevant. Furthermore the experiments in this study showed that TNFR2-mediated depletion of TRAF2 resulted in a sensitization for TNFR1-induced cell death, for example in JJN3-cells. Taken together, this study revealed that the TNF-TNFR system influenced the outcome of activation of the extrinsic apoptotic pathway in myeloma cells by various mechanisms and the effect of TNF on MM cell survival is thus context dependent.
KW  - Apoptosis
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor
KW  - Plasmozytom
KW  - apoptosis
KW  - TNF
KW  - multiple myeloma
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73998
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TY  - THES
A1  - Prinzing, Claudia Stefanie
T1  - Evaluation der intracochleären Lage von CI-Elektroden mit MRT-/CT-Bildfusion
T1  - Evaluation of the intracochlear position of CI electrodes via MRI/CT image fusion
N2  - MRT und CT liefern komplementäre Informationen über die Strukturen der Cochlea. Um die genaue Lage der Elektrode nach Implantation eines CIs beurteilen zu können, wurden in der vorliegenden Arbeit präoperative MRT-Datensätze und postoperative CT-Datensätze mit dem frei erhältlichen Programm "3D-Slicer" fusioniert. Nach 1350 erfolgten Implantationen am Universitätsklinikum Würzburg konnte bei 16 Ohren die Qualität der Fusion beurteilt und bei 15 Ohren die intracochleäre Lage der CI-Elektroden evaluiert werden. Die manuelle Fusion der Datensätze wurde in einer reproduzierbaren Vorgehensweise umgesetzt und war der automatischen Registrierung überlegen. Bildfusion und -analyse ließen sich umso präziser und sicherer durchführen, je besser die Bildqualität und je kürzer der zeitliche Abstand zwischen der Akquisition von MRT und CT waren. Da die Cochlea bei Geburt bereits ausgewachsen ist, war die Fusion selbst bei den Kindern möglich, deren Schädel in der Zwischenzeit gewachsen war. Aufgrund der seltenen Indikation eines postoperativen CTs und mangelnder Standardisierung der Bildgebung konnte eine Analyse lediglich bei 15 der insgesamt 1350 Ohren mit CI durchgeführt werden. In diesen Fällen ließ sich die Fusion jedoch sehr gut durchführen. Die Sicherheit bei der Beurteilung der Elektrodenlage nimmt in den einzelnen Abschnitten der Cochlea von basal nach apikal ab. Unabhängig davon waren die Entscheidungen für die Elektrodenlage in der Scala tympani mit einer größeren Sicherheit gefällt worden als die für die Lage in der Scala vestibuli. Die genaue Elektrodenlage konnte im Rahmen dieser Studie zwar nicht anhand histologischer Schnitte bewiesen werden, jedoch stimmen die in den fusionierten Bildern analysierten Insertionsstellen mit den in den OP-Berichten dokumentierten Angaben überein.
N2  - MRI and CI offer complementary information on the temporal bone's structures. Preoperative MRIs and postoperative CTs were registered with the free programm "3D-Slicer" in order to evaluate the intracochlear position of the electrode of cochlear implants. Manual registration was performed in a reproducible procedure
KW  - Cochlear-Implantat
KW  - Registrierung <Bildverarbeitung>
KW  - 3D Slicer
KW  - Computertomographie
KW  - NMR-Tomographie
KW  - Scala tympani
KW  - Scala vestibuli
KW  - Scala tympani
KW  - Scala vestibuli
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69524
ER  - 
TY  - JOUR
T1  - einBlick - Ausgabe 35 - 02. Oktober 2012
N2  - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
KW  - Würzburg
KW  - Universität
KW  - University
KW  - Wuerzburg
KW  - Wurzburg
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73176
VL  - 35/2012
ER  - 
TY  - JOUR
T1  - einBlick - Ausgabe 36 - 09. Oktober 2012
N2  - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
KW  - Würzburg
KW  - Universität
KW  - University
KW  - Wuerzburg
KW  - Wurzburg
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73188
VL  - 36/2012
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heidbreder, Meike
T1  - Association and Activation of TNF-Receptor I Investigated with Single-Molecule Tracking and Super-Resolution Microscopy in Live Cells
T1  - Assoziierung und Aktivierung des TNF-Rezeptor I untersucht mit Einzelmolekül-Tracking und hochauflösender Mikroskopie in lebenden Zellen
N2  - Cellular responses to outer stimuli are the basis for all biological processes. Signal integration is achieved by protein cascades, recognizing and processing molecules from the environment. Factors released by pathogens or inflammation usually induce an inflammatory response, a signal often transduced by Tumour Necrosis Factor alpha (TNF). TNFα receptors TNF-R1 and TNF-R2 can in turn lead to apoptosis or proliferation via NF-B. These processes are closely regulated by membrane compartimentalization, protein interactions and trafficking. Fluorescence microscopy offers a reliable and non-invasive method to probe these cellular events. However, some processes on a native membrane are not resolvable, as they are well below the diffraction limit of microscopy. The recent development of super-resolution fluorescence microscopy methods enables the observation of these cellular players well below this limit: by localizing, tracking and counting molecules with high spatial and temporal resolution, these new fluorescence microscopy methods offer a previously unknown insight into protein interactions at the near-molecular level. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) utilizes the reversible, stochastic blinking events of small commercially available fluorescent dyes, while photoactivated localization microscopy (PALM) utilizes phototransformation of genetically encoded fluorescent proteins. By photoactivating only a small fraction of the present fluorophores in each observation interval, single emitters can be localized with high precision and a super-resolved image can be reconstructed. Quantum Dot Triexciton imaging (QDTI) utilizes the three-photon absorption (triexcitonic) properties of quantum dots (QD) and to achieve a twofold resolution increase using conventional confocal microscopes. In this thesis, experimental approaches were implemented to achieve super-resolution microscopy in fixed and live-cells to study the spatial and temporal dynamics of TNF and other cellular signaling events. We introduce QDTI to study the three-dimensional cellular distribution of biological targets, offering an easy method to achieve resolution enhancement in combination with optical sectioning, allowing the preliminary quantification of labeled proteins. As QDs are electron dense, QDTI can be used for correlative fluorescence and transmission electron microscopy, proving the versatility of QD probes. Utilizing the phototransformation properties of fluorescent proteins, single-receptor tracking on live cells was achieved, applying the concept of single particle tracking PALM (sptPALM) to track the dynamics of a TNF-R1-tdEos chimera on the membrane. Lateral receptor dynamics can be tracked with high precision and the influences of ligand addition or lipid disruption on TNF-R1 mobility was observed. The results reveal complex receptor dynamics, implying internalization processes in response to TNFα stimulation and a role for membrane domains with reduced fluidity, so-called lipid raft domains, in TNF-R1 compartimentalization prior or post ligand induction. Comparisons with previously published FCS data show a good accordance, but stressing the increased data depth available in sptPALM experiments. Additionally, the active transport of NF-κB-tdEos fusions was observed in live neurons under chemical stimulation and/or inhibition. Contrary to phototransformable proteins that need no special buffers to exhibit photoconversion or photoactivation, dSTORM has previously been unsuitable for in vivo applications, as organic dyes relied on introducing the probes via immunostaining in concert with a reductive, oxygen-free medium for proper photoswitching behaviour. ATTO655 had been previously shown to be suitable for live-cell applications, as its switching behavior can be catalyzed by the reductive environment of the cytoplasm. By introducing the cell-permeant organic dye via a chemical tag system, a high specificity and low background was achieved. Here, the labeled histone H2B complex and thus single nucleosome movements in a live cell can be observed over long time periods and with ~20 nm resolution. Implementing these new approaches for imaging biological processes with high temporal and spatial resolution provides new insights into the dynamics and spatial heterogeneities of proteins, further elucidating their function in the organism and revealing properties that are usually only detectable in vitro.  
N2  - Zelluläre Antworten auf externe Stimuli sind die Basis aller biologischer Prozesse. Die Integration dieser Signale wird dabei von Proteinkaskaden ausgeführt, welche Moleküle aus der Umgebung wahrnehmen und verarbeiten. Faktoren, welche von Pathogenen oder während einer Entzündung freigesetzt werden, induzieren für gewöhnlich eine Entzündungsantwort, eine Reaktion, die oft vom Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) vermittelt wird. Die TNFα Rezeptoren TNF-R1 und TNF-R2 vermitteln nach Ligandenbinding Apoptose oder Zellproliferation durch NF-kB. Diese Prozesse sind engmaschig durch Membrankompartimentierung, Proteininteraktionen und -transport reguliert. Fluoreszenzmikroskopie bietet eine zuverlässige, nicht-invasive Methode um diese zellulären Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind einige Prozesse innerhalb einer nativen Membran nicht auflösbar, da sie weit unterhalb der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie stattfinden. Die jüngste Entwicklung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopiemethoden erlaubt die Beobachtung dieser zellulären Abläufe auf molekularer Ebene: durch das Lokalisieren, Verfolgen und Zählen von Molekülen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung bieten diese neuen Fluoreszenzmethoden bisher unbekannte Einblicke in Proteininteraktionen. Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) nutzt die reversiblen, stochastischen Ereignisse von kleinen blinkenden, kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen, während die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) die Phototransformation fluoreszierenden Proteinen nutzt. Durch das Photoaktivieren lediglich eines kleinen Bruchteils der Fluorophore innerhalb eines Zeitintervalls können einzelne Emitter mit hoher Genauigkeit lokalisiert und ein hochaufgelöstes Bild daraus rekonstruiert werden. Quantum Dot Triexciton Imaging (QDTI) nutzt die Drei-Photonen-Absorption von Quantenpunkten um eine zweifache Auflösungserhöhung mittels eines Konfokalmikroskopes zu erreichen. In dieser Arbeit wurden experimentelle Ansätze zur hochauflösenden Mikroskopie an fixierten und lebenden Zellen implementiert, um die räumliche und zeitliche Dynamik von TNF und anderen zellulären Signalwegen zu untersuchen. Zur Analyse der dreidimensionalen, zellulären Verteilung von biologischen Zielen stellen wir QDTI vor, welches eine einfache Methode zur Verbesserung der Auflösung an Konfokalmikroskopen in Kombination mit optischen Schnitten darstellt. Dies ermöglicht die vorläufige Quantifizierung von markierten Proteinen. Da QDs eine hohe Elektronendichte besitzen kann QDTI auch für korrelative Fluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie genutzt werden, was die Vielseitigkeit der QD-Sonden verdeutlicht. Mit Hilfe des single-particle tracking PALM (sptPALM) Konzepts konnten einzelne Rezeptormoleküle verfolgt werden, um die Dynamiken einer TNF-R1-tdEos Chimäre auf der Membran zu beobachten. Die laterale Rezeptordynamik kann hier mit hoher Präzision gemessen, und die Einflüsse auf die TNF-R1-Mobilität konnte nach Ligandenzugabe oder die Störung der Membranzusammensetzung analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen eine komplexe Rezeptordynamik und lassen sowohl auf Internalisierungsprozesse in Reaktion auf TNFα-Stimulation, als auch auf eine wichtige Rolle von Membrandomänen mit eingeschränkter Fluidität in der TNF-R1 Kompartimentierung während der Ligandenbindung schließen. Zusätzlich wurde der aktive Transport von NF-kB-tdEos Fusionsproteinen in lebenden Neuronen unter chemischer Stimulierung bzw. Inhibierung untersucht. Im Gegensatz zu phototransformierbaren Proteinen, die keine speziellen Puffer zur Photokonversion oder Photoaktivierung benötigen, war dSTORM bisher für in vivo Anwendungen ungeeignet, da organische Farbstoffe auf die Einführung über Immunfärbung in Kombination mit einem reduktiven, Sauerstoff-freiem Medium für korrektes Photoschalten angewiesen waren. ATTO655 wurde zuvor als geeignet für die Anwendung in lebenden Zellen eingestuft, da das Schaltverhalten durch die reduktive Umgebung des Zytoplasmas katalysiert werden kann. Durch die Einführung von membranpermeablen organischen Farbstoffen über ein chemisches Markierungssystem konnte eine hohe Spezifität und ein geringer Hintergrund erreicht werden. Hier konnte durch die Markierung des Histon H2B Komplexes die Bewegung einzelner Nukleosome in lebenden Zellen über lange Zeiträume mit einer Auflösung von ~20 nm beobachtet werden. Die Umsetzung dieser neuen Ansätze für die Darstellung biologischer Prozesse mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung liefert neue Einblicke in die Dynamiken und die räumliche Heterogenität von Proteinen und enthüllt Funktionen im Organismus und beleuchtet Eigenschaften, die sonst nur in vitro nachweisbar wären.
KW  - Fluoreszenzmikrosopie
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor <alpha>
KW  - Hochauflösendes Verfahren
KW  - sptPALM
KW  - dSTORM
KW  - PALM
KW  - QDTI
KW  - TNF-R1
KW  - TNF-R2
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73191
ER  - 
TY  - THES
A1  - Büttner, Bastian
T1  - Micromagnetic Sensors and Dirac Fermions in HgTe Heterostructures
T1  - Mikromagnetische Sensoren und Dirac Fermionen in HgTe Heterostrukturen
N2  - Within the scope of this thesis two main topics have been investigated: the examination of micromagnetic sensors and transport of massive and massless Dirac fermions in HgTe quantum wells. For the investigation of localized, inhomogeneous magnetic fields, the fabrication and characterization of two different non-invasive and ultra sensitive sensors has been established at the chair ”Experimentelle Physik” of the University of Würzburg. The first sensor is based on the young technique named micro-Hall magnetometry. The necessary semiconductor devices (Hall cross structures) were fabricated by high-resolution electron beam lithography based on two different two dimensional electron gases (2DEGs), namely InAs/(Al,Ga)Sb- and HgTe/(Hg,Cd)Te- heterostructures. The characteristics have been examined in two different ways. Measurements in homogeneous magnetic fields served for characterization of the sensors, whereas the investigation of artificially produced sub-µm magnets substantiates the suitability of the devices for the study of novel nanoscale magnetic materials (e.g. nanowires). Systematic experiments with various magnets are in accordance with the theory of single-domain particles and anisotropic behavior due to shapes with high aspect ratio. The highest sensitivity for strongly localized fields was obtained at T = 4.2 K for a (200x200) nm^2 Hall cross - made from shallow, high mobility HgTe 2DEG. Although the field resolution was merely δB ≈ 100 µT, the nanoscale sensor size yields an outstanding flux resolution of δΦ = 2 10^(−3) Φ0, where Φ0 = h/2e is the flux quantum. Translating this result in terms of magnetic moment, the sensitivity allows for the detection of magnetization changes of a particle centered on top of the sensor as low as δM ≈ 10^2 µB, with the magnetic moment of a single electron µB, the Bohr magneton. The further examination of a permalloy nanomagnet with a cross-section of (100x20) nm^2 confirms the expected resolution ability, extracted from the noise of the sensor. The observed high signal-to-noise ratio validates the detection limit of this sensor in terms of geometry. This would be reached for a magnet (same material) with quadratic cross-section for an edge length of 3.3 nm. Moreover, the feasibility of this sensor for operation in a wide temperature range (T = mK... > 200 K) and high magnetic fields has been confirmed. The second micromagnetic sensor is the micro-SQUID (micro-Superconducting-QUantum-Interference-Device) based on niobium. The typical sensor area of the devices built in this work was (1.0x1.0) µm^2, with constrictions of about 20 nm. The characterization of this device demonstrates an amazing field sensitivity (regarding its size) of δB < 1 µT. Even though the sensor was 25 times larger than the best micro-Hall sensor, it provided an excellent flux resolution in the order of δΦ ≈ 5 10^(−4) Φ0 and a similar magnetic moment resolution of δM ≈ 10^2 µB. Furthermore, the introduction of an ellipsoidal permalloy magnet (axes: 200 nm and 400 nm, thickness 30 nm) substantiates the suitability for the detection of minuscule, localized magnetic fields. The second part of the thesis deals with the peculiar transport properties of HgTe quantum wells. These rely on the linear contribution to the band structure inherent to the heterostructure. Therefore the system can be described by an effective Dirac Hamiltonian, whose Dirac mass is tunable by the variation of the quantum well thickness. By fabrication and characterization of a systematical series of substrates, a system with vanishing Dirac mass (zero energy gap) has been confirmed. This heterostructure therefore resembles graphene (a monolayer of graphite), with the difference of exhibiting only one valley in the energy dispersion of the Brillouin zone. Thus parasitical intervalley scattering cannot occur. The existence of this system has been proven by the agreement of theoretical predictions, based on widely accepted band structure calculations with the experiment (Landau level dispersion, conductivity). Furthermore, another particularity of the band structure - the transition from linear to parabolic character - has been illustrated by the widths of the plateaus in the quantum Hall effect. Finally, the transport of ”massive” Dirac fermions (with finite Dirac mass) is investigated. In particular the describing Dirac Hamiltonian induces weak localization effects depending on the Dirac mass. This mechanism has not been observed to date, and survives in higher temperatures compared to typical localization mechanisms.
N2  - Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Themenbereiche bearbeitet: die Untersuchung von mikromagnetischen Sensoren und der Transport von massiven und masselosen Dirac Fermionen in HgTe Quantenwällen. Für die Untersuchung von lokalisierten, inhomogenen Magnetfeldern wurde die Herstellung und Charakterisierung von zwei unterschiedlichen nicht-invasiven und hochempfindlichen Sensoren am Lehrstuhl für Experimentelle Physik III der Universität Würzburg etabliert. Der erste Sensor beruht auf der noch recht jungen Methode der Mikro-Hall-Magnetometrie. Die dafür notwendigen Halbleiterbauteile (Hallkreuzstrukturen) wurden mit höchstauflösender Elektronenstrahllithografie auf Basis von zwei verschiedenen zweidimensionalen Elektronengasen (2DEGs) hergestellt, genauer InAs/(Al,Ga)Sb- und HgTe/(Hg,Cd)Te- Halbleiterheterostrukturen. Nachfolgend wurden deren Charakteristika auf zwei verschiedene Arten untersucht. Messungen in homogenen Magnetfeldern dienten der Charakterisierung der Sensoren, während die Untersuchung von künstlich hergestellten sub-Mikrometermagneten die Eignung der Bauteile für die Detektion neuartiger magnetischer Materialien auf der Nanoskala (z.B. Nanodrähte) nachweist. Systematische Messungen an Magneten unterschiedlicher Ausdehnungen stimmen mit theoretischen Vorausbetrachtungen in Bezug auf Einzeldomänenteilchen und Formanisotropie überein. Die höchste Empfindlichkeit für stark lokalisierte Magnetfelder wurde mit einem (200x200)nm^2 großen Hallkreuz - hergestellt aus einem oberflächennahen, hochbeweglichen HgTe 2DEG - bei einer Temperatur von 4.2 K erreicht. Obwohl die Feldauflösung lediglich δB ≈ 100 µT betrug, konnte auf Grund der Miniaturisierung der Sensorfläche eine beeindruckende Flusssensitivität von δΦ ≈ 2 10^(−3) Φ0 erreicht werden, wobei Φ0 = h/2e das Flussquant darstellt. Wenn man diese Auflösung in Bezug auf die Magnetisierung betrachtet, ermöglicht der Sensor die Detektion von Magnetisierungsänderungen eines Teilchens auf der Mitte des Sensors in Höhe von δM ≈ 10^2 µB mit dem magnetischen Moment eines Elektrons, dem Bohrschen Magneton µB. Die weiteren Untersuchungen eines Permalloy-Nanomagneten mit einer Querschnittfläche von (100x20) nm^2 bestätigt die erwartete Auflösungsfähigkeit, die aus dem Rauschen des Sensors hervorgeht. Weiterhin konnte die Einsatzfähigkeit des Bauteils in einem breiten Temperaturbereich (T = mK... > 200 K) und bei hohen Magnetfeldern bestätigt werden. Bei dem zweiten mikromagnetischen Sensor handelt es sich um das Mikro-SQUID (Mikro-Superconducting-QUantum-Interference-Device) basierend auf Niob. Die Sensorfläche der in dieser Arbeit hergestellten Mikro-SQUIDs betrug typischerweise (1.0x1.0) µm^2 mit Einschnürungen im Bereich von 20 nm. Die Charakterisierung dieses Bauteils zeigt eine beeindruckende Magnetfeldauflösung von δB < 1 µT, besonders hinsichtlich der minimalen Ausdehnung des Bauteils. Obwohl die Sensorfläche 25 mal größer als die des Mikro-Hallsensors war, wurde so eine höhere Flusssensitivität von δΦ ≈ 5 10^(−4) Φ0 und eine ähnliche magnetische Momentauflösung von δM ≈ 10^2 µB erreicht. Des weiteren konnte mit der Einbringung eines ellipsoidalen Permalloy-Magneten (Achsen: 200 und 400 nm, Dicke: 30 nm) die Eignung zur Detektion winziger lokaler Magnetfelder konkretisiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit sind die besonderen Transporteigenschaften von HgTe Quantenwällen, die auf dem linearen Anteil in der Bandstruktur beruhen, untersucht worden. Das System kann mit einem Dirac Hamiltonian beschrieben werden, dessen Diracmasse durch Variation der Quantenwalldicke beeinflusst werden kann. Im Verlauf der Arbeit konnte durch Herstellung und Charakterisierung einer systematischen Serie von Substraten ein System mit verschwindender Diracmasse (Energielücke gleich 0) bestätigt werden. Diese Halbleiterheterostruktur gleicht damit Graphen (eine Monolage von Graphit), mit dem Unterschied, dass es in der Brillouinzone nur eine Elektronensenke aufweist und demzufolge keine störende Intervalley-Streuung auftreten kann. Die Existenz dieses Systems konnte durch die Übereineinstimmung von Vorhersagen aus theoretischen Bandstrukturrechnungen mit dem Experiment (Verlauf der Landauniveaus, Leitfähigkeit) bestätigt werden. Außerdem konnte die Besonderheit der Bandstruktur - der Übergang von linearem zu quadratischem Charakter - anhand der Plateauweiten im Quanten-Hall-Effekt veranschaulicht werden. Im weiteren Verlauf wurde der Transport von ”massiven” Dirac Fermionen (mit endlicher Diracmasse) untersucht. Im Besonderen führt der beschreibende Dirac Hamiltonian in Abhängigkeit von der Diracmasse zu schwachen Lokalisierungeffekten, die bis dato noch nicht beobachtet wurden und im Vergleich zu typischen Mechanismen bis zu weit höheren Temperaturen überleben.
