TY  - THES
A1  - Nilla, Jaya Santosh Chakravarthy
T1  - An Integrated Knowledgebase and Network Analysis Applied on Platelets and Other Cell Types
T1  - Integrierte Datenbank und Netzwerkanalysen zur Untersuchung von Blutplättchen und anderen Zelltypen
N2  - Systems biology looks for emergent system effects from large scale assemblies of molecules and data, for instance in the human platelets. However, the computational efforts in all steps before such insights are possible can hardly be under estimated. In practice this involves numerous programming tasks, the establishment of new database systems but as well their maintenance, curation and data validation. Furthermore, network insights are only possible if strong algorithms decipher the interactions, decoding the hidden system effects. This thesis and my work are all about these challenges. To answer this requirement, an integrated platelet network, PlateletWeb, was assembled from different sources and further analyzed for signaling in a systems biological manner including multilevel data integration and visualization. PlateletWeb is an integrated network database and was established by combining the data from recent platelet proteome and transcriptome (SAGE) studies. The information on protein-protein interactions and kinase-substrate relationships extracted from bioinformatical databases as well as published literature were added to this resource. Moreover, the mass spectrometry-based platelet phosphoproteome was combined with site-specific phosphorylation/ dephosphorylation information and then enhanced with data from Phosphosite and complemented by bioinformatical sequence analysis for site-specific kinase predictions. The number of catalogued platelet proteins was increased by over 80% as compared to the previous version. The integration of annotations on kinases, protein domains, transmembrane regions, Gene Ontology, disease associations and drug targets provides ample functional tools for platelet signaling analysis. The PlateletWeb resource provides a novel systems biological workbench for the analysis of platelet signaling in the functional context of protein networks. By comprehensive exploration, over 15000 phosphorylation sites were found, out of which 2500 have the corresponding kinase associations. The network motifs were also investigated in this anucleate cell and characterize signaling modules based on integrated information on phosphorylation and protein-protein interactions. Furthermore, many algorithmic approaches have been introduced, including an exact approach (heinz) based on integer linear programming. At the same time, the concept of semantic similarities between two genes using Gene Ontology (GO) annotations has become an important basis for many analytical approaches in bioinformatics. Assuming that a higher number of semantically similar gene functional annotations reflect biologically more relevant interactions, an edge score was devised for functional network analysis. Bringing these two approaches together, the edge score, based on the GO similarity, and the node score, based on the expression of the proteins in the analyzed cell type (e.g. data from proteomic studies), the functional module as a maximum-scoring sub network in large protein-protein interaction networks was identified. This method was applied to various proteome datasets (different types of blood cells, embryonic stem cells) to identify protein modules that functionally characterize the respective cell type. This scalable method allows a smooth integration of data from various sources and retrieves biologically relevant signaling modules.
N2  - Systembiologie sucht nach Systemeffekten in großflächigen Anordnungen von Molekülen und Daten, beispielsweise in menschlichen Blutplättchen. Allerdings kann der Rechenaufwand in den Schritten, die für solche Einsichten nötig sind, kaum unterschätzt werden. In der Praxis umfasst dies zahlreiche Programmieraufgaben, die Einrichtung neuer Datenbanksysteme, sowie deren Wartung, aber auch die Pflege und Validierung der vorgehaltenen Daten. Zudem sind Netzwerkeinsichten nur möglich, wenn effiziente und gute Algorithmen für versteckte Systemeffekte oder auch codierende Wechselwirkungen entschlüsseln. Diese Dissertation und meine Arbeit sind auf diese Herausforderungen konzentriert. Um diese Anforderung zu erfüllen, wurde ein integriertes Thrombozytennetzwerk, PlateletWeb, aus verschiedenen Quellen zusammengestellt und weiterhin auf Signalverarbeitung und –weitergabe einschließlich mehrstufiger Datenintegration und Visualisierung systembiologisch analysiert. PlateletWeb ist eine integrierte Netzwerkdatenbank, die durch die Kombination von Daten aus den neuesten Thrombozyten Proteom und Transkriptom (SAGE) Studien etabliert wurde. Information über Protein-Protein-Wechselwirkungen und Kinase-Substrat-Paaren wurde aus bioinformatischen Datenbanken hinzugefügt, extrahierte Daten aus der veröffentlichten Literatur ergänzten dies weiter. Darüber hinaus wurde das Blutplättchen-Phosphoproteom aufgrund von Daten aus der Massenspektroskopie mit ortsspezifischen Phosphorylierungs-/ Dephosphorylierungsdaten kombiniert. Ergänzt wurde dies um Daten aus der Datenbank Phosphosite und durch bioinformatische Sequenzanalyse unter Nutzung ortsspezifischer Kinasevorhersagen. Die Zahl der katalogisierten Thrombozytenproteine wurde im Vergleich mit der Vorversion von 2008 um mehr als 80% erhöht (beinahe Verdoppelung der Daten, insbesondere aber neue, zusätzliche Datenkategorien, z.B. über Pharmaka, Phosphorylierung, Gen-Ontologie, daneben auch weitere Validierung und Pflege der vorhandenen Daten). Die neue Integration von Annotationen für Kinasen, Proteindomänen, Transmembranregionen, Gene Ontology, Krankheitsbezüge und Azneimittelziele bietet neue, mächtige Werkzeuge für die funktionelle und systembiologische Analyse von Thrombozytensignalwegen. Die PlateletWeb Datenbank liefert eine neuartige systembiologische Werkbank zur Analyse von medizinisch relevanten Blutplättchensignalen (z.B. Plättchenaktivierung bei Thrombose, Hämostase etc.) im funktionellen Zusammenhang von Proteinnetzwerken. Durch umfassende Untersuchungen wurden über 15000 Phosphorylierungsstellen identifiziert, von denen 2500 einer Kinase zugeordnet werden konnten. Netzwerkmotive wurden auch in diesen Zellen ohne Zellkern untersucht und neue und interessante Signalmodule charakterisiert. Dies war nur durch die integrierte Information über Phosphorylierung und Protein-Protein-Wechselwirkungen möglich. Darüber hinaus wurden zahlreiche algorithmische Ansätze verwand, darunter ein exakter Ansatz zur Bayesschen Analyse von Interaktionsnetzwerken (Heinz) basierend auf linearer Integer-Programmierung. Gleichzeitig hat sich unser Konzept der semantischen Ähnlichkeiten zwischen zwei Genen basiert auf Gene Ontology (GO) Annotationen etabliert und ist eine wichtige Grundlage für viele analytische Ansätze in der Bioinformatik geworden. Unter der Annahme, dass eine höhere Anzahl von semantisch ähnlichen funktionellen Genannotationen biologisch relevantere Interaktionen reflektieren, wurde eine Bewertung der Kanten für funktionelle Netzwerkanalyse entwickelt. Die Kombination beider Ansäte, die Kantenbewertung, basierend auf der GO-Ähnlichkeit und die Netzknotenbewertung bezogen auf die Expression der Proteine ermöglichte in den analysierten Zelltypen (unter Nutzung von Daten z.B. aus Proteomstudien) die Identifizierung funktioneller Module als maximal bewertete Subnetzwerke in großen Proteinnetzwerken. Dieses Verfahren wurde an verschiedenen Proteomdatensätzen getestet (verschiedene Arten von Blutzellen, embryonale Stammzellen), um Proteinmodule zu identifizieren, die funktionell den jeweiligen Zelltyp charakterisieren. Weitere Ansätze der Methode erfassen die Analyse von quantitativen Phosphoproteom-Daten zur Identifizierung des Signalflusses in einem Kinase-Substrat Netzwerk. Diese skalierbaren Ansätze ermöglichen eine reibungslose Integration von Daten aus verschiedenen Quellen und liefern biologisch relevante Signalmodule.
