TY - THES A1 - Saal, Lena T1 - Whole transcriptome profiling of compartmentalized motoneurons T1 - Globale Transkriptomanalyse von kompartimentierten Motoneuronen N2 - Spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis are the two most common devastating motoneuron diseases. The mechanisms leading to motoneuron degeneration are not resolved so far, although different hypotheses have been built on existing data. One possible mechanism is disturbed axonal transport of RNAs in the affected motoneurons. The underlying question of this study was therefore to characterize changes in transcript levels of distinct RNAs in cell culture models of spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis, especially in the axonal compartment of primary motoneurons. To investigate this in detail we first established compartmentalized cultures of Primary mouse motoneurons. Subsequently, total RNA of both compartments was extracted separately and either linearly amplified and subjected to microarray profiling or whole transcriptome amplification followed by RNA-Sequencing was performed. To make the whole transcriptome amplification method suitable for compartmentalized cultures, we adapted a double-random priming strategy. First, we applied this method for initial optimization onto serial dilutions of spinal cord RNA and later on to the compartmentalized motoneurons. Analysis of the data obtained from wildtype cultures already revealed interesting results. First, the RNA composition of axons turned out to be highly similar to the somatodendritic compartment. Second, axons seem to be particularly enriched for transcripts related to protein synthesis and energy production. In a next step we repeated the experiments by using knockdown cultures. The proteins depleted hereby are Smn, Tdp-43 and hnRNP R. Another experiment was performed by knocking down the non-coding RNA 7SK, the main interacting RNA of hnRNP R. Depletion of Smn led to a vast number of deregulated transcripts in the axonal and somatodendritic compartment. Transcripts downregulated in the axons upon Smn depletion were especially enriched for GOterms related to RNA processing and encode proteins located in neuron projections including axons and growth cones. Strinkingly, among the upregulated transcripts in the somatodendritic compartment we mainly found MHC class I transcripts suggesting a potential neuroprotective role. In contrast, although knockdown of Tdp-43 also revealed a large number of downregulated transcripts in the axonal compartment, these transcripts were mainly associated with functions in transcriptional regulation and RNA splicing. For the hnRNP R knockdown our results were again different. Here, we observed downregulated transcripts in the axonal compartment mainly associated with regulation of synaptic transmission and nerve impulses. Interestingly, a comparison between deregulated transcripts in the axonal compartment of both hnRNP R and 7SK knockdown presented a significant overlap of several transcripts suggesting some common mechanism for both knockdowns. Thus, our data indicate that a loss of disease-associated proteins involved in axonal RNA transport causes distinct transcriptome alterations in motor axons. N2 - Spinale Muskelatrophie und Amyotrophe Lateralsklerose zählen zu den beiden häufigsten und schwersten Motoneuronerkrankungen. Der zugrunde liegende Mechanismus beider Krankheiten ist bis heute nicht geklärt, dennoch werden verschiedene Theorien diskutiert. Ein möglicher Grund ist ein gestörter axonaler Transport von RNAs in den betroffenen Motoneuronen. Daraus folgernd ergab sich die zugrunde liegende Frage dieser Arbeit, ob Veränderungen in den Transkriptleveln bestimmter RNAs unter krankheitsähnlichen Bedingungen vor allem im axonalen Kompartiment von primären Maus-Motoneuronen beobachtet werden können. Um die Fragestellung genauer zu untersuchen, etablierten wir zuerst kompartimentierte Kulturen von primären Motoneuronen. Darauffolgend haben wir die totale RNA aus beiden Kompartimenten separat extrahiert und entweder diese linear amplifiziert und zur Microarrayanalyse gegeben oder wir führten eine Amplifikation des kompletten Transkriptoms mit anschließender RNA-Sequenzierung durch. Um die Amplifikation des kompletten Transkriptoms auch für die kompartimentierten Kulturen geeignet zu machen, verwendeten wir eine doublerandom priming Strategie und haben diese entsprechend angepasst. Zuerst wendeten wir die Methode an Serienverdünnungen von RNA aus dem Rückenmark an, um die Methode zu optimisieren. Später benutzten wir die Methode ebenfalls für kompartimentierte Motoneurone. Schon die Analyse der Wildtyp-Daten lieferte interessante Ergebnisse. Erstens, die Zusammensetzung der RNA in Axonen war höchst ähnlich zu der im somatodendritischen Kompartiment. Zweitens, in Axonen scheinen speziell Transkripte angereichert zu sein, welche mit Proteinsynthese und Energieproduktion in Verbindung stehen. In einem nächsten Schritt wurden dann die Experimente unter Verwendung von Knockdown-Kulturen wiederholt. Die Proteine, die dabei vermindert wurden waren Smn, Tdp-43 und hnRNP R. Ein weiteres Experiment wurde durchgeführt indem die nicht-codierende RNA 7SK verringert wurde. Die Depletion von Smn führte zu einer hohen Anzahl an deregulierten Transkripten sowohl im axonalen, als auch im somatodendritischen Kompartiment. Transkripte, die im axonalen Kompartiment nach Smn Depletion verringert waren, waren überwiegend für GOTerms angereichert, welche mit RNA Prozessierung in Verbindung stehen oder welche Proteine codieren, die in neuronalen Fortsätzen, einschließlich Axon und Wachstumskegel lokalisiert sind. Bemerkenswert ist, dass wir unter den hochregulierten Transkripten im somatodendritischen Kompartiment überwiegend MHC Klasse I Transkripte gefunden haben. Dies könnte eine mögliche neuroprotektive Rolle dieser Transkripte annehmen lassen. Im Gegensatz zu den Ergebnissen beim Smn Knockdown fanden wir beim Tdp-43 Knockdown ebenfalls eine große Anzahl an herunterregulierten Transkripten im axonalen Kompartiment, diese sind allerdings überwiegend mit Funktionen in der Transkriptionsregulierung und beim RNA Splicing assoziiert. Die Ergebnisse des hnRNP R Knockdowns waren ebenfalls unterschiedlich. Bei diesem fanden wir die herunteregulierten Transkripte im axonalen Kompartiment überwiegend mit einer Regulierung der synaptischen Übertragung sowie mit Nervenimpulsen assoziiert. Interessanterweise zeigte ein Vergleich der deregulierten Transkripte sowohl im axonalen Kompartiment vom hnRNP R Knockdown, als auch vom 7SK Knockdown eine signifikante Übereinstimmung mehrerer Transkripte. Dies lässt einen teilweise gemeinsamen Mechanismus für beide Genprodukte vermuten. Somit deuten unsere Daten darauf hin, dass ein Verlust von krankheitsassoziierten Proteinen, die eine Rolle beim axonalen RNA-Transport spielen, zu verschiedenen Transkriptomveränderungen in Axonen von Motoneuronen führt. KW - Axon KW - Motoneuron KW - Spinale Muskelatrophie KW - amyotrophic lateral sclerosis Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140006 ER - TY - THES A1 - Flohr, Elena Leonie Ruth T1 - The Scents of Interpersonality - On the Influence of Smells on the Evaluation and Processing of Social Stimuli T1 - Die Düfte der Zwischenmenschlichkeit - Über den Einfluss von Gerüchen auf die Bewertung und Verarbeitung von sozialen Reizen N2 - In daily life, olfactory stimuli are potential generators of affective states, but also have a strong influence on social interaction. Pleasant odors have been shown to increase perceived attractiveness and pro-social behavior, whereas unpleasant body odors are often associated with negative personality traits. Since both pleasant odors and positive affective state facilitate pro-social behavior, it is conceivable that the influence of the odors on social interaction is mediated by the induced affective state elicited by the odor itself. The present thesis aims at exploring the impact of hedonic, i.e., pleasant or unpleasant, odors on the processing and evaluation of social stimuli as assessed by verbal, physiological, and behavioral indices. First, I investigate the effects of initially neutral odors which gained threatening value through an aversive conditioning procedure on social stimuli (Study 1). Second, I study the influence of naturally hedonic odors on social interaction. Third, this thesis aims at disentangling differences in the effects of an odor attributed to either a social interaction partner or the environment where the social encounter takes place (Study 2, 3, and 4). In the first study, a context conditioning procedure was applied, during which one out of two long-lasting neutral odors was paired with an unpredictable aversive unconditioned stimulus (US, i.e., white noise). This odor (CTX+) thereby gained threatening value, while another odor (CTX-) remained unpaired and therefore signaled safety. During a test session, facial stimuli were presented within both conditioned olfactory contexts. Results indicate that autonomic arousal was increased to faces when presented in the threatening odor context. Additionally, participants rated facial stimuli as more aversive when presented in the threatening odor as compared to the safety odor, indicating that faces acquire hedonic value from the odor they were presented in. Strikingly, angry facial expressions received additional processing resources when presented within a threatening olfactory context, as reflected on verbal reports and electrodermal activity (EDA). This latter finding suggests that threat-related