KW  - Magnetischer Sensor
KW  - Mikrohallmagnetometrie
KW  - Mikro-SQUID
KW  - HgTe
KW  - Micro-Hall Magnetometry
KW  - Micro-SQUID
KW  - HgTe
KW  - Quecksilbertellurid
KW  - Heterostruktur
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72556
ER  - 
TY  - THES
A1  - Eujen, Ulrike
T1  - Maximierung der Oszillationsfrequenzen unter Hochfrequenz-Oszillations-Ventilation: Auswirkungen auf den Gasaustausch und die beatmungsinduzierte Lungenschädigung in einem Langzeit-Großtiermodell des akuten Lungenversagens
T1  - Maximization of oscillatory frequencies during high-frequency oscillatory ventilation: Impact on gas exchange and ventilator induced lung injury in a long term animal model of acute respiratory distress syndrome
N2  - Beim akuten Lungenversagen (ARDS) handelt es sich um eine akute, schwere pulmonale Insuffizienz mit Gasaustauschstörung als typische Reaktion der Lunge auf unterschiedliche Noxen und Traumata. Durch die Einführung einer lungenprotektiven Beatmungsstrategie mit reduziertem Tidalvolumen konnte sowohl die Mortalität als auch die systemische und pulmonale Entzündungsreaktion bei ARDS-Patienten gesenkt werden. Neuere Untersuchungen zeigen jedoch, dass selbst bei Anwendung niedriger Tidalvolumina die lokale Überblähung gesunder Lungenareale eine weitere Lungenschädigung zur Folge hat. Eine weitere Reduktion des Vt im Sinne einer erhöhten Lungenprotektion wäre daher wünschenswert. Die Hochfrequenz-Oszillations-Ventilation ist durch die Applikation kleiner Tidalvolumina und durch die Verwendung hoher mittlerer Atemwegsdrücke gekennzeichnet. Diese Charakteristika zeichnen die HFOV als ideale lungenprotektive Beatmungsform beim ARDS aus, da der hohe mPaw die zyklische Derekrutierung der Lunge (Atelektrauma) vermindert und die kleinen Tidalvolumina eine alveoläre Überdehnung (Volutrauma) limitieren. In der vorliegenden ARDS-Großtier-Studie wurden zwei lungenprotektive Hochfrequenz-Oszillations-Beatmungsformen einander gegenübergestellt, indem eine HFOV mit einer konventionellen Beatmungsfrequenz von 6 Hz mit einer HFOV mit 12-15 Hz verglichen wurde. Die Anwendung solch hoher Oszillationsfrequenzen von 12-15 Hz bedeutet eine erhebliche Verminderung des Tidalvolumens. Das Ziel dieser Studie war es, zu untersuchen, ob mit dieser Beatmungsform eine suffiziente Oxygenierung und Ventilation zu erreichen ist und ob diese Strategie die Lungenschädigung in der Histopathologie zu reduzieren vermag. Hierzu wurde bei jeweils 8 Pietrain-Schweinen pro Untersuchungsgruppe mittels repetitiven salinen Lavagen ein akutes Lungenversagen induziert. Danach wurde eine Druck-Volumen-Kurve erstellt und der mPaw für den gesamten weiteren Versuchszeitraum auf 3 cmH2O über dem unteren Inflektionspunkt festgesetzt. Es folgte ein Rekrutierungsmanöver, wonach die Tiere, randomisiert den beiden Gruppen zugeordnet, über einen Zeitraum von 24 Stunden mit der jeweiligen HFOV-Strategie beatmet wurden. Während des Experiments wurden regelmäßig verschiedene Parameter betreffend Beatmung, Gasaustausch und Hämodynamik dokumentiert. Nach Versuchsende wurde das Ausmaß der Lungenschädigung bei den Tieren histopathologisch beurteilt. Die Daten zeigen, dass beide Formen der HFOV, besonders durch die Kombination mit der Anwendung von Rekrutierungsmanövern und durch die Applikation eines suffizient hohen mPaw, eine anhaltende Verbesserung des pulmonalen Gasaustauschs bewirken. Dies ließ sich unter anderem an einem signifikant verminderten Oxygenierungsindex, einem erhöhten PaO2/FiO2-Verhältnis und einer reduzierten Shunt-Fraktion erkennen. Mit unseren histopathologischen Ergebnissen wurde außerdem demonstriert, dass eine HFOV mit 12-15 Hz das Ausmaß der Inflammation und damit die Lungenschädigung im Unterlappen im Vergleich mit einer HFOV mit 6 Hz signifikant vermindert, was darauf schließen lässt, dass eine Beatmung mit hohen Oszillationsfrequenzen eine größere Lungenprotektion bewirkt.
N2  - The acute respiratory distress syndrome (ARDS) is characterized by severe pulmonary insufficiency. The introduction of a lung protective ventilation strategy with reduced tidal volume was able to reduce both mortality rate and systemic and pulmonary inflammation. However, recent studies show that even when using low tidal volumes local hyperinflation can occur. A further reduction of Vt would therefore be desirable. High-frequency oscillatory ventilation is characterized by application of small tidal volumes and use of high mean airway pressures. These characteristics make HFOV an ideal form of lung protective ventilation in ARDS because high mPaw reduces atelectrauma and small tidal volumes limit volutrauma. In this ARDS large animal study two lung-protective high-frequency oscillatory ventilation modes were compared (HFOV with a conventional frequency of 6 Hz vs. HFOV at 12-15 Hz). The use of high frequencies results in a considerable reduction of tidal volume. The aim of this study was to investigate whether this type of ventilation can ensure oxygenation and ventilation and whether it is able to reduce lung injury in histopathology. In 16 pigs acute lung injury was induced by repetitive saline lavage. Thereafter, a pressure volume curve was created and mPaw was set 3 cmH2O above the lower inflection point. A recruitment maneuver was performed, after which the animals were randomly assigned to the two groups and ventilated for a period of 24 hours. During the experiment several parameters regarding ventilation, gas exchange and hemodynamics were documented. Finally the degree of lung injury was assessed histopathologically. The data show that both forms of HFOV, especially when combined with the use of recruitment maneuvers and by the application of sufficient mPaw, lead to improvement in pulmonary gas exchange. This could be shown in a significantly decreased oxygenation index, an increased PaO2/FiO2-index and a reduced shunt fraction. Our histopathological results demonstrate that HFOV at 12-15 Hz significantly reduces the degree of inflammation in the lower lobe in comparison with a HFOV at 6 Hz, which suggests that higher frequencies cause better lung protection.
KW  - ARDS
KW  - HFOV
KW  - Hochfrequenz-Oszillations-Ventilation
KW  - Beatmung
KW  - ARDS
KW  - Acute Respiratory Distress Syndrome
KW  - High-frequency oscillatory ventilation
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72542
ER  - 
TY  - BOOK
A1  - Falk, Michael
A1  - Marohn, Frank
A1  - Michel, René
A1  - Hofmann, Daniel
A1  - Macke, Maria
A1  - Spachmann, Christoph
A1  - Englert, Stefan
T1  - A First Course on Time Series Analysis : Examples with SAS [Version 2012.August.01]
N2  - The analysis of real data by means of statistical methods with the aid of a software package common in industry and administration usually is not an integral part of mathematics studies, but it will certainly be part of a future professional work. The present book links up elements from time series analysis with a selection of statistical procedures used in general practice including the statistical software package SAS. Consequently this book addresses students of statistics as well as students of other branches such as economics, demography and engineering, where lectures on statistics belong to their academic training. But it is also intended for the practician who, beyond the use of statistical tools, is interested in their mathematical background. Numerous problems illustrate the applicability of the presented statistical procedures, where SAS gives the solutions. The programs used are explicitly listed and explained. No previous experience is expected neither in SAS nor in a special computer system so that a short training period is guaranteed. This book is meant for a two semester course (lecture, seminar or practical training) where the first three chapters can be dealt within the first semester. They provide the principal components of the analysis of a time series in the time domain. Chapters 4, 5 and 6 deal with its analysis in the frequency domain and can be worked through in the second term. In order to understand the mathematical background some terms are useful such as convergence in distribution, stochastic convergence, maximum likelihood estimator as well as a basic knowledge of the test theory, so that work on the book can start after an introductory lecture on stochastics. Each chapter includes exercises. An exhaustive treatment is recommended. Chapter 7 (case study) deals with a practical case and demonstrates the presented methods. It is possible to use this chapter independent in a seminar or practical training course, if the concepts of time series analysis are already well understood. This book is consecutively subdivided in a statistical part and an SAS-specific part. For better clearness the SAS-specific parts are highlighted. This book is an open source project under the GNU Free Documentation License.
KW  - Zeitreihenanalyse
KW  - Box-Jenkins-Verfahren
KW  - SAS <Programm>
KW  - Zustandsraummodelle
KW  - Time Series Analysis
KW  - State-Space Models
KW  - Frequency Domain
KW  - Box–Jenkins Program
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72617
N1  - Version: 2012-August-01
ER  - 
TY  - THES
A1  - Englberger, Eva
T1  - Gene regulation in hearts of Hey-mutant mouse embryos and monitoring of sub-cellular Hey1 distribution
T1  - Genregulation in Herzen Hey-mutierter Mausembryonen und Darstellung der sub-zellulären Verteilung von Hey1
N2  - Hey-mutant mouse hearts at embryonic day E14.5 were shown to react to the knock out of Hey2 with several up-regualted genes. This up-regulation is due to the lack of Hey2 and cannot be explained by the structural changes in heart morphology as shown using control animals. Part of the gene regulation was further validated using in situ hybridization. Hey1 was located to the nucleus in immunofluorescence experiments. However, experiments on protein level showed also amount of Hey1 within the cytoplasm. The nuclear localization of Hey1 was unchanged during all cell cycle phases as well as when CaMKII was co-expressed or other cellular pathways were inhibited or stimulated. Hey1 does not seem to interact with the nuclear transport proteins importin-alpha and -beta, therefore it still needs to be elucidated how Hey1 is transported into the nucleus.
N2  - Am Embryonaltag 14,5 zeigten Herzproben von Hey2-KO-Mäusen eine deutliche Hochregulation mehrerer Gene, die auf das Fehlen von Hey2 zurückzuführen ist, da Kontroll-Tiere gezeigt haben, dass die morphologischen Veränderungen in der Herzstruktur keinen Einfluss auf die Genregulation haben. Vereinzelt wurden die regulierten Gene noch mittels in situ Hybridisierung weiter verdeutlicht. In Immunfloureszenzexperimenten wurde Hey1 im Zellkern lokalisiert. Auf Proteinebene zeigte sich allerdings auch ein Vorhandensein von Hey1 im Cytoplasma der Zellen. Die Kernlokalisaiton von Hey1 veränderte sich während des gesamten Zellzykluses nicht und wurde auch nicht durch die Co-Expression von CaMKII beeinflusst oder die Inhibition oder Stimulation anderer Signalwege in der Zelle. Hey1 scheint nicht mit den Kerntransportproteinen Importin-alpha und -beta zu interagieren, so dass weiterhin nach einem Kernimport-System für Hey1 gesucht werden muss.
KW  - Maus
KW  - Herz
KW  - Embryonalentwicklung
KW  - Genregulation
KW  - Herzentwicklung
KW  - Kerntransport
KW  - Hey
KW  - heart development
KW  - nuclear transport
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73395
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schlegelmilch, Katrin
T1  - Molecular function of WISP1/CCN4 in the musculoskeletal system with special reference to apoptosis and cell survival
T1  - Funktionsüberprüfung von WISP1/CCN4 im mukuloskelettalen System mit besonderem Augenmerk auf Apoptose und das Überleben der Zellen
N2  - Human adult cartilage is an aneural and avascular type of connective tissue, which consequently reflects reduced growth and repair rates. The main cell type of cartilage are chondrocytes, previously derived from human mesenchymal stem cells (hMSCs). They are responsible for the production and maintainance of the cartilaginous extracellular matrix (ECM), which consists mainly of collagen and proteoglycans. Signal transmission to or from chondrocytes, generally occurs via interaction with signalling factors connected to the cartilaginous ECM. In this context, proteins of the CCN family were identified as important matricellular and multifunctional regulators with high significance during skeletal development and fracture repair. In this thesis, main focus lies on WISP1/CCN4, which is known as a general survival factor in a variety of cell types and seems to be crucial during lineage progression of hMSCs into chondrocytes. We intend to counter the lack of knowledge about the general importance of WISP1-signalling within the musculoskeletal system and especially regarding cell death and survival by a variety of molecular and cell biology methods. First, we established a successful down-regulation of endogenous WISP1 transcripts within different cell types of the human musculoskeletal system through gene-silencing. Interestingly, WISP1 seems to be crucial to the survival of all examined cell lines and primary hMSCs, since a loss of WISP1 resulted in cell death. Bioinformatical analyses of subsequent performed microarrays (WISP1 down-regulated vs. control samples) confirmed this observation in primary hMSCs and the chondrocyte cell line Tc28a2. Distinct clusters of regulated genes, closely related to apoptosis induction, could be identified. In this context, TRAIL induced apoptosis as well as p53 mediated cell death seem to play a crucial role during the absence of WISP1 in hMSCs. By contrast, microarray analysis of WISP1 down-regulated chondrocytes indicated rather apoptosis induction via MAPK-signalling. Despite apoptosis relevant gene regulations, microarray analyses also identified clusters of differentially expressed genes of other important cellular activities, e.g. a huge cluster of interferon-inducible genes in hMSCs or gene regulations affecting cartilage homeostasis in chondrocytes. Results of this thesis emphasize the importance of regulatory mechanisms that influence cell survival of primary hMSCs and chondrocytes in the enforced absence of WISP1. Moreover, findings intensified the assumed importance for WISP1-signalling in cartilage homeostasis. Thus, this thesis generated an essential fundament for further examinations to investigate the role of WISP1-signalling in cartilage homeostasis and cell death.
N2  - Humaner adulter Knorpel besitzt weder Blutgefäße noch Nerven, weswegen diese Knorpelart im Vergleich zu anderen Gewebetypen ein verringertes Wachstum und Regenerierung wiederspiegelt. Den Hauptteil der Zellen im adulten Knorpel stellen die Chondrozyten (Knorpelzellen)dar, welche sich zuvor aus humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) entwickelt haben. Sie sind verantwortlich für die Bildung und Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) des Knorpelgewebes, welche hauptsächlich aus Kollagen und Proteoglykanen besteht. Signale, die durch Chondrozyten erzeugt oder weitergeleitet werden, finden in der Regel durch Interaktion mit Molekülen der im Knorpel liegenden ECM statt. Mitglieder der CCN-Familie gelten hierbei als bedeutende extrazelluläre Matrixproteine, die bei verschiedenen regulatorischen Prozessen während der Skelettentwicklung und der Frakturheilung eine Rolle spielen. In dieser Doktorarbeit liegt das Hauptaugenmerk auf dem CCN Protein WISP1/CCN4. Dieses Protein gilt bereits in verschiedenen Zellen als ein notwendiger Überlebensfaktor und scheint desWeiteren eine regulatorische Funktion während der Differenzierung von hMSCs in Chondrozyten auszuüben. Die generelle Bedeutung von WISP1 für das muskuloskelettale System ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt und soll während dieser Doktorarbeit mittels einer Reihe von molekular- und zellbiologischer Methoden genauer untersucht werden. Hierfür wurde zu Beginn eine erfolgreiche Herunterregulierung endogen hergestellter WISP1 Transkripte mittels Genexpressionshemmung (gene-silencing) in verschiedenen muskuloskelettalen Zellen erzielt. Interessanterweise scheint WISP1 eine bedeutende Rolle für das Überleben dieser Zellen zu spielen, da ein Verlust bei allen untersuchten Zelllinien und primären hMSCs zum Zelltod führte. Um zu Grunde liegende Mechanismen genauer zu untersuchen, wurden daraufhin Microarray Analysen von hMSCs und Tc28a2 Chondrocyten durchgeführt (jeweils WISP1 herunterreguliert vs Kontrollzellen). In diesem Zusammenhang identifizierten bioinformatische Analysen differentielle Expressionen verschiedener apoptoseresponsiver Gene. So scheint eine Apoptoseinduktion über TRAIL und/oder p53 in hMSCs stattzufinden, wohingegen eine starke Regulation des MAPK-Signalweges in Chondrozyten detektiert wurde. Neben diesen Genregulationen, deckten die Analysen ebenso Gengruppen auf, die bei anderen wichtigen zellulären Abläufen eine Rolle spielen. Hier sind in WISP1 herunterregulierten hMSCs u.a. viele differenziell exprimierte Gene zu nennen, die durch Interferone induzierbar sind. In Chondrozyten dagegen scheint eine verringerte WISP1 Expression Genexpressionen zu beeinflussen, welche die Knorpelhomeostase regulieren. Die Ergebnisse, die während dieser Doktorarbeit erzielt wurden, verdeutlichen die Wichtigkeit von WISP1 für das Überleben von primären hMSCs und Chondrozyten. Darüberhinaus verstärken die bioinformatischen Analysen die Annahme, das WISP1 regulatorische Funktionen für die Knorpelhomeostase ausübt. Somit bietet diese Doktorarbeit ein essentielles Fundament, um die Rolle von WISP1 bei der Aufrechterhaltung der Knorpelhomeostase und des Zelltodes weiter zu erforschen.
KW  - Knorpelzelle
KW  - Extrazelluläre Matrix
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - Apoptosis
KW  - WISP1/CCN4
KW  - mesenchymale Stammzellen
KW  - Apoptose
KW  - WISP1/CCN4
KW  - mesenchymal stem cells
KW  - apoptosis
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73430
ER  - 
TY  - THES
A1  - Grünewald, Benedikt
T1  - Autoantikörper-vermittelte Störungen der synaptischen Übertragung im ZNS
T1  - Autoantibody mediated dysfunction of synaptic transmission in the CNS
N2  - Die Anzahl neurologischer Erkrankungen bei denen Autoantikörper gegen zentralnervöse An-tigene bekannt sind, hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Allerdings gibt es nur für wenige dieser Erkrankungen hinreichende experimentelle Belege für eine pathogene Wir-kung der Autoantikörper. Zwei dieser Erkrankungen wurden im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht: die Juvenile Neuronale Zeroid-Lipofuszinose (JNCL) mit Autoantikörpern gegen die 65 kD Isoform der Glutamatdecarboxylase und das Stiff Person Syndrom (SPS) mit Auto-antikörpern gegen Amphiphysin. Die phänotypische Charakterisierung der cln3 knockout-Maus, einem Mausmodell für die JNCL, zeigte eine progressive Verschlechterung der motorischen und koordinativen Fä-higkeiten, eingeschränktes reizbedingtes Lernen und gesteigertes angstähnliches Verhalten. Diese Symptome ähneln denen der humanen Erkrankung. Elektrophysiologisch konnte eine Antikörper-induzierte zerebelläre Dysfunktion identifiziert werden, die einer verminderten lokalen GABAergen Hemmung zugeordnet wird. Eine Reduktion der Antiköperproduktion im Tiermodell durch eine Depletion der Plasmazellen durch den Proteseinhibitor Bortezomib hatte einen positiven Effekt auf die Krankheitsentwicklung. Im zweiten experimentellen Teil der Arbeit wurde der Einfluss von Autoantikörpern gegen Amphiphysin von Patienten mit SPS auf die synaptische Transmission untersucht. Es zeigte sich hierbei in Patch-Clamp Experimenten eine Störung der GABAergen Übertragung v.a. bei hochfrequenter Stimulation, was im Einklang mit dem vermuteten Antikörper-induzierten Endozytosedefekt steht. Passiver Transfer von humanen Autoantikörpern gegen Amphiphysin induzierte angst-ähnliches Verhalten in Ratten, einem weiteren Kernsymptom des SPS. Aktive Immunisierung gegen Amphiphysin und anschließende Öffnung der Blut-Hirn-Schranke in Mäusen führte zu einer subklinischen Veränderung der Reflexverarbeitung von Ia Afferenzen auf Motoneurone im Rückenmark der Mäuse. Insgesamt konnten in zwei Erkrankungen des ZNS autoimmune Mechanismen identifi-ziert werden, die zu einer Antikörper-induzierten Fehlregulation der zentralen synaptischen Transmission führen. Diese Ergebnisse können wegweisend sein auch für die Erforschung der Pathophysiologie anderer Antikörper-assoziierte Erkrankungen des ZNS.
N2  - A growing number of neurological disorders are associated with autoantibodies targeting an-tigens within the central nervous system. Only in few cases experimental evidence corrobo-rates a pathogenic role of the autoantibodies. Two autoantibody associated diseases were investigated in detail in this work: the Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses (JNCL) with au-toantibodies against the 65kD isoform of the glutamate decarboxylase and the Stiff Person Syndrome (SPS) with autoantibodies against amphiphysin. The analysis of cln3 knockout mice, an animal model of the JNCL, revealed a phenotype resembling the human disorder, including progressive motor decline, limited cued learning and an increase in anxiety-related behavior. Electrophysiological analysis revealed an autoan-tibody mediated cerebellar dysfunction, which is best explained by diminished local GABAer-gic inhibition. A reduction of autoantibody production in the cln3 knockout mice by depletion of plasma cells after treatment with Bortezomib had a positive effect on the disease out-come. In the second experimental part, the effect of autoantibodies to amphiphysin from SPS patients on synaptic transmission was analysed. In patch-clamp experiments the GABAergic synaptic transmission was found to be disturbed primarily during high-frequent stimulation. This is in line with the hypothesized defect of synaptic vesicle endocytosis induced by autoan-tibodies. Passive transfer of human autoantibodies to rats induced anxiety-related behavior, a key symptom of SPS. The active immunization of mice against amphiphysin and subsequent opening of the blood brain barrier led to subclinical disturbances of the Ia afferent-motor neuron reflex pathway within the spinal cord. In conclusion, for two CNS disorders autoimmune mechanisms were identified leading to antibody-induced deregulations of central synaptic transmission. These findings may have implication for the research on pathomechanisms of other putative antibody mediated dis-orders.
