TY  - THES
A1  - Kunz, Meik
T1  - Systembiologische Analysen von Interaktionen: Zytokinine (Pflanzenpathogene), 3D-Zellkulturen (Krebstherapie) und Drugtargets
T1  - Systems biology analysis of interactions: Cytokinins (plant pathogens), 3D cell cultures (cancer therapy) and drug targets
N2  - Der Einsatz von computergestützten Analysen hat sich zu einem festen Bestandteil der biowissenschaftlichen Forschung etabliert. Im Rahmen dieser vorliegenden Arbeit wurden systembiologische Untersuchungen auf verschiedene biologische Themengebiete und Organismen angewendet. In diesem Zusammenhang liefert die Arbeit einen innovativen und interdisziplinären methodischen Ansatz. Die grundlegende Frage lautet: Wie verstehe und beschreibe ich Signalwege und wie kann ich sie beeinflussen? Der Ansatz verknüpft verschiedene biologische Datensätze und Datenebenen miteinander, beginnend vom Genom und Interaktionskontext über semiquantitative Simulationen hin zu neuen Interventionen und Experimenten, welche therapeutisch und biotechnologisch genutzt werden können. Die Analysen können auf diese Weise 
- zu einem besseren Verständnis experimenteller Daten und biologischer Fragestellungen beitragen und ermöglichen ein systematisches Verständnis der zugrunde liegenden Signalwege und Netzwerkeffekte (z.B. in Pflanzen). 
- Darüber hinaus ermöglichen sie die Identifizierung wichtiger funktioneller Hubproteine und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für weitere experimentelle Testungen (z.B. Tumormodelle), 
- stellen zudem einen hilfreichen Schritt auf dem Weg zur personalisierten Medizin (z.B. lncRNAs und Tumormodelle) und Medikamentenentwicklung (z.B. Datenbank DrumPID) dar.

(i) Als Grundlage wurde hierzu eine integrierte systembiologische Methode entwickelt, welche experimentelle Daten (z.B. Transkriptomdaten) hinsichtlich ihrer biologischen Funktionen untersucht und die Identifizierung relevanter funktioneller Cluster und Hubproteine ermöglicht. In einem ersten Teil wurden Analysen zum pflanzlichen Immunsystem durchgeführt. Mithilfe der entwickelten Methode wurden Genexpressionsdatensätze von A. thaliana, die mit dem Pathogen Pst DC3000 infiziert wurden, untersucht, um den Einfluss verschiedener Virulenzfaktoren auf das Interaktom der Wirtspflanze zu untersuchen und neue Modulatoren einer CK-vermittelten Immunabwehr zu finden. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass die von Pst DC3000 sekretierten Abwehrstoffe wichtige pflanzliche Hormonsignalwege für die Immunabwehr in A. thaliana beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen zudem, dass sich der Einfluss auf das Netzwerkverhalten der Effektorproteine und COR-Phytotoxine von dem der PAMPs unterscheidet, sich jedoch auch eine Regulierung gemeinsamer Signalwege und eine Überlappung der beiden Phasen der Immunantwort (PTI und ETI) in A. thaliana finden lassen. Die komplexe Immunantwort auf eine Infektion spiegelt sich zudem in einer höheren Anzahl an funktionellen Clustern und Hubproteinen in Pst DC3000 gegenüber den beiden untersuchten Mutanten wider, wobei sich für Pst DC3000 insbesondere ein stark vernetztes immunrelevantes Cluster um den JA-Signalweg zeigt. Weiterhin wurden anhand der entwickelten Methode wichtige Hubproteine für die Immunabwehr identifiziert. Als bedeutende Vertreter sind AHK2 und AAR14 zu nennen, welche Teil des Zweikomponentensystems der Signalübertragung von CK sind und hierbei wichtige Modulatoren für eine CK-vermittelte Immunabwehr darstellen.

(ii) Im zweiten Teil der Arbeit schließen sich Untersuchungen an einem in vitro-Experiment einer 2D- und 3D-Zellkultur einer HSP90-Behandlung in einem Lungentumormodell an. In diesem Zusammenhang wurden mithilfe der entwickelten Methode Unterschiede zwischen den beiden Zellkultursystemen gefunden, die das unterschiedliche Behandlungsansprechen erklären, und für die beiden KRAS-mutierten Zelllinien A549 und H441 des 3D-Testsystems neue prognostische und therapeutische Kandidaten identifiziert. Hierbei haben die durchgeführten Analysen zwei funktionelle Cluster von Protein-Interaktionen um p53 und die STAT-Familie gefunden, welche eine Verbindung zu HSP90 haben und die entsprechenden Behandlungsunterschiede nach einer HSP90-Inhibierung zwischen den beiden Zellkultursystemen erklären können. Unter Berücksichtigung des zelllinien-spezifischen Mutationshintergrunds wurde eine prognostische Markersignatur und daraus abgeleitet HIF1A für die H441-Zelllinie und AMPK für die A549-Zelllinie als neue therapeutische Targets gefunden, wobei die anschließend durchgeführten in silico-Simulationen einen potentiellen therapeutischen Effekt aufzeigen konnten. Weiterhin wurden wichtige experimentelle Readout-Parameter in ein in silico-Lungentumormodell integriert, wobei unter Einbeziehung des Mutationshintergrunds für die verwendeten Zelllinien die HSP90-Behandlung des 3D-Testsystems computergestützt abgebildet werden konnte. Im weiteren Verlauf wurden im in silico-Lungentumormodell Resistenzmechanismen nach einer Gefitinib-Behandlung mit bekanntem Mutationsstatus für die Zelllinien HCC827 und A549 untersucht und daraus folgend neue Therapieansätze abgeleitet, die von potentieller klinischer Bedeutung sein können. Die durchgeführten in silico-Simulationen für HCC827 konnten hierbei zeigen, dass eine EGFR- und c-MET-Koaktivierung zu einer Gefitinib-Resistenz führen kann, wohingegen bei den A549 eine Komutation von KRAS und IGF-1R zu einem geringen Behandlungsansprechen beiträgt. Die Simulationen lassen zudem erkennen, dass eine direkte Inhibierung der an der Resistenzentwicklung beteiligten Rezeptoren c-MET und IGF-1R in beiden Fällen nicht die bestmögliche Therapiestrategie darstellt. In beiden Zelllinien konnte gezeigt werden, dass eine kombinierte Inhibierung von PI3K und MEK den bestmöglichen therapeutischen Effekt liefert, was demnach einen vielversprechenden Therapieansatz bei Gefitinib-resistenten Lungentumorpatienten darstellt. In einem weiteren Schritt wurde das therapeutische Potential der miRNA-21 im in silico-Modell für die HCC827-Zelllinie untersucht. Die durchgeführten Simulationen zeigen, dass eine miRNA-21-Überexpression zu einer Resistenzentwickung nach Gefitinib-Behandlung beitragen kann, wobei eine Inhibierung der miRNA-21 diesen Effekt umkehren kann. Die Ergebnisse lassen zudem erkennen, dass eine PTEN-Aktivierung als potentieller Marker einer erfolgreichen therapeutischen Inhibierung der miRNA-21 fungieren kann, wohingegen eine reduzierte miRNA-21-Expression als möglicher Marker für eine erfolgreiche Gefitinib-Behandlung dienen kann.

