TY - THES A1 - Ernst, Roman T1 - Visuelle Mustererkennung und Parameterextraktion bei Drosophila melanogaster T1 - Visual pattern recognition and parameter extraction in Drosophila melanogaster N2 - In operanten Konditionierungsexperimenten im Flugsimulator werden vier Parameter gefunden die Drosophila melanogaster aus visuellen Mustern extrahieren kann: Musterfläche, vertikale Position des Musterschwerpunkts, Verteiltheit und Musterausrichtung in horizontaler und vertikaler Richtung. Es ist nicht auszuschliessen, dass die Fliege weitere Musterparameter extrahieren kann. Spontane Musterpräferenzen und konditionierte Präferenzen zeigen unterschiedliche Zusammenhänge mit den Musterparametern. Aus räumlich getrennten Musterelementen zusammengesetzte Muster werden von der Fliege wie ein Gesamtmuster behandelt. Retinaler Transfer wird auch bei der Präsentation von Mustern an zwei verschiedenen vertikalen Trainingspositionen nicht beobachtet. Muster werden generalisiert, wenn die Schwerpunkte korrespondierender Muster zwischen Training und Test ungefähr an der gleichen Position liegen aber keine retinale Überlappung von Trainings- und Testmustern besteht. Retinotopie des Mustergedächtnisses liegt in diesem Fall nicht auf der Ebene der Bildpunkte, jedoch möglicherweise auf der Ebene des Parameters 'Musterschwerpunkt' vor. Fliegen können nicht trainiert werden bestimmte Musterpaare zu diskriminieren die sich nur durch die vertikale Position ihres Musterschwerpunktes unterscheiden. Dennoch bevorzugen sie beim Lerntest mit anderen Mustern mit korrespondierenden Schwerpunktspositionen die zuvor nicht bestrafte Schwerpunktsposition. Für die Modellierung der Extraktion von Musterschwerpunkt und Musterfläche wird ein einfaches künstliches neuronales Filter präsentiert, dessen Architektur auf einem Berechnungsalgorithmus für den gemeinsamen Schwerpunkt mehrerer Teilelemente beruht. N2 - The results of operant conditioning experiments at the flight simulator suggest that Drosophila melanogaster can extract four parameters from visual patterns: pattern area, vertical position of the center of gravity, separatedness and horizontal/vertical pattern orientation. It can not be excluded that the fly can extract additional parameters. Spontaneous pattern preferences and conditioned preferences show different relationships with pattern parameters. The fly treats separated pattern elements as a compound figure. Retinal transfer is not observed even when patterns are presented at two different vertical training positions. Patterns are generalized if the positions of the centers of gravity of corresponding patterns are retained between training and test although training and test patterns do not overlap retinally. In this case there is no retinotopy of pattern memory on the pixel level but possibly on the level of the pattern parameter 'center of gravity'. Flies can not be trained to discriminate certain patterns that differ only by the vertical position of their centers of gravity. However, when tested with different patterns with corresponding centers of gravity they prefer the previously unpunished position of the center of gravity. The extraction of center of gravity and pattern area are modelled with a simple artificial neuronal filter. The architecture of this filter is based on an algorithm for the computation of the common center of gravity of multiple elements. KW - Taufliege KW - Mustererkennung KW - Visuelle Wahrnehmung KW - visuelle Mustererkennung KW - Musterlernen KW - Parameterextraktion KW - Generalisierung KW - neuronales Filter KW - Drosophila melanogaster KW - visiual pattern recognition KW - pattern conditioning KW - parameter extraction KW - generalization KW - neuronal filter KW - Drosophila melanogaster Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1156 ER - TY - THES A1 - Bausenwein, Burkhard T1 - Funktionelle Charakterisierung von Daughter of Sevenless T1 - Functional characterisation of Daughter of Sevenless N2 - Ein Weg, der von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen benutzt wird um Signale auf "downstream" gelegene Effektormoleküle zu übertragen, erfolgt über Adaptorproteine, die Bindungsstellen für verschiedene Proteine zur Verfügung stellen. Das daughter of sevenless (dos) Gen wurde in einem Screen nach Downstream-Komponenten der Sevenless (Sev) Rezeptor-Tyrosin-Kinase gefunden. Dos besitzt eine N-terminale PH-Domäne und mehrere Tyrosinreste in Konsensussequenzen für SH2-Domänen Bindungsstellen von verschiedenen Proteinen. Die strukturellen Merkmale von Dos und Experimente, die zeigten, daß Tyrosine im Dos Protein nach der Aktivierung von Sev phosphoryliert werden, legen den Schluß nahe, daß Dos zur Familie der Multi-Adaptor-Proteine gehört. Zu dieser Familie werden die Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) Proteine, Gab1 und Gab2 gerechnet. In dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Maus anti-Dos Antikörper etabliert. Das Epitop dieses Antikörpers liegt im Bereich der C-terminalen 416 Aminosäuren des Dos Proteins. Mittels Westernblot Analysen wurde für Dos ein Molekulargewicht von 115 kD ermittelt. Antikörperfärbungen von wildtypischen Augenimaginalscheiben dritter Larven zeigten, daß das Dos Protein in Zellen in und posterior der morphogenetischen Furche exprimiert wird und in diesen Zellen apikal lokalisiert ist. Zur Charakterisierung des homozygot letalen dosR31 Allels, wurde der genomische Bereich sequenziert und die erhaltenen Daten mit der cDNA Sequenz verglichen. Die so etablierte Aminosäuresequenz für das DosR31 Protein hat sechs Aminosäuresubstitutionen, die möglicherweise die Tertiärstruktur beeinflussen. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Position 463 der Aminosäuresequenz gefunden. Bei dosR31 handelt es sich um ein "loss of function" Allel, das nicht in der Lage ist, die normale Dos Funktion zu erfüllen. Um die funktionelle Rolle der potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für die Dos Funktion in der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen vermittelten Signaltransduktion zu untersuchen, wurden mutierte dos Transgene in Fliegen exprimiert. Die potentiellen Bindungsstellen für die SH2-Domänen des SH2/SH3 Adaptorproteins Shc, der PhospholipaseC-g (PLCg), der regulatorische Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3Kinase) und der Corkscrew (Csw) Tyrosin Phosphatase wurden durch den Austausch des für die Bindung wichtigen Tyrosins gegen ein Phenylalanin mutiert. Die ektopische Expression der mutierten Konstrukte ohne Bindungsstellen für die Shc, PLCg und PI3Kinasen SH2-Domänen konnte in Abwesenheit von endogenem Dos die fehlende Dos Funktion während der Entwicklung vollständig ersetzen. Im Gegensatz dazu ist das Tyrosin 801 als nachgewiesene Bindungsstelle für Csw SH2-Domänen essentiell für die Funktion von Dos. Ektopische Expression von Transgene durch Hitzeschock kann zu phänotypischen Effekten