KW  - Systembiologie
KW  - Netzwerkanalyse
KW  - Thrombozyt
KW  - Integrated Knowledgebase
KW  - Network Analysis
KW  - Platelets
KW  - Integrierte Datenbank
KW  - Blutplättchen
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85730
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TY  - THES
A1  - Heidbreder, Meike
T1  - Association and Activation of TNF-Receptor I Investigated with Single-Molecule Tracking and Super-Resolution Microscopy in Live Cells
T1  - Assoziierung und Aktivierung des TNF-Rezeptor I untersucht mit Einzelmolekül-Tracking und hochauflösender Mikroskopie in lebenden Zellen
N2  - Cellular responses to outer stimuli are the basis for all biological processes. Signal integration is achieved by protein cascades, recognizing and processing molecules from the environment. Factors released by pathogens or inflammation usually induce an inflammatory response, a signal often transduced by Tumour Necrosis Factor alpha (TNF). TNFα receptors TNF-R1 and TNF-R2 can in turn lead to apoptosis or proliferation via NF-B. These processes are closely regulated by membrane compartimentalization, protein interactions and trafficking. Fluorescence microscopy offers a reliable and non-invasive method to probe these cellular events. However, some processes on a native membrane are not resolvable, as they are well below the diffraction limit of microscopy. The recent development of super-resolution fluorescence microscopy methods enables the observation of these cellular players well below this limit: by localizing, tracking and counting molecules with high spatial and temporal resolution, these new fluorescence microscopy methods offer a previously unknown insight into protein interactions at the near-molecular level. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) utilizes the reversible, stochastic blinking events of small commercially available fluorescent dyes, while photoactivated localization microscopy (PALM) utilizes phototransformation of genetically encoded fluorescent proteins. By photoactivating only a small fraction of the present fluorophores in each observation interval, single emitters can be localized with high precision and a super-resolved image can be reconstructed. Quantum Dot Triexciton imaging (QDTI) utilizes the three-photon absorption (triexcitonic) properties of quantum dots (QD) and to achieve a twofold resolution increase using conventional confocal microscopes. In this thesis, experimental approaches were implemented to achieve super-resolution microscopy in fixed and live-cells to study the spatial and temporal dynamics of TNF and other cellular signaling events. We introduce QDTI to study the three-dimensional cellular distribution of biological targets, offering an easy method to achieve resolution enhancement in combination with optical sectioning, allowing the preliminary quantification of labeled proteins. As QDs are electron dense, QDTI can be used for correlative fluorescence and transmission electron microscopy, proving the versatility of QD probes. Utilizing the phototransformation properties of fluorescent proteins, single-receptor tracking on live cells was achieved, applying the concept of single particle tracking PALM (sptPALM) to track the dynamics of a TNF-R1-tdEos chimera on the membrane. Lateral receptor dynamics can be tracked with high precision and the influences of ligand addition or lipid disruption on TNF-R1 mobility was observed. The results reveal complex receptor dynamics, implying internalization processes in response to TNFα stimulation and a role for membrane domains with reduced fluidity, so-called lipid raft domains, in TNF-R1 compartimentalization prior or post ligand induction. Comparisons with previously published FCS data show a good accordance, but stressing the increased data depth available in sptPALM experiments. Additionally, the active transport of NF-κB-tdEos fusions was observed in live neurons under chemical stimulation and/or inhibition. Contrary to phototransformable proteins that need no special buffers to exhibit photoconversion or photoactivation, dSTORM has previously been unsuitable for in vivo applications, as organic dyes relied on introducing the probes via immunostaining in concert with a reductive, oxygen-free medium for proper photoswitching behaviour. ATTO655 had been previously shown to be suitable for live-cell applications, as its switching behavior can be catalyzed by the reductive environment of the cytoplasm. By introducing the cell-permeant organic dye via a chemical tag system, a high specificity and low background was achieved. Here, the labeled histone H2B complex and thus single nucleosome movements in a live cell can be observed over long time periods and with ~20 nm resolution. Implementing these new approaches for imaging biological processes with high temporal and spatial resolution provides new insights into the dynamics and spatial heterogeneities of proteins, further elucidating their function in the organism and revealing properties that are usually only detectable in vitro.  
N2  - Zelluläre Antworten auf externe Stimuli sind die Basis aller biologischer Prozesse. Die Integration dieser Signale wird dabei von Proteinkaskaden ausgeführt, welche Moleküle aus der Umgebung wahrnehmen und verarbeiten. Faktoren, welche von Pathogenen oder während einer Entzündung freigesetzt werden, induzieren für gewöhnlich eine Entzündungsantwort, eine Reaktion, die oft vom Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) vermittelt wird. Die TNFα Rezeptoren TNF-R1 und TNF-R2 vermitteln nach Ligandenbinding Apoptose oder Zellproliferation durch NF-kB. Diese Prozesse sind engmaschig durch Membrankompartimentierung, Proteininteraktionen und -transport reguliert. Fluoreszenzmikroskopie bietet eine zuverlässige, nicht-invasive Methode um diese zellulären Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind einige Prozesse innerhalb einer nativen Membran nicht auflösbar, da sie weit unterhalb der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie stattfinden. Die jüngste Entwicklung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopiemethoden erlaubt die Beobachtung dieser zellulären Abläufe auf molekularer Ebene: durch das Lokalisieren, Verfolgen und Zählen von Molekülen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung bieten diese neuen Fluoreszenzmethoden bisher unbekannte Einblicke in Proteininteraktionen. Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) nutzt die reversiblen, stochastischen Ereignisse von kleinen blinkenden, kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen, während die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) die Phototransformation fluoreszierenden Proteinen nutzt. Durch das Photoaktivieren lediglich eines kleinen Bruchteils der Fluorophore innerhalb eines Zeitintervalls können einzelne Emitter mit hoher Genauigkeit lokalisiert und ein hochaufgelöstes Bild daraus rekonstruiert werden. Quantum Dot Triexciton Imaging (QDTI) nutzt die Drei-Photonen-Absorption von Quantenpunkten um eine zweifache Auflösungserhöhung mittels eines Konfokalmikroskopes zu erreichen. In dieser Arbeit wurden experimentelle Ansätze zur hochauflösenden Mikroskopie an fixierten und lebenden Zellen implementiert, um die räumliche und zeitliche Dynamik von TNF und anderen zellulären Signalwegen zu untersuchen. Zur Analyse der dreidimensionalen, zellulären Verteilung von biologischen Zielen stellen wir QDTI vor, welches eine einfache Methode zur Verbesserung der Auflösung an Konfokalmikroskopen in Kombination mit optischen Schnitten darstellt. Dies ermöglicht die vorläufige Quantifizierung von markierten Proteinen. Da QDs eine hohe Elektronendichte besitzen kann QDTI auch für korrelative Fluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie genutzt werden, was die Vielseitigkeit der QD-Sonden verdeutlicht. Mit Hilfe des single-particle tracking PALM (sptPALM) Konzepts konnten einzelne Rezeptormoleküle verfolgt werden, um die Dynamiken einer TNF-R1-tdEos Chimäre auf der Membran zu beobachten. Die laterale Rezeptordynamik kann hier mit hoher Präzision gemessen, und die Einflüsse auf die TNF-R1-Mobilität konnte nach Ligandenzugabe oder die Störung der Membranzusammensetzung analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen eine komplexe Rezeptordynamik und lassen sowohl auf Internalisierungsprozesse in Reaktion auf TNFα-Stimulation, als auch auf eine wichtige Rolle von Membrandomänen mit eingeschränkter Fluidität in der TNF-R1 Kompartimentierung während der Ligandenbindung schließen. Zusätzlich wurde der aktive Transport von NF-kB-tdEos Fusionsproteinen in lebenden Neuronen unter chemischer Stimulierung bzw. Inhibierung untersucht. Im Gegensatz zu phototransformierbaren Proteinen, die keine speziellen Puffer zur Photokonversion oder Photoaktivierung benötigen, war dSTORM bisher für in vivo Anwendungen ungeeignet, da organische Farbstoffe auf die Einführung über Immunfärbung in Kombination mit einem reduktiven, Sauerstoff-freiem Medium für korrektes Photoschalten angewiesen waren. ATTO655 wurde zuvor als geeignet für die Anwendung in lebenden Zellen eingestuft, da das Schaltverhalten durch die reduktive Umgebung des Zytoplasmas katalysiert werden kann. Durch die Einführung von membranpermeablen organischen Farbstoffen über ein chemisches Markierungssystem konnte eine hohe Spezifität und ein geringer Hintergrund erreicht werden. Hier konnte durch die Markierung des Histon H2B Komplexes die Bewegung einzelner Nukleosome in lebenden Zellen über lange Zeiträume mit einer Auflösung von ~20 nm beobachtet werden. Die Umsetzung dieser neuen Ansätze für die Darstellung biologischer Prozesse mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung liefert neue Einblicke in die Dynamiken und die räumliche Heterogenität von Proteinen und enthüllt Funktionen im Organismus und beleuchtet Eigenschaften, die sonst nur in vitro nachweisbar wären.
KW  - Fluoreszenzmikrosopie
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor <alpha>
KW  - Hochauflösendes Verfahren
KW  - sptPALM
KW  - dSTORM
KW  - PALM
KW  - QDTI
KW  - TNF-R1
KW  - TNF-R2
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73191
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TY  - THES
A1  - Zeeshan, Ahmed
T1  - Bioinformatics Software for Metabolic and Health Care Data Management
T1  - Metabolische Flux-Analyse
N2  - Computer Science approaches (software, database, management systems) are powerful tools to boost research. Here they are applied to metabolic modelling in infections as well as health care management. Starting from a comparative analysis this thesis shows own steps and examples towards improvement in metabolic modelling software and health data management. In section 2, new experimental data on metabolites and enzymes induce high interest in metabolic modelling including metabolic flux calculations. Data analysis of metabolites, calculation of metabolic fluxes, pathways and their condition-specific strengths is now possible by an advantageous combination of specific software. How can available software for metabolic modelling be improved from a computational point of view? A number of available and well established software solutions are first discussed individually. This includes information on software origin, capabilities, development and used methodology. Performance information is obtained for the compared software using provided example data sets. A feature based comparison shows limitations and advantages of the compared software for specific tasks in metabolic modeling. Often found limitations include third party software dependence, no comprehensive database management and no standard format for data input and output. Graphical visualization can be improved for complex data visualization and at the web based graphical interface. Other areas for development are platform independency, product line architecture, data standardization, open source movement and new methodologies. The comparison shows clearly space for further software application development including steps towards an optimal user friendly graphical user interface, platform independence, database management system and third party independence especially in the case of desktop applications. The found limitations are not limited to the software compared and are of course also actively tackled in some of the most recent developments. Other improvements should aim at generality and standard data input formats, improved visualization of not only the input data set but also analyzed results. We hope, with the implementation of these suggestions, metabolic software applications will become more professional, cheap, reliable and attractive for the user. Nevertheless, keeping these inherent limitations in mind, we are confident that the tools compared can be recommended for metabolic modeling for instance to model metabolic fluxes in bacteria or metabolic data analysis and studies in infection biology. ...
