TY  - THES
A1  - Nuwal, Tulip
T1  - Characterization of Synapsin, Tubulin-Binding Chaperone E-like, And Their Putative Interactions With Synapse Associated Protein Of 47 kDa In Drosophila melanogaster
N2  - In this thesis we have used Drosophila melanogaster as a model organism to investigate proteins and their putative interacting partners that are directly or indirectly involved in the release of neurotransmitters at the synapse. We have used molecular techniques to investigate conserved synaptic proteins, synapsin and synapse associated protein of 47 kD (SAP47), and a putative interaction partner of SAP47, tubulin binding chaperone E-like (TBCEL). SAP47 and synapsins are highly conserved synaptic vesicle associated proteins in Drosophila melanogaster. To further investigate the role and function of Sap47 and Syn genes, we had earlier generated the null mutants by P-element mutagenesis (Funk et al., 2004; Godenschwege et al., 2004). Western blots and ELISA of brain homogenates from Sap47156 null mutants showed the presence of up-regulated phospho-synapsin in comparison to wild-type (CS) and the presence of up-regulated phospho-synapsin was partially abolished when a pan-neuronal rescue of SAP47 was performed by the Gal4- UAS technique. Thus, the results suggest a qualitative and quantitative modulation of synapsin by SAP47. At the transcript level, we did not observe any difference in content of Syn transcript in Sap47156 and wild-type CS flies. The question of a direct molecular interaction between SAP47 and synapsin was investigated by co-immunoprecipitation (Co-IP) experiments and we did not find any stable interactions under the several IP conditions we tested. The possibility of Sap47 as a modifier of Syn at the genetic level was investigated by generating and testing homozygous double null mutants of Sap47 and Syn. The Syn97, Sap47156 double mutants are viable but have a reduced life span and decreased locomotion when compared to CS. In 2D-PAGE analysis of synapsins we identified trains of spots corresponding to synapsins, suggesting that synapsin has several isoforms and each one of them is posttranslationally modified. In an analysis by Blue native-SDS-PAGE (BN-SDS-2D- PAGE) and Western blot we observed synapsin and SAP47 signals to be present at 700-900 kDa and 200-250 kDa, respectively, suggesting that they are part of large but different complexes. We also report the possibility of Drosophila synapsin forming homo- and heteromultimers, which has also been reported for synapsins of vertebrates. In parallel to the above experiments, phosphorylation of synapsins in Drosophila was studied by IP techniques followed by 1D-SDS gel electrophoresis and mass spectrometry (in collaboration with S. Heo and G. Lubec). We identified and verified 5 unique phosphorylation sites in Drosophila synapsin from our MS analysis. Apart from phosphorylation modifications we identified several other PTMs which have not been verified. The significance of these phosphorylations and other identified PTMs needs to be investigated further and their implications for synapsin function and Drosophila behavior has to be elucidated by further experiments. In a collaborative project with S. Kneitz and N. Nuwal, we investigated the effects of Sap156 and Syn97 mutations by performing a whole Drosophila transcriptome microarray analysis of the individual null mutants and the double mutants (V2 and V3). We obtained several candidates which were significantly altered in the mutants. These genes need to be investigated further to elucidate their interactions with Sap47 and Syn. In another project, we investigated the role and function of Drosophila tubulin- binding chaperone E-like (Tbcel, CG12214). The TBCEL protein has high