führen, die nicht auf das Transgen zurückzuführen sind. Um dieses Problem zu umgehen wurde das endogene dos Enhancer/Promotor Element kloniert, damit die Funktion von mutierten Transgenen auch im endogenen Expressionsmuster untersucht werden konnte. Das klonierte genE-dos Minigen war in der Lage, den Verlust von endogenem Dos in dosR31 und dosP115 Tieren vollständig zu ersetzen und zeigte eine völlig wildtypische Expression in Augenimaginalscheiben. Zur Untersuchung, welche Rolle die mutierten SH2-Domänen Bindungsstellen bei der Dos Funktion in der Augenentwicklung spielen, wurde ein neues in vivo Testsystem basierend auf der Flp/FRT Flipase Rekombinase Technik etabliert. Dieses klonale Testsystem erlaubt die Expression mutierter Transgene unter der Kontrolle der dos Enhancer/Promotor Sequenzen in Klonen von Zellen, denen die endogene Dos Funktion fehlt. Die klonale Analyse der mutierten Konstrukte konnte zeigen, daß das Tyrosin 801, als Bindungsstelle für eine Csw SH2-Domäne, eine essentielle Rolle für die Dos Funktion spielt. Die Tyrosinreste in den potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für Shc, PLCg und PI3Kinase spielen hingegen keine essentielle Rolle für die Dos Funktion bei der Augenentwicklung. Das etablierte klonale Testsystem kann allgemein zur Untersuchung der in vivo Funktion von potentiellen Protein-Protein Interaktionsregionen im Dos Protein bei der Augenentwicklung eingesetzt werden unabhängig von deren Erfordernis für andere Entwicklungsprozesse. N2 - One mechanism used by receptor tyrosine kinases to relay a signal to different downstream effector molecules is to use adaptor proteins that provide docking sites for a variety of proteins. The daughter of sevenless (dos) gene was isolated in a genetic screen for components acting downstream of the Sevenless (Sev) receptor tyrosine kinase. Dos contains a N-terminally located PH domain and several tyrosine residues within consensus binding sites for a number of SH2 domain containing proteins. The structural features of Dos and experiments demonstrating tyrosine phosphorylation of Dos upon Sev activation suggested that Dos belongs to the family of multisite adaptor proteins that include the Insulin Receptor Substrate (IRS) proteins, Gab1, and Gab2. In this work, a monoclonal mouse anti-Dos antibody was generated. The epitope of this antibody lies within the C-terminal 416 amino acids of the Dos Protein. Western Blot analyses of the Dos protein revealed a molecular mass of 115 kD. The staining of eye imaginal discs from wildtype third instar larvae with the monoclonal antibody showed that the Dos protein is expressed in cells in and posterior to the morphogenetic furrow. In this cells Dos localizes to the apical region. For the molecular characterisation of the homozygous lethal dosR31 allele, genomic sequence analysis were performed and the sequences compared to the dos cDNA sequence. The established amino acid sequence of the DosR31 protein showed six amino acid substitutions that potentially influence the tertiary structure of the protein. In addition, a stop codon in position 463 of the amino acid sequence was found. These results confirm that dosR31 is a loss-of-function allele which does not provide normal Dos function. To study the functional requirements of the potential SH2 domain binding sites for the Dos function in receptor tyrosine kinase mediated signaling processes, mutated dos transgenes were expressed in flies. The putative binding sites for the SH2 domains of the SH2/SH3 adaptor protein Shc, PhospholipaseC-g (PLCg), the regulatory subunit of Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3kinase) and the Corkscrew (Csw) tyrosine phosphatase were mutated by changing the invariant tyrosine within the consensus sites into phenylalanine. Ectopic expression of the mutated constructs lacking the binding sites for the Shc, PLCg, and PI3kinase SH2 domains can substitute the loss of endogenous Dos function during development. In contrast, tyrosine 801, corresponding to a Corkscrew (Csw) SH2 domain binding site, is essential for Dos function. Ectopic expression of transgenes upon heat shock induction may lead to phenotypic effects not caused by the transgene. To circumvent this problem, the endogenous dos enhancer/promotor element was cloned to study the function of the mutated transgenes expressed in a wildtype pattern. The cloned genE-dos minigene was able to fully substitute the loss of endogenous Dos function in dosR31 and dosP115 animals and shows wildtype like expression in eye imaginal discs. To study the role of the mutated SH2 domain binding sites for Dos function in eye development, a new in vivo test system based on the Flp/FRT flipase recombinase system was established. This clonal assay system allows the expression of the mutated transgenes under the control of the dos enhancer/promotor in clones of cells lacking endogenous Dos function. Expression of mutated transgenes in clones of cells lacking endogenous Dos function provided evidence that tyrosine residue Y801 that has been shown to bind a Csw SH2 domain is critical for Dos function. The tyrosine residues within the potential SH2 domain binding sites for Shc, PLCg and PI3kinase do not play an essential role for the Dos function during eye development. The established clonal test system is of general use for assaying the in vivo function of putative protein-protein interaction regions within the Dos protein for eye development irrespective of their requirement in other developmental processes. KW - Taufliege KW - Auge KW - Ontogenie KW - Signaltransduktion KW - Genregulation KW - Daughter of Sevenless KW - Multi-Adaptor-Protein KW - PH-Domäne KW - SH2-Domänen Bindungsstelle KW - Rezeptor-Tyrosin-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Daughter of Sevenless KW - multi-adaptor-protein KW - PH-domain KW - SH2-domain binding site KW - receptor tyrosin kinase KW - signal transduction Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-814 ER - TY - THES A1 - Tschäpe, Jakob-Andreas T1 - Molekulare und funktionelle Analyse der Drosophila-Mutante löchrig T1 - Molecular and Functional Analysis of the Drosophila mutant löchrig N2 - Neurodegenerative Erkrankungen des Menschen sind eines der Hauptfelder molekularer neurobiologischer Grundlagenforschung. Um generell molekulare, komplizierte Vorgänge in vivo untersuchen zu können, nutzt man seit geraumer Zeit Modellorganismen wie Caenorhabditis elegans oder Drosophila melanogaster. In der vorliegenden Arbeit wird die Drosophila-Neurodegenerationsmutante loe (löchrig) beschrieben, die als Modell für die Rolle des Cholesterinhaushalts im Bezug auf Neurodegeneration herangezogen werden kann. Die Fliegen dieser Mutante zeigen stark progressive, altersabhängige Degeneration von Neuronen, dabei unterlaufen diese Nervenzellen einen nekrotischenZelltod. Verantwortlich für diese Mutation ist die Insertion eines P-Elementes