TY - THES A1 - Böhme, Linda T1 - Cellular response to double-stranded RNA in Chlamydia trachomatis-infected human host cells T1 - Zelluläre Antwort auf doppelsträngige RNA in Chlamydia trachomatis-infizierten humanen Wirtszellen N2 - Chlamydien sind Gram-negative, obligat-intrazelluläre Bakterien, die für ein weites Spektrum an relevanten Krankheiten verantwortlich sind. Auf Grund ihres zweiphasigen Entwicklungszyklusses sind Chlamydien von einer intakten Wirtszelle abhängig, um sich erfolgreich vermehren und im Organismus ausbreiten zu können. Daher haben Chlamydien anspruchsvolle Strategien entwickelt, um das Immunsystem des Wirtes auszuschalten oder den programmierten Zelltod ihrer Wirtszelle zu verhindern. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Infektion mit C. trachomatis einen Einfluss auf die zelluläre Antwort auf dsRNA nehmen kann. Die Synthese von dsRNA ist ein charakteristisches Merkmal der Replikation von Viren, welche sowohl die Apoptose induzieren als auch das Immunsystem aktivieren kann. Um eine chlamydiale und virale Co-Infektion zu simulieren, wurden Chlamydien-infizierte Epithelzellen mit der synthetischen dsRNA Polyinosin-Polycytidinsäure (polyI:C) transfiziert. Im ersten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die durch dsRNA eingeleitete Apoptose verhindern können. Eine signifikante Reduktion der dsRNA-induzierten Apoptose konnte in infizierten Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass die Prozessierung der Initiator-Caspase-8 in infizierten Zellen unterblieb. Dies war von der frühen bakteriellen Proteinsynthese abhängig und für die dsRNA-vermittelte Apoptose spezifisch, da der durch TNFalpha bewirkte Zelltod nicht auf der Ebene der Caspase-8 verhindert werden konnte. Die Aktivierung von zellulären Faktoren, die bei der Apoptoseinduzierung eine wichtige Rolle spielen, beispielsweise PKR und RNase L, war in infizierten Zellen jedoch unverändert. Stattdessen konnte durch RNA Interferenz-vermittelte Depletion gezeigt werden, dass der zelluläre Caspase-8-Inhibitor cFlip eine entscheidende Rolle bei der chlamydialen Blockierung der dsRNA-vermittelten Apoptose spielt. Mittels Co-Immunopräzipitation konnte ein erster Hinweis darauf gefunden werden, dass C. trachomatis eine Anreicherung von cFlip im dsRNA-induzierten Komplex von Caspase-8 und FADD bewirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die Immunantwort auf virale Infektionen beeinflussen, welche vor allem die Expression von Interferonen und Interleukinen beinhaltet. Es stellte sich heraus, dass die Aktivierung des Interferon regulatory factor 3 (IRF-3) und des zur Familie von NF-kappaB Trankriptionsfaktoren gehörenden p65, zwei zentralen Regulatoren der Immunantwort auf dsRNA, in infizierten Epithelzellen verändert war. Die Degradation von IkappaB-alpha, des Inhibitors von NF-kappaB, war in infizierten Zellen beschleunigt, begleitet von einer Veränderung der Translokation des Transkriptionsfaktors in den Zellkern. Im Gegensatz dazu wurde die nukleäre Translokation von IRF-3 durch die Infektion signifikant verhindert. Die hier vorgestellten Daten zeigen erstmals, dass eine Infektion mit C. trachomatis die zelluläre Antwort auf dsRNA signifikant verändern kann und implizieren einen Einfluss von chlamydialen Infektionen auf den Ausgang von viralen Superinfektionen. N2 - Chlamydia are Gram-negative obligate intracellular bacteria responsible for a wide spectrum of relevant diseases. Due to their biphasic developmental cycle Chlamydia depend on an intact host cell for replication and establishment of an acute infection. Chlamydia have therefore evolved sophisticated strategies to inhibit programmed cell death (PCD) induced by a variety of stimuli and to subvert the host immune system. This work aimed at elucidating whether an infection with C. trachomatis can influence the cellular response to double-stranded RNA (dsRNA). The synthesis of dsRNA is a prominent feature of viral replication inside infected cells that can induce both PCD and the activation of a cellular innate immune response. In order to mimic chlamydial and viral co-infections, Chlamydia-infected cells were transfected with polyinosinic:polycytidylic acid (polyI:C), a synthetic dsRNA. In the first part of this work it was investigated whether C. trachomatis-infected host cells could resist apoptosis induced by polyI:C. A significant reduction in apoptosis, determined by PARP cleavage and DNA fragmentation, could be observed in infected cells. It could be shown that processing of the initiator caspase-8 was inhibited in infected host cells. This process was dependent on early bacterial protein synthesis and was specific for dsRNA because apoptosis induced by TNFalpha was not blocked at the level of caspase-8. Interestingly, the activation of cellular factors involved in apoptosis induction by dsRNA, most importantly PKR and RNase L, was not abrogated in infected cells. Instead, RNA interference experiments revealed the crucial role of cFlip, a cellular caspase-8 inhibitor, for chlamydial inhibition of dsRNA-induced apoptosis. First data acquired by co-immunoprecipitation experiments pointed to an infection-induced concentration of cFlip in the dsRNA-induced death complex of caspase-8 and FADD. In the second part of this work, the chlamydial influence on the first line of defense against viral infections, involving expression of interferons and interleukins, was examined. Activation of the interferon regulatory factor 3 (IRF-3) and the NF-kappaB transcription factor family member p65, both central regulators of the innate immune response to dsRNA, was altered in Chlamydia-infected epithelial cells. polyI:C-induced degradation of IkappaB-alpha, the inhibitor of NF-kappaB, was accelerated in infected cells which was accompanied by a change in nuclear translocation of the transcription factor. Translocation of IRF-3, in contrast, was significantly blocked upon infection. Together the data presented here demonstrate that infection with C. trachomatis can drastically alter the cellular response to dsRNA and imply an impact of chlamydial infections on the outcome of viral super-infections. KW - Chlamydia trachomatis KW - Signaltransduktion KW - Immunreaktion KW - Doppelhelix KW - RNS KW - Apoptosis KW - Apoptose KW - doppelsträngige RNA KW - Immunantwort KW - Apoptosis KW - Chlamydia trachomatis KW - double-stranded RNA KW - innate immunity KW - signal transduction Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46474 ER - TY - THES A1 - Dinev, Dragomir T1 - Analysis of the role of extracellular signal regulated kinase (ERK5) in the differentiation of muscle cells T1 - Analyse der Rolle der extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK5) in der Differenzierung von Muskelzellen N2 - The MEK5/ ERK5 kinase module is a relatively new discovered mitogen-activated protein kinase (MAPK) signalling pathway with a poorly defined physiological function. Since ERK5 and its upstream activator MEK5 are abundant in skeletal muscle a function of the cascade during muscle differentiation was examined. ERK5 becomes activated upon induction of differentiation in mouse myoblasts. The selective activation of the pathway results in promoter activation of differentiation-specific genes, such as the cdk-inhibitor p21 gene, the myosin light chain (MLC1A) gene, or an E-box containing promoter element, where myogenic basic-helix-loop-helix proteins such as MyoD or myogenin bind. Moreover, myogenic differentiation is completely blocked, when ERK5 expression is inhibited by antisense RNA. The effect can be detected also on the expression level of myogenic determination and differentiation markers such as p21, MyoD and myogenin. Another new finding is that stable expression of ERK5 in C2C12 leads to differentiation like phenotype and to increased p21 expression levels under growth conditions. These results provide first evidence that the MEK5/ERK5 MAP kinase cascade is critical for early steps of muscle cell differentiation. N2 - MEK5/ ERK5 ist ein erst kürzlich entdeckter MAPK- Signalweg, dessen physiologische Funktion noch wenig verstanden ist. Da ERK5 und der in der Kaskade oberhalb liegende Aktivator MEK5 in Skelettmuskeln hoch expremiert werden, wurde eine Funktion der Kaskade während des