TY - THES A1 - Kißner [geb. Stenger], Stefanie Martina T1 - Morphologische Untersuchungen an Myoblasten von Patienten, die an facioscapulohumeraler Muskeldystrophie (FSHD) leiden T1 - Morphological studies on myoblasts of patients with facioscapulohumeral muscular dystrophy N2 - Die autosomal-dominant vererbte facioscapulohumerale Muskeldystrophie (FSHD) ist mit einer Prävalenz von etwa 1:20.000 die dritthäufigste Form der hereditären Myopathien. Erste Beschwerden werden meist in der zweiten Lebensdekade beobachtet. Betroffen sind vor allem die Muskulatur von Gesicht, Schultern, Oberarmen, die Fußhebermuskulatur und die Muskeln des Hüftgürtels. FSHD wird durch einen Gendefekt ausgelöst, der den langen Arm des Chromosoms vier (4q35) betrifft, wobei es zur teilweisen Deletion des polymorphen Abschnitts D4Z4, der für das Protein DUX4 codiert, kommt. Dabei treten unter anderem Störungen in der DUX4-Expression, Veränderungen der myogenen Genexpression, eine Unterdrückung der Muskelzelldifferenzierung und eine Inhibition der Muskelbildung auf. FSHD und eine andere Form der Muskeldystrophie, die Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), zeigen trotz unterschiedlicher genetischer Ursachen phänotypisch Ähnlichkeiten in der Ausprägung der Erkrankungen. In früheren Studien zeigte die Kernhülle von EDMD-Myoblasten morphologische Auffälligkeiten. In anderen Untersuchungen waren morphologische Veränderungen der Mitochondrien von FSHD-Patienten festzustellen. Daher wurden elektronenmikroskopische Untersuchungen der Kernhülle und der Mitochondrien von FSHD-Myoblasten durchgeführt und mit der entsprechenden Kontrolle verglichen. Hierfür wurden drei verschiedene Zelllinien-Paare in unterschiedlichen Passagen, das heißt unterschiedlicher Anzahl an Subkultivierungen, eingesetzt, wobei in den höheren Passagen vermehrt morphologische Atypien beobachtet werden konnten. Die eingesetzten Zelllinien differenzieren sich durch verschiedene Parameter wie beispielsweise Alter und Geschlecht der Patienten. Dabei zeigten sich sowohl zwischen den Kontrollzellen als auch zwischen den FSHD-Myoblasten Unterschiede. Im Rahmen der Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie kamen zwei verschiedene Fixierungsmethoden zum Einsatz: die konventionelle chemische Fixierung, Entwässerung und Flacheinbettung von Kulturzellen und die Hochdruckgefrierung mit anschließender Gefriersubstitution. In Bezug auf die Qualität des Strukturerhalts, die beim Hochdruckgefrieren erreicht wird, wird dieser Art der Fixierung eine Überlegenheit gegenüber allen anderen Verfahren zugeschrieben. Diese allgemeine Aussage kann nicht vollständig auf die Untersuchungen an den Myoblasten übertragen werden. Für die Untersuchung der Kernmembranen sind beide Methoden geeignet, wobei der Abstand zwischen innerer und äußerer Kernmembran nach der HPF-Fixierung schärfer abgebildet wurde. Bei der Darstellung der Mitochondrien zeigten die elektronenmikroskopischen Aufnahmen nach dem Hochdruckgefrieren bessere und schärfere Ergebnisse. Die Kernporen waren bei beiden Fixierungsmethoden gut erkennbar. Beim Vergleich der gesunden und erkrankten Myoblasten wiesen die Kontrollzellen deutlich weniger Auffälligkeiten auf als die Myoblasten von FSHD-Patienten. Innere und äußere Kernmembran verliefen bei den Kontrollzellen meist parallel und die Mitochondrien zeigten in den meisten Fällen eine typische wurmartige, längliche Form mit Cristae. Dies traf sowohl für die konventionelle Fixierung als auch für das Hochdruckgefrieren zu. Die erkrankten Myoblasten wiesen im Vergleich zur Kontrolle bei beiden Fixierungsmethoden deutliche Auffälligkeiten in der Mitochondrien-Morphologie auf. Neben einer oft großen Variationsbreite hinsichtlich Form und Länge war auch das teilweise Fehlen der Cristae festzustellen. Bei Betrachtung der Kernhülle fielen jedoch deutliche Unterschiede zwischen konventioneller und HPF-Fixierung auf. Die äußere Kernmembran der konventionell fixierten FSHD-Myoblasten verlief unregelmäßig und gewellt. Im Gegensatz dazu wies die Kernhülle der HPF-fixierten erkrankten Myoblasten einen erstaunlich parallelen Verlauf auf. Da bei EDMD in vorangegangenen Untersuchungen auch fluoreszenzmikroskopisch Veränderungen der erkrankten Zellen auffällig waren, wurde neben den Methoden der Elektronenmikroskopie das Vorliegen und die Verteilung verschiedener Proteine in FSHD-Myoblasten mittels indirekter Immunfluoreszenz untersucht und mit den Kontrollzellen verglichen. Zur Beurteilung der Kernhülle wurden Antikörper gegen Lamin A/C und Nukleoporine eingesetzt. Die Mitochondrien wurden mithilfe des Antikörpers ANT1/2, der an den Adenin-Nukleotid-Translokator der inneren Mitochondrienmembran bindet, untersucht. Im Gegensatz zu den Untersuchungen an EDMD-Myoblasten waren die Lamine A und C sowie die Kernporen sowohl bei den Myoblasten der FSHD-Patienten als auch bei den Kontrollzellen nachweisbar und gleichmäßig verteilt. Bei der indirekten Immunfluoreszenz mit ANT1/2 zeigten sich Unterschiede zwischen den untersuchten Myoblasten-Paaren. Durch die vorliegenden Ergebnisse ist darauf zu schließen, dass die Myoblasten von FSHD-Patienten Veränderungen Mitochondrien aufweisen. Die Untersuchungen der Kernhülle liefern abhängig von der Fixierungsmethode unterschiedliche Ergebnisse. N2 - The autosomal dominant facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD), with a prevalence of about 1:20,000, is the third most common form of hereditary myopathy. First complaints are usually observed in the second decade of life. Most affected are the muscles of the face, shoulders, upper arms, lower legs and girdle. FSHD is triggered by a gene defect affecting the long arm of chromosome four (4q35), resulting in the partial deletion of polymorphic portion D4Z4 encoding the protein DUX4. This leads to disorders in DUX4 expression, changes in myogenic gene expression, suppression of muscle cell differentiation and inhibition of muscle formation. FSHD and another form of muscular dystrophy, the Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD), show phenotypic similarities in the severity of the disease, despite different genetic causes. In previous studies, the nuclear envelope of EDMD myoblasts showed morphological abnormalities. Other studies revealed morphological changes in the mitochondria of FSHD patients. Therefore, electron micrographs of the nuclear envelope and mitochondria of FSHD myoblasts were performed and compared to the corresponding control. For this purpose, three different pairs of myoblasts were used in different passages, that is, different numbers of subcultures, with increased morphological atypia being observed in the higher passages. The cell lines used differentiate by several parameters such as age and sex of the patients. There were differences between the control cells as well as between the FSHD myoblasts. Two different fixation methods