stimuli, here angry faces, are preferentially processed within an olfactory context where a threat might happen. Considering that the hedonic value of an odor may be quite subjective, I conducted a pilot study in order to identify odors with pleasant vs. unpleasant properties for most participants. Seven odors (four pleasant and three unpleasant) were rated with respect to their valence (pleasant vs. unpleasant), arousal (arousing vs. calm), and intensity. Additionally, EDA was measured. Two pleasant (Citral and Eucalyptol) and two unpleasant (“Animalis” and Isobutyraldehyde) odors were chosen from the original seven. The unpleasant odors were rated as more negative, arousing, and intense than the positive ones, but no differences were found regarding EDA. These four odors were subsequently used in a virtual reality (VR) paradigm with two odor attribution groups. Participants of the social attribution group (n = 59) were always passively guided into the same room (an office) towards one out of two virtual agents who were either paired with the pleasant or the unpleasant odor. Participants of the contextual attribution group (n = 58) were guided into one out of two rooms which were either paired with the pleasant or the unpleasant odor and where they always met the same agent. For both groups, the agents smiled, frowned or remained with a neutral facial expression. This design allowed evaluating the influence of odor valence as a within-subjects factor and the influence of odor attribution as a between-subjects factor. Unpleasant odors facilitated the processing of social cues as reflected by increased verbal and physiological arousal as well as reduced active approach behavior. Specific influence of odor valence on emotional facial expressions was found for ratings, EDA, and facial mimicry, with the unpleasant odor causing a levelling effect on the differences between facial expressions. The social attribution group exhibited larger differences between odors than the contextual group with respect to some variables (i.e., ratings and EDA), but not to others (i.e., electrocortical potentials – ERPs – and approach behavior). In sum, unpleasant in comparison to pleasant odors diminished emotional responses during social interaction, while an additional enhancing effect of the social attribution was observed on some variables. Interestingly, the awareness that an interaction partner would smell (pleasantly or unpleasantly) boosted the emotional reactivity towards them. In Study 3, I adapted the VR paradigm to a within-subjects design, meaning that the different attribution conditions were now manipulated block-wise. Instead of an approach task, participants had to move away from the virtual agent (withdrawal task). Results on the ratings were replicated from Study 2. Specifically, the difference between pleasant and unpleasant odors on valence, arousal, and sympathy ratings was larger in the social as compared to the contextual attribution condition. No effects of odor or attribution were found on EDA, whereas heart rate (HR) showed a stronger acceleration to pleasant odors while participants were passively guided towards the agent. Instead of an approach task, I focused on withdrawal behavior in this study. Interestingly, independently of the attribution condition, participants spent more time withdrawing from virtual agents, when an unpleasant odor was presented. In sum, I demonstrated that the attribution of the odors to the social agent itself had an enhancing effect on their influence on social interaction. In the fourth and last study, I applied a similar within-subjects protocol as in Study 3 with an additional Ultimatum Game task as a measure of social interaction. Overall findings replicated the results of Study 3 with respect to HR and EDA. Strikingly, participants offered less money to virtual agents in the bad smelling room than in the good smelling room. In contrast to Study 3, no effects of odor attribution were found in Study 4. In sum, again I demonstrated that unpleasant odor may lessen social interaction not only when the interaction partner smells badly, but also in more complex interaction situations. In conclusion, I demonstrated that hedonic odors in general influence social interaction. Thus, pleasant odors seem to facilitate, while unpleasant odors seem to reduce interpersonal exchanges. Therefore, the present thesis extends the body of literature on the influence of odors on the processing of social stimuli. Although I found a direct influence of odors on social preferences as well as on the physiological and behavioral responses to social stimuli, I did not disentangle impact of odor per se from the impact of the affective state. Interestingly, odor attribution might play an additional role as mediator of social interactions such as odor effects in social interactions might be boosted when the smell is attributed to an individual. However, the results in this regard were less straightforward, and therefore further investigations are needed. Future research should also take into account gender or other inter-individual differences like social anxiety. N2 - Im täglichen Leben dienen Gerüche als starke Auslöser von emotionalen Zuständen, doch üben sie auch einen starken Einfluss auf soziale Interaktion aus. Angenehme Gerüche sollten die Attraktivität von Gesichtern und prosoziales Verhalten verstärken, während unangenehme Körpergerüche oft mit negativen Persönlichkeitseigenschaften assoziiert werden. Dieser Zusammenhang zeigt sich auch auf physiologischen und Verhaltensmaßen. Während angenehme Gerüche prosoziales Verhalten verstärken, kann derselbe Effekt auch durch einen positiven affektiven Zustand erreicht werden. Der Einfluss von Gerüchen auf soziale Interaktion könnte daher auch durch den affektiven Zustand der Versuchspersonen vermittelt werden. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, den Einfluss von hedonischen Gerüchen auf soziale Interaktion, wie er sich auf verschiedenen verbalen, physiologischen und Verhaltensvariablen abbilden lässt, darzustellen. Auf der einen Seite wurde der Einfluss von ursprünglich neutralen Gerüchen untersucht, die in einer Kontextkonditionierung bedrohliche Bedeutung erhielten (Studie 1). Auf der anderen Seite sollte der Einfluss eines Geruchs, der direkt von einem sozialen Interaktionspartner ausgeht, von dem eines eher kontextuellen Geruchs getrennt werden, der auf den Raum attribuiert wurde, in dem die soziale Interaktion stattfand (Studien 2, 3 und 4). In der ersten Studie wurde auf einen von zwei ursprünglich neutralen Gerüchen eine Kontextkonditionierungsprozedur angewandt. Dieser Geruch erhielt somit durch die Paarung mit einem aversiven unvorhersehbaren unkonditionierten Stimulus (US) bedrohliche Bedeutung, während der andere Geruch niemals mit einem unkonditionierten Stimulus gepaart wurde und dadurch Sicherheit signalisierte. In der Testphase wurden Gesichter entweder innerhalb des bedrohlichen Geruchs oder des Sicherheitsgeruchs präsentiert. Es konnte gezeigt werden, dass im Anschluss daran der bedrohliche Geruch die elektrokortikalen Potenziale (EKPs) auf Gesichter verstärkt, die in diesem Geruchskontext präsentiert werden. Zudem war das autonome Arousal während der Präsentation der Gesichsstimuli in diesem Kontext erhöht. Subjektive Ratings unterstützen zusätzlich die Annahme, dass die bedrohliche Bedeutung des Kontexts, in dem Gesichter präsentiert werden, auf diese übergeht. Zusätzlich zu diesem generellen Effekt konnte auf den subjektiven Ratings wie auch auf der elektrodermalen Aktivität (EDA) ein spezifischer Einfluss des olfaktorischen Kontexts auf die Verarbeitung von Gesichtern gezeigt werden. Ärgerliche Gesichter zogen dabei zusätzliche Verarbeitungsressourcen auf sich, wenn sie innerhalb eines bedrohlichen olfaktorischen Kontexts präsentiert wurden, wie sich auf der EDA und den verbalen Ratings zeigte. Zusammengefasst legen die letzteren Ergebnisse nahe, dass bedrohliche Reize (hier ärgerliche Gesichter) bevorzugt verarbeitet werden, wenn sie in einem ebenfalls bedrohlichen Kontext präsentiert werden. Um für die anschließenden Studien Gerüche zu identifizieren, die von den meisten Versuchspersonen als angenehm bzw. unangenehm bewertet werden, wurde vor der zweiten Studie eine Pilotstudie durchgeführt. Sieben Gerüche (vier angenehme und drei unangenehme) wurden bezüglich Valenz, Arousal und Intensität evaluiert. Zusätzlich wurde die EDA aufgezeichnet. Aus den ursprünglichen sieben Gerüchen wurden zwei angenehme (Citral und Eukalyptol) und zwei unangenehme („Animalis“ und Isobutanal) ausgewählt. Die unangenehmen Gerüche wurden als unangenehmer, aufregender und intensiver bewertet als die angenehmen, wohingegen in der EDA keine Unterschiede gefunden wurden. Studie 2 wandte die ausgewählten Gerüche in einem Experiment in virtueller Realität an. Um eine soziale und eine kontextuelle Attribution der Gerüche abzubilden, erhob ich zwei Attributions-gruppen. Versuchspersonen der sozialen Attributionsgruppe (n = 59) wurden passiv immer in denselben Raum geführt, in dem sie auf einen von zwei virtuellen Agenten trafen. Jeder dieser Agenten wurden mit entweder dem angenehmen oder dem unangenehmen Geruch gepaart. Probanden der kontextuellen Attributionsgruppe (n = 58) wurden jeweils passiv in einen von zwei Räumen geführt, der entweder mit dem angenehmen oder dem unangenehmen Geruch gepaart wurde. In diesen Räumen trafen sie immer auf denselben virtuellen Agenten. So war es möglich, den Einfluss der Geruchshedonik als Innersubjektfaktor und den Einfluss der Geruchsattribution als Zwischensubjektfaktor darzustellen. Der unangenehme Geruch erzeugte eine verstärkte Verarbeitung sozialer Reize, was sich in erhöhtem physiologischen Arousal, in subjektiven Ratings und vermindertem aktiven Annäherungsverhalten zeigte. Ein spezifischer Einfluss auf emotionale Gesichtsausdrücke war außerdem auf den subjektiven Ratings, EDA und der fazialen Mimikry zu beobachten. Hierbei zeigte sich ein abflachender Effekt auf den Unterschied zwischen den Gesichtsausdrücken, wenn der unangenehme Geruch präsentiert wurde. In der sozialen Attributionsgruppe fanden sich auf manchen Variablen stärkere Effekte als in der kontextuellen Attributionsgruppe (wie den Ratings und der EDA), aber auf anderen Variablen nicht (wie den EKPs und dem Annäherungsverhalten). Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass unangenehme Gerüche im Vergleich zu angenehmen emotionale Reaktionen auf soziale Interaktion vermindern. Ein zusätzlicher verstärkender Effekt durch die soziale Attribution der Gerüche war auf einigen Variablen zu beobachten. Interessanterweise scheint das Wissen darüber, dass ein Interaktionspartner riechen könnte, die emotionale Reaktion auf ihn zu verstärken. Für die dritte Studie passte ich das Paradigma für ein Innersubjektdesign an, wobei nun die beiden Attributionsbedingungen blockweise manipuliert wurden. Die Resultate der Ratings replizierten die aus Studie 2. Außerdem zeigten sich stärkere Effekte der Geruchsvalenz in der sozialen Attributionsbedingung auf allen Ratings. In der EDA wurden keine Effekte gefunden, aber in der Herzrate zeigte sich eine verstärkte Verarbeitung der angenehmen Gerüche während der passiven Annäherung an den Agenten. Statt des Annäherungsverhaltens wurde in dieser Studie das Rückzugsverhalten gemessen. Die Versuchspersonen verbrachten mehr Zeit damit, von einem Agenten zurückzuweichen, wenn ein unangenehmer Geruch präsentiert wurde. In Summe konnte ich zeigen, dass die Attribution der Gerüche auf den sozialen Agenten einen verstärkenden Effekt auf den Einfluss der Gerüche auf die soziale Interaktion hat. In der letzten Studie wurde dasselbe Protokoll wie in Studie 3 mit einer zusätzlichen Ultimatumspielaufgabe durchgeführt. Die Ergebnisse aus Studie 3 wurden bezüglich der Herzrate und der EDA repliziert. Außerdem boten die Versuchspersonen dem Agenten im Kontext eines unangenehmen Geruchs weniger Geld an als im Kontext eines angenehmen. In Studie 4 wurde kein Effekt für die Attribution des Geruchs gefunden. Zusammenfassend wurde gezeigt dass unangenehme Gerüche einen reduzierenden Effekt auf soziale Interaktion auch in komplexeren interaktiven Situationen ausüben. Zusammenfassend zeigte ich, dass Gerüche soziale Interaktion beeinflussen. Angenehme Gerüche scheinen soziale Interaktionen zu vereinfachen, während unangenehme Gerüche sie erschweren. Damit erweitert die vorliegende Arbeit bereits bestehende Forschung über den Einfluss von Gerüchen auf die Verarbeitung sozialer Stimuli. Obwohl ich einen direkten Einfluss von Gerüchen auf soziale Präferenzen sowie auf die physiologischen und behavioralen Reaktionen auf soziale Stimuli fand, konnte ich den Einfluss von Gerüchen per se nicht von dem Einfluss des affektiven Zustandes abgrenzen. Interessanterweise scheint die Attribution von Gerüchen einen zusätzlichen Faktor als Mediator von sozialen Interaktionen darzustellen, so dass der Effekt der Gerüche verstärkt wird, wenn er mit einem Individuum assoziiert ist. Nichtsdestotrotz waren die diesbezüglichen Effekte weniger klar und mehr Forschung auf diesem Gebiet könnte diese Unklarheit auflösen. Zukünftige Forschung sollte auch den Faktor Geschlecht nicht außer Acht lassen sowie andere inter-individuelle Unterschiede wie soziale Ängstlichkeit. KW - smell KW - social cognition KW - smells KW - social stimuli KW - social interaction Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153352 ER - TY - THES A1 - Stritt, Simon T1 - The role of the cytoskeleton in platelet production and the pathogenesis of platelet disorders in humans and mice T1 - Die Rolle des Zytoskeletts in der Thrombopoese und der Pathogenese von Thrombozytopathien im Menschen und der Maus N2 - Platelets are continuously produced from megakaryocytes (MK) in the bone marrow by a cytoskeleton-driven process of which the molecular regulation is not fully understood. As revealed in this thesis, MK/ platelet-specific Profilin1 (Pfn1) deficiency results in micro- thrombocytopenia, a hallmark of the Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) in humans, due to accelerated platelet turnover and premature platelet release into the bone marrow. Both Pfn1-deficient mouse platelets and platelets isolated from WAS patients contained abnormally organized and hyper-stable microtubules. These results reveal an unexpected function of Pfn1 as a regulator of microtubule organization and point to a previously unrecognized mechanism underlying the platelet formation defect in WAS patients. In contrast, Twinfilin2a (Twf2a) was established as a central regulator of platelet reactivity and turnover. Twf2a-deficient mice revealed an age-dependent macrothrombocytopenia that could be explained by a markedly decreased platelet half-life, likely due to the pronounced hyper-reactivity of \(Twf2a^{-/-}\) platelets. The latter was characterized by sustained integrin acti- vation and thrombin generation in vitro that translated into accelerated thrombus formation in vivo. To further elucidate mechanisms of integrin activation, Rap1-GTP-interacting adaptor molecule (RIAM)-null mice were generated. Despite the proposed critical role of RIAM for platelet integrin activation, no alterations in this process could be found and it was concluded that RIAM is dispensable for the activation of β1 and β3 integrins, at least in platelets. These findings change the current mechanistic understanding of platelet integrin activation. Outside-in signaling by integrins and other surface receptors was supposed to regulate MK migration, but also the temporal and spatial formation of proplatelet protrusions. In this the- sis, phospholipase D (PLD) was revealed as critical regulator of actin dynamics and podo- some formation in MKs. Hence, the unaltered platelet counts and production in \(Pld1/2^{-/-}\) mice and the absence of a premature platelet release in the bone marrow of \(Itga2^{-/-}\) mice question the role of podosomes in platelet production and raise the need to reconsider the proposed inhibitory signaling by α2β1 integrins on proplatelet formation. Non-muscle myosin IIA (NMMIIA) has been implicated as a downstream effector of the in- hibitory signals transmitted via α2β1 integrins. Besides Rho-GTPase signaling, also \(Mg^{2+}\) and transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) channel α-kinase are known regulators of NMMIIA activity. In this thesis, TRPM7 was identified as major regulator of \(Mg^{2+}\) homeostasis in MKs and platelets. Furthermore, decreased \([Mg^{2+}]_i\) led to deregulated NMMIIA activity and altered cytoskeletal dynamics that impaired thrombopoiesis and resulted in macrothrombocytopenia in humans and mice. N2 - Thrombozyten werden kontinuierlich durch einen Zytoskelett-getriebenen Prozess von Megakaryozyten (MK) im Knochenmark gebildet. Die zugrunde liegenden molekularen Me- chanismen sind jedoch weitestgehend unverstanden. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass eine MK/ Thrombozyten-spezifische Profilin1 (Pfn1) Defizienz eine Mikrothrombozytopenie verursacht, die das Hauptmerkmal des Wiskott- Aldrich Syndroms (WAS) im Menschen ist. Die reduzierte Thrombozytenzahl konnte auf eine beschleunigte Entfernung der Thrombozyten aus der Zirkulation sowie deren vorzeitige Freisetzung im Knochenmark zurückgeführt werden. Sowohl Thrombozyten von Pfn1- defizienten Mäusen, als auch von Patienten mit WAS wiesen abnormal organisierte und hyper-stabile Mikrotubuli auf. Die im Rahmen dieser Thesis gewonnenen Ergebnisse zeigen eine unerwartete Funktion von Pfn1 als Regulator der Mikrotubuliorganisation und weisen auf einen bisher nicht erkannten Mechanismus hin, welcher dem Thrombozytenproduktionsde- fekt in Patienten mit WAS zugrunde liegt. Im Gegensatz hierzu konnte Twinfilin2a (Twf2a) als zentraler Regulator der Thrombozyten- reaktivität und Lebenspanne etabliert werden. Mäuse mit einer Twf2a Defizienz zeigten eine progressive Makrothrombozytopenie, die durch eine stark reduzierte Lebenspanne der Thrombozyten erklärt werden konnte. Letzteres war höchstwahrscheinlich durch eine erhöhte Empfindlichkeit von Twf2a-defizienten Thrombozyten gegenüber von aktivierenden Stimuli bedingt. Die Hyperreaktivität von Twf2a-defizienten Thrombozyten zeigte sich durch eine verlängerte Aktivierung der Integrine und erhöhter Thrombingenerierung in vitro sowie be- schleunigter Thrombusbildung in vivo. Um die Mechanismen der Integrinaktivierung besser zu charakterisieren, wurden Rap1-GTP- interacting adaptor molecule (RIAM)-null Mäuse generiert. Obwohl RIAM eine zentrale Rolle in der thrombozytären Integrinaktivierung zugeschriebenen wurde, konnten keine Defekte in diesem Prozess in RIAM-null Thrombozyten identifiziert werden. Dies führte zu der Schluss- folgerung, dass RIAM für die Aktivierung von β1 und β3 Integrinen in Thrombozyten nicht benötigt wird. Diese Erkenntnisse verändern das gegenwärtige mechanistische Verständnis der Integrinaktivierung in Thrombozyten. Die outside-in Signalgebung durch Integrine und andere Oberflächenrezeptoren reguliert die Migration sowie die zeitliche und räumliche Bildung von proplatelets durch MKs. