TY - THES A1 - Danner, Nadja T1 - Honey bee foraging in agricultural landscapes T1 - Sammelverhalten von Honigbienen in der Agrarlandschaft N2 - 1. Today honey bee colonies face a wide range of challenges in modern agricultural landscapes which entails the need for a comprehensive investigation of honey bees in a landscape context and the assessment of environmental risks. Within this dissertation the pollen foraging of honey bee colonies is studied in different agricultural landscapes to gain insight into the use of pollen resources and the influence of landscape structure across the season. General suggestions for landscape management to support honey bees and other pollinators are derived. 2. Decoding of waggle dances and a subsequent spatial foraging analysis are used as methods in Chapters 4 and 5 to study honey bee colonies in agricultural landscapes. The recently developed metabarcoding of mixed pollen samples was applied for the first time in honey bee foraging ecology and allowed for a detailed analysis of pollen, that was trapped from honey bees in front hive entrances (Chapter 6). 3. Pollen identification through molecular sequencing and DNA barcoding has been proposed as an alternative approach to light microscopy, which still is a tedious and error-prone task. In this study we assessed mixed pollen probes through next-generation sequencing and developed a bioinformatic workflow to analyse these high-throughput data with a newly created reference database. To evaluate the feasibility, we compared results from classical identification based on light microscopy from the same samples with our sequencing results. Abundance estimations from sequencing data were significantly correlated with counted abundances through light microscopy. Next-generation sequencing thus presents a useful and efficient workflow to identify pollen at the genus and species level without requiring specialized palynological expert knowledge. 4. During maize flowering, four observation hives were placed in and rotated between 11 landscapes covering a gradient in maize acreage. A higher foraging frequency on maize fields compared to other landuse types showed that maize is an intensively used pollen resource for honey bee colonies. Mean foraging distances were significantly shorter for maize pollen than for other pollen origins, indicating that effort is put into collecting a diverse pollen diet. The percentage of maize pollen foragers did not increase with maize acreage in the landscape and was not reduced by grassland area as an alternative pollen resource. Our findings allow estimating the distance-related exposure risk of honey bee colonies to pollen from surrounding maize fields treated with systemic insecticides. 5. It is unknown how an increasing area of mass-flowering crops like oilseed rape (OSR) or a decrease of semi-natural habitats (SNH) change the temporal and spatial availability of pollen resources for honey bee colonies, and thus foraging distances and frequency in different habitat types. Sixteen observation hives were placed in and rotated between 16 agricultural landscapes with independent gradients of OSR and SNH area within 2 km to analyze foraging distances and frequencies. SNH and OSR reduced foraging distance at different spatial scales and depending on season, with possible benefits for the performance of honey bee colonies. Frequency of pollen foragers per habitat type was equally high for SNH, grassland and OSR fields, but lower for other crops and forest. In landscapes with a small proportion of SNH a significantly higher density of pollen foragers on SNH was observed, indicating the limitation of pollen resources in simple agricultural landscapes and the importance of SNH. 6. Quantity and diversity of collected pollen can influence the growth and health of honey bee colonies, but little is known about the influence of landscape structure on pollen diet. In a field experiment we rotated 16 honey bee colonies across 16 agricultural landscapes (see also Chapter 5), used traps to get samples of collected pollen and observed the intra-colonial dance communication to gain information about foraging distances. Neither the amount of collected pollen nor pollen diversity were related to landscape diversity. The revealed increase of foraging distances with decreasing landscape diversity suggests that honey bees compensate for a lower landscape diversity by increasing their pollen foraging range in order to maintain pollen amount and diversity. 7. Our results show the importance of diverse pollen resources for honey bee colonies in agricultural landscapes. Beside the risk of exposure to pesticides honey bees face the risk of nutritional deficiency with implications for their health. By modifying landscape composition and therefore availability of resources we are able to contribute to the wellbeing of honey bees. Agri-environmental schemes aiming to support pollinators should focus on possible spatial and temporal gaps in pollen availability and diversity in agricultural landscapes. N2 - 1. Honigbienen stehen heutzutage vor einer Vielzahl von Herausforderungen in der modernen Agrarlandschaft, was umfassende Untersuchungen von Honigbienen im Landschafskontext erforderlich macht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Pollensammeln von Honigbienenvölkern in verschiedenen Agrarlandschaften studiert, um Einblick in die Nutzung von Pollenressourcen und auf den Einfluss der Landschaftsstruktur zu gewinnen. 2. Die Dekodierung von Schwänzeltänzen und eine anschließende räumliche Analyse des Sammelverhaltens werden als Methoden in den Kapiteln 4 und 5 eingesetzt, um Bienenvölker in Agrarlandschaften zu untersuchen. Das kürzlich entwickelte Metabarcoding von gemischten Pollenproben wurde zum ersten Mal in der Honigbienenökologie angewandt und ermöglichte eine detaillierte Analyse von Pollenproben, die per Pollenfallen vor den Stockeingängen gesammelt wurden (Kapitel 6). 3. Pollenbestimmung durch molekulare Sequenzierung und DNA Barcoding wurde als Alternative zur Lichtmikroskopie vorgeschlagen, die immer noch sehr mühsam und fehlerbehaftet ist. In dieser Studie bestimmten wir gemischte Pollenproben durch Next-Generation-Sequenzierung und entwickelten einen bioinformatischen Arbeitsablauf um diese Hochdurchsatz-Daten mit einer neu kreierten Referenzdatanbank zu analysieren. Um die Durchführbarkeit zu evaluieren verglichen wir Ergebnisse aus der klassischen Identifizierung via Lichtmikroskopie derselben Proben mit unseren Sequenzier-Ergebnissen. Häufigkeitsschätzungen auf Basis der Sequenzierdaten waren signifikant mit den gezählten Häufigkeiten via Lichtmikroskopie korreliert. Next-Generation-Sequenzierung stellt daher einen nützlichen und effizienten Arbeitsablauf dar, um Pollen auf dem Gattungs- und Artniveau zu bestimmen ohne spezielles palynologisches Expertenwissen zu benötigen. 4. Während der Maisblüte wurden vier Beobachtungsstöcke in 11 Landschaften mit einem Maisflächengradienten platziert und zwischen diesen rotiert. Maisfelder wurden intensiver genutzt als Flächen anderer Landnutzungstypen. Die mittleren Sammeldistanzen waren signifikant niedriger für Maispollen als Pollen anderer Herkunft, was darauf hinweist, dass Aufwand in das Sammeln einer diversen Pollendiät gesetzt wird. Der Anteil an Maispollensammlerinnen stieg nicht mit der Maisanbaufläche in der Landschaft und wurde nicht durch Grünlandfläche als alternative Pollenressource reduziert. Unsere Ergebnisse ermöglichen die Schätzung des entfernungsbezogenen Expositionsrisikos von Honigbienenvölker auf Pollen aus den umliegenden Maisfeldern, die mit systemischen Insektiziden behandelt werden. 5. Es ist nicht bekannt, wie eine Zunahme von Massentrachten wie Raps (OSR) oder eine Abnahme von halbnatürlichen Habitaten (SNH) die zeitliche und räumliche Verfügbarkeit von Pollenressourcen für die Honigbienen, und damit Sammeldistanzen und -frequenzen in verschiedenen Lebensraumtypen verändert. Sechzehn Beobachtungsstöcke wurden in 16 Agrarlandschaften mit unabhängigen Gradienten an OSR- und SNH-Fläche innerhalb von 2 km platziert und regelmäßig rotiert, um Sammeldistanzen und -frequenzen zu analysieren. SNH und OSR reduzierten die Sammeldistanzen auf verschiedenen räumlichen Skalen und je nach Saison, mit möglichen Vorteilen für die Leistungsfähigkeit von Bienenvölkern. Die Häufigkeit der Pollensammler pro Habitattyp war gleich hoch für SNH, Grünland und OSR, aber niedriger für andere Kulturen und Wald. In Landschaften mit einem kleinen Anteil von SNH wurde eine deutlich höhere Dichte von Pollensammlerinnen auf SNH beobachtet, was auf die Begrenzung der Pollenressourcen in einfachen Agrarlandschaften und die Bedeutung von SNH hinweist. 6. Menge und Diversität des gesammelten Pollens können das Wachstum und die Gesundheit von Honigbienenvölkern beeinflussen, aber es ist wenig über den Einfluss der Landschaftsstruktur auf die Pollendiät bekannt. In einem Feldexperiment rotierten wir 16 Honigbienenkolonien über 16 Agrarlandschaften (siehe auch Kapitel 5), nutzten Pollenfallen um Proben des gesammelten Pollens zu nehmen und beobachteten die intrakoloniale Tanzkommunikation, um Informationen über die Sammeldistanzen zu erhalten. Weder Pollenmenge noch -diversität waren von der Landschaftsdiversität abhängig. Der offenbarte Anstieg von Sammeldistanzen mit abnehmender Landschaftsdiversität legt nahe, dass Honigbienen durch die Erweiterung des Pollensammelbereichs eine niedrigere Landschaftsdiversität kompensieren, um Pollenmenge und -diversität zu erhalten. 7. Unsere Ergebnisse zeigen die Bedeutung eines diversen Pollenangebots für Bienenvölker in der Agrarlandschaft. Neben dem Risiko einer Exposition gegenüber Pestiziden, stehen Bienenvölker vor der Gefahr von Mangelernährung mit Auswirkungen auf ihre Gesundheit. Durch eine Änderung der Landschaftzusammensetzung und damit der Verfügbarkeit von Ressourcen können wir zum Wohlergehen der Honigbienen beitragen. Agrarumweltmaßnahmen mit dem Ziel Bestäuber zu unterstützen, sollten sich auf mögliche räumliche und zeitliche Lücken in der Pollenverfügbarkeit und Vielfalt in der Agrarlandschaft konzentrieren. KW - Apis mellifera KW - Zea mays KW - Resource Use KW - Exposure Risk KW - Oilseed Rape KW - foraging distances KW - Sammeldistanzen KW - semi-natural habitat KW - halbnatürliche Habitate KW - next-generation sequencing KW - pollen KW - Pollen KW - Next-Generation Sequenzierung KW - Landschaftsstruktur KW - landscape structure Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139322 ER - TY - THES A1 - Kuen, Janina T1 - Influence of 3D tumor cell/fibroblast co-culture on monocyte differentiation and tumor progression in pancreatic cancer T1 - Einfluss von 3D Tumorzell/Fibroblasten Ko-kulturen auf die Monozyten Differenzierung und das Tumorwachstum bei Bauchspeicheldrüsenkrebs N2 - Pancreatic cancer (PC) remains one of the most challenging solid tumors to treat with a high unmet medical need as patients poorly respond to standard-of-care-therapies. Prominent desmoplastic reaction involving cancer-associated fibroblasts (CAFs) and the immune cells in the tumor microenvironment (TME) and their cross-talk play a significant role in tumor immune escape and progression. To identify the key cellular mechanisms induce an immunosuppressive tumor microenvironment, we established 3D co-culture model with pancreatic cancer cells, CAFs, monocyte as well as T cells. Using this model, we analysed the influence of tumor cells and fibroblasts on monocytes and their immune suppressive phenotype. Phenotypic characterization of the monocytes after 3D co-culture with tumor/fibroblast spheroids was performed by analysing the expression of defined cell surface markers and soluble factors. Functionality of these monocytes and their ability to influence T cell phenotype and proliferation was investigated. 