were used in sample preparation for electron microscopy: conventional chemical fixation, drainage and flat embedding of cultured cells and high-pressure freezing with subsequent freeze substitution. In terms of the quality of structure preservation achieved in high pressure freezing, this type of fixation is attributed superiority over all other methods. This general statement cannot be completely applied to the investigations on the myoblasts. For the investigation of the nuclear membranes both methods are suitable, whereby the distance between inner and outer nuclear membrane after the HPF fixation was more sharply mapped. In the representation of mitochondria, the electron micrographs after high pressure freezing showed better and sharper results. The nuclear pores were easily recognizable in both fixation methods. When comparing the healthy and diseased myoblasts, the control cells showed significantly less abnormalities than the myoblasts of FSHD patients. The inner and outer nuclear membrane were mostly parallel in the control cells, and the mitochondria in most cases showed a typical worm-like elongated form with cristae. This was true for both conventional fixation and high pressure freezing. FSHD myoblasts exhibited marked abnormalities in mitochondrial morphology compared to controls in both fixation methods. In addition to an often wide range of variation in shape and length there was also noted the partial absence of cristae. When looking at the nuclear envelope, however, there were clear differences between conventional and HPF fixation. The outer nuclear membrane of the conventionally fixed FSHD myoblasts was irregular and wavy. In contrast, the nuclear envelope of HPF fixed diseased myoblasts showed an astonishingly parallel course. Since in EDMD changes in the diseased cells were also noticeable by fluorescence microscopy, in addition to the methods of electron microscopy, the presence and distribution of various proteins in FSHD myoblasts was examined by indirect immunofluorescence and compared with the control cells. To assess the nuclear envelope, antibodies against lamin A/C and nucleoporins were used. The mitochondria were examined using the antibody ANT1 / 2, which binds to the adenine nucleotide translocator of the inner mitochondrial membrane. In contrast to the studies on EDMD myoblasts, the lamins A and C as well as the nuclear pores were detectable and evenly distributed both in the myoblasts of the FSHD patients and in the control cells. Indirect immunofluorescence with ANT1 / 2 showed differences between the investigated myoblasts. The present results suggest that the myoblasts of FSHD patients have changes in mitochondria. The investigations of the nuclear envelope provide different results depending on the fixation method. KW - Landouzy-Déjerine-Atrophie KW - Facioscapulohumeral muscular dystrophy KW - Myoblast KW - Morphologie KW - FSHD KW - myoblast KW - Myoblasten KW - HPF KW - morphology Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156676 ER - TY - THES A1 - Böck, Julia T1 - Differenzielle Methylierungsanalysen mittels verschiedener Next-Generation Sequencing-basierter Techniken: Die Bedeutung von differenziell methylierten Regionen in der menschlichen Hirnevolution und bei der Krebsentstehung T1 - Differential methylation analysis via various next-generation sequencing technologies: The impact of differentially methylated regions on human brain evolution and cancer development N2 - Die Evolution der Primaten zeigt eine Verbindung zwischen der zunehmenden Komplexität des sozialen Verhaltens und der Vergrößerung des humanen Gehirns, insbesondere des präfrontalen Cortex. Deshalb stellt der präfrontale Cortex bezüglich der Evolution des Menschen eine der interessantesten Strukturen im humanen Gehirn dar. Es wird angenommen, dass nicht allein die Größe, sondern auch die Funktion, vor allem das Zusammenspiel von Neuronen und nicht-neuronalen Zellen, wie z.B. Gliazellen, zur Differenzierung des menschlichen Gehirns von dem rezenter Primaten geführt hat. Daraus lässt sich schließen, dass die Gehirnfunktionen über eine ausgeglichene und gut aufeinander abgestimmte transkriptionelle Landschaft kontrolliert werden, die durch ein zugrundeliegendes genetisches und epigentisches Rückgrat organisiert ist. In dieser Studie wurden das Methylierungsprofil neuronaler und nicht-neuronaler Zellen des präfrontalen Cortex (Brodmann-Areal 10) von drei Menschen und drei Schimpansen miteinander verglichen. Die intra- und interspezifischen differenziell methylierten Regionen (DMRs) waren in bestimmten genomischen Regionen angereichert. Intraspezifische Methylierungsunterschiede zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen konnten dreimal häufiger beobachtet werden als interspezifische Unterschiede in den einzelnen Zelltypen. Rund 90% der humanen intraspezifischen DMRs wiesen eine Hypomethylierung in den neuronalen Zellen im Vergleich zu den nicht-neuronalen Zellen auf. In den intraspezifischen DMRs (Mensch und Schimpanse) waren Gene angereichert, die mit verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert sind. Der Vergleich zwischen Menschen und Schimpanse in den neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen zeigte eine Anreicherung von Genen mit human-spezifischer Histonsignatur. In den nicht-neuronalen Zellen konnten mehr interspezifische DMRs (n=666) detektiert werden als in den neuronalen Zellen (n=96). Ungefähr 95% der nicht-neuronalen interspezifischen DMRs waren im Menschen, im Vergleich zum Schimpansen, hypermethyliert. Daraus ergibt sich der Eindruck, dass mehrere hundert der nicht-neuronalen Gene während der humanen Gehirnevolution einer Methylierungswelle unterlagen. Dies führt zu der Annahme, dass der Einfluss dieser Veränderungen in den nicht-neuronalen Zellen auf die Vergößerung des menschlichen Gehirns bisher stark unterschätzt wurde. Die bekannteste genetische Ursache für erblichen Brust- und Eierstockkrebs sind Mutationen in den Tumorsuppressorgenen (TSG) BRCA1 und BRCA2. Dennoch können nur rund 20-25% der familiären Brustkrebserkrankungen über Keimbahnmutationen in BRCA1/BRCA2 erklärt werden, besonders bei Frauen, deren Erkrankung vor dem vierzigsten Lebensjahr auftritt. Epigenetische Veränderungen, die zu einer aberranten Genexpression führen, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese und der Entwicklung einer Brustkrebserkrankung. Es ist bekannt, dass TSG nicht nur durch den Verlust der Heterozygotie (engl. loss of heterozygosity, LOH) oder homozygote Deletionen, sondern auch durch transkriptionelle Stilllegung via DNA-Methylierung inaktiviert werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde überprüft, welchen Einfluss aberrante Methylierungsmuster im Promotorbereich von TSG auf die Brustkrebskarzinogenese und die Expression der Gene haben. Für die Quantifizierung der Epimutationen wurden die