TY - THES A1 - Spohn, Gunther T1 - The transcriptional control of virulence gene expression in Helicobacter pylori T1 - Die transkriptionelle Kontrolle der Virulenzgenexpression in Helicobacter pylori N2 - The Gram-negative, spiral-shaped, microaerophilic bacterium Helicobacter pylori is the causative agent of various disorders of the upper gastrointestinal tract, such as chronic superficial gastritis, chronic active gastritis, peptic ulceration and adenocarcinoma. Although many of the bacterial factors associated with disease development have been analysed in some detail in the recent years, very few studies have focused so far on the mechanisms that regulate expression of these factors at the molecular level. In an attempt to obtain an overview of the basic mechanisms of virulence gene expression in H. pylori, three important virulence factors of this pathogen, representative of different pathogenic mechanisms and different phases of the infectious process, are investigated in detail in the present thesis regarding their transcriptional regulation. As an essential factor for the early phase of infection, including the colonisation of the gastric mucosa, the flagella are analysed; the chaperones including the putative adhesion factors GroEL and DnaK are investigated as representatives of the phase of adherence to the gastric epithelium and persistence in the mucus layer; and finally the cytotoxin associated antigen CagA is analysed as representative of the cag pathogenicity island, which is supposed to account for the phenomena of chronic inflammation and tissue damage observed in the later phases of infection. RNA analyses and in vitro transcription demonstrate that a single promoter regulates expression of cagA, while two promoters are responsible for expression of the upstream divergently transcribed cagB gene. All three promoters are shown to be recognised by RNA polymerase containing the vegetative sigma factor sigma 80. Promoter deletion analyses establish that full activation of the cagA promoter requires sequences up to -70 and binding of the C-terminal portion of the alpha subunit of RNA polymerase to an UP-like element located between -40 and -60, while full activation of the major cagB promoter requires sequences upstream of -96 which overlap with the cagA promoter. These data suggest that the promoters of the pathogenicity island represent a class of minimum promoters, that ensure a basic level of transcription, while full activation requires regulatory elements or structural DNA binding proteins that provide a suitable DNA context. Regarding flagellar biosynthesis, a master transcriptional factor is identified that regulates expression of a series of flagellar basal body and hook genes in concert with the alternative sigma factor sigma 54. Evidence is provided that this regulator, designated FlgR (for flagellar regulatory protein), is necessary for motility and transcription of five promoters for seven basal body and hook genes. In addition, FlgR is shown to act as a repressor of transcription of the sigma 28-regulated promoter of the flaA gene, while changes in DNA topology are shown to affect transcription of the sigma 54-regulated flaB promoter. These data indicate that the regulatory network that governs flagellar gene expression in H. pylori shows similarities to the systems of both Salmonella spp. and Caulobacter crescentus. In contrast to the flagellar genes which are regulated by three different sigma factors, the three operons encoding the major chaperones of H. pylori are shown to be transcribed by RNA polymerase containing the vegetative sigma factor sigma 80. Expression of these operons is shown to be regulated negatively by the transcriptional repressor HspR, a homologue of a repressor protein of Streptomyces spp., known to be involved in negative regulation of heat shock genes. In vitro studies with purified recombinant HspR establish that the protein represses transcription by binding to large DNA regions centered around the transcription initiation site in the case of one promoter, and around -85 and -120 in the case of the the other two promoters. In contrast to the situation in Streptomyces, where transcription of HspR-regulated genes is induced in response to heat shock, transcription of the HspR-dependent genes in H. pylori is not inducible with thermal stimuli. Transcription of two of the three chaperone encoding operons is induced by osmotic shock, while transcription of the third operon, although HspR-dependent, is not affected by salt treatment. Taken together, the analyses carried out indicate that H. pylori has reduced its repertoire of specific regulatory proteins to a basic level that may ensure coordinate regulation of those factors that are necessary during the initial phase of infection including the passage through the gastric lumen and the colonisation of the gastric mucosa. The importance of DNA topology and/or context for transcription of many virulence gene promoters may on the other hand indicate, that a sophisticated global regulatory network is present in H. pylori, which influences transcription of specific subsets of virulence genes in response to changes in the microenvironment. N2 - Das Gram-negative, spiralförmige Bakterium Helicobacter pylori verursacht verschiedene Krankheiten des oberen Verauungstraktes, wie z.B. chronische superfizielle Gastritis, chronische aktive Gastritis, Ulzera und Magenkarzinom. Obwohl viele der bakteriellen Faktoren, die zur Entwicklung dieser Krankheitsformen beitragen, in den letzten Jahren untersucht wurden, sind die molekularen Mechanismen, die die Expression dieser Faktoren regulieren, noch weitgehend unbekannt. Als Ansatz zur Untersuchung der grundlegenden Mechanismen der Virulenzgenexpression in H. pylori wurden in der vorliegenden Arbeit drei wichtige Virulenzfaktoren repräsentativ für die verschiedenen Phasen des Infektionsprozesses ausgewählt und in Bezug auf ihre transkriptionelle Regulation analysiert. Als essentielle Faktoren für die frühe Phase der Infektion, gekennzeichnet durch die Erstbesiedelung der Schleimschicht des Magens durch die Bakterien, wurden die Flagellen untersucht. Die Chaperone-Proteine mit den mutmaßlichen Adhärenzfaktoren GroEL und DnaK wurden stellvertretend für die Phase der Adhäsion an die Magenepithelzellen und die anschließende persistente Besiedelung der Magenschleimhaut analysiert. Als Verteter der cag Pathogenitätsinsel, die mit großer Wahrscheinlichkeit für die chronische Entzündung und Schädigung des Magengewebes in den späteren Phasen der Infektion verantwortlich ist, wurde schließlich das sogenannte Cytotoxin-assoziierte Antigen CagA untersucht. RNA-Analysen und in vitro-Transkriptionsstudien konnten zeigen, daß die Transkription des cagA-Gens von einem einzigen Promotor aus gesteuert wird, während die Expression des stromaufwärts gelegenen divergenten cagB-Gens von zwei Promotoren reguliert wird. Alle drei Promotoren werden von der vegetativen, sigma 80-enthaltenden RNA-Polymerase erkannt. Durch die Einführung spezifischer Deletionen zwischen cagA und cagB konnte weiterhin gezeigt werden, daß zur vollständigen Aktivierung des cagA-Promoters Sequenzen bis -70 sowie die Bindung der alpha-Untereinheit der RNA-Polymerase an ein UP-ähnliches Element zwischen -40 und -60 erforderlich sind, während die vollständige Aktivierung des wichtigsten cagB-Promotors Sequenzen oberhalb von -96 erfordert, die mit denjenigen des cagA Promoters überlappen. Diese Daten lassen darauf schließen, daß die Promotoren der Pathogenitätsinsel eine Klasse von Minimalpromotoren darstellen, die ein geringes Niveau an Transkription garantieren, für ihre volle Aktivierung aber regulatorische Elemente oder strukturelle DNA-bindende Proteine benötigen, die ein spezielles topologisches Umfeld produzieren. Bezüglich der Flagellen konnte ein zentraler Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der in Kooperation mit dem alternativen Sigma-Faktor sigma 54 die Expression einer Serie von Genen kontrolliert, die für strukturelle Komponenten des Flagellenkörpers kodieren. Es konnte gezeigt werden, daß dieser Faktor (genannt FlgR für Flagellen-Regulator) für die Motilität der Bakterien notwendig ist und die Transkription von fünf Operonen reguliert, die für sieben strukturelle Gene des Flagellen-Basalkörpers und -Hakens kodieren. Darüberhinaus reprimiert FlgR die Transkription des sigma 28-regulierten flaA-Gens, während Änderungen der DNA-Topologie die Transkription des sigma 54-regulierten flaB-Promotors beeinflussen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß das regulatorische Netzwerk, welches die Expression der strukturellen Komponenten der Flagellen in H. pylori kontrolliert, Ähnlichkeiten zu den in Caulobacter crescentus und Salmonella spp. beschriebenen Systemen aufweist. Im Gegensatz zu den Flagellengenen, die von drei verschiedenen Sigma-Faktoren reguliert werden, konnte im Fall der drei Operone, die für die Haupt-Chaperone von H. pylori kodieren, eine sigma 80-abhängige Transkription nachgewiesen werden. Die Expression