TY - THES A1 - Münz, Thomas Sebastian T1 - Aspects of neuronal plasticity in the mushroom body calyx during adult maturation in the honeybee Apis mellifera T1 - Aspekte neuronaler Plastizität im Pilzkörper kalyx während der Adultreifung der Honigbiene Apis mellifera N2 - Division of labor represents a major advantage of social insect communities that accounts for their enormous ecological success. In colonies of the honeybee, Apis mellifera, division of labor comprises different tasks of fertile queens and drones (males) and, in general, sterile female workers. Division of labor also occurs among workers in form of an age-related polyethism. This helps them to deal with the great variety of tasks within the colony. After adult eclosion, workers spend around three weeks with various duties inside the hive such as tending the brood or cleaning and building cells. After this period workers switch to outdoor tasks and become foragers collecting nectar, pollen and water. With this behavioral transition, workers face tremendous changes in their sensory environment. In particular, visual sensory stimuli become important, but also the olfactory world changes. Foragers have to perform a completely new behavioral repertoire ranging from long distance navigation based on landmark orientation and polarized-skylight information to learning and memory tasks associated with finding profitable food sources. However, behavioral maturation is not a purely age-related internal program associated with a change, for example, in juvenile hormone titers. External factors such as primer pheromones like the brood pheromone or queen mandibular pheromone can modulate the timing of this transition. In this way colonies are able to flexibly adjust their work force distribution between indoor and outdoor tasks depending on the actual needs of the colony. Besides certain physiological changes, mainly affecting glandular tissue, the transition from indoor to outdoor tasks requires significant adaptations in sensory and higher-order integration centers of the brain. The mushroom bodies integrate olfactory, visual, gustatory and mechanosensory information. Furthermore, they play important roles in learning and memory processes. It is therefore not surprising that the mushroom bodies, in particular their main input region, the calyx, undergo volumetric neuronal plasticity. Similar to behavioral maturation, plastic changes of the mushroom bodies are associated with age, but are also to be affected by modulating factors such as task and experience. In my thesis, I analyzed in detail the neuronal processes underlying volumetric plasticity in the mushroom body. Immunohistochemical labeling of synaptic proteins combined with quantitative 3D confocal imaging revealed that the volume increase of the mushroom body calyx is largely caused by the growth of the Kenyon cell dendritic network. This outgrowth is accompanied by changes in the synaptic architecture of the mushroom body calyx, which is organized in a distinct pattern of synaptic complexes, so called microglomeruli. During the first week of natural adult maturation microglomeruli remain constant in total number. With subsequent behavioral transition from indoor duties to foraging, microglomeruli are pruned while the Kenyon cell dendritic network is still growing. As a result of these processes, the mushroom body calyx neuropil volume enlarges while the total number of microgloumeruli becomes reduced in foragers compared to indoor workers. In the visual subcompartments (calyx collar) this process is induced by visual sensory stimuli as the beginning of pruning correlates with the time window when workers start their first orientation flights. The high level of analysis of cellular and subcellular process underlying structural plasticity of the mushroom body calyx during natural maturation will serve as a framework for future investigations of behavioral plasticity in the honeybee. The transition to foraging is not purely age-dependent, but gets modulated, for example, by the presence of foragers. Ethyl oleate, a primer pheromone that is present only in foragers, was shown to delay the onset of foraging in nurse bees. Using artificial application of additional ethyl oleate in triple cohort colonies, I tested whether it directly affects adult neuronal plasticity in the visual input region of the mushroom body calyx. As the pheromonal treatment failed to induce a clear behavioral phenotype (delayed onset of foraging) it was not possible to show a direct link between the exposure to additional ethyl oleate and neuronal plasticity in mushroom body calyx. However, the general results on synaptic maturation confirmed my data of natural maturation processes in the mushroom body calyx. Given the result that dendritic plasticity is a major contributor to neuronal plasticity in the mushroom body calyx associated with division of labor, the question arose which proteins could be involved in mediating these effects. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) especially in mammals, but also in insects (Drosophila, Cockroach), was shown to be involved in facilitating learning and memory processes like long-term synaptic potentiation. In addition to presynaptic effects, the protein was also revealed to directly interact with cytoskeleton elements in the postsynapse. It therefore is a likely candidate to mediate structural synaptic plasticity. As part of my thesis, the presence and distribution of CaMKII was analyzed, and the results showed that the protein is highly concentrated in a distinct subpopulation of the mushroom body intrinsic neurons, the noncompact Kenyon cells. The dendritic network of this population arborizes in two calyx subregions: one receiving mainly olfactory input – the lip – and the collar receiving visual input. This distribution pattern did not change with age or task. The high concentration of CaMKII in dendritic spines and its overlap with f-actin indicates that CaMKII could be a key player inducing structural neuronal plasticity associated with learning and memory formation and/or behavioral transitions related to division of labor. Interestingly CaMKII immunoreactivity was absent in the basal ring, another subregion of the mushroom body calyx formed almost exclusively by the inner compact Kenyon cells and known to receive combined visual and olfactory input. This indicates differences of this mushroom body subregion regarding the molecular mechanisms controlling plastic changes in corresponding Kenyon cells. How is timing of behavioral and neuronal plasticity regulated? The primer pheromone ethyl oleate was found in high concentrations on foragers and was shown to influence behavioral maturation by delaying the onset of foraging when artificially applied in elevated concentrations. But how is ethyl oleate transferred and how does it shift the work force distribution between indoor and outdoor tasks? Previous work showed that ethyl oleate concentrations are highest in the honeycrop of foragers and suggested that it is transferred and communicated inside the colony via trophallaxis. The results of this thesis however clearly show, that ethyl oleate was not present inside the honey crop or the regurgitate, but rather in the surrounding tissue of the honey crop. As additionally the second highest concentration of ethyl oleate was measured on the surface of the cuticle of forgers, trophallaxis was ruled out as a mode of transmission. Neurophysiological measurements at the level of the antennae (electroantennogram recordings) and the first olfactory neuropil (calcium imaging of activity in the antennal lobe) revealed that the primer pheromone ethyl oleate is received and processed as an olfactory stimulus. Appetitive olfactory conditioning using the proboscis extension response as a behavioral paradigm showed that ethyl oleate can be associated with a sugar reward. This indicates that workers are able to perceive, learn and memorize the presence of this pheromone. As ethyl oleate had to be presented by a heated stimulation device at close range, it can be concluded that this primer pheromone acts via close range/contact chemoreception through the olfactory system. This is also supported by previous behavioral observations. Taken together, the findings presented in this thesis revealed structural changes in the synaptic architecture of the mushroom body calyx associated with division of labor. For the primer pheromone ethyl oleate, which modulates the transition from nursing to foraging, the results clearly showed that it is received via the olfactory system and presumably acts via this pathway. However, manipulation experiments did not indicate a direct effect of ethyl oleate on synaptic plasticity. At the molecular level, CaMKII is a prime candidate to mediate structural synaptic plasticity in the mushroom body calyx. Future combined structural and functional experiments are needed to finally link the activity of primer pheromones like ethyl oleate to the molecular pathways mediating behavioral and synaptic plasticity associated with division of labor in Apis mellifera. The here identified underlying processes will serve as excellent models for a general understanding of fundamental mechanisms promoting behavioral plasticity. N2 - Arbeitsteilung stellt einen der wesentlichen Faktoren dar, der für den ökologischen Erfolg von sozialen Insektengemeinschaften verantwortlich ist. In Staaten der Honigbiene, Apis mellifera, umfasst die Arbeitsteilung verschiedene Aufgaben für die fertilen Königinnen und Drohnen (Männchen) beziehungsweise die gewöhnlicherweise sterilen Arbeiterinnen. Arbeitsteilung findet aber auch in Form eines altersabhängigen Polyethismus zwischen den Arbeiterinnen selber statt. Dies hilft ihnen die Vielzahl verschiedener Aufgaben im Stock zu bewältigen. Nach dem Schlupf verbringen die Arbeiterinnen etwa drei Wochen mit verschiedenen Aufgaben im Stock, wie beispielsweise Brutpflege oder Reinigen und Bauen neuer Wabenzellen. Nach dieser Zeit wechseln die Arbeiterinnen zu Aufgaben außerhalb des Stocks und werden Nektar-, Pollen- oder Wassersammlerinnen. Durch diesen Verhaltensübergang sind die Arbeiterinnen mit einem massiven Wandel ihrer sensorischen Umwelt konfrontiert. Im speziellen werden nun visuelle Reize wichtig, aber auch die olfaktorische Welt der Arbeiterinnen ändert sich. Sammlerinnen zeigen ein komplett neues Verhaltensrepertoire das von Langstreckennavigation, basierend Landmarken und dem Polarisationsmuster des Himmels, bishin zu Lern- und Gedächtnisaufgaben im Zusammenhang mit dem Auffinden profitabler Futterquellen reicht. Allerdings ist Verhaltensreifung kein rein altersbedingtes internes Programm beispielsweise basierend auf einer Veränderung des Juvenilhormon-Titers. Externe Faktoren wie beispielsweise die Primer Pheromone Brutpheromone oder Königinnenpheromon können den Zeitpunkt des Übergangs modulieren. Hierdurch sind Staaten in der Lage ihre Arbeiterkräfte flexibel zwischen Innen- und Außendienst Aufgaben zu verschieben. Neben bestimmten physiologischen Veränderungen, die vor allem Drüsengewebe betreffen, benötigt der Übergang vom Innendienst zum Außendienst deutliche Anpassungen sensorischer und höherer Integrationszentren im Gehirn. Die Pilzkörper integrieren olfaktorische, visuelle und mechanosensorische Informationen. Sie spielen weiterhin eine wichtige Rolle für Lern- und Gedächtnisvorgänge. Es ist daher nicht überraschend, dass die Pilzkörper, im Speziellen deren Haupteingangsregion, der Kalyx, eine neuronale Volumensplastizität durchlaufen. Ähnlich wie die Verhaltensreifung, sind plastische Veränderungen im Pilzkörper mit dem Alter verbunden, werden aber auch durch modulierende Faktoren wie Aufgabe und Erfahrungen beeinflusst. In meiner Dissertation habe ich detailliert die neuronalen Prozesse analysiert, die der Volumensplastizität des Pilzkörpers zugrunde liegen. Immunhistologische Färbungen synaptischer Proteine kombiniert mit quantitativer 3D Konfokalmikroskopie zeigten, dass die Volumenszunahme des Pilzkörpers hauptsächlich durch dendritisches Wachstum des Kenyon-Zellen-Netzwerks bedingt ist. Dieses Auswachsen wurde begleitet durch Veränderungen der synaptischen Architektur des Kalyx des Pilzkörpers, welcher in Form synaptischer Komplexe, sogenannter Mikroglomeruli organisiert ist. Während der ersten Woche der Adultreifung blieb die Gesamtzahl der Mikroglomeruli konstant. Im folgenden Verhaltensübergang von Innendienstaufgaben zum Sammeln, wurden die Mikroglomeruli zurückgetrimmt, während das dendritische Kenyon-Zell-Netzwerk weiterhin wuchs. Als Ergebnis dieser Prozesse vergrößerte sich das Volumen des Kalyx des Pilzkörpers während die Gesamtzahl der Mikroglomeruli bei Sammlerinnen im Vergleich zu Inndienst Arbeiterinnen reduziert war. In der visuellen Unterregion (Kragen des Kalyx) wurde dieser Prozess induziert durch sensorische Stimuli, da der Beginn des Zurücktrimmens mit dem Zeitfenster zusammenfiel, in dem die Arbeiterinnen ihre ersten Orientierungsflüge starteten. Der hohe Analysegrad der zellulären und subzellulären Prozesse, die der strukturellen Plastizität des Kalyx des Pilzkörpers während der natürlichen Reifung zugrunde liegen, wird zukünftigen Untersuchungen der Verhaltensplastizität bei Honigbienen als Referenz dienen. Der Übergang zur Sammlerin ist nicht rein altersabhängig, sondern wird beispielsweise durch die Gegenwart von anderen Sammlerinnen moduliert. Ethyloleat, ein Primer Pheromone das nur auf Sammlerinnen auftritt, verzögert das Einsetzen des Sammelns von Ammenbienen. Durch das Einbringen zusätzlichen Ethyloleats in Dreifach Kohorten, testete ich, ob es einen direkten Einfluss auf die neuronale Plastizität der visuellen Eingangsregion des Pilzkörper Kalyx hat. Da durch die Pheromon Behandlung kein eindeutiger Verhaltensphänotyp (verzögerter Sammelbeginn) induziert werden konnte, war es nicht möglich einen direkten Zusammenhang zwischen der verstärkten Ethyloleat-Exposition und der neuronalen Plastizität des Kalyx des Pilzkörpers herzustellen. Dennoch bestätigten die Beobachtungen der synaptischen Reifung meine generellen Daten zu den natürlichen Reifungsprozessen im Kalyx des Pilzkörper. Basierend auf dem Ergebnis, dass dendritische Plastizität einen wesentlichen Anteil an der arbeitsteilungsbezogenen neuronalen Plastizität des Kalyx des Pilzkörper hat, stellte sich die Frage, welche Proteine daran beteiligt sein könnten diese Effekte zu vermitteln. Von der Calcium/Calmodulin abhängigen Kinase II (CaMKII) ist bekannt, dass sie speziell bei Säugetieren - aber bei Insekten (Drosophila, Schabe) - daran beteiligt ist, Lern- und Gedächtnisvorgänge, wie die Langzeitpotenzierung, zu ermöglichen. Neben präsynaptischen Effekten, wurde gezeigt, dass dieses Protein direkt mit Elementen des postsynaptischen Cytoskeletts interagieren kann. Als Teil meiner Dissertation habe ich das Vorkommen und die Verteilung der CaMKII analysiert. Ich konnte es hochkonzentriert in einer definierten Subpopulation der intrinsischen Pilzkörper-Neurone, den „nicht kompakten“ Kenyon Zellen, nachweisen. Das dendritische Netzwerk dieser Population verzweigt sich in zwei Kalyx Subregionen: eine olfaktorisch innervierte – die Lippe – und den Kragen, welcher optischen Eingang erfährt. Dieses Verteilungsmuster ändert sich nicht mit dem Alter oder der Aufgabe der Biene. Die hohe Konzentration von CaMKII in den dendritsichen Dornenfortsätzen und die gleichzeitige räumliche Überlappung mit f-Aktin, weisen darauf hin, dass CaMKII eine Schüsselrolle bei der Induzierung struktureller neuronaler Plastizität im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnisbildung und/oder Arbeitsteilung bezogener Verhaltensübergänge, zukommen könnte. Interessanterweise wies der Basalring, eine weitere Subregion des Kalyx des Pilzkörpers die dafür bekannt ist kombinierten visuellen und olfaktorischen Eingang zu erhalten und fast ausschließlich durch die „inneren kompakten“ Kenyon Zellen gebildet wird, keine Immunreaktivität auf. Dies deutet auf Unterschiede in den molekularen Mechanismen die plastische Veränderungen in den entsprechenden Kenyon zellen kontrollieren. Wie wird die zeitliche