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass Phospholipase D (PLD) ein zentraler Regulator der Aktindynamik und Podosomenbildung in MKs ist. Die normale Thrombozytenzahl und -Produktion in \(Pld1/2^{-/-}\) Mäusen sowie die fehlende vorzeitige Freisetzung von Thrombozytenim Knochenmark von \(Itga2^{-/-}\) Mäusen, stellen die Funktion von Podosomen in der Throm- bozytenproduktion in Frage. Ferner zeigen diese Ergebnisse, dass die Rolle der inhibitori- schen Signalgebung durch α2β1 Integrine in der proplatelet-Bildung noch einmal überdacht werden muss. Non-muscle myosin IIA (NMMIIA) wird als Effektorprotein im α2β1 Integrinsignalweg ange- sehen. Neben Signalen, die durch Rho-GTPasen vermittelt werden, regulieren auch \(Mg^{2+}\) und die α-Kinase des transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) Kanals die Akti- vität von NMMIIA. Im Rahmen dieser Thesis wurde TRPM7 als Hauptregulator der \(Mg^{2+}\) Homöostase in MKs und Thrombozyten identifiziert. Darüber hinaus führten erniedrigte intra- zelluläre \(Mg^{2+}\) Konzentrationen zu einer veränderten NMMIIA Aktivität und Zytoskelettdyna- mik. Diese Defekte beeinträchtigten die Thrombopoese und verursachten eine Makrothrom- bozytopenie im Menschen und der Maus. KW - Thrombozytopoese KW - Thrombozytopathie KW - Megakaryopoese KW - Zellskelett KW - Thrombozyt KW - Zytoskelett Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122662 ER - TY - THES A1 - Deppermann, Carsten T1 - The role of platelet granules in thrombosis, hemostasis, stroke and inflammation T1 - Zur Rolle der Thrombozytengranula in Thrombose, Hämostase, Schlaganfall und Entzündung N2 - Platelets are small anucleate cell fragments derived from bone marrow megakaryocytes (MKs) and are important players in hemostasis and thrombosis. Platelet granules store factors which are released upon activation. There are three major types of platelet granules: alpha-granules, dense granules and lysosomes. While dense granules contain non-proteinacious factors which support platelet aggregation and adhesion, platelet alpha-granules contain more than 300 different proteins involved in various functions such as inflammation, wound healing and the maintenanceof vascular integrity, however, their functional significance in vivo remains unknown. This thesis summarizes analyses using three mouse models generated to investigate the role of platelet granules in thrombosis, hemostasis, stroke and inflammation. Unc13d-/- mice displayed defective platelet dense granule secretion, which resulted in abrogated thrombosis and hemostasis. Remarkably, Munc13-4-deficient mice were profoundly protected from infarct progression following transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) and this was not associated with increased intracranial bleeding indicating an essential involvementof dense granule secretion in infarct progression but not intracranial hemostasis during acute stroke with obvious therapeutic implications. In the second part of this thesis, the role of platelet alpha-granules was investigated using the Nbeal2-/- mouse. Mutations in NBEAL2 have been linked to the gray platelet syndrome (GPS), a rare inherited bleeding disorder. Nbeal2-/- mice displayed the characteristics of human GPS, with defective alpha-granule biogenesis in MKs and their absence from platelets. Nbeal2-deficiency did not affect MK differentiation and proplatelet formation in vitro or platelet life span in vivo. Nbeal2-/- platelets displayed impaired adhesion, aggregation, and coagulant activity ex vivo that translated into defective arterial thrombus formation and protection from thrombo-inflammatory brain infarction in vivo. In a model of skin wound repair, Nbeal2-/- mice exhibited impaired development of functional granulation tissue due to severely reduced differentiation of myofibroblasts. In the third part, the effects of combined deficiency of alpha- and dense granule secretion were analyzed using Unc13d-/-/Nbeal2-/- mice. Platelets of these mice showed impaired aggregation and adhesion to collagen under flow ex vivo, which translated into infinite tail bleeding times and severely defective arterial thrombus formation in vivo. When subjected to in vivo models of skin or lung inflammation, the double mutant mice showed no signs of hemorrhage. In contrast, lack of platelet granule release resulted in impaired vascular integrity in the ischemic brain following tMCAO leading to increased mortality. This indicates that while defective dense granule secretion or the paucity of alpha-granules alone have no effect on vascular integrity after stroke, the combination of both impairs vascular integrity and causes an increase in mortality. N2 - Thrombozyten sind kleine, kernlose Zellfragmente, die von Megakaryozyten (MKs) im Knochenmark gebildet werden und eine zentrale Rolle in Thrombose und Hämostase spielen. Thrombozytengranula speichern Faktoren, die nach Thrombozytenaktivierung freigesetzt werden. Die drei wichtigsten Thrombozytengranula sind alpha- und dichte Granula, sowie Lysosomen. Während dichte Granula vor allem anorganische Faktoren enthalten, welche die Thrombozytenaktivierung und -aggregation fördern, speichern alpha-Granula mehr als 300 verschiedene Proteine mit einer Vielzahl an Funktionen. Sie sind beispielsweise an Entzündungsprozessen, Wundheilung und der Aufrechterhaltung vaskulärer Integrität beteiligt. Die funktionelle Signifikanz dieser Faktoren, insbesondere in vivo, blieb bisher allerdings ungeklärt. Diese Doktorarbeit beschreibt die Analyse der Rolle von Thrombozytengranula in Thrombose, Hämostase, Schlaganfall und Entzündung unter Verwendung von drei Knockout-Mauslinien. Unc13d-/- Mäuse dienten als Modell, um die Rolle der dichten Granulasekretion in Thrombose, Hämostase, Schlaganfall und der Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität nach Thromboinflammation zu untersuchen. Die fehlende Freisetzung des Inhalts dichter Granula aus Thrombozyten dieser Mäuse führte zu defekter Thrombose und Hämostase. Unc13d-/- Mäuse zeigten deutlich kleinere Infarkte im tMCAO (transient middle cerebral artery occlusion)-Modell des ischämischen Schlaganfalls. Gleichzeitig wurde jedoch keine erhöhte Blutungsneigung im Gehirn nach Schlaganfall festgestellt. Dies deutet auf eine Schlüsselrolle der Sekretion dichter Granula in der Infarktentwicklung hin, die jedoch nicht die intrakranielle H¨amostase w¨ahrend des akuten Schlaganfalls beeinflusst. Der zweite Teil dieser Doktorarbeit behandelt die Rolle von alpha-Granula unter Verwendung der Nbeal2-/- Maus. Vor Kurzem wurde gezeigt, dass Mutationen im NBEAL2-Gen das Gray Platelet Syndrome (GPS) hervorrufen. Das GPS ist eine seltene erbliche Blutungskrankheit mit Makrothrombozytopenie, defekter alpha-Granulabiogenese in MKs und dem Fehlen thrombozytärer alpha-Granula. Nbeal2-Defizienz führte zu unveränderter MK-Differenzierung, Proplättchenbildung in vitro und Thrombozytenlebensdauer in vivo. Nbeal2-defiziente Thrombozyten zeigten jedoch verringerte Adhäsion, Aggregation und Koagulation ex vivo, welche zu einer gestörten arteriellen Thrombusbildung und Schutz vor thromboinflammatorischem Schlaganfall nach zerebraler Ischämie führte. In einem Wundheilungsmodell der Haut zeigte sich bei Nbeal2-defizienten Mäusen eine verringerte Bildung von Granulationsgewebe während des Heilungsvorgangs. Die Ursache hierfür lag in der reduzierten Myofibroblastendifferenzierung aufgrund fehlender alpha-Granulaausschüttung. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass alpha-Granulabestandteile nicht nur für Thrombose und Hämostase, sondern auch für akute thromboinflammatorische Krankheitszust¨ande und Geweberegeneration nach Verletzung essentiell sind. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt einer kombinierten Sekretionsdefizienz von alpha- und dichten Granula mithilfe von Unc13d-/-/Nbeal2-/- Mäusen untersucht. Thrombozyten dieser Mäuse zeigten verringerte Aggregation und Adhäsion an Kollagen unter Flussbedingungen ex vivo, sowie massiv verlängerte Blutungszeiten und defekte Thrombusbildung in vivo. Die defekte Granulafreisetzung in Unc13d-/-/Nbeal2-/- Mäusen führte zum Zusammenbruch der vaskulären Integrität im tMCAO-Modell des ischämischen Schlaganfalls und zu einer erhöhten Mortalitätsrate. Im Gegensatz dazu zeigten die doppeldefizienten Mäuse in in vivo Modellen der Haut- oder Lungenentzündung keine Einblutungen. Dies deutet darauf hin, dass die fehlende Sekretion dichter Granula oder die Abwesenheit von alpha-Granula für sich genommen keinen Einfluss auf die Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität nach Schlaganfall hat. Die Kombination beider Defekte führt jedoch zum Zusammenbruch der zerebrovaskulären Integrität und erhöhter Mortalität nach Schlaganfall. KW - Thrombozyten KW - Schlaganfall KW - Entzündung KW - Platelet granules KW - Thrombosis KW - Hemostasis KW - Stroke KW - Inflammation Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121010 ER - TY - THES A1 - Karl, Franziska T1 - The role of miR-21 in the pathophysiology of neuropathic pain using the model of B7-H1 knockout mice T1 - Die Rolle von miR-21 in der Pathophysiologie von neuropathischem Schmerz am Model der B7-H1 defizienten Maus N2 - The impact of microRNA (miRNA) as key players in the regulation of immune and neuronal gene expression and their role as master switches in the pathophysiology of neuropathic pain is increasingly recognized. miR-21 is a promising candidate that could be linked to the immune and the nociceptive system. To further investigate the pathophysiological role of miR-21 in neuropathic pain, we assesed mice deficient