dieser Operone wird darüberhinaus negativ reguliert durch den transkriptionellen Repressor HspR, ein Homolog des gleichnamigen Hitzeschockrepressors von Streptomyces spp. In vitro-Experimente mit gereinigtem rekombinantem HspR konnten zeigen, daß das Protein die Transkription durch die Bindung an große DNA Regionen reprimiert, die in einem Fall mit dem Transkriptionsstart überlappen, und in den anderen beiden Fällen um -85 bzw. -120 lokalisiert sind. Im Gegensatz zur Situation in Streptomyces, wo die Transkription HspR-abhängiger Gene durch Hitzeschock induziert werden kann, ist die Transkription der HspR-regulierten Gene in H. pylori nicht mit Temperaturerhöhungen induzierbar. Die Expression zweier der drei Chaperone-kodierenden Operone kann dagegen durch osmotischen Schock induziert werden, während die Transkription des dritten Operons, trotz seiner HspR-Abhängigkeit, nicht durch osmotische Reize beeinflußbar ist. In ihrer Gesamtheit lassen die transkriptionellen Analysen der verschiedenen Virulenzfaktoren darauf schließen, daß H. pylori sein Repertoire an spezifischen regulatorischen Genen auf ein minimales Niveau reduziert hat, das die koordinierte Regulation derjenigen Faktoren sicherstellt, die für die Anfangsphase der Infektion, namentlich die Durchquerung des Magenlumens und die Erstbesiedelung des Magenepithels, notwendig sind. Die Bedeutung von DNA-Topologie und -Kontext für die Transkription vieler Virulenzgene könnte andererseits auf die Anwesenheit eines hochentwickelten globalen regulatorischen Netzwerkes hinweisen, welches die Transkription spezifischer Untergruppen von Virulenzgenen in Reaktion auf bestimmte Umweltfaktoren beeinflußt. KW - Helicobacter-pylori-Infektion KW - Virulenz KW - Genexpression KW - Helicobacter pylori KW - Transkription KW - Virulenzfaktoren KW - Flagellen KW - Pathogenitätsinsel KW - Chaperone KW - Helicobacter pylori KW - transcription KW - virulence factors KW - flagella KW - pathogenicity island KW - chaperones Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2334 ER - TY - THES A1 - Niederführ, Alexandra T1 - Expressionskartierung des menschlichen Chromosoms 11p13 T1 - Expression mapping of human chromosome 11p13 N2 - In die Region p13 des menschlichen Chromosoms 11 kartieren mehrere krankheitsrelevante Gene wie das Wilms' Tumor Gen WT1 oder das für die Aniridie verantwortliche Gen PAX6. Beide Gene können bei Patienten mit dem WAGR-Syndrom deletiert sein, was das Auftreten von Wilms' Tumoren oder Aniridie bei diesen Patienten erklärt. Die genetische Ursache für weitere Symptome des WAGR-Syndroms, wie beispielsweise die geistige Retardierung, ist bisher nicht geklärt. Des weiteren wurden Allelverluste auf 11p13 in Verbindung mit verschiedenen Tumoren (Lunge, Blase, Brust, Ovar) beobachtet, ohne daß die ursächlichen Gene hierfür beschrieben werden konnten. Eine Kartierung und anschließende Sequenzierung dieser Region dient als Grundlage für die Identifizierung neuer Gene, die möglicherweise im Zusammenhang mit diesen Krankheiten stehen. Mit dem Ziel der Sequenzierung dieser Region wurde ausgehend von einem YAC-Contig, das 8 Mb des Chromosoms 11p13-14.1 abdeckt, eine Feinkartierung der Region 11p13 durchgeführt. Über ein Screening einer humanen PAC-Bibliothek mit 11p13-spezifischen Proben, wurden PAC-Klone erhalten, die aus dieser Region stammen. Mit einem Teil dieser Klone konnte mittels "chromosome walking" ein 4,5 Mb großes PAC-Contig erstellt werden. Zur Sequenzierung des Chromosomenabschnitts 11p13 am Sanger Centre/UK wurden die PAC-Klone des "minimal tiling path" gewählt. Auf der Grundlage des PAC-Contigs wurden auf experimentellem Weg mit Hilfe des Exontrappings neue Transkripte isoliert. Hierfür wurden sechs PAC-Klone, die etwa 700 kb des Chromosoms 11p13 abdecken, herangezogen. Zusätzlich wurden erste Sequenzabschnitte (insgesamt ca. 640 kb) der PAC-Klone über eine computergestütze Auswertung mit dem Programmpaket NIX/HGMP analysiert. Insgesamt konnten mit Hilfe des Exontrappings und der in silico Analyse fünf neue potentielle Transkripte identifiziert werden. Eine erste Untersuchung dieser Transkripte wurde mit Hilfe von Datenbankvergleichen und Expressionsstudien auf Northern Blots und in situ Hybridisierungen durchgeführt. Aussagen über eine mögliche Funktion konnten bei zwei der identifizierten Transkripte anhand von Datenbankvergleichen getroffen werden. Es handelt sich zum einen um ein Transkript mit Homologien zum Gen cca3 aus der Ratte, für das aufgrund der enthaltenen BTB-Domäne eine regulatorische Funktion auf DNA-Ebene postuliert werden kann. Zum anderen wurde ein Gen mit Ähnlichkeiten zu einem Transkript aus Achlya ambisexualis isoliert. Letzteres besitzt möglicherweise die Funktion eines Steroidrezeptors. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Transkripten, können aus dem erstellten PAC-Contig neue Gene auf der Basis von cDNA-Selektion, Exontrapping oder, nach Fertigstellung der gesamten Sequenz, über in silico Analysen identifiziert werden. N2 - The human chromosomal region 11p13 harbours several disease related genes among them the Wilms' tumour gene WT1 and PAX6 which is responsible for aniridia. Both genes can be deleted in patients with the WAGR syndrome explaining the Wilms' tumour or aniridia of the WAGR-syndrome. Additional symptoms of the WAGR syndrome like mental retardation are not yet understood genetically. Furthermore loss of heterozygosity of 11p13 has been observed in severel cancers (breast, bladder, ovary, lung). None of these regions of allele loss have been narrowed down to a single gene yet. In order to identify genes associated with these diseases mapping and subsequent sequencing of the 11p13 region are of great interest. With the aim of sequencing this region, fine mapping of 11p13 has been performed based on a YAC-contig spanning 8 Mb of chromosome 11p13-14.1. Screening of a human PAC-library with 11p13 derived probes resulted in a set of clones located in 11p13. Using the strategy of chromosome walking a PAC contig covering 4,5 Mb of 11p13 could be established with a subset of these clones. For sequencing 11p13 by the Sanger Centre/UK a minimal tiling path of PAC clones was chosen. The PAC contig has been used to isolate new transcripts located in this region. For this purpose exon trapping was performed with six of the PAC clones spanning 700 kb of 11p13. Additionally, genomic sequences of some of the PAC clones (ca. 640 kb) were analysed in silico by the NIX program package/HGMP. The exon trapping approach together with the in silico analyses resulted in the identification of five new transcripts which were investigated by database searches as well as expression studies via Northern blots and in situ hybridisations. For two of the identified transcripts a possible function could be suggested based on database searches. One shows similarities to a rat gene named cca3 which may be involved in transcriptional regulation due to its BTB domain. The other one is similar to a transcript of Achlya ambisexualis. For the latter a role as a steroid receptor has been postulated. In addition to the transcripts described here, new genes can be isolated by using the established PAC contig for either exon trapping, cDNA selection or in silico analysis of the sequence which will be finished in the near future. KW - Mensch KW - Chromosom 11 KW - Genexpression KW - Genkartierung KW - Chromosom 11p13 KW - PAC-Contig KW - genomische Sequenzierung KW - Expressionskartierung KW - Genidentifizierung KW - DNA-Sequenzanalyse KW - chromosome 11p13 KW - PAC contig KW - genomic sequencing KW - expression mapping KW - gene identification KW - DNA sequence analysis KW - exon trapping Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1803 ER - TY - THES A1 - Hansen, Immo A. T1 - Hexamerine und Neuropeptide in der postembryonalen Entwicklung der Insekten T1 - Hexamerins and Neuropeptides during the postembryonic development of insects N2 - Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung neuartige Ansätze zur Identifizierung von biologisch aktiven Wirkstoffen, die in die Metamorphose von holometabolen Insekten eingreifen. Hexamerine und Neuropeptide besitzen sehr unterschiedliche Funktionen. Während Neuropeptide zusammen mit anderen Gewebshormonen auf einer übergeordneten regulatorischen Ebene wirken, sind Hexamerine als Speicher- und Verteidigungsproteine ein Endglied dieser hormonellen Regulationskaskade. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Fragestellungen bearbeitet: 1) Im ersten Projekt sollten allatotrope Substanzen im Gehirn der großen Wachsmotte Galleria mellonella durch Screening einer Expressionsbibliothek mit polyklonalen Antiseren identifiziert werden. Dabei wurde das Neuropeptid Corazonin identifiziert. Die vollständige Corazonin-mRNA wurde kloniert und sequenziert. Das Expressionsmuster der Corazonin-mRNA und des Peptids wurde mittels Northern-Analyse und in-situ-Hybridisierung charakterisiert. Corazonin wird in vier Zellpaaren, die zu den lateralen neurosekretorischen Zellen gehören, exprimiert. Die Axone dieser Zellen verlaufen ipsilateral zu den Nervi corpori cardiaci I+II, feine Fasern verzweigen sich in die am Ösophagus angrenzende Hirnregion hinein. Corazonin wird offensichtlich an den Axon- Endigungen in den Corpora cardiaca in die Hämolymphe freigesetzt. Einige feine Fasern enden in den Corpora allata bzw. am Vorderdarm. Der Nachweis, dass Corazonin tatsächlich eine allatotrope Wirkung hat, konnte nicht erbracht werden. 