KW  - Glutamat-Decarboxylase
KW  - Autoantigen
KW  - Nervensystem
KW  - Krankheit
KW  - Synapse
KW  - JNCL
KW  - Batten disease
KW  - GAD65
KW  - Autoantikörper
KW  - JNCL
KW  - Batten disease
KW  - autoantibodies
KW  - GAD65
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73283
ER  - 
TY  - THES
A1  - Mihlan, Sabrina [geb. Jasper]
T1  - Identifikation von Zonula Occludens 2 (ZO-2) als neuen LASP-1 Interaktionspartner und Aufklärung der LASP-1/ZO-2 Kern-Zytosol Translokation
T1  - Identification of zonula occludens 2 (ZO-2) as a new LASP-1binding partner and the elucidation of LASP-1/ZO-2 nucleo-cytoplasmatic shuttling
N2  - LASP-1 (LIM und SH3 Domänen Protein) ist ein in Zellen ubiquitär vorkommendes Protein, welches in verschiedenen Tumorgeweben eine pathophysiologische Überexpression aufweist. Das Protein besitzt eine LIM Domäne, zwei Aktinbindungsregionen sowie eine SH3 Domäne und bindet einerseits an dynamischen Aktinstrukturen wie den fokalen Kontakten, Lamellopodien und Membranfortsätzen, kann andererseits aber auch in den Zellkern translokalisieren. Für Aktinstrukturen wirkt LASP-1 als Gerüstprotein und ist wichtig für die Migration und Proliferation der Zellen. Die Funktion von LASP-1 im Zellkern ist noch nicht bekannt, da aber in Tumorzellen eine erhöhte nukleare Akkumulation von LASP-1 beobachtet werden konnte, deren Intensität mit der Tumorgröße sowie dem Langzeitüberleben der Patientinnen korreliert, ist LASP-1, zusätzlich zu seiner Funktion als Strukturprotein, vermutlich auch ein Transkriptionsfaktor oder ein transkriptioneller Kofaktor. Eine Herunterregulation von LASP-1 in verschiedenen Tumorentitäten führt zur Inhibition der Proliferation und Migration. In dieser Arbeit konnte der bisher unbekannte Zellkernimport und -export von LASP-1 aufgeklärt werden. Maßgeblich daran beteiligt ist ein durch Pulldown Experimente neu identifizierter LASP-1 Bindungspartner: das Zonula Occludens 2 Protein (ZO-2). Mittels Immunpräzipitationen und Immunfluoreszenzen wurde diese Interaktion bestätigt. Nach Phosphorylierung von LASP-1 an Ser-146 durch Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) kommt es zu einer partiellen Ablösung des LASP-1/ZO-2 Komplexes aus den fokalen Kontakten hin zu einer vermehrten Kernlokalisation beider Proteine. Dies lässt sich durch Kern/Zytosol Trennungen belegen. Dabei ist die Bindung von LASP-1 an ZO-2 essentiell für die Translokation in den Zellkern, da bei einem ZO-2 Knockdown auch nach PKA Aktivierung LASP-1 zytosolisch lokalisiert bleibt. Wie Mutationsanalysen zeigen, findet die Interaktion zwischen der C-terminalen SH3 Domäne im LASP-1 und der Prolin-reichen SH3-Bindungssequenz im Bereich der Aminosäuren 1103-1121 am C-Terminus im ZO-2 statt. Die Translokation des Komplexes in den Kern erfolgt dabei über das Kernlokalisationssignal im ZO-2, da die LASP-1 Sequenz selbst keine nukleare Importsequenz aufweist. Im Zellkern konnte die direkte Interaktion von LASP-1 und ZO-2 mittels Duolink® Proximity Ligation Assay sichtbar gemacht werden. Der Export der Proteine erfolgt über das Protein CRM1. Eine Inhibition der Kernexportmaschinerie mit Leptomycin B erhöht die Konzentration beider Proteine im Zellkern. Das nukleare Exportsignal (NES) im LASP-1 konnte durch Punktmutationen N-terminal der Leucin-reichen Aminosäuresequenz 70-77 zugeordnet werden (NLRLKQQS). Im letzten Schritt dieses Zyklus erfolgt die Relokalisation von LASP-1 zurück an die Zellmembranstrukturen. Der neu gefundene Signalweg dient wahrscheinlich zur Weiterleitung von externen Stimuli in den Kern und zur Genregulation - mit LASP-1 als Transkriptionsfaktor oder transkriptionellen Kofaktor.
N2  - LASP-1 (LIM and SH3 protein) is ubiquitously expressed at basal levels, but was found to be pathophysiologically overexpressed in several cancer entities. LASP-1 exhibits one LIM domain, two actin binding domains and one SH3 domain. On the one hand, LASP-1 is predominantly localized at focal contacts, lamellopodia and membrane ruffles, on the other hand a nuclear localization is observed. LASP-1 works as actin-binding scaffolding protein and is essential for migration and proliferation. Silencing of LASP-1 by RNA- interference in various cancer cell lines results in a strong inhibition of proliferation and migration. However, in tumor cells, an additional striking nuclear localization of the protein was observed, which significantly correlates with tumor size and a poor long term survival of the patients. Therefore, LASP-1 might act additionally as transcription factor or transcriptional co-factor In this work, a novel LASP-1 binding partner, zonula occludens protein 2 (ZO-2), was identified and its role in the signal transduction pathway of LASP-1 nucleo-cytoplasmic shuttling was established. Upon LASP-1 phosphorylation at Ser-146 by activated cAMP-dependent protein kinase A (PKA), LASP-1 binding to Zyxin and F-actin decreases and the protein detaches, in complex with ZO-2, from the plasma membrane and translocates into the nucleus. These results were confirmed by nuclear and cytosolic separation assays. Pull-down assays with mutants revealed that ZO-2 binds with its proline-rich sequence (amino acids 1103-1121) to the SH3 domain in LASP-1. LASP-1 exhibits no nuclear localization signal and requires ZO-2 to shuttle into the nucleus. In situ proximity ligation assay confirmed the direct binding between LASP-1 and ZO-2 and visualized the shuttling. Inhibition of the nuclear export system by Leptomycin B results in an accumulation of both proteins in nuclei. Nuclear export is regulated by the newly identified nuclear export signal in LASP-1 (amino acids 70-77) and mediated by CRM1. Finally LASP-1 relocalizes to focal contacts. This new identified pathway serves presumably as a signal transductor from the focal contacts to the nucleus for gene regulation.
KW  - Tumorzelle
KW  - Skleroproteine
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - Überexpression
KW  - Zellkern
KW  - Kern-Zytosoltranslokation
KW  - ZO-2
KW  - Phosphorylierung
KW  - LASP-1
KW  - nuclear cytosolic translocation
KW  - ZO-2
KW  - phosphorylation
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73442
ER  - 
TY  - THES
A1  - Qamar, Riaz-ul
T1  - Synthesis of functionalized molecular probes for bioorthogonal metabolic glycoengineering
T1  - Synthese von funktionalisierten molekularen Strukturen für metabolisch bioorthogonales Glycoengineering
N2  - Biomolecules are difficult to investigate in their native environment. The vast complexity of cellular systems and seldom availability of chemical reactions compatible with the physiological milieu make it a challenging task. Bioorthogonal chemical reactions serve as a key to achieve selective ligation, whose components must react rapidly and selectively with each other under physiological conditions in the presence of the plethora of functionalities necessary to sustain life. In this dissertation, we focused on the synthesis of chemical reporters and probe molecules for bioorthogonal labeling through click reaction. Initially, sialic acid derivatives with a linker containing terminal alkyne functionality were synthesized. After the synthesis of azide derivatives of fluorescent dyes as counter partners, they were conjugated with sialic acids through Cu(I) catalyzed alkyne azide cycloaddition (CuAAC). The successful in vitro conjugation of Sia and fluorescent dyes was followed by metabolic tagging of human larynx carcinoma (HEp-2) and the carcinoma of Chinese hamster ovary (CHO­K1) with alkynated Sia that were subsequently ligated with fluorescein azide. Finally, the stained cells were subjected to fluorescent microscopy to obtain their images. To enable the click reaction compatible to in vivo applications, the reactivity of cyclooctyne was enhanced by two different approaches. In a first approach, following the Bertozzi’s strategy, two fluorine atoms were introduced adjacent to the alkyne to lower the LUMO. In a second strategy the ring strain of cyclooctyne was attempted to be enhanced by the introduction of an amide group. In addition, glutarimide derivatives with free amino and carboxylic acid functional groups were synthesized by domino-Michael addition-cyclization-reaction.
N2  - Biomoleküle sind schwer in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen. Die enorme Komplexizität zellulärer Systeme und die geringe Verfügbarkeit von chemischen Reaktionen, welche mit physiologischen Bedingungen kompatibel sind, stellen eine große Herausforderung dar. Bioorthogonale Reaktionen dienen hierbei als Schlüssel für eine selektive Ligation, bei der die Komponenten schnell, selektiv und unter genannten Bedingungen miteinander reagieren. Der Fokus dieser Dissertation lag auf der Synthese von chemischen Reportermolekülen, welche für bioorthogonale Markierungsversuche mithilfe einer Klick-Reaktion eingesetzt werden können. Dafür wurden zunächst Derivate der Sialinsäure mit einem Linker, der eine endständige Alkinfunktion trägt, synthetisiert und diese mit ebenfalls in dieser Arbeit dargestellten Azidofluoreszenzfarbstoffen in einer Cu(I)-katalysierten Alkin-Azid-Cycloaddition (CuAAC) konjugiert. Nach erfolgreicher in vitro Durchführung wurden Zellen des menschlichen Larynx Karzinoms (HEp-2) und Zellen des Ovariumkarzinoms des chinesischen Hamsters metabolisch mit alkinfunktionalisierten Sialinsäuren markiert und anschließend mit Fluoresceinazid ligiert. Fluoreszenzmikroskopie an diesen Zellen demonstrierte den erfolgreichen Einbau der Sialinderivate. Um die Klickreaktion verträglicher für in vivo Anwendungen zu gestalten, wurde versucht die Reaktivität des Cyclooctin durch zwei verschiedene Herangehensweisen zu erhöhen. Zum einen wurden nach Strategie von Bertozzi zwei Fluoratome benachbart zur Alkingruppe eingeführt, um die LUMO-Energie zu erniedrigen. Zum anderen wurde versucht die Ringspannung des Cyclooctin durch Einführung einer Amidgruppe zu erhöhen. Neben dem Klickprojekt wurden in dieser Arbeit außerdem Glutarimidderivate mit freien Amino- und Carbonsäuregruppen über eine Domino-Michael-Additions-Zyklisierungsreaktion dargestellt.
KW  - Click-Chemie
KW  - Acetylneuraminsäure <N->
KW  - Cyclooctine
KW  - Ringschlussmetathese
KW  - Michael-Addition
KW  - Bioorthogonal
KW  - Glycoengineering
KW  - Sialinsäuren
KW  - Molecular probes
KW  - Bioorthogonal
KW  - Glycoengineering
KW  - Sialic acids
KW  - Cyclooctyne
KW  - Ring closing metathesis
KW  - Michael addition
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73378
ER  - 
TY  - JOUR
T1  - einBlick - Ausgabe 29 - 24. Juli 2012
N2  - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
KW  - Würzburg
KW  - Universität
KW  - University
KW  - Wuerzburg
KW  - Wurzburg
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72213
VL  - 29/2012
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kistenpfennig, Christa
T1  - Rhodopsin 7 and Cryptochrome - circadian photoreception in Drosophila
T1  - Rhodopsin 7 und Cryptochrome - circadiane Photorezeption in Drosophila
N2  - Many organisms evolved an endogenous clock to adapt to the daily environmental changes caused by the earth’s rotation. Light is the primary time cue (“Zeitgeber”) for entrainment of circadian clocks to the external 24-h day. In Drosophila, several visual pigments are known to mediate synchronization to light: The blue-light photopigment Cryptochrome (CRY) and six well-described rhodopsins (Rh1-Rh6). CRY is present in the majority of clock neurons as well as in the compound eyes, whereas the location of rhodopsins is restricted to the photoreceptive organs – the compound eyes, the ocelli and the HB-eyelets. CRY is thought to represent the key photoreceptor of Drosophila’s circadian clock. Nevertheless, mutant flies lacking CRY (cry01) are able to synchronize their locomotor activity rhythms to light-dark (LD) cycles, but need significantly longer than wild-type flies. In this behavior, cry01 mutants strongly resemble mammalian species that do not possess any internal photoreceptors and perceive light information exclusively through their photoreceptive organs (eyes). Thus, a mammalian-like phase-shifting behavior would be expected in cry01 flies. We investigated this issue by monitoring a phase response curve (PRC) of cry01 and wild-type flies to 1-h light pulses of 1000 lux irradiance. Indeed, cry01 mutants produced a mammalian-similar so called type 1 PRC of comparatively low amplitude (< 25% of wild-type) with phase delays to light pulses during the early subjective night and phase advances to light pulses during the late subjective night (~1 h each). Despite the predominant role of CRY, the visual system contributes to the light sensitivity of the fly’s circadian clock, mainly around dawn and dusk. Furthermore, this phase shifting allows for the slow re-entrainment which we observed in cry01 mutants to 8-h phase delays of the LD 12 h:12 h cycle. However, cry01 also showed surprising differences in their shifting ability: First of all, their PRC was characterized by a second dead zone in the middle of the subjective night (ZT17-ZT19) in addition to the usual unresponsiveness during the subjective day. Second, in contrast to wild-type flies, cry01 mutants did not increase their shift of activity rhythms neither in response to longer stimuli nor to light pulses of higher irradiance. In contrast, both 6-h light pulses of 1000 lux and 1-h light pulses of 10,000 lux light intensity during the early subjective night even resulted in phase advances instead of the expected delays. Thus, CRY seems to be not only responsible for the high light sensitivity of the wild-type circadian clock, but is apparently also involved in integrating and processing light information. Rhodopsin 7 (Rh7) is a yet uncharacterized protein, but became a good photoreceptor candidate due to sequence similarities to the six known Drosophila Rhs. The second part of this thesis investigated the expression pattern of Rh7 and its possible functions, especially in circadian photoreception. Furthermore, we were interested in a potential interaction with CRY and thus, tested cry01 and rh70 cry01 mutants as well. Rh1 is the main visual pigment of the Drosophila compound eye and expressed in six out of eight photoreceptors cells (R1-R6) in each of the ~800 ommatidia. Motion vision depends exclusively on Rh1 function but, moreover, Rh1 plays an important structural role and assures proper photoreceptor cell development and maintenance. In order to investigate its possible photoreceptive function, we expressed Rh7 in place of Rh1. Rh7 was indeed able to overtake the role of Rh1 in both aspects: It prevented retinal degeneration and mediated the optomotor response (OR), a motion vision-dependent behavior. At the transcriptional level, rh7 is expressed at approximately equal amounts in adult fly brains and retinas. Due to a reduced specificity of anti-Rh7 antibodies, we could not verify this result at the protein level. However, analysis of rh7 null mutants (rh70) suggested different Rh7 functions in vivo. Previous experiments strongly indicated an increased sensitivity of the compound eyes in the absence of Rh7 and suggested impaired light adaptation. We aimed to test this hypothesis at the levels of circadian photoreception. Locomotor activity rhythms are a reliable output of the circadian clock. Rh70 mutant flies generally displayed a wild-type similar bimodal activity pattern comprising morning (M) and evening (E) activity bouts. Activity monitoring supported the proposed “shielding” function, since rh70 mutants behaved like wild-type flies experiencing high irradiances. Under all investigated conditions, their activity peaks lay further apart resulting in a prolonged midday break. The behavior of cry01 mutants was mainly characterized by an unexpectedly high flexibility in the timing of M and E activity bouts which allowed tracking of lights-on and lights-off even under extreme photoperiods. Activity profiles of the corresponding rh70 cry01 double mutants reflected neither synergistic nor antagonistic effects of Rh7 and CRY and were dominated by a broad E activity peak. In the future, the different circadian phenotypes will be further investigated on the molecular level by analysis of clock protein cycling in the underlying pacemaker neurons. The work of this thesis confirmed that Rh7 is indeed able to work as a photoreceptor and to initiate the classical phototransduction cascade. On the other hand, it provided further evidence at the levels of circadian photoreception that Rh7 might serve as a shielding pigment for Rh1 in vivo, thereby mediating proper light adaptation.
N2  - Viele Lebewesen haben eine endogene (circadiane) Uhr entwickelt, um sich an die im 24-Stunden-Rhythmus variierenden Umweltbedingungen anzupassen, die auf der Erdrotation beruhen. Zur Synchronisation auf den externen 24-Stunden-Tag nutzen circadiane Uhren in erster Linie Licht als Zeitgeber. An dieser Lichtsynchronisation sind bei Drosophila nachweislich eine Reihe von Sehpigmenten, der Blaulicht Photorezeptor Cryptochrom (CRY) sowie sechs bekannte Rhodopsine (Rh1-Rh6), beteiligt. CRY ist sowohl in der Mehrheit der Uhrneuronen als auch in den Komplexaugen zu finden. Die Lokalisation der Rhodopsine ist im Gegensatz dazu auf die Photorezeptoren – die Komplexaugen, die Ocellen und die HB-Äuglein – beschränkt. CRY gilt als der entscheidende Photorezeptor in der circadianen Uhr von Drosophila. Zwar können Mutanten, die kein CRY besitzen (cry01), ihre Laufaktivitätsrhythmen durch Licht-Dunkel-Zyklen synchronisieren, jedoch brauchen sie dafür mehrere Tage und damit erheblich länger als wildtypische Fliegen. In diesem Verhalten ähneln cry01-Mutanten den Säugetieren, die nicht über interne Photorezeptoren verfügen und Licht somit ausschließlich über ihre Lichtsinnesorgane (Augen) wahrnehmen. Demnach wären bei cry01-Fliegen säugetierähnliche Phasenverschiebungen des Laufaktivitäts-rhythmus auf Lichtpulse zu erwarten. Um diesen Sachverhalt zu untersuchen, wurde sowohl für cry01-Mutanten als auch für Wildtyp-Fliegen eine Phasenresponsekurve (PRC) aufgezeichnet, wobei einstündige Lichtpulse mit einer Intensität von 1000 lux als Stimulus dienten. Wir erhielten für die cry01-Mutanten tatsächlich eine säugetierähnliche PRC, welche auch als so genannte Typ 1 PRC bezeichnet wird und sich durch eine im Vergleich zum Wildtyp verringerte Amplitude (< 25%) auszeichnete. Die dabei beobachteten maximalen Phasenverschiebungen betrugen ungefähr eine Stunde. Dies galt sowohl für Lichtpulse, die in der ersten Hälfte der subjektiven Nacht gegeben wurden und die Laufaktivität verzögerten (nach hinten verschoben), als auch für Lichtpulse, die in der zweiten Hälfte der subjektiven Nacht gegeben wurden und die Laufaktivität beschleunigten (nach vorne verschoben). Die für cry01-Mutanten ermittelten Reaktionen auf einstündige Lichtpulse erklären die langsame Resynchronisation der Mutanten auf Phasenverschiebungen des Licht-Dunkel-Zyklus (LD-Zyklus). Allerdings zeigte die PRC von cry01-Mutanten auch überraschende Besonderheiten, die bisher für kein Tier berichtet wurden. Üblicherweise hat eine PRC eine so genannte „Tot-Zone“ am subjektiven Tag, d. h. die Tiere reagieren nicht auf Lichtreize, die während des subjektiven Tages verabreicht werden. Die PRC der cry01-Mutanten zeichnete sich durch eine zweite solche Tot-Zone in der Mitte der subjektiven Nacht (ZT17-ZT19) aus. Außerdem konnten die Phasenverschiebungen in cry01-Mutanten weder durch eine Verlängerung noch durch eine Verstärkung des Reizes gesteigert werden. Dies steht im Gegensatz zu wildtypischen Fliegen und anderen Tieren, deren PRC dosisabhängig ist. Bei cry01-Mutanten riefen dagegen sowohl sechsstündige Lichtpulse der zuvor verwendeten Intensität (1000 lux) als auch einstündige Lichtpulse hoher Intensität (10.000 lux) sogar gegenteilige Effekte auf die Phasenverschiebung hervor. Die cry01-Mutanten reagierten auf den Stimulus, der jeweils in der ersten Nachthälfte einsetzte, unter beiden Bedingungen mit einer Vorverschiebung ihres Aktivitätsrhythmus anstatt mit der eigentlich erwarteten Verzögerung. Obwohl CRY sicher die wichtigste Rolle einnimmt, trägt auch das visuelle System zur Lichtsensitivität und Synchronisation der inneren Uhr der Fliege bei. Dies ist vor allem morgens und abends in der Dämmerung der Fall. Cry01-Mutanten reagierten auf Lichtpulse, die morgens oder abends gegeben wurden, mit den oben beschriebenen einstündigen Phasenverschiebungen. Dies reicht aus, um die Aktivität der Fliegen auf einen Licht-Dunkel-Zyklus zu synchronisieren. Rhodopsin 7 (Rh7) ist ein noch nahezu unbeschriebenes Protein, das Ähnlichkeiten in seiner Aminosäuresequenz zu den bereits bekannten Drosophila-Rhodopsinen besitzt und daher als potentieller neuer Photorezeptor betrachtet wird. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit dem Expressionsmuster sowie den möglichen Funktionen von Rh7, insbesondere in der circadianen Photorezeption. Darüber hinaus wurden rh70 cry01-Doppelmutanten getestet, um eine eventuelle Interaktion zwischen Rh7 und CRY zu untersuchen. Rh1, das in jeweils sechs von acht Photorezeptorzellen (R1-R6) der insgesamt rund 800 Ommatidien exprimiert wird, stellt das häufigste Photopigment im Komplexauge von Drosophila dar. Zum einen vermittelt Rh1 die Wahrnehmung von Bewegungen, zum anderen besitzt es wichtige strukturelle Aufgaben, da es sowohl eine normale Entwicklung der Photorezeptorzellen als auch deren Erhaltung gewährleistet. Um eine mögliche Beteiligung in der Lichtwahrnehmung zu untersuchen, wurde Rh7 anstelle von Rh1 exprimiert. Rh7 konnte in der Tat Rh1 unter beiden Aspekten ersetzen. Seine Expression verhinderte nicht nur die Degeneration der Retina, sondern ermöglichte zudem optomotorische Reaktionen, die auf einem intakten Bewegungssehen beruhen. In adulten Fliegen wird Rh7 auf Ebene der Transkription in vergleichbaren Mengen im Gehirn und in der Retina exprimiert. Aufgrund der geringen Spezifität der anti-Rh7 Antikörper konnte dieses Ergebnis leider nicht auf Proteinebene bestätigt werden. Die Untersuchung von rh7-Knockout-Mutanten (rh70) befürwortete jedoch eine alternative Funktion von Rh7 in vivo. In vorangegangenen Versuchen führte der Verlust von Rh7 zu einer gesteigerten Sensitivität der Komplexaugen, was wahrscheinlich auf einer verminderten Lichtadaptation beruhte. Wir versuchten diese Hypothese auf Ebene der circadianen Photorezeption zu überprüfen und zeichneten dazu die Laufaktivität der Fliegen auf, da ihr Aktivitätsrhythmus einen verlässlichen Output der circadianen Uhr darstellt. Grundsätzlich wiesen die rh70-Mutanten das für Wildtyp-Fliegen typische bimodale Aktivitätsmuster auf, das sich durch zwei Aktivitätsmaxima auszeichnet, die entsprechend ihrer Lage als Morgen- beziehungsweise Abendaktivitätsgipfel bezeichnet werden. Dabei wurde beobachtet, dass sich rh70-Mutanten wie Wildtyp-Fliegen verhalten, die hohen Lichtintensitäten ausgesetzt sind. So zeigte deren Aktivitätsrhythmus unter allen Versuchsbedingungen eine verlängerte Mittagspause, die durch einen großen Abstand zwischen den beiden Aktivitätsmaxima hervorgerufen wurde. Durch diese Versuche wurde die Hypothese, dass Rh7 als eine Art Schirmpigment wirken könnte, auf Verhaltensebene bestätigt. Das Verhalten der cry01-Fliegen zeichnete sich im Wesentlichen durch eine unerwartet hohe Flexibilität der beiden Aktivitätsmaxima aus. Diese konnten auch unter extremen Photoperioden an die Übergänge von Licht und Dunkelheit gekoppelt werden. Der Aktivitätsrhythmus der entsprechenden rh70 cry01-Doppelmutanten wurde durch eine ausgeprägte Abendaktivität bestimmt und erlaubte es nicht, Rückschlüsse auf eine synergistische oder antagonistische Wirkung von Rh7 und CRY zu ziehen. Zukünftige Versuche könnten die verschiedenen circadianen Phänotypen auf molekularer Ebene charakterisieren, z. B. durch Untersuchung der Oszillationen der Uhrproteine in den verantwortlichen Schrittmacher-Neuronen. Zum einen konnten die Versuche dieser Arbeit bestätigen, dass Rh7 in der Tat über die klassische Phototransduktionskaskade als Photorezeptor wirken kann. Darüber hinaus wurden auf Ebene der circadianen Photorezeption weitere Anzeichen für eine alternative in vivo Funktion von Rh7 gesammelt. Diese sprechen für eine Rolle von Rh7 als Schirmpigment für Rh1, wodurch Rh7 an der einwandfreien Lichtadaptation beteiligt wäre.