(iii) Im dritten Teil der Arbeit wurden systematisch RNA- und Protein-Interaktionen untersucht. Hierzu wurden integrierte systembiologische Analysen an neu identifizierten und funktionell bislang unbekannten lncRNAs durchgeführt. Die Analysen für die infolge einer Herzhypertrophie hochregulierte lncRNA Chast haben umfassend gezeigt, dass diese Proteine und Transkriptionsfaktoren regulieren und binden kann, welche die Signalübertragung und Genexpression regulieren, aber auch eine Verbindung zum kardiovaskulären System und stressinduzierter Herzhypertrophie besitzt. Anhand der Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass Chast direkt und indirekt (a) Proteine binden und die Translation beeinflussen kann, zudem eine Chromatin-modifizierende Funktion besitzt und so die Transkription, z.B. für herz- und stress-assoziierte Gene, reguliert, und/oder (b) in einem negativen Feedbackloop seine eigene Transkription reguliert. Obwohl lncRNAs meist eine geringe Konservierung aufweisen, konnten die durchgeführten Analysen für Chast eine Sequenz-Struktur-Konservierung in Säugetieren aufzeigen. Weiterhin haben die Untersuchungen an zwei hypoxie-induzierten lncRNAs in Endothelzellen gezeigt, dass die lncRNA MIR503HG eine hohe Sequenz-Struktur-Konservierung in Säugetieren besitzt, wohingegen die LINC00323-003 eine geringe Konservierung aufzeigt. Dies untermauert die Tatsache, dass lncRNAs häufig eine geringe Konservierung aufweisen, was Untersuchungen in Modellorganismen hinsichtlich einer therapeutischen Nutzung schwierig machen.
Da sich zahlreiche Untersuchungen auf Interaktionen und Signalwege konzentriert haben, wurde abschließend eine Datenbank entwickelt, welche Analysen von Protein-Interaktionen und Signalwegen nachhaltig voranbringt. Die entwickelte DrumPID-Datenbank stellt insbesondere die Interaktion zwischen einem Medikament und seinem Target in den Fokus und ermöglicht Analysen einzelner Interaktionen und beteiligter Signalwege, bietet zusätzlich aber auch verschiedene Links zu anderen Datenbanken für individuelle weiterführende Analysen. DrumPID ermöglicht ein geeignetes Medikament u. a. für ein vorgegebenes Zielprotein zu finden und dessen Wirkmechanismus und Interaktionskontext zu untersuchen, was zu einem besseren experimentellen Verständnis beitragen kann. Zudem erlaubt DrumPID eine potentielle chemische Leitstruktur für ein Zielprotein zu entwickeln, was z.B. spezifisch ein parasitisches Protein inhibiert, ohne dabei einen toxischen Effekt im Menschen zu haben. Zahlreiche weitere Pharmakabeispiele belegen, dass DrumPID für den täglichen wissenschaftlichen Gebrauch auf dem Gebiet der Analyse von Protein-Pharmaka-Interaktionen und der Medikamentenentwicklung geeignet ist.

Die beschriebenen Ergebnisse der Promotionsarbeit wurden in fünf Originalarbeiten, zwei Übersichtsartikeln und einem Buchteil, u. a. in Science Translational Medicine, veröffentlicht, sechs dieser Publikationen erfolgten im Rahmen von Erstautorschaften.
N2  - The use of computer-based analysis has become an integral part of life science research. Within this thesis, systems biology investigations have been applied to various biological topics and organisms which provides an innovative and interdisciplinary methodological approach. The basic question was: How do I understand and describe signaling pathways and how can I influence them? The approach combines various biological data sets and data levels starting from the genome and interaction context over semiquantitative simulations towards new interventions and experiments which can be used therapeutically and biotechnologically. The analysis can contribute to 
- a better understanding of experimental data and biological questions and enables a systematic understanding of the signaling pathways and network effects (e.g. in plants). 		         
- They enable the identification of important functional hub nodes as well as the development of new therapeutic strategies for further experimental testing (e.g. tumor models), 	         
- also representing a helpful step on the path to personalized medicine (e.g. lncRNAs and tumor models) and drug development (e.g. database DrumPID).

