TY - THES A1 - Wagner, Martin T1 - Zyto- und Gentoxizität von Zinkoxid-Nanopartikeln in humanen mesenchymalen Stammzellen nach repetitiver Exposition und im Langzeitversuch T1 - Time-Dependent Toxic and Genotoxic Effects of Zinc Oxide Nanoparticles after Long-Term and Repetitive Exposure to Human Mesenchymal Stem Cells N2 - Zinkoxid-Nanopartikel (ZnO-NP) finden in vielen Produkten des täglichen Verbrauchs Verwendung. Daten über die toxikologischen Eigenschaften von ZnO-NP werden kontrovers diskutiert. Die menschliche Haut ist in Bezug auf die ZnO-NP Exposition das wichtigste Kontakt-Organ. Intakte Haut stellt eine suffiziente Barriere gegenüber NP dar. Bei defekter Haut ist ein Kontakt zu den proliferierenden Stammzellen möglich, sodass diese als wichtiges toxikologische Ziel für NP darstellen. Das Ziel dieser Dissertation war die Bewertung der genotoxischen und zytotoxischen Effekte an humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) durch niedrig dosierte ZnO-NP nach 24 stündiger Exposition, repetitiven Expositionen und im Langzeitversuch bis zu 6 Wochen. Zytotoxische Wirkungen von ZnO-NP wurden mit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Test (MTT) gemessen. Darüber hinaus wurde die Genotoxizität durch den Comet-Assay bewertet. Zur Langzeitbeobachtung bis zu 6 Wochen wurde die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet. Zytotoxizität nach 24-stündiger ZnO-NP-Exposition war ab einer Konzentration von 50 µg/ml nachweisbar. Genotoxizität konnten bereits bei Konzentrationen von 1 und 10 µg/ml ZnO-NP beschrieben werden. Wiederholte Exposition verstärkte die Zyto-, aber nicht die Genotoxizität. Eine intrazelluläre NP-Akkumulation mit Penetration der Zellorganelle wurde bei einer Exposition bis zu 6 Wochen beobachtet. Die Ergebnisse deuten auf zytotoxische und genotoxisches Effekte von ZnO-NP hin. Bereits geringe Dosen von ZnO-NP können bei wiederholter Exposition toxische Wirkungen hervorrufen sowie eine langfristige Zellakkumulation. Diese Daten sollten bei der Verwendung von ZnO-NP an geschädigter Haut berücksichtigt werden. N2 - Zinc oxide nanoparticles (ZnO-NP) are widely used in many products of daily consumption. Data on the toxicological properties of the ZnO-NP used are discussed controversially. Human skin is the most important organ in terms of ZnO-NP exposure. Intact skin has been shown to provide an adequate barrier against NPs, while defective skin allows NP contact with proliferating cells. Among proliferating cells, stem cells are the main toxicological target for NPs. Therefore, the aim of this dissertation was to evaluate the genotoxic and cytotoxic effects of human mesenchymal stem cells (hMSC) by low-dose ZnO-NP after 24 hours of exposure, repetitive exposures and in long-term experiments up to 6 weeks. Cytotoxic effects of ZnO-NP were measured with 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide test (MTT). In addition, genotoxicity was assessed by the comet assay. Transmission electron microscopy (TEM) was used for long-term observation after 6 exposure periods. The results of the study show that ZnO-NP has a cytotoxic effect starting at high concentrations of 50 µg/mL and could demonstrate genotoxic effects in hMSC exposed to 1 and 10 µg/ml ZnO-NP. Repeated exposure enhanced cytotoxicity but not genotoxicity. Intracellular NP accumulation with penetration of the cell organelles was observed at exposure up to 6 weeks. The results indicate the cytotoxic and genotoxic potential of ZnO-NP. Even small doses of ZnO-NP can cause toxic effects with repeated exposure and long-term cell accumulation. These data should be considered when using ZnO-NP on damaged skin. KW - nanoparticle KW - zinc oxid KW - stem cells KW - nanotoxicology KW - human skin KW - Nanopartikel KW - humane mesenchymale Stammzellen KW - Genotoxizität KW - Zytotoxizität KW - Repetitive Exposition KW - Elektronenmikroskopie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-275726 ER - TY - THES A1 - Pitsch, Maximilian Jonathan T1 - Zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) als Äquivalent akkumulierter neuronaler Evidenz T1 - Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an equivalent of accumulated neuronal evidence N2 - Die vier Crz-Neurone des ventralen Nervensystems von Drosophila melanogaster sammeln Evidenz, wann im Rahmen eines Paarungsakts zirka 6 Minuten vergangen sind. Diese Entscheidung ist für die männliche Fliege von Bedeutung, da das Männchen vor Ablauf dieser ~6 Minuten, welche den Zeitpunkt der Ejakulation darstellen, eher das eigene Leben opfern würde, als dass es die Paarung beenden würde. Nach Ablauf der ~6 Minuten fällt die Motivation des Männchens dagegen dramatisch ab. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst mittels optogenetischer neuronaler Inhibitionsprotokolle sowie Verhaltensanalysen das Phänomen der Evidenz-akkumulation in den Crz-Neuronen genauer charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die akkumulierte Evidenz auch während einer elektrischen Inhibition der Crz-Neurone persistierte. Dieses Ergebnis warf die Hypothese auf, dass das Äquivalent der akkumulierten Evidenz in den Crz-Neuronen biochemischer Natur sein könnte. Es wurde daraufhin ein Hochdurchsatzscreening-Verfahren entwickelt, mittels dessen 1388 genetische Manipulationen der Crz-Neurone durchgeführt und auf eine Änderung der Evidenzakkumulation getestet wurden. Nur ~30 genetische Manipulationen zeigten eine veränderte Evidenzakkumulation, wobei die meisten dieser Manipulationen den cAMP-Signalweg betrafen. Mittels der optogenetischen Photoadenylatzyklase bPAC, einer Reihe weiterer genetischer Manipulationen des cAMP-Signalwegs sowie der ex vivo Kalzium-Bildgebung und Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie konnte bestätigt werden, dass cAMP das Äquivalent der in den Crz-Neuronen spannungsabhängig akkumulierten Evidenz darstellt, wobei die Kombination dieser Methoden nahelegte, dass der Schwellenwert der Evidenzakkumulation durch die cAMP-Bindungsaffinität der regulatorischen PKA-Untereinheiten festgelegt sein könnte. Mittels genetischer Mosaikexperimente sowie bildgebenden Verfahren konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass innerhalb des Crz-Netzwerks eine positive Rückkopplungsschleife aus rekurrenter Aktivität sowie der cAMP-Akkumulation besteht, welche, sobald die cAMP-Spiegel den Schwellenwert erreichen, zu einem netzwerkweit synchronisierten massiven Kalziumeinstrom führt, was die Abgabe des Crz-Signals an nachgeschaltete Netzwerke triggert. Dieses Phänomen könnte ein Analogon des Aktionspotenzials auf Netzwerkebene sowie auf Intervallzeitskalen darstellen und wurde als „Eruption“ bezeichnet. Genetische, optogenetische sowie Bildgebungsexperimente konnten zeigen, dass die CaMKII derartige Eruptionen durch Niedrighalten der cAMP-Spiegel unterdrückt, was den Zeitmessmechanismus des ersten beschriebenen Intervallzeitmessers CaMKII offenlegt. N2 - The four Crz neurons of the ventral nervous system of Drosophila melanogaster collect evidence about when approximately 6 minutes have elapsed during a mating act. This decision is of importance for the male fly as the male would rather sacrifice his own life than terminate mating before the expiration of these ~6 minutes, which represent the time of ejaculation. After these ~6 minutes, however, the male's motivation drops dramatically. In this dissertation, optogenetic neuronal inhibition protocols as well as behavioral analyses were used to characterize the phenomenon of evidence accumulation in the Crz neurons in more detail. This showed that the accumulated evidence persisted during electrical inhibition of the Crz neurons. This result raised the hypothesis that the equivalent of accumulated evidence in the Crz neurons might be biochemical in nature. A high-throughput-screening-assay was developed using which 1388 genetic manipulations of the Crz neurons were performed and tested for a change in evidence accumulation. Only ~30 genetic manipulations showed altered evidence accumulation, with most of these manipulations involving the cAMP pathway. Using the optogenetic photoadenylyl cyclase bPAC, a number of other genetic manipulations of the cAMP pathway, as well as ex vivo calcium imaging and fluorescence lifetime microscopy techniques, it was confirmed that cAMP represents the equivalent of accumulated evidence in the Crz neurons, and the combination of these methods suggested that the evidence accumulation threshold may be set by the cAMP-binding affinity of regulatory PKA subunits. Using genetic mosaic experiments as well as imaging techniques, it was further shown that within the Crz network there is a positive feedback loop between the recurrent activity as well as the cAMP accumulation, which, once cAMP levels reach the threshold, leads to a network-wide synchronized massive calcium influx, triggering the delivery of the Crz signal to downstream networks. This phenomenon could represent an analog of the action potential at the network level as well as at interval time scales and has been termed an "eruption." Genetic, optogenetic as well as imaging experiments could show that CaMKII suppresses such eruptions by keeping cAMP levels low, revealing the timing mechanism of CaMKII, the first described interval timer. KW - Evidenz KW - Drosophila KW - Biologische Uhr KW - cAMP KW - Intervallzeitmessung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-351292 ER - TY - THES A1 - Larsen, Mirjam T1 - Zur genetischen Heterogenität der Muskeldystrophien: alternative genetische Ursachen der Myotonen Dystrophie und FSHD T1 - The genetic heterogeneity of the muscular dystrophies: alternative genetic causes of myotonic dystrophy and FSHD N2 - Die klinische Symptomatik verschiedener erblicher Muskelerkrankungen verläuft oft erstaunlich ähnlich mit Muskelschwäche und -schwund als den hervorstechenden Alltagsproblemen. Dem gegenüber sind die genetischen Grundlagen sehr vielfältig mit > 250 bisher identifizierten Genen (musclegenetable.org). Auch innerhalb eines definierten Krankheitsbildes werden verschiedene genetische Ursachen nebeneinander gefunden, was durch die Verknüpfung in einem gemeinsamen Pathomechanismus begründet sein kann. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit verschiedenen Aspekten dieser genetischen Heterogenität am Beispiel der beiden häufigen Muskelerkrankungen Myotone Dystrophie (DM) und Facioscapulohumerale Muskeldystrophie (FSHD), bei denen alternative genetische Ursachen, sowie anknüpfende Fragestellungen untersucht wurden. Das erste Projekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit Fragestellungen, welche die DM betreffen. Die DM Typ 1 und Typ 2 (DM1 und DM2) bilden zusammen die häufigste Muskelerkrankung im Erwachsenenalter. Sie ist durch die gemeinsamen Symptome Myotonie, Muskelschwäche und Katarakt sowie die Beteiligung weiterer Organsysteme gekennzeichnet, was sie zu einer multisystemischen Erkrankung macht. Die genetische Ursache liegt für beide Formen in einer Repeatexpansion eines Mikrosatelliten in der untranslatierten Region zweier Gene (DMPK in DM1, CNBP in DM2). Dem gemeinsamen Pathomechanismus liegt eine toxische Funktionsgewinn-Mutation des expandierten RNA-Transkripts zugrunde. Die beiden bekannten Formen der DM sind phänotypisch häufig nicht unterscheidbar, weshalb in vielen Fällen beide Erkrankungen molekulargenetisch untersucht werden müssen. Dabei ist die Diagnostik der DM durch die Notwendigkeit des Nachweises von sehr großen Repeatexpansionen recht aufwändig und die Bestimmung der Repeatlänge im Fall der DM2 nur eingeschränkt möglich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Test zum Nachweis der Repeatexpansionen auf der Basis der Methode des Molecular Combing entwickelt, welche den gleichzeitigen Nachweis der beiden Loci von DM1 und DM2 erlaubt und zusätzlich eine direkte Messung der Repeatlänge ermöglicht. Das Molecular Combing ist eine fluoreszenz-mikroskopische Einzelmolekül-Analysemethode, durch die es erstmals möglich wurde, die vermutete somatische Instabilität bei DM2 darzustellen. Das zweite DM-Teilprojekt beschäftigt sich mit der Identifikation möglicher alternativer genetischer Ursachen für die Erkrankung. Dies wurde anhand einer Kohorte von 138 DM1- und DM2-negativen Indexpatienten mit dem typischen DM-Phänotyp untersucht. Ausgehend von dem gemeinsamen Pathomechanismus wurden die primären Krankheitsgene DMPK und CNBP, sowie CELF1 und MBNL1, welche wichtige Rollen auf sekundärer Ebene des Pathomechanismus spielen, mittels Next Generation Sequencing untersucht. Dabei wurde eine auffällige Variante in DMPK gefunden, keine Varianten in CNBP oder CELF1 und drei Varianten in MBNL1, was auf MBNL1 als Kandidatengen einer alternativen Ursache für DM hinweist. MBNL1 ist ein gewebespezifischer Spleißregulator, welcher einen Wechsel von einem fetalen zu einem adulten Spleißmuster im Muskel steuert. Die Pathogenität einer der Varianten wurde in einem RNA-Spleißassay mit MBNL1-Targetgenen untersucht. Dabei konnten keine spezifischen Spleiß-Effekte festgestellt werden, aber eine Verminderung des Expressionsniveaus im Sinne einer Haploinsuffizienz. Die 3D-Modellierung dieser Variante deutet auf Änderungen der Oberflächenladungen in MBNL1 hin. Der Nachweis der Pathogenität der Varianten und somit die Ursächlichkeit von MBNL1-Mutationen für DM konnte hiermit nicht abschließend geklärt werden. Die gefundenen Ergebnisse regen jedoch hoffentlich zu nachfolgenden Studien an. Das zweite Projekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit Fragestellungen um die FSHD. Diese bildet die dritthäufigste Muskelerkrankung, charakterisiert durch eine oft asymmetrische Schwäche der Muskulatur von Gesicht, Schultergürtel und Oberarmen. Genetisch ist die FSHD Typ 1 (FSHD1) mit einer Kontraktion des Makrosatelliten D4Z4 verknüpft, was eine Relaxation der Chromatinstruktur der Region mit sich bringt und damit die ektopische Expression des apoptotisch wirkenden Proteins DUX4 ermöglicht. Die pathogene Ausprägung dieser Funktionsgewinn-Mutation findet dabei nur in Verbindung mit einem FSHD-permissiven Haplotyp statt. Auf der Grundlage des gleichen Pathomechanismus wurde eine zweite Form der FSHD (FSHD2) vorgestellt, bei der die Chromatinrelaxation unabhängig von der Länge von D4Z4 durch einen Defekt in dem an der DNA-Methylierung beteiligten Gen SMCHD1 assoziiert sein soll. Die Vererbung von FSHD2 verläuft digenisch mit Mutationen in SMCHD1 und dem FSHD-permissiven Haplotyp auf zwei unabhängigen Loci. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Kohorte von 55 FSHD1-negativen Patienten mit dem typischen FSHD-Phänotyp untersucht. Dabei wurden der Haplotyp, die Methylierung von D4Z4 sowie das SMCHD1-Gen analysiert. Es konnten neun Patienten mit einem Defekt in SMCHD1 identifiziert werden. In einer zweiten Kohorte von 45 FSHD1-positiven Patienten wurde untersucht, ob SMCHD1-Mutationen auch in Kombination mit einer Kontraktion von D4Z4 vorkommen. Dieser Fall von FSHD1+2 konnte für drei Patienten gezeigt werden, welche außerdem einen auffällig schweren Phänotyp zeigten. SMCHD1 kann also als Modifier-Gen für die Schwere der Erkrankung bei FSHD1 angesehen werden. Damit wurden insgesamt zwölf SMCHD1-Mutationsträger identifiziert, davon sind zehn der Varianten noch nicht beschrieben worden. Für alle erkrankten Mutationsträger konnte eine Methylierung von D4Z4 ≤ 20 % ermittelt werden, was als diagnostisches Kriterium verwendet werden kann. Mit einem Anteil von 16,3 % Mutationsträger in der FSHD1-negetiven Kohorte bildet FSHD2 einen bedeutenden Anteil an dem Krankheitsbild der FSHD, weshalb die entwickelten Analysen in die Routinediagnostik eingegliedert wurden. Das zweite Teilprojekt der FSHD beschäftigt sich mit der Funktion des SMCHD1-Gens bei der X-Inaktivierung (XI). Es ist bekannt, dass SMCHD1 bei weiblichen Mäusen an der Aufrechterhaltung der XI mitwirkt. Die Untersuchung der XI bei FSHD2-Frauen ergab eine extreme Verschiebung der erwarteten XI von 50:50 auf 0:100 oder 100:0 bei sechs von 13 Patientinnen. Die übrigen sieben zeigten eine XI im Normalbereich von > 20:80 oder < 80:20. Der Befund der einseitigen Verschiebung könnte auf einen negativen Selektionsdruck gegenüber Zellen mit unvollständiger XI hindeuten. Es wäre interessant zu untersuchen, ob sich der gleiche Effekt auch in einer größeren Kohorte wiederfindet und ob er sich mit der Art der Mutation korrelieren lässt. N2 - The clinical presentation of many inherited muscular disorders is often remarkably similar with muscle weakness and wasting as the most prominent everyday problems. By contrast, the genetic basis is highly heterogeneous with so far > 250 identified genes (musclegenetable.org). Even within a defined disease group different genetic causes are found side by side which can be explained by linking into a common pathomechanism. The present thesis deals with different aspects of this genetic heterogeneity using the two common muscular disorders myotonic dystrophy (DM) and facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) as examples. It addresses questions on alternative genetic causes and related issues. The first project of this work is focused on issues related to DM. DM type 1 and DM type 2 (DM1 and DM2) together represent the most frequent muscular disorder in adulthood. Clinically, the disease is characterized by the common symptoms myotonia, muscular weakness and cataract as well as multi organ involvement, making it a multisystemic disorder. The genetic cause of both forms is the expansion of a microsatellite repeat in the untranslated regions of two different genes (DMPK in DM1, CNBP in DM2). The common pathogenic mechanism is based on a toxic gain of function mutation of the expanded RNA transcript. The two known forms of DM are phenotypically often not distinguishable which is why in many cases molecular genetic testing for both forms must be performed. In addition, the diagnosis of DM is quite challenging due to the need of detecting very large repeat expansions. Furthermore, an exact determination of repeat length in DM2 has so far not been possible. In this study, a test based on the method Molecular Combing was developed for detection of the repeat expansions, which allows for the simultaneous detection of the two loci of DM1 and DM2 in a single assay and in addition for a direct measurement of the repeat length. The Molecular Combing is a fluorescence microscopic single-molecule method which enables for the first time the visualization of the suspected somatic instability in DM2. The second DM-project deals with the identification of possible alternative genetic causes of the disease. This was investigated by a cohort of 138 DM1- and DM2-negative index patients displaying the typical DM-phenotype. Based on the common pathogenic mechanism, the primary disease genes DMPK and CNBP, as well as CELF1 and MBNL1 which play important roles on a secondary level of the pathomechanism were examined by Next Generation Sequencing. One candidate variant was found in DMPK, no variants in CNBP or CELF1 and three variants in MBNL1, suggesting that MBNL1 is an alternative candidate gene for DM. MBNL1 is a tissue-specific splicing regulator which controls the change from a fetal to an adult splicing pattern in muscle. Pathogenicity of one of the variants was tested in an RNA splicing assay with MBNL1 target genes. No alternative splicing patterns were observed but a reduction in expression levels suggests a haploinsufficiency mechanism. 3D-modelling of this variant suggests a change in surface charge of MBLN1. However, the proof of the pathogenicity of the three variants and thus the causality of MBNL1 mutations as a cause for DM still remains to be confirmed. Hopefully, our observations may foster further studies into this direction. The second project of this thesis deals with the genetic causes of FSHD. This is the third most common muscular disorder, characterized by often asymmetric weakness of the muscles of the face, shoulder girdle and upper arms. Genetically, FSHD type 1 (FSHD1) is associated with a contraction of the macrosatellite repeat D4Z4 which induces a relaxation of the chromatin structure of the region and thus allows ectopic expression of the apoptotic DUX4 protein. Pathogenicity of this gain-of-function mutation is exclusively associated with a permissive FSHD haplotype. Based on the same pathomechanism, a second form of FSHD (FSHD2) has been described in which chromatin relaxation is caused by a defect in the SMCHD1 gen that is involved in DNA methylation - independent of the D4Z4 repeat length. The inheritance of FSHD2 is therefore digenic with mutations in SMCHD1 and a FSHD permissive haplotype, located on two different chromosomes. In this study, a cohort of 55 FSHD1-negative patients displaying the typical FSHD phenotype was studied. The haplotype, methylation of D4Z4 and the SMCHD1 gene were analyzed. A number of nine patients with mutations in SMCHD1 could be identified. In a second cohort 45 FSHD1-positive patients were examined, addressing the question, whether SMCHD1 mutations also occur in combination with a contraction of D4Z4. The condition of FSHD1 + 2 was found in three patients who also showed a strikingly severe phenotype. SMCHD1 therefore can be regarded as a modifier gene for disease severity in FSHD1. In total, twelve SMCHD1 mutation carriers were identified in this study with ten novel variants. For all affected mutation carriers methylation of D4Z4 was found to be ≤ 20 % which can be used as a diagnostic criterion. With a proportion of 16.3 % mutation carriers in the FSHD1-negative cohort FSHD2 represents a significant part of the clinical spectrum of FSHD. Based on these findings, a modified algorithm for routine diagnostics of FSHD is presented. The second FSHD-project deals with the function of the SMCHD1 gene in X-inactivation (XI). It is known that in female mice SMCHD1 is involved in the maintenance of XI. The investigation of XI in FSHD2-women showed an extreme shift of the expected XI of 50:50 to 0:100 or 100:0 in six of 13 patients. The remaining seven patients showed XI in the normal range of > 20:80 or < 80:20. The finding of this one-sided shift could indicate a negative selection pressure against cells with incomplete XI. It would be interesting to investigate whether this effect can be confirmed in a larger cohort and whether it can eventually be correlated with the type of mutation. KW - Humangenetik KW - Myotonische Dystrophie KW - Landouzy-Déjerine-Atrophie KW - Gen Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123431 ER - TY - THES A1 - Krüger, Timothy T1 - Zur funktionellen Architektur des Nukleolus in lebenden Zellen T1 - Functional architecture of the nucleolus in living cells: Dynamics of nucleolar proteins. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden Fusionsprodukte aus verschiedenen nukleolären Proteinen mit fluoreszierenden Proteinen (GFP und dsRed: rot fluoreszierendes Protein) in lebenden Zellen von Säugern und Xenopus laevis exprimiert und lokalisiert. Dadurch standen "Marker" für die drei Hauptkomponenten des Nukleolus zur Verfügung. Die dynamischen Eigenschaften dieser Fusionsproteine wurden quantitativ mit Hilfe von "Photobleaching"-Experimenten analysiert (FRAP: fluorescence recovery after photobleaching). Im einzelnen wurde durch die Untersuchung von RNA-Polymerase I der rDNA Transkriptionsort im fibrillären Zentrum des Nukleolus bestätigt. Die kinetischen Analysen von zwei pol I-Untereinheiten (RPA194 und RPA53) durch FRAP in transkriptionell aktiven und inaktiven Nukleoli erlaubten direkte Rückschlüsse auf die Transkriptionsdauer der rRNA-Gene in vivo. Die individuellen pol I-Untereinheiten bewegen sich rasch zwischen Nukleoplasma und Nukleolus und interagieren in den fibrillären Zentren mit dem rDNA-Promoter. Dann werden sie in produktive Transkriptionskomplexe integriert, die während der Elongationsphase, die bei Raumtemperatur etwa fünf Minuten dauert, stabil bleiben und erst nach der Termination dissoziieren. Zumindest ein Teil der Untereinheiten wandert anschließend in das Nukleoplasma. Die Ergebnisse widersprechen Modellen, welche die dichte fibrilläre Komponente als Transkriptionsort ansehen oder immobile RNA Polymerase I-Moleküle postulieren. Die Identifizierung des fibrillären Zentrums als rDNA-Transkriptionsort wurde durch die Koexpression der pol I-Untereinheiten mit Fibrillarin, einem Leitprotein der dichten fibrillären Komponente, ermöglicht. Durch die Expression der beiden Proteine als unterschiedlich fluoreszierende Fusionsproteine konnten die Orte der Transkription (die fibrillären Zentren) und die Orte der ersten Prozessierungsschritte, an denen Fibrillarin beteiligt ist (die dichte fibrilläre Komponente), in lebenden Zellen als direkt benachbarte, aber räumlich getrennte Kompartimente identifiziert werden. Die Rolle der granulären Komponente als Ort späterer Prozessierungschritte und Integration ribosomaler Proteine wurde durch die Expression von B23 und der ribosomalen Proteine L4, L5 und L10 verdeutlicht. Dabei wurde die nukleoläre Lokalisation von L10 erstmals belegt. In der Literatur wurde bisher angenommen, L10 würde erst im Cytoplasma mit Ribosomen assoziieren. Dies ist nicht der Fall, wie insbesondere Experimente mit Leptomycin B gezeigt haben. Diese Droge hemmt den CRM1-abhängigen Kernexport und führte zu einer deutlichen Akkumulation von L10-haltigen Präribosomen im Nukleoplasma von menschlichen Zellen. Schließlich sollte ein neues nukleoläres Protein von Xenopus laevis molekular charakterisiert werden, das mit verschiedenen Antikörpern in der granulären Komponente des Nukleolus lokalisiert wurde. Durch massenspektrometrische Analysen nach zweidimensionaler Gelelektrophorese wurden die Antigene überraschenderweise als Cytokeratin-Homologe identifiziert. Im Verlauf dieser Arbeit wurden drei bisher unveröffentlichte Cytokeratin 19 Isoformen von Xenopus kloniert, sequenziert und als GFP-Fusionsproteine exprimiert. Diese wurden allerdings wie reguläre Cytokeratine in cytoplasmatische Intermediärfilamente integriert und konnten, auch nach Translokation in den Zellkern durch ein experimentell eingefügtes Lokalisationssignal, nicht im Nukleolus nachgewiesen werden. Nach der Kotransfektion mit verschiedenen Zellkern-Proteinen wurde Cytokeratin 19 mit diesen in den Zellkern und mit nukleolären Proteinen in den Nukleolus transportiert. Obwohl diese Versuche auf einen "Huckepack"-Transportmechanismus für ein normalerweise cytoplasmatisches Protein hinweisen, konnte Cytokeratin 19 nicht spezifisch in der granulären Komponente des Nukleolus lokalisiert werden. Daher konnte bisher, trotz intensiver Bemühungen, die Identität des in der Immunfluoreszenz nachgewiesenen nukleolären Proteins leider nicht aufgeklärt werden. N2 - In the present work, nucleolar proteins were expressed as fusions with fluorescent proteins (GFP: green fluorescent protein or dsRed: red fluorescent protein) in living mammalian and Xenopus laevis cells. These tagged proteins were used as markers for the three main components of the nucleolus. The dynamic properties of the fusion proteins were analyzed quantitatively in photobleaching experiments (FRAP: fluorescence recovery after photobleaching). The analysis of RNA polymerase I allowed the conclusion that the fibrillar centers are the site of rDNA transcription. The kinetic FRAP analysis of two pol I subunits (RPA194 and RPA53) in transcriptionally active and inactive nucleoli allowed an estimate of the transcription time of rDNA genes in vivo. The individual pol I subunits move rapidly between the nucleoplasm and the nucleolus and associate at rDNA promoter sites. Then they are integrated into productive transcription complexes, which remain stable for the elongation phase of about five minutes at room temperature, and dissociate after termination. At least part of the subunits migrate to the nucleoplasm. The obtained results disagree with models that assume the site of transcription to be in the dense fibrillar component, as well as proposing immobile RNA Polymerase I molecules. The designation of the fibrillar center as site of rDNA transcription was further corroborated by the coexpression of pol I subunits with fibrillarin, a major protein of the dense fibrillar component. Using two differently fluorescing tags, the sites of transcription (fibrillar centers) and the sites of early processing steps, in which fibrillarin participates (dense fibrillar components), could be identified in living cells as closely neighboured but clearly separated compartments. The granular component as the site of late processing steps and assembly of ribosomal proteins was visualized by the expression of B23 and ribosomal proteins L4, L5 and L10. In the course of this work L10 was shown to be localized in the nucleolus for the first time. In the literature, human L10 was assumed to associate with ribosomes only in the cytoplasm. This is not the case, as was shown in particular by experiments with Leptomycin B. This drug inhibits the CRM1 dependent nuclear export pathway and resulted in a clear accumulation of L10 containing preribosomes in the nucleoplasm of human cells. Finally, a novel nucleolar protein (p52) of Xenopus laevis was studied in detail. Antigens of various p52 antibodies, localized in the granular component of nucleoli by immunofluorescence were surprisingly identified as cytokeratin homologs by two-dimensional immunoblot analysis and mass spectrometry. In the course of this work three hitherto unpublished Cytokeratin 19 isoforms of Xenopus were cloned, sequenced and expressed as GFP-fusion proteins. However, these proteins behaved like regular cytokeratins and were integrated into intermediate filaments. They were not detectable in the nucleolus, even after translocation into the nucleus by means of an experimentally added localization signal. Following cotransfection with various nuclear RFP-fusion proteins, GFP-CK19 was transported into the nucleus and localized with ist coexpressed partner. When coexpressed with nucleolar proteins, Cytokeratin 19 was also transported into the nucleolus. Although these experiments indicate a possible piggyback transport mechanism for a normally cytoplasmic protein, Cytokeratin 19 was not specifically located in the granular component of the nucleolus. Therefore, despite all efforts, until now the identity of the nucleolar protein originally identified by immunofluorescence remains to be clarified. KW - Nucleolus KW - Grün fluoreszierendes Protein KW - RNS-Polymerase I KW - Ribosomenproteine KW - Cytokeratine KW - Nukleolus KW - GFP KW - RNA-Polymerase I KW - ribosomale Proteine KW - Cytokeratin KW - nucleolus KW - GFP KW - RNA-Polymerase I KW - ribosomal proteins KW - cytokeratin Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4000 ER - TY - THES A1 - Heddergott, Niko T1 - Zellbiologische Aspekte der Motilität von Trypanosoma brucei unter Berücksichtigung der Interaktion mit der Mikroumwelt T1 - Cell biological aspects of motility of Trypanosoma brucei in consideration of the interaction with the microenvironment N2 - Trypanosomen sind Protozoen, die Krankheiten bei Mensch und Tier verursachen, die unbehandelt infaust verlaufen. Die Zellen sind hoch motil, angetrieben von einem einzelständigen Flagellum, welches entlang des Zellkörpers angeheftet ist. Selbst in Zellkultur hören Trypanosomen niemals auf sich zu bewegen und eine Ablation funktioneller Bestandteile des Flagellarapparates ist letal für Blutstromformen. Es wurde gezeigt, dass Motilität notwendig ist für die Zellteilung, Organellenpositionierung und Infektiosität. Dies macht Trypanosomen zu besonders geeigneten Modellorganismen für die Untersuchung der Motilität. Dennoch ist erstaunlich wenig über die Motilität bei Trypanosomen bekannt. Dies gilt auch noch genereller für die Protozoen. Unlängst ist dieses Gebiet allerdings in den Fokus vieler Arbeiten gerückt, was bereits erstaunliche, neue Erkenntnisse hervorgebracht hat. Doch Vieles ist noch nicht abschliessend geklärt, so z.B. wie der Flagellarschlag genau reguliert wird, oder wie sich der Schlag des Flagellums entlang des Zellkörpers ausbreitet. Die vorliegende Arbeit befasst sich besonders mit den Einflüssen, die die Mikroumgebung auf die Motilität von Blutstromform-Trypanosomen ausübt. In ihrem natürlichen Lebensraum finden sich Trypanosomen in einer hoch komplexen Umgebung wieder. Dies gilt sowohl für den Blutkreislauf, als auch für den Gewebezwischenraum in ihrem Säugerwirt. Die hohe Konzentration von Zellen, Gewebeverbänden und extrazellulären Netzwerken könnte man als Ansammlung von Hindernissen für die Fortbewegung auffassen. Diese Arbeit zeigt dagegen, dass der Mechanismus der Bewegung eine Adaptation an genau diese Umweltbedingungen darstellt, so z.B. an die Viskosität von Blut. Es wird auch ein Bewegungsmodell vorgestellt, das erläutert, worin diese Adaption besteht. Dies erklärt auch, warum die Mehrheit der Zellen einer Trypanosomenkultur eine ungerichtete Taumel-Bewegung aufweist in nieder-viskosem Medium, das keine solchen “Hindernisse” enthält. Die Zugabe von Methylcellulose in einer Konzentration von ca. 0,5% (w/v) erwies sich als geeigneter Ersatz von Blut, um optimale Bedingungen für gerichtetes Schwimmen von Blutstromform Trypanosomen zu erreichen. Zusätzlich wurden in dieser Arbeit unterschiedliche Arten von Hindernissen, wie Mikroperlen (Beads) oder molekulare Netzwerke, sowie artifizielle, geordnete Mikrostrukturen verwendet, um die Interaktion mit einer festen Matrix zu untersuchen. In deren Anwesenheit war sowohl die Schwimmgeschwindigkeit, als auch der Anteil an persistent schwimmenden Trypanosomen erhöht. Zellen, die frei schwimmend in Flüssigkeiten vorkommen (wie Euglena oder Chlamydomonas), werden effizient durch einen planaren Schlag des Flagellums angetrieben. Trypanosomen hingegen mussten sich evolutionär an eine komplexe Umgebung anpassen, die mit einer zu raumgreifenden Welle interferieren würde. Der dreidimensionale Flagellarschlag des, an die Zelloberfläche angehefteten, Flagellums erlaubt den Trypanosomen eine effiziente Fortbewegung durch die Interaktion mit Objekten in jedweder Richtung gleichermassen. Trypanosomen erreichen dies durch eine hydrodynamisch verursachte Rotation ihres Zellkörpers entlang ihrer Längsachse, entgegen dem Uhrzeigersinn. Der Einfluss der Mikroumgebung wurde in früheren Untersuchungen bisher vernachlässigt, ist zum Verständnis der Motilität von T. brucei jedoch unerlässlich. Ein weiterer, bisher nicht untersuchter Aspekt der Beeinflussung der Motilität durch die Umwelt sind hydrodynamische Strömungseffekte, denen Trypanosomen im kardiovaskulären System ausgesetzt sind. Diese wurden in dieser Arbeit mittels Mikrofluidik untersucht. Um unser Verständnis der Motilität von Trypanosomen von 2D, wie üblich in der Motilitätsanalyse mittels Lebend-Zell-Mikroskopie, auf drei Dimensionen auszudehnen, wurde als bildgebendes Verfahren auch die Holographie eingesetzt. Mikrofluidik und Holographie sind beides aufkommende Techniken mit großem Anwendungspotential in der Biologie, die zuvor noch nie für die Motilitätsanalyse von Trypanosomen eingesetzt worden waren. Dies erforderte daher interdisziplinäre Kooperationen. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit auch ein vollständig automatisiertes und Software-gesteuertes Fluoreszenzmikroskopiesystem entwickelt, das in der Lage ist, einzelne Zellen durch entsprechende Steuerung des Mikroskoptisches autonom zu verfolgen und somit eine Bewegungsanalyse in Echtzeit ermöglicht, ohne weitere Benutzerinteraktion. Letztendlich konnte dadurch auch die Bewegung der schlagenden Flagelle und des gesamten Zellkörpers mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung mittels Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskopie aufgeklärt werden. N2 - Trypanosomes are protozoa causing fatal diseases in livestock and man. The cells show vivid motility, driven by a single flagellum that runs along the cell body, attached to the cell surface. Even in cell culture, trypanosomes never stop moving and ablation of functional components of the flagellum is lethal for bloodstream-forms. Motility has been shown to be essential for cell division, organelle positioning and infectivity. This renders trypanosomes valuable model organisms for studying motility. But, surprisingly little is known about motility in trypanosomes, as well as in protozoa, in general. Recently, motility of trypanosomes therefore has gotten into the spotlight of interest which brought some new insights, but many essential points are still a matter of debate, for example how the flagellar beat is regulated or how it is propagated along the cell body. In this work, the effects of the micro-environment of blood-stream form trypanosomes on motility were investigated. In their natural habitat, trypanosomes find themselves in a crowded environment. This is not only the case in the blood circulatory system, but also in extra-tissue space. The high concentration of cells and extra-cellular networks might be regarded as a kind of obstacle to cellular motion. This work shows that the mode of motility of bloodstream form trypanosomes instead is adapted to the viscosity of blood. Also a mechanistic model is presented which elucidates how this adaptation works. This also explains why most trypanosomes are tumbling in low-viscous cell culture medium, lacking other cellular components. Addition of Methylcellulose at a concentration of about 0.5% (w/v) was found to be a potent substitute for blood, providing optimal conditions for trypanosome motility. Also different types of obstacles like beads and molecular networks, as well as arranged pillar microstructures were used as a tool to mimic interaction with a solid matrix. In presence of these, the swimming speed as well as the percentage of persistent swimming cells was increased. Cells inhabiting an open-ranged environment (like Euglena or Chlamydomonas) are efficiently propelled by a planar flagellar wave. Trypanosomes in contrast, had to evolutionary adapt to a crowded environment, which would infer with any extensive planar wave. The three-dimensional flagellar beat of the attached flagellum allows trypanosomes to harness any rigid matrix for effective propulsion, in all directions equally. Trypanosomes achieve this by a rotational counter-clockwise motion of their whole cell body. Another environmental aspect for trypanosome motility that had not been studied before is the influence of hydrodynamic flow, which trypanosomes are subjected to, when swimming in the blood circulatory system. For studying this, in this work, the motilty of trypanosomes was analyzed in microfluidic devices. To extend our understanding of trypanosomal motility from 2D, like in standard microscopy based live-cell imaging analysis, to 3D, a imaging technique known as holography was used, in addition. Microfluidics as well as Holography both are emerging, high-potential techniques in biology, which had not been used for the motility analysis of trypanosomes before and establishing this therefore only got possible due to interdisciplinary collaborations. In addition, a custom fully automated, software-controlled, fluorescence microscopic system was developed in this work, which is able to track and follow single cells for motility analysis in real-time without the need for user input. The motion of the flagellar beat and the cell itself was investigated at high spatio-temporal resolution using highspeed fluorescence microscopy. KW - Trypanosoma brucei KW - Motilität KW - Blutviskosität KW - Hochgeschwindigkeitsmikroskopie KW - Mikrofluidik KW - Mikroumwelt KW - Mikrostrukturen KW - Trypanosomen KW - Blut KW - Trypanosoma KW - motility KW - blood KW - microfluidics KW - microenvironment Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56791 ER - TY - THES A1 - Kleinhenz, Marco T1 - Wärmeübertragung im Brutbereich der Honigbiene (Apis mellifera) T1 - Heat transfer in the brood area of honeybees (Apis mellifera) N2 - In dieser Arbeit untersuche ich das Verhalten von Arbeiterbienen beim Brutwärmen, die Wärmeübertragung von den Bienen auf die gedeckelte Brut, die thermophysikalischen Eigenschaften des Brutnests und spezielle Aspekte des Brutnestaufbaus, die für dieses Thema relevant sind und bisher nicht untersucht wurden. Meine Arbeit umfasst Verhaltensbeobachtungen und thermografische Messungen an individuellen Bienen, die Simulation des Heizverhaltens von Arbeiterinnen und das Messen der Temperaturänderungen in der Wabe, die Messung der thermophysikalischen Eigenschaften der Brutwabe und der Zellwände (Wärmeleitfähigkeit und Durchlässigkeit für Wärmestrahlung), die Auswertung von Brutzelltemperaturen als Ergebnis des Verhaltens von Arbeiterbienen, die Analyse der Anzahl und der räumlichen Verteilung von Brutlücken (Auswertung in 2-D und 3-D bezüglich beider Wabenseiten) und die Entwicklung spezifischer Computersoftware, die zur Erarbeitung dieser Ergebnisse unverzichtbar ist. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Entdeckung und Beschreibung eines bemerkenswerten, bislang unbekannten Verhaltens der Honigbiene: Die Aufrechterhaltung hoher Thoraxtemperaturen (TTh) bei Langzeitbesuchen in offenen Zellen („Lücken“) die verstreut in der gedeckelten Brutfläche vorkommen. Hier zeige ich, dass die Aufrechterhaltung der hohen TTh nicht auf den Zellinhalt (z. B. offene Brut) bezogen ist - in den meisten Fällen waren die besuchten Zellen ohnehin leer - sondern auf die direkt benachbarte gedeckelte Brut, mit der diese Zellen über gemeinsame Zellwände in Kontakt stehen. Dieses Verhalten liefert eine Erklärung für Langzeitzellbesuche von sehr langer Dauer ohne erkennbare Aktivität, die in früheren Arbeiten beschrieben aber nicht völlig verstanden wurden, und es rehabilitiert die scheinbar „faulen“ Bienen im Zellinnern. Diesem Verhalten kommt eine große Bedeutung für das Brutwärmen zu, da sich der aufgeheizte Thorax tief in der Wabe (fast an der Mittelwand) befindet wo der Wärmeverlust an die Luft minimiert ist und von wo bis zu 6 umliegende Puppenzellen gleichzeitig gewärmt werden können. Im Vergleich zum Brutwärmeverhalten an der Wabenoberfläche (Andrücken des Thorax an die Brutdeckel), wo nur 1 oder Teile von 3 Brutdeckeln mit dem Thorax in Berührung stehen, ist das Wärmen im Zellinnern mit derselben TTh bis zu 2,6-fach effizienter. Die Messung der thermophysikalischen Eigenschaften der Brutwabe und die Simulation des Brutwärmeverhaltens unter kontrollierten Bedingungen zeigen, dass sich die Wabe langsam aufwärmt und eher ein lokal begrenztes Wärmen als eine rasche Wärmeausbreitung über eine große Fläche begünstigt. Der Einflussbereich eines einzelnen Zellbesuchers hängt von seiner TTh und der Dauer des Zellbesuchs ab. Anstiege der Bruttemperatur in bis zu 3 Zellen Abstand zum Zellbesucher sind nachweisbar. Das hier beschriebene Brutwärmeverhalten im Innern von Lücken (offenen Zellen) bietet nicht nur neue Einsichten in das Bienenverhalten. Es ermöglicht auch eine Neubewertung der Lücken und ihrer Nützlichkeit für die Bienen. Eine von mir entwickelte Computersoftware („CombUse 2.0“) ermöglicht es, das Vorkommen und die räumliche Verteilung von Lücken mit hoher Genauigkeit auf der Ebene einzelner Zellen zu erfassen und auszuwerten. Die räumliche Verteilung der Lücken in der gedeckelten Brutfläche zeigt, dass schon bei geringen Lückenhäufigkeiten von ca. 4 bis 10 %, die in gesunden Kolonien normal sind, eine überraschend große Zahl gedeckelter Brutzellen (88 % bis 99 %, wenn die dreidimensionale Verteilung berücksichtigt wird) im Einflussbereich von Brut wärmenden Zellbesuchern sind. Obwohl das Brutwärmeverhalten im Zellinnern schwer zu entdecken und zu beobachten ist, führen die in dieser Arbeit präsentierten Daten zu dem Schluss, dass es sich dabei um einen wichtigen Bestandteil der Nestklimatisierung bei Honigbienen handelt. N2 - In this thesis I investigate the behaviour of worker bees while incubating brood, heat transfer from bees to the sealed brood, the thermophysical properties of the brood nest and special aspects of brood nest architecture that are relevant for this topic but have not been investigated so far. My work comprises behavioural observations and thermographic measurements of individual bees, simulation of worker bees’ heating behaviour and measurement of temperature changes within the brood comb, the measurement of thermophysical properties of the brood comb and cell walls (thermal conductivity and transmission of thermal radiation), the analysis of brood cell temperatures as a result of the behaviour of worker bees, the analysis of the number and spatial distribution of brood gaps (analysis in 2-D and 3-D with regard to both sides of a comb) and the engineering of specific computer software which was indispensable to achieve these results. One major result of this work is the discovery and description of a very remarkable, hitherto unknown behaviour of the honeybee: the maintenance of high thorax temperatures (TTh) during long-time visits to open cells (“gaps”) which are scattered at low rates among the sealed brood. Here I show that the maintenance of high TTh is not related to the contents of the visited cells (anyway, they were empty in most cases) but to the presence of sealed brood which is directly adjacent to and sharing common cell walls with the visited cell. The discovery of this behaviour casts a positive light on apparently “lazy” bees and provides an explanation for long-time cell-visits with durations of several ten minutes which were described but not fully understood in earlier works by other authors. Moreover, this behaviour is of high relevance for brood incubation itself because the heated thorax is deep in the comb (almost down to the middle wall) where heat loss to the air is minimized and where up to 6 surrounding pupa cells can be warmed simultaneously. In comparison to specific brood incubation behaviour on the comb surface (pressing the thorax onto the brood caps), where only one or parts of three brood caps may be in touch with a heated thorax, heating inside cells with the same TTh is up to 2,6 times more efficient. The measurement of thermophysical properties of the brood comb and the simulation of worker heating under controlled conditions show that the comb warms up slowly and supports local heating rather than a rapid spread of heat all over the area. The radius-of-influence of a single cell visitor depends on its TTh and on the duration of the cell visit. Increases of brood temperature as far as three cells away from the cell visitor may be detected. The brood incubation behaviour via gaps (i.e. open cells) which I describe in this work does not only give new insights into bee behaviour. It also allows a reconsideration of the gaps them¬selves and their usefulness to the bees. A specific computer software (“CombUse 2.0”) which I developed for this work allowed me to register and analyze the spatial distribution of gaps with high precision on the level of cells, in contrast to rough estimations of brood areas and gap numbers which are commonly used in bee-breeding and population assessments. The analysis of the spatial distribution of gaps in the sealed brood area shows that even at small proportions of gaps (ca. 4 to 10 %, common to healthy colonies), a surprisingly large number (88 % to 99 %, if the three-dimensional distribution of gaps is considered) of sealed brood cells is within the reach of brood incubating worker bees visiting these gaps. Although brood incubation behaviour inside cells is very difficult to detect and observe, the data presented in this work strongly suggest that heating inside cells is an important part of nest climate control and other aspects of social life in honeybee colonies. KW - Biene KW - Bienenzelle KW - Carnica-Biene KW - Biene KW - Bienenbrut KW - Thermoregulation KW - Wabe KW - Verhalten KW - honeybee KW - behaviour KW - thermoregulation KW - brood KW - comb Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26866 ER - TY - THES A1 - Wegert, Jenny T1 - WTX-Mutationsscreen und funktionelle Analyse des Retinsäure-Signalwegs in Wilms Tumoren T1 - WTX-mutation screening and functional analysis of the retinoic acid signaling pathway in Wilms tumors N2 - Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, ist einer der häufigsten bösartigen Tumoren im Kindesalter. Er entsteht aus embryonalem undifferenziertem Nierengewebe und tritt meist als unilateraler und sporadischer Tumor auf. In 10-15% der Wilms Tumoren finden sich WT1- und/oder CTNNB1-Mutationen. Während diese schon länger als genetische Ursachen des Nephroblastoms bekannt sind, wurde erst kürzlich WTX als drittes Gen beschrieben, welches eine Rolle in der Tumorentstehung spielt. Für einen Großteil der WT ist die genetische Ursache jedoch unklar. Da die bisher publizierten WTX-Mutationsraten auf Untersuchungen kleiner Gruppen basieren und sich stark unterscheiden, sollten in dieser Arbeit WTX-, CTNNB1- und WT1-Mutationen in einem großen WT-Set bestimmt werden. Verluste genetischen Materials in der WTX-Region traten in 17% der Fälle auf und waren zwischen den Geschlechtern gleich verteilt. Die Sequenzierung von WT-Proben zeigte, dass nur 2% von WTX-Punktmutationen betroffen sind. In weiteren 11,5% der Proben konnte keine WTX-Expression nachgewiesen werden. Die WTX-Veränderungen traten z. T. gemeinsam mit WT1- und/oder CTNNB1-Mutationen auf. Die unvollständige WTX-Deletion in einigen WT legte die Vermutung nahe, dass innerhalb eines Tumors eine Heterogenität in Bezug auf den WTX-Status möglich ist. Dieser Verdacht konnte durch die detaillierte Untersuchung verschiedener Regionen solcher Tumoren erhärtet werden: Hierzu wurden histologisch unterschiedliche Bereiche auf den Anteil einer WTX-Mutation bzw. eines WTX-LOH hin untersucht. Obwohl alle Regionen des jeweiligen Tumors einen kompletten LOH auf Chromosom 11 aufwiesen, waren die WTX-Veränderungen unterschiedlich stark ausgeprägt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass WTX-Veränderungen keine notwendigen und frühen Ereignisse in der Tumorentstehung sind, sondern erst später auftreten und nur einen Teil der Tumorzellen betreffen können. Die Vermutung, dass WTX-Mutationen keinen direkten Einfluss auf die Tumorentwicklung und prognose haben, wird durch das Fehlen eines signifikanten Zusammenhangs zwischen WTX-Deletion bzw. WTX-Expression und den klinischen Eigenschaften der WT gestützt. Um die Rolle von Genen, die potentiell an der Entstehung und Entwicklung des Nephroblastoms beteiligt sind, zu untersuchen oder mögliche neue Therapiestrategien zu überprüfen, sind in vitro-Modelle nötig. Da ein solches für Wilms Tumoren nicht etabliert ist, wurden Primärkulturen aus verschiedenen WT-Proben angelegt. Kulturen aus Tumorgewebe von 12 Patienten mit unterschiedlichen genetischen Veränderungen konnten als echte Tumorzellen validiert werden. Zwei Zelltypen ließen sich morphologisch und immunhistochemisch unterscheiden: Zum einen runde, langsam wachsende Zellen mit Epithelcharakter und zum anderen fibroblastenähnliche Zellen, welche weniger differenziert waren und häufig für viele Passagen kultiviert werden konnten. Somit wurde ein Set verschiedener WT-Primärkulturen etabliert, welches nun für in vitro-Experimente zur Untersuchung grundlegender Mechanismen der WT-Entstehung oder zum Test neuer Therapieansätze eingesetzt werden kann. Frühere Microarray-Analysen deuteten auf eine Deregulation des Retinsäure (RA)-Signalwegs in fortgeschrittenen Wilms Tumoren hin. Diese Ergebnisse sollten in einem großen unabhängigen Proben-Set mittels Realtime-RT-PCR validiert werden. Eine Deregulation des RA-Signalwegs und die Überexpression von NMYC wurden für Tumoren der Hochrisikogruppe im Vergleich zu Tumoren mit geringem/mittlerem Risiko nachgewiesen. So stellte sich die Frage, ob Patienten mit fortgeschrittenem WT von einem Retinsäure-Einsatz in der Therapie profitieren könnten. Um dies zu beantworten, wurde der Effekt von verschiedenen Retinoiden auf WT-Primärkulturen untersucht. Die WT-Zellen wurden mit all-trans RA (ATRA), 9cisRA, dem synthetischen Retinoid Fenretinid (4HPR) und Kombinationen von ATRA bzw. 4HPR und einem HDAC-Inhibitor (SAHA) behandelt. Gene, welche in Hochrisiko-WT differenziell reguliert waren, wurden untersucht und zeigten nach RA-Behandlung eine entgegengesetzte Expression. In sechs der sieben verwendeten Primärkulturen wurde eine RA-vermittelte Proliferationsreduktion nachgewiesen. Für die Kombinationen von Retinoiden mit SAHA wurden keine synergistischen Effekte beobachtet. Während Fenretinid in den meisten Kulturen Apoptose induzierte, verursachten ATRA und 9cisRA morphologische Veränderungen, welche auf Differenzierungsvorgänge hindeuteten. Eine Microarray-Analyse ATRA-behandelter WT-Zellen zeigte die differenzielle Regulation vieler Gene, welche eine Rolle in der Bildung der extrazellulären Matrix oder bei Differenzierungsvorgängen von Knochen-, Knorpel-, Nerven- oder Muskelgewebe spielen. Diese Befunde bieten einen weiteren Hinweis darauf, dass Retinoide für den Einsatz in der Therapie des Nephroblastoms geeignet sein könnten. N2 - Wilms tumor (WT) – or nephroblastoma – is one of the most common solid tumors in childhood. It arises from embryonal blastema and most frequently presents as a unilateral and sporadic tumor. Mutations in WT1 and CTNNB1 are well established as causal alterations in about 10-15 % of cases. Recently, WTX (Wilms tumor gene on the X-chromosome), a gene implicated in WNT signaling, has been identified as a third WT gene, but for the majority of nephroblastomas the genetic etiology is still unclear. Published WTX mutation rates in Wilms tumors are still based on smaller cohorts and differ significantly. Therefore, the WTX, CTNNB1 and WT1 mutation state was determined in a large set of 429 Wilms tumors. Genomic WTX alterations were identified in 17% of WT, equally distributed between males and females. Analysis of 104 WT samples for WTX point mutations revealed a frequency of only 2%. An additional 11,5% of tumor samples lacked expression of WTX mRNA. These WTX alterations can occur in parallel to WT1 or CTNNB1 mutations. Incomplete deletion of WTX in several cases suggested heterogeneity of WTX alterations in tumors and this was corroborated by analysis of different regions of such tumors. In cases with heterozygous point mutations or LOH, separate tumor fragments or microdissected regions with different histology were analyzed. Despite complete allele losses at chromosome 11 varying ratios of WTX mutation were detected. This suggests that WTX alteration is not an essential and early mutation needed to drive tumorigenesis, but rather a late event that may affect only a fraction of cells with unclear clinical relevance. This hypothesis is supported by the fact that there is no significant correlation between WTX deletion status or expression level and clinical parameters suggesting that WTX mutations apparently have little direct impact on tumor behavior and presentation. As there is no in vitro model for nephroblastoma that could be used to investigate genes playing a role in development and progression of WT or to test new treatment strategies, primary cultures were generated from fresh tumor tissue. Cultures from tumor samples of 12 patients with different genetic alterations could be validated as tumor derived cells. Two different cell types could be distinguished by immunohistochemistry and cell morphology: large round, slowly growing cells with epithelial characteristics and fibroblast-like cells that are less differentiated and some of which could be kept in culture for many passages before getting senescent. In this way a set of primary WT-cells could be established that is suitable for in vitro approaches to study mechanisms of nephroblastoma development or to test new therapy strategies. Prior microarray analyses suggested a deregulation of the retinoic acid (RA) pathway in advanced Wilms tumors. This should be validated in a large independent tumor set of 163 WT by realtime-RT-PCR. Deregulation of RA signaling and overexpression of NMYC was found in high risk tumors as opposed to tumors with low/intermediate risk and suggested a beneficial impact of retinoic acid on advanced nephroblastoma. To investigate whether retinoids could be employed as a novel therapeutic agent in WT primary WT-cells were treated with all-trans-RA (ATRA), 9cisRA, the synthetic retinoid fenretinide and combinations of retinoids and the HDAC inhibitor SAHA. Expression of genes deregulated in high risk tumors were analyzed and showed opposite changes upon treatment suggesting a positive effect of retinoids. For six of seven primary cultures tested cell growth was reduced upon retinoid administration. No additional synergistic effect could be observed for the combination of retinoids with the HDAC inhibitor SAHA. While fenretinide induced apoptosis in several cultures tested, ATRA and 9cisRA caused morphological changes suggesting differentiation upon treatment. Microarray analysis of ATRA treated WT-cells revealed differential expression of many genes involved in the formation of the extracellular matrix and osteogenic, neuronal or muscle differentiation processes. These findings provide further evidence of a potential utility of retinoids in Wilms tumor treatment. KW - Nephroblastom KW - Genmutation KW - Retinoesaeure KW - Signaltransduktion KW - Wilms Tumor KW - WTX KW - Primärkultur KW - Nephroblastoma KW - Wilms tumor KW - WTX KW - primary cell culture KW - retinoic acid Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52822 ER - TY - THES A1 - Römer, Daniela T1 - Where and how to build? Influence of social and environmental cues on nest building behavior in leaf-cutting ants T1 - Wo und wie Bauen? Der Einfluss von sozialen und Umwelt-Hinweisen auf das Nestbauverhalten von Blattschneiderameisen N2 - This thesis explores the influence of social and environmental cues on the nest building behavior of leaf-cutting ants. Especially, the investigations are aimed at evaluating the mechanisms of nest building and how the nest environment can spatially guide building responses that lead to an adaptive nest architecture. The emergence of nest chambers in the nest of the leaf-cutting ant Acromyrmex lundi were evaluated. Rather than excavating nest chambers in advance, at places where workers encounter suitable environmental conditions for brood and fungus rearing, these items have to be present at a site. When presented in the laboratory with a choice between two otherwise identical digging sites, offering suitable environmental conditions, but one containing brood, the workers displayed a higher excavation activity at the site where they encountered the putative content of a chamber. The shape of the excavated cavity was also more round and chamber-like. It is concluded that leaf-cutting ants respond to social cues during nest building. Excavation is a costly process and colonies have to spend a part of their energy stores on nest building, so that regulatory responses for the control of nest excavation are expected to occur. Worker density at the beginning of the digging process influenced digging activity while the presence of in-nest stores did not. Stored brood and fungus did however influence the architecture of the excavated nest, leading to the excavation of larger chambers and smaller tunnels. While self-organized mechanisms appear to be involved in the nest building process, the social cues of the ants’ environment during building clearly influence the nest architecture and lead to an adjustment of the nest size to the current space needs of the colony. Workers secondarily regulated nest size by the opportunistic refilling of unused space with excavated soil pellets. As the ants should provide suitable conditions for brood and fungus rearing, they should show a behavioral response to CO2 concentrations, as the gas is known to hinder fungus respiration. Workers of A. lundi did indeed avoid high CO2-levels for fungus rearing but actually preferred CO2-values in the range encountered close to the soil surface, where this species excavates their nests. However, different CO2-levels did not affect their excavation behavior. While fungus chambers make up part of a leaf-cutting ant nest, most leaf-cutting ants of the genus Atta also spent part of the colony’s energy on excavating large, voluminous chambers for waste disposal, rather than scattering the material aboveground. It is expected that leaf-cutting ants also show environmental preferences for waste management. In experiments Atta laevigata workers preferred deposition in a warm and dry environment and showed no preference for specific CO2-levels. The continued accumulation of waste particles in a waste chamber seems to be based on the use of volatiles. These originate from the waste itself, and seem to be used as an orientation cue by workers relocating the material. The ensuing large accumulation of waste at one site should result in the emergence of more voluminous chambers for waste disposal. N2 - Diese Arbeit erforscht den Einfluss von sozialen und Umwelt-Hinweisen auf das Nestbauverhalten von Blattschneider-Ameisen. Die Untersuchungen sind besonders darauf gerichtet, die Mechanismen des Nestbaus zu erforschen, und wie die Umgebung des Nestes Bau-Antworten räumlich beeinflussen kann, wodurch eine adaptierte Nestarchitektur entsteht. Die Entstehung von Nestkammern in Nestern der Blattschneiderameise Acromyrmex lundi wurde untersucht. Anstatt Nestkammern im Voraus zu graben, an Orten an denen Arbeiterinnen geeignete Umweltbedingungen für Brut- und Pilzwachstum vorfinden, müssen diese Elemente an dieser Stelle anwesend sein. Wenn Arbeiter im Labor die Wahl hatten, an identischen Grabeorten zu graben, aber ein Grabeort ebenfalls Brut anbot, kam es zu einer höheren Grabeaktivität an dem Ort, an dem der voraussichtliche Inhalt einer Kammer, Brut und Pilz, anwesend war. Die Form des gegrabenen Hohlraumes war außerdem runder und entsprach mehr der einer Kammer. Es wurde geschlussfolgert, dass Blattschneiderameisen auf die Anwesenheit dieser sozialen Hinweise während des Nestbaus reagieren. Graben ist ein kostspieliger Prozess und Kolonien müssen einen Teil ihrer Energiereserven für den Nestbau aufwenden. Daher werden regulatorische Prozesse für die Kontrolle des Nestgrabens erwartet. Die Dichte der Arbeiter zu Beginn des Grabeprozesses beeinflusste die Grabeaktivität, während die Anwesenheit von Brut und Pilz dies nicht taten. Anwesende Brut und Pilz beeinflussten hingegen die Architektur des gegrabenen Nestes und führten zum Graben von größeren Kammern und kleineren Tunneln. Während Mechanismen der Selbst-Organisation am Nestbau-Prozess beteiligt sind, beeinflussen die sozialen Hinweise während des Nest-Baus anscheinend die Nest-Architektur und führen zu einer Anpassung der Nestgröße an die momentanen Ansprüche der Kolonie. Arbeiterinnen regulierten sekundär die Nestgröße, indem sie opportunistisch ungenutzten Platz mit ausgegrabenen Pellets auffüllen. Da die Ameisen Brut und Pilz unter geeigneten Umweltbedingungen entwickeln sollten, sollten sie Verhaltensantworten auf verschiedene CO2 Konzentrationen zeigen, da es bekannt ist, dass das Gas die Atmung des symbiontischen Pilzes negativ beeinflussen kann. Arbeiter vermieden in der Tat 4% CO2, zogen aber Konzentrationen von 1% CO2 vor, wie sie auch in den oberflächennahen Erdschichten vorzufinden sind, in denen die untersuchte Art, Acromyrmex lundi, ihre Nester gräbt. Allerdings beeinflussten höhere CO2 Konzentrationen nicht die Grabeaktivität der Arbeiterinnen. Während die Pilzkammern einen Teil eines Blattschneider-Nestes bilden, so verwenden die meisten Arten der Gattung Atta auch einen Teil der Energie der Kolonie auf das Graben von großen, voluminösen Abfallkammern, anstatt das Material an der Erdoberfläche zu verstreuen. Es wird daher erwartet, dass Blattschneiderameisen während der Abfallentsorgung bestimmte Präferenzen für ihre Umwelt zeigen. In Experimenten präferierten Arbeiterinnen von Atta laevigata eine warme und trockene Umgebung, zeigten jedoch keinerlei Präferenz für die CO2 Konzentration ihrer Umgebung. Die kontinuierliche Anhäufung von Abfallpartikeln in einer Abfallkammer scheint auf der Wahrnehmung von Volatilen zu basieren. Diese scheinen vom Abfall selbst auszugehen und zur Orientierung der abfalltragenden Arbeiterinnen zu dienen. Die darauf erfolgende Anhäufung von Abfall an einem Ort sollte zur Entstehung von großvolumigen Kammern zur Abfallentsorgung führen. KW - Nestbau KW - nest building KW - self-organization KW - leaf-cutting ant KW - environmental cues KW - symbiotic fungus KW - Blattschneiderameisen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109409 ER - TY - THES A1 - Pfister, Heiko T1 - Wegener'sche Granulomatose T1 - Wegener's granulomatosis N2 - Die Wegener'sche Granulomatose (WG) ist eine Autoimmunerkrankung, die sich typischerweise als chronische Entzündung des oberen Respirationstraktes, Vaskulitis und Glomerulonephritis manifestiert. WG gehört zur Gruppe der sog. “pauci-immunen” Vaskulitiden, die mit Anti-Neutrophilen-Antikörpern (ANCA, anti neutrophil cytoplasmic antibody) assoziiert sind. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz lassen sich ANCA im Serum der meisten WG-Patienten nachweisen. Die mit WG assoziierten sog. “klassischen” ANCA (c-ANCA) erkennen spezifisch Konformationsepitope der Serinprotease Proteinase 3 (PR3), die in den azurophilen Granula neutrophiler Granulozyten gespeichert wird. Die enge Korrelation PR3-spezifischer Antikörperspiegel mit dem Krankheitsverlauf läßt vermuten, daß sie bei der Pathogenese eine zentrale Rolle spielen könnten. Diese Hypothese wird von Daten aus in vitro Experimenten gestützt: werden Zytokin-stimulierte neutrophile Granulozyten mit Patientenserum oder isolierten c-ANCA inkubiert, erfolgt eine Aktivierung der Neutrophilen, die sich durch Degranulation und Freisetzung von Sauerstoffradikalen äußert. c-ANCA können so indirekt - aber vermutlich auch direkt - zur Endothelschädigung beitragen. Jedoch konnte bisher kein direkter Beweis des pathogenen Potentials von c-ANCA am Tiermodell erbracht werden. Um die Wirkung von c-ANCA an einem Mausmodell zu testen, war zunächst ein murines Maus-PR3- (mPR3) spezifisches Antiserum notwendig. Da humane c-ANCA nicht mit mPR3 kreuzreagieren, wurde für die Immunisierung von PR3/Neutrophilen-Elastase (NE)-defizienten Mäusen ein mPR3-Zymogen rekombinant in E. coli als Einschlußkörpermaterial (IB, inclusion bodies) hergestellt. Nach Renaturierung des IB-Materials in vitro wurde mit der Dipeptidylaminopeptidase Cathepsin C das N-terminale Propeptid abgespalten. Das gewonnene Enzym besaß die für PR3 und NE spezifische katalytische Aktivität, die durch den physiologischen Inhibitor humaner PR3, a1-Antitrypsin, inhibiert werden konnte. Es ist daher anzunehmen, daß das gewonnene rekombinante Material die korrekte Konformation durch Renaturierung in vitro erhalten hatte. Um nun die pathologische Wirkung von Anti-rmPR3-Antikörpern zu testen, wurden PR3/NE-defiziente Mäuse mit dem rekombinanten Zymogen (pro-rmPR3) oder der N-terminal prozessierten Form (rmPR3) immunisiert. Die Spezifität der gewonnenen Antiseren wurde durch Festphasenimmunoassay, Western Blotting und indirekte Immunfluoreszenzfärbung überprüft. Weiterhin konnte fluoreszenzzytometrisch die Bindung von Anti-mPR3-IgG an die Plasmamembran Zytokin-stimulierter Granulozyten nachgewiesen werden. Die hergestellten Antiseren erfüllten somit die für c-ANCA-positive Seren von WG-Patienten typischen Eigenschaften hinsichtlich der Antigenspezifität. Wenn c-ANCA alleine hinreichend für die Induktion der für WG charakteristischen Symptome sind, sollte der Antiserumtransfer auf Wildtyp-Mäuse WG-ähnliche Symptome in den Rezipienten hervorrufen. Nach wiederholter intravenöser Injektion von Serum pro-rmPR3-immunisierter Mäuse ließ sich ein signifikanter Antikörperspiegel bei Verdünnungen von 1:2000 über den gesamten Behandlungszeitraum von 10 Wochen in den Rezipienten nachweisen. Der anschließende histologische Befund von Niere und Lunge ergab jedoch keine pathologischen Veränderungen. Dieses Ergebnis legt nahe, daß c-ANCA alleine keine Krankheitssymptome hervorrufen. In dem gegenwärtigen Modell für c-ANCA-vermittelte Vaskulitis entfaltet sich die pathogene Wirkung von c-ANCA vor allem dann, wenn neutrophile Granulozyten zusätzlich durch proinflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor alpha (TNF alpha) stimuliert werden. Erst die Stimulation der Granulozyten ermöglicht die Bindung von c-ANCA an die Plasmamembran und deren anschließende Aktivierung. Deshalb wurde dieses Modell, das vorwiegend aus Ergebnissen von Experimenten in vitro abgeleitet ist, auf ein lokales Entzündungsmodell der Maus übertragen: Durch wiederholte Injektion von TNF alpha in die Haut wurde eine leichte Entzündungsreaktion ausgelöst. Diese Entzündungsreaktion ließ sich schließlich durch intravenöse Verabreichung von pro-rmPR3- oder rmPR3-Antiserum verstärken. Dieser Befund ist ein wichtiger Beweis für die verbreitete Ansicht, daß c-ANCA nicht nur ein Epihänomen der WG darstellen, sondern selbst ein pathogenes Potential besitzen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Serinproteasen NE und PR3 an der Entstehung inflammatorischer Prozesse untersucht. Im Hinblick auf die bei der Pathogenese der WG beteiligten Mechanismen könnten PR3 und NE eine wichtige Rolle spielen. PR3 und NE können Proteine der extrazellulären Matrix abbauen, Apoptose in Endothelzellen induzieren und sind an der Regulation entzündlicher Prozesse über verschiedene Wirkmechanismen beteiligt. Um quantitative Unterschiede bei Entzündungsreaktionen zwischen NE/PR3-defizienten Mäusen und kongenen Wildtyp-Tieren zu untersuchen, wurde als Modell einer Typ III Hypersensitivitätsreaktion eine lokale passive Arthus-Reaktion induziert. Wildtyp-Mäuse entwickelten dabei eine deutlich stärkere lokale Entzündung als NE/PR3-defiziente Mäuse. Weitere Studien sind nötig um die Frage zu klären, ob eine der beiden Serinproteasen alleine oder in Kooperation mit der anderen diesen Phänotyp hervorruft. Für einen direkten synergistischen Effekt sprechen indes die Ergebnisse eines in vitro Experiments mit pro-rmPR3 und humaner NE: Bei Inkubation von pro-rmPR3 mit hNE wurde eine Spaltung des Proenzyms beobachtet, die mit einer Verstärkung der enzymatischen Bruttoaktivität einherging. Die physiologische Relevanz dieser Beobachtung muß allerdings noch geklärt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stehen im Einklang mit den neuesten Erkenntnissen über die Rolle der PR3 bei der Wegener’schen Granulomatose: PR3 dürfte sowohl aufgrund pleiotroper Effekte auf entzündliche Reaktionen als auch wegen seiner lytischen Eigenschaften zur Gewebeschädigung beitragen. Darüberhinaus konnte eine pathogene Wirkung von mPR3-spezifischen Antikörpern in der Maus nachgewiesen werden. N2 - Wegener's granulomatosis (WG) is an autoimmune disorder typically characterized by chronic inflammmation of the upper respiratory tract, vasculitis and glomerulonephritis. WG belongs to the group of anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody (ANCA) associated vasculitides with no or very few immune complex deposits (“pauci-immune”) in affected organs. “Classic” ANCA (c-ANCA) that produce a cytoplasmic staining pattern on neutrophils are a specific seromarker for this disease entity. They recognize conformational epitopes of proteinase 3 (PR3) from azurophil granules of neutrophil granulocytes. The correlation of PR3-specific antibody titers and disease course suggests that they are an important pathogenic factor for this autoimmune disease. The hypothesis is supported by in vitro experiments demonstrating an interaction of c-ANCA with cytokine primed neutrophils resulting in full activation manifested by degranulation and respiratory burst. It has been shown that c-ANCA can also directly induce the loss of endothelial barrier functions. However, direct evidence for the pathogenic potential of c-ANCA in vivo has not been published yet. The central aim of this study is to clarify the role of c-ANCA in WG. Since antibodies directed against human PR3 do not crossreact with the murine homolog, mPR3-specific antibodies were necessary to provide direct proof for c-ANCA mediated tisssue damage in a murine disease model. Hence, sufficient amounts of recombinant murine PR3 (mPR3) were necessary to generate mPR3 specific murine antibodies. Several attempts have been made to produce recombinant PR3 in prokaryotic and eukaryotic host systems. But conformational epitopes recognized by c-ANCA are not well preserved on recombinant PR3 derived from E. coli, P. pastoris, or baculovirus-infected insect cells described in the literature so far. While recombinant human PR3 expressed in eukaryotes is well recognized by c-ANCA, the yield of both active human and murine PR3 generated in eukaryotic expression systems is very low. To obtain sufficient amounts of correctly folded recombinant murine proteinase 3 (rmPR3) for multiple immunizations of PR3/NE-deficient mice, rmPR3 was produced as inclusion body material in E. coli as a catalytically inactive precursor molecule. After in vitro refolding the N-terminal propeptide was removed by limited proteolysis with the dipeptidylaminopeptidase cathepsin C yielding catalytically active enzyme. Due to its catalytic activity that could be inhibited by the physiologic inhibitor of human PR3, α1-antitrypsin, but not by secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI), the recombinant material was assumed to harbour the correct conformation after refolding. To test, if anti-rmPR3 antibodies were sufficient to induce symptoms characteristic for WG, anti-PR3 antiserum was generated by immunization of PR3/neutrophil elastase (NE)-deficient mice with recombinant, refolded mPR3 or its zymogen. Specificity of the obtained sera was confirmed by ELISA, Western Blotting and indirect immunofluorescence. Moreover, antisera bound to the membranes of primed murine neutrophils as determined by flow cytometry. The generated antisera thus fulfilled the criteria defining c-ANCA positive sera of WG patients with respect to antigen specificity. If anti-PR3 antibodies are sufficient to induce symptoms characteristic for WG, transfer of antiserum to wildtype mice should induce vasculitis and/or glomerulonephritis. By repetitive intravenous injection of antiserum from immunized mice a persisting antibody titer was generated in naïve wild type mice over a treatment period of 10 weeks. Lung and kidney of these mice were analyzed histologically but neither granuloma or vasculitis were found in the lungs nor glomerulonephritis or vasculitis was observed in the kidneys. This result suggests that c-ANCA alone are not sufficient to induce WG symptoms in the mouse. Our initial observations were not surprising since the current hypothetical concept of c-ANCA-induced vasculitis implies that a primary inflammatory stimulus provided by cytokines like TNF alpha is required for the target antigen to be expressed on the plasma membrane of neutrophils. Exposure of the target antigen enables the binding of c-ANCA and subsequently triggers neutrophil activation. Consequently, this model, that was primarily deduced from in vitro experiments, was adapted to a model of local inflammation in the mouse: A mild inflammation was induced by repetitive local injection of TNF alpha into the skin. This inflammatory reaction increased significantly in the presence of rmPR3-antibodies. Our experimental data thus confirm the current concept that ascribes a pathogenic potential to c-ANCA. A second aspect adressed in this work is the contribution of the two neutrophil serine proteases NE and PR3 to the generation of inflammatory processes. With respect to the mechanisms involved in the pathogenesis of WG, NE and PR3 may be of particular importance due to their ability to degrade extracellular matrix proteins, induction of apoptosis in endothelial cells, and the regulation of inflammatory processes by a variety of mechanisms. A local reverse passive Arthus reaction (RPA) was chosen as a model of a type III hypersensitivity reaction to reveal quantitative differences of inflammation in PR3/NE-deficient mice and congenic wild type mice. Wild type mice reacted significantly stronger than PR3/NE-deficient mice as determined by examination of local edema and hemorrhage intensity. It remains to be determined if the observed phenotype in vivo reveals a concerted effect of both serine proteases or if deficiency of one of the proteases alone accounts already for this phenotype. Experimental data presented in this work are consistent with the hypothesis that PR3 and NE may directly interact: When recombinant mPR3 was incubated with hNE, a cleavage of rmPR3 was observed that is apparently associated with changes in enzymatic activity. The physiologic relevance of this finding has to be defined in further studies. In summary, this work adds to the current understanding of the role of PR3 in WG: PR3 is not only the relevant autoantigen whose interaction with c-ANCA contributes to the fatal outcome of the disease but also contributes together with neutrophil elastase to tissue damage by its lytic activity and pleiotropic effects on inflammatory reactions. KW - Granuloma gangraenescens KW - Leukozytenelastase KW - Autoantikörper KW - Neutrophiler Granulozyt KW - Wegener'sche Granulomatose KW - Proteinase 3 KW - Serinprotease KW - vasculitis KW - ANCA KW - rekombinante Proteinexpression KW - Autoimmunität KW - Wegener's granulomatosis KW - Proteinase 3 KW - serine protease KW - vasculitis KW - ANCA KW - recombinant protein expression KW - autoimmunity Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3133 ER - TY - THES A1 - Andronic, Joseph T1 - Volumenregulatorische Transportwege von anorganischen und organischen Osmolyten in Säugetierzellen T1 - Volume ragulatory pathways of anorganic and organic osmolytes in mammalian cells N2 - Die Aufrechterhaltung des Zellvolumens unter variablen osmotischen Bedingungen stellt für nahezu alle tierischen Zellen eine essenzielle Aufgabe dar. Um regulatorische Volumenanpassungen vorzunehmen besitzen sie daher effektive Mechanismen, mit deren Hilfe der zelluläre Gehalt an organischen und anorganischen Osmolyten erhöht (= regulatorische Volumenzunahme; RVI) oder gesenkt (= regulatorische Volumenabnahme; RVD) werden kann. Trotz langjähriger Forschung auf diesem Gebiet konnten die hieran beteiligten Transportwege für Osmolyte bisher nur unvollständig aufgeklärt werden. Insbesondere bei T-Lymphozyten sind wichtige Zellfunktionen wie die Proliferation, Migration und die T-Zell-Aktivierung eng mit volumenregulatorischen Mechanismen verbunden. Bei all diesen Prozessen sind u. a. unterschiedliche Kaliumkanäle beteiligt, die insbesondere für die pharmakologische Manipulation von Immunsystemprozessen von wissenschaftlichem Interesse sind. Bisherige Modelle der hypotonen Volumenregulation von T-Lymphozyten berücksichtigen lediglich den spannungsabhängigen KV1.3 sowie den Ca2+-aktivierten IKCa1-Kanal, die zur Klasse der 6TM/P-K+-Kanäle gehören. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine potentielle Rolle von kürzlich entdeckten Zwei-Poren Domänen Kaliumkanälen (K2P) am RVD von murinen und humanen primären CD4+-T-Lymphozyten untersucht. In einem kombinierten genetischen und pharmakologischen Ansatz mittels knockout-Tiermodellen und dem Einsatz kanalspezifischer Inhibitoren konnte mithilfe zellvolumetrischer Analysen gezeigt werden, dass die K2P-Vertreter TASK1, TASK2, TASK3 und TRESK maßgeblich am schwellungsaktivierten Efflux von K+ beteiligt sind. Beurteilt an den Ergebnissen dieser Untersuchung sind der spannungsabhängige TASK2- und der Ca2+-aktivierte TRESK-Kanal für die hypotone Volumenregulation in T-Zellen deutlich bedeutender als TASK1 und TASK3. Der Beitrag der Kanäle TASK2 und TRESK am RVD-Prozess war über dies vergleichbar mit dessen des bisher bekannten KV1.3-Kanals. In dieser Arbeit wurde damit erstmals eine Beteiligung der K2P-Kanäle am RVD muriner und humaner CD4+-Lymphozyten identifiziert. Aufgrund der engen Verbindung zwischen T-Zell-Funktion und der Volumenregulation können Zwei-Poren Domänen K+-Kanäle damit in den engeren Kreis potentieller immunmodulierende Angriffspunkte aufgefasst werden. Im zweiten und umfangreicheren Teil dieser Arbeit wurden darüber hinaus die schwellungsaktivierten Transportwege für organische Osmolyte (small organic osmolytes; SOOs) untersucht. SOOs stellen chemisch inerte Verbindungen dar, zu denen vor allem Polyole (Sorbitol, myo-Inositol), Methylamine (Betain, α-Glycerophosphocholin) sowie Aminosäuren (α- bzw. β-Alanin und Prolin) und deren Derivate (Taurin) zählen. Da SOOs weder die zelluläre Struktur noch die Funktion von Makromolekülen beeinträchtigen, sind sie wichtige Instrumente der Volumenregulation, die sich in hohen Konzentrationen im Zytosol nahezu aller Zellen wiederfinden. Werden tierische Zellen mit hypotonen Bedingungen konfrontiert, dann ist bei nahezu allen Zellen die Freisetzung organischer Osmolyte zu beobachten, wodurch die zelluläre Osmolarität unabhängig von Elektrolyten angepasst werden kann. Trotz der wichtigen Funktion der SOOs in der Osmoregulation tierischer Zellen konnte die molekulare Identität beteiligter Effluxwege (Kanäle bzw. Transporter) bisher nicht aufgeklärt werden. Ungeachtet der molekularen Identität der SOO-Effluxwege war es aus zahlreichen biotechnologischen Anwendungen zu Beginn dieser Arbeit bekannt, dass die schwellungsaktivierten Transportwege für organische Osmolyte eine größenselektive Permeabilität für eine Reihe monomerer Zucker und verwandter Verbindungen aufweisen. Um diese Größenselektivität näher zu charakterisieren, wurde im ersten Schritt die schwellungsaktivierte Membranpermeabilität für eine Reihe strukturell homogener Polyethylenglykole unterschiedlicher Polymerlänge (PEG200–1500; hydrodynamische Radien zwischen ~0,5-1,5 nm) unter iso- und hypotonen Bedingungen in Jurkat-Lymphozyten untersucht. Unter milden hypotonen Bedingungen (200 mOsm) war die Plasmamembran der untersuchten Lymphozyten für PEG300-1500 undurchlässig, was aus der Fähigkeit der Zellen zur hypotonen Volumenregulation geschlossen werden konnte. Darüber hinaus wurde RVD in stark hypotonen Lösungen (100 mOsm) mit PEG600-1500 beobachtet, während PEG300-400 unter vergleichbaren osmotischen Bedingungen die Volumenregulation der Zellen inhibierten. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass starkes hypotones Zellschwellen der Lymphozyten zur Permeabilisierung der Plasmamembran für PEG300-400, nicht jedoch für PEG600-1500, führt. Anhand der hydrodynamischen Radien Rh der verwendeten PEGs konnte ein cutoff-Radius von ~0,74 nm für schwellungsaktivierte Transportwege organischer Osmolyte bestimmt werden. Da diese schwellungsaktivierten Transportwege vielfältig für Zellbeladungstechniken verwendet werden, könnte dieses Ergebnis für zahlreiche biotechnologische und biomedizinische Anwendungen von Interesse sein. Im zweiten Schritt wurde der Versuch unternommen, potentielle Transportwege für organische Osmolyte im RVD-Prozess molekular zu identifizieren. Da es grundlegend ungeklärt war, wie viele unterschiedliche Transporter bzw. Kanäle am Efflux der zahlreichen organischen Osmolyte beteiligt sind, erfolgte zunächst die vergleichende Analyse des schwellungsaktivierten Membrantransports strukturell verschiedener SOOs einschließlich der Aminosulfonsäure Taurin und des Polyols myo-Inositol. Hierbei wurde erstmals gezeigt, dass die schwellungsaktivierten Transportwege für Taurin und myo-Inositol deutlich unterschiedliche Aktivitätsprofile aufweisen. Während der Taurintransport bereits unter milden hypotonen Bedingungen, d.h. nach einer geringen Absenkung der Osmolalität von 300 auf ~230 mOsm, aktiviert wurde, erfolgte die Aktivierung der Membranpermeabilität für myo-Inositol bei einer viel niedrigeren Osmolalität von ~150 mOsm. Darüber hinaus wiesen die beiden Transportwege unter vergleichbarem hypotonen Stress von 100 mOsm deutlich unterschiedliche Aktivitätsdauern auf (Transport von Taurin ~95 min und myo-Inositol ~40 min). Somit deuteten diese Ergebnisse erstmals auf substrat-spezifische Transportwege für SOOs hin, die voneinander stark abweichende osmotische Aktivierungsprofile besitzen. Als aussichtsreiche Kandidaten für diese Transportwege wurden zwei Mitglieder der Gruppe der Solute Carrier (SLC) untersucht, die klare Übereinstimmungen mit den gesuchten Transportern für SOOs aufweisen. Daher wurde im Weiteren eine RVD-Beteiligung dieser Transportergruppe mit einer Kombination aus molekularbiologischer und konventioneller bzw. hochaufgelöster mikroskopischen Techniken überprüft. Die semiqantitativen RT-PCR-Ergebnisse dieser Arbeit zeigen dabei, dass die Gentranskription der potentiellen SOO-Transporter SLC5A3 und SLC6A6 in den untersuchten Zelllinien Jurkat, HEK wie auch HepG2-Zellen durch hypotone Bedingungen deutlich verstärkt wird. Hierbei nimmt der zelluläre mRNA-Gehalt der Gene SLC5A3 zwischen 20-60% und SLC6A6 um 30-100% innerhalb von 10-20 min zu, was auf eine potentielle RVD-Beteiligung von SLC-Transportern hindeutet. Ausgehend von diesem Ergebnis wurde daraufhin die zelluläre Lokalisation des SLC5A3-Transporters unter isotonen und hypotonen Bedingungen mikroskopisch untersucht. Wie anhand der konfokalen lasermikroskopischen Untersuchung zu erkennen ist, findet unter hypotoner Stimulation eine zelluläre Umverteilung des mit EGFP fluoreszenzmarkierten Proteins SLC5A3 statt. Innerhalb von 10 min wird der Transporter dabei von intrazellulären Regionen in Richtung Plasmamembran verlagert. Darüber hinaus konnte mit Hilfe der hochauflösenden Mikroskopie-Technik dSTORM gezeigt werden, dass der Transporter SLC5A3 unter hypotoner Stimulation verstärkt mit der Plasmamembran assoziiert vorliegt. Diese verstärkte Membranassoziation des SLC5A3-Proteins deutet damit auf einen schwellungsinduzierten exozytotischen Einbau des Transporters hin. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen damit erstmals, dass SLC-Transporter wie SLC5A3, SLC6A6 und vermutlich andere Vertreter der SLC-Superfamilie potentiell am Mechanismus der hypotonen Volumenregulation beteiligt sind. Da SLC-Transporter als wichtige Transportsysteme für Therapeutika angesehen werden und die Mechanismen der Volumenregulation bereits in zahlreichen biotechnologischen Anwendungen implementiert sind, könnte der hier aufgedeckte Zusammenhang einen Erkenntnisgewinn für zahlreiche biomedizinische Forschungsgebiete darstellen. N2 - Cell volume homeostasis is critically important for the functional and structural integrity of mammalian cells. To counteract osmotically induced volume perturbations, cells possess efficient mechanisms that control the intracellular osmolyte composition. The volume regulatory mechanisms operating under hyper- and hypotonic conditions are known, respectively, as regulatory volume increase (RVI) and decrease (RVD). During both, RVI and RVD, cells adjust the cellular content of inorganic ions (most notably Na+, K+ and Cl-) and organic solutes in order to gain or lose osmotically obligated water. These mechanisms counteract osmotic cell damage and enable the adaptation of cells to a wide range of extracellular osmolarities. Despite decades of research in this field, many aspects of the mechanisms underlying RVD and RVI remain poorly understood. In case of T lymphocytes, various cellular functions, including proliferation, migration and T cell activation are closely associated with the cell volume regulatory machinery. Among other mechanisms, all these processes are tightly linked by a network of potassium channels. The identification of this network is of great biomedical interest as it provides a key to pharmacological manipulation of the immune system. Current models of hypotonic volume regulation (RVD) in T-lymphocytes consider primarily the voltage-gated KV1.3 and the calcium-activated IKCa1 channel. The first part of this thesis explores the potential role of two-pore domain (K2P) potassium channels in RVD in murine and human primary CD4+-T lymphocytes. Using a combined genetic and pharmacological approach, time-resolved cell volume analysis revealed an important role of the K2P channels TASK1, TASK2, TASK3 and TRESK in swelling activated K+ efflux from hypotonically swollen T cells. Based on the analysis carried out here, the voltage-gated TASK2 as well as the calcium-activated TRESK channel were found as the most important K2P channels involved in the RVD of both naïve and stimulated T cells. The importance of TASK2 and TRESK in the RVD process was comparable to that of KV1.3. In summary, the data provide first evidence that hypotonic volume regulation of murine and human CD4+-T lymphocytes relies on K2P channels. With respect to the close relationship of T-cell function and volume regulatory mechanisms K2P channels may thus be considered as potential targets for immunomodulation. In the second and major part of this thesis, the swelling-activated transport pathways for small organic osmolytes (SOOs) were investigated. Nearly all eukaryotic cells possess a considerable reservoir of SOOs, such as polyols (e.g. sorbitol, myo-inositol), methylamines (e.g. betaine, α-glycerophosphoryl choline) and small amino acids (e.g. α-/β- alanine, proline and the derivate taurine), which are synthesized within the cells or accumulated from the extracellular medium. Since SOOs do not interfere with the integrity of macromolecules and the membrane potential, cells tolerate great cytosolic fluctuations of these solutes without negative effects on cellular structure or function. Due to these properties, small organic osmolytes are important tools for cell volume regulatory mechanisms, by which the intracellular osmolarity can be adjusted independently of electrolytes. Although the importance of SOOs for hypotonic volume regulation has been known for long time, the molecular identity of participating membrane efflux pathways is far from being clear. Regardless of the involved transporters, swelling-activated pathways have been reported to exhibit a size selective permeability for a wide range of sugars and related compounds. To gain a deeper insight into this issue, in a first step the impact of the molecular size on the permeation of low-molecular-weight polyethylene glycols (PEG200–1500) through the plasma membrane of Jurkat cells under iso- and hypotonic conditions was analyzed. Upon moderate swelling in slightly hypotonic solutions (200 mOsm), the lymphocyte membrane was found to remain impermeable to PEG300–1500, which allowed the cells to accomplish regulatory volume decrease. RVD also occurred in strongly hypotonic solutions (100 mOsm) of PEG600–1500, whereas 100 mOsm solutions of PEG300–400 inhibited RVD. These findings suggest that extensive hypotonic swelling rendered the cell membrane highly permeable to PEG300–400, but not to PEG600–1500. Using the values of hydrodynamic radii Rh for PEGs, the observed size-selectivity of membrane permeation yielded an estimate of ∼0.74 nm for the cut-off radius of the swelling-activated pathway for organic osmolytes. This result may be of interest for many biotechnological and biomedical applications, where swelling-activated SOO-pathways are widely used for cell-loading techniques. As a second step, an attempt was made to elucidate the molecular identity of transporters for organic osmolytes potentially involved in RVD. Since it was not clear whether RVD-related efflux of SOOs is mediated by one common or several distinct transporter(s), at first, the plasma membrane permeability profiles for two structurally dissimilar SOOs, including the amino sulfonic acid taurine and the polyol myo-inositol were analyzed. The results of the time resolved volumetric measurements clearly showed that the membrane permeability to taurine was activated upon moderate cell swelling (by ~15%) in mildly hypotonic solutions (~230 mOsm). In sharp contrast, the membrane permeability to myo-inositol was activated after a much larger swelling (~50%) in strongly hypotonic media (<150 mOsm). Moreover, the swelling-activated permittivity to taurine during RVD in 100 mOsm medium persisted for about twice as long as that for myo-inositol (taurine ~95 min, myo-inositol ~40 min). These findings clearly showed that, taurine and myo-inositol utilized separate, apparently substrate-specific pathways, which were activated at different hypotonic thresholds. Since many members of SLC-family proteins (Solute Carrier) are known for their substrate selectivity and also for their contribution to osmoregulatory mechanisms a participation of SLCs was investigated in the context of RVD. To this end, a combination of molecular biological (semiquantitative RT-PCR) and fluorescence microscopy techniques (confocal and super-resolution microscopy) was used. The semiquantitative RT-PCR data showed a transcriptional upregulation for the SLC proteins SLC5A3 (myo-inositol transporter; SMIT) and SLC6A6 (taurine transporter TauT) in hypotonically stressed Jurkat lymphocytes, HEK293, and HepG2 cells. In all three human cell lines strongly hypotonic solutions (100 mOsm) increased the mRNA level of the genes SLC5A3 and SLC6A6 between 20-60% and 30-100%, respectively, suggesting a potential participation of SLC transporters in RVD. In addition, confocal microscopy images clearly showed the intracellular displacement of EGFP-tagged SLC5A3 expressed in HEK293 cells following strongly hypotonic stress (100 mOsm). Within 10 min the fluorescence of EGFP was shifted from intracellular regions towards the plasma membrane. Furthermore, super-resolution microscopy by means of dSTORM revealed a considerably increased membrane association of SLC5A3 in strongly hypotonic stressed (100 mOsm) HEK293 and Jurkat cells. This finding suggests that SLC5A3 is integrated into the plasma membrane by swelling-induced exocytosis. Taken together, the results of this investigation provided first evidence that transporters such as SLC5A3, SLC6A6 and probably other SLC-proteins participate in the mechanism of hypotonic volume regulation. Due to the relevance of SLC-proteins as potential drug delivery systems the possible role of these transporters might be of great interest for many biomedical research areas. KW - Säugetiere KW - Osmoregulation KW - Zelle KW - Regulatory Volume Decrease KW - Transporter SLC5A3 KW - Transporter SLC6A6 KW - small organic osmolytes KW - Zwei-Poren Domänen Kaliumkanäle KW - two-pore domain potassium channels KW - Zellvolumen KW - Volumenregulation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103255 ER - TY - THES A1 - Ernst, Roman T1 - Visuelle Mustererkennung und Parameterextraktion bei Drosophila melanogaster T1 - Visual pattern recognition and parameter extraction in Drosophila melanogaster N2 - In operanten Konditionierungsexperimenten im Flugsimulator werden vier Parameter gefunden die Drosophila melanogaster aus visuellen Mustern extrahieren kann: Musterfläche, vertikale Position des Musterschwerpunkts, Verteiltheit und Musterausrichtung in horizontaler und vertikaler Richtung. Es ist nicht auszuschliessen, dass die Fliege weitere Musterparameter extrahieren kann. Spontane Musterpräferenzen und konditionierte Präferenzen zeigen unterschiedliche Zusammenhänge mit den Musterparametern. Aus räumlich getrennten Musterelementen zusammengesetzte Muster werden von der Fliege wie ein Gesamtmuster behandelt. Retinaler Transfer wird auch bei der Präsentation von Mustern an zwei verschiedenen vertikalen Trainingspositionen nicht beobachtet. Muster werden generalisiert, wenn die Schwerpunkte korrespondierender Muster zwischen Training und Test ungefähr an der gleichen Position liegen aber keine retinale Überlappung von Trainings- und Testmustern besteht. Retinotopie des Mustergedächtnisses liegt in diesem Fall nicht auf der Ebene der Bildpunkte, jedoch möglicherweise auf der Ebene des Parameters 'Musterschwerpunkt' vor. Fliegen können nicht trainiert werden bestimmte Musterpaare zu diskriminieren die sich nur durch die vertikale Position ihres Musterschwerpunktes unterscheiden. Dennoch bevorzugen sie beim Lerntest mit anderen Mustern mit korrespondierenden Schwerpunktspositionen die zuvor nicht bestrafte Schwerpunktsposition. Für die Modellierung der Extraktion von Musterschwerpunkt und Musterfläche wird ein einfaches künstliches neuronales Filter präsentiert, dessen Architektur auf einem Berechnungsalgorithmus für den gemeinsamen Schwerpunkt mehrerer Teilelemente beruht. N2 - The results of operant conditioning experiments at the flight simulator suggest that Drosophila melanogaster can extract four parameters from visual patterns: pattern area, vertical position of the center of gravity, separatedness and horizontal/vertical pattern orientation. It can not be excluded that the fly can extract additional parameters. Spontaneous pattern preferences and conditioned preferences show different relationships with pattern parameters. The fly treats separated pattern elements as a compound figure. Retinal transfer is not observed even when patterns are presented at two different vertical training positions. Patterns are generalized if the positions of the centers of gravity of corresponding patterns are retained between training and test although training and test patterns do not overlap retinally. In this case there is no retinotopy of pattern memory on the pixel level but possibly on the level of the pattern parameter 'center of gravity'. Flies can not be trained to discriminate certain patterns that differ only by the vertical position of their centers of gravity. However, when tested with different patterns with corresponding centers of gravity they prefer the previously unpunished position of the center of gravity. The extraction of center of gravity and pattern area are modelled with a simple artificial neuronal filter. The architecture of this filter is based on an algorithm for the computation of the common center of gravity of multiple elements. KW - Taufliege KW - Mustererkennung KW - Visuelle Wahrnehmung KW - visuelle Mustererkennung KW - Musterlernen KW - Parameterextraktion KW - Generalisierung KW - neuronales Filter KW - Drosophila melanogaster KW - visiual pattern recognition KW - pattern conditioning KW - parameter extraction KW - generalization KW - neuronal filter KW - Drosophila melanogaster Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1156 ER - TY - THES A1 - Völler, Thomas T1 - Visualisierung und Manipulation neuronaler Aktivitäten im Gehirn von Drosophila melanogaster T1 - Visualization and manipulation of neuronal activity in the brain of Drosophila melanogaster N2 - In dieser Arbeit wurden zwei Techniken zur Analyse der Funktion diverser Neuronen in Drosophila melanogaster angewendet. Im ersten Teil wurde mittels in-vivo Calcium Imaging Technik unter Verwendung des Calciumsensors Cameleon neuronale Aktivität entlang des olfaktorischen Signalweges registriert. Hierbei wurde die neuronale Repräsentation der Duftidentität und der Duftintensität untersucht. In Bezug auf diese Fragestellung wurde die Datenverarbeitung und Datenanalyse weiterentwickelt und standardisiert. Die Experimente führten zu dem Ergebnis, dass duftspezifische Aktivitätsmuster auf der Ebene des Antennallobus sehr gut unterscheidbar sind. Manche Aktivitätsmuster der präsentierten Düfte zeigten interessanterweise einen hohen Ähnlichkeitsgrad, wohingegen andere unähnlich waren. In höheren Gehirnzentren wie den Orten der terminalen Aborisationen der Projektionsneurone oder den Pilzkörper Kenyonzellen liegt eine starke Variabilität der duftevozierten Aktivitätsmuster vor, was generelle Interpretationen unmöglich macht und höchstens Vergleiche innerhalb eines Individuums zulässt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Calciumsignale in den Rezeptorneuronen sowie prä- und postsynaptisch in den Projektionsneuronen bei Erhöhung der Konzentration der verschiedenen präsentierten Düfte über einen Bereich von mindestens drei Größenordnungen ansteigen. In den Kenyonzellen des Pilzkörper-Calyx und der Pilzkörper-Loben ist diese Konzentrationsabhängigkeit weniger deutlich ausgeprägt und im Falle der Loben nur für bestimmte Düfte detektierbar. Eine Bestätigung des postulierten „sparsed code“ der Duftpräsentation in den Pilzkörpern konnte in dieser Arbeit nicht erbracht werden, was möglicherweise daran liegt, dass eine Einzelzellauflösung mit der verwendeten Technik nicht erreicht werden kann. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte durch die Nutzung des lichtabhängigen Kationenkanals Channelrhodopsin-2 der Frage nachgegangen werden, ob bestimmte modulatorische Neurone die verstärkenden Eigenschaften eines bestrafenden oder belohnenden Stimulus vermitteln. Die lichtinduzierte Aktivierung von Channelrhodopsin-2 exprimierenden dopaminergen Neuronen als Ersatz für einen aversiven Reiz führte bei einer olfaktorischen Konditionierung bei Larven zur Bildung eines aversiven assoziativen Gedächtnisses. Im Gegensatz dazu induzierte die Aktivierung von Channelrhodopsin-2 in oktopaminergen/tyraminergen Neuronen als Ersatz für einen appetitiven Reiz ein appetitives assoziatives Gedächtnis. Diese Ergebnisse zeigen, dass dopaminerge Neurone bei Larven aversives Duftlernen, oktopaminerge/tyraminerge Neurone dagegen appetitives Duftlernen induzieren. N2 - In this work two different techniques were used to determine the functions of various neurons in the brain of Drosophila melanogaster. First, by using in vivo calcium imaging and the calcium indicator cameleon odor-evoked neuronal activity was monitored along the olfactory pathway. How are odor identity and odor intensity represented in the fruit fly brain? To investigate this question we improved and standardized the data processing and data analysis. The experiments reveal that calcium activity patterns elicited by different odors are distinguishable in the antennal lobe. Interestingly, the patterns evoked by some odors show a high degree of similarity whereas those of other odors show less similarity in this analyzed neuropile. In higher brain centers like the region of the terminal aborizations of the projection neurons and the mushroom body Kenyon cells the odor evoked activity patterns are highly variable allowing no general interpretations but only comparison of patterns within fruit flies. Furthermore this work demonstrates an odor concentration dependent activity in the olfactory receptor neurons as well as pre- and postsynaptically in the projection neurons. In the Kenyon cells of the mushroom body calyx this concentration dependency is less clear and in the mushroom body lobes it seems that there is a concentration dependency only for specific odors. So far we have no evidence for the postulated so called “sparsed code” of odor representation in the mushroom body which might be due to limited resolution of the technique used in this work. In the second part of my work we used the light-dependent cation channel channelrhodopsin-2 and asked the question whether specific modulatory neurons mediate the reinforcing properties of a rewarding or punishing stimulus. Light-induced activation of dopaminergic neurons expressing channelrhodopsin-2 caused aversive associative memory formation in an aversiv olfactory conditioning paradigm for Drosophila larvae. Conversely, the artificial activation of octopaminergic/tyraminergic neurons by channelrhodopsin-2 induced appetitive associative memory. The conclusion is that dopaminergic neurons trigger aversive odor learning whereas octopaminergic/tyraminergic neurons trigger appetitive odor learning. KW - Taufliege KW - Calcium KW - Calciumkonzentration KW - Calcium-bindende Proteine KW - Klassische Konditionierung KW - Drosophila KW - in-vivo Calcium-Imaging KW - Cameleon KW - Channelrhodopsin KW - Light-activation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35589 ER - TY - THES A1 - Mauder, Norman T1 - Vergleichende Untersuchung der Internaline und PrfA-abhängigen Transkription in Listeria monocytogenes, L. ivanovii und L. seeligeri T1 - comparative study of internalins and PrfA-dependent transcription in Listeria monocytogenes, L. ivanovii and L. seeligeri N2 - Die Gattung Listeria umfasst sechs bekannte Arten ubiquitär vorkommender Gram-positiver, nicht sporulierender Stäbchenbakterien. Von diesen Spezies sind Listeria monocytogenes und L. ivanovii in der Lage bei Mensch und Tier das Krankheitsbild der Listeriose zu verursachen (Rocourt & Seeliger, 1985; Vázquez-Boland et al., 2001b; Weis & Seeliger, 1975), wobei L. ivanovii vorwiegend bei Tieren als Krankheitserreger vorkommt (Cummins et al., 1994; Hof & Hefner, 1988). L. monocytogenes gilt als wichtiges Modell für ein intrazelluläres Pathogen, das mit Hilfe seiner Internaline auch in nicht-professionelle Phagozyten invadieren (Gaillard et al., 1991; Lingnau et al., 1995) und sich dank einer Reihe weiterer Virulenzfaktoren im Zytoplasma vermehren, fortbewegen und Nachbarzellen infizieren kann (Tilney & Portnoy, 1989). Die beiden pathogenen Arten und das apathogene L. seeligeri besitzen eine als LIPI-1 bezeichnete Pathogenitätsinsel (Gouin et al., 1994; Kreft et al., 2002). Internalingene sind bei L. monocytogenes teilweise geclustert und bei L. ivanovii zu einem großen Teil in einer LIPI-2 genannten Pathogenitätsinsel organisiert (Domínguez-Bernal et al., 2006; Dramsi et al., 1997; Gaillard et al., 1991; Raffelsbauer et al., 1998). Die Expression vieler dieser Virulenzgene wird durch das zentrale Regulatorprotein PrfA gesteuert, dessen Gen prfA selbst Teil der LIPI-1 ist (Domínguez-Bernal et al., 2006; Leimeister-Wächter et al., 1990; Lingnau et al., 1995; Mengaud et al., 1991a). Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Internaline InlC, InlE, InlG und InlH von L. monocytogenes näher untersucht werden. Dazu wurden rekombinante His6-markierte Internaline aufgereinigt und polyklonale Antiseren gegen die Internaline A, B, E, G und H hergestellt. Darüber hinaus gelang die Herstellung zweier monoklonaler Antikörper gegen InlG. Obwohl die Antikörper gegen InlG und InlE ihre rekombinanten Antigene gut dekorieren, konnten mit ihnen keine Proteine in Zellwand- oder Überstandspräparaten von L. monocytogenes EGD und EGDe detektiert werden. Das Antiserum gegen InlH kreuzreagierte mit InlA und auch schwach mit anderen Internalinen. In Zellwandpräparaten von L. monocytogenes dekorierte es ein ~50 kDa schweres Protein, welches mit InlH identisch sein könnte. Es fehlt in inlG/H/E Deletionsmutanten und wird in einer inlA/B Deletionsmutante stärker exprimiert. Im Kulturüberstand ist es etwas schwerer, wie man es von einem Protein mit LPXTG Motiv erwartet, das nicht von Sortase (Bierne et al., 2002; Garandeau et al., 2002) prozessiert wurde. In L. monocytogenes EGDe wird dieses ~50 kDa Protein um ein bis zwei dekadische Größenordungen stärker exprimiert als in L. monocytogenes EGD. Die Expression des Proteins war bei 30 und 37 °C gleich stark und wurde nicht durch PrfA reguliert. In Zellwandpräparaten von L. ivanovii ATCC 19119 dekorierten die Seren gegen InlA und InlH ein Protein das in seiner Größe dem InlA von L. monocytogenes entspricht. Mit Hexosaminidase Assays zur Untersuchung von Zelladhärenz (nach Landegren, 1984) an rekombinante His6-markierte Internaline konnte keine Interaktion der Internaline InlE, InlG oder InlH mit Oberflächenfaktoren von Caco-2, HeLa oder HepG2 Zellen nachgewiesen werden, während Positivkontrollen mit InlA und InlB weitestgehend erwartungsgemäß ausfielen. InlC besitzt jedoch offenbar einen bisher noch nicht genauer identifizierten Rezeptor auf der Zelloberfläche. An InlC und EGF adhärierten Caco-2 Zellen stark wachstumsphasenabhängig und etwa tausendfach schwächer als an InlA. Die beste Bindung erfolgte bei semikonfluent gewachsenen Zellen, die am Vortag ausgesät wurden. Unter diesen Bedingungen war auch die von Bergmann et al. beobachtete unterstützende Wirkung von InlC auf die InlA-abhängige Invasion am größten (Bergmann et al., 2002). In dieser Arbeit wurden außerdem die Promotoren von Internalingenen aus L. ivanovii, sowie weitere Virulenzgene (plcA, hly, actA) der Spezies L. monocytogenes, L. ivanovii und L. seeligeri mit Hilfe eines zellfreien in vitro Transkriptionssystems (Lalic-Mülthaler et al., 2001) untersucht, um deren PrfA-Abhängigkeit und Aktivität unabhängig von physiologischen Faktoren analysieren zu können, da die PrfA-Aktivität in vivo pleiotrop reguliert wird (Dickneite et al., 1998; Ermolaeva et al., 2004; Milenbachs et al., 1997; Milenbachs Lukowiak et al., 2004; Renzoni et al., 1997; Ripio et al., 1996). Dafür wurde in dieser Arbeit RNA-Polymerase aus L. monocytogenes ΔprfA ΔsigB (Stritzker et al., 2005) isoliert. Gleichzeitig wurde die Aktivität von rekombinanten His6-markierten PrfA Proteinen untersucht. Dazu wurden die PrfA Proteine von L. monocytogenes (m-PrfA und hyperaktives m-PrfA* (Ripio et al., 1997b)), L. ivanovii (i-PrfA) und L. seeligeri (s-PrfA), so wie ein Hybridprotein (sm-PrfA) aufgereinigt. Das Hybridprotein sm-PrfA entspricht s-PrfA bis auf die letzten 38 Aminosäurereste, die durch jene von m-PrfA ersetzt wurden. ... N2 - The genus Listeria comprises six known species of ubiquitous Gram-positive, non-sporulating, rod-shaped bacteria. Of these species Listeria monocytogenes and L. ivanovii are able to cause the clinical picture of listeriosis in humans and animals (Rocourt & Seeliger, 1985; Vázquez-Boland et al., 2001b; Weis & Seeliger, 1975) with L. ivanovii predominantly occurring in animals (Cummins et al., 1994; Hof & Hefner, 1988). L. monocytogenes is considered as important model of an intracellular pathogen that can also invade non-professional phagocytes with the aid of internalins (Gaillard et al., 1991; Lingnau et al., 1995) and can multiply and spread due to a set of virulence factors (Tilney & Portnoy, 1989). The two pathogenic species and the apathogenic L. seeligeri possess a pathogenicity island termed LIPI-1 (Gouin et al., 1994; Kreft et al., 2002). In L. monocytogenes internalin genes are partially clustered and mainly form a pathogenicity island termed LIPI-2 in L. ivanovii (Domínguez-Bernal et al., 2006; Dramsi et al., 1997; Gaillard et al., 1991; Raffelsbauer et al., 1998). The expression of many virulence genes is controlled by the central regulatory protein PrfA which gene prfA is part of LIPI-1 (Domínguez-Bernal et al., 2006; Leimeister-Wächter et al., 1990; Lingnau et al., 1995; Mengaud et al., 1991a). In the context of this work the internalins InlC, InlE, InlG and InlH of L. monocytogenes should be further investigated. Therefore recombinant His6-tagged internalins were purified and polyclonal antisera against the internalins A, B, E, G and H were raised. In addition the creation of two monoclonal antibodies against InlG succeeded. While the antibodies against InlG and InlE decorated well their recombinant antigens, they could not detect proteins in cell wall preparations or culture supernatant of L. monocytogenes EGD and EGDe. The antiserum against InlH cross-reacted with InlA and weakly also with other internalins. In cell wall preparations of L. monocytogenes it decorated a ~50 kDa protein which could be identical with InlH. This protein is missing in inlG/H/E deletion mutants and is stronger expressed in inlA/B deletion mutants. It is slightly bigger in the supernatant as expected for a protein with LPXTG motif that was not processed by sortase (Bierne et al., 2002; Garandeau et al., 2002). In L. monocytogenes EGDe the ~50 kDa protein was expressed stronger than in L. monocytogenes EGD by two orders of magnitude. The expression of this protein was equal at 30 and 37 °C and was not regulated by PrfA. In cell wall preparations of L. ivanovii ATCC 19119 the antisera against InlA and InlH decorated a protein matching the size of InlA of L. monocytogenes. Hexosaminidase assays for analysis of cell adherence (after Landegren, 1984) with recombinant His6-tagged internalins showed no interaction of the internalins InlE, InlG or InlH with surface factors of Caco-2, HeLa or HepG2 cells while positive controls with InlA and InlB mainly resulted as expected. However InlC has a not yet identified receptor on the eukaryotic cell surface. Caco-2 cells adhered to InlC and EGF in a strongly growth phase dependent manner and roughly thousand fold weaklier then to InlA. Best binding was observed with semi confluent grown cells which were prepared one day before the assay. Under these conditions the supportive effect of InlC in InlA-dependent invasion reported by Bergmann et al. was also maximal (Bergmann et al., 2002). Furthermore in this work the promoters of internalin genes from L. ivanovii and other virulence genes (plcA, hly, actA) from the species L. monocytogenes, L. ivanovii and L. seeligeri were investigated with the aid of the cell free in vitro transcription assay (Lalic-Mülthaler et al., 2001) to analyze their PrfA-dependency and activity independent of metabolic factors because PrfA activity is pleiotropicly regulated in vivo (Dickneite et al., 1998; Ermolaeva et al., 2004; Milenbachs et al., 1997; Milenbachs Lukowiak et al., 2004; Renzoni et al., 1997; Ripio et al., 1996). Therefore RNA polymerase from L. monocytogenes ΔprfA ΔsigB (Stritzker et al., 2005) was isolated in this work. Simultaneously the activity of recombinant His6-tagged PrfA proteins was investigated. For this purpose PrfA proteins of L. monocytogenes (m-PrfA and hyperactive m-PrfA* (Ripio et al., 1997b)), L. ivanovii (i-PrfA), L. seeligeri (s-PrfA) and the hybrid protein (sm-PrfA) were purified. The hybrid protein sm-PrfA corresponds to s-PrfA except for the last 38 amino acid residues which were substituted by those of m-PrfA. ... KW - Listeria KW - Virulenz KW - Internaline KW - Transkription KW - Listeria KW - Internaline KW - PrfA KW - Transkription KW - Listeria KW - internalins KW - PrfA KW - transcription Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21659 ER - TY - THES A1 - Schneider, Felicitas Maria Hannelore T1 - Vergleichende Evaluierung verschiedener Ansätze des Memory Enhancement bei neurodegenerativen Prozessen T1 - Comparative evaluation of different approaches of memory enhancement in neurodegenerative disease N2 - Angesichts des dramatischen, weltweiten Anstiegs der Prävalenz von Demenzerkrankungen und der aktuellen, unzureichenden Therapieansätze ist die Bereitstellung neuer, wirkungsvoller Behandlungsoptionen von größter Bedeutung. Technologische, pharmakologische und verhaltensbasierte Verfahren des Memory Enhancement könnten zur Lösung dieses Problems beitragen: Hierzu zählt die Stammzelltransplantation, die in mehreren Tierstudien zu einer Verbesserung der Gedächtnisfunktion führte. Zudem wird seit Längerem an einer Impfung gegen die Alzheimer-Krankheit mittels β-Amyloid-Antikörpern geforscht. Ein weiterer therapeutischer Ansatz für die Alzheimer-Krankheit besteht in der optogenetischen Stimulation spezifischer hippocampaler Engramm-Zellen, durch die bei einem Maus-Modell verloren gegangene Erinnerungen wiederhergestellt werden konnten. Unkonventionelle Pharmazeutika wie Erythropoetin führten in Tierstudien und bei Patienten mit neuropsychiatrischen Erkrankungen zu einer Verbesserung der kognitiven Fähigkeiten und des Gedächtnisses. Eine Modifikation der Ernährung und der Einsatz von Pro- und Präbiotika beeinflussen das Gedächtnis über eine Manipulation der Darm-Hirn-Achse. Verhaltensbasierte Maßnahmen wie körperliche Aktivität und der Einsatz von Mnemotechniken stellen effektive Ansätze des Memory Enhancement dar, welche bereits heute von gesunden Individuen implementiert werden können. Für die Anwendung von Augmented Reality (AR) konnten kognitionsfördernde Wirkungen beim Lernen neuroanatomischer Themen und dem Zusammenbau von Objekten nachgewiesen werden. Besonders vielversprechend stellt sich die Entwicklung einer Gedächtnisprothese dar, durch die vergessene Informationen bei Personen mit stattgehabtem Schädel-Hirn-Trauma und apoplektischem Insult reaktiviert werden könnten. Memory Enhancement ist prinzipiell bereits heute bei gesunden und kranken Individuen anwendbar und verspricht wirksame zukünftige Präventions- und Therapieoptionen. Ein realer Einsatz in der klinischen Praxis ist in naher Zukunft jedoch noch nicht zu erwarten. N2 - Due to the worldwide increasing prevalence of dementia and the current, inadequate therapeutic approaches, it is very important to develop new, effective treatment options. Technological, pharmacological and behavior-based methods of memory enhancement could help to solve this problem: This includes stem cell transplantation, which has led to an improvement in memory function in several animal studies. In addition, research into vaccination against Alzheimer's disease using β-amyloid antibodies has been done for several years. Another therapeutic approach for Alzheimer's disease is the optogenetic stimulation of specific hippocampal engram cells, through which lost memories could be restored in a mouse model. Unconventional pharmaceuticals such as erythropoietin have improved cognitive skills and memory in animal studies and in patients with neuropsychiatric disorders. A diet modification and the use of probiotics and prebiotics affect memory by manipulating the gut-brain axis. Behavioral approaches such as physical activity and the use of mnemonics represent effective approaches of memory enhancement that healthy individuals can already implement today. The application of augmented reality (AR) was associated to cognition-promoting effects when learning neuroanatomical topics and assembling objects. The development of a memory prosthesis seems to be particularly promising and could be used to reactivate forgotten information in people with traumatic brain injury and apoplectic insult. In principle, memory enhancement can already be used today in healthy and diseased individuals and promises effective future prevention and therapy options. However, a real use in clinical practice cannot be expected in the near future. KW - Neurodegeneration KW - Langzeitgedächtnis KW - Alzheimerkrankheit KW - memory enhancement KW - neuroenhancement Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207562 ER - TY - THES A1 - Karkazis, Andreas T1 - Vergleich von sozialrechtlichen Gestaltungsmöglichkeiten der medizinischen Versorgung in der Humangenetik an der Universität Würzburg durch das SGB V / 2004 T1 - Comparison of different scopes of design in medical sercice in the field of Human Genetics according to Health Care legislation N2 - „Die berufspolitische Situation für die Humangenetischen Institute hat sich an den Universitäten in den letzten zwei Jahren leider nicht verbessert. Vielen Instituten wurde der Zugang zur Erbringung von Kassenleistungen deutlich erschwert bzw. gänzlich entzogen.“ (Grimm, T.; Zerres, K., 2005, S. 41). Eine Analyse der Rechtsform und Aufbauorganisation sowie der Leistungen des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg kann als Grundlage dienen, um die Auswirkungen einer entzogenen Kassenzulassung besser verstehen zu können. Zudem ermöglicht eine solche Betrachtung die Ableitung von Erfordernissen, die eine optimale Rechtsform und Aufbauorganisation des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg erfüllen sollte. Zusammenfassend können dann die aktuellen und zukünftigen Rahmenbedingungen für die humangenetische Leistungserbringung bei bestehender Rechtsform und Aufbauorganisation beschrieben werden. Es wird deutlich, dass aufgrund eines drohenden Entzuges der Kassenzulassung eine Gefährdung der Erbringung humangenetischer Leistungen an der Universität Würzburg besteht. Die Finanzierung der erbrachten Leistungen in der Patientenversorgung wird zu ca. 75% von den gesetzlichen Krankenkassen getragen. Ein Wegbrechen eines solchen Leistungsumfanges hätte kaum kompensierbare Auswirkungen auf Forschung, Lehre, Weiterbildung und die Patientenversorgung an sich. Durch die Reformen des SGB aus dem Jahre 2004 sind verschiedene Alternativen zur bestehenden Rechtsform und Aufbauorganisation möglich geworden. Hierbei handelt es sich um Hochschulambulanzen (gem. §117 SGB V), Integrierte Versorgung (gem. §140 SGB V) und Medizinische Versorgungszentren (gem. §95 SGB V). Zudem gibt es die Möglichkeit einer „Praxis im Institut“-Kooperation. Diese Alternativen werden in der hier vorliegenden Arbeit kurz einzeln charakterisiert, um dann eine Bewertung der möglichen Rechtsformen und Aufbauorganisationen gemäß am Institut bestehender Erfordernisse zu ermöglichen. Die vergleichende Betrachtung wird zeigen, dass ein Medizinisches Versorgungszentrum (MVZ) eine gute Möglichkeit darstellt, die beschriebene Problematik zu lösen und die Erfordernisse des Instituts zu erfüllen. Im Anschluss werden die rechtlichen und organisatorischen Ausgestaltungsmöglichkeiten eines MVZs zur Erbringung humangenetischer Leistungen beleuchtet. Hierbei wird im Besonderen auf die gesetzlichen Gründungsvoraussetzungen eingegangen. Die Anforderungen an Gründer, Rechtsform, Leistungserbringer und ärztliche Leitung werden detailliert beschrieben, und die jeweiligen Gestaltungsmöglichkeiten im Hinblick auf die am Institut bestehenden Erfordernisse gewertet. Im Anschluss kann der Zulassungsprozess des MVZs an sich betrachtet werden. N2 - Comparison of different scopes of design in medical sercice in the field of Human Genetics according to Health Care legislation KW - Humangenetik KW - Humangenetik KW - Medizinisches Versorgungszentrum KW - Organisationsform KW - integrierte Versorgung Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34679 ER - TY - THES A1 - Huang, Ting T1 - Vaccinia Virus-mediated Therapy of Solid Tumor Xenografts: Intra-tumoral Delivery of Therapeutic Antibodies T1 - Vaccini-Virus-vermittelte Therapie solider Tumoren: Intra-tumoraler Transport therapeutischer Antikörper N2 - Over the past 30 years, much effort and financial support have been invested in the fight against cancer, yet cancer still represents the leading cause of death in the world. Conventional therapies for treatment of cancer are predominantly directed against tumor cells. Recently however, new treatments options have paid more attention to exploiting the advantage of targeting the tumor stroma instead. Vaccinia virus (VACV) has played an important role in human medicine since the 18th century as a vaccination against smallpox. In our laboratory, the recombinant, replication-competent vaccinia virus, GLV-1h68, was shown to enter, colonize and destroy cancer cells both in cell culture, and in vivo, in xenograft models (Zhang, Yu et al. 2007). In addition, combined therapy of GLV-1h68 and anti-VEGF immunotherapy significantly enhanced antitumor therapy in vivo (Frentzen, Yu et al. 2009). In this study, we constructed several new recombinant VACVs carrying genes encoding different antibodies against fibroblast activation protein (FAP) in stroma (GLV-1h282), nanobody against the extracellular domain of epidermal growth factor receptor (EGFR, GLV-1h442) or antibodies targeting both vascular endothelial growth factor (VEGF) and EGFR (GLV-1h444) or targeting both VEGF and FAP (GLV-1h446). The expression of the recombinant proteins was first verified using protein analytical methods, SDS-gel electrophoresis, Western blot analysis, immunoprecipitation (IP) assays and ELISA assays. The proteins were detected after infection of the cells with the different VACVs and the recombinant proteins purified by affinity adsorption. The purified antibodies were shown to specifically bind to their respective antigens. Secondly, the infection and replication capability of all the virus strains was analyzed in cell culture using several human tumor cell lines (A549, FaDu or DU145), revealing that all the new recombinant VACVs were able to infect cancer cells with comparable efficiency to the parental viruses from which they were derived. Thirdly, the antitumor efficacy of the new recombinant VACVs was evaluated in vivo using several human cancer xenograft models in mice. In A549 and DU145 xenografts, the new recombinant VACVs exhibited an enhanced therapeutic efficacy compared to GLV-1h68 with no change in toxicity in mice. In the FaDu xenograft, treatment with GLV-1h282 (anti-FAP) significantly slowed down the speed of tumor growth compared to GLV-1h68. Additionally, treatment with the recombinant VACVs expressed the various antibodies achieved comparable or superior therapeutic effects compared to treatment with a combination of GLV-1h68 and the commercial therapeutic antibodies, Avastin, Erbitux or both. Next, the virus distribution in tumors and organs of treated mice was evaluated. For most of the viruses, the virus titer in tumors was not signficantly diffferent than GLV-1h68. However, for animals treated with GLV-1h282, the virus titer in tumors was significantly higher than with GLV-1h68. This may be the reason for enhanced antitumor efficacy of GLV-1h282 in vivo. Lastly, the underlying mechanisms of therapeutic antibody-enhanced antitumor effects were investigated by immunohistochemistry. Blood vessels density and cell proliferation in tumors were suppressed after treatment with the antibody-encoded VACVs. The results indicated that the suppression of angiogenesis or cell proliferation in tumors may cause the observed therapeutic effect. In conclusion, the results of the studies presented here support the hypothesis that the treatment of solid tumors with a combination of oncolytic virotherapy and immunotherapy has an additive effect over each treatment alone. Moreover, expression of the immunotherapeutic antibody by the oncolytic VACV locally in the tumor enhances the antitumor effect over systemic treatment with the same antibody. Combined, these results indicate that therapy with oncolytic VACVs expressing-therapeutic antibodies may be a promising approach for the treatment of cancer. N2 - In den letzten 30 Jahren wurde viel Aufwand und finanzielle Unterstützung in den Kampf gegen Krebs investiert, doch das Resultat ist limitiert, da Krebs immer noch die zweithöchste Todesursache in der Welt darstellt. Zusätzlich zu gegenwärtig verwendeten Therapien, die vorwiegend gegen Tumorzellen gerichtet sind, wird neuen Therapien mehr Aufmerksamkeit gewidmet, die stattdessen direkt auf das Tumorstroma zielen. Onkolytische Vaccinia Viren haben seit dem 18ten Jahrhundert als Impfstoff gegen Pocken in der Humanmedizin eine wichtige Rolle gespielt. In unserem Labor hat das rekombinante, replikationskompetente Vaccinia Virus GLV-1h68 gezeigt, dass es in Zellkultur und in Xenograft Modellen in Krebszellen eindringen sowie diese kolonisieren und zerstören kann (Zhang, Yu et al. 2007). Zusätzlich verbessert die kombinierte Therapie von GLV-1h68 und anti-VEGF Immunotherapy signifikant die Antitumortherapie in vivo (Frentzen, Yu et al. 2009). In dieser Studie haben wir mehrere neue rekombinante VACVs konstruiert, die die Gene für verschiedene Antikörper gegen das Fibroblasten Aktivierungs Protein (FAP) im Stroma (GLV-1h282) oder einen Nanobody gegen die extrazelluläre Domäne des Epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR; GLV-1h442) kodieren. Ausserdem wurden Viren konstruiert, die eine Ko-Expression von Antikörpern gegen sowohl vaskulären Endothelwachstumsfaktor (VEGF) als auch EGFR (GLV-1h444) oder gegen sowohl VEGF als auch FAP (GLV-1h446) erlauben. Zunächst wurden SDS-Gelelektrophorese, Western Blot Analyse, Immunprezipitation (IP) und ELISA Assays durchgeführt, um die Expression der rekombinanten Proteine in Zellen mit proteinanalytischen Methoden zu untersuchen. Die Proteine waren nach Infektion der Zellen mit den verschiedenen VACVs nachweisbar und wurden mittles des FLAG Tags mit einem IP Kit aufgereinigt. Es konnte gezeigt werden, dass die aufgereinigten Antikörper spezifisch an ihr jeweiliges Antigen binden. Zweitens wurde die Infektion und Replikationsfähigkeit aller Virusstämme in Zellkultur untersucht (A549, FaDu oder DU145) und mit ihrem jeweiligen Ausgangsstamm GLV-1h68, GLV-1h164, GLV-1h282 oder GLV-1h442 verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass alle neuen rekombinanten VACVs Zellen mit vergleichbarer Effizienz infizieren konnten wie ihre Ausgangsstämme. Drittens, um die Antitumoreffizienz der neuen rekombinanten Stämme in vivo zu testen, wurden verschiedene humane Tumor Xenotransplantat-tragende Nacktmäuse mit verschiedenen VACVs behandelt. In A549 und DU145 Xenotransplantaten zeigten die neuen rekombinanten VACVs erhöhte therapeutische Effizienz verglichen mit dem Ausgangsstamm GLV-1h68, ohne Veränderung der Toxizität in Mäusen. Im FaDu Xenotransplantat verursachte die Behandlung mit GLV-1h68 keine Tumorregression, wohingegen die Behandlung mit GLV-1h282 (anti-FAP) die Geschwindigkeit des Tumorwachstums signifikant verlangsamte sowie das Überleben verlängerte. Zusätzlich haben wir herausgefunden, dass die Behandlung mit Antikörpern, die mittels Virus geliefert wurden, einen identischen oder sogar erhöhten inhibitorischen Effekt erzielen können, wie in einer Kombinationstherapie von GLV-1h68 und kommerziell erhältlichen Antikörpern, wie Avastin, Erbitux oder beidem. Um die virale Verteilung in vivo zu untersuchen, wurden Tumore und Organe von Mäusen seziert und homogenisiert, gefolgt von Titration der Virusmenge. Die Virus-Titer in Tumoren waren signifikant höher in Tieren, die mit GLV-1h282 behandelt wurden als solche, die mit GLV-1h68 behandelt wurden. Dies mag den Grund für die erhöhte Antitumoreffizienz von GLV-1h282 in vivo darstellen. Die Virus-Titer in allen anderen Gruppen zeigten keinen