KW  - Circadiane Rhythmik
KW  - Drosophila
KW  - Photorezeption
KW  - Circadian Rhythms
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72209
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TY  - THES
A1  - Uhlenhut, Klaus
T1  - Effekte eines standardisierten Kiefernrindenextraktes und dessen Metabolit auf NO und NO-Synthasen
T1  - Effects of a standardized pine bark extract and its metabolite on NO and NO-synthases
N2  - Um die Grundlagen für die in klinischen Studien beim Einsatz des standardisierten Kiefernrindenextraktes (Pycnogenol®) gefundenen Effekte auf einer mechanistischen zellulären Ebene aufzuklären, wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Einfluss der Komponenten des Extraktes und dessen Metabolit M1 (chemisch benannt δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton bzw. 5 (3,4 Dihydroxybenzyl)dihydrofuran 2(3H) on) hinsichtlich der Wirkung auf Stickstoffmonoxid(= NO)-produzierende Systeme untersucht. NO ist an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen in lebenden Organismen beteiligt. Im Menschen sind bislang drei NO-Synthasen bekannt: die induzierbare (iNOS), die hinsichtlich der Pathologie vor allem mit entzündlichen Vorgängen assoziiert wird, die endotheliale (eNOS), die bei Gefäß- und Herzkreislauferkrankungen eine Rolle spielt, und die neuronale (nNOS), die mit der Gedächtnisbildung, aber auch mit zytotoxischen Prozessen im Gehirn etwa bei Morbus Alzheimer oder der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Der nach peroraler Einnahme des Extraktes im Darm durch metabolisierende Kolonbakterien entstehende und darauf im Plasma erscheinende Metabolit M1, dem bei allen durchgeführten Untersuchungen besonderes Augenmerk zuteil wurde, zeigte eine starke konzentrationsabhängige Inhibierung der NO-Freisetzung der iNOS aus einer durch einen Entzündungsreiz stimulierten murinen Makrophagenzellkultur (IC50= 1,28 µg/mL). Im Vergleich mit Fraktion I des Kiefernrindenextraktes, die vor allem monomere Extraktbestandteile enthält, und Hydrocortison zeigte M1 zusätzlich einen stärkeren Hemmeffekt auf die NO-Freisetzung nach dem Entzündungsreiz. Die Zytotoxizität von M1 im Testsystem war dabei als gering einzustufen. Interessanterweise wurde neben den NO-Radikalfängereigenschaften von M1 auch ein deutlich hemmender konzentrationsabhängiger Effekt auf die iNOS-Proteinexpression gefunden (IC50= 3,78 µg/mL). Da die bislang im Plasma bestimmten M1-Konzentrationen deutlich geringer als die in Zellkulturversuchen wirksamen waren, wurde eine mögliche Anreicherung von M1 in Gegenwart von Serumproteinen in humanen Endothelzellen, primären Monozyten und murinen Makrophagen untersucht. Dabei wurde eine starke Bindung von M1 an die Zellen gezeigt und Hinweise für eine potentiell erleichterte Aufnahme von M1 durch membranständige Transporter unter Einsatz eines Influx-Hemmers (Phloretin) gefunden. Zur Untersuchung der eNOS, die sehr geringe Mengen NO produziert, wurden neue methodische Ansätze entwickelt. In diesem Zusammenhang wurden zuvor unbekannte Fallstricke bei der Verwendung der Fluoreszenzsonde DAF-2 (4,5-Diaminofluorescein) zur NO-Detektion und dem Einsatz unterschiedlicher Detektionssysteme entdeckt. DAF-2 zeigte unter verschiedenen Bedingungen auch ohne extern zugegebene NO-Quelle und besonders beim Einfrieren/Auftauen unerwarteterweise eine Konversion zum korrespondierenden NO-Addukt (DAF-2T). Die eingesetzten monomeren Testsubstanzen ((+)-Catechin, (-)-Epicatechin, Resveratrol, M1) waren über die Testzeiträume deutlich instabil mit dynamischer Eigenfluoreszenz. Sowohl über kurze (≤ 45 min) als auch über längere Zeiträume (14-20 h) wurde entsprechend der Redoxaktivität der eingesetzten Polyphenole eine konzentrationsabhängige scheinbar hemmende Wirkung auf die extrazelluläre NO-Freisetzung der eNOS gezeigt. Die eNOS-Proteinexpression blieb durch die verwendeten Monomere weitestgehend unbeeinflusst. Durch eine hohe Konzentration der Fraktion I des Kiefernrindenextraktes wurde eine Steigerung der eNOS-Proteinkonzentration in Endothelzellen gefunden, wobei zytotoxische Artefakte dabei nicht auszuschließen waren. Als kompetitive endogene Inhibitoren der NOS wurden in vivo in jüngster Zeit methylierte Arginine (ADMA= asymmetrisches, SDMA= symmetrisches Dimethylarginin) entdeckt. In einer randomisierten, kontrollierten, doppelt-blinden klinischen Studie mit einem Cross-over Design am Universitätsklinikum Zürich mit 28 Patienten, die an einer koronaren Herzerkrankung litten, wurden die Plasmaspiegel methylierter Arginine vor und nach 8 wöchiger Einnahme des Kiefernrindenextraktes bestimmt. Es zeigte sich dabei trotz einer Verbesserung der flussinduzierten Gefäßerweiterungskapazität (Flow-mediated dilation) und Verringerung der 15-F2t-Isoprostan-Plasmaspiegel keine signifikante Veränderung der Plasmakonzentrationen von ADMA, SDMA und ET-1 (Endothelin-1) durch die Einnahme des Extraktes. Die nNOS kommt vor allem im Gehirn, aber auch in Muskelzellen vor. Der Einsatz des Metaboliten M1 führte zu keinen deutlichen Effekten auf die konstitutive nNOS-Expression in einem Rhabdomyosarkom(A-673)-Zellkulturmodell. Zur Beantwortung der Frage, wie wahrscheinlich es ist, dass zur möglichen Beeinflussung von (patho)-physiologischen zerebralen Prozessen Polyphenole in vivo das Gehirn erreichen, wurde erstmals ein in silico-Modell zur Vorhersage der Verteilung von ausgewählten polyphenolischen Substanzen zwischen Blut und Gehirn entwickelt. Damit wurde anschließend eine Reihenfolge mit logBB-Werten (logarithmierter Quotient aus Konzentration im Blut und im Gehirngewebe) geordnet nach einer entsprechend dem Modell wahrscheinlich höheren Verteilung ins Gehirn für die untersuchten Substanzen berechnet: Protocatechusäure < Quercetin < Cyanidin < (+) Catechin < (-)-Epicatechin < Phloretin < M1. Insgesamt schienen die untersuchten polyphenolischen Substanzen eher schwach bluthirnschrankengängig zu sein. Der Metabolit M1 zeigte den höchsten logBB-Wert und somit die höchste Wahrscheinlichkeit der untersuchten Polyphenole, die Blut-Hirnschranke in vivo zu überwinden. Im Kontext einer möglichen Anwendung bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen wurde zusätzlich ein Extrakt aus der Frucht von Morinda citrifolia L. in einem primären Monozyten-Zellkulturmodell auf seine Eigenschaften hin die Sekretion der Matrix-Metalloprotease-9 (MMP-9) aus Immunzellen nach einem Entzündungsreiz zu beeinflussen untersucht. Dabei zeigten die Extraktverdünnungen deutliche konzentrationsabhängige Hemmeffekte um bis zu ~50 % der maximalen MMP-9 Sekretion, die mit dem Einsatz von Hydrocortison vergleichbar waren. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit neue Beiträge zur Wirkungsweise der untersuchten Pflanzenextrakte und vor allem zum Verständnis der möglichen Effekte von Polyphenolen auf physiologisch relevante NO-Systeme sowie zur methodischen Wissenserweiterung der komplexen NO-Analytik geleistet werden.
N2  - Many clinical trials with the administration of a standardized maritime pine bark extract (Pycnogenol®) have shown benefical effects. In order to study the basic mechanistic principles of how the extract might work on a cellular level the impact of the extract components and especially of the metabolite M1 (chemically named δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolactone or 5 (3,4 Dihydroxybenzyl)dihydrofuran 2(3H) one) on nitric oxide (NO) producing systems was tested and evaluated. NO is involved in many physiological and pathophysiological processes in living organisms. There are three different isoforms of NO-synthases (NOS) known in humans so far: the inducible NOS (iNOS) is pathologically associated with inflammatory processes, the endothelial NOS (eNOS) is linked to (cardio-)vascular diseases, and the neuronal NOS (nNOS) plays a role in memory formation, but is also put in context to neuronal cytotoxicity within the course of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. The metabolite M1 is generated by microbiota in the human colon after per os ingestion of the pine bark extract and thereafter enters the circulation. M1 showed a strong concentration dependent inhibition of NO-release by iNOS from murine macrophages after an inflammatory stimulus (IC50= 1.28 µg/mL). M1 was even more potent at inhibiting NO-release from macrophages than fraction I of the pine bark extract, which predominantly contains monomeric extract compounds, and slightly more potent than hydrocortisone. Cytotoxicity of M1 was found to be modest in the test system. In addition to the NO-radical scavenging activities of M1 there were also profound concentration dependent inhibitory effects on iNOS protein expression (IC50= 3.78 µg/mL). As there is a gap between determined plasma concentrations of M1 after pine bark extract ingestion and required bioactive concentrations in cell culture test systems the binding of M1 to human endothelial cells, human monocytes and murine macrophages in the presence of serum proteins was determined in order to test for cellular M1 accumulation. There was a strong binding of M1 to these cells and a possible facilitated uptake via distinct membrane transporters was shown with using an influx-inhibitor (phloretin). In order to analyze the very small amounts of NO produced by eNOS new methodic approaches were established. Formerly unkown pitfalls and limitations with using the fluorescence dye DAF-2 (4,5-diaminofluorescein) and with applying different detection systems for NO were revealed. DAF-2 was subject to conversion to the NO adduct triazolofluorescein (DAF-2T) even without an externally added NO source under certain assay and storage conditions, especially after freezing and thawing sample solutions. Thus control of spontaneous reagent conversion is advisable. The monomers (+)-catechin, (-)-epicatechin, resveratrol, and M1 were not stable over time and displayed highly dynamic auto-fluorescence. In accordance with their radical scavenging activity the polyphenols seemingly showed a concentration dependent inhibitory effect on NO-release from endothelial cells over short (≤ 45 min) and longer incubation periods (14-20 h). After incubation with the monomers eNOS-protein expression was not markedly affected. When applying very high concentrations of fraction I of the extract an increase of cellular eNOS protein content was observed, but cytotoxic artefacts could not be ruled out though. Recently, competitive endogenous in vivo inhibitors of NOS were identified as methylated arginines (ADMA= asymmetric-, SDMA= symmetric dimethylarginine). In the course of a randomized, double-blind, placebo-controlled and cross-over designed clinical trial, which was conducted at the University of Zurich and enrolled 28 coronary heart disease patients, plasma concentrations of methylated arginines before and after the 8-week intake of pine bark extract were determined. Despite of improvements in flow-mediated dilation parameters and decrease of 15-F2t-Isoprostane plasma concentrations there was no significant alteration of plasma concentrations of ADMA, SDMA and ET-1 (endothelin-1) after the pine bark extrakt intake. The nNOS is found in neuronal cells but is also expressed in other cell types like muscle cells. In a rhabdomyosarcoma (A-673) cell culture model the metabolite M1 had no meaningful effect on nNOS expression. In order to contribute answering the question whether polyphenols are likely to cross the blood brain barrier an in silico model for predicting polyphenol distribution between blood and brain tissue (logBB) was developed. logBB values for selected polyphenols were calculated and resulted in the following rank order with increasing probability of an uptake into the brain: protocatechuic acid< quercetin < cyanidin < (+) catechin < (-)-epicatechin < phloretin < M1. The metabolite M1 showed the highest logBB value of the tested polyphenols and thus had the highest predicted feasibility for crossing the blood brain barrier as described with the newly established computer based model. The extract of the fruits from Morinda citrifolia L. is traditionally utilized for the treatment of inflammatory diseases. Applying a primary human monocyte cell culture model the extract was tested for its ability to inhibit the secretion of matrix-metalloprotease-9 after an inflammatory stimulus. Dilutions of the extract in cell culture media showed profound concentration dependent inhibitory effects with up to a ~50 % decrease of metalloprotease secretion that were comparable to hydrocortisone. Thus, new and substantial contributions were made in this work allowing a better understanding of the mode of action of the tested plant extracts, especially of the effects of polyphenols on physiological relevant nitric oxide systems, and gaining a deeper methodical knowledge in the challenging field of NO-analysis.
KW  - Stickstoffmonoxid
KW  - Strandkiefer
KW  - Rinde
KW  - Extrakt
KW  - Stickstoffmonoxid-Synthase
KW  - Metabolit
KW  - EA.hy 926
KW  - DAF-2
KW  - Radikal
KW  - HPLC
KW  - Monozyten
KW  - free radicals
KW  - DAF-2
KW  - (+)-Catechin
KW  - nitric oxide
KW  - metabolite
KW  - hplc
KW  - EA.hy 926
KW  - monocyte
KW  - macrophage
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72102
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TY  - THES
A1  - Schönlein, Michael
T1  - Stability and Robustness of Fluid Networks: A Lyapunov Perspective
T1  - Stabilität und Robustheit von Fluidnetzwerken: Eine Lyapunov Perspektive
N2  - In the verification of positive Harris recurrence of multiclass queueing networks the stability analysis for the class of fluid networks is of vital interest. This thesis addresses stability of fluid networks from a Lyapunov point of view. In particular, the focus is on converse Lyapunov theorems. To gain an unified approach the considerations are based on generic properties that fluid networks under widely used disciplines have in common. It is shown that the class of closed generic fluid network models (closed GFNs) is too wide to provide a reasonable Lyapunov theory. To overcome this fact the class of strict generic fluid network models (strict GFNs) is introduced. In this class it is required that closed GFNs satisfy additionally a concatenation and a lower semicontinuity condition. We show that for strict GFNs a converse Lyapunov theorem is true which provides a continuous Lyapunov function. Moreover, it is shown that for strict GFNs satisfying a trajectory estimate a smooth converse Lyapunov theorem holds. To see that widely used queueing disciplines fulfill the additional conditions, fluid networks are considered from a differential inclusions perspective. Within this approach it turns out that fluid networks under general work-conserving, priority and proportional processor-sharing disciplines define strict GFNs. Furthermore, we provide an alternative proof for the fact that the Markov process underlying a multiclass queueing network is positive Harris recurrent if the associate fluid network defining a strict GFN is stable. The proof explicitely uses the Lyapunov function admitted by the stable strict GFN. Also, the differential inclusions approach shows that first-in-first-out disciplines play a special role.
N2  - Für den Nachweis der positiven Harris-Rekurrenz bei Multiklassenwarteschlangennetzwerken ist die Stabilitätsanalyse der Klasse von Fluidnetzwerken von wesentlicher Bedeutung. Gegenstand dieser Arbeit ist die Stabilität von Fluidnetzwerken aus der Sicht von Lyapunov. Ein besonderes Augenmerk wird dabei auf konverse Lyapunov Theoreme gelegt. Hierzu wird ein axiomatischer Zugang gewählt, der auf generischen Eigenschaften gängiger Fluidnetzwerke basiert. Die Arbeit zeigt, dass die Klasse der abgeschlossenen generischen Fluidnetzwerk (abgeschlossene GFN) Modelle zu weit gefasst ist, um eine umfassende Lyapunovtheorie zu ermöglichen. Um dies zu beheben, wird die Klasse der strikten GFN Modelle eingeführt. In dieser Klasse wird verlangt, dass abgeschlossene GFN Modelle zusätzlich eine Verkettungs- sowie eine Unterhalbstetigkeitsbedingung erfüllen. Aus der Arbeit geht hervor, dass für strikte GFN Modelle Stabilität äquivalent zu der Existenz einer stetigen Lyapunov-Funktion ist. Darüberhinaus wird eine Regularitätseigenschaft an die Trajektorien des stikten GFN Modells gegeben, welche die Konstruktion glatter Lyapunov-Funktionen ermöglicht. Für den Nachweis, dass Fluidnetzwerke unter gängigen Disziplinen die zusätzlichen Eigenschaften erfüllen, werden diese als Differentialinklusionen aufgefasst. Dabei zeigt sich, dass allgemein arbeitserhaltende Fluidnetzwerke und Fluidnetzwerke mit Prioritäten strikte GFN Modelle liefern. Zudem zeigt die Arbeit einen alternativen Beweis dafür, dass der einem Multiklassenwarteschlangennetzwerk zugrunde liegende Markovprozess positiv Harris-rekurrent ist, falls das zugehörige Fluidnetzwerk ein striktes GFN Modell definiert und stabil ist. Dabei wird explizit die Lyapunov-Funktion des Fluidnetzwerkes ausgenutzt. Außerdem zeigt die Betrachtung von Fluidnetzwerken mittels Differentialinklusionen, dass first-in-first-out Fluidnetzwerken eine Sonderrolle zukommt.
KW  - Warteschlangennetz
KW  - Ljapunov-Funktion
KW  - Ljapunov-Stabilitätstheorie
KW  - Fluidnetzwerk
KW  - Lyapunov Funktion
KW  - Stabilität
KW  - queueing networks
KW  - fluid networks
KW  - stability
KW  - Lyapunov functions
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72235
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TY  - THES
A1  - Tuchscherer, Philip
T1  - A Route to Optical Spectroscopy on the Nanoscale
T1  - Über Optische Spektroskopie auf der Nanoskala
N2  - Time-resolved optical spectroscopy has become an important tool to investigate the dynamics of quantum mechanical processes in matter. In typical applications, a first “pump” pulse excites the system under investigation from the thermal equilibrium to an excited state, and a second variable time-delayed “probe” pulse then maps the dynamics of the excited system. Although advanced nonlinear techniques have been developed to investigate, e.g., coherent quantum effects, all of these techniques are limited in their spatial resolution. The laser focus diameter has a lower bound given by Abbe’s diffraction limit, which is roughly half the optical excitation wavelength—corresponding to about 400nm in the presented experiments. In the time-resolved experiments that have been suggested so far, averaging over the sample volume within this focus cannot be avoided. In this thesis, two approaches were developed to overcome the diffraction limit in optical spectroscopy and to enable the investigation of coherent processes on the nanoscale. In the first approach, analytic solutions were found to calculate optimal polarizationshaped laser pulses that provide optical near-field pump–probe pulse sequences in the vicinity of a nanostructure. These near-field pulse sequences were designed to allow excitation of a quantum system at one specific position at a certain time and probing at a different position at a later time. In the second approach, the concept of coherent two-dimensional (2D) spectroscopy, which has had great impact on the investigation of coherent quantum effects in recent years, was combined with photoemission electron microscopy, which yields a spatial resolution well below the optical diffraction limit. Using the analytic solutions, optical near fields were investigated in terms of spectroscopic applications. Near fields that are excited with polarization-shaped femtosecond laser pulses in the vicinity of appropriate nanostructures feature two properties that are especially interesting in the view of spectroscopic applications: On the one hand, control of the spatial distribution of the optical fields is achieved on the order of nanometers. On the other hand, the temporal evolution of these fields can be adjusted on the order of femtoseconds. In this thesis, solutions were found to calculate the optimal polarizationshaped laser pulses that control the near field in a general manner. The main idea to achieve this deterministic control was to disentangle the spatial and temporal near-field control. First, the spatial distribution of the optical near field was controlled by assigning the correct state of polarization for each frequency within the polarization-shaped laser pulse independently. The remaining total phase—not employed for spatial control—was then used for temporal near-field compression, which, in experimental applications, would lead to an enhancement of the nonlinear signal at the respective location. In contrast to the use of optical near fields, where pump–probe sequences themselves are localized below the diffraction limit and the detection does not have to provide the spatial resolution, a different approach was suggested in this thesis to gain spectroscopic information on the nanoscale. The new method was termed “Coherent two-dimensional (2D) nanoscopy” and transfers the concept of “conventional” coherent 2D spectroscopy to photoemission electron microscopy. The pulse sequences used for the investigation of quantum systems in this method are still limited by diffraction. However, the new key concept is to detect locally generated photoelectrons instead of optical signals. This yields a spatial resolution that is well below the optical diffraction limit. In “conventional” 2D spectroscopy a triple-pulse sequence initiates a four wave mixing process that creates a coherence. In a quantum mechanical process, this coherence is converted into a population by emission of an electric field, which is measured in the experiment. Contrarily, in the developed 2D nanoscopy, four-wave mixing is initiated by a quadruple-pulse sequence, which leaves the quantum system in an electronic population. This electronic population carries coherent information about the investigated quantum system and can be mapped with a spatial resolution down to a few nanometers given by the spatial resolution of the photoemission electron microscope. Hence, 2D nanoscopy can be considered a generalization of time-resolved photoemission experiments. In the future, it may be of similar beneficial value for the field of photoemission research as “conventional” 2D spectroscopy has proven to be for optical spectroscopy and nuclear magnetic resonance experiments. In a first experimental implementation of coherent 2D nanoscopy coherent processes on a corrugated silver surface were measured and unexpected long coherence lifetimes could be determined.