Promotorbereiche von acht TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1, RB1) und des estrogene receptor (ESR1) Gens, welches eine Rolle in der Tumorprogression spielt, mittels Deep Bisulfite Amplicon Sequencing (DBAS) analysiert. Es wurden Blutproben von zwei unabhängigen BRCA1/BRCA2-mutationsnegativen Brustkrebs (BC)-Patientenkohorten, sowie von zwei unabhängigen alters-gematchten, gesunden Kontrollkohorten untersucht. BC-Kohorte 1 beinhaltet early-onset (EO) BC-Patientinnen. Kohorte 2 enthält BC-Patientinnen mit einem Risiko von >95% eine heterozygote Mutation in BRCA1/BRCA2 (high-risk, HR) zu tragen. Allele mit >50% methylierten CpGs werden als funktionell relevante Epimutationen erachtet, da bekannt ist, dass TSG über eine Methylierung im Promotorbereich transkriptionell stillgelegt werden. Im Vergleich zu ESR1 (Ø Methylierung, 3%), welches die Methylierungslevel eines durchschnittlichen Promotors wiederspiegelt, zeigten die TSG sehr geringe durchschnittliche Methylierungswerte von weniger als 1%. Zudem waren die durchschnittlichen Epimutationsraten (EMR; <0,0001-0,1%) der TSG sehr gering. Mit der Ausnahme von BRCA1, welches eine erhöhte EMR in der BC-Kohorte verglichen zu den Kontrollen (0,31% gegen 0,06%) zeigte, gab es keine signifikanten Gruppenunterschiede zwischen BC-Patientinnen und Kontrollen. Eine von 36 HR BC-Patientinnen zeigte im Vergleich zu den restlichen Proben eine stark erhöhte EMR von 14,7% in BRCA1. Rund ein Drittel (15/44) der EO BC-Patientinnen wiesen eine erhöhte Rate an Einzel-CpG Fehlern in mehreren TSG auf. Die nachfolgenden Expressionsanalysen ergaben eine erniedrigte Expression vieler TSG je analysierter Patientin. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass epigenetische Veränderungen in normalen Körperzellen als ein möglicher Indikator für einen gestörten Mechanismus, der für die Aufrechterhaltung des unmethylierten Status und der daraus resultierenden normalen Genexpression zuständig ist, angesehen werden können. Dies kann mit einem erhöhten BC-Risiko assoziiert werden. N2 - The increasing complexity of social behavior along the ascending scale of primates, peaking in human spoken language, is accompanied by an impressive expansion of the human brain, particularly of the prefrontal cortex. Hence, prefrontal cortex appears to be one of the most interesting structures of the human brain, at least from an evolutionary perspective. But not only size but also function, in particular the interplay of neurons and glia cells, are suspected to distinguish the human brain from great apes and other primates. It is plausible to assume that proper brain function is controlled by a coordinated and well balanced transcriptional landscape, orchestrated by the underlying genetic and epigenetic backbone. Using reduced representation bisulfite sequencing (RRBS), we have compared the methylation profiles of neuronal and non-neuronal cells from three human and three chimpanzee prefrontal cortices (Brodmann area 10). Bioinformatic analyses revealed a genome-wide significant enrichment of differentially methylated regions (DMRs) in specific genomic areas. Intraspecific methylation differences between neuronal and non-neuronal cells are about three times more abundant than the interspecific methylation differences. More than 90% of human intraspecific DMRs were hypomethylated in neuronal cells, compared to non-neuronal cells. Intraspecific DMRs showed enrichment of genes associated with different neuropsychiatric disorders. Comparison between humans and chimpanzees yielded enrichments of genes showing human-specific brain histon modification. Interspecific DMRs were much more frequent in non-neuronal cells (n=666) than in neurons (n=96). Approximately 95% of interspecific DMRs in non-neuronal cells were hypermethylated in humans, compared to chimpanzees. It can be assumed that several hundreds of non-neuronal genes underwent a wave of methylation during human brain evolution. The impact of these changes in non-neuronal cells on the extension of the human brain may have been largely underestimated so far. The most prominent genetic cause for inherited breast and ovarian cancer are mutations in the BRCA1 and BRCA2 tumor suppressor genes (TSG). However, BRCA1/BRCA2 germline mutations explain less than 50% of all familial breast cancers, even for women diagnosed before the age of 40 years. It has also been reported that epigenetic abnormalities, which contribute to changes in gene expression, play an important role in carcinogenesis and breast cancer development. To rapidly quantify the number of epimutations in different TSG, in both a qualitative and quantitative manner, we have developed a deep bisulfite sequencing assay targeting the promoter regions of eight TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1 and RB1) and the estrogene receptor (ESR1) gene, which plays a role in tumor progression. We have analyzed blood samples of two independent BRCA1/BRCA2-mutation negative breast cancer (BC) cohorts and two independent age-matched healthy control cohorts. BC cohort 1 represents patients with early-onset BC and BC cohort 2 patients with a high risk to carry a heterozygous mutation. Since it is well known that tumor suppressor genes are transcriptionally silenced by promoter methylation, alleles with >50% methylated CpGs are considered as functionally relevant epimutations. Compared to ESR1, which is representative for an average promoter, TSG exhibited very low (<1%) average methylation levels and also very low mean epimutation rates (EMR; <0.0001% to 0.1%). With exception of BRCA1, which showed an increased EMR in BC (0.31% vs. 0.06%), there was no significant difference between patients and controls detectable. One of 36 HR BC patients showed a dramatically increased EMR (14.7%) in BRCA1. We identified in approximately one third (15 of 44) of EO BC patients increased rates of single CpG methylation errors in multiple TSG. Both EO and HR BC patients exhibited global underexpression of blood TSG. We propose that epigenetic abnormalities in normal body cells are indicative of disturbed mechanisms for maintaining low methylation and appropriate expression levels and may be associated with an increased BC risk. KW - Epigenetik KW - Gehirn KW - Brustkrebs KW - differenzielle Methylierung KW - familiärer Brustkrebs KW - Next-Generation Sequencing KW - Methylierung KW - Evolution KW - menschliche Hirnevolution Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164220 ER - TY - THES A1 - Maierhofer, Anna T1 - Altersassoziierte und strahleninduzierte Veränderungen des genomweiten DNA-Methylierungs-Profils T1 - Age-associated and radiation-induced changes in genome-wide DNA methylation N2 - Der Prozess des Alterns ist ein komplexer multifaktorieller Vorgang, der durch eine sukzessive Verschlechterung der physiologischen Funktionen charakterisiert ist. Ein