TY - THES A1 - Löwe, Tobias T1 - Untersuchung von gene-drive-Strategien als neue Interventionsstrategien zur Eindämmung der Malaria T1 - A refined genome engineering strategy against parasites and vectors: an application for malaria control N2 - In der vorliegenden Arbeit haben wir unter Nutzung bioinformatischer Methoden eine innovative Strategie zur Eindämmung der Malaria entwickelt. Die genetische Modifikationsstrategie beinhaltet sowohl Manipulationen aufseiten des gefährlichsten Erregers, Plasmodium falciparum, als auch des Hauptvektors, Anopheles gambiae. In den Genomen beider Spezies wurden eine Reihe neuer konkreter targets identifiziert. Auch bereits beschriebene targets und Ansätze wurden in die Strategie einbezogen bzw. weiter ausgestaltet. Bezüglich der Vektormoskitos wird die Verbreitung eines gegenüber Plasmodien resistenten Genotyps angestrebt. Es werden einerseits effiziente natürliche und künstliche Resistenzgene diskutiert und andererseits eine bekannte Strategie zur Fixierung natürlicher Resistenzallele in natürlichen Populationen verbessert. Auf der Seite der Plasmodien erweiterten wir einen bereits von A. Burt (2003) beschriebenen Eradikationsansatz um weitere targets. Aus ethischen und evolutionsbiologischen Erwägungen bevorzugen wir jedoch eine alternative Strategie, welche die Etablierung von in ihrer Virulenz gemilderten Parasiten zum Ziel hat. Der attenuierte Genotyp wird unter anderem durch komplexe Pathway-Remodellierungen beschrieben (Löwe, Sauerborn, Schirmer, Dandekar, A refined genome engineering strategy against parasites and vectors, Manuskript beim Journal „Genome Biology“ eingereicht). Da sich Mutanten in der Natur gegen Wildtyp-Organismen kaum durchsetzen können, werden zwei drive-Systeme beschrieben, welche für die Implementierung der genetischen Manipulationsstrategie entwickelt wurden. Beide Konstrukte wurden zur Patentierung angemeldet (Patentanmeldung U30010 DPMA bzw. Aktenzeichen 102006029354.1). Zusätzlich zur deutschen wurde für eines der beiden Konstrukte eine PCT-Anmeldung eingereicht, welche in Zukunft einen internationalen Patentschutz ermöglichen soll. Es werden Kalkulationen vorgelegt, welche die Verbreitungstendenzen der Konstrukte in natürlichen Populationen vorhersagen. Die Beschreibung der entwickelten Konstrukte beschränkt sich nicht auf das primäre Anwendungsgebiet der Arbeit (Malaria), sondern beinhaltet auch andere Anwendungsgebiete, vor allem im Bereich der Medizin und Molekularbiologie. N2 - Background: Gene drive strategies are an important alternative to control tropical diseases such as malaria. Results: Here we introduce a new gene drive strategy based on gene conversion constructs. We identify a gene drive strategy both for plasmodia and for anopheles including design of an inducible modification vector. Our constructs are based on group II introns or homing endonuclease genes. They include besides the intron to modify vector or parasite genome sites inducible promoters for gene activation. We thus separate gene modification from activation of the modified gene. Moreover, we provide a detailed list of suitable targets in vector and plasmodia for the modification strategy. Finally, we discuss the control effect of an eradication strategy versus a mild strategy of the gene construct for vector and parasite populations. Conclusions: A new eukaryotic vector and parasite control strategy using gene drive systems is presented and discussed. KW - Malaria tropica KW - Malaria KW - Gentechnologie KW - Malariamücke KW - Anopheles gambiae KW - Plasmodium KW - Plasmodium falciparum KW - Containment KW - malaria KW - disease control KW - population engineering KW - siRNA KW - evolution Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28750 ER - TY - THES A1 - Zirkel, Janina T1 - Malaria in Burkina Faso – Chancen für eine neue Strategie mit Hilfe von Methylenblau T1 - Malaria in Burkina Faso - Evaluation of new strategies with methylene blue N2 - Trotz beträchtlicher Anstrengung Malaria zu kontrollieren bzw. zu eradizieren, stellt die Krankheit weiterhin eines der gravierendsten Gesundheitsprobleme unseres Jahrtausends dar. Malaria fordert jährlich zwischen 0,7 und 2,7 Millionen Menschenleben, beeinträchtigt schulische und soziale