in einem Intron des Drosophila-g-5'-AMP-aktivierten Proteinkinase- (AMPK)-Gens. Die verschiedenen Spleißprodukte des loe Gens kodieren für die regulatorische g-Untereinheit des AMPK-Komplexes, der , aktiviert durch 5'AMP, energieintensive Prozesse negativ reguliert. Die Spleißform loeI ist durch die P-Element-Insertion betroffen, Anteile des P-Elementes werden in das loeI-Transkript hineingespleißt. Eine neuronale Expression von loeI im loe-Hintergrund führt zur Revertierung des loe-Phänotypes. Mit der Expression anderer Spleißformen kann dieser Effekt nicht erzielt werden. Das LOE I-Protein birgt in seinem N-Terminus eine Reihe möglicher Interaktionstellen mit anderen Proteinen, die den AMPK-Komplex in einen Kontext mit den Proteinen der APP (Amyloid Precursor Proteins) ?Familie stellen oder z. B. Interaktionen mit dem Cytoskelett herstellen können. Eine molekulare Interaktion mit NiPSNAP, einem Protein, dass vermutlich eine Rolle im Vesikelverkehr spielt, konnte nachgewiesen werden. Ein direktes humanes Homolog von LOE I ist nicht bekannt, wohlgleich es im Menschen drei AMPK-g-Untereinheiten gibt, von denen zwei ähnliche Funktionen übernehmen könnten wie LOE I. Die loe-Mutante interagiert genetisch mit der Mutante clb ? columbus, die einen Defekt im Gen der HMG-CoA-Reduktase trägt. Dieses Emzym ist das Schlüsselenzym der Cholesterinbiosynthese. Die Art der Interaktion belegt eine negative Regulierung der HMG-CoA-Reduktase durch die AMPK. So schwächt die clb-Mutation den neurodegenerativen loe-Phänotyp ab, eine Überexpression von clb verstärkt diesen. Eine Verminderung der Neurodegeneration kann auch mit Medikamenten erreicht werden: Statine, potente Hemmer der HMG-COA-Reduktase, reprimieren deutlich den loe-Phänotyp. In loe ist der Cholesterinester-Spiegel auf 40% abgesenkt. Eine weitere genetische Interaktion von loe konnte nachgewiesen werden: Die Mutante für das Drosophila-Homolog von APP (Appl) verstärkt den neurodegenerativen Phänotyp in loe stark, wogegen die Appl-Mutante selbst keine neurodegenerativen Defekte aufweist. Darüberhinaus zeigt die Doppelmutante Defekte, die keine der Einzelmutanten aufweist: Sterilität oder eine extrem kurze Lebensdauer von nur 3-4 Tagen. Diese Interaktion ließ sich auf molekularer Ebene charakterisieren. Die proteolytische Prozessierung von APPL durch Sekretasen ist in loe alteriert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch die loe-Mutation die b-Sekretase aus Vertebraten (BACE) und eine bisher noch nicht beschriebene endogene Sekretase aus Drosophila negativ beeiflusst werden. Ein AMPK-Komplex mit LOE I als g-Untereinheit scheint über den Cholesterinester-Spiegel die Aktivität einer speziellen Untergruppe der Sekretasen zu beeinflussen. Die Missfunktion dieser Sekretasen ist ein kritischer Punkt in der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit. Die loe-Mutation wirft neues Licht auf die bekannten Verbindungen zwischen Cholesterin-Stoffwechsel, Vesikelverkehr und Prozessierung von APP(L). Mit den großen Möglichkeiten, die die Drosophila-Genetik bietet, stellt diese neue Mutante ein weiteres Werkzeug zur Charakterisierung von Therapie-Ansätzen für die Alzheimer-Kankheit dar. Die vorliegende Arbeit belegt um ein weiteres Mal, dass Drosophila ein potentes Modellsystem zur Untersuchung humaner, neurodegenerativer Erkrankungen wie Chorea Huntington, Parkinson oder der Alzheimer Krankheit ist. N2 - Human neurodegenerative diseases are the main topic of molecular neurobiological basic research. To investigate detailed mechanisms in vivo one uses the tool of genetic model organisms like Caenorhabditis elegans or Drosophila melanogaster for quite a long while. This thesis describes the Drosophila neurodegenration mutant löchrig (loe), which can be used as a model for cholesterol metabolism in respect to neurodegeneration. Mutant loe flies show strong and progressive age-dependent degenration of neurons undergoing necrotic cell death. The P-element inserted in an intron of the gene coding for the Drosophila 5'-AMP activated protein kinase (AMPK) complex gamma subunit is responsible for the mutation in loe. The various splice forms of the loe gene code for different regulatory gamma subunits of this complex consisiting of three subunits. The splice form loeI is affected by the P-element insertion, parts of the P-element are spliced into the loeI transkript in the loe mutant. The neuronal expression of one copy of loeI in the mutant background revertes the neurodegenerative phenotype which can not be achieved by expression of one of the other splice forms. The LOE I protein contains in its N-terminus several putative interaction motifs and domaines. These could get a LOE I-containing AMPK complex in context with the APP (amyloid precursor protein) or the cytoskeletton. An interaction with NiPSNAP ? a protein with a putative function in the vesicular transport ? has been proved molecularly. A human homolog of LOE I is not yet known, although there are three different isoforms of a AMPK gamma subunit described in humans. The loe mutant interacts genetically with the columbus (clb) mutant, wich is affected in the gene of the HMG-CoA reductase, the key enzyme in cholesterol biosynthesis. This shown interaction verifies a negative regulation of the HMG-CoA reductase by the AMPK complex in Drosophila. Thus the clb mutation supresses the loe phenotype, an overexpression of clb enhances the neurodegeneration. A supression of the neurodegenerative phenotype can be also achieved by a statin treatment of loe flies. Statins are potent inhibitors of the HMG-CoA reductase. Another genetic interaction exists between loe and the Appl mutant. Appl d, the null mutant of the Drosophila APP homolog, enhances strongly the neurogenerative phenotype of loe, whereas the Appl mutant itself shows no neuronal defects. In addition the double mutant shows defects which none of the single mutants show: sterility of females and a dramatic shortened lifespan of only 3-4 days. This interaction could be characterized on the molecular level: The proteelytic processing of APPL by sectretases is altered in the loe mutant. Both the BACE sectretase from vertebrates and an so far uncharakterized endogenous sectretase in Drosophila are negatively influenced by the loe mutation. An AMPK complex containing LOE I as the gamma subunit seems to regulate the activity of a subgroup of the sectretases via the cholesterolester level. The misfunction of secretases is a crutial point in the pathogenesis of Alzheimer's disease. The loe mutation gives new insights in the already known links between cholesterol homeostasis, vesicular transport, and processing of APP(L). Together with the exstensive tools of Drosophila genetics this new mutant will supply new possibilities to characterize putative therapies to cure Alzheimer's disease. This thesis at another time presents Drosophila as an potent model system for the