TY - THES A1 - Wolter, Steve T1 - Single-molecule localization algorithms in super-resolution microscopy T1 - Einzelmoleküllokalisierungsalgorithmen in der superauflösenden Mikroskopie N2 - Lokalisationsmikroskopie ist eine Methodenklasse der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie, deren Methoden sich durch stochastische zeitliche Isolation der Fluoreszenzemission auszeichnen. Das Blinkverhalten von Fluorophoren wird so verändert, dass gleichzeitige Aktivierung von einander nahen Fluorophoren unwahrscheinlich ist. Bekannte okalisationsmikroskopische Methoden umfassen dSTORM, STORM, PALM, FPALM, oder GSDIM. Lokalisationsmikroskopie ist von hohem biologischem Interesse, weil sie die Auflösung des Fluoreszenzmikroskops bei minimalem technischem Aufwand um eine Größenordnung verbessert. Der verbundene Rechenaufwand ist allerdings erheblich, da Millionen von Fluoreszenzemissionen einzeln mit Nanometergenauigkeit lokalisiert werden müssen. Der Rechen- und Implementationsaufwand dieser Auswertung hat die Verbreitung der superauflösenden Mikroskopie lange verzögert. Diese Arbeit beschreibt meine algorithmische Grundstruktur für die Auswertung lokalisationsmikroskopischer Daten. Die Echtzeitfähigkeit, d.h. eine Auswertegeschwindigkeit oberhalb der Datenaufnahmegeschwindigkeit an normalen Messaufbauten, meines neuartigen und quelloffenen Programms wird demonstriert. Die Geschwindigkeit wird auf verbrauchermarktgängigen Prozessoren erreicht und dadurch spezialisierte Rechenzentren oder der Einsatz von Grafikkarten vermieden. Die Berechnung wird mit dem allgemein anerkannten Gaussschen Punktantwortmodell und einem Rauschmodell auf Basis der größten Poissonschen Wahrscheinlichkeit durchgeführt. Die algorithmische Grundstruktur wird erweitert, um robuste und optimale Zweifarbenauswertung zu realisieren und damit korrelative Mikroskopie zwischen verschiedenen Proteinen und Strukturen zu ermöglichen. Durch den Einsatz von kubischen Basissplines wird die Auswertung von dreidimensionalen Proben vereinfacht und stabilisiert, um präzisem Abbilden von mikrometerdicken Proben näher zu kommen. Das Grenzverhalten von Lokalisationsalgorithmen bei hohen Emissionsdichten wird untersucht. Abschließend werden Algorithmen für die Anwendung der Lokalisationsmikroskopie auf verbreitete Probleme der Biologie aufgezeigt. Zelluläre Bewegung und Motilität werden anhand der in vitro Bewegung von Myosin-Aktin-Filamenten studiert. Lebendzellbildgebung mit hellen und stabilen organischen Fluorophoren wird mittels SNAP-tag-Fusionsproteinen realisiert. Die Analyse des Aufbaus von Proteinklumpen zeigt, wie Lokalisationsmikroskopie neue quantitative Ansätze jenseits reiner Bildgebung bietet. N2 - Localization microscopy is a class of super-resolution fluorescence microscopy techniques. Localization microscopy methods are characterized by stochastic temporal isolation of fluorophore emission, i.e., making the fluorophores blink so rapidly that no two are likely to be photoactive at the same time close to each other. Well-known localization microscopy methods include dSTORM}, STORM, PALM, FPALM, or GSDIM. The biological community has taken great interest in localization microscopy, since it can enhance the resolution of common fluorescence microscopy by an order of magnitude at little experimental cost. However, localization microscopy has considerable computational cost since millions of individual stochastic emissions must be located with nanometer precision. The computational cost of this evaluation, and the organizational cost of implementing the complex algorithms, has impeded adoption of super-resolution microscopy for a long time. In this work, I describe my algorithmic framework for evaluating localization microscopy data. I demonstrate how my novel open-source software achieves real-time data evaluation, i.e., can evaluate data faster than the common experimental setups can capture them. I show how this speed is attained on standard consumer-grade CPUs, removing the need for computing on expensive clusters or deploying graphics processing units. The evaluation is performed with the widely accepted Gaussian PSF model and a Poissonian maximum-likelihood noise model. I extend the computational model to show how robust, optimal two-color evaluation is realized, allowing correlative