N2  - Zur Untersuchung von Dynamiken quantenmechanischer Prozesse in Materie hat sich die zeitaufgelöste optische Spektroskopie zu einem zentralen Werkzeug entwickelt. Eine Standardmethode ist hierbei die Anrege-Abfrage-Spektroskopie. Bei solch einem Experiment wird das zu untersuchende System zunächst mit einem Anregepuls aus dem thermischen Gleichgewicht in einen höheren Zustand angeregt. Anschließend untersucht man mit einem zweiten zeitverzögerten Abfragepuls die Dynamik des angeregten Systems. Obwohl fortgeschrittene experimentelle Methoden entwickelt wurden um kohärente Quanteneffekte zu untersuchen, sind all diese Experimente nach wie vor in ihrer räumlichen Auflösung begrenzt. Aufgrund von Beugung ist der Fokus eines Laserstrahls limitiert. Diese untere Grenze ist durch Abbe’s Auflösungsgrenze gegeben und entspricht etwa der Hälfte der optischen Anregungswellenlänge, d.h. etwa 400nm in den hier vorgestellten Experimenten. Daher kann eine Mittelung über das Probenvolumen, gegeben durch die Fokusgröße, in den bisher vorgestellten Experimenten nicht vermieden werden. In dieser Arbeit wurden zwei Ansätze verfolgt, um die Beugungsgrenze in der optischen Spektroskopie zu überwinden und die Untersuchung von kohärenten Prozessen auf der Nanometerskala zu ermöglichen. Im ersten Ansatz wurden analytische Lösungen gefunden, um optimal polarisationsgeformte Laserpulse zu berechnen, die optische Anrege-Abfrage-Nahfeld-Pulsfolgen in der Nähe einer Nanostruktur ermöglichen. Diese Nahfeld-Pulsfolgen wurden entwickelt, um ein quantenmechanisches System an einer bestimmten Position zu einem bestimmten Zeitpunkt anzuregen und an einer anderen Position zu einem späteren Zeitpunkt abzufragen. Im zweiten Ansatz wurde das Konzept der kohärenten zweidimensionalen (2D) Spektroskopie, die in den letzten Jahren großen Einfluss auf die Untersuchung von kohärenten Quanteneffekten gehabt hat, mit Photoelektronenmikroskopie kombiniert. Letztere ermöglicht eine räumliche Auflösung deutlich unter der optischen Auflösungsgrenze. Mit Hilfe der analytischen Lösungen wurden optische Nahfelder in Bezug auf spektroskopische Anwendungen untersucht. Nahfelder, die mit polarisationsgeformten Femtosekunden-Laserpulsen in der Nähe von entsprechenden Nanostrukturen angeregt werden, verfügen über zwei Eigenschaften, die besonders interessant für spektroskopische Anwendungen sind: Zum einen kann die räumliche Verteilung der optischen Felder auf der Größenordnung von Nanometern kontrolliert werden. Zum anderen kann die zeitliche Entwicklung dieser Felder in der Größenordnung von Femtosekunden manipuliert werden. In dieser Arbeit wurden Lösungen gefunden, um optimale polarisationsgeformte Laserpulse zu berechnen, die diese Nahfeld-Steuerung in einer allgemeinen Art und Weise erlauben. Die Hauptidee, um diese deterministische Steuerung zu erreichen, war die räumliche und zeitliche Nahfeld-Kontrolle zu entkoppeln. Zuerst wurde dafür die räumliche Verteilung der optischen Nahfelder durch die Zuordnung des korrekten Polarisationszustandes für jede Frequenz, innerhalb des polarisationsgeformten Laserpulses, unabhängig gesteuert. Die verbleibende totale Phase, die nicht für die räumliche Kontrolle benötigt wird, wurde dann verwendet um den nichtlinearen Fluss an den gewünschten Positionen durch zeitliche Nahfeldkomprimierung zu erhöhen. Im Gegensatz zur Verwendung von optischen Nahfeldern, in der die Anrege-Abfrage-Nahfeld-Pulsfolgen selbst unter dem Beugungslimit lokalisiert sind und die Detektion nicht räumlich aufgelöst sein muss, wurde in dieser Arbeit noch ein anderer Ansatz vorgeschlagen, um spektroskopische Informationen auf der Nanometerskala zu erhalten. Die neue Methode wurde als „kohärente zweidimensionale (2D) Nanoskopie“ beschrieben und überträgt das Konzept der „herkömmlichen“ kohärenten 2D Spektroskopie auf die Photoemissionselektronenmikroskopie. In dieser neuen Methode ist die räumliche Auflösung der zur Untersuchung des quantenmechanischen Sytems erforderlichen Pulssequenzen zwar durch Beugung begrenzt. Die wesentliche Neuerung ist allerdings, lokal erzeugte Photoelektronen anstelle von optischen Signalen zu messen. Daraus ergibt sich eine räumliche Auflösung, die weit unterhalb der optischen Beugungsgrenze liegt. Die photoemittierten Elektronen tragen dann kohärente Information über das untersuchte System und können mit einer räumlichen Auflösung von wenigen Nanometern abgebildet werden. Die Auflösung ist dabei durch das verwendete Photoemissionsmikroskop vorgegeben. Demzufolge kann 2D Nanoskopie als eine Verallgemeinerung der zeitaufgelösten Photoemissionsexperimente gesehen werden. In einer ersten experimentellen Umsetzung der kohärenten 2D Nanoskopie wurden kohärente Prozesse auf einer rauhen Silberoberfläche untersucht und dabei unerwartet langlebige Kohärenzen gemessen.
KW  - Ultrakurzzeitspektroskopie
KW  - Kohärente Optik
KW  - Ultrakurzzeit Spektroskopie
KW  - Kohärente 2D Spektroskopie
KW  - Coherent 2D Spectroscopy
KW  - Nanooptic
KW  - Ultrafast spectroscopy
KW  - Surface plasmons
KW  - Optische Spektroskopie
KW  - Nahfeldoptik
KW  - Oberflächenplasmonresonanz
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72228
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TY  - JOUR
T1  - einBlick - Ausgabe 32 - 11. September 2012
N2  - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
KW  - Würzburg
KW  - Universität
KW  - University
KW  - Wuerzburg
KW  - Wurzburg
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72726
VL  - 32/2012
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bätz, Julia
T1  - FRET-basierte Untersuchungen zur ligandenselektiven Beeinflussung der Rezeptorkonformation durch orthosterische und allosterische Liganden am Beispiel des muskarinischen M2 Acetylcholinrezeptors
T1  - FRET-based analysis of the ligandselective influence of orthosteric and allosteric ligands on the change of receptor conformation of the muscarinic m2 acetylcholine receptor
N2  - Zahlreiche experimentelle Befunde lassen vermuten, dass G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) nach ihrer Aktivierung einer ligandenselektiven Änderung der Rezeptorkonformation unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es dieses Phänomen am Subtyp 2 der muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (M2 AChR) zu untersuchen. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChR) können in fünf Subtypen (M1-M5) unterschieden werden. Durch die Beteiligung der mAChR an zahlreichen physiologischen Prozessen stellen sie wichtige Zielstrukturen pharmakologischer Therapien dar. Da die orthosterische Ligandenbindestelle (= Bindestelle des endogenen Liganden) in allen fünf Subtypen hoch konserviert ist, wird ihr pharmakologischer Nutzen derzeit allerdings durch die unselektive Rezeptormodulation und dem damit verbundenen Auftreten unerwünschter Arzneimittelwirkungen stark limitiert. Ein Ansatz zur Erzielung subtypselektiver Effekte besteht in der Verwendung allosterischer Modulatoren. Da die allosterische Bindestelle der mAChR eine geringere Sequenzhomologie aufweist, können so gezielt einzelne Subtypen der mAChR reguliert werden. Der M2 AChR stellt hinsichtlich allosterischer Modulation ein gut charakterisiertes Modellsystem dar. Für ihn wurde bereits eine Vielzahl allosterischer Liganden entwickelt. Auch bitopische Liganden, die sowohl einen allosterischen als auch einen orthosterischen Anteil enthalten, wurden für den M2 AChR bereits beschrieben. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene FRET-Sensoren des M2 AChR generiert und charakterisiert. Als FRET-Paar wurden das cyan fluoreszierende Protein (CFP) und der niedermolekulare fluorescein-basierte Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) gewählt. CFP wurde in den Sensoren am Ende des C-Terminus angefügt. Die zur Markierung mit FlAsH nötige Tetracysteinsequenz wurde in verschiedenen Bereichen der dritten intrazellulären Rezeptorschleife (IL) eingebracht. Die auf diese Weise erstellten Re-zeptorsensoren trugen das Tetracysteinmotiv in der N terminalen (M2i3-N) bzw. in der C terminalen Region (M2i3-C) von IL 3. Die Charakterisierung der Rezeptorsensoren bezüglich Ligandenbindung, Gi-Protein Aktivierung und β-Arrestin2 Translokation ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen M2i3-N, M2i3 C und M2CFP oder Wildtyp M2 AChR. Zunächst wurden sowohl unterschiedliche orthosterische, als auch allosterische Liganden hinsichtlich ihrer mittleren effektiven Konzentration und ihrer maximalen Wirkstärke an den Rezeptorsensoren untersucht. Mit Hilfe von FRET-Messungen konnte ein superago-nistisches Verhalten des orthosterischen Testliganden Iperoxo gezeigt werden. Die Eigenschaften der allosterischen Substanzen wurden durch Messung der Rezeptordeakti-vierungskinetik und des maximalen Hemmeffekts auf einen vorstimulierten Rezeptor charakterisiert. Alle allosterischen Liganden deaktivierten den vorstimulierten M2 AChR mit einer schnelleren Kinetik als Atropin. Die EC50-Werte der unterschiedlichen Substanzen waren unabhängig von der Markierungsposition im verwendeten Rezeptorsensor vergleich-bar. Ausnahmen bildeten die allosterischen Liganden JK 289, JK 338, ½ W84 und EHW 477, die liganden- und sensorabhängig unterschiedliche mittlere effektive Konzentrationen aufwie-sen. Bei der Untersuchung der Konformationsänderung des M2 AChR konnte kein liganden-selektiver Unterschied zwischen den FRET-Signalen für 19 getestete orthosterische Liganden beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass alle orthosterischen Testliganden eine dem Acetylcholin (ACh) vergleichbare Änderung der M2 AChR Konformation induzier-ten. Um zu untersuchen, ob für die orthosterischen Testliganden eine Korrelation zwischen ihrer maximalen Wirkstärke hinsichtlich Rezeptoraktivierung in FRET-Experimenten und der Aktivierung nachgeschalteter Signalwege besteht, wurde die orthosterisch-vermittelte Translokation von β-Arrestin2 mit Hilfe der Konfokalmikroskopie bestimmt. Bis auf 5-Methyl-furmethiodid translozierten alle orthosterischen Liganden β-Arrestin2 in einem Ausmaß, das mit der maximalen Rezeptoraktivierung vergleichbar war. Dagegen rief 5 Methylfurmethiodid verglichen mit dem endogenen Liganden ACh zwar eine ca. halbmaximale Rezeptorakti-vierung, aber nur eine äußerst geringe β-Arrestin2 Translokation hervor. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Allostere auf eine ligandenselektive Konformationsänderung des M2 AChR untersucht. Die allosterischen Liganden JK 337 und Seminaph beeinflussten den M2i3-C Sensor signifikant stärker, als das M2i3-N Konstrukt. Dagegen zeigte EHW 477 eine stärkere Beeinflussung der Rezeptorkon-formation des M2i3-N-, als des M2i3-C Sensors. Dies erlaubt die Vermutung, dass JK 337 und Seminaph eine stärkere Bewegung unterhalb von Transmembrandomäne (TM) 6, als unterhalb von TM 5 hervorriefen. Die Ergebnisse für EHW 477 legen nahe, dass TM 5 eine größere Bewegung eingeht, als TM 6. FRET-basierte Untersuchungen der Einflüsse der allosterischen Testliganden auf nachgeschaltete Signalwege ergaben, dass sowohl die Akti-vierung des Gi Proteins, als auch die β-Arrestin2 Translokation selektiv durch einzelne allosterische Liganden beeinflusst werden. Auch ein Zusammenhang zwischen Rezeptor-aktivierung und der Regulation nachgeschalteter Signalwege war erkennbar. Allerdings waren auf Grund der Versuchsbedingungen keine quantitativen Aussagen möglich. Im Folgenden wurden die bitopischen Liganden Hybrid 1 und 2 (H 1, H 2) hinsichtlich ihres Effekts auf die Konformationsänderung des M2 AChR untersucht. Während eine Stimulation mit H 1 vergleichbare FRET-Signale an beiden Sensoren ergab, konnte mit H 2 weder am M2i3-N-, noch an M2i3-C Sensor eine FRET-Änderung detektiert werden. Um den mangeln-den Effekt der Hybridsubstanzen in FRET-mikroskopischen Untersuchungen aufzuklären, wurden verschiedene Ansätze gewählt: Mit kettenverlängerten Derivaten der Hybridsubstanzen konnte in FRET-Messungen eine Änderung des FRET-Signals detektiert werden. Die Entfernung des allosterischen Bausteins führte in FRET-Experimenten zu einer verglichen mit dem endogenen Liganden ACh etwa halbmaximalen Aktivierung beider Sensoren. Dagegen resultierte die Mutation der alloste-rischen Bindestelle in nachfolgenden FRET-Untersuchungen mit H 1 und H 2 in keiner Signaländerung des FRET-Ratio. Diese Beobachtungen führten zu der Annahme, dass die Linkerkette, die orthosterischen und allosterischen Baustein der Hybride miteinander verbindet, zu kurz war um eine gleichzeitige Bindung an die allosterische und orthosterische Bindestelle zu ermöglichen. Ein anderer Erklärungsansatz besteht darin, dass nach Bindung des Orthosters der Kanal zwischen orthosterischer und allosterischer Bindestelle durch die Konformationsänderung des Rezeptors verschlossen wird, weshalb keine dauerhafte, dualsterische Bindung der Hybridsubstanzen an den M2 AChR möglich ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen mittels FRET-Experimenten die Existenz einer ligandenselektiven Rezeptorkonformation des M2 AChR mit allosterischen Liganden nachzuweisen. Darüber hinaus konnte auch ein Bezug zum Auftreten einer funktionellen Selektivität mit allosterischen Liganden hergestellt werden. Die Untersuchung von 19 orthosterischen Liganden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Rezeptorkonformation des M2 AChR ergab keinen Hinweis auf eine ligandenselektive Konformationsänderung. Die Betrachtung der orthosterisch-vermittelten Translokation von β-Arrestin2 zeigte, dass zwischen der Effizienz der orthosterischen Testliganden, den M2 AChR zu aktivieren und dem Ausmaß, in dem sie eine β Arrestin2 Translokation induzierten eine direkte Korrelation besteht. Lediglich 5-Methylfurmethiodid rief eine ungleich geringere β-Arrestin2 Translokation hervor, verglichen mit dem Ausmaß an Rezeptoraktivierung. Diese Beobachtung deutet auf die Existenz eines signaling-bias für diesen Liganden hin. Die Untersuchung der dualsterischen Liganden H 1 und 2 bezüglich ihrer Fähigkeit zur Rezeptoraktivierung ergab, dass erst durch eine Verlängerung der Linkerkette, durch die orthosterischer und alloste-rischer Baustein miteinander verbunden sind eine Konformationsänderung des M2 AChR hin zu einer aktiven Konformation erreicht werden kann. Es kann somit angenommen werden, dass in den ursprünglichen Hybridsubstanzen H 1 und H 2 eine zu kurze Linkerkette, durch die keine dualsterische Bindung der Hybride an die allosterische und orthosterische Bindestelle möglich ist, ursächlich für die mangelnde Rezeptoraktivierung des M2 AChR war.
N2  - A large body of experimental evidence suggests that upon receptor activation G-protein coupled receptors are subject to ligandspecific changes of receptor conformation. The aim of this study was to investigate this phenomenon using the muscarinic M2 acetylcholine receptor (M2 AChR). Muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) can be subdivided into five different subtypes (M1-M5). Their involvement in various physiological processes makes them an important target of pharma-cological therapies. With the orthosteric binding site (= binding site of the endogenous ligand) being highly conserved across all five mAChR subtypes, the unselective receptor modulation can lead to severe side effects. Thus the clinical use of drugs modulating muscarinic receptors is currently limited. Allosteric modulation is one attempt to achieve subtype-selective receptor regulation. Since the allosteric binding site of mAChR is less well conserved, it is possible to selectively target one mAChR subtype. As far as allosteric modulation is concerned, the M2 AChR represents a well characterized model with a large number of allosteric modulators being available. For the M2 AChR bitopic ligands which contain an allosteric as well as an orthosteric binding block have been developed as well. In the first part of this study several FRET-sensors of the M2 AChR were designed and characterized. The cyan fluorescent protein (CFP) was fused to the C-terminus of both sensors while the FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) binding site was inserted into the N-terminal (M2i3-N) or the C terminal (M2i3-C) region of the third interacellular loop (IL). The receptor sensors were characterized concerning ligand affinity, activation of the Gi protein and -arrestin2 translocation and did not display any significant differences compared to the wildtype M2 or the M2 CFP receptor. Various orthosteric as well as allosteric ligands were investigated regarding their affinity and efficacy at both sensors. Using FRET-measurements iperoxo was proven to behave as a superagonist. The characteristics of the allosteric ligands were investigated by measuring the receptor deactivation kinetics and their maximum inhibitory effect on a pre-stimulated receptor. All allosteric test substances displayed faster deactivation kinetics compared to the antagonist atropine and similar EC50 values at both receptor sensors. When investigating the change of receptor conformation of the M2 AChR upon ligand binding there were no ligand selective differences in the FRET-signal detected for either of the 19 orthosteric ligands at both M2 sensors. This data suggest that all orthosteric ligands induced a change in receptor conformation comparable to acetylcholine (ACh). In order to correlate the efficacy of various orthosteric ligands to activate the M2 AChR in FRET-experiments with their effect on downstream signaling pathways, the translocation of  arrestin2 upon receptor activation with orthosteric ligands was investigated using confocal microscopy. Except for 5 methylfurmethiodide all orthosteric ligands induced -arrestin2 translocation to an extent which was comparable to the maximal receptor activation observed with each other ligand, respectively. In contrast 5-methylfurmethiodide evoked a half maximal receptor activation compared to the endogenous ligand ACh while only a minimal translocation of -arrestin2 was observed. The second aim of this study was to investigate the effects of allosteric ligands on the change of receptor conformation of the M2 AChR. The allosteric ligands JK 337 and seminaph more strongly influenced the M2i3-C than the M2i3-N, whilst EHW 477 behaved just the opposite way. This data suggest that the orthosteric ligands induce a conformation of the M2 AChR comparable to ACh. JK 337 and seminaph seem to evoke a greater movement underneath TM 6 compared to TM 5 whereas EHW 477 probably induces a larger movement beneath TM 5. The allosteric ligands were tested via FRET-measurements concerning their ability to activate the Gi protein and to translocate  arrestin2. The activation of the Gi protein as well as the -arrestin2 translocation were selectively influenced by all allosteric ligands. However, due to the experimental setup, a quantification of the effects was not possible. Furthermore the bitopic ligands hybrid 1 and 2 (H 1, H 2) were tested regarding their effect on the receptor conformation of the M2 AChR. While stimulation with H 1 induced FRET signals that were comparable for both receptor sensors, it wasn’t possible to detect any change in the FRET ratio neither of the M2i3-N nor of the M2i3-C with H 2. The lack of effect of H 1 and H 2 in the FRET-experiments was explored using two different approaches: Derivatives of H 1 and H 2, in which the carbon linker between the allosteric and the orthosteric building block had been elongated, were able to induce changes in the FRET ratio. Upon the removal of the allosteric building block a half-maximal activation of both receptor sensors could be detected. However, the mutation of the allosteric binding site did not result in any change of the FRET-signals upon stimulation of the receptor mutants with H 1 or H 2. These data suggest that the carbon linker, which connects the allosteric and the orthosteric building block, is not long enough to enable a simultaneous binding to the allosteric and the orthosteric binding site. Another explanation would be that upon binding of an orthoster the channel between the orthosteric and the allosteric binding site of the M2 AChR is closed because of the change in receptor conformation, hence a stable, dual-steric binding of the hybrid substances to the M2 AChR would not be possible. In the course of this study it was possible to prove the existence of a ligand selective receptor conformation of the M2 AChR with allosteric ligands using FRET-experiments. In addition a connection was found to the occurrence of a functional selctivity with allosteric ligands. The investigation of 19 orthosteric ligands regarding their influence on the receptor conformation of the M2 AChR did not reveal any evidence of the existence of a ligand selective change of the receptor conformation. Regarding the translocation of β arrestin2 induced by orthosteric ligands there was a direct correlation between the efficency of the orthosteric ligands to activate the receptor and the extend of β-arrestin2 translocation observed. With the only exception being 5-methylfurmethiodide which induced far less β arrestin2 translocation compared to the magnitude of the conformational change of the receptor. This data suggest the existence of a signaling bias for this ligand. The analysis of the dualsteric ligands H 1 and H 2 concerning their ability to activate the M2 AChR revealed that an activation of the M2 AChR could just be observed upon elongation of the linker which connects the orthosteric with the allosteric building block. This suggests that the short linker chain of the original hybrid substances inhibited a dualsteric binding to the orthosteric and the allosteric binding site and thus caused the difficency of H 1 and H 2 to activate the M2 AChR.
KW  - Muscarinrezeptor
KW  - Allosterie
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - allosteric modulation
KW  - muscarinic aceylcholine receptor
KW  - GPCR
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72836
ER  - 
TY  - THES
A1  - Glaser, Nina
T1  - Influence of natural food compounds on DNA stability
T1  - Einfluss natürlicher Nahrungsbestandteile auf die DNA Stabilität
N2  - Cancer is one of the leading causes of death all over the world. Malnutrition and toxic contaminations of food with substances such as mycotoxins have been thought to account for a high percentage of cancers. However, human diet can deliver both mutagens and components that decrease the cancer risk. Genomic damage could be reduced by food components through different mechanisms such as scavenging of reactive oxygen species. In the first part of this study we tried to investigate the effects of patulin and resveratrol on DNA stability in V79 cells. Patulin is a mycotoxin, which is frequently found in spoiled apples and other fruits. The WHO has established a safety level of 50 µg/L, which is indeed not observed by all manufacturers. The acute toxicity of patulin in high concentrations is well known, however its potential carcinogenicity is still a matter of debate. Therefore we wanted to investigate further steps in the mechanism of patulin-induced genotoxicity. Patulin caused the formation of micronuclei and nucleoplasmic bridges in a dose-dependent manner. Further analysis revealed that patulin induced both kinetochore-negative and positive micronuclei. Time course of incubation indicate a new mechanism for patulin-induced nucleoplasmic bridge formation. We hypothized a mechanism via cross-linking of DNA, which was confirmed by a modified version of comet assay. Incubations of cells with patulin led to an increased number of multinucleated cells and multipolar mitoses. Cell cytometry revealed a G2 arrest by patulin, which might explain the amplification of centrosomes and patulin-induced aneuploidy. Patulin cause a dose-dependent DNA damage in comet assay which was influenced by the cellular GSH content. However, an induction of oxidative stress was just seen with higher concentrations of patulin. Levels of cellular glutathione were increased after 24 h incubation indicating an adaptive response to patulin-induced stress. There is growing interest in polyphenols such as resveratrol which have shown many positive effects on human health. The beneficial properties are partially attributed to their ability to scavenge reactive oxygen species. Co-incubation of V79 cells with patulin and 10 µM of the antioxidant resveratrol led to a slight reduction of micronucleus frequency compared to cells which were just treated with patulin. However, in higher concentrations resveratrol themselves caused the formation of micronuclei in V79 cells. Kinetochore analysis indicated only clastogenic properties for resveratrol but no disturbance of mitosis. The antioxidant properties of resveratrol were shown in ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay. However, in cellular system resveratrol in higher concentrations revealed also prooxidative properties, as shown in 2,7-dichlordihydrofluorescein (DCF) assay. The increased level of glutathione after resveratrol treatment might reflect an adaptive response to resveratrol-induced oxidative stress. For the second part of this thesis we investigated the effects of an anthocyanin-rich grape extract on hypertensive Ren-2 rats. Ren-2 rats are an accepted genetically modified rat model for the investigation of hypertension and increased oxidative stress. We divided 23 female Ren-2 rats into three groups. One group was fed with an anthocyanin-rich Dacapo grape extract, one group was treated with the angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor ramipril and the third group was kept without medication during the experiment. After one week untreated group showed a clear increase in systolic and diastolic blood pressure compared to the ramipril treated rats. This was in part attenuated in the animals fed with anthocyanin-rich Dacapo grape extract. Effects on blood pressure were also reflected in an increased thirst of untreated and extract fed animals. Comet assay with cells of kidney and liver revealed a slight protective impact of Dacapo extract on DNA damage compared to the other groups. Similar results were obtained after evaluation of ɣ-H2AX-staining of kidney and heart sections. However, in the small intestine oppositional effects were seen, indicating an increased number of double strand breaks probably due to the high local concentration of polyphenols after oral ingestion. Antioxidative properties of the extract were shown in FRAP assay. However, this effect was not reflected in an increased antioxidative capacity in serum or a protective impact in the dihydroethidium (DHE) assay. The extract showed protective effects on DNA damage in comet assay and ɣ-H2AX-staining, but was not able to reduce hypertension back to the control level of ramipril treated animals. High local concentrations could also result in an increased damage of the affected tissue. Therefore, the administration of such concentrated compounds should be handled with care.