3D co-culture of monocytes with pancreatic cancer cells and fibroblasts induced the production of immunosuppressive cytokines which are known to promote polarization of M2 like macrophages and myeloid derived suppressive cells (MDSCs). These co-culture spheroid polarized monocyte derived macrophages (MDMs) were poorly differentiated and had an M2 phenotype. The immunosuppressive function of these co-culture spheroids polarized MDMs was demonstrated by their ability to inhibit autologous CD4+ and CD8+ T cell activation and proliferation in vitro, which we could partially reverse by 3D co-culture spheroid treatment with therapeutic molecules that are able to re-activate spheroid polarized MDMs or block immune suppressive factors such as Arginase-I. In conclusion, we generated a physiologically relevant 3D co-culture model, which can be used as a promising tool to study complex cell-cell interactions between different cell types within the tumor microenvironment and to support drug screening and development. In future, research focused on better understanding of resistance mechanisms to existing cancer immunotherapies will help to develop new therapeutic strategies in order to combat cancer. N2 - Bei Bauchspeicheldrüsenkrebs handelt es sich um eine maligne Tumorerkrankung, deren Behandlung Ärzte noch immer vor große Herausforderungen stellen und die zur dritthäufigsten krebsbedingten Todesursache der westlichen Welt zählt. Desmoplastische Reaktionen im Tumorgewebe sind hierbei ein besonderes Merkmal dieser Erkrankung. Dabei spielen tumor-assoziierte Fibroblasten sowie unterschiedliche Zellen des Immunsystems und deren Interaktionen eine essentielle Rolle hinsichtlich Tumorwachstum und der Herunterregulation des Immunsystems. Um zelluläre Mechanismen, die ein immunsuppressives Tumormilieu induzieren, zu identifizieren, entwickelten wir ein 3D Ko-Kultur Modell mit Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, tumor-assoziierten Fibroblasten sowie Monozyten und T-Zellen. Mit Hilfe dieses Modells konnten wir den Einfluss von Tumorzellen und Fibroblasten auf den Phänotyp und das Verhalten von Monozyten untersuchen. Dazu wurden Monozyten in einer 3D Tumorzell/Fibroblasten Ko-Kultur kultiviert und differenziert, um anschließend die Expression definierter Zelloberflächenmarker und löslicher Faktoren zu analysieren. Des Weiteren wurde das Verhalten dieser 3D Ko-Kultur differenzierten myeloiden Zellpopulation sowie ihre Fähigkeit den Phänotyp von T Zellen und deren Proliferation zu beeinflussen untersucht. Die 3D Ko-Kultur der Monozyten zusammen mit den Tumorzellen und den Fibroblasten führten zur Produktion immunsuppressiver Zytokine und Chemokine, wodurch die Differenzierung der Monozyten in M2-ähnliche Makrophagen induziert wurde. Diese durch die 3D Tumorzell/Fibroblasten Sphäroide polarisierten aus Monozyten herangereiften M2-ähnlichen Makrophagen besaßen außerdem immunsuppressive funktionelle Eigenschaften, indem sie in der Lage waren, die Aktivierung und Proliferation von autologen CD4+ und CD8+ T Zellen in vitro zu inhibieren. Die Suppression sowohl der CD4+ als auch der CD8+ T Zellen konnte durch die Behandlung therapeutischer Moleküle, die die Re-Aktivierung der immunsuppressiven 3D Sphäroid polarisierten Makrophagen stimulierten oder suppressive Faktoren wie Arginase-I blockierten, wieder aufgehoben und die T Zell Proliferation teilweise wiederhergestellt werden. Unser etabliertes 3D Ko-Kultur System repräsentiert ein vielversprechendes physiologisch relevantes Modell, welches genutzt werden kann, um Zell-Zell Interaktion und Kommunikation im Tumormilieu zu untersuchen und dadurch die Wirkung von Medikamenten zu verbessern. Ein gezieltes besseres Verständnis von Tumorresistenz Mechanismen gegen bereits bestehende Immun Therapien fördert die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze zur Bekämpfung von Krebs. KW - monocyte KW - pancreatic cancer KW - 3D cell culture KW - monocyte differentiation KW - Bauchspeicheldrüsenkrebs KW - fibroblasts KW - TAMs KW - 3D Ko-kulture KW - Monozytendifferenzierung KW - Fibroblasten Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156226 ER - TY - THES A1 - Ritter, Cathrin T1 - Scientific basics for new immunotherapeutic approaches towards Merkel cell carcinoma T1 - Grundlagen neuer immuntherapeutischer Ansätze gegen das Merkelzellkarzinom N2 - Merkel cell carcinoma (MCC) is an aggressive neuroendocrine skin cancer that has been associated with the Merkel cell polyomavirus (MCPyV). Indeed, MCC is one of the cancers with the best-established viral carcinogenesis. Despite persistence of the virus in MCC cells and the subsequent expression of viral antigens, the majority of MCC tumors are able to escape the surveillance of the immune system. Therefore the aim of the here presented thesis was to scrutinize immune escape mechanisms operative in MCC. A better understanding of their underlying molecular processes should allow to improve immunotherapeutic treatment strategies for MCC patients. The manuscripts included in this thesis characterize three novel immune evasion strategies of MCC. I) the epigenetic silencing of the NKG2D ligands MICA and MICB via histone H3 hypoacetylation II) reduced HLA class I surface expression via epigenetic silencing of the antigen processing machinery (APM) III) the activation of the PI3K-AKT pathway in a mutation independent manner as potential immune escape strategy MCC tumors and MCC cell lines were analyzed for their expression of MICA/B, HLA and components of the antigen processing machinery as well as for the activation of the PI3K-AKT pathway in situ and in vitro. These analysis reviled MICA and MICB, as well as HLA class I were not expressed or at least markedly reduced in ~80% of MCCs in situ. The PI3K-AKT pathway, that had only recently been demonstrated to play a significant role in tumor immune escape, was activated in almost 90% of MCCs in situ. To determine the underlying molecular mechanisms of these aberrations well characterized MCC cell lines were further analyzed in vitro. The fact that the PI3K-AKT pathway activation was due to oncogenic mutations in the PIK3CA or AKT1 gene in only 10% of MCCs, suggested an epigenetic regulation of this pathway in MCC. In line with this MICA/B as well as components of the APM were indeed silenced epigenetically via histone hypoacetylation in their respective promoter region. Notably MICA/B and HLA class I expression on the cell surface of MCC cells could be restored after treatment with HDAC inhibitors in combination with the Sp1 inhibitor Mithramycin A in all analyzed MCC cell lines in vitro and in a xenotransplantation mouse model in vivo. Moreover inhibition of HDACs increased immune recognition of MCC cell lines in a MICA/B and HLA class I dependent manner. Several studies have accumulated evidence that immunotherapy is a promising treatment option for MCC patients due to the exquisite immunogenicity of this malignancy. However, current immunotherapeutic interventions towards solid tumors like MCC have to account for the plentitude of tumor immune escape strategies, in order to increase response rates. The immune escape mechanisms of MCC described in this thesis can be reverted by HDAC inhibition, thus providing the rationale to combine ‘epigenetic priming’ with currently tested immunotherapeutic regimens. N2 - Das Merkelzellkarzinom (MCC) ist ein aggressiver neuroendokriner Hautkrebs, der mit dem Merkelzell-Polyomavirus (MCPyV) assoziiert ist. Das MCC ist eine der Krebserkrankungen mit der am besten etablierten viralen Karzinogenese. Trotz der Anwesenheit des MCPyV in MCC-Zellen und der daraus einhergehenden Expression viraler Antigene sind die meisten MCC-Tumoren in der Lage der Überwachung durch das Immunsystem zu entgehen. Aus diesem Grund war das Ziel der hier vorliegenden Arbeit, neue im MCC operative „immune escape“ Mechanismen zu ermitteln. Ein besseres Verständnis der hierbei zugrunde liegenden Mechanismen, sollte es ermöglichen, immuntherapeutische Behandlungsstrategien für MCC-Patienten zu verbessern. Die vorgestellten Manuskripte beschreiben drei neuartige „immune evasion“ Strategien des MCC: I) die epigenetische Inaktivierung der NKG2D-Liganden MICA und MICB mittels Histone-H3-Hypoacetylierung II) eine reduzierte HLA Klasse I-Oberflächenexpression aufgrund epigenetischer Inaktivierung der Antigenprozessierungsmaschinerie (APM) III) die mutationsunabhängige Aktivierung des PI3K-AKT-Signalweges, als potentieller „immune escape“ Mechanismus MCC-Tumoren und MCC-Zelllinien wurden sowohl bezüglich der Expression von MICA/B, HLA Klasse I und Komponenten der APM als auch auf die Aktivierung des PI3K Signalweges in situ und in vitro untersucht. Diese Analysen zeigten, dass sowohl MICA und MICB als auch HLA Klasse I in ca. 80% der MCC-Tumoren in situ nicht, oder nur sehr reduziert, exprimiert wurden. Der PI3K-AKT-Signalweg, welcher erst kürzlich mit Tumor „immune escape“ in Verbindung gebracht wurde, war in fast 90% aller MCC-Tumoren in situ aktiviert. Um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen dieser Aberrationen zu entschlüsseln, wurden gut charakterisierte MCC-Zelllinien in vitro untersucht. Die Tatsache, dass der PI3K-AKT-Signalweg in nur 10% der MCCs auf Mutationen im PI3KA- oder AKT1-Gen zurückzuführen war, suggeriert eine epigenetische Regulation dieses Signalwegs. In Übereinstimmung hiermit waren sowohl MICA/B als auch Gene der APM epigenetisch mittels Histon-Hypoacetylierung in ihren jeweiligen Promoterregionen inaktiviert. Bemerkenswerterweise konnten in vitro und in einem Xenotransplantations-Mausmodell in vivo sowohl die MICA/B als auch die HLA Klasse I-Oberflächenexpression aller untersuchter MCC-Zelllinien durch die Behandlung mit HDAC-Inhibitoren in Kombination mit dem Sp1-Inhibitor Mithramycin A wieder hergestellt werden. Des Weiteren erhöhte die Inhibition von HDACs die MCC-Immunerkennung auf eine MICA/B und HLA Klasse I-abhängige Weise. Zahlreiche aktuelle Studien bestärken die Annahme, dass aufgrund der besonderen Immunogenität des MCC, die Immuntherapie eine aussichtsreiche Behandlungsoption für MCC-Patienten darstellt. Nichtsdestotrotz müssen die derzeitigen immuntherapeutischen Methoden zur Behandlung solider Tumore die Vielzahl von Tumor „immune escape“ Mechanismen mitberücksichtigen, um die Ansprechrate zu erhöhen. Die Tatsache, dass die hier beschriebenen „immune escape“ Mechanismen durch HDAC-Inhibition aufgehoben werden können, spricht für die Hypothese, dass eine Kombination von „epigenetischem Priming“ mit derzeitig untersuchten immuntherapeutischen Ansätzen sinnvoll ist. KW - Merkel-Zellkarzinom KW - Merkel cell carcinoma KW - Epigenetics KW - MICA KW - MICB KW - Tumor Immunology KW - Immune Escape Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124162 ER - TY - THES A1 - Borst, Andreas T1 - Apoptosis & senescence: cell fate determination in inhibitor-treated melanoma cells T1 - Apoptose & Seneszenz: Bestimmung der Zell-spezifischen Reaktion von Melanomzellen auf Inhibitoren N2 - Neoplasms of the skin represent the most