TY - THES A1 - Müller, Stefanie T1 - Funktionale und molekulare Charakterisierung des ArsRS Zweikomponenten-Systems sowie der Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 von Helicobacter pylori T1 - Functional and molecular characterization of the ArsRS two-component-system and of the response-regulators HP1021 and HP1043 of Helicobacter pylori N2 - Bakterien sind in der Lage, sich schnell an wechselnde Umweltbedingungen anzupassen. Eine wichtige Rolle bei der Wahrnehmung von verschiedensten Umweltreizen und der zellulären Antwort spielt die Genregulation durch Zweikomponenten-Systeme. Gut charakterisiert ist das ArsRS Zweikomomponenten-System in H. pylori, welches an der Ausbildung der Säureresistenz beteiligt ist und dem Bakterium so die Kolonisierung der Magenschleimhaut ermöglicht. Die Histidin-Kinase ArsS wird in Gegenwart von Säure aktiviert und phosphoryliert den Response-Regulator ArsR, der die Transkription von Target-Genen reguliert. In der periplasmatischen Sensordomäne der Histidin-Kinase ArsS sind sieben Histidinreste vorhanden, die aufgrund ihres pKa-Wertes von 6,0 bei Absenken des pH Wertes von pH 7 auf pH 5, was eine Aktivierung der Histidin-Kinase zur Folge hat, protoniert werden könnten. Es konnte gezeigt werden, dass der Histidinrest H94 der periplasmatischen Sensordomäne einen wesentliche Rolle bei der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase ArsS spielt. Die Einführung einer positiv geladenen AS an dieser Position allein reicht jedoch nicht aus, um die Kinase zu aktivieren, weshalb unklar bleibt, ob eine Protonierung des Histidinrestes H94 in vivo die Säurewahrnehmung vermittelt. Weiterhin konnten Indizien darauf erhalten werden, dass neben dem Histidinrest H94 noch weitere Aminosäuren an der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase beteiligt sind. Der Aspartatrest D124 leistet unter den negativ geladenen AS vermutlich den größten Beitrag zur Säurewahrnehmung. In den mit H. pylori nahe verwandten Arten Helicobacter hepaticus, Wolinella succinogenes und Campylobacter jejuni sind Orthologe zu dem ArsRS Zweikomponenten-System vorhanden. Um zu untersuchen, ob es sich bei der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase ArsS um eine spezifische Anpassung von H. pylori an sein Habitat handelt oder ob Säure einen allgemeinen Stimulus der ArsS-orthologen Kinasen darstellt, wurden Mutanten im genetischen Hintergrund von H. pylori G27 konstruiert, in welchen die Histidin-Kinase ArsS durch die orthologen Kinasen HH1608, CJ1262 und WS1818 substituiert wurde. Durch Transkriptionsstudien konnte gezeigt werden, dass die Kinase WS1818 eine gesteigerte Aktivität bei saurem pH-Wert aufweist. Auch die Kinase HH1607 kann Säure als einen Umweltreiz wahrnehmen, jedoch deutlich weniger effektiv als die Kinasen ArsS und WS1818. Ob die Zweikomponenten-Systeme HH1608/HH1607 und WS1817/WS1818 in vivo in H. hepaticus und W. succinogenes an der Wahrnehmung von Säure und evtl. an der Ausbildung einer Säureresistenz beteiligt sind, ist unklar, da über die Funktion dieser Zweikomponenten-Systeme bisher nichts bekannt ist. Die Kinase CJ1262 ist nicht in der Lage, Säure als einen Umweltreiz wahrzunehmen. Die beiden Response-Regulatoren HP1043 und HP1021 spielen vermutlich eine Rolle bei der Regulation von Genen, deren Produkte eine wichtige Funktion für das vegetative Zellwachstum haben. Die Aktivität der beiden RR wird entgegen dem gängigen Zweikomponenten-System-Paradigma nicht über eine Phosphorylierung moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurde analysiert, ob eine strikte Expressionskontrolle für die wachstumsassoziierten Funktion dieser Response-Regulatoren von Bedeutung ist. Zu diesem Zweck wurden verschieden Mutanten konstruiert, in welchen die Transkription der Gene hp1021 und hp1043 unter der Kontrolle von unterschiedlich regulierten Promotoren stattfindet. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des Gens hp1043 sowohl transkriptionell als auch posttranskriptionell und/oder posttranslational strikt reguliert wird. Es kann deshalb postuliert werden, dass die Aktivität des RR HP1043 über die vorhandene Konzentration an Regulator in der Bakterienzelle beeinflusst wird. Die Expression des Gens hp1021 wird nicht strikt reguliert. Auf welche Weise die Aktivität des RR HP1021 moduliert wird, bleibt unklar. N2 - Bacteria are able to adapt rapidly to alternating environmental conditions. Two component systems play a predominant role in sensing environmental stimuli and triggering a proper cellular response. The genome of Helicobacter pylori harbours