N2  - Krebs ist eine der häufigsten weltweiten Todesursachen. Fehlernährung und Kontaminationen der Nahrungsmittel mit Toxinen wie Schimmelpilzgift tragen zu einem hohen Prozentsatz zu Krebserkrankungen bei. Allerdings enthält die Nahrung neben Mutagenen auch Bestandteile, die dazu beitragen das Krebsrisiko zu senken. Schäden am Genom können durch Nahrungsbestandteile über verschiedene Mechanismen, wie zum Beispiel das Abfangen von freien Radikalen reduziert werden. Im ersten Teil dieser Studie haben wir versucht die Effekte von Patulin und Resveratrol auf die DNA Stabilität von V79 Zellen zu untersuchen. Patulin ist ein Schimmelpilztoxin, welches häufig in verfaulten Äpfeln und anderen Früchten gefunden wird. Die WHO hat einen Grenzwert von 50 µg/L festgelegt, der jedoch nicht von allen Herstellern eingehalten wird. Die akute Giftwirkung von Patulin in hohen Dosen ist gut bekannt, wohingegen seine potentielle Kanzerogenität immer noch umstritten ist. Daher wollten wir weitere Schritte der Patulin induzierten Genotoxizität aufdecken. Patulin führte zu einer dosisabhängigen Bildung von Mikrokernen und Nucleoplasmic Bridges. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Patulin sowohl kinetochor-positive wie auch kinetochor-negative Mikrokerne verursacht. Bei der Analyse des Zeitverlaufs einer Patulininkubation deutete sich ein neuer Mechanismus für die Patulin induzierte Bildung von Nucleoplasmic Bridges an. Wir haben die Hypothese einer Quervernetzung von DNA-Strängen aufgestellt, die durch eine modifizierte Version des Comet Assays bestätigt wurde. Die Inkubation mit Patulin führte zudem zu einer erhöhten Anzahl von vielkernigen Zellen und multipolaren Mitosen. Mittels Durchflusszytometrie konnten wir einen durch Patulin verursachten G2 Arrest nachweisen, der die Amplifikation von Centrosomen und die Patulin induzierte Aneuploidie erklären könnte. Patulin verursachte einen dosisabhängigen Schaden im Comet Assay, der durch den zellulären Glutathiongehalt beeinflusst ist. Eine Auslösung von oxidativem Stress wurde dagegen erst bei höheren Konzentrationen an Patulin beobachtet. Der zelluläre Gluathiongehalt war nach 24 h Inkubationszeit erhöht, was auf eine adaptive Antwort auf den durch Patulin verursachten zellulären Stress hindeutet. Polyphenole wie Resveratrol gewinnen zunehmend an Bedeutung, da zahlreiche positive Effekte auf die menschliche Gesundheit bewiesen wurden. Diese vorteilhaften Eigenschaften werden zum Teil ihrer Eigenschaft als Radikalfänger zugeschrieben. Die Co-Inkubation von V79 Zellen mit Patulin und Resveratrol führte zu einer leichten Reduktion der Mikrokernfrequenz im Vergleich zu Zellen, die nur mit Patulin inkubiert wurden. Allerdings löste Resveratrol in höheren Konzentrationen selbst die Bildung von Mikrokernen aus. Die Kinetochor-Analyse zeigte für Resveratrol clastogene Eigenschaften aber keine störende Effekte auf den Ablauf der Mitose. Die antioxidativen Eigenschaften von Resveratrol wurden im FRAP (ferric reducing antioxidant power) -Assay nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurden im zellulären System mittels DCF (2,7-Dichlordihydro-fluorescein) -Assay in höheren Konzentrationen auch prooxidative Eigenschaften festgestellt. Der erhöhte zelluläre Glutathionspiegel nach Resveratrol-Behandlung könnte dabei auf eine adaptive Anwort auf den durch Resveratrol ausgelösten oxidativen Stress hindeuten Im zweiten Teil dieser Doktorabeit haben wir die Effekte eines anthocyanreichen Traubenextrakts auf hypertensive Ren-2 Ratten untersucht. Ren-2 Ratten sind ein anerkanntes genetisch modifiziertes Rattenmodell zur Untersuchung von Bluthochdruck und erhöhtem oxidativem Stress. Wir haben 23 weibliche Ren-2 Ratten in 3 Gruppen geteilt. Eine Gruppe wurde mit einem anthocyan-reichen Dacapo Traubenextrakt gefüttert, eine Gruppe wurde mit dem ACE (angiotensin converting enzyme) Inhibitor Ramipril behandelt und eine dritte Gruppe wurde während dem Experiment nicht medikamentös behandelt. Nach einer Woche zeigte die nicht therapierte Gruppe einen deutlichen Anstieg des systolischen und diastolischen Blutdrucks. Dieser Anstieg war bei der mit anthocyanreichem Dacapo Traubenextrakt gefütterten Gruppe abgeschwächt. Die Effekte auf den Blutdruck spiegelten sich auch in einer erhöhten Trinkmenge der unbehandelten und mit Extrakt behandelten Tiere wider. Ein Comet Assay mit Nieren- und Leberzellen zeigte einen schwachen schützenden Einfluß des Dacapoextrakts auf den DNA Schaden im Vergleich zu den anderen Behandlungsgruppen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei der Auswertung der ɣ-H2AX Färbung in Nieren- und Herzschnitten erzielt. Im Dünndarm wurden dagegen gegensätzliche Effekte beobachtet, die auf eine erhöhte Doppelstrangfrequenz durch die hohe lokale Konzentration an Polyphenolen nach oraler Aufnahme hindeuten. Die antioxidative Eigenschaften des Extrakts wurden im FRAP_Assay nachgewiesen. Diese Effekte spiegelten sich jedoch nicht in einer erhöhten antioxidativen Kapazität des Serums oder einem schützenden Effekt im DHE-Assay wider. Der Extrakt zeigte schützende Eigenschaften im Comet Assay und in der ɣ-H2AX-Färbung, war aber nicht in der Lage den Bluthochdruck auf das Kontrollniveau der Ramipril-behandelten Tiere herabzusenken. Hohe lokale Konzentrationen können auch zu einem erhöhten Schaden des betroffenen Gewebes führen. Daher sollte die Anwendung solcher hochkonzentrierter Präparate mit Vorsicht bedacht werden.
KW  - Patulin
KW  - Anthocyane
KW  - Resveratrol
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Mutagenität
KW  - Genotoxizität
KW  - Patulin
KW  - anthocyanins
KW  - resveratrol
KW  - genotoxicity
KW  - oxidative stress
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72872
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hansjakob, Anton
T1  - The role of cuticular waxes in the prepenetration processes of Blumeria graminis f.sp. hordei
T1  - Der Einfluss kutikulärer Wachse auf die Präpenetrationsprozesse von Blumeria graminis f.sp. hordei
N2  - Der obligat biotrophe Pilz Blumeria graminis f.sp. hordei gilt als Erreger des Gerstenmehltaus, einer destruktiven Erkrankung der Gerste (Hordeum vulgare). Als Folge des Befalls mit B. graminis f.sp. hordei drohen erhebliche Ernteeinbußen. Das kutikuläre Wachs von Gerstenblättern besteht hauptsächlich aus primären Alkoholen (80%), Alkylestern (10%) sowie aus geringfügig vorkommenden Bestandteilen wie Fettsäuren (2%), Alkanen (2%) und Aldehyden (1%). Der initiale Kontakt der asexuellen und durch die Luft verbreiteten Konidien findet auf der Blattoberfläche in einer Umgebung statt, die von den kutikulären Wachsen bestimmt ist, welche Keimung und Differenzierung stimulieren. Während der Keimungs- und Differenzierungsphase durchlaufen die Konidien eine sequenzielle Morphogenese, die so genannten Präpenetrationsprozesse. Dabei bilden die Konidien auf der Pflanzenoberfläche zunächst einen primären, kurzen und im weiteren Verlauf einen sekundären, elongierten Keimschlauch aus. Im Anschluss daran schwillt dieser an und wird letztlich zu einem septierten Appressorium differenziert. Mit Hilfe des Appressoriums dringt der Pilz dann in die Epidermiszelle der Wirtspflanze ein und bildet ein initiales Haustorium, das die Ernährung des Pilzes sicherstellt. Um den Einfluss von einzelnen Wachsbestandteilen der Wirtspflanze auf die Präpenetrationsprozesse systematisch zu untersuchen wurde ein neues in vitro System auf der Basis von Formvar®-Harz etabliert. Dieses System ermöglicht die Erzeugung homogener Oberflächen als Substrate für den Pilz, bei denen sowohl die aufgelagerten Mengen als auch die Oberflächenhydrophobizität unabhängig von den getesteten Substanzklassen und Kettenlängen der Moleküle hochgradig reproduzierbar sind. In diesem System haben langkettige Aldehyde die Keimung und die Differenzierung von B. graminis f.sp. hordei Konidien am wirksamsten induziert, wobei die Raten der Appressorienbildung in Abhängigkeit von der Konzentration und der Kettenlänge im Vergleich zu n-Hexacosanal (C26), das sich als am effektivsten zeigte, abnahmen (C22<<C24<C26>C28>>C30). Die getesteten gerad- und ungeradzahligen Alkane (C24-C33), Fettsäuren (C20-C28), Alkylester (C40-C44) und primären Alkohole (C20-C30) hatten keinen signifikanten Einfluss auf die Keimung und die Appressorienbildung des Pilzes. Der primäre Alkohol n-Hexacosanol (C26) stellte hierbei eine Ausnahme dar, da er die Keimung und die Bildung des Appressorium-Keimschlauchs signifikant erhöhte. Um die Rolle von langkettigen Aldehyden auf einer intakten Pflanzenoberfläche in vivo genauer zu untersuchen wurden B. graminis f.sp. hordei Konidien auf Blätter von glossy11 Mutanten der Nicht-Wirtspflanze Mais (Zea mays) inokuliert. Anders als der Wildtyp weisen glossy11 Blätter keine langkettigen Aldehyde auf. Auf glossy11 Blättern keimten 60% der B. graminis f.sp. hordei Konidien nicht und nur 10% der Konidien entwickelten ein reifes Appressorium, was einer dreimal geringeren Rate als auf Wildtyp-Blättern entspricht. Durch das Besprühen von glossy11 Blätter mit synthetischem n-Hexacosanal oder mit Wachs des Wildtyps wurden die pilzlichen Präpenetrationsprozesse wieder vollständig durchlaufen. Wurden im Gegensatz dazu Blätter des Mais-Wildtyps mit nicht induzierenden n-Alkanen, primären Alkoholen oder langkettigen Fettsäuren besprüht, konnte das den Aldehyd-defizienten Phänotyp von glossy11 imitieren. Während der Präpenetrationsprozesse wird ein Appressorium gebildet, wobei es sich hierbei um eine neu gebildete Zelle handelt. Die Keimung und die anschließende Morphogenese sind wichtige Schritte in der Etablierung der pilzlichen Infektionsstrukturen. Da diese Prozesse in einigen phytopathogenen Pilzen mit dem Zellzyklus gekoppelt sind wurde untersucht, inwieweit die Präpenetrationsprozesse von B. graminis f.sp. hordei mit dem Verlauf des Zellzykluses synchronisiert sind. Hierfür wurde eine Methode basierend auf DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) zur Färbung der Zellkerne für fixierte Präparate von B. graminis f.sp. hordei Konidien entwickelt. Mittels eines pharmakologischen Ansatzes war es auf diese Weise erstmals möglich die Abhängigkeit der Präpenetrationsprozesse von der Mitose in vivo und in vitro zu verfolgen. Sechs Stunden nach der Inokulation trat nach Ausbildung des Appressorium-Keimschlauchs eine Mitose in der einkernigen Konidie auf. Die Hemmung der S-Phase mit Hydroxyharnstoff oder die Hemmung der M-Phase mit Benomyl verhinderten eine Bildung des Appressoriums, nicht aber die Entwicklung des Appressorium-Keimschlauchs. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Mitose und eine abgeschlossene Zytokinese notwendige Voraussetzungen für die Appressoriumsbildung, jedoch nicht für die Morphogenese der Konidie, sind. Als Reaktion auf bestimmte Wachsbestandteile der Wirtspflanze werden pilzliche Gene, die während der Präpenetrationsprozesse eine wichtige Rolle spielen können, differenziell exprimiert. Um solche Gene zu identifizieren wurden cDNA Klonbibliotheken mittels der suppression subtractive hybridization (SSH) 22 Minuten nach der Inokulation erstellt. Das auf Formvar®-Harz basierende in vitro System ermöglichte die selektive Anreicherung von cDNA Sequenzen aus B. graminis f.sp. hordei Konidien, die auf n-Hexacosanal beschichteten Oberflächen inokuliert wurden. Aus einer Reihe von Kandidaten wurde eine cDNA-Sequenz identifiziert, die sowohl auf Gerstenblättern als auch auf mit n-Hexacosanal oder extrahiertem Gerstenwachs beschichteten Oberflächen hochreguliert war. Mittels 3’ und 5’ RACE wurde das n-Hexacosanal induzierte Transkript kloniert. Diese cDNA-Sequenz wies keine Homologien zu bekannten Genen, die Funktionen in der pilzlichen Entwicklung und der Ausbildung von Pathogenität in Pflanzen haben, auf.
N2  - The obligate biotrophic fungus Blumeria graminis f.sp. hordei is the causative agent of barley powdery mildew, a destructive foliar disease. The fungus infests barley (Hordeum vulgare), an important crop plant, which causes remarkable yield losses. Leaf cuticular wax of barley consists mainly of primary alcohols (80%), alkyl esters (10%) and minor constituents such as fatty acids (2%), alkanes (2%) and aldehydes (1%). The asexual airborne conidia have an initial contact to the leaf surface, in an environment dominated by cuticular waxes, which trigger germination and differentiation. The conidia undergo a sequential morphogenesis during that phase, the so-called prepenetration processes. The conidium initially forms a short primary germ tube, followed by a secondary elongated germ tube, which swells and finally forms a septate appressorium. The fungal appressorium infests the epidermal cell of the host plant and establishes an initial haustorium, the feeding structure of the fungus. In order to assess the effects of single host plant wax constituents on the prepenetration processes a novel in vitro assay based on Formvar® resin was established. This system permits the setting up of homogeneous surfaces as substrata, at which the adsorbed amounts and the surface hydrophobicity are highly reproducible, independently of the tested substance classes and chain lengths of the molecules. In this system, very-long-chain aldehydes promoted germination and differentiation of B. graminis f.sp. hordei conidia. The appressorium formation rates were decreasing in a concentration and chain-length dependent manner compared to n-hexacosanal (C26), which was the most effective aldehyde (C22<<C24<C26>C28>>C30). The tested alkanes with even and odd numbers (C24-C33), fatty acids (C20-C28), alkyl esters (C40-C44) and primary alcohols (C20-C30) did not induce germination and appressorium formation. The primary alcohol n-hexacosanol (C26) was an exception, as it was capable of significantly stimulating conidial germination and appressorial germ tube formation. To elucidate the impact of very-long-chain aldehydes on an intact plant surface in vivo, B. graminis f.sp. hordei conidia were inoculated on glossy11 mutant leaves of the non-host plant maize (Zea mays), which are - unlike the wildtype - completely devoid of very-long-chain aldehydes. On glossy11 leaves 60% of B. graminis f.sp. hordei conidia remained ungerminated and 10% developed a mature appressorium, which is three times less than on wildtype plants. Spraying of synthetic n-hexacosanal or wildtype leaf wax on glossy11 leaves fully restored the fungal prepenetration processes. In contrast, spraying of non-inducing n-alkanes, primary alcohols or very-long-chain fatty acids on wildtype leaves of maize mimicked the aldehyde deficient phenotype of glossy11. During the prepenetration processes an appressorium is formed, which is a newly formed specialized cell. Germination and subsequent morphogenesis are linked to the cell cycle in certain phytopathogenic fungi. It was investigated to what extent the prepenetration processes of B. graminis f.sp. hordei are synchronized with cell cycle progression. Hence, a distinct staining procedure of nuclei for fixed samples of B. graminis f.sp. hordei conidia based on DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) was developed. In combination with a pharmacological approach it was possible to trace mitosis in dependency of conidial germination and differentiation in vivo and in vitro. The uninucleate conidium germinated and after formation of the appressorial germ tube, a single mitosis occurred in the primordial conidium six hours after inoculation. The inhibition of S-phase with hydroxyurea or M-phase with benomyl prevented appressorium formation, but not the development of the appressorial germ tube. These results indicate that mitosis and a successful cytokinesis are necessary prerequisites for the appressorium formation but not for conidial morphogenesis. In order to identify genes that are expressed in response to certain host plant wax constituents, which may be critical for the prepenetration phase, cDNA clone libraries were constructed by suppression subtractive hybridization (SSH) after inoculation. The Formvar® resin based in vitro system provided a stable platform to enrich cDNA sequences that were expressed in B.graminis f.sp. hordei conidia incubated on n-hexacosanal coated surfaces for 22 minutes. Among various candidates, a cDNA sequence was identified, which was upregulated on barley leaves and on surfaces coated with n-hexacosanal or extracted barley leaf wax. The hexacosanal responsive transcript was cloned by 3’ and 5’ RACE. The cDNA sequence showed no homologies to genes of known function in fungal development and fungal pathogenicity in plants.
KW  - .
KW  - Gerste
KW  - Erysiphe graminis
KW  - Aldehyde
KW  - Kutikularwachs
KW  - barley
KW  - Blumeria graminis
KW  - very-long-chain aldehydes
KW  - wax
KW  - glossy11
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72840
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schwarz-Erfurth, Maren
T1  - Beschreibung und epidemiologische Untersuchungen eines Malariakontrollprogramms auf Flores, Indonesien
T1  - Description and epidemiological investigations of a malaria control programme in Flores, Indonesia
N2  - In den Jahren 1998 bis 2004 wurden auf der Insel Flores (Indonesien) vereinzelt klinische und laborchemische Untersuchungen auf Malaria bei Kindern und Jugendlichen durchgeführt, dabei wurde eine Malariaprävalenz zwischen 59 % und 81 % festgestellt. Vor diesem Hintergrund entstand aus der Kooperation der lokalen Stiftung YASPEM, dem Missionsärztlichen Institut Würzburg und Misereor e.V. ein groß angelegtes Malariakontrollprogramm, das im Herbst 2007 seine Arbeit aufnahm. Ziel des Programms war es, die Malariaprävalenz erneut zu überprüfen und diese durch ein umfassendes Konzept mit Aufklärungskampagnen, flächendeckenden Blutuntersuchungen, medizinischer Behandlung und Vektorkontrollmaßnahmen nachhaltig zu senken. Ziel dieser Dissertation ist dabei, eine Evaluation der gewonnenen Daten durchzuführen und anhand dieser Handlungsempfehlungen für Folgeprojekte herauszuarbeiten. In der Evaluation zeigte sich, dass die tatsächliche Prävalenz weit unter den zuvor angegebenen Raten lag: Im Dorf Waiara war die Prävalenz mit 13,2 % am höchsten, in den übrigen untersuchten Dörfern (Namang Kewa, Geliting, Kopong, Iantena, Umagera) lag sie zwischen 1,2 % und 3,5 %. Zurückzuführen ist diese Diskrepanz auf verschieden Ursachen. Zum einen wird die Diagnose „Malaria“ häufig klinisch gestellt, es subsummieren sich viele andere fieberhafte Erkrankungen unter dieser Diagnose. Des Weiteren zeigte sich eine hohe Rate an falsch positiven Befunden des Labors des lokalen Krankenhauses im Vergleich zu den Laborergebnissen des Malariakontrollprogramms. In der weiteren Evaluation konnten geographische, demographische und jahreszeitliche Schwerpunkte für die Malariaarbeit auf Flores herausgearbeitet werden: •Es gab eine signifikante Häufung der Malariafälle in geographisch besonders prädestinierten Gebieten. •Zudem waren signifikant mehr Kinder und Jugendliche von Malaria betroffen als Erwachsene. •Die Malariainfektionen traten vornehmlich in der Regenzeit auf, in der Trockenzeit sank die Prävalenz in allen untersuchten Gebieten ab. Durch das umfassende Malariakontrollprogramm konnte in stark betroffenen Regionen ein Erfolg im Sinne eines signifikanten Rückgangs der Prävalenz verzeichnet werden.