2) Die Protein/Protein-Interaktion zwischen Hexamerinen und dem Hexamerinrezeptor der Schmeißfliege Calliphora vicina wurde durch Two-Hybrid-Experimenten analysiert. Durch Interaktionstest mit trunkierten Proteinfragmenten wurden die Bindungsdomänen beider Proteine kartiert. Als rezeptorbindende Domäne des Arylphorins wurde ein 49 AS großes Peptid in der Domäne-3 des Arylphorin- Monomers identifiziert. Die Ligandenbindungsdomäne des Hexamerinrezeptors wurde in den ersten 24 AS des N-Terminus kartiert. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein HTS-Protokoll entwickelt, das zur Identifizierung von Substanzen verwendet werden kann, welche die Bindung dieser beiden Proteine beeinflussen. Eine Two-Hybrid-Bibliothek wurde ausgehend von 7dL-Fettkörper-RNA konstruiert und mit "Hexamerinrezeptor-Ködern" gescreent. Dabei wurden zwei neue Interaktionspartner des Hexamerinrezeptors gefunden und genauer charakterisiert. Der erste identifizierte Interaktionspartner - d-AP-3 - ist Teil eines Adaptin- Komplexes, der als Adapter zwischen membranständigen Rezeptoren und Clathrin oder ähnlichen Proteinen an der rezeptorvermittelten Endozytose beteiligt ist. Die Adaptin-Interaktionsdomäne liegt innerhalb des ABP64-Spaltprodukts des Hexamerinrezeptors. Die Funktion des zweiten Interaktionspartners - AFP - ist unbekannt. AFP wird im anterioren Teil des Fettkörpers und in Hämozyten exprimiert. Die Interaktion zwischen dem Hexamerinrezeptor und AFP ist demnach auf diesen Teil des Fettkörpers beschränkt. Die mit AFP interagierende Domäne des Hexamerinrezeptors liegt innerhalb des P30-Spaltprodukts. N2 - The goal of this project was to develop innovative approaches to identify biologically active substances which interfere with the metamorphosis of holometabolous insects. Hexamerins and neuropeptides clearly have different functions. While neuropeptides are involved in initial regulatory steps hexamerins have important functions as storage and defense proteins during the final steps of the regulatory cascade. Two projects are part of this dissertation: 1) The aim of the first project was the identification of allatotropic substances in the brain of the greater waxmoth Galleria mellonella by means of screening an expression-library with polyclonal antisera. This approach led to the identification the neuropeptide corazonin. The corazonin-mRNA was cloned and sequenced. The expression profile of the mRNA and the peptide was examined with northern-blotting and in-situ-hybridization. Corazonin is produced in four neurosecretory cells localized laterally in each brain hemisphere. Axons of these cells follow the ipsilateral tract to the nervi corpori cardiaci I+II, finer fibers seem to terminate in the brain region adjacent to the oesophagus. Corazonin seems to be released in axon terminals within the corpora cardiaca. Axon endings are even regularly seen in the foregut wall and in the corpora allata. However it could not be established that corazonin in fact is an allatotropic substance. 2) The protein/protein-interaction between hexamerins and the hexamerin-receptor of the blowfly Calliphora vicina was analysed using the yeast-two-hybrid- system. By interaction tests with truncated protein fragments the binding domains of both proteins were mapped. The receptor binding domain of arylphorin was located within a peptide of 49 aa in domain-3 of the arylphorin monomer. The ligand binding domain of the hexamerin-receptor was mapped within the first 24 aa of the N-terminus. Proceeding from this results a protocol for a high-throughput-screening was developed which can be used to identify substances that interfere with the binding of these two proteins. A two-hybrid-library was constructed from 7dL-fat body RNA and screened with a hexamerin-receptor-bait. Two novel interactors of the hexamerin-receptor were identified and characterized within this project. The first identified interactor - d-AP-3 - is part of an adaptin complex which serves as an adapter between membrane-bound receptors and clathrin or related proteins and is part of the receptor-mediated endocytosis process. The adaptin-interacting domain lies within the ABP64 cleavage product of the receptor. The function of the second interactor - AFP - is unknown. AFP is produced specifically in the anterior part of the fat body and in hemocytes. Hence the interaction between the hexamerin-receptor and AFP is limited to this part of the fat body. The AFP-interacting domain is located within the P30 cleavage product of the hexamerin-receptor. KW - Blaue Fleischfliege KW - Hexamerine KW - Rezeptor KW - Arylphorine KW - Wechselwirkung KW - Große Wachsmotte KW - Jugendentwicklung KW - Corazonin KW - Genexpression KW - Biologische Schädlingsbekämpfung KW - Hexamerin KW - Neuropeptid KW - Corazonin KW - Arylphorin AFP KW - hexamerin KW - neuropeptide KW - corazonin KW - arylphorin AFP Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180084 ER - TY - THES A1 - Brambrink, Tobias T1 - Entwicklung und Evaluierung eines Verfahrens zur Genexpressionsanalyse bei individuellen präimplantatorischen Säugerembryonen über die cDNA-Array-Technologie T1 - Development and evaluation of a methodology for cDNA-array gene expression profiling in individual mammalian preimplantation embryos N2 - Untersuchungen der Transkriptionsebene individueller präimplantatorischer Embryonalstadien können wertvolle Informationen über den physiologischen Status der betrachteten Embryonen, die z.B. zur Verbesserung der Systeme zur In vitro-Produktion von Embryonen genutzt werden können, liefern. Bisher fehlte es jedoch an einer geeigneten Technologie, um eine große Anzahl von Transkripten in einzelnen Embryonen zu erfassen. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, ein Verfahren zur globalen Amplifikation embryonaler mRNA-Präparationen zu entwickeln, das die Analyse der Transkriptionsebene einzelner präimplantatorischer Embryonalstadien über die cDNA-Array-Technologie ermöglicht. Dazu wurde die Strategie gewählt, zwei bereits etablierte Amplifikationsverfahren, Polymerasekettenreaktion und In vitro-Transkription, zu kombinieren, um so synergistische Effekte beider Verfahren zu nutzen. Die Evaluierung des entwickelten Verfahrens zeigte eine hohe Reproduzierbarkeit der erhaltenen Genexpressionsdaten und belegte, dass die relativen Mengenverhältnisse einzelner mRNA-Spezies zueinander während der globalen mRNA-Amplifikation nur unwesentlich verändert wurden. Die entwickelte Methodik ist somit geeignet, komplexe Genexpressionsprofile einzelner Blastozysten zu erstellen und Unterschiede in der Expressionsstärke einzelner Transkripte zu detektieren. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass es möglich ist, über heterologe Hybridisierung Genexpressionsprofile boviner Blastozysten mit cDNA-Arrays, die murine Probensequenzen enthalten, reproduzierbar darzustellen. Neben der Detektion individueller Unterschiede in den Genexpressionsprofilen diverser muriner Embryonalstadien und boviner Blastozysten lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit in der Untersuchung der Auswirkungen verschiedener in vitro-Produktionssysteme auf die embryonale Genexpression. Die erhaltenen cDNA-Array Expressionsdaten muriner Oozyten, Zweizeller und Blastozysten befanden sich dabei in Übereinstimmung mit Daten früherer Publikationen anderer Arbeitsgruppen. Genexpressionsprofile in vitro fertilisierter boviner Blastozysten ließen eine Beurteilung der Auswirkungen unterschiedlicher Proteinsupplemente des Kulturmediums auf die embryonale Genexpression zu. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal Genexpressionsprofile einzelner präimplantatorischer Säugerembryonen über cDNA-Array-Analyse erstellt. Die entwickelte Technologie ermöglicht es -bei Verwendung entsprechender cDNA-Array-Systeme-, eine theoretisch unbegrenzte Zahl von Transkripten in individuellen Säugerembryonen semiquantitativ zu erfassen. Dies ist ein wichtiger Schritt hin zu einem besseren Verständnis komplexer Regulationsabläufe während der frühen Embryonalentwicklung und einer besseren Beurteilung der Lebensfähigkeit und Entwicklungskompetenz in vitro produzierter Embryonen, was für die Verbesserung von In vitro-Produktionssystemen für Embryonen sowohl bei Tieren als auch beim Menschen unerlässlich ist. N2 - Transcript expression profiling in single mammalian embryos can provide valuable information about their physiological status and developmental competence that can be exploited to improve systems for embryo in vitro production. Conventional methodologies such as RT-PCR limit the number of transcripts that can be quantitatively screened in a single embryo to only a few. The purpose of this study was to develop and evaluate a methodology for the global amplification of mRNA that permits cDNA-array analysis of individual preimplantation embryos. For this purpose, two conventional amplification procedures – polymerase chain reaction and in vitro transcription – were combined to a global amplification procedure. Evaluation of methodology developed revealed that data produced were high reproducible and that the relative transcript levels found in the original (non-amplified) sample were maintained throughout the amplification process. Thus, this method is suitable to generate complex gene expression profiles and to detect differentially expressed transcripts in individual mammalian embryos. Furthermore, this study demonstrates that expression profiles can reproducibly be produced from bovine embryos using arrays consisting of murine cDNA-probes by heterologous hybridization. The focus of this study was to establish a methodology to detect differentially expressed genes in different murine developmental stages and in bovine embryos derived from different in vitro production systems. The data obtained from murine oocyte, 2-cell stage and blastocyst expression profiles were in agreement with data previously published by other groups. Expression profiles from bovine in vitro fertilized embryos cultured in different media revealed effects of different media protein supplementation on embryonic gene expression. In this study, for the first time, gene expression profiles were generated from single mammalian preimplantation embryos via model cDNA-arrays. Using state-of-the-art cDNA-arrays this technology features the quantitative screening of a virtually unlimited number of transcripts in individual blastocysts and cleavage stages. Complex expression profiles of preimplantation embryos will contribute to the understanding of the molecular mechanisms essential for embryogenesis. This is crucial for the improvement of systems for in vitro production of mammalian embryos. KW - Embryo KW - Säugetiere KW - Array-Technologie KW - Messenger-RNS KW - Genexpression KW - Embryo KW - Genexpression KW - cDNA-Arrays KW - mRNA-Amplifikation KW - embryo KW - gene expression KW - cDNA-arrays KW - mRNA-amplification Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1787 ER - TY - THES A1 - Jager, Tertia ¬de¬ T1 - Estrogen action in the myocardium T1 - Östrogenwirkung im Myokard N2 - Cardiovascular disease is the leading cause of mortality in both men and women in the Western world. Earlier observations have pointed out that pre-menopausal women have a lower risk of developing cardiovascular disease than age-matched men, with an increase in risk after the onset of menopause. This observation has directed the attention to estrogen as a potential protective factor in the heart. So far the focus of research and clinical studies has been the vascular system, leaving the current knowledge on the role of estrogen in the myocardium itself rather scarce. Functional estrogen receptor-alpha as well as -beta have recently been identified in the myocardium, making the myocardium an estrogen target organ. The focus of this thesis was 1) to investigate the role of estrogen and estrogen receptors in modulating myocardial gene expression both in vivo in an animal model for cardiac hypertrophy (spontaneously hypertensive rats; SHR), as well as in vitro in isolated neonatal cardiomyocytes, 2) to investigate the mechanisms of the rapid induction of an estrogen target gene, the early growth response gene-1 (Egr-1) and 3) to initiate the search for novel estrogen target genes in the myocardium. 1) The effects of estrogen on the expression of one of the major myocardial specific contractile proteins, the alpha-myosin heavy chain (alpha-MHC) have been investigated. In ovarectomised animals treated either with 17beta-estradiol alone or in combination with a specific estrogen receptor antagonist, ICI 182780, it was shown that both alpha-MHC mRNA and protein were upregulated by estrogen in an estrogen receptor specific manner. The in vivo results were confirmed in vitro in isolated neonatal cardiomyocytes which showed that estrogen has a direct action on the myocardium potent enough to upregulate the expression of alpha-MHC. Furthermore it was shown that the alpha-MHC promoter is induced by estrogen in an estrogen receptor-dependent manner and first investigations into the mechanisms involved in this upregulation identified Egr-1 as a potential transcription factor which, upon induction by estrogen, drives the expression of the alpha-MHC promoter. 2) Previously it was shown that Egr-1 is rapidly induced by estrogen in an estrogen receptor-dependent manner which was mediated via 5 serum response elements (SREs) in the promoter region and surprisingly not via the estrogen response elements (EREs). In this study it was shown that estrogen-treatment of cardiomyocytes resulted in the recruitment of serum response factor (SRF), or an antigenically related protein, to the SREs in the Egr-1 promoter, which was specifically inhibited by the estrogen receptor antagonist ICI 182780. Transfection experiments showed that estrogen induced a heterologous promoter consisting only of 5 tandem repeats of the c-fos SRE in an ER-dependent manner, which identified SREs as promoter elements able to confer an estrogen response to target genes. 3) Potentially new target genes regulated by estrogen in vivo were analysed using hearts of ovarectomised animals as well as ovarectomised animals treated with estrogen. Analyses of cDNA microarray filters containing 1250 known genes identified 24 genes that were modified by estrogen in vivo. Among these genes, some might have potentially important functions in the heart and further analyses of these genes will create a more global picture of the role and function of estrogen in the myocardium. Taken together, the results showed that estrogen does have a direct action on the myocardium both by regulating the expression of myocardial specific genes in vivo, as well as exerting rapid non-nuclear effects in cardiac myocytes. It was shown that SREs in the promoter region of genes can confer an estrogen response to genes identifying SREs as important elements in regulation of genes by estrogen. Furthermore, 24 potentially new estrogen targets were identified in the myocardium, contributing to the general understanding of estrogen action in the myocardium. N2 - Kardiovaskuläre Erkrankungen gehören zu den häufigsten Todesursachen in westlichen Ländern. Vor den Wechseljahren besteht für Frauen ein geringeres Risiko, Herzerkrankungen zu entwickeln als für gleichaltrige Männer. Nach dem Eintritt der Menopause sind diese geschlechtsspezifischen Unterschiede aufgehoben, da sich das Risiko bei Frauen erhöht. Dies deutet darauf hin, dass Östrogene kardioprotektiv wirken. Bislang konzentrierten sich sowohl Forschung als auch klinische Studien hauptsächlich auf das vaskuläre System, so dass wenig über die Rolle von Östrogenen im Myokard bekannt ist. Zwar wurde gezeigt, dass funktionelle Östrogenrezeptoren (alpha- und beta-Form) in Herzmuskelzellen exprimiert werden, ihre genaue Funktion im Myokard ist jedoch noch ungeklärt. Dies lieferte den Ansatzpunkt für die vorliegende Arbeit, die sich mit der Rolle von Östrogenen im Myokard beschäftigte. Dazu wurde 1) der Einfluss der Östrogene auf die Genexpression im Myokard sowohl in vivo mit Hilfe eines Tiermodells für Herzhypertrophie, der spontan hypertensiven Ratte (SHR), als auch in vitro an isolierten neonatalen Kardiomyozyten untersucht. 2) Weiterhin wurde der Mechanismus der schnellen Geninduktion durch Östrogene mit Hilfe eines bereits identifizierten östrogenresponsiven Gens, dem ?Early growth response gene-1? (Egr-1), analysiert. 3) Gleichzeitig wurden erste Versuche zur Identifizierung bislang unbekannter Östrogenzielgene im Myokard eingeleitet. 1) Die Beeinflussung der myokardiale Genexpression wurde an Hand eines myokardial spezifischen kontraktilen Proteins, der alpha-Myosinschwerkette (alpha-MHC), untersucht. Östrogensubstitution in ovarektomierten Ratten induzierte alpha-MHC sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene in einer spezifisch durch Östrogenrezeptoren vermittelten Weise. In isolierten Kardiomyozyten konnten diese in vivo Ergebnisse bestätigt werden, indem gezeigt wurde, dass Östrogene direkt auf die Herzmuskelzellen wirken und die alpha-MHC-Expression induzieren. Weiterhin wurde die Östrogenrezeptor-abhängige Induktion des alpha-MHC-Promotors durch Östrogene nachgewiesen. Untersuchungen zu dem Mechanismus dieser Induktion identifizierten Egr-1 als potentiellen Transkriptionsfaktor, der durch Östrogene induziert wird und so die alpha-MHC-Induktion vermittelt. 