Abstimmung der Verhaltensplastizität und neuronalen Plastizität reguliert? Für das in hohen Konzentration auf Sammlerinnen vorkommende Primer Pheromon Ethyloelat konnte durch dessen Anwendung in erhöhten Konzentrationen gezeigt werden, dass es die Verhaltensreifung durch Verzögerung des Sammelbeginns beeinflussen kann. Wie aber wird Ethyloleat transferiert und wie verschiebt es die Arbeitskräfteverteilung zwischen Innen- und Außendienst Aufgaben? Frühere Arbeiten zeigten die höchste Konzentration von Ethyloleat im Sozialmagen der Sammlerinnen und schlugen vor, dass es innerhalb der Kolonie über Trophollaxis transferiert und kommuniziert wird. Die Ergebnisse meiner Arbeit zeigten aber eindeutig, dass Ethyloleat nicht im Inhalt des Sozialmagen und auch nicht im Regurgitat, sondern nur im Gewebe des Sozialmagens vorhanden ist. Da zusätzlich die zweithöchste Konzentration von Ethyloleat auf der Oberfläche der Kutikula von Sammlerinnen gemessen wurde, wurde Trophollaxis als Übertragungsmodus ausgeschlossen. Neurophysiologische Messungen an der Antenne (Elektroantennografie), dem ersten olfaktorischen Neuropil (Calcium Imaging der Aktivität des Antennallobus), zeigten, dass Ethyloleat als olfaktorischer Reiz wahrgenommen und prozessiert wird. Appetitive olfaktorische Konditionierung mit Hilfe des Rüsselstreckreflexes wurde als Verhaltensparadigma verwendet um zu zeigen, dass Ethyloleat mit einer Zuckerbelohnung assoziiert werden kann. Dies deutet darauf hin, dass Arbeiterinnen in der Lage sind, die Anwesenheit dieses Pheromons zu perzipieren, zu erlernen und sich auch daran zu erinnern. Da Ethyloleat nur durch Erwärmung als Stimulus präsentiert werden konnte, lässt sich schlussfolgern, dass es über Nahbereichs/Kontakt-Chemorezeption durch das olfaktorische System wahrgenommen wird. Dies wird auch durch frühere Verhaltensbeobachtungen unterstützt. Zusammengenommen, zeigen die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse strukturelle Veränderungen in der synaptischen Architektur des Kalyx des Pilzkörpers in Zusammenhang mit Arbeitsteilung. Für das Primer Pheromone Ethyloleat, welches den Übergang von Ammendiensten zum Sammeln moduliert, zeigten die Ergebnisse eindeutig, dass es über das olfaktorische System wahrgenommen wird und vermutlich auch über diesen Weg seine Wirkung vermittelt. Dennoch konnten Manipulationsexperimente keine direkte Verbindung zwischen Ethyloleat und der synaptischen Reifung herstellen. Auf molekularer Ebene stellt CaMKII einen Topkandidaten dar, der strukturelle synaptische Plastizität im Kalyx des Pilzkörpers vermitteln kann. Eine Kombination struktureller und funktioneller Experimente ist der nächste logische Schritt um schlussendlich die Verbindung zwischen der Aktivität von Primer Pheromonen (wie Ethyloleat) und molekularen Signalwegen, die Verhaltensplastizität und synaptische Plastizität im Zusammenhang mit der Arbeitsteilung von Apis mellifera vermitteln, herzustellen. Die hierbei identifizierten zugrundeliegenden Prozesse werden als exzellente Modelle für ein generelles Verständnis der fundamentalen Mechanismen welche Verhaltensplastizität vermitteln, dienen. KW - Biene KW - Neuronale Plastizität KW - Pheromon KW - Neuronal plasticity KW - Honeybee KW - Pheromon communication KW - CaMKII KW - Division of labor KW - Neuronale Plastizität KW - Honigbiene KW - Pheromon Kommunikation KW - Arbeitsteilung Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111611 ER - TY - THES A1 - Heidinger, Ina M. M. T1 - Beyond metapopulation theory: Determinants of the dispersal capacity of bush crickets and grasshoppers T1 - Bestimmende Faktoren der Ausbreitungsfähigkeit von Heuschrecken N2 - Habitat fragmentation and destruction due to anthropogenic land use are the major causes of the increasing extinction risk of many species and have a detrimental impact on animal populations in numerous ways. The long-term survival and stability of spatially structured populations in fragmented landscapes largely depends on the colonisation of habitat patches and the exchange of individuals and genes between patches. The degree of inter-patch dispersal, in turn, depends on the dispersal ability of a species (i.e. the combination of physiological and morphological factors that facilitate dispersal) and the landscape structure (i.e. the nature of the landscape matrix or the spatial configuration of habitat patches). As fragmentation of landscapes is increasing and the number of species is continuously declining, a thorough understanding of the causes and consequences of dispersal is essential for managing natural populations and developing effective conservation strategies. In the context of animal dispersal, movement behaviour is intensively investigated with capture-mark-recapture studies. For the analysis of such experiments, the influence of marking technique, handling and translocation of marked animals on movement pattern is of crucial importance since it may mask the effects of the main research question. Chapter 2 of this thesis presents a capture-mark-recapture study investigating the effect of translocation on the movement behaviour of the blue-winged grasshopper Oedipoda caerulescens. Transferring individuals of this grasshopper species to suitable but unfamilliar sites has a significant influence on their movement behaviour. Translocated individuals moved longer distances, showed smaller daily turning angles, and thus their movements were more directed than those of resident individuals. The effect of translocation was most pronounced on the first day of the experiment, but may persist for longer. On average, daily moved distances of translocated individuals were about 50 % longer than that of resident individuals because they have been transferred to an unfamiliar habitat patch. Depending on experiment duration, this leads to considerable differences in net displacement between translocated and resident individuals. In summary, the results presented in chapter 2 clearly point out that translocation effects should not be disregarded in future studies on arthropod movement, respectively dispersal. Studies not controlling for possible translocation effects may result in false predictions of dispersal behaviour, habitat detection capability or habitat preferences. Beside direct field observations via capture-mark-recapture methods, genetic markers can be used to investigate animal dispersal. Chapter 3 presents data on the genetic structure of populations of Metrioptera bicolor, a wing-dimorphic bush cricket, in a spatially structured landscape with patches of suitable habitat distributed within a diverse matrix of different habitat types. Using microsatellite markers, the effects of geographic distance and different matrix types on the genetic differentiation among 24 local populations was assessed. The results of this study clearly indicate that for M. bicolor the isolation of local populations severely depends on the type of surrounding matrix. The presence of forest and a river running through the study area was positively correlated with the extent of genetic differentiation between populations. This indicates that both matrix types severely impede gene flow and the exchange of individuals between local populations of this bush cricket. In addition, for a subsample of populations which were separated only by arable land or settlements, a significant positive correlation between pairwise genetic and geographic distances exists. For the complete data set, this correlation could not be found. This is most probably due to the adverse effect of forest and river on gene flow which dominates the effect of geographic distance in the limited set of patches investigated in this study. The analyses in chapter 3 clearly emphasize the differential resistance of different habitat types on dispersal and the importance of a more detailed view on matrix ‘quality’ in metapopulation studies. Studies that focus on the specific dispersal resistance of different matrix types may provide much more detailed information on the dispersal capacity of species than a mere analysis of isolation by distance. Such information is needed to improve landscape oriented models for species conservation. In addition to direct effects on realised dispersal (see chapter 3), landscape structure on its own is known to act as an evolutionary selection agent because it determines the costs and benefits of dispersal. Both morphological and behavioural traits of individuals and the degree to which a certain genotype responds to environmental variation have heritable components, and are therefore expected to be able to respond to selection pressures. Chapter 4 analyses the influence of patch size, patch connectivity (isolation of populations) and sand dynamics (stability of habitat) on thorax- and wing length as proxies for dispersal ability of O. caerulescens in coastal grey dunes. This study revealed clear and sex-specific effects of landscape dynamics and patch configuration on dispersal-related morphology. Males of this grasshopper species were smaller and had shorter wings if patches were larger and less connected. In addition, both sexes were larger in habitat patches with high sand dynamics compared to those in patches with lower dynamics. The investments in wing length were only larger in connected populations when sand dynamics were low, indicating that both landscape and patch-related environmental factors are of importance. These results are congruent with theoretical predictions on the evolution of dispersal in metapopulations. They add to the evidence that dispersal-related morphology varies and is selected upon in recently structured populations even at small spatial scales. Dispersal involves different individual fitness costs like increased predation risk, energy expenditure, costs of developing dispersal-related traits, failure to find new suitable habitat as well as reproductive costs. Therefore, the decision to disperse should not be random but depend on the developmental stage or the physiological condition of an individual just as on actual environmental conditions (context-dependent dispersal, e.g. sex- and wing morph-biased dispersal). Biased dispersal is often investigated by comparing the morphology, physiology and behaviour of females and males or sedentary and dispersive individuals. Studies of biased dispersal in terms of capture-mark-recapture experiments, investigating real dispersal and not routine movements, and genetic proofs of biased dispersal are still rare for certain taxa, especially for orthopterans. However, information on biased dispersal is of great importance as for example, undetected biased dispersal may lead to false conclusions from genetic data. In chapter 5 of this thesis, a combined approach of morphological and genetic analyses was used to investigate biased dispersal of M. bicolor. The presented results not only show that macropterous individuals are predestined for dispersal due to their morphology, the genetic data also indicate that macropters are more dispersive than micropters. Furthermore, even within the group of macropterous individuals, males are supposed to be more dispersive than females. To get an idea of the flight ability of M. bicolor, the morphological data were compared with that of Locusta migratoria and Schistocerca gregaria, which are proved to be very good flyers. Based on the morphological data presented here, one can assume a good flight ability for macropters of M. bicolor, although flying individuals of this species are seldom observed in natural populations. N2 - Zahlreiche Tierarten sind mehr und mehr vom Aussterben bedroht. Hauptursachen dafür sind die Zerstörung und Fragmentierung von Lebensraum durch den Menschen. Mit der anthropogenen Landnutzung sind vielfältige, negative Auswirkungen auf die betroffenen Tierpopulationen verbunden. Das langfristige Überleben und die Stabilität von räumlich strukturierten Populationen in fragmentierten Landschaften hängen dabei wesentlich von der Besiedlung von Habitatflächen, sowie dem Individuenaustausch und dem damit verbundenen genetischen Austausch zwischen einzelnen Populationen ab. Das Ausmaß der Ausbreitung von Individuen zwischen einzelnen Habitatflächen wird dabei (i) durch die Ausbreitungsfähigkeit der betreffenden Tierart, als die Kombination physiologischer und morphologischer Faktoren, welche die Ausbreitung eines Individuums begünstigen, und (ii) von der Struktur der Landschaft, wie z.B. dem Matrix-Typ oder die räumliche Anordnung von Habitatflächen, bestimmt. Da die Fragmentierung von Lebensräumen und die Anzahl bedrohter Tierarten stetig zunehmen, ist ein umfassendes Verständnis der Ursachen und Konsequenzen der Ausbreitung essenziel für das Management natürlicher Populationen sowie für die Entwicklung effektiver Schutzmaßnahmen. Eine gängige und sehr häufig angewandte Methode, Ausbreitung zu untersuchen, sind Fang-Wiederfang-Studien zum Laufverhalten einzelner Individuen. Dabei wird grundsätzlich davon ausgegangen, dass das Markieren und das Versetzen der Tiere keinerlei Einfluss auf deren Verhalten haben. Für die Analyse und Interpretation solcher Experimente ist es entscheidend, diesen Einfluss ausschließen zu können, da er die Effekte, die eigentlich untersucht werden sollen, überlagern kann. Kapitel 2 der vorliegenden Arbeit ist eine Fang-Wiederfang-Studie, die diese Annahme und damit den Einfluss des Versetzens auf das Laufverhalten der Blauflügelige Ödlandschrecke (Oedipoda caerulescens) untersucht. Wie sich zeigte, hat das Versetzen von Individuen auf eine geeignete, jedoch fremde Habitatfläche einen signifikanten Einfluss auf das Laufverhalten der versetzten Tiere. Versetzte Individuen legten größere Strecken zurück und zeigten ein geradlinigeres Bewegungsmuster als die Tiere, die genau an ihrem Fundort im „Heimathabitat“ wieder freigelassen wurden. Dieser Effekt war am ersten Tag nach der Freilassung der Versuchstiere am deutlichsten ausgeprägt, kann jedoch auch noch darüber hinaus anhalten. Die zurückgelegten Tagesstrecken der versetzten Individuen, die in eine ihnen unbekannte Habitatfläche verbracht wurden, waren im Durchschnitt 50 % länger, als die der nichtversetzten Tiere. In Abhängigkeit von der Dauer eines Experiments führt dies zu erheblichen Unterschieden hinsichtlich der Nettostrecken, die insgesamt von versetzten und nicht versetzten Tieren zurückgelegt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in Kapitel 2 präsentierten Ergebnisse deutlich zeigen, dass in zukünftigen Untersuchungen des Laufverhaltens von Arthropoden bzw. deren Ausbreitung, der Effekt des Versetzens berücksichtigt werden muss. Studien, die diesen Einfluss ignorieren, können zu falschen Vorhersagen bezüglich des Ausbreitungsverhaltens, der Fähigkeit geeignetes Habitat zu detektieren oder der Habitatpräferenzen einer Art führen. Neben direkter Beobachtung mittels Fang-Wiederfang-Methoden kommen auch genetische Methoden zur Anwendung, um das Ausbreitungsverhalten von Tieren zu untersuchen. Kapitel 3 beinhaltet Daten zur genetischen Struktur von Populationen der Zweifarbigen Beißschrecke (Metrioptera bicolor), einer Heuschreckenart mit ausgeprägtem Flügeldimorphismus. Die Untersuchung fand in einer räumlich strukturierten Landschaft statt, in der geeignete Habitatflächen verteilt in einer diversen Matrix von unterschiedlichen nicht-geeigneten Habitattypen vorliegen. Mit Hilfe von Mikrosatellitenmarkern wurde der Einfluss der geographischen Distanz und unterschiedlicher Matrixtypen auf die genetische Differenzierung von 24 lokalen Populationen von M. bicolor untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen deutlich, dass der Isolationsgrad lokaler Populationen dieser Heuschreckenart wesentlich von der umgebenden Matrix abhängt. Wie sich zeigte, werden der Individuenaustausch und der damit verbundenen Genfluss zwischen den untersuchten Populationen wesentlich durch Wald und einen Fluss eingeschränkt, da das Vorhandensein dieser beiden Matrixtypen positiv mit dem Grad der genetischen Differenzierung zwischen den Populationen korrelierte. Zudem zeigte sich für eine Teilauswahl von Populationen, welche nur durch landwirtschaftlich genutzte Flächen