frequent tumors worldwide; fortunately, most of them are benign or semi-malignant and well treatable. However, the two most aggressive and deadly forms of malignant skin-neoplasms are melanoma and Merkel cell carcinoma (MCC), being responsible for more than 90% of skin-cancer related deaths. The last decade has yielded enormous progress in melanoma therapy with the advent of targeted therapies, like BRAF or MEK inhibitors, and immune-stimulating therapies, using checkpoint antibodies targeting CTLA- 4, PD-1 or PD-L1. Very recent studies suggest that also MCC patients benefit from a treatment with checkpoint antibodies. Nevertheless, in an advanced metastatic stage, a cure for both of these aggressive malignancies is still hard to achieve: while only a subset of patients experience durable benefit from the immune-based therapies, the widely applicable targeted therapies struggle with development of resistances that inevitably occur in most patients, and finally lead to their death. The four articles included in this thesis addressed current questions concerning therapy and carcinogenesis of melanoma and MCC. Moreover, they are discussed in the light of the up-to-date research regarding targeted and immune-based therapies. In article I we demonstrated that besides apoptosis, MAPK pathway inhibition in BRAF-mutated melanoma cells also induces senescence, a permanent cell cycle arrest. These cells may provide a source for relapse, as even permanently arrested cancer cells can contribute to a pro-tumorigenic milieu. To identify molecular factors determining the differential response, we established M14 melanoma cell line derived single cell clones that either undergo cell death or arrest when treated with BRAF/MEK inhibitors. Using these single cell clones, we demonstrated in article IV that downregulation of the pro-apoptotic BH3-only protein BIK via epigenetic silencing is involved in apoptosis deficiency, which can be overcome by HDAC inhibitors. These observations provide a possible explanation for the lack of a complete and durable response to MAPK inhibitor treatment in melanoma patients, and suggest the application of HDAC inhibitors as a complimentary therapy to MAPK pathway inhibition. Concerning MCC, we scrutinized the interactions between the Merkel cell polyomavirus’ (MCV) T antigens (TA) and the tumor suppressors p53 and Rb in article II and III, respectively. In article III, we demonstrated that the cell cycle master regulator Rb is the crucial target of MCV large T (LT), while it - in contrast to other polyomavirus LTs - exhibits much lower affinity to the related proteins p107 and p130. Knockdown of MCV LT led to proliferation arrest in MCC cells, which can be rescued by knockdown of Rb, but not by knockdown of p107 and p130. Contrary to Rb, restriction of p53 in MCC seems to be independent of the MCV TAs, as we demonstrated in article II. In conclusion, the presented thesis has revealed new molecular details, regarding the response of melanoma cells towards an important treatment modality and the mechanisms of viral carcinogenesis in MCC. N2 - Die häufigsten Tumore weltweit sind Neoplasien der Haut; glücklicherweise sind die meisten dieser benigne oder semi-maligne und gut behandelbar. Die beiden aggressivsten und tödlichsten Formen bösartiger Hauttumoren sind das Melanom und das Merkelzell-Karzinom (MCC), welche verantwortlich für über 90% aller durch Hauttumore verursachten Todesfälle sind. Im letzten Jahrzehnt gab es jedoch erstaunliche Fortschritte in der Therapie des malignen Melanoms, was vor allem durch das Aufkommen der zielgerichteten Therapien wie den BRAF oder MEK Inhibitoren und den immunstimulierenden Therapien, welche Checkpoint-Antikörper gegen CTLA-4, PD-1 oder PD-L1 verwenden, bedingt ist. Neueste Studien legen nahe, dass auch MCC Patienten von diesen Checkpoint-Antikörpern profitieren können. In fortgeschrittenen, metastasierten Stadien ist jedoch für beide Malignitäten eine Heilung immer noch sehr schwer erreichbar: nur eine kleine Gruppe der Patienten erreichen einen dauerhaften Nutzen durch die Immuntherapien, während die breit anwendbaren zielgerichteten Therapien mit der Entwicklung von Resistenzen zu kämpfen haben, welche unausweichlich in den meisten Patienten entstehen und letztendlich zu deren Tod führen. Die vier dieser Dissertation beigefügten Publikationen adressierten aktuelle Fragestellungen bezüglich Therapie und Karzinogenese des Melanoms und des MCCs. Des Weiteren werden diese im Licht des heutigen Forschungsstandes diskutiert, im Besonderen mit Blick auf die zielgerichteten und immunbasierten Therapien. In Publikation I zeigten wir, dass Inhibition des MAPK Signalwegs in BRAF-mutierten Melanom-Zellen neben Apoptose auch zu Seneszenz, einem permanenten Zellzyklusarrest, führen kann. Diese Zellen können der Ursprung der Resistenzbildung sein, da auch permanent arretierte Krebszellen zu einem Tumor-fördernden Milieu beitragen können. Um molekulare Faktoren zu identifizieren, die für diese unterschiedliche Behandlungsreaktion ursächlich sind, haben wir Einzelzellklone aus der M14 Melanom-Zelllinie etabliert, welche entweder mit Zelltod oder Arrest auf die BRAF/MEK Inhibitor Behandlung reagieren. Mit Hilfe dieser Klone zeigten wir in Publikation IV, dass die Herunterregulierung des pro-apoptotischen BH3-only Proteins BIK durch einen epigenetischen Mechanismus zur Apoptose-Resistenz dieser Zellen führt, was durch den Einsatz von HDAC-Inhibitoren umgangen werden kann. Diese Beobachtungen bieten eine mögliche Erklärung für das Ausbleiben eines vollständigen und dauerhaften Ansprechens auf die MAPK-Inhibitor Behandlung der Melanom-Patienten, und legen den Einsatz von HDAC-Inhibitoren als komplementäre Therapieoption nahe. Beim MCC haben wir jeweils die Interaktion zwischen den Merkelzell-Polyomavirus (MCV) T Antigenen (TA) und den Tumor-Suppressoren p53 und Rb in Publikation II und III näher betrachtet. In Publikation III haben wir gezeigt, dass das zentrale, Zellzyklus-regulierende Protein Rb das vorrangige Ziel des MCV large T Antigens (LT) ist, während es - im Gegensatz zu anderen Polyomavirus-LTs - viel weniger Affinität zu den verwandten Proteinen p107 und p 130 aufweist. Der Knockdown des MCV LT führte zu Proliferationsarrest in MCC Zellen, welcher durch Knockdown von Rb aufgehoben werden konnte, nicht jedoch durch Knockdown von p107 und p130. Die Restriktion von p53 scheint im Gegensatz zu Rb im MCC unabhängig von den MCV TAs zu sein, wie wir in Publikation II gezeigt haben. Zusammenfassend gibt diese Dissertation Aufschluss über neue molekulare Zusammenhänge bezüglich der Reaktion von Melanom-Zellen gegenüber einer wichtigen Behandlungsmöglichkeit und den Mechanismen der viralen Karzinogenese des MCC. KW - Melanom KW - Apoptosis KW - MAP-Kinase KW - Senescence KW - BRAF inhibition Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155085 ER - TY - THES A1 - Scholz, Nicole T1 - Genetic analyses of sensory and motoneuron physiology in Drosophila melanogaster T1 - Genetische Analyse sensorischer und motoneuronaler Physiologie in Drosophila melanogaster N2 - During my PhD I studied two principal biological aspects employing Drosophila melanogaster. Therefore, this study is divided into Part I and II. Part I: Bruchpilot and Complexin interact to regulate synaptic vesicle tethering to the active zone cytomatrix At the presynaptic active zone (AZ) synaptic vesicles (SVs) are often physically linked to an electron-dense cytomatrix – a process referred to as “SV tethering”. This process serves to concentrate SVs in close proximity to their release sites before contacting the SNARE complex for subsequent fusion (Hallermann and Silver, 2013). In Drosophila, the AZ protein Bruchpilot (BRP) is part of the proteinous cytomatrix at which SVs accumulate (Kittel et al., 2006b; Wagh et al., 2006; Fouquet et al., 2009). Intriguingly, truncation of only 1% of the C-terminal region of BRP results in a severe defect in SV tethering to this AZ scaffold (hence named brpnude; Hallermann et al., 2010b). Consistent with these findings, cell-specific overexpression of a C-terminal BRP fragment, named mBRPC-tip (corresponds to 1% absent in brpnude; m = mobile) phenocopied the brpnude mutant in behavioral and functional experiments. These data indicate that mBRPC-tip suffices to saturate putative SV binding sites, which induced a functional tethering deficit at motoneuronal AZs. However, the molecular identity of the BRP complement to tether SVs to the presynaptic AZ scaffold remains unknown. Moreover, within larval motoneurons membrane-attached C-terminal portions of BRP were sufficient to tether SVs to sites outside of the AZ. Based on this finding a genetic screen was designed to identify BRP interactors in vivo. This screen identified Complexin (CPX), which is known to inhibit spontaneous SV fusion and to enhance stimulus evoked SV release (Huntwork and Littleton, 2007; Cho et al., 2010; Martin et al., 2011). However, so far CPX has not been associated with a function upstream of priming/docking and release of SVs. This work provides morphological and functional evidence, which suggests that CPX promotes recruitment of SVs to the AZ and thereby curtails synaptic short-term depression. Together, the presented findings indicate a functional interaction between BRP and CPX at Drosophila AZs. Part II: The Adhesion-GPCR Latrophilin/CIRL shapes mechanosensation The calcium independent receptor of α-latrotoxin (CIRL), also named Latrophilin, represents a prototypic Adhesion class G-protein coupled-receptor (aGPCR). Initially, Latrophilin was identified based on its capacity to bind the α-component of latrotoxin (α-LTX; Davletov et al., 1996; Krasnoperov et al., 1996), which triggers massive exocytotic activity from neurons of the peripheral nervous system (Scheer et al., 1984; Umbach et al., 1998; Orlova et al., 2000). As a result Latrophilin is considered to play a role in synaptic transmission. Later on, Latrophilins have been associated with other biological processes including tissue polarity (Langenhan et al., 2009), fertility (Prömel et al., 2012) and synaptogenesis (Silva et al., 2011). However, thus far its subcellular localization and the identity of endogenous ligands, two aspects crucial for the comprehension of Latrophilin’s in vivo function, remain enigmatic. Drosophila contains only one latrophilin homolog, named dCirl, whose function has not been investigated thus far. This study demonstrates abundant dCirl expression throughout the nervous system of Drosophila larvae. dCirlKO animals are viable and display no defects in development and neuronal differentiation. However, dCirl appears to influence the dimension of the postsynaptic sub-synaptic reticulum (SSR), which was accompanied by an increase in the postsynaptic Discs-large abundance (DLG). In contrast, morphological and functional properties of presynaptic motoneurons were not compromised by the removal of dCirl. Instead, dCirl is required for the perception of mechanical challenges (acoustic-, tactile- and proprioceptive stimuli) through specialized mechanosensory devices, chordotonal organs (Eberl, 1999). The data indicate that dCirl modulates the sensitivity of chordotonal neurons towards mechanical stimulation and thereby adjusts their input-output relation. Genetic interaction analyses suggest that adaption of the molecular mechanotransduction machinery by dCirl may underlie this process. Together, these