N2  - Informatik Ansätze (Software, Datenbank, Management-Systeme) sind wichtige Werkzeuge für die Forschung in der Biologie. Ausgehend von einer vergleichenden Analyse zeigt diese Arbeit eigene Schritte und Beispiele zur Verbesserung von metabolischer Modellierungs-Software und Gesundheit Datenmanagementsystemen auf. Neue experimentelle Daten über Metaboliten und Enzyme führen zu hohem Interesse an metabolischen Modellierungen einschließlich Stoffwechselflusses Berechnungen. In Kapitel 2 zeigen wir, das die Datenanalyse von Metaboliten, die Berechnung der Stoffflüsse und Wege sowie die spezifischen Softwarestärken nur durch eine vorteilhafte Kombination voll ausgeschöpft werden. Wie kann Software zur metabolischen Modellierung von einer informatischen Sicht her verbessert werden? Eine Anzahl von verfügbaren und gut etablierten Softwareansätzen wird zunächst einzeln diskutiert. Dazu gehören Informationen über Software-Herkunft, Fähigkeiten, Entwicklung und verwendeten Methodik einschließlich Testdatensätzen und Modellen. Ein Vergleich zeigt, merkmalsbasierte Einschränkungen und Vorteile der verglichenen Software für spezifische Aufgaben in der metabolischen Modellierung. Häufige Einschränkungen der verglichenen Software sind ihre Abhängigkeit von Drittanbietern, kein umfassendes Datenbank-Management und kein Standard-Format für Dateneingabe und -ausgabe. Die grafische Visualisierung für komplexe Visualisierungen von Daten und die Web-basierte grafische Benutzeroberfläche kann oft noch verbessert werden. Andere Bereiche für weitere Entwicklung sind Plattformunabhängigkeit, Produktlinien-Architektur, Daten-Standardisierung, die Open-Source-Bewegung und neue Algorithmen und Methoden. Der Vergleich zeigt deutlich Möglichkeiten für weitere Entwicklung von Softwareanwendungen auf, einschließlich Schritten in Richtung einer optimalen, benutzerfreundlichen grafischen Benutzeroberfläche, Plattform-Unabhängigkeit, Datenbank-Management-System und Unabhängigkeit von weiterer software, vor allem im Falle von Desktop-Anwendungen. Die gefundenen Einschränkungen sind von allgemeiner Bedeutung für bioinformatische Modellierungssoftware einschließlich jüngster Entwicklungen. Weitere Verbesserungen betreffen standardisierte Formate und eine, verbesserte Visualisierung von Eingabedatensatz und analysierten Ergebnissen. Wir hoffen, dass mit der Umsetzung dieser Vorschläge metabolische Software-Anwendungen professioneller werden, billiger, zuverlässiger und attraktiver für den Anwender. Trotz dieser inhärenten Einschränkungen im Hinterkopf sind wir zuversichtlich und ...
KW  - Stoffwechsel
KW  - Modell
KW  - Software
KW  - Gesundheitswesen
KW  - Datenbanksystem
KW  - Metabolische Flux-Analyse
KW  - Massen-Isotopomer Verteilungs-Analyse
KW  - Datenbank
KW  - Management-Systeme
KW  - Metabolic Flux Analysis
KW  - Mass Isotopomers Distribution Analysis
KW  - Software
KW  - Database
KW  - Management System
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73926
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TY  - THES
A1  - Reinboth, Jennifer
T1  - Cellular Factors Contributing to Host Cell Permissiveness in Support of Oncolytic Vaccinia Virus Replication
T1  - Beteiligung zellulärer Faktoren an der Permissivität von Wirtszellen in Unterstützung der onkolytischen Vaccinia Virus Replikation
N2  - In initial experiments, the well characterized VACV strain GLV-1h68 and three wild-type LIVP isolates were utilized to analyze gene expression in a pair of autologous human melanoma cell lines (888-MEL and 1936 MEL) after infection. Microarray analyses, followed by sequential statistical approaches, characterized human genes whose transcription is affected specifically by VACV infection. In accordance with the literature, those genes were involved in broad cellular functions, such as cell death, protein synthesis and folding, as well as DNA replication, recombination, and repair. In parallel to host gene expression, viral gene expression was evaluated with help of customized VACV array platforms to get better insight over the interplay between VACV and its host. Our main focus was to compare host and viral early events, since virus genome replication occurs early after infection. We observed that viral transcripts segregated in a characteristic time-specific pattern, consistent with the three temporal expression classes of VACV genes, including a group of genes which could be classified as early-stage genes. In this work, comparison of VACV early replication and respective early gene transcription led to the identification of seven viral genes whose expression correlated strictly with replication. We considered the early expression of those seven genes to be representative for VACV replication and we therefore referred to them as viral replication indicators (VRIs). To explore the relationship between host cell transcription and viral replication, we correlated viral (VRI) and human early gene expression. Correlation analysis revealed a subset of 114 human transcripts whose early expression tightly correlated with early VRI expression and thus early viral replication. These 114 human molecules represented an involvement in broad cellular functions. We found at least six out of 114 correlates to be involved in protein ubiquitination or proteasomal function. Another molecule of interest was the serine-threonine protein kinase WNK lysine-deficient protein kinase 1 (WNK1). We discovered that WNK1 features differences on several molecular biological levels associated with permissiveness to VACV infection. In addition to that, a set of human genes was identified with possible predictive value for viral replication in an independent dataset. A further objective of this work was to explore baseline molecular biological variances associated with permissiveness which could help identifying cellular components that contribute to the formation of a permissive phenotype. Therefore, in a subsequent approach, we screened a set of 15 melanoma cell lines (15-MEL) regarding their permissiveness to GLV-1h68, evaluated by GFP expression levels, and classified the top four and lowest four cell lines into high and low permissive group, respectively. Baseline gene transcriptional data, comparing low and highly permissive group, suggest that differences between the two groups are at least in part due to variances in global cellular functions, such as cell cycle, cell growth and proliferation, as well as cell death and survival. We also observed differences in the ubiquitination pathway, which is consistent with our previous results and underlines the importance of this pathway in VACV replication and permissiveness. Moreover, baseline microRNA (miRNA) expression between low and highly permissive group was considered to provide valuable information regarding virus-host co-existence. In our data set, we identified six miRNAs that featured varying baseline expression between low and highly permissive group. Finally, copy number variations (CNVs) between low and highly permissive group were evaluated. In this study, when investigating differences in the chromosomal aberration patterns between low and highly permissive group, we observed frequent segmental amplifications within the low permissive group, whereas the same regions were mostly unchanged in the high group. Taken together, our results highlight a probable correlation between viral replication, early gene expression, and the respective host response and thus a possible involvement of human host factors in viral early replication. Furthermore, we revealed the importance of cellular baseline composition for permissiveness to VACV infection on different molecular biological levels, including mRNA expression, miRNA expression, as well as copy number variations. The characterization of human target genes that influence viral replication could help answering the question of host cell response to oncolytic virotherapy and provide important information for the development of novel recombinant vaccinia viruses with improved features to enhance replication rate and hence trigger therapeutic outcome.