(i) As a basis, an integrated systems biology methodology was developed which examines experimental data sets (e.g. transcriptome data) with respect to their biological functions and enables the identification of relevant functional clusters and hub nodes. 			       
In the first part of the thesis, analyzes regarding the plant immune system were accomplished. Using the developed methodology, gene expression datasets of A. thaliana infected with the pathogen Pst DC3000 were analyzed in order to investigate the influence of different virulence factors on the host interactome, and to find new modulators of CK-mediated immune defense. In this context, the analysis could show that the secreted defense compounds of Pst DC3000 influence important plant hormone signaling pathways for the immune defense in A. thaliana. Moreover, the results show that the impact on the network behavior of the effector proteins and COR phytotoxins differ from the PAMPs, but there also exists an overlap in common regulated signal pathways as well as an overlap between the two phases of immune response (PTI and ETI) in A. thaliana. In addition, the complex immune response to an infection is also reflected by a higher number of functional clusters and hub nodes in Pst DC3000 compared to the two studied mutants, whereby for Pst DC3000 a highly connected immune-relevant cluster around the JA pathway has been found. Furthermore, using the developed methodology several important hub nodes for the immune defense have been identified. As most important candidates, AHK2 and AAR14 have to be highlighted which are part of the two-component-system of signal transduction of CK and represent in this context important modulators for a CK mediated immune defense.

(ii) In the second part of the thesis, analyzes of a HSP90 treatment in lung cancer in an in vitro experiment in 2D and 3D cell cultures were accomplished. In this context using the developed methodology, differences between the two cell cultures explaining the differences in treatment responses were found, and for the two KRAS mutated cell lines A549 and H441 of the 3D test system new prognostic marker and therapeutic drug candidates were identified. However, the analyzes found two functional clusters of protein interactions around p53 and the STAT family which have a connection to HSP90 and might explain the observed treatment differences for the HSP90 inhibition between the two cell culture systems. Considering the mutational background of the cell lines, a prognostic marker signature were found and derived from it HIF1A for the H441 cell line and AMPK for the A549 cell line as new therapeutic drug targets. Moreover, the subsequently performed in silico simulations could show a potential therapeutic effect of the identified drug targets. Furthermore, important experimental read-out parameters were integrated into the in silico lung tumor model, and by considering the mutation background of the used cell lines the HSP90 treatment of the 3D test system could be in silico simulated. In the further course of the thesis, resistance mechanisms after gefitinib treatment with known mutation status for the HCC827 and A549 cell lines were investigated in the in silico lung tumor model and consequently new therapeutic approaches were derived which may be of potential clinical relevance. Here, the in silico simulations for HCC827 cells show that a co-activation of EGFR and c-MET can lead to a gefitinib resistance, whereas in the A549 a co-mutation of KRAS and IGF-1R can contribute to the reduced treatment response. In addition, the simulations reveal that a direct inhibition of the resistance contributing receptors c-MET and IGF-1R reflect not the best treatment strategy in both cases. However, in both cell lines a combined inhibition of PI3K and MEK provides the best therapeutic effect, thus representing a promising new therapeutic approach in gefitinib resistant lung cancer patients. In a further step, the therapeutic potential of the miRNA-21 was examined in the in silico model for the HCC827 cells. The simulations show that an overexpression of the miRNA-21 can contribute to a resistance development after gefitinib treatment, in which an inhibition of the miRNA-21 reverses this effect. Moreover, the results show that a PTEN activation can function as a potential marker of therapeutic success of miRNA-21 inhibition whereas a reduced miRNA-21 expression may serve as a potential marker for a successful gefitinib treatment.

(iii) In the third part of the thesis, systematic RNA and protein interactions were investigated. For this, integrated systems biology analyzes were carried out on new identified and previously functional unknown lncRNAs. The analyzes of the cardiac hypertrophy caused upregulated lncRNA Chast have extensive demonstrated that Chast can regulate and bind proteins and transcription factors which regulate signal transduction and gene expression, but it has also a connection to the cardiovascular system and stress-induced cardiac hypertrophy. Based on the results, it can be concluded that Chast can directly and indirectly (a) bind proteins and influence the translation but also possess a chromatin-modifying function and regulate transcription e.g. for cardiac and stress-associated genes, and/or (b) regulate its own transcription in a negative feedback loop. Although lncRNAs often have a low conservation the analysis could show a sequence-structure-conservation for Chast in mammalians. Furthermore, the investigations for two hypoxia induced endothelial lncRNAs have shown that the lncRNA MIR503HG represents a high sequence-structure-conservation in mammalians, whereas the LINC00323-003 shows a low conservation. This underscores the fact that lncRNAs often have a low conservation thereby making studies regarding the therapeutic potential in model organisms difficult.									          
Finally, as numerous analyzes in this thesis have focused on interactions and signaling pathways, a database was developed which brings a sustainable progress in analysis of protein interactions and signaling pathways. The developed DrumPID database puts especially the interaction between a drug and its target into its focus and allows analysis of individual interactions and involved signaling pathways but, additionally, provides various crosslinks to other databases for individual further analysis. DrumPID enables to find a suitable drug, e.g. for a given target protein, and to analyze its mechanism of action as well as interaction context which can contribute to a better understanding of experimental data. Moreover, DrumPID allows to develop a potential chemical lead structure for a target protein which e.g. specifically inhibits a parasitic protein but has no toxic effect in humans. Numerous additional pharmaceutical examples verify that DrumPID is suitable for the daily scientific usage in the field of analysis of protein-drug-interactions and drug development.

The described results of the doctoral thesis were published in five research papers, two review articles and a book chapter, e.g. in Science Translational Medicine, including six first authorships.