Entwicklung und hemmt erheblich das Wirtschaftswachstum der betroffenen Länder. In Burkina Faso, einem der ärmsten Länder der Welt, ist Malaria eines der größten Gesundheitsprobleme und ca. ein Drittel aller Todesfälle werden hier Malaria angelastet. Die sich weiter ausbreiteten Resistenzen gegen die gängigen Malariamedikamente machen die Bekämpfung der Malaria zunehmend schwierig. Artemisinin basierende Kombinationstherapien sind aktuell, trotz relativ hoher Therapiekosten und erster Resistenzen, die Erstlinien Behandlung. Effektive und billige neue Kombinationstherapien werden dringend benötigt. In dieser Doktorarbeit wurde das Resistenzpotential von Artemisinin modelliert. Die Homologiemodellierungen unterstützen die These von Krishna und Kollegen von SERCA als einzige Zielstruktur von Artemisinin. Des Weiteren wurde Methylenblau als neues altes Malariamittel evaluiert. Methylenblau ist das erste gegen Malaria eingesetzte Medikament, agiert als ein prooxidatives Agens und inhibiert selektiv und nicht-kompetitiv die P. falciparum Glutathion Reduktase. Die additiven und multiplen Zielprotein Effekte von Methylenblau wurden experimentell untersucht und hier in einem bioinformatischem Modell getestet. Unter dem Einfluss von Methylenblau werden einige Schlüsselenzyme des Redoxstoffwechsels in ihrer Aktivität beeinträchtigt und der Parasit wird verstärkt oxidativem Stress ausgesetzt. Des Weiteren konnte in dieser Dr. Arbeit eine starke Kooperationsbereitschaft der urbanen und ländlichen Bevölkerung an zukünftigen Malaria Projekten gezeigt werden. N2 - Dispite numerous global efforts malaria remains one of the biggest challenges of our millennium. Between 0,7-2,7 million people die from malaria each year. The disease is estimated to be responsible for an annual reduction of economic growth and hampers social und mental development. In Burkina Faso, one of the poorest countries in the world, malaria is the main health challenge and malaria is estimated to be responsible for one third of all death there. The fight against malaria has to cope with more and more resistance. Artemisinin-based combination therapies remain the first line treatment against malaria even when therapy is expensive and resistances are starting to appear. Effective and cheap combination therapies are needed. In this thesis resistance potential of the standard drug Artemisinin was modelled. The structure model data support the results by Krishna and co-workers that this is a principal target for Artemisinins. Furthermore the complementary aspects in order to introduce methylene blue (MB) combination therapies were examined. Methylene blue, the first synthetic drug ever used against malaria, is a subversive substrate and specific inhibitor of P. falciparum glutathione reductase. The additive and multi-target effects of MB are here both modelled and tested regarding redox network attack in the malaria parasite. Under the influence of MB enzyme participating in redox protection are switched of and the parasite is exposed to oxidative stress. Furthermore it could be shown a convincing commitment of rural and urban populations in Burkina Faso to eradicate malaria using a MB combination drug. KW - Methylenblau KW - Malaria KW - Burkina Faso KW - Malaria KW - Burkina Faso KW - methylene blue Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72583 ER - TY - THES A1 - Schaefer, Frauke T1 - Diagnosis and therapy of malaria under the conditions of a developing country - the example of Burkina Faso T1 - Diagnose und Therapie der Malaria unter den Bedingungen eines Entwicklungslandes - das Beispiel Burkina Fasos N2 - Malaria is a challenging infection with increasing and wide-spread treatment failure risk due to resistance. With a estimated death toll of 1-3 Million per year, most cases of Malaria affect children under the age of five years in Sub-Saharan Africa. In this thesis, I analyse the current status of malaria control (focussing on diagnosis and therapy) in Burkina Faso to show how this disease burdens public health in endemic countries and to identify possible approaches to improvement. MB is discussed as a therapeutic option under these circumstances. Burkina Faso is used as a representative example for a country in Sub-Saharan