results uncover an unexpected function of Latrophilin/dCIRL in mechanosensation and imply general modulatory roles of aGPCR in mechanoception. N2 - In dieser These wurden zwei grundlegende biologische Aspekte mittels Drosophila melanogaster untersucht, weshalb diese in zwei Teile gegliedert ist. TeiL I: Die Interaktion von Bruchpilot und Complexin vermittelt die Anbindung von synaptischen Vesikeln an die Zytomatrix der aktiven Zone Oft findet man an aktiven Zonen (AZ) von Präsynapsen elektronendichte Matrices, welche meist in physischem Kontakt mit synaptischen Vesikeln (SV) stehen. Dieser als „SV Tethering“ bezeichnete Prozess dient der Anreicherung SV in der unmittelbaren Nähe ihrer Freisetzungszonen, noch bevor diese mit dem SNARE Komplex interagieren, um mit der präsynapti-schen Plasmamembran zu fusionieren (Hallermann und Silver, 2013). In der Taufliege Drosophila melanogaster bildet das AZ Protein Bruchpilot (BRP) Protrusionen, um welche SV akkumulieren (Kittel et al., 2006b; Wagh et al., 2006; Fouquet et al., 2009). Interessan-terweise resultiert bereits eine minimale Verkürzung von BRP (1% der Gesamtlänge) am C-terminalen Ende in einem schwerwiegenden Anbindedefekt von SV, der mit einem Funkti-onsverlust dieser Synapsen einhergeht (brpnude; Hallermann et al., 2010b). Entsprechend diesem Vorbefund resultierte die gewebespezifische Überexpression eines C-terminalen BRP Fragments - mBRPC-tip (entspricht dem fehlenden Fragment der brpnude Mu-tante; m = mobil) - sowohl in Verhaltens- als auch funktionellen Analysen in einer Phänoko-pie der brpnude Mutante. Dies deutet daraufhin, dass mBRPC-tip vermeintliche vesikuläre Interaktionspartner blockiert und so die Anreicherung von SV an motoneuronalen AZ verhindert, was ähnlich wie in brpnude Mutanten zu einem funktionellen Tethering-Defekt führt. Die molekulare Identität eines BRP Partners zur Anreicherung von SV an der Zytomatrix der AZ wurde bisher nicht beschrieben. Weiterhin zeigt diese Arbeit, dass membrangebundene C-terminale BRP Anteile genügen, um SV an Positionen außerhalb von AZ zu binden. Basierend auf diesem Befund wurde ein gene-tischer in vivo Screen zur Identifikation von BRP Interaktoren entwickelt. Dieser Screen identifizierte Complexin (CPX), ein Protein, dessen hemmende beziehungsweise fördernde Wirkung auf die spontane und reizinduzierte Vesikelfusion bekannt ist (Huntwork und Littleton, 2007; Cho et al., 2010; Martin et al., 2011). CPX wurde bisher nicht mit einer Funktion ober-halb von Vesikelpriming und -fusion in Verbindung gebracht. Diese Studie dokumentiert strukturelle und funktionelle Hinweise, die darauf hindeuten, dass CPX mit BRP interagiert, um Vesikelakkumulation an AZ zu fördern und dadurch synaptischer Kurzzeit-Depression entgegen zu wirken. Teil II: Adhäsions-GPCR Latrophilin/CIRL moduliert die Wahrnehmung mechanischer Reize Der Kalzium-unabhängige Rezeptor für α-Latrotoxin (CIRL), oder Latrophilin, ist ein prototypischer Rezeptor der Adhäsions G-Protein gekoppelten Klasse (aGPCR). Identifiziert wurde Latrophilin ursprünglich aufgrund seiner Fähigkeit die α-Komponente von Latrotoxin (α-LTX) zu binden (Davletov et al., 1996; Krasnoperov et al., 1996), welches seine Wirkung am peripheren Nervensystem entfaltet und dort übermäßige Transmitterausschüttung an neuronalen Endigungen induziert (Scheer et al., 1984; Umbach et al., 1998; Orlova et al., 2000). Basierend auf diesem Effekt wurde Latrophilin eine Rolle bei der synaptischen Transmission zugesprochen. Später wurden Latrophiline mit weiteren biologischen Prozessen in Zusammenhang gebracht, darunter Gewebepolarität (Langenhan et al., 2009), Fertilität (Prömel et al., 2012) und Synaptogenese (Silva et al., 2011). Allerdings blieb sowohl die subzelluläre Lokalisation als auch die Identität endogener Liganden, zwei Schlüsselaspekte im Verständnis der in vivo Funktion von Latrophilinen bisher rätselhaft. Drosophila besitzt lediglich ein latrophilin Homolog, dCirl, dessen Funktion bisher nicht untersucht wurde. Diese Arbeit zeigt, dass dCirl in weiten Teilen des larvalen Nervensystems von Drosophila exprimiert ist. dCirl knock-out Mutanten sind lebensfähig und weisen keine Störungen in der Entwicklung und neuronalen Differenzierung auf. Allerdings schien dCirl Einfluss auf die Ausdehnung des postsynaptischen subsynaptischen Retikulums (SSR) zu nehmen, was mit einer erhöhten Menge an Discs-large (DLG) assoziiert war. Die morphologischen und funktionellen Eigenschaften präsynaptischer Motoneurone der Fliegenlarve hingegen, waren durch den Verlust von dCirl funktionell weitestgehend unbeeinträchtigt. Vielmehr ist dCirl notwendig für die Wahrnehmung mechanischer Reize (akustische-, taktile und propriozeptive) durch spezialisierte Vorrichtungen - Chordotonalorgane (Eberl, 1999). Die Befunde deuten daraufhin, dass dCirl die Sensitivität der Chordotonalneurone gegenüber mechanischen Reizen moduliert und dadurch das Input-Output Verhältnis einstellt. Adaptation der molekularen Mechanotransduktionsmaschinerie durch dCirl könnte die molekulare Grundlage für diesen Prozess darstellen, eine Hypothese die durch genetische Interaktionsanalysen gestützt wird. Schlussfolglich enthüllen die experimentellen Befunde dieser These eine unerwartete Funktion von Latrophilin/dCirl bei der Mechanoperzeption und implizieren eine generelle modula-torische Rolle für aGPCR bei der Wahrnehmung mechanischer Reize. KW - Drosophila KW - Synapse KW - GPCR KW - synaptic vesicle tethering KW - active zone KW - Complexin KW - Bruchpilot KW - Adhesion-GPCR KW - Latrophilin KW - mechanosensing Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123249 ER - TY - THES A1 - Fuchs, Benjamin Felix T1 - Effects of timing and herbivory on a grass-endophyte association and its trophic interactions T1 - Auswirkungen von Timing und Herbivorie auf eine Gras-Endophyten Assoziation und ihre trophischen Interaktionen N2 - I.) Plant associated microorganisms can affect the plant`s interaction with herbivores and higher trophic levels. For instance, endophytic fungi infecting aerial plant parts of grass species produce bioactive alkaloids that can negatively affect species from higher trophic levels, indicating a defensive mutualism between the grass and the endophyte. However, beneficial insects can also be negatively affected by the endophyte, which might question the mutualistic effect of endophytic fungi. On the other hand, grass-endophytes are affected by environmental conditions and species interactions. Grazing can increase endophyte frequencies in natural habitats. Furthermore, endophyte mediated effects on herbivores are most pronounced during warm summers following rainy springs. In this study, we investigated whether endophyte derived alkaloids cascade up a food chain (chapter II) and whether their concentrations depend on plant age and season (chapter III). Further we analysed, whether altered herbivore phenology affects the endophytic fungus (chapter IV) and whether endophyte derived alkaloid production is induced by different herbivore species (chapter V). II.) In our first experimental study we analysed whether grass-endophyte derived alkaloids decreased the performance of two ladybird species feeding on aphids exclusively reared on endophyte infected grass (6 weeks young grass). Further, we screened species from three trophic levels (grass, herbivores and aphid predators) for their alkaloid content using two year old infected grass as diet for herbivores. We established an UPLC-MS method to detect and quantify the amount of the endophyte derived alkaloids peramine and lolitrem B extracted from the organic plant and insect material. Performance parameters of ladybirds revealed little differences between ladybirds fed on aphids reared on endophyte infected and non-infected grass, which probably resulted from low alkaloid concentrations in the young (6-weeks old) endophyte infected grass used in this part of the study. Alkaloid quantification of the two year old endophyte infected grass, herbivores and aphid predators revealed similar concentrations between grass and aphids, while aphid predators contained approximately half of that amount which still exceeded the bioactive threshold. We conclude that alkaloids produced by grass-endophytes cascade up the food chain and are responsible for fitness disadvantages of higher trophic levels. III.) In the second study we investigated the impact of plant age and seasonal timing on grass-endophyte growth and alkaloid production. Plants were sown in April of 2013 and sampled monthly over 30 consecutive months. Endophyte growth was quantified with real-time PCR (qPCR) and alkaloid concentrations with UPLC-MS. We showed that alkaloid concentrations and fungal growth followed a seasonal rhythmicity and that alkaloid concentrations increased with plant age. Alkaloid concentrations peak during summer, when also herbivore abundances are high. Consequently, we conclude that plant age and season contribute to the toxicity of endophytes on grass herbivores IV.) In the third study we simulated earlier spring arrival of aphids by enhancing aphid abundance on endophyte infected and endophyte-free grass in spring and analysed responses across three trophic levels. Enhanced aphid abundance in spring caused higher aphid abundances during the study period. Predators stayed unaffected by increased herbivore abundances; however they did level aphid numbers within two weeks after arrival on the plants, independent of aphid abundance. Grass-endophyte showed a time delayed growth, two weeks after aphid abundance peak and after predators already controlled aphid infestations on the plants. We conclude that phenology shifts of herbivorous insects can affect multi-trophic interactions leading to desynchronizations between phenologies of interacting species and mismatches in food-webs. V.) In the fourth study we analysed whether herbivores induce endophyte growth and alkaloid production and whether different types of herbivores induce specific alkaloid production. We applied three different herbivore treatments on endophyte infected grass over 18 weeks. Locust herbivory increased the insect deterring alkaloid peramine and clipping of plants (simulation of grazing livestock) increased the vertebrate toxic alkaloid lolitrem B. Aphid herbivory did not affect endophyte derived alkaloid concentrations. Endophyte responses to herbivory were species specific which indicates a primarily plant protecting role of alkaloid synthesis in endophyte infected plants and a close chemical crosstalk between interacting species. VI.) In summary, we showed that endophyte derived alkaloids affect higher trophic levels and that alkaloid concentrations in the plant depend on prevalent herbivore species, plant age and seasonal timing. Our results indicate a close chemical crosstalk between the host plant and the endophytic fungus which is susceptible to environmental changes altering the endophyte`s alkaloid production in plants. We gained insights into the grass-endophyte symbiosis in ecological contexts and conclude that several factors determine the herbivore toxic potential of endophytic fungi and thereby their plant mutualistic or parasitic character. Future studies should investigate the mechanisms behind the herbivore induced alkaloid concentration increase, shown in this thesis, especially whether plant signals mediate the endophyte response. Furthermore it would be interesting to study the induction of