und Siedlungen voneinander getrennt sind, eine signifikant positive Korrelation zwischen der paarweise berechneten genetischen und der geographischen Distanz zwischen zwei Populationen. Dies bedeutet eine größere Differenzierung der Populationen je weiter sie voneinander entfernt sind. Für den vollständigen Datensatz mit allen untersuchten Populationen, konnte dieser Zusammenhang nicht nachgewiesen werden. Am wahrscheinlichsten ist dies darauf zurück zu führen, dass der nachteilige Effekt von Wald und Fluss auf den Genfluss den Effekt der geographischen Distanz überlagert. Die Analysen in Kapitel 3 machen deutlich, dass sich verschiedene Matrixtypen unterschiedlich auf die Ausbreitung einer Art auswirken, und unterstreichen wie wichtig eine eingehende Betrachtung der Matrixqualität für Metapopulationsstudien ist. Studien mit Fokus auf den unterschiedlichen Einfluss verschiedener Matrixtypen können wesentlich genauere Informationen zur Ausbreitungsfähigkeit einer Art liefern, als eine alleinige Analyse des isolierenden Effekts der räumlichen Trennung von Populationen. Gerade solche Informationen sind essentiell und nötig, um landschaftsorientierte Modelle für den Artenschutz verbessern zu können. Zusätzlich zu dem unmittelbaren Einfluss der Struktur der Landschaft auf die realisierte Ausbreitung von Individuen (siehe Kapitel 3), kann Landschaft auch als evolutionärer Selektionsfaktor agieren, da sie Kosten und Nutzen der Ausbreitung bestimmt. Ein entsprechender Selektionsdruck sollte sich sowohl auf morphologische Merkmale und Verhaltensmerkmale eines Individuums als auch auf das Ausmaß, mit dem ein bestimmter Genotyp auf Variationen der Umwelt reagiert, auswirken. Kapitel 4 untersucht den Einfluss der Größe und der Isolation einer Habitatfläche, sowie der Habitatstabilität (in Form der Sanddynamik) auf die Thorax- und Flügellänge, als Maße für die Ausbreitungsfähigkeit, der Blauflügeligen Ödlandschrecke in einem Küstengebiet. Die vorliegende Studie zeigte deutliche, geschlechtsspezifische Effekte der Sanddynamik und der räumlichen Anordnung der Habitatflächen zueinander auf die untersuchten morphologischen Merkmalen. Mit zunehmender Flächengröße und abnehmender Habitatkonnektivität, waren die Männchen von O. caerulescens kleiner und hatten zudem kürzere Flügel. Männchen und Weibchen von instabilen Habitatflächen (gekennzeichnet durch eine hohe Sanddynamik) waren größer als die Individuen von stabileren Habitatflächen (geringerer Sanddynamik). Insgesamt machen die vorliegenden Ergebnisse deutlich, dass sowohl landschaftsbezogene als auch habitatflächenbezogene Umweltfaktoren für die individuelle Investition in ausreitungsrelevante, morphologische Merkmale von Bedeutung sind. Diese Ergebnisse stimmen mit den Vorhersagen theoretischer Modelle zur Evolution der Ausbreitung in Metapopulationen überein und liefern einen weiteren Nachweis dafür, dass ausbreitungsrelevante, morphologische Merkmale variieren und in kürzlich strukturierten Populationen einer Selektion unterliegen. Die Ausbreitung eines Individuums ist mit unterschiedlichen Fitnesskosten verbunden. Dazu zählen zum Beispiel: Ein erhöhtes Predationsrisiko, energetische Kosten, das Risiko kein geeignetes Habitat zu finden, Kosten die mit der Ausbildung von ausbreitungsrelevanten Merkmalen verbunden sind, sowie Reproduktionskosten. Die Entscheidung, ob sich ein Individuum ausbreitet, sollte daher nicht zufällig erfolgen, sondern von dessen Entwicklungsstadium oder dessen physiologischer Konstitution, sowie von aktuellen Umweltbedingungen abhängen. Man spricht von einer kontextbezogene Ausbreitung, die zum Beispiel vom Geschlecht oder der Flügelmorphe eines Individuums abhängt. Ein Ungleichgewicht in der Ausbreitung verschiedener Geschlechter oder Morphen wird als biased dispersal bezeichnet. Für die Untersuchung von biased dispersal werden häufig Weibchen und Männchen oder sesshafte und sich ausbreitende Individuen einer Art morphologisch, physiologisch oder hinsichtlich ihres Verhaltens miteinander verglichen. Für einige Taxa, insbesondere Heuschrecken, liegen bislang nur wenige Studien zum biased dispersal in Form von Fang-Wiederfang-Experimenten (die auch wirklich Ausbreitung und keine Routinebewegungen einzelner Individuen untersuchen) oder genetischen Analysen vor. Allerdings sind gerade Informationen hierzu von großer Bedeutung, da zum Beispiel ein unentdecktes biased dispersal dazu führen kann, dass falsche Schlüsse aus den Ergebnissen genetischer Untersuchungen gezogen werden. Kapitel 5 der vorliegenden Dissertation untersucht das Auftreten von biased dispersal der Zweifarbigen Beißschrecke unter Verwendung eines kombinierten Ansatzes morphologischer und genetischer Analysen. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen nicht nur, dass makroptere Individuen aufgrund ihrer Morphologie prädestiniert für die Ausbreitung sind. Auch die genetischen Daten deuten an, dass sich makroptere Tiere stärker ausbreiten als mikroptere Tiere. Darüber hinaus besitzen innerhalb der Gruppe der makropteren Individuen Männchen eine bessere Ausbreitungsfähigkeit als Weibchen. Um die Flugfähigkeit von M. bicolor beurteilen zu können, wurden die morphologischen Daten der vorliegenden Untersuchung mit den Ergebnissen von Studien über Locusta migratoria and Schistocerca gregaria verglichen. Beide Arten sind für ihr sehr gutes Flugvermögen bekannt. Darauf basierend ist für maktoptere Individuen von M. bicolor eine gute Flugfähigkeit anzunehmen, wenn auch in natürlichen Populationen fliegende Tiere dieser Art nur selten beobachtet werden. KW - Heuschrecken <Überfamilie> KW - capture-mark-recapture KW - patch connectivity KW - sand dynamics KW - populations genetics KW - biased dispersal KW - Populationsgenetik KW - Demökologie KW - Habitat KW - Ausbreitung KW - dispersal KW - orthoptera Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135068 ER - TY - THES A1 - Scholl, Christina T1 - Cellular and molecular mechanisms contributing to behavioral transitions and learning in the honeybee T1 - Zelluläre und molekulare Mechanismen, die zu Verhaltensänderungen und Lernen in der Honigbiene beitragen N2 - The honeybee Apis mellifera is a social insect well known for its complex behavior and the ability to learn tasks associated with central place foraging, such as visual navigation or to learn and remember odor-reward associations. Although its brain is smaller than 1mm² with only 8.2 x 105 neurons compared to ~ 20 x 109 in humans, bees still show amazing social, cognitive and learning skills. They express an age – related division of labor with nurse bees staying inside the hive and performing tasks like caring for the brood or cleaning, and foragers who collect food and water outside the hive. This challenges foragers with new responsibilities like sophisticated navigation skills to find and remember food sources, drastic changes in the sensory environment and to communicate new information to other bees. Associated with this plasticity of the behavior, the brain and especially the mushroom bodies (MBs) - sensory integration and association centers involved in learning and memory formation – undergo massive structural and functional neuronal alterations. Related to this background my thesis on one hand focuses on neuronal plasticity and underlying molecular mechanisms in the MBs that accompany the nurse – forager transition. In the first part I investigated an endogenous and an internal factor that may contribute to the nurse - forager phenotype plasticity and the correlating changes in neuronal network in the MBs: sensory exposure (light) and juvenile hormone (JH). Young bees were precociously exposed to light and subsequently synaptic complexes (microglomeruli, MG) in the MBs or respectively hemolymph juvenile hormone (JH) levels were quantified. The results show that light input indeed triggered a significant decrease in MG density, and mass spectrometry JH detection revealed an increase in JH titer. Interestingly light stimulation in young bees (presumably nurse bees) triggered changes in MG density and JH levels comparable to natural foragers. This indicates that both sensory stimuli as well as the endocrine system may play a part in preparing bees for the behavioral transition to foraging. Considering a connection between the JH levels and synaptic remodeling I used gene knockdown to disturb JH pathways and artificially increase the JH level. Even though the knockdown was successful, the results show that MG densities remained unchanged, showing no direct effect of JH on synaptic restructuring. To find a potential mediator of structural synaptic plasticity I focused on the calcium-calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) in the second part of my thesis. CaMKII is a protein known to be involved in neuronal and behavioral plasticity and also plays an important part in structural plasticity reorganizing synapses. Therefore it is an interesting candidate for molecular mechanisms underlying MG reorganization in the MBs in the honeybee. Corresponding to the high abundance of CaMKII in the learning center in vertebrates (hippocampus), CaMKII was shown to be enriched in the MBs of the honeybee. Here I first investigated the function of CaMKII in learning and memory formation as from vertebrate work CaMKII is known to be associated with the strengthening of synaptic connections inducing long term potentiation and memory formation. The experimental approach included manipulating CaMKII function using 2 different inhibitors and a specific siRNA to create a CaMKII knockdown phenotype. Afterwards bees were subjected to classical olfactory conditioning which is known to induce stable long-term memory. All bees showed normal learning curves and an intact memory acquisition, short-term and mid-term memory (1 hour retention). However, in all cases long-term memory formation was significantly disrupted (24 and 72 hour retention). These results suggests the necessity of functional CaMKII in the MBs for the induction of both early and late phases of long-term memory in honeybees. The neuronal and molecular bases underlying long-term memory and the resulting plasticity in behavior is key to understanding higher brain function and phenotype plasticity. In this context CaMKII may be an important mediator inducing structural synaptic and neuronal changes in the MB synaptic network. N2 - Die Honigbiene Apis mellifera ist ein soziales Insekt, das bekannt ist für sein komplexes Verhalten und seine Fähigkeiten, Aufgaben in Bezug auf zentrales Sammelverhalten, zum Beispiel visuelle Navigation oder die Assoziation Duft – Belohnung, zu lernen, ist. Obwohl das Bienengehirn kleiner als 1mm² ist und im Vergleich zum dem des Menschen mit ~ 20 x 109 Neuronen nur 8.2 x 105 Neurone besitzt, verfügen Bienen trotzdem über beeindruckende soziale, kognitive und Lernfähigkeiten. Sie praktizieren eine altersabhängige Arbeitsteilung mit Ammen, die im Stock bleiben und Aufgaben wie das Versorgen der Brut übernehmen, und Sammlerinnen, die außerhalb des Stockes Futter und Wasser suchen. Dies fordert die Sammlerinnen zu neuen Aufgaben heraus, zum Beispiel hochentwickelte Navigation, drastischen Änderungen der sensorischen Umwelt, Lernen neuer Assoziationen und die Vermittlung der neuen Informationen an andere Bienen. Diese phänotypische Plastizität geht mit stark strukturellen und funktionell neuronalen Veränderungen im Gehirn und vor allem in den Pilzkörpern – sensorische Integrierungszentren, die an Lernen und Gedächtnisbildung beteiligt sind – einher. Passend dazu liegt ein Schwerpunkt meiner Arbeit darauf, die neuronale Plastizität und die molekularen Mechanismen im Pilzkörper, die mit der Wandlung der Amme hin zur Sammlerin zusammen hängen, zu untersuchen. Im ersten Teil werden ein endogener und ein interner Faktor, die zum Ammen - Sammlerinnen Übergang und den damit einhergehenden Änderungen im neuronalen Netzwerk beitragen könnten, untersucht: sensorische Input (Licht) und Juvenilhormon (JH). Junge Bienen wurden frühzeitig dem Licht ausgesetzt und anschließend synaptische Komplexe (Mikroglomeruli, MG) in den Pilzkörpern beziehungsweise JH aus der Hämolymphe quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass der Einfluss des Lichts tatsächlich eine plastische Verringerung der MG-Dichte auslöst und massenspektrometrische Messungen eine Zunahme an der JH-Menge in der Hämolymphe zeigen. Interessanterweise führt die Stimulation der jungen Ammen mit Licht zu Änderungen in der MG-Dichte und zu JH-Mengen, die vergleichbar sind mit den Werten bei natürlichen Sammlerinnen sind. Dies weist darauf hin, dass sowohl sensorische Stimuli als auch das Hormonsystem einen Beitrag zu der Vorbereitung der Bienen auf die bevorstehende Verhaltensänderung leisten. Um eine Verbindung zwischen der JH-Menge und synaptischen Umstrukturierungen in Betracht zu ziehen, habe ich einen Gen-Knockdown eingesetzt, um JH-Signalwege zu manipulieren und dadurch die JH-Menge künstlich zu erhöhen. Obwohl der Knockdown erfolgreich war, zeigen die Ergebnisse keinen direkten Zusammenhang zwischen der JH-Menge und einer synaptischer Umgestaltung. Um einen möglichen Vermittler von struktureller Plastizität zu finden, habe ich den Fokus im zweiten Teil meiner Arbeit auf die Calcium-Calmodulin-abhängige Protein-Kinase II (CaMKII) gerichtet. CaMKII ist ein Protein, das für seine Rolle sowohl in neuronaler und Verhaltensplastizität als auch in struktureller Plastizität bekannt ist. Daher ist es ein interessanter Kandidat, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die bei der MG-Umstrukturierung in den Pilzkörpern beteiligt sind. In Übereinstimmung mit dem hohen Vorkommen der CaMKII in Lernzentren in Vertebraten (Hippocampus) kommt CaMKII auch in hohem Maß in den Pilzkörpern der Biene vor. In dieser Arbeit habe ich zuerst die Funktion der CaMKII in Lernvorgängen und bei der Gedächtnisbildung untersucht, da bekannt ist, dass CaMKIII mit verstärkten synaptischen Verbindungen, die Langzeitpotenzierung und Gedächtnisbildung auslösen, in Zusammenhang gebracht wird. Der experimentelle Ansatz beinhaltet die Manipulation der CaMKII mit zwei verschiedenen Inhibitoren und einer spezifische siRNA, um einen CaMKII-Knockdown-Phänotyp zu erzeugen. Alle Substanzen wurden über den medialen Ocellartrakt injiziert, um zu gewährleisten, dass sie den Pilzkörper erreichen. Anschließend wurde eine klassische olfaktorische Konditionierung durchgeführt, die ein stabiles Langzeitgedächtnis induziert. Alle Bienen zeigten ein normales Lernverhalten, Kurzzeitgedächtnis und Mittelzeitgedächtnis (eine Stunde Speicherung) waren intakt. Jedoch war in allen Fällen das Langzeitgedächtnis beschädigt (24 und 72 Stunden Speicherung). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CaMKII in den Pilzkörpern essentiell für das Auslösen von frühen und späten Formen des Langzeitgedächtnisses der Biene ist. Die neuronalen und molekularen Grundlagen des Langzeitgedächtnis sind der Schlüssel, um höhere Gehirnfunktionen und phänotypische Plastizität zu verstehen. CaMKII könnte ein wichtiger Vermittler sein, um strukturelle und neuronale synaptische Änderungen im Netzwerk des Pilzkörpers auszulösen. KW - Biene KW - honeybee KW - learning and memory KW - division of labor KW - Lernen KW - Molekularbiologie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115527 ER - TY - THES A1 - Kober, Christina T1 - Characterization of Murine GL261 Glioma Models for Oncolytic Vaccinia Virus Therapy T1 - Charakterisierung onkolytischer Vaccinia Virus Therapie in murinen Gliommodellen N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most frequent and malignant forms of brain cancer in adults. The prognosis is poor with a median survival time of 12-15 months. There is a broad range of alternative treatment options studied in preclinical and clinical trials for GBM. One alternative treatment option is oncolytic virotherapy, defined as the use of replication‐competent viruses that selectively infect and destroy cancer cells while leaving, non‐transformed cells unharmed. Vaccinia virus (VACV) is one favorable candidate. Although oncolytic viruses can kill tumor cells grown in vitro with high efficiency, they often exhibit reduced replication capacity in vivo suggesting that physiological aspects of the tumor microenvironment decrease the virus’ therapeutic potential. The percentage and composition of immune cells varies between cancer types and patients and is investigated as a biomarker in several studies. Making oncolytic virotherapy successful for GBM, it is necessary to understand the individual tumor biology, the interaction with the microenvironment and immune system. It was demonstrated that the attenuated VACV wild-type (wt) isolate LIVP 1.1.1 replicate and lyse the murine GL261 glioma cell line in vitro. In the following, the replication efficacy was characterized in a comparative approach in vivo. Immunocompetent C57BL/6 (wt) mice and immunodeficient mouse strains of different genetic background C57BL/6 athymic and Balb/c athymic mice were used. In addition, subcutaneous and intracranial locations were compared. The results revealed viral replication exclusively in Balb/c athymic mice with subcutaneous tumors but in none of the other models. In the following, the tumor microenvironment of the subcutaneous tumor models at the time of infection was performed. The study showed that implantation of the same tumor cells in different mouse strains resulted in a different tumor microenvironment with a distinct composition of immune cells. Highest differences were detected between immunodeficient and immunocompetent mice. The study showed major differences in the expression of MHCII with strongest expression in C57BL/6 wt and weakest in Balb/c athymic tumors. In the following, the influence of the phenotypic change associated with the upregulation of MHCII on GL261 tumor cells on viral replication was analyzed. Comparison of C57BL/6 wt and C57BL/6 IFN-γ knockout mice revealed endogenous IFN-γ levels to upregulate MHCII on GL261 tumor cells and to reduce viral replication in C57BL/6 wt mice. Analysis of single cell suspensions of tumor homogenates of C57BL/6 and Balb/c athymic mice showed that the IFN-γ-mediated anti-tumor effect was a reversible effect. Furthermore, reasons for inhibition of virus replication in orthotopic glioma models were elucidated. By immunohistochemical analysis it was shown that intratumoral amounts of Iba1+ microglia and GFAP+ astrocytes in Gl261 gliomas was independent from intratumoral VACV injection. Based on these findings virus infection in glioma, microglia and astrocytes was compared and analyzed in cell culture. In contrast to the GL261 glioma cells, replication was barely detectable in BV-2 microglia and IMA2.1 astrocytic cells. Co-culture experiments revealed that microglia compete for virus uptake in cell culture. It was further shown that BV-2 cells showed apoptotic characteristics after VACV infection while GL261 cells showed signs of necrotic cell death. Additionally, in BV-2 cells with M1-phenotype a further reduction of viral replication and inhibition of cell lysis was detected. Infection of IMA 2.1 cells was independent of the M1/M2-phenotype. Application of BV-2 microglia with M1-phenotype onto organotypic slice cultures with implanted GL261 tumors resulted in reduced infection of BV-2 cells with LIVP 1.1.1, whereas GL261 cells were significantly infected. Taken together, the analyzed GL261 tumors were imprinted by the immunologic and genetic background in which they grow. The experimental approach applied in this thesis can be used as suitable model which reflects the principles of personalized medicine In an additional project, based on gene expression data and bioinformatic analyses, the biological role and function of the anti-apoptotic factor AVEN was analyzed with regard to oncolytic VACV therapy. Besides a comparison of the replication efficacy of GLV-1h68 and VACV-mediated cell killing of four human tumor cell lines, it was shown that AVEN was expressed in all analyzed cells. Further, shown for HT-29 and 1936-MEL, the knockdown of AVEN by siRNA in cell culture resulted in an increase of apoptotic characteristics and a decrease of VACV infection. These findings provide essential insights for future virus development. N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) ist einer der häufigsten und bösartigsten Hirntumoren im Erwachsenenalter. Die Prognose für GBM ist mit einer Überlebenszeit von 12-15 Monaten sehr schlecht. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit stellt die onkolytische Virustherapie dar. Ein vielversprechender Kandidat ist das Vaccinia-Virus. Die große Diskrepanz zwischen der onkolytischen Effektivität in Zellkultur und den Ergebnissen im Mausmodell ist oftmals auf physiologische Komponenten im Tumor-Mikromilieu zurückzuführen. Die Zusammensetzung von Immunzellen im Mikromilieu variiert zwischen verschiedenen Krebsarten und Patienten und wird als Biomarker angewendet. Um eine erfolgreiche Virustherapie für GBM zu etablieren, wird ein umfangreiches Verständnis der Tumorbiologie, des Tumormikromilieus und des Immunsystems vorausgesetzt. Es wurde gezeigt, dass LIVP 1.1.1, ein attenuiertes wildtypisches VACV-Isolat, in der murinen GL261 Gliom-Zelllinie repliziert und zum Absterben der Zellen führt. Daraufhin wurde die Replikationseffizienz von LIVP 1.1.1 durch einen vergleichenden Ansatz in murinen GL261-Gliomen im Mausmodell untersucht. Es wurden immunkompetente C57BL/6-wildtypische (wt) Mäuse und immundefiziente Mausstämme mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund, C57BL/6 athymisch und Balb/c athymisch, verwendet. Zudem wurden unterschiedliche Tumor-Lokalisationen, subkutan und intrakranial analysiert. Ausschließlich im subkutanen Tumormodell der Balb/c athymischen Mäuse fand eine effektive Replikation der Viren statt. Eine detaillierte Charakterisierung des Mikromilieus zum Zeitpunkt der Infektion zeigte, dass die Implantation derselben Tumorzellen in unterschiedliche Mausstämme zur Entwicklung eines unterschiedlichen Tumormikromilieus und einer variierenden Zusammensetzung von Immunzellen führt. Die C57BL/6-wt-Mäuse wiesen eine starke proinflammatorische Signatur auf. Des Weiteren zeigte die Studie signifikante Unterschiede in der MHCII-Expression: Die prominenteste Expression wurde in C57BL/6-wt-Mäusen detektiert. Im weiteren Verlauf wurde analysiert, wodurch die phänotypischen Veränderungen in den GL261-Zellen, verbunden mit der Hochregulierung von MHCII ausgelöst wurden und welche Konsequenzen dies für die virale Infektion dieser Zellen hat. Durch einen direkten Vergleich von C57BL/6-wt-Mäusen und C57BL/6-IFN-γ-Knockout Mäusen konnte IFN-γ als verantwortlicher Faktor im Tumormikromilieu identifiziert werden, welcher für die Reduktion des Virustiters und für die Hochregulierung von MHCII in den C57BL/6-wt-Mäusen verantwortlich ist. Der durch endogenes IFN-γ ausgelöste anti-virale Effekt war reversibel. Des Weiteren wurden Gründe für die Hemmung der viralen Replikation in den orthotopen Gliom-Modellen aufgeklärt. Durch immunhistochemische Analysen von Mikroglia und Astrozyten konnte gezeigt werden, dass die intratumorale Menge und Verteilung der Gliazellen in diesen Tumoren unabhängig von der Virus-Applikation war. Gliomzellen, Mikroglia und Astrozyten, wurden daraufhin untersucht. Im Vergleich zur starken Replikation in GL261-Zellen, ließen BV-2-Mikroglia und IMA 2.1-Astrozyten, nur eine sehr schwache Replikation von LIVP 1.1.1 zu. Ko-Kultivierungsversuche wiesen darauf hin, dass Mikroglia um die Aufnahme der Viruspartikel mit den Tumorzellen konkurrieren. Es wurde gezeigt, dass das LIVP 1.1.1 unterschiedliche Eigenschaften des Zelltods in den Zellen auslösen kann. BV-2 wiesen verstärkte Charakteristika der Apoptose auf während in GL261-Zellen nekrotische Eigenschaften überwogen. In BV-2-Zellen mit M1-Phänotyp wurde eine weitere Reduktion der viralen Infektion festgestellt. Die Infektion von IMA-2.1-Zellen war unabhängig vom induzierten M1/M2 Phänotyp. Die Applikation von BV-2-Zellen mit M1-Phänotyp auf organotypische Schnittkulturen mit implantierten GL261-Tumoren resultierte in einer reduzierten Infektion der BV-2-Zellen und einer verstärkten Infektion der GL261-Zellen. Es wurde gezeigt, dass GL261-Tumore durch den immunologischen und genetischen Hintergrund der Umgebung geprägt wurden. Es wurde ein Modell entwickelt, welches das Prinzip der personalisierten Medizin widerspiegelt. In einem zusätzlichen Projekt wurde, basierend auf Genexpressionsdaten und bioinformatischer Auswertung, die biologische Funktion des anti-apoptotischen Faktors AVEN hinsichtlich der onkolytischen Virustherapie mit dem VACV GLV-1h68 analysiert. Für diese Studie wurden vier humane Zelllinien untersucht. Neben einem Vergleich der Replikationseffizienz des VACV GLV-1h68 und der VACV-vermittelten Zelllyse wurde gezeigt, dass AVEN, in allen untersuchten Zellen exprimiert wird. Am Beispiel von HT-29 und 1936-MEL wurde gezeigt, dass die Herunterregulierung von AVEN durch siRNA zu einer Erhöhung der apoptotischen Eigenschaften und Abnahme der VACV Infektion führt. Die Ergebnisse liefern wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung zukünftiger genetisch veränderter VACV. KW - Krebs KW - Vaccinia-Virus KW - Glioblastom KW - Onkolytische Vaccinia Virustherapie KW - Mikroglia KW - Astrozyten KW - Oncolytic Vaccinia Virus Therapy Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118556 ER - TY - THES A1 - Kuhn [geb. Bach], Julia Elisa T1 - Design und Etablierung von Next Generation Sequencing-Methoden zur Diagnostik verschiedener Erbkrankheiten T1 - Design and establishment of next-generation sequencing methods for diagnostics of different hereditary diseases N2 - Innerhalb des letzten Jahrzehnts entstanden zahlreiche neue Anreicherungs- und Sequenzier-technologien der zweiten (und dritten) Generation, die in rasantem Tempo weiterentwickelt und schon jetzt in vielen Bereichen als neuer Goldstandard für molekulargenetische For-schung und Diagnostik angesehen werden. Als Hochdurchsatz-Verfahren ermöglichen diese Next Generation Sequencing-Methoden (NGS) in immer kürzerer Zeit die parallele Analyse zahlreicher Proben und immer größerer Zielregionen bis hin zum ganzen Genom und führten in der Humangenetik dadurch zu Forschungsansätzen in neuen Dimensionen. In dieser Doktorarbeit, die im molekulargenetischen Diagnostik-Labor der Humangenetik Würzburg durchgeführt wurde, wurden in fünf Projekten NGS-Ansätze unterschiedlicher Stufen bzw. Größenordnungen für verschiedene erblich bedingte Erkrankungen konzipiert und etabliert und in Forschungsprojekten sowie der Routinediagnostik eingesetzt. Dabei wurden verschiedene Methoden zur Anreicherung der Zielsequenzen und zur NGS-Sequenzierung erprobt und auf ihre Effizienz beurteilt. Die Ergebnisse des NGS und darauf basierender Nachweis-Experimente wurden in sieben Veröffentlichungen dokumentiert, auf denen diese Dissertation aufbaut. In den drei ersten Projekten wurden das Access Array-System (Fluidigm) zur Anreicherung der Zielsequenzen und der GS Junior (Roche) zur Erzeugung der Sequenzen verwendet. In Projekt 1 wurde COL4A6 als neues Kandidatengen für nicht-syndromale Hörstörungen identifiziert. Um mögliche weitere Mutationsträger zu detektieren, wurde erfolgreich ein kleiner NGS-Ansatz für das zügige Screening dieses Gens bei knapp 100 weiteren Patienten etabliert. Diese und weitere Ergebnisse bestätigten die Kausalität der COL4A6-Mutation eines Index-Patienten mit schwerer, X-chromosomal-rezessiver Hörstörung. Ein geeigneter NGS-Ansatz für die Analyse des großen RYR1-Gens wurde in Projekt 2 ge-sucht. Der erste Ansatz mit Access Array-System und GS Junior führte zwar bei 39 von 87 Patienten mit Maligner Hyperthermie und/oder Central Core Disease zu dem Auffinden einer (potentiell) pathogenen Variante, allerdings mit hohen Ausfallquoten. Mit der zweiten Methode (Anreicherung: SureSelect-System custom design, Agilent; Sequenzierung: HiSeq, Illumina) wurden neben RYR1 noch 63 weitere Gene analysiert, was zu deutlich besseren Ergebnissen und vier Mutationsfunden führte. Projekt 3 beinhaltete die Etablierung zwei kleiner Panels für Muskelkrankheiten. Ein Panel für drei Gene für Gliedergürteldystrophien wurde sogar erfolgreich in die akkreditierte Rou-tinediagnostik übernommen. Mit dem zweiten Panel für acht Kandidatengene myofibrillärer Myopathien (MFM) wurde u.a. eine neue Mutation im BAG3-Gen identifiziert. Das Exom eines MFM-Patienten wurde in Projekt 4 nach Anreicherung mit dem SureSelect-System (Agilent) auf dem HiSeq (Illumina) sequenziert. Nach Auswertung und Beurteilung der identifizierten Varianten wurde ein neuer Erbgang für Myotilinopathien entdeckt. Verschiedene Nachweisexperimente bestätigten die Kausalität der Mutation im Myotilin-Gen. In Projekt 5 wurde die komplette genomische Sequenz des F8-Gens nach tiefen intronischen Mutationen bei Hämophilie-Patienten abgesucht (Anreicherung SureSelect custom design, Agilent; Sequenzierung MiSeq, Illumina). Bei jedem der analysierten Patienten konnte min-destens eine verdächtige Variante identifiziert werden, die zu verändertem Spleißverhalten führen könnte. Drei Mutationen waren schon durch Publikationen bekannt, bei einer weite-ren konnten in vitro-Spleißanalysen die Kausalität bestätigen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die zur Verfügung stehenden Methoden zur An-reicherung von Zielsequenzen aus dem menschlichen Genom und zu deren Sequenzierung je nach Komplexität der Fragestellung, d.h. der Anzahl und Größe der Gene sowie der Anzahl der zu untersuchenden Proben, sinnvoll und effizient kombiniert werden können. Im Verlauf der Arbeit haben sich die NGS-Techniken rasant weiterentwickelt. So sind PCR-basierte Ansätze zur Anreicherung der Zielsequenzen für die meisten Anwendungen von hybridisierungs-basierten Methoden verdrängt worden. Von den ursprünglich drei konkur-rierenden Verfahren zur Hochdurchsatzsequenzierung hat sich die Methode des „sequen-cing-by-synthesis“ (Illumina) weitgehend durchgesetzt. Diese Entwicklung spiegelt sich auch in den während dieser Arbeit erhobenen Daten wider. N2 - Several enrichment and sequencing technologies of the second (and third) generation have been developed in the past decade, were rapidly refined and are already considered as new state of the art method in several fields of molecular genetic research and diagnostics. Con-sidered as high-throughput technologies, these next-generation sequencing methods (NGS) allow the parallel analysis of several samples and regions of interests up to whole genomes in decreasing time and thus permitted research projects with novel dimensions in human genetics. This doctoral thesis was performed at the molecular genetic laboratory at the Department of Human Genetics in Würzburg. In five projects, NGS approaches of variable scale and for different hereditary diseases were designed, established and applied in research and routine diagnostics. Different methods for target enrichment and NGS analysis were tested and evaluated concerning their efficiency. The results of NGS and subsequent verification ex-periments were documented in seven publications forming the basis of this dissertation. In project 1 - 3, the Access Array system (Fluidigm) was used for target enrichment and the GS Junior (Roche) for sequence generation. COL4A6 has been identified as novel candidate gene for non-syndromic hereditary hearing loss in project 1. A small NGS approach was established to screen this gene in approx. 