N2  - Die Replikationseffizienz von VACVs spielt eine maßgebliche Rolle für deren antitumorale Wirkung und onkolytische Effizienz. Ferner hängt die Permissivität einer Wirtszelle gegenüber der Behandlung mit onkolytischen VACVs maßgeblich von einer erfolgreichen viralen Replikation und Vermehrung ab. Darauf basierend, war der Fokus der vorliegenden Arbeit, zelluläre Eigenschaften zu erforschen, welche die VACV-Replikation beeinflussen und die Wirtszell-Permissivität gegenüber einer Behandlung mit VACV prognostizieren können. Für initiale Genexpressionsanalysen wurden zwei autologe, humane Melanom-Zelllinien (888-MEL und 1936 MEL), sowie der ausgiebig charakterisierte VACV-Stamm GLV-1h68 und drei wildtypische LIVP Isolate verwendet. Mit Hilfe von Microarray Analysen und einem sequenziellen statistischen Ansatz konnten humane Gene charakterisiert werden, deren Transkription eigens durch VACV-Infektion beeinflusst wird. Erwartungsgemäß zeigten diese Gene eine Anreicherung in globalen zellulären Signalwegen und Funktionen. Die frühe virale Gentranskription kann als repräsentative Bestimmungsgröße für virale Replikation betrachtet werden. Darauf basierend resultierte der Vergleich von früher VACV Replikation und entsprechender früher Gentranskription in der Identifikation von sieben viralen Genen, deren Expression und Replikation stark korrelierten. Aus diesem Grund wurde die frühe Expression der sieben VACV-Gene als kennzeichnend für virale Replikation angesehen und diese Gene als virale Replikations-Indikatoren (VRIs) definiert. Zur Aufklärung von Zusammenhängen zwischen Wirts-Transkription und viraler Replikation wurde die frühe virale VRI-Expression mit der frühen humanen Genexpression in Beziehung gesetzt. Mit Hilfe von Vergleichsanalysen wurden 114 humane Transkripte identifiziert, deren frühes Expressionsmuster eng mit demjenigen der VRIs korrelierte und dementsprechend ebenso mit der viralen Replikation. Von den 114 Korrelaten spielen mindestens sechs eine Rolle in der Protein-Ubiquitinierung oder in der proteasomalen Signalgebung. Ein weiteres Molekül, welches besonderes Interesse weckte, war die Serin-Threonin Proteinkinase WNK Lysin-defizientes Protein 1 (WNK1). Für WNK1 wurden Unterschiede, die mit der VACV-Infektions-Permissivität zusammenhängen, auf verschiedenen molekularbiologischen Ebenen nachgewiesen. Desweiten wurde in dieser Arbeit eine Anzahl humaner Gene identifiziert, welche virale Replikation in einem unabhängigen Datensatz prognostizieren konnten. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war es, molekularbiologische Unterschiede, welche mit Infektions-Permissivität von Zellen assoziiert sind, auf Basisebene zu ergründen. Diese könnten dabei helfen, zelluläre Komponenten zu identifizieren, welche einen so genannten permissiven Phänotyp kennzeichnen. Aus diesem Grund wurden in einem weiteren Versuchsansatz 15 Melanom-Zelllinien (15-MEL) bezüglich ihrer Permissivität gegenüber GLV-1h68 anhand von GFP Expression untersucht. Die vier Zelllinien mit der höchsten und diejenigen vier mit der niedrigsten Permissivität wurden je einer Gruppe zugeordnet (hochpermissive und niedrigpermissive Gruppe). Die Gruppen hoher und niedriger Permissivität wurden bezüglich ihrer Basislevel-Transkription verglichen. Unterschiedlich exprimierte Gene waren, zumindest zum Teil, in globale zelluläre Prozesse involviert. Darüber hinaus wurde microRNA (miRNA) Basislevel-Expression von hoch- und niedrigpermissiver Gruppe untersucht. In dieser Arbeit wurden sechs miRNAs identifiziert, deren Basislevel-Expression zwischen niedrig und hochpermissiver Gruppe differiert. Abschließend wurden Veränderungen der Kopienzahl von Genen (copy number variations, CNVs) im Vergleich zwischen niedrig- und hochpermissiver Gruppe untersucht. Betrachtung chromosomaler Veränderungen zeigte eine Anreicherung von Segment-Amplifikationen in der niedrigpermissiven Gruppe, während gleiche Abschnitte der hochpermissiven Gruppe größtenteils keine Veränderungen aufwiesen. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit eine mutmaßliche Korrelation zwischen viraler Replikation, früher Genexpression und der entsprechenden Wirtsantwort gezeigt werden und somit eine mögliche Beteiligung humaner Wirtsfaktoren an der viralen Replikation. Zusätzlich wurden wichtige Aspekte der Basiskomposition von Zellen für die Permissivität gegenüber VACV-Infektion auf verschiedenen molekularbiologischen Ebenen aufgedeckt, einschließlich mRNA-Expression, miRNA-Expression sowie Kopienzahl-Variationen. Die Charakterisierung humaner Zielgene, welche die virale Replikation beeinflussen, könnte dabei helfen, die Wirtszellantwort auf onkolytische Virotherapie aufzuklären und wichtige Informationen zu liefern für die Entwicklung neuartiger rekombinanter Vaccinia-Viren mit verbesserten Eigenschaften und verbesserter Replikationseffizienz und somit einem gesteigerten Therapieerfolg.
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Microarray
KW  - Melanom
KW  - onkolytische Virotherapie
KW  - Vaccinia Virus Replikation
KW  - vaccinia virus
KW  - microarray
KW  - malignant melanoma
KW  - oncolytic virotherapy
KW  - vaccinia virus replication
KW  - Onkolyse
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85392
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TY  - THES
A1  - Kronhardt, Angelika
T1  - Channel Formation, Binding and Translocation Properties of Anthrax, CDT and Related Toxins of the AB7 type
T1  - Kanalbilidung, Bindungs- und Translokationseigenschaften des Anthrax, CDT und verwandten Toxinen des AB7-Toxintyps
N2  - The ability to produce toxins is spread among a huge variety of bacterial strains. A very prominent class of bacterial protein toxins is the family of binary AB toxins sharing a common mode of intoxication. A pore forming component B binds and translocates an enzymatic component A into the cytosol of target cells exhibiting a fatal mode of action. These components are supposed to be not toxic themselves but both required for cell toxicity. Anthrax toxin produced by the Gram-positive bacteria Bacillus anthracis is the best studied binary toxin especially since its use as a biological weapon in the context of the attacks of 9/11 in 2001. In contrast to other binary toxins, Anthrax toxin possesses two different enzymatic components, edema factor (EF), a calcium- and calmodulin-dependent adenylat-cyclase and lethal factor (LF), a zinc-dependent metalloprotease. Protective antigen (PA) is the pore-forming component responsible for binding and translocation. Clostridium botulinum possesses in addition to the well known botulinum toxin (Botox) a variety of other toxins, such as the binary C2 toxin. C2 toxin is composed of the binding and translocation moiety C2II and the enzymatic moiety C2I acting as an actin-ADP-ribosyltransferase. In this study, the mode of translocation and the binding kinetics to the enzymatic component were studied in a biophysical experimental setup. In chapter 2, the binding of the N-terminal fractions EFN and LFN to the PA channel are analyzed in artificial bilayer membranes revealing lower binding affinity compared to full-length EF and LF. Other biophysical properties like voltage-dependency and ionic-strength dependency are not influenced. The results suggest that additional forces are involved in the binding process, than those concerning the N-terminus exclusively, as it was supposed previously. As the treatment of an Anthrax infection with antibiotics is often medicated very late due to the lack of early symptoms, tools to prevent intoxication are required. 4-aminoquinolones like chloroquine are known to block the PA channel, thereby inhibiting intoxication but they also lead to severe side-effects. In chapter 3 new promising agents are described that bind to PA in artificial bilayer systems, elucidating common motives and features which are necessary for binding to PA in general. The possible interaction of Anthrax and C2 toxin is investigated by measuring the binding of one enzymatic component to the respective other toxin’s pore (chapter 4). Interestingly, in vitro experiments using the black lipid bilayer assay show that PA is able to bind to C2I resulting in half saturation constants in the nanomolar range. Furthermore, in vivo this combination of toxin components exhibits cell toxicity in human cell lines. This is first-time evidence that a heterologous toxin combination is functional in in vitro and in vivo systems. In contrast, C2II is able to bind to EF as well as to LF in vitro, whereas in in vivo studies almost no toxic effect is detected. In the case of PA, an N-terminal His6-tag attached to the enzymatic subunit increased the binding affinity (chapter 5). A His6-tag attached to not related proteins also led to high binding affinities, providing the possibility to establish PA as a general cargo protein. In chapter 6 a set of different molecules and proteins is summarized, which are either related or not related to binary toxins, PA is able to bind. In first line, the presence of positive charges is found to be responsible for binding to PA which is in accordance to the fact that PA is highly cation selective. Furthermore, we present evidence that different cationic electrolytes serve as a binding partner to the PA channel. In the last decade another toxin has aroused public attention as it was found to be responsible for a rising number of nosocomial infections: Clostridium difficile CDT toxin. The mode of action of the enzymatic subunit CDTa is similar to C2I of C2 toxin, acting as an ADP-ribosylating toxin. The channel forming and binding properties of CDT toxin are studied in artificial bilayer membranes (chapter 7). We found that two different types of channels are formed by the B component CDTb. The first channel is similar to that of iota toxin’s Ib of Clostridium perfringens with comparable single channel conductance, selectivity and binding properties to the enzymatic subunit CDTa. The formation of this type of channel is cholesterol-dependent, whereas in the absence of cholesterol another kind of channel is observed. This channel has a single channel conductance which is rather high compared to all other binary toxin channels known so far, it is anion selective and does not show any binding affinity to the enzymatic component CDTa. The results reveal completely new insights in channel formation properties and the flexibility of a pore-forming component. Additionally, these findings suggest further possibilities of toxicity of the pore forming component itself which is not known for any other binary toxin yet. Therefore, the pathogenic role of this feature has to be studied in detail.