Muskel-Differenzierung untersucht. ERK5 wird nach einer Induktion der Differenzierung in Maus-Myoblasten aktiviert. Die gezielte Aktivierung dieses Signalwegs führt zur Induzierung von Promotoren differenzierungs-spezifischer Gene, wie z.B. des cdk-Inhibitors p21, der MLC1A, oder eines Promotors, der E-Boxen enthält, woran myogene Basische-Helix- loop- Helix Proteine, wie MyoD oder Myogenin binden können. Darüber hinaus ist die Muskeldifferenzierung völlig blockiert, wenn die Expression von ERK5 mittels antisense-RNA inhibiert wird. Diesen Effekt kann man auch an hand der Menge von exprimierten muskelspezifischen Differenzierungsproteinen, wie p21, MyoD und Myogenin nachweisen. Eine weitere neue Entdeckung ist, daß stabile Expression von ERK5 in C2C12 Zellen zu einem differenzierungsähnlichen Phänotyp und gesteigerter p21 Expression unter Wachstum-bedingungen führt. Diese Ergebnisse geben erste Anhaltspunkte, daß der MEK5/ ERK5 MAP Kinase Signalweg entscheidend für frühe Stadien der Muskeldifferenzierung ist. KW - Muskelzelle KW - Zelldifferenzierung KW - Signaltransduktion KW - Proteinkinasen KW - ERK5 KW - MEK5 KW - MEF2C KW - MyoD KW - Muskeldifferenzierung KW - Kinase KW - ERK5 KW - MEK5 KW - MEF2C KW - MyoD KW - muscle differentiation KW - kinase Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180481 ER - TY - THES A1 - Feldmann, Kristina T1 - Signal transduction of transforming growth factor-Beta in cytotoxic T cells T1 - Signaltransduktion von Transforming-Growth-Factor-beta in Zytotoxischen T-Zellen N2 - Transforming-Growth-Factor-beta1 (TGF-b1) ist ein multifunktionelles Zytokin, welches insbesondere Zellwachstum und Zelldifferenzierung koordiniert. TGF-b ist vor allem dafür bekannt, Zellen des Immunsystems zu beeinflussen. TGF-b steuert zum Beispiel die Differenzierung von T-Zellen und und deren Effektorfunktionen. Die Signaltransduktion von TGF-b wird vermittelt durch die Phosphorylierung von Rezeptor-assoziierten Smad-Proteinen (R-Smads). R-Smads werden vom Typ I Rezeptor aktiviert, der seinerseits vom hochaffinen Typ II Rezeptor phosphoryliert wird, sobald der Ligand bindet. Die phosphorylierten RSmads assoziieren darauf mit Co-Smads. Heterooligomere von R-Smads und Co-Smads wandern dann in den Zellkern, wo sie im Zusammenspiel mit Transkriptionsfaktoren wie CBP/p300 oder AP-1 die Transkription TGF-b-spezifischer Zielgene koordinieren. Neue Erkenntnisse lassen vermuten, daß die pleiotropen Effekte von TGF-b durch das Interagieren mit anderen Signalkaskaden entstehen, zum Beispiel mit dem MAP-Kinase-Weg oder der STAT-Kaskade. Wir beschreiben hier den Effekt von TGF-b auf die Effektorfunktionen unterschiedlich stimulierter primärer Maus-Milzzellen und aufgereinigten zytotoxischen CD8+ Maus-TZellen. Langzeitbehandlung mit TGF-b resultierte in der Unfähigkeit der Zellen, Smad2 ligandeninduziert zu phosphorylieren. Entweder wurde überhaupt keine Phosphorylierung beobachtet, oder eine anhaltende Phosphorylierung von Smad2 unabhängig vom Vorhandensein des Liganden. Des weiteren stellten wir einen Zusammenhang zwischen anhaltender Smad2-Phosphorylierung und der Resistenz gegenüber TGF-b induzierter Wachstumshemmung fest. Im Gegensatz dazu zeigen Zellen, die sensitiv sind gegenüber TGF-b vermittelter Wachstumshemmung, keine Smad2-Phosphorylierung mehr. Bezüglich ihrer zytotoxische Aktivtät waren allerdings beide Phänotypen nicht mehr lytisch wirksam, unabhängig von der jeweiligen Smad2-Phosphorylierung. In dieser Arbeit zeigen wir auch die Notwendigkeit eines funktionalen MEK-1-Signalweges auf, der unabdingbar ist, damit TZellen keine Wachstumsinhibierung durch TGF-b mehr erfahren. Das Blockieren dieses Signalweges führt darüberhinaus bei diesen Zellen ebenfalls zu einem veränderten Smad2- Phosphorylierungsmuster. Bezüglich des JNK-Signalweges konnten wir feststellen, daß ein funktional aktiver JNK-Signalweg mit der Resistenz gegenüber TGF-b vermittelter Wachstumsinhibierung einhergeht. Allerdings führt die Zugabe von IFNg und/oder aCD28- Antikörper nicht zu einer veränderten Sensitivität gegenüber TGF-b. Im Gegensatz zuprimären Zellen können die beschriebenen Zusammenhänge in Zellkulturen vom humanen und murinen T Zellen nicht beobachtet werden, und sind somit spezifisch für primare TZellen. Wir beschreiben auch die Klonierung eines chimären dominant-negativen Typ II Rezeptors, der an eine Kinase gekoppelt ist, die bei Aktivierung Zelltod auslöst. Damit soll es in Zukunft möglich sein, T-Zellen gegenüber TGF-b Resistenz zu verleihen. Die hier geschilderten Ergebnisse vertiefen die Kenntnisse über molekulare Mechanismen der Wirkung von TGF-b auf T-Zellen und können vielleicht dazu beitragen, negative Effekte von TGF-b, zum Beispiel in der Tumortherapie, gezielt abzuwenden. N2 - Transforming-Growth-Factor-beta1 (TGF-b1) is a multifunctional cytokine that regulates cell growth and differentiation in many types of cells. TGF-b1 is especially known to exert a variety of regulatory functions in the immune system, such as T cell differentiation and T cell function. Signal transduction of TGF-b1 is mediated by phosphorylation of receptorassociated Smad proteins (R-Smads). R-Smads are phosphorylated by the activated type I receptor, which is itself phosphorylated by the high affinity type II receptor upon ligand binding. The phosphorylated R-Smads then associate with Co-Smads. Heterooligomers of R- and Co-Smads translocate into the nucleus where they regulate transcription of target genes in concert with other transcription factors such as CBP/p300 or AP-1. Recent findings suggest that the pleiotropic effects of TGF-b1 are conferred by crosstalks to other signal transduction pathways such as the MAP-kinases or the STAT-pathway. Here we describe the effect of long-term exposure to TGF-b1 on the effector function of differentially stimulated primary murine splenocytes and purified primary murine CD8+ cytotoxic T cells. Long-term exposure to TGF-b1 results in non-responsiveness to TGF-b1- induced Smad2 phosphorylation. This is seen either by no phosphorylation or sustained phosphorylation of Smad2. Furthermore, we observed a strong correlation between sustained Smad2 phosphorylation and resistance to TGF-b1 mediated growth inhibition. In contrast, splenocyte cultures strongly growth inhibited by TGF-b1 showed no Smad2 phosphorylation. Lytic activity of these cultures, however, was found to be suppressed regardless of proliferation properties and Smad2 phosphorylation pattern. We also describe that a functional MEK-1 pathway is a prerequisite for rendering murine splenocytes unresponsive to TGF-b1 mediated growth inhibition, and that inhibition of the MEK-1 cascade alters the Smad2 phosphorylation pattern. In addition, we show that resistance to TGF-b1 mediated growth inhibition correlates with the activation of the JNK pathway. However, the resistant phenotype was found unable to be reverted upon administration of exogeneous IFNg and/or aCD28 antibody. In human or mouse T cell lines, however, the described correlation between the type of stimulation and TGF-b growth resistance or growth sensitivity is not present. Thus, this correlation is specific for primary T cells. We also cloned a chimeric dominantnegative TGF-b receptor which is coupled to a suicide gene, in order to render T cells resistant to TGF-b mediated effects.These findings shed light on how TGF-b1 mediates its immunosuppressive role, and may help to gain knowledge of averting these TGF-b1 effects in the course of tumor therapy. KW - T-Lymphozyt KW - Transforming Growth Factor beta 1 KW - Signaltransduktion KW - T-Zellen KW - TGF-beta KW - Signaltransduktion KW - Smad KW - T-cells KW - TGF-beta KW - Signal transduction KW - Smad Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4912 ER - TY - THES A1 - Hart, Stefan T1 - Characterisation of the molecular mechanisms of EGFR signal transactivation in human cancer T1 - Charakterisierung der molekularen Mechanismen der EGFR-Transaktivierung in humanen Tumoren. N2 - In a variety of established tumour cell lines, but also in primary mammary epithelial cells metalloprotease-dependent transactivation of the EGFR, and EGFR characteristic downstream signalling events were observed in response to stimulation with physiological concentrations of GPCR agonists such as the