100 patients with hearing loss in order to search for additional carriers of COL4A6 mutations. The results of this and further experiments confirmed the causality of the COL4A6 mutation found in the index patient with severe X-linked hearing loss. Project 2 aimed at finding a convenient NGS method for the analysis of the large RYR1 gene. A first approach with the Access Array system and the GS Junior lead to the identifi-cation of a (potential) pathogenic mutation in 39 out of 87 patients with malignant hyper-thermia and / or central core disease, but with high failure rates. RYR1 and 63 further genes were then analyzed in a second approach (target enrichment with SureSelect custom design, Agilent; sequence analysis on a HiSeq, Illumina) providing considerably improved results and the identification of four mutations in five patients. Two small panels for muscular diseases were established in project 3. A panel for three genes associated with limb-girdle muscular dystrophies were even successfully applied in accredited routine diagnostics. A novel mutation in the BAG3 gene could be identified using the second panel established for eight candidate genes of myofibrillar myopathies (MFMs). The exome of a patient with MFM was analyzed in project 4 after target enrichment with the SureSelect system (Agilent) and sequence analysis on a HiSeq (Illumina). A novel in-heritance pattern of myotilinopathy was identified after analysis and evaluation of the de-tected variants. Several experiments confirmed the causality of the mutation in the myotilin gene. In project 5, the whole genomic sequence of the F8 gene was analyzed for deep intronic mutations in haemophilic patients (target enrichment with SureSelect custom design, Ag-ilent; sequence analysis on a MiSeq, Illumina). In each of the patients at least one conspicu-ous variant was identified probably leading to alternative splicing. Three mutations were known by publications and for another one causality could be proven by an in vitro splicing assay. The results of this doctoral thesis show that the available methods for target enrichment and sequence analysis of specific targets of the human genome can be combined in a reasonable and efficient way considering the number and size of the targeted genes and probes. During the course of this doctoral thesis, NGS technologies have been further developed in a rapid way. For most applications, PCR-based technologies for target enrichment have been dis-placed by hybridization-based methods. Of the originally three competing techniques of high-throughput sequencing the “sequencing-by-synthesis” method (Illumina) has become the widely accepted standard. This development is reflected in the data generated in this doctoral thesis. KW - Diagnostik KW - DNA-Sequenz KW - Erbkrankheit KW - Next Generation Sequencing KW - Mutation KW - Humangenetik Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116854 ER - TY - THES A1 - Schneider, Gudrun T1 - Effects of adjacent habitats and landscape composition on biodiversity in semi-natural grasslands and biological pest control in oilseed rape fields T1 - Effekte von Nachbarhabitaten und der Landschaftkomposition auf die Biodiversität in halb-natürlichen Grasländern und auf die biologische Schädlicngskontrolle in Rapsfeldern N2 - 1) Modern European agricultural landscapes form a patchy mosaic of highly fragmented natural and semi-natural habitat remnants embedded in a matrix of intensively managed agricultural land. In those landscapes many organism frequently cross habitat borders including the crop – non-crop boundary, hereby connecting the biotic interactions of multiple habitat types. Therefore biodiversity and ecosystem functions within habitats are expected to depend on adjacent habitat types and the surrounding landscape matrix. In this thesis the biodiversity of non-crop habitats, and ecosystem services and disservices in crop habitats were studied in the human-dominated agricultural landscape in the district Lower Franconia, Bavaria, Germany. First we examined the effect of adjacent habitat type on species composition, diversity and ecosystem functions in semi-natural calcareous grasslands, a biodiversity-rich habitat of high conservation value (chapter 2 and 3). Second we studied the effect of habitat composition in the landscape on herbivory, biological pest control and yield in oilseed rape fields (chapter 4). 2) We examined the effect of adjacent habitat type on the diversity of carabid beetles in 20 calcareous grasslands using pitfall traps. Half of the grasslands were adjacent to a coniferous forest and half to a cereal crop field. We found different species compositions of carabid beetles depending on adjacent habitat type. In addition calcareous grasslands adjacent to crop fields harboured a higher species richness and activity density but a lower evenness of carabid beetles than calcareous grasslands adjacent to forests. These differences can be explained by the spillover of carabid beetles from the adjacent habitats. After crop harvest carabid beetle activity density in crop fields decreased while in parallel the activity density in the calcareous grasslands adjacent to the crop fields increased, indicating an unidirectional carabid beetle spillover. Our results underline that type and management of adjacent habitats affect community composition and diversity in calcareous grasslands. Therefore nature conservation measures, which focused on the improvement of local habitat quality so far, additionally need to consider adjacent habitat type. 3) In addition to carabid beetle communities we also surveyed predation rates of ground-dwelling predators on the same calcareous grasslands in two study periods (June and late August). As ground-dwelling predators of forests or crop fields can move into adjacent calcareous grasslands we expected different predation rates depending on adjacent habitat type. We exposed in total 32.000 lady bird eggs as prey items on the calcareous grasslands in distances of 5 and 20m from the habitat border. We found higher predation rates on calcareous grasslands adjacent to forests than on calcareous grasslands adjacent to crop fields, but only on cool days. On warm days a very high extent (often 100%) of the exposed prey items were consumed adjacent to both habitat types, which did not allow the detection of possible differences between the adjacent habitat types. Predation rates differed not between the two study periods or the two distances to the habitat edge. The higher predation rates adjacent to forests can be explained by the spillover of ground-dwelling predators from forests into calcareous grasslands. Our results show, that spillover into semi-natural habitats affects ecosystem functioning in addition to species composition and diversity. 4) In chapter 4 of this thesis we examined the effect of spatiotemporal changes in crop cover on pest - natural enemy interactions and crop yields. During two study years we surveyed the abundance of adult and larval pollen beetles, parasitism of pollen beetle larvae by a hymenopteran parasitoid and oilseed rape yields of 36 oilseed rape fields. The surrounding landscape of the fields (1 km radius) differed in the oilseed rape proportion and in the inter-annual change in the oilseed rape proportion since the previous year. We found a dilution effect, i.e. a decreasing abundance with increasing oilseed rape proportions, for pollen beetle larvae and parasitoids in both study years and for adult pollen beetles in one study year. Oilseed rape yields increased with increasing oilseed rape proportions. Inter-annual changes in oilseed rape proportions led to inter-annual crowding and dilution effects for pollen beetles, but had no effect on parasitism or yield. Our results indicate the potential to reduce pest loads and increase yields in intensively managed oilseed rape fields by a coordinated management of the spatiotemporal oilseed rape cover in the landscape. 5) In summary, we showed in this thesis that the biodiversity and functioning of crop and non-crop habitats within agricultural landscapes is affected by the spillover of organisms and thus by the habitat composition in the close surrounding and in the broader landscape context. Spillover affects also ecosystem services and disservices and therefore crop productivity. Thereby the spatial and temporal variation of specific crop types in the landscape can be of particular importance for crop yields. Thus a coordinated landscape wide management can help to optimize both biodiversity conservation and the delivery of ecosystem services and thus crop yields. Future studies integrating landscape effects across several ecosystem functions, multiple taxonomic groups and different crop types are necessary to develop definite landscape management schemes. N2 - 1) Heutige europäische Agrarlandschaften bestehen aus einem Mosaik stark fragmentierter natürlicher und halbnatürlicher Habitate, die in eine Matrix aus intensiv bewirtschafteten Agrarflächen eingebettet sind. In solchen Landschaften überqueren Organismen häufig Habitatgrenzen, einschließlich der Grenze zwischen Agrar- und Nichtagrarhabitaten. Dabei verknüpfen sie die biotischen Interaktionen der verschiedenen Habitate miteinander. Deshalb ist zu erwarten, dass die Diversität und die Ökosystemfunktionen in Habitaten auch von den Nachbarhabitaten und der umgebenden Landschaft beeinflusst werden. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die Diversität halbnatürlicher Habitate sowie die Ökosystemdienstleistungen in Agrarhabitaten im Bezirk Unterfranken in Bayern, Deutschland. Zum einen untersuchten wir den Einfluss von zwei verschiedenen Nachbarhabitattypen auf die Artenzusammensetzung, die Diversität und die Ökosystemfunktionen in halbnatürlichen Kalkmagerrasen, einem sehr artenreichen Habitat mit hohem Naturschutzwert (Kapitel 2 und 3). Zum anderen untersuchten wir den Einfluss der Habitatzusammensetzung in der Landschaft auf die Herbivorie, die biologische Schädlingskontrolle und den Ertrag in Rapsfeldern (Kapitel 4). 2) Mit Hilfe von Barberfallen untersuchten wir den Einfluss von zwei benachbarten Habitattypen auf die Diversität von Laufkäfern in 20 Kalkmagerrasen. Die Hälfte der Kalkmagerrasen grenzte an einen Nadelwald, die andere Hälfte an einen Getreideacker. Wir fanden unterschiedliche Artenzusammensetzungen der Laufkäfer in Abhängigkeit vom Nachbarhabitat. Außerdem fanden wir auf den Kalkmagerrasen neben Getreideäckern einen höheren Artenreichtum und eine höhere Aktivitätsdichte sowie eine geringere Evenness der Laufkäfer als auf den Kalkmagerrasen neben Nadelwäldern. Diese Unterschiede können durch den spillover von Laufkäfern aus den zwei unterschiedlichen Nachbarhabitaten erklärt werden. Nach der Getreideernte sank die Aktivitätsdichte der Laufkäfer auf den Getreideäckern und stieg parallel in den benachbarten Kalkmagerrasen an. Das weist auf einen einseitig gerichteten Spillover der Laufkäfer vom Acker auf die Kalkmagerrasen nach der Getreideernte hin. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl der Habitattyp als auch das Management benachbarter Habitate die Artenzusammensetzung und die Diversität auf Kalkmagerrasen beeinflusst. Daher sollten Naturschutzmaßnahmen, welche sich bisher nur auf die Verbesserung der lokalen Habitatqualität konzentrierten, zusätzlich den Habitattyp und das Management benachbarter Habitate berücksichtigen. 3) Neben der Zusammensetzung der Laufkäfergemeinschaften untersuchten wir auf den gleichen Kalkmagerrasen die Prädationsraten von auf dem Boden lebenden Prädatoren in zwei Untersuchungszeiträumen (Juni und Ende August). Da Prädatoren benachbarter Wälder oder Äcker auch in Kalkmagerrasen eindringen können, erwarteten wir unterschiedliche Prädationsraten in Abhängigkeit vom Nachbarhabitat. Wir brachten insgesamt 32.000 Marienkäfereier als Beute auf den Kalkmagerrasen aus. Die Eier wurden in Distanzen von 5 m und 20 m zur Habitatgrenze exponiert. Wir fanden höhere Prädationsraten auf den Kalkmagerrasen neben Wäldern als auf denen neben Äckern, allerdings nur an kühlen Tagen. An warmen Tagen wurden die exponierten Eier neben beiden Nachbarhabitaten zu sehr hohen Anteilen (oft zu 100%) konsumiert, was es nicht ermöglichte potentielle Unterschiede zwischen den beiden Nachbarhabitattypen zu ermitteln. Wir fanden keine Unterschiede in den Prädationsraten zwischen den beiden Untersuchungszeiträumen oder zwischen den zwei Distanzen zur Habitatgrenze. Die höheren Prädationsraten auf Kalkmagerrasen neben Wäldern an kühlen Tagen können durch den spillover von am Boden lebenden Prädatoren aus den Wäldern in die Kalkmagerrasen erklärt werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Spillover in halbnatürliche Habitate neben der Zusammensetzung der Lebensgemeinschaft auch Ökosystemfunktionen beeinflussen kann. 4) In Kapitel 4 dieser Arbeit untersuchten wir den Einfluss von räumlichen und zeitlichen Änderungen in der Rapsanbaufläche auf die Interaktionen zwischen Schädlingen und natürlichen Gegenspielern sowie auf Erträge. Dazu untersuchten wir in zwei Jahren auf insgesamt 36 Rapsfeldern die Abundanz adulter und larvaler Rapsglanzkäfer, Parasitierungsraten von Rapsglanzkäferlarven durch eine Schlupfwespe und Rapserträge. Die Landschaften im 1km Radius um die Rapsfelder unterschieden sich im Rapsanteil und in der Änderung des Rapsanteils seit dem Vorjahr. Wir fanden Verdünnungseffekte, d.h. eine sinkende Abundanz mit zunehmendem Rapsanteil, für Rapsglanzkäferlarven und Parasitoide in beiden Untersuchungsjahren und für adulte Rapsglanzkäfer in einem Untersuchungsjahr. Rapserträge stiegen mit höheren Rapsanteilen in der Landschaft. Eine Vergrößerung des Rapsanteils seit dem Vorjahr führte zu einer Verdünnung der Rapsglanzkäferpopulationen auf der vergrößerten Rapsfläche und eine Verringerung des Rapsanteils zur Konzentration auf der verkleinerten Rapsfläche. Die zeitliche Änderung des Rapsanteils hatte aber keinen Einfluss auf die Parasitierungsrate oder den Ertrag. Unsere Ergebnisse unterstreichen das Potential durch Management der räumlichen und zeitlichen Verteilung der Rapsanbaufläche Schädlingsdichten verringern und Rapserträge erhöhen zu können. 5) Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass die Biodiversität und die Funktionen von Agrar- und Nichtagrarhabitaten in Agrarlandschaften durch den Spillover von Organismen und folglich durch die Habitatzusammensetzung in der unmittelbaren und weiteren Umgebung bestimmt werden. Spillover beeinflusst dabei auch Ökosystemdienstleistungen und daher die Produktivität in der Landwirtschaft. Die räumliche und zeitliche Variation der Anbaufläche einzelner Anbaufrüchte hat dabei eine besondere Bedeutung für landwirtschaftliche Erträge. Daher kann ein koordiniertes Landschaftsmanagement helfen, sowohl die Biodiversität in der Landschaft als auch die Produktivität von Agrarhabitaten zu optimieren. Um konkrete Landschaftsmanagementpläne entwickeln zu können, sind weitere Studien, die gleichzeitig mehrere Ökosystemfunktionen, verschiedene taxonomische Gruppen und unterschiedliche Anbaufrüchte untersuchen, nötig. KW - Landschaftsökologie KW - spillover KW - biological pest control KW - oilseed rape KW - calcareous grassland KW - crop harvest KW - community composition KW - landscape ecology KW - ecosystem services KW - Magerrasen KW - Rapsanbau KW - Laufkäfer Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113549 ER - TY - THES A1 - Stangler, Eva T1 - Effects of habitat fragmentation on trap-nesting bees, wasps and their natural enemies in small secondary rainforest fragments in Costa Rica T1 - Die Auswirkungen von Habitatfragmentierung auf nisthilfenbewohnende Bienen, Wespen und deren Gegenspieler in kleinen Sekundärwaldfragmenten in Costa Rica N2 - Summary (English) I. Human induced global change threatens biodiversity and trophic interactions. Fragmentation is considered as one of the major threats to biodiversity and can cause reduced species richness, population declines, loss of genetic diversity and disruption of trophic interactions such as predation and parasitism. However forest fragmentation effects can be eclectic due to species specific traits. Specialist species with narrower niches or at higher trophic levels may be in danger of extinction whereas generalist species with less specific habitat requirements may even profit from fragmentation. In the tropics, known as “the” terrestrial biodiversity hotspots, even biodiversity inventories are often lacking, especially in forest canopies. Ongoing deforestation and resulting fragmentation in tropical regions are expected to heavily affect ecosystem functions by changes in biodiversity, community compositions and disruption of trophic interactions. It is even less unknown in what extent different global change drivers for example climate change and fragmentation interact. It is unlikely that deforestation will end, so that small secondary forest fragments will be important habitat elements that must be investigated to optimize their potential contribution to biodiversity conservation. This dissertation aimed to disentangle the effects of forest fragmentation on trap-nesting bee and wasp communities in small secondary forest fragments addressing the following main questions: 1) Are there interactive effects between microclimate and fragmentation on the abundance of bees and wasps, their mortality - and parasitism rates (Chapter II)? 