hohes Alter ist der Hauptrisikofaktor für die meisten Krankheiten, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Das Verständnis der epigenetischen Mechanismen, die in den Prozess des Alterns involviert sind, könnte zur Entwicklung pharmakologischer Interventionen beitragen, die nicht nur die Lebenserwartung erhöhen, sondern auch den Beginn des altersassoziierten funktionellen Abbaus verzögern könnten. Durch die Langzeit-Kultivierung primärer humaner Fibroblasten wurde ein in vitro Modell für das Altern etabliert, das die Identifizierung altersassoziierter DNA-Methylierungs-Veränderungen ermöglichte. Die in vitro Alterung konnte mit einer globalen Hypomethylierung und einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA assoziiert werden. Darüber hinaus konnten DNA-Methylierungs-Veränderungen in Genen und Signalwegen, die für das Altern relevant sind, und ein erhöhtes epigenetisches Alter nachgewiesen werden. Das in vitro Modell für das Altern wurde verwendet, um neben den direkten Effekten ionisierender Strahlung auf die DNA-Methylierung auch deren Langzeit-Effekte zu untersuchen. Die Strahlentherapie ist ein entscheidendes Element der Krebstherapie, hat aber auch negative Auswirkungen und kann unter anderem das Risiko für die Entwicklung eines Zweittumors erhöhen. Bei externer Bestrahlung wird neben dem Tumor auch gesundes Gewebe ionisierender Strahlung ausgesetzt. Daher ist es wichtig zu untersuchen, wie Zellen mit intakten DNA-Reparatur-Mechanismen und funktionierenden Zellzyklus-Checkpoints durch diese beeinflusst werden. In der frühen Phase der DNA-Schadensantwort auf Bestrahlung wurden in normalen Zellen keine wesentlichen DNA-Methylierungs-Veränderungen beobachtet. Mehrere Populations-Verdoppelungen nach Strahlenexposition konnten dagegen eine globale Hypomethylierung, eine erhöhte DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und ein erhöhtes epigenetisches Alter detektiert werden. Des Weiteren zeigten Gene und Signalwege, die mit Krebs in Verbindung gebracht wurden, Veränderungen in der DNA-Methylierung. Als Langzeit-Effekte ionisierender Strahlung traten somit die mit der in vitro Alterung assoziierten DNA-Methylierungs-Veränderungen verstärkt auf und ein epigenetisches Muster, das stark an das DNA-Methylierungs-Profil von Tumorzellen erinnert, entstand. Man geht davon aus, dass Veränderungen der DNA-Methylierung eine aktive Rolle in der Entwicklung eines Tumors spielen. Die durch ionisierende Strahlung induzierten DNA-Methylierungs-Veränderungen in normalen Zellen könnten demnach in die Krebsentstehung nach Strahlenexposition involviert sein und zu dem sekundären Krebsrisiko nach Strahlentherapie beitragen. Es ist bekannt, dass Patienten unterschiedlich auf therapeutische Bestrahlung reagieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die individuelle Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung auch auf epigenetischer Ebene beobachtet werden kann. In einem zweiten Projekt wurden Gesamtblutproben von Patienten mit Werner-Syndrom, einer segmental progeroiden Erkrankung, und gesunden Kontrollen analysiert, um mit dem vorzeitigen Altern in Verbindung stehende DNA-Methylierungs-Veränderungen zu identifizieren. Werner-Syndrom konnte nicht mit einer globalen Hypomethylierung, jedoch mit einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA und einem erhöhten epigenetischen Alter assoziiert werden. Das vorzeitige Altern geht demzufolge mit spezifischen epigenetischen Veränderungen einher, die eine Beschleunigung der mit dem normalen Altern auftretenden DNA-Methylierungs-Veränderungen darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Bedeutung epigenetischer Mechanismen im Prozess des Alterns hervorgehoben werden und gezeigt werden, dass sowohl exogene Faktoren, wie ionisierende Strahlung, als auch endogene Faktoren, wie das in Werner-Syndrom-Patienten mutiert vorliegende WRN-Gen, altersassoziierte DNA-Methylierungs-Veränderungen beeinflussen können. N2 - Aging is a complex, multifactorial process that is characterized by the successive deterioration of normal physiological functions. Age is the main risk factor for most diseases, including cancer. Understanding the epigenetic mechanisms that are involved in the aging process could contribute to the development of pharmacological interventions not only increasing lifespan but also delaying the onset of age-dependent functional decline. An in vitro model for aging was established by long-term culturing of primary human fibroblasts and used to identify age-associated changes in DNA methylation. In vitro aging could be linked to global hypomethylation, elevated DNA methylation of ribosomal DNA, a higher epigenetic age and alterations in DNA methylation of genes and pathways being relevant for aging. The in vitro model for aging allowed to analyse the long-term effects of ionizing radiation on DNA methylation in addition to their direct effects. Radiotherapy is an important element of cancer treatment but can also have negative effects and increase the risk of second cancers. Although radiotherapy is targeted to the tumour, it also affects the surrounding healthy tissue. Therefore, it is important to analyse the impacts of ionizing radiation on normal cells with intact DNA repair and cell cycle checkpoints. The early phase of DNA damage response to radiation does not seem to include great changes in DNA methylation in normal cells. In contrast, several population doublings after radiation exposure, global hypomethylation and DNA methylation changes of genes and pathways being linked to tumorigenesis were detected. Furthermore, DNA methylation of ribosomal DNA and the epigenetic age were increased. Thus, as long-term effects of ionizing radiation the age-associated changes in DNA methylation were enhanced and an epigenetic pattern strongly resembling the DNA methylation profile of tumour cells was observed. It is assumed that alterations in DNA methylation are not only side effects of carcinogenesis but rather play an active role during this process. Radiation-induced changes in DNA methylation could thus be involved in tumour development and contribute to the secondary cancer risk after radiotherapy. It is well known that patients react differently to therapeutic radiation. The results of this study suggest that individual radiation sensitivity is also reflected on epigenetic level. In a second project whole blood samples from patients with Werner syndrome, a segmental progeroid syndrome, and healthy controls were analysed to identify changes in DNA methylation associated with premature aging. Werner syndrome could not be linked to global hypomethylation, but to an increased epigenetic age and elevated methylation levels of ribosomal DNA. Hence, premature aging seems to be accompanied by specific alterations in DNA methylation representing an acceleration of the DNA methylation changes