KW  - Systembiologie
KW  - Interaktionen
KW  - Zytokinine (Pflanzenpathogene)
KW  - 3D-Zellkulturen (Krebstherapie)
KW  - Drugtargets
KW  - Systembiologische Analysen
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134911
ER  - 
TY  - THES
A1  - Faist, Hanna
T1  - Bedeutung und Charakterisierung der bakteriellen Flora in Vitis vinifera mit und ohne Wurzelhalsgallen
T1  - Significance and characterization of the bacterial community in Vitis vinifera with and without crown galls
N2  - Am Rebstock werden in der Natur von Agrobacterium vitis, dem Auslöser Wurzelhalsgallenerkrankung, charakteristische Wurzelhalsgallentumore induziert. Virulente Vertreter der Gattung der Agrobacteria schleusen bakterielle DNA in das pflanzliche Genom ein, wodurch die Pflanze Tumore produziert. Die Wurzelhalsgallenerkrankung wird seit einem Jahrhundert als ein Beispiel der Pflanzen-Pathogen-Interaktion untersucht. Die Rolle der bakteriellen Flora im Zusammenhang mit der Wurzelhalsgallenerkrankung beim Rebstock wurde bisher kaum betrachtet. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich die endophytische mikrobielle Zusammensetzung von Rebstöcken mit und ohne Wurzelhalsgalle analysiert. Es werden Proben von drei Zeitpunkten einer Wachstumsperiode (Frühling, Sommer und Herbst) und von den Organen der Rebstöcke (Wurzeln, Pfropfstelle und einjährige Triebe) sowie dem Boden in einer Weinanlage bei Himmelstadt in Unterfranken genommen. Die Bakterienflora dieser Umweltproben wird mit kultivierungsabhängigen (Isolierung von Bakterien) und kultivierungsunabhängigen (Hochdurchsatzsequenzierungen) Methoden untersucht. Zudem werden i) die Virulenz der verschiedenen Agrobacterium-Isolate in Tumorassays bestimmt, ii) synthetische Bakteriengemeinschaften von in vitro kultivierten Weinpflänzchen mit Wurzelhalsgallen analysiert, iii) die Genome von einem virulenten und einem nicht-virulenten Agrobacteria-Isolat aus der Wurzelhalsgalle verglichen, iv) erste Interaktionsstudien auf festen Nährmedien durchgeführt und v) virulente Agrobacteria mittels bildgebender Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) in Wurzelhalsgallen lokalisiert. 
Die Rebstöcke dieser Studie haben eine organspezifische Bakterienflora, die innerhalb einer Wachstumsperiode variiert. Nur die Bakterienflora der Pfropfstelle (mit oder ohne Wurzelhalsgalle) aber nicht die des Bodens, der Wurzeln, und der einjährigen Triebe unterscheidet sich strukturell zwischen gesunden und erkrankten Rebstöcken. Mikroskopisch konnten virulente Agrobacteria punktuell in Interzellularen, sklerenchymatischen Geweben und assoziiert mit Leitgefäßen nachgewiesen werden. Dadurch ist ausreichend Lebensraum vorhanden, der zusätzlich von tumorspezifischen Bakterien besiedelt werden kann. Im Gegensatz zur gesunden Pfropfstelle ist in der Wurzelhalsgalle eine saisonal stabile Kernmikroflora, bestehend aus Vertreter von A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria und Burkholderiales, vorhanden. Diese Bakterien werden überwiegend aus dem Boden rekrutiert und profitieren von der Nährstoffsituation in der Wurzelhalsgalle. Wurzelhalsgallen enthalten Opine, die nur von der transformierten Pflanzenzelle produziert werden. Interessanterweise hat in dieser Arbeit ein Agrobacterium-Isolat Gene, die zum Opinkatabolismus beitragen und ein Pseudomonas-Isolat kann Opine als einzige Kohlenstoffquelle nutzen. Trotzdem sind beide Isolate weder virulent noch verdrängen sie die virulenten A. vitis, die ebenso Opine nutzen, aus der Wurzelhalsgalle. In synthetischen Bakteriengemeinschaften an in vitro kultivierten Weinpflänzchen konnte gezeigt werden, dass diese und weitere tumorspezifischen Bakterien, neben A. vitis, nicht essentiell zur Entstehung der Wurzelhalsgalle nötig sind aber unterschiedliche Funktionen in der Wurzelhalsgalle übernehmen. Ein Serratia-Isolat hemmt das Wachstum von A. vitis auf festen Nährmedium, andere fördern oder hemmen das Wachstum der Wurzelhalsgalle. Nach Studien in der Literatur erhöhen weitere Bakterien die Resistenz des Rebstocks gegenüber biotischem und abiotischem Stress. 
Zusammengefasst identifizierten und isolierte ich in dieser Studie unter 150 unterschiedlichen Bakterien in der Wurzelhalsgalle jene Bakterien, die neben A. vitis von der neuen ökologischen Nische profitieren und somit wahrscheinlich Opportunisten mit unterschiedlichen Funktionen sind. In Folge von multiplen Interaktionen in der Wurzelhalsgalle entsteht ein ökologisches Gleichgewicht zwischen den opportunistischen Bakterien, der Wurzelhalsgalle und dem Rebstock, das den Fortbestand des Rebstocks mit Wurzelhalsgalle ermöglicht.