2) How does fragmentation affect bee biodiversity from canopy to the understory with considerations of single species patterns (Chapter III)? 3) How is fragmentation affecting diversity and community composition of different trophic levels between understory and canopy with emphasis on the host-antagonist relation? (Chapter IV). II. A variety of global change drivers affect biodiversity and trophic interactions. The combined effects of habitat fragmentation and climate change are poorly understood and with ongoing deforestation and agricultural intensification secondary rainforest fragments might contribute to biodiversity conservation and mitigation of climate warming. This chapter investigated the interactive effects of habitat fragmentation and microclimate on the abundance and biotic interactions of trap-nesting bees and wasps in secondary forest fragments in the Northeastern lowlands of Costa Rica. Habitat area did not affect hymenopteran abundance, parasitism and mortality rates, but tree location- from the forest border to the forest center- influenced all variables. Interactive effects were found such as in the higher mortality rates at interior locations in larger fragments. Mean temperature at edge and interior locations led to significant effects on all tested variables and interactive effects between temperature and tree locations were found. Abundances at interior locations were significantly higher with increasing temperatures. Mortality rates at interior location increased at lower mean temperatures, whereas higher temperatures at edges marginally increased mortality rates. Our results indicate, that edge effects, mediated by altered microclimatic conditions, significantly change biotic interactions of trap-nesting hymenopterans in small secondary fragments. III. This chapter focusses on the vertical distribution of bees, their parasitism and mortality rates as well as single species patterns in relation to fragment size and edge effects in secondary rainforest remnants. No size effects on bee abundance, bee diversity and on parasitism- and mortality rates were found. Bees were least abundant at the intermediate height and were most abundant in the understory; whereas the highest diversity was found in the canopy. Tree location had no effect on bee abundance, but on bee diversity since most species were found in the forest interior. The cuckoo bees Aglaomelissa duckei and Coelioxys sp. 1 only partly followed the patterns of their hosts, two Centris species. Edge effects greatly influenced the bee community, so that the amount of edge habitat in secondary forest fragments will influence the conservation value for bees. IV. In this section the effects of habitat fragmentation on biodiversity, on community structure of hosts and natural enemies as well as the relation of hosts and antagonists were investigated from the understory to the canopy. The results stress the importance to monitor biodiversity, community composition and trophic interactions from the understory to the canopy. The higher trophic level of the antagonists was found to be more sensitive to fragment size compared to their hosts. Again edge effects were found to be the dominant driver since both host and antagonist richness, as well as community compositions were strongly affected. Ongoing fragmentation and increased amount of edge habitat could favor few abundant disturbance-adapted species over the rare and more diverse forest-adapted species. A positive-density dependent parasitism rate was demonstrated, as well as an increase of the parasitism rate not only with antagonist abundance but also diversity. Small secondary forest fragments surely can contribute to the conservation of biodiversity and trophic interactions, but increase of edge habitat will have negative consequences on above-ground nesting Hymenoptera, so that important interactions such as pollination, predation and parasitism could be disrupted. Therefore small forest fragments could contribute to biodiversity conservation but will not be able to compensate for the loss of large areas of primary forests. V. This dissertation contributes to the understanding of habitat area - and edge effects as well as the interaction of those with microclimatic conditions in small secondary rainforest fragments. As study system trap nests inhabited by solitary above-ground nesting bees, wasps and their natural enemies were chosen because they allow to study trophic interactions along their whole vertical distribution from the understory to the canopy. The effect of fragment size was rather weak, however, larger sizes affected the diversity of natural enemies positively, proofing the hypothesis that higher trophic levels react more sensitive to habitat loss. Edge effects heavily affected the abundance, diversity and community composition of hosts and their natural enemies as well as parasitism and mortality rates. Increased edge conditions resulting from ongoing fragmentation and deforestation will therefore negatively affect bees, wasps and their trophic interactions with natural enemies. Those changes affect important processes such as pollination, predation and parasitism, which could result in changes of ecosystem functioning. This study showed the importance to include all strata in biodiversity monitoring since height did matter for the trap-nesting communities. Diversity was shown to be higher in the canopy and community composition did change significantly. To conclude we could show that secondary forest fragments can sustain a trap-nesting bee and wasp community, but the amount of interior habitat is highly important for the conservation of forest-adapted species. Probably the conservation of large primary forest in combination with a high habitat connectivity, for example with small secondary forest fragments, will help to sustain biodiversity and ecosystem functioning better than the mere presence of small forest fragments. N2 - Zusammenfassung (German) I. Die weltweite Umweltveränderung, die durch den Menschen verursacht wird, gefährdet die Artenvielfalt und die trophischen Wechselbeziehungen zwischen Organismen. Fragmentierung gilt als eine der Hauptbedrohungen für die Biodiversität und kann weitreichende Konsequenzen haben wie zum Beispiel verminderte Artenvielfalt, Rückgang von Populationen, Verlust von genetischer Diversität und auch die Unterbrechung von trophischen Interaktionen, z.B. Prädation und Parasitierung. In Waldökosystemen können Fragmentierungsauswirkungen vielfältig sein. Spezialisierte Arten mit engen natürlichen Nischen, die zum Beispiel in höheren trophischen Ebenen zu finden sind, könnten vom Aussterben bedroht sein, während generalisierte Arten mit weniger spezifischen Habitatansprüchen sogar profitieren könnten. In den Tropen, „den“ terrestrischen Biodiversitäts-Hotspots, fehlen oft sogar grundlegende Bestandsaufnahmen von Flora und Fauna, insbesondere für die Kronen der Regenwälder. Die fortschreitende Abholzung in tropischen Regionen und die dadurch verursachte Fragmentierung wird die Funktion des Ökosystems durch Veränderung der Artenvielfalt, der Zusammensetzung von Artengemeinschaften und der Unterbrechung von trophischen Interaktionen in hohem Maße beeinflussen. Besonders das Zusammenwirken von verschiedenen Facetten des globalen Umweltwandels, z. B. Klimawandel und Fragmentierung, ist nahezu unbekannt. Da es unwahrscheinlich ist, dass die Abholzung von Regenwäldern eingestellt wird, ist es äußerst wichtig den Wert von kleinen Sekundärwaldfragmenten für den Schutz der Artenvielfalt zu untersuchen. Diese Dissertation trägt dazu bei verschiedene Aspekte der Fragmentierung auf die Artengemeinschaft von nisthilfenbewohnenden Hymenopteren in kleinen Sekundärwaldfragmenten zu untersuchen und behandelt dabei die folgenden zentralen Fragen: 1) Wirken Fragmentierung und mikroklimatische Bedingungen interaktiv auf die Abundanz von Bienen und Wespen sowie deren Mortalitäts- und Parasitierungsraten (2. Kapitel)? 2) Wie beeinflusst Fragmentierung die Artenvielfalt von Bienen vom Unterholz bis zur Krone und wie reagieren einzelne Arten darauf (3. Kapitel)? 3) Wie beeinflusst Fragmentierung die Biodiversität und die Artengemeinschaften verschiedener trophischer Ebenen vom Unterholz bis zum Kronendach unter besonderer Berücksichtigung der Wirts-Antagonist-Beziehung (4. Kapitel)? II. Eine Reihe von Faktoren des weltweiten Umweltwandels beeinflusst die Artenvielfalt und trophische Interaktionen. Die Auswirkungen von Fragmentierung und Klimawandel, die sich gegenseitig beeinflussen könnten, sind nahezu unverstanden. Außerdem könnten Sekundärwaldfragmente zum Erhalt der Artenvielfalt und der Abschwächung der Auswirkungen des Klimawandels sowie der anhaltenden Abholzung und der Intensivierung der Landwirtschaft dienen. Dieser Abschnitt untersucht mögliche Wechselwirkungen zwischen Fragmentierung und Temperatur auf die Abundanz und trophische Interaktionen von nisthilfenbewohnenden Bienen und Wespen in kleinen Sekundärwaldfragmenten im Nordosten Costa Ricas. Die Fragmentgröße hatte keinen Einfluss auf die Abundanz, die Parasitierungs- und Mortalitätsraten der Hymenopteren, während der Baumstandort- vom Waldrand zur Waldmitte immensen Einfluss auf alle untersuchten Variablen hatte. In größeren Fragmenten war die Mortalitätsrate innerhalb des Waldes verglichen mit kleineren Fragmenten höher. Die mittlere Temperatur beeinflusste alle untersuchten Variablen und hatte je nach Standort des Baumes unterschiedliche Auswirkungen. Die Abundanzen im Waldinneren stiegen signifikant mit höheren Temperaturen an. Die Mortalitätsraten im Waldinneren nahmen mit niedrigeren Temperaturen zu, während höhere Temperaturen am Waldrand zu höheren Mortalitätsraten führten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Randeffekte, die auch durch Temperaturunterschiede zustande kommen, biotische Interaktionen von nisthilfenbewohnenden Bienen und Wespen in kleinen Sekundärwaldfragmenten ändern. III. Dieses Kapitel konzentriert sich auf den Einfluss der Fragmentgröße und der Randeffekte auf Bienen und deren Parasitierungs- und Mortalitätsraten vom Unterholz bis zu den Kronendächern in kleinen Sekundärwaldfragmenten. Dabei wurden auch die Muster von einzelnen Arten näher untersucht. Die Fragmentgröße hatte keinen Einfluss auf die Bienenabundanz, die Artenvielfalt oder die Parasitierungs- und Mortalitätsraten. Die höchste Bienenabundanz wies das Unterholz auf, während die höchste Diversität im Kronendach gefunden wurde. Der Gradient vom Waldrand bis zur Waldmitte hatte keinen Einfluss auf die Bienenabundanz, wohingegen die Diversität zum Waldinnern hin anstieg. Die Kuckucksbienen Aglaomelissa duckei und Coelioxys sp. 1 folgten nur zum Teil den Mustern ihrer Wirte, zwei Centris Arten. Randeffekte hatten großen Einfluss auf die Bienengemeinschaften, so dass der Anteil von Waldrändern bzw. die Form der Sekundärwaldfragmente über den Nutzen für die Erhaltung der Bienenvielfalt bestimmt. IV. In diesem Kapitel wurden die Fragmentierungsauswirkungen auf die Biodiversität, die Gemeinschaftszusammensetzung von Wirten und ihrer natürlichen Feinde als auch die Beziehung zwischen den Wirten und ihren natürlichen Feinden vom Unterholz bis zum Kronendach untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass es äußerst wichtig ist die Biodiversität, die Zusammensetzung der Artengemeinschaft als auch die trophischen Interaktionen in den verschiedenen Straten des Regenwaldes zu untersuchen. Die natürlichen Feinde, die auf einer höheren trophischen Ebene stehen, reagierten empfindlicher auf die Größe der Fragmente. Randeffekte waren der einflussreichste Faktor, weil die Diversität der Wirte und der natürlichen Feinde, sowie deren Artengemeinschaften stark beeinflusst wurden. Fortschreitende Fragmentierung und der damit einhergehende erhöhte Flächenanteil des Randhabitats könnte daher wenige häufige Arten bevorzugen, die gestörtes Habitat tolerieren können, wohingegen die seltenere aber artenreichere Gemeinschaft, die das Waldinnere bevorzugt, benachteiligt wird. Es konnte außerdem eine positiv-dichteabhängige Parasitierungsrate sowie ein positiver Zusammenhang zwischen der Abundanz und Diversität von natürlichen Feinden und der Parasitierungsrate gezeigt werden. Kleine Sekundärwaldfragmente können sicherlich helfen die Artenvielfalt und die trophischen Interaktionen zu erhalten, aber die Erhöhung des Anteils von Randhabitat wird nachteilige Folgen für solitäre Hymenopteren haben. Dies kann zur Unterbrechung von wichtigen Interaktionen wie Bestäubung, Prädation und Parasitierung führen. Kleine Sekundärwaldfragmente können daher zwar hilfreich zur Erhaltung der Biodiversität sein, aber niemals große Primärwaldflächen, die von unschätzbarem Wert sind, ersetzen. V. Die vorliegende Doktorarbeit trägt zum Verständnis der Auswirkungen der Habitatgröße und von Randeffekten als auch deren Wechselwirkungen mit mikroklimatischen Bedingungen in kleinen Sekundärwaldfragmenten bei. Benutzt wurden Nisthilfen, die von solitären Bienen, Wespen und ihren natürlichen Feinden besiedelt werden, da hierdurch auch trophische Interaktionen vom Unterholz bis zum Kronendach aufgenommen werden können. Die Fragmentgröße hatte keine weitreichenden Auswirkungen. Größere Fragmente wiesen allerdings eine höhere Vielfalt von natürlichen Feinden auf, was die Hypothese der höheren Empfindlichkeit von höheren trophischen Ebenen bestätigt. Randeffekte hingegen haben sowohl die Bienen und Wespen als Wirte als auch deren natürliche Feinde in ihrer Häufigkeit, Artenvielfalt und Artenzusammensetzung in hohem Maße beeinflusst. Eine Erhöhung des Anteils von Randhabitaten, die mit fortschreitender Abholzung und Fragmentierung einhergeht, wird daher einen negativen Einfluss auf diese Hymenopteren haben, was sogar die Funktion des Ökosystems beeinflussen könnte, da dadurch auch wichtige Interaktionen, zum Beispiel Bestäubung, Prädation und Parasitierung beeinträchtigt werden. Außerdem konnte diese Doktorarbeit zeigen, dass es unbedingt notwendig ist die Fauna des gesamten Regenwaldes unter Berücksichtigung aller Straten aufzunehmen. Die Artenvielfalt in der Kronenschicht war höher und auch die Zusammensetzung der Artengemeinschaften war signifikant verschieden zwischen dem Unterholz und den Kronendächern. Diese Doktorarbeit zeigt, dass kleine Sekundärwaldfragmente zwar Lebensraum und Ressourcen für eine Gemeinschaft von solitären Bienen, Wespen und deren natürlichen Gegenspielern bieten kann, dass jedoch die Form und damit der Anteil von Innenhabitat ausschlaggebend für den Erhalt von spezialisierten Waldarten ist. Der Erhalt von großen Flächen von Primärwald ist daher unabdingbar, jedoch könnten Sekundärwaldfragmente zur Erhöhung der Vernetzung beitragen, um so ein stabiles, artenreiches und einzigartiges Waldökosystem zu erhalten, was allein durch kleine Sekundärwaldfragmente nicht möglich sein wird. KW - Costa Rica KW - Sekundärwald KW - natural enemies KW - secondary rainforest fragments KW - Hymenoptera KW - Bienen KW - Wespen KW - Nisthilfe KW - Fragmentierung Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108254 ER - TY - THES A1 - Simann, Meike T1 - Aufklärung der Effekte von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 und 2 auf die Adipogenese und Osteogenese von primären humanen Knochenmark-Stroma-Zellen T1 - Elucidation of fibroblast growth factor 1 and 2 effects on the adipogenesis and osteogenesis of primary human bone marrow stromal cells N2 - Regulating and reverting the adipo-osteogenic lineage decision of trabecular human bone marrow stromal cells (hBMSCs) represents a promising approach for osteoporosis therapy and prevention. Fibroblast growth factor 1 (FGF1) and its