of B7 homolog 1 (B7-H1 ko), a protein with suppressive effect on inflammatory responses. B7-H1 ko mice and wildtype littermates (WT) of three different age-groups, young (8 weeks), middle-aged (6 months), and old (12 months) received a spared nerve injury (SNI). Thermal withdrawal latencies and mechanical withdrawal thresholds were determined. Further, we investigated anxiety-, depression-like and cognitive behavior. Quantitative real time PCR was used to determine miR-21 relative expression in peripheral nerves, dorsal root ganglia and white blood cells (WBC) at distinct time points after SNI. Naïve B7-H1 ko mice showed mechanical hyposensitivity with increasing age. Young and middle-aged B7-H1 ko mice displayed lower mechanical withdrawal thresholds compared to WT mice. From day three after SNI both genotypes developed mechanical and heat hypersensitivity, without intergroup differences. As supported by the results of three behavioral tests, no relevant differences were found for anxiety-like behavior after SNI in B7-H1 ko and WT mice. Also, there was no indication of depression-like behavior after SNI or any effect of SNI on cognition in both genotypes. The injured nerves of B7-H1 ko and WT mice showed higher miR-21 expression and invasion of macrophages and T cells 7 days after SNI without intergroup differences. Perineurial miR-21 inhibitor injection reversed SNI-induced mechanical and heat hypersensitivity in old B7-H1 ko and WT mice. This study reveals that reduced mechanical thresholds and heat withdrawal latencies are associated with miR-21 induction in the tibial and common peroneal nerve after SNI, which can be reversed by perineurial injection of a miR-21 inhibitor. Contrary to expectations, miR-21 expression levels were not higher in B7-H1 ko compared to WT mice. Thus, the B7-H1 ko mouse may be of minor importance for the study of miR-21 related pain. However, these results spot the contribution of miR-21 in the pathophysiology of neuropathic pain and emphasize the crucial role of miRNA in the regulation of neuronal and immune circuits that contribute to neuropathic pain. N2 - Die Beteiligung von microRNA (miRNA) an der Genregulation immunologischer und neuronaler Prozesse und deren Rolle als Schlüsselelement in der Pathophysiologie von neuropathischem Schmerz gewinnt zunehmend an Bedeutung. miR-21 ist ein vielversprechender Kandidat, der sowohl das Immunsystem, als auch das nozizeptive System beeinflusst. Um die pathophysiologische Rolle von miR-21 bei neuropathischem Schmerz besser zu verstehen wurden Mäuse mit B7 homolog 1 Defizienz (B7-H1 ko), einem immunsupprimierendem Protein, untersucht. Eine frühere Studie zeigte eine Hochregulierung von miR-21 in murinen Lymphozyten. Junge (8 Wochen), mittelalte (6 Monate) und alte (12 Monate) B7-H1 ko Mäuse und Wildtypwurfgeschwister (WT) erhielten eine spared nerve injury (SNI) als neuropathischem Schmerzmodell. Es wurden thermische Rückzugslatenzen und mechanische Rückzugsschwellen bestimmt. Des weiteren wurde sowohl das Angstverhalten, das depressive Verhalten, als auch das kognitive Verhalten untersucht. Um die relative Expression von miR-21 in den peripheren Nerven, den Spinalganglien und in den weißen Blutzellen zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen, wurde die quantitative real time PCR angewandt. Naive B7-H1 ko Mäuse zeigten mit zunehmendem Alter eine mechanische Hyposensitivität. Bereits 3 Tage nach SNI entwickelten beide Genotypen eine Überempfindlichkeit gegenüber Hitze und mechanischer Stimulation. In drei durchgeführten Verhaltenstests konnten keine relevanten Unterschiede im Angstverhalten nach SNI von B7-H1 ko und WT Mäusen festgestellt werden. Bei beiden Genotypen gab es weder Hinweise auf depressives Verhalten nach SNI, noch wurde das kognitive Verhalten durch SNI beeinträchtigt. Die verletzen Nerven der B7-H1 ko und WT Mäuse zeigten 7 Tage nach SNI eine höhere miR-21 Expression und eine Invasion durch Makrophagen und T-Zellen ohne Gruppenunterschiede. Die perineurale Injektion eines miR-21 Inhibitors konnte die durch SNI induzierte mechanische und thermische Hypersensitivität lindern. Diese Studie zeigt, dass der Anstieg von miR-21 im N. tibialis und N. peroneus communis mit reduzierten Rückzugsschwellen gegen mechanische Reize und verkürzten Wegzugslatenzen bei Hitzestimulation einhergeht, welche durch perineurale Injektion eines miR-21 Inhibitors verringert werden können. Entgegen der Erwartungen zeigten B7-H1 ko Mäuse im Vergleich zu WT Mäusen keine erhöhte miR-21 Expression und sind daher möglicherweise von geringer Bedeutung für die Untersuchung von miR-21 assoziiertem Schmerz. Jedoch bekräftigen diese Ergebnisse eine Beteiligung von miR-21 an der Pathophysiologie von neuropathischem Schmerz und bestätigen die wichtige Rolle von miRNA bei der Regulation von neuronalen und immunologischen Prozessen, die zu neuropathischem Schmerz beitragen. KW - neuropathic pain KW - inflammation KW - B7-H1 KW - immune system KW - neuropathic pain KW - miRNA KW - miR-21 Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156004 ER - TY - THES A1 - Iltzsche, Fabian T1 - The Role of DREAM/MMB-mediated mitotic gene expression downstream of mutated K-Ras in lung cancer T1 - Die Rolle DREAM/MMB-vermittelter mitotischer Genexpression unterhalb von mutiertem K-Ras in Lungenkrebs N2 - The evolutionary conserved Myb-MuvB (MMB) multiprotein complex has an essential role in transcriptional activation of mitotic genes. MMB target genes as well as the MMB associated transcription factor B-Myb and FoxM1 are highly expressed in a range of different cancer types. The elevated expression of these genes correlates with an advanced tumor state and a poor prognosis. This suggests that MMB could contribute to tumorigenesis by mediating overexpression of mitotic genes. Although MMB has been extensively characterized biochemically, the requirement for MMB to tumorigenesis in vivo remains largely unknown and has not been tested directly so far. In this study, conditional knockout of the MMB core member Lin9 inhibits tumor formation in vivo in a mouse model of lung cancer driven by oncogenic K-Ras and loss of p53. The incomplete recombination observed within tumors points towards an enormous selection pressure against the complete loss of Lin9. RNA interference (RNAi)-mediated depletion of Lin9 or the MMB associated subunit B-Myb provides evidence that MMB is required for the expression of mitotic genes in lung cancer cells. Moreover, it was demonstrated that proliferation of lung cancer cells strongly depends on MMB. Furthermore, in this study, the relationship of MMB to the p53 tumor suppressor was investigated in a primary lung cancer cell line with restorable p53 function. Expression analysis revealed that mitotic genes are downregulated after p53 re-expression. Moreover, activation of p53 induces formation of the repressive DREAM complex and results in enrichment of DREAM at mitotic gene promoters. Conversely, MMB is displaced at these promoters. Based on these findings the following model is proposed: In p53-negative cells, mitogenic stimuli foster the switch from DREAM to MMB. Thus, mitotic genes are overexpressed and may promote chromosomal instability and tumorigenesis. This study provides evidence that MMB contributes to the upregulation of G2/M phase-specific genes in p53-negative cells and suggests that inhibition of MMB (or its target genes) might be a strategy for treatment of lung cancer. N2 - Der evolutionär konservierte Myb-MuvB (MMB) Multiproteinkomplex hat eine wesentliche Rolle in der transkriptionellen Aktivierung mitotischer Gene. Zielgene des MMB sowie die MMB assoziierten Transkriptionsfaktoren B-Myb und FoxM1 sind hoch exprimiert in einer Bandbreite verschiedener Krebsarten. Die erhöhte Expression dieser Gene korreliert mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium und einer geringen Prognose. Das weißt auf darauf hin, dass MMB an der Tumorentstehung beteiligt sein könnte indem es die Überexpression mitotischer Gene fördert. Obwohl MMB biochemisch eingehend untersucht wurde, ist die Erfordernis von MMB zur Tumorentstehung in vivo weitestgehend unbekannt und wurde bisher nicht direkt getestet. In dieser Studie hemmt der konditionale Knockout der MMB Kerneinheit Lin9 die Tumorbildung in vivo in einem Lungenkrebs-Mausmodell angetrieben durch onkogenes K-Ras und den Verlust von p53. Die unvollständige Rekombination welche in Tumoren beobachtet wurde deutet auf einen starken Selektionsdruck gegen den kompletten Verlust von Lin9 hin. Die Verminderung von Lin9 und der MMB- assoziierten Untereinheit B-Myb durch RNAi-Interferenz (RNAi) liefert Beweise dafür, dass MMB für die Expression mitotischer Gene in Lungenkrebszellen notwendig ist. Zudem wurde gezeigt, dass das Zellwachstum von Lungenkrebszellen stark von MMB abhängig ist. Weiterhin wurde der Zusammenhang zwischen MMB und dem p53-Tumorsuppressor in einer primären Lungenkrebszelllinie mit wiederherstellbarer p53-Funktion untersucht. Expressionsanalysen zeigen, dass mitotische Gene nach Re-expression von p53 runterreguliert werden. Außerdem induziert die Aktivierung von p53 die Bildung des repressiven DREAM-Komplexes und führt zu einer Anreicherung von DREAM an Promotoren mitotischer Gene. Im Gegenzug wird MMB an den Promotoren verdrängt. Basierend auf den Ergebnissen wird das folgende Model vorgeschlagen: In p53- negativen Zellen begünstigen mitogene Reize den Wechsel von DREAM zu MMB. Dadurch werden mitotische Gene überexprimiert und können so chromosomale Instabilität und Tumorentstehung fördern Diese Studie liefert