indirect endophyte mediated defence and how it affects multi-trophic level interactions. N2 - I.) Mit Pflanzen assoziierte Mikroorganismen können die Interaktionen von Pflanzen mit Herbivoren und höheren trophischen Ebenen beeinflussen. Endophytische Pilze, die oberirdische Pflanzenteile von Gräsern infizieren, produzieren bioaktive Alkaloide, die negative Effekte auf pflanzenfressende Organismen haben können. Blattlaus parasitierende und räuberische Insekten hatten ebenso Fitnessnachteile, wenn sie mit Blattläusen gefüttert wurden, die auf Epichloë festucae var. lolii infiziertem Lolium perenne gezüchtet wurden. Umwelteinflüsse und Interaktionen zu anderen Arten beeinträchtigen das Wachstum und die Alkaloid Produktion von Endophyten. Die Häufigkeit von Endophyten in natürlichen Habitaten können von Herbivorie beeinflusst werden. Weiterhin sind Endophyten verursachte Effekte auf Pflanzenfresser am häufigsten in warmen Sommermonaten nach regenreichen Frühlingsmonaten. In dieser Studie analysieren wir, ob Endophyten produzierte Alkaloide in einer Nahrungskette aufsteigen und in höheren trophischen Ebenen gefunden werden (Kapitel II) und ob ihre Konzentrationen von Pflanzenalter und Saison abhängig sind (Kapitel III). Weiterhin analysieren wir, ob veränderte Phänologie von herbivoren Insekten den endophytischen Pilz beeinflussen (Kapitel IV) und ob Alkaloid Produktion von verschiedenen Pflanzenfressern induziert wird (Kapitel V). II.) In der ersten Studie analysierten wir, ob Alkaloide, die von Gras Endophyten produziert werden, die Fitness von zwei Marienkäfer Arten verringern, wenn sie mit Blattläusen gefüttert werden, die ausschließlich auf Endophyten infiziertem Gras (6 Wochen alt) gezüchtet wurden. Weiterhin analysierten wir Arten aus drei trophischen Ebenen (Gras, Herbivore, Blattlaus Prädatoren) auf ihren Alkaloid Gehalt mit zwei Jahre altem Endophyten infizierten Gras als Futter für pflanzenfressende Insekten. Wir etablierten eine UPLC-MS Methode, um die Endophyten produzierten Alkaloide Peramin und Lolitrem B zu detektieren und zu quantifizieren, nach der Extraktion aus organischem Material von Pflanzen und Insekten. Fitness von Marienkäfern zeigte nur geringe Unterschiede zwischen Marienkäfern, denen Blattläuse gefüttert wurden, die ausschließlich auf Endophyten infizierten Grass oder nicht infiziertem Grass gezüchtet wurden. Die Ursache dafür, ist wahrscheinlich eine zu geringe Alkaloid Konzentration in dem jungen, Endophyten-infizierten Grass (6 Wochen alt), das für diesen Teil der Studie verwendet wurde. Die Quantifizierung der Alkaloide von zwei Jahre altem Endophyten infiziertem Gras, Herbivoren und Prädatoren zeigte ähnliche Konzentrationen zwischen Gras und Blattläusen, wohingegen Prädatoren etwa eine halb so hohe Alkaloid Konzentration enthielten, die aber dennoch den Grenzwert für biologische Wirksamkeit überschritt. Wir folgern, dass Endophyten produzierte Alkaloide innerhalb der Nahrungskette weitergegeben werden und somit verantwortlich für Nachteile auf die Fitness höherer trophischer Ebenen sind. III.) In der zweiten Studie untersuchten wir den Einfluss von Pflanzenalter und Saison auf Wachstum des Endophyten und dessen Alkaloid Produktion. Pflanzen wurden im April 2013 gesät und über einen Zeitraum von 30 Monaten monatlich beprobt. Endophyten Wachstum wurde mittels real-time PCR (qPCR) und Alkaloide mittels UPLC-MS quantifiziert. Wir zeigten, dass Pilzwachstum und Alkaloid Produktion einer saisonalen Rhythmik folgen und Alkaloid Konzentrationen zudem mit dem Pflanzenalter ansteigen. Demzufolge tragen Pflanzenalter und Saison zur Toxizität von endophytischen Pilzen bei. Alkaloid Konzentrationen sind am höchsten im Sommer, wenn auch die Abundanzen von Herbivoren besonders hoch sind. IV.) In der dritten Studie simulierten wir frühzeitiges Blattlausvorkommen, indem wir Blattlausabundanzen auf Endophyten freien und infizierten Graspflanzen im Frühling erhöhten und die Reaktionen auf drei trophischen Ebenen analysierten. Top-Down Kontrolle durch Blattlausprädatoren wurde nicht von erhöhten Blattlausabundanzen beeinflusst, aber innerhalb von zwei Wochen nach ihrem Erscheinen, reduzierten Prädatoren die Anzahl an Blattläusen erheblich, unabhängig von den Blattlausabundanzen. Bottom-Up Kontrolle durch erhöhtes Wachstum der Grasendophyten war zeitlich verzögert, zwei Wochen nachdem Blattlausabundanzen ihre Maxima erreichten und bereits durch Prädatoren stark dezimiert waren. Daraus schlussfolgern wir, dass Phänologieverschiebungen von pflanzenfressenden Insekten multi-trophische Interaktionen beeinflussen und zu einer Desynchronisierung der Phänologien von interagierenden Arten und somit unausgeglichenen Beziehungen in Nahrungsnetzen führen können. V.) In der vierten Studie analysierten wir, ob Herbivore Insekten das Wachstum und die Alkaloid Produktion von endophytischen Pilzen induzieren und ob verschiedene Arten von Herbivorie die Produktion spezifischer Alkaloide induzieren. Wir applizierten drei verschieden Arten von Pflanzenfraß Treatments an Endophyten infiziertem Grass über einen Zeitraum von 18 Wochen und fanden heraus, dass Heuschrecken eine Erhöhung der Konzentration des insektenwirksamen Alkaloids induzieren und Schnitt der Pflanze (Simulierung von Weidevieh) eine Erhöhung des Vertebraten toxischen Alkaloids Lolitrem B. Herbivorie durch Blattläuse hatte keinen Einfluss auf Konzentrationen von Endophyten produzierten Alkaloiden. Reaktionen von endophytischen Pilzen auf Herbivorie sind demnach artspezifisch, was darauf hinweist, dass Alkaloide vorrangig zu Pflanzenschutz Zwecken gegen Fraßfeinde produziert werden. VI.) Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass die von endophytischen Pilzen produzierten Alkaloide, Organismen höherer trophischer Ebenen beeinflussen können und dass Alkaloid Konzentrationen im Wirtsgras von Herbivorietyp, Pflanzenalter und saisonbedingten Umwelteinflüssen abhängig sind. Schlussendlich deuten unsere Ergebnisse auf eine enge chemische Verständigung zwischen Wirtsgras und endophytischem Pilz hin, empfindlich gegenüber Umweltveränderungen, die folglich eine Veränderung in der Konzentration von Endophyten produzierten Alkaloiden auslösen. Zukünftige Studien sollten die Mechanismen hinter induziertem Anstieg von Alkaloid Konzentrationen analysieren, speziell, ob Pflanzensignale die Reaktion des Endophyten auf Herbivorie vermitteln. Weiterhin könnte eine Endophyten-vermittelte Induktion von indirekter Pflanzenabwehr zur Interaktion zwischen mehreren trophischen Ebenen beitragen. KW - fungal endophytes of grasses KW - plant defense KW - alkaloids KW - endophyte KW - grass KW - symbiosis Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141465 ER - TY - THES A1 - Iltzsche, Fabian T1 - The Role of DREAM/MMB-mediated mitotic gene expression downstream of mutated K-Ras in lung cancer T1 - Die Rolle DREAM/MMB-vermittelter mitotischer Genexpression unterhalb von mutiertem K-Ras in Lungenkrebs N2 - The evolutionary conserved Myb-MuvB (MMB) multiprotein complex has an essential role in transcriptional activation of mitotic genes. MMB target genes as well as the MMB associated transcription factor B-Myb and FoxM1 are highly expressed in a range of different cancer types. The elevated expression of these genes correlates with an advanced tumor state and a poor prognosis. This suggests that MMB could contribute to tumorigenesis by mediating overexpression of mitotic genes. Although MMB has been extensively characterized biochemically, the requirement for MMB to tumorigenesis in vivo remains largely unknown and has not been tested directly so far. In this study, conditional knockout of the MMB core member Lin9 inhibits tumor formation in vivo in a mouse model of lung cancer driven by oncogenic K-Ras and loss of p53. The incomplete recombination observed within tumors points towards an enormous selection pressure against the complete loss of Lin9. RNA interference (RNAi)-mediated depletion of Lin9 or the MMB associated subunit B-Myb provides evidence that MMB is required for the expression of mitotic genes in lung cancer cells. Moreover, it was demonstrated that proliferation of lung cancer cells strongly depends on MMB. Furthermore, in this study, the relationship of MMB to the p53 tumor suppressor was investigated in a primary lung cancer cell line with restorable p53 function. Expression analysis revealed that mitotic genes are downregulated after p53 re-expression. Moreover, activation of p53 induces formation of the repressive DREAM complex and results in enrichment of DREAM at mitotic gene promoters. Conversely, MMB is displaced at these promoters. Based on these findings the following model is proposed: In p53-negative cells, mitogenic stimuli foster the switch from DREAM to MMB. Thus, mitotic genes are overexpressed and may promote chromosomal instability and tumorigenesis. This study provides evidence that MMB contributes to the upregulation of G2/M phase-specific genes in p53-negative cells and suggests that inhibition of MMB (or its target genes) might be a strategy for treatment of lung cancer. N2 - Der evolutionär konservierte Myb-MuvB (MMB) Multiproteinkomplex hat eine wesentliche Rolle in der transkriptionellen Aktivierung mitotischer Gene. Zielgene des MMB sowie die MMB assoziierten Transkriptionsfaktoren B-Myb und FoxM1 sind hoch exprimiert in einer Bandbreite verschiedener Krebsarten. Die erhöhte Expression dieser Gene korreliert mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium und einer geringen Prognose. Das weißt auf darauf hin, dass MMB an der Tumorentstehung beteiligt sein könnte indem es die Überexpression mitotischer Gene fördert. Obwohl MMB biochemisch eingehend untersucht wurde, ist die Erfordernis von MMB zur Tumorentstehung in vivo weitestgehend unbekannt und wurde bisher nicht direkt getestet. In dieser Studie hemmt der konditionale Knockout der MMB Kerneinheit Lin9 die Tumorbildung in vivo in einem Lungenkrebs-Mausmodell angetrieben durch onkogenes K-Ras und den Verlust von p53. Die unvollständige Rekombination welche in Tumoren beobachtet wurde deutet auf einen starken Selektionsdruck gegen den kompletten Verlust von Lin9 hin. Die Verminderung von Lin9 und der MMB- assoziierten Untereinheit B-Myb durch RNAi-Interferenz (RNAi) liefert Beweise dafür, dass MMB für die Expression mitotischer Gene in Lungenkrebszellen notwendig ist. Zudem wurde gezeigt, dass das Zellwachstum von Lungenkrebszellen stark von MMB abhängig ist. Weiterhin wurde der Zusammenhang zwischen MMB und dem p53-Tumorsuppressor in einer primären Lungenkrebszelllinie mit wiederherstellbarer p53-Funktion untersucht. Expressionsanalysen zeigen, dass mitotische Gene nach Re-expression von p53 runterreguliert werden. Außerdem induziert die Aktivierung von p53 die Bildung des repressiven DREAM-Komplexes und führt zu einer Anreicherung von DREAM an Promotoren mitotischer Gene. Im Gegenzug wird MMB an den Promotoren verdrängt. Basierend auf den Ergebnissen wird das folgende Model vorgeschlagen: In p53- negativen Zellen begünstigen mitogene Reize den Wechsel von DREAM zu MMB. Dadurch werden mitotische Gene überexprimiert und können so chromosomale Instabilität und Tumorentstehung fördern Diese Studie liefert Hinweise, dass MMB an der Hochregulation G2/M- Phasenspezifischer Gene in p53-negativen Zellen beteiligt ist und dass die Hemmung von MMB (oder seiner Zielgene) eine Strategie zur Behandlung von Lungenkrebs sein könnte. KW - Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom (NSCLC) KW - Lungenkrebs KW - lung cancer KW - DREAM complex KW - MMB KW - K-Ras KW - mitotic gene expression KW - Mitose Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154108 ER - TY - THES A1 - Kunz, Meik T1 - Systembiologische Analysen von Interaktionen: Zytokinine (Pflanzenpathogene), 3D-Zellkulturen (Krebstherapie) und Drugtargets T1 - Systems biology analysis of interactions: Cytokinins (plant pathogens), 3D cell cultures (cancer therapy) and drug targets N2 - Der Einsatz von computergestützten Analysen hat sich zu einem festen Bestandteil der biowissenschaftlichen Forschung etabliert. Im Rahmen dieser vorliegenden Arbeit wurden systembiologische Untersuchungen auf verschiedene biologische Themengebiete und Organismen angewendet. In diesem Zusammenhang liefert die Arbeit einen innovativen und interdisziplinären methodischen Ansatz. Die grundlegende Frage lautet: Wie verstehe und beschreibe ich Signalwege und wie kann ich sie beeinflussen? Der Ansatz verknüpft verschiedene biologische Datensätze und Datenebenen miteinander, beginnend vom Genom und Interaktionskontext über semiquantitative Simulationen hin zu neuen Interventionen und Experimenten, welche therapeutisch und biotechnologisch genutzt werden können. Die Analysen können auf diese Weise - zu einem besseren Verständnis experimenteller Daten und biologischer Fragestellungen beitragen und ermöglichen ein systematisches Verständnis der zugrunde liegenden Signalwege und Netzwerkeffekte (z.B. in Pflanzen). - Darüber hinaus ermöglichen sie die Identifizierung wichtiger funktioneller Hubproteine und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für weitere experimentelle Testungen (z.B. Tumormodelle), - stellen zudem einen hilfreichen Schritt auf dem Weg zur personalisierten Medizin (z.B. lncRNAs und Tumormodelle) und Medikamentenentwicklung (z.B. Datenbank DrumPID) dar. (i) Als Grundlage wurde hierzu eine integrierte systembiologische Methode entwickelt, welche experimentelle Daten (z.B. Transkriptomdaten) hinsichtlich ihrer biologischen Funktionen untersucht und die Identifizierung relevanter funktioneller Cluster und Hubproteine ermöglicht. In einem ersten Teil wurden Analysen zum pflanzlichen Immunsystem durchgeführt. Mithilfe der entwickelten Methode wurden Genexpressionsdatensätze von A. thaliana, die mit dem Pathogen Pst DC3000 infiziert wurden, untersucht, um den Einfluss verschiedener Virulenzfaktoren auf das Interaktom der Wirtspflanze zu untersuchen und neue Modulatoren einer CK-vermittelten Immunabwehr zu finden. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass die von Pst DC3000 sekretierten Abwehrstoffe wichtige pflanzliche Hormonsignalwege für die Immunabwehr in A. thaliana beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen zudem, dass sich der Einfluss auf das Netzwerkverhalten der Effektorproteine und COR-Phytotoxine von dem der PAMPs unterscheidet, sich jedoch auch eine Regulierung gemeinsamer Signalwege und eine Überlappung der beiden Phasen der Immunantwort (PTI und ETI) in A. thaliana finden lassen. Die komplexe Immunantwort auf eine Infektion spiegelt sich zudem in einer höheren Anzahl an funktionellen Clustern und Hubproteinen in Pst DC3000 gegenüber den beiden untersuchten Mutanten wider, wobei sich für Pst DC3000 insbesondere ein stark vernetztes immunrelevantes Cluster um den JA-Signalweg zeigt. Weiterhin wurden anhand der entwickelten Methode wichtige Hubproteine für die Immunabwehr identifiziert. Als bedeutende Vertreter sind AHK2 und AAR14 zu nennen, welche Teil des Zweikomponentensystems der Signalübertragung von CK sind und hierbei wichtige Modulatoren für eine CK-vermittelte Immunabwehr darstellen. (ii) Im zweiten Teil der Arbeit schließen sich Untersuchungen an einem in vitro-Experiment einer 2D- und 3D-Zellkultur einer HSP90-Behandlung in einem Lungentumormodell an. In diesem Zusammenhang wurden mithilfe der entwickelten Methode Unterschiede zwischen den beiden Zellkultursystemen gefunden, die das unterschiedliche Behandlungsansprechen erklären, und für die beiden KRAS-mutierten Zelllinien A549 und H441 des 3D-Testsystems neue prognostische und therapeutische Kandidaten identifiziert. Hierbei haben die durchgeführten Analysen zwei funktionelle Cluster von Protein-Interaktionen um p53 und die STAT-Familie gefunden, welche eine Verbindung zu HSP90 haben und die entsprechenden Behandlungsunterschiede nach einer HSP90-Inhibierung zwischen den beiden Zellkultursystemen erklären können. Unter Berücksichtigung des zelllinien-spezifischen Mutationshintergrunds wurde eine prognostische Markersignatur und daraus abgeleitet HIF1A für die H441-Zelllinie und AMPK für die A549-Zelllinie als neue therapeutische Targets gefunden, wobei die anschließend durchgeführten in silico-Simulationen einen potentiellen therapeutischen Effekt aufzeigen konnten. Weiterhin wurden wichtige experimentelle Readout-Parameter in ein in silico-Lungentumormodell integriert, wobei unter Einbeziehung des Mutationshintergrunds für die verwendeten Zelllinien die HSP90-Behandlung des 3D-Testsystems computergestützt abgebildet werden konnte. Im weiteren Verlauf wurden im in silico-Lungentumormodell Resistenzmechanismen nach einer Gefitinib-Behandlung mit bekanntem Mutationsstatus für die Zelllinien HCC827 und A549 untersucht und daraus folgend neue Therapieansätze abgeleitet, die von potentieller klinischer Bedeutung sein können. Die durchgeführten in silico-Simulationen für HCC827 konnten hierbei zeigen, dass eine EGFR- und c-MET-Koaktivierung zu einer Gefitinib-Resistenz führen kann, wohingegen bei den A549 eine Komutation von KRAS und IGF-1R zu einem geringen Behandlungsansprechen beiträgt. Die Simulationen lassen zudem erkennen, dass eine direkte Inhibierung der an der Resistenzentwicklung beteiligten Rezeptoren c-MET und IGF-1R in beiden Fällen nicht die bestmögliche Therapiestrategie darstellt. In beiden Zelllinien konnte gezeigt werden, dass eine kombinierte Inhibierung von PI3K und MEK den bestmöglichen therapeutischen Effekt liefert, was demnach einen vielversprechenden Therapieansatz bei Gefitinib-resistenten Lungentumorpatienten darstellt. In einem weiteren Schritt wurde das therapeutische Potential der miRNA-21 im in silico-Modell für die HCC827-Zelllinie untersucht. Die durchgeführten Simulationen zeigen, dass eine miRNA-21-Überexpression zu einer Resistenzentwickung nach Gefitinib-Behandlung beitragen kann, wobei eine Inhibierung der miRNA-21 diesen Effekt umkehren kann. Die Ergebnisse lassen zudem erkennen, dass eine PTEN-Aktivierung als potentieller Marker einer erfolgreichen therapeutischen Inhibierung der miRNA-21 fungieren kann, wohingegen eine reduzierte miRNA-21-Expression als möglicher Marker für eine erfolgreiche Gefitinib-Behandlung dienen kann. (iii) Im dritten Teil der Arbeit wurden systematisch RNA- und Protein-Interaktionen untersucht. Hierzu wurden integrierte systembiologische Analysen an neu identifizierten und funktionell bislang unbekannten lncRNAs durchgeführt. Die Analysen für die infolge einer Herzhypertrophie hochregulierte lncRNA Chast haben umfassend gezeigt, dass diese Proteine und Transkriptionsfaktoren regulieren und binden kann, welche die Signalübertragung und Genexpression regulieren, aber auch eine Verbindung zum kardiovaskulären System und stressinduzierter Herzhypertrophie besitzt. Anhand der Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass Chast direkt und indirekt (a) Proteine binden und die Translation beeinflussen kann, zudem eine Chromatin-modifizierende Funktion besitzt und so die Transkription, z.B. für herz- und stress-assoziierte Gene, reguliert, und/oder (b) in einem negativen Feedbackloop seine eigene Transkription reguliert. Obwohl lncRNAs meist eine geringe Konservierung aufweisen, konnten die durchgeführten Analysen für Chast eine Sequenz-Struktur-Konservierung in Säugetieren aufzeigen. Weiterhin haben die Untersuchungen an zwei hypoxie-induzierten lncRNAs in Endothelzellen gezeigt, dass die lncRNA MIR503HG eine hohe Sequenz-Struktur-Konservierung in Säugetieren besitzt, wohingegen die LINC00323-003 eine geringe Konservierung aufzeigt. Dies untermauert die Tatsache, dass lncRNAs häufig eine geringe Konservierung aufweisen, was Untersuchungen in Modellorganismen hinsichtlich einer therapeutischen Nutzung schwierig machen. Da sich zahlreiche Untersuchungen auf Interaktionen und Signalwege konzentriert haben, wurde abschließend eine Datenbank entwickelt, welche Analysen von Protein-Interaktionen und Signalwegen nachhaltig voranbringt. Die entwickelte DrumPID-Datenbank stellt insbesondere die Interaktion zwischen einem Medikament und seinem Target in den Fokus und ermöglicht Analysen einzelner Interaktionen und beteiligter Signalwege, bietet zusätzlich aber auch verschiedene Links zu anderen Datenbanken für individuelle weiterführende Analysen. DrumPID ermöglicht ein geeignetes Medikament u. a. für ein vorgegebenes Zielprotein zu finden und dessen Wirkmechanismus und Interaktionskontext zu untersuchen, was zu einem besseren experimentellen Verständnis beitragen kann. Zudem erlaubt DrumPID eine potentielle chemische Leitstruktur für ein Zielprotein zu entwickeln, was z.B. spezifisch ein parasitisches Protein inhibiert, ohne dabei einen toxischen Effekt im Menschen zu haben. Zahlreiche weitere Pharmakabeispiele belegen, dass DrumPID für den täglichen wissenschaftlichen Gebrauch auf dem Gebiet der Analyse von Protein-Pharmaka-Interaktionen und der Medikamentenentwicklung geeignet ist. Die beschriebenen Ergebnisse der Promotionsarbeit wurden in fünf Originalarbeiten, zwei Übersichtsartikeln und einem Buchteil, u. a. in Science Translational Medicine, veröffentlicht, sechs dieser Publikationen erfolgten im Rahmen von Erstautorschaften. N2 - The use of computer-based analysis has become an integral part of life science research. Within this thesis, systems biology investigations have been applied to various biological topics and organisms which provides an innovative and interdisciplinary methodological approach. The basic question was: How do I understand and describe signaling pathways and how can I influence them? The approach combines various biological data sets and data levels starting from the genome and interaction context over semiquantitative simulations towards new interventions and experiments which can be used therapeutically and biotechnologically. The analysis can contribute to - a better understanding of experimental data and biological questions and enables a systematic understanding of the signaling pathways and network effects (e.g. in plants). - They enable the identification of important functional hub nodes as well as the development of new therapeutic strategies for further experimental testing (e.g. tumor models), - also representing a helpful step on the path to personalized medicine (e.g. lncRNAs and tumor models) and drug development (e.g. database DrumPID). (i) As a basis, an integrated systems biology methodology was developed which examines experimental data sets (e.g. transcriptome data) with respect to their biological functions and enables the identification of relevant functional clusters and hub nodes. In the first part of the thesis, analyzes regarding the plant immune system were accomplished. Using the developed methodology, gene expression datasets of A. thaliana infected with the pathogen Pst DC3000 were analyzed in order to investigate the influence of different virulence factors on the host