associated with normal aging. This work outlines the importance of epigenetic mechanisms in the aging process and shows that not only exogenous factors like ionizing radiation but also endogenous factors like Werner syndrome causing mutations in the WRN gene can influence age-associated changes in DNA methylation. KW - Methylierung KW - Ionisierende Strahlung KW - Altern KW - Progeria adultorum KW - Epigenetik KW - Epigenetische Uhr Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174134 ER - TY - THES A1 - Burgert, Anne T1 - Untersuchung von Sphingolipiden und anderen Membrankonjugaten mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie T1 - Analysis of sphingolipids and other membrane conjugates with super-resolution fluorescence microscopy N2 - Methoden der Fluoreszenz-Lokalisationsmikroskopie (engl. single-molecule localization microscopy, SMLM) ermöglichen es Moleküle zu quantifizieren und deren Verteilung zu analysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Membranmoleküle auf unterschiedlichen eukaryotischen Zellen, aber auch auf Prokaryoten mit dSTORM (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) oder PALM (engl.: photoactivated localization microscopy) aufgenommen und quantifiziert. Bevor jedoch diese hochauflösende fluoreszenzbasierte Technik für biologische Fragestellungen angewendet werden konnten, mussten zunächst potentielle Artefakt-auslösende Quellen identifiziert und Strategien gefunden werden, um diese zu eliminieren. Eine mögliche Artefakt-Quelle ist eine zu niedrige Photonenzahl, die von Fluorophoren emittiert wird. Werden zu wenige Photonen detektiert, kann die Lokalisation eines Fluorophors weniger präzise bestimmt werden. Dies kann zu einer falschen Abbildung von Strukturen führen oder zu falschen Rückschlüssen über die Verteilung von Molekülen. Eine Möglichkeit die Anzahl der emittierten Photonen zu erhöhen, ist chemische Additive als Triplettlöscher einzusetzen. Sie bewirken, dass die Fluorophore wieder in den Grundzustand relaxieren und somit wieder angeregt werden können. Es wurden verschiedene Additive, die in der Literatur als Triplettlöscher beschrieben sind, getestet. Dazu wurden zunächst ihre Auswirkungen auf den Triplettzustand verschiedener Fluorophore (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) mit Hilfe von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) untersucht. Cyclooctatetraen (COT) bewirkte dabei eine Abnahme der Triplettausbeute von Al488, Al532 und Al647 um ~ 40-60%, bei Atto655 veränderte sie sich nicht. Obwohl die Ergebnisse der FCS-Messungen darauf hindeuten, dass COT in einer erhöhten Anzahl an emittierten Photonen resultiert, konnte dies bei dSTORM-Messungen nicht bestätigt werden. Hier hatte COT nur einen größeren positiven Effekt auf das Fluorophor Al647 (Zunahme um ~ 60%). Eine Erklärung für diese Widersprüchlichkeit zu den Ergebnissen aus den FCS-Messungen, könnte das Vorhandensein des Schaltpuffers bei dSTORM-Messungen sein. Dieser bewirkt den Übergang der Fluorophore in den Aus-Zustand bzw. entzieht dem Puffer Sauerstoff. Bei der Zugabe von 5 mM Kaliumiodid (KI) nahm die Triplettamplitude bei FCS-Messungen nur bei Al488 ab (um ~ 80%). Eine geringe Steigerung (um ~ 10%) der Intensität von Al488 mit KI konnte bei dSTORM-Messungen mit niedrigen Konzentrationen (~ 0,5 mM) erzielt werden. Bei einer Konzentration von 5 mM sank die Intensität jedoch wieder um 40%. Deuteriumoxid (D2O) soll, anders als die Triplettlöscher, eine Verbesserung der Photonenausbeute dadurch bewirken, dass strahlungslose Relaxationsprozesse minimiert werden. Mit dSTORM-Messungen konnte gezeigt werden, dass Atto655 und Al647 in D2O zwar pro An-Zustand mehr Photonen emittieren als in Schaltpuffer ohne D2O, da die Fluorophore hier jedoch schneller bleichen, letztendlich die gleiche Anzahl an Photonen detektiert werden. Um die Anzahl an emittierten Photonen zu erhöhen, eignet sich also nur COT bei dSTORM-Messungen mit AL647 und KI in sehr geringen Konzentrationen bei Al488. D2O kann eingesetzt werden, wenn eine Probe schnell vermessen werden muss, wie zum Beispiel bei Lebendzellmessungen. Nicht nur eine zu niedrige Photonenzahl, auch eine zu geringe Photoschaltrate kann Artefakte bei dSTORM-Messungen erzeugen. Dies wurde anhand von verschiedenen biologischen Strukturen, die mit unterschiedlichen Anregungsintensitäten aufgenommen wurden, deutlich gemacht. Besonders die Aufnahmen von Plasmamembranen sind anfällig für die Generierung von Artefakten. Sie weisen viele inhomogene und lokal dichte Regionen auf. Wenn nun mehr als ein Emitter pro µm² gleichzeitig an ist, erzeugt das Auswertungsprogramm große artifizielle Cluster. Die hier durchgeführten Messungen machen deutlich, wie wichtig es ist, dSTORM-Bilder immer auf mögliche Artefakte hin zu untersuchen, besonders wenn Moleküle quantifiziert werden sollen. Dafür müssen die unbearbeiteten Rohdaten sorgfältig gesichtet werden und notfalls die Messungen mit einer höheren Laserleistung wiederholt werden. Da dSTORM mittlerweile immer mehr zur Quantifizierung eingesetzt wird und Clusteranalysen durchgeführt werden, wäre es sinnvoll bei Veröffentlichungen die Rohdaten von entscheidenden Aufnahmen der Öffentlichkeit zur Verfügung zu stellen. Die Färbemethode ist ein weiterer Punkt, durch den Artefakte bei der Abbildung von Molekülen mittels SMLM entstehen können. Häufig werden Antikörper zum Markieren verwendet. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass möglichst kleine Antikörper oder Antikörperfragmente verwendet werden, besonders wenn Clusteranalysen durchgeführt werden sollen. Anderenfalls leidet die Auflösung darunter, bzw. erhöht sich die Gefahr der Kreuzvernetzung von Molekülen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden Plasmamembran-Ceramide untersucht. Ceramide gehören zu den Sphingolipiden und regulieren diverse zelluläre Prozesse. Verschiedene Stimuli bewirken eine Aktivierung von Sphingomyelinasen (SMasen), die Ceramide in der Plasmamembran synthetisieren. Steigt die Konzentration von Ceramiden in der Plasmamembran an, kondensieren diese zu Ceramid-reichen Plattformen (CRPs). Bisher ist noch wenig über die Verteilung der Ceramide und die Größe der CRPs bekannt. Sie wurden hier über IgG-Antikörper in der Plasmamembran von Jurkat-, U2OS-, HBME- und primären T-Zellen angefärbt und erstmals mit dSTORM hochaufgelöst, um sie dann zu quantifizieren. Unabhängig von der Zelllinie befanden sich 50% aller Ceramidmoleküle in ~ 75 nm großen CRPs. Im Mittel bestanden die CRPs aus ~ 20 Ceramiden. Mit Hilfe einer Titrationsreihe konnte ausgeschlossen werden, dass diese Cluster nur durch die Antikörper-Färbung artifiziell erzeugt wurden. Bei Inkubation der Zellen mit Bacillus cereus Sphingomyelinase (bSMase) stieg die Gesamtkonzentration der Ceramide in der Plasmamembran an, ebenso wie die Ceramidanzahl innerhalb der CRPs, außerdem die Anzahl und Größe der CRPs. Dies