N2  - Die Fähigkeit, Toxine zu produzieren, ist unter verschiedensten Bakterienstämmen sehr verbreitet. Zu diesen Toxinen zählt auch die Familie der binären AB-Toxine, die hauptsächlich von Bakterien der Gattung Bacillus und Clostridium gebildet werden. Charakteristisch für diese bakteriellen Proteintoxine ist der Wirkungsmechanismus der Zellintoxikation. Eine porenformende Untereinheit B bindet eine enzymatische Untereinheit A und transportiert diese in das Zytosol von Zielzellen, die dort tödliche Wirkung entfalten. Es wird angenommen, dass die einzelnen Komponenten an sich nicht toxisch sind, sondern nur in Kombination Zellvergiftung auslösen. Anthrax-Toxin, das von dem Gram-positiven Bakterium Bacillus anthracis produziert wird, ist das bekannteste und am besten untersuchte binäre Toxin, besonders seit es im Jahr 2001 als Biowaffe eingesetzt wurde. Im Gegensatz zu anderen binären Toxinen besitzt das Anthrax-Toxin zwei enzymatische Komponenten: Edema Factor (EF), eine kalzium- und calmodulinabhängige Adenylatzyklase, und Lethal Factor (LF), eine zinkabhängige Metalloprotease. Protective Antigen (PA) ist die porenformende Komponente, die für die Binding und die Translokation der enzymatischen Untereinheiten verantwortlich ist. Clostridium botulinum produziert neben dem bekannten Botulinumtoxin (Botox) eine Reihe weiterer Toxine, unter anderem das binäre C2 Toxin. Dieses besteht aus der Binde- und Translokationskomponente C2II und der enzymatischen Komponente C2I, die als ADP-Ribosyltransferase fungiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden der Translokationsmechanismus und die kinetischen Bindeeigenschaften dieser Toxine biophysikalisch untersucht. In Kapitel 2 wird die Bindung der N-terminalen Fragmente EFN und LFN an den PA-Kanal in künstlichen Lipidmembranen analysiert. Obwohl die Spannungs- und Ionenstärkeabhängigkeit unverändert sind, weisen die verkürzten Proteine deutlich geringe Bindeaffinitäten zu PA im Vergleich zu den vollständigen Proteinen auf. Die Ergebnisse zeigen, dass, anders als bisher angenommen, weitere Kräfte als die zwischen dem N-Terminus und dem PA-Kanal eine Rolle für die Bindung der enzymatischen Komponente spielen. Da bei einer Anthraxinfektion häufig keine frühen Symptome sichtbar sind, erfolgt die Behandlung mit Antibiotika in der Regel relativ spät. Daher werden neue Wirkstoffe benötigt, um einer Intoxikation vorzubeugen. Es ist bekannt, dass 4-Aminoquinolone, wie zum Beispiel Chloroquin, in der Lage sind, die PA-Pore zu blockieren und somit eine Zellvergiftung zu verhindern, allerdings haben diese Wirkstoffe starke Nebenwirkungen. In Kapitel 3 werden neue, vielversprechende Wirkstoffe beschrieben, die an PA binden können und Aufklärung darüber geben, welche Eigenschaften für die Bindung an PA im Allgemeinen verantwortlich sind. Des Weiteren wird untersucht, ob eine Kreuzreaktion zwischen den Komponenten des Anthrax- und C2-Toxins möglich ist (Kapitel 4). Dazu wird die Bindung einer enzymatischen Komponente an die Pore des entsprechenden anderen Toxins gemessen. Interessanterweise ergeben in vitro Experimente an künstlichen Lipidmembranen, dass PA an C2I bindet und in vivo Vergiftungen an humanen Zelllinien auslöst. Damit wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine heterologe Toxinkombination sowohl in vitro als auch in vivo funktionell ist. C2II hingegen ist zwar in der Lage, EF und LF zu binden, die Transportrate in Zielzellen ist jedoch sehr gering. Im Fall von PA bewirkt ein N-terminaler His6-tag, der an die enzymtischen Einheiten gekoppelt ist, eine Erhöhung der Bindeaffinität, beschrieben in Kapitel 5. Dies ist sowohl für nah verwandte Proteine der Fall als auch für Proteine, die nicht im Zusammenhang mit binären Toxinen stehen. Somit eröffnet sich die Möglichkeit, PA als universelles Transportprotein zu nutzen. In Kapitel 6 werden verschiedene Moleküle und Proteine beschrieben, die in der Lage sind, an PA zu binden. Vor allem positive Ladungen scheinen für die Bindung an PA-Kanäle verantwortlich zu sein, was mit der Tatsache, dass PA stark kationenselektiv ist, im Einklang steht. Des Weiteren wird zum ersten Mal beschrieben, dass verschiedene Kationen selbst als Bindepartner fungieren können. Seit einigen Jahren ist ein weiteres Toxin in den Fokus der Öffentlichkeit gerückt, da es zunehmend für nosokomiale Infektionen verantwortlich gemacht wird: CDT-Toxin von Clostridium difficile. Wie das C2-Toxin besitzt CDT-Toxin ADP-Ribosyltransferaseaktivität, was zu irreversiblen Schäden des Aktin- Zytoskeletts und somit zum Zelltod führt. Die biophysikalischen Eigenschaften, betreffend Porenbildung und Bindeaffinität des CDT-Toxins werden in Kapitel 7 beschrieben. Wir zeigen, dass die B Komponente CDTb fähig ist, zwei unterschiedliche Kanäle zu bilden. Einer dieser Kanäle ist dem des Iota-Toxins von Clostridium perfringens ähnlich, die Einzelkanalleitfähigkeit, Selektivität und Bindeeigenschaften sind vergleichbar. Die Bildung dieses Kanals ist abhängig von Cholesterin, wohingegen in Abwesenheit von Cholesterin überwiegend ein anderer Kanal geformt wird. Dieser zeigt eine für einen binären Toxinkanal ungewöhnlich hohe Einzelkanalleitfähigkeit, der Kanal ist anionselektiv und weist keinerlei Bindeaffinität zu der enzymatischen Komponente CDTa auf. Die Ergebnisse offenbaren neue Einblicke in die Formierung von Toxinkanälen und deuten darauf hin, dass dieses Toxin durch die Flexibilität der Kanalbildung möglicherweise zusätzliche Fähigkeiten besitzt, Zellintoxikation auszulösen. Dennoch ist die physiologische und pathogene Rolle dieser Eigenschaft noch weitestgehend ungeklärt und bedarf intensiver Untersuchung.
KW  - Bacillus anthracis
KW  - Toxin
KW  - Lipidmembran
KW  - Pore
KW  - Translokation
KW  - Porenbildung
KW  - Anthrax toxin
KW  - Black lipid bilayer
KW  - pore formation and translocation
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71559
ER  - 
TY  - THES
A1  - Cardoso e Castro, Inês Sofia
T1  - Epigenetic switch induced by MYC in Non-Small-Cell Lung Cancer
T1  - Durch MYC induzierte epigenetische Veränderung im Nichtkleinzelligen Bronchialkarzinom
N2  - Non–Small-Cell Lung Cancer (NSCLC) is the most frequent human lung cancer and a major cause of death due to its high rate of metastasis1. These facts emphasize the urgent need for the investigation of new targets for anti-metastatic therapy. Up to now a number of genes and gene products have been identified that positively or negatively affect the probability of established human tumor cell lines to metastasize2. Previously, together with the group of Professor Ulf Rapp, we have described the first conditional mouse model for metastasis of NSCLC and identified a gene, c-MYC, that is able to orchestrate all steps of this process. We could identify potential markers for detection of metastasis and highlighted GATA4, which is exclusively expressed during lung development, as a target for future therapeutic intervention2. However, the mechanism underlying this metastatic conversion remained to be identified, and was therefore the focus of the present work. Here, GATA4 is identified as a MYC target in the development of metastasis and epigenetic alterations at the GATA4 promoter level are shown after MYC expression in NSCLC in vivo and in vitro. Such alterations include site-specific demethylation that accompanies the displacement of the MYC-associated zinc finger protein (MAZ) from the GATA4 promoter, which leads to GATA4 expression. Histone modification analysis of the GATA4 promoter revealed a switch from repressive histone marks to active histone marks after MYC binding, which corresponds to active GATA4 expression. This work identifies a novel epigenetic mechanism by which MYC activates GATA4 leading to metastasis in NSCLC, suggesting novel potential targets for the development of anti-metastatic therapy.
N2  - Das nichtkleinzellige Bronchialkarzinom (Non-Small-Cell Lung Cancer/NSCLC) ist die häufigste Form des Lungenkrebs und ist aufgrund seiner hohen Metastasierungsrate für die meisten krebsbedingten Todesfälle verantwortlich1. Bisher konnte eine Vielzahl von Genen und Genprodukten identifiziert werden, die einen Einfluss auf das Metastasierungspotenzial von humanen Tumorzelllinien in vitro haben2. Vor kurzem gelang es uns unter der Leitung von Prof. Ulf R. Rapp das erste konditionelle Modell der Metastasierung von NSCLC zu beschreiben. Wir identifizierten u.a. das Gen c-MYC, welches in der Lage ist, in alle Schritte des Prozesses manipulierend einzugreifen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir potentielle Marker zur Detektion der Metastasierung identifizieren. Unser Hauptaugenmerk lag dabei auf GATA4, ein Gen, das nur während der Lungenentwicklung exprimiert wird. Als potentielles Ziel für spätere therapeutische Eingriffe erscheint es daher besonders geeignet2. Die der Metastasierung zugrunde liegenden Mechanismen sind bisher weitestgehend ungeklärt und stellen daher einen Fokus dieser Arbeit dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde GATA4 als ein von MYC regulierter Faktor identifiziert, der an der Entwicklung von Metastasen beteiligt ist. Epigenetische Veränderungen am GATA4-Promotor nach der Expression von MYC konnten sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen werden. Die Veränderungen beinhalten ortsspezifische Methylierungen, die einhergehen mit der Dislokation des MYC-assoziierten zinc finger protein (MAZ), die zur Expression von GATA4 führt. Die Analyse der Histon-Modifikationen am GATA4-Promotor ergab, dass nach der Bindung von MYC ein Wechsel von reprimierenden Histon-Markierungen zu aktiven stattfindet, der mit der GATA4-Expression korreliert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte also ein neuartiger epigenetischer Mechanismus identifiziert werden, mit dem MYC GATA4 aktiviert und auf diese Weise zur Metastasenbildung bei NSCLC führt. Gleichzeitig wurden dadurch neue potentielle Zielstrukturen für die Entwicklung von anti-metastasierenden Therapeutika gefunden.
