TY - THES A1 - Fischer, Robin T1 - Generating useful tools for future studies in the center of the circadian clock – defined knockout mutants for PERIOD and TIMELESS T1 - Generierung nützlicher Instrumente für zukünftige Studien im Zentrum der Inneren Uhr - definierte knockout Mutanten für PERIOD und TIMELESS N2 - To unravel the role of single genes underlying certain biological processes, scientists often use amorphic or hypomorphic alleles. In the past, such mutants were often created by chance. Enormous approaches with many animals and massive screening effort for striking phenotypes were necessary to find a needle in the haystack. Therefore at the beginning chemical mutagens or radiation were used to induce mutations in the genome. Later P-element insertions and inaccurate jump-outs enabled the advantage of potential larger deletions or inversions. The mutations were characterized and subsequently kept in smaller populations in the laboratories. Thus additional mutations with unknown background effects could accumulate. The precision of the knockout through homologous recombination and the additional advantage of being able to generate many useful rescue constructs that can be easily reintegrated into the target locus made us trying an ends-out targeting procedure of the two core clock genes period and timeless in Drosophila melanogaster. Instead of the endogenous region, a small fragment of approximately 100 base pairs remains including an attP-site that can be used as integration site for in vitro created rescue constructs. After a successful ends-out targeting procedure, the locus will be restored with e.g. flies expressing the endogenous gene under the native promoter at the original locus coupled to a fluorescence tag or expressing luciferase. We also linked this project to other research interests of our work group, like the epigenetic related ADAR-editing project of the Timeless protein, a promising newly discovered feature of time point specific timeless mRNA modification after transcription with yet unexplored consequences. The editing position within the Timeless protein is likewise interesting and not only noticed for the first time. This will render new insights into the otherwise not-satisfying investigation and quest for functional important sequences of the Timeless protein, which anyway shows less homology to other yet characterized proteins. Last but not least, we bothered with the question of the role of Shaggy on the circadian clock. The impact of an overexpression or downregulation of Shaggy on the pace of the clock is obvious and often described. The influence of Shaggy on Period and Timeless was also shown, but for the latter it is still controversially discussed. Some are talking of a Cryptochrome stabilization effect and rhythmic animals in constant light due to Shaggy overexpression, others show a decrease of Cryptochrome levels under these conditions. Also the constant light rhythmicity of the flies, as it was published, could not be repeated so far. We were able to expose the conditions behind the Cryptochrome stabilization and discuss possibilities for the phenomenon of rhythmicity under constant light due to Shaggy overexpression. N2 - Um die Rolle einzelner Gene hinter biologischen Prozessen zu entschlüsseln, bedienen sich Wissenschaftler häufig amorpher oder hypomorpher Allele. Diese wurden in der Vergangenheit oft auf Zufall basierend generiert. Gewaltige Ansätze mit zahllosen Tieren unter enormem Selektionsaufwand bei der Suche nach markanten Phänotypen waren notwendig um sprichwörtlich die Nadel im Heuhaufen zu finden. Zunächst wurden chemische Mutagene oder Strahlung verwendet um Mutationen im Genom zu induzieren. Später kamen P-element Insertionen und induziertes unpräzises Herausspringen der Transposons dazu. Das hatte den Vorteil, dass so unter Umstände größere Deletionen oder Inversionen entstanden. Die Mutationen wurden charakterisiert und die Tiere anschließend in kleinen Populationen gehalten. Dadurch konnten sich zusätzliche Mutationen mit möglichen Hintergrundeffekten unbemerkt ansammeln. Ebenso blieben weitere durchaus mögliche Mutationen aufgrund der Mutagene und dem deutlicheren Phänotyp der primären Mutation oftmals unbemerkt. Die Präzision eines Knockouts durch homologe Rekombination und der Vorteil, zusätzlich im Stande zu sein, jedes entworfene Rettungskonstrukt auf einfache Weise wieder einsetzen zu können, überzeugte uns, eine Ends-out Targeting Prozedur mit den zwei Uhr Basisgenen period und timeless in Drosophila melanogaster durchzuführen. Dabei soll ein geplanter Knockout zu einer kompletten Deletion des gesamten Bereichs durch homologe Rekombination führen. Anstelle der endogenen Region verbleibt lediglich ein kleines Fragment von ungefähr 100 Basenpaaren inklusive einer attP-Stelle, die als Insertionsstelle für in vitro hergestellte Konstrukte genutzt werden