Africa with high endemicity for malaria and is here portrayed, its health system characterised and discussed under socioeconomic aspects. More than half of this country’s population live in absolute poverty. The burden that malaria, especially treatment cost, poses on these people cannot be under-estimated. A retrospective study of case files from the university pediatric hospital in Burkina Faso’s capital, Ouagadougou, shows that the case load is huge, and especially the specific diagnosis of severe malaria is difficult to apply in the hospital’s daily routine. Treatment policy as proposed by WHO is not satisfactorily implemented neither in home treatment nor in health services, as data for pretreatment clearly show. In the face of growing resistance in malaria parasites, pharmacological combination therapies are important. Artemisinins currently are the last resort of malaria therapy. As I show with homology models, even this golden bullet is not beyond resistance development. Inconsidered mass use has rendered other drugs virtually useless before. Artemisinins should thus be protected similar to reserve antibiotics against multi-resistant bacteria. There is accumulating evidence that MB is an effective drug against malaria. Here the biological effects of both MB alone and in combination therapy is explored via modeling and experimental data. Several different lines of MB attack on Plasmodium redox defense were identified by analysis of the network effects. Next, CQ resistance based on Pfmdr1 and PfCRT transporters as well as SP resistance were modeled in silico. Further modeling shows that MB has a favorable synergism on antimalarial network effects with these commonly used antimalarial drugs, given their correct application. Also from the economic point of view MB shows great potential: in terms of production price, it can be compared to CQ, which could help to diminuish the costs of malaria treatment to affordable ranges for those most affected and struk by poverty. Malaria control is feasible, but suboptimal diagnosis and treatment are often hindering the achievment of this goal. In order to achieve malaria control, more effort has to be made to implement better adjusted and available primary treatment strategies for uncomplicated malaria that are highly standardised. Unfortunately, campaigns against malaria are chronically underfinanced. In order to maximize the effect of available funds, a cheap treatment option is most important, especially as pharmaceuticals represent the biggest single matter of expense in the fight against malaria. N2 - Malaria ist eine Krankheit, die uns vor große Herausforderungen stellt. Insbesondere die weltweit verbreiteten Resistenzen, die viele Therapieoptionen nutzlos werden lassen, haben den Kampf gegen die Malaria in den letzten Jahrzehnten deutlich verkompliziert. Schätzungen gehen davon aus, dass Malaria jährlich 1 bis 3 Millionen Todesopfer fordert. Mortalität und Morbidität der Erkrankung konzentrieren sich dabei in besonderer Weise auf Kinder unter fünf Jahren in Afrika südlich der Sahara. In der hier vorgestellten Doktorarbeit analysiere ich den aktuellen Stand der Malaria-Kontrolle in Burkina Faso und zeige beispielhaft auf, warum diese Krankheit eine derart große Bürde für die Volksgesundheit darstellt und wo Ansatzpunkte zur Verbesserung der Kontrollmaßnahmen zu sehen sind, mit einem besonderen Fokus auf Diagnostik und Therapieoptionen. Dabei wird MB als Therapieoption genauer beleuchtet. Um die besonderen Gegebenheiten eines Landes wie Burkina Faso - welches hier als repräsentatives Beispiel für einen Staat mit hoher Endemizität für Malaria herangezogen wird - aufzuzeigen, wird ein Porträt des Landes und seines Gesundheitssystems insbesondere unter Sozio- Ökonomischen Gesichtspunkten gezeichnet. Burkina Faso ist ein sehr armes Land, über die Hälfte seiner Bevölkerung lebt unterhalb der Armutsgrenze. Die Kosten von Malaria sind für diese Menschen gigantisch, und insbesondere die Kosten von Medikamenten wiegen schwer. Eine retrospektive Studie aus Fallakten des Universitäts-Kinderkrankenhauses in Burkina Fasos Hauptstadt Ouagadougou zeigt vor allem, dass allein die Fallzahlen überwältigend sind, und vor allem die spezifische Diagnose der schweren