2) Es wurde bereits in einer früheren Arbeit nachgewiesen, dass Egr-1 durch Östrogene in Kardiomyozyten induziert wird. Diese schnelle Induktion wird durch serumresponsive Elemente (SREs), nicht aber durch die östrogenresponsiven Elemente (EREs) im Egr-1 Promotor vermittelt. Zur Untersuchung des Mechanismus dieser schnellen Induktion konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Östrogenbehandlung die Bindung von SRF (serum response factor) an die SREs im Egr-1 Promoter auslöst. Ebenso wurde ein künstlicher Promotor aus 5 SREs des c-fos Promotors durch Östrogene induziert. Diese Induktion fand in einer spezifisch Östrogenrezeptor-vermittelten Weise statt. Damit konnten SREs neben EREs und AP-1 als Promoterelemente identifiziert werden, die eine wichtige Rolle bei der östrogenabhängigen Induktion von Zielgenen spielen. 3) Ein Ansatz zur Identifizierung neuer potentieller Östrogenzielgene im Myokard wurde etabliert. Mit Hilfe der Microarray-Technik wurde die Genexpression in Herzen von ovarektomierten, östrogenbehandelten Tieren mit unbehandelten Tieren verglichen. Durch die Verwendung von cDNA Mikroarray-Membranen mit 1250 cDNAs bekannter Rattengene wurden 24 Gene identifiziert, deren Expression möglicherweise durch Östrogene im Herzen beeinflusst werden könnte. Im Rahmen dieser Arbeit ist es somit gelungen zu zeigen, dass Östrogene eine direkte Wirkung auf das Myokard haben, indem sie die Expression des wichtigen kontraktilen Proteins a-MHC beeinflussen. Daneben vermitteln Östrogene auch schnelle nicht-genomische Geninduktionen via SREs. Zusätzlich wurden 24 potentiell neue Östrogenzielgene im Myokard identifiziert, was zu dem allgemeinen Verständnis der Östrogenwirkung im Myokard beiträgt. KW - Herzmuskel KW - Östrogene KW - Genexpression KW - Östrogene KW - Östrogenrezeptor KW - Myokard KW - alpha-Myosinschwerkette KW - Egr-1 KW - serumresponsive Elemente KW - SRF KW - estrogen KW - estrogen receptor KW - myocardium KW - alpha-myosin heavy chain KW - Egr-1 KW - serum response element KW - SRF Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1182573 ER - TY - THES A1 - Altrock, Stefanie T1 - Genetische Organisation und Transkription eines Virulenz-assoziierten, instabilen Chromosomenabschnitts von Listeria ivanovii T1 - Genetic organisation and transcription of a virulence-associated, instable chromosomal region of Listeria ivanovii N2 - Unter den sechs Arten der Gattung Listeria finden sich nur zwei pathogene Spezies. L. monocytogenes ist pathogen für Mensch und Tier, L. ivanovii nur tierpathogen. Beide Arten besitzen ein Virulenzgencluster, das auch als Pathogenitätsinsel LIPI-1 bezeichnet wird. Pathogenitätsinseln (PAIs) sind bei gram-negativen Bakterien weit verbreitet, wurden bei gram-positiven Pathogenen bisher jedoch nur selten beschrieben. In L. ivanovii wurde nun ein weiterer Virulenz-assoziierter, instabiler Chromosomenabschnitt entdeckt, der in einem Teilbereich Eigenschaften einer Pathogenitätsinsel besitzt. Ausgehend von einem spontanen, aber reproduzierbaren Deletionsereignis eines großen Genomabschnitts, der einige schon bekannte Virulenz-assoziierte Gene umfasst (i-inlE, i-inlF, smcL), wurden in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern an der "Universidad Complutense de Madrid", insbesondere mit G. Domínguez-Bernal die komplette deletierte Region sowie flankierende Genombereiche genauer analysiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten rechts von dem bereits charakterisierten Gen smcL 13 neue Open Reading Frames (ORFs) bzw. Gene (ydeI, rnaH, norA) von L. ivanovii identifiziert werden, die größtenteils in der Deletionsmutante L. ivanovii GD-3 deletiert waren. Für die meisten Open Reading Frames konnten Homologien zu ORFs in den Genomsequenzen von L. monocytogenes und der apathogenen Art L. innocua gefunden werden. Eigene experimentelle Analysen zeigten zudem, dass diese ORFs in ähnlicher Anordnung auch in den apathogenen Arten L. seeligeri und L. welshimeri vorhanden sind, was wahrscheinlich macht, dass sie nicht an der Virulenz von Listerien beteiligt sind. G. Domínguez-Bernal fand im links von smcL liegenden Bereich eine Reihe neuer Internalingene, die alle spezifisch für L. ivanovii sind. Für die Gene i-inlE, i-inlF und smcL ist bereits bekannt, dass diese Virulenz-assoziiert sind. Dies führte zur Definition einer neuen, LIPI-2 genannten Pathogenitätsinsel in L. ivanovii, die außer smcL und i-inlFE alle neu gefundenen Internalingene umfasst. In dieser Arbeit durchgeführte Untersuchungen der LIPI-2 flankierenden Bereiche zeigten, dass diese in L. monocytogenes und auch den apathogenen Arten L. innocua, L. seeligeri und L. welshimeri bemerkenswert konserviert sind. Durch Transkriptionsuntersuchungen mittels RT-PCR wurde die Expression der neu identifizierten Gene analysiert. Hierbei wurden verschiedene Kulturbedingungen untersucht sowie die Transkription nach Infektion mehrerer Zelllinien bestimmt. Bei der Sequenzanalyse wurde für fast alle Internalingene eine PrfA-Box identifiziert und es bestätigte sich in dieser Arbeit, dass die meisten der Internalingene PrfA-abhängig exprimiert werden. Allerdings wiesen die einzelnen Gene kein einheitliches Transkriptionsprofil unter verschiedenen in vitro-Bedingungen auf. Eine Analyse der Genexpression nach Infektion verschiedener Zelllinien zeigte schließlich, dass die Internalingene während einer Infektion differentiell transkribiert werden und möglicherweise am Infektionsgeschehen beteiligt sind. Das Expressionsmuster der zu LIPI-2 benachbarten Open Reading Frames bestätigte, dass diese Gene PrfA-unabhängig und unter verschiedenen Bedingungen konstitutiv exprimiert werden. Das Expressionsmuster dieser Gene läßt den Schluss zu, dass sie vermutlich nicht zur Virulenz von L. ivanovii beitragen. Die Untersuchung der Virulenzclustergene in LIPI-1 schließlich zeigte eine deutliche PrfA-Abhängigkeit der Genexpression. Es konnte bestätigt werden, dass deren Transkription unter PrfA-induzierenden Bedingungen verstärkt wird. Zudem fand sich auch nach Infektion eine deutliche Expression dieser Gene. N2 - Among the six species of Listeria only two are pathogenic. Whereas L. monocytogenes is pathogenic for men and animals, L. ivanovii only causes Listeriosis in animals. Both pathogenic species possess a virulence gene cluster, which is also designated as pathogenicity island LIPI-1. Pathogenicity islands (PAIs) are widespread among gram-negative bacteria, but so far have rarely been described for gram-positive pathogens. In L. ivanovii, an additional virulence-associated unstable part of the chromosome has recently been discovered, parts of which have some characteristics of a pathogenicity island. Starting from a spontaneous but reproducible deletion event of a big part of the genome which carries some known virulence associated genes (i-inlE, i-inlF, smcL), the complete deleted area plus flanking regions were analyzed in co-operation with G. Domínguez-Bernal from the "Universidad Complutense de Madrid". Within this work 13 new open reading frames (ORFs) resp. genes (ydeI, rnaH, norA) on the right side of the smcL gene could be identified in L. ivanovii. Most of them were deleted in the deletion mutant L ivanovii GD-3. Most of the open reading frames show homologies to ORFs also found in the genome sequences of L. monocytogenes and the apathogenic species L. innocua. Own experimental analyses showed, that the genes identified in this work are also present in the apathogenic species L. seeligeri and L. welshimeri. From this it can be concluded that they presumably are not involved in L. ivanovii virulence. G. Domínguez-Bernal discovered several new internalin genes on the left side of the smcL gene. All these genes are specific for L. ivanovii. For i-inlE, i-inlF and smcL it has already been shown that they are virulence associated. This lead to the definition of a new pathogenicity island (LIPI-2) in L. ivanovii, which, in addition to smcL and i-inlFE, comprises all newly found internalin genes. Study of the regions flanking LIPI-2 showed that these are considerably conserved in L. monocytogenes as well as in the apathogenic species L. innocua, L. seeligeri and L. welshimeri. By means of RT-PCR the expression of the new identified genes was analyzed. For this, different culture conditions and transcription after infection of several cell lines were examined. By sequence analysis, a PrfA-box has been identified in front of almost all internalin genes. This work confirmed, that the expression of most internalin genes is PrfA-dependent. However, the transcription pattern was not uniform under different in vitro conditions. Finally, the analysis of gene expression after infection of several cell lines showed, that the internalin genes are transcribed differentially during infection. From this it can be concluded that they may have a role in the infection process. The expression pattern of the open reading frames flanking LIPI-2 confirmed, that these genes are transcribed PrfA independently and constitutively in vitro. This suggests that they do not contribute to virulence of L. ivanovii. Examination of the virulence cluster genes finally showed, that there is a strong PrfA dependency in gene expression. It could be confirmed, that the transcription of these genes is increased under PrfA inducing conditions. In addition, after infection also a strong