KW  - Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom
KW  - Metastase
KW  - Gen
KW  - Myc
KW  - Epigenese
KW  - Non-Small Cell Lung Cancer
KW  - Epigenetic
KW  - MYC
KW  - GATA4
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76713
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmidt, Traudel
T1  - Establishment of Hey-triple-KO-ES cells and characterisation of Bre, a Hey binding partner
T1  - Etablierung von Hey-triple-KO ES-Zellen und Charakterisierung von Bre, einem Hey Bindepartner
N2  - Hey1, Hey2 and HeyL are downstream effectors of the Notch signalling pathway. Hey genes play decisive roles during embryonic development for example in cardiovascular development. However, the precise transcriptional programmes and genes, which are affected by each single Hey gene, are still poorly understood. One drawback for the analysis of Hey1, Hey2 or HeyL single gene function is that these genes are co-expressed in many tissues and share a high degree of functional redundancy. Thus, it was necessary to establish a system, which is either devoid of Hey expression, or just comprises one single Hey gene family member. For this, Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- as well as Hey-triple- knock out (KO)-ES cells (embryonic stem cells) were generated in this work, because ES cells and their differentiation as EBs (embryoid bodies) represent a valuable tool for the in vitro analysis of embryonic developmental processes. After the establishment of Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- and Hey-triple- KO-ES cells, it could be seen by ALP staining and pluripotency marker expression that loss of Hey expression did not affect ES cell pluripotency features. Thus, these ES cells represent bona fide ES cells and could be further used for the differentiation as EBs. Here, differences in gene expression between Hey1(fl/fl)/Hey2(-/-)/HeyL(-/-)- and Hey-triple- KO-ES cells (after the loss of Hey1) could be observed in realtime-RT-PCR analysis for the endodermal marker AFP as well as for neural and myogenic markers in d10 EBs. However, the establishment of inducible Hey1, Hey2 or HeyL ES cell lines will be essential to confirm these findings and to search for novel Hey target genes. To get further insight into the mode of Hey action, the analysis of Hey interaction partners is necessary. One such binding partner, the Bre protein, has previously been found in a yeast-two-hybrid screen. Bre has been described to be a member of two distinct complexes (i.e. the nuclear BRCA1-A complex with a function in DNA damage response and the cytoplasmic BRISC complex), to directly interact with the TNF-receptor and Fas and to interfere with apoptotic signalling. The Hey-Bre interaction could be further corroborated in this work; yet, it was not possible to narrow down the interaction site of Bre with Hey1. It rather seems that non-overlapping parts of the Bre protein may bind to Hey. This interaction may be direct– pointing to more than one interaction site inside the Bre protein – or via a common binding partner such as the endogenous Bre protein itself. Besides the interaction studies, functional assays were performed for a more detailed characterisation of Hey1 and Bre interaction. Here, it could be shown that Hey1 over-expression did not have any influence on Bre sub-cellular localisation. Interestingly, it could be demonstrated that Bre positively interfered with Hey1 repressive function in luciferase assays at three of four promoters analysed. Moreover, interaction with Bre seems to lead to a stabilisation of Hey1. As Bre has been described to modulate the E3-ligase activity intrinsic to the BRCC complex it was analysed whether Bre over-expression results in an ubiquitination of Hey1. Yet, this could not be observed in the present work. Furthermore, an interaction of Bre with ubiquitinated proteins could not be demonstrated in an ubiquitin binding assay. To obtain a better insight into Bre function, Bre LacZ gene trap-ES cells and animals were generated. However, realtime-RT-analyses revealed that these cells and mice did not show a loss of Bre expression on mRNA level indicating that insertion mutagenesis did not occur as expected. However, embryos derived from these mice could nevertheless be used for the detection of tissues with Bre expression by β-galactosidase staining. Bre deficiency on mRNA levels was only achieved after the deletion of the floxed exon 3 resulting in the generation of Bre del-mice. Bre del-mice were fertile and without any obvious phenotype and they were used for the generation of Bre del- and wt-MEFs (murine embryonic fibroblasts). Characterisation of these cells showed that proliferation was not affected after loss of Bre (neither under normal nor under stress conditions). However, loss of Bre notably resulted in a reduction in the BRCA1 DNA damage response, in a slightly increased sensitivity towards apoptosis induction by FasL treatment and in an increase in the K63-poly-ubiquitin content in Bre del-cytoplasmic fractions, probably linked to a change in the BRISC de-ubiquitinase activity. Even though these results have the same tendencies as observed in former studies, the effects in the present work are less striking. Further studies as well as intercrossing of Bre del- to Hey KO-animals will be necessary to further understand the functional relevance of Hey and Bre interaction.
N2  - Hey1, Hey2 und HeyL sind Zielgene des Notch Signalwegs und spielen eine entscheidende Rolle während der Embryonalentwicklung, z. B. bei der Bildung des kardiovaskulären Systems. Die genauen Effekte eines jeden einzelnen Hey Gens auf Transkriptionsprogramme und einzelne Gene sind allerdings noch relativ unbekannt. Einer der Gründe hierfür liegt vermutlich in der Koexpression von Hey-Proteinen in vielen Geweben bzw. in der daraus resultierenden funktionellen Redundanz. Daher sollte in dieser Arbeit ein System entwickelt werden, in dem entweder keines oder jeweils nur eines der Hey-Gene intakt ist. Hierzu wurden Hey1fl/fl/Hey2-/-/HeyL-/- und Hey-triple-knock out (KO) ES-Zellen (embryonale Stammzellen) etabliert. ES-Zellen stellen ein hervorragendes Modellsystem für die Embryonalentwicklung dar, weil ihre in vitro Differenzierung als sog. „embryoid bodies“ (EBs) embryonale Entwicklungsprozesse widerspiegelt. Der Verlust der Hey-Genexpression hatte keinen Einfluss auf den Stammzellcharakter der etablierten Zellen, da sowohl die generierten Hey-triple-KO- als auch die Hey1fl/fl/Hey2-/-/HeyL-/--ES-Zellen eine positive ALP-Färbung sowie eine hohe Expression von Pluripotenzmarkern zeigten. Daher konnten die Zellen im Folgenden als EBs differenziert und auf Genexpressionsunterschiede während der Differenzierung untersucht werden. Zwischen Hey1fl/fl/Hey2-/-/HeyL-/-- (mit intakter Hey1-Expression) und Hey-triple- KO- ES Zellen konnten an EB Tag 10 mittels realtime-RT-PCR Unterschiede in der Genexpression für den endodermalen Marker AFP, sowie für neurale und myogene Marker festgestellt werden. Um diese Ergebnisse zu bestätigen, aber auch, um neue Hey Zielgene ausfindig machen zu können, ist jedoch die Etablierung induzierbarer ES-Zellen (für Hey1, Hey2 bzw. HeyL) notwendig. Um einen tieferen Einblick in die Funktionsweise der Hey-Gene gewinnen zu können ist die Untersuchung von Hey Interaktionspartnern wichtig. Das Bre-Protein ist ein solcher Bindepartner und wurde zuvor in einem Yeast-two-hybrid Assay gefunden. Bre ist in zwei verschiedenen Komplexen beschrieben worden: dem nukleären BRCA1-A-Komplex, der eine Rolle bei der Detektion von DNA-Schäden spielt und dem cytoplasmatischen BRISC-Komplex. Es ist außerdem bekannt, dass Bre direkt mit dem TNF-Rezeptor und mit Fas interagiert und die apoptotische Antwort in der Zelle beeinflusst. Die Interaktion zwischen Bre und Hey1 konnte in dieser Arbeit zunächst bestätigt werden; in weiteren Ko-immunpräzipitations-Experimenten war es aber nicht möglich, den Bereich des Bre-Proteins zu bestimmen, der die Interaktion mit Hey1 vermittelt, da verschiedene nicht überlappende Bereiche des Bre-Proteins eine Interaktion mit Hey1 zeigten. Ob es sich hierbei um direkte Interaktionen handelte und Bre somit mehrere Bindestellen für Hey1 aufweist oder ob die Interaktion indirekt über einen gemeinsamen Bindepartner wie z.B. das endogene Bre-Protein selbst vermittelt wird, ist noch nicht geklärt. Für eine weitere Charakterisierung der Interaktion zwischen den beiden Proteinen wurden funktionelle Versuche durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von Hey1 keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation des Bre Proteins hat. Mit Hilfe von Luziferase Assays konnte aber interessanterweise nachgewiesen werden, dass Bre bei drei von vier untersuchten Promotern positiv auf die Repression durch Hey1 einwirkte. Außerdem scheint die Überexpression von Bre möglicherweise eine Stabilisierung des Hey1-Proteins zu bewirken. Da Bre eine Verstärkung der E3-Ligasefunktion des BRCC-Komplexes zugeschrieben wird, wurde außerdem untersucht, ob die Überexpression von Bre zu einer Ubiquitinylierung von Hey1 führt. Dies konnte allerdings nicht festgestellt werden. Desweiteren konnte in einem Ubiquitin-Bindeassay keine Interaktion von Bre mit anderen ubiquitinylierten Proteinen gezeigt werden. ...