Verlaufsform der Malaria ist unter den vorherrschenden Bedingungen eine Mammutaufgabe. Die Behandlungsvorschriften wie von der WHO vorgegeben werden weder vom Gesundheitssystem noch von der Therapie zu Hause erfüllt, wie in den präsentierten Daten für die Vorbehandlung zeigen. Die zur Verfügung stehenden Malaria-wirksamen Therapeutika sind leider dank Resistenzentwicklung - oft durch unbedachten Masseneinsatz verursacht - sehr begrenzt. Artemisinine sind momentan das einzige Mittel gegen welches noch keine Resistenzen im Feld nachgewiesen wurden. Mittels Homologie-Modellierung zeige ich auf wie einfach eine solche Resistenzentwicklung jedoch denkbar wäre. Artemisinine sollten daher durch sehr gezielten Einsatz als ”letzter Trumpf” möglichst lange vor Resistenzentwicklung geschützt werden, ähnlich wie Reserveantibiotika gegen Multi-resistente Keime. MB ist ein hervorragender Kandidat für eine Kombinationsbehandlung gegen Malaria und eventuell eine Option, Artemisinine länger zu ”schonen”. Hier wird dieses Medikament mit bioinformatischen Mitteln genauer in seinen Wirkmechanismen beleuchtet und in Kombination mit anderen Medikamenten getestet mittels einer experimentell gestützten bioinformatischen Pathway-Modellierung. Durch diese Netzwerk-Analyse wurden verschiedene Angriffspunkte von MB auf das Redox-Netzwerk der Malariaerreger identifiziert. Daraufhin wurden CQ und SP-Resistenzen in silico simuliert. Weitere Analysen zeigten dabei, dass MB synergisitische Wirkungen mit anderen Therapeutika gegen Malaria aufzeigt, wenn sie zielgerichtet eingesetzt werden. Finanziell gesehen hat MB Potenzial, ein zweites CQ zu werden, und somit endlich wieder die Kosten der Behandlung für Menschen die in Armut leben erschwinglich zu machen. Malaria Kontrolle ist erreichbar, aber suboptimale Diagnosestellung und Behandlung behindern das Erreichen dieses Zieles. Hierfür muss eine angepasste, dezentrale und hochgradig standardisierte Primärbehandlung unkomplizierter Malaria implementiert werden und für eine bessere Verfügbarkeit dieser gesorgt werden. Leider leidet die Finanzierung der Kampagnen gegen Malaria an chronischer Unterversorgung. Um den maximalen Nutzen aus den vorhandenen Mitteln ziehen zu können ist eine günstigere medikamentöse Therapie ein entscheidender Beitrag, zumal Medikamente den größten Einzelbetrag im Kampf gegen Malaria verbrauchen. KW - Malaria KW - bioinformatic KW - socioeconomic KW - Methylene blue KW - developing country KW - therapy KW - diagnosis Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102863 ER - TY - THES A1 - Derrer, Bianca T1 - Charakterisierung der Vitamin B6 Synthese und des Shikimatsyntheseweges im Malariaerreger Plasmodium ssp. T1 - Characterisation of vitamin B6 synthesis and shikimate pathway in the malaria causing agents Plasmodium ssp. N2 - Malaria ist eine schwerwiegende Krankheit, die jährlich über eine Million Menschen tötet. Die zunehmende Resistenzbildung gegenüber den verwendeten Medikamenten macht die Entwicklung neuer Antimalariamittel dringend notwendig. Daher sind die Vitamin B6 Synthese und der Shikimatweg von besonderem Interesse, da diese beiden Synthesewege nur im Parasiten und nicht im Menschen vorkommen. Unter der Voraussetzung, dass diese essentiell für den Parasiten sind, böten sie ideale Ansatzpunkte zur Entwicklung neuer Antimalariamittel. Voraus gegangene Studien haben gezeigt, dass Plasmodium falciparum in der Lage ist, PLP de novo mittels eines bifunktionalen Enzymkomplex, bestehend aus den Proteinen Pdx1 und Pdx2, zu synthetisieren. Pdx1 stellt dabei die eigentliche Synthase dar, während Pdx2 als Glutaminase-Partner das benötigte Ammoniumion für den heterocyclen Ring bereitstellt. Zusätzlich dazu verfügt der Parasit auch über einen salvage pathway um PLP zu „recyclen“, in dem der Pyridoxalkinase PdxK eine Schlüsselfunktion zufällt. Knockout Studien der pdx1 im Mausmalariasystem P. berghei haben gezeigt, dass PbPdx1 für eine optimale Entwicklung der Blutstadien benötigt wird, nicht jedoch für deren Überleben. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich die Effekte eines pbpdxK(-) Knockouts in demselben System untersucht. Es konnte eine monoklonale Knockoutlinie generiert werden, was zeigte, dass PbPdxK nicht essentiell für das Überleben des Parasiten in den Blutstadien ist. Die Entwicklung während des Blutstadiums war von dem pbpdxK(-) Knockout nicht betroffen. Allerdings zeigte sich im Moskitostadium eine drastische Reduktion der Sporozoitenzahl sowohl in den Mitteldärmen als auch in den Speicheldrüsen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass PbPdxK essentiell für das Überleben der Sporozoiten ist. Daneben wurde versucht, die Gene pfpdx1, pfpdx2 sowie pfpdxK in P. falciparum 3D7 durch Verwendung der single cross over Strategie auszuschalten. Es konnte jedoch für keines der genannten Konstrukte eine Integration in die jeweiligen Genloci anhand von PCR-Analysen nachgewiesen werden. Ebenso scheiterte der Versuch, durch Rekombination eines komplementären Genabschnitts die Funktion des Gens zu rekonstituieren. Daher bleibt es unklar, ob pfpdx1, pfpdx2 und pfpdxK durch Knockout Strategien auszuschalten sind oder nur für Genmanipulationen nicht zugänglich sind. Die Kultivierung von P. falciparum 3D7 Parasiten in Vitamin B6 depletiertem Medium hatte keinen Effekt auf deren Wachstum. Eine anschließende Analyse der Proteinextrakte zeigte eine erhöhte Expression der PfPdxK, während sich das Expressionslevel der PfPdx1 nicht veränderte. Es scheint, dass der Parasit in der Lage ist Vitamin B6 Mangel durch vermehrte Nutzung des salvage pathways vollständig zu kompensieren. Frühere Arbeiten zeigten, dass der C-Terminus der Pdx1 in die Aktivität des PLP Synthasekomplexes involviert ist. Aus diesem Grund wurden verschiedene C-terminale Deletionsmutanten der PfPdx1 konstruiert und dabei bis zu 30 Aminosäuren entfernt. Diese Analysen ergaben, dass der C-Terminus vier verschiedene Funktionen besitzt: das Assembly der Pdx1 Untereinheiten zum Dodekamer, die Bindung des Pentosesubstrats Ribose 5-Phosphat, die Bildung des Intermediats I320 und schließlich die PLP Synthese. Diese unterschiedlichen Funktionen wurden durch verschiedene Deletionsvarianten identifiziert. Darüber hinaus waren alle Deletionsvarianten in der Lage, die Glutaminase Pdx2 zu aktivieren, was zeigt, dass das Dodekamer nicht Vorraussetzung für die Glutaminaseaktivität ist. Aufgrund der geringen PLP Syntheseaktivität in vitro wurde vermutet, dass der PfPdx1/PfPdx2 Komplex durch einen zusätzlichen Faktor aktiviert wird. Daher wurde versucht, mittels Yeast 2-Hybrid, basierend auf einer PCR-amplifizierten P. falciparum 3D7 cDNA-Bibliothek als bait und PfPdx1 als prey, einen Interaktionspartner zu identifizieren. Mehrere Klone wurden gewonnen, die alle einen Bereich des Mal13P1.540, einem putativen Hsp70 Proteins, enthielten. Jedoch scheiterten alle Versuche, die Protein-Protein-Interaktion mit rekombinant exprimierten Protein zu bestätigen. Ebenso war es nicht möglich, das vollständige Mal13P1.540 rekombinant zu exprimieren sowie dessen Lokalisation in vivo zu bestimmen. Daher bleibt die Interaktion von PfPdx1 und Mal13P1.540 ungeklärt. Neben der Vitamin B6 Biosynthese konnten auch einige Gene des Shikimatweges in Plasmodium identifiziert werden. In P. berghei konnten der C-terminale Teil der 3-Dehydroquinatsynthase (2) sowie die Shikimatkinase (5) und die 5-Enoylpyruvylshikimat 3-Phosphatsynthase (6) in einem open reading frame (ORF) identifiziert werden, der dieselbe genetische Organisation aufweisen wie der Arom-Komplex der Hefen. Mit Hilfe eines Komplementationsassay wurde die Funktionalität dieses ORFs überprüft. Dazu wurden S. cerevisiae BY4741Δaro1, ein Hefestamm ohne funktionalen Arom-Komplex, mit dem Pb2_6_5_ABC Fragment transformiert. Die so transformierten Hefen waren nicht in der Lage, auf Mangelplatten ohne aromatische Aminosäuren zu wachsen, was zeigte, dass das Pb2_6_5_ABC Konstrukt den BY4741Δaro1 Phänotyp nicht komplementieren konnte. Der Versuch, mit Hilfe des Baculovirussytems rekombiant exprimiertes Protein zu erhalten, verlief erfolglos. Ebenso war es nicht möglich, Teile des Proteins für Immunisierungen zu exprimieren. Daher bleibt die Funktionalität des Pb2_6_5_ABC Konstruktes ungeklärt. N2 - Malaria is a serious burden of mankind causing over one million deaths a year. In view of the raising number of resistances to common drugs there is an urgent need for the development of new antimalarial drugs. In this respect, the