homology to vertebrate TBCE-like (or E-like) which has high sequence similarity to tubulin-binding chaperone E (TBCE) (hence the name TBCE-Like). We generated an anti-TBCEL polyclonal antiserum (in collaboration with G. Krohne). According to flybase, the Tbcel gene has only one exon and codes for two different transcripts by alternative transcription start sites. The longer transcript RB is present only in males whereas the shorter transcript RA is present only in females. In order to study the gene function we performed P- element jump-out mutagenesis to generate deletion mutants. We used the NP4786 (NP) stock which has a P(GawB) insertion in the 5’ UTR of the Tbcel gene. NP4786 flies are homozygous lethal due to a second-site lethality as the flies are viable over a deficiency (Df) chromosome (a deletion of genomic region spanning the Tbcel gene and other upstream and downstream genes). We performed the P-element mutagenesis twice. In the first trial we obtained only revertants and the second experiment is still in progress. In the second attempt, jump-out was performed over the deficiency chromosome to prevent homologous chromosome mediated double stranded DNA repair. During the second mutagenesis an insertion stock G18151 became available. These flies had a P-element insertion in the open reading frame (ORF) of the Tbcel gene but was homozygous viable. Western blots of fresh tissue homogenates of NP/Df and G18151 flies probed with anti-TBCEL antiserum showed no TBCEL signal, suggesting that these flies are Tbcel null mutants. We used these flies for further immunohistochemical analyses and found that TBCEL is specifically expressed in the cytoplasm of cyst cells of the testes and is associated with the tubulin of spermatid tails in wild-type CS, whereas in NP/Df and G18151 flies the TBCEL staining in the cyst cells was absent and there was a disruption of actin investment cones. We also found enrichment of TBCEL staining around the actin investment cone. These results are also supported by the observation that the enhancer trap expression of the NP4786 line is localised to the cyst cells, similar to TBCEL expression. Also, male fertility of NP/Df and G18151 flies was tested and they were found to be sterile with few escapers. Thus, these results suggest that TBCEL is involved in Drosophila spermatogenesis with a possible role in the spermatid elongation and individualisation process.
N2  - In dieser Arbeit benutzte ich Drosophila melanogaster als Modellorganismus für die Untersuchung von Proteinen und ihren möglichen Interaktionspartnern, die direkt oder indirekt an der Freisetzung von Neurotransmittern an der Synapse beteiligt sind. Für die Untersuchung der konservierten synaptischen Proteine Synapsin (SYN) und Synapsen-assoziertes Protein von 47 kDa (SAP47), sowie ihrer möglichen Interaktionspartner, bediente ich mich molekularer Methoden. SAP47 und SYN sind hoch konservierte Proteine von Drosophila melanogaster, die mit synaptischen Vesikeln assoziert sind. Um die Rolle und Funktion der Sap47- und Syn-Gene näher zu beleuchten, wurden bereits früher mit Hilfe von P-Element Mutagenesen Null Mutanten generiert (Funk et al., 2004; Godenschwege et al., 2004). Western Blots und ELISA der Gehirnhomogenate der Sap47156 Nullmutanten zeigten im Vergleich zum Wildtyp (CS) das Vorhandensein von hochreguliertem phospho-Synapsin. Dieser Effekt ließ sich durch ein panneuronales Rescue wieder partiell rückgängig machen. Diese Ergebnisse lassen eine qualitative sowie quantitative Modulation von SYN druch SAP47 vermuten. Auf der Transkriptebene konnte ich keinen Unterschied im Gehalt von Syn Transkript zwischen den Sap47156 und wildtypischen CS Fliegen feststellen. Das Vorhandensein einer direkten molekularen Interaktion