Hinweise, dass MMB an der Hochregulation G2/M- Phasenspezifischer Gene in p53-negativen Zellen beteiligt ist und dass die Hemmung von MMB (oder seiner Zielgene) eine Strategie zur Behandlung von Lungenkrebs sein könnte. KW - Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom (NSCLC) KW - Lungenkrebs KW - lung cancer KW - DREAM complex KW - MMB KW - K-Ras KW - mitotic gene expression KW - Mitose Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154108 ER - TY - THES A1 - Gupta, Sanjay Kumar T1 - The human CCHC-type Zinc Finger Nucleic Acid Binding Protein (CNBP) binds to the G-rich elements in target mRNA coding sequences and promotes translation T1 - Das humane CCHC-Typ-Zinkfinger-Nukleinsäure-Binde-Protein (CNBP) bindet an G-reiche Elemente in der kodierenden Sequenz seiner Ziel-mRNAs und fördert deren Translation N2 - The genetic information encoded with in the genes are transcribed and translated to give rise to the functional proteins, which are building block of a cell. At first, it was thought that the regulation of gene expression particularly occurs at the level of transcription by various transcription factors. Recent discoveries have shown the vital role of gene regulation at the level of RNA also known as post-transcriptional gene regulation (PTGR). Apart from non-coding RNAs e.g. micro RNAs, various RNA binding proteins (RBPs) play essential role in PTGR. RBPs have been implicated in different stages of mRNA life cycle ranging from splicing, processing, transport, localization and decay. In last 20 years studies have shown the presence of hundreds of RBPs across eukaryotic systems many of which are widely conserved. Given the rising number of RBPs and their link to human diseases it is quite evident that RBPs have major role in cellular processes and their regulation. The current study is aimed to describe the so far unknown molecular mechanism of CCHC-type Zinc Finger Nucleic Acid Binding Protein (CNBP/ZNF9) function in vivo. CNBP is ubiquitously expressed across various human tissues and is a highly conserved RBP in eukaryotes. It is required for embryonic development in mammals and has been implicated in transcriptional as well as post-transcriptional gene regulation; however, its molecular function and direct target genes remain elusive. Here, we use multiple systems-wide approaches to identify CNBP targets and document the consequences of CNBP binding. We established CNBP as a cytoplasmic RNA-binding-protein and used Photoactivatable Ribonucleoside Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation (PAR-CLIP) to identify direct interactions of CNBP with 4178 mRNAs. CNBP preferentially bound a G-rich motif in the target mRNA coding sequences. Functional analyses, including ribosome profiling, RNA sequencing, and luciferase assays revealed the CNBP mode of action on target transcripts. CNBP binding was found to increase the translational efficiency of its target genes. We hypothesize that this is consistent with an RNA chaperone function of CNBP helping to resolve secondary structures, thus promoting translation. Altogether this study provides a novel mechanism of CNBP function in vivo and acts as a step-stone to study the individual CNBP targets that will bring us closer to understand the disease onset. N2 - Die in der DNA kodierte genetische Information wird transkribiert und translatiert, um funktionelle Proteine zu bilden, welche die Bausteine von Zellen sind. Lange Zeit wurde vermutet, dass die Regulation der Genexpression insbesondere auf dem Level der Transkription erfolgt. Kürzlich gemachte Entdeckungen haben jedoch die zentrale Rolle der Genregulation auf dem Level der RNA, auch bekannt als posttranskriptionelle Genregulation (PTGR), gezeigt. Neben nicht-kodierenden RNAs wie microRNAs, besitzen verschiedene RNA-Binde-Proteine (RBP) eine Schlüsselrolle in der PTGR. RBPs wurden mit diversen Ebenen des mRNA- Lebenszyklus, wie Speißen, Prozessieren, Transport, Lokalisation und Abbau in Verbindung gebracht. In den letzten 20 Jahren haben Studien die Existenz von Hunderten von RBPs in unterschiedlichen eukaryotischen Systemen gezeigt, von denen viele weithin konserviert sind. Bedenkt man die steigende Anzahl entdeckter und charakterisierter RBPs und ihren Bezug zu Krankheiten des Menschen, so ist es offensichtlich, dass RBPs eine große Rolle in der Regulation zellulärer Prozesse besitzen. Das Ziel der hier vorliegenden Studie bestand darin, die bis jetzt unbekannten molekularen Mechanismen der Funktion des CCHC-Typ-Zinkfinger-Nukleinsäure- Binde-Proteins (CNBP/ZNF9) in vivo zu beschreiben. CNBP ist in verschiedenen humanen Geweben ubiquitär exprimiert und ein hoch konserviertes RBP in Eukaryoten. Es ist für die embryonale Entwicklung in Säugetieren notwendig und wurde mit der transkriptionellen und posttranskriptionellen Genregulation in Verbindung gebracht. Seine molekulare Funktion sowie die unmittelbaren Zielgene blieben jedoch unklar. In dieser Studie verwendeten wir systemweit analysierende Methoden um CNPB-Zieltranskripte zu identifizieren und dokumentierten die Folgen der Bindung von CNBP an diese. Wir haben CNBP als ein zytoplasmatisches RNA-Binde-Protein charakterisiert und Quervernetzung und Immunpräzipitation mit photoaktivierbaren Ribonukleotiden (PAR-CLIP) angewendet. Dabei wurden direkte Interaktionen von CNBP mit 4178 mRNAs identifiziert. CNBP bindet bevorzugt an ein G-reiches Motiv in der kodierenden Sequenz der Ziel-mRNA. Funktionale Analysen, unter anderem Ribosom-Profil-Untersuchungen, RNA Sequenzierung und Luciferaseproben, zeigten die Art und Weise, wie CNBP auf die Zieltranskripte wirkt. Die Bindung von CNBP an seine Zieltranskripte erhöht deren Translationseffizienz. Wir vermuten, dass dies eine RNA-Chaperon- Funktion von CNBP darstellt, die hilft Sekundärstrukturen aufzulösen und die Translation zu fördern. Zusammengefasst liefert diese Studie einen neuen Mechanismus der Funktion von CNBP in vivo und kann als Startpunkt dienen um einzelne CNBP Ziele zu untersuchen. Dies wird uns helfen dem Verständnis der Krankheitsentstehung näher zu kommen. ... KW - CNBP KW - RNA binding potein CNBP Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142917 ER - TY - THES A1 - Cherpokova, Deya T1 - Studies on modulators of platelet (hem)ITAM signaling and platelet production in genetically modified mice T1 - Untersuchungen an Modulatoren des thrombozytären (hem)ITAM-Signalwegs und der Thrombozytenbildung in genetisch veränderten Mäusen N2 - Summary Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic disease states, such as myocardial infarction and stroke. Glycoprotein (GP) VI and C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) are essential platelet activating receptors in hemostasis and thrombo-inflammatory disease which signal through a (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-dependent pathway. The adapter molecules Src-like adapter protein (SLAP) and SLAP2 are involved in the regulation of immune cell receptor surface expression and signaling, but their function in platelets is unknown. As revealed in this thesis, single deficiency of SLAP or SLAP2 in mice had only moderate effects on platelet function, while SLAP/SLAP2 double deficiency resulted in markedly increased signal transduction, integrin activation, granule release, aggregation, procoagulant activity and thrombin generation following (hem)ITAM-coupled, but not G protein-coupled receptor activation. Slap-/-/Slap2-/- mice displayed accelerated occlusive arterial thrombus formation and a dramatically worsened outcome after focal cerebral ischemia. These results establish SLAP and SLAP2 as critical inhibitors of platelet (hem)ITAM signaling in the setting of arterial thrombosis and ischemic stroke. GPVI has emerged as a promising novel pharmacological target for treatment of thrombotic and inflammatory disease states, but the exact mechanisms of its immunodepletion in vivo are incompletely understood. It was hypothesized that SLAP and SLAP2 may be involved in the control of GPVI down-regulation because of their role in the internalization of immune cell receptors. As demonstrated in the second part of the thesis, SLAP and SLAP2 were dispensable for antibody-induced GPVI down-regulation, but anti-GPVI treatment resulted in prolonged strong thrombocytopenia in Slap-/-/Slap2-/- mice. The profound thrombocytopenia likely resulted from the powerful platelet activation which the anti-GPVI antibody induced in Slap-/-/Slap2-/- platelets, but importantly, not in wild-type platelets. These data indicate that the expression and activation state of key modulators of the GPVI signaling cascade may have important implications for the safety profile and efficacy of anti-GPVI agents. Small GTPases of the Rho family, such as RhoA and Cdc42, are critically involved in the regulation of cytoskeletal rearrangements during platelet activation, but little is known about the specific roles and functional redundancy of both proteins in platelet biogenesis. As shown in the final part of the thesis, combined deficiency of RhoA and Cdc42 led to marked alterations in megakaryocyte morphology and the generation of platelets of heterogeneous size and granule content. Despite severe hemostatic defects and profound thrombo¬cytopenia, circulating RhoA-/-/Cdc42-/- platelets were still capable of granule secretion and the formation of occlusive thrombi. These results implicate the existence of both distinct and overlapping roles of RhoA and Cdc42 in platelet production and function. N2 - Zusammenfassung Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach einer Gefäßverletzung ist entscheidend, um einen starken Blutverlust zu vermeiden. Diese Prozesse können aber auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen führen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall. Die aktivatorischen Thrombozytenrezeptoren Glykoprotein (GP) VI und C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) spielen eine wichtige Rolle im Prozess der Hämostase und Thrombo-Inflammation. Die Aktivierung beider Rezeptoren leitet eine (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-abhängige Signalkaskade ein. Die Adapterproteine Src-like adapter protein (SLAP) und SLAP2 sind an der Regulation der Oberflächenexpression von Immunzellrezeptoren und der Steuerung nachgeschalteter Signalwege beteiligt, aber ihre Funktion in Thrombozyten ist unbekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Einzeldefizienz von SLAP oder SLAP2 in Mäusen einen milden Effekt auf die Thrombozytenfunktion hatte. Hingegen führte das Fehlen beider Proteine zu deutlich verstärkter Signaltransduktion, Integrinaktivierung, Freisetzung von Granula, Aggregation, prokoagulatorischer Aktivität und Thrombingenerierung nach (hem)ITAM-abhängiger, aber nicht G Protein-gekoppelter Rezeptoraktivierung. Die SLAP/SLAP2-Doppeldefizienz ging mit beschleunigter Bildung okklusiver arterieller Thromben und dramatisch verschlechtertem Zustand nach fokaler zerebraler Ischämie einher. Diese Ergebnisse etablieren SLAP und SLAP2 als essentielle Inhibitoren des (hem)ITAM-Signalwegs in arterieller Thrombose und im ischämischen Schlaganfall. GPVI wird zunehmend als vielversprechender neuer pharmakologischer Angriffspunkt für die Behandlung von thrombotischen und entzündlichen Erkrankungen betrachtet. Die genauen Mechanismen der Herabregulierung von GPVI nach Antikörper-Gabe in vivo sind jedoch unvollständig aufgeklärt. Im Hinblick auf die Rolle von SLAP und SLAP2 in der Internalisierung von Immunzellrezeptoren wurde die Hypothese aufgestellt, dass beide Adapterproteine entscheidend an der Herabregulierung von GPVI beteiligt sein könnten. Im zweiten Teil dieser Dissertation wurde aber gezeigt, dass SLAP und SLAP2 nicht erforderlich sind für die Depletion von GPVI. Dagegen ging die Antikörper-induzierte Herabregulierung von GPVI mit lang anhaltender starker Thrombozytopenie in Slap-/-/Slap2-/- Mäusen einher. Der anti-GPVI-Antikörper induzierte eine starke Aktivierung von Slap-/-/Slap2-/- Thrombo¬zyten, nicht aber von Wildtypthrombozyten, was eine mögliche Erklärung für die schwere Thrombozytopenie lieferte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Expression und der Aktivierungszustand von Molekülen, die die Feinregulierung der GPVI-Signalkaskade steuern, wichtige Auswirkungen auf das Sicherheitsprofil und die Wirksamkeit von an GPVI angreifenden Substanzen haben könnten. Kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie, wie z.B. RhoA und Cdc42, sind maßgeblich an der Regulation von Umstrukturierungen des Zytoskeletts während der Aktivierung von Thrombozyten beteiligt. Dennoch ist wenig über spezifische und überlappende Funktionen von RhoA und Cdc42 während der Thrombozyten-Biogenese bekannt. Der letzte Teil der Arbeit befasste sich mit den Auswirkungen einer Doppeldefizienz von RhoA und Cdc42 in Megakaryozyten. Das Fehlen beider Proteine führte zu einer dramatisch veränderten Megakaryozyten¬morphologie und zur Produktion von Thrombozyten heterogener Größe und Granulainhaltes. Trotz markanter Thrombozytopenie und stark beeinträchtigter Hämostase in den RhoA-/-/Cdc42-/- Mäusen waren zirkulierende Thrombozyten in der Lage, ihre Granula freizusetzen, und die Bildung okklusiver Thromben war weitestgehend unverändert. Diese Ergebnisse implizieren, dass RhoA und Cdc42 sowohl unterschiedliche als auch überlappende Rollen in der Produktion und Funktion von Thrombozyten spielen. KW - Thrombozyt KW - Platelets KW - Thrombozytenaggregation KW - platelet aggregation KW - megakaryocyte Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120068 N1 - Aus datenschutzrechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. Eine inhaltlich identische neue Version ist erhältlich unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-30377 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Dominik T1 - Structural Characterization of the TFIIH Subunits p34 and p44 from C. thermophilum T1 - Strukturelle Charakterisierung der TFIIH Untereinheiten p34 und p44 aus C. thermophilum N2 - Several important cellular processes, including transcription, nucleotide excision repair and cell cycle control are mediated by the multifaceted interplay of subunits within the general transcription factor II H (TFIIH). A better understanding of the molecular structure of TFIIH is the key to unravel the mechanism of action of this versatile protein complex within these pathways. This becomes especially important in the context of severe diseases like xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy, that arise from single point mutations in some of the TFIIH subunits. In an attempt to structurally characterize the TFIIH complex, we harnessed the qualities of the eukaryotic thermophile Chaetomium thermophilum, a remarkable fungus, which has only recently been recognized as a novel model organism. Homologues of TFIIH from C. thermophilum were expressed in E. coli, purified to homogeneity and subsequently utilized for crystallization trials and biochemical studies. The results of the present work include the first crystal structure of the p34 subunit of TFIIH, comprising the N-terminal domain of the protein. The structure revealed a von Willebrand Factor A (vWA) like fold, which is generally known to be involved in a multitude of protein-protein interactions. Structural comparison allowed to delineate similarities as well as differences to already known vWA domains, providing insight into the role of p34 within TFIIH. These results indicate that p34 assumes the role of a structural scaffold for other TFIIH subunits via its vWA domain, while likely serving additional functions, which are mediated through its C-terminal zinc binding domain and are so far unknown. Within TFIIH p34 interacts strongly with the p44 subunit, a positive regulator of the XPD helicase, which is required for regulation of RNA Polymerase II mediated transcription and essential for eukaryotic nucleotide excision repair. Based on the p34 vWA structure putative protein-protein interfaces were analyzed and binding sites for the p34 p44 interaction suggested. Continuous crystallization efforts then led to the first structure of a p34 p44 minimal complex, comprising the N-terminal vWA domain of p34 and the C-terminal C4C4 RING domain of p44. The structure of the p34 p44 minimal complex verified the previous hypothesis regarding the involved binding sites. In addition, careful analysis of the complex interface allowed to identify critical residues, which were subsequently mutated and analyzed with respect to their significance in mediating the p34 p44 interaction, by analytical size exclusion chromatography, electrophoretic mobility shift assays and isothermal titration calorimetry. The structure of the p34 p44 complex also revealed a binding mode of the p44 C4C4 RING domain, which differed from that of other known RING domains in several aspects, supporting the hypothesis that p44 contains a novel variation of this domain. N2 - Zelluläre Prozesse, wie beispielsweise die Transkription, die Nukleotid-Exzisionsreparatur und die Kontrolle des Zellzyklus sind abhängig vom vielschichtigen Zusammenspiel der zehn Protein-Untereinheiten des allgemeinen Transkriptionsfaktors II H (TFIIH). Zur Aufklärung der genauen Funktion dieses Komplexes ist ein besseres Verständnis seiner molekularen Struktur essentiell. Besondere Bedeutung erhält der TFIIH dabei im Hinblick auf verschiedene schwerwiegende Krankheiten, wie z.B. Xeroderma pigmentosum (XP), Cockayne-Syndrom (CS) und Trichothiodystrophie (TTD), die als Folge von einzelnen Punkt-Mutationen in bestimmten Untereinheiten des Komplexes entstehen. In der vorliegenden Arbeit wurden zur strukturellen Charakterisierung der TFIIH Untereinheiten p34 und p44 die homologen Proteine aus Chaetomium thermophilum verwendet. Hierbei handelt es sich um einen eukaryotischen und thermophilen Pilz, der erst kürzlich als neuer und vielversprechender Modellorganismus an Bedeutung gewann. Die TFIIH Homologe aus C. thermophilum wurden rekombinant exprimiert, gereinigt und anschließend für Kristallisations-Versuche eingesetzt. Darüber hinaus wurden die Proteine mittels verschiedener biochemischer Verfahren analysiert. Die erzielten Resultate beinhalten unter anderem die erste Kristall-Struktur der p34 Untereinheit des TFIIH und zeigen eine von Willebrand Faktor A (vWA) ähnliche Domäne im N-terminalen Bereich des Proteins. Vergleiche mit bereits bekannten vWA Proteinen liefern Gemeinsamkeiten sowie Unterschiede und erlauben erste Einblicke in die Funktion der p34 Untereinheit innerhalb des TFIIH Komplexes. Die gewonnenen Erkenntnisse legen nahe, dass p34 über seine vWA Domäne anderen TFIIH Untereinheiten als strukturelles Gerüst dient, während die C-terminale Zinkfinger-Domäne des Proteins sehr wahrscheinlich zusätzliche Aufgaben übernimmt, die bisher noch nicht genau bekannt sind. Innerhalb des TFIIH Komplexes ist p34 eng mit der p44 Untereinheit assoziiert. Letztere ist als positiver Regulator der XPD Helikase bekannt, die im Rahmen der RNA Polymerase II vermittelten Transkription und der eukaryotischen Nukleotid-Exzisionsreparatur eine entscheidende Rolle spielt. Basierend auf der erzielten