interactome, and to find new modulators of CK-mediated immune defense. In this context, the analysis could show that the secreted defense compounds of Pst DC3000 influence important plant hormone signaling pathways for the immune defense in A. thaliana. Moreover, the results show that the impact on the network behavior of the effector proteins and COR phytotoxins differ from the PAMPs, but there also exists an overlap in common regulated signal pathways as well as an overlap between the two phases of immune response (PTI and ETI) in A. thaliana. In addition, the complex immune response to an infection is also reflected by a higher number of functional clusters and hub nodes in Pst DC3000 compared to the two studied mutants, whereby for Pst DC3000 a highly connected immune-relevant cluster around the JA pathway has been found. Furthermore, using the developed methodology several important hub nodes for the immune defense have been identified. As most important candidates, AHK2 and AAR14 have to be highlighted which are part of the two-component-system of signal transduction of CK and represent in this context important modulators for a CK mediated immune defense. (ii) In the second part of the thesis, analyzes of a HSP90 treatment in lung cancer in an in vitro experiment in 2D and 3D cell cultures were accomplished. In this context using the developed methodology, differences between the two cell cultures explaining the differences in treatment responses were found, and for the two KRAS mutated cell lines A549 and H441 of the 3D test system new prognostic marker and therapeutic drug candidates were identified. However, the analyzes found two functional clusters of protein interactions around p53 and the STAT family which have a connection to HSP90 and might explain the observed treatment differences for the HSP90 inhibition between the two cell culture systems. Considering the mutational background of the cell lines, a prognostic marker signature were found and derived from it HIF1A for the H441 cell line and AMPK for the A549 cell line as new therapeutic drug targets. Moreover, the subsequently performed in silico simulations could show a potential therapeutic effect of the identified drug targets. Furthermore, important experimental read-out parameters were integrated into the in silico lung tumor model, and by considering the mutation background of the used cell lines the HSP90 treatment of the 3D test system could be in silico simulated. In the further course of the thesis, resistance mechanisms after gefitinib treatment with known mutation status for the HCC827 and A549 cell lines were investigated in the in silico lung tumor model and consequently new therapeutic approaches were derived which may be of potential clinical relevance. Here, the in silico simulations for HCC827 cells show that a co-activation of EGFR and c-MET can lead to a gefitinib resistance, whereas in the A549 a co-mutation of KRAS and IGF-1R can contribute to the reduced treatment response. In addition, the simulations reveal that a direct inhibition of the resistance contributing receptors c-MET and IGF-1R reflect not the best treatment strategy in both cases. However, in both cell lines a combined inhibition of PI3K and MEK provides the best therapeutic effect, thus representing a promising new therapeutic approach in gefitinib resistant lung cancer patients. In a further step, the therapeutic potential of the miRNA-21 was examined in the in silico model for the HCC827 cells. The simulations show that an overexpression of the miRNA-21 can contribute to a resistance development after gefitinib treatment, in which an inhibition of the miRNA-21 reverses this effect. Moreover, the results show that a PTEN activation can function as a potential marker of therapeutic success of miRNA-21 inhibition whereas a reduced miRNA-21 expression may serve as a potential marker for a successful gefitinib treatment. (iii) In the third part of the thesis, systematic RNA and protein interactions were investigated. For this, integrated systems biology analyzes were carried out on new identified and previously functional unknown lncRNAs. The analyzes of the cardiac hypertrophy caused upregulated lncRNA Chast have extensive demonstrated that Chast can regulate and bind proteins and transcription factors which regulate signal transduction and gene expression, but it has also a connection to the cardiovascular system and stress-induced cardiac hypertrophy. Based on the results, it can be concluded that Chast can directly and indirectly (a) bind proteins and influence the translation but also possess a chromatin-modifying function and regulate transcription e.g. for cardiac and stress-associated genes, and/or (b) regulate its own transcription in a negative feedback loop. Although lncRNAs often have a low conservation the analysis could show a sequence-structure-conservation for Chast in mammalians. Furthermore, the investigations for two hypoxia induced endothelial lncRNAs have shown that the lncRNA MIR503HG represents a high sequence-structure-conservation in mammalians, whereas the LINC00323-003 shows a low conservation. This underscores the fact that lncRNAs often have a low conservation thereby making studies regarding the therapeutic potential in model organisms difficult. Finally, as numerous analyzes in this thesis have focused on interactions and signaling pathways, a database was developed which brings a sustainable progress in analysis of protein interactions and signaling pathways. The developed DrumPID database puts especially the interaction between a drug and its target into its focus and allows analysis of individual interactions and involved signaling pathways but, additionally, provides various crosslinks to other databases for individual further analysis. DrumPID enables to find a suitable drug, e.g. for a given target protein, and to analyze its mechanism of action as well as interaction context which can contribute to a better understanding of experimental data. Moreover, DrumPID allows to develop a potential chemical lead structure for a target protein which e.g. specifically inhibits a parasitic protein but has no toxic effect in humans. Numerous additional pharmaceutical examples verify that DrumPID is suitable for the daily scientific usage in the field of analysis of protein-drug-interactions and drug development. The described results of the doctoral thesis were published in five research papers, two review articles and a book chapter, e.g. in Science Translational Medicine, including six first authorships. KW - Systembiologie KW - Interaktionen KW - Zytokinine (Pflanzenpathogene) KW - 3D-Zellkulturen (Krebstherapie) KW - Drugtargets KW - Systembiologische Analysen Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134911 ER - TY - THES A1 - Faist, Hanna T1 - Bedeutung und Charakterisierung der bakteriellen Flora in Vitis vinifera mit und ohne Wurzelhalsgallen T1 - Significance and characterization of the bacterial community in Vitis vinifera with and without crown galls N2 - Am Rebstock werden in der Natur von Agrobacterium vitis, dem Auslöser Wurzelhalsgallenerkrankung, charakteristische Wurzelhalsgallentumore induziert. Virulente Vertreter der Gattung der Agrobacteria schleusen bakterielle DNA in das pflanzliche Genom ein, wodurch die Pflanze Tumore produziert. Die Wurzelhalsgallenerkrankung wird seit einem Jahrhundert als ein Beispiel der Pflanzen-Pathogen-Interaktion untersucht. Die Rolle der bakteriellen Flora im Zusammenhang mit der Wurzelhalsgallenerkrankung beim Rebstock wurde bisher kaum betrachtet. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich die endophytische mikrobielle Zusammensetzung von Rebstöcken mit und ohne Wurzelhalsgalle analysiert. Es werden Proben von drei Zeitpunkten einer Wachstumsperiode (Frühling, Sommer und Herbst) und von den Organen der Rebstöcke (Wurzeln, Pfropfstelle und einjährige Triebe) sowie dem Boden in einer Weinanlage bei Himmelstadt in Unterfranken genommen. Die Bakterienflora dieser Umweltproben wird mit kultivierungsabhängigen (Isolierung von Bakterien) und kultivierungsunabhängigen (Hochdurchsatzsequenzierungen) Methoden untersucht. Zudem werden i) die Virulenz der verschiedenen Agrobacterium-Isolate in Tumorassays bestimmt, ii) synthetische Bakteriengemeinschaften von in vitro kultivierten Weinpflänzchen mit Wurzelhalsgallen analysiert, iii) die Genome von einem virulenten und einem nicht-virulenten Agrobacteria-Isolat aus der Wurzelhalsgalle verglichen, iv) erste Interaktionsstudien auf festen Nährmedien durchgeführt und v) virulente Agrobacteria mittels bildgebender Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) in Wurzelhalsgallen lokalisiert. Die Rebstöcke dieser Studie haben eine organspezifische Bakterienflora, die innerhalb einer Wachstumsperiode variiert. Nur die Bakterienflora der Pfropfstelle (mit oder ohne Wurzelhalsgalle) aber nicht die des Bodens, der Wurzeln, und der einjährigen Triebe unterscheidet sich strukturell zwischen gesunden und erkrankten Rebstöcken. Mikroskopisch konnten virulente Agrobacteria punktuell in Interzellularen, sklerenchymatischen Geweben und assoziiert mit Leitgefäßen nachgewiesen werden. Dadurch ist ausreichend Lebensraum vorhanden, der zusätzlich von tumorspezifischen Bakterien besiedelt werden kann. Im Gegensatz zur gesunden Pfropfstelle ist in der Wurzelhalsgalle eine saisonal stabile Kernmikroflora, bestehend aus Vertreter von A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria und Burkholderiales, vorhanden. Diese Bakterien werden überwiegend aus dem Boden rekrutiert und profitieren von der Nährstoffsituation in der Wurzelhalsgalle. Wurzelhalsgallen enthalten Opine, die nur von der transformierten Pflanzenzelle produziert werden. Interessanterweise hat in dieser Arbeit ein Agrobacterium-Isolat Gene, die zum Opinkatabolismus beitragen und ein Pseudomonas-Isolat kann Opine als einzige Kohlenstoffquelle nutzen. Trotzdem sind beide Isolate weder virulent noch verdrängen sie die virulenten A. vitis, die ebenso Opine nutzen, aus der Wurzelhalsgalle. In synthetischen Bakteriengemeinschaften an in vitro kultivierten Weinpflänzchen konnte gezeigt werden, dass diese und weitere tumorspezifischen Bakterien, neben A. vitis, nicht essentiell zur Entstehung der Wurzelhalsgalle nötig sind aber unterschiedliche Funktionen in der Wurzelhalsgalle übernehmen. Ein Serratia-Isolat hemmt das Wachstum von A. vitis auf festen Nährmedium, andere fördern oder hemmen das Wachstum der Wurzelhalsgalle. Nach Studien in der Literatur erhöhen weitere Bakterien die Resistenz des Rebstocks gegenüber biotischem und abiotischem Stress. Zusammengefasst identifizierten und isolierte ich in dieser Studie unter 150 unterschiedlichen Bakterien in der Wurzelhalsgalle jene Bakterien, die neben A. vitis von der neuen ökologischen Nische profitieren und somit wahrscheinlich Opportunisten mit unterschiedlichen Funktionen sind. In Folge von multiplen Interaktionen in der Wurzelhalsgalle entsteht ein ökologisches Gleichgewicht zwischen den opportunistischen Bakterien, der Wurzelhalsgalle und dem Rebstock, das den Fortbestand des Rebstocks mit Wurzelhalsgalle ermöglicht. N2 - In nature, Agrobacterium vitis is known for the ability to introduce bacterial DNA into the grapevine genome, thereby causing crown gall disease. This plant disease has been studied for a century as a model for plant-pathogen interaction, while the role of the plant microbiota in disease