vitamin B6 biosynthesis and the shikimate pathway are of particular interest, since these synthesis pathways are only present in the malarial parasites and not in their human host. Given their essentiality for the parasite, they would represent ideal targets for antimalarial drug development. Previous studies revealed that Plasmodium falciparum is able to produce PLP de novo through a bifunctional enzyme complex composed of the proteins Pdx1 and Pdx2, of which Pdx1 is the actual synthase and Pdx2 the glutaminase partner providing the nitrogen for the ring system. In addition, the parasites possess a salvage pathway for PLP, of which pyridoxal kinase, PdxK, is a key player. Knockout studies of the pdx1 in the rodent malaria system P. berghei showed, that pbpdx1 is required for the optimal development of parasite blood stages but is not essential for parasite survival. Here, I investigated the effect of a pbpdxK(-) knockout in the same system. A monoclonal knockout strain was obtained, indicating that PbPdxK is not essential for the survival of the parasite. Blood stages were not affected by the knockout. However, in the mosquito stages pbpdxK(-) showed a tremendous reduction of sporozoites numbers in the midgut and in the salivary glands, indicating that PbPdxK is essential for the survival of sporozoites. It was then also tried to knockout pfpdx1, pfpdx2 and pfpdxK in the P. falciparum 3D7 strain by using the single cross over strategy. However, no integration of the constructs in the corresponding gene locus could be detected by a PCR approach. Also an approach to complement the loss of endogenous gene function by generating a functional gene copy upon recombination failed. Thus, it remains unclear if pfpdx1, pfpdx2 and pfpdxK can be knocked out or are inaccessible for gene targeting in P. falciparum. Cultivation of P. falciparum 3D7 parasites in medium deficient of vitamin B6 showed no effect on the growth rate of the parasites. Analysis of protein extracts of these parasites revealed an upregulation of PfPdxK expression, whereas the level of PfPdx1 remained stable. Thus it seems that the parasite is fully able to compensate vitamin B6 malnutrition by the increased usage of the salvage pathway. Previous studies on the activity of the PLP synthase complex indicated that the C-terminal end of Pdx1 is involved in PLP formation. Therefore several C-terminal deletion mutants of PfPdx1 were constructed, removing up to 30 amino acids. These analyses revealed that the C-terminus has four distinct functionalities: assembly of the Pdx1 monomers, binding of the pentose substrate (ribose 5-phosphate), formation of the reaction intermediate I320, and finally PLP synthesis. Deletions of distinct C-terminal regions distinguish between these individual functions. All variants were able to activate the glutaminase PfPdx2, indicating that the dodecameric structure is not a prerequisite for Pdx2 activation. Due to the low PLP synthase activity in vitro it was assumed that the PfPdx1/PfPdx2 complex maybe activated by an additional protein. Hence a yeast 2-hybrid assay was performed, using PfPdx1 as prey and a PCR-amplified cDNA-library of P. falciparum 3D7 as bait. Several clones were detected on high stringency plates, containing all a region of Mal13P1.540, a putative Hsp70 protein. Trials to confirm protein-protein interaction with recombinantly produced proteins failed as well as protein expression of full length Mal13P1.540. It was also not possible to determine the localisation of Mal13P1.540 in vivo. Thus, an interaction of PfPdx1 with Mal13P1.540 could so far not be verified. Besides the vitamin B6 biosynthesis, some genes of the shikimate pathway were identified in Plasmodium. In P. berghei, the C-terminal part of the dehydroquinatesynthase (2) as well as the shikimate kinase (5) and 5-enoylpyruvylshikimate 3-phosphatesynthase (6) were found in a single open reading frame having the same organisation as the arom-complex of yeast. To proof the functionality of these genes a complementation assay with S. cerevisiae BY4741Δaro1 with the Pb2_6_5_ABC construct, comprising the above mentioned genes, was performed. However, transformded yeast strains were not able to grow on minimal media without aromatic