zwischen SAP47 und SYN wurde in Co-Immunopräzipitations-Experimenten (CO-IP) untersucht. Ich konnte unter diversen getesteten IP Bedingungen keine stabilen Interaktionen finden. Die Möglichkeit, dass Sap47 auf der molekularen Ebene modifizierend auf das Syn-Gen wirkt, wurde durch das Erzeugen und Testen homozygoter doppelter Nullmutanten für Sap47 und Syn untersucht. Syn97, Sap47156 Doppelmutanten sind lebensfähig, zeigen jedoch eine im Vergleich zu CS reduzierte Lebensspanne und Lokomotion. In einer 2D-SDS-PAGE Analyse der Synapsine identifizierte ich Reihen von Synapsin-Signalen, die darauf schließen ließen, dass Synapsin über mehrere Isoformen verfügt, von denen jede mehrfach posttranslational modifiziert ist. In einer Blue native-SDS-PAGE (BN-SDS-2D-PAGE) mit anschließendem Western Blot konnte ich Synapsin und SAP47 Signale bei 700-900 kDa beziehungsweise 200-250 kDa feststellen, was darauf schließen ließ, dass sie als Komponenten von unterschiedlichen größeren Komplexen fungieren. Ich zeigte außerdem die Möglichkeit auf, dass Drosophila Synapsin Homo- und Heteromultimere bilden kann, was bereits für Synapsine von Wirbeltieren gezeigt wurde. Gleichzeitig mit den obigen Experimenten untersuchte ich durch IP Methoden, gefolgt von 1D SDS Gelelektrophorese und Massenspektroskopie (in Zusammenarbeit mit S. Heo und G. Lubec), die Phosphorylierung der Synapsine in Drosophila. In der MS Analyse konnte ich 5 distinkte Phosphorylierungs-Stellen des Drosophila Synapsins identifizieren und verifizieren. Zusätzlich zu den Modifikationen durch Phosphorylierung konnte ich einige andere posttranslationale Modifikationen zeigen, die jedoch nicht verifiziert wurden. Die Bedeutung dieser Phosphorylierung, sowie anderer identifizierter Modifikationen, sollte durch weitere Experimente beleuchtet werden. In einem Kollaborationsprojekt mit S. Kneitz und N. Nuwal untersuchte ich die Auswirkungen der Sap47156 und Syn97 Mutationen mithilfe einer Microarray Analyse des gesamten Drosophila Transkriptoms der individuellen Nullmutanten sowie Doppelmutanten (V2 und V3). Es wurden einige Kandidaten gefunden, die in den Mutanten signifikante Änderungen aufweisen. Diese Gene sollten weiterhin auf ihre Interaktionen mit Sap47 und Syn untersucht werden. In einem weiteren Projekt untersuchte ich die Rolle und Funktion des Drosophila tubulin binding chaperon E-like-Gens(Tbcel, CG12214). Das TBCEL Protein weist eine hohe Homologie zum Vertebraten TBCE-like (oder E-like) auf, welches über eine namensgebende hohe Sequenzähnlichkeit zum Tubulin bindenden Chaperon E (TBCE) verfügt. Ich erzeugte ein polyklonales anti-TBCEL Antiserum (in Kollaboration mit G. Krohne). Laut Flybase besitzt das Tbcel-Gen nur ein Exon und kodiert für zwei unterschiedliche Transkripte durch alternative Orte des Transkriptionsstarts. Das längere Traskript RB ist nur in Männchen vorhanden, während das kürzere Transkript RA sich nur in Weibchen finden lässt. Um eine Untersuchung der Genfunktion zu ermöglichen, führte ich eine P-Element jump-out-Mutagenese durch, mit der Deletions-Mutanten generiert werden sollten. Ich benutzte dazu den Stamm NP4786 (NP), welches eine P(GawB) Insertion in der 5´ UTR des Tbcel-Gens aufweist. NP4786 Fliegen sind aufgrund einer second-site Lethalität homozygot letal, da sie über einer chromosomalen Defizienz (Df) (einer Deletion der genomischen Region, die das Tbcel-Gen sowie benachbarte Gene umfasst) lebensfähig sind. Die P-Element jump-out-Mutagenese wurde von mir zweimal durchgeführt, wobei ich beim ersten Mal nur Revertanten erhielt, während der zweite Durchgang sich momentan noch in Arbeit befindet. Beim zweiten Versuch wurde der jump-out über dem Defizienz-Chromosom durchgeführt, um eine doppelsträngige DNA Reparatur durch