N2  - In nature, Agrobacterium vitis is known for the ability to introduce bacterial DNA into the grapevine genome, thereby causing crown gall disease. This plant disease has been studied for a century as a model for plant-pathogen interaction, while the role of the plant microbiota in disease development is not well understood. My study contributes to the understanding of the microbial ecology in crown galls of grapevine, combining culture-dependent with culture-independent high-throughput sequencing techniques. I analysed the structure of the endophytic microbiota by collecting different samples (soil, roots, graft unions and canes) of diseased and non-diseased grapevines from one vine-yard in Franconia, Bavaria, Germany during one growing season (spring, summer, autumn). The characterization of the grapevine-associated bacterial microbiota was completed by (i) detecting the virulence of diverse agrobacterial isolates using a tumour growth assay with in vitro cultivated grapevine plantlets, (ii) microbial analysis of synthetic communities of in vitro cultivated grapevine plantlets with crown galls, (iii) genome sequencing of a virulent and a non-virulent agrobacterial isolate, (iv) in vitro interaction studies on solid medium with bacterial isolates and (v) localisation of virulent A. vitis using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) in tumour tissues. 
Grapevine plants of this study have an organ-specific bacterial community that varies during one growing season. Healthy and diseased grapevine plants differed in the struc-ture of the bacterial community only in the graft union (with or without a crown gall), but not in the soil, root and one-year old cane. Microscopy revealed that virulent Agrobacteria mainly accumulate in defined spots of sclerenchymatous tissue, intercellular space and tissues associated with vessels. Therefore, there is unoccupied living space in a crown gall, which can be additionally colonized by tumour-specific bacteria. A season-independent stable core bacteria exists in grapevine crown galls in contrast to healthy graft unions, consisting of OTUs assigned to A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria and Burkholderiales. These bacteria are predominantly recruited from the soil and most likely profit from special nutrients in the crown gall. The crown gall contains opines, exclusively produced by transformed plant cells. Curiously individual isolates of Agrobacteria and Pseudo-monas of this study that are non-virulent do not outcompete virulent A. vitis in the crown gall but harbour, like A. vitis, genes involved in octopin-catabolism or use opines in liquid cultures as a sole nutrient source. Although synthetic bacterial communities revealed that the tumour-specific bacteria are not required for crown gall induction us-ing in vitro grown grapevine plantlets, they may have different functions in crown gall persistence. A Serratia-isolate inhibits the growth of A. vitis on solid medium, others reduce or support crown gall development, while some, according to literature, increase resistance of the grapevine plant against biotic and abiotic stresses.
Taken together, among the 150 bacteria found in the crown galls, I identified and isolated bacteria in addition to A. vitis that profit from the new ecological niche suggesting an opportunistic lifestyle with different ecological functions. An ecological equilibrium in a bacterial community that balances crown gall growth will support the existence of grapevine plants with a crown gall in vineyards.
KW  - Wurzelhalsgalle
KW  - DNA Barcoding
KW  - Agrobacterium vitis
KW  - Weinrebe
KW  - Angewandte Mikrobiologie
KW  - bakterielle Flora
KW  - Holobiont
KW  - Mikrobiota
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154359
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zimnol, Anna
T1  - Relevance of angiotensin II type 1a receptor and NADPH oxidase for the formation of angiotensin II-mediated DNA damage
T1  - Relevanz des Angiotensin II Typ 1a-Rezeptors und der NADPH-Oxidase für die Entstehung Angiotensin II-vermittelter DNA-Schäden
N2  - Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) reguliert den Blutdruck sowie den Elektrolyt- und Wasserhaushalt. Das aktive Peptid, Angiotensin II (AngII), führt dabei zur Vasokonstriktion und in höheren Konzentrationen zu Bluthochdruck. Hypertensive Patienten haben ein erhöhtes Risiko an Krebs zu erkranken, vor allem an Nierenkrebs. Wir konnten bereits in vivo zeigen, dass AngII in der Lage ist, den Blutdruck zu steigern und dosisabhängig zu DNA-Schäden über den Angiotensin II Typ 1-Rezeptor (AT1R) führt. Ein stimuliertes RAAS kann ferner über die Aktivierung der NADPH-Oxidase, einer Hauptquelle der Generierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in der Zelle, zu oxidativem Stress führen. Zielsetzung dieser Arbeit war es zum einen, mit Hilfe von AT1a-Rezeptor-defizienten Mäusen in vivo zu prüfen, ob die Bildung von ROS, sowie die Bildung von DNA-Schäden in der Niere und im Herzen unabhängig von einem erhöhten Blutdruck auftreten. Zum anderen sollte, ebenfalls in vivo, untersucht werden, ob eine oder beide von zwei untersuchten Isoformen der NADPH-Oxidase (Nox) für die Auslösung oxidativen Stresses in der Niere verantwortlich ist. 