könnte zu einer Veränderung der Löslichkeit von Membrankomponenten führen, was wiederum eine Akkumulation bestimmter Rezeptoren oder eine Kompartimentierung bestimmter Proteine erleichtern könnte. Die Anhäufung der Ceramide in den CRPs könnte ebenfalls die lokale Interaktion mit anderen Membranmolekülen erleichtern und dadurch möglicherweise die Reaktivität von Rezeptoren verändern. Mittels Azid-modifizierten Ceramidanaloga und kupferfreier Click-Chemie wurden Plasmamembran-Ceramide auch in lebenden Jurkat-Zellen mit Hilfe konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM, engl. confocal laser scanning microscopy) und Strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM, engl. structured illumination microscopy) untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Fettsäure-Kettenlänge und die Position des Azids bei den Ceramidanaloga eine entscheidende Rolle spielt, wie hoch das detektierte Signal in der Plasmamembran letztendlich ist. Die Versuche machen auch deutlich, dass die klickbaren Ceramidanaloga lebendzellkompatibel sind, sodass sie eine hervorragende Möglichkeit darstellen, zelluläre Reaktionen zu verfolgen. Es wurden hier nicht nur Ceramide in eukaryotischen Zellen analysiert, sondern auch in Bakterien. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) sind gramnegative Bakterien, die im Menschen eine Sepsis oder eine Meningitis auslösen können. Es wurde mittels immunhistochemischen Färbungen mit dem anti-Ceramid IgG-Antikörper, aber auch mit den klickbaren Ceramidanaloga, ein Signal in der Membran erhalten, was mit dSTORM hochaufgelöst wurde. In anderen Bakterien wurden ebenfalls schon Sphingolipide nachgewiesen. Studien zu Ceramiden in N. meningitidis wurden bisher jedoch noch nicht veröffentlicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals Ergebnisse erhalten werden, die darauf hinweisen, dass N. meningitidis ebenfalls Ceramide besitzen könnten. In einem dritten Projekt wurde die Interaktion zwischen NK-Zellen und Aspergillus fumigatus untersucht. Der Schimmelpilz kann eine Invasive Aspergillose in immunsupprimierten Menschen auslösen, was zum Tod führen kann. Verschiedene Studien konnten schon zeigen, dass NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung des Pilzes spielen. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass der NK-Zell-Marker CD56 entscheidend für die Pilzerkennung ist. Mit immunhistochemischen Färbungen und LSM-, aber auch dSTORM-Messungen, konnte gezeigt werden, dass die normalerweise homogen verteilten CD56-Rezeptoren auf der Plasmamembran von NK-Zellen aktiv an die Interaktionsstelle zu A. fumigatus transportiert werden. Mit der Zeit akkumulieren hier immer mehr CD56-Proteine, während das Signal in der restlichen Membran immer weiter abnimmt. Es konnte erstmals CD56 als wichtiger Erkennungsrezeptor für A. fumigatus identifiziert werden. In dem letzten bearbeiteten Projekt, wurde die Bindung von Anti-N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor Enzephalitis Autoantikörper an Neuronen untersucht. Bei einer Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis bilden die Patienten Autoantikörper gegen die NR1-Untereinheit ihrer eigenen postsynaptischen NMDA-Rezeptoren. Da die Krankheit oft sehr spät erkannt wird und die Behandlungsmöglichkeiten noch sehr eingeschränkt sind, führt sie noch oft zum Tod. Sie wurde erst vor wenigen Jahren beschrieben, sodass der genaue Mechanismus noch unbekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit, konnten erste Färbungen mit aufgereinigten Antikörper aus Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis Patienten an NMDA-Rezeptor-transfizierte HEK-Zellen und hippocampalen Maus-Neuronen durchgeführt und mit dSTORM hochaufgelöst werden. Mit den Messungen der HEK-Zellen konnte bestätigt werden, dass die Autoantikörper an die NR1-Untereinheit der Rezeptoren binden. Es konnten erstmals auch die Bindung der Antikörper an Neuronen hochaufgelöst werden. Dabei wurde sichtbar, dass die Antikörper zum einen dicht gepackt in den Synapsen vorliegen, aber auch dünner verteilt in den extrasynaptischen Regionen. Basierend auf der Ripley’s H-Funktion konnten in den Synapsen große Cluster von ~ 90 nm Durchmesser und im Mittel ~ 500 Lokalisationen und extrasynaptisch kleinere Cluster mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ~ 70 nm und ~ 100 Lokalisationen ausgemacht werden. Diese ersten Ergebnisse legen den Grundstein für weitere Messungen, mit denen der Mechanismus der Krankheit untersucht werden kann. N2 - With single molecule localization microscopy (SMLM) quantification of molecules and the analysis of their distribution becomes possible. In this work various plasma membrane molecules of different eukaryotic and prokaryotic cells were imaged with dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) or PALM (photoactivated localization microscopy) and quantified. To use these super-resolution fluorescence microscopy techniques and answer elaborate biological questions, potential sources of artifacts were identified and strategies to circumvent them developed. A possible source of artifacts is an insufficient number of photons emitted by fluorophores. If less photons are detected, determining the localization of one fluorophore is less precise. This can cause a wrong reconstruction of structures or might lead to false conclusions about the distribution of molecules. One possibility to increase the number of photons is to use chemical additives which quench the triplet state of fluorophores. They ensure that the fluorophores relax into the ground state allowing them to become excited again. Different additives, described in literature as triplet quenchers, were tested. The effects of these additives on the triplet state of different fluorophores (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) were analyzed with fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Cyclooctatetraene (COT) resulted in a decrease of triplet state yield of Al488, Al532 and Al647 by ~ 40-60%, yet the triplet state of Atto655 was unaffected. FCS measurements indicated that COT results in an increased number of emitted photons, but dSTORM measurements could not confirm this finding. Here, COT only revealed a positive effect on the intensity of Al647 (increase by ~ 60%). An explanation for this inconsistency with the FCS results might be the presence of the switching buffer in dSTORM measurements. The buffer is designed to cause a transition of the fluorophores to and stabilize the off-state by removing oxygen from the sample, counteracting the effect of COT. On addition of 5 mM potassium iodide (KI) only Al488 fluorophores showed a decreased triplet state rate (~ 80%) in FCS measurements. This finding was confirmed by dSTORM measurements with low concentrations (~ 0.5 mM) of KI which resulted in a slight intensity increase (~ 10%) of Al488. Higher KI concentration (5 mM) on the other hand showed a reversed effect, resulting in a drop in intensity by ~ 40%. Deuterium oxide (D2O) isn’t a triplet quencher but should minimize non-radiative processes. DSTORM measurements with Atto665 and Al647 revealed, that D2O does not affect the total number of emitted photons per fluorophore. Instead, D2O increased the amount of emitted photons per time. In a nutshell, these results show that dSTORM measurements with Al647 can be improved using COT, and measurements with Al488 by using very low concentrations of KI. If needed, D2O can speed up dSTORM acquisition time considerably, e.g. for life cell measurements. In addition to an insufficient number of collected photons, inappropriate photoswitching rates can induce artifacts in dSTORM measurements as well. This was shown using various biological reference structures. Especially the imaging of plasma membranes is prone to generate artifacts. Plasma membranes exhibit a lot of intrinsically three-dimensional structures with high local emitter densities. In these regions of higher fluorophore densities the likelihood of two close fluorophores emitting at the same time is increased. This in turn can result in large artificial clusters due to misinterpretation by the reconstruction software. Taken together, the performed experiments show how important it is to prove dSTORM images and minimize possibility image artifacts. Thus, raw data movies need to be examined carefully and, if necessary, measurements must be repeated with adapted imaging conditions. Since dSTORM is increasingly used for quantification and cluster analysis it is recommended to publish raw data in the Supporting information of the manuscript. Another source of artifacts when imaging molecules with SMLM is the staining procedure. Usually antibodies are used to label biological structures for dSTORM. In the interest of resolution, small antibodies or just fragments of antibodies should be used, especially if cluster analysis is performed. Otherwise reduced resolution or an increase in cross-linking of molecules might occur. In the second part of this study plasma membrane ceramides were investigated. Sphingolipid ceramides regulate various cellular processes. Different stimuli initiate activation of sphingomyelinases (SMase) which synthesize ceramides at the plasma membrane. A rise in ceramide concentration leads to a condensation of them in ceramide-rich platforms (CRPs). So far, only little is known about the distribution and the size of CRPs. Here, plasma membrane ceramides of Jurkat-, U2OS-, HBME- and primary T-cells were stained with an IgG-antibody, imaged using dSTORM and their distribution quantitatively analyzed. Independent of the analyzed cell line, ~ 50% of all ceramides detected in the plasma membrane formed CRPs with a size of ~ 75 nm. On average one CRP consisted of ~ 20 ceramide molecules. Using a titration series the possibility of artificial cluster generation due to antibody staining was ruled out. Treatment of cells with Bacillus cereus sphingomyelinase (bSMase) increased the overall ceramide concentration in the plasma membrane, the number of ceramides in the CRPs as well as the quantity and the size of CRPs. This might result in a higher solubility of membrane components in CRPs which in turn could facilitate accumulation or compartmentation of certain proteins. Accumulation of ceramides in the CRPs could also enable local interaction with other molecules and possibly change the reactivity of some receptors. To investigate plasma membrane ceramides in living cells azido-modified ceramides and copper-free click chemistry were used for labeling. Imaging was performed using confocal laser-scanning microscopy (LSM) and structured illumination microscopy. It was shown that the length of fatty acid chains and the position of the azido group of ceramide analogues play a decisive role in the magnitude of the detected signal in the plasma membrane. These results demonstrate that azido-functionalized ceramides are live-cell compatible, making them an excellent tool to follow cellular reactions. In this study, ceramides were not only analyzed in eukaryotic cells but in bacteria as well. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) are gram-negative bacteria triggering sepsis or meningitis in humans. Using both immunolabeling with anti-ceramide IgG-antibodies and azido-modified ceramides, ceramides were detected for the first time in the membrane of N. meningitidis by dSTORM. Although sphingolipids were reported to exist in various bacterial membranes, studies about ceramides in N. meningitidis have not yet been published. The results obtained here suggest the presence of ceramides in N. meningitidis. The third part of this thesis addresses the interaction between NK cells and Aspergillus fumigatus. The mold can cause invasive aspergillosis in immunocompromised patients which can lead to death. Various studies have already shown that NK cells play a crucial role in the clearance of the fungal infection. Still, the exact mechanism remains unknown. As part of this work the NK cell marker CD56 was identified as a decisive receptor in recognition of the mold. Using LSM and dSTORM measurements in combination with immunocytochemical staining an active transport of the usually homogenous distributed CD56 receptors to the interaction site of NK cells and fungus was detected. Over time CD56 proteins accumulate at these interaction sites while the signal in the rest of the membrane continuously decreases. For the first time this study was able to identify CD56 as an important recognition receptor for A. fumigatus. In the last project binding of anti-N-Methyl-D-aspartate (NMDA) receptor encephalitis autoantibodies were investigated in neurons. Patients with this form of encephalitis generate autoantibodies against the NR1 subunit of their own postsynaptic NMDA receptors. Since NMDA receptor encephalitis is often diagnosed too late and treatment options are limited the disease often proves to be fatal. Anti-NMDA receptor encephalitis was described quite recently, explaining why the exact mechanism remains still unknown. For this study purified antibodies from anti-NMDA receptor encephalitis patients were used to stain NMDA receptor transfected HEK cells and hippocampal mouse neurons. These samples were subsequently imaged with dSTORM and analyzed. Measurements on HEK cells confirmed that the autoantibodies bind to the NR1 subunit. Using dSTORM, the binding sites of these antibodies at the neurons were imaged for the first time with super-resolution microscopy. The receptors are densely localized in synapses and more equally distributed at lower density in extrasynaptic regions. Based on Ripley’s H function synaptic clusters with a diameter of ~ 90 nm and ~ 500 localizations were determined while the extrasynaptic smaller clusters have a