research on human neurodegenerative diseases like Huntington's disease, Parkinson or Alzheimer's disease. KW - Taufliege KW - Mutante KW - Cholesterin KW - Nervenzelle KW - Degeneration KW - Alzheimer-Krankheit KW - Neurodegeneration KW - Drosophila KW - APP KW - Cholesterin KW - Alzheimer Krankheit KW - AMPK KW - Neurodegeneration KW - Drosophila KW - APP KW - Cholesterol KW - Alzheimer's Disease KW - AMPK Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2963 ER - TY - THES A1 - Kibler, Eike Mathias U. T1 - Casein-Kinase-2-Beta und neuronale Entwicklungsprozesse T1 - Casein kinase 2ß and neural development - examinations employing the neurogenetic model organism Drosophila melanogaster N2 - Die Pilzkörper von Drosophila melanogaster stellen eine für die Lebensfähigkeit dieses Organismus entbehrliche Gehirnstruktur dar. Die Entwicklungsprozesse, die der Bildung dieser zentralnervösen Struktur zugrunde liegen, sind gut erforscht. Die neuronalen Stammzellen, die für die Bildung dieser Gehirnstruktur verantwortlich sind, sind identifiziert und experimentell gut zugänglich. Daher bietet sich die Drosophila-Pilzkörperentwicklung als neurogenetisches Modellsystem an, grundlegende Mechanismen der Gehirnentwicklung durch die Untersuchung von Pilzkörperstrukturmutanten zu erforschen. In dieser Arbeit wurde mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) als eine durch Transposon- Insertion in den Casein-Kinase-2ß-Genlokus verursachte, hypomorphe Mutation identifiziert, die zu einer starken Verringerung der Anzahl der die Pilzkörper bildenden intrinsischen Neurone führt. Eine Reversion des mbuP1-Pilzkörperphänotyps konnte unter anderem durch die Expression von Casein-Kinase-2ß-(CK2ß)-Transgenen im mbuP1-Hintergrund erzielt werden. Durch Rekombination wurde ein fertiler mbuP1-Stamm etabliert, der nun die Untersuchung der zellulären mbuP1-Defekte ermöglicht. Eine partielle, letale Deletion der CK2ß-Transkriptionseinheit wurde erzeugt. Die Letalität dieser Deletion konnte sowohl durch ein genomisches CK2ß-Transgen als auch durch die ubiquitäre Expression einer CK2ß-cDNA gerettet, und hierdurch die essentielle Funktion der CK2ß-Transkriptionseinheit in Drosophila belegt werden. Durch die ubiquitäre Expression von in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im CK2ß-Letalhintergrund wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der regulatorischen CK2ß-Untereinheit durch die katalytisch aktive CK2α-Untereinheit kein lebensnotwendiger Prozess ist. Gleichartige Experimente wurden zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung eines CK2ß-Zinkfingermotivs und eines CK2ß-Destruction-Box-Motivs durchgeführt. Diese legen nahe, daß das Zinkfingermotiv im Gegensatz zum Destruction-Box-Motiv für die in vivo-Funktion der CK2ß-Untereinheit essentiell ist. Expression der in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im mbuP1-Hintergrund werden die funktionelle Bedeutung der ausgetauschten Aminosäuren für die Pilzkörperentwicklung zeigen. Eine letale genetische Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-MAP-Kinase-Gens rolled (rlSem) und eine lebensfähige Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-S6-Kinase-p90rsk-Gens ignorant (ignP1), bei der Flügel- und Augenent-wicklungsdefekte zu beobachten sind, wurden gefunden. Es wurde zudem gezeigt, daß rlSem als Suppressor des Pilzkörperphänotyps eines schwächeren mbu-Allels wirkt. Hierdurch konnte eine Beteiligung der Casein-Kinase-2 an MAP-Kinase-Signalübertragungswegen wahrscheinlich gemacht werden. N2 - Mushroom bodies are dispensable for the developing and adult Drosophila fly. The developmental processes underlying mushroom body formation are well studied, the neural stem cells responsable for their development are identified and experimentally well accessable. Therefore Drosophila mushroom body development can be used as a powerful neurogenetic model system to find out about fundamental mechanisms underlying brain development by studying mutant flies showing aberrant mushroom body development. In the course of this work, mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) was identified as a hypomorphic casein kinase 2ß-allele (CK2ß) caused by the insertion of transposable elements in the casein kinase 2ß gene locus. The mbuP1-mutation leads to a drastic reduction of the number of intrinsic neurons forming the adult mushroom body. Expression of transgenic CK2ß in a mbuP1-mutant background led to a reversion of the mbuP1-associated mushroom body phenotype. Fertility of mbuP1-flies could be partially restored by recombining the original mbuP1{P3843/2}-chromosome with a w1118-chromosome. This will allow future studies to identify the cellular defects caused by mbuP1. A partial deletion of the CK2ß gene causes lethality which could be rescued by either a genomic CK2ß-transgene or by ubiquitous expression of a CK2ß-cDNA. Therefore, CK2ß has been shown to be an essential gene in Drosophila. By ubiquitous expression of in vitro mutagenized CK2ß-cDNAs in a CK2ß-lethal background, a non-essential role of phosphorylation of the regulatory CK2ß-subunit by the catalytically active CK2α-subunit could be shown. Similar experiments were performed to examine the role of a CK2ß-zincfinger motif and a CK2ß-destruction-box motif. The obtained results suggest a non-essential in vivo function for the destruction-box motif and an essential in vivo function for the zincfinger-motif. Expression of the in vitro mutagenized CK2ß-cDNAs in a mbuP1-background will reveal the functional significance of the substituted amino acids for mushroom body development. Performed genetic interaction studies showed a lethal interaction of mbuP1 with a mutation in the Drosophila-MAP-kinase gene rolled (rlSem) and a viable genetic interaction with a mutation in the Drosophila-S6-kinase-p90rsk gene ignorant (ignP1) which revealed defects in wing formation and eye development. It also could be shown that rlSem acts as a suppressor of the mushroom body phenotype associated with a weaker mbu-allele. These observations point towards a role of casein kinase 2 in MAP-kinase signalling. KW - Taufliege KW - Pilzkörper KW - Ontogenie KW - Embryonalentwicklung KW - Proteinkinase CK2 KW - Drosophila KW - CK2 KW - Pilzkörper KW - CK2ß KW - Entwicklung KW - Drosophila KW - CK2 KW - mushroom body KW - CK2ß KW - development Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4202 ER - TY - THES A1 - Wagner, Nicole T1 - Charakterisierung der Kernmembranproteine Lamin-B-Rezeptor und Bocksbeutel von Drosophila melanogaster T1 - Characterization of nuclear membrane proteins Lamin B Receptor and Bocksbeutel of Drosophila melanogaster N2 - Funktionelle Charakterisierung neuer Proteine der inneren Kernmembran von Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Rezeptor (dLBR), ein integrales Membranprotein der inneren Kernmembran; Bocksbeutel alpha und Bocksbeutel beta, LEM-Domänen Proteine