signifikanten Unterschied. Um den Mechanismus der durch therapeutische Antikörper erhöhten Antitumortherapie zu untersuchen, wurde Immunohistochemie durchgeführt. Nach Behandlung mit den Antikörper-kodierenden VACVs waren die Blutgefäβdichte und Zellproliferation in Tumoren reduziert, nachgewiesen durch die jeweilige CD31 and Ki67 Färbung. Die Resultate deuteten an, dass die Suppression der Angiogenese oder der Zellproliferation in Tumoren den beobachteten Effekt verursachen könnte. Zusammenfassend zeigen die hier präsentierten Daten dass die Kombination der Behandlung von onkolytischer Virotherapie mit Immunotherapie durch Virus-gelieferte Antikörper einen vielversprechenden Ansatz für Krebstherapie darstellt. KW - Vaccinia-Virus KW - therapeutic antibody KW - oncolytic virus KW - Krebs KW - Therapie KW - Antikörper KW - Tumor Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91327 ER - TY - THES A1 - Geissinger, Ulrike T1 - Vaccinia Virus-mediated MR Imaging of Tumors in Mice: Overexpression of Iron-binding Proteins in Colonized Xenografts T1 - Vaccinia Virus-vermittelte MR Bildgebung von Tumoren in Maeusen: Ueberexpression von Eisen-bindenden Proteinen in kolonisierten Heterotransplantaten N2 - Vaccinia virus plays an important role in human medicine and molecular biology ever since the 18th century after E. Jenner discovered its value as a vaccination virus against smallpox. After the successful eradication of smallpox, vaccinia virus, apart from its use as a vaccine carrier, is today mainly used as a viral vector in molecular biology and increasingly in cancer therapy. The capability to specifically target and destroy cancer cells makes it a perfect agent for oncolytic virotherapy. Furthermore, the virus can easily be modified by inserting genes encoding therapeutic or diagnostic proteins to be expressed within the tumor. The emphasis in this study was the diagnosis of tumors using different vaccinia virus strains. Viruses with metal-accumulating capabilities for tumor detection via MRI technology were generated and tested for their usefulness in cell culture and in vivo. The virus strains GLV-1h131, GLV-1h132, and GLV-1h133 carry the gene encoding the two subunits of the iron storage protein ferritin under the control of three different promoters. GLV-1h110, GLV-1h111, and GLV-1h112 encode the bacterial iron storage protein bacterioferritin, whereas GLV-1h113 encodes the codon-optimized version of bacterioferritin for more efficient expression in human cells. GLV-1h22 contains the transferrin receptor gene, which plays an important role in iron uptake, and GLV-1h114 and GLV-1h115 contain the murine transferrin receptor gene. For possibly better iron uptake the virus strains GLV-1h154, GLV-1h155, GLV-1h156, and GLV-1h157 were generated, each with a version of a ferritin gene and a transferrin receptor gene. GLV-1h154 carries the genes that encode bacterioferritin and human transferrin receptor, GLV-1h155 the human ferritin H-chain gene and the human transferrin receptor gene. GLV-1h156 and GLV-1h157 infected cells both express the mouse transferrin receptor and bacterioferritin or human ferritin H-chain, respectively. The virus strains GLV-1h186 and GLV-1h187 were generated to contain a mutated form of the ferritin light chain, which was shown to result in iron overload and the wildtype light chain gene, respectively. The gene encoding the Divalent Metal Transporter 1, which is a major protein in the uptake of iron, was inserted in the virus strain GLV-1h102. The virus strain GLV-1h184 contains the magA gene of the magnetotactic bacterium Magnetospirillum magnetotacticum, which produces magnetic nanoparticles for orientation in the earth’s magnetic field. Initially the infection and replication capability of all the virus strains were analyzed and compared to that of the parental virus strain GLV-1h68, revealing that all the viruses were able to infect cells of the human cancer cell lines A549 and GI-101A. All constructs exhibited a course of infection comparable to that of GLV-1h68. Next, to investigate the expression of the foreign proteins in GI-101A and A549 cells with protein analytical methods, SDS-gelelectrophoresis, Western blots and ELISAs were performed. The proteins, which were expressed under the control of the strong promoters, could be detected using these methods. To be able to successfully detect the protein expression of MagA and DMT1, which were expressed under the control of the weak promoter, the more sensitive method RT-PCR was used to at least confirm the transcription of the inserted genes. The determination of the iron content in infected GI-101A and A549 cells showed that infection with all used virus strains led to iron accumulation in comparison to uninfected cells, even infection with the parental virus strain GLV-1h68. The synthetic phytochelatin EC20 was also shown to enhance the accumulation of different heavy metals in bacterial cultures. In vivo experiments with A549 tumor-bearing athymic nude mice revealed that 24 days post infection virus particles were found mainly in the tumor. The virus-mediated expression of recombinant proteins in the tumors was detected successfully by Western blot. Iron accumulation in tumor lysates was investigated by using the ferrozine assay and led to the result that GLV-1h68-infected tumors had the highest iron content. Histological stainings confirmed the finding that iron accumulation was not a direct result of the insertion of genes encoding iron-accumulating proteins in the virus genome. Furthermore virus-injected tumorous mice were analyzed using MRI technology. Two different measurements were performed, the first scan being done with a seven Tesla small animal scanner seven days post infection whereas the second scan was performed using a three Tesla human scanner 21 days after virus injection. Tumors of mice injected with the virus strains GLV-1h113 and GLV-1h184 were shown to exhibit shortened T2 and T2* relaxation times, which indicates enhanced iron accumulation. In conclusion, the experiments in this study suggest that the bacterioferritin-encoding virus strain GLV-1h113 and the magA-encoding virus strain GLV-1h184 are promising candidates to be used for cancer imaging after further analyzation and optimization. N2 - Das Vaccinia Virus spielt in der Humanmedizin und Molekularbiologie eine wichtige Rolle seit E. Jenner im 18. Jahrhundert seinen Nutzen als Impfvirus entdeckt hat. Nach der erfolgreichen Ausrottung der Pocken, wird das Vaccinia Virus heutzutage neben der Anwendung als Impfstoffträger hauptsächlich als viraler Vektor in der Molekularbiologie und in zunehmendem Maße in der Krebstherapie verwendet. Die Fähigkeit Krebszellen gezielt zu zerstören, macht es zu einem perfekten Wirkstoff für die onkolytische Virotherapie. Des Weiteren kann das Virus durch das Inserieren von Genen, die für therapeutische oder diagnostische Proteine kodieren, und im Tumor exprimiert werden, modifiziert werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war die Tumordiagnose mit Hilfe verschiedener Vaccinia Virusstämme. Viren mit der Fähigkeit, Metalle anzureichern wurden zur Tumordetektion mittels Kernspintomographie hergestellt und auf ihre Nutzbarkeit in Zellkultur und in vivo getestet. Die Virusstämme GLV-1h132, GLV-1h132 und GLV-1h133 tragen das Gen, welches für die zwei Untereinheiten des Eisenspeicherproteins Ferritin kodieren unter der Kontrolle von drei verschiedenen Promotoren. GLV-1h110, GLV-1h111, und GLV-1h112 tragen das Gen, welches für das bakterielle Eisenspeicherprotein Bacterioferritin kodiert, wohingegen das inserierte Gen in GLV-1h113 für die codon-optimierte Version dieses Proteins kodiert, die eine effizientere Expression in humanen Zellen ermöglichen soll. GLV-1h22 beinhaltet das Transferrin-Rezeptor-Gen, welches eine wichtige Rolle in der Eisenaufnahme spielt, und GLV-1h114 und GLV-1h115 beinhalten das murine Transferrin-Rezeptor-Gen. Für eine möglicherweise bessere Eisenaufnahme wurden die Virusstämme GLV-1h154, GLV-1h155, GLV-1h156 und GLV-1h157 mit je einer Version eines Ferritin-Gens und eines Transferrin-Rezeptor-Gens generiert. GLV-1h154 trägt die Gene, die für Bacterioferritin und den humanen Transferrin Rezeptor kodieren, GLV-1h155 trägt die Gene für die humane Ferritin H-Untereinheit und den humanen Transferrin Rezeptor. Zellen, die mit GLV-1h156 und GLV-1h157 infiziert wurden, exprimierten den Maus-Transferrin-Rezeptor und Bacterioferritin beziehungsweise die humane Ferritin-H-Untereinheit. Die Virusstämme GLV-1h186 und GLV-1h187 wurden mit einer mutierten Form der leichten Untereinheit von Ferritin, für die eine Überladung mit Eisen gezeigt wurde, beziehungsweise mit der leichten Untereinheit des wildtypischen Gens ausgestattet. Das Gen, das für den Divalenten Metal Transporter 1 kodiert, welches ein bedeutendes Protein für die Aufnahme von Eisen darstellt, wurde in den Virusstamm GLV-1h102 inseriert. Der Virusstamm GLV-1h184 trägt das magA Gen des magnetotaktischen Bakteriums Magnetospirillum magnetotacticum, welches magnetische Nanopartikel zur Orientierung im Erdmagnetfeld produziert. Zunächst wurde die Infektions- und Replikationsfähigkeit aller Viren analysiert und mit der des Ausgangsstammes GLV-1h68 verglichen, was zeigte, dass alle Viren in der Lage waren humane Krebszellen der Zelllinien GI-101A und A549 zu infizieren. Alle Konstrukte zeigten einen vergleichbaren Infektionsverlauf zu GLV-1h68. Als nächstes, um die Expression der fremden Proteine in GI-101A und A549 Zellen zu untersuchen, wurden SDS-Gelelektrophorese, Western Blots und ELISAs durchgeführt. Die Proteine, welche unter der Kontrolle von starken Promotoren exprimiert wurden, konnten mit diesen Methoden detektiert werden. Um die Expression von MagA und DMT1 zu detektieren, welche unter der Kontrolle des schwachen Promotors exprimiert wurden, wurde die sensitivere Methode RT-PCR angewendet, mit der zumindest die Transkription der Gene nachgewiesen werden konnte. Die Bestimmung des Eisengehaltes in infizierten GI-101A und A549 Zellen zeigte, dass die Infektion mit allen Viren im Vergleich zu uninfizierten Zellen zu einer Eisenanreicherung führte, sogar die Infektion mit dem Ausgangsstamm GLV-1h68. Für das synthetische Phytochelatin EC20 wurde auch eine Anhäufung von verschiedenen Schwermetallen in Bakterienkulturen gezeigt. In vivo Experimente mit A549 tumor-tragenden athymischen Nacktmäusen ergaben, dass Viruspartikel 24 Tage nach der Infektion hauptsächlich im Tumor gefunden wurden. Die von den Viren vermittelte Expression der rekombinanten Proteine in den Tumoren wurde erfolgreich mit Hilfe von Western Blots detektiert. Die Eisenansammlung in Tumorlysaten wurde mit dem Ferrozine Assay untersucht und führte zu dem Ergebnis, dass Tumore, die mit GLV-1h68 infiziert wurden, den höchsten Eisengehalt vorwiesen. Histologische Färbungen bestätigten die Erkenntnis, dass die Eisenansammlung nicht ein direktes Resultat der Insertion von eisenansammelnden Genen in das Virusgenom war. Darüberhinaus wurden tumortragende Mäuse, denen Virus injiziert wurde, mittels Kernspintomographie analysiert. Zwei verschiedene Messungen wurden durchgeführt, wobei die erste Messung sieben Tage nach Virusinjektion mit einem sieben Tesla Kleintier-Scanner durchgeführt wurde und die zweite Messung mit einem humanen drei Tesla Scanner 21 Tage nach Virusinjektion. Tumore von Mäusen, die mit den Virusstämmen GLV-1h113 und GLV-1h184 injiziert wurden, zeigten verkürzte T2- und T2*-Relaxationszeiten, was auf eine verbesserte Eisenakkumulation hinweist. Zusammenfassend deuten die Experimente dieser Studie darauf hin, dass der Virusstamm GLV-1h113, welcher für Bacterioferritin kodiert, und der Virusstamm GLV-1h184, welcher für MagA kodiert, nach weiterer Untersuchung und Optimierung vielversprechende Kandidaten für die Krebs Bildgebung sind. KW - Vaccinia-Virus KW - NMR-Tomographie KW - Tumor KW - Krebsbildgebung KW - Tumordetektion KW - Vaccinia Virus KW - Tumor detection KW - MRI Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48099 ER - TY - THES A1 - Heß, Michael T1 - Vaccinia virus-encoded bacterial beta-glucuronidase as a diagnostic biomarker for oncolytic virotherapy T1 - Vaccinia Virus-codierte bakterielle Beta-Glucuronidase als diagnostischer Biomarker in der onkolytischen Virotherapie N2 - Oncolytic virotherapy represents a promising approach to revolutionize cancer therapy. Several preclinical and clinical trials display the safety of oncolytic viruses as wells as their efficiency against solid tumors. The development of complementary diagnosis and monitoring concepts as well as the optimization of anti-tumor activity are key points of current virotherapy research. Within the framework of this thesis, the diagnostic and therapeutic prospects of beta-glucuronidase expressed by the oncolytic vaccinia virus strain GLV-1h68 were evaluated. In this regard, a beta-glucuronidase-based, therapy-accompanying biomarker test was established which is currently under clinical validation. By using fluorescent substrates, the activity of virally expressed beta-glucuronidase could be detected and quantified. Thereby conclusions about the replication kinetics of oncolytic viruses in animal models and virus-induced cancer cell lysis could be drawn. These findings finally led to the elaboration and establishment of a versatile biomarker assay which allows statements regarding the replication of oncolytic viruses in mice based on serum samples. Besides the analysis of retrospective conditions, this test is able to serve as therapy-accompanying monitoring tool for virotherapy approaches with beta-glucuronidase-expressing viruses. The newly developed assay also served as complement to routinely used plaque assays as well as reference for virally expressed anti-angiogenic antibodies in additional preclinical studies. Further validation of this biomarker test is currently taking place in the context of clinical trials with GL-ONC1 (clinical grade GLV-1h68) and has already shown promising preliminary results. It was furthermore demonstrated that fluorogenic substrates in combination with beta-glucuronidase expressed by oncolytic viruses facilitated the optical detection of solid tumors in preclinical models. In addition to diagnostic purposes, virus-encoded enzymes could also be combined with prodrugs resulting in an improved therapeutic outcome of oncolytic virotherapy. In further studies, the visualization of virus-induced immune reactions as well as the establishment of innovative concepts to improve the therapeutic outcome of oncolytic virotherapy could be accomplished. In conclusion, the results of this thesis provide crucial findings about the influence of virally expressed beta-glucuronidase on various diagnostic concepts in the context of oncolytic virotherapy. In addition, innovative monitoring and therapeutic strategies could be established. Our preclinical findings have important clinical influence, particularly by the development of a therapy-associated biomarker assay which is currently used in different clinical trials. N2 - Onkolytische Viren stellen einen vielversprechenden Therapieansatz dar, der die Behandlung von Krebserkrankungen revolutionieren könnte. Intensive präklinische und klinische Studien zeigen sowohl die körperliche Verträglichkeit von onkolytischen Viren, als auch deren Wirksamkeit gegenüber soliden Tumoren. Die Entwicklung von therapiebegleitenden Diagnose- und Monitoringkonzepten sowie eine Optimierung der Antitumorwirkung onkolytischer Viren stellen Eckpunkte der aktuellen Forschung auf dem Gebiet der Virotherapie dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, welche diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten die virale Expression von beta-Glucuronidase durch den onkolytischen Vaccinia-Virus-Stamm GLV-1h68 eröffnet. In diesem Zusammenhang wurde ein, auf beta-Glucuronidase basierender, therapiebegleitender Biomarkertest entwickelt, dessen klinische Validierung derzeit stattfindet. Mit Hilfe von fluorogenen Substraten konnte die Aktivität viral exprimierter beta-Glucuronidase detektiert und quantifiziert werden. Dies lies direkte Rückschlüsse auf das Replikationsverhalten von onkolytischen Viren im Tiermodell zu und ermöglichte zudem Aussagen über die Zelllyse Virus-infizierter Krebszellen. Diese Erkenntnisse führten letztendlich zur Ausarbeitung und Etablierung eines vielseitig anwendbaren Biomarker-Assays, der es ermöglicht anhand von Blutproben Aussagen über das Replikationsverhalten onkolytischer Viren in Mäusen zu machen. Neben retrospektiven Analysen erlaubt dieser Test auch ein therapiebegleitendes Monitoring der onkolytischen Virotherapie mit beta-Glucuronidase-exprimierenden Viren. In weiteren präklinischen Untersuchungen diente der entwickelte Assay zudem als Ergänzung zum viralen Plaque Assays sowie als Referenz für Virus-exprimierte anti-angiogene Antikörper. Eine fortführende Validierung dieses neuartigen Biomarkertests findet derzeit im Rahmen humaner Studien mit der klinischen Formulierung von GLV-1h68, GL-ONC1, statt und zeigte bereits erste positive Resultate. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Expression von beta-Glucuronidase durch onkolytische Viren in Verbindung mit fluoreszierenden Substraten eine optische Detektion von Karzinomen im präklinischen Tiermodell ermöglicht. Neben diagnostischen Zwecken, konnten Virus-kodierte Enzyme in Kombination mit Prodrugs genutzt werden, um den Therapieerfolg der onkolytischen Virotherapie zu verbessern. In zusätzlichen Studien konnten zudem Methoden zur Visualisierung der Virus-induzierten Immunantwort sowie neuartige Konzepte zur Therapieverbesserung etabliert werden. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wichtige Erkenntnisse über den Einfluss Virus-exprimierter beta-Glucuronidase auf unterschiedliche Diagnosekonzepte im Rahmen der onkolytischen Virotherapie. Daneben konnten entscheidende Erkenntnisse über den möglichen Einsatz neuer Monitoring- und Therapieansätze erzielt werden. Insbesondere durch die Entwicklung eines therapiebegleitenden Biomarkertests haben diese Resultate erheblichen Einfluss auf die weitere klinische Anwendung von onkolytischen Vaccinia-Viren. KW - Vaccinia-Virus KW - Glucuronidase KW - Krebs KW - cancer KW - oncolytic virus KW - biomarker KW - beta-glucuronidase Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86789 ER - TY - THES A1 - Nguyen, Hoang Duong T1 - Vaccinia virus mediated expression of human erythropoietin in colonized human tumor xenografts results in faster tumor regression and increased red blood cell biogenesis in mice T1 - Expression von humanem Erythropietin in Vaccinia Virus-kolonisierten Tumorxenograftmodellen fördert die Tumorregression und die Biogenese roter Blutzellen N2 - Cancer-related anemia is prevalent in cancer patients. Anemia negatively affects normal mental and physical function capacity with common symptoms s like fatigue, headache, or depression. Human erythropoietin (hEPO), a glycoprotein hormone regulating red blood cell formation, is approved for the treatment of cancer-related anemia. It has shown benefits in correcting anemia, and subsequently improving health-related quality of life and/or enhancing radio-, and chemotherapy. Several recent clinical trials have suggested that recombinant hEPO (rhEPO) may promote tumor growth that raises the questions concerning the safety of using rhEPO for cancer treatment. However in others, such effects were not indicated. As of today, the direct functional effect of rhEPO in tumor models remains controversial and needs to be further analyzed. Based on the GLV-1h68 backbone, the hEPO-expressing recombinant VACV strains (EPO-VACVs) GLV-1h210, GLV-1h211, GLV-1h212 and GLV-1h213 were generated by replacing the lacZ expression cassette at the J2R locus with hEPO under the control of different vaccinia promoters p7.5, pSE, pSEL, pSL, respectively. Also, GLV-1h209 was generated, which is similar to GLV-1h210 but expresses a mutated non-functinal EPO (R103A). The EPO-VACV strains were characterized for their oncolytic efficacy in lung (A549) cancer cells in culture and tumor xenografts. Concomitantly, the effects of locally expressed hEPO in tumors on virus replication, host immune infiltration, tumor vascularization and tumor growth were also evaluated. As expected, EPO-VACVs enhanced red blood cell (RBC) formation in xenograft model. The number of RBCs and hemoglobin (Hb) levels were significantly increased in EPO-VACVs-treated mice compared to GLV-1h68-treated or untreated control mice. However, the mean size of RBC or Hb content per RBC remained normal. Furthermore, over-expression of hEPO did not significantly affect numbers of lymphocytes, monocytes, leucocytes or platelets in the peripheral blood stream. The expression of hEPO in colonized tumors of mice treated with EPO-VACVs was demonstrated by immunohistological staining. Interestingly, there were 9 - 10 hEPO isoforms detected either in tumors, cells, or supernatant, while 3-4 basic isoforms were missing in blood serum, where only six hEPO isoforms were found. Tumor-bearing mice after treatment with EPO-VACVs showed enhanced tumor regression compared to GLV-1h68. The virus titers in tumors in EPO-VACVs-treated mice were 3-4 fold higher compared to GLV-1h68-treated mice. Nevertheless, no significant difference in virus titers among EPO-VACVs was found. The blood vessels in tumors were significantly enlarged while the blood vessel density remained unchanged compared to the GLV-1h68 treated mice, indicating that hEPO did not affect endothelial cell proliferation in this model. Meanwhile, rhEPO (Epoetin alfa) alone or in combination with GLV-1h68 did not show any signs of enhanced tumor growth when compared to untreated controls and GLV-1h68 groups, while doses used were clinical relevant (500 U/kg). These findings suggested that hEPO did not promote angiogenesis or tumor growth in the A549 tumor xenograft model. Human EPO has been reported to function as an immune modulator. In this study, however, we did not find any involvement of hEPO in immune cytokine and chemokine expression or innate immune cell infiltration (leucocytes, B cells, macrophages and dendritic cells) into infected tumors. The degree of immune infiltration and cytokine expression was directly correlated to the number of virus particles. Increased virus replication, led to more recruited immune cells and secreted cytokines/chemokines. It was proposed that tumor regression was at least partially mediated through activation of innate immune mechanisms. In conclusion, the novel EPO-VACVs were shown to significantly increase the number of RBCs, Hb levels, and virus replication in tumors as well as to enhance tumor regression in the A549 tumor xenograft model. Moreover, locally expressed hEPO did not promote tumor angiogenesis, tumor growth, and immune infiltration but was shown to causing enlarged tumoral microvessels which facilitated virus spreading. It is conceivable that in a possible clinical application, anemic cancer patients could benefit from the EPO-VACVs, where they could serve as “wellness pills” to decrease anemic symptoms, while simultaneously destroying tumors. N2 - Blutarmut stellt eine häufige Begleiterscheinung in Krebspatienten dar. Anämie beeinträchtigt die normale mentale und körperliche Funktionsfähigkeit. Menschliches Erythropoetin (hEPO), welches die Bildung roter Blutzellen reguliert, ist klinisch zur Behandlung von Krebs-induzierter Blutarmut zugelassen. Wenn es zur Behandlung von Anämie benutzt wird, verbessert es den Gesundheitszustand sowie Bestrahlungs- und Chemotherapie. Verschiedene klinische zeigten, dass rekombinantes hEPO (rhEPO) das Tumorwachstum anregen kann, was die Frage nach Sicherheit der Anwendung von rhEPO aufbringt. In anderen Studien hingegen, gab es keine Anzeichen für eine Tumorwachstum anregenden Wirkung oder für ein Eingreifen in krebsspezifische Signalwege. Verschiedene hEPO exprimierende rekombinante VACV Stämme (EPO-VACV) wurden hergestellt, GLV-1h210, GLV-1h211 und GLV-1h213, in welchen die lacZ Expressionskassette im J2R Lokus durch das hEPO Gen unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren, p7.5, pSE und pSL, ersetzt wurde. Ebenfalls wurde GLV-1h209 hergestellt, welches ähnlich zu GLV-1h210 ist, jedoch ein mutiertes und nicht-funktionelles EPO Protein (R103A) exprimiert. Alle EPO-VACV Stämme wurden bezüglich ihrer onkolytischen Funktion in Zellkulturexperimenten sowie in in vivo Tumormodellen charakterisiert. Die Expression von zwei Markergene war in Zellkultur sowie in Tumorxenograften für alle EPO-VACV vergleichbar mit der des parentalen GLV-1h68 Virus. Unterschiede in hEPO Transkription und Translation der EPO-VACV war deutlich abhängig von der Promotorstärke und stieg an von p7.5, über pSE und pSL zu pSEL 12 h nach Infektion von Zellen. Darüberhinaus hatte die Insertion von hEPO in das virale Genom keinen Einfluss auf Replikation oder Zytotoxizität aller EPO-VACV in A549 oder NCI-H1299 Zelllinien, obwohl zu frühen Zeitpunkten (24-48 hpi) die Replikation der EPO-VACV etwas höher war, als die des GLV-1h68 Virus. Die A549 Zellen war zugänglicher für virale Infektion durch alle untersuchten Viren als die NCI-H1299 Zellen. Von besonderem Interesse ist, dass hypoxische Bedingungen (2% O2) die Replikation und damit Expression des Markergens gusA, sowie Zytotoxizität für alle untersuchten VACV unabhängig von hEPO Expression verlangsamte. Alle EPO-VACV erhöhen die Bildung von roten Blutzellen (RBC) in Mausmodellen. Anzahl und RBCs sowie Hämoglobin (Hb) Level waren signifikant erhöht im Vergleich zu unbehandelten oder GLV-1h68 behandelten Mäusen. Die Durchschnittsgröße einer RBC sowie der Hämoglobinanteil hingegen waren unverändert. Darüberhinaus hatte die Expression von hEPO keinen signifikanten Einfluss auf Lymphozyten, Monozyten, Leukozyten oder Blutplättchen im peripheren Blut. Die Expression von hEPO in EPO-VACV kolonisierten Tumoren wurde durch immunohistologische Färbungen bestätigt. Interessanterweise konnten 9-10 EPO Isoformen in Tumoren, Zellen oder Zellüberständen gefunden werden, während im Blutserum 3-4 basische Isoformen fehlten und nur 6 Isoformen auftraten. Tumortragende Mäuse, die mit EPO-VACV behandelt wurden, wiesen im Vergleich zu GLV-1h68 behandelten Mäusen eine erhöhte Tumorregression auf. Ausserdem waren virale Titer in EPO-VACV behandleten Tumoren 3-4 fach höher also in denen, die mit GLV-1h68 behandelt wurden. Kein signifikanter Unterschied hingegen wurde zwischen viralen Titern der verschiedenen EPO-VACV in Tumoren gefunden. Tumorale Blutgefäße waren im Vergleich zu GLV-1h68 behandelten Mäusen deutlich vergrößert, wohingegen die Dichte an Blutgefäßen unverändert war, was andeuted, dass keine Proliferation von Endothelzellen angeregt wurde. Rekombinant hergestelltes Epoetin alfa in klinisch relevanten Dosen allein oder in Kombination mit GLV-1h68 hatte keinen Einfluss auf Verbesserung der Tumorregression verglichen mit unbehandelten oder GLV-1h68 behandelten Mäusen. Diese Ergbnisse legen nahe, dass weder Angiogenese noch Tumorwachstum durch hEPO im A549 Tumormodell angeregt wurde. In dieser Studie hingegen wurde kein Einfluss von hEPO im Bezug auf Zytokin- oder Chemokinexpression sowie Immunzellinfiltration in Tumore nachgewiesen. Das Ausmass an Immunzellinfiltratrion und Zytokinexpression konnte direkt mit der Anzahl an viralen Partikeln korreliert werden. Es wurde angenommen, dass Tumorregression zumindest teiweise durch eine Aktivierung des angeborenen Immunsystems bedingt ist. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass durch die neuartigen EPO-VACV die Bildung von RBC, die Level an Hb und die virale Replikation signifikant angeregt wurden sowie eine erhöhte Tumorregression im Xenograftmodell auftrat. Darüberhinaus leitete lokal exprimiertes hEPO keine Tumorangiogenese oder Tumorwachstum ein, aber führte zu einer Vergrößerung von Tumorblutgefäßen, was die virale Ausbreitung erleichtern könnte. Es ist vorstellbar, dass anämische Patienten von einer möglichen klinischen Anwendung der EPO-Viren profitieren würden. KW - Erythropoietin KW - Lungenkrebs KW - Anämie KW - onkolytische Virotherapie KW - erythropoietin KW - lung cancer KW - anemia KW - oncolytic therapy KW - Onkolyse Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85383 ER - TY - THES A1 - Prieto García, Cristian T1 - USP28 regulates Squamous cell oncogenesis and DNA repair via ΔNp63 deubiquitination T1 - USP28 reguliert Plattenepithelzell-Onkogenese und DNA-Reparatur über ΔNp63-Deubiquitinierung N2 - ∆Np63 is a master regulator of squamous cell identity and regulates several signaling pathways that crucially contribute to the development of squamous cell carcinoma (SCC) tumors. Its contribution to coordinating the expression of genes involved in oncogenesis, epithelial identity, DNA repair, and genome stability has been extensively studied and characterized. For SCC, the expression of ∆Np63 is an essential requirement to maintain the malignant phenotype. Additionally, ∆Np63 functionally contributes to the development of cancer resistance toward therapies inducing DNA damage. SCC patients are currently treated with the same conventional Cisplatin therapy as they would have been treated 30 years ago. In contrast to patients with other tumor entities, the survival of SCC patients is limited, and the efficacy of the current therapies is rather low. Considering the rising incidences of these tumor entities, the development of novel SCC therapies is urgently required. Targeting ∆Np63, the transcription factor, is a potential alternative to improve the therapeutic response and clinical outcomes of SCC patients. However, ∆Np63 is considered “undruggable.” As is commonly observed in transcription factors, ∆Np63 does not provide any suitable domains for the binding of small molecule inhibitors. ∆Np63 regulates a plethora of different pathways and cellular processes, making it difficult to counteract its function by targeting downstream effectors. As ∆Np63 is strongly regulated by the ubiquitin–proteasome system (UPS), the development of deubiquitinating enzyme inhibitors has emerged as a promising therapeutic strategy to target ∆Np63 in SCC treatment. This work involved identifying the first deubiquitinating enzyme that regulates ∆Np63 protein stability. Stateof-the-art SCC models were used to prove that USP28 deubiquitinates ∆Np63, regulates its protein stability, and affects squamous transcriptional profiles in vivo and ex vivo. Accordingly, SCC depends on USP28 to maintain essential levels of ∆Np63 protein abundance in tumor formation and maintenance. For the first time, ∆Np63, the transcription factor, was targeted in vivo using a small molecule inhibitor targeting the activity of USP28. The pharmacological inhibition of USP28 was sufficient to hinder the growth of SCC tumors in preclinical mouse models. Finally, this work demonstrated that the combination of Cisplatin with USP28 inhibitors as a novel therapeutic alternative could expand the limited available portfolio of SCC therapeutics. Collectively, the data presented within this dissertation demonstrates that the inhibition of USP28 in SCC decreases ∆Np63 protein abundance, thus downregulating the Fanconi anemia (FA) pathway and recombinational DNA repair. Accordingly, USP28 inhibition reduces the DNA damage response, thereby sensitizing SCC tumors to DNA damage therapies, such as Cisplatin. N2 - ∆Np63 ist ein Hauptregulator der Plattenepithelzellidentität und reguliert mehrere Signalwege, die entscheidend zur Entstehung von Plattenepithelkarzinomen (SCC) beitragen. Sein Beitrag zur Koordination der Expression von Genen, die an der Onkogenese, der epithelialen Identität, der DNA-Reparatur und der Genomstabilität beteiligt sind, wurde umfassend untersucht und charakterisiert. Für SCC ist die Expression von ∆Np63 eine wesentliche Voraussetzung, um den malignen Phänotyp zu erhalten. Darüber hinaus trägt ∆Np63 funktionell zur Entwicklung einer Krebsresistenz gegenüber Therapien bei, die DNA-Schäden induzieren. SCC-Patienten werden derzeit mit der gleichen konventionellen Cisplatin-Therapie behandelt, wie sie vor 30 Jahren behandelt worden wären. Im Gegensatz zu Patienten mit anderen Tumorentitäten ist das Überleben von SCC-Patienten begrenzt und die Wirksamkeit der aktuellen Therapien eher gering. Angesichts der steigenden Inzidenz dieser Tumorentitäten ist die Entwicklung neuer Therapien für das Plattenepithelkarzinom dringend erforderlich. Das Targeting von ∆Np63, dem Transkriptionsfaktor, ist eine potenzielle Alternative zur Verbesserung des therapeutischen Ansprechens und der klinischen Ergebnisse von SCC-Patienten. ∆Np63 gilt jedoch als „nicht medikamentös“. Wie bei Transkriptionsfaktoren häufig beobachtet, bietet ∆Np63 keine geeigneten Domänen für die Bindung von niedermolekularen Inhibitoren. ∆Np63 reguliert eine Vielzahl von verschiedenen Signalwegen und zellulären Prozessen, was es schwierig macht, seiner Funktion entgegenzuwirken, indem es nachgeschaltete Effektoren angreift. Da ∆Np63 stark durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) reguliert wird, hat sich die Entwicklung von deubiquitinierenden Enzyminhibitoren als vielversprechende therapeutische Strategie erwiesen, um ∆Np63 bei der Behandlung von Plattenepithelkarzinomen zu bekämpfen. Diese Arbeit beinhaltete die Identifizierung des ersten deubiquitinierenden Enzyms, das die Stabilität des ∆Np63-Proteins reguliert. Hochmoderne SCC-Modelle wurden verwendet, um zu beweisen, dass USP28 ∆Np63 deubiquitiniert, seine Proteinstabilität reguliert und Plattenepithel-Transkriptionsprofile in vivo und ex vivo beeinflusst. Dementsprechend hängt SCC von USP28 ab, um wesentliche Mengen des Np63-Proteinüberflusses bei der Tumorbildung und -erhaltung aufrechtzuerhalten. Zum ersten Mal wurde ∆Np63, der Transkriptionsfaktor, in vivo mit einem niedermolekularen Inhibitor gezielt, der auf die Aktivität von USP28 abzielt. Die pharmakologische Hemmung von USP28 war ausreichend, um das Wachstum von SCC-Tumoren in präklinischen Mausmodellen zu verhindern. Schließlich zeigte diese Arbeit, dass die Kombination von Cisplatin mit USP28-Inhibitoren als neuartige therapeutische Alternative das begrenzt verfügbare Portfolio an SCC-Therapeutika erweitern könnte. Zusammengefasst zeigen die in dieser Dissertation präsentierten Daten, dass die Hemmung von USP28 in SCC die Np63-Proteinhäufigkeit verringert, wodurch der Fanconi-Anämie (FA)-Signalweg und die rekombinatorische DNA-Reparatur herunterreguliert werden. Dementsprechend reduziert die Hemmung von USP28 die Reaktion auf DNA-Schäden und sensibilisiert dadurch SCC- Tumoren für DNA-Schädigungstherapien wie Cisplatin. KW - USP28 KW - Squamous cell carcinoma KW - ΔNp63 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-270332 ER - TY - THES A1 - Gnamlin, Prisca T1 - Use of Tumor Vasculature for Successful Treatment of Carcinomas by Oncolytic Vaccinia Virus T1 - Die Tumorvasulatur in der erfolgreichen Therapie von Carcinomen durch onkolytische Vaccinia Viren N2 - Tumor-induced angiogenesis is of major interest for oncology research. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is the most potent angiogenic factor characterized so far. VEGF blockade was shown to be sufficient for angiogenesis inhibition and subsequent tumor regression in several preclinical tumor models. Bevacizumab was the first treatment targeting specifically tumor-induced angiogenesis through VEGF blockade to be approved by the Food and Drugs Administration (FDA) for cancer treatment. However, after very promising results in preclinical evaluations, VEGF blockade did not show the expected success in patients. Some tumors became resistant to VEGF blockade. Several factors have been accounted responsible, the over-expression of other angiogenic factors, the noxious influence of VEFG blockade on normal tissues, the selection of hypoxia resistant neoplastic cells, the recruitment of hematopoietic progenitor cells and finally the transient nature of angiogenesis inhibition by VEGF blockade. The development of blocking agents against other angiogenic factors like placental growth factor (PlGF) and Angiopoietin-2 (Ang-2) allows the development of an anti-angiogenesis strategy adapted to the profile of the tumor. Oncolytic virotherapy uses the natural propensity of viruses to colonize tumors to treat cancer. The recombinant vaccinia virus GLV-1h68 was shown to infect, colonize and lyse several tumor types. Its descendant GLV-1h108, expressing an anti-VEGF antibody, was proved in previous studies to inhibit efficiently tumor induced angiogenesis. Additional VACVs expressing single chain antibodies (scAb) antibodies against PlGF and Ang-2 alone or in combination with anti VEGF scAb were designed. In this study, VACV-mediated anti-angiogenesis treatments have been evaluated in several preclinical tumor models. The efficiency of PlGF blockade, alone or in combination with VEGF, mediated by VACV has been established and confirmed. PlGF inhibition alone or with VEGF reduced tumor burden 5- and 2-folds more efficiently than the control virus, respectively. Ang-2 blockade efficiency for cancer treatment gave controversial results when tested in different laboratories. Here we demonstrated that unlike VEGF, the success of Ang-2 blockade is not only correlated to the strength of the blockade. A particular balance between Ang-2, VEGF and Ang-1 needs to be induced by the treatment to see a regression of the tumor and an improved survival. We saw that Ang-2 inhibition delayed tumor growth up to 3-folds compared to the control virus. These same viruses induced statistically significant tumor growth delays. This study unveiled the need to establish an angiogenic profile of the tumor to be treated as well as the necessity to better understand the synergic effects of VEGF and Ang-2. In addition angiogenesis inhibition by VACV-mediated PlGF and Ang-2 blockade was able to reduce the number of metastases and migrating tumor cells (even more efficiently than VEGF blockade). VACV colonization of tumor cells, in vitro, was limited by VEGF, when the use of the anti-VEGF VACV GLV-1h108 drastically improved the colonization efficiency up to 2-fold, 72 hours post-infection. These in vitro data were confirmed by in vivo analysis of tumors. Fourteen days post-treatment, the anti-VEGF virus GLV-1h108 was colonizing 78.8% of the tumors when GLV-1h68 colonization rate was 49.6%. These data confirmed the synergistic effect of VEGF blockade and VACV replication for tumor regression. Three of the tumor cell lines used to assess VACV-mediated angiogenesis inhibition were found, in certain conditions, to mimic either endothelial cell or pericyte functions, and participate directly to the vascular structure. The expression by these tumor cells of e-selectin, p-selectin, ICAM-1 and VCAM-1, normally expressed on activated endothelial cells, corroborates our findings. These proteins play an important role in immune cell recruitment, and there amount vary in presence of VEGF, PlGF and Ang-2, confirming the involvement of angiogenic factors in the immuno-modulatory abilities of tumors. In this study VACV-mediated angiogenesis blockade proved its potential as a therapeutic agent able to treat different tumor types and prevent resistance observed during bevacizumab treatment by acting on different factors. First, the expression of several antibodies by VACV would prevent another angiogenic factor to take over VEGF and stimulate angiogenesis. Then, the ability of VACV to infect tumor cells would prevent them to form blood vessel-like structures to sustain tumor growth, and the localized delivery of the antibody would decrease the risk of adverse effects. Next, the blockade of angiogenic factors would improve VACV replication and decrease the immune-modulatory effect of tumors. Finally the fact that angiogenesis blockade lasts until total regression of the tumor would prevent the recovery of the tumor-associated vasculature and the relapse of patients. N2 - Ein Hauptinteresse der onkologischen Forschung liegt auf dem Verständnis der Tumor-induzierten Angiogenese. Es wurde bereits festgestellt, dass die meisten Tumortypen eine abnorme Expression angiogener Faktoren zeigen. Der vascular endothelial growth factor (VEGF) wurde als der effektivste angiogene Faktor beschrieben. Es wurde gezeigt, dass die Hemmung des VEGF zur Inhibition der Angiogenese führt, das wiederum zu Tumorregression in vorklinischen Tumormodellen führte. Bevacizumab ist das erste FDA zugelassene Krebs-Therapeutikum, welches spezifisch auf die Tumor-induzierte Angiogenese durch VEGF-Inhibition abzielt. Der erwartete Erfolg durch VEGF-Hemmung konnte im Patienten allerdings nicht erzielt werden. Die Entwicklung von neuen Angiogenese hemmenden Stoffen wie gegen den placental growth factor (PIGF) oder Angiopoietin-2 (Ang-2), ermöglichen eine an das Tumor-Profil angepasste anti-angiogene Strategie. Die onkolytische Virustherapie die natürliche Eigenschaft der Viren Tumore zu kolonisieren. Das Vaccinia-Virus (VACV) gehört zur Familie der Poxviridae und wurde bereits lange Zeit als Vakzin zur Immunisierung gegen Pocken eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das rekombinante VACV GLV-1h68 effizient verschiedene Tumortypen infiziert, kolonisiert und lysiert. Das VACV GLV-1h108, welches auf der Basis des GLV-1h68 generiert wurde, kodiert einen anti-VEGF Antikörper. Dieses Virus ist in der Lage ist die Tumor-induzierte Angiogenese effizient zu inhibieren. Zusätzlich zu diesem VACV wurden weitere Konstrukte kloniert, welche für Antikörper gegen PIGF und Ang-2 kodieren. Zusätzlich wurden Virusstämme konstruiert, die gleichzeitig zwei Angiogenesefaktoren anzielen. Es wurde verschiedene VACV-vermittelte anti-Angiogenese Therapien in vorklinischen Tumormodellen wie Lungenadenokarzinome, KolonKarzinom, Melanom und Lungenadenokarzinome evaluiert. Die Effizienz der VACV-vermittelten Hemmung von PIGF und Ang-2, singulär oder in Kombination mit VEGF, wurde mit Tumor-Xenotransplantaten ermittelt. Die Inhibition von PlGF alleine oder in Kombination mit VEGF reduzierten die Tumorbelastung bis zu fünf, beziehungsweise zwei mal effizienter als GLV-1h68. Weiterhin wurde gezeigt, dass anders als VEGF, der Erfolg der Ang-2 Hemmung nicht nur mit der Stärke der Hemmung korreliert. Um Tumorregression sowie eine verbesserte Überlebensrate zu verursachen muss eine Balance zwischen Ang-2, VEGF und Ang-1 induziert werden. GLV-1h68 behandelte Tumore waren drei mal gröβer als Tumore, die mit den anti-Ang2 exprimierenden Viren behandelt wurden. Dieselben Virusstämme verursachten eine erhebliche Verspätung des Wachstums der Tumoren. Ausserdem hat diese Arbeit die Notwendigkeit enthüllt, ein angiogenes Profil des zu behandelnden Tumors zu etablieren sowie den Bedarf die synergistischen Effekte von VEGF und Ang-2 besser zu verstehen. Durch die Inhibition der Angiogenese durch VACV-verursachte PIGF und Ang-2 Hemmung wurde die Anzahl der Metastasen und der migrierenden Tumorzellen reduziert. Es wurde gezeigt, dass VEGF die VACV-Kolonisierung von Tumorzellen limitiert, da der Einsatz eines anti-VEGF VACV zu einer Verbesserung der Kolonisierung führt. In vivo Analysen bestätigten diese in vitro Daten. Nach vierzehn Tagen kolonisierte das anti-VEGF Virus 78,85% der Tumoren während die Kolonizationsquote des Kontrollviruses 49,64 % war. Dies resultierte in Tumorregression. Drei der getesteten Tumorzelllinien, in welchen die VACV-vermittelte Angiogenese-Inhibition untersucht wurde, waren in der Lage als Teil der Vaskulatur zu fungieren. Die Expression von Adhäsionsproteinen in diesen Tumorzellen untermauert die Ergebnisse. Weiterhin konnte ein unterschiedliches Expressionsmuster in Anwesenheit von VEGF, PIGF und Ang-2 festgestellt werden, wodurch die Beteiligung angiogener Faktoren bei den immunmodulatorischen Eigenschaften von Tumoren gezeigt werden konnte. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine VACV-vermittelte anti-angiogene Behandlung für verschiedene Tumorvarianten erfolgsversprechend ist. Die Möglichkeit verschiedene Antikörper gegen unterschiedliche angiogene Faktoren zu exprimieren würde verhindern, dass diese die Angiogenese stimulierende Wirkung des VEGF übernehmen. Die Eigenschaft von VACV Tumorzellen zu infizieren verhindert, dass diese Blutgefäß-ähnliche Strukturen bilden, welche das Tumorwachstum gewährleisten würde. Weiterhin würde die lokal begrenzte Antikörper-Freisetzung das Risiko von Nebenwirkungen senken. Die Inhibition angiogener Faktoren würde die VACV Replikationsrate steigern und den immunmodulatorischen Effekt der Tumore abschwächen. Letztlich würde die Hemmung der Angiogenese bis zur völligen Regression des Tumors aufrechterhalten, die Neubildung Tumor-assoziierter Vaskulatur verhindern und somit den Rückfall des Patienten. KW - Vaccinia-Virus KW - cancer KW - vaccinia virus KW - virotherapy KW - tumor vascularization KW - oncolytic virotherapy KW - Onkolyse KW - Angiogenese Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119019 ER - TY - THES A1 - Horvat, Aleksandra T1 - Untersuchungen zur Signalwahrnehmung der Sensorkinase BvgS des BvgAS-Zwei-Komponentensystems aus Bordetella bronchiseptica und Struktur-Funktionsanalyse des Response Regulator-Proteins BvgA aus Bordetella holmesii T1 - Characterisation of signal perception of the BvgS sensorkinase of Bordetella bronchiseptica and molecular characterisation of the BvgA response regulator of Bordetella holmesii N2 - Die Histidin-Kinase BvgS des BvgAS-Zwei-Komponentensystems gehört zu den unorthodoxen Histidin-Kinasen, die im Gegensatz zu den klassischen Sensorkinasen durch eine komplexere Domänen-Struktur gekennzeichnet ist. Schon seit längerem ist bekannt, dass BvgS durch niedrige Temperaturen oder die Anwesenheit von chemischen Substanzen, wie Sulfationen oder Nikotinsäure inaktiviert wird. Zudem konnte in vitro gezeigt werden, dass die Autophosphorylierungs-Aktivität der BvgS Histidin-Kinase nach Inkubation mit oxidiertem Ubichinon inhibiert wird (Bock & Gross, 2002). Bislang ist weitgehend unklar, welche Bedeutung die zusätzlichen Domänen, wie die periplasmatische-, PAS- bzw. HPt-Domäne für die Signalwahrnehmung besitzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb nach Erstellung einer B. bronchiseptica spezifischen Genbank mit Hilfe des GAL4-Yeast Two-Hybrid (YTH) Systems nach Interaktionspartnern der einzelnen BvgS-Domänen gesucht. Nach dem Ausschluss von falsch-positiven Klonen und dem Durchlauf entsprechender Kontrollen konnten im YTH-System für die periplasmatische und die PAS-Domäne von BvgS insgesamt vier Interaktionspartner identifiziert werden. Für die HPt-Domäne konnte mit Hilfe des YTH-Systems kein möglicher Interaktionspartner gefunden werden. Als ein putativer Interaktionspartner der BvgS-PAS-Domäne wurde das BB0602-Protein identifiziert, das ein ATP-Bindeprotein darstellt, welches als Bestandteil eines ABC-Transport-System für den Transport von verzweigten Aminosäuren verantwortlich gemacht wird. Diese Interaktion konnte mittels eines GST-Pulldownassays bestätigt werden. Der biochemische Nachweis der übrigen identifizierten Protein-Interaktionen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erbracht werden. Die Ergebnisse des YTH-Screenings deuten darauf hin, dass die Aktivität der BvgS Histidin-Kinase und damit die Virulenzgenexpression durch die An- bzw. Abwesenheit von verzweigten Aminosäuren beeinflusst werden könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Relevanz der Interaktion zwischen der PAS-Domäne und dem ATP-Bindeprotein BB0602 nicht näher charakterisiert werden, so dass in Zukunft unter anderem die Konstruktion einer B. bronschiseptica bb0602-Deletionsmutante geplant ist, um somit mögliche Auswirkungen auf die Expression von bvg-abhängigen Genen zu beobachten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit lag in der Struktur-Funktionsanalyse des Response Regulators BvgA aus B. holmesii (BvgABH). Kürzlich konnte gezeigt werden, dass trotz der umfangreichen Sequenzkonservierung der BvgA-Proteine aus B. holmesii und B. pertussis, eine B. pertussis bvgA-Mutante nicht durch den bvgA-Lokus aus B. holmesii komplementiert werden konnte (Gerlach et al., 2004). Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein hybrider Response Regulator BvgAfus konstruiert, der aus der Receiver- und Linker-Domäne des BvgABH-Proteins und der Output-Domäne von BvgABP zusammengesetzt ist. Voraussetzung hierfür war die Kenntnis der einzelnen Domänengrenzen und die Sequenz des Linker-Bereiches des Response Regulators BvgA aus B. pertussis (BvgABP), welche durch limitierte Proteolyse und massenspektrometrische Methoden identifiziert wurden (Bantscheff et al., 2000). Im Falle des hybriden Proteins konnte im Gegensatz zu BvgABH eine Bindung an BvgABP-abhängige Promotorsequenzen beobachtet werden. Zudem war BvgAfus in der Lage, die Expression BvgABP-abhängiger Gene in vivo zu induzieren. Allerdings war es in seiner Phosphorylierungseffizienz im Vergleich zum wildtypischen Response Regulator-Protein aus B. holmesii eingeschränkt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die wenigen Abweichungen zwischen den Aminosäuresequenzen der Output-Domänen dafür verantwortlich sind, dass das BvgABH-Protein die Funktion von BvgABP in vivo und in vitro nicht übernehmen kann. So unterscheiden sich die Output-Domänen der Response Regulatoren aus B. pertussis und B. holmesii in zehn Aminosäureaustauschen, wobei davon vier Aminosäuren innerhalb des Helix-Turn-Helix-Motives verändert sind. Um zu untersuchen, ob die unterschiedlichen DNA-Binde- und transkriptionsaktivierenden Eigenschaften von BvgABH im Besonderen auf diese Aminosäureunterschiede zurückzuführen sind, wurden mittels ortspezifischer Mutagenese die Aminosäuresequenz innerhalb des Helix-Turn-Helix-Motives an die Sequenz aus B. pertussis angeglichen. Das resultierende Protein BvgABH* zeigte eine dem wildtypischen BvgABH-Protein ähnliche Phosphorylierungseffizienz, war aber nicht in der Lage, BvgABP-abhängige Zielsequenzen spezifisch zu erkennen bzw. die Funktion des BvgABP-Proteins in vivo zu ersetzen. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass die wenigen Aminosäureunterschiede der Output-Domäne außerhalb der DNA-Binderegion zwar nicht im Zusammenhang mit der Phosphorylierungseffizienz stehen, jedoch die DNA-Bindeeigenschaften beeinflussen. N2 - The BvgS protein of the BvgAS two-component system belongs to the family of unorthodox histidine-kinases, which are characterized by a more complex domain-structure compared to the classical sensor proteins. Since a long time it is known that the activity of BvgS can be modulated by several external stimuli. At low temperature or in the presence of nicotinic acid or sulfate, the protein is inactivated in vivo and therefore the respective system is switched off under these conditions. Moreover, it has been shown that the incubation of BvgS with oxidized ubichinone had an inhibitory effect on the autophosphorylation activity of the kinase (Bock & Gross, 2002). So far, the relevance for the signal perception of the additional BvgS-domains, like the periplasmic, the PAS- or the HPt-domain is still unclear. Therefore in this work a self-constructed Bordetella bronchiseptica specific gene bank was screened with the periplasmic, the PAS- and the HPt-Domain of BvgS for protein-interactions in the GAL4-yeast two-hybrid (YTH) system. All together four putative protein-interactions were found in the case of the periplasmic and the PAS domain after exclusion of false-positive clones and after going through corresponding controls, while on the other hand no protein interaction could be detected for the HPt domain. Among the detected putative protein interactions of the PAS domain the protein BB0602 was identified as an ATP binding protein of an ABC transport system for branched chain amino acids. This interaction could also be verified by GST-pull down assay. The biochemical proof for the other protein interactions still remains to be done. The results of the YTH screening indicate that the activity of BvgS and therefore the virulence gene expression might be influenced by the presence or absence of branched chain amino acids. Among others characterization of a B. bronchiseptica bb0602 deletion mutant with respect to the possible effect on the expression of bvg-dependent genes will further elucidate the relevance of the detected protein interaction between the BvgS-PAS domain and the BB0602 protein. Another aim of this work was the structural and functional characterization of the response regulator BvgA of B. holmesii (BvgABH). Recently, it was shown that despite extensive sequence conservation between the response regulator BvgA of B. holmesii and BvgA of B. pertussis (BvgABP), the BvgABH protein is not able to replace the function of the BvgABP protein in vitro and in vivo (Gerlach et al., 2004). Therefore in this work a hybrid response regulator protein BvgAfus was constructed, which contains the receiver and the linker domain of BvgABH and the output domain of BvgABP. A Prerequisite for this experiment was the knowledge of domain borders and linker sequences of BvgABP, which have been identified by means of limited proteolysis in combination with mass spectrometric methods (Bantscheff et al., 2000). In contrast to the BvgABH protein, the hybrid response regulator BvgAfus showed binding to BvgABP-dependent promoter sequences. Additionally, BvgAfus was able to induce the expression of BvgABP-dependent genes in vivo. But compared to the wild-type protein BvgABH the hybrid response regulator BvgAfus was limited in its phosphorylation efficiency. These results indicate that the inability of BvgABH to complement BvgABP in B. pertussis is due to the small number of sequence variations present in its output domain. The output domains of BvgABH and BvgABP differ in ten amino acids of which four amino acid substitutions are located in the helix-turn-helix motif (HTH). To investigate whether the different binding and transcription activating properties of BvgABH are due to the sequence variations in the HTH, the sequence was adjusted as compared to BvgABP by means of site directed mutagenesis. The resulting protein BvgABH* showed similar phosphorylation efficiency compared to the wild-type protein BvgABH but no specific binding to BvgABP-dependent promoter sequences and was not able to replace BvgABP functionally in vivo. This result indicates that the few additional amino acid differences outside of the HTH present in the output domain of BvgABH which do not interfere much with the phosphorylation efficiency of the protein influence its DNA binding properties. The identification of further BvgABH regulated genes of B. holmesii and the characterization of BvgABH binding sites will help to further clarify the functional differences between the orthologous BvgA proteins of B. holmesii and B. pertussis. KW - Bordetella KW - Genregulation KW - Bordetella KW - Genregulation KW - Bordetella KW - gene regulation Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21991 ER - TY - THES A1 - Williams, Tatjana T1 - Untersuchungen zur Rolle des Phosphoproteins Stathmin in Listeria monocytogenes-infizierten Säugerzellen und Molekulare Charakterisierung der listeriellen Zweikomponetensysteme T1 - The role of the phosphoprotein stathmin during an infection with Listeria monocytogenes and Molecular characterization of listerial two-componentsystems N2 - Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes besitzt die Fähigkeit, eukaryotische Wirtszellen zu penetrieren, sich in diesen zu vermehren, fortzubewegen und zwischen den Zellen auszubreiten. Im Zuge des intrazellulären Lebenszyklus gehen Listerien Wechselwirkungen mit ver-schiedenen zellulären Proteinen ein. Als eines dieser Proteine konnte das zelluläre Phosphoprotein Stathmin identifiziert werden. Dieses Protein bindet an Untereinheiten des Tubulins und destabilisiert dadurch Mikrotubuli (MT). Es wird durch Phosphorylierung von vier spezifischen Serinresten in seiner MT-destabilisierenden Aktivität reguliert. Da Stathmin als Antwort auf externe Signale zelluläre Funktionen, z. B. Zell-Proliferation und Differenzierung reguliert, vermutet man seine Funktion in einer Art Relais welches verschiedene Signale aus dem Umfeld der Zelle integriert. In mit L. monocytogenes infizierten Wirtszellen wird Stathmin an die Oberfläche intrazellulärer Bakterien rekrutiert. Inwiefern diese Rekrutierung das Phosphorylierungsmuster von Stathmin und damit dessen Aktivität beeinflusst, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Stathmin knock-out Mäuse sollten sich gut eignen, um die Rolle von Stathmin während einer Infektion mit L. monocytogenes EGD in vitro und in vivo zu untersuchen. Es stellte sich heraus, dass in Stathmin(-/-)-Makrophagen der intrazelluläre Lebenszyklus der Listerien nicht signifikant beeinflusst ist. Nach intravenöser Verabreichung von 5x103 L. monocytogenes waren drei Tage nach der Infektion in Leber und Milz der knock-out Mäuse allerdings signifikant mehr Listerien nachzuweisen, als in den Organen wildtypischer Mäuse. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und einem anti-Stathmin-Antiersum konnte an mit verschiedenen L. monocytogenes-Mutanten infizierten Zellen gezeigt werden, dass Stathmin mit der Oberfläche intrazellulärer Listerien kolokalisiert. Allerdings konnten dabei die Angaben in der Literatur nicht bestätigt werden, wonach für diese Kolokalisation die Expression von ActA notwendig ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen im Gegensatz zu den publizierten Daten dafür, dass Stathmin über einen bisher noch unbekannten Mechanismus ActA-unabhängig an intrazelluläre Listerien rekrutiert wird. Zweikomponentensysteme ermöglichen Bakterien eine rasche Anpassung an sich verändernde Umweltbedingungen, da sie extra- und intrazelluläre Stimuli in zelluläre Signale umwandeln. Um die 16 in der Genomsequenz von L. mono-cytogenes EGDe identifizierten Zweikomponentensysteme charakterisieren zu können, wurden individuelle Mutanten konstruiert, in denen individuelle Response Regulatorgene deletiert sind. Die erhaltenen Mutanten wurden in vitro und in vivo auf ihr Wachstumsverhalten hin untersucht. Es zeigte sich, dass unter den angewandten Kultur- und Versuchsbedingungen keines der Zweikomponentensysteme eine signifikante Rolle bei der Anpassung an Temperatur, sowie an oxidativen oder osmotischen Stress spielt. Die Zugabe von 5 % Ethanol hatte einen stark hemmenden Effekt auf das Wachstum von 4 Mutanten, wohingegen zwei andere Mutanten in Gegenwart des Alkohols deutlich besser wuchsen. Unter anaeroben Bedingungen konnte kein Unterschied im Wachstum beobachtet werden. Die Expression wichtiger Virulenzgene war in keiner der untersuchten Mutanten im Vergleich zum Ausgangsstamm verändert. Die intrazelluläre Replikation sowie intrazelluläre Bewegung und Ausbreitung im Zellrasen waren durch die Deletion der Response Regulatorgene nicht beeinträchtigt. Abgesehen von geringen Unterschieden in der Invasivität einiger Deletionsmutanten für Cos-1 und Caco-2 Zellen zeigte sich keiner der Response Regulatoren für den intrazellulären Lebenszyklus von L. monocytogenes erforderlich. Es zeigte sich, dass der in der vorliegenden Arbeit verwendete L. monocyto-genes-Wildstamm auch bei der für die Flagellenexpression normalerweise nicht-permissiven Temperatur von 37° C noch beweglich ist. Die L. monocytogenes ΔdegU-Mutante war dagegen auf Weichagar temperaturunabhängig unbeweglich. Die elektronenmikroskopische Analyse ergab, dass dieser Stamm im Gegensatz zum Wildtyp auch bei 24° C keine Flagellen ausbildet. Durch vergleichende Proteomanalysen konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes ΔdegU bei 24° C wesentliche Proteine des Flagellenapparates nicht synthetisiert. Mittels Transkriptomanalysen konnten die Ergebnisse der Proteomanalysen bestätigt werden. Es wurden neben Genen, die für Proteine der Flagellenbiosynthese und Chemotaxis codieren, noch weitere Gene identifiziert, die offensichtlich unter der transkriptionellen Kontrolle des Response Regulators DegU stehen. Die Ergebnisse der in vivo Studien zeigten, dass L. monocytogenes ΔdegU deutlich virulenzattenuiert ist. Für die restlichen L. monocytogenes ΔTCS-Mutanten waren im Vergleich zum Wildtyp die Unterschiede in Leber und Milz nur leicht verändert und statistisch nicht signifikant. N2 - The facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes is able to penetrate eukaryotic host cells, to multiply and move intracellularly and to spread between the cells. In the course of the intracellular lifecycle the listeriae interact with different cellular proteins. The cellular phosphoprotein stathmin was identified as one of these proteins. This protein binds to the tubulin subunits thereby destabilizing microtubules. It is regulated in its microtubule-destabilizing activity via phosphorylation of four specific serine residues. Since stathmin regulates cellular functions, i. e. cell proliferation and differentiation, its function is presumed in acting as a type of relay integrating different signals of the cell´s environment. In L. monocytogenes infected host cells stathmin is recruited to the bacterial cell surface. Whether and to which extent this recruitment influences the phosphorylation pattern of stathmin and thereby its activity, could not be identified during this work. Stathmin knock-out mice should be valuable for experimentally testing the influence of stathmin in an infection with L. monocytogenes in vitro and in vivo. It appeared that the listerial intracellular lifecycle is not significantly influenced in stathmin(-/-) macrophages. However, three days after intravenous application of 5x103 L. monocytogenes EGD the bacterial load in liver and spleen of stathmin knock-out mice was significantly higher than in organs of wildtype mice. By means of immunfluorescence microscopy with an anti-stathmin antiserum it could be revealed that within infected cells stathmin colocalizes with the listerial cell surface. Data from the literature, however, suggesting that this recruitment of stathmin is dependent upon the expression of ActA, could not be confirmed implicating stathmin to be recruited in an up to now unknown ActA-independent manner. Two-component systems enable bacteria to efficiently adapt to changes in the environment by converting extra- and intracellular signals into cellular responses. In order to characterize the 16 identified two-component systems of L. monocytogenes EGDe in detail individual mutants with deletions in each one of the response regulator genes were constructed. The growth characteristics of the mutants were examined in in vitro and in vivo experiments. It appeared that under the culture and test conditions applied, neither one of the TCS plays a role for adapting to temperature, as well as oxidative or osmotic stress. The addition of 5 % ethanol severely impaired growth of 4 of the mutants, whereas growth of two other mutatns was enhanced. No difference in growth between wildtype listeriae and the individual mutants was observed when the cells were grown anaerobically. Expression of important virulencefactor genes was not altered in the mutants tested compared to the wildtype strain. Intracellular replication as well as intracellular movement and spreading was not affected by either one of the response regulator gene deletions. Despite a slightly reduced invasiveness of a few deletion mutants for Cos-1 and Caco-2 cells none of the response regulators appeared to be necessary for the intracellular lifecycle of L. monocytogenes. The wildtype strain used throughout this work proved to be motile even at 37° C, a temperature usually non-permissive for flagellin expression. In contrast, the L. monocytogenes ΔdegU mutant displayed a non-motile phenotype on semisolid agar irrespective of the temperature applied. Electron microscopical analysis demonstrated that, unlike the wildtype strain EGD, this deletion mutant did not produce flagella, not even at 24° C. Comparative proteomics revealed that at 24° C L. monocytogenes ΔdegU did not produce the major components of the flagella apparatus. The results of transcriptome analysis were in line with the results of the proteome analysis and, aside of genes for flagella biosynthesis and chemotaxis, identified other genes obviously under transcriptional regulation by DegU. In vivo studies revealed that only L. monocytogenes ΔdegU showed a conspicuous virulence attenuation. There were significantly less bacteria in liver and spleen compared to an infection with the wildtype strain L. monocytogenes EGD. For the other L. monocytogenes ΔTCS-mutants the difference of bacterial counts in liver and spleen compared to the wildtype was slightly altered but not statistically significant. KW - Phosphoproteine KW - Säugetiere KW - Listeria monocytogenes KW - Infektion KW - Listeria monocytogenes KW - Stathmin KW - Zweikomponentensystem KW - Listeria monocytogenes KW - stathmin KW - two-componentsystems Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15388 ER - TY - THES A1 - Zunker, Katrin T1 - Untersuchungen zur Rolle der Mikrosatelliteninstabilität in hereditären Melanomen von Xiphophorus sowie zur Integrität von Elementen der Zellzykluskontrolle/DNA-Reparatur T1 - Genomic stability in hereditary malignant melanoma of Xiphophorus N2 - Die Bedeutung der genomischen Instabilität in humanen melanocytischen Läsionen ist Gegenstand vieler dermatologischer Studien und bis heute ungeklärt. Ist die Mikrosatelliteninstabilität bloße Begleiterscheinung der unkontrolliert proliferierenden Tumorzellen oder wird ihr ein pathogenetischer Mechanismus zuteil? In Fischen der Gattung Xiphophorus können durch klassische Kreuzungsexperimente melanocytische Läsionen verschiedener Malignitätsgrade induziert werden. Diese Läsionen sind auf Grund ihres genetisch kontrollierten Hintergrundes eindeutig definiert und reproduzierbar - und damit im Vorteil gegenüber der unsicheren Klassifikation humaner Hautläsionen. In der vorliegenden Arbeit wurde hauptsächlich der Frage nachgegangen, ob MIN+ ein obligates molekulares Ereignis für die Progression von Melanomen bis zum terminalen Stadium darstellt. Dieser Fragestellung wurde unter Verwendung PCR-basierter Mikrosatellitenanalysen sowie Multilocus DNA-Fingerprint Analysen nachgegangen. 23 Tumoren unterschiedlicher Malignität wurden im Vergleich zum tumorfreien Normalgewebe desselben Fisches an 12 Genloci unbekannter chromosomaler Lokalisation auf Mikrosatelliteninstabilität untersucht. Es wurde insgesamt eine Zahl von 263 informativen Loci erzielt, von denen sich nur 20 ( = 7.6%) als instabil erwiesen. Mittels der Multilocus-Fingerprint Analysen wurden 8 Melanome und deren korrespondiere Normalgewebe mit drei Sonden hybridisiert. Nur einer von 12 analysierbaren MLFPs zeigte eine genetische Aberration in Form einer Deletion einer einzelnen Bande im Tumorgewebe. Mit diesem Ergebnis wurde das in der Mikrosatellitenanalyse erhaltene Resultat einer nicht signifikanten Mikrosatelliteninstabilität im Xiphophorus-Melanom-Modell System bestätigt. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Abwesenheit eines MIN+-Phänotypen in den Melanomen von Xiphophorus darauf hinweist, daß der Erwerb von MIN weder ein notwendiges Kriterium für die Initiation eines Tumors noch für seine Progression darstellt. Ein anderer Pfad der Tumorinitiation ist die direkte Schädigung oder der Verlust von Tumorsuppressorgenen, von in Mismatch Repair involvierten Genen oder durch die Transformation von Proto-Onkogenen zu Onkogenen. In dieser Arbeit wurde die Expression von drei Genen, die in der Regulation des Zellzyklus Schlüsselrollen spielen (rb, p53, cdkn2a), sowie einer Komponente des MMR-Systems (MSH2) auf RNA-Ebene untersucht. Ihre Expressionsstärke wurde in folgenden Geweben miteinander verglichen: Maligne Melanome, benigne Läsionen, tumorfreie Kontrollgewebe und die Xiphophorus-Melanomzellinie (PSM). MSH2 und p53 wurden in allen untersuchten Geweben auf gleichem Niveau exprimiert. Die vergleichende Expressionsanalyse des vermeintlichen "melanoma susceptibility gene" cdkn2a im Melanom-Modell und der PSM-Zellinie bestätigte die bereits vorbeschriebene Überexpression des Zellzyklusinhibitors in malignen Melanomen von Xiphophorus-Hybriden. Die Untersuchung des Expressionsmusters von Rb in den oben genannten Geweben ergab eine verminderte Transkription dieses Gens in malignen Melanomen. Eine mögliche Interpretation dieses Ergebnisses wäre, einen Defekt in Rb oder pRB zu Grunde zu legen und die Hochregulation von cdkn2a entsprechend einer negativen Rückkopplungsschleife als physiologische Konsequenz anzusehen. N2 - Microsatellite instability is a feature of many tumours and is indicative of a generalized genomic instability of cancer cells. Whether this phenomenon is essential for tumorigenesis and whether it is an early or late step is still a matter of debate. In the Xiphophorus melanoma model, the primary steps leading to tumour formation are known and include overexpression of a mutationally altered epidermal growth factor receptor and the resulting defects in signalling. We have analysed the late stages of melanoma progression for microsatellite instability. Although several types of microsatellite allele alteration in DNA from tumours relative to DNA from non-tumour tissue were found, the frequency was rather low (7.6%). Thus, although the tumours show a wide range of malignancy and agressiveness, genomic instability that becomes apparent as microsatellite instability does not appear to be an obligatory step for melanoma progression. KW - Mikrosatellit KW - Melanom KW - Fisch KW - genetischer Fingerabdruck KW - Zellzykluskontrolle KW - Microsatellite KW - genomic stability KW - fish KW - hereditary melanoma KW - cell cycle control Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21736 ER - TY - THES A1 - Wende, Elisabeth Sophie T1 - Untersuchungen zur Rolle der melanominduzierenden Rezeptortyrosinkinase Xmrk bei der Migration melanozytärer Zellen T1 - A role for the melanoma-inducing receptor tyrosine kinase Xmrk in the migration of melanocytic cells N2 - Das maligne Melanom ist ein Hauttumor mit steigender Inzidenz und hohen Mortalitätsraten. Da die molekularbiologischen Ereignisse, die der Melanomentwicklung zugrundeliegen, nur unzureichend bekannt sind, gibt es kaum spezifische Therapieansätze. Zur Untersuchung der Melanomentwicklung eignet sich das Xiphophorus-Modell. In diesem System ist die Anwesenheit der RTK Xmrk ausreichend, um durch Aktivierung proliferativer und entdifferenzierender Signalwege und Apoptoseinhibition Melanome zu verursachen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Xmrk auch die Migration der Melanozytenzellinie Melan a-Hm induzieren kann. Die Migration der durch Xmrk transformierten Zellen ist amöboid und unabhängig von MAPK- und PI3K-Signalwegen. Eine Funktion bei der Migration haben jedoch die Kinasen FAK und Fyn. Sie bilden möglicherweise einen Proteinkomplex, der für FAK und Src aus zahlreichen anderen Systemen bekannt ist und als Signalplattform für die Zellmigration fungiert. Diese Erkenntnisse können dazu beitragen, das Xiphophorus-Modell weiterzuentwickeln und die Grundlagen der Melanomgenese besser zu verstehen. N2 - Malignant melanoma is a tumor of the skin with increasing incidence and high mortality rates. As the biomolecular events underlying melanoma development are poorly understood, specific therapeutics for this disease are few. The Xiphophorus system is suitable for studying melanoma development. In this model, presence of the RTK Xmrk is sufficient to initiate melanoma formation by activating proliferative and anti-apoptotic pathways and interfering with differentiation. This work demonstrates that Xmrk is also able to induce migration of the melanocytic cell line Melan a-Hm. Cells transformed by Xmrk migrate in amoeboid fashion, independently of MAPK or PI3K pathways. However, kinases FAK and Fyn are involved in Melan a-Hm migration, possibly as a signal-integrating protein complex similar to the role that has been described for FAK and Src in various systems. The results from this work serve to extend the Xiphophorus model to other aspects of melanoma development and may help to better understand the molecular basis of melanoma. KW - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor KW - Melanom KW - Zellmigration KW - Src-Proteine KW - Xiphophorus KW - fokale Adhäsionskinase (FAK) Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70945 ER - TY - THES A1 - Riedel, Alexander T1 - Untersuchungen zur endogenen MHC-Klasse-II-restringierten Präsentation nukleärer Antigene T1 - Investigation of the endogenous MHC class II-restricted presentation of nuclear antigens N2 - Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf Major-Histokompatibilitätskomplex Klasse-II (MHC-II) -Molekülen ist von entscheidender Bedeutung für eine Reihe von immunologischen Prozessen. Die mechanistischen Grundlagen dieses Präsentationsweges sind aber noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum molekularen Verständnis der Abläufe zu leisten, die an der endogenen Präsentation nukleärer Antigene auf MHC-II-Molekülen beteiligt sind. Dazu sollte am Beispiel des nukleär lokalisierten Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase II (NucNeoR) sowie des viralen Kernantigens Epstein-Barr-virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) und entsprechender antigenspezifischer MHC-II-restringierter CD4+ T-Zellen die verantwortlichen Präsentationswege in professionell und nicht-professionell antigenpräsentierenden Zellen untersucht werden. In beiden Zellsystemen wurde NucNeoR über einen endogenen Präsentationsweg und nicht über die Freisetzung und Wiederaufnahme als exogenes Protein auf MHC-II-Molekülen präsentiert. Durch die Verwendung chemischer Inhibitoren konnte eine Beteiligung der Autophagie an der endogenen Antigenpräsentation nachgewiesen werden. Da Autophagie ausschließlich im Zytoplasma stattfindet, wurde nach möglichen Eintrittspforten für nukleäre Proteine in diesen Abbauweg gesucht. Für die Autophagie-abhängige Präsentation von NucNeoR war weder ein CRM1-vermittelter aktiver Export des Antigens aus dem Kern ins Zytoplasma, noch eine Auflösung der Kernmembran im Rahmen der Zellteilung und der dadurch bedingten Durchmischung nukleärer und zytoplasmatischer Bestandteile notwendig. Mit Hilfe eines konditionalen Antigenexpressionsystems und der Auftrennung antigenexprimierender Zellen nach Zellzyklusphasen konnte eine verstärkte Antigenpräsentation in der G1/0-Phase nachgewiesen werden, die mit fortschreitendem Zellzyklus immer mehr abnahm. Die Antigenpräsentation korrelierte dabei mit der ebenfalls im Laufe des Zellzyklus abnehmenden Transkriptions- bzw. Translationsrate des Antigens, aber nicht mit der absoluten Menge an Antigen in den Zellen. Bei abgeschalteter Antigentranskription dagegen korrelierte die Antigenpräsentation mit der MHC-II-Oberflächenexpression, die von der G1/0- bis hin zur G2/M-Phase kontinuierlich zunahm. Eine ähnliche Korrelation von Antigentranskription/ Antigentranslation und Autophagie-abhängiger Antigenpräsentation wurde auch für EBNA3C und die zytoplasmatisch lokalisierte NeoR-Variante beobachtet. Diese Ergebnisse identifizieren die Autophagie-abhängige Präsentation neusynthetisierter Proteine als den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene Präsentation der untersuchten nukleären Antigene auf MHC-II-Molekülen. Durch die Kopplung von Translation und autophagischem Abbau erlangen Proteine unabhängig von ihrer subzellulären Lokalisation Zugang zu diesem Präsentationsweg und erweitern so das Spektrum der intrazellulären Antigene, die einer CD4+ T-Zellüberwachung unterliegen. N2 - The endogenous presentation of intracellular antigens on major histocompatibility complex class II (MHC-II) molecules plays an important role in adaptive immune responses, but the underlying molecular mechanisms are not well understood. The aim of this study was to gain insight into the endogenous presentation pathways for nuclear antigens on MHC-II molecules. By using antigen-specific CD4+ T cell clones, MHC-II presentation of the nuclear antigens neomycin phosphotransferase II (NucNeoR) and Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) was studied in professional and non-professional antigen presenting cells (APC). Both types of APC presented peptides derived from these nuclear proteins on MHC-II molecules by an endogenous presentation pathway and not by release and reuptake as exogenous protein. Inhibition of autophagy drastically reduced endogenous antigen presentation, indicating that nuclear proteins enter the MHC-II processing and loading compartment through autophagic vesicles. Because autophagocytosis occurs in the cytoplasm, potential entry routes for nuclear proteins into this pathway were investigated. Endogenous presentation of NucNeoR on MHC-II molecules by autophagy did neither involve the CRM1-mediated export of the nuclear protein into the cytoplasm, nor the redistribution of nuclear and cytoplasmic components following the dissolution of the nuclear envelope during mitosis. Conditional antigen expression and cell cycle phase separation of antigen-expressing cells revealed that antigen presentation was maximal in cells in G1/0 and then gradually decreased as cells progressed in the cell cycle. This reduction in antigen presentation correlated with a cell cycle-dependent decrease in antigen transcription/translation, but not with the total amount of antigen present in these cells. By contrast, when antigen expression was turned off, antigen presentation correlated with MHC-II surface expression, which increased from G1/0- to G2/M-phase. A similar correlation between antigen presentation and antigen transcription/translation was also observed for the antigens EBNA3C and the cytosolic variant of neomycin phosphotransferase II (NeoR). These results identify autophagocytosis of newly-synthesized proteins as the molecular mechanism mediating endogenous presentation of nuclear and cytosolic antigens on MHC-II molecules. By coupling protein translation and autophagocytosis, newly-synthesized proteins gain access to the endogenous MHC-II presentation pathway irrespective of their subcellular localisation and thereby broaden the spectrum of intracellular antigens that are presented to CD4+ T cells. KW - Autophagie KW - Antigenpräsentation KW - MHC KW - nukleäre Antigene KW - T-Zellen KW - autophagy KW - antigen presentation KW - MHC KW - nuclear antigen KW - T Lymphocytes Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25183 ER - TY - THES A1 - Hüttinger, Christian T1 - Untersuchungen zur Aufklärung der In-vivo-Funktion des Zytolysins ClyA von Escherichia coli T1 - Analysis of the in vivo-function of the cytolysin ClyA from Escherichia coli N2 - Porenbildende Zytolysine stellen wichtige Virulenzfaktoren von vielen pathogenen Bakterien dar. In Escherichia coli-Stämmen wurden bisher drei verschiedene porenbildende Zytolysine identifiziert, nämlich das alpha-Hämolysin (HlyA), das EHEC-Hämolysin (EHEC-HlyA, Ehx) und das latente Hämolysin ClyA. Alpha-Hämolysin und EHEC-Hämolysin, die beide zur Familie der RTX-Toxine gehören, werden häufig von uropathogenen bzw. enterohämorrhagischen E. coli-Stämmen gebildet. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, daß das alpha-Hämolysin maßgeblich an der Pathogenität von uropathogenen E. coli-Stämmen beteiligt ist. Das Hämolysin ClyA, ein Protein von 34 kDa das keine Homologien zu den RTX-Toxinen aufweist, wurde zuerst im Laborstamm E. coli K-12 identifiziert, wo es unter normalen in vitro-Kulturbedingungen nur in sehr geringem Ausmaß exprimiert wird. Ein funktionales clyA-Gen wurde kürzlich aber auch in verschiedenen pathogenen E. coli-Stämmen, u. a. in enteroinvasiven E. coli (EIEC)-Stämmen, gefunden. Bislang ist jedoch unbekannt, ob ClyA eine Rolle in der Virulenz von pathogenen E. coli-Stämmen spielt. Die vorliegende Arbeit sollte deshalb zur Aufklärung der in vivo-Funktion von ClyA in E. coli beitragen. Im Mittelpunkt des Interesses stand dabei die Frage nach der Bedeutung von ClyA für EIEC-Stämme, die zur fakultativ intrazellulären Lebensweise befähigt sind. Ausgewählte wildtypische EIEC-Stämme (EIEC 12860, EIEC 4608-58) zeigten von sich aus bzw. bei Überexpression des Transkriptionsregulators SlyA phänotypisch sichtbare hämolytische Aktivität, während in vitro konstruierte isogene clyA-"knock-out"-Mutanten dieser Stämme stets nichthämolytisch waren. Daraus konnte geschlossen werden, daß die wildtypischen EIEC-Stämme in der Lage sind, ClyA in signifikanten Mengen zu exprimieren. Vergleichende Infektionsstudien, die mit dem EIEC-Stamm 4608-58 und der entsprechenden clyA-Mutante unter Verwendung von J774-Makrophagen durchgeführt wurden, ergaben außerdem, daß ClyA wesentlich zur Zytotoxizität des wildtypischen EIEC-Stamms beiträgt. Eine spezielle Bedeutung von ClyA für die fakultativ intrazelluläre Lebensweise von EIECs konnte mit diesen Versuchen allerdings nicht nachgewiesen werden. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, daß im Fall des fakultativ intrazellulären Bakteriums Listeria monocytogenes ein porenbildendes Toxin, Listeriolysin O (LLO), nach der Invasion in phagozytische Zellen die Befreiung der Bakterien aus dem Phagosom ermöglicht. Es stellte sich deshalb die Frage, ob ClyA bei EIECs möglicherweise eine ähnliche Rolle spielt. Um dies herauszufinden, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit ClyA von E. coli in der Lage ist, LLO in L. monocytogenes funktional zu ersetzen. Hierzu wurden L. monocytogenes-Mutanten, die aufgrund von chromosomalen Deletionen nicht in der Lage waren, LLO zu produzieren, mit verschiedenen Plasmiden komplementiert, welche clyA bzw. clyA-Derivate unter der Kontrolle der Promotorregion des LLO-Gens (hly) enthielten. Einige dieser komplementierten Stämme exprimierten und sezernierten tatsächlich das ClyA-Protein und zeigten dementsprechend auch einen hämolytischen Phänotyp. Dieselben Stämme waren jedoch bei Infektionen in J774-Zellen nicht in der Lage, sich intrazellulär signifikant zu vermehren, obwohl teilweise eine Befreiung der Bakterien aus dem Phagosom zu beobachten war. Diese Daten zeigten, daß das ClyA-Protein von E. coli das Listeriolysin O von L. monocytogenes nicht funktional ersetzen kann. Eine mögliche Funktion von ClyA als Phagosomenöffner in EIECs kann aufgrund der vorliegenden Ergebnisse jedoch nicht ausgeschlossen werden. N2 - Pore-forming cytolysins are important virulence factors of many pathogenic bacteria. In E. coli strains, three different pore-forming cytolysins have been identified so far:alpha-hemolysin (HlyA), EHEC-hemolysin (EHEC-HlyA; Ehx) and the cryptic hemolysin (ClyA). alpha-hemolysin and EHEC-hemolysin are frequently produced by uropathogenic and enterohaemorrhagic strains. Both toxins are related cytolysins and belong to a large family referred to as RTX-toxins. Among these, alpha-hemolysin has been most extensively studied. Futher experiments have shown that alpha-hemolysin which is produced by uropathogenic E. coli strains (UPEC), contributes to the virulence of UPEC. Recently, the cryptic hemolysin ClyA, a protein of about 34 kDa showing no homology to any member of the RTX-family was identified in the laboratory strain E. coli K-12. Under standard in-vitro-laboratory conditions ClyA is not produced at detectable levels. Further studies demonstrated that clyA is not only present in E. coli K12 but also a functional clyA-gene has been detected in various pathogenic E. coli isolates (p.e. enteroinvasive E. coli strains). So far, the role of ClyA for the virulence of pathogenic E. coli strains is unknown. Therefore, in that work the in-vivo function of ClyA of pathogenic E. coli strains was investigated. Especially, in enteroinvasive E. coli (EIEC) strains, which are able to replicate intracellulary in mammalian cells and to evade into the cytoplasm of the host cell, the relevance of ClyA for EIEC strains is unknown. Carefully selected wildtyp EIEC strains (EIEC 12860, EIEC 4608-58) showed a clear hemolytic phenotyp per se and after overproduction of the positive regulatory protein SlyA, respectively, while in ClyA-knock-out-mutants of these wildtyp EIEC strains a hemolytic phenotyp has never been observed. All these findings indicate that ClyA is expressed in significant amounts in wildtyp EIEC strains under standard in-vitro-laboratory conditions. Further infection studies with J774 macrophages by using the EIEC strain 4608-58 and a isogenic ClyA deletion mutante, respectively, revealed that ClyA is a strong cytolysin in wildtyp EIEC strains, which contributes to the cytotoxicity of these wildtyp EIEC strains. But a special relevance of ClyA for the intracellulary growth of EIEC could not be seen in any of these experiments. Recent studies showed that the facultative intracellulary bacteria Listeria monocytogenes produce the poreforming toxin listeriolysin O (LLO), which allows L. monocytogenes by opening the phagosomal membrane to evade into the cytoplasma of the host cell after invasion into a phagocytic cells. However, the mechanism which allows EIEC strains to penetrate the phagosomal membran is still unknown. ClyA might play a similar role for opening the phagosomal membran after invasion of EIEC into host cells. In this work it has been investigated wether ClyA of E. coli might functionally replace LLO of L. monocytogenes. In addition, L. monocytogenes LLO mutants which have a chromosomal deletion of the LLO gene and thereby lost the ability to produce LLO, were complemented with several plasmids. These plasmids carrying clyA and clyA-derivates under the control of the listeriolysin O promotorregion, respectively, were substituted for the listeriolysin O gene in the L. monocytogenes LLO mutants. Some of the recombinant L. monocytogenes strains expressed ClyA and showed hemolytic activity and a hemolytic phenotyp. Further experiments with J774 macrophages revealed that some of these recombinant L. monocytogenes strains seemed to open the phagosomal membrane. In consequence some bacteria were able to escape from the phagosomal compartment, but were not able to grow in the cytosol of infected cells. However, when ClyA were expressed in recombinant L. monocytogenes strains, a fully virulence phenotype could not be restored in-vitro. Due to these findings, ClyA of E. coli might be involved in the opening of the phagosomal membrane and the virulence of EIEC strains. KW - Escherichia coli KW - Perforine KW - Zytolsin KW - Hämolysin KW - ClyA KW - EIEC KW - cytolysin KW - ClyA KW - EIEC Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6817 ER - TY - THES A1 - Hassel, Jessica C. T1 - Untersuchungen zur Apoptoseregulation durch die Melanom induzierende Rezeptortyrosinkinase Xmrk T1 - Investigations on apoptosis regulation by the melanoma inducing receptor tyrosine kinase Xmrk N2 - Überexpression der konstitutiv aktiven Rezeptortyrosinkinase Xmrk im Zahnkarpfen Xiphophorus führt zur Ausbildung maligner Melanome. Expressionsstudien in transgenen Medaka-Fischen haben gezeigt, daß Xmrk allerdings nur in bestimmten Geweben wie Hirn, Epithelien, Auge und Pigmentzellen zur Tumorbildung führt. Zellen, die durch Xmrk transformiert werden können, scheinen somit über entsprechende Komponenten der durch Xmrk induzierten intrazellulären Signaltransduktion verfügen zu müssen. Bisher wurde eine Reihe von Signalproteinen identifiziert, die von Xmrk rekrutiert und aktiviert werden. Dazu gehören die PLC-g, die Adapterproteine Shc und Grb2, die PI3K, die Fyn-Kinase aus der Familie der Src-Kinasen und der Transkriptionsfaktor STAT5. Um die Signaltransduktion von Xmrk in induzierbarer Form untersuchen zu können, wurde eine mit EGF stimulierbare Rezeptorchimäre HER-mrk, deren extrazellulärer Anteil vom humanen EGF-R und deren intrazellulärer Anteil von Xmrk stammt, in der IL-3 abhängigen murinen pro-B-Zellinie Ba/F3 exprimiert. EGF-Stimulation dieser als BaF Hm bezeichneten Zellen führt zu IL-3 unabhängigem Wachstum und zu Langzeitüberleben. Stimulation des aus der gleichen Genfamilie stammenden EGF-Rezeptors hingegen, wird er in Ba/F3 Zellen exprimiert, kann kein Langzeitüberleben vermitteln. Erste Untersuchungen zeigten, daß das durch HER-mrk vermittelte Langzeitüberleben in Ba/F3 Zellen nicht auf einer höheren Rezeptorexpression verglichen mit den EGF-R exprimierenden Zellen beruht. Allerdings korreliert die Rezeptordichte mit der DNA-Syntheseleistung der Ba/F3 Zellen. Durch verschiedene carboxyterminal verkürzte HER-mrk Rezeptormutanten wurde eine unterschiedliche Anzahl von Substratbindungsstellen von Xmrk deletiert. Expression dieser HER-mrk Rezeptormutanten in Ba/F3 Zellen zeigte, daß für die Auslösung der Replikation der DNA keine C-terminale Substratbindungsstelle notwendig ist, während für eine Vollendung der Zellteilung mit Zellvermehrung und für Langzeitüberleben zwei membrannahe Substratbindungsstellen ausreichend sind. Der Vergleich der durch die verschiedenen Rezeptoren induzierten Signalwege bzw. der Substratinteraktionen von HER-mrk, seinen Mutanten und dem EGF-R gab Hinweise auf für die Antiapoptose entscheidende Signalwege. Untersuchungen zur Aktivierung von STAT1, 3 und 5 zeigten, daß HER-mrk zu einer Aktivierung aller drei STAT-Proteine führt, während der EGF-R in Ba/F3 Zellen nur STAT1 und 3, nicht aber STAT5 aktivieren kann. Die HER-mrk Rezeptormutanten zeigten, daß für die Aktivierung von STAT5 durch HER-mrk keine carboxyterminale Substratbindungsstelle notwendig ist, diese aber möglicherweise durch Stabilisierung der Rezeptorbindung seine Aktivierung verstärken. Für die Aktivierung von STAT1 und 3 hingegen sind carboxyterminale Substratbindungsstellen entscheidend. Das für ein antiapoptotisches Protein kodierende STAT5-Zielgen bcl-X wurde als HER-mrk Zielgen identifiziert. Auch die schwächere STAT5 Aktivierung durch die trunkierte HER-mrk Rezeptormutante Hm delta1006 hatte eine bcl-X Transkription zur Folge, während der EGF-R bcl-X nicht induzierte. Untersuchungen weiterer antiapoptotischer Signalwege zeigten, daß die mrk-Kinase sowie ihre Rezeptormutante Hm delta1006 im Gegensatz zum EGF-R auch zu einer Induktion von bcl-2 führen. Da diese Mutante kein Langzeitüberleben vermittelt, ist somit die Induktion der Genexpression antiapoptotischer Proteine wie Bcl-XL und Bcl-2 nicht ausreichend für Antiapoptose. Es bedarf somit der Kombination mehrerer antiapoptotischer Signalwege, um Langzeitüberleben zu sichern. Expression der Rezeptorchimäre HER-mrk in murinen Melanozyten führt bei Stimulation der mrk-Kinase zur Transformation der Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine starke Induktion von bcl-X nach HER-mrk Stimulation in den Melanozyten nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung humaner Melanomzellinien, die in der Expression verschiedener Rezeptortyrosinkinasen oft ein sehr unterschiedliches Muster zeigen, konnte eine konstitutive Aktivität von STAT5 in allen untersuchten Zellinien nachgewiesen werden, während STAT1 und 3 nur eine schwache und inhomogene Basalaktivität aufwiesen. Es zeigt sich folglich ein ähnliches Bild wie im Xiphophorus-Melanom, in dem ausschließlich STAT5 konstitutiv aktiv ist. Die untersuchten humanen Melanomzellinien zeigten durchweg eine Expression von Bcl-XL. Andere Signalwege wie z.B. die Aktivierung der MAPK hingegen zeigten ein heterogenes Muster bei den verschiedenen Zellinien. Erste Experimente in A375 Zellen deuten darauf hin, daß die Expression von dominant negativem STAT5 zur Reduktion der bcl-X Transkription und zur Apoptose der Zellen führt (Wellbrock, unveröffentlicht). Der STAT5/Bcl-XL Signalweg scheint folglich ganz entscheidend für die Antiapoptose von Melanomen zu sein. N2 - Overexpression of the constitutively active receptor tyrosine kinase Xmrk, a member of the EGF-R family, in the fish Xiphophorus leads to the formation of malignant melanoma. Studies in transgenic Medaka fish showed that Xmrk only induced tumour formation in distinct tissues like brain, epithelia, eye and pigment cells. This showed that cells, which can be transformed by Xmrk need to have the appropriate components of the Xmrk signal transduction pathways. Until now PLC-g, the adaptor proteins Shc and Grb2, PI3K, the Src kinase Fyn and the transcription factor STAT5 have been identified as signalling proteins recruited and activated by Xmrk. To further investigate the mrk kinase induced signal transduction the receptor chimera HER-mrk was expressed in the IL-3 dependent pro-B cell line Ba/F3. This receptor chimera consists of the extracellular part of the human EGF receptor and the intracellular part of Xmrk. EGF stimulation, therefore, leads to mrk specific signalling in Ba/F3 cells. In HER-mrk expressing Ba/F3 cells EGF can replace the physiological growth factor IL-3 for proliferation and long term survival. In contrast stimulation of the EGF receptor if expressed in Ba/F3 cells does not have this effect. The long term survival triggered by HER-mrk was not based on higher receptor densities of HER-mrk expressing Ba/F3 cells compared to EGF-R expressing ones. Even a strong EGF-R expression could not mediate long term survival whereas even a low HER-mrk receptor expression was sufficient. Expression of C-terminal truncated HER-mrk receptor mutants in Ba/F3 cells showed that for induction of DNA synthesis no C-terminal substrate binding site is needed and that to complete cell division and for long term survival the two membrane proximal binding sites are important. This made it possible to define the crucial pathways for antiapoptotic signalling. Further analysis revealed that Her-mrk activates STAT1, 3 and 5 proteins, whereas the EGF-R could only activate STAT1 and 3, but not STAT5 in Ba/F3 cells. Strikingly, the HER-mrk receptor mutants showed that STAT5 activation by HER-mrk is not dependent on one of the known substrate binding sites but that C-terminal phosphotyrosines enhance the activation of STAT5, possibly by stabilizing the binding to the receptor. For the activation of STAT1 and 3, however, C-terminal substrate binding sites are needed. With regard to antiapoptotic signalling pathways a possible induction of the STAT5 target gene bcl-X has been investigated. Indeed, HER-mrk leads in contrast to the EGF-R to an induction of bcl-X transcription. Even the weaker STAT5 activation by the HER-mrk receptor mutant Hm delta1006 is followed by bcl-XL expression. Investigation of other antiapoptotic singalling pathways showed that the mrk kinse also leads to an induction of bcl-2 expression in contrast to the EGF-R. Strinkingly this was also seen for the receptor mutant Hm delta1006, which is not able to mediate long term growth in Ba/F3 cells. Therefore induction of the expression of the antiapoptotic proteins bcl-XL and bcl-2 seems not to be sufficient for long term survival. This suggests that a combination of different pathways is needed. Expression of the receptor chimera HER-mrk in murine melanocytes induces transformation of the cells under treatment with EGF. With this study it could be shown that mrk stimulation in these melanocytes leads to a strong induction of bcl-X which seems to be based on the activation of STAT5. Investigation of different human melanoma cell lines which often show varying expression of different receptor tyrosine kinases revealed constitutive activation of STAT5 in all of the tested cell lines. STAT1 and 3 however were only weakly activated and showed different activation patterns in the melanoma cell lines. Therefore in human melanoma cell lines a similar picture as for the Xiphophorus melanoma was found. While bcl-XL could not be investigated in the fish melanoma due to lacking cross reactivity of the antibody, northern probes and RT-PCR primers, the human melanoma cell lines showed expression of bcl-XL. Other pathways like the activation of MAPK, however, displayed a heterogenous activation pattern in the different cell lines. First experiments in A375 cells gave evidence that expression of dominant negative STAT5 is followed by reduction of bcl-X transcription and apoptosis of the cells (Wellbrock, unpublished). The STAT5/bcl-XL pathway therefore seems to be crucial for antiapoptosis in melanomas. KW - Apoptose KW - Rezeptortyrosinkinase KW - Melanom KW - STAT KW - Bcl-X KW - apoptosis KW - receptor tyrosine kinase KW - melanoma KW - STAT KW - bcl-X Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11319 ER - TY - THES A1 - Wistuba, Nicole T1 - Untersuchungen zum Mechanismus des Wassertransportes in Höheren Pflanzen mit Hilfe der Druckmeßsonden- und NMR-Bildgebungstechnik T1 - Investigations on the mechanism of water transport in higher plants by means of the pressure probe- and the NMR-imaging-techniques N2 - Untersuchungen zum Wasserferntransport wurden mit Hife der Druckmeßsonden- und NMR-Bildgebungstechnik durchgeführt. Dabei wurden Experimente zum Einfluß der Schwerkraft auf den Wasserferntransport an einer Liane bei unterschiedlicher Orientierung der Pflanze durchgeführt. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Korrelation von Flußgeschwindigkeiten und Xylemdruck in den Wasserleitungsbahnen gut gewässerter und trockengestreßter Pflanzen. Der dritte Teil befasste sich mit der Wiederbefüllung von kavitierten oder leeren Xylemgefäßen anhand der Auferstehungspflanze Myrothamnus flabellifolia. N2 - Investigations on the water transport were done by means of the pressure probe and NMR-imaging-techniques. Measurements were performed on a liana to determine the influence of gravity on water transport while the plant was placed into different orientations. The second part of this dissertation dealed with the correlation of flow velocity and xylem pressure in well-hydrated and drought-stressed plants. The third part investigated the refilling of cavitated or empty xylem conduits by means of the resurrection plant Myrothamnus flabellifolia. KW - Samenpflanzen KW - Wassertransport KW - Druckmessung KW - NMR-Bildgebung KW - Xylemdruck KW - Xylemdruckmeßsonde KW - NMR-Bildgebung KW - Myrothamnus flabellifolia KW - Epipremnum aureum KW - Wassertransport in Pflanzen KW - xylem pressure KW - xylem pressure probe KW - NMR-imaging KW - Myrothamnus flabellifolia KW - Epipremnum aureum KW - water transport in plants Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2471 ER - TY - THES A1 - Weismann, Dirk Thorsten T1 - Untersuchungen zum enzymatischen und immunchemischen Nachweis der Phytanoyl-CoA-Hydroxylase in CHO-Zellen T1 - Development of enzymatical and immunohistochemical assays of phytanoyl-CoA hydroxylase in CHO-cells. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde nach Wegen gesucht, den Import peroxisomaler Matrixproteine, der über ein peroxisomales Targeting Signal Typ 2 gesteuert wird, zu messen. Es war vorgesehen, in erster Linie einen enzymchemischen Nachweis zu etablieren, da diese Methode den Vorteil einer Quantifizierbarkeit der Aktivität der gemessenen Enzyme bietet und somit Rückschlüsse auf den Grad einer Beeinträchtigung des Importes zulassen würden. Von dem Test wurde eine Sensitivität gefordert, die eine Messung auch in Homogenaten kultivierter Zellen, insbesondere von CHO-Zellen, erlaubt. Dieses war deswegen gefordert, weil der Test zur Charakterisierung induzierter CHO-Zell-Mutanten eingesetzt werden sollte, die die Merkmale eines PTS 2-Import-Defektes aufweisen. Dieser Nachweis sollte durch eine Messung der Phytanoyl-CoA-Hydroxylase erfolgen. Dieses Enzym ist eines von drei derzeit bekannten Proteinen, die eine PTS 2 besitzen und über diesen Weg importiert werden. Das Substrat für die Hydroxylase war als Phytansäure mit einer 2,3-3H-Markierung in der Arbeitsgruppe vorrätig und wurde für den Test zum CoA-Thioester chemisch umgesetzt. Nach erfolgter enzymatischer Umsetzung von Phytonoyl-CoA zu a-Hydroxyphytanoyl-CoA durch die Hydroxylase waren dann sowohl Edukt wie auch das Produkt durch eine radioaktive Markierung gekennzeichnet und konnten nach einer dünnschicht-chromatographischen Trennung über Kieselgel durch einem Radiodünnschichtscanner nachgewiesen werden. Zunächst wurde mit Hilfe von Homogenaten aus Rattenlebergewebe ein bereits beschriebenes Verfahren zur Messung der Phytanoyl-CoA-Hydroxylase optimiert. Es stellte sich jedoch heraus, daß die Sensitivität dieses Testes nicht hoch genug ist, um die Hydroxylase-Aktivität in Homogenaten kultivierter CHO-Zellen zu messen. An dieser Stelle wurde die Etablierung eines immunchemischen Nachweises begonnen. Hierzu sollten Antikörper gegen die Hydroxylase des chinesischen Zwerghamsters, des Ursprungsorganismus der CHO-Zellen, generiert werden. Eine Reinigung des Enzyms kam nicht in Betracht, weil die Hamster nicht im Labortierhandel erhältlich waren. Folglich musste die cDNA der Hydroxylase aus einer Hamster-cDNA-Bank kloniert werden, nachdem sie durch ihre bekannten Homologe aus Mensch und Maus identifizierbar war. In den verfügbaren cDNA-Banken fand sich keine vollständige Sequenz, so daß mit einer partiellen Sequenz ohne 5´-Ende weitergearbeitet werden musste. Es bot sich im Institut die Möglichkeit, aus dieser Sequenz Pepetide zu bestimmen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit stark immunogen wirken. Solche Peptide wurden synthetisiert und nach Koppelung an Trägerproteine neuseeländischen weißen Kaninchen geimpft. Im Elisa wies das Antiserum zum Zeitpunkt seiner Gewinnung einen Titer von etwa 1:10000 auf, zeigte aber im Westernblot neben einer starken Detektion in Laufweite der Hydroxylase auch eine unspezifische Anfärbung der Proben. In der nun durchgeführten Affinitätsreinigung des Antiserums über einer mit den antigenen Peptiden beladenen Säule tauchte das Problem auf, daß die Antikörper so fest binden, daß sie von ihren Antigenen nicht mehr ohne dentaturierende Bedingungen zu lösen waren. Für die weitere Arbeit sollte sich nun eine affinitätschromatographische Reinigung über Peptide, die den Antikörper mit geringerer Avidität binden, anschließen, so daß nach Trennung der Immunkomplexe native Antikörper isoliert werden könnten. Hierzu wäre ein Epitop-mapping wünschenswert, damit auf dieser Grundlage Peptide mit den geforderten Eigenschaften synthetisiert werden können. N2 - The aim of the present work was to establish methods for studying the import of peroxisomal matrix proteins that are imported via the peroxisomal targeting signal type 2 (PTS-2). Initially, an enzymatical approach was preferred, because this would allow quantification of the enzyme activity and thus estimation of the degree of any impairment. With a test sensitive enough to measure the activity of the enzyme in homogenates of cultivated cells, especially of CHO-cells, it should be possible to characterize mutant CHO-cells with a defect of the PTS-2-mediated import. Phytanoyl-CoA hydroxylase was chosen as one of three known enzymes that are imported via PTS-2. The substrate [2,3-3H]phytanic acid, was available in the laboratory and was chemically converted to the CoA thioester. After enzymatic conversion of phytanoyl-CoA to hydroxyphytanoyl-CoA, both substrate and product were radioactively labeled and could be quantified by a TLC scanner after separation by thin layer chromatography. Attempts to optimize established assay procedures for measuring the hydroxylase in rat liver homogenates, however, failed because the sensitivity of the test could not be increased sufficiently to measure the much lower hydroxylase activity in homogenates of cultivated CHO-cells. Therefore, an immunohistochemical approach was pursued. Purification of the hamster enzyme was considered impractical because it would have been very difficult to obtain a sufficient number of the animals. Instead, it was planned to isolate the cDNA coding for the hamster enzyme from a Chinese hamster cDNA bank and to express the required amounts of the recombinant enzyme in E. coli. Starting from the rat paralogue, it was indeed possible to identify several clones with partial sequences but none of them contained the 5‘ terminus, so that expression of the enzyme was not possible. Within the amino acid sequence derived from the cDNA sequence information, sequences with predicted high immunogenicities were identified and the correspond-ing peptides were synthesized. After binding the peptides either to BSA or to keyhole limpet hemocyanin, these were injected into new zealand white rabbits. The titers achieved were approx. 1:10000, as estimated by ELISA, but Western blot analysis revealed a substantial amount of non-specific cross-reaction, making purification of the antibodies necessary. Affinity chromatography with the same peptides immobi-lized on a solid matrix gave unsatisfactory results, presumably because, owing to their high avidity, the antibodies could only be eluted under very harsh conditions, leading to their denaturation. It is now planned to conduct an epitope mapping of the binding sequence of the antibodies and to synthesize new peptides which are bound with lower affinity, which should make their purification easier. KW - Peroxisomale Biogenese Defekte KW - alpha-Oxidation KW - Phytansäure KW - Phytanoyl-CoA-Hydroxylase KW - peroxisomal biogenesis disease KW - alpha-oxidation KW - phytanic acid KW - phytanoyl-CoA Hydroxylase Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8064 ER - TY - THES A1 - Fischer, Peter T1 - Untersuchungen zum Einfluss der Anzahl primordialer Keimzellen auf die Geschlechtsbestimmung von Medaka, Oryzias latipes T1 - Investigations on the influence of Primordial Germ Cell number on the sex determination of Medaka, Oryzias latipes N2 - Die primordialen Keimzellen (PGCs) sind die einzigen Zellen des Embryos, die die genetische Information von einer Generation an die nächste weiter geben können. Es wurde gezeigt, dass in allen bislang untersuchten Knochenfischen die Anzahl der Urgeschlechtszellen während der Embryonalentwicklung der erste sichtbare Unterschied zwischen Männchen und Weibchen ist. Daraus ergibt sich die Frage, ob die Anzahl der primordialen Keimzellen das Geschlecht bestimmt, oder ob die somatischen Zellen je nach sexueller Identität die Urgeschlechtszellen zur Proliferation anregen. Um zu untersuchen, wie die Anzahl der Urgeschlechtszellen mit der Geschlechtsdetermination zusammenhängt, habe ich in dieser Arbeit die Anzahl der Urgeschlechtszellen manipuliert und deren Schicksal im Verlauf der Embryonalentwicklung verfolgt. Weiterhin untersuchte ich, in wieweit die Temperatur einen Einfluss auf die Geschlechtsbestimmung hat und ob sie Auswirkungen auf die Anzahl und die Wanderung der Urgeschlechtszellen hat beim Medaka hat. Durch meine Experimente, in denen ich die Fische während der Embryonalentwicklung bei verschiedenen Temperaturen hielt, konnte ich zeigen, dass beim Medaka der genetische Geschlechtsbestimmungsmechanismus durch erhöhte Temperatur überschrieben werden kann. Die Temperaturerhöhung in der Embryonalentwicklung führt zu einer Weibchen­‐zu­‐Männchen Geschlechtsumkehr. Dabei wird die Anzahl der primordialen Keimzellen im Vergleich zu den Kontrollen reduziert. Zudem wird durch die höhere Temperatur das autosomale dmrt1a viel früher angeschaltet, wa sauf einen alternativenSignalweg deutet, der die männliche Geschlechtsentwicklung in XX geschlechtsumgewandelten Tieren steuert. N2 - Primordial Germ Cells (PGCs) are the only cells, which can transport genetic information from one generation to the next one. In all investigated teleost fish the different number of germ cells is the foist recognizable difference between mal and female. Therefore the question arises, if the number of germ cells is the sex determining mechanism, or if the somatic cells of the gonad stimulate the PGCs to proliferate. To investigate the connection between germ cell number and sex determination in medaka, i manipulated the number of germ calls and followed their fate through embryonic development. Furthermore i investigated the influence of temperature on sex determination and behavior and number of germ cells. I could show, that it is possible to ablate all PGCs by DND morpholino injection. While total absence of PGCs led to infertile male development with string like gonads, increasing the number of PGCs by bucky ball mRNA injection showed no influence on sexual development. Interestingly I observed that even when I increased the number early in embryonic development by more than two-­fold, PGC number after some time went down to the untreated embryo level. This points to a non‐cell autonomous mechanism, which limits PGC number according to the somatic SD process. KW - Geschlechtsbestimmung KW - Gamet KW - Sex determination KW - Sexual development KW - Japankärpfling KW - Gonadenentwicklung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106846 ER - TY - THES A1 - Pfann, Christina T1 - Untersuchungen zu neuen therapeutischen Ansätzen zur Beeinflussung der MYC-Expression im kolorektalen Karzinom T1 - Experiments on new therapeutic strategies to influence MYC expression in colorectal cancer N2 - Eine veränderte Expression des Transkriptionsfaktors MYC wird als entscheidender Faktor für Tumorentstehung und -progress im kolorektalen Karzinom gesehen. Somit ist die Hemmung dessen Expression und Funktion ein zentraler Ansatz bei der zielgerichteten Tumortherapie. Als geeignete Strategie, sowohl die Halbwertszeit als auch die Translation von MYC zu verringern, erschien eine duale PI3K-/mTOR-Hemmung durch den small molecule-Inhibitor BEZ235. Gegenteilig ist jedoch unter Behandlung mit BEZ235 eine verstärkte MYC-Expression in verschiedenen Kolonkarzinom-Zelllinien zu beobachten. Neben verstärkter Transkription, konnte eine verstärkte IRES-abhängige Translation von MYC nach Hemmung der mTOR-/5´Cap-abhängigen Translation durch BEZ235, als Ursache der MYC-Induktion nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Induktion von MYC nach PI3K-/mTOR-Hemmung durch eine kompensatorische Aktivierung des MAPK-Signalwegs in Folge einer FOXO-abhängigen Induktion von Rezeptortyrosinkinasen, stattfindet. Eine mögliche Strategie, diese Feedback-Mechanismen zu umgehen, ist die direkte Hemmung der Translationsinitiation. Hierfür wurden Rocaglamid und dessen Derivat Silvestrol als small molecule-Inhibitoren der eIF4A-Helikase verwendet. Im Gegensatz zur PI3K/mTOR-Hemmung, ist durch eIF4A-Inhibition eine Reduktion der MYC-Proteinexpression in verschiedenen Kolonkarzinom-Zelllinien zu erreichen – ohne einhergehende MAPK-Aktivierung. Anhand der Ergebnisse kann postuliert werden, dass Silvestrol das Potential besitzt, sowohl die Cap-/eIF4F-abhängie als auch die somit eIF4A-abhängige IRES-vermittelte Translation von MYC zu hemmen. Weiterhin kann eine proliferationshemmende Wirkung durch Silvestrol auf Kolonkarzinom-Zellen in vitro, via Zellzyklusarrest und Induktion von Apoptose, gezeigt werden. Dies stellt die Voraussetzung für eine potentielle Eignung als tumorhemmender Wirkstoff in der Therapie des kolorektalen Karzinoms dar. N2 - Deregulated expression of MYC is a driver of colorectal carcinogenesis. Thus inhibition of MYC function and expression may be a central aim in targeted therapy. Inhibiting the PI3K-and mTOR pathway seemed to be a proper strategy to increase MYC turnover and reduce its translation. Instead, we observe enhanced MYC expression in colon carcinoma cells upon treatment with the dual PI3K-/mTOR-inhibitor BEZ235. PI3K-/mTOR-Inhibition permits both enhanced transcription and induction of IRES-dependent translation of MYC through feedback activation of the MAPK pathway via FOXO-dependent induction of receptor tyrosine kinases. A strategy to bypass the signalling feedback mechanisms, is targeting the translation initiation. Using Silvestrol, a Rocaglamid derivate as small molecule inhibitor of the initiation factor eIF4A, MYC protein expression can be reduced in colorectal cancer cells – without observed MAPK-activation. So Silvestrol has he potential to inhibit Cap-/eIF4F-dependend as well as eIF4A-dependent IRES-mediated tranlation of MYC. Furthermore Silvestrol inhibits proliferation of colon carcinoma cells in vitro, shown by cell cycle arrest and induction of apoptosis. Our data argue that targeting translation initiation is a promising strategy to limit MYC expression in colorectal cancer. Thus, together with its antiproliferative effect, Silvestrol might be a potential anti-tumor agent. KW - Myc KW - colorectal cancer Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216687 ER - TY - THES A1 - Bock, Fiola T1 - Untersuchungen zu natürlicher und manipulierter Aufzucht von Apis mellifera : Morphologie, Kognition und Verhalten T1 - Studies of natural and manipulated breeding of Apis mellifera: Morphology, cognition and behaviour N2 - 3. Zusammenfassung Ein noch immer unvollständig verstandenes Problem sind die exakten Mechanismen der Arbeitsteilung und Koordination innerhalb von Bienenvölkern Apis mellifera. Auf der einen Seite muss die sensorische und neuronale Ausstattung jedes Individuums das Potential zur Kommunikation und Aufgabenbewältigung enthalten, zum anderen müssen jedem Bienenvolk Mechanismen zur Steuerung zur Verfügung stehen, die auch so weit in die Zukunft reichenden Notwendigkeiten wie Wintervorbereitungen zuverlässig durchführen. Die vorliegende Arbeit beleuchtet daraus ausgewählte Aspekte. Zum einen werden Aspekte der kognitiven Fähigkeiten der Einzelbienen untersucht, die im Hinblick auf ihre Rolle als sammelnde Arbeiterinnen eine wichtige Rolle spielen. Das Erkennen und Verarbeiten von Mustern spielt eine wichtige Rolle beim Auffinden von potentiellen Nahrungsquellen. Hier konnte mittels des DMTS – Paradigma ein hoher Abstraktionsgrad der Musterverarbeitung sowie eine Speicherung auch komplexer Muster gezeigt werden. Zum anderen wird die Bruttemperatur als ein Einfluss auf die Puppenentwicklung und dessen mögliche Folgen auf kognitive Fähigkeiten und Lebenshistorie untersucht. Variation der Bruttemperatur wurde in verschiedenen Zusammenhängen als starker Einfluss auf unterschiedliche Aspekte der Entwicklung gezeigt. In der vorliegenden Arbeit kann diese Bruttemperatur als möglicher Faktor der nachfolgend unterschiedlichen Ausprägung von Verhaltensmustern gezeigt werden. Dabei wird ebenso auf die Unterschiede im Verhaltensmuster von täglichen Stocktätigkeiten wie auf die resultierenden Unterschiede in der Lebensgeschichte und –spanne eingegangen, die aus unterschiedlichen Brutaufzuchtstemperaturen resultieren können. Als Aufzuchtstemperaturen werden dabei 32°C, 35°C sowie 36°C verwendet, um eine Vari ation zwischen der an anderer Stelle berichteten mittleren, der niedrigsten und der höchsten Temperatur für morphologisch vollständig entwickelte Bienen zu erreichen und die daraus resultierenden Arbeiterinnen zu untersuchen. Sowohl die Ergebnisse der Verhaltensuntersuchungen von Stockbienen wie auch der Vergleich von Lebensaktivität und –spanne zeigen dabei signifikante Unterschiede zwischen den bei unterschiedlichen Temperaturen aufgezogenen Arbeiterinnen in deren analysiertem Verhalten. N2 - One of the still incompletely understood problems is the accurate mechanisms of work division and co-ordination within bee colonies Apis mellifera. On the one side the sensory and neural equipment of each individual must contain the potential for communication and task accomplishment that is viable for the daily organisation of a honeybee hive, on the other hand reliable mechanisms for planning and fulfilling future demands like winter preparations are vitally important. This work investigates selected aspects of the underlying communication and regulation aspects of these demands. The cognitive abilities of the single worker bee regarding their role as foraging and collecting force for the beehive are examined. The process of recognizing and processing the visual cues found while foraging is examined by means of the DMTS – paradigm. A high degree of abstraction while processing the patterns as well as the memorisation of complex samples is shown. Furthermore the breeding temperature as one factor influencing pupae development and its influence on subsequent behaviour and life history of the adult workers is analysed. The available work can link differences in the brood temperature with the resulting different patterns of behaviour and life history of worker bees. The temperature levels while raising the different groups of honeybees were chosen as 32°C, 35°C and 36°C to rea ch a variation between the from other groups reported as normal, the lowest and highest breeding temperature and to examine the resulting female workers. Both the results of the behavioural observation of worker bees that are active inside the colony as well as the overall comparison of their life activity and lifespan show significant differences between these groups of bees that were raised on varying brood temperatures. KW - Biene KW - Morphologie KW - Verhalten KW - Apis mellifera KW - Morphologie KW - Kognition KW - Verhalten KW - Apis mellifera KW - Morphology KW - cognition KW - behaviour Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17801 ER - TY - THES A1 - Gehrig, Andrea T1 - Untersuchungen zu den molekularen Ursachen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis - vom Gendefekt zum Mausmodell T1 - Molecular studies of X-linked juvenile Retinoschisis - from gene defect to the mouse model N2 - Hereditäre Netzhautdegenerationen betreffen weltweit etwa 15 Millionen Menschen. Sie sind klinisch und genetisch auffällig heterogen. Bisher wurden 139 verschiedene chromosomale Genorte mit Netzhautdystrophien assoziiert, wovon inzwischen 90 Gene identifiziert werden konnten. Mit Hilfe verschiedener Klonierungsstrategien konnte in der vorgelegten Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der genetischen Ursachen einiger ausgewählter Retinopathien geleistet werden. So konnte durch die Positionsklonierung das Gen, das mit der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (RS) assoziiert ist, identifiziert werden. Funktionelle Analysen des Genproduktes sowie die Generierung eines Mausmodells der RS geben einen Einblick in die Physiologie der Retina sowie den Pathomechanismus der Erkrankung. Die genomische Organisation des Interphotorezeptor-Matrixproteoglykans-1 (IMPG1) wurde aufgeklärt und die chromosomale Lokalisation auf 6q13-15 bestimmt. Damit kartierte das Gen in eine Region, in die die Genorte für 7 Retinopathien des Menschen kartiert wurden. Durch Kopplungs- und Mutationsanalysen konnten unsere Arbeiten ausschließen, daß IMPG1 mit North Carolina Makuladystrophie (MCDR1) oder der progressiven bifokalen chorioretinalen Atrophie (PBCRA) in Zusammenhang steht. Die Diacylglycerin Kinase-3 (DAGK3) konnte nach der Bestimmung der genomischen Organisation in die Region 3q27-28 kartiert werden. Dieser chromosomale Abschnitt deckt sich mit der chromosomalen Lokalisation der autosomal dominanten Optikusatrophie (OPA1). Auch hier konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen ein Ausschluß des Gens erfolgen. Die X-gebundene juvenile Retinoschisis ist eine häufige Ursache juveniler Makula-degenerationen und betrifft etwa 300.000 junge Männer weltweit. Charakteristische Kennzeichen der Erkrankung sind Aufspaltungen in den inneren Netzhautschichten, die zu zystischen Veränderungen der zentralen Retina führen. Ungefähr 50 % der Patienten entwickeln auch periphere Manifestationen. Durch die Arbeit unserer und anderer Forschergruppen konnte der Krankheitslokus in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert werden. Durch einen Vergleich der genomischen DNA Sequenzen mit öffentlich zugänglichen ESTs (expressed sequence tags) konnte ein retinaspezifisches Transkript identifiziert werden. Es besteht aus 6 Exonen und kodiert für ein putatives 224 Aminosäuren großes Protein, das sekretiert wird und ein hochkonserviertes Discoidindomänen-Motiv enthält. Discoidindomänen sind in Zelladhäsion oder in Zell-Zell Interaktionen involviert. Mutationsanalysen in RS-Patienten bestätigten, daß es sich bei diesem Transkript um RS1, d.h. um das krankheitsassoziierte Gen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis handelte. Das RS1-Protein (Retinoschisin) kommt in homo-oligomeren Komplexen, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, auf der Zelloberfläche der Photorezeptoren und der Bipolaren sowie in den synaptischen Regionen der äußeren (OPL) und innere plexiformen Schicht (IPL) vor. Um die Funktion des normalen Retinoschisins zu untersuchen und um einen Einblick in die RS-Pathogenese zu bekommen, wurde nach der Charakterisierung des orthologen murinen Gens (Rs1h) eine Retinoschisin-defiziente knock-out Maus generiert. Ophthalmologische und histologische Untersuchungen der Rs1h-/Y-Maus zeigen signifikante Parallelen zu dem RS-Erkrankungsbild des Menschen. Damit stellt die Rs1h knock-out Maus ein ideales Tiermodell für die Untersuchung des zugrundeliegenden Krankheitsmechanismusses dar. So konnten wir inzwischen zeigen, daß apoptotische Prozesse zur Degeneration der Photorezeptoren führen. Gegenwärtig werden mit diesem Tiermodell erste gentherapeutische Versuche durchgeführt. Diese Arbeiten sollen Aufschluß darüber geben, ob ein Adeno-assoziierter Virus (AAV)-Transfer des RS1 Gens in die erkrankte Retina ein möglicher Therapieansatz für RS auch beim Menschen sein könnte. N2 - The World Health Organization (WHO) estimates that worldwide approximately 15 million people are affected with hereditary retinal degenerations. Retinal dystrophies are clinically and genetically heterogeneous. To date, 90 retinal disease genes have been identified and of 139 retinal disease genes the chromosomal location is known. In this study, different strategies of disease gene cloning were utilized to elucidate the underlying genetic defects of selected retinopathies. This has led to the identification of the gene associated with X-linked juvenile retinoschisis (RS) by positional cloning. Both, functional analysis of the gene product, named retinoschisin (RS1), and the generation of a mouse model for RS provide novel insight into retinal physiology and the pathomechanism of the disease. The genomic organization of the interphotoreceptor matrix proteoglycan-1 (IMPG1) was established and its chromosomal localization was identified (6q13-15). Seven different human retinal dystrophies have previously been mapped to this region on chromosome 6. A possible genetic association between IMPG1 and two retinal dystrophies, North Carolina macular dystrophy (MCDR1) and progressive bifocal chorioretinal atrophy (PBCRA), was investigated. By means of linkage studies and mutation analysis in affected patients the involvement of IMPG1 in these two different diseases was ruled out. The genomic organization of diacylglycerol kinase-3 (DAGK3) was determined and the gene locus was mapped to chromosome 3q27-28. The autosomal dominant optic atrophy (OPA1) was independently localized to the same chromosomal region. This has prompted us to investigate the role of DAGK3 in OPA1. By mutation analysis such a correlation could be excluded. X-linked juvenile retinoschisis is a common cause of juvenile macular degeneration affecting approximately 300.000 young males worldwide. The disease is characterized by a slitting of the inner retinal layers resulting in cystic degeneration of the central retina. Half of the patients also develop peripheral manifestations. Our laboratory and others localized the RS gene to a 900 kb interval on the short arm of chromosome Xp22.2. Comparison of genomic DNA sequences with publicly available expressed sequence tags (ESTs) have identified a retina-specific transcript. This novel transcript is composed of six exons that encode a 224-amino acid protein including a 23 amino acid signal peptide. Bioinformatical analysis revealed that the putative protein consists almost exclusively of a discoidin domain wich is highly conserved from slime mold to human. Discoidin domains are implicated in cell adhesion or cell-cell interactions. On the basis of mutation analysis in patients affected with RS, we confirmed that the gene indeed is responsible for RS pathology. The RS1 protein is found at the cell surfaces of photoreceptors and bipolar cells and within the synaptic regions of the outer (OPL) and the inner plexiform layers (IPL) most likely as a homo-oligomeric complex. To clarify the function of the normal RS1 and to gain insight into RS pathogenesis a mouse model deficient of the endogenous RS1 protein was generated. For these purposes the genomic organization of the murine orthologous RS1 gene (Rs1h) was identified. Ophthalmologic and histologic analysis of Rs1h-/Y mice revealed significant parallels to the human RS phenotyp. Therefore, the knock-out mouse represents an ideal model to further study the underlying disease mechanism. Recently, we showed that apoptosis is the final pathway of photoreceptor degeneration in Rs1h-/Y mice. Most importantly this mouse model can serve as proof-of-concept for gene therapy. Towards this end we are testing adeno-associated virus (AAV)-based gene transfer of RS1 into the defect murine retina. This may pave the way for a gene based future intervention in humans affected with this condition. KW - Maus KW - Retinoschisis KW - Erbkrankheit KW - Molekulargenetik KW - X-gebundene juvenile Retinoschisis KW - Gendefekt KW - Mausmodell KW - X-linked juvenile retinoschisis KW - gene defect KW - mouse model Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7212 ER - TY - THES A1 - Löffler, Daniela Inge Martina T1 - Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell T1 - Virulence-attenuated Listeria monocytogenes strains as vaccine carrier in vivo N2 - Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte. N2 - Virulence-attenuated strains of the Gram positive pathogen Listeria monocytogenes (Lm) are optimal candidates for the delivery of heterologous antigens into mammalian hosts. Lm escapes the phagosome, replicates efficiently within the cytosol of many host cells including appropriate cells of the immune system like macrophages and dendritic cells (antigen presenting cells, APCs). These natural biological properties of Lm to enter and replicate in relevant immunological APCs allow the targeted delivery of heterologous antigens into the antigen-processing pathway of MHC class I and MHC class II molecules leading to a strong cellular immunity. In this work, the in vivo efficiences of activation of antigen-specific CD8 and CD4 T cells were compared when the plasmid-encoded protein antigen ovalbumin was secreted by the bacteria as a protein or delivered as cDNA or as mRNA. Delivery was supported also by a specific endolysin produced by the bacteria. Listeriae harbouring this transcriptional unit undergo lysis when they reach the cytosol. In the case of OVA as protein or as mRNA, delivery of these different biological active molecules by autolysing Listeria resulted in significant OVA peptide (SIINFEKL) presentation in the context of MHC class I molecules, which also induced an adaptive cellular immunity with memory T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest immune response involving OVA-specific memory CD8 and CD4 T cells. In contrast, infection with autolysing Listeria delivering OVA-encoded DNA failed to generate OVA-specific T cells. Due to its harbouring of the autolysing cassette, carrier strain Lm trpS was virulence-attenuated, but infection with 5107 bacteria of this strain resulted in a partial lysis. Therefore investigation of other attenuated and also autolysing strains (Lm mutants trpS hlyW491A and (trpS aroA aroB)) was necessary. Both these strains facilitated OVA presentation via MHC-class-I molecules resulting in clonal expansion of specific CD8+ T cells in comparable frequencies as the wild-type strain. Furthermore, autolysing Lm trpS hlyW491A delivering OVA-encoded DNA led to specific presentation of OVA in the context of MHC class I molecules. Additionally, autolysing Lm (trpS aroA aroB) strain with high infection dose (5107) is a promising carrier for heterologous protein antigens because this mutant exhibited only marginal liver toxicity in contrast to the strain Lm trpS. In this regard, comparable frequencies of proliferated OVA-specific CD8+ T cells were induced through the delivery of OVA antigens into phagosome or cytosol of APCs that were expressed as secreted proteins, as anchored-proteins or as intracellular proteins by the respective carrier Lm strains (trpS aroA aroB). Activation of antigen-specific CD4+ T cells by these OVA-carrier Lm (trpS aroA aroB) was different compared to activation of antigen-specific CD8+ T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest activation of both MHC-class I and II restricted antigen presentation in vivo. Different lysis cassettes were tested consisting of Listeria-specific phage lysis proteins and an intracellular promoter of Listeria for the delivery of DNA vaccines (bactofection). The efficiency of these cassettes was compared to the original cassette (PactA-ply118). Two of the four new cassettes achieved comparable bactofection rates in some cell lines as the originally used cassette. However, the Lm strain containing the cassette PactA-ply118 was found to be the most effective due to high attenuation in mice. KW - Listeria monocytogenes KW - Attenuierung KW - Impfstoff KW - Maus KW - Listeria monocytogenes KW - Impfstoffe KW - Mausmodell KW - Listeria monocytogenes KW - vaccines KW - in vivo Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18728 ER - TY - THES A1 - Gruber, Franz Andreas T1 - Untersuchung zur Regulation der Expression des zuckerkonditionierten Verhaltens bei