expression could be detected. KW - Listeria ivanovii KW - Virulenz KW - Molekulargenetik KW - Listeria KW - Listeria ivanovii KW - LIPI-2 KW - Pathogenitätsinsel KW - Internaline KW - ydeI KW - rnaH KW - norA KW - Genexpression KW - Listeria KW - Listeria ivanovii KW - LIPI-2 KW - pathogenicity island KW - internalins KW - ydeI KW - rnaH KW - norA KW - gene expression Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3303 ER - TY - THES A1 - Lang, Carmen T1 - Molekulare Charakterisierung, Expressionsmuster und Interaktionen der Lamina-assoziierten Polypeptide 2 (LAP2) in Xenopus laevis T1 - Molecular characterization, expression pattern and interactions of lamina-associated polypeptides 2 (LAP2) in Xenopus laevis N2 - Lamina-assoziierte Polypeptide 2 (LAP2) in Vertebraten sind bis auf zwei Ausnahmen integrale Membranproteine der inneren Kernmembran, die durch unterschiedliches Spleißen eines einzigen Gens entstehen. Während die aminoterminale Domäne, die allen LAP2 Isoformen gemeinsam ist, in Interphasezellen mit Chromatin und dem DNA-Bindungsprotein BAF interagiert, beinhaltet der carboxyterminale Bereich die Lamin Bindungsdomäne und eine Transmembrandomäne. Diese beiden carboxyterminalen Domänen bewirken die Lokalisation der Proteine an die Kernhülle. In dieser Arbeit konnten drei LAP2 Isoformen von Xenopus laevis molekular charakterisiert werden, die alle integrale Membranproteine sind. In somatischen Zellen werden vorwiegend die beiden Isoformen LAP2γ und LAP2ß exprimiert, in frühen Entwicklungsstadien dagegen die größte Isoform, das LAP2ω. In allen bekannten funktionellen Domänen weisen die LAP2 Proteine von Xenopus eine hohe Sequenzübereinstimmung mit den LAP2 Proteinen in Säugern auf. Allerdings finden sich in Xenopus zusätzliche Isoform-spezifische Proteindomänen, die zwischen der amino-terminalen Domäne und der Lamin Bindungsdomäne eingeschoben sind. Eine dem Xenopus LAP2ω im Aufbau und in der Expression vergleichbare Isoform wurde bisher nur beim Zebrafisch nachgewiesen. Auch die somatisch exprimierten LAP2 Isoformen des Zebrafisch (ZLAP2b und ZLAP2g) entsprechen den beiden somatischen Xenopus Isoformen. Um Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den drei LAP2 Isoformen feststellen zu können, wurden die Proteine des Zebrafischs als GFP Fusionsproteine in Xenopus A6 Zellen exprimiert. ZLAP2ω und LAP2ß wurden vorwiegend an mitotische Chromosomen gebunden, dagegen war der größte Teil des ZLAP2g im Cytoplasma verteilt. Mutanten der drei Proteine, denen jeweils die Lamin Bindungsdomäne einschließlich der Transmembrandomäne fehlte, zeigten dasselbe Verhalten. Somit scheinen diese b- und w-spezifischen Domänen Chromatin-Bindungseigenschaften zu besitzen. In Amphibien liegt das XLAP2ß in der Interphase in einem Proteinkomplex mit A- und B-Typ Laminen vor. Diese Proteinkomplexe konnten durch Immunpräzipitationen von GFP-XLAP2ß Fusionsproteinen mit GFP Antikörpern nachgewiesen werden. Die Extrakte für die Immunpräzipitationen wurden aus stabil transfizierten Xenopus A6 Zelllinien gewonnen. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit in vitro Bindungsstudien mit GST- XLAP2ß Fusionsproteinen. Für die Bildung des Lamin-LAP2ß Proteinkomplexes und auch für die korrekte Lokalisation des Proteins an die Kernhülle reicht ein in Vertebraten hochkonservierter Bereich von 36 Aminosäuren in Kombination mit der Transmembrandomäne aus. Zudem scheint diese kurze carboxyterminale LAP2ß Sequenz in Xenopus, Zebrafisch und Ratte mit dem endogenen LAP2ß um Bindungsstellen in der Kernlamina zu konkurrieren. Sowohl in Amphibien- wie auch in Säugerzellen konnte in transient transfizierten Zellen eine beträchtliche Verminderung des endogenen LAP2ß beobachtet werden, ohne dass dabei die Kernmorphologie und die Verteilung anderer Kernmembranproteine beeinträchtigt wurde. Somit scheint die Lamin-Bindungsdomäne des LAP2ß in Vertebraten stark konserviert zu sein. N2 - Lamina-associated polypeptides 2 (LAP2) in vertebrates are, except for two mammalian isoforms, integral membrane proteins of the inner nuclear membrane which are generated by alternative splicing from a single gene. Whereas the aminoterminal domain, which is common for all LAP2 isoforms, interacts with chromatin and the DNA-binding protein BAF in interphase cells, the carboxyterminal region contains the lamin binding domain and a transmembrane domain. Both carboxyterminal domains are responsible for the localisation of the proteins in the nuclear envelope. In this work three LAP2 isoforms of Xenopus laevis were molecularly characterised, all of them being integral membrane proteins. In somatic cells the two predominant isoforms are LAP2γ and LAP2ß, whereas in early developmental stages only the largest isoform LAP2ω can be found. In all known functional domains, the LAP2 proteins of Xenopus show a high sequence homology to the LAP2 proteins of mammals. But in Xenopus, additional isoform-specific domains can be found which are inserted between the aminoterminal domain and the lamin binding domain. Only in zebrafish, an isoform comparable in structure and expression pattern to the Xenopus LAP2ω can be found. Also the LAP2 isoforms characteristic for somatic cells of zebrafish (LAP2ß and LAP2γ) correspond to the two somatic Xenopus isoforms. To enable the investigation of differences and similarities between the three LAP2 isoforms, the zebrafish proteins were expressed as GFP fusion proteins in Xenopus A6 cells. ZLAP2ω and ZLAP2ß were mainly bound to mitotic chromosomes, whereas ZLAP2γ was mostly distributed in the cytoplasm. Mutants of the three proteins which were lacking the lamin binding region and the transmembrane domain, showed the same behaviour. It seems therefore that the ω- and ß-specific domains mediate chromatin binding. In interphase cells of amphibian XLAP2ß is part of a protein complex also containing A- and B-type lamins. The existence of these protein complexes could be demonstrated by immunoprecipitations of GFP-LAP2ß fusion proteins with GFP antibodies. The extracts used for these immunoprecipitations were prepared from stably transfected Xenopus A6 cell lines. These results correspond to the results obtained by in vitro binding studies with GST-XLAP2ß fusion proteins. In vertebrates a short, highly conserved region of 36 amino acids in combination with the transmembrane domain, is sufficient for the formation of the lamin-LAP2ß protein complex as well as for the correct localisation of the proteins to the nuclear envelope. Moreover, it seems that this short carboxyterminal sequence of LAP2ß in Xenopus, zebrafish and rat competes with endogenous LAP2ß for the same binding sites in the nuclear lamina. In amphibian as well as in mammalian cells a significant reduction of the endogenous LAP2ß can be seen in transiently transfected cells. The nuclear morphology and the distribution of other nuclear components seems to be unchanged. Therefore it can be concluded that the lamin binding domain of LAP2ß is highly conserved in vertebrates. KW - Glatter Krallenfrosch KW - Kernhülle KW - Polypeptide KW - Genexpression KW - Lamina-assoziierte Polypeptide KW - Expressionsmuster KW - Interaktionen KW - molekulare Charakterisierung KW - Lamina-associated polypeptides KW - expression pattern KW - interactions KW - molecular characterization Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3844 ER - TY - THES A1 - Treichel, Dieter T1 - Isolierung, evolutive Einordnung und funktionelle Charakterisierung von Knopfkopf, einem buttonhead-Ortholog in der Maus T1 - Isolation, evolutioniary analysis and functional characterization of Knopfkopf, a buttonhead ortholog in the mous. N2 - Isolierung des Sp1-verwandten Transkriptionsfaktors Knopfkopf mittels eines PCR-basierten Homologie-Screens in der Maus. Das Gen Knopfkopf wurde anschließend hinsichtlich der evolutiven Verwandtschaftsbeziehungen zum Drosophila-Gen buttonhead eingeordnet. Eine funktionelle Charakterisierung erfolgte mit Hilfe einer gezielten Geninaktivierung durch homologe Rekombination (knock out). Es konnte gezeigt werden, dass das Gen in der Embryogenese der Maus essentiell ist für die Entwicklung der Extremitäten, der Nase und des Zentralen Nervensystems sowie der sekundären Gastrulation. N2 - Isolation of the Sp1-related transkription factor Knopfkopf by a PCR-based homology screen in the mouse. The Knopfkopf gene was analysed regarding its evolutionary relationship with the Drosophila gene buttonhead. The functional characterization was done via a targeted gene inactivation by a homologous recombination (knock out). It was shown that the gene is necessary during the mouse embryogenesis for the development of limbs, nose, central nervous system, as well as the secondary gastrulation. KW - Maus KW - Gap-gen KW - Gastrulation KW - Genexpression KW - Knopfkopf KW - buttonhead KW - Knopfkopf KW - buttonhead Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5867 ER - TY - THES A1 - Reisch, Natasa T1 - Das Cysteine-String-Protein in Drosophila melanogaster: Molekulare und funktionelle Analyse verschiedener CSP-Mutanten; Ein