mitogens LPA and S1P as well as therapeutically relevant concentrations of cannabinoids. Moreover, this study reveals ADAM17 and HB-EGF as the main effectors of this mechanism in most of the cancer cell lines investigated. However, depending on the cellular context and GPCR agonist, various different members of the ADAM family are selectively recruited for specific ectodomain shedding of proAR and/or proHB-EGF and subsequent EGFR activation. Furthermore, biological responses induced by LPA or S1P such as migration in breast cancer and HNSCC cells, depend on ADAM17 and proHB-EGF/proAR function, respectively, suggesting that highly abundant GPCR ligands may play a role in tumour development and progression. Moreover, EGFR signal transactivation could be identified as the mechanistic link between cannabinoid receptors and the activation of mitogen activated protein kinases (MAPK) ERK1/2 as well as pro-survival Akt/PKB signalling. Depending on the cellular context, cannabinoid-induced signal cross-communication was mediated by shedding of proAmphiregulin and/or proHB-EGF by ADAM17. Most importantly, our data show that concentrations of THC comparable to those detected in the serum of patients after THC administration accelerate proliferation of cancer cells instead of apoptosis and thereby may contribute to cancer progression in patients. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass in verschiedenen etablierten Tumorzelllinien, aber auch in primären Brustepithelzellen sowohl physiologische Konzentrationen von GPCR Liganden, wie z.B. den Mitogenen LPA und S1P, als auch therapeutische Konzentrationen von Cannabinoiden zur metalloproteaseabhängigen Aktivierung des EGFRs führen. Abhängig von diesem Mechanismus konnte die Aktivierung der mitogenen Ras/MAPK-Kaskade als auch des antiapoptotischen Akt/PKB Signalweges beobachtet werden. Untersuchungen mit Hilfe der siRNA-Technik oder dominant-negativen Konstrukten identifizierten ADAM17 sowie den EGFR-Liganden HB-EGF als wichtigste Komponenten dieses Signalweges. Abhängig vom Zellsystem konnte aber auch eine Beteiligung anderer Mitglieder der ADAM Familie sowie des EGFR-Liganden Amphiregulin nachgewiesen werden. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die durch LPA und S1P induzierten biologische Prozesse, wie z.B. die Migration in Brustkrebs- oder HNSCC-Zellen, vollständig von der Aktivität von ADAM17 und HB-EGF/AR abhängig waren. Außerdem konnte die ADAM17- und HB-EGF/AR-vermittelte EGFR-Transaktivierung als Bindeglied zwischen Cannabinoid-Rezeptoren und MAPK- und Akt-Aktivierung sowie erhöhter Zellproliferation identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Rolle der EGFR Signaltransaktivierung und dadurch induzierter biologischer Antworten wie Zellmigration oder –proliferation in Tumorzellen, und sollten darüber hinaus zu einer Neubewertung der Krebstherapie mit Cannabinoiden führen. KW - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor KW - Krebs KW - Signaltransduktion KW - EGFR KW - GPCR KW - Transaktivierung KW - Krebs KW - Metalloprotease KW - EGFR KW - GPCR KW - transactivation KW - cancer KW - metalloprotease Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10067 ER - TY - THES A1 - Harth, Stefan T1 - Molecular Recognition in BMP Ligand-Receptor Interactions T1 - Molekulare Erkennung in BMP Ligand-Rezeptor Interaktionen N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are secreted multifunctional signaling proteins that play an important role during development, maintenance and regeneration of tissues and organs in almost all vertebrates and invertebrates. BMPs transmit their signals by binding to two types of serine-/threonine-kinase receptors. BMPs bind first to their high affinity receptor, thereby recruiting their low affinity receptor into the complex. This receptor assembly starts a Smad (Small mothers against decapentaplegic) protein signaling cascade which regulates the transcription of responsive genes. Up to date, only seven type I and five type II receptors are known for more than 30 ligands. Therefore, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype. Vice versa, receptors can bind to several ligands, indicating a highly promiscuous ligand-receptor interaction. This raises the following questions: (i) How are BMPs able to induce ligand-specific signals, despite forming complexes with identical receptor composition and (ii) how are they able to recognize and bind various binding partners in a highly specific manner. From the ligand’s point of view, heterodimeric BMPs are valuable tools for studying the interplay between different sets of receptors, thereby providing new insights into how the various BMP signals can be generated. This study describes the expression and purification of the heterodimers BMP-2/6 and -2/7 from E.coli cells. BIAcore interaction studies and various in vitro cell activity assays revealed that the generated heterodimers are biologically active. Furthermore, BMP-2/6 and -2/7 exhibit a higher biological activity in most of the cell assays compared to their homodimeric counterparts. In addition, the BMP type I receptor BMPR-IA is involved in heterodimeric BMP signaling. However, the usage of other type I receptor subtypes (e.g. ActR-I) building a heteromeric ligand-receptor type I complex as indicated in previous works could not be determined conclusively. Furthermore, BMP heterodimers seem to require only one type I receptor for signaling. From the receptors’ point of view, the BMP type I receptor BMPR-IA is a prime example for its promiscuous binding to different BMP ligands. The extracellular binding interface of BMPR-IA is mainly unfolded in its unbound form, requiring a large induced fit to adopt the conformation when bound to its ligand BMP-2. In order to unravel whether the binding promiscuity of BMPR-IA is linked to structural plasticity of its binding interface, the interaction of BMPR-IA bound to an antibody Fab fragment was investigated. The Fab fragment was selected because of its ability to recognize the BMP-2 binding epitope on BMPR-IA, thus neutralizing the BMP-2 mediated receptor activation. This study describes the crystal structure of the complex of the extracellular domain of BMPR-IA bound to the antibody Fab fragment AbyD1556. The crystal structure revealed that the contact surface of BMPR-IA overlaps extensively with the contact surface of BMPR-IA for BMP-2 interaction. Although the contact epitopes of BMPR-IA to both binding partners coincide, the three-dimensional structures of BMPR-IA in both complexes differ significantly. In contrast to the structural differences, alanine-scanning mutagenesis of BMPR-IA showed that the functional determinants for binding to both the antibody and BMP-2 are almost identical. Comparing the structures of BMPR-IA bound to BMP-2 or to the Fab AbyD1556 with the structure of unbound BMPR-IA revealed that binding of BMPR-IA to its interaction partners follows a selection fit mechanism, possibly indicating that the ligand promiscuity of BMPR-IA is inherently encoded by structural adaptability. N2 - „Bone Morphogenetic Proteins” (BMPs) sind sezernierte multifunktionelle Signalproteine, die eine wichtige Rolle während der Entwicklung, Aufrechterhaltung und Regeneration von Geweben und Organen in fast allen Vertebraten und wirbellosen Tieren spielen. Die BMP-Signalgebung wird durch die Bindung an zwei Typen von Serin/Threonin Rezeptorkinasen eingeleitet. Hierbei binden BMPs zuerst an ihren hochaffinen Rezeptor, bevor der niederaffine Rezeptor in den Komplex eingefügt wird. Durch das Zusammenfügen beider Rezeptortypen wird eine von Smad (Small mothers against decapentaplegic)-Proteinen gesteuerte Signalkaskade gestartet, die letztendlich die Transkription responsiver Gene reguliert. Aktuell sind nur sieben Typ I und fünf Typ II Rezeptoren für mehr als 30 Liganden bekannt. Viele BMP-Liganden können demzufolge mehr als einen Rezeptorsubtyp rekrutieren. Umgekehrt jedoch können auch Rezeptoren an unterschiedliche Liganden binden, was auf eine im hohen Maße promiske Ligand-Rezeptor-Interaktion hinweist. Dabei stellen sich folgende Fragen: (i) Wie können BMPs ligandspezifische Signale erzeugen, obwohl sie dafür die gleichen Rezeptoren benutzen? (ii) Und wie können BMPs unterschiedliche Bindungspartner erkennen und trotzdem hochspezifisch an diese binden? Von Blickwinkel der Liganden aus betrachtet stellen heterodimere BMPs wertvolle Hilfsmittel dar, um das Zusammenspiel zwischen den verschiedenen Rezeptortypen zu studieren. Darüber hinaus können sie neue Einblicke in die Entstehung von unterschiedlichen BMP-Signalen gewähren. In dieser Doktorarbeit wird die Expression und Aufreinigung von heterodimeren BMP-2/6 und -2/7 aus E.coli Zellen beschrieben. Mittels BIAcore Interaktionsstudien und in vitro Aktivitätsassays in Säugerzellen konnte gezeigt werden, dass die hergestellten Heterodimere biologisch aktiv sind. Darüber hinaus zeigen BMP-2/6 and -2/7 in den meisten Zellassays eine höhere biologische Aktivität als ihre homodimeren Gegenstücke. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass der BMP Typ I Rezeptor BMPR-IA an der Signalgebung von heterodimeren BMPs involviert ist. Eine Beteiligung weiterer Typ I Rezeptoren (wie z.B. die von ActR-I), die einen heteromeren Ligand-Rezeptor Typ I Signalkomplex bilden, wie es bereits in früheren Studien gezeigt wurde, konnte jedoch experimentell nicht eindeutig belegt werden. Des Weiteren lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass heterodimere BMPs für eine erfolgreiche Signalweiterleitung nur die Präsenz eines einzelnen Typ I Rezeptors benötigen. Von Blickwinkel der Rezeptoren aus betrachtet, ist der BMP Typ I Rezeptor BMPR-IA ein Paradebeispiel für promiskes Bindeverhalten an verschiedene BMP-Liganden. Das extra-zelluläre Kontaktepitop von BMPR-IA ist im Wesentlichen ungefaltet, wenn BMPR-IA in freier ungebundener Form vorliegt. Infolge dessen durchläuft die Binderegion in BMPR-IA weit reichende strukturelle Veränderungen, um die erforderliche Konformation auszubilden, die für die Bindung an BMP-2 essentiell ist. Um herauszufinden, ob das promiske Binde-verhalten von BMPR-IA mit einer strukturellen Plastizität seiner Binderegion einhergeht, wurde die Interaktion zwischen BMPR-IA und einem Antikörper Fab Fragment experimentell untersucht. Das Fab Fragment wurde aufgrund folgender Eigenschaft ausgewählt, nämlich an das BMP-2 Bindeepitop des Rezeptors anzudocken, um so eine BMP-2 vermittelte Rezeptoraktivierung zu verhindern. In dieser Doktorarbeit wird die Kristallstruktur des Komplexes, bestehend aus der extrazellulären Domäne von BMPR-IA und dem Antikörper Fab Fragment AbyD1556 beschrieben. Die Kristallstruktur zeigt, dass die Kontaktoberfläche von BMPR-IA zu einem sehr großen Teil mit der Kontaktoberfläche bei der Interaktion mit BMP-2 übereinstimmt. Obwohl das Kontaktepitop von BMPR-IA zu beiden Bindungspartnern weitestgehend deckungsgleich ist, unterscheiden sich die dreidimensionalen Strukturen von BMPR-IA in beiden Komplexen sehr stark voneinander. Im Gegensatz zu den strukturellen Differenzen zeigt jedoch eine Mutationsanalyse, bei der wichtige Aminosäuren mit Alanin ausgetauscht wurden, dass die funktionellen Determinanten, die die Bindung an den Antikörper und an BMP-2 bestimmen, beinahe die gleichen sind. Wenn man die Strukturen von BMPR-IA, das an BMP-2 bzw. an das Fab Fragment AbyD1556 gebunden ist, mit der Struktur von ungebundenem BMPR-IA vergleicht, so fällt auf, dass die Bindung von BMPR-IA an seine Bindungspartner einem sog. „Selektions-Anpassungsmechanismus“ folgt, was möglicherweise zeigt, dass das promiske Ligand-Bindeverhalten von BMPR-IA von Natur aus durch seine strukturelle Anpassungsfähigkeit festgelegt wird. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Ligand KW - Molekulare Erkennung KW - Transforming Growth Factor beta KW - Strukturaufklärung KW - Proteinfaltung KW - Proteinkristallographie KW - Heterodimer KW - BMP-2/6 KW - BMP-2/7 KW - BMPR-IA KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - protein crystallography KW - signal transduction KW - heterodimer Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52797 ER - TY - THES A1 - Haßel, Sylke T1 - Signal transduction via multiple BMP receptor complexes T1 - Signaltransduktion über verschiedene BMP Rezeptorkomplexe N2 - BMPs influence a variety of cellular processes. They have been shown to regulate proliferation, differentiation, migration and apoptosis and thus play central roles during developmental processes and tissue homeostasis. Ligand mediated signal transduction is transmitted via BMP type I and BMP type II receptors, both members of the serine/threonine kinase superfamily. The BMP receptor mediated signal transduction is not explored in detail. Therefore our aim was to address different aspects of BMP mediated signal transduction with main focus on BRII and its regulation. Due to the existence of two alternative splice variants, a long and a short form, the function of the two variants and the impact of the C-terminal extension are of general interest. Moreover, mutations in the BMPR2 gene were identified to be responsible for PPH, a autosomal dominant lung disease. In this thesis, BRII phosphorylation and signalling mediated by different receptor oligomers were investigated and multiple BRII associated proteins were identified. We could show that the oligomerization pattern of BMP receptors exhibits a higher degree of flexibility compared to other receptors of that superfamily. In the present work the BMP2 mediated signal transduction should be examined, depending on the receptor oligomerization pattern. Using kinase-deficient mutants, it could be demonstrated, that signalling via preformed BMP receptor complexes is mediated by the well characterized Smad1/5/8 pathway, whereas signalling initiated by BMP2 induced recruitment of the receptors activates the p38 pathway and leads to Alkaline Phosphatase production. To further study signalling events triggered directly from the BRII a proteomics-based screen for BRII associated proteins was performed. 53 associated proteins were found, the majority being signal transducing molecules, but in addition metabolic proteins, transcriptional regulators and others were identified. These proteins enable to gain a deeper insight in BMP mediated signalling. One of the interactors, the receptor tyrosine kinase c-kit, was characterized in more detail. It could be demonstrated, that BRII and c-kit form a complex in vitro and in vivo, and the interaction is enhanced upon BMP2 stimulation. 2D phosphopeptid mapping showed that BRII is phosphorylated at S757 upon activation of c-kit by SCF. Moreover, c-kit and its ligand SCF are modulating BMP2 pathways, by enhancing Smad1/5 phosphorylation, Smad-transcriptional activity, Alkaline Phosphatase production and expression of Cbfa1. All these pathways hint towards modulation of the osteoblast development via c-kit. Thus, we were able to develop a novel paradigm for the BMP2 meditated signalling. One of the initial triggers for BRII is the auto-phosphorylation of BRII. Here we analyze ligand-independent as well as ligand-dependent phosphorylation of BRII. Some phosphorylation sites in BRII were identified. The general phosphorylation occurs mostly on serines. S815, S818 and Y825 are identified targets of phosphorylation whose function is still unclear. However phosphorylation of S336 is demonstrated to be essential for BRII activation. The elucidation of BMP receptor phosphorylation and oligomerization as well as the impact of a number of BRII associated proteins (such as c-kit), demonstrated in this thesis that BMP signalling has to be regulated precisely on multiple levels. This can be useful for the development of selective signalling inhibitors for basic research and therapeutic approaches of PPH and other diseases. N2 - BMPs regulieren eine Vielzahl zellulärer Prozesse, unter anderem Zellwachstum, Zelldifferenzierung, Bewegung und Zelltod. Dies macht sie zu einem bedeutenden Faktor während zahlreicher Entwicklungsvorgänge und im adulten Organismus. BMP-Signale werden über BMP Typ I und Typ II Rezeptoren weitergeleitet, die beide Serin/Threonin Kinase Rezeptoren sind. Während der Typ I Rezeptor Signale zu den Smad-Proteinen weiterleitet, fungiert der Typ II Rezeptor seinerseits als Aktivator des Typ I Rezeptors und ist somit für die Signalweiterleitung essentiell. Alternative Signalwege sind nicht sehr gut untersucht. Deswegen war es unser Ziel verschiedene Aspekte der BMP vermittelten Signaltransduktion, mit