Drosophila melanogaster T1 - Analysing the regulation of the expression of sugar-conditioned behaviour in Drosophila melanogaster N2 - In dieser Doktorarbeit habe ich die Regulation der Expression des zuckerbelohnten Verhaltens durch den Fütterungszustand bei Drosophila melanogaster untersucht. Die Fliegen können während einer Trainingsphase mit Hilfe einer Zuckerbelohnung auf einen bestimmten Duft konditioniert werden. Nach dem Training können die Fliegen dann auf das olfaktorische Gedächtnis getestet werden. Die Bereitschaft das zuckerkonditionierte Gedächtnis im Test zu zeigen wird vom Fütterungszustand kontrolliert, wie ich in Übereinstimmung mit den Ergebnissen früherer Arbeiten demonstrierte (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008). Nur nicht gefütterte Fliegen exprimieren das Gedächtnis, während Fütterungen bis kurz vor dem Test eine reversibel supprimierende Wirkung haben. Einen ähnlichen regulatorischen Einfluss übt der Futterentzug auch auf die Expression anderer futterbezogener Verhaltensweisen, wie z.B. die naive Zuckerpräferenz, aus. Nachdem ich den drastischen Einfluss des Fütterungszustands auf die Ausprägung des zuckerkonditionierten Verhaltens gezeigt bzw. bestätigt hatte, habe ich nach verhaltensregulierenden Faktoren gesucht, die bei einer Fütterung die Gedächtnisexpression unterdrücken. Als mögliche Kandidaten untersuchte ich Parameter, die zum Teil bereits bei verschiedenen futterbezogenen Verhaltensweisen unterschiedlicher Tierarten als „Sättigungssignale“ identifiziert worden waren (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). Dabei stellte sich heraus, dass weder die „ernährende“ Eigenschaft des Futters, noch ein durch Futteraufnahme bedingter Anstieg der internen Glukosekonzentration für die Suppression des zuckerkonditionierten Gedächtnisses notwendig sind. Die Unterdrückung der Gedächtnisexpression kann auch nicht durch Unterschiede in den aufgenommenen Futtermengen, die als verhaltensinhibitorische Dehnungssignale des Verdauungstrakts wirken könnten, oder mit der Stärke des süßen Geschmacks erklärt werden. Die Suppression des zuckerbelohnten Verhaltens folgte den Konzentrationen der gefütterten Substanzen und war unabhängig von deren chemischen Spezifität. Deshalb wird die Osmolarität des aufgenommenen Futters als ein entscheidender Faktor für die Unterdrückung der zuckerkonditionierten Gedächtnisexpression angenommen. Weil nur inkorporierte Substanzen einen Unterdrückungseffekt hatten, wird ein osmolaritätsdetektierender Mechanismus im Körper 67 postuliert, wahrscheinlich im Verdauungstrakt und/oder der Hämolymphe. Die Hämolymphosmolarität ist als „Sättigungssignal“ bei einigen wirbellosen Tieren bereits nachgewiesen worden (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Deshalb habe ich mit Hilfe genetischer Methoden und ohne die Fliegen zu füttern, versucht über einen künstlich induzierten Anstieg der Trehaloseund Lipidkonzentrationen die Osmolarität der Hämolymphe in Drosophila zu erhöhen. Eine solche konzentrationserhöhende Wirkung für Lipide und die Trehalose, dem Hauptblutzucker der Insekten, ist bereits für das adipokinetische Hormon (AKH), das von Zellen der Corpora cardiaca exprimiert wird, nachgewiesen worden (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). Es stellte sich heraus, dass die künstliche Stimulierung AKH-produzierender Neurone das zuckerkonditionierten Verhalten temporär, reversible und selektiv unterdrückt. Gleiche Behandlungen hatten keinen Effekt auf ein aversiv konditioniertes olfaktorisches Gedächtnis oder ein naives Zuckerpräferenzverhalten. Wie aus dieser Arbeit hervorgeht, stellt wahrscheinlich die Osmolarität des Verdauungstrakts und der Hämolymphe oder nur der Hämolymphe ein physiologisches Korrelat zum Fütterungszustand dar und wirkt als unterdrückendes Signal. Dass Fütterungen das zuckerkonditionierte Verhalten und die Zuckerpräferenz supprimieren, die künstliche Stimulation AKH-produzierender Zellen aber selektiv nur die zuckerbelohnte Gedächtnisexpression unterdrückt, deutet auf mindestens zwei unterschiedliche „Sättigungssignalwege“ hin. Außerdem macht es deutlich wie uneinheitlich futterbezogene Verhaltensweisen, wie das zuckerbelohnte Verhalten und die naive Zuckerpräferenz, reguliert werden. N2 - In this work I investigated the regulation of the expression of the sugar conditioned behavior by feeding states in Drosophila melanogaster. During the training flies are able to associate an odor with a sugar reward. During the test these flies have the opportunity to show their odor memory. In accordance with previous findings (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008), I also showed that the readiness to express sugar conditioned memory is controlled by the feeding state. The memory was only displayed by starved flies, whereas feedings of the flies until the test cause a reversible and temporary suppression of conditioned behavior. Feeding states similarly influence the expression of other food-related behaviors like sugar preference. After I have showed/confirmed the drastic influence of feeding state on sugar conditioned behavior, I tried to search for factors which suppress the memory expression of conditioned flies during feeding. Therefore I verified physiological parameters as promising candidates which have already been identified as “satiation-signals” for different food-related behaviors through the animal kingdom (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). As the results revealed, neither the nutritional value of the available food nor an increase of the internal glucose-concentrations were necessary for suppressing conditioned behavior. Furthermore differences in sweet taste and in the amount of the ingested food, which likely serve as volumetric signals of the digestive system, were not critical determinants for inhibition of the memory expression. Because suppression followed the concentration of the substances independent of the chemical specificity, I conclude that the osmolarity of the ingested food is a critical factor for inhibition of sugar conditioned behavior. Only ingested substances were suppressive. Therefore an internal osmolarity-detecting mechanism is postulated, most probably in the digestive system or the hemolymph. Hemolymph-osmolarity has already been shown as a “satiation-signal” for some invertebrates (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Thus I tried to increase the hemolymph-osmolarity by an artificially induced rise of the concentration of lipids and trehalose, the main blood sugar of insects. A concentration-increasing effect such like this has already been shown for the adipokinetic hormone (AKH), which is expressed in cells of the corpora cardiaca (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). I demonstrated that an artificial stimulation of AKH69 producing neurons induces the suppression of sugar conditioned behavior, but leaves aversive conditioned behavior and naïve sugar preference unchanged. This work indicates that the osmolarity of the digestive system and the hemolymph or only of the hemolymph serves as (a) physiological correlate(s), which signals suppression. Feeding induced inhibition of the expression of sugar conditioned behavior and naïve sugar preference, whereas the artificial stimulation of AKH-producing cells selectively inhibited sugar rewarded memory expression alone. Thus I assume at least two separable “satiation”-pathways. Moreover these results demonstrate the non-uniform regulation of different food-related behaviors like sugar conditioned behavior and naïve sugar preference. KW - Taufliege KW - Futterentzug KW - Klassische Konditionierung KW - Konditionierung KW - Gedächtnis KW - Assoziatives Gedächtnis KW - Osmolarität KW - Drosophila melanogaster KW - zuckerkonditioniertes Verhalten KW - klassische Konditionierung KW - Futterentzug KW - Drosophila melanogaster KW - sugar-conditioned behaviour KW - classical conditioning KW - food deprivation KW - starvation Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48802 ER - TY - THES A1 - Rajab, Suhaila T1 - Untersuchung von Sub-Millisekunden Dynamiken und allosterischer Kommunikation in Ligandenbindedomänen ionotroper Glutamatrezeptoren T1 - Investigation of sub-millisecond dynamics and allosteric communication in ionotropic glutamate receptor ligand binding domains N2 - Ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) sind ligandengesteuerte Ionenkanäle und vermitteln den Großteil der exzitatorischen Signalweiterleitung im gesamten zentralen Nervensystem. Darüber hinaus spielen iGluRs eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Entwicklung und Funktion, einschließlich Lernprozessen und Gedächtnisbildung. Da eine Fehlfunktion dieser Rezeptoren mit zahlreichen neurodegenerativen Erkrankungen verbunden ist, stellen iGluRs zudem wichtige Zielproteine für die pharmakologische Wirkstoffentwicklung dar. Im Allgemeinen wird zwischen drei Untergruppen ionotroper Glutamatrezeptoren unterschieden, welche aufgrund ihrer Selektivität für einen bestimmten Liganden benannt sind: AMPA-, Kainate-, und NMDA-Rezeptoren. Die iGluRs jeder dieser Untergruppen bestehen in der Regel aus vier Untereinheiten, welche wiederum aus vier semiautonomen Domänen aufgebaut sind: (i) die aminoterminale Domäne (ATD), (ii) die Ligandenbindedomäne (LBD), (iii) die Transmembrandomäne (TMD) und (iv) die carboxyterminale Domäne (CTD). Die Ligandenbindedomäne, welche wiederum aus zwei Lobes (D1 und D2) besteht und in ihrer Struktur einer Muschelschale ähnelt, vollzieht bei Bindung eines Neurotransmitters eine Konformationsänderung, wobei sie sich um den gebundenen Agonisten herumschließt. Diese Konformationsänderung der LBD wird auf die Transmembrandomäne, welche den membranüberspannenden Ionenkanal ausbildet, übertragen, was in einer Umlagerung der Transmembranhelices und infolgedessen der Öffnung des Ionenkanals resultiert. Die Konformationsänderung der LBD ist demnach die treibende Kraft, welche dem Öffnen und Schließen des Ionenkanals zugrunde liegt. Aus diesem Grund stellt die isolierte Ligandenbindedomäne, welche als lösliches Protein hergestellt werden kann, ein etabliertes Modellsystem zur Untersuchung der strukturellen und funktionellen Zusammenhänge innerhalb des Funktionsmechanismus ionotroper Glutamatrezeptoren dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Konformationsdynamiken der in Escherichia coli-Bakterien exprimierten isolierten Ligandenbindedomänen der drei homologen Untergruppen – AMPA-, Kainate- und NMDA-Rezeptoren – sowohl als Monomer als auch als Dimer untersucht. Hierbei wurden im ungebundenen Apo-Zustand der Proteine signifikante Kinetiken im Bereich von Nanosekunden bis Mikrosekunden festgestellt, welche bei Bindung eines Agonisten sowie bei Dimerisierung erheblichen Veränderungen zeigen. Darüber hinaus wurde allosterische Kommunikation zwischen den LBDs der NMDA-Untergruppe untersucht, wobei in der Tat ein deutlicher allosterischer Effekt in Bezug auf die Konformationsdynamiken der Proteine gemessen werden konnte. Weiterhin wurde ein PET-FCS-basiertes Verfahren zur Messung der Dissoziationskonstante der Bindung eines Liganden an die LBD eines AMPA-Rezeptors entwickelt. Zuletzt wurde außerdem ermittelt, ob ein Unterschied zwischen vollen und partiellen Agonisten hinsichtlich ihres Einflusses auf die Konformationsdynamiken einer AMPA-Rezeptor LBD besteht, was nachgewiesenermaßen nicht der Fall ist. Alle Messungen wurden auf Einzelmolekülebene auf Zeitskalen von Nanosekunden bis Millisekunden basierend auf Fluoreszenzfluktuationen unter Verwendung des photoinduzierten Elektronentransfers (PET) in Kombination mit Korrelationsspektroskopie (PET-FCS) durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden PET-basierte Fluoreszenzsonden entwickelt, um Konformationsänderungen auf einer räumlichen Skala von einem Nanometer zu detektieren. Durch die Experimente innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PET-FCS-Methode eine vielversprechende Ergänzung zu allen bisher bestehenden Methoden zur Untersuchung der Konformationsdynamiken der Ligandenbindedomäne ionotroper Glutamatrezeptoren darstellt und daher eine aussichtsreiche Möglichkeit zur Erweiterung des zukünftigen Verständnisses der Funktionsweise von iGluRs bietet. N2 - Ionotropic glutamate receptors (iGluRs) are ligand-gated ion channels that mediate most of the excitatory signal transmission throughout the central nervous system. In addition, iGluRs play a crucial role in neural development and function, including learning and memory. Since receptor malfunction contributes to a variety of neurological diseases, iGluRs are key targets for drug development in pharmacology. Furthermore, ionotropic glutamate receptors are divided into three major subgroups, all of which are named due to their selectivity for a certain ligand: AMPA, Kainate and NMDA. Members of each subgroup usually consist of four subunits, which in turn comprise four semi-autonomous domains: (i) the amino terminal domain (ATD), (ii) the ligand binding domain (LBD), (iii) the transmembrane domain (TMD), and (iv) the carboxy terminal domain (CTD). Upon binding a neurotransmitter the ligand binding domain, which adopts a clamshell-like structure consisting of two domains (D1 and D2), undergoes a conformational change by closing around the ligand and trapping it within the binding cleft. The conformational change of the LBD is then transferred to the transmembrane domain which forms the membrane-spanning ion channel, which results in rearrangement of the transmembrane helices and consequently in opening of the ion channel. Accordingly, the conformational change of the LBD is the driving force underlying opening and closing of the ion channel. The isolated ligand binding domain can be produced as soluble protein and represents a well-established model system for exploring structural and functional relationships within the functional mechanism of ionotropic glutamate receptors. As part of this thesis, ligand binding domains of all three homologues – AMPAR, KainateR and NMDAR – have been expressed in Escherichia coli bacterial cells and conformational dynamics of the proteins both as monomer and as dimer have been investigated. In the unbound apo state of the proteins, significant kinetics have been observed in the nanosecond to microsecond time range which undergo considerable changes upon agonist binding or dimerization. In addition, allosteric communication between LBDs of the NMDA subgroup has been investigated, whereby a distinct allosteric effect regarding the conformational dynamics of the protein could actually be measured. Furthermore, a PET-FCS-based tool for measuring the dissociation constant of a ligand for an AMPA receptor LBD has been developed. Finally, it has been investigated whether full and partial agonists have different effects on the conformational dynamics of an AMPA receptor LBD, which has been found clearly not to be the case. All measurements have been performed at the single-molecule level on time scales from nanoseconds to milliseconds based on fluorescence fluctuations using photoinduced electron transfer (PET) fluorescence quenching in combination with correlation spectroscopy (PET-FCS). To this end, PET-based fluorescence probes have been engineered to monitor conformational changes on the one-nanometer scale. The experiments that have been carried out within this thesis introduce PET-FCS as a promising tool to complement all previously existing methods for studying conformational dynamics of ionotropic glutamate receptor ligand binding domains and hence offer a promising opportunity to expand future understanding of how iGluRs work. KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - Glutamatrezeptor KW - Einzelmolekülspektroskopie KW - Proteinsynthese KW - Photoinduzierter Elektronentransfer KW - photoinduced electron transfer KW - Ionotrope Glutamatrezeptoren KW - ionotropic glutamate receptors KW - Ligandenbindedomäne KW - ligand binding domain Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244946 ER - TY - THES A1 - Burgert, Anne T1 - Untersuchung von Sphingolipiden und anderen Membrankonjugaten mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie T1 - Analysis of sphingolipids and other membrane conjugates with super-resolution fluorescence microscopy N2 - Methoden der Fluoreszenz-Lokalisationsmikroskopie (engl. single-molecule localization microscopy, SMLM) ermöglichen es Moleküle zu quantifizieren und deren Verteilung zu analysieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Membranmoleküle auf unterschiedlichen eukaryotischen Zellen, aber auch auf Prokaryoten mit dSTORM (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy) oder PALM (engl.: photoactivated localization microscopy) aufgenommen und quantifiziert. Bevor jedoch diese hochauflösende fluoreszenzbasierte Technik für biologische Fragestellungen angewendet werden konnten, mussten zunächst potentielle Artefakt-auslösende Quellen identifiziert und Strategien gefunden werden, um diese zu eliminieren. Eine mögliche Artefakt-Quelle ist eine zu niedrige Photonenzahl, die von Fluorophoren emittiert wird. Werden zu wenige Photonen detektiert, kann die Lokalisation eines Fluorophors weniger präzise bestimmt werden. Dies kann zu einer falschen Abbildung von Strukturen führen oder zu falschen Rückschlüssen über die Verteilung von Molekülen. Eine Möglichkeit die Anzahl der emittierten Photonen zu erhöhen, ist chemische Additive als Triplettlöscher einzusetzen. Sie bewirken, dass die Fluorophore wieder in den Grundzustand relaxieren und somit wieder angeregt werden können. Es wurden verschiedene Additive, die in der Literatur als Triplettlöscher beschrieben sind, getestet. Dazu wurden zunächst ihre Auswirkungen auf den Triplettzustand verschiedener Fluorophore (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) mit Hilfe von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) untersucht. Cyclooctatetraen (COT) bewirkte dabei eine Abnahme der Triplettausbeute von Al488, Al532 und Al647 um ~ 40-60%, bei Atto655 veränderte sie sich nicht. Obwohl die Ergebnisse der FCS-Messungen darauf hindeuten, dass COT in einer erhöhten Anzahl an emittierten Photonen resultiert, konnte dies bei dSTORM-Messungen nicht bestätigt werden. Hier hatte COT nur einen größeren positiven Effekt auf das Fluorophor Al647 (Zunahme um ~ 60%). Eine Erklärung für diese Widersprüchlichkeit zu den Ergebnissen aus den FCS-Messungen, könnte das Vorhandensein des Schaltpuffers bei dSTORM-Messungen sein. Dieser bewirkt den Übergang der Fluorophore in den Aus-Zustand bzw. entzieht dem Puffer Sauerstoff. Bei der Zugabe von 5 mM Kaliumiodid (KI) nahm die Triplettamplitude bei FCS-Messungen nur bei Al488 ab (um ~ 80%). Eine geringe Steigerung (um ~ 10%) der Intensität von Al488 mit KI konnte bei dSTORM-Messungen mit niedrigen Konzentrationen (~ 0,5 mM) erzielt werden. Bei einer Konzentration von 5 mM sank die Intensität jedoch wieder um 40%. Deuteriumoxid (D2O) soll, anders als die Triplettlöscher, eine Verbesserung der Photonenausbeute dadurch bewirken, dass strahlungslose Relaxationsprozesse minimiert werden. Mit dSTORM-Messungen konnte gezeigt werden, dass Atto655 und Al647 in D2O zwar pro An-Zustand mehr Photonen emittieren als in Schaltpuffer ohne D2O, da die Fluorophore hier jedoch schneller bleichen, letztendlich die gleiche Anzahl an Photonen detektiert werden. Um die Anzahl an emittierten Photonen zu erhöhen, eignet sich also nur COT bei dSTORM-Messungen mit AL647 und KI in sehr geringen Konzentrationen bei Al488. D2O kann eingesetzt werden, wenn eine Probe schnell vermessen werden muss, wie zum Beispiel bei Lebendzellmessungen. Nicht nur eine zu niedrige Photonenzahl, auch eine zu geringe Photoschaltrate kann Artefakte bei dSTORM-Messungen erzeugen. Dies wurde anhand von verschiedenen biologischen Strukturen, die mit unterschiedlichen Anregungsintensitäten aufgenommen wurden, deutlich gemacht. Besonders die Aufnahmen von Plasmamembranen sind anfällig für die Generierung von Artefakten. Sie weisen viele inhomogene und lokal dichte Regionen auf. Wenn nun mehr als ein Emitter pro µm² gleichzeitig an ist, erzeugt das Auswertungsprogramm große artifizielle Cluster. Die hier durchgeführten Messungen machen deutlich, wie wichtig es ist, dSTORM-Bilder immer auf mögliche Artefakte hin zu untersuchen, besonders wenn Moleküle quantifiziert werden sollen. Dafür müssen die unbearbeiteten Rohdaten sorgfältig gesichtet werden und notfalls die Messungen mit einer höheren Laserleistung wiederholt werden. Da dSTORM mittlerweile immer mehr zur Quantifizierung eingesetzt wird und Clusteranalysen durchgeführt werden, wäre es sinnvoll bei Veröffentlichungen die Rohdaten von entscheidenden Aufnahmen der Öffentlichkeit zur Verfügung zu stellen. Die Färbemethode ist ein weiterer Punkt, durch den Artefakte bei der Abbildung von Molekülen mittels SMLM entstehen können. Häufig werden Antikörper zum Markieren verwendet. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass möglichst kleine Antikörper oder Antikörperfragmente verwendet werden, besonders wenn Clusteranalysen durchgeführt werden sollen. Anderenfalls leidet die Auflösung darunter, bzw. erhöht sich die Gefahr der Kreuzvernetzung von Molekülen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden Plasmamembran-Ceramide untersucht. Ceramide gehören zu den Sphingolipiden und regulieren diverse zelluläre Prozesse. Verschiedene Stimuli bewirken eine Aktivierung von Sphingomyelinasen (SMasen), die Ceramide in der Plasmamembran synthetisieren. Steigt die Konzentration von Ceramiden in der Plasmamembran an, kondensieren diese zu Ceramid-reichen Plattformen (CRPs). Bisher ist noch wenig über die Verteilung der Ceramide und die Größe der CRPs bekannt. Sie wurden hier über IgG-Antikörper in der Plasmamembran von Jurkat-, U2OS-, HBME- und primären T-Zellen angefärbt und erstmals mit dSTORM hochaufgelöst, um sie dann zu quantifizieren. Unabhängig von der Zelllinie befanden sich 50% aller Ceramidmoleküle in ~ 75 nm großen CRPs. Im Mittel bestanden die CRPs aus ~ 20 Ceramiden. Mit Hilfe einer Titrationsreihe konnte ausgeschlossen werden, dass diese Cluster nur durch die Antikörper-Färbung artifiziell erzeugt wurden. Bei Inkubation der Zellen mit Bacillus cereus Sphingomyelinase (bSMase) stieg die Gesamtkonzentration der Ceramide in der Plasmamembran an, ebenso wie die Ceramidanzahl innerhalb der CRPs, außerdem die Anzahl und Größe der CRPs. Dies könnte zu einer Veränderung der Löslichkeit von Membrankomponenten führen, was wiederum eine Akkumulation bestimmter Rezeptoren oder eine Kompartimentierung bestimmter Proteine erleichtern könnte. Die Anhäufung der Ceramide in den CRPs könnte ebenfalls die lokale Interaktion mit anderen Membranmolekülen erleichtern und dadurch möglicherweise die Reaktivität von Rezeptoren verändern. Mittels Azid-modifizierten Ceramidanaloga und kupferfreier Click-Chemie wurden Plasmamembran-Ceramide auch in lebenden Jurkat-Zellen mit Hilfe konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM, engl. confocal laser scanning microscopy) und Strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM, engl. structured illumination microscopy) untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Fettsäure-Kettenlänge und die Position des Azids bei den Ceramidanaloga eine entscheidende Rolle spielt, wie hoch das detektierte Signal in der Plasmamembran letztendlich ist. Die Versuche machen auch deutlich, dass die klickbaren Ceramidanaloga lebendzellkompatibel sind, sodass sie eine hervorragende Möglichkeit darstellen, zelluläre Reaktionen zu verfolgen. Es wurden hier nicht nur Ceramide in eukaryotischen Zellen analysiert, sondern auch in Bakterien. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) sind gramnegative Bakterien, die im Menschen eine Sepsis oder eine Meningitis auslösen können. Es wurde mittels immunhistochemischen Färbungen mit dem anti-Ceramid IgG-Antikörper, aber auch mit den klickbaren Ceramidanaloga, ein Signal in der Membran erhalten, was mit dSTORM hochaufgelöst wurde. In anderen Bakterien wurden ebenfalls schon Sphingolipide nachgewiesen. Studien zu Ceramiden in N. meningitidis wurden bisher jedoch noch nicht veröffentlicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals Ergebnisse erhalten werden, die darauf hinweisen, dass N. meningitidis ebenfalls Ceramide besitzen könnten. In einem dritten Projekt wurde die Interaktion zwischen NK-Zellen und Aspergillus fumigatus untersucht. Der Schimmelpilz kann eine Invasive Aspergillose in immunsupprimierten Menschen auslösen, was zum Tod führen kann. Verschiedene Studien konnten schon zeigen, dass NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung des Pilzes spielen. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass der NK-Zell-Marker CD56 entscheidend für die Pilzerkennung ist. Mit immunhistochemischen Färbungen und LSM-, aber auch dSTORM-Messungen, konnte gezeigt werden, dass die normalerweise homogen verteilten CD56-Rezeptoren auf der Plasmamembran von NK-Zellen aktiv an die Interaktionsstelle zu A. fumigatus transportiert werden. Mit der Zeit akkumulieren hier immer mehr CD56-Proteine, während das Signal in der restlichen Membran immer weiter abnimmt. Es konnte erstmals CD56 als wichtiger Erkennungsrezeptor für A. fumigatus identifiziert werden. In dem letzten bearbeiteten Projekt, wurde die Bindung von Anti-N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor Enzephalitis Autoantikörper an Neuronen untersucht. Bei einer Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis bilden die Patienten Autoantikörper gegen die NR1-Untereinheit ihrer eigenen postsynaptischen NMDA-Rezeptoren. Da die Krankheit oft sehr spät erkannt wird und die Behandlungsmöglichkeiten noch sehr eingeschränkt sind, führt sie noch oft zum Tod. Sie wurde erst vor wenigen Jahren beschrieben, sodass der genaue Mechanismus noch unbekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit, konnten erste Färbungen mit aufgereinigten Antikörper aus Anti-NMDA-Rezeptor Enzephalitis Patienten an NMDA-Rezeptor-transfizierte HEK-Zellen und hippocampalen Maus-Neuronen durchgeführt und mit dSTORM hochaufgelöst werden. Mit den Messungen der HEK-Zellen konnte bestätigt werden, dass die Autoantikörper an die NR1-Untereinheit der Rezeptoren binden. Es konnten erstmals auch die Bindung der Antikörper an Neuronen hochaufgelöst werden. Dabei wurde sichtbar, dass die Antikörper zum einen dicht gepackt in den Synapsen vorliegen, aber auch dünner verteilt in den extrasynaptischen Regionen. Basierend auf der Ripley’s H-Funktion konnten in den Synapsen große Cluster von ~ 90 nm Durchmesser und im Mittel ~ 500 Lokalisationen und extrasynaptisch kleinere Cluster mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ~ 70 nm und ~ 100 Lokalisationen ausgemacht werden. Diese ersten Ergebnisse legen den Grundstein für weitere Messungen, mit denen der Mechanismus der Krankheit untersucht werden kann. N2 - With single molecule localization microscopy (SMLM) quantification of molecules and the analysis of their distribution becomes possible. In this work various plasma membrane molecules of different eukaryotic and prokaryotic cells were imaged with dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) or PALM (photoactivated localization microscopy) and quantified. To use these super-resolution fluorescence microscopy techniques and answer elaborate biological questions, potential sources of artifacts were identified and strategies to circumvent them developed. A possible source of artifacts is an insufficient number of photons emitted by fluorophores. If less photons are detected, determining the localization of one fluorophore is less precise. This can cause a wrong reconstruction of structures or might lead to false conclusions about the distribution of molecules. One possibility to increase the number of photons is to use chemical additives which quench the triplet state of fluorophores. They ensure that the fluorophores relax into the ground state allowing them to become excited again. Different additives, described in literature as triplet quenchers, were tested. The effects of these additives on the triplet state of different fluorophores (Alexa Fluor (Al) 488, 532 und 647 und Atto655) were analyzed with fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Cyclooctatetraene (COT) resulted in a decrease of triplet state yield of Al488, Al532 and Al647 by ~ 40-60%, yet the triplet state of Atto655 was unaffected. FCS measurements indicated that COT results in an increased number of emitted photons, but dSTORM measurements could not confirm this finding. Here, COT only revealed a positive effect on the intensity of Al647 (increase by ~ 60%). An explanation for this inconsistency with the FCS results might be the presence of the switching buffer in dSTORM measurements. The buffer is designed to cause a transition of the fluorophores to and stabilize the off-state by removing oxygen from the sample, counteracting the effect of COT. On addition of 5 mM potassium iodide (KI) only Al488 fluorophores showed a decreased triplet state rate (~ 80%) in FCS measurements. This finding was confirmed by dSTORM measurements with low concentrations (~ 0.5 mM) of KI which resulted in a slight intensity increase (~ 10%) of Al488. Higher KI concentration (5 mM) on the other hand showed a reversed effect, resulting in a drop in intensity by ~ 40%. Deuterium oxide (D2O) isn’t a triplet quencher but should minimize non-radiative processes. DSTORM measurements with Atto665 and Al647 revealed, that D2O does not affect the total number of emitted photons per fluorophore. Instead, D2O increased the amount of emitted photons per time. In a nutshell, these results show that dSTORM measurements with Al647 can be improved using COT, and measurements with Al488 by using very low concentrations of KI. If needed, D2O can speed up dSTORM acquisition time considerably, e.g. for life cell measurements. In addition to an insufficient number of collected photons, inappropriate photoswitching rates can induce artifacts in dSTORM measurements as well. This was shown using various biological reference structures. Especially the imaging of plasma membranes is prone to generate artifacts. Plasma membranes exhibit a lot of intrinsically three-dimensional structures with high local emitter densities. In these regions of higher fluorophore densities the likelihood of two close fluorophores emitting at the same time is increased. This in turn can result in large artificial clusters due to misinterpretation by the reconstruction software. Taken together, the performed experiments show how important it is to prove dSTORM images and minimize possibility image artifacts. Thus, raw data movies need to be examined carefully and, if necessary, measurements must be repeated with adapted imaging conditions. Since dSTORM is increasingly used for quantification and cluster analysis it is recommended to publish raw data in the Supporting information of the manuscript. Another source of artifacts when imaging molecules with SMLM is the staining procedure. Usually antibodies are used to label biological structures for dSTORM. In the interest of resolution, small antibodies or just fragments of antibodies should be used, especially if cluster analysis is performed. Otherwise reduced resolution or an increase in cross-linking of molecules might occur. In the second part of this study plasma membrane ceramides were investigated. Sphingolipid ceramides regulate various cellular processes. Different stimuli initiate activation of sphingomyelinases (SMase) which synthesize ceramides at the plasma membrane. A rise in ceramide concentration leads to a condensation of them in ceramide-rich platforms (CRPs). So far, only little is known about the distribution and the size of CRPs. Here, plasma membrane ceramides of Jurkat-, U2OS-, HBME- and primary T-cells were stained with an IgG-antibody, imaged using dSTORM and their distribution quantitatively analyzed. Independent of the analyzed cell line, ~ 50% of all ceramides detected in the plasma membrane formed CRPs with a size of ~ 75 nm. On average one CRP consisted of ~ 20 ceramide molecules. Using a titration series the possibility of artificial cluster generation due to antibody staining was ruled out. Treatment of cells with Bacillus cereus sphingomyelinase (bSMase) increased the overall ceramide concentration in the plasma membrane, the number of ceramides in the CRPs as well as the quantity and the size of CRPs. This might result in a higher solubility of membrane components in CRPs which in turn could facilitate accumulation or compartmentation of certain proteins. Accumulation of ceramides in the CRPs could also enable local interaction with other molecules and possibly change the reactivity of some receptors. To investigate plasma membrane ceramides in living cells azido-modified ceramides and copper-free click chemistry were used for labeling. Imaging was performed using confocal laser-scanning microscopy (LSM) and structured illumination microscopy. It was shown that the length of fatty acid chains and the position of the azido group of ceramide analogues play a decisive role in the magnitude of the detected signal in the plasma membrane. These results demonstrate that azido-functionalized ceramides are live-cell compatible, making them an excellent tool to follow cellular reactions. In this study, ceramides were not only analyzed in eukaryotic cells but in bacteria as well. Neisseria meningitidis (N. meningitidis) are gram-negative bacteria triggering sepsis or meningitis in humans. Using both immunolabeling with anti-ceramide IgG-antibodies and azido-modified ceramides, ceramides were detected for the first time in the membrane of N. meningitidis by dSTORM. Although sphingolipids were reported to exist in various bacterial membranes, studies about ceramides in N. meningitidis have not yet been published. The results obtained here suggest the presence of ceramides in N. meningitidis. The third part of this thesis addresses the interaction between NK cells and Aspergillus fumigatus. The mold can cause invasive aspergillosis in immunocompromised patients which can lead to death. Various studies have already shown that NK cells play a crucial role in the clearance of the fungal infection. Still, the exact mechanism remains unknown. As part of this work the NK cell marker CD56 was identified as a decisive receptor in recognition of the mold. Using LSM and dSTORM measurements in combination with immunocytochemical staining an active transport of the usually homogenous distributed CD56 receptors to the interaction site of NK cells and fungus was detected. Over time CD56 proteins accumulate at these interaction sites while the signal in the rest of the membrane continuously decreases. For the first time this study was able to identify CD56 as an important recognition receptor for A. fumigatus. In the last project binding of anti-N-Methyl-D-aspartate (NMDA) receptor encephalitis autoantibodies were investigated in neurons. Patients with this form of encephalitis generate autoantibodies against the NR1 subunit of their own postsynaptic NMDA receptors. Since NMDA receptor encephalitis is often diagnosed too late and treatment options are limited the disease often proves to be fatal. Anti-NMDA receptor encephalitis was described quite recently, explaining why the exact mechanism remains still unknown. For this study purified antibodies from anti-NMDA receptor encephalitis patients were used to stain NMDA receptor transfected HEK cells and hippocampal mouse neurons. These samples were subsequently imaged with dSTORM and analyzed. Measurements on HEK cells confirmed that the autoantibodies bind to the NR1 subunit. Using dSTORM, the binding sites of these antibodies at the neurons were imaged for the first time with super-resolution microscopy. The receptors are densely localized in synapses and more equally distributed at lower density in extrasynaptic regions. Based on Ripley’s H function synaptic clusters with a diameter of ~ 90 nm and ~ 500 localizations were determined while the extrasynaptic smaller clusters have a median diameter of ~ 70 nm and ~ 100 localizations per cluster. These first results form the basis for further investigations on the mechanism of anti-NMDA receptor encephalitis. KW - Ceramide KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Aspergillus fumigatus KW - NMDA KW - Neisseria meningitidis KW - Lokalisationsmikroskopie KW - dSTORM KW - Plasmamembran Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145725 ER - TY - THES A1 - Löwe, Tobias T1 - Untersuchung von gene-drive-Strategien als neue Interventionsstrategien zur Eindämmung der Malaria T1 - A refined genome engineering strategy against parasites and vectors: an application for malaria control N2 - In der vorliegenden Arbeit haben wir unter Nutzung bioinformatischer Methoden eine innovative Strategie zur Eindämmung der Malaria entwickelt. Die genetische Modifikationsstrategie beinhaltet sowohl Manipulationen aufseiten des gefährlichsten Erregers, Plasmodium falciparum, als auch des Hauptvektors, Anopheles gambiae. In den Genomen beider Spezies wurden eine Reihe neuer konkreter targets identifiziert. Auch bereits beschriebene targets und Ansätze wurden in die Strategie einbezogen bzw. weiter ausgestaltet. Bezüglich der Vektormoskitos wird die Verbreitung eines gegenüber Plasmodien resistenten Genotyps angestrebt. Es werden einerseits effiziente natürliche und künstliche Resistenzgene diskutiert und andererseits eine bekannte Strategie zur Fixierung natürlicher Resistenzallele in natürlichen Populationen verbessert. Auf der Seite der Plasmodien erweiterten wir einen bereits von A. Burt (2003) beschriebenen Eradikationsansatz um weitere targets. Aus ethischen und evolutionsbiologischen Erwägungen bevorzugen wir jedoch eine alternative Strategie, welche die Etablierung von in ihrer Virulenz gemilderten Parasiten zum Ziel hat. Der attenuierte Genotyp wird unter anderem durch komplexe Pathway-Remodellierungen beschrieben (Löwe, Sauerborn, Schirmer, Dandekar, A refined genome engineering strategy against parasites and vectors, Manuskript beim Journal „Genome Biology“ eingereicht). Da sich Mutanten in der Natur gegen Wildtyp-Organismen kaum durchsetzen können, werden zwei drive-Systeme beschrieben, welche für die Implementierung der genetischen Manipulationsstrategie entwickelt wurden. Beide Konstrukte wurden zur Patentierung angemeldet (Patentanmeldung U30010 DPMA bzw. Aktenzeichen 102006029354.1). Zusätzlich zur deutschen wurde für eines der beiden Konstrukte eine PCT-Anmeldung eingereicht, welche in Zukunft einen internationalen Patentschutz ermöglichen soll. Es werden Kalkulationen vorgelegt, welche die Verbreitungstendenzen der Konstrukte in natürlichen Populationen vorhersagen. Die Beschreibung der entwickelten Konstrukte beschränkt sich nicht auf das primäre Anwendungsgebiet der Arbeit (Malaria), sondern beinhaltet auch andere Anwendungsgebiete, vor allem im Bereich der Medizin und Molekularbiologie. N2 - Background: Gene drive strategies are an important alternative to control tropical diseases such as malaria. Results: Here we introduce a new gene drive strategy based on gene conversion constructs. We identify a gene drive strategy both for plasmodia and for anopheles including design of an inducible modification vector. Our constructs are based on group II introns or homing endonuclease genes. They include besides the intron to modify vector or parasite genome sites inducible promoters for gene activation. We thus separate gene modification from activation of the modified gene. Moreover, we provide a detailed list of suitable targets in vector and plasmodia for the modification strategy. Finally, we discuss the control effect of an eradication strategy versus a mild strategy of the gene construct for vector and parasite populations. Conclusions: A new eukaryotic vector and parasite control strategy using gene drive systems is presented and discussed. KW - Malaria tropica KW - Malaria KW - Gentechnologie KW - Malariamücke KW - Anopheles gambiae KW - Plasmodium KW - Plasmodium falciparum KW - Containment KW - malaria KW - disease control KW - population engineering KW - siRNA KW - evolution Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28750 ER - TY - THES A1 - Schwarze, Simone T1 - Untersuchung von Faltungs- und Funktionsdynamik isolierter Proteindomänen mittels Fluoreszenzlöschung T1 - Investigation of folding and function dynamics of isolated Protein Domains using fluorescence quenching N2 - Proteine bestehen aus einer spezifischen Sequenz verschiedener Aminosäuren, die ihre charakteristische Funktion bestimmt. Die große Variabilität an Aminosäuresequenzen ermöglichte die Evolution einer nahezu unbegrenzten Anzahl an Proteinen. Meistens nehmen diese Schlüsselpositionen ein, von robusten Baustoffen bis hin zu molekularen Maschinen. Daher kann eine Fehlfunktion gravierende Auswirkungen auf das Leben haben, z.B. Krankheiten wie Alzheimer oder Epilepsi. Um die Funktionen und Fehlfunktionen zu verstehen, ist eine umfassende Kenntnis der Proteinfaltung, der Protein-Protein Assoziation, sowie den Dynamiken innerhalb von Proteinen erforderlich. Diese Vorgänge wurden in dieser Arbeit an drei isolierten Proteindomänen durch die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers untersucht. Der entfaltete Zustand der Bindungsdomäne BBL, das Teil des 2-oxo-acid Dehydrogenasekomplexes ist, wurde unter physiologischen Bedingungen mit Zirkulardichroismus (CD) und einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie analysiert. Beide Methoden zeigten übereinstimmend anhand von 20 in BBL einzeln eingefügten konservativen Punktmutationen, dass Seitenketteninteraktionen keine Auswirkungen auf die Sekundärstruktur des denaturierten Zustandes, den Ausgangspunkt der Faltung, haben. Mit Hilfe der Dekonvolation der CD-Spektren wurde zudem gezeigt, dass die Reststruktur im denaturierten Zustand der helikalen Proteindomäne von β-Strängen und β-Kehren dominiert wird, die eine entscheidende Funktion bei der Faltung in den nativen Zustand haben könnten. Die N-terminale Domäne (NTD), der für die Materialforschung hochinteressanten Spinnen-seidenfaser, ist für die Polymerisation des Spinnenseidenfadens auf den pH-Wechsel von pH 7 auf pH 6 hin verantwortlich. Dieser für die Proteinfunktion wichtige Prozess wurde durch die Einbringung eines extrinsischen Fluoreszenzschalters, basierend auf der H-Dimerbildung, mit der Stopped-Flow-Technik untersucht. Es wurde gezeigt, dass die NTDs 104 mit einer Rate von 3 x 10^8 M-1 s-1 assoziieren und somit nahezu das Geschwindigkeitslimit der Protein-Protein Assoziation erreicht wird. Zwei geladenen Seitenketten, der D39 und D40, kommt eine entscheidende Funktion in dem Prozess zu, da eine Mutation dieser die Assoziation verhindert. Des Weiteren wurde gezeigt, dass sich die NTD auf eine Erhöhung der Ionenstärke entgegengesetzt zu anderen Proteinen verhält: die Dissoziation wird beschleunigt, die Assoziation nicht beeinflusst. Gleiches Verhalten wurde auf den einzelnen Austausch der übrigen protonierbaren Aminosäureseitenketten hin beobachtet, ausgenommen die