Modell zur räumlich und zeitlich kontrollierten CSP-Expression T1 - The cysteine string protein in Drosophila melanogaster: Molecular and functional analysis of different CSP-mutants; A model for spatial and temporal controlled CSP-expression N2 - Die Exozytose von Neurotransmittern und Peptiden während der Verarbeitung und Weiterleitung von Reizen im Nervensystem wird durch eine komplexe Maschinerie von Proteinen reguliert. Das konservierte Cysteine String Protein (CSP), das gebunden an synaptische und andere sekretorische Vesikel vorliegt, konnte in den vergangenen Jahren als Teil in diesen Prozess eingeordnet werden. Die Frage nach der genauen Funktion von CSP während der Exozytose ist allerdings weiterhin offen. CSP-Nullmutanten in Drosophila melanogaster zeigen temperatursensitive Paralyse und eine extrem verkürzte Lebenserwartung, gepaart mit verminderter Fertilität. In larvalen Nerv-Muskel Präparaten kommt es bei Temperaturen über 29°C zu einem reversiblen Block der elektrophysiologisch messbaren synaptischen Transmission. Die Primärstruktur des Cysteine String Proteins kann in folgende konservierte Sequenzabschnitte unterteilt werden: eine N-terminale Protein Kinase A Phosphorylierungsstelle, eine Region mit Homologie zu einer charakteristischen Domäne von DnaJ-Proteinen (DnaJ-Domäne), einen als Linkerregion bezeichneten Abschnitt, eine cysteinreiche Sequenz, die bei Drosophila aus dem namensgebenden Strang von 11 aufeinanderfolgenden Cysteinen flankiert von 2 Cysteinpaaren besteht, und einen schwächer konservierten C-Terminus, in dem sich auch einzelne Spleißvarianten unterscheiden. Versuche mit Vertebraten konnten zeigen, dass CSP in einem trimeren Komplex aus Hsc70/CSP/SGT vorkommt und bei der Exozytose wahrscheinlich als molekulares Co-Chaperon wirkt. Der Cysteinstrang liegt mehrfach palmityliert vor und ist für die Zielfindung des Proteins zur Vesikelmembran essentiell. In vorangegangenen Arbeiten wurde begonnen, bei Drosophila durch gezielte Mutagenese und Keimbahntransformation die Rolle des Cysteinstrangs, der Linkerregion und des C-Terminus für die Funktion des CSP zu analysieren. In der vorliegenden Dissertation wurden in transgenen Fliegen die Eigenschaften von Isoformen mit vier unterschiedlich mutierten Varianten des Cysteinstrangs (CSLP, SCSP, CLP, SSP) und je Deletionen in der Linkerregion (LΔ8) und im C-terminalen Bereich (CΔ27) charakterisiert. Die subzelluläre Verteilung und veränderte Membranbindungseigenschaften dieser Proteine wurden mithilfe von Membranfraktionierung und Glycerindichtegradienten von Homogenaten der transgenen Mutanten aufgezeigt. Die Isoformen CLP und SSP sind aufgrund der fehlenden Palmitylierung nicht an die Membran der synaptischen Vesikel gebunden, während die Isoform CSLP sowohl in der Vesikelmembranfraktion als auch als lösliches Protein nachgewiesen werden kann. Die flankierenden Cysteinpaare und die verbliebenen Cysteine in den Isoformen CSLP und SCSP erfüllen offenbar noch teilweise die Aufgabe des Cysteinstrangs bei der Zielfindung der Proteine. Eine Depalmitylierung mit Hydroxylamin löst das verkürzte SCSP Protein ebensowenig aus der Membran wie das intakte CSP. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen stehen im Einklang mit immunhistochemischen Befunden. Die Deletion bzw. Substitution der zentralen 11 Cysteine in den Isoformen CSLP, CLP und SSP äußert sich in den transgenen Fliegen in einer gleichmäßigeren Verteilung der Proteine, die nicht mehr wie im Wildtyp auf das synaptische Neuropil beschränkt ist. Keine der Isoformen mit verändertem Cysteinstrang ist in der Lage die Funktion des wildtypischen CSP zu übernehmen, da die adulten transgenen Fliegen den temperatursensitiven Phänotyp und eine kurze Lebensdauer ähnlich den Csp-Nullmutanten zeigen. Die Proteinisoformen LΔ8 und CΔ27 dagegen lassen in den biochemischen Analysen keine Abweichung vom Wildtyp erkennen und weisen auch eine wildtypische Verteilung in Kryostat-Gehirnschnitten auf. Die Deletion in der Linkerregion in der Isoform LΔ8 scheint die Funktion des CSPs allerdings einzuschränken, da die entsprechenden transgenen Fliegen bereits bei 38°C, wildtypische Tiere dagegen erst bei 40°C paralysieren. Die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Drosophila CSP und Syntaxin konnte für die transgen exprimierte größte CSP Isoform CSP1 in Immunpräzipitationsexperimenten mit Drosophila-Kopfhomogenat bestätigt werden. Die Frage nach einer Interaktion zwischen Syntaxin und den anderen untersuchten mutierten CSP-Isoformen bleibt dagegen offen. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Versuch, mithilfe des UAS/Gal4- und des Flippase/FRT -Systems die CSP-Expression räumlich und zeitlich zu kontrollieren. Dazu wurde aufgrund von Datenbankangaben eine minimale FRT-Sequenz aus Oligonukleotiden mit entsprechenden Linkern konstruiert. Das gesamte Csp-Gen beziehungsweise die Csp cDNA1 einschließlich der regulatorischen Sequenzen wurde zwischen zwei gleichgerichteten FRT-Sequenzen pW8 eingebracht. Die Keimbahntransformation führte zu mehreren transgenen Fliegenlinien. Nach aufwendigen Kreuzungen mit Gal4-, UAS-Flippase- und Csp-Null-Linien entstanden Fliegen im CSP-Nullhintergrund, welche eine durch die verwendete Gal4-Linie definierte Expression von Flippase zeigten und das FRT-Konstrukt trugen. Diese Fliegen sollten in Flippase positiven Bereichen keine CSP-Expression mehr zeigen. Verhaltensanalysen an solchen Tieren bei normaler und erhöhter Temperatur könnten dann Aufschluss über die Funktion der Zellen ohne CSP-Expression geben. Leider konnten die erwarteten Veränderungen in der CSP-Expression nicht beobachtet werden, obwohl alle Konstrukte sich nach einer Überprüfung als intakt erwiesen haben. Die Ursache für die fehlende Rekombination zwischen den FRT-Sequenzen ist möglicherweise in einer zu geringen Länge dieser Zielsequenz der Flippase zu suchen. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird der Csp-Genlokus und seine benachbarten Gene vorgestellt, und die möglichen Auswirkungen der Deletionen in den zur Verfügung stehenden Mutanten CspU1, CspU1w und CspK16 diskutiert. Aufgrund der Daten aus dem Drosophila Genomprojekt lag die Spekulation nahe, dass der Phänotyp der Deletionsmutanten auch durch eine veränderte Expression der benachbarten Gene stromab- und stromaufwärts des Csp Gens beeinflusst werden könnte. Die Auswertung eines Northern Blots von PolyA+-RNA adulter Fliegen, sowie einfache Verhaltenstests an vorliegenden und neu generierten CSP-Nullmutanten konnten diesen Verdacht allerdings nicht bestätigen. N2 - Exocytosis during synaptic transmission is regulated by a complex machinery of numerous proteins. CSPs (cysteine string proteins), conserved from C.elegans to mamals, are attached to synaptic vesicle membranes and other secretory granules. They were therefore implicated to play a distinct part in this regulated process. However the exact role of the CSP protein in exocytosis is not yet known. Studies of Drosophila in null mutants for the Csp gene revealed a temperature sensitive paralytic phenotype, severely shortened lifespan and fertility. Exposure of larval nerve-muscle preparations to elevated temperatures (>29°C) lead to a reversible block of neurotransmitter release in electrophysiological measurements. The primary structure of the cysteine string protein is characterized by distinct conserved domains: a N-terminal protein kinase A (PKA) phosphorylation site, a region showing high homology to a domain found in DnaJ proteins (DnaJ-domain), a region called linker domain, a cysteine rich region, which in Drosophila comprises the characteristic string of 11 cysteines flanked by two additional pairs of cysteines, and a less conserved C-terminal region, which is absent in various splice variants. Experiments using vertebrates showed that CSP is part of a trimeric complex of Hsc70/CSP/SGT and may possibly act as co-chaperone during exocytotic processes. The cysteine string is found to be modified with multiple palmitoyl residues and appears to be essential for targeting of the protein to the vesicle membrane. In earlier studies mutagenesis and germ-line transformation were used to initiate an analysis on the role of the cysteine string, the linker domain and C-terminal region for CSP function. The present thesis extends this work by characterizing in transgenic flies four different mutated cysteine string isoforms (CSLP, SCSP, CLP, SSP) and deletions affecting the linker domain (LΔ8) and C-terminal region (CΔ27) using transgenic flies. The subcellular distribution and altered membrane binding properties of the mutated isoforms were analyzed using glycerol gradients and membrane fractionation. Due to the lack of palmitoylation CLP and SSP are exclusively found as soluble proteins in the cytosol whereas CSLP can also be found attached to vesicle membranes in membrane fractions. The flanking and remaining cysteines in the isoforms CSLP and SCSP apparently are able to partially direct the proteins to the membrane. The shortened cysteine string in SCSP is sufficient to induce