sowie deren potentiellen Interaktionspartner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF). N2 - Functional characterization of novel inner membrane proteins of Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Receptor (dLBR), a novel integral membrane protein of the inner nuclear membrane; Bocksbeutel alpha and Bocksbeutel beta, LEM-domain proteins and their putative interacting partner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF). KW - Taufliege KW - Kernhülle KW - Proteine KW - Molekularbiologie KW - Kernhülle KW - innere Kernmembran KW - LEM Domäne KW - nuclear envelope KW - INM KW - LEM domain Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7245 ER - TY - THES A1 - Funk, Natalja T1 - Das Sap47-Gen aus Drosophila melanogaster : Gezielte Mutagenisierung und Suche nach Interaktionspartnern T1 - The Sap47 gene of Drosophila melanogaster: mutagenesis and identification of interaction partners N2 - SAP47 ist ein Synapsenassoziiertes Protein von 47 kDa aus Drosophila melanogaster, das zu einer neuen Proteinfamilie gehört. Um eine Sap47 Mutante zu erzeugen wurden drei Methoden eingesetzt: Gezielte Mutagenese durch homologe Rekombination, RNA interference (RNAi) und Transposon Remobilisierung. Um einen Interaktionspartner für das SAP47 Protein zu identifizieren wurden ein Yeast-Two-Hybrid System und das "CytoTrap" Verfahren eingesetzt. N2 - SAP47 (synapse-associated protein of 47 kDA) of Drosophila melanogaster belongs to a novel protein family of unknown function. Three techniques were used for Sap47 mutagenesis: "gene targeting" by homologous recombination, RNA interference (RNAi) and Jump-out mutagenesis. A standard yeast-two-hybrid system and the "CytoTrap" assay were used to identify interaction partners for the SAP47 protein. KW - Taufliege KW - Molekulargenetik KW - Sap47 KW - Synapse KW - RNA interference KW - Gezeilte Mutagenese KW - Sap47 KW - synapse KW - RNA interference KW - gene targeting Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7667 ER - TY - THES A1 - Leibold, Christian T1 - Das Cystein String Protein von Drosophila melanogaster - Invivo-Funktionsanalyse verschiedener Proteindomänen am Modellsystem der larvalen neuromuskulären Synapse T1 - The Cysteine string protein of Drosophila melanogaster - Invivo-functional analysis of different protein domains using the larval neuromuscular junction as a model system N2 - Cystein String Proteine (CSPs) wurden als synaptische Vesikelproteine entdeckt. In Drosophila werden sie in den funktionellen Synapsen und sekretorischen Organellen aller Entwicklungsstufen exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass CSPs an der regulierten Neurotransmitterausschüttung beteiligt sind und mehrere, von Insekten bis zum Menschen konservierte Domänen besitzen: eine N-terminale Phosphorylierungsstelle der Protein Kinase A (PKA), eine J-Domäne mit 50%iger Homologie zum bakteriellen Chaperone-Protein DnaJ, eine Linker-Domäne, einen Cystein String aus elf aufeinander folgenden Cysteinen, die durch zwei Cystein-Paare flankiert werden und einen variableren C-Terminus. Es wurden Interaktionen mit den Proteinen HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, verschiedenen Untereinheiten von G-Proteinen, Synaptotagmin, sowie spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen beschrieben. csp-Nullmutanten CspU1 von Drosophila melanogaster zeigen einen temperatursensitiven Phänotyp, in dem adulte Fliegen von CspU1 reversibel bei 37°C innerhalb von drei Minuten paralysieren. An der neuromuskulären Synapse dritter Larven von CspU1 kann bei nicht-permissiver Temperatur von 32°C eine reversible Blockade der synaptischen Transmission beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe des larvalen Nerv-Muskel-Präparats dritter Larven elektrophysiologische Untersuchungen an verschiedenen csp-Mutanten durchgeführt werden. Hierdurch sollte die Bedeutung der einzelnen Domänen für die Funktion von csp weiter aufgeklärt werden. Am larvalen Nerv-Muskel-Präparat von Drosophila ist eine Arbeit auf Einzel-Zell-Niveau möglich. Die Segmentierung, die wiederkehrende Anordnung von Muskeln und innervierenden Motoneuronen, sowie das Vorkommen vieler auch im Gehirn von Drosophila lokalisierter synaptischer Proteine machen die larvale neuromuskuläre Synapse für die vorliegenden Fragestellungen. Wie in vielen anderen Arbeiten, wurden elektrophysiologische Messungen an dem Longitudinalmuskel 6 durchgeführt. Alle Messungen evozierter Muskelpotentiale (EJP) wurden, wenn nicht anders erwähnt, mit 0,2Hz Stimulusfrequenz durchgeführt. Die Reiz-Intensität wurde an jedes Präparat individuell angepasst und betrug das 2 ½ -fache des Initial-Schwellenwertes, bei dem ein vollständiges EJP ausgelöst wurde. Zunächst konnte der in der Literatur beschriebene larvale Block der synaptischen Transmitterausschüttung bei erhöhter Temperatur nicht reproduziert, jedoch durch Rückkreuzungen der Nullmutante CspU1 gegen den Wildtyp w1118 wiederhergestellt werden. Das „Rescue“-Konstrukt scDNA1, welches die Grundlage für alle weiteren mutierten Formen von csp darstellt, rettete den larvalen temperatursensitiven Phänotyp im csp-Nullmutantenhintergrund von CspU1 vollständig. Larvale Mutanten der Linie SSP, bei denen der Cystein String durch einen Serin String ausgetauscht worden war (Serine-string protein), zeigten in Übereinstimmung mit den adulten Fliegen den bekannten temperatursensitiven Phänotyp. Larvale Mutanten der Linie CLP (Cysteine-less protein) zeigten im Gegensatz zu adulten Tieren dieser Linie keinen temperatursensitiven Phänotyp, sondern ein wildtypisches Verhalten. Für die Mutante L∆8, die im Nullmutantenhintergrund von CspU1 roc ein in der Linker-Domäne um acht Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimiert, wurden verschiedene elektrophysiologische Phänotypen beobachtet: Larven der X-chromosomalen Linie zeigten den bekannten temperaturabhängigen Block der synaptischen Transmission. Larven der Insertionslinie für das 3. Chromosom zeigten keine Temperatursensitivität, sondern wildtypisches Verhalten. In immunhistochemischen Untersuchungen konnte für die X-chromosomale Linie eine deutlich schwächere Expression des L∆8-Proteins beobachtet werden. Larven der Linie C∆27, die ein im C-terminalen Bereich von CSP um 27 Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimieren, im Nullmutantenhintergrund CspU1 roc konnten anhand des Phänotyps in zwei Gruppen unterteilt werden. Unabhängig vom Insertionsort zeigte eine Gruppe den bekannten larvalen temperatursensitiven Phänotyp. Die zweite Gruppe zeigte auch bei erhöhter Temperatur wildtypisches Verhalten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, eine neue Deletionsmutante für csp durch Remobilisierung einer P-Insertion (P#1617, flybase, Bloomington) im ersten Exon zu erzeugen, da in der Nullmutante CspU1 möglicherweise auch benachbarte Gene betroffen sind. Nach Überprüfung der erzeugten Mutanten