KW  - Embryonale Stammzelle
KW  - Zeitdifferenzierung
KW  - Gen notch
KW  - Knockout <Molekulargenetik>
KW  - Hey
KW  - Bre
KW  - Hey
KW  - embryonic stem cells
KW  - differentiation
KW  - interaction
KW  - Bre-knockout
KW  - Interaktion
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85459
ER  - 
TY  - THES
A1  - Buckel, Lisa
T1  - Evaluating the combination of oncolytic vaccinia virus and ionizing radiation in therapy of preclinical glioma models
T1  - Evaluierung der Kombination von onkolytischem Vaccinia Virus und ionisierender Strahlung in vorklinischen Gliomamodellen
N2  - Glioblastoma multiforme (GBM) represents the most aggressive form of malignant brain tumors and remains a therapeutically challenge. Intense research in the field has lead to the testing of oncolytic viruses to improve tumor control. Currently, a variety of different oncolytic viruses are being evaluated for their ability to be used in anti-cancer therapy and a few have entered clinical trials. Vaccinia virus, is one of the viruses being studied. GLV-1h68, an oncolytic vaccinia virus engineered by Genelux Corporation, was constructed by insertion of three gene cassettes, RUC-GFP fusion, β-galactosidase and β- glucuronidase into the genome of the LIVP strain. Since focal tumor radiotherapy is a mainstay for cancer treatment, including glioma therapy, it is of clinical relevance to assess how systemically administered oncolytic vaccinia virus could be combined with targeted ionizing radiation for therapeutic gain. In this work we show how focal ionizing radiation (IR) can be combined with multiple systemically delivered oncolytic vaccinia virus strains in murine models of human U-87 glioma. After initial experiments which confirmed that ionizing radiation does not damage viral DNA or alter viral tropism, animal studies were carried out to analyze the interaction of vaccinia virus and ionizing radiation in the in vivo setting. We found that irradiation of the tumor target, prior to systemic administration of oncolytic vaccinia virus GLV-1h68, increased viral replication within the U-87 xenografts as measured by viral reporter gene expression and viral titers. Importantly, while GLV-1h68 alone had minimal effect on U-87 tumor growth delay, IR enhanced GLV-1h68 replication, which translated to increased tumor growth delay and mouse survival in subcutaneous and orthotopic U-87 glioma murine models compared to monotherapy with IR or GLV-1h68. The ability of IR to enhance vaccinia replication was not restricted to the multi-mutated GLV-1h68, but was also seen with the less attenuated oncolytic vaccinia, LIVP 1.1.1. We have demonstrated that in animals treated with combination of ionizing radiation and LIVP 1.1.1 a strong pro-inflammatory tissue response was induced. When IR was given in a more clinically relevant fractionated scheme, we found oncolytic vaccinia virus replication also increased. This indicates that vaccinia virus could be incorporated into either larger hypo-fraction or more conventionally fractionated radiotherapy schemes. The ability of focal IR to mediate selective replication of systemically injected oncolytic vaccinia was demonstrated in a bilateral glioma model. In mice with bilateral U-87 tumors in both hindlimbs, systemically administered oncolytic vaccinia replicated preferentially in the focally irradiated tumor compared to the shielded non- irradiated tumor in the same mouse We demonstrated that tumor control could be further improved when fractionated focal ionizing radiation was combined with a vaccinia virus caring an anti-angiogenic payload targeting vascular endothelial growth factor (VEGF). Our studies showed that following ionizing radiation expression of VEGF is upregulated in U-87 glioma cells in culture. We further showed a concentration dependent increase in radioresistance of human endothelial cells in presence of VEGF. Interestingly, we found effects of vascular endothelial growth factor on endothelial cells were reversible by adding purified GLAF-1 to the cells. GLAF-1 is a single- chain antibody targeting human and murine VEGF and is expressed by oncolytic vaccinia virus GLV-109. In U-87 glioma xenograft murine models the combination of fractionated ionizing radiation with GLV-1h164, a vaccinia virus also targeting VEGF, resulted in the best volumetric tumor response and a drastic decrease in vascular endothelial growth factor. Histological analysis of embedded tumor sections 14 days after viral administration confirmed that blocking VEGF translated into a decrease in vessel number to 30% of vessel number found in control tumors in animals treated with GLV-164 and fractionated IR which was lower than for all other treatment groups. Our experiments with GLV-1h164 and fractionated radiotherapy have shown that in addition to ionizing radiation and viral induced tumor cell destruction we were able to effectively target the tumor vasculature. This was achieved by enhanced viral replication translating in increased levels of GLAF-2 disrupting tumor vessels as well as the radiosensitization of tumor vasculature to IR by blocking VEGF. Our preclinical results have important clinical implications of how focal radiotherapy can be combined with systemic oncolytic viral administration for highly aggressive, locally advanced tumors with the potential, by using a vaccinia virus targeting human vascular endothelial growth factor, to further increase tumor radiation sensitivity by engaging the vascular component in addition to cancer cells.
N2  - Glioblastoma multiforme (GBM) verkörpert die aggressivste Form von bösartigen Gehirntumoren und seine Therapie gestaltet sich schwierig. Weitläufige Forschung hat dazu geführt, dass onkolytische Viren zur Verbesserung der Tumorbehandlung untersucht wurden. Gegenwärtig wird eine Vielzahl an verschiedenen onkolytischen Viren untersucht und einige wenige befinden sich bereits in klinischen Studien. Eines der Viren die untersucht werden, ist das Vaccinia-Virus. GLV-1h68, ein onkolytisches Vaccinia- Virus, wurde durch die Einfügung von drei Genkasseten, RUC-GFP Fusion, β- Galaktosidase und β- Glucuronidase in das Genom des LIVP Stammes hergestellt. Da fokale Bestrahlungstherapie aus der Behandlung von Krebs, nicht nur im Falle von Glioblastomen, nicht wegzudenken ist, ist es klinisch relevant, zu untersuchen, wie ein systemisch verabreichtes Vaccinia-Virus mit gezielter ionisierender Strahlung (IR) kombiniert werden könnte, um Therapiechancen zu verbesseren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, wie gezielte IR mit verschiedenen sytemisch injizierten Vaccinia-Virus Stämmen in einem Mausmodell für humane U-87-Glioma kombiniert wurde. Nachdem einleitende Versuche bestätigten, dass IR die virale Erbinformation nicht beschädigt und auch nicht den viralen Tropismus verändert, wurden Tierstudien durchgeführt, die die Interaktion des Vaccinia-Virus mit Bestrahlungtherapie in vivo untersuchten. Wir konnten zeigen, dass eine vorherige Bestrahlung des Tumors, bevor das GLV-1h68-Virus systemisch injiziert wurde, eine erhöhte viraler Replikation im Tumor zur Folge hatte, wie wir durch gesteigerte virale Titer und Markergenexpression belegen konnten. Von wesentlicher Bedeutung ist, dass eine Verabreichung von ausschliesslich GLV-1h68 einen minimalen Einfluss auf das U-87 Tumorwachstum hatte, während die durch die Bestrahlung ausgelöste erhöhte Vermehrung von Virus im Tumor eine Verzögerung des Tumorwachstums sowie ein verlängertes Überleben von Mäusen mit U-87-Xenografts zur Folge hatte. Die Fähigkeit von IR virale Vermehrung zu erhöhen, wurde auch für das weniger attenuierte LIVP 1.1.1-Virus gezeigt. Wenn die Bestrahlung in einem klinisch relevanten fraktionierten Bestrahlungsschema verabreicht wurde, war virale Replikation ebenfalls erhöht. Dies verdeutlicht, dass das Vaccinia-Virus klinisch entweder in eine Bestrahlung mit einer einzelnen Dosis oder in eine konventionelle fraktionierte Bestrahlung integriert werden kann. Die Fähigkeit von fokaler IR, eine selektive Vermehrung von systemisch injizierten onkolytischen Vaccinia-Viren zu ermöglichen, wurde in einem bilateralen Gliomamausmodell bestätigt. In Mausen mit Tumoren an beiden Hinterbeinen, vermehrte sich das systemisch gespritzte Vaccinia-Virus bevorzugt im bestrahlten Tumor. Wir konnten zeigen, wie die Tumorkontrolle darüber hinaus weiter verbessert werden kann, wenn fraktionierte fokale Bestrahlung mit einem Vaccinia-Virus kombiniert wird, das eine anti-angiogenetische Ladung, die den vaskulaeren endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) inhibiert, exprimiert. Unsere Studien konnten zeigen, dass durch die Bestrahlung von U-87 Gliomazellen eine Hochregulation von VEGF-Expression ausgelöst wurde, die Radioresistenz von Endothelzellen konzentrationsabhängig induzierte. Wir konnten zeigen, dass die durch VEGF verursache Radioresistenz umkehrbar ist, wenn zusätzlich aufgereinigtes GLAF-1, einen Vaccinia Virus exprimierten Antikörper, zu den Zellen gegeben wurde. In einem Mausmodell zeigte die Kombination aus fraktionierter Bestrahlung und GLV-1h164, ein Vaccinia-Virus, das ebenfalls einen VEGF Antikörper mit Ähnlichkeit zu GLAF-1 exprimiert, resultierte in der stärksten volumetrischen Tumorantwort. Es wurde ebenfalls eine drastische Abnahme an VEGF im Tumor bereits 3 Tagen nach Virus- Injektion nachgewiesen. Histologische Analyse bestätigte, dass die Blockade von VEGF eine Erniedrigung der Anzahl von Tumorblutgefäßen, zu 30% von Kontrolltumoren, zur Folge hatte. Dieser Wert war niedriger als in allen anderen Behandlungsgruppen. Unsere Versuche mit fraktionierter Bestrahlung und GLV-1h164 konnten zeigen, dass zusätzlich zu der durch Virus und Bestrahlung ausgelösten Tumorzellzerstörung, eine effiziente Degeneration der Tumorblutgefäße möglich war. Dies wurde durch eine erhöhte Virus-Vermehrung als Folge der Bestrahlung, sowie durch Sensitiveren der tumoralen Endothelzellen durch Blockierung von VEGF-A erreicht. Die Ergebnisse, die in dieser Arbeit zeigen, wie fokale Bestrahlungstherapie mit systemisch verabreichten onkolytische Vaccinia-Viren für aggressive, fortgeschrittene Tumore kombiniert werden kann. Es ist denkbar, dass die Tumortherapie weiter verbessert werden kann, wenn ein Vaccinia-Virus benutzt wird, das sich zusätzlich gegen VEGF richtet, so werden zu den Krebszellen zusätzlich Tumorblutgefäße in die Therapie miteinbezogen, um die Sensitivität von Endothelzellen gegen Bestrahlung weiter zu erhöhen.