only a few genes encoding for two component system proteins. The ArsRS two component system of H. pylori which controls the acid response and therefore is required for colonization of the mucus is well characterized. The kinase ArsS is activated under acidic conditions and phosphorylates the response regulator ArsR resulting in activation or repression of transcription of ArsRS-dependent target genes. The acid response of H. pylori is triggered when the pH drops from 7 to 5. Therefore, due to their side chain pKa-value of 6 seven histidine residues in the periplasmic sensor domain of the kinase ArsS were hypothesized to be involved in acid sensing. It was shown that the histidine residiue H94 is involved in the acid sensing by the histidine kinase ArsS. Substitution of H94 by the positively charged amino acid arginine did not result in a constitutively active ArsS protein. Therefore it remains unclear whether H94 contributes to the acid-sensing via protonation. Furthermore it was speculated that apart from histidine H94 other other amino acids contribute to the acid sensing of ArsS. Amongst them the aspartic acid residue D126 seems to play a predominant role. The closely related epsilon-proteobacteria Helicobacter hepaticus, Wolinella succinogenes and Campylobacter jejuni express ArsRS orthologs. Mutants of H. pylori G27 expressing the orthologous hisitine kinases WS1818, HH1607, and CJ1262 instead of the ArsS protein where constructed to investigate whether acidic pH is a common stimulus sensed by ArsS orthologs. Transcriptional analysis of the mutants revealed that the kinase WS1818 is activated under acidic conditions. The histidine kinase HH1607 also responds to acid as an environmental signal though less efficient than ArsS and WS1818. Since nothing is known about the function of the kinases HH1607 and WS1818 it remains unclear whether these proteins contribute to acid sensing and mounte an acid response in vivo in W. succinogenes and H. hepaticus. The kinase CJ1262 is not activated under acidic conditions. The response regulators HP1021 and HP1043 presumably play a role in the regulation of genes whose protein products have a fundamental function in vegetative cell growth. In contrast to the well established two component system paradigm their activity is not modulated via phosphorylation. In this work it was analyzed whether a strict control of their expression is required for the growth associated function of the respective response regulators. For this purpose several mutants were constructed in which the transcription of the genes hp1021 and hp1043 was placed under the control of different promoters. It was demonstrated that the expression of the gene hp1043 is controlled both on the transcriptional and posttranscriptional and/or posttranslational level and that this expression control is important for response regulator function. In contrast, strict expression control is not a prerequisite for the function of response regulator HP1021. KW - Helicobacter pylori KW - Säure KW - Genregulation KW - Zweikomponenten-System KW - ArsRS KW - Response-Regulator KW - HP1021 KW - HP1043 KW - two-cpmponent-system KW - ArsRS KW - response-regulator KW - HP1021 KW - HP1043 Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36263 ER - TY - THES A1 - Schär, Jennifer T1 - Molekulare Charakterisierung der Response-Regulatoren ArsR (HP0166), HP1043 und HP1021 von Helicobacter pylori T1 - Molecular characterisation of the response regulators ArsR, HP1043, HP1021 of Helicobacter pylori N2 - Bakterien müssen ständig in der Lage sein auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren zu können. Zur Wahrnehmung dieser Veränderungen haben sich unterschiedliche Signaltransduktionssysteme entwickelt. Ein weit verbreiteter und gut charakterisierter Mechanismus zur Signaltransduktion sind die so genannten Zwei-Komponentensysteme. Im Genom von H. pylori konnten nur wenige Bestandteile von Zwei-Komponentensystemen identifiziert werden. Dazu zählen neben dem Chemotaxis-System lediglich drei Histidin-Kinasen, ArsS, CrdS und FlgS, und fünf Response-Regulatoren HP1021, HP1043, ArsR, CrdR und FlgR, die vermutlich Transkriptions-regulatorische Funktionen haben. Zwei der Response-Regulatoren, HP1043 und ArsR als essentiell für das Überleben von H. pylori, während HP1021 einen deutlichen Einfluss auf das Zellwachstum hat, da ein Wachstums-Defekt zu erkennen ist, wenn das entsprechende Gen hp1021 deletiert wird. Eine Deletion von arsS, dem Gen der zugehörigen Histidin-Kinase von ArsR, hat unter Standard-Wachstumsbedingungen keine