Zunächst wurden für den Versuch zur Überprüfung der Abhängigkeit AngII-induzierter DNA-Schäden vom Blutdruck männliche C57BL/6-Mäuse und AT1a-Knockout (KO)-Mäuse mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die AngII in einer Konzentrationen von 600 ng/kg min über einen Zeitraum von 28 Tagen abgaben. Zusätzlich wurde eine Gruppe von AngII-behandelten Wildtyp (WT)-Mäusen mit dem AT1-Rezeptor-Blocker Candesartan (Cand) behandelt. Während des Versuchszeitraumes fanden regelmäßige, nicht-invasive Blutdruckmessungen an den wachen Mäusen statt. In WT-Mäusen induzierte AngII Bluthochdruck, verursachte erhöhte Albumin-Level im Urin und führte zur Bildung von ROS in Niere und im Herzen. Außerdem traten in dieser Gruppe DNA-Schäden in Form von Einzel- und Doppelstrangbrüchen auf. All diese Reaktionen auf AngII konnten jedoch durch gleichzeitige Behandlung mit Cand verhindert werden. AT1a-KO-Mäuse hatten, verglichen mit WT-Kontrollmäusen, einen signifikant niedrigeren Blutdruck und normale Albumin-Level im Urin. In AT1a-KO-Mäusen, die mit AngII behandelt wurden, konnte kein Anstieg des systolischen Blutdrucks sowie kein Einfluss auf die Nierenfunktion gefunden werden. Jedoch führte AngII in dieser Gruppe zu einer Steigerung von ROS in der Niere und im Herzen. Zusätzlich wurden genomische Schäden, vor allem in Form von Doppelstrangbrüchen signifikant in dieser Gruppe induziert. Auch wenn AT1a-KO-Tiere, unabhängig von einer AngII-Infusion, keine eingeschränkte Nierenfunktion zeigten, so wiesen sie erhebliche histopathologische Schäden im Hinblick auf die Glomeruli und das Tubulussystem auf. Diese Art von Schäden deuten auf eine besondere Bedeutung des AT1aR im Hinblick auf die embryonale Entwicklung der Niere hin. Zusammenfassend beweisen die Ergebnisse dieses Experiments eindeutig, dass eine AngII-induzierte ROS-Produktion und die Induktion von DNA-Schäden unabhängig von einem erhöhten Blutdruck auftreten. Da in der AngII-behandelten AT1a-KO-Gruppe eine signifikant höhere Expression des AT1b-Rezeptors zu finden war und die Blockade von beiden Rezeptorsubtypen mit Cand zu einer Verhinderung der schädlichen Effekte durch AngII führte, scheint der AT1bR im Falle einer AT1aR-Defizienz für die Entstehung der Schäden zuständig zu sein. 
Ziel des zweiten Experimentes war es, den Beitrag der Nox2 und Nox4 zum oxidativen DNA-Schaden in vivo zu untersuchen. Hierfür wurden männliche C57BL/6-Mäuse und Nox2- oder Nox4-defiziente Mäuse mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die AngII in einer Konzentration von 600 ng/kg min über einen Zeitraum von 28 Tagen abgaben. Im WT-Stamm und in beiden Nox-defizienten Stämmen induzierte AngII Bluthochdruck, verursachte erhöhte Albumin-Level im Urin und führte zur Bildung von ROS in der Niere. Außerdem waren in allen AngII-behandelten Gruppen genomische Schäden, vor allem in Form von Doppelstrangbrüchen, erhöht. Auch in Abwesenheit von AngII wiesen Nox2- und Nox4-defiziente Mäuse mehr Doppelstrangbrüche im Vergleich zu WT-Kontrollmäusen auf. Interessanterweise kompensieren allerdings weder Nox2 noch Nox4 das Fehlen der jeweils anderen Isoform auf RNA-Basis. Aufgrund dieser Ergebnisse schließen wir, dass bislang keine Isoform alleine für die Generierung von oxidativen DNA-Schäden in der Niere verantwortlich gemacht werden kann und dass eine Beteiligung einer weiteren Nox-Isoform sehr wahrscheinlich ist. Möglicherweise könnten aber auch andere ROS-generierende Enzyme, wie Xanthinoxidase oder Stickoxidsynthase involviert sein. Da genomische Schäden in Nieren von Nox2- und Nox4-defizienten Mäusen in Abwesenheit von AngII gegenüber den Schäden in WT-Kontrollmäusen erhöht waren, könnten die beiden Isoformen auch eine schützende Funktion im Bereich von Nierenkrankheiten übernehmen. Da dies aber bislang nur für Nox4 beschrieben ist, ist es wahrscheinlicher, dass das Fehlen von einer der beiden Isoformen eher einen Einfluss auf die Embryonalentwicklung hat. Um dies jedoch abschließend zu klären wäre es sinnvoll mit induzierbaren Knockout-Modellen zu arbeiten, bei denen mögliche entwicklungsbedingte Effekte minimiert werden können.
N2  - The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) regulates blood pressure, electrolyte metabolism and water balance. The reactive peptide, Angiotensin II (AngII), of the RAAS causes vasoconstriction and, in higher concentrations, increased blood pressure. Hypertensive patients have an increased risk to develop cancer, especially kidney cancer. We have shown in vivo, that AngII is capable to cause an elevation of blood pressure, as well as DNA damage dose-dependently via the AngII type 1 receptor (AT1R). A stimulated RAAS can further lead to oxidative stress by activating NADPH oxidases which are major enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS) in the cell. On the one hand the aim of this work was to examine in vivo with the help of AT1aR-deficient mice whether the formation of ROS and DNA damage in the kidney and the heart occur independently of an increased blood pressure. On the other hand we wanted to investigate whether one or both of the two examined isoforms of the NADPH oxidase (Nox) is responsible for the triggering of oxidative stress in the kidney. 
For the purpose of the first experiment which examined the dependency of AngII-induced DNA damage on blood pressure, male C57BL/6-mice and AT1a-knockout (KO)-mice were equipped with osmotic minipumps, delivering AngII in a concentration of 600 ng/kg x min during 28 days. Additionally, wild-type (WT) mice were treated with the AT1R antagonist candesartan (cand). Over the whole time period, frequent non-invasive blood pressure measurements were taken. In WT mice, AngII induced hypertension, an elevated urinary albumin level and formation of ROS in kidney and heart. Furthermore, genomic damage, in form of single- and double strand breaks, was augmented in this group. All these responses to AngII could be attenuated by concurrent administration of candesartan. AT1a-deficient mice had lower basal systolic pressures than WT mice and comparable urinary albumin levels. In AT1a-deficient mice treated with AngII, systolic pressure was not increased, and no effect on renal function could be detected. However, AngII led to an increase of ROS in kidney and heart in this group. In addition, genomic damage, especially in form of double strand breaks was significantly induced. Although AT1a-KO-mice, independent of an AngII-infusion, showed no renal impairment they had significant histopathological changes in glomeruli and tubules. This points to a special importance of AT1aR with regard to the embryonic development of the kidney. In summary our results clearly demonstrate that AngII-induced ROS production and DNA damage is independent of blood pressure. Since we found a significantly higher expression of the AT1bR in the AngII-treated AT1aR-KO-group and since blocking of both subtypes with cand resulted in a complete prevention of adverse AngII effects, the receptor responsible for the mediation of these effects seems to be AT1bR. 