das homologe Chromosom zu verhindern. Während der zweiten Mutagenese wurde ein Stamm G18151 verfügbar, bei welchem die P-Element Insertion im offenen Leseraster (Open reading frame: ORF) des Tbcel-Gens erfolgt war. Western Blots von frischem Gewebehomogenat der NP/Df und G18151 Fliegen zeigten nach dem Testen mit anti-TBCEL Antiserum kein Signal, was darauf schließen lässt, dass diese Fliegen Tbcel Nullmutanten sind. Ich verwendete diese Fliegen für weitere immunhistochemische Analysen und fand heraus, dass TBCEL im Wildtyp spezifisch im Zytoplasma der Cysten-Zellen der Hoden exprimiert wird, sowie mit dem Tubulin der Spermatidenschwänze assoziert ist, während es in den NP/Df und G18151 Fliegen keine TBCEL-Färbung der Cysten-Zellen gab. Des weiteren konnte eine Störung der Actin Kegel und eine Anreicherung von TBCEL um diese herum gezeigt werden. Diese Ergebnisse werden zusätzlich durch die Beobachtung unterstützt, dass die Enhancer-trap Expression der NP4786 Linie analog zu dem TBCEL in den Cysten-Zellen lokalisiert ist. Zusätzlich wurde die Fertilität der NP/Df und G18151 Männchen getestet und gezeigt, dass diese Tiere nahezu vollständig steril sind. Die Ergebnisse lassen daher vermuten, dass TBCEL an der Spermatogenese bei Drosophila beteiligt ist, sowie eine mögliche Rolle bei der Elongation und Individualisierung der Spermatiden spielt.
KW  - Taufliege
KW  - Synapsine
KW  - Molekularbiologie
KW  - synaptisch protein
KW  - synapsin
KW  - tubulin binding chaperone E-like
KW  - SAP47
KW  - Massenspektrometrie
KW  - synaptic proteins
KW  - synapsin
KW  - tubulin binding chaperone E-like
KW  - SAP47
KW  - mass spectrometry
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51683
ER  - 
TY  - THES
A1  - Knapek, Stephan
T1  - Synapsin and Bruchpilot, two synaptic proteins underlying specific phases of olfactory aversive memory in Drosophila melanogaster
T1  - Synapsin und Bruchpilot, zwei synaptische Proteine für spezifische Komponenten von aversivem olfaktorischem Gedächtnis bei Drosophila melanogaster
N2  - Memory is dynamic: shortly after acquisition it is susceptible to amnesic treatments, gets gradually consolidated, and becomes resistant to retrograde amnesia (McGaugh, 2000). Associative olfactory memory of the fruit fly Drosophila melanogaster also shows these features. After a single associative training where an odor is paired with electric shock (Quinn et al., 1974; Tully and Quinn, 1985), flies form an aversive odor memory that lasts for several hours, consisting of qualitatively different components. These components can be dissociated by mutations, their underlying neuronal circuitry and susceptibility to amnesic treatments (Dubnau and Tully, 1998; Isabel et al., 2004; Keene and Waddell, 2007; Masek and Heisenberg, 2008; Xia and Tully, 2007). A component that is susceptible to an amnesic treatment, i.e. anesthesia-sensitive memory (ASM), dominates early memory, but decays rapidly (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). A consolidated anesthesia-resistant memory component (ARM) is built gradually within the following hours and lasts significantly longer (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). I showed here that the establishment of ARM requires less intensity of shock reinforcement than ASM. ARM and ASM rely on different molecular and/or neuronal processes: ARM is selectively impaired in the radish mutant, whereas for example the amnesiac and rutabaga genes are specifically required for ASM (Dudai et al., 1988; Folkers et al., 1993; Isabel et al., 2004; Quinn and Dudai, 1976; Schwaerzel et al., 2007; Tully et al., 1994). The latter comprise the cAMP signaling pathway in the fly, with the PKA being its supposed major target (Levin et al., 1992). Here I showed