subfamily member FGF2 were scored as lead candidates to exercise control over lineage switching processes (conversion) in favor of osteogenesis previously. However, their impact on differentiation events is controversially discussed in literature. Hence, the present study aimed to investigate the effects of these FGFs on the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion of primary hBMSCs. Moreover, involved downstream signaling mechanisms should be elucidated and, finally, the results should be evaluated with regard to the possible therapeutic approach. This study clearly revealed that culture in the presence of FGF1 strongly prevented the adipogenic differentiation of hBMSCs as well as the adipogenic conversion of pre-differentiated osteoblastic cells. Lipid droplet formation was completely inhibited by a concentration of 25 ng/µL. Meanwhile, the expression of genetic markers for adipogenic initiation, peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARg2) and CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPa), as well as subsequent adipocyte maturation, fatty acid binding protein 4 (FABP4) and lipoprotein lipase (LPL), were significantly downregulated. Yet, the genetic markers of osteogenic commitment and differentiation were not upregulated during adipogenic differentiation and conversion under FGF supplementation, not supporting an event of osteogenic lineage switching. Moreover, when examining the effects on the osteogenic differentiation of hBMSCs and the osteogenic conversion of pre-differentiated adipocytic cells, culture in the presence of FGF1 markedly decreased extracellular matrix (ECM) mineralization. Additionally, the gene expression of the osteogenic marker alkaline phosphatase (ALP) was significantly reduced and ALP enzyme activity was decreased. Furthermore, genetic markers of osteogenic commitment, like the master regulator runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4), as well as markers of osteogenic differentiation and ECM formation, like collagen 1 A1 (COL1A1) and integrin-binding sialoprotein (IBSP), were downregulated. In contrast, genes known to inhibit ECM mineralization, like ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator (ANKH) and osteopontin (OPN), were upregulated. ANKH inhibition revealed that its transcriptional elevation was not crucial for the reduced matrix mineralization, perhaps due to decreased expression of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1) that likely annulled ANKH upregulation. Like FGF1, also the culture in the presence of FGF2 displayed a marked anti-adipogenic and anti-osteogenic effect. The FGF receptor 1 (FGFR1) was found to be crucial for mediating the described FGF effects in adipogenic and osteogenic differentiation and conversion. Yet, adipogenic conversion displayed a lower involvement of the FGFR1. For adipogenic differentiation and osteogenic differentiation/conversion, downstream signal transduction involved the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) and the mitogen-activated protein kinase (MAPK)/ERK kinases 1 and 2 (MEK1/2), probably via the phosphorylation of FGFR docking protein FGFR substrate 2a (FRS2a) and its effector Ras/MAPK. The c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38-MAPK, and protein kinase C (PKC) were not crucial for the signal transduction, yet were in part responsible for the rate of adipogenic and/or osteogenic differentiation itself, in line with current literature. Taken together, to the best of our knowledge, our study was the first to describe the strong impact of FGF1 and FGF2 on both the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion processes of primary hBMSCs in parallel. It clearly revealed that although both FGFs were not able to promote the differentiation and lineage switching towards the osteogenic fate, they strongly prevented adipogenic differentiation and lineage switching, which seem to be elevated during osteoporosis. Our findings indicate that FGF1 and FGF2 entrapped hBMSCs in a pre-committed state. In conclusion, these agents could be applied to potently prevent unwanted adipogenesis in vitro. Moreover, our results might aid in unraveling a pharmacological control point to eliminate the increased adipogenic differentiation and conversion as potential cause of adipose tissue accumulation and decreased osteoblastogenesis in bone marrow during aging and especially in osteoporosis. N2 - Die Regulation und Umkehr des adipogenen und osteogenen Commitments von trabekulären humanen Knochenmarks-Stroma Zellen (hBMSCs) stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Prävention und Therapie der Knochenerkrankung Osteoporose dar. Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1) und sein Proteinfamilien-Mitglied FGF2 wurden in einer vorhergehenden Studie als Hauptkandidaten bezüglich der Kontrolle einer Konversion (Schicksalsänderung) von hBMSCs in die osteogene Richtung bewertet. Der Effekt von FGF1 und FGF2 auf die Differenzierung von hBMSCs wird jedoch in der Literatur kontrovers diskutiert. Folglich zielte die aktuelle Studie darauf ab, die Effekte dieser Faktoren auf die adipogene und osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs zu untersuchen. Außerdem sollten die nachgeschalteten Signalmechanismen aufgeklärt und die Ergebnisse abschließend bezüglich des angestrebten Therapieansatzes bewertet werden. Die vorliegende Studie zeigte eindeutig, dass die adipogene Differenzierung von hBMSCs sowie die adipogene Konversion von vordifferenzierten osteoblastischen Zellen durch die Kultur in Gegenwart von FGF1 stark inhibiert wurden. Die typische Bildung von intrazellulären Fetttropfen war bei einer Konzentration von 25 ng/µL vollständig inhibiert, während die Genexpression von frühen und späten adipogenen Markern signifikant herunterreguliert war. Die osteogenen Marker waren jedoch während der adipogenen Differenzierung und Konversion unter FGF-Zugabe nicht hochreguliert, was eine etwaige Schicksalsänderung zugunsten der osteogenen Richtung nicht unterstützte. Bei der Untersuchung der osteogenen Differenzierung von hBMSCs und der osteogenen Konversion von vordifferenzierten adipozytischen Zellen bewirkte die Zugabe von FGF1 zum Differenzierungsmedium eine deutliche Verminderung der Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM). Darüber hinaus war die Genexpression der alkalischen Phosphatase (ALP) signifikant reduziert; außerdem wurde die ALP Enzymaktivität erniedrigt. Sowohl Marker des osteogenen Commitments einschließlich des osteogenen Master-Transkriptionsfaktors RUNX2 (Runt-related transcription factor 2), als auch Marker der weiterführenden osteogenen Differenzierung waren herunterreguliert. Im Kontrast dazu waren Inhibitoren der ECM-Mineralisierung hochreguliert. Die Hochregulation von ANKH (ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator) schien hierbei jedoch keine direkte Auswirkung auf die Reduzierung der Mineralisierung zu haben; seine Wirkung wurde wahrscheinlich durch die Herunterregulation von ENPP1 (Ectonucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase 1) aufgehoben. Wie FGF1 zeigte auch FGF2 eine anti-adipogene und anti-osteogene Wirkung. Der FGF Rezeptor 1 (FGFR1) war für die Weiterleitung der beschriebenen FGF-Effekte entscheidend, wobei die adipogene Konversion eine erniedrigte Beteiligung dieses Rezeptors zeigte. Bei der adipogenen Differenzierung und der osteogenen Differenzierung und Konversion waren die nachgeschalteten Signalwege ERK1/2 (Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2) bzw. MEK1/2 (Mitogenactivated protein kinase (MAPK)/ ERK kinases 1 and 2) involviert, vermutlich über eine Phosphorylierung des FGFR Substrats FRS2a (FGFR substrate 2a) und der Ras/MAP Kinase. Im Gegensatz dazu waren die c-Jun N-terminale Kinase (JNK), die p38-MAP Kinase und die Proteinkinase C (PKC) nicht an der Weiterleitung des FGF-Signals beteiligt. Sie zeigten sich jedoch, in Übereinstimmung mit der aktuellen Literatur, verantwortlich für das Ausmaß der adipogenen bzw. osteogenen Differenzierung selbst. Zusammenfassend war die vorliegende Studie nach unserem besten Wissen die erste, die den starken Einfluss von FGF1 und FGF2 parallel sowohl auf die adipogene als auch die osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs untersucht hat. Sie zeigte deutlich, dass, obwohl beide FGFs nicht die Differenzierung und Konversion zum osteogenen Zellschicksal hin unterstützen konnten, sie dennoch wirkungsvoll die adipogene Differenzierung und Konversion verhinderten, die während der Osteoporose erhöht zu sein scheinen. Unsere Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass hBMSCs durch FGF1 und FGF2 in einem Stadium vor dem Schicksals-Commitment festgehalten werden. Folglich könnten diese Proteine verwendet werden, um eine ungewollte Adipogenese in vitro zu verhindern. Außerdem könnten unsere Ergebnisse helfen, einen pharmakologischen Kontrollpunkt zur Eliminierung der gesteigerten adipogenen Differenzierung und Konversion aufzudecken, welche potentielle Gründe für die Fettakkumulation und die reduzierte Osteoblastogenese im Knochenmark während des Alterns und besonders in der Osteoporose sind. KW - Mesenchymzelle KW - Genexpression KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - Osteoporose KW - Fettzelle KW - Bone marrow stromal cell (BMSC) KW - Osteogenesis KW - Adipogenesis KW - Differentiation KW - adipocytes KW - Mesenchymale Stammzelle Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119322 ER - TY - THES A1 - Kuhtz, Juliane T1 - Epimutationen humaner Keimzellen und Infertilität T1 - Epimutations of human germ cells and infertility N2 - Infertilität stellt in unserer heutigen Gesellschaft ein zunehmendes Problem dar. Bei der Suche nach den der Infertilität zugrunde liegenden Ursachen gerät immer mehr die Epigenetik in den Fokus. Epigenetische Prozesse sind nicht nur in die Embryo-nalentwicklung und Wachstumsprozesse des Kindes involviert, sondern auch in korrekte Funktionsweisen von Gameten. Störungen können die Fertilität beeinträch-tigen. Eine besondere Rolle spielen geprägte Gene, die auf einem ihrer Allele, je nach parentaler Herkunft, ein Imprint in Form von DNA-Methylierung tragen. Fehl-regulationen solcher geprägter Gene können zu Imprinting-Erkrankungen führen. Seit Einführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) wurden verschiedene assistierte Re-produktionstechniken (ART) entwickelt, um infertilen Paaren zu helfen. Die Sicher-heit dieser Techniken ist nicht abschließend geklärt. Immer wieder wird von nach ART-Behandlung gehäuft auftretenden Imprinting-Erkrankungen berichtet. Diese Erkrankungen stehen jedoch eher in Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Infertilität, als mit ART selbst. Dennoch ist es notwendig zu untersuchen inwieweit sich ART eventuell auf den Gesundheitszustand dieser Kinder auswirken könnte. In der hier vorgelegten Arbeit wurde der Zusammenhang von Epigenetik, Infertilität und ART von verschiedenen Standpunkten aus beleuchtet. In humanen Spermien wurde die DNA-Methylierung verschiedener geprägter Gene hinsichtlich Epimutationen untersucht. ICSI (intracytoplasmatic sperm injection) und IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) sind verschiedene Techniken zur Selektion von Spermien für eine ART-Behandlung. Hier wurde un-tersucht, ob IMSI epigenetisch bessere Spermien selektiert als die konventionelle ICSI-Methode. Außerdem ist bekannt, dass in Spermienköpfen fertiler und infertiler Männer Vakuolen vorkommen können, deren epigenetische Bedeutung jedoch un-bekannt ist. Ob diese Vakuolen in Zusammenhang mit Epimutationen stehen könn-ten, wurde ebenfalls überprüft. Dazu wurde bisulfitkonvertierte DNA weniger Sper-mien (11 je Probe) mithilfe der Limiting Dilution (LD)–Technik und Pyrosequenzie-rung analysiert. Insgesamt standen 880 Spermien für diese Untersuchung zur Ver-fügung. Es konnte kein Unterschied zwischen IMSI- und ICSI-selektierten Spermien gefunden werden. Vorhandene Vakuolen im Spermienkopf beeinträchtigten nicht die DNA-Methylierung der Gene hGTL2, hLIT1 und hPEG3. Ein weiteres Projekt befasste sich mit der Frage, inwieweit die Technik der In-vitro-Maturation (IVM) DNA-Methylierung in humanen Oocyten beeinflussen könnte. Bisulfitkonvertierte DNA einzelner humaner Oocyten wurde mit LD und Pyrose-quenzierung analysiert. Verglichen wurden IVM und in vivo gereifte Oocyten. Hier-für standen 139 Oocyten zur Verfügung, wovon 90 mittels IVM und 49 in vivo gereift waren. Untersucht wurden vier geprägte Gene (hGTL2, hLIT1, hPEG3 und hSNRPN) und drei nicht geprägte Gene (hDNMT3Lo, hNANOG und hOCT4). Es konnten keine IVM-bedingten Epimutationen gefunden werden. Im dritten Projekt wurde untersucht, ob sich die DNA-Methylierung normaler Sper-mien von Spermien aus Oligozoospermie-Asthenozoospermie-Teratozoospermie (OAT)–Syndrom-Patienten unterscheidet. Eine weitere Frage war, ob Epimutationen einen Einfluss auf den ART-Ausgang haben. Untersucht wurden 54 Spermienpro-ben von Paaren in ART-Behandlung. Zur Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster der geprägten Gene hGTL2 und hPEG3 sowie der beiden nicht geprägten Pluripotenzgene hNANOG und hOCT4 wurde die Methode Deep Bisulfite Sequencing (DBS) verwendet. Dies ist eine Next Generation Sequencing (NGS)–Technik, angewandt an bisulfitkonvertierter DNA. Diese Technik ermöglicht es mehrere Proben sowie Gene gleichzeitig zu analysieren. Es zeigte sich, dass OAT-Spermien, die zu einer Lebendgeburt geführt hatten, sich epigenetisch nicht von normalen Spermien unterschieden. Besonders viele Epimutationen konnten hingegen in OAT-Spermien gefunden werden, die zu keiner Schwangerschaft ge-führt hatten. Zwischen Spermien die zu einer Lebendgeburt oder keiner Schwan-gerschaft geführt hatten, zeigten sich Unterschiede in der Häufigkeit von hGTL2-Epimutationen. Über die Häufigkeit von Epimutationen konnte eine prädiktive Aus-sage zum ART-Ausgang getroffen werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass sich eine Häu-fung von Epimutationen darauf auswirkt, ob eine Schwangerschaft erreicht werden kann oder nicht. Diese Epimutationen liegen bereits im parentalen Genom vor. Sie werden nicht durch ART verursacht. Allerdings muss man Techniken finden, mit denen man Gameten mit möglichst wenig Epimutationen selektiert, um eine Über-tragung solcher auf das Kind zu verhindern. N2 - Infertility is an increasing problem in today’s society. The search for the underlying causes of infertility reveals more and more the role of epigenetics. Epigenetic pro-cesses are involved in embryo development and growth, but also in the proper func-tion of gametes. Disturbances have been shown to impair fertility. Imprinted genes play an important role. They carry a parental-specific DNA methylation imprint on one of their alleles. Deregulation of these genes leads to imprinting diseases. Since the introduction of in vitro fertilisation (IVF), different assisted reproductive technologies (ART) have been developed to treat infertile couples. The safety of these techniques is not finally solved. Increased rates of imprinting diseases in ART offspring have been reported, but seem more likely to be linked to the underlying parental infertility problems than to ART itself. Nevertheless it is of importance to in-vestigate how ART could affect the health of those children. In the work presented here the relations between epigenetics, infertility and ART have been investigated from different points of view. Firstly, the DNA methylation pattern of different imprinted genes has been investi-gated in human sperm with regard to the frequency of epimutations. ICSI (intracyto-plasmatic sperm injection) and IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) are different techniques to select sperm for ART treatment. It was analysed whether IMSI selects epigenetically superior sperm than the conventional ICSI method. Furthermore it is known that sperm from fertile and infertile men can carry vacuoles in their sperm heads. Their epigenetic relevance is unknown. Whether these vacuoles are linked to epimutations has also been investigated here. Bisulfite converted DNA of a few sperm (11 