Schwerpunkt BRII, zu untersuchen. Der BRII ist interessant, da er in zwei alternativen Spleißvarianten vorliegt, einer langen und einer kurzen Form, die sich intrazellulär um mehr als 500 Aminosäuren unterscheiden und deren Unterschiede hinsichtlich Signalweiterleitung noch nicht erforscht sind. Darüber hinaus führen Mutationen im BMPR2 Gen zu einen Gefäßerkrankung der Lunge, PPH. In dieser Arbeit wurden die BRII Phosphorylierung und Signalweiterleitung, initiiert von unterschiedlichen BMP Rezeptorkomplexen, untersucht. Hierbei wurde eine Vielzahl von BRII assoziierten Proteine identifiziert und hinsichtlich ihres Einflusses auf BMP Signalweiterleitung charakterisiert.. Unser Labor konnte zeigen, daß das Oligomerisierungsmuster der BMP Rezeptoren weitaus flexibler als das der verwandten TGF-β Rezeptoren ist. Aus diesem Grund wurde die Siganltransduktion der BMP Rezeptoren im Hinblick auf die Komplexbildung untersucht. Mit Hilfe Kinase-defekter Mutanten konnte gezeigt werden, dass präformierte Rezeptorkomplexe den Smad-Signalweg benutzen, wohingegen liganden-induzierte Komplexe ihre Signale über den p38-Weg weiterleiten, welcher die Produktion von Alkalischer Phosphatase steuert. Um darüber hinaus Signalwege ausgehend vom BRII zu untersuchen und mehr über Smad-unabhängige Signalwege zu erfahren, wurde ein Proteomics-basierter Screen nach BMP Typ II Rezeptor interagierenden Proteinen durchgeführt. Unter den 53 Rezeptor-assoziierten Proteinen befanden sich viele Signaltransduktionsmoleküle, aber auch metabolische Proteine, Proteine, die an der Regulation der Transkription beteiligt sind und andere. Mit Hilfe dieser Proteine kann ein Einblick in die Vielfalt der BMP Rezeptor vermittelten Signaltransduktion gewonnen werden. Der Tyrosinkinase Rezeptor c-kit ist eines der assoziierten Proteine. Es konnte gezeigt werden, dass die Interaktion durch BMP2 Zugabe in vivo verstärkt wurde. Phosphorylierung an Serin 757 des BRII, vermittelt von aktiviertem c-kit und SCF, konnte mittels 2-dimensionalem Phosphopeptidmapping gezeigt werden. Außerdem beeinflusst der SCF/c-kit Signalweg auch bereits beschriebene BMP Signalwege. So konnten synergistische Effekte beider Liganden auf dem Smad1/5 Weg, bei der Produktion der Alkalischen Phosphatase und bei der Transkription von Cbfa1 beobachtet werden, alles Wege, die die Entwicklung von Osteoblasten steuern. So konnte mit dem Einfluß von c-kit auf BMP2 vermittelte Osteoblastenetwicklung ein neuer Faktor bei BMP gesteuerter Entwicklung aufgedeckt werden. Einer der initialen Trigger bei der BMP Signaltransuktion ist die Aktivierung des BMP Typ II Rezeptors durch Phosphorylierung. Es wurde Liganden-unabhängige wie Liganden-abhängige Phosphorylierung des BRII untersucht und die jeweiligen Phosphorylierungssites identifiziert. Hauptsächlich findet die Phosphorylierung an Serinen statt. So wurden S815 und S818, aber auch Y825 als Target-sites identifiziert. Im Gegensatz zu der Phosphorylierung von S815, S818 und Y825, deren Funktion noch unklar ist, konnte gezeigt werden, daß Phosphorylierung von S336 essentiell für die Rezeptoraktivierung ist. Die Erforschung der BMP-Rezeptor Phosphorylierung, Oligomerisierung und Rezeptor-assoziierter Proteine (wie c-kit), wie in dieser Arbeit vorgestellt, zeigt, dass BMP vermittelte Signaltransduktion präzise auf mehreren Ebenen reguliert werden muß. Die hier erstmalig beschriebenen Wege der Regulation der BMP Signaltransduktion tragen sowohl zu einem besseren Verständnis molekularer Zusammenhänge bei, als auch zu der Entwicklung selektiver Inhibitoren und therapeutischer Ansätze zur Behandlung der PPH und anderer Krankheiten. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Signaltransduktion KW - BMP KW - Signaltransduktion KW - Smad KW - p38 KW - proteomics KW - BMP KW - signalling KW - Smad KW - p38 KW - proteomics Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13353 ER - TY - THES A1 - Jiménez-Pearson, María-Antonieta T1 - Characterization of the mechanisms of two-component signal transduction involved in motility and chemotaxis of Helicobacter pylori T1 - Untersuchungen zur Zweikomponenten- Signaltransduktion bei der Motilität und Chemotaxis von Helicobacter pylori N2 - Flagellen-basierte Motilität und Chemotaxis stellen essentielle Pathogenitätsfaktoren dar, die für die erfolgreiche Kolonisierung der Magenschleimhaut durch H. pylori notwendig sind. Die Mechanismen der Regulation der Flagellensynthese und das Chemotaxis-System von H. pylori weisen trotz einiger Ähnlichkeiten fundamentale Unterschiede zu den Systemen anderer Bakterien auf. In H. pylori ist die Flagellensynthese durch eine komplex regulierte Kaskade kontrolliert, die Regulatorkomponenten wie das Zweikomponentensystem HP244/FlgR, die Sigma Faktoren 54 und 28 und den Sigma Faktor28-Antagonisten FlgM enthält. Das Signal, welches über die Histidinkinase des Zweikomponentensystems HP244/FlgR die Expression der Sigma Faktor54-abhängigen Klasse 2 Flagellengene reguliert, ist bisher noch nicht bekannt. Allerdings konnte mit HP137 ein Protein identifiziert werden, das im „yeast two-hybrid“ System sowohl mit der korrespondierenden Kinase HP244 des Flagellenregulators FlgR, als auch mit der Flagellenkomponente FlgE´ interagiert (Rain et al., 2001). In dieser Arbeit wurde eine mögliche Rolle von HP137 in einem Rückkopplungsmechanismus untersucht, welcher die Aktivität der Histidinkinase in der Flagellenregulation kontrollieren könnte. Obwohl die Deletion des ORF hp137 zu einer unbeweglichen Mutante führte, legen die erfolglosen Komplementations Experimente, sowie die Beobachtung, dass HP137 in vitro keinen bedeutenden Effekt auf die Aktivität der Histidinkinase HP244 hat nahe, dass HP137 weder in H. pylori noch im nahe verwandten C. jejuni direkt an der Flagellenregulation beteiligt ist. Das Chemotaxis-System von H. pylori unterscheidet sich vom gutuntersuchten Chemotaxis-System der Enterobakterien in einigen Aspekten. Zusätzlich zu dem CheY Response Regulator Protein (CheY1) besitzt H. pylori eine weitere CheY-artige Receiver-Domäne (CheY2) welche C-terminal an die Histidinkinase CheA fusioniert ist. Zusätzlich finden sich im Genom von H. pylori Gene, die für drei CheV Proteine kodieren die aus einer N-terminalen Domäne ähnlich CheW und einer C-terminalen Receiver Domäne bestehen, während man keine Orthologen zu den Genen cheB, cheR, and cheZ findet. Um einen Einblick in den Mechanismus zu erhalten, welcher die chemotaktische Reaktion von H. pylori kontrolliert, wurden Phosphotransferreaktionen zwischen den gereinigten Signalmodulen des Zweikomponentensystems in vitro untersucht. Durch in vitro-Phosphorylierungsexperimente wurde eine ATP-abhängige Autophosphorylierung der bifunktionellen Histidinkinase CheAY2 und von CheA´, welches ein verkürztes Derivat von ChAY2 ohne Receiver-Domäne darstellt, nachgewiesen. CheA´ zeigt eine für an der Chemotaxis beteiligte Histidinkinasen typische Phosphorylierungskinetik mit einer ausgeprägten exponentiellen Phase, während die Phosphorylierungskinetik von CheAY2 nur eine kurze exponentielle Phase aufweist, gefolgt von einer Phase in der die Hydrolyse von CheAY2~P überwiegt. Es wurde gezeigt, dass die Anwesenheit einer der CheY2 Domäne die Stabilität der phosphorylierten P1 Domäne im CheA Teil des bifunktionellen Proteins beeinflusst. Außerdem wurde gezeigt, dass sowohl CheY1 als auch CheY2 durch CheAY2 phosphoryliert werden und dass die drei CheV Proteine die Histidinkinase CheA´~P dephosphorylieren, wenn auch mit einer im Vergleich zu CheY1 und CheY2 geringeren Affinität. Außerdem ist CheA´ in der Lage seine Phosphatgruppen auf CheY1 aus C. jejuni und CheY aus E. coli zu übertragen. Retrophosphorylierungsexperimente weisen darauf hin, dass CheY1~P die Phosphatgruppe zurück auf die Histidinkinase CheAY2 übertragen kann und dass die CheY2-Domäne in dem bifunktionellen Protein CheAY2 als „Phosphat Sink“ agiert der den Phosphorylierungszustand und damit die Aktivität des frei diffundierbaren Proteins CheY1 reguliert, das vermutlich es mit dem Flagellenmotor interagiert. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die unabhängige Funktion der beiden Domänen CheA´ und CheY2 für eine normale chemotaktische Signalgebung in vivo nicht ausreicht. In dieser Arbeit wurden also Hinweise auf eine komplexe Kaskade Phosphatübertragungsreaktionen im chemotaktischen System von H. pylori gefunden, welches Ähnlichkeiten zu dem Syteme-Chemotaxis von S. meliloti aufweist an denen multiple CheY Proteine beteiligt sind. Die Rolle der CheV Proteine bleibt im Moment unklar, jedoch könnte es sein, dass sie an einer weiteren Feinregulierung der Phosphatgruppenübertragungsreaktionen in diesem komplexen chemotaktischen System beteiligt sind N2 - Flagellar motility and chemotaxis are essential virulence traits required for the ability of Helicobacter pylori to colonize the gastric mucosa. The flagellar regulatory network and the complex chemotaxis system of H. pylori are fundamentally different from other bacteria, despite many similarities. In H. pylori expression of the flagella is controlled by a complex regulatory cascade involving the two-component system FlgR-HP244, the sigma factors 54 and 28 and the anti-sigma 28 factor FlgM. Thus far, the input signal for histidine kinase HP244, which activates the transcriptional regulator FlgR, which triggers sigma factor 54-dependent transcription of the flagellar class 2 genes, is not known. Based on a yeast two-hybrid screen a highly significant protein-protein interaction between the H. pylori protein HP137 and both the histidine kinase HP244 and the flagellar hook protein HP908 (FlgE´) has been reported recently (Rain et al., 2001). So far, no function could be assigned to HP137. Interestingly, the interaction between HP137 and histidine kinase HP244 was observed in the characteristic block N sequence motif of the C-terminal ATP-binding kinase domain. In this work a potential role of HP137 in a feedback regulatory mechanism controlling the activity of histidine kinase HP244 in the flagellar regulation of H. pylori was investigated. Although the substitution of the gene encoding HP137 by a kanamycin cassette resulted in non-motile bacteria, the failure to restore motility by the reintroduction of hp137 in cis into the mutant strain, and the observation that HP137 has no significant effect on the activity of histidine kinase HP244 in vitro indicated that HP137 is not directly involved in flagellar regulation. Therefore, it was demonstrated that HP137 does not participate in the regulation of flagellar gene expression, neither in H. pylori nor in the closely related bacterium C. jejuni. Chemotactic signal transduction in H. pylori differs from the enterobacterial paradigm in several respects. In addition to a CheY response regulator protein (CheY1) H. pylori contains a CheY-like receiver domain (CheY2) which is C-terminally fused to the histidine kinase CheA. Furthermore, the genome of H. pylori encodes three CheV proteins consisting of an N-terminal CheW-like domain and a C-terminal receiver domain, while there are no orthologues of the chemotaxis genes cheB, cheR, and cheZ. To obtain insight into the mechanism controlling the chemotactic response of H. pylori the phosphotransfer reactions between the purified two-component signalling modules were investigated in vitro. Using in vitro phosphorylation assays it was shown that both H. pylori histidine kinases CheAY2 and CheA´ lacking the CheY-like domain (CheY2) act as ATP-dependent autokinases. Similar to other CheA proteins CheA´ shows a kinetic of phosphorylation represented by an exponential time course, while the kinetics of phosphorylation of CheAY2 is characterized by a short exponential time course followed by the hydrolysis of CheAY2~P. Therefore, it was demonstrated that the presence of the CheY2-like receiver domain influences the stability of the phosphorylated P1 domain of the CheA part of the bifunctional protein. Furthermore, it was proven that both CheY1 and CheY2 are phosphorylated by CheAY2 and CheA´~P and that the three CheV proteins mediate the dephosphorylation of CheA´~P, although with a clearly reduced efficiency as compared to CheY1 and CheY2. Moreover, CheA´ is capable of donating its phospho group to the CheY1 protein from C. jejuni and to CheY protein from E. coli. Retrophosphorylation experiments indicated that CheY1~P is able to transfer the phosphate group back to the HK CheAY2 and the receiver domain present in the bifunctional CheAY2 protein acts as a phosphate sink fine tuning the activity of the freely diffusible CheY1 protein, which is thought to interact with the flagellar motor. Hence, in this work evidence of a complex phosphorelay in the chemotaxis system was obtained which has similarities to other systems with multiple CheY proteins. The role of the CheV proteins remain unclear at the moment, but they might be engaged in a further fine regulation of the phosphate flow in this complex chemotaxis system and the independent function of the two domains CheA´ and CheY2 is not sufficient for normal chemotactic signalling in vivo. KW - Helicobacter pylori KW - Chemotaxis KW - Motilität KW - Signaltransduktion KW - Helicobacter pylori KW - Flagellensynthese KW - Chemotaxis KW - Phosphotransferreaktionen KW - Helicobacter pylori KW - Flagella KW - Chemotaxis KW - Phosphotransfer reactions Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15698 ER - TY - THES A1 - Lutz, Marion T1 - Effects of nerve growth factor on TGF-Beta,Smad signal transduction in PC12 cells T1 - Einfluß von NGF auf die TGF-ß/Smad Signaltransduktion in PC12 Zellen N2 - Transforming growth factor-ß (TGF-ß) is a multifunctional cytokine that is engaged in regulating versatile cellular processes that are pivotal for development and homeostasis of most tissues in multicellular organisms. TGF-ß signal transduction is initially propagated by binding of TGF-ß to transmembrane serine/threonine kinase receptors, designated TßRI and TßRII. Upon activation, the receptors phosphorylate Smad proteins which serve as downstream mediators that enter the nucleus and finally trigger transcriptional responses of specific genes. During the past years, it became evident that signaling cascades do not proceed in a linear fashion but rather represent a complex network of numerous pathways that mutually influence each other. Along these lines, members of the TGF-ß superfamily are attributed to synergize with neurotrophins. Together, they mediate neurotrophic effects in different populations of the nervous system, suggesting that an interdependence exists between TGF-ßs on the one hand and neurotrophins on the other. In the present work, the crosstalk of NGF and TGF-ß/Smad signaling pathways is characterized in rat pheochromocytoma cells (PC12) which are frequently used as a model system for neuronal differentiation. PC12 cells were found to be unresponsive to TGF-ß due to limiting levels of TßRII. However, stimulation with NGF results in initiation of Smad-mediated transcription independent of TGF-ß. Binding of NGF to functional TrkA receptors triggers activation of Smad3. This NGF-dependent Smad activation occurs by a mechanism which is different from being induced by TGF-ß receptors in that it provokes a different phosphorylation pattern of R-Smads. Together with an inferior role of TßRI, Smad3 is proposed to serve as a substrate for cellular kinases other than TßRI. Based on the presented involvement of components of both, the MAPK/Erk and the TAK1/MKK6 cascade, signal mediators of these pathways rank as candidates to mediate direct activation of Smad3. Smad3 is subsequently translocated to the nucleus and activates transcription in a Smad4-dependent manner. Negative regulation is provided by Smad7 which was found to act as a potent inhibitor of Smad signaling not only in TGF-ß- but also in NGF-mediated cascades. The potential of NGF to activate the Smad pathway independent of TGF-ß might be of special importance in regulating expression of genes that are essential for the development and function of neuronal cells or of other NGF-sensitive cells, in particular those which are TGF-ß-resistant. N2 - Das multifunktionelle Zytokin TGF-ß ist an der Regulation vielfältiger zellulärer Prozesse beteiligt. Diese sind für die Entwicklung und die Homöostase der meisten Gewebe vielzelliger Organismen essenziell. Die TGF-ß Signaltransduktionskaskade wird durch die Bindung des Zytokins an spezifische transmembrane Serin/Threonin-Kinase Rezeptoren (TßRI und TßRII) initiiert. Eine solche Rezeptoraktivierung