that a synapsin null-mutant encoding the evolutionary conserved phosphoprotein Synapsin is selectively impaired in the labile ASM. Further experiments suggested Synapsin as a potential downstream effector of the cAMP/PKA cascade. Similar to my results, Synapsin plays a role for different learning tasks in vertebrates (Gitler et al., 2004; Silva et al., 1996). Also in Aplysia, PKA-dependent phosphorylation of Synapsin has been proposed to be involved in regulation of neurotransmitter release and short-term plasticity (Angers et al., 2002; Fiumara et al., 2004). Synapsin is associated with a reserve pool of vesicles at the presynapse and is required to maintain vesicle release specifically under sustained high frequency nerve stimulation (Akbergenova and Bykhovskaia, 2007; Li et al., 1995; Pieribone et al., 1995; Sun et al., 2006). In contrast, the requirement of Bruchpilot, which is homologous to the mammalian active zone proteins ELKS/CAST (Wagh et al., 2006), is most pronounced in immediate vesicle release (Kittel et al., 2006). Under repeated stimulation of a bruchpilot mutant motor neuron, immediate vesicle release is severely impaired whereas the following steady-state release is still possible (Kittel et al., 2006). In line with that, knockdown of the Bruchpilot protein causes impairment in clustering of Ca2+ channels to the active zones and a lack of electron-dense projections at presynaptic terminals (T-bars). Thus, less synaptic vesicles of the readily-releasable pool are accumulated to the release sites and their release probability is severely impaired (Kittel et al., 2006; Wagh et al., 2006). First, I showed that Bruchpilot is required for aversive olfactory memory and localized the requirement of Bruchpilot to the Kenyon cells of the mushroom body, the second-order olfactory interneurons in Drosophila. Furthermore, I demonstrated that Bruchpilot selectively functions for the consolidated anesthesia-resistant memory. Since Synapsin is specifically required for the labile anesthesia sensitive memory, different synaptic proteins can dissociate consolidated and labile components of olfactory memory and two different modes of neurotransmission (high- vs. low frequency dependent) might differentiate ASM and ARM.
N2  - Gedächtnis ist ein dynamischer Prozess. In der Zeit kurz nach seiner Bildung ist es instabil und anfällig gegen amnestische Störungen, dann wird es schrittweise konsolidiert und schließlich resistent gegenüber retrogradem Gedächtnisverlust (McGaugh, 2000). Auch das assoziative olfaktorische Gedächtnis der Fruchtfliege Drosophila melanogaster zeigt diese Merkmale. Nach einem einzelnen assoziativen Training, in welchem ein Duft mit elektrischen Stromstößen gepaart wird, bilden die Fliegen ein aversives Duftgedächtnis, welches über mehrere Stunden anhält und aus qualitativ unterschiedlichen Komponenten besteht (Quinn et al., 1974; Tully and Quinn, 1985). Diese Komponenten können zum Beispiel durch Mutationen, die zugrunde liegenden neuronalen Verknüpfungen oder durch ihre Anfälligkeit für amnestische Behandlungen unterschieden werden (Dubnau and Tully, 1998; Isabel et al., 2004; Keene and Waddell, 2007; Masek and Heisenberg, 2008; Xia and Tully, 2007). Eine gegen amnestische Behandlungen, wie beispielsweise Kälte-induzierte Betäubung, anfällige Komponente beherrscht das frühe Gedächtnis, zerfällt jedoch schnell (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). Diese wird deshalb Anästhesie-sensitives Gedächtnis genannt (anesthesia-sensitive memory [ASM]). Im Gegensatz dazu baut sich eine konsolidierte Komponente erst langsam in den folgenden Stunden nach dem Training auf, hält stattdessen jedoch länger an (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). Diese Komponente