microscopy between multiple proteins or structures. By employing cubic B-splines, I show how the evaluation of three-dimensional samples can be made simple and robust, taking an important step towards precise imaging of micrometer-thick samples. I uncover the behavior and limits of localization algorithms in the face of increasing emission densities. Finally, I show up algorithms to extend localization microscopy to common biological problems. I investigate cellular movement and motility by considering the in vitro movement of myosin-actin filaments. I show how SNAP-tag fusion proteins enable imaging with bright and stable organic fluorophores in live cells. By analyzing the internal structure of protein clusters, I show how localization microscopy can provide new quantitative approaches beyond pure imaging. KW - super-resolution microscopy KW - fluorescence KW - scientific computing KW - dSTORM KW - localization microscopy KW - PALM KW - 3D microscopy KW - two-color microscopy KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Bildauflösung KW - Bioinformatik Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109370 ER - TY - THES A1 - Schulze, Katja T1 - Automatisierte Klassifizierung und Viabilitätsanalyse von Phytoplankton T1 - Automated classification and viability analysis for phytoplankton N2 - Zentrales Ziel dieser Arbeit war es, Methoden der Mikroskopie, Bildverarbeitung und Bilderkennung für die Charakterisierungen verschiedener Phyotplankter zu nutzen, um deren Analyse zu verbessern und zu vereinfachen. Der erste Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Analyse von Phytoplanktongemeinschaften, die im Rahmen der Überprüfung der Süßwasserqualität als Marker dienen. Die konventionelle Analyse ist dabei sehr aufwendig, da diese noch immer vollständig von Hand durchgeführt wird und hierfür speziell ausgebildetes Personal eingesetzt werden muss. Ziel war es, ein System zur automatischen Erkennung aufzubauen, um die Analyse vereinfachen zu können. Mit Hilfe von automatischer Mikroskopie war es möglich Plankter unterschiedlicher Ausdehnung durch die Integration mehrerer Schärfeebenen besser in einem Bild aufzunehmen. Weiterhin wurden verschiedene Fluoreszenzeigenschaften in die Analyse integriert. Mit einem für ImageJ erstellten Plugin können Organismen vom Hintergrund der Aufnahmen abgetrennt und eine Vielzahl von Merkmalen berechnet werden. Über das Training von neuralen Netzen wird die Unterscheidung von verschieden Gruppen von Planktontaxa möglich. Zudem können weitere Taxa einfach in die Analyse integriert und die Erkennung erweitert werden. Die erste Analyse von Mischproben, bestehend aus 10 verschiedenen Taxa, zeigte dabei eine durchschnittliche Erkennungsrate von 94.7% und eine durchschnittliche Falsch-Positiv Rate von 5.5%. Im Vergleich mit bestehenden Systemen konnte die Erkennungsrate verbessert und die Falsch Positiv Rate deutlich gesenkt werde. Bei einer Erweiterung des Datensatzes auf 22 Taxa wurde darauf geachtet, Arten zu verwenden, die verschiedene Stadien in ihrem Wachstum durchlaufen oder höhere Ähnlichkeiten zu den bereits vorhandenen Arten aufweisen, um evtl. Schwachstellen des Systemes erkennen zu können. Hier ergab sich eine gute Erkennungsrate (86.8%), bei der der Ausschluss von nicht-planktonischen Partikeln (11.9%) weiterhin verbessert war. Der Vergleich mit weiteren Klassifikationsverfahren zeigte, dass neuronale Netze anderen Verfahren bei dieser Problemstellung überlegen sind. Ähnlich gute Klassifikationsraten konnten durch Support Vektor Maschinen erzielt werden. Allerdings waren diese bei der Unterscheidung von unbekannten Partikeln dem neuralen Netz deutlich unterlegen. Der zweite Abschnitt stellt die Entwicklung einer einfachen Methode zur Viabilitätsanalyse von Cyanobakterien, bei der keine weitere Behandlung der Proben notwendig ist, dar. Dabei wird die rote Chlorophyll - Autofluoreszenz als Marker für lebende Zellen und eine grüne unspezifische Fluoreszenz als Marker für tote Zellen genutzt. Der Assay wurde mit dem Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803 etabliert und validiert. Die Auswahl eines geeigeneten Filtersets ermöglicht es beide Signale gleichzeitig anzuregen und zu beobachten und somit direkt zwischen lebendenden und toten Zellen zu unterscheiden. Die Ergebnisse zur Etablierung des Assays