durch Western und Southern Blot, immunhistochemische Experimente und elektrophysiologische Untersuchungen am Nerv-Muskel-Präparat 3. Larven konnte keine Deletionsmutante mit temperaturabhängigem Phänotyp isoliert werden, die ausschließlich csp betraf. N2 - Cysteine string proteins (CSPs) were detected as synaptic vesicle proteins. In Drosophila they are expressed in functional synapses and secretory organelles of all developmental stages. CSPs were shown to be involved in regulated neurotransmitter release and contain several domains, which are conserved from insects to man: N-terminal phosphorylation site for protein kinase A (PKA), “J”-domain with 50% homology to a bacterial chaperone-protein DnaJ, “linker”-domain, cysteine string consisting of eleven following cysteines, flanked by two pairs of cysteines and the more variable C-terminus. Interactions with the following proteins have been described: HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, several subunits of G-proteins, Synaptotagmin, and voltage-dependent Ca2+-channels. Csp-null mutants (CspU1) of Drosophila melanogaster exhibit a temperature sensitive phenotype. Adult flies of CspU1 paralyse reversibly at 37°C within three minutes. At the neuromuscular junction of 3rd instar larvae of CspU1 a reversible blockade of synaptic transmission can be observed at non-permissive temperature of 32°C. Electrophysiological studies at the larval nerve-muscle-preparation of 3rd instar larvae of different csp-mutants were performed in this Ph.D. thesis in order to investigate the relevance of the different CSP domains for the function of csp. Using the larval nerve-muscle-preparation of Drosophila studies at single-cell-levels are possible. The clear segmentation, iterated position of the body wall muscles and localization of many proteins, which are also present in the brain, account for the larval neuromuscular junction as an ideal model-system for the study of synaptic transmission. As described in previous work, electrophysiological studies have been performed at longitudinal muscle 6. All recordings of evoked junction potentials (EJP) were performed with 0.2Hz stimulus frequency (if not described in a different way). Stimulus intensity was adjusted 2 ½ times to initial threshold for a complete EJP, individually for each preparation. In the beginning larval blockade of synaptic transmitter release as described in literature could not be reproduced. Backcrossing for 12 generations of CspU1 with w1118 could restore the temperature-dependent blockade of synaptic transmission in 3rd instar larvae. “Rescue”-construct scDNA1, which was further used as template for all mutated forms of CSP used in this study, completely rescued the larval temperature-sensitive phenotype in csp-null mutant background. Larval mutants of SSP (serine-string protein, serine-string replaces cysteine-string) showed the temperature-sensitive phenotype, as known from their adult flies. In contrast to their adult flies larval mutants of CLP (cysteine-less protein) showed no temperature-sensitive phenotype, but wild type-like behaviour. For the mutant L∆8 (deletion of eight conserved amino acids of linker domain) in null mutant background of CspU1 roc two different phenotypes could be observed: The X-chromosomal strain showed the known temperature-dependent blockade of synaptic transmission. In contrast, 3rd instar larvae of the strain with insertion on the 3rd chromosome showed no temperature sensitivity, but wild type-like behaviour. In immunhistochemical staining a weaker L∆8-protein expression could be observed for the X-chromosomal line. Due to their different phenotype and independent of insertion locus, larval C∆27-mutants could be divided into two groups. One group revealed the known larval temperature-sensitive phenotype. The second group showed also at elevated temperature wild type-like behaviour. In the second part of the current work a new mutant for csp should be created because of the possibility that additional genes are influenced in the null-mutant CspU1. Therefore a deletion in the csp-Locus should be created in a jump-out mutagenesis. In the strain P1617 (flybaase, Bloomington) the PZ-element, which is located in the non-translated region of the 1st exon of csp, was remobilized. Characterization of the jump-out mutants by western and southern blot analysis, immunhistochemical experiments and electrophysiological studies at nerve-muscle-preparations of 3rd instar larvae failed to isolate a jump-out mutant with described temperature-dependent phenotype and affection only of csp. KW - Taufliege KW - Cysteinderivate KW - Temperaturabhängigkeit KW - Drosophila KW - CSP KW - Synapse KW - temperatursensitiv KW - Drosophila KW - CSP KW - Synapse KW - temperature sensitive Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7481 ER - TY - THES A1 - Huber, Saskia T1 - Charakterisierung von SAP47 in Drosophila melanogaster und der dazugehörigen Proteinfamilie T1 - Characterization of SAP47 in Drosophila melanogaster and its protein familiy N2 - In der Arbeit wird ein synapsenassoziiertes Protein, das SAP47 und seine zugehörige Proteinfamilie charakterisiert. N2 - A synapse associated protein, SAP47, and its protein family is characterized. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Molekularbiologie KW - Drosophila KW - Synapse KW - SAP47 KW - BSD KW - Drosophila KW - synapse KW - SAP47 KW - BSD Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7777 ER - TY - THES A1 - Reisch, Natasa T1 - Das Cysteine-String-Protein in Drosophila melanogaster: Molekulare und funktionelle Analyse verschiedener CSP-Mutanten; Ein Modell zur räumlich und zeitlich kontrollierten CSP-Expression T1 - The cysteine string protein in Drosophila melanogaster: Molecular and functional analysis of different CSP-mutants; A model for spatial and temporal controlled CSP-expression N2 - Die Exozytose von Neurotransmittern und Peptiden während der Verarbeitung und Weiterleitung von Reizen im Nervensystem wird durch eine komplexe Maschinerie von Proteinen reguliert. Das konservierte Cysteine String Protein (CSP), das gebunden an synaptische und andere sekretorische Vesikel vorliegt, konnte in den vergangenen Jahren als Teil in diesen Prozess eingeordnet werden. Die Frage nach der genauen Funktion von CSP während der Exozytose ist allerdings weiterhin offen. CSP-Nullmutanten in Drosophila melanogaster zeigen temperatursensitive Paralyse und eine extrem verkürzte Lebenserwartung, gepaart mit verminderter Fertilität. In larvalen Nerv-Muskel Präparaten kommt es bei Temperaturen über 29°C zu einem reversiblen Block der elektrophysiologisch messbaren synaptischen Transmission. Die Primärstruktur des Cysteine String Proteins kann in folgende konservierte Sequenzabschnitte unterteilt werden: eine N-terminale Protein Kinase A Phosphorylierungsstelle, eine Region mit Homologie zu einer charakteristischen Domäne von