Auswirkung auf das Zellwachstum von H. pylori. Diese Beobachtung spricht für die Hypothese, dass der Response-Regulator ArsR die Transkription zweier unterschiedlicher Sets von Zielgenen kontrolliert. Demzufolge reguliert der Response-Regulator ArsR nach Säure-induzierter Phosphorylierung durch ArsS die Transkription von Genen, die zur Säureresistenz beitragen, während ArsR im nicht-phosphorylierten Zustand die Transkription von weiteren Zielgenen kontrolliert, von denen mindestens eines für das Zellwachstum essentiell sein sollte. Das durch ArsR~P kontrollierte Regulon konnte bereits weitgehend charakterisiert werden allerdings sind die Zielgene des unphosphorylierten Regulators bislang unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte die zuvor beschriebene Hypothese bestätigt werden, da gezeigt wurde, dass ein Derivat von ArsR, mit einer Mutation der Phosphorylierungsstelle D52 zu N52, das wildtypische Protein bezüglich des Zellwachstums unter Standardbedingungen funktionell ersetzen kann. Für die Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 konnte bislang keine zugehörige Histidin-Kinase identifiziert werden und interessanterweise findet man in der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren atypische Abweichungen von der Konsensus-Sequenz. Um die Bedeutung dieser atypischen Primärsequenzen für die Funktion dieser Response-Regulatoren zu untersuchen wurden mutierte H. pylori-Stämme konstruiert, die ausschließlich Derivate von HP1021 bzw. HP1043 exprimieren, die in ihrer Receiver-Sequenz der Konsensus-Sequenz entsprachen. Da diese Mutanten sich bezüglich ihres Zellwachstums nicht vom Wildtyp unterscheiden, konnte nachgewiesen werden, dass die atypischen Receiver-Sequenzen der beiden Response-Regulatoren nicht entscheidend für die Funktionen der Response-Regulatoren sind. Weiterhin konnten Indizien dafür gesammelt werden, dass HP1021 und HP1043 hinsichtlich ihrer Aktivierung vermutlich vom üblichen Zwei-Komponentenparadigma abweichen. Derivate von HP1021 und HP1043 mit Mutationen ihrer putativen atypischen Phosphorylierungsstelle sind in der Lage ihre wildtypischen Pendants hinsichtlich der bekannten Phänotypen funktionell zu ersetzen. Somit ist eine Phosphorylierung der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren keine Voraussetzung für ein normales Zellwachstum von H. pylori. Diese Hypothese wird gestützt durch die Beobachtung, dass ein Ortholog von HP1043 aus C. jejuni CJ0355, das natürlicherweise an der potentiellen Phosphorylierungsstelle einen nicht phosphorylierbaren Aminosäurerest trägt, HP1043 in seiner Funktion ersetzen kann. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro keine Phosphorylierung durch radioaktiv markiertes Acetylphosphat stattfindet und dass ein H. pylori-Stamm mit einer Deletion der Gene pta und ackA, welche Proteine kodieren, die bei der Synthese von zellulärem Acetylphosphat benötigt werden, einen normalen Wachstums-Phänotyp zeigt. Zusätzlich konnten in einer massenspektrometrischen Analyse des Proteins HP1021, welches nach Zweidimensionaler Gelelektrophorese von Gesamtzellproteinlysaten aus H. pylori isoliert wurde, keine Hinweise auf eine Serinphosphorylierung entdeckt werden. Es ist daher fraglich ob in vivo eine funktionell relevante Phosphorylierung stattfindet. Die Mechanismen zur Modulation der Regulator-Aktivität von HP1043 und HP1021 bleiben unklar. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass eine strikte Transkriptionskontrolle nicht für die Zellwachstums-assoziierten Funktionen von HP1021 von Bedeutung ist. Dagegen wurden Hinweise darauf erzielt, dass die Expression von HP1043 auf einem posttranskriptionellen und/oder auf einem posttranslationellen Level reguliert wird. Es waren bislang keine Zielgene von HP1021 bekannt. Durch vergleichende Zweidimensionale Gelelektrophorese der H. pylori Stämme 26695 und 26695 1021Δ konnten einige potentielle Zielgene des Response-Regulators HP1021 identifiziert werden. N2 - Bacteria need to react instantaneously on changes in their environment. For the sensing of environmental changes many different signaltransduction-systems have been evolved and the most widespread and well-characterised mechanism for signal transduction among the bacteria are the so called two-component systems. The genome of Helicobacter pylori encodes only a few proteins which are part of a two-component system. In addition to the chemotaxis-system there are just three histidine kinases, ArsS (HP0165), CrdS (HP1364) and HP0244, and five response regulators HP1021, HP1043, ArsR (HP0166), CrdR (HP1365) and