führt zur Phosphorylierung von Smad Proteinen. Diese dienen der Signalweiterleitung, indem sie anschließend in den Zellkern translozieren und dort die Transkription spezifischer Zielgene modulieren. In den letzten Jahren wurde deutlich, dass Signalkaskaden nicht nur linear weitergeleitet werden, sondern dass vielmehr ein komplexes Netzwerk aus zahlreichen, sich gegenseitig regulierenden, Signalwegen existiert. In diesem Zusammenhang wird auch den Mitgliedern der TGF-ß Superfamilie zugeschrieben, dass sie mit Neurotrophinen kooperieren und somit deren Effekte in unterschiedlichen neuronalen Zellpopulationen unterstützen. In der vorliegenden Arbeit wurde der "crosstalk" von NGF- und TGF-ß/Smad-Signalwegen charakterisiert. Als Zellsystem dienten dazu Ratten Pheochromocytoma Zellen (PC12), die weithin als Modellsystem für neuronale Differenzierung verwendet werden. Basierend auf der Expression limitierender Mengen an TßRII, zeigen PC12 Zellen keine Responsivität gegenüber TGF-ß. Stimulation mit NGF hingegen resultiert - unabhängig von TGF-ß - in der Initiation von Smad-vermittelter Transkription. Die initiale Bindung von NGF an TrkA Rezeptoren führt zur Aktivierung von Smad3. Diese NGF-induzierte Smad-Aktivierung unterscheidet sich von der durch TGF-ß-Rezeptoren initiierten Aktivierung hinsichtlich des Phosphorylierungsmusters der R-Smads. Da weiterhin gezeigt werden konnte, dass die TGF-ß Rezeptoren für NGF-induzierte Ereignisse eine untergeordnete Rolle spielen, wird angenommen, dass Smad3 ein Substrat für andere zelluläre Kinasen als TßRI ist. Die hier nachgewiesene Beteiligung der MAPK/Erk Kaskade sowie des TAK1/MKK6 Signalwegs an der Weiterleitung des NGF-Signals machen deren Signalmoleküle zu potenziellen Kinasen für die direkte Aktivierung von Smad3. Im Anschluß daran erfolgt die nukleäre Translokation des Smad3 und spezifische Promotoraktivierungen unter Beteiligung von Smad4. Abschließend konnte gezeigt werden, dass das Smad7 Protein, nicht nur nach TGF-ß- sondern auch nach NGF-Stimulation als effektiver Inhibitor der Smad Signalkaskade wirkt. Die bislang unbekannte Fähigkeit, den Smad-Signaltransduktionsweg unabhängig von TGF-ß zu aktivieren, schreibt NGF eine besondere Bedeutung für die Genregulation in neuronalen Zellpopulationen oder anderen NGF-sensitiven - insbesondere TGF-ß-resistenten - Zellen zu. KW - Transforming growth factor beta KW - Nervenwachstumsfaktor KW - Signaltransduktion KW - TGF-ß KW - NGF KW - Signaltransduktion KW - TGF-ß KW - NGF KW - signal transduction KW - crosstalk Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4248 ER - TY - THES A1 - Pei, Geng T1 - The Role of Raf-mediated Signalling Pathways for Motoneuron T1 - Die Rolle von Raf-vermittelten Signalwegen bei Entwicklung und Überleben von Motoneuronen N2 - The transmission of proliferative and developmental signals from activated cell-surface receptors to initiation of cellular responses in the nucleus is synergically controlled by the coordinated action of a diverse set of intracellular signalling proteins. The Ras/Raf/MEK/MAPK signalling pathway has been shown to control the expression of genes which are crucial for the physiological regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Within this signalling cascade, the Raf protein family of serine/threonine kinases serves as a central intermediate which connects to many of other signal transduction pathways. To elucidate the signalling functions of the different Raf kinases in motoneurons during development, the expression, distribution and subcellular localization of Rafs in the spinal cord and the facial nucleus in brainstem of mice at various embryonic and postnatal stages were investigated. Moreover, we have investigated the intracellular redistribution of Raf molecules in isolated motoneurons from 13 or 14 day old mouse embryos, after addition or withdrawal of neurotrophic factors to induce Raf kinases activation in vitro. Furthermore, in order to investigate the potential anti-apoptotic function of Raf kinases on motoneurons, we isolated motoneurons from B-raf-/- and c-raf-1-/- mouse embryos and analysed the survival and differentiation effects of neurotrophic factors in motoneurons lacking B-Raf and c-Raf-1. We provide evidence here that all three Raf kinases are expressed in mouse spinal motoneurons. Their expression increases during the period of naturally occurring cell death of motoneurons. In sections of embryonic and postnatal spinal cord, motoneurons express exclusively B-Raf and c-Raf-1, but not A-Raf, and subcellularly Raf kinases are obviously colocalized with mitochondria. In isolated motoneurons, most of the B-Raf or c-Raf-1 immunoreactivity is located in the perinuclear space but also in the nucleus, especially after activation by addition of CNTF and BDNF in vitro. We found that c-Raf-1 translocation from the cytosol into the nucleus of motoneurons after its activation by neurotrophic factors is a distinct event. As a central finding of our study, we observed that the viability of isolated motoneurons from B-raf but not c-raf-1 knockout mice is lost even in the presence of CNTF and other neurotrophic factors. This indicates that B-Raf but not c-Raf-1, which is still present in B-raf deficient motoneurons, plays a crucial role in mediating the survival effect of neurotrophic factors during development. In order to prove that B-Raf is an essential player in this scenario, we have re-expressed B-Raf in mutant sensory and motor neurons by transfection. The motoneurons and the sensory neurons from B-raf knockout mouse which were transfected with exogenous B-raf gene revealed the same viability in the presence of neurotrophic factors as primary neurons from wild-type mice. Our results suggest that Raf kinases have important signalling functions in motoneurons in mouse CNS. In vitro, activation causes redistribution of Raf protein kinases, particularly for c-Raf-1, from motoneuronal cytoplasm into the nucleus. This redistribution of c-Raf-1, however, is not necessary for the survival effect of neurotrophic factors, given that B-raf-/- motor and sensory neurons can not survive despite the presence of c-Raf-1. We hypothesize that c-Raf-1 nuclear translocation may play a direct role in transcriptional regulation as a consequence of neurotrophic factor induced phosphorylation and activation of c-Raf-1 in motoneurons. Moreover, the identification of target genes for nuclear translocated c-Raf-1 and of specific cellular functions initiated by this mechanism awaits its characterization. N2 - Die Vermittlung von wachstumsfördernden und entwicklungsspezifischen Signalen von aktivierten Zelloberflächenrezeptoren führt zur Initiation von Transkriptionsprogrammen im Zellkern, die durch das koodinierte Zusammenwirken von intrazellulären Signalproteinen synergistisch gesteuert werden. Der Ras/Raf/MEK/MAPK-Weg steuert die Expression von Genen für die physiologische Regulation der Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose. Innerhalb dieser Signalkaskade stellen die Serin/Threonin Kinasen der Raf Familie eine zentrale Zwischenstufe dar, die Verbindungen zu vielen anderen Signaltransduktionswegen herstellt. Um die Funktionen der verschiedenen Raf-Kinasen in Motoneuronen während der Entwicklung aufzuklären, wurden die Expression, Verteilung und subzelluläre Lokalisation der Raf-Isoformen in spinalen Motoneuronen und im Nucleus Fazialis der Maus während der Embryonalentwicklung und postnatal untersucht. Desweiteren haben wir die intrazelluläre Umverteilung der Raf-Moleküle in isolierten Motoneuronen von 13 oder 14 Tage alten Mäusembryonen untersucht. Um die Rolle der Raf-Kinasen nach Zugabe oder Entzug von neurotrophen Faktoren bei Motoneuronen zu untersuchen, analysierten wir die Überlebens-und Differenzierungseffekte von neurotrophen Faktoren bei Motoneuronen von B-raf oder c-raf-1 defizienten Mäusen. Wir zeigen in dieser Arbeit, daß alle drei Raf-Kinasen in spinalen Motoneuronen der Mäuse exprimiert sind. Ihre Expression steigt während der Zeit des natürlich auftretenden Zelltods. An Schnitten von embryonalem und postnatalem Rückenmark exprimieren Motoneurone ausschließlich B-Raf and c-Raf-1, aber nicht A-Raf. Raf-Kinasen sind offensichtlich an Mitochondrien lokalisiert. In isolierten Motoneuronen findet