The aim of the second experiment was to examine the contribution of Nox2 and Nox4 to oxidative DNA damage in vivo. Therefore male C57BL/6-mice and Nox2- or Nox4-deficient mice were equipped with osmotic minipumps, delivering AngII in a concentration of 600 ng/kg × min during 28 days. In WT and in both strains of Nox-deficient mice, AngII induced hypertension, elevated urinary albumin levels and formation of ROS in the kidney. Furthermore, genomic damage, especially in form of double strand breaks were augmented in all of the AngII-treated groups. Also in the absence of AngII, Nox2- and Nox4-deficient mice exhibited a higher background of double strand breaks. Interestingly neither Nox2 nor Nox4 do not compensate for the deficiency of the other isoform on mRNA level. Due to these results we conclude that there is no isoform so far which is solely responsible for the generation of ROS in the kidney under AngII-treatment. Potentially there might also be a contribution of other enzymes like xanthine oxidase or nitric oxide synthase to the formation of ROS. Since genomic damage in kidneys of Nox2- and Nox4-deficient mice in the absence of AngII was higher as compared to the damages in WT control mice it might be that both isoforms could have a protective role in renal disease. But, since this is so far only described for Nox4 it is likely that the absence of one of the two isoforms rather has an influence on the embryonic development. To finally clarify this hypothesis it would be suggestive to work with inducible knockout mouse models where possible developmental effects can be minimized.
KW  - Angiotensin II
KW  - NADPH-Oxidase
KW  - DNS-Schädigung
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Angiotensin II
KW  - NADPH oxidase
KW  - angiotensin II type 1a receptor
KW  - DNA damage
KW  - oxidative stress
KW  - Angiotensin II Typ 1a-Rezeptor
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137469
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hofmann, Stefan
T1  - Hybridisierungsbasierte Multiplex-Detektion von microRNA mit CMOS-Technologie für die Anwendung in der Point-of-Care-Diagnostik
T1  - Hybridization-based multiplex detection of microRNA using CMOS technology towards point-of-care diagnostics
N2  - MicroRNAs sind kurze, nicht-kodierende Ribonukleinsäuren, die eine wichtige Rolle bei der Genregulation spielen. Sie sind an vielen physiologischen Prozessen beteiligt und werden als vielversprechende Kandidaten für eine neue Generation von Biomarkern gehandelt. Die Quantifizierung von miRNAs aus Blut oder anderen Körperflüssigkeiten verspricht eine frühe Diagnose verschiedener Krankheitsbilder. Dazu zählen neben zahlreichen Krebsformen unter anderem auch Autoimmun- oder Herz-Kreislauferkrankungen. Um diese Biomarker schnell, sensitiv und spezifisch detektieren zu können, werden geeignete Detektionssysteme benötigt. Dabei liegt ein besonderer Fokus auf der Entwicklung von Point-of-Care-Systemen, die eine automatisierte Durchführung mit einfacher Handhabung verlangen.
Mikrochips können als leistungsfähige technische Hilfsmittel für eine robuste und miniaturisierte Signalerfassung an biochemischen Grenzflächen dienen. Auf der Grundlage eines CMOS-Chips mit einem Sensorarray aus interdigitalen Gold-Elektroden sollte in dieser Arbeit eine quantitative und multiplexfähige miRNA-Detektionsmethode mit elektrochemischer Signaltransduktion entworfen und untersucht werden. Weitere wichtige Zielfaktoren waren eine einfache und schnelle Durchführbarkeit, eine hohe Spezifität und eine gute Sensitivität bei gleichzeitigem Verzicht auf Amplifikation und Vormarkierung des Ausgangsmaterials.
Es wurden verschiedene Methoden entworfen, überprüft, untersucht, optimiert und weiterentwickelt. Das beste Ergebnis wurde letztlich mit einem als Sandwich-Ligations-Methode bezeichneten Verfahren erzielt. Dabei wird zunächst ein aus zwei doppelsträngigen Assay-Komponenten und der Ziel-miRNA bestehender dreiteiliger Hybridisierungskomplex gebildet, der eine beidseitige spezifische Ligation der miRNA mit einem auf der Sensoroberfläche immobilisierten Fängerstrang und einem enzymmarkierten Reporterstrang vermittelt. Durch einen anschließenden Waschschritt werden alle überschüssigen Markierungen vom Detektionsbereich entfernt, so dass bei der Detektion nur Reporterenzyme ausgelesen werden, die über die Ziel-miRNA kovalent mit dem immobilisierten Strang verbunden sind. Dieses Signal ist daher proportional zur Ausgangskonzentration der gesuchten miRNA.
Die Methode wurde mit Hilfe von synthetischen miRNAs etabliert und optimiert. Sie erreichte eine analytische Sensitivität von unter 1 pM Ziel-Nukleinsäure bei einer Gesamt-Versuchsdauer von nur 30 Minuten. Konzentrationsreihen demonstrierten einen linearen dynamischen Messbereich zwischen 1 pM und 1 nM, der eine verlässliche Quantifizierung der detektierten miRNAs in diesem Bereich ermöglicht. Die sehr gute Spezfifität des Assays zeigte sich bei der Untersuchung des Einflusses verschiedener IsomiRs auf das Messergebnis sowie im Rahmen von Experimenten mit miRNAs der let-7-Familie. Dabei konnten Ziel-Nukleinsäuren mit Einzelbasenunterschieden klar differenziert werden. Die Multiplexfähigkeit der vorgestellten Methode wurde durch die gleichzeitige Quantifizierung von bis zu acht miRNAs auf einem CMOS-Chip demonstriert, zuzüglich Kontrollen.