p34ct vWA Struktur wurden verschiedene Interaktions-Flächen zwischen p34 und p44 analysiert und mögliche Bindestellen für die beiden Proteine ermittelt. Weitere Kristallisations-Experimente ermöglichten schließlich die Aufklärung der Struktur eines p34 p44 Minimal-Komplexes, bestehend aus der N-terminalen vWA Domäne von p34 und der C-terminalen C4C4 RING Domäne von p44. Die gewonnenen Struktur-Daten bestätigten die zuvor ermittelte Bindestelle der beiden Proteine. Eine genauere Untersuchung der Kontakt-Fläche zwischen p34 und p44 lieferte darüber hinaus entscheidende Hinweise auf besonders wichtige Interaktions-Bereiche und Aminosäuren, die im Folgenden mutiert wurden, um deren Bedeutung für die Komplexbildung zu ermitteln. Mit Hilfe der analytischen Größenausschluss-Chromatographie, elektro-phoretischer Mobilitäts-Verlagerungs-Assays und isothermaler Titrations-Kalorimetrie konnten hierbei verschiedene Aminosäuren identifiziert werden, die für eine stabile p34 p44 Interaktion erforderlich sind. Ferner zeigte die Struktur des p34 p44 Minimal-Komplexes eine Bindungsweise der p44 C4C4 RING Domäne, die sich von der anderer, bereits bekannter RING Domänen in verschiedenen Punkten unterschied. Diese Erkenntnis bestätigt die zuvor aufgestellte Hypothese, dass es sich im Falle von p44 um eine neue Variante der bereits gut charakterisierten RING Domäne handelt. KW - DNA-Reparatur KW - Transkription KW - Transkriptionsfaktor KW - TFIIH KW - General Transcription Factor II H KW - p34 KW - p44 KW - Tfb4 KW - Ssl1 KW - Chaetomium thermophilum Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104851 ER - TY - THES A1 - Hagen, Franziska T1 - Sphingolipids in gonococcal infection T1 - Sphingolipide in der Gonokokken Infektion N2 - Neisseria gonorrhoeae, the causative agent of the sexually transmitted disease gonorrhea, has the potential to spread in the human host and cause a severe complication called disseminated gonococcal infection (DGI). The expression of the major outer membrane porin PorBIA is a characteristic of most gonococci associated with DGI. PorBIA binds to the scavenger receptor expressed on endothelial cells (SREC-I), which mediates the so-called low phosphate-dependent invasion (LPDI). This uptake mechanism enables N. gonorrhoeae to rapidly invade epithelial and endothelial cells in a phosphate-sensitive manner. We recently demonstrated that the neutral sphingomyelinase, which catalyses the hydrolysis of sphingomyelin to ceramide and phosphorylcholine, is required for the LPDI of gonococci in non-phagocytic cells. Neutral sphingomyelinase 2 (NSM2) plays a key role in the early PorBIA signaling by recruiting the PI3 kinase to caveolin. The following activation of the PI3 kinase-dependent downstream signaling leads to the engulfment of the bacteria. As a part of this work, I could confirm the involvement of the NSM2. The role of the enzyme was further elucidated by the generation of antibodies directed against NSM2 and the construction of an epithelium-based NSM2 knockout cell line using CRISPR/Cas9. The knockout of the NSM2 strongly inhibits the LPDI. The invasion could be, however, restored by the complementation of the knockout using an NSM2-GFP construct. However, the results could not be reproduced. In this work, I could show the involvement of further members of the sphingolipid pathway in the PorBIA-mediated invasion. Lipidome analysis revealed an increase of the bioactive molecules ceramide and sphingosine due to gonococcal infection. Both molecules do not only affect the host cell, but seem to influence the bacteria as well: while ceramide seems to be incorporated by the gonococci, sphingosine is toxic for the bacteria. Furthermore, the sphingosine kinase 2 (SPHK2) plays an important role in invasion, since the inhibition and knockdown of the enzyme revealed a negative effect on gonococcal invasion. To elucidate the role of the sphingosine kinases in invasion in more detail, an activity assay was established in this study. Additionally, the impact of the sphingosine-1-phosphate lyase (S1PL) on invasion was investigated. Inhibitor studies and infection experiments conducted with a CRISPR/Cas9 HeLa S1PL knockout cell line revealed a role of the enzyme not only in the PorBIA-mediated invasion, but also in the Opa50/HSPG-mediated gonococcal invasion. The signaling experiments allowed the categorization of the SPHK and S1PL activation in the context of infection. Like the NSM2, both enzymes play a role in the early PorBIA signaling events leading to the uptake of the bacteria. All those findings indicate an important role of sphingolipids in the invasion and survival of N. gonorrhoeae. In the last part of this work, the role of the NSM2 in the inhibition of apoptosis in neutrophils due to gonococcal infection was investigated. It could be demonstrated that the delayed onset of apoptosis is independent of neisserial porin and Opa proteins. Furthermore, the influence of neisserial peptidoglycan on PMN apoptosis was analysed using mutant strains, but no connection could be determined. Since the NSM2 is the most prominent sphingomyelinase in PMNs, fulfils manifold cell physiological functions and has already been connected to apoptosis, the impact of the enzyme on apoptosis inhibition due to gonococcal infection was investigated using inhibitors, with no positive results. N2 - Neisseria gonorrhoeae, der Auslöser der sexuell übertragbaren Krankheit Gonorrhö, hat das Potenzial sich im menschlichen Wirt auszubreiten und eine schwere Komplikation, die disseminierende Gonokokkeninfektion (DGI), hervorzurufen. Die Expression des Porins PorBIA, das eines der häufigsten Proteine der äußeren Membran ist, stellt ein Charakteristikum der mit DGI assoziierten Gonokokken dar. PorBIA bindet an SREC-I (scavenger receptor expressed on endothelial cells), der die phosphatabhängige Invasion (low phosphate-dependent invasion LPDI) vermittelt. Dieser Aufnahmemechanismus erlaubt es N. gonorrhoeae Epithel- sowie Endothelzellen, schnell zu invadieren. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die neutrale Sphingomyelinase 2 (NSM2), welche die Hydrolyse von Sphingomyelin zu Ceramid und Phosphorylcholin katalysiert, für die LPDI der Gonokokken in nicht-phagozytische Zellen benötigt wird. Dabei spielt die neutrale Sphingomyelinase 2 eine Schlüsselrolle in der frühen PorBIA Signalübertragung, indem sie die PI3 Kinase zu Caveolin rekrutiert. Die darauffolgende Aktivierung von nachgeschalteten Signalwegen, die von der PI3 Kinase abhängig sind, führt zur Aufnahme der Bakterien. Als Teil dieser Arbeit konnte ich die Beteiligung der NSM2 bestätigen. Die Rolle des Enzyms sollte durch die Herstellung von NSM2-spezifischen Antikörpern und einer auf Epithelzellen basierenden NSM2 knockout Zelllinie, die mit Hilfe des CRISPR/Cas9 Systems hergestellt wurde, aufgeklärt werden. Der knockout der NSM2 führte zu einer starken Inhibition der LPDI. Die Invasion konnte jedoch durch die Komplementation mit Hilfe eines NSM2-GFP Konstruktes wiederhergestellt werden. Wobei die Ergebnisse jedoch nicht reproduziert werden konnten. In dieser Arbeit konnte ich die Beteiligung weiterer Mitglieder des Sphingolipid Signalwegs an der PorBIA-vermittelten Invasion zeigen. Die Lipidomanalysen zeigten einen Anstieg der bioaktiven Moleküle Ceramide und Sphingosin aufgrund der Gonokokkeninfektion. Beide Moleküle beeinflussen nicht nur die Wirtszelle, sondern schienen auch Auswirkungen auf die Bakterien selbst zu haben: während Ceramid anscheinend von den Gonokokken aufgenommen wird, ist Sphingosin für die Bakterien toxisch. Weiterhin spielt die Sphingosinkinase 2 (SPHK2) eine wichtige Rolle in der Invasion, da die Inhibierung und der Knockdown des Enzyms die Gonokokkeninfektion negativ beeinflussen. Um die Rolle der Sphingosinkinasen in der Invasion im Detail zu erforschen, wurde in dieser Arbeit ein Aktivitätsassay etabliert. Außerdem wurde der Einfluss der Sphingosin-1-phosphat Lyase (S1PL) auf die Invasion erforscht. Inhibitorstudien und Infektionsexperimente, die mit einer CRISPR/Cas9 HeLa S1PL knockout Zelllinie durchgeführt wurden, zeigten, dass das Enzym nicht nur eine Rolle in der PorBIA-vermittelten, sondern auch in der Opa50/HSPG-vermittelten Gonokokkeninfektion spielt. Die Experimente, die bezüglich der zugrundeliegenden Signalwege durchgeführt wurden, erlaubten die Einordnung der Aktivierung der SPHK und der S1PL im Kontext der Invasion. Wie auch die NSM2, spielen beide Enzyme in der frühen PorBIA Signalübertragung eine Rolle, die schließlich zur Aufnahme der Bakterien führt. Alle diese Ergebnisse weisen auf eine wichtige Rolle der Sphingolipide für die Invasion und das Überleben von N. gonorrhoeae hin. Im letzten Teil dieser Arbeit, wurde die Inhibierung der Apoptose von Neutrophilen aufgrund der Gonokokkeninfektion untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das verspätete Einsetzen der Apoptose von neisseriellen Porinen und Opa Proteinen unabhängig ist. Weiterhin wurde der Einfluss von neisseriellem Peptidoglycan auf die Apoptose der Neutrophilen mit Hilfe von Mutanten untersucht, wobei eine Verbindung nicht bestätigt werden konnte. Da die NSM2 die bedeutendste Sphingomyelinase in Neutrophilen darstellt, sowie vielfältige zellphysiologische Funktionen erfüllt und im Vorfeld schon mit der Apoptose in Verbindung gebracht wurde, wurde der Einfluss des Enzymes auf die Inhibierung der Apoptose durch die Gonokokkeninfektion mit Hilfe von Inhibitoren überprüft. KW - gonococcal KW - sphingolipids KW - gonococcal infection Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153852 ER -