DnaJ-Proteinen (DnaJ-Domäne), einen als Linkerregion bezeichneten Abschnitt, eine cysteinreiche Sequenz, die bei Drosophila aus dem namensgebenden Strang von 11 aufeinanderfolgenden Cysteinen flankiert von 2 Cysteinpaaren besteht, und einen schwächer konservierten C-Terminus, in dem sich auch einzelne Spleißvarianten unterscheiden. Versuche mit Vertebraten konnten zeigen, dass CSP in einem trimeren Komplex aus Hsc70/CSP/SGT vorkommt und bei der Exozytose wahrscheinlich als molekulares Co-Chaperon wirkt. Der Cysteinstrang liegt mehrfach palmityliert vor und ist für die Zielfindung des Proteins zur Vesikelmembran essentiell. In vorangegangenen Arbeiten wurde begonnen, bei Drosophila durch gezielte Mutagenese und Keimbahntransformation die Rolle des Cysteinstrangs, der Linkerregion und des C-Terminus für die Funktion des CSP zu analysieren. In der vorliegenden Dissertation wurden in transgenen Fliegen die Eigenschaften von Isoformen mit vier unterschiedlich mutierten Varianten des Cysteinstrangs (CSLP, SCSP, CLP, SSP) und je Deletionen in der Linkerregion (LΔ8) und im C-terminalen Bereich (CΔ27) charakterisiert. Die subzelluläre Verteilung und veränderte Membranbindungseigenschaften dieser Proteine wurden mithilfe von Membranfraktionierung und Glycerindichtegradienten von Homogenaten der transgenen Mutanten aufgezeigt. Die Isoformen CLP und SSP sind aufgrund der fehlenden Palmitylierung nicht an die Membran der synaptischen Vesikel gebunden, während die Isoform CSLP sowohl in der Vesikelmembranfraktion als auch als lösliches Protein nachgewiesen werden kann. Die flankierenden Cysteinpaare und die verbliebenen Cysteine in den Isoformen CSLP und SCSP erfüllen offenbar noch teilweise die Aufgabe des Cysteinstrangs bei der Zielfindung der Proteine. Eine Depalmitylierung mit Hydroxylamin löst das verkürzte SCSP Protein ebensowenig aus der Membran wie das intakte CSP. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen stehen im Einklang mit immunhistochemischen Befunden. Die Deletion bzw. Substitution der zentralen 11 Cysteine in den Isoformen CSLP, CLP und SSP äußert sich in den transgenen Fliegen in einer gleichmäßigeren Verteilung der Proteine, die nicht mehr wie im Wildtyp auf das synaptische Neuropil beschränkt ist. Keine der Isoformen mit verändertem Cysteinstrang ist in der Lage die Funktion des wildtypischen CSP zu übernehmen, da die adulten transgenen Fliegen den temperatursensitiven Phänotyp und eine kurze Lebensdauer ähnlich den Csp-Nullmutanten zeigen. Die Proteinisoformen LΔ8 und CΔ27 dagegen lassen in den biochemischen Analysen keine Abweichung vom Wildtyp erkennen und weisen auch eine wildtypische Verteilung in Kryostat-Gehirnschnitten auf. Die Deletion in der Linkerregion in der Isoform LΔ8 scheint die Funktion des CSPs allerdings einzuschränken, da die entsprechenden transgenen Fliegen bereits bei 38°C, wildtypische Tiere dagegen erst bei 40°C paralysieren. Die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Drosophila CSP und Syntaxin konnte für die transgen exprimierte größte CSP Isoform CSP1 in Immunpräzipitationsexperimenten mit Drosophila-Kopfhomogenat bestätigt werden. Die Frage nach einer Interaktion zwischen Syntaxin und den anderen untersuchten mutierten CSP-Isoformen bleibt dagegen offen. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Versuch, mithilfe des UAS/Gal4- und des Flippase/FRT -Systems die CSP-Expression räumlich und zeitlich zu kontrollieren. Dazu wurde aufgrund von Datenbankangaben eine minimale FRT-Sequenz aus Oligonukleotiden mit entsprechenden Linkern konstruiert. Das gesamte Csp-Gen beziehungsweise die Csp cDNA1 einschließlich der regulatorischen Sequenzen wurde zwischen zwei gleichgerichteten FRT-Sequenzen pW8 eingebracht. Die Keimbahntransformation führte zu mehreren transgenen Fliegenlinien. Nach aufwendigen Kreuzungen mit Gal4-, UAS-Flippase- und Csp-Null-Linien entstanden Fliegen im CSP-Nullhintergrund, welche eine durch die verwendete Gal4-Linie definierte Expression von Flippase zeigten und das FRT-Konstrukt trugen. Diese Fliegen sollten in Flippase positiven Bereichen keine CSP-Expression mehr zeigen. Verhaltensanalysen an solchen Tieren bei normaler und erhöhter Temperatur könnten dann Aufschluss über die Funktion der Zellen ohne CSP-Expression geben. Leider konnten die erwarteten Veränderungen in der CSP-Expression nicht beobachtet werden, obwohl alle Konstrukte sich nach einer Überprüfung als intakt erwiesen haben. Die Ursache für die fehlende Rekombination zwischen den FRT-Sequenzen ist möglicherweise in einer zu geringen Länge dieser Zielsequenz der Flippase zu suchen. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird der Csp-Genlokus und seine benachbarten Gene vorgestellt, und die möglichen Auswirkungen der Deletionen in den zur Verfügung stehenden Mutanten CspU1, CspU1w und CspK16 diskutiert. Aufgrund der Daten aus dem Drosophila Genomprojekt lag die Spekulation nahe, dass der Phänotyp der Deletionsmutanten auch durch eine veränderte Expression der benachbarten Gene stromab- und stromaufwärts des Csp Gens beeinflusst werden könnte. Die Auswertung eines Northern Blots von PolyA+-RNA adulter Fliegen, sowie einfache Verhaltenstests an vorliegenden und neu generierten CSP-Nullmutanten konnten diesen Verdacht allerdings nicht bestätigen. N2 - Exocytosis during synaptic transmission is regulated by a complex machinery of numerous proteins. CSPs (cysteine string proteins), conserved from C.elegans to mamals, are attached to synaptic vesicle membranes and other secretory granules. They were therefore implicated to play a distinct part in this regulated process. However the exact role of the CSP protein in exocytosis is not yet known. Studies of Drosophila in null mutants for the Csp gene revealed a temperature sensitive paralytic phenotype, severely shortened lifespan and fertility. Exposure of larval nerve-muscle preparations to elevated temperatures (>29°C) lead to a reversible block of neurotransmitter release in electrophysiological measurements. The primary structure of the cysteine string protein is characterized by distinct conserved domains: a N-terminal protein kinase A (PKA) phosphorylation site, a region showing high homology to a domain found in DnaJ proteins (DnaJ-domain), a region called linker domain, a cysteine rich region, which in Drosophila comprises the characteristic string of 11 cysteines flanked by two additional pairs of cysteines, and a less conserved C-terminal region, which is absent in various splice variants. Experiments using vertebrates showed that CSP is part of a trimeric complex of Hsc70/CSP/SGT and may possibly act as co-chaperone during exocytotic processes. The cysteine string is found to be modified with multiple palmitoyl residues and appears to be essential for targeting of the protein to the vesicle membrane. In earlier studies mutagenesis and germ-line transformation were used to initiate an analysis on the role of the