median diameter of ~ 70 nm and ~ 100 localizations per cluster. These first results form the basis for further investigations on the mechanism of anti-NMDA receptor encephalitis. KW - Ceramide KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Aspergillus fumigatus KW - NMDA KW - Neisseria meningitidis KW - Lokalisationsmikroskopie KW - dSTORM KW - Plasmamembran Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145725 ER - TY - THES A1 - Herweg, Jo-Ana T1 - Die Simkania-Vakuole: Die Rolle von ER, retro-/anterograden Protein- und Lipidtransport T1 - The Simkania-vacuole: the role of ER, retro-/anterograde protein- and lipid-transport N2 - Simkania negevensis (Sn) is a Chlamydia-like obligate intracellular bacterium which replicates within a membrane bound vacuole, termed SCV (Simkania-containing vacuole). The SCV is a unique compartment closely associated with ER-membranes, consequently ER-stress is blocked by the bacteria. SCV morphology is similar among epithelial cells (HeLa229, A549, HEp-2) and macrophages (THP1). The SCV represents the first intracellular interface between the host and pathogen which serves as a replication niche. Identifying human and bacterial factors associated with ER-SCV-membranes should contribute towards the understanding of SCV composition and formation as well as interactions with ER or transports. Comparative studies of the SCV should indicate similarities to the chlamydial inclusion since some host cell factors are already known for Chlamydia. In this thesis, a purification protocol has been established that is applicable to HeLa229 and THP1 ER-SCV-membranes and has been further utilized for proteome and lipidome analyses. 302 bacterial and 1178 human proteins composing ER-SCV-membranes and 885 bacterial proteins composing purified Sn have been identified by using label-free mass spectrometry measurements. Among the human factors of non or Sn infected ER-(SCV-) membranes we found 51 enriched or depleted proteins in addition to 57 transport associated ones that indicated infection induced differences among intracellular protein transport. Contrary regulation of retrograde and anterograde transported proteins could be confirmed by using RNA interference and inhibitor tests, whereby Clathrin-associated and COPI vesicles seem to play a central role. Application of Retro-inhibitors, which interfered with retrograde transport processes between endosome to Golgi or early to late endosomes, as well as Bafilomycin A1 (retrograde, late endosomes and lysosomes) and Brefeldin A (anterograde, ER and Golgi) exerted a strong influence on SCV formation, morphology and intracellular lipid transport. By using label-free mass spectrometry measurements and thin layer chromatography we could determine differences in lipid levels within Sn infected cells, ER-SCV-membranes and purified Sn in comparison to uninfected cells. In addition to lipid enrichment or depletion in whole-cell extracts and ER-SCV-membranes, we identified two infection-specific lipids, cholesterol-ß-Dglucoside and PE 30:0. Further, high-throughput RNA interference tests indicated a dependence of Sn infections on endosome to Golgi and Clathrin-associated vesicle transports. Taken together, we were able to identify initial potential SCV-associated proteins and lipids that were connected to bacterial infection. Furthermore, SCV formation and Sn infectiousness depends on retrograde transport processes and therefore also on acquisition of nutrients, such as lipids. N2 - Simkania negevensis (Sn) repliziert als Chlamydia-ähnliches obligat intrazelluläres Bakterium auch in einer membranumschlossenen Vakuole, die als SCV (engl. Simkania-containing vacuole) bezeichnet wird. Die SCV ist ein bis jetzt einzigartiges Kompartiment, das stark mit ER-Membranen assoziiert ist, wobei ER-Stress von den Bakterien blockiert wird. Die Morphologie der SCV scheint dabei in Epithelzellen (HeLa229, A549, HEp-2) als auch in Makrophagen (THP1) gleich zu sein. Die SCV stellt die erste intrazelluläre Berührungsfläche dar, an der Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen erfolgen, und dient gleichzeitig als Replikationsnische. Mithilfe der Identifizierung von humanen und bakteriellen Faktoren, die mit der ER-SCV-Membran assoziiert sind, sollten die Zusammensetzung der SCV sowie mögliche Interaktionen mit dem ER oder zellulären Transportwegen ermittelt werden. Vergleichsstudien von SCV-assoziierten Proteinen sollten Ähnlichkeiten zur chlamydialen Inklusion aufzeigen, für die bereits einige interagierende Wirtszellfaktoren beschrieben wurden. In dieser Arbeit wurde ein Aufreinigungsprotokoll etabliert, das sowohl für ER-SCVMembranen aus HeLa229 als auch THP1 geeignet war und für spätere Proteom- oder Lipidomanalysen diente. Über markierungsfreie massenspektrometrische Messungen konnten 302 bakterielle und 1178 humane Proteine in ER-(SCV-) Membranen und 885 bakterielle Proteine in aufgereinigten Sn identifiziert werden. In ER-(SCV-) Membranen von nicht und Sn-infizierten HeLa229 Zellen befanden sich 51 unterschiedlich verteilte und 57 transportassoziierte humane Proteine, die auf infektionsinduzierte Unterschiede beim intrazellulären Proteintransport hindeuteten. Eine entgegengesetzte Regulation von retro- und anterograd transportierten Proteinen konnte mithilfe von RNA-Interferenz und dem Einsatz geeigneter Inhibitoren bestätigt werden, wobei sich zeigte, dass Clathrin-assoziierte und COPI-Vesikel eine zentrale Rolle spielen. Retro-Inhibitoren, die den retrograden Transport zwischen Endosomen zum Golgi oder zwischen frühen und späten Endosomen inhibieren, sowie Bafilomycin A1 (retrograd, späte Endosomen und Lysosomen) und Brefeldin A (anterograd, ER und Golgi), beeinflussten massiv die SCV-Ausbildung, SCV-Morphologie und den intrazellulären Lipidtransport. Über markierungsfreie massenspektrometrische und dünnschichtchromatographische Analysen konnten erste Unterschiede im Lipidvorkommen in Sn-infizierten Zellen, an ER-SCVMembranen und in aufgereinigten Sn im Vergleich zu nicht infizierten Zellen ermittelt werden. Dabei konnten neben An- und Abreicherungen in Gesamtzellextrakten sowie ER-SCVMembranen zwei infektionsspezifische Lipide, Cholesterol-ß-D-Glykosid und PE 30:0, identifiziert werden. Weiterführende umfangreiche RNA-Interferenzstudien weisen darauf hin, dass die Sn-Infektion vom Endosomen-zum-Golgi-Transport und vom Clathrin-assoziierten Vesikeltransport abhängig ist. Zusammenfassend konnten erste mögliche SCV-assoziierte Proteine und Lipide identifiziert werden, die mit der bakteriellen Infektion verbunden waren. Des Weiteren hängen eine stabile SCV-Ausbildung und Sn-Infektivität von verschiedenen retrograden Transportwegen und damit von dem Erwerb von Nährstoffen wie bspw. Lipiden ab. KW - Simkania KW - Vakuole KW - Proteintransport KW - Lipidtransport Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136844 ER -