amino acids, indicating that they were not able to produce chorismate. Recombinant expression of this constructs in the baculovirussystem did not yield any detectable protein. Expression of parts of this protein for immunisation was also not successful. Hence, the functionality of this protein remains to be established. KW - Plasmodium falciparum KW - Shikimisäure KW - Vitamin B6 KW - Biosynthese KW - Shikimatsynthese KW - Plasmodium falciparum KW - Malaria KW - vitamin B6 synthesis KW - shikimate pathway KW - malaria Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51456 ER - TY - THES A1 - Bertram, Helge T1 - Bioinformatische Identifikation von Domänenunterschieden bei Parasit und Wirt am Beispiel der Malaria T1 - Bioinformatic identification of domain differences in parasite and host using malaria as an example N2 - Diese Arbeit untersucht zelluläre Netzwerke mit dem Ziel, die so gewonnenen Einsichten medizinisch beziehungsweise biotechnologisch zu nutzen. Hierzu müssen zunächst Proteindomänen und wichtige regulatorische RNA Elemente erkannt werden. Dies geschieht für regulatorische Elemente in Nukleinsäuren am Beispiel von Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylococcus aureus, wobei sich solche Elemente in viel versprechender Nähe zu exprimierten Sequenzen finden lassen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Noch bedeutsamer als Ziele zur Medikamentenentwicklung gegen Parasiten sind Domänenunterschiede in Struktur und Sequenz bei Proteinen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Ihre Identifikation wird am Beispiel eines potentiellen Transportproteins in Plasmodium falciparum exemplarisch dargestellt. Anschließend wird das Zusammenwirken von regulatorischen Elementen und Domänen in Netzwerken betrachtet (einschließlich experimenteller Daten). Dies kann einerseits zu allgemeineren Schlussfolgerungen über das Netzwerkverhalten führen, andererseits für konkrete Anwendungen genutzt werden. Als Beispiel wählten wir hier Redoxnetzwerke und die Bekämpfung von Plasmodien als Verursacher der Malaria. Da das gesamte Redoxnetzwerk einer lebenden Zelle mit Methoden der pH Wert Messung nur unzureichend zu erfassen ist, werden als alternative Messmethode für dieses Netzwerk Mikrokristalle der Glutathionreduktase als Indikatorsystem nach digitaler Verstärkung experimentell genutzt (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). Um komplexe Redoxnetzwerke auch bioinformatisch zu modulieren, werden Verfahren der metabolischen Fluxanalyse vorgestellt und verbessert, um insbesondere ihrer Verzahnung besser gerecht zu werden und solche Netzwerke mit möglichst wenig elementaren Flussmoden zutreffend beschreiben zu können. Die Reduktion der Anzahl von Elementarmoden bei sehr großen metabolischen Netzwerken einer Zelle gelingt hier mit Hilfe unterschiedlicher Methoden und führt zu einer vereinfachten Darstellungsmöglichkeit komplexer Stoffwechselwege von Metaboliten. Dabei dient bei jeder dieser Methoden die biochemisch sinnvolle Definition von externen Metaboliten als Grundlage (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). Allgemeiner werden Verfahren der Proteindomänenklassifikation sowie neue Strategien gegen mikrobielle Erreger betrachtet. In Bezug auf automatisierte Einteilung von Proteinen in Domänen wird ein neues System von Taylor (2002b) mit bekannten Systemen verglichen, die in unterschiedlichem Umfang menschlichen Eingriffs bedürfen (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). Außerdem wurde neben einer Arbeit über die verschiedenen Methoden aus den Daten eines Genoms Informationen über das metabolische Netzwerk der Zelle zu erlangen (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11) auch eine Übersicht über die Schwerpunkte der Bioinformatik in Würzburg zusammengestellt (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Schließlich wird beschrieben, wie die Pathogenomik und Virulenz von Bakterien der bioinformatischen Analyse zugänglich gemacht werden können (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). Im letzten Teil wird die metabolische Fluxanalyse zur Identifikation neuer Strategien zur Bekämpfung von Plasmodien dargestellt: Beim Vergleich der Stoffwechselwege mit Glutathion und Thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles und Mensch geht es darum, gezielte Störungen im Stoffwechsel des Malariaerregers auszulösen und dabei den Wirt zu schonen. Es ergeben sich einige interessante Ansatzpunkte, deren medizinische Nutzung experimentell angestrebt werden kann. N2 - The objective of this thesis is to obtain information, which may be advantageous for biotechnical and medical purposes. In order to achieve this aim it is first necessary to identify protein domains and essential regulatory RNA elements. In case of regulatory RNA elements this is accomplished by investigating Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylocuccus aureus as a model. In this case these elements are found in much promising vicinity to open reading frames coding for proteins (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Even more significant for the purpose of developing pharmaceuticals against parasites are differences of structure and sequence in protein domains (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Their identification is shown in a potential transport protein in Plasmodium falciparum. Subsequently the interaction of regulatory elements and domains in networks is considered (including experimental data). The resulting observations may lead to general conclusions concerning network reaction, as well as specific applications. Our example and field of interest are redox networks and Plasmodia causing malaria. It is not possible to cover the redox network state of a living cell using only pH measurements. Therefore small crystals of glutathione reductase are employed as a more suitable indicator, whose signal is digitally amplified (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). In order to bioinformatically modulate complex redox networks techniques of metabolic flux analysis are presented. They are also improved particularly to advance the understanding of interdependences and to facilitate the correct comprehension of such networks with as few elementary flux modes as possible. In this thesis the reduction of the number of elementary modes of large and intertwined metabolic networks succeeds with various methods. This leads to a simpler model of complex metabolic functions. For each of the methods used in this process the biochemically justified definition of external and internal metabolites constitutes the basis (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). In a more general sense methods of protein domain classification and new strategies for the control of microbial pathogens are considered. In reference to automated classification of protein domains a new system by Taylor (2002b) is compared with traditional systems, which require a varying degree of human intervention (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). In addition different methods of acquiring information on the cellular metabolic network from genomic data is discussed (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11). Furthermore a survey of the main fields of bioinformatic research in Würzburg is given (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Finally it is outlined how pathogenicity and virulence of bacteria may be made accessible to bioinformatic analysis (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). In the conclusion metabolic flux analysis is used for the identification of new strategies in the battle against Plasmodia: The comparison of metabolic pathways with glutathione and thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles and man aims at raising planned dysfunctions in the metabolism of Plasmodium or Anopheles without harming the human host. Valuable suggestions for medical applications and pharmacological targets are obtained. KW - Plasmodium falciparum KW - Domäne KW - Klassifikation KW - Bioinformatik KW - Redoxsystem KW - Glutathion-Reductase KW - Malariamücke KW - Mensch KW - Stoffwechselweg KW - Malaria KW - metabolische Fluxanalyse KW - Glutathionreduktase KW - Iron Responsive Elements KW - Proteindomänenklassifikation KW - malaria KW - metabolic fluxanalysis KW - glutathione reductase KW - iron responsive elements KW - classification of protein domains Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17188 ER -