N2  - In the years 1998 to 2004, on the island of Flores (Indonesia), isolated clinical and laboratory studies on malaria in children and adolescents were performed. Thereby, a malaria prevalence between 59% and 81 % was found. Against this background, a cooperation of the local YASPEM Foundation, the Medical Mission Institute Würzburg and Misereor e. V. was established and a large-scale malaria control program was brought into being. The program started in autumn 2007 at the beginning of the rainy season. The program's objective was to reassess the prevalence of malaria and to reduce malaria infections using a comprehensive approach, including education campaigns, mass blood tests, medical treatment and vector control measures. The aim of this thesis is to conduct an evaluation of the data and to work out recommendations for future malaria projects. The evaluation showed that the actual malaria prevalence was much lower than detected before. In the village Waiara the prevalence was the highest with 13.2%; in the other villages surveyed (Namang Kewa, Geliting, Kopong, Iantena, Umagera) it ranged between 1.2% and 3.5%. This discrepancy has a variety of reasons. First, malaria is often diagnosed clinically without further testing. There are many other feverish diseases subsumed under this diagnosis. In addition, the laboratory of the local hospital showed a high rate of false positive results compared to the laboratory of the malaria control program. Furthermore, it could be shown that the malaria work on Flores was focused differently, according to geographical, demographic and seasonal conditions. •There was a significant accumulation of cases of malaria in geographically very predestined areas. •Significantly more children and adolescents were affected by malaria compared to adults. •Malaria infections occurred mainly in the rainy season, in the dry season the prevalence decreased. In summary, the comprehensive malaria control program could decline malaria prevalence significantly in certain areas and is therefore a success.
KW  - Malaria
KW  - Flores <Indonesien>
KW  - Vektor <Epidemiologie>
KW  - Malaria tropica
KW  - Indonesien
KW  - Malaria tropica
KW  - Flores
KW  - Indonesia
KW  - Vector control
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72669
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wippel, Carolin
T1  - Alterations of brain dendrite and synapse structure by the Streptococcus pneumoniae neurotoxin pneumolysin - Insights and pharmacological modulation
T1  - Morphologische Veränderungen von Dendriten und Synapsen durch das Neurotoxin Pneumolysin - Einblicke und pharmakologischer Ansatz
N2  - Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus) is one of the leading causes of childhood meningitis,pneumonia and sepsis. Despite the availability of childhood vaccination programs and antimicrobial agents, childhood pneumococcal meningitis is still a devastating illness with mortality rates among the highest of any cause of bacterial meningitis. Especially in low-income countries, where medical care is less accessible, mortality rates up to 50 % have been reported. In surviving patients, neurological sequelae, including hearing loss, focal neurological deficits and cognitive impairment, is reported in 30 to 50 %. Growing resistance of pneumococci towards conventional antibiotics emphasize the need for effective therapies and development of effective vaccines against Streptococcus pneumoniae. One major virulence factor of Streptococcus pneumoniae is the protein toxin Pneumolysin (PLY). PLY belongs to a family of structurally related toxins, the so-called cholesterol-dependent cytolysins (CDCs). Pneumolysin is produced by almost all clinical isolates of the bacterium. It is expressed during the late log phase of bacterial growth and gets released mainly through spontaneous autolysis of the bacterial cell. After binding to cholesterol in the host cell membranes, oligomerization of up to 50 toxin monomers and rearrangement of the protein structure, PLY forms large pores, leading to cell lysis in higher toxin concentrations. At sub-lytic concentrations, however, PLY mediates several other effects, such as activation of the classic complement pathway and the induction of apoptosis. First experiments with pneumococcal strains, deficient in pneumolysin, showed a reduced virulence of the organism, which emphasizes the contribution of this toxin to the course of bacterial meningitis and the urgent need for the understanding of the multiple mechanisms leading to invasive pneumococcal disease. The aim of this thesis was to shed light on the contribution of pneumolysin to the course of the disease as well as to the mental illness patients are suffering from after recovery from pneumococcal meningitis. Therefore, we firstly investigated the effects of sub-lytic pneumolysin concentrations onto primary mouse neurons, transfected with a GFP construct and imaged with the help of laser scanning confocal microscopy. We discovered two major morphological changes in the dendrites of primary mouse neurons: The formation of focal swellings along the dendrites (so-called varicosities) and the reduction of dendritic spines. To study these effects in a more complex system, closer to the in vivo situation, we established a reproducible method for acute brain slice culturing. With the help of this culturing method, we were able to discover the same morphological changes in dendrites upon challenge with sub-lytic concentrations of pneumolysin. We were able to reverse the seen alterations in dendritic structure with the help of two antagonists of the NMDA receptor, connecting the toxin´s mode of action to a non-physiological stimulation of this subtype of glutamate receptors. The loss of dendritic spines (representing the postsynapse) in our brain slice model could be verified with the help of brain slices from adult mice, suffering from pneumococcal meningitis. By immunohistochemical staining with an antibody against synapsin I, serving as a presynaptic marker, we were able to identify a reduction of synapsin I in the cortex of mice, infected with a pneumococcal strain which is capable of producing pneumolysin. The reduction of synapsin I was higher in these brain slices compared to mice infected with a pneumococcal strain which is not capable of producing pneumolysin, illustrating a clear role for the toxin in the reduction of dendritic spines. The fact that the seen effects weren´t abolished under calcium free conditions clarifies that not only the influx of calcium through the pneumolysin-pore is responsible for the alterations. These findings were further supported by calcium imaging experiments, where an inhibitor of the NMDA receptor was capable of delaying the time point, when the maximum of calcium influx upon PLY challenge was reached. Additionally, we were able to observe the dendritic beadings with the help of immunohistochemistry with an antibody against MAP2, a neuron-specific cytoskeletal protein. These observations also connect pneumolysin´s mode of action to excitotoxicity, as several studies mention the aggregation of MAP2 in dendritic beadings in response to excitotoxic stimuli. All in all, this is the first study connecting pneumolysin to excitotoxic events, which might be a novel chance to tie in other options of treatment for patients suffering from pneumococcal meningitis.
N2  - Streptococcus pneumoniae ist einer der Hauptauslöser für bakterielle Meningitis, Lungenentzündung und Sepsis. Ungeachtet der Tatsache, dass es heutzutage viele Impfprogramme zur Prävention, sowie Antibiotika zur Behandlung gibt, ist die bakterielle Meningitis im Kindesalter, ausgelöst durch S. pneumoniae, immer noch eine ernstzunehmende Krankheit mit Sterberaten von bis zu 50 %. Bei 30 bis 50 % der Patienten, die die Krankheit überstehen, bleiben teilweise schwere neurologische Störungen zurück. Die steigende Resistenz des Erregers gegenüber herkömmlichen Antibiotika macht zudem die Dringlichkeit zur Entwicklung effektiver Therapieansätze deutlich. Ein Hauptpathogenitätsfaktor von Streptococcus pneumoniae ist das Proteintoxin Pneumolysin (PLY). PLY gehört zu einer Familie strukturell verwandter Toxine; die sogenannten cholesterinabhängigen Cytolysine (CDCs). Das Toxin wird hauptsächlich nach spontaner Autolyse des Bakteriums freigesetzt. Nach Bindung des Proteins an das Cholesterin in den Zellmembranen des Wirtsorganismus, Oligomerisierung von bis zu 50 Toxinmonomeren und Umordnung der Proteinstruktur, bildet das Toxin Poren in der Zellmembran, die in höheren Konzentrationen von PLY zur Zelllyse führen. In niedrigeren Konzentrationen löst das Toxin jedoch verschiedene andere Prozesse, darunter Apoptose und Aktivierung des Komplementsystems, aus. Erste Experimente, die mit einem mutierten Pneumokokkenstamm (unfähig, Pneumolysin zu exprimieren) durchgeführt wurden, konnten eine reduzierte Virulez des Erregers zeigen, was die Beteiligung des Toxins am Verlauf der Krankheit verdeutlicht. Ziel vorliegender Arbeit war, die Beteiligung von Pneumolysin sowohl am Verlauf der bakteriellen Meningitis, hervorgerufen durch Pneumolysin, zu erforschen, als auch dessen Beteiligung an der Entstehung von neurologischen Störungen, wie sie auch nach Rehabilitation von einer Meningitis noch bestehen können. Dafür wurden zuerst die Effekte von sublytischen Konzentrationen des Toxins auf primäre Mausneuronen (transfiziert mit GFP und mit Hilfe eines Konfokalmikroskopes aufgenommen) erfasst. Dabei zeigten sich hauptsächlich zwei morphologische Veränderungen in den Dendriten der mikroskopierten Neurone: Die Entstehung von fokalen Schwellungen der Dendriten (sogenannte „varicosities“) sowie eine Verminderung der Anzahl von dendritischen Dornfortsätzen (sogenannte „dendritic spines“). Um diese Effekte in einem komplexeren System näher untersuchen zu können, entwickelten wir eine reproduzierbare Methode um akute Gehirnschnitte über längere Zeit kultivieren zu können. Mithilfe dieser Methode konnten wir die Veränderungen, die wir schon in der Primärkultur beobachteten, ebenso nachweisen. Die Entwicklung der fokalen Schwellungen der Dendriten konnten mithilfe zweier Antagonisten des NMDA Rezeptors rückgängig gemacht werden, wodurch erstmals eine Verbindung der Effekte mit einer Aktivierung von Glutamatrezeptoren aufgezeigt wurde. Die Verminderung der Anzahl dendritischer Dornfortsätze im Gehirnschnittmodell wurde untermauert von den Ergebnissen, die wir durch Gehirnschnitte von Mäusen, die tatsächlich an pneumokokkaler Meningitis erkrankt waren, erlangen konnten. Durch immunohistologische Färbungen mit einem Antikörper gegen Synapsin I (ein präsynaptisches Protein) konnten wir eine Reduktion dieses Proteins im Cortex erkrankter Mäuse nachweisen. Die Tatsache, dass die morphologischen Veränderungen der Dendriten ebenfalls in calciumfreiem Puffer beobachtet werden konnten, macht deutlich, dass nicht nur der Calciuminflux durch die Pneumolysinpore verantwortlich ist für dessen Neurotoxizität. Diese These wird untermauert durch die Ergebnisse, die wir mithilfe der Calciummikroskopie erhielten: Die Applikation eines Antagonisten des NMDA Rezeptors konnte den Zeitpunkt des maximalen Calciuminfluxes in die Zelle nach Behandlung mit Pneumolysin hinauszögern. Zudem konnten wir die Schwellungen in den Dendriten auch durch einen Antikörper gegen MAP2 (ein neuronenspezifisches Protein des Zytoskeletts) darstellen, was ebenfalls eine Verbindung von Pneumolysin zu „excitotoxicity“ (Toxizität aufgrund einer Übererregung von Glutamatrezeptoren) darstellt, da verschiedene Studien die Aggregation von MAP2 in fokalen dendritischen Schwellungen als Reaktion auf die Einwirkung von „excitotoxischen“ Stimuli nachweisen konnten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies die erste Studie ist, die Pneumolysin in Zusammenhang mit einer Überaktivierung von Glutamatrezeptoren bringt, was eine komplett neue Sichtweise darstellt und eventuell neue Möglichkeiten der Therapie für Patienten, die an dieser Form der bakteriellen Hirnhautentzündung leiden, eröffnet.
KW  - Nervenzelle
KW  - Nervennetz
KW  - Bakterien
KW  - Bakterielle Hirnhautentzündung
KW  - Bakteriengift
KW  - Bacterial meningitis
KW  - Pneumolysin
KW  - Excitotoxicity
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72016
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hubertus, Katharina
T1  - Regulation des cAMP Spiegel und der Signaltransduktion in humanen Thrombozyten durch Prostanoid-Rezeptoren
T1  - Regulation of cAMP level and signaltransduction in human platelets by prostanoid-receptors
N2  - Prostanoide wirken über Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten. In dieser Arbeit wurde die Existenz und Funktionsweise der Prostanoid-Rezeptoren anhand synthetischer Agonisten und Antagonisten in humanen Thrombozyten nachgewiesen. Weiter wurde untersucht, über welche Prostanoid-Rezeptoren die Signaltransduktion der natürlichen Agonisten wie PGE2, PGE1 und PGA1 vermittelt wird, sowie das Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten gezeigt. Das Vorhandensein der Prostaglandin E2 Synthase 3 wurde nachgewiesen sowie erste Anhaltspunkte für die Existenz eines Komplexes aus Prostaglandin E2 Synthase 3, Hitzeschockprotein-90 sowie Casein Kinase 2 gezeigt.
N2  - Prostanoids act to platelet activation or inhibition via prostanoid-receptors. In this work, the existence and function of prostanoid receptors in human platelets was shown by using sythetic agonists and antagonists. Further, the prostanoid receptors taking part at the signaltransduction induced by endogen prostanoids like PGE2, PGE1 and PGA1 were examinated. The interactions of the prostanoid receptors in platelet activation and inhibition were shown. The existence of prostaglandin E2 synthase 3 in human platelets was shown and first evidence for a complexe of prostaglandin E2 synthase 3, heat shock protein 90 and casein kinase 2 was given.
KW  - Prostaglandine
KW  - Rezeptor
KW  - Cyclo-AMP
KW  - Prostanoid-Rezeptor
KW  - cAMP
KW  - Prostanoide
KW  - Thrombozyt
KW  - prostanoid receptor
KW  - platelets
KW  - cAMP
KW  - prostanoids
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71996
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rathod, Reenaben Jagdishbhai
T1  - Study of local protein synthesis in growth cones of embryonic mouse motor neurons
T1  - Analyse der lokalen Proteinsynthese in Wachstumskegeln von embryonalen Maus Motoneuronen
N2  - In cultured motoneurons of a mouse model for the motoneuron disease spinal muscular atrophy (SMA), reduced levels of the protein SMN (survival of motoneurons) cause defects in axonal growth. This correlates with reduced β-actin mRNA and protein in growth cones, indicating that anterograde transport and local translation of β-actin mRNA are crucial for motoneuron function. However, direct evidence that indeed local translation is a physiological phenomenon in growth cones of motoneurons was missing. Here, a lentiviral GFP-based reporter construct was established to monitor local protein synthesis of β-actin mRNA. Time-lapse imaging of fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) in living motoneurons revealed that β-actin is locally translated in the growth cones of embryonic motoneurons. Interestingly, local translation of the β-actin reporter construct was differentially regulated by different laminin isoforms, indicating that laminins provide extracellular cues for the regulation of local translation in growth cones. Notably, local translation of β-actin mRNA was deregulated when motoneurons of a mouse model for type I SMA (Smn-/-; SMN2) were analyzed. In situ hybridization revealed reduced levels of β-actin mRNA in the axons of Smn-/-; SMN2 motoneurons. The distribution of the β-actin mRNA was not modified by different laminin isoforms as revealed by in situ hybridization against the mRNA of the eGFP encoding element of the β-actin reporter. In case of the mRNA of α-actin and γ-actin isoforms, the endogenous mRNA did not localize to the axons and the localization pattern was not affected by the SMN levels expressed in the cell. Taken together our findings suggest that regulation of local translation of β-actin in growth cones of motoneurons critically depends on laminin signaling and the amount of SMN protein. Embryonic stem cell (ESC)-derived motoneurons are an excellent in vitro system to sort out biochemical and cellular pathways which are defective in neurodegenerative diseases like SMA. Here, a protocol for the differentiation and antibody-mediated enrichment of ESC-derived motoneurons is presented, which was optimized during the course of this study. Notably, this study contributes the production and purification of highly active recombinant sonic hedgehog (Shh), which was needed for the efficient differentiation of mouse ESCs to motoneurons. ESC-derived motoneurons will now offer high amounts of cellular material to allow the biochemical identification of disease-relevant molecular components involved in regulated local protein synthesis in axons and growth cones of motoneurons.
N2  - In kultivierten Motoneuronen eines Maus-Models für die Motoneuronen-Erkrankung Spinale Muskelatrophie (SMA) verursachen verminderte Mengen des Proteins SMN (survival of motoneurons) Schäden im axonalen Wachstum. Dies korreliert mit einer verminderten Menge an β-Aktin kodierender mRNA und β-Aktin Protein. Dies impliziert, dass anterograder Transport und lokale Translation von β-Aktin mRNA für die Motoneuronfunktion notwendig ist. Bislang gab es jedoch keinen direkten Nachweiß funktioneller lokaler Translation in Wachstumskegeln von Motoneuronen. In dieser Arbeit wurde ein lentivirales GFP-basierendes Reporterkonstrukt etabliert, welches lokale Proteinsynthese von β-Aktin mRNA nachweißt. Zeitraffermikroskopie von GFP-vermittelter Fluoerszenzregeneration nach Fotobleichung (fluorescence recovery after photobleaching; FRAP) in lebenden Motoneuronen zeigte, dass β-Aktin in Wachstumskegeln embryonaler Motoneuronen lokal translatiert wird. Interessanterweise wurde die lokale Translation des β-Aktin Reporterkonstrukts differentiell durch verschiedene Laminin-Isoformen reguliert. Dies gibt einen Hinweis, dass Laminin als extrazelluläres Signalmolekül die Regulation der lokalen Translation in Wachstumskegeln reguliert. Die lokale Translation von β-Aktin mRNA war dereguliert wenn Motoneurone eines Mausmodels für die Typ I SMA (Smn-/-;SMN2) analysiert wurden. In situ Hybridisierung bestätigte eine Reduktion von β-Aktin mRNA in den Axonen von Smn-/-;SMN2 Motoneuronen. Die Verteilung der β-Aktin mRNA wurde von verschiedenen Laminin-Isoformen nicht beeinflusst, wie durch in situ Hybridisierung gegen eGFP kodierende Elemente des β-Aktin Reporters bestätigt werden konnte. Im Fall der mRNA für α-Aktin und γ-Aktin Isoformen wurde keine axonale Lokalisierung der endogenen mRNAs festgestellt und das Lokalisierungsmuster dieser mRNAs war durch reduzierte zelluläre SMN Mengen nicht beeinflusst. Zusammenfassend deuten diese Befunde darauf hin, dass die lokale Translation von β-Aktin in Wachstumskegeln von Motoneuronen von Laminin-Signalgebung und von der Menge an SMN Protein abhängt. Motoneurone aus embryonalen Stammzellen sind ein etabliertes in vitro System um biochemische und zelluläre Signalwege zu identifizieren, die in neurodegenerativen Erkrankungen wie SMA betroffen sind. Hier wird ein Protokoll zur Differenzierung und Antikörper-gestützten Anreicherung von Motoneuron aus embryonalen Stammzellen präsentiert, welches im Rahmen dieser Arbeit optimiert wurde. Im Besonderen wird die Herstellung und Reinigung von hochaktivem Sonic Hedgehog (Shh) vorgestellt, welches für die effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus notwendig war. Motoneurone aus embryonalen Stammzellen werden in zukünftigen Studien nun große Mengen an zellulärem Material liefern, und somit auf biochemischer Ebene die Identifizierung von krankheitsrelevanten molekularen Komponenten ermöglichen, die in der Regulation der lokalen Proteinsynthese in Axonen und Wachstumskegeln von Motoneuronen involviert sind.
KW  - Motoneuron
KW  - Maus
KW  - Embryo
KW  - Proteinsynthese
KW  - lokale Proteinsynthese
KW  - embryonale Maus
KW  - SMN
KW  - local translation
KW  - SMN
KW  - motor neuron
KW  - beta actin
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72045
ER  - 
TY  - JOUR
T1  - einBlick - Ausgabe 28 - 17. Juli 2012
N2  - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
KW  - Würzburg
KW  - Universität
KW  - University
KW  - Wuerzburg
KW  - Wurzburg
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72069
VL  - 28/2011
ER  - 
TY  - RPRT
A1  - Ratz, Christoph
A1  - Dworschak, Wolfgang
A1  - Gross, Peter
T1  - Hilfebedarf im Ambulant Betreuten Wohnen. Ein Vergleich von H.M.B.-W. und ICF-BEST. Abschlussbericht des Forschungsprojektes HAWO
N2  - Hilfebedarfserhebung und -bemessung im Bereich Ambulant betreutes Wohnen für Menschen mit geistiger und körperlicher Behinderung - Vergleich eines ICF basierten Verfahrens mit dem HMB-W
KW  - Eingliederungshilfe
KW  - ICF
KW  - Behinderung
KW  - Geistige Behinderung
KW  - Geistigbehindertenpädagogik
KW  - Körperbehinderung
KW  - Körperbehindertenpädagogik
KW  - Wohnen
KW  - ambulant betreutes Wohnen
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71919
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hancock, Christine [geb. Herbst]
T1  - Influence of land use on Plantago lanceolata L. and its higher trophic levels at different spatial scales and in three geographic regions
T1  - Einfluß von Landnutzung auf Plantago lanceolata L. und seine höheren trophischen Ebenen auf unterschiedlichen räumlichen Skalen und in drei geographischen Regionen.
N2  - Heutzutage prägen landwirtschaftlich genutzte Flächen einen großen Teil der deutschen Landschaft. Die Umwandlung von natürlichen Lebensräumen zu bewirtschaftetem Grünland beeinflusst grundlegend die Vielfalt von Pflanzen und Tieren. Zwar erhöht die intensive Nutzung dieser Flächen die Produktivität der Pflanzen oder die Biomasse als Viehfutter auf den Wiesen. Wie diese Einflüsse auf die Artenvielfalt, Ökosysteme und trophische Interaktionen, im Laufe der Jahre wirken ist jedoch immer noch nicht vollständig verstanden. Um die Funktionen der Biodiversität in einer landwirtschaftlich genutzten Fläche zu verstehen konzentrierte sich meine Arbeit auf den Einfluss der Landnutzung (Düngung, Beweidung und Mahd) auf ein Herbivor-Parasitoid-System von Plantago lanceolata. Der Spitzwegerich ist ein generalistisches Kraut mit kosmopolitischem Vorkommen. Er kann in einem sehr breiten Spektrum von Bodenverhältnissen (sowohl in nassen und auch in trockenen Lebensräumen) vorkommen und ist daher ein ideales Modellsystem zur Untersuchung tritrophischer Systeme in einem Landnutzungs-intensitätsgradienten. Die Rüsselkäfer Mecinus labilis und M. pascuorum ernähren sich von P. lanceolata und legen dort ihre Eier ab. Mesopolobus incultus ist ein generalistisch lebender Parasitoid, der verschiedenen Insektenordnungen parasitiert. Die einzigen Wirte auf P. lanceolata sind jedoch die beiden erwähnten Rüsselkäferarten. Das Ziel meiner Studie war es, den Einfluss der Landnutzung auf ein tritrophisches System und seiner umgebenden Vegetation (Struktur, Dichte und Artenreichtum) auf unterschiedlichen räumlichen Skalen wie Subplot, Plot und Landschaftebene in drei verschiedenen Regionen (Nord-, Mittel- und Süddeutschland) zu untersuchen. Ich untersuchte den Einfluss der Nutzungsintensität nicht nur korrelativ, sondern auch experimentell. Zusätzlich zielte ich darauf ab, aufzuzeigen wie die Vegetationszusammensetzung die Metabolite der Wirtspflanze verändert und ob diese Veränderungen Auswirkungen auf höhere trophische Ebenen im Feld haben.