development is not well understood. My study contributes to the understanding of the microbial ecology in crown galls of grapevine, combining culture-dependent with culture-independent high-throughput sequencing techniques. I analysed the structure of the endophytic microbiota by collecting different samples (soil, roots, graft unions and canes) of diseased and non-diseased grapevines from one vine-yard in Franconia, Bavaria, Germany during one growing season (spring, summer, autumn). The characterization of the grapevine-associated bacterial microbiota was completed by (i) detecting the virulence of diverse agrobacterial isolates using a tumour growth assay with in vitro cultivated grapevine plantlets, (ii) microbial analysis of synthetic communities of in vitro cultivated grapevine plantlets with crown galls, (iii) genome sequencing of a virulent and a non-virulent agrobacterial isolate, (iv) in vitro interaction studies on solid medium with bacterial isolates and (v) localisation of virulent A. vitis using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) in tumour tissues. Grapevine plants of this study have an organ-specific bacterial community that varies during one growing season. Healthy and diseased grapevine plants differed in the struc-ture of the bacterial community only in the graft union (with or without a crown gall), but not in the soil, root and one-year old cane. Microscopy revealed that virulent Agrobacteria mainly accumulate in defined spots of sclerenchymatous tissue, intercellular space and tissues associated with vessels. Therefore, there is unoccupied living space in a crown gall, which can be additionally colonized by tumour-specific bacteria. A season-independent stable core bacteria exists in grapevine crown galls in contrast to healthy graft unions, consisting of OTUs assigned to A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria and Burkholderiales. These bacteria are predominantly recruited from the soil and most likely profit from special nutrients in the crown gall. The crown gall contains opines, exclusively produced by transformed plant cells. Curiously individual isolates of Agrobacteria and Pseudo-monas of this study that are non-virulent do not outcompete virulent A. vitis in the crown gall but harbour, like A. vitis, genes involved in octopin-catabolism or use opines in liquid cultures as a sole nutrient source. Although synthetic bacterial communities revealed that the tumour-specific bacteria are not required for crown gall induction us-ing in vitro grown grapevine plantlets, they may have different functions in crown gall persistence. A Serratia-isolate inhibits the growth of A. vitis on solid medium, others reduce or support crown gall development, while some, according to literature, increase resistance of the grapevine plant against biotic and abiotic stresses. Taken together, among the 150 bacteria found in the crown galls, I identified and isolated bacteria in addition to A. vitis that profit from the new ecological niche suggesting an opportunistic lifestyle with different ecological functions. An ecological equilibrium in a bacterial community that balances crown gall growth will support the existence of grapevine plants with a crown gall in vineyards. KW - Wurzelhalsgalle KW - DNA Barcoding KW - Agrobacterium vitis KW - Weinrebe KW - Angewandte Mikrobiologie KW - bakterielle Flora KW - Holobiont KW - Mikrobiota Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154359 ER - TY - THES A1 - Hagen, Franziska T1 - Sphingolipids in gonococcal infection T1 - Sphingolipide in der Gonokokken Infektion N2 - Neisseria gonorrhoeae, the causative agent of the sexually transmitted disease gonorrhea, has the potential to spread in the human host and cause a severe complication called disseminated gonococcal infection (DGI). The expression of the major outer membrane porin PorBIA is a characteristic of most gonococci associated with DGI. PorBIA binds to the scavenger receptor expressed on endothelial cells (SREC-I), which mediates the so-called low phosphate-dependent invasion (LPDI). This uptake mechanism enables N. gonorrhoeae to rapidly invade epithelial and endothelial cells in a phosphate-sensitive manner. We recently demonstrated that the neutral sphingomyelinase, which catalyses the hydrolysis of sphingomyelin to ceramide and phosphorylcholine, is required for the LPDI of gonococci in non-phagocytic cells. Neutral sphingomyelinase 2 (NSM2) plays a key role in the early PorBIA signaling by recruiting the PI3 kinase to caveolin. The following activation of the PI3 kinase-dependent downstream signaling leads to the engulfment of the bacteria. As a part of this work, I could confirm the involvement of the NSM2. The role of the enzyme was further elucidated by the generation of antibodies directed against NSM2 and the construction of an epithelium-based NSM2 knockout cell line using CRISPR/Cas9. The knockout of the NSM2 strongly inhibits the LPDI. The invasion could be, however, restored by the complementation of the knockout using an NSM2-GFP construct. However, the results could not be reproduced. In this work, I could show the involvement of further members of the sphingolipid pathway in the PorBIA-mediated invasion. Lipidome analysis revealed an increase of the bioactive molecules ceramide and sphingosine due to gonococcal infection. Both molecules do not only affect the host cell, but seem to influence the bacteria as well: while ceramide seems to be incorporated by the gonococci, sphingosine is toxic for the bacteria. Furthermore, the sphingosine kinase 2 (SPHK2) plays an important role in invasion, since the inhibition and knockdown of the enzyme revealed a negative effect on gonococcal invasion. To elucidate the role of the sphingosine kinases in invasion in more detail, an activity assay was established in this study. Additionally, the impact of the sphingosine-1-phosphate lyase (S1PL) on invasion was investigated. Inhibitor studies and infection experiments conducted with a CRISPR/Cas9 HeLa S1PL knockout cell line revealed a role of the enzyme not only in the PorBIA-mediated invasion, but also in the Opa50/HSPG-mediated gonococcal invasion. The signaling experiments allowed the categorization of the SPHK and S1PL activation in the context of infection. Like the NSM2, both enzymes play a role in the early PorBIA signaling events leading to the uptake of the bacteria. All those findings indicate an important role of sphingolipids in the invasion and survival of N. gonorrhoeae. In the last part of this work, the role of the NSM2 in the inhibition of apoptosis in neutrophils due to gonococcal infection was investigated. It could be demonstrated that the delayed onset of apoptosis is independent of neisserial porin and Opa proteins. Furthermore, the influence of neisserial peptidoglycan on PMN apoptosis was analysed using mutant strains, but no connection could be determined. Since the NSM2 is the most prominent sphingomyelinase in PMNs, fulfils manifold cell physiological functions and has already been connected to apoptosis, the impact of the enzyme on apoptosis inhibition due to gonococcal infection was investigated using inhibitors, with no positive results. N2 - Neisseria gonorrhoeae, der Auslöser der sexuell übertragbaren Krankheit Gonorrhö, hat das Potenzial sich im menschlichen Wirt auszubreiten und eine schwere Komplikation, die disseminierende Gonokokkeninfektion (DGI), hervorzurufen. Die Expression des Porins PorBIA, das eines der häufigsten Proteine der äußeren Membran ist, stellt ein Charakteristikum der mit DGI assoziierten Gonokokken dar. PorBIA bindet an SREC-I (scavenger receptor expressed on endothelial cells), der die phosphatabhängige Invasion (low phosphate-dependent invasion LPDI) vermittelt. Dieser Aufnahmemechanismus erlaubt es N. gonorrhoeae Epithel- sowie Endothelzellen, schnell zu invadieren. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die neutrale Sphingomyelinase 2 (NSM2), welche die Hydrolyse von Sphingomyelin zu Ceramid und Phosphorylcholin katalysiert, für die LPDI der Gonokokken in nicht-phagozytische Zellen benötigt wird. Dabei spielt die neutrale Sphingomyelinase 2 eine Schlüsselrolle in der frühen PorBIA Signalübertragung, indem sie die PI3 Kinase zu Caveolin rekrutiert. Die darauffolgende Aktivierung von nachgeschalteten Signalwegen, die von der PI3 Kinase abhängig sind, führt zur Aufnahme der Bakterien. Als Teil dieser Arbeit konnte ich die Beteiligung der NSM2 bestätigen. Die Rolle des Enzyms sollte durch die Herstellung von NSM2-spezifischen Antikörpern und einer auf Epithelzellen basierenden NSM2 knockout Zelllinie, die mit Hilfe des CRISPR/Cas9 Systems hergestellt wurde, aufgeklärt werden. Der knockout der NSM2 führte zu einer starken Inhibition der LPDI. Die Invasion konnte jedoch durch die Komplementation mit Hilfe eines NSM2-GFP Konstruktes wiederhergestellt werden. Wobei die Ergebnisse jedoch nicht reproduziert werden konnten. In dieser Arbeit konnte ich die Beteiligung weiterer Mitglieder des Sphingolipid Signalwegs an der PorBIA-vermittelten Invasion zeigen. Die Lipidomanalysen zeigten einen Anstieg der bioaktiven Moleküle Ceramide und Sphingosin aufgrund der Gonokokkeninfektion. Beide Moleküle beeinflussen nicht nur die Wirtszelle, sondern schienen auch Auswirkungen auf die Bakterien selbst zu haben: während Ceramid anscheinend von den Gonokokken aufgenommen wird, ist Sphingosin für die Bakterien toxisch. Weiterhin spielt die Sphingosinkinase 2 (SPHK2) eine wichtige Rolle in der Invasion, da die Inhibierung und der Knockdown des Enzyms die Gonokokkeninfektion negativ beeinflussen. Um die Rolle der Sphingosinkinasen in der Invasion im Detail zu erforschen, wurde in dieser Arbeit ein Aktivitätsassay etabliert. Außerdem wurde der Einfluss der Sphingosin-1-phosphat Lyase (S1PL) auf die Invasion erforscht. Inhibitorstudien und Infektionsexperimente, die mit einer CRISPR/Cas9 HeLa S1PL knockout Zelllinie durchgeführt wurden, zeigten, dass das Enzym nicht nur eine Rolle in der PorBIA-vermittelten, sondern auch in der Opa50/HSPG-vermittelten Gonokokkeninfektion spielt. Die Experimente, die bezüglich der zugrundeliegenden Signalwege durchgeführt wurden, erlaubten die Einordnung der Aktivierung der SPHK und der S1PL im Kontext der Invasion. Wie auch die NSM2, spielen beide Enzyme in der frühen PorBIA Signalübertragung eine Rolle, die schließlich zur Aufnahme der Bakterien führt. Alle diese Ergebnisse weisen auf eine wichtige Rolle der Sphingolipide für die Invasion und das Überleben von N. gonorrhoeae hin. Im letzten Teil dieser Arbeit, wurde die Inhibierung der Apoptose von Neutrophilen aufgrund der Gonokokkeninfektion untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das verspätete Einsetzen der Apoptose von neisseriellen Porinen und Opa Proteinen unabhängig ist. Weiterhin wurde der Einfluss von neisseriellem Peptidoglycan auf die Apoptose der Neutrophilen mit Hilfe von Mutanten untersucht, wobei eine Verbindung nicht bestätigt werden konnte. Da die NSM2 die bedeutendste Sphingomyelinase in Neutrophilen darstellt, sowie vielfältige zellphysiologische Funktionen erfüllt und im Vorfeld schon mit der Apoptose in Verbindung gebracht wurde, wurde der Einfluss des Enzymes auf die Inhibierung der Apoptose durch die Gonokokkeninfektion mit Hilfe von Inhibitoren überprüft. KW - gonococcal KW - sphingolipids KW - gonococcal infection Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153852 ER -