konnten durch Ausplattieren, Chlorophyllbestimmung und Bestimmung des Absorbtionsspektrums bestätigt werden. Durch den Einsatz von automatisierter Mikroskopie und einem neu erstellten ImageJ Plugin wurde eine sehr genaue und schnelle Analyse der Proben möglich. Der Einsatz beim Monitoring einer mutagenisierten Kultur zur Erhöhung der Temperaturtoleranz ermöglichte genaue und zeitnahe Einblicke in den Zustand der Kultur. Weitere Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Kombination mit Absorptionsspektren es ermöglichen können bessere Einblicke in die Vitalität der Kultur zu erhalten. N2 - Central goal of this work was to improve and simplify the characterization of different phytoplankter by the use of automated microscopy, image processing and image analysis. The first part of the work dealt with the analysis of pytoplankton communities, which are used as a marker for the determination of fresh water quality. The current routine analysis, is very time consuming and expensive, as it is carried out manually by trained personnel. Thus the goal of this work was to develop a system for automating the analysis. With the use of automated microscopy different focal planes could be integrated into one image, which made it possible to image plankter of different focus levels simultaneously. Additionally it allowed the integration of different fluorescence characteristics into the analysis. An image processing routine, developed in ImageJ, allows the segmentation of organisms from the image background and the calculation of a large range of features. Neural networks are then used for the classification of previously defined groups of plankton taxa. The program allows easy integration of additional taxa and expansion of the recognition targets. The analysis of samples containing 10 different taxa showed an average recognition rate of 94.7% and an average error rate of 5.5%. The obtained recognition rate was better than those of existing systems and the exclusion of non-plankton particles could be greatly improved. After extending the data set to 22 different classes of (more demanding) taxa a still good recognition (86.9 %) and still improved error rate (11.9 %) were obtained. This extended set was specifically selected in order to target potential weaknesses of the system. It contained mainly taxa that showed strong similarities to each other or taxa that go through various different morphological stages during their growth. The obtained recognition rates were comparable or better than those of existing systems and the exclusion of non-plankton particles could be greatly improved. A comparison of different classification methods showed, that neural networks are superior to all other investigated methods when used for this specific task. While similar recognition rates could be achieved with the use of support vector machines they were vastly inferior for the differentiation of unknown particles. The second part focused on the development of a simple live - dead assay for unicellular cyanobacteria without the need of sample preparation. The assay uses red chlorophyll fluorescence, corresponding to viable cells, and an unspecific green autofluorescence, that can only be observed in non viable cells. The assay was established and validated for the model organism Synechocystis sp. PCC 6803. With the selection of a suitable filter-set both signals could be excited and observed simultaneously, allowing a direct classification of viable and non-viable cells. The results were confirmed by plating/colony count, absorption spectra and chlorophyll measurements. The use of an automated fluorescence microscope and an ImageJ based image analysis plugin allows a very precise and fast analysis. The monitoring of a random mutagenized culture undergoing selection for improved temperature tolerance allowed an accurate and prompt insight into the condition of the culture. Further results indicate that a combination of the new assay with absorption spectra or chlorophyll concentration measurements allows the estimation of the vitality of cells. KW - Bilderkennnung KW - Bioinformatik KW - Phytoplankton KW - Bilderkennung KW - Phytoplankton KW - Viabilität KW - Mikroskopie KW - Bioinformatik Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107174 ER - TY - THES A1 - Zeeshan [geb. Majeed], Saman T1 - Implementation of Bioinformatics Methods for miRNA and Metabolic Modelling T1 - Die Umsetzung der Bioinformatik-Methoden für miRNA-und der Metabolischen Modellierung N2 - Dynamic interactions and their changes are at the forefront of current research in bioinformatics and systems biology. This thesis focusses on two particular dynamic aspects of cellular adaptation: miRNA and metabolites. miRNAs have an established role in hematopoiesis and megakaryocytopoiesis, and platelet miRNAs have potential as tools for understanding basic mechanisms of platelet function. The thesis highlights the possible role of miRNAs in regulating protein translation in platelet lifespan with relevance to platelet apoptosis and identifying involved pathways and potential key regulatory molecules. Furthermore, corresponding miRNA/target mRNAs in murine platelets are identified. Moreover, key miRNAs involved in aortic aneurysm are predicted by similar techniques. The clinical relevance of miRNAs as biomarkers, targets, resulting later translational therapeutics, and tissue specific restrictors of genes expression in cardiovascular diseases is also discussed. In a second part of thesis we highlight the importance of scientific software solution development in metabolic modelling and how it can be helpful in bioinformatics tool development along with software feature analysis such as performed on metabolic flux analysis applications. We proposed the “Butterfly” approach to implement efficiently scientific software programming. Using this approach, software applications were developed for quantitative Metabolic Flux Analysis and efficient Mass Isotopomer Distribution Analysis (MIDA) in metabolic modelling as well as for data management. “LS-MIDA” allows easy and efficient MIDA analysis and, with a more powerful algorithm and database, the software “Isotopo” allows efficient analysis of metabolic flows, for instance in pathogenic bacteria (Salmonella, Listeria). All three approaches have been published (see Appendices). N2 - Dynamische Wechselwirkungen und deren Veränderungen sind wichtige Themen der aktuellen Forschung in Bioinformatik und Systembiologie. Diese Promotionsarbeit konzentriert sich auf zwei besonders dynamische Aspekte der zellulären Anpassung: miRNA und Metabolite. miRNAs spielen eine wichtige Rolle in der Hämatopoese und Megakaryozytopoese, und die Thrombozyten miRNAs helfen uns, grundlegende Mechanismen der Thrombozytenfunktion besser zu verstehen. Die Arbeit analysiert die potentielle Rolle von miRNAs bei der Proteintranslation, der Thrombozytenlebensdauer sowie der Apoptose von Thrombozyten und ermöglichte die Identifizierung von beteiligten Signalwegen und möglicher regulatorischer Schlüsselmoleküle. Darüber hinaus wurden entsprechende miRNA / Ziel-mRNAs in murinen Thrombozyten systematisch gesammelt. Zudem wurden wichtige miRNAs, die am Aortenaneurysma beteiligt sein könnten, durch ähnliche Techniken vorhergesagt. Die klinische Relevanz von miRNAs als Biomarker, und resultierende potentielle Therapeutika, etwa über eine gewebsspezifische Beeinflussung der Genexpression bei Herz-Kreislauf Erkrankungen wird ebenfalls diskutiert. In einem zweiten Teil der Dissertation wird die Bedeutung der Entwicklung wissenschaftlicher Softwarelösungen für die Stoffwechselmodellierung aufgezeigt, mit einer Software-Feature-Analyse wurden verschiedene Softwarelösungen in der Bioinformatik verglichen. Wir vorgeschlagen dann den "Butterfly"-Ansatz, um effiziente wissenschaftliche Software-Programmierung zu implementieren. Mit diesem Ansatz wurden für die quantitative Stoffflussanalyse mit Isotopomeren effiziente Software-Anwendungen und ihre Datenverwaltung entwickelt: LS-MIDA ermöglicht eine einfache und effiziente Analyse, die Software "Isotopo" ermöglicht mit einem leistungsfähigeren Algorithmus und einer Datenbank, eine noch effizientere Analyse von Stoffwechselflüssen, zum Beispiel in pathogenen Bakterien (Salmonellen, Listerien). Alle drei Ansätze wurden bereits veröffentlicht (siehe Appendix). KW - miRNS KW - Bioinformatics KW - miRNA KW - Metabolic Modelling KW - Spectral Data Analysis KW - Butterfly KW - Thrombozyt KW - Bioinformatik KW - Stoffwechsel KW - Modellierung KW - Metabolischen Modellierung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102900 ER -