N2  - Nowadays, agriculturally used areas form a major part of the German landscape. The conversion from natural habitats to agriculturally used grasslands fundamentally influences the diversity of plants and animals. Intensive use of these areas increases indeed the productivity of crop or biomass on meadows as food source for cattle. How these influences affect biodiversity, ecosystems and trophic interactions over years is still not understood completely. To understand biodiversity functions in an agriculturally used area my study focused on the influence of land use (fertilization, grazing and mowing) on a herbivore-parasitoid system of Plantago lanceolata. The ribwort plantain is a generalist herb of cosmopolitan distribution. It can grow in a very broad range of ground conditions (both in wet and dry habitats), which makes P. lanceolata an ideal model system for investigating tritrophic interactions in a gradient of land use intensity. The weevils Mecinus labilis and M. pascuorum feed and oviposit on P. lanceolata. Mesopolobus incultus is a generalist parasitoid that parasitizes different insect orders. However its only hosts on P. lanceolata are the two weevil species mentioned before. The intention of my study was to investigate the influence of land use on a tritrophic system and its surrounding vegetation (structure, density and species richness) at different spatial scales like subplot, plot and landscape level in three different regions (north, middle and south of Germany). I studied the influence of land use intensity not only correlative but also experimentally. Additionally I aimed to reveal how vegetation composition changes host plant metabolites and whether these changes impact higher trophic levels in the field.
KW  - Landnutzung
KW  - Spitzwegerich
KW  - Rüsselkäfer
KW  - Parasit
KW  - Herbivor-Parasitoid Interaktion
KW  - Landschaft
KW  - Land use
KW  - ribwort plantain
KW  - herbivore-parasitoid interaction
KW  - landscape
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73877
ER  - 
TY  - THES
A1  - Waltenberger, Constanze Ricarda Maria
T1  - Virtuelles Screening nach einer neuen Inhibitorklasse der Enoyl-ACP-Reduktase InhA aus Mycobacterium tuberculosis
T1  - Virtual screening for a new inhibitor class of the enoyl-ACP-reductase InhA of Mycobacterium tuberculosis
N2  - Die Zahl der Tuberkuloseerkrankungen ist in den letzten Jahrzehnten weltweit gestiegen. Da es an innovativen Antituberkulotika mangelt, werden nach wie vor Medikamente der ersten Generation eingesetzt. Das wachsende Problem sind multi-resistente und extrem-resistente Bakterienstämme, die kaum oder gar nicht auf die medikamentöse Therapie ansprechen. Charakteristisch für M. tuberculosis ist eine dicke Zellwand. Der Aufbau der Zellwand ermöglicht es dem Bakterium in den Makrophagen zu persistieren und sich dort zu vermehren. Die Zellwand ist reich an Mykolsäuren und so wenig durchlässig für Fremdstoffe. Das mykobakterielle Zellwandskelett kann man in zwei Teile unterteilen, den Zellwandkern und die äußere Lipidhülle. Die freien Lipide der äußeren Lipidhülle dienen als Signalmoleküle im Krankheitsverlauf und interkalieren mit den Mykolsäuren des Zellwandkerns. M. tuberculosis besitzt für die Fettsäurebiosynthese zwei Enzymkomplexe: Die Typ-I-Fettsäuresynthase, die auch in Säugetieren zu finden ist, produziert Fettsäuren von C16- bis C26-Kettenlänge, die dann in der Typ-II-Fettsäuresynthase (FAS-II) zu Meromykolsäuren verlängert werden. Im Synthesezyklus des FAS-II sind mehrere monofunktionale Enzyme hintereinander geschaltet. Wird eines dieser Enzyme in seiner Funktion gestört, kumulieren Zwischenprodukte und benötigte Zellwandlipide können nicht synthetisiert werden. In der Folge wird die Zellwand instabil und das Bakterium stirbt. Die mykobakterielle Lipidbiosynthese ist somit ein ideales Target für die Entwicklung neuer Antituberkulotika. Ziel dieser Arbeit war es, eine neue Inhibitorklasse des FAS-II Enzyms InhA des M. tuberculosis mittels virtuellem Screening zu finden. Für das virtuelle Screening wurden drei aufeinander aufbauende Pharmakophorhypothesen entwickelt und mit diesen zwei unabhängige Datenbanken durchsucht. Als Grundlage für die Berechnungen des virtuellen Screenings diente die PDB Röntgenkristallstruktur 2h7m mit dem Liganden 1-Cyclohexyl-N-(3,5-dichlorophenyl)-5-oxopyrrolidin-3-carboxamid. Für die Erstellung der Pharmakophorhypothesen wurden zuerst die Strukturen des Enzyms mit und ohne Ligand bezüglich ihrer Konformationsunterschiede vor allem im Bereich der Bindetasche analysiert. Als nächstes wurden die Wechselwirkungen des Liganden mit den Aminosäuren der Bindetasche und dem Cofaktor näher analysiert und die verschiedenen Wechselwirkungsarten hinsichtlich ihrer Relevanz für eine inhibitorische Aktivität beurteilt. Schließlich wurde eine Bindetaschenanalyse durchgeführt und Hotspots für unterschiedliche chemische Funktionalitäten berechnet. Für das Datenbankenscreening wurden das ZINC 'drug-like' Subset (2005) und CCGs MOE 2006 Vendor Compound 3D Collection verwendet, beides Datenbanken exklusiv kommerziell erhältlicher Verbindungen. Das ZINC 'drug-like' Subset wurde über einen für InhA individuell angepassten hierarchischen Filter numerisch reduziert. Von den verbleibenden Verbindungen wurde eine Konformerendatenbank berechnet. Die MOE 2006 Vendor Compound 3D Collection lag bereits als Konformerendatenbank vor und wurde für das Screening 'as-is' verwendet. Mit den Pharmakophorhypothesen I und II wurde das reduzierte ZINC 'drug-like' Subset gescreent. Für die Treffer wurden Fingerprints berechnet, sie danach mithilfe des Tanimotokoeffizienten nach ihrer Ähnlichkeit in Cluster eingeteilt und visuell analysiert; 149 Verbindungen wurden für die Dockingsimulationen ausgewählt. Die MOE Konformerendatenbank wurde ebenso über einen für InhA individuell angepassten hierarchischen Filter numerisch reduziert und mit der Pharmakophorhypothese III gescreent, 28 Verbindungen wurden für die Dockingsimulationen ausgewählt. Die Dockingsimulationen wurden mit den Programmen MOE Dock und Autodock durchgeführt. Die Ergebnisse wurden numerisch ausgewertet und innerhalb der Bindetasche relativ zur jeweiligen zugrunde liegenden Pharmakophorhypothese visuell analysiert; 27 Substanzen wurden schließlich für die Testungen ausgewählt. Die Testungen erfolgten mit einem enzymatischen Assay und einem Assay an attenuierten M. tuberculosis Für die Etablierung des enzymatischen Assays wurde das Enzym InhA mittels Vektortransformation in E. coli überexprimiert und säulenchromatographisch aufgereinigt. Das Substrat 2-trans-Octenoyl-Coenzym A wurde synthetisiert. Von den 27 ausgewählten Substanzen waren 9 im Handel erhältlich und wurden schließlich auf ihre inhibitorische Aktivität getestet. Es wurden ein Thiazolidin-2,4-dion, ein 2-Thioxoimidazolidin-4-on und ein Sulfonamid als aktive Substanzen gefunden.
N2  - Worldwide the number of tuberculosis cases has increased in the decades. Since there is a lack of innovative anti-tuberculosis drugs, the first-generation drugs are still used as gold standard. Therefore, strains of mycobacteria, that respond only little or not at all to drug therapy, picture a growing problem. Characteristic of M. tuberculosis is its thick cell wall. The structure of the cell wall allows the bacterium to persist in the macrophages and to multiply there. The cell wall is rich in mycolic acids and, in this, little permeable to xenobiotics. The mycobacterial cell wall skeleton can be divided into two parts, the cell wall core and the outer lipid envelope. The free lipids of the outer lipid envelope serve as signalling molecules in course of the disease, and intercalate with the mycolic acids of the cell wall core. For fatty acid biosynthesis M. tuberculosis has two enzyme complexes: the type I fatty acid synthase, which is also found in mammals, produces fatty acids of C16 to C26 chain length; subsequently, these are extended to meromycolic acids in the type II fatty acid synthase (FAS II). The synthesis cycle of FAS-II consists of mono-functional enzymes that build up on each other. If one of these enzymes is disturbed in its functionality, intermediates accumulate and required cell wall lipids can not be synthesized. As a result, the cell wall turns unstable and the bacterium dies. Therefore, the mycobacterial lipid biosynthesis is an ideal target for developing new antituberculous drugs. The aim of this study was to develop a new inhibitor class of the mycobacterial FAS-II enzyme InhA by means of virtual screening. For the virtual screening three consecutive pharmacophore hypotheses were developed, and with these two independent databases were screened. As a basis for the calculations of the virtual screening the PDB X-ray crystal structure 2h7m with the ligand 1-cyclohexyl-N-(3,5-dichlorophenyl)-5-oxopyrrolidine-3-carboxamide was used. In order to construct the pharmacophore hypotheses, first, the structures of the enzyme with and without a ligand were analyzed for their conformational differences, in particular with respect to the geometry of the binding pocket. Next, the interactions of the ligand with the amino acids of the binding pocket and with the cofactor were analyzed in detail; thereby, the different types of interactions were assessed in terms of their relevance for the inhibitory activity. Finally, a hot spot analysis of the active site was carried out for different chemical functionalities. The ZINC 'drug-like' subset (2005) and CCG's 2006 Vendor MOE 3D compound collection were used for the database screening, both being databases of commercially available compounds. The ZINC 'drug-like' subset was numerically reduced by a hierarchical filter customized for InhA; of the remaining compounds a database of conformers was calculated. The MOE 2006 Vendor 3D Compound Collection was already available as a conformer database. The reduced ZINC 'drug-like' subset was screened with the pharmacophore hypotheses I and II. After calculating fingerprints the hits were clustered according to their similarity using the Tanimoto coefficient and visually analyzed; 149 compunds were selected for the docking simulations. The MOE conformers database also was numerically reduced by a hierarchical filter customized for InhA, and then screened with the pharmacophore hypothesis III, 28 compounds were chosen for the docking simulations. The docking simulations were performed with the programs MOE Dock and Autodock. The results were evaluated numerically, and analyzed visually within the binding pocket relative to the respective underlying pharmacophore hypothesis. Finally, 27 substances were selected for testing. The tests were carried out using an enzymatic assay and an assay on attenuated M. tuberculosis. For establishing the enzymatic assay, the enzyme InhA was overexpressed using vector transformation into E. coli and purified by column chromatography. The substrate 2-trans-octenoyl-coenzyme A was synthesized. Of the 27 selected compounds 9 substances were commercially available and were tested for their inhibitory activity. A thiazolidine-2,4-dione, a 2-thioxoimidazolidine-4-one and a sulfonamide were found to be active.
KW  - Screening
KW  - Tuberkelbakterium
KW  - Enoyl-acyl-carrier-protein-Reductase
KW  - Inhibitor
KW  - Virtuelles Screening
KW  - Enoyl-ACP-Reduktase
KW  - InhA
KW  - neue Inhibitorklasse
KW  - Tuberkulose
KW  - Virtual Screening
KW  - enoyl-ACP-reductase
KW  - InhA
KW  - new inhibitor class
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73736
ER  - 
TY  - THES
A1  - Deiß, Katharina
T1  - Die Regulation des Kinasemodulators Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP): Einfluss von Phosphorylierung und Dimerisierung auf die Interaktion mit Raf1 und G Protein-gekoppelter Rezeptorkinase 2 (GRK2)
T1  - Regulation of the kinase modulator Raf kinase inhibitor protein (RKIP): Influence of phosphorylation and dimerization on its interaction with Raf1 and G protein coupled receptor kinase 2 (GRK2)
N2  - RKIP reguliert Proteinkinasen der Signaltransduktionskaskaden von G Protein-gekoppelten Rezeptoren, der Raf/MEK/ERK-MAPK, des Transkriptionsfaktors NFκB und von GSK3β. Unklar war bisher, wie die spezifische Interaktion von RKIP mit seinen mannigfaltigen Interaktionspartnern ermöglicht und reguliert wird. Raf1 und GRK2 sind die einzigen bekannten direkten Interaktionspartner von RKIP und wurden deshalb gewählt, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser Interaktion genauer zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass RKIP nach PKC-vermittelter Phosphorylierung von Serin153 dimerisiert und dass diese Dimerisierung für die RKIP/Raf1-Dissoziation und die RKIP/GRK2-Interaktion essentiell ist. Co-Immunpräzipitationsexperimente mit einer phosphorylierungsdefizienten Mutante zeigten, dass für diese Dimerisierung die Phosphorylierung von beiden RKIP-Molekülen notwendig ist. Als Dimerinteraktionsfläche wurden die Aminosäuren 127-146 von RKIP identifiziert, da das Peptid RKIP127-146 die Dimerisierung von RKIP spezifisch und effizient hemmte. Um die Bedeutung dieser phosphorylierungsinduzierten Dimerisierung von RKIP für seine Interaktion mit Raf1 und GRK2 zu untersuchen, wurden eine phosphomimetische Mutante (RKIPSK153/7EE) und eine Mutante von RKIP generiert, welche bereits unphosphoryliert dimerisiert (RKIP∆143-6). Folgende Ergebnisse legen nahe, dass die Dimerisierung von RKIP für die spezifische Interaktion mit Raf1 bzw. GRK2 entscheidend ist: (i) Die Dimerisierung von phosphoryliertem RKIP ging mit der Dissoziation von RKIP und Raf1 und der Assoziation von RKIP und GRK2 einher; (ii) die Mutanten RKIPSK153/7EE und RKIP∆143-6, die bereits in unstimulierten Zellen eine starke Dimerisierung zeigten, hatten eine höhere Affinität zu GRK2 als zu Raf1; (iii) die Hemmung der RKIP-Dimerisierung interferierte nur mit der RKIP/GKR2- aber nicht mit der RKIP/Raf1-Interaktion; (iv) in vitro und in Mausherzen konnte ein RKIP- und GRK2-immunreaktiver Komplex nachgewiesen werden; (v) Untersuchungen zur RKIP-vermittelten Hemmung der Kinaseaktivität von GRK2 und Raf implizierten, dass dimerisiertes RKIP nur die Aktivität von GRK2, nicht aber von Raf hemmt. Diese Arbeit zeigt, dass die phosphorylierungsinduzierte Dimerisierung von RKIP die spezifische Interaktion von RKIP mit Raf1 und GRK2 koordiniert. Die Aufklärung dieses Mechanismus erweitert unser Verständnis der spezifischen Interaktion von Kinasen mit ihren Regulatorproteinen.
N2  - RKIP is a regulator of several distinct kinases and modulates diverse signal transduction cascades such as the signaling of G protein coupled receptors, of the Raf/MEK/ERK-cascade, of the transcription factor NFκB, and of GSK3β. Until now, it was not well understood how the specific interaction of RKIP with its diverse targets is achieved and regulated. Raf1 and GRK2 are the only known direct interaction partners of RKIP and were thus chosen to untangle the molecular mechanisms regulating the specific interaction of RKIP with these kinases. In this dissertation it is shown that RKIP dimerizes upon PKC-mediated phosphorylation of serine153 and that this dimerization is essential for RKIP/Raf1-dissociation and RKIP/GRK2-association. Co-immunoprecipitation experiments with a phosphorylation-deficient mutant revealed that the dimerization of RKIP requires the phosphorylation of two RKIP molecules. The amino acids 127-146 of RKIP were identified as dimer-interface, since RKIP-dimerization was efficiently and specifically inhibited by the peptide RKIP127-146. To elucidate the implication of this phosphorylation-induced dimerization on the target specificity of RKIP, a phosphomimetic RKIP mutant (RKIPSK153/7EE) and a dimeric RKIP mutant (RKIP∆143-6) were generated. The following results indicated that dimerization of RKIP controls its specific interaction with Raf1 or GRK2, respectively: (i) dimerization of phosphorylated RKIP occurred concomitantly with the release of RKIP from Raf1 and its association with GRK2; (ii) the RKIP mutants RKIPSK153/7EE and RKIP∆143-6, which had a higher propensity for RKIP-dimerization already under basal conditions, had a higher affinity to GRK2 than to Raf1; (iii) inhibition of RKIP-dimerization prevented only RKIP/GRK2-binding but did not interfere with RKIP/Raf1-binding; (iv) an RKIP- and GRK2-immunoreactive complex was detected in vitro as well as in mouse hearts; (v) analyses of RKIP-mediated inhibition of GRK2 and Raf showed that a higher propensity for RKIP-dimerization translates into efficient GRK2-inhibition but not into Raf-inhibition. The results of this thesis show that phosphorylation-induced dimerization of RKIP regulates its specific interaction with Raf1 and GRK2. The elucidation of this mechanism improves our understanding how specificity in the interaction of kinases and their regulatory proteins can be achieved.
KW  - Signaltransduktion
KW  - Dimerisierung
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Proteinkinase C
KW  - Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP)
KW  - G protein-gekoppelte Rezeptor Kinase 2 (GRK2)
KW  - Raf1
KW  - Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP)
KW  - G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2)
KW  - Raf1
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73884
ER  - 
TY  - JOUR
T1  - einBlick - Ausgabe 42 - 20. November 2012
N2  - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
KW  - Würzburg
KW  - Universität
KW  - University
KW  - Wuerzburg
KW  - Wurzburg
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73890
VL  - 42/2012
ER  - 
TY  - JOUR
T1  - einBlick - Ausgabe 43 - 27. November 2012
N2  - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
KW  - Würzburg
KW  - Universität
KW  - University
KW  - Wuerzburg
KW  - Wurzburg
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74043
VL  - 43/2012
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dang, Nghia Duc
T1  - Konzeption und Evaluation eines hybriden, skalierbaren Werkzeugs zur mechatronischen Systemdiagnose am Beispiel eines Diagnosesystems für freie Kfz-Werkstätten
T1  - Conception and evaluation of a hybrid, scalable tool for mechatronical system diagnosis on the example of a diagnostic system for independent car repair shops
N2  - Die Entwicklung eines wissensbasierten Systems, speziell eines Diagnosesystems, ist eine Teildisziplin der künstlichen Intelligenz und angewandten Informatik. Im Laufe der Forschung auf diesem Gebiet wurden verschiedene Lösungsansätze mit unterschiedlichem Erfolg bei der Anwendung in der Kraftfahrzeugdiagnose entwickelt. Diagnosesysteme in Vertragswerkstätten, das heißt in Fahrzeughersteller gebundenen Werkstätten, wenden hauptsächlich die fallbasierte Diagnostik an. Zum einen hält sich hier die Fahrzeugvielfalt in Grenzen und zum anderen besteht eine Meldepflicht bei neuen, nicht im System vorhandenen Fällen. Die freien Werkstätten verfügen nicht über eine solche Datenbank. Somit ist der fallbasierte Ansatz schwer umsetzbar. In freien Werkstätten - Fahrzeughersteller unabhängigen Werkstätten - basiert die Fehlersuche hauptsächlich auf Fehlerbäumen. Wegen der wachsenden Fahrzeugkomplexität, welche wesentlich durch die stark zunehmende Anzahl der durch mechatronische Systeme realisierten Funktionen bedingt ist, und der steigenden Typenvielfalt ist die geführte Fehlersuche in freien Werkstätten nicht immer zielführend. Um die Unterstützung des Personals von freien Werkstätten bei der zukünftigen Fehlersuche zu gewährleisten, werden neue Generationen von herstellerunabhängigen Diagnosetools benötigt, die die Probleme der Variantenvielfalt und Komplexität lösen. In der vorliegenden Arbeit wird ein Lösungsansatz vorgestellt, der einen qualitativen, modellbasierten Diagnoseansatz mit einem auf heuristischem Diagnosewissen basierenden Ansatz vereint. Neben der Grundlage zur Wissenserhebung werden in dieser Arbeit die theoretische Grundlage zur Beherrschung der Variantenvielfalt sowie die Tests für die erstellten Diagnosemodelle behandelt. Die Diagnose ist symptombasiert und die Inferenzmechanismen zur Verarbeitung des Diagnosewissens sind eine Kombination aus Propagierung der abweichenden physikalischen Größen im Modell und der Auswertung des heuristischen Wissens. Des Weiteren werden in dieser Arbeit verschiedene Aspekte der Realisierung der entwickelten theoretischen Grundlagen dargestellt, zum Beispiel: Systemarchitektur, Wissenserhebungsprozess, Ablauf des Diagnosevorgangs in den Werkstätten. Die Evaluierung der entwickelten Lösung bei der Wissenserhebung in Form von Modellerstellungen und Modellierungsworkshops sowie Feldtests dient nicht nur zur Bestätigung des entwickelten Ansatzes, sondern auch zur Ideenfindung für die Integration der entwickelten Tools in die existierende IT-Infrastruktur.
N2  - The development of a knowledge-based system - in particular a diagnostic system - is a branch of artificial intelligence and applied computer science. Throughout the research in this field, various approaches have been developed with varying degrees of success in the application in automotive diagnostics. Diagnostic systems in authorized garages i.e. in garages bound to vehicle manufacturers mainly apply case-based diagnosis. In those cases first the variance of vehicles is limited and second there is a reporting obligation of new, yet not existing cases within the system. The independent repair shops do not have such a database. Thus, the case-based approach is difficult to implement. In independent garages - car manufacturer independent garages - the troubleshooting is mainly based on fault trees. Because of the growing complexity of vehicles, which is mainly due to the rapidly increasing number of functions realized by mechatronic systems and the increasing variety of vehicle types, guided troubleshooting for independent garages is not always productive. To ensure the support of the staff of independent garages in the future troubleshooting, new generations of multivendor diagnostic tools are needed to solve the problems of the variety and complexity. In the present paper an approach is presented which combines a qualitative, model-based diagnostic approach to a heuristic diagnostic knowledge-based approach. In addition to the basis for knowledge collection in this study the theoretical basis for the control of the variety and the tests for the generated diagnosis models are discussed. The diagnosis is symptom-based and the inference mechanisms for processing of diagnostic knowledge are a combination of propagation of the different physical parameters in the model and the evaluation of heuristic knowledge. Furthermore, various aspects of the implementation of the developed theoretical basis are presented in this thesis, for example: system architecture, knowledge collection process, the course of action of the diagnostic process in the workshops. The evaluation of the developed solution for the collection of knowledge in the form of preparation of models and modeling workshops, as well as field tests not only serves to validate the developed approach, but also to find ideas for the integration of the developed tools into the existing IT infrastructure.
KW  - Diagnosesystem
KW  - Künstliche Intelligenz
KW  - Modellbasierte Diagnose
KW  - Werkstattdiagnose
KW  - hybride Diagnose
KW  - skalierbare Diagnose
KW  - Inferenz <Künstliche Intelligenz>
KW  - Angewandte Informatik
KW  - aftermarket diagnostic
KW  - model-base diagnosis
KW  - hybrid Diagnostic
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70774
ER  - 
TY  - JOUR
T1  - einBlick - Ausgabe 18 - 08. Mai 2012
N2  - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
KW  - Würzburg
KW  - Universität
KW  - University
KW  - Wuerzburg
KW  - Wurzburg
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70870
VL  - 18/2012
ER  -