KW  - Gliom
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Strahlentherapie
KW  - Kombinationstherapie
KW  - onkolytische Virotherapie
KW  - Glioma
KW  - vaccinia virus
KW  - ionizing radiation
KW  - combination therapy
KW  - oncolytic virotherapy
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85309
ER  - 
TY  - THES
A1  - Chaianunporn, Thotsapol
T1  - Evolution of dispersal and specialization in systems of interacting species
T1  - Evolution von Ausbreitung und Spezialisierung von interagierenden Arten
N2  - A metacommunity approach will be a useful framework to assess and predict changes in biodiversity in spatially structured landscapes and changing environments. However, the relationship between two core elements of metacommunity dynamics, dispersal and species interaction are not well understood. Most theoretical studies on dispersal evolution assume that target species are in isolation and do not interact with other species although the species interactions and community structure should have strong interdependence with dispersal. On the one hand, a species interaction can change the cost and benefit structure of dispersing in relation to non-dispersing individuals. On the other hand, with dispersal, an individual can follow respectively avoid species partners. Moreover, it is also important to explore the interdependence between dispersal and species interaction with spatial and temporal heterogeneity of environment because it would allow us to gain more understanding about responses of community to disturbances such as habitat destruction or global climate change, and this aspect is up to now not well-studied. In this thesis, I focus on the interactive and evolutionary feedback effects between dispersal and various types of interspecific interactions in different environmental settings. More specifically, I contrast dispersal evolution in scenarios with different types of interactions (chapter 2), explore the concurrent evolution of dispersal and habitat niche width (specialization) in spatial heterogeneous landscape (chapter 3) and consider (potential) multidimensional evolutionary responses under climate change (chapter 4). Moreover, I investigate consequences of different dispersal probability and group tolerance on group formation respectively group composition and the coexistence of ‘marker types’ (chapter 5). For all studies, I utilize individual-based models of single or multiple species within spatially explicit (grid-based) landscapes. In chapter 5, I also use an analytical model in addition to an individual-based model to predict phenomenon in group recognition and group formation. ...
N2  - Ein „Multi-Arten“ Ansatz („metacommunity approach“; im Weiteren als Meta-Gemeinschaften bezeichnet) ist eine immer noch neue und wichtige Methode zur Einschätzung und Vorhersage von Änderungen der Biodiversität in räumlich strukturierten Habitaten. Dabei werden denkbare Reaktionen von Arten nicht isoliert betrachtet, sondern auch im Kontext von Interaktionen mit anderen Arten. Bisher wurde dabei die Beziehung zwischen zwei essentiellen Mechanismen, die in Meta-Gemeinschaften eine große Rolle spielen – Ausbreitung („dispersal“) und interspezifische Interaktion – wenig untersucht. Die meisten theoretischen Untersuchungen zur Ausbreitung erfolgen mit der Annahme, dass Arten in keinen Interaktionen mit anderen Arten stehen – in natürlichen Systemen interagieren die meisten Arten jedoch mit anderen. Interspezifische Interaktionen können außerdem die Kosten-Nutzen-Bilanz von Ausbreitenden im Vergleich zu Nicht-Ausbreitenden ändern. Andererseits kann ein Individuum durch Ausbreitung Interaktionspartnern folgen beziehungsweise sie vermeiden. Es ist deshalb zu erwarten, dass die interspezifischen Interaktionen und Ausbreitung stark interagieren. Weiter ist es wichtig, die gegenseitige Abhängigkeit der interspezifischen Interaktionen und Ausbreitung unter unterschiedlicher räumlicher und zeitlicher Heterogenität der Umwelt zu untersuchen, damit wir die Antwort einer Lebensgemeinschaft auf Umweltstörung, z.B. Habitatzerstörung und Klimawandel, besser verstehen können. ...
KW  - Tiergesellschaft
KW  - Ausbreitung
KW  - Spezialisierung
KW  - Evolution
KW  - interaktive Arten
KW  - dispersal
KW  - specialization
KW  - interacting species
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76779
ER  - 
TY  - THES
A1  - Chen, Yi-chun
T1  - Experimental access to the content of an olfactory memory trace in larval Drosophila
T1  - Eine experimentelle Strategie zur Beschreibung des Inhaltesdes Duftgedächtnisses von Larven der Drosophila
N2  - Animals need to evaluate their experiences in order to cope with new situations they encounter. This requires the ability of learning and memory. Drosophila melanogaster lends itself as an animal model for such research because elaborate genetic techniques are available. Drosphila larva even saves cellular redundancy in parts of its nervous system. My Thesis has two parts dealing with associative olfactory learning in larval Drosophila. Firstly, I tackle the question of odour processing in respect to odour quality and intensity. Secondly, by focusing on the evolutionarily conserved presynaptic protein Synapsin, olfactory learning on the cellular and molecular level is investigated. Part I.1. provides a behaviour-based estimate of odour similarity in larval Drosophila by using four recognition-type experiments to result in a combined, task-independent estimate of perceived difference between odour-pairs. A further comparison of these combined perceived differences to published calculations of physico-chemical difference reveals a weak correlation between perceptual and physico-chemical similarity. Part I.2. focuses on how odour intensity is interpreted in the process of olfactory learning in larval Drosophila. First, the dose-effect curves of learnability across odour intensities are described in order to choose odour intensities such that larvae are trained at intermediate odour intensity, but tested for retention either with that trained intermediate odour intensity, or with respectively HIGHer or LOWer intensities. A specificity of retention for the trained intensity is observed for all the odours used. Such intensity specificity of learning adds to appreciate the richness in 'content' of olfactory memory traces, and to define the demands on computational models of associative olfactory memory trace formation. In part II.1. of the thesis, the cellular site and molecular mode of Synapsin function is investigated- an evolutionarily conserved, presynaptic vesicular phosphoprotein. On the cellular level, the study shows a Synapsin-dependent memory trace in the mushroom bodies, a third-order “cortical” brain region of the insects; on the molecular level, Synapsin engages as a downstream element of the AC-cAMP-PKA signalling cascade.
N2  - Tiere müssen ihre eigenen Erfahrungen heranziehen, damit sie neue Situationen meistern können. Dies setzt die Fähigkeit zum Lernen und ein Gedächtnis voraus. Drosophila melanogaster eignet sich dank der Vielzahl verfügbarer genetischer Methoden als ein Modellorganismus für solche Forschung. Die Drosophila Larve kommt zudem in Teilen ihres Nervensystems ohne zelluläre Redundanz aus. Meine Doktorarbeit gliedert sich in zwei Teile, die das assoziative olfaktorische Lernen der Drosophila Larven zum zentralen Gegenstand haben. Erstens bearbeite ich den Prozess der Geruchswahrnehmung hinsichtlich der Duftqualität und Duftintensität. Im zweiten Teil meiner Arbeit erforschen wir das olfaktorische Lernen auf zellulärer und molekularer Ebene und konzentrieren uns dabei auf das hochkonservierte präsynaptische Protein Synapsin. Teil I.1. handelt von der Ähnlichkeit zwischen Duftpaaren in der Wahrnehmung von Drosophila Larven anhand vier verschiedener Typen von Lernexperiment. Mit diesen Experimenten ließ sich eine Abschätzung der vom Tier wahrgenommenen Ähnlichkeiten zwischen Paaren von Duftstoffen erreichen. Ein Vergleich dieser wahrgenommenen Ähnlichkeiten mit veröffentlichten physikalisch-chemischen Ähnlichkeiten ergibt eine schwache Korrelation. Teil I.2. befasst sich damit, wie die Intensität eines Duftes in die olfaktorische Wahrnehmung und das Gedächtnis der Drosophila Larven integriert sein könnte. Zunächst wird die Lernbarkeit verschiedener Duftstoffe abhängig von ihren Intensitäten beschrieben; anhand dieser Dosis-Wirkungskurven werden dann Duftintensitäten so ausgewählt, dass die Larven mit der mittleren Duftintensität trainiert werden, aber mit einer höheren, oder mit einer niedrigeren Duftintensität getestet werden. Es zeigt sich eine Spezifität des Gedächtnisabrufs für die trainierte Intensität, und zwar für alle verwendeten Duftstoffe. Eine solche Spezifität für Intensität bereichert das Bild des ‚Inhalts’ von olfaktorischen Gedächtnisspuren und damit die Anforderungen an Computermodelle über Riechen und Geruchslernen. Im Teil II.1. habe ich in Zusammenarbeit mit Birgit Michels auf zelluläre Ebene die Funktion von Synapsin beim assoziativen Lernen von Drosophila Larven untersucht- ein evolutionär konserviertes, präsynaptisches, vesikel-assoziiertes Phosphoprotein. Auf zellulärer Ebene zeigt die Studie eine Synapsin-abhängige Gedächtnisspur im Pilzkörper, einer dem olfaktorischen Cortex der Vertebraten womöglich homologen Struktur. Auf molekularer Ebene wurde nachgewiesen, dass Synapsin als ein Zielprotein in der AC-cAMP-PKA Kaskade am Lernvorgang beteiligt ist.
KW  - Taufliege
KW  - Geruchssinn
KW  - Lernen
KW  - Sinnesphysiologie
KW  - Ähnlichkeit
KW  - Wahrnehmung
KW  - Geschmack
KW  - Duftintensität
KW  - Drosophila
KW  - Olfaction
KW  - Learning
KW  - Sensory
KW  - Physiology
KW  - Similarity
KW  - Perception
KW  - Taste
KW  - Odour Intensity
KW  - Drosophila
KW  - Geruchssinn
KW  - Lernen
KW  - Sinnesphysiologie
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83705
ER  -