kann. Angestrebte Ziele sind beispielsweise Fliegen, die das endogene Gen unter der Kontrolle des ursprünglichen Promoters am originalen Lokus gebunden an einen Fluoreszenzmarker oder aber gekoppelt an Luziferase exprimieren. Wir koppelten dieses Projekt zusätzlich mit anderen Forschungsinteressen unserer Arbeitsgruppe, wie zum Beispiel dem epigenetischen ADAR-Editierungsprojekt des Timeless Proteins, einer vielversprechenden Neuentdeckung zeitpunktspezifischer und posttranskriptionaler Modifizierung der timeless mRNA, mit bisher noch unbekannten Folgen. Die Position der Editierung innerhalb des Timeless Proteins ist ebenfalls sehr interessant und nicht zum ersten Mal im Fokus von Wissenschaftlern. Dies wird neue Einblicke in die sonst bislang nicht zufriedenstellende Suche nach funktionell wichtigen Strukturen von Timeless bringen, welche aufgrund der geringen Homologie zu anderen bisher charakterisierten Proteinen bislang nur unzureichend bestimmt werden konnten. Zuletzt beschäftigten wir uns mit der Frage nach der Rolle von Shaggy bezüglich der inneren Uhr. Der Einfluss einer Überexpression oder Herabregulierung von Shaggy auf die Taktung der Uhr ist eindeutig und wurde schon oft beschrieben. Der Einfluss von Shaggy auf Period und Timeless wurde ebenfalls bereits gezeigt, wird jedoch im Falle des letzteren Proteins noch sehr kontrovers diskutiert. Während einige von einem Cryptochrom stabilisierenden Effekt und rhythmischen Tieren in konstanter Beleuchtung aufgrund von Shaggy Überexpression sprechen, zeigen andere einen Abfall des Cryptochromlevels unter eben genau diesen Umständen. Es war uns möglich die Umstände hinter der Cryptochromstabilisierung aufzudecken. Darüber hinaus zeigen wir mögliche Gründe für das Phänomen des Rhythmus im Dauerlicht von Shaggy Überexpressionstieren auf. KW - Biologische Uhr KW - Circadian clock KW - Period KW - Timeless KW - Genetic engineering KW - Shaggy KW - Taufliege KW - Knockout Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119141 ER - TY - THES A1 - Dusik, Verena T1 - Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase p38 in der inneren Uhr von Drosophila melanogaster T1 - Immunhistochemical and functional characterisation of the mitogen-activated protein kinase p38 in the endogenous clock of Drosophila melanogaster N2 - Circadianes und Stress-System sind zwei physiologische Systeme, die dem Organismus helfen sich an Veränderungen ihrer Umwelt anzupassen. Während letzteres spontane und schnelle Antworten auf akute, unvorhersehbare Umweltreize liefert, sagt das circadiane System täglich wiederkehrende Ereignisse vorher and bereitet den Organismus so vorzeitig auf diese nahende Umweltveränderung vor. Dennoch, trotz dieser unterschiedlichen Reaktionsmechanismen agieren beide Systeme nicht komplett autonom. Studien der vergangen Jahre belegen vielmehr eine Interaktion beider Systeme. So postulieren sie zum einem Unterschiede in der Stressantwort in Abhängigkeit von der Tageszeit zu der der Reiz auftritt und weisen zugleich auf eine Zunahme von gestörten biologischen Tagesrhythmen, wie zum Beispiel Schlafstörungen, in Folge von unkontrollierten oder exzessiven Stress hin. Ebenso liefern kürzlich durchgeführte Studien an Vertebraten und Pilzen Hinweise, dass mit p38, eine Stress-aktivierte Kinase, an der Signalweiterleitung zur inneren Uhr beteiligt ist (Hayashi et al., 2003), sogar durch dieses endogene Zeitmesssystem reguliert wird (Vitalini et al., 2007; Lamb et al., 2011) und deuten damit erstmals eine mögliche Verbindung zwischen Stress-induzierten und regulären rhythmischen Anpassungen des Organismus an Umweltveränderungen an. Molekulare und zelluläre Mechanismen dieser Verknüpfung sind bisher noch nicht bekannt. Während die Rolle von p38 MAPK bei der Stress- und Immunantwort in Drosophila melanogaster gut charakterisiert ist, wurden Expression und Funktion von p38 in der inneren Uhr hingegen bislang nicht untersucht. Die hier vorliegende Arbeit hatte daher zum Ziel mittels immunhistochemischer, verhaltensphysiologischer und molekularer Methoden eine mögliche Rolle der Stress-aktivierten Kinase im circadianen System der Fliege aufzudecken. Antikörperfärbungen sowie Studien mit Reporterlinien zeigen deutliche Färbesignale in den s-LNv, l-LNv und DN1a und erbringen erstmals einen Nachweis für p38 Expression in den Uhrneuronen der Fliege. Ebenso scheint die Aktivität von p38 MAPK in den DN1a uhrgesteuert zu sein. So liegt p38 vermehrt in seiner aktiven Form in der Dunkelphase vor und zeigt, neben seiner circadian regulierten Aktivierung, zusätzlich auch eine Inaktivierung durch Licht. 