per sample) was analysed using the Limiting Dilution (LD) technique followed by pyrosequencing. In total 880 sperm were available for analysis. No difference between IMSI and ICSI selected sperm was found. Further, no influence of sperm head vacuoles on the DNA methylation patterns of the genes hGTL2, hLIT1 and hPEG3 could be observed. Secondly, it was of interest whether the in vitro maturation (IVM) technique has an influence on DNA methylation in human oocytes. Bisulfite converted DNA of single human oocytes was analysed with LD and pyrosequencing. IVM oocytes were com-pared to in vivo grown oocytes. A total of 139 oocytes were available, of which 90 oocytes were IVM treated while 49 oocytes were grown in vivo. Four imprinted genes (hGTL2, hLIT1, hPEG3 and hSNRPN) and three non-imprinted genes (hDNMT3Lo, hNANOG and hOCT4) were analysed. No IVM-induced epimutations were detected. Finally, it was investigated whether DNA methylation patterns of normal sperm would differ from sperm of oligozoospermia-asthenozoospermia-teratozoospermia (OAT) syndrome patients. Furthermore it was of interest whether epimutations would influence the ART outcome. A total of 54 sperm samples from couples undergoing ART treatment were investigated. To analyse DNA methylation of the imprinted genes hGTL2 and hPEG3 as well as the non-imprinted pluripotency genes hNANOG and hOCT4, Deep Bisulfite Sequencing (DBS) was applied. This is a Next Generation Sequencing (NGS) technique applied on bisulfite converted DNA, al-lowing the analysis of several samples and genes at once. The obtained results showed that OAT samples, which had led to a live-birth, did not differ epigenetically from normal sperm. Much more epimutations were found in OAT sperm which had failed to achieve a pregnancy. Sperm not being able to achieve a pregnancy differed from sperm that had led to a live-birth with regard to hGTL2 epimutation frequency. In addition, ART outcome can be predicted using the frequency of epimutations. Taken together this work shows that the amount of epimutations influences whether a pregnancy can be achieved or not. Epimutations already exist within the parental genome. They are not caused by ART. Nevertheless, one needs to find techniques with which gametes with as few as possible epimutations are being selected to pre-vent the transmission of these onto the offspring. KW - Epigenetik KW - Sterilität KW - Epimutationen KW - geprägte Gene KW - humane Keimzellen KW - Infertilität Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108248 ER - TY - THES A1 - Endt, Daniela T1 - Fanconi Anämie : Entwicklung von hämatopoetischen Mosaiken sowie funktionelle Studien von FANCO (RAD51C) und FANCN (PALB2) T1 - Fanconi Anämie : Development of hematopoetic mosaicism and functional studies of FANCO (RAD51C) and FANCN (PALB2) N2 - Zur Wahrung der Genomstabilität entwickelten sich verschiedene Reparaturmechanismen, deren Defekte zu diversen Erkrankungen führen. Der 1927 erstmals beschriebenen Fanconi Anämie (FA) (Fanconi 1927) liegt eine fehlerhafte Reparatur der DNA-Doppelstrang-Quervernetzung zugrunde. Als Ursache wurden Defekte innerhalb des FA/BRCA-Weges lokalisiert, welche zur Chromosomeninstabilität führen. Das Krankheitsbild der autosomal rezessiven oder X-chromosomalen Erkrankung wird meist von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarkversagen sowie bereits im jugendlichen Alter erhöhten Tumor-raten und Anämien geprägt. Bisher wurden Defekte in 19 verschiedenen Genen als ursächlich für diese Erkrankung diskutiert. Anhand des betroffenen Gens können nur begrenzt Rückschlüsse auf die Ausprä-gung des Phänotyps geschlossen werden, vielmehr scheinen die Art der Mutation und deren Position im Gen mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Im Laufe der Zeit wurden immer mehr Patienten mit mild ausgeprägtem Erkrankungsbild beobachtet. Eine mögliche Erklärung hierfür liefern milde Mutationen, eine weitere das Vorhandensein von Mosaiken blutbildender Zellen. Zu letzterem führt die Reversion einer der beiden Mutationen. Diese Art der „natürlichen Gentherapie“ wurde bei 10-30% der FA-Patienten beobachtet. Um die Entwicklung von Reversionen besser zu verstehen, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit die Untersuchung verschiedener Zelllinien von 5 Patienten im Alter von 11 (Pat. 5) bis 33 (Pat. 4) Jahren. Die FA-A-Patienten 1 und 2 wurden bereits von Gross et al. 2002 als Mosaikpatienten beschrieben. Für die weiteren Patienten führten unterschiedliche Aspekte, wie normale Blutwerte, MMC-tolerante lympho-blastoide Zelllinien und gDNA-Analysen des Blutes zum Mosaikverdacht. Nähere Analysen bestätigten für die FA-D2-Patienten (Pat. 4, 5) ebenfalls das Vorliegen einer Reversion in den Blutzellen. Allen Patienten gemein war die Reversion in Form einer Rückmutation (Pat. 1: c.971T>G, Pat. 2: c.856 C>T, Pat. 4: c.3467-2A>G, Pat. 5: c.3707G>A), welche meist in einem oder in der Nähe eines Mutationsmotives vorlag. Zur Einschätzung des Mosaikstatus in den Patientenblutzellen wurden, neben der meist mehrjährigen Be-obachtung der Blutwerte (Thrombo-, Mono-, Granulo-, Lymphozyten, Hämoglobin), gDNA-, Chromoso-menbruch- und Zellzyklusanalysen durchgeführt. Chromosomenbruchanalysen von Metaphasen der T-Lymphozyten der Patienten 4 und 5 zeigten nach MMC-Behandlung die mosaik-typische bimodale Vertei-lung der Chromosomenbruchraten. Die nur moderat erhöhten Bruchraten in Metaphasen des Patienten 1 sprachen für eine starke Reversion. Zur besseren Abschätzung des Mosaikstatus wurden Zellzyklusanaly-sen an Mischungsreihen aus FA- und nicht FA- Blut durchgeführt. Die Detektionsgrenze für FA-Mosaike lag bei einem Anteil von 30% Zellen mit spontanem/MMC-induziertem G2-Phasen-Arrest. In Anlehnung an Mischungskurven wurden für die vier Patienten Reversionen von 0% (Pat. 4) bis 90-95% (Pat. 2) ange-nommen. Die gDNA-Analyse MACS-sortierter T-/B-Lympho-, Mono- und Granulozyten sowie von Fib-roblasten und lymphoblastoiden Zelllinien ermöglichte einen detaillierten Einblick in die Mosaikstatus auf molekularer Ebene. Wir fanden bei allen Patienten einen unterschiedlich stark ausgeprägten Mosaikstatus ihrer Blutzellreihen. Tendenziell scheinen die Reversionsgrade mit der Zell-Lebensdauer korrelieren, hier-bei zeigen kurzlebige Zellen (Mono-, Granulo-, B-Lymphozyten) höhere Reversionsgrade als langlebige T-Lymphozyten. Das Auftreten von gleichen Reversionen in allen Zelllinien lässt eine Reversion in einer gemeinsamen Vorläuferzelle vermuten. Als Besonderheit fanden wir, unseren Erachtens erstmalig, eine komplette Reversion einer Knochenmark-Fibroblastenzelllinie (Pat. 1). Häufig in Kultur stattfindende Re-versionen in lymphoblastoiden Zelllinien beobachteten wir für alle vier Patienten. Die Mosaikentstehung im Patientenblut konnte mit allen Methoden bestätigt werden. Jede Methode wies Vor- und Nachteile auf. Zur Abschätzung der Mosaikstatus empfiehlt sich deshalb eine Kombination der Methoden. Ein weiteres Projekt beschäftigte sich mit Interaktionen des FANCO (RAD51C) innerhalb der RAD51 Paraloge (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) und mit RAD51. Die Analysen erfolgten im Mammalian Two- und Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Die Untersuchungen bestätigten die meisten der bisher detektierten Interaktionen, welche zur Ausbildung des RAD51C-XRCC3 Komplexes und des, aus den Subkomplexen RAD51B-RAD51C (BC) und RAD51D-XRCC2 (DX2) bestehenden, BCDX2-Komplex führen. Die M3H-Analysen weisen auf eine wichtige Rolle des RAD51B-Proteins bei der Ausprägung dieses Komplexes hin. Es scheint die Ausbildung der RAD51C-RAD51D-Interaktion erst zu ermöglichen und zusätzlich, anders als bisher beobachtet, auch mit XRCC2 zu interagieren. Diese Interaktion wiederum wird durch die Anwesenheit von RAD51D stark gefördert. Unsere M2H-/M3H-Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Ausbildung der Subkomplexe für die Entstehung des BDCX2-Komplexes wichtig ist und dieser vermutlich als Ringstruktur vorliegt. Zusätzlich fanden wir Hinweise auf mögliche Wechselwir-kungen zwischen den BCDX2- und den XRCC3-Komplexproteinen. Aufgrund der Beteiligung der Protei-ne an der Doppelstrangläsionsreparatur wurde die Auswirkung von MMC-induzierten DNA-Schäden un-tersucht. Diese führten innerhalb der Subkomplexe zu gegensätzlichen Änderungen der Interaktionsinten-sität. Während die Substanz im DX2-Komplex zum Sinken der Interaktionsstärke führte, erhöhte sich diese im BC-Komplex. Die in der Literatur beschriebene und charakterisierte RAD51C-FANCN-Interation war im M2H-Test nicht darstellbar. Möglicherweise würde diese jedoch durch die Anwesenheit eines drit-ten Proteins gefördert werden. Zusätzlich wurde ein RAD51C-Protein, welches die Patientenmutation R258H enthielt, überprüft. Es zeigte nur in der M3H-Analyse, mit pMRAD51D und nativem RAD51B, nach Behandlung mit MMC eine reduzierte Interaktionsstärke im Vergleich zum Wildtyp. Dies unter-streicht einmal mehr die als hypomorph beschriebene Mutation des Proteins. Das dritte Projekt, die angestrebte Strukturaufklärung des RAD51C-Proteins erwies sich als schwierig. Eine für eine Kristallisation ausreichende Proteinmenge konnte, weder im E. coli-System noch in Insektenzellen oder in Co-Expression mit seinem Interaktionspartner XRCC3, isoliert und aufgereinigt werden. Elektro-phoretische Mobility Shift Assays des CX3-Proteinkomplexes mit DNA-Strukturen (ssDNA, Open Fork, 3‘-/ 5‘-Überhang-Struktur), zeigten eine Bevorzugung des 3‘-Überhang-DNA-Substrates. Diese Art der Analyse könnte in weiterführenden Analysen zur Abschätzung der Auswirkung von Patientenmutationen herangezogen werden. bb N2 - For maintaining genomic stability several repair mechanisms have evolved. Defects in these mechanisms lead to diverse diseases. One of these Fanconi Anemia (FA), first described in 1927, evoked by deficient mechanism of interstrand crosslinks. As causative reason defects within the FA-BRCA pathway were iden-tified leading to chromosome instability. To date 19 different genes were found to cause Fanconi Anemia. Most commonly for the clinical picture of FA are congenital malformations, progressive bone marrow defects as like an increased tumor rates and anemia at a juvenile age. Knowing the affected gene only lim-ited conclusions could be considered of the phenotypical appearance. More likely the kind of mutation and the affected position within the gene seems to correlate with the severity of the disease. Over the time an elevated number of patients with mild phenotype were observed. One possible explanation may be mild mutations another a mosaic state developed within the blood forming cells. The latter was caused by rever-sion of one of both mutations. This kind of “natural gene therapy” was observed in the blood of 10 up to 30 % FA- patients. To get better insights in to the mosaic development we investigated different cell lines of five patients aged between 11 (pat. 5) and 33 (pat. 4) years. Both FA-A patients (pat. 1, 2) were described as mosaic patients before by Gross et al. 2002. The other patients arouse suspicion for developing mosai-cism by different aspects like normal blood counts, MMC tolerant lymphoblastiode cell lines and analyzing gDNA from blood. Detailed analyses confirmed the reversion of one mutation in blood of the FA-D2 patients (pat. 4, 5). In common for all four mosaic was the kind of reversion, a back mutation (pat. 1: c.971T>G, pat. 2: c.856 C>T, pat. 4: c.3467-2A>G, pat. 5: c.3707G>A) mostly in or near by a mutation motive. To get insights in to the mosaic state of the patients’ blood cells, gDNA, chromosomal breakage and cell cycle analyses were performed and blood cell counts of thrombo-, mono-, granulo-, lymphocytes and haemoglobin were observed for several years. Chromosomal breakage analyses of t-lymphocytes met-aphases (pat. 4, 5) treated with MMC showed a mosaicism typical bimodal distribution. The only moderate increased chromosomal breakage rate in metaphases of patient 1 points out a strong pronounced reversion. For better estimation of the Mosaic state in patient blood we performed cell cycle analysis with mixtures of FA- and non FA-blood. Thereby we observed the border for mosaic detection at a degree of 30 % cells with spontaneous /MMC induced G2-phase arrest. Compared to the mixing study reversion degrees of 0 % (pat. 4) up to 90-95 % (pat. 2) were assumed for four of the patients. At molecular base gDNA analyses of MACS sorted T-/ B- lympho, mono and granulocytes as well as from fibroblasts and lymphoblastoide cell lines allowed a more detailed insight in to the mosaic statuses. In all patients we observed different distinct of mosaic state in their blood cell lines. We observed a tendency of correlation between reversion degree and the longevity of blood cells – cells with short life spans (mono-, granulo-, B-lymphoytes) showed higher reversion degrees than log living T-lymphocytes. The fact that we detected the same rever-sion in the different cell lines of a patient suggests a reversion within a common precursor cell. Further we observed, as we know for the first time, a reversion within a bone marrow fibroblast line (pat. 1). Four of our patients showed commonly observed reversions in cultured lymphoblastoide cell lines. With each of the tested methods we could show mosaic development in blood of our patients. Every of them showed pros and cons. For this reason a combination of the different methods would be recommendable for cal-culation of the mosaic state in patient blood. The second project investigated the interactions of FANCO (RAD51C) within the group of the RAD51 paralogs (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) and with RAD51. Interactions were tested by Mammalian Two- and Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Our investigations confirm most of the up to now detected interactions leading to RAD51C-XRCC3-complex (CX3) and RAD51B-RAD51C-RAD51D-XRCC2 com-plex (BCDX2) formation – latter consisting of the subcomplexes RAD51B-RAD51C (BC) and RAD51D-XRCC2 (DX2). M3H analyses give a hint for the importance of the RAD51B protein for the BCDX2 complex formation. The protein seems to be necessary for RAD51C-RAD51D interaction and also to interact, other than intended before, with XRCC2. In turn this interaction seems to be strongly promoted by RAD51D. In M2H and M3H analyses we found evidence of the importance of subcomplex formation for the formation of the whole BCDX2 complex and that the complex may be a circular structure. Addi-tionaly we observed evidence for interdependency between the BCDX2- and the XRCC3- complex pro-teins. Because of the proteins involvement into the double strand lesion repair the effect of MMC induced DNA lesions were tested. MMC treatment leads to different changes of interaction within the subcom-plexes. We observed a decrease of interaction strength between RAD51D and XRCC2 and an increased interaction within the BC-complex. The interaction between RAD51C and FANCN was not detectable in our M2H assay but may be promoted by another protein in M3H analysis. Additionally we tested a RAD51C protein inherited the patient mutation R258H. Only in M3H analysis with pMRAD51D and native RAD51B and with additional MMC treatment reduced interaction strength was detectable compared to the wildtype RAD51C. This underlines the hypomorphic nature of the mutation described before. The third project – the elucidation of the RAD51C protein structure proved to be difficult. We could not isolate and purify enough protein for crystallization, neither by expression within a E.coli or an insect cell system not even by co-expression of the complex partner XRCC3. Electrophoretic mobility shift assays of the CX3 complex with different DNA-structures (ssDNA, open fork, 3’- and 5’- overhang structures) showed preference for the 3’-overhang DNA substrate. This method may be used for further investiga-tions of mutations in patient DNA in future. KW - Fanconi Anämie KW - Hämatopoese KW - Mosaik KW - Remission KW - Molekulargenetik KW - Fanconi Anämie KW - hämatopoetisches Mosaik KW - Reversion KW - RAD51C KW - FANCO Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127836 ER -