ist resistent gegenüber Kälte-induzierter Anästhesie und wird deshalb als ARM (anesthesia-resistant memory) bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit konnte ich zeigen, dass das konsolidierte ARM bereits mit deutlich weniger starken Elektroschocks im Training gebildet wird als das instabile ASM. ARM und ASM unterliegen unterschiedliche molekulare und/oder neuronale Prozesse. Während in einer Mutante für das radish Gen selektiv ARM beeinträchtigt ist, werden andere Gene wie zum Beispiel amnesiac oder rutabaga ausschließlich für ASM benötigt (Dudai et al., 1988; Folkers et al., 1993; Isabel et al., 2004; Quinn and Dudai, 1976; Schwaerzel et al., 2007; Tully et al., 1994). Die beiden letzteren sind Teil des cAMP Signalweges, welcher vermutlich hauptsächlich die cAMP abhängige Protein-Kinase A (PKA) aktiviert (Levin et al., 1992). Hier zeige ich, dass eine Null-Mutante für das evolutionär konservierte Phosphoprotein Synapsin einen selektiven Defekt in ASM hat. Weitere Experimente lassen vermuten, dass Synapsin als Effektor stromabwärts der cAMP/PKA Kaskade wirkt. Ähnlich wie bei Drosophila spielt Synaspin auch in Vertebraten eine Rolle in unterschiedlichen Lernparadigmen (Gitler et al., 2004; Silva et al., 1996). Auch in der Meeresschnecke Aplysia wurde eine PKA abhängige Phosphorylierung von Synapsin als Mechanismus für die Regulierung von Neurotransmitterausschüttung und Kurzzeitplastizität vorgeschlagen (Angers et al., 2002; Fiumara et al., 2004). Synapsin wird für die Bildung eines Reserve-Pools von Vesikeln an der Präsynapse und für die Aufrechterhaltung der Vesikelausschüttung speziell bei anhaltender, hochfrequenter Stimulation von Nervenzellen benötigt (Akbergenova and Bykhovskaia, 2007; Li et al., 1995; Pieribone et al., 1995; Sun et al., 2006). Im Gegensatz dazu wird Bruchpilot, ein Protein der aktiven Zone und homolog zu den ELKS/CAST Proteinen bei Säugern (Wagh et al., 2006), haupsächlich für sofortige Vesikelausschüttung gebraucht (Kittel et al., 2006). Bei wiederholter Stimulation an Motorneuronen einer bruchpilot Mutante ist die akute Vesikelausschüttung stark vermindert, während die darauf folgende andauernde Ausschüttung noch immer möglich ist (Kittel et al., 2006). Dazu passend beeinträchtigt eine künstliche Verminderung des Bruchpilot-Proteins die Ansammlung von Ca2+ Kanälen an den aktiven Zonen, sowie die Bildung von elektronendichten Strukturen (T-bars) an den präsynaptischen Endigungen. Deshalb akkumulieren weniger Vesikel des “readily-releasable” Pools an den Ausschüttungsstellen und die Ausschüttungswahrscheinlichkeit ist stark vermindert (Kittel et al., 2006; Wagh et al., 2006). In dieser Arbeit zeige ich zum ersten Mal, dass Bruchpilot für aversives olfaktorisches Gedächtnis benötigt wird. Der Ort an dem Bruchpilot hierfür gebraucht wird sind die Kenyon-Zellen des Pilzkörpers, die olfaktorischen Interneuronen zweiter Ordnung in Drosophila. Desweiteren zeige ich, dass die Funktion von Bruchpilot selektiv für das konsolidierte ARM ist. Da Synapsin spezifisch für das labile ASM benötigt wird, können diese beiden olfaktorischen Gedächtniskomponenten durch verschiedene synaptische Proteine getrennt werden, und zwei unterschiedliche Arten der Neurotransmitterausschüttung (abhängig von hoch- oder niedrig-frequenter Stimulation) könnten ASM und ARM auseinander halten.
KW  - Taufliege
KW  - Assoziatives Gedächtnis
KW  - Geruchswahrnehmung
KW  - Molekularbiologie
KW  - Synapsin
KW  - Bruchpilot
KW  - Präsynapse
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - olfaktorisches Gedächtnis
KW  - Synapsin
KW  - Bruchpilot
KW  - presynapse
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - olfactory memory
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49726
ER  -