15-Minuten-Lichtpulse in der subjektiven Nacht führen zu einer signifikanten Reduktion von aktivierter, phosphorylierter p38 MAPK in den DN1a von Canton S Wildtypfliegen im Vergleich zu Fliegen ohne Lichtpuls-Behandlung. Aufzeichnungen der Lokomotoraktivität offenbaren zusätzlich die Notwendigkeit von p38 MAPK für wildtypisches Timing der Abendaktivität sowie zum Erhalt von 24-Stunden-Verhaltensrhythmen unter konstanten Dauerdunkel-Bedindungen. So zeigen Fliegen mit reduzierten p38 Level in Uhrneuronen einen verzögerten Beginn der Abendaktivität und stark verlängerte Freilaufperioden. In Übereinstimmung mit Effekten auf das Laufverhalten scheint darüber hinaus die Expression einer dominant-negativen Form von p38b in Drosophila’s wichtigsten Uhrneuronen eine verspätete nukleäre Translokation von Period zur Folge zu haben. Westernblots legen zusätzlich einen Einfluss von p38 auf den Phosphorylierungsgrad von Period nahe und liefern damit einen mögliche Erklärung für den verspäteten Kerneintritt des Uhrproteins. Abschließende Stützung der Westernblotergebnisse bringen in vitro Kinasenassays und deuten auf p38 als eine potentielle „Uhrkinase“ hin, welche auch in vivo Period an Serin 661 sowie weiteren potentiellen Phosphorylierungsstellen phosphorylieren könnte. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit eindeutig auf eine bedeutende Rolle von p38, neben dessen Funkion im Stress-System, auch im circadianen System der Fliege hin und offenbaren damit die Möglichkeit, dass p38 als Schnittstelle zwischen beider Systeme fungiert. N2 - The circadian and the stress system are two distinct physiological systems that help the organism to adapt to environmental challenges. While the latter elicits reactive responses to acute environmental changes, the circadian system predicts daily occurring alterations and prepares the organism in advance. However, despite of these differences both responses are not mutually exclusive. Studies in the last years obviously prove a strong interaction between both systems showing a strong time-related stress response depending on the time of day of stressor presentation on the one hand and increased disturbances of daily rhythms, like sleep disorders, in consequence of uncontrolled or excessive stress on the other. In line with this fact, recent studies in vertebrates and fungi indicate that p38, a stress-activated Kinase, is involved in signaling to the circadian clock (Hayashi et al., 2003) and in turn is additionally regulated by this timekeeping system (Vitalini et al., 2007; Lamb et al., 2011) providing an interesting link between stress-induced and regularly rhythmic adaptations of the organism to environmental changes. However, little is known about molecular and cellular mechanisms of this interconnection. In Drosophila melanogaster the role of p38 MAPK is well characterized in terms of immune and stress response, p38 expression and function in the circadian clock has not been reported so far. Therefore, the present thesis aimed to elucidate a putative role of the stress-activated Kinase in the fly’s circadian system using an immunohistochemical, behavioral as well as molecular approach. Surprisingly, for the first time antibody as well as reporterline studies cleary prove p38 expression in Drosophila clock neurons showing visible staining in s-LNvs, l-LNvs and DN1as. Moreover p38 MAPK in DN1as seems to be activated in a clock-dependent manner. p38 is most active under darkness and, besides its circadian activation, additionally gets inactivated by light. 15 minutes light pulse applied during the dark phase lead to a significant reduction in phosphorylated and activated p38 MAPK in Canton S wildtype flies compared to flies without light pulse treatment. In addition, locomotor activity recordings reveal that p38 is essential for a wild-type timing of evening activity and for maintaining ~24h behavioral rhythms under constant darkness. Flies with reduced p38 activity in clock neurons show delayed evening activity onsets and drastically lengthened the period of their free-running rhythms. In line with these effects on locomotor behavior, the nuclear translocation of the clock protein Period is significantly delayed on the expression of a dominant-negative form of p38b in Drosophila’s most important clock neurons. Western Blots reveal that p38 affects the phosphorylation degree of Period, what is likely the reason for its effects on nuclear entry of Period. In vitro kinase assays additionally confirm the Western Blot results and point to p38 as a potential “clock kinase” phosphorylating Period at Serin 661 and putative phosphorylation sites. Taken together, the results of the present thesis clearly indicate a prominent role of p38 in the circadian system of the fly besides its function in stress-input pathways und open up the possibility of p38 MAPK being a nodal point of both physiological systems. KW - Taufliege KW - Biologische Uhr KW - MAP-Kinase KW - Innere Uhr KW - MAPK KW - p38 KW - Phosphorylierung KW - Mitogen-aktivierte Proteinkinase KW - Drosophila melanogaster KW - Circadiane Rhythmen KW - Drosophila Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124636 ER -