membrane binding and is as resistant to depalmitoylation with hydroxylamine as wildtype CSP. The biochemical results correspond to the immunohistochemical findings, which show an almost homogenous distribution of the proteins CSLP, CLP and SSP, unlike the wildtype staining which is confined to neuropil regions in the adult brain. The mutant isoforms with deleted or substituted cysteine string do neither rescue the temperature sensitive phenotype nor the short life span observed in CSP-null mutants. In contrast the proteins LΔ8 and CΔ27 exhibit wildtype properties in the biochemical assays and the staining pattern of the adult brain. The deletion LΔ8 seems to interfere with regular CSP function in some way, as these transgenic flies paralyze at 38°C whereas wildtype flies paralyze at 40°C. The previously described interaction of CSP and syntaxin in Drosophila could be confirmed by precipitating syntaxin together with the largest CSP isoform CSP1 from Drosophila head homogenates using an antibody against CSP. A possible disruption of this interaction in the mutant transgenic flies could not be shown and remains to be investigated. The second part of this work describes the attempt to temporally and spatially regulate CSP expression by employing the UAS/Gal4- and flippase/FRT-system. Using database information a minimal FRT-sequence with apprropriate linkers was generated from oligonucleotides. The entire Csp gene or Csp cDNA1 with necessary regulatory sequences was ligated between two FRT sites and inserted into the transformation vector pW8. After extensive crossing of transgenic flies carrying the FRT-construct with Gal4-,UAS-flippase-, and Csp-null-lines flies were obtained which expressed the flippase in defined areas of Gal4 expression and contained the FRT construct, all in Csp-null background. Areas positiv for flippase expression should loose transgenic CSP expression. Behavioural analyis of these flies at normal and elevated temperatures should provide functional information on the cells lacking CSP. Unfortunately no differences in behaviour or staining pattern of adult brain could be detected, although all constructs were proven to be functional. The lack of recombination events might be due to the reduced length of the flippase target sequence used. The third project presents the Csp-locus and its neighbouring genes in Drosophila. The possible influence of deletions in the CSP null mutants CspU1, CspU1w and CspK16 on the expression of neighbouring genes are discussed. Based on sequence data offered by the Drosophila genome project it was speculated that these genes might influence the mutant phenotype. Northern blotting of adult head polyA+-RNA, simple tests of behaviour of already known and newly generated Csp null mutants could not confirm this speculation. KW - Taufliege KW - Cysteinderivate KW - Genexpression KW - Cysteine String Protein KW - Drosophila melanogaster KW - Cysteine String Protein KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6291 ER - TY - THES A1 - Körner, Ulrich T1 - Funktionelle Rolle von HMGN-Proteinen während der Embryonalentwicklung von Xenopus laevis T1 - The functional role of the HMGN proteins during embryogenesis of Xenopus laevis N2 - HMGN Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und besitzen die Fähigkeit, Chromatin aufzulockern. Sie ermöglichen anderen Proteinen den Zugang zu Nukleosomen und unterstützen DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle der HMGN Proteine während der Embryogenese am Beispiel des südafrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis untersucht. Dabei wurde entdeckt, dass sowohl die Expression als auch die zelluläre Verteilung der HMGN Proteine entwicklungsspezifisch reguliert ist. Eine Manipulation der HMGN Proteinmengen während der Embryonalentwicklung führte zu schweren Fehlentwicklungen in Postblastula Embryonen. In der Oogenese waren sowohl Xenopus HMGN mRNAs als auch Xenopus HMGN Proteine in allen Oozytenstadien nachweisbar. Interessanterweise waren HMGN Proteine in späteren Oozytenstadien nur im Zytoplasma zu finden und nicht mit Lampenbürstenchromosomen assoziiert. Im Zuge der Maturation der Oozyten zu Eiern verschwinden die Proteine gänzlich. Während der Embryogenese waren HMGN Proteine dann erst wieder ab der Blastula detektierbar, zeitgleich mit der transkriptionellen Aktivierung des embryonalen Genoms. Gleichzeitig wiesen ihre Expressionsmuster, zumindest auf mRNA-Ebene, auf Gewebspezifität hin. Whole mount in situ-Hybridisierungen und RT-PCR-Analysen zeigten eine erhöhte mRNA-Menge in mesodermalen und neuroektodermalen Geweben von Schwanzknospenstadien. Nach Injektion rekombinanter HMGN Proteine (Überexpression) oder Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (knock-down) in die Zygote entwickelten sich Embryonen mit offenen Rücken, stark verkürzten und gebogenen Körperachsen und deformierten Kopfstrukturen als Hauptmerkmale. Histologische Analysen und insbesondere die Magnetresonanz Bildgebung deuteten auf Fehler in der Mesodermdifferenzierung hin. Die Analysen zeigen, dass eine bestimmte kritische zelluläre HMGN Proteinmenge für eine korrekte Embryonalentwicklung von Xenopus laevis notwendig ist. Durch „animal cap assays“ und RT-PCR-Expressionsanalysen Mesoderm-spezifischer Gene konnte schließlich gezeigt werden, dass HMGN Proteine die Regulation Mesoderm-spezifischer Gene beeinflussen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass auch die HMGN-Genexpression während der Mesodermdifferenzierung reguliert wird. Durch eine Analyse des Expressionsbeginns entwicklungsrelevanter Gene während der Midblastula Transition konnte gezeigt werden, dass veränderte HMGN Proteinmengen den Expressionsbeginn spezifischer Gene wie Xbra und chordin beeinflussen. Damit konnte zum ersten Mal ein Einfluss dieser ubiquitären Chromatinproteine auf die Expression spezifischer Gene gefunden werden. Die durch HMGN Proteine verursachte fehlerhafte Expression von Xbra und chordin als Schlüsselgene der Mesodermdifferenzierung kann die Fehlentwicklungen mesodermaler Strukturen erklären. N2 - HMGN proteins are architectural chromatin proteins that reduce the compaction of the chromatin fiber, facilitate access to nucleosomes and modulate DNA-dependent processes such as replication, transcription and DNA repair. In this work the functional role of the HMGN proteins during embryogenesis was analyzed using the African clawed frog Xenopus laevis as a model system. The expression and cellular location of the HMGN proteins was found to be developmentally regulated. Experimental manipulations of the HMGN protein amounts led to gross developmental defects in postblastula embryos. HMGN transcripts and proteins were present throughout oogenesis. Interestingly, the HMGN proteins were stored in the cytoplasm of later oocyte stages and excluded from the oocytes nuclei and lampbrush chromosomes. Upon maturation of oocytes into eggs, HMGN proteins were no longer detectable. During embryogenesis, HMGN proteins were first detected in blastula stage embryos, coinciding with the transcriptional activation of the embryonic genome. At least at the mRNA level the expression pattern showed a tissue specific pattern, with relatively high levels of mRNAs in the mesodermal and neuroectodermal regions of early tailbud embryos as shown by whole mount in-situ hybridization and RT-PCR-analyses. After microinjection of recombinant HMGN proteins (overexpression) or morpholino-antisense oligonucleotides (knock-down) the embryos displayed typical phenotypes with imperfect closure of the blastopore, distorted body axis and abnormal head structures. Histological analyses and magnetic resonance imaging indicated that mesoderm differentiation was particularly affected by aberrant HMGN protein levels. The results demonstrate that proper embryonic development of Xenopus laevis requires precisely regulated levels of HMGN proteins. “Animal cap assays” and RT-PCR-analyses of the expression of mesodermal genes indicated that HMGN proteins are involved in the regulation of mesoderm specific genes. These experiments also indicated that the HMGN expression itself is regulated during mesoderm differentiation. Moreover, by studying the expression pattern of developmentally relevant genes during midblastula transition it became evident that altered HMGN protein levels influence the onset of the expression of specific genes such as Xbra and chordin. The results show, for the first time, that these ubiquitous chromatin proteins modulate the expression of specific genes. The HMGN-induced misexpression of Xbra and chordin as key regulatory genes during mesoderm differentiation may explain the observed malformations of mesodermal structures. KW - Glatter Krallenfrosch KW - HMG-Proteine KW - Genexpression KW - Embryonalentwicklung KW - HMGN Proteine KW - Xenopus laevis KW - Genexpression KW - Chromatin KW - Embryonalentwicklung KW - HMGN proteins KW - Xenopus laevis KW - chromatin KW - gene expression KW - early development Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9166 ER -