Die Validierung der Detektionsmethode erfolgte mit Gesamt-RNA-Extrakten aus Vollblutproben. Dazu wurde ein kardiales Panel aus acht miRNAs, die auf Basis von Studien zu zirkulierenden miRNAs bei Herzerkrankungen ausgewählt wurden, festgelegt. Mit Hilfe der entsprechenden optimierten Detektionskomponenten wurden aus Spenderblut gewonnene endogene miRNAs analysiert. Dabei zeigte sich für fünf der acht Kandidaten sowohl eine solide Korrelation zwischen eingesetzter Gesamt-RNA-Menge und Messsignal, als auch eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. 
Die Konzentrationen der übrigen drei miRNAs lagen nah am unteren Detektionslimit und lieferten daher keine verlässlichen Daten. Mit Hilfe sogenannter branched DNA zur Signalamplifikation könnte bei Bedarf die Sensitivität des Assays noch verbessert werden, was durch weitere Experimente dieser Arbeit demonstriert wurde.
Ein Vergleichsexperiment zwischen der Sandwich-Ligations-Methode und qRT-PCR zeigte nur eine schwache Korrelation der Messergebnisse. Dies ist jedoch konsistent mit anderen Studien zur Vergleichbarkeit unterschiedlicher Detektionsmethoden.
Abschließend wurden die miRNAs des kardialen Panels in Gesamt-RNA-Extrakten aus Vollblut von Herzinfarktpatienten und Kontrollen mit der entwickelten Detektionsmethode analysiert und die Ergebnisse verglichen. Dabei konnten Abweichungen in den Konzentrationen von miR-15a und miR-425 aufgedeckt werden. Eine entsprechende diagnostische Untersuchung mit der hier vorgelegten und validierten Detektionsmethode könnte eine Alternative oder Ergänzung zu aktuell eingesetzten proteinbasierten Tests bieten.
N2  - MicroRNAs are short, non-coding ribonucleic acids that play an important role in gene regulation. They are involved in many physiological processes and therefore considered as auspicious candidates for a new generation of biomarkers. The quantification of miRNAs from blood or other body fluids promises early diagnosis of various diseases, including autoimmune disorders, cardiovascular disease as well as different types of cancer. For a fast, sensitive and specific detection of these biomarkers, suitable detection systems are needed. A particular focus is thereby on the development of point-of-care systems, which require an automatized work-flow with easy handling.
Microchips are powerful technical tools for a robust and miniaturized signal acquisition at biochemical interfaces. Based on a CMOS chip providing an array of interdigitated gold electrode sensors, a quantitative multiplex miRNA detection method with electrochemical readout should be designed and investigated in this work. A fast and easy workflow, a high specificity and a good sensitivity without amplification or prelabeling of the target material were additional important goals.
Several approaches were designed, tested, investigated, optimized and refined. In the end a method labeled as Sandwich Ligation Assay provided the best results. In this procedure, a tripartite hybridization complex is created by two double-stranded assay components and the target nucleic acid. This formation mediates a specific both-sided ligation of the miRNA to an immobilized capture strand on the sensor surface and to an enzyme-linked reporter strand. A subsequent washing step removes all excessive label conjugates from the sensor array. Thus only reporter enzymes that are covalently bound to the immobilized capture strand via the target miRNA are measured during detection. The acquired signal is therefore proportional to the initial concentration of the respective target.
The Sandwich Ligation Assay was established and optimized using synthetic miRNAs. A sensitivity of less than 1 pM nucleic acid target could be achieved at a time to result of only 30 minutes. Generated concentration curves showed a linear dynamic range between 1 pM and 1 nM allowing a reliable quantification of detected miRNAs in this scope of measurement. Experiments with miRNAs of the let-7 family that exhibited only one or two nucleotide differences demonstrated a very good specificity of the presented method, as did the investigation of the influence of IsomiRs on the measurement signal. The ability of multiplex measurement was verified by the simultaneous quantification of up to eight miRNAs plus controls on one CMOS chip.
The detection method was validated using total RNA extracts gained from whole blood samples. Therefore a cardiac panel composed of eight miRNA candidates was assorted by leveraging the results of studies about circulating miRNAs in heart disease. The optimized corresponding detection components were used to analyze endogenous miRNAs from donor blood. Five of the eight candidates showed a solid correlation between the applied amount of total RNA and the measurement signal as well as a good reproducibility of results with CV values ranging from 0.04 to 0.13.
The concentrations of the three remaining miRNAs were too close to the lower detection limit and hence didn’t provide reliable data. A signal amplification using so-called branched DNA can be integrated into the measurement procedure to further enhance the sensitivity of the assay, if required. This was demonstrated by additional experiments of this thesis.
A comparison between the Sandwich Ligation Assay and qRT-PCR showed only weak correlation of measurement results, which is in line with previous studies about interplatform comparability.
Finally, the miRNAs of the cardiac panel were analyzed in total RNA samples extracted from whole blood of patients with myocardial infarction and controls using the established detection method. By comparison of the results dysregulations of the particular miRNAs miR-15a and miR-425 could successfully be identified. A respective diagnostic test using the proposed measurement procedure could provide an alternative or a complement to the currently applied immunoassays.
KW  - miRNS
KW  - Diagnostik
KW  - Molekulare Hybridisierung
KW  - Detektion
KW  - miRNA-Detektion
KW  - molecular diagnostics
KW  - point-of-care
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150949
ER  -