HP0703, which are probably involved in transcriptional regulation (Alm et al., 1999; Tomb et al., 1997). Interestingly two of the response regulators, HP1043 and ArsR (HP0166) proved to be essential for the survival of H. pylori, while the response regulator HP1021 has a distinct influence on the cell-growth, as indicated by a severe growth defect when hp1021 is deleted (Beier & Frank, 2000; McDaniel et al., 2001; Schär, 2001). Under standard growth-conditions, the deletion of arsS (hp0165), encoding the cognate histidine kinase of ArsR (HP0166), has no effect on the cell-growth of H. pylori. This observation argues for the hypothesis that the response regulator ArsR (HP0166) controls the transcription of two different sets of target-genes. Upon acid-induced phosphorylation via ArsS (HP0165), the response regulator ArsR (HP0166) regulates the transcription of genes which are involved in acid resistance mechanisms, while in an unphosphorylated state ArsR (HP0166) controls other target genes, of which at least one is essential for cell-growth. The regulon controlled by ArsR~P (HP0166~P) has been extensively studied (Dietz, 2002; Forsyth et al., 2002; Pflock et al., 2004; Pflock et al., 2006; Pflock et al., 2005), while target genes of the unphosphorylated response regulator are so far unknown. In this work this hypothesis could be proven. It was shown that a derivative of ArsR (HP0166), with a mutation of the phosphorylation site D52 to N52, is able to substitute the wildtype protein functionally with respect to cell-growth. In the case of the response regulators HP1021 and HP1043 no cognate histidine kinases have been identified so far (Beier & Frank, 2000). Interestingly the receiver domains of the response regulators differ from the consensus sequence at highly conserved aminoacid residues. To investigate the importance of the atypical primary sequences for the function of HP1021 and HP1043, mutated H. pylori strains expressing exclusively derivatives of HP1021 or HP1043 with receiver sequences matching the consensus sequence were constructed. As these mutants did not show differences in cell-growth in comparison to the wildtype strain, it was proven that the atypical receiver sequences are not crucial for cell growth. Furthermore, indications could be found that HP1021 and HP1043 presumably differ from the common two component paradigm regarding their activation. Derivatives of HP1021 and HP1043 with mutations in their putative phosphorylation sites could functionally complement their wildtype counterparts with regards to cell growth. Therefore the phosphorylation of the receiver domain of these response regulators is not a pre-requisite for normal cell growth of H. pylori. In line with this hypothesis it could be demonstrated that there is no in vitro phosphorylation of the receiver domain of HP1021 and HP1043 with radioactive labelled acetylphosphate and that a H. pylori strain which a deletion of the genes pta and ackA, encoding proteins involved in the synthesis of acetylphosphate in the cell, showed a normal growth-phenotype. Moreover, when the protein HP1021, which was isolated by two-dimensional gelelectrophoreses, was analysed by mass spectrometry no evidence of a serine phosphorylation was obtained. Aditionally the observation that deletion of hp1043 can be complemented by the C. jejuni ortholog cj0355 encoding a response regulator protein with an asparagine residue replacing the consensus phosphate-accepting aspatic acid residue supports this hypothesis. Therefore it is questionable whether in vivo there is a phosphorylation which is functional relevant at all at the receiver domain. The mechanisms by which the activity of the Response-Regulators HP1021 and HP1043 is modulated still remain unclear. Here it could be demonstrated that strict transcriptional control of its expression is not relevant for the cell-growth associated function of HP1021. In contrast there are hints that the expression of HP1043 is controlled on a post-transcriptional and/or a post-translational level. Up to now no target genes of HP1021 were known. Using comperative two-dimensional gelelectrophoresis some potential target genes have been identified, among others HP0695, FadA and the Catalase. KW - Helicobacter pylori KW - Signaltransduktion KW - Genregulation KW - Response-Regulator KW - Helicobacter pylori KW - Zwei-Komponentensystem KW - essentiell KW - orphan KW - response regulator KW - Helicobacter pylori KW - two component system KW - essential KW - orphan Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21855 ER -