cysteine string, the linker domain and C-terminal region for CSP function. The present thesis extends this work by characterizing in transgenic flies four different mutated cysteine string isoforms (CSLP, SCSP, CLP, SSP) and deletions affecting the linker domain (LΔ8) and C-terminal region (CΔ27) using transgenic flies. The subcellular distribution and altered membrane binding properties of the mutated isoforms were analyzed using glycerol gradients and membrane fractionation. Due to the lack of palmitoylation CLP and SSP are exclusively found as soluble proteins in the cytosol whereas CSLP can also be found attached to vesicle membranes in membrane fractions. The flanking and remaining cysteines in the isoforms CSLP and SCSP apparently are able to partially direct the proteins to the membrane. The shortened cysteine string in SCSP is sufficient to induce membrane binding and is as resistant to depalmitoylation with hydroxylamine as wildtype CSP. The biochemical results correspond to the immunohistochemical findings, which show an almost homogenous distribution of the proteins CSLP, CLP and SSP, unlike the wildtype staining which is confined to neuropil regions in the adult brain. The mutant isoforms with deleted or substituted cysteine string do neither rescue the temperature sensitive phenotype nor the short life span observed in CSP-null mutants. In contrast the proteins LΔ8 and CΔ27 exhibit wildtype properties in the biochemical assays and the staining pattern of the adult brain. The deletion LΔ8 seems to interfere with regular CSP function in some way, as these transgenic flies paralyze at 38°C whereas wildtype flies paralyze at 40°C. The previously described interaction of CSP and syntaxin in Drosophila could be confirmed by precipitating syntaxin together with the largest CSP isoform CSP1 from Drosophila head homogenates using an antibody against CSP. A possible disruption of this interaction in the mutant transgenic flies could not be shown and remains to be investigated. The second part of this work describes the attempt to temporally and spatially regulate CSP expression by employing the UAS/Gal4- and flippase/FRT-system. Using database information a minimal FRT-sequence with apprropriate linkers was generated from oligonucleotides. The entire Csp gene or Csp cDNA1 with necessary regulatory sequences was ligated between two FRT sites and inserted into the transformation vector pW8. After extensive crossing of transgenic flies carrying the FRT-construct with Gal4-,UAS-flippase-, and Csp-null-lines flies were obtained which expressed the flippase in defined areas of Gal4 expression and contained the FRT construct, all in Csp-null background. Areas positiv for flippase expression should loose transgenic CSP expression. Behavioural analyis of these flies at normal and elevated temperatures should provide functional information on the cells lacking CSP. Unfortunately no differences in behaviour or staining pattern of adult brain could be detected, although all constructs were proven to be functional. The lack of recombination events might be due to the reduced length of the flippase target sequence used. The third project presents the Csp-locus and its neighbouring genes in Drosophila. The possible influence of deletions in the CSP null mutants CspU1, CspU1w and CspK16 on the expression of neighbouring genes are discussed. Based on sequence data offered by the Drosophila genome project it was speculated that these genes might influence the mutant phenotype. Northern blotting of adult head polyA+-RNA, simple tests of behaviour of already known and newly generated Csp null mutants could not confirm this speculation. KW - Taufliege KW - Cysteinderivate KW - Genexpression KW - Cysteine String Protein KW - Drosophila melanogaster KW - Cysteine String Protein KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6291 ER - TY - THES A1 - Pick, Simon T1 - Kinematik und visuelle Steuerung des Kletterverhaltens und der Beinplatzierung der Fliege Drosophila melanogaster und Übertragung auf die Robotik T1 - Kinematics and visual control of climbing behaviour and leg placement in the fly Drosophila melanogaster and applications to robotics N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden visuelle Einflüsse auf die Beinplatzierung beim Laufen und auf das Kletterverhalten der Fliege Drosophila melanogaster analysiert. Während sich die Beinplatzierung als vorwiegend taktil gesteuert herausstellte, ist das Klettern sowohl bezüglich der Entscheidung zur Durchführung (Motivationssteuerung) als auch bezüglich der Ausführung selbst unter präziser visueller Kontrolle. Für die Untersuchungen wurde ein Lücken-Überwindungsparadigma entwickelt und die Kinematik des Kletterns über verschieden breite Lücken mit einer eigens entwickelten 3D-Hochgeschwindigkeits-Videoanlage erstmals quantitativ beschrieben. Drei wesentliche Verhaltensanpassungen sorgen dafür, dass die Fliegen die maximal mögliche Spannbreite ihrer Beine voll ausnützen und Lücken von bis zu 170% der eigenen Körperlänge überqueren können. Das Kletterverhalten wird abhängig von der Lückenbreite initiiert und sinnlose Versuche an unüberwindbar breiten Lücken vermieden. Die visuelle Lückenbreitenmessung wurde analysiert; sie beruht auf der Auswertung von Bewegungsparallaxe beim Anlauf. Einige Erkenntnisse aus der Laufforschung an Fliegen wurden auf einem im Rahmen dieser Arbeit modifizierten hexapoden Laufroboter umgesetzt und die Verbesserungen quantifiziert. N2 - This work started out to analyze visual influences on leg placement and on the climbing behavior of the fly Drosophila melanogaster. Whereas leg placement turned out to be predominantly under tactile control, climbing is indeed under tight visual control both with regard to the decision to initiate the behavior (motivational control) as well as with regard to the execution of climbing. A gap-crossing paradigm has been developed to facilitate a detailed study and the kinematics of climbing over gaps of various widths has been quantified using a 3D high-speed video analysis system developed for this purpose. Three major behavioral adaptations help the fly to exploit fully the limits of its leg span in order to overcome gaps of up to 170% of its own body length. Climbing is initiated dependent on gap width. Vain attempts to overcome insurmountably broad gaps are avoided. Analysis showed that the fly uses parallax motion generated during the approach to estimate the width of a gap. Some of the results of the research on the fly’s walking behavior have been implemented in a modified hexapod walking robot, and the improvements have been quantified. KW - Taufliege KW - Kinematik KW - Klettern KW - Verhaltensanpassung KW - Drosophila KW - Verhalten KW - Klettern KW - Laufen KW - Robotik KW - Drosophila KW - behaviour KW - climbing KW - walking KW - robotics Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12737 ER -