man B-Raf und c-Raf-1, Immunreaktivität vor allem im perinukleären Bereich, aber auch im Zellkern, vor allem nach Aktivierung durch Zugabe von CNTF und BDNF in vitro. Wir haben gefunden, daß die Translokation von c-Raf-1 vom Zytosol in den Nukleus von Motoneuronen nach Aktivierung durch neurotrophe Faktoren ein spezifischer Vorgang ist. Als zentralen Befund dieser Arbeit beobachteten wir, daß Motoneurone von B-raf-/-, aber nicht von c-raf-1-/-, Embryonen nicht lebensfähig sind, auch nicht in Gegenwart von CNTF oder anderer neurotropher Faktoren. Dies bedeutet, daß B-Raf und nicht c-Raf-1, welches noch immer in B-raf defizienten Motoneuronen präsent ist, eine entscheidende Rolle als Vermitter des Überlebenseffektes von neurotrophen Faktoren spielt. Um zu beweisen, daß B-Raf hierbei eine essentielle Komponente darstellt, haben wir in B-raf defizienten sensorischen und Motoneuronen B-Raf durch Transfektion exprimiert. Erfolgreich mit B-raf Plasmid transfizierte B-raf-/- sensorische und Motoneurone zeigten dieselbe Überlebensfähigkeit in Gegenwart von neurotrophen Faktoren wie primäre Neurone von Wildtyp-Mäusen. Diese Arbeit zeigt daher, daß Raf-Kinasen wichtige Funktionen in Motoneuronen der Maus haben. Die Aktivierung von Raf-Kinasen in vitro führt zur Änderung ihrer subzellulären Verteilung, vor allem von c-Raf-1 vom Zytoplasma in den Kern. Diese Umverteilung von c-Raf-1 ist jedoch nicht notwendig für den Überlebenseffekt von neurotrophen Faktoren, vor allem, wenn man in Betracht zieht, daß B-raf defiziente sensorische und Motoneuronen trotz der Gegenwart von c-Raf-1 nicht überleben. Wir nehmen an, daß die nukleäre Translokation von c-Raf-1 eine direkte Rolle bei der transkriptionellen Regulation durch neurotrophe Faktoren spielt. Die Indentifizierung von c-Raf-1 regulierten Zielgenen und von durch diese beeinflussten zellulären Funktionen ist eine Aufgabe für die Zukunft. KW - Maus KW - Motoneuron KW - Zelldifferenzierung KW - Raf KW - Signaltransduktion KW - Raf-Kinasen KW - Motoneuron KW - Raf-Kinase KW - Zentrales Nervensystem KW - motoneuron KW - Raf KW - CNS Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1846 ER - TY - THES A1 - Schul, Daniela T1 - Spatio-temporal investigation and quantitative analysis of the BMP signaling pathway T1 - Raum-Zeitliche Untersuchung und quantitative Analyse des BMP-Signaltransduktionsweges N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are key regulators for a lot of diverse cellular processes. During embryonic development these proteins act as morphogens and play a crucial role particularly in organogenesis. BMPs have a direct impact on distinct cellular fates by means of concentration-gradients in the developing embryos. Using the diverse signaling input information within the embryo due to the gradient, the cells transduce the varying extracellular information into distinct gene expression profiles and cell fate decisions. Furthermore, BMP proteins bear important functions in adult organisms like tissue homeostasis or regeneration. In contrast to TGF-ß signaling, currently only little is known about how cells decode and quantify incoming BMP signals. There is poor knowledge about the quantitative relationships between signal input, transducing molecules, their states and location, and finally their ability to incorporate graded systemic inputs and produce qualitative responses. A key requirement for efficient pathway modulation is the complete comprehension of this signaling network on a quantitative level as the BMP signaling pathway, just like many other signaling pathways, is a major target for medicative interference. I therefore at first studied the subcellular distribution of Smad1, which is the main signal transducing protein of the BMP signaling pathway, in a quantitative manner and in response to various types and levels of stimuli in murine c2c12 cells. Results indicate that the subcellular localization of Smad1 is not dependent on the initial BMP input. Surprisingly, only the phospho-Smad1 level is proportionally associated to ligand concentration. Furthermore, the activated transducer proteins were entirely located in the nucleus. Besides the subcellular localization of Smad1, I have analyzed the gene expression profile induced by BMP signaling. Therefore, I examined two endogenous immediate early BMP targets as well as the expression of the stably transgenic Gaussia Luciferase. Interestingly, the results of these independent experimental setups and read-outs suggest oscillating target gene expression. The amplitudes of the oscillations showed a precise concentration-dependence for continuous and transient stimulation. Additionally, even short-time stimulation of 15’ activates oscillating gene-expression pulses that are detectable for at least 30h post-stimulation. Only treatment with a BMP type I receptor kinase inhibitor leads to the complete abolishment of the target gene expression. This indicated that target gene expression oscillations depend directly on BMP type I receptor kinase activity. N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) stellen wichtige Regulatoren für eine Vielzahl von verschiedenen zellulären Prozessen dar. Während der Embryonalentwicklung agieren diese Proteine als Morphogene und spielen daher eine entscheidende Rolle für diesen Prozess, vor allem in der Organogenese. Durch Konzentrationsgradienten üben BMPs einen direkten Einfluss auf verschiedene zelluläre Schicksale im entwickelnden Embryo aus. Aufgrund dieser Gradienten gelangen vielfältige Signalinformationen zu den verschiedenen Zellen, welche die extrazelluläre Information in verschiedene Genexpressionsprofile und Zellschicksalsentscheidungen umwandeln. Darüber hinaus tragen BMPs wichtige Funktionen im erwachsenen Organismus, wie z.B. Gewebshomöostase oder -regeneration. Im Gegensatz zu dem verwandten TGF-ß Signaltransduktionsweg ist derzeit nur wenig über die zelluläre Übersetzung und Quantifizierung eingehender BMP-Signale bekannt. Es gibt wenige Kenntnisse über die quantitative Beziehung zwischen Signaleingang, Überträgerproteinen, ihren Zuständen sowie intrazellulären Positionen, und schließlich ihre Fähigkeit Signaleingänge systemisch zu integrieren und qualitative Antworten der Zelle zu produzieren. Eine wesentliche Voraussetzung für die effiziente Signaltransduktions-modulierung ist das vollständige Verständnis des Signalnetzwerkes auf einer quantitativen Ebene, da der BMP-Signalweg, wie auch viele andere Signalwege, ein wichtiges Ziel für medizinische Anwendungen und Medikamentenentwicklung ist. Daher untersuchte ich zunächst die subzelluläre Verteilung der wichtigsten Signalweiterleitungsproteine des BMP-Signalweges, der Smad1-Proteine, auf quantitativer Ebene und deren Reaktion auf verschiedene Stimulierungsarten und BMP-Konzentrationsstufen in murinen c2c12-Zellen. Die Ergebnisse zeigen, dass die subzelluläre Lokalisation von Smad1 unabhängig von der BMP-Konzentration ist und nur das phospho-Smad1 Level proportional zur Konzentration des Liganden steigt. Darüber hinaus befanden sich die aktiven Überträgerproteine nach Stimulierungvollständig im Zellkern. Neben der subzellulären Lokalisation von Smad1, habe ich das Genexpressionsprofil von BMP-Zielgenen analysiert. Ich untersuchte zwei endogene und frühe BMP-Zielgene sowie die Expression der stabil transgenen Gaussia Luciferase. Interessanterweise deuten die Ergebnisse dieser zwei unabhängigen Versuchsaufbauten und Detektionsmethoden auf eine oszillierende Expression der Zielgene hin. Die Amplituden der Schwingungen zeigten eine deutliche Konzentrationsabhängigkeit bei kontinuierlicher und transienter Stimulation. Außerdem aktiviert eine Kurzzeitstimulierung von 15 Minuten ebenfalls ein oszillierendes Genexpressionsprofil, welches für mindestens 30 Stunden nach der Stimulierung nachweisbar ist. Nur die Behandlung mit einem BMP Typ-I-Rezeptorkinaseinhibitor führt zur vollständigen Aufhebung der Zielgenexpression. Infolgedessen sind die Oszillationen der Zielgenexpression direkt von der Aktivität der BMP Typ-I-Rezeptorkinase abhängig. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Signaltransduktion KW - BMP-Signaltransduktionsweg KW - Analyse KW - BMP signaling pathway KW - analysis Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-84224 ER -