Mutation der E119, welche die Dissoziation verlangsamt. Daher scheint der makromolekulare Dipol, der auf Grund der Ladungsverteilung in der NTD entsteht, die Assoziation maßgeblich zu beeinflussen. Glutamatrezeptoren sind an der schnellen synaptischen Signalweiterleitung im Nervensys-tem von Vertebraten beteiligt. Die Konformationen der Ligandenbindungsdomäne (LBD) haben dabei entscheidende Auswirkungen auf die Funktion des Gesamtrezeptors. Diese wurden mit einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie untersucht. Mit dieser Methode wurde ein dynamisches Bild der gebundenen sowie ungebundenen Form der AMPA-spezifischen Glutamatrezeptor 2-LBD gezeigt. Es wurde zudem gezeigt, dass sich die Dynamiken in Abhängigkeit der Bindung von den Agonisten Glutamat und AMPA, dem partiellen Agonisten Kainate oder Cyclothiazid (CTZ), welches eine Dimerisierung der LBDs bewirkt, unterschiedlich verändern. Dies könnte eine Auswirkung auf die Funktion der Rezeptoren haben. Die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers in dieser Arbeit hat gezeigt, dass diese die Möglichkeit bieten, unterschiedlichste Fragestellungen zu beantworten und so Einblicke in dynamische Funktionsweisen von Proteinen eröffnen. Kombiniert mit etablierten Fluoreszenzmethoden ist es so möglich quantitativ Kinetiken auf unterschiedlichen Zeitskalen zu untersuchen. N2 - Proteins are composed of a specific sequence of variable amino acids that specify their specific function. The vast variability of possible amino acid sequences allowed for the evolution of a nearly infinite number of different proteins. Mostly these will have key positions, reaching from strong building material to molecular machines. Therefore a malfunction will have an immense effect on life, i.e. diseases like Alzheimer disease or epilepsy. In order to understand the function and malfunction an intense understanding of the protein folding, the protein-protein association, as well as the protein dynamics is essential. These processes have been investigated in this thesis with three isolated protein domains by the application of the fluorescence quenching mechanisms of the H-dimer-formation and by the photoinduced electron transfer. The unfolded state of the binding domain BBL, which is part of the 2-oxo-acid-dehydrogenase-complex, was analysed under physiological conditions by circular dichroism (CD), and a combination of photoinduced electron transfer and fluorescence correlation spectroscopy. Both methods showed accordingly, using 20 singly implanted conservative point mutations in BBL, that side-chain interactions have no effect on the secondary struc-ture of the denatured condition, the initial state of the folding. Using deconvolution on the CD spectra it was shown in addition, that the remaining structure of the helical protein domain in the denatured state is dominated by β-strands and β-turns. These may have a decisive function during the folding in the native state. The N-terminal domain of the spider silk fibre, which is of high interest for the material research, is responsible for the polymerisation of the spider silk fibre during the pH-change from pH 7 to pH 6. This important process for the protein function was investigated with the Stopped-Flow technique by the application of an extrinsic fluorescence switch, based on the H-dimer formation. It was shown, that NTDs associate with a rate of 3 x 10^8 M-1 s-1, and so nearly reach the speed limit of the protein-protein association. In this process two charged side chains, the D39 and D40, have a decisive function, as a mutation of these will 106 avoid the association. Furthermore it was shown, that the NTD will react in opposition to other proteins on the increase of the ionic strength: the dissociation will be speeded up, and the association is not influenced. The identical behaviour was observed with the single ex-change of the other protonable amino acid side chains, except for the mutation of E119, which retards dissociation. Therefore the macromolecular dipol, that is formed by the charge distribution of the NTD, is obviously influencing the association. Glutamate receptors participate in the fast synaptic signal transfer in vertebrates. Here dif-ferent conformations of the ligand binding domain (LBD) have decisive effects on the function of the entire receptor. These have been investigated with a combination of photoin-duced electron transfer and fluorescence correlation spectroscopy. Using this method a dynamic behaviour of the bound and unbound form of the AMPA specific glutamate receptor 2 LBD was shown. Furthermore it was shown, that the dynamics will change differently in dependence of the binding of the agonist glutamate and AMPA, the partial agonist kainate or Cyclothiazide (CTZ), which effects a dimerization of the LBDs. This may have an effect on the function of the receptors. The use of the fluorescence quenching mechanisms of the H-dimer formation and the pho-toinduced electron transfer in this thesis has shown, that these offer the opportunity to an-swer a large range of questions and open a view to the dynamic functionality of proteins. Combined with established fluorescence methods it is possible to quantitatively investigate kinetic rates at different time scales. KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Fluoreszenzlöschung KW - Domäne KW - Proteindynamiken KW - H-Dimerbildung KW - Photoinduzierter Elektronentransfer KW - Spinnenseide KW - Glutamatrezeptor KW - BBL KW - protein dynamics KW - fluorescence quenching KW - Proteindomänen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107080 ER - TY - THES A1 - Riemensperger, Thomas T1 - Untersuchung prädiktiver Eigenschaften des dopaminergen Systems von Drosophila melanogaster mittels genetisch kodierter Calcium Sensoren T1 - Analysis of predictive features in the dopaminergic System of Drosophila melanogaster using genetically encoded Calcium Sensors N2 - Die Technik des optischen Imaging unter Verwendung DNA-codierter Sensoren ermöglicht es, Messungen neuraler Aktivitäten in genetisch definierten Populationen von Neuronen durchzuführen. In der Vielzahl der verschiedenen entwickelten Sensoren konnten die Calciumsensoren bisher das beste Verhältnis zwischen Signal und Rauschen und die beste zeitliche Auflösung aufzeigen. Hierbei handelt es sich in erster Linie um zwei Typen von Sensoren, zum einen ratiometrische Sensoren, deren Signal auf einem Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) basiert, und zum anderen um zirkulär permutierte Sensoren, die auf einem modifizierten GFP-Molekül basieren, wobei das Signal auf einer veränderten Protonierung des Chromophors beruht. Beide Arten dieser Sensoren wurden schon erfolgreich zum Messen neuraler Aktivitäten in Nervensystemen verschiedener Tierarten verwendet. Ein Teil dieser Arbeit bestand darin, zu untersuchen, welche Sensoren sich für die Messung an einem lebenden Organismus am besten eignen. Hierfür wurden die Eigenschaften von vier verschiedenen FRET basierten Sensoren und zwei der zyklisch permutierten Sensoren nach Expression im zentralen Nervensystem von Drosophila charakterisiert. Die Sensoren wurden in Neuronen zweiter und dritter Ordnung des olfaktorischen Signalwegs exprimiert und ihre Antworten auf physiologische Duftstimulation oder artifiziell induzierte Depolarisation des Gehirns untersucht. Während die calciumabhängigen Signale der zyklisch permutierten Sensoren in der Regel größer waren als die der FRET basierten Sensoren, zeichneten sich letztere durch ein besseres Signal zu Rausch-Verhältnis aus, wenn Bewegungen der fluoreszierenden Strukturen nicht zu vermeiden waren. Dies war auch der ausschlaggebende Grund für die Verwendung eines FRET basierten Sensors im anschließenden Teil der Arbeit. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Effekt untersucht, den die Paarung eines neutralen Stimulus mit einem bestrafenden Stimulus auf dopaminerge Neurone hat. Eine solche Paarung kann zu einer klassischen Konditionierung führen, einer einfachen Form des Lernens, in welcher das Tier einem ursprünglich neutralen Stimulus einen Wert zuordnet, und dadurch sein Verhalten dem Stimulus gegenüber ändert. Die olfaktorische klassische Konditionierung in Drosophila wird seit vielen Jahren intensiv untersucht, um die molekularen und neuronalen Grundlagen von Lernen und Gedächtnis zu charakterisieren. Dabei hat sich gezeigt, dass besonders die Pilzkörper von essentieller Bedeutung für die Ausbildung eines olfaktorischen Gedächtnisses sind. Während das olfactorische System bei Insekten bereits detailiert analysiert wurde, ist über die Neurone, die den bestrafenden Stimulus vermitteln, nur sehr wenig bekannt. Unter Anwendung des funktionellen optischen Calcium Imaging konnte im Rahmen der Arbeit gezeigt werden, dass die Projektionen von dopaminergen Neuronen im Bereich der Loben der Pilzkörper schwach auf die Präsentation eines Duftes, jedoch sehr stark auf eine Stimulation durch einen Elektroschock antworten. Nach mehrmaliger Paarung eines Duftes mit einem Elektroschock während eines Trainings, verlängert sich die Aktivität dieser dopaminergen Neurone auf den bestraften Duft hin im Test ohne Elektroschock drastisch, während die Antwort auf den Kontrollduft keine signifikanten Veränderungen aufweist. Während bei Säugetieren belohnende Reize bei appetitiven Lernvorgängen über dopaminerge Neurone vermittelt werden, spielen bei Drosophila diese Neurone offensichtlich eine Rolle bei der aversiven Konditionierung. Jedoch blieb, auch wenn sich die Rolle des Dopamins im Laufe der Evolution geändert zu haben scheint, die Fähigkeit dieses Neuronentyps, nicht nur auf einen eintreffenden verstärkenden Stimulus zu reagieren, sondern diesen auch vorhersagen zu können, zwischen Säugern und Drosophila erhalten. N2 - The technique of optical in vivo imaging using genetically encoded fluorescent sensors in transgenic animals has paved the way for real-time monitoring of spatio-temporal activity in the brain. Among the different fluorescent probes, the calcium sensors produce signals with the highest signal to noise ratio and the best temporal resolution. Basically these sensors can be split into two groups, those based on a FRET-effect between two modified green fluorescent proteins (GFPs) and those which make use of on a circular permutation of GFP. Both types have successfully been used for measuring neuronal activity in various species. One part of the present work was to test which of these different sensor types are best suited for an in vivo situation. For this, two members of the class of circularly permutated sensors and four members of the class of FRET based sensors were tested and compaired in Drosophila. Each sensor was expressed in second and third order neurons of the olfactory pathway and the calcium activity evoked by artificial depolarisation or physiological odour stimuli was recorded. Whereas the Calcium dependent change in signal intensity is substantially higher for the circularly permutated sensors, the FRET based sensors tested in this work showed a better signal to noise ratio when movement of the brain structures under investigation could not be prevented. For this reason a FRET based sensor was chosen to measure the activity of dopaminergic neuronsin a classical conditioning paradigm. In the second part of this work the effect of pairing a neutral stimulus with a negative reinforcer (in this case an electric shock) on the activity of dopaminergic neurons was investigated. The pairing of these two stimuli can lead to classical conditioning, a simple form of learning in which the animal assigns a value (positive or negative) to the formerly neutral stimulus. Olfactory classical conditioning in Drosophila melanogaster is a prime model for the analysis of the molecular and neuronal substrate of this type of learning and memory. In particular the mushroom bodies have been shown to be essential for olfactory memory formation. While the olfactory system of insects has been extensively characterized little is known about the neurons that mediate the reinforcing stimulus. Using the technique of optical calcium imaging it was possible to show that dopaminergic projections in the region of the mushroom body lobes responded weakly to odour presentations, but strongly to the stimulation by an electric shock. After pairing for several times one of two odours presented to the fly with an electric shock (training), the activity of the dopaminergic neurons to the punished odour is significantly prolonged in a test after the training. No change is observed after the training for the control odour that was not paired with the electric shock. Whereas in mammals rewarding stimuli are mediated by dopaminergic neurons, in Drosophila this catecholamine apparently plays a role in mediating aversive reinforcement. Even though the role of dopamine seems to have changed during evolution the capability of dopaminergic neurons to predict a reinforcing stimulus appears to be conserved between Drosophila and mammals. KW - Taufliege KW - Dopaminerge Nervenzelle KW - Calcium KW - Calcium imaging KW - Sensoren KW - Dopamin KW - Drosophila melanogaster KW - prädiktive Eigenschaften KW - Calcium imaging KW - Sensors KW - Dopamine KW - Drosophila melanogaster KW - predictive features Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19041 ER - TY - THES A1 - Göhler, Antonia T1 - Untersuchung Karbohydrat-bindender Proteine mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung T1 - Studying carbohydrate binding proteins with high temporal and spatial resolution N2 - Das menschliche Genom verschlüsselt 30000 bis 40000 Proteine, von denen ein Großteil kovalent gebundene Karbohydrat-Gruppen an Asparagin-, Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-Resten trägt. Diese sogenannten Glykoproteine sind allgegenwärtige Bestandteile der extrazellulären Matrix von Zelloberflächen. Sie steuern Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikationen, können bei der roteinfaltung helfen bzw. die Proteinstabilität erhöhen oder Immunantworten regulieren. Die Auslösung von biologischen Prozesse erfordert aber Übersetzer der zuckerbasierten Informationen. Solche Effektoren sind die Lektine, unter ihnen auch die Galektine. Galektine binden spezifisch β-Galaktosen, weisen strukturelle Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz ihrer Zuckererkennungsdomänen (CRDs) auf und zeigen ein „jelly-roll“-Faltungsmuster, bestehend aus einem β-Sandwich mit zwei antiparallelen Faltblättern. Strukturell werden die CRDs in drei verschiedenen, topologischen Formen präsentiert. Proto-Typen existieren als nicht-kovalent verknüpfte Dimere der CRDs, Chimera-Typen besitzen neben der CRD eine Nicht-Lektin-Domäne und bei den Tandem-Repeat-Typen sind zwei verschiedene CRDs über ein kurzes Linker-Peptid kovalent verbunden. Galektine werden sowohl in normalem wie auch pathogenem Gewebe exprimiert und das zunehmende Wissen über die Beteiligung an verschiedenen Krankheiten und Tumorwachstum liefert die Motivation, strukturelle Aspekte und die Vernetzung von Lektinen detailliert, insbesondere im Hinblick auf ihre intrafamiliären Unterschiede, zu untersuchen. Durch die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, basierend auf der Verwendung von Fluorophoren (intrinsisch und extrinsisch), werden in dieser Arbeit die Eigenschaften von Galektinen näher untersucht. Mit Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) und Anisotropie-Messungen wird gezeigt, dass eine Liganden-Bindung bei Proto-Typ-Galektinen mit einer Verringerung des hydrodynamischen Radius einhergeht. Bei Tandem-Repeat- und Chimera-Typen bleibt der Radius konstant. Dafür skaliert die Diffusionskonstante von Tandem-Repeat-Typen anormal mit der molaren Masse. Die Anisotropie-Messungen werden parallel zu den FCS-Messungen durchgeführt, um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Mit Hilfe dieser Technik wird außerdem gezeigt, dass unterschiedliche Dissoziationskonstanten und Kinetiken für den Bindungsprozess innerhalb der Proto-Typ-Gruppe möglichweise auf unterschiedliche Konformationsdynamiken zurückgehen. Der Vergleich von hGal-1 und cG-1B verdeutlicht, dass strukturelle Ähnlichkeiten zwar ein identisches Bindungsverhalten hervorrufen können, der Oxidationsprozess der Proteine aber unterschiedlich ablaufen kann. Beide Methoden können so als sehr sensitive Techniken zur Untersuchung von Strukturmerkmalen bei Galektinen etabliert werden, wobei die Übertragbarkeit auf andere Glykoproteine gewährleistet ist. Weiterhin gilt Quervernetzung als eine der wichtigsten Eigenschaften von Galektinen, da durch die Vernetzung von Glykoproteinen auf der Zelloberfläche Signalwege aktiviert und Immunantworten reguliert werden. Um die räumliche organisation und Quervernetzung von hGal-1 auf den Oberflächen von Neuroblastomzellen nachzuweisen, eignet sich das hochauflösende Mikroskopieverfahren dSTORM sehr gut. Durch Verwendung des photoschaltbaren Fluorophors Alexa647 als spezifischem Marker für hGal-1, einem Standard-Weitfeld-Aufbau und verschiedenen Analyseverfahren, kann eine Clusterformation von hGal-1 auf der Zelloberfläche bestätigt werden. hGal-1 bildet Cluster mit einem mittleren Durchmesser von 81±7 nm aus. Der Durchmesser ist unabhängig von der Konzentration, während die Anzahl der Cluster davon abhängt. Für die Clusterausbildung ist ein Startpunkt, also eine minimale Dichte der Galektin-Moleküle, notwendig. Durch Blockierung der CRDs mit Laktose wird die Clusterbildung unterdrückt und die Spezifität der CRDs gegenüber β-Galaktosen erneut herausgestellt. Anders als dimeres hGal-1 binden Monomere deutlich schlechter an die Membranrezeptoren. Es werden keine Cluster ausgebildet, eine Quervernetzung von Membranrezeptoren ist nicht möglich. Außerdem kann es durch die Monomere zu einer vollständigen Markierung und damit Abkugellung der Zellen kommen. Möglicherweise wird der Zelltod induziert. Hochauflösende Mikroskopieverfahren sind durch den Markierungsprozess limitiert. Die bioorthogonale Click-Chemie eröffnet jedoch neue Möglichkeiten zur Markierung und Visualisierung von Biomolekülen, ohne die Notwenigkeit genetischer Manipulationen. Es werden modifizierte Zuckermoleküle in die Zellmembranen eingebaut, über eine 1,3-polare Cycloaddition mit einem Alkin markiert und ihre Verteilung mit Hilfe von dSTORM untersucht. Es wird nachgewiesen, dass die Zuckermoleküle in Clustern auftreten und Click-Chemie trotz dem Katalysator Kupfer an lebenden Zellen durchführbar ist. Die Bewegung der Gesamtcluster wird mittels Mean Square Displacement aufgeschlüsselt und eine Diffusionskonstante für Cluster im Bereich von 40 - 250 nm bestimmt. Zusammenfassend stellt die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken ein gutes Werkzeug zur Untersuchung von Karbohydrat-bindendenden Proteinen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung dar und ermöglicht einen neuen Einblick in die Biologie der Galektine. N2 - The human genome encodes 30,000 to 40,000 proteins of which the majority have covalently linked carbohydrates at the amino acids asparagine, serine, hreonine and hydroxylysine. These so called glycoproteins are embedded in the extracellular matrix and presented on cell surfaces. Glycoproteins are important membrane proteins, which are involved in cell-cell or cell-matrix interactions, protein folding or missfolding and the regulation of immune responses. The glycan chains harbour ideal properties for high-density storage of biological information; they are the basis of the sugar code. To translate its structural information into physiological effects the interplay with endogenous lectins is important. Lectins, among them the family of galectins, translate the sugarbased information into biosignaling. Galectins are carbohydrate-binding proteins that bind β-galactosides. They share a core sequence consisting of 130 amino acids, and a β-sandwich fold with two antiparallel β-sheets. Structurally, they are divided into three groups: proto-types exist as non-covalent dimers of two carbohydrate-recognition domains (CRD). The chimera-types have a lectin and a non-lectin domain and tandem-repeat-types contain of two different CRDs covalently linked by a short peptide. They are differentially expressed by various normal and pathological tissues. Due to the documented relation between lectins and different diseases (tumour growth, immune responses) it is important to study structural properties and their cross-linking ability in solution, especially in view of their intrafamily diversification. Therefore different spectroscopic techniques are used. Intrinsic and extrinsic fluorophores allow fluorescent measurements with high spatial and temporal resolution. Combining FCS and anisotropy measurements structural information about lectins, glycoproteins and their relations are monitored. For prototype galectins the hydrodynamic radius decrease upon ligand binding. Tandemrepeat- and chimera-types do not change their dimensions whereas their diffusion constants, measured with FCS, scale anomalous with the molar mass. Anisotropy measurements are carried out in parallel. Since an intrinsic fluorophore of the protein (tryptophan) is exploited, no labelling is necessary. With the help of this technique I am able to show that different binding constants and kinetics of the binding process within the galectin-family are caused by various conformational dynamics. Comparing hGal1 and cG-1B, the oxidation processes reveal differences despite of structural and binding similarities. These two techniques are very sensitive and applicable to study structural characteristics of galectins. Cross-linking between galetins and glycoproteins on the cell surface have been proposed to function as an „on-off“-switch that regulates cell proliferation, differentiation and immune responsiveness. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) provide an opportunity to study the spatial organization and cross-linking ability of hGal-1 interacting with β-galactose specific receptors on the cell surface of neuroblastoma cells. Alexa647, which can be switched reliable between an on- and a very stable off-state, is used as specific galectin marker. Measurements are done on a standard widefield setup and a spot analysis of single molecules in order to resolve clustering and cross-linking of galectins with a spatial resolution of better than 50 nm. The mean cluster size of hGal-1 molecules on the cell surface of neuroblastoma cells is 81±7 nm. The cluster diameter is independent of the protein concentration, a starting point or minimal galectin density for cluster formation is needed and the specificity of the CRDs for galactosides is underlined. Monomeric hGal-1 molecules show a different binding behaviour. On the one hand there are less localizations detectable and on the other hand I find very densly labelled, spherically shaped cells. This can maybe interpreted as hGal1-induced apoptosis. Existing labeling strategies limitate the value of super-resolution microscopy. The bioorthogonal click-chemistry creates a new field for labeling and visualizing biomolecules in vivo without the requirement of genetic manipulation. By hijacking a cell’s biosynthetic machinery, a metabolic precursor functionalized with a bioorthogonal chemical tag is incorporated into target biomolecules, including glycans, lipids, proteins and nucleic acids. Because of this I combine click-chemistry and the super-resolution technique dSTORM for specific labelling of metabolized sugar molecules. The cluster formation of sugar molecules on living and fixed cells in the presence of copper is being studied. Copper has no negative influence on the living cells. The mean square displacement decode cluster movement and determine cluster diameters in the range of 40 - 250 nm. In summary, we show that a combination of various temporal and spatial highresolution fluorescence techniques can be used advantageously to obatin new insights into the biology of galectins. KW - Fluoreszenz KW - Glykoproteine KW - Fluoreszenzspektroskopie KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - Anisotropie KW - dSTORM-Mikroskopie KW - Galektine KW - Fluorescence KW - Microscopy KW - anisotropy KW - glycoproteins KW - galectins KW - fluorescence correlation spectroscopy KW - dSTORM Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76665 ER - TY - THES A1 - Glaser, Stefanie T1 - Untersuchung des RNA-Kernexportes im Modellsystem Xenopus laevis T1 - Analysis of the RNA nuclear export in the model system Xenopus laevis N2 - Der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (eIF5A) ist evolutionär hoch konserviert und besitzt als einzig bislang bekanntes Protein die Aminosäuremodifikation Hypusin. Obwohl eIF5A ubiquitär exprimiert wird, sind die zellulären Funktionen von eIF5A noch weitgehend unklar. Hypusininhibitoren konnten die Oberflächenexpression von CD83 die CD83 mRNA im Zellkern dendritischer Zellen anreichern und folglich die Oberflächenexpression von CD83 verhindern konnten, wurde eine Beteiligung von eIF5A beim nukleozytoplasmatischen Export der CD83 mRNA vermutet. Weiterhin ist bekannt, dass HuR, ein Protein der ELAV-Familie, an ein cis-aktives RNA-Element mit einer ausgeprägten Sekundärstruktur innerhalb der kodierenden Sequenz der CD83 mRNA bindet. Während die Bindung von HuR an AU-reiche Elemente in der 3UTR bestimmter Transkripte zu deren Stabilisierung führt, wird die Stabilität von CD83-Transkripten durch die Interaktion mit HuR jedoch nicht beeinflusst. In dieser Arbeit wurden Mikroinjektionsstudien in Xenopus laevis-Oozyten zum nukleozytoplasmatischen Export von CD83 mRNA durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die charakteristische Sekundärstruktur des HuR-Response-Elements essentiell für den Kernexport von CD83-Transkripten ist. HuR wurde zudem als Bindungspartner von eIF5a identifiziert. Inhibitorische Antikörper sowohl gegen HuR als auch eIF5A waren in der Lage, den Export von CD83-Transkripten zu inhibieren. Während die meisten mRNAs durch den TAP/NXT1-vermittelten Exportweg in das Zytoplasma transportiert werden, transloziert CD83 mRNA CRM1-vermittelt, da der Export durch den CRM1-Inhibitor Leptomycin B gehemmt werden konnte. Oozytentypischer TFIIIA, ebenfalls ein Interaktionspartner von eIF5A, ist in jungen Xenopus-Oozyten sowohl bei der RNA-Polymerase III-abhängigen Transkription von 5S rRNA als auch am nukleozytoplasmatischem Export und der Lagerung von 5S rRNA im Zytoplasma beteiligt. Aufgrund der Parallele zwischen dem HIV-1-Rev vermittelten HIV-1-mRNA-Export und dem TFIIIA-vermittelten 5S rRNA-Export, wurde der Export von TFIIIA im Hinblick auf eine Beteiligung von eIF5A als Kofaktor analysiert. In Xenopus-Oozyten wurde TFIIIA an den nukleoplasmatischen Filamenten der Kernporenkomplexe detektiert. Weiterhin konnte durch den Einsatz des spezifischen CRM1-Inhibitors Leptomycin B bestätigt werden, dass TFIIIA, welches ein leucinreiches Kernexportsignal enthält, mittels CRM1 exportiert wird. Im Overlay-Blot-Assay konnte gezeigt werden, dass eIF5A mit TFIIIA interagiert. Außerdem deuten Mikroinjektionsexperimente darauf hin, dass eIF5A, wie beim HIV-1-Rev-vermittelten Export, auch beim TFIIIA-Export als essentieller Kofaktor involviert ist. Ein weiterer bekannter Bindungspartner von eIF5A ist Aktin, das im Zellkern an verschiedenen Exportprozessen sowie der RNA-Polymerase I-, II- und III-abhängigen Transkription beteiligt ist. Im Gegensatz zu Aktin wurde die Existenz des Aktinpartners Myosin im Zellkern erst vor kurzem realisiert. In dieser Arbeit konnten durch bioinformatische Analysen gezeigt werden, dass Kernmyosin IC bei Vertebraten weit verbreitet ist. Es wurde auch bei Xenopus laevis identifiziert. Im Vergleich zu Myosin IC fand sich ein zusätzlicher Aminoterminus aus 16 Aminosäuren, welcher als Kernlokalisationssignal fungiert. In Oozyten von Xenopus laevis konnte Kernmyosin IC, ähnlich wie RNA-Polymerase II, an den lateralen Schleifen der Lampenbürstenchromosomen dargestellt werden. Inhibierende Kernmyosinantikörper führten nach Mikroinjektion in den Zellkern von Xenopus-Oozyten zu einer kompletten Retraktion der meisten lateralen transkriptionsaktiven Schleifen sowie zu einer Verkürzung der Chromosomenachsen. konnte Kernmyosin IC vor allem im Nukleoluskern detektiert werden, wo es partiell mit RNA-Polymerase I und Fibrillarin kolokalisierte. In amplifizierten Nukleolen führte eine Transkriptionsinhibition mit Aktinomycin D zu einer Umverteilung des Kernmyosin IC zusammen mit der RNA-Polymerase I und der rDNA. Nach Injektion inhibierender Kernmyosinantikörper kam es zu einem massiven architektonischen Umbau der Nukleolen. Im Gegensatz zu den Nukleolen von somatischen Xenopus-Zellen war ein BrUTP-Einbau in amplifizierte Nukleolen jedoch noch möglich. Wie für Kernaktin bereits beschrieben, konnte auch Kernmyosin IC an den nukleoplasmatischen Filamenten der Kernporenkomplexe von Xenopus laevis-Ooyzten dargestellt werden. Da Aktin als essentieller Kofaktor an Exportprozessen beteiligt ist, sollte in Mikroinjektionsexperimenten auch eine Beteiligung von Kernmyosin IC beim Kernexport überprüft werden. Antikörper gegen ein Epitop in der Myosinkopfdomäne des Kernmyosin IC (XNMIC #42) waren im Gegensatz zu Antikörpern, die den charakteristischen Aminoterminus aus 16 Aminosäuren erkennen (XNMIC #54), in der Lage, einen CRM1-vermittelten Proteinexport zu inhibieren. N2 - Eucaryotic initiation factor 5A (eIF5A), an evolutionary highly conserved protein, is the only protein known to contain the unique amino acid modification hypusine. Even if eIF5A is ubiquitous expressed, cellular functions of eIF5A remain widely obscure. Hypusine inhibitors are able to enrich CD83 transcripts in the cell nucleus of dendritic cells and subsequently prevent surface expression of CD83. Therefore, a role of eIF5A in nucleocytoplasmic export of CD83 mRNA was supposed. Furthermore, HuR, a member of the ELAV family, binds CD83 transcripts on a specific cis-active RNA element, which forms a characteristic secondary structure. Whereas binding of HuR on AU-rich elements in the 3-UTR of certain transcripts leads to their stability, binding of HuR on CD83 transcripts in the coding region does not. In this thesis, microinjection experiments were performed in Xenopus laevis oocytes to elucidate the nucleocytoplasmic export of CD83 mRNA. The characteristic secondary structure of the HuR response element could be demonstrated as crucial for the nucleocytoplasmic export of CD83 transcripts. Furthermore, HuR could be identified as a binding partner of eIF5A. Inhibitory antibodies against both HuR and eIF5A were able to inhibit nuclear export of CD83 mRNA. While the bulk of cellular mRNAs leaves the nucleus with the aid of TAP/NXT1, CD83 mRNA is exported via the CRM1-mediated pathway, as could be demonstrated by export inhibition using specific CRM1 inhibitor leptomycin B. Oocyte type TFIIIA, another interaction partner of eIF5A, promotes RNA-Polymerase III-dependent transcription, nucleocytoplasmic translocation as well as storage of 5S rRNA in immature Xenopus oocytes. Due to a parallel of HIV-1 Rev mediated HIV-1 mRNA export and TFIIIA mediated 5S rRNA export, nuclear export of TFIIIA was examined with respect to a possible role of eIF5A as a cofactor. In Xenopus oocytes, TFIIIA could be detected on nucleoplasmic filaments of the nuclear pore complexes. Moreover, treatment with specific CRM1 inhibitor Leptomycin B comfirmed nucleocytoplasmic export of leucin-rich nuclear export signal containing TFIIIA via CRM1. Interaction of eIF5A with TFIIIA could be demonstrated using overlay blot assay. In microinjection experiments, eIF5A also seems to be an essential cofactor in TFIIIA export, parallel to HIV-1-Rev mediated export. Actin, a further known binding partner of eIF5A, is involved in diverse nuclear export pathways and RNA-Polymerase I, II and III dependent transcription. In contrast to actin, its partner myosin was only recently discovered undeniable in the cell nucleus. Nuclear myosin IC is a member of the Myosin I family of non filamentous, unconventional myosins. In this thesis, bioinformatical analysis displayed a wide distribution in vertebrates. Nuclear myosin IC is also present in Xenopus laevis. Compared to myosin IC, it contains a specific 16 amino acid aminoterminus, which acts as a nuclear localization signal. In Xenopus laevis oocytes, nuclear myosin IC, as well as RNA-polymerase II, localized on the lateral transcriptional active loops of lampbrush chromosomes. Inhibitory antibodies against nuclear myosin lead to complete retraction of most of the lateral transcriptional active loops and to a shortening of the chromosome axes. After inhibition of transcription in amplified nucleoli, using actinomycin D, nuclear myosin IC was relocated together with RNA-polymerase I and rDNA. Injection of inhibitory antibodies against nuclear myosin resulted in a massive architectural alteration of the amplified nucleoli. In contrast to nucleoli of somatic Xenopus cells, BrUTP-incorporation in amplified nucleoli was still possible. As already published for nuclear actin, nuclear myosin IC could also be detected on nucleoplasmic filaments of nuclear pore complexes in Xenopus laevis oocytes. As actin is an essential cofactor in export pathways, a possible role for nuclear myosin IC in nuclear export was examined by microinjection experiments. Antibodies against an epitop in the nuclear myosin head domain (XNMIC #42) were able to inhibit a CRM1 mediated protein export, whereas antibodies against the specific 16 amino acid terminus (XNMIC #54) failed. KW - RNS KW - Kernhülle KW - Stofftransport KW - Glatter Krallenfrosch KW - eIF5A KW - TFIIIA KW - CD83mRNS KW - Kernmyosin KW - eIF5A KW - TFIIIA KW - CD83mRNA KW - nuclear myosin Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37474 ER - TY - THES A1 - Oberländer, Uwe T1 - Untersuchung der immunstimulatorischen Effekte von Neuromelanin (NM) auf dendritische Zellen und deren Bedeutung in der Pathogenese von Morbus Parkinson T1 - Investigation of immunostimulatory effects of Neuromelanin on dendritic cells and relevance for Parkinsons disease N2 - Hintergrund: Das Absterben Neuromelanin (NM)-haltiger Zellen in der substantia nigra (SN), und die daraus resultierende Erniedrigung des Dopaminspiegels im striatum, ist ein pathologisches Hauptmerkmal der Parkinsonschen Krankheit. Ein neuerlicher Nachweis von Anti-Melanin-Antikörpern gibt Anlass zur Vermutung, dass NM ein Autoantigen sein könnte. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass NM tatsächlich von dendritischen Zellen (DZ), die in vivo hauptverantwortlich für die Auslösung von T- und B-Zellantworten sind, erkannt wird. Die Erkennung von NM durch DZ ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Einleitung einer adaptiven Immunantwort. Methoden: Murine dendritische Zellen (mDZ) wurden aus Knochenmarkszellen generiert und mit NM aus humaner SN oder synthetischem Dopaminmelanin (DAM) behandelt, nachdem beide Melanine endotoxinfrei getestet wurden. Die Phagozytose von NM wurde mittels konfokaler Mikroskopie dokumentiert. Die Expression von MHC II und CD86 wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS) analysiert. Zytokinkonzentrationen von TNF- und dem Interleukin IL-6 wurden mit ELISA-Assays bestimmt. Abschließend wurde die Funktion der durch NM aktivierten DZ mit einer allogenen mixed lymphocyte reaction (MLR) überprüft. Ergebnisse: NM wurde von den mDZ effektiv phagozytiert, woraufhin die mDZ einen reifen Phenotyp (CD86high/MHC IIhigh) zeigten. Zusätzlich sekretierten durch NM aktivierte mDZ die Zytokine IL-6 and TNF-. Schließlich ließen die mDZ T-Zellen in einer MLR proliferieren, und beweisen so ihre Funktionalität und die Fähigkeit eine primäre T-Zellantwort auszulösen. Im Gegenteil dazu konnte DAM, dem die Protein- und Lipidkomponenten von NM fehlen und nur das Melaninrückrat mit NM gemeinsam hat, nur einen kleinen Effekt bei den mDZ hervorrufen. Diskussion: NM wird von DZ in vitro erkannt und bewirkt deren Reifung. Sollte der Vorgang auch in vivo stattfinden, besteht die Möglichkeit, dass SN-Antigene dem adaptiven Immunsystem präsentiert werden, was in einzelnen Fällen zur Einleitung einer adaptiven Immunantwort führen könnte. NM könnte also der Auslöser für einen autoimmunen Pathomechanismus in der parkinsonschen Krankheit sein. N2 - Background: The degeneration of neuromelanin (NM)-containing dopaminergic cells in the substantia nigra (SN) and a resulting reduction in striatal dopamine is a key feature in Parkinsons´s Disease (PD). Increased anti-melanin antibodies in sera of Parkinson patients had been shown recently, suggesting that NM may act as an autoantigen in PD. In this work it was asserted that NM is being recognized by dendritic cells (DCs), the major cell type for inducing T- and B-cell responses in vivo. This recognition of NM by DCs is a prerequisite to trigger an autoimmune response directed against NM-associated structures. Methods: Murine dendritic cells (mDC), generated from bone marrow, were treated with NM of SN from human subjects or with synthetic dopamine melanin (DAM) after both melanins were tested free of endotoxin contamination. Phagocytosis was documented with confocal microscopy. The expression of MHC II and CD86 was analyzed by flow cytometry. Concentrations of inflammatory cytokines TNF- and interleukin IL-6 were determined by ELISA. Finally the function of activated mDCs was tested by allogeneic mixed lymphocyte reaction (MLR). Results: NM was phagocytized effectively by mDCs, which subsequently developed a mature phenotype (CD86high/MHC IIhigh). In addition, NM-activated mDCs secreted the proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-. Finally, they potently triggered T cell proliferation in a mixed lymphocyte reaction, showing that mDC activation was functional to induce a primary T cell response. On the contrary, DAM, which lacks the protein and lipid components of NM but mimics the dopamine-melanin backbone of NM, had only very little effect on mDC phenotype and function. Discussion: NM is recognized by DCs in vitro and triggers their maturation. If this process occurs in vivo, it would allow DCs to transport and present SN antigens to the adaptive immune system, thus leading to autoimmmunity in susceptible individuals. This finding offers a rationale for an autoimmune-based pathomechanism of PD with NM as the initial trigger. KW - Parkinson-Krankheit KW - Melanin KW - dendritische Zellen KW - Autoimmunität KW - Parkinson KW - Neuromelanin KW - dendritische Zellen KW - Autoimmunität KW - Parkinsons Disease KW - Neuromelanin KW - dendritic cells KW - Autoimmunity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73684 ER - TY - THES A1 - Schneider, Hannah T1 - Untersuchung der drei Isoformen des Elongationsfaktors 1A von Xenopus laevis: 42Sp50 versus EF1A-1/EF1A-2 T1 - Analysis of the three isoforms of elongation factor 1A of Xenopus laevis: 42Sp50 versus EF1A-1/EF1A-2 N2 - Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der monoklonale Antikörper IV´D4 biochemisch charakterisiert und die zelluläre Verteilung des Antigens mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Durch elektronenmikroskopische Lokalisierungsexperimente wurde gezeigt, dass es sich dabei um Nuage handelt. Obwohl der Antikörper eine oozytenspezifische Struktur markierte, färbte er in der Immunfluoreszenz überraschenderweise auch somatische Xenopus Kulturzellen (A6 und XTC) an. Als nächstes wurde das Antigen von IV´D4 und damit eine neue Proteinkomponente der Nuage identifiziert. Durch Immunblots von prävitellogenen Oozyten und Expression rekombinanter Proteine wurde festgestellt, dass der Antikörper das Protein 42Sp50 erkennt. Es war nicht auszuschließen, dass die Nuage lediglich die somatischen EF1A-Isoformen akkumulieren. Tatsächlich werden alle drei EF1A-Isoformen in Oozyten exprimiert, wie RT-PCR-Experimente belegten. Die ubiquitäre Expression und hohe Sequenzverwandtschaft der beiden traditionellen Xenopus EF1A-Isoformen mit denen der Säuger veranlassten uns, die Nomenklatur anzugleichen (Xenopus EF1A-1 für EF1A-S und EF1A-2 für EF1A-O). Durch Mikroinjektion entsprechender mRNAs wurden Fluoreszenz-EF1A Fusionsproteine (gekoppelt an EGFP, monomeres DsRed oder monomeres RFP) in lebenden Oozyten exprimiert und lokalisiert. Neben 42Sp50 wurde auch die zweite Proteinkomponente der 42S Partikel, 42Sp43, in Form von fluoreszierenden Fusionsproteinen in Oozyten exprimiert und lokalisiert. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Dynamik der Nuage untersucht. Dazu wurden Versuche mit verschiedenen Inhibitoren durchgeführt. Es sollte überprüft werden, ob die Hemmung unterschiedlicher zellulärer Prozesse Einfluss auf die strukturelle Organisation der Nuage hat. Zu Beginn der Arbeit lagen keine Kenntnisse darüber vor, in welchem Zellkompartiment das Assembly der 42S RNPs stattfindet. Zunächst wurden deshalb die beiden Proteine 42Sp50 und 42Sp43 als fluoreszierende Fusionsproteine in prävitellogenen Ooyzten koexprimiert. Ein eindeutiger Nachweis der spezifischen Interaktion zwischen 42Sp43 und 42Sp50 gelang insbesondere durch die transiente Expression der entsprechenden fluoreszenzmarkierten Proteinpaare in somatischen Kulturzellen (Xenopus A6 und Säuger COS-7 Zellen). Die hier beschriebene Koexpression von Proteinpaaren mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen in Säugerzellen stellt eine einfache Methode dar, um in vivo Interaktionen mikroskopisch sichtbar zu machen. Damit sollte es möglich sein, durch gezielte Mutationen und Deletionen von 42Sp50 und 42Sp43 diejenigen Aminosäuren und strukturellen Determinanten zu identifzieren, die bei der spezifischen Interaktion und damit beim Assembly der 42S Partikel eine Rolle spielen. N2 - In the first part of the present work the monoclonal antibody IV´D4 was characterized biochemically and the cellular distribution of the antigen was analyzed using immunofluorescence microscopy. Electron microscopic localization experiments identified them as nuage. Although the antibody marked an oocyte specific structure, immunofluorescence surprisingly showed that it also stained somatic Xenopus culture cells (A6 and XTC). Next, the antigen recognized by IV´D4 was identified as a new protein component of nuage. By immunoblotting of previtellogenic oocytes and by expression of recombinant proteins it was observed that the antibody recognizes the protein 42Sp50. Hence, it was impossible to obtain evidence that nuage really contain 42Sp50 and therefore are sites of 42S RNP formation. It could not be excluded that nuage accumulate only somatic EF1A-isoforms. RT-PCR experiments demonstrated that in fact, all three isoforms are expressed in oocytes. The ubiquitous expression and the high sequence similarity of traditional Xenopus EF1A-isoforms prompted us to adopt the nomenclature (Xenopus EF1A-1 for EF1A-S and EF1A-2 for EF1A-2). Fluorescent EF1A fusion proteins (linked to EGFP, monomeric DsRed and monomeric RFP) were expressed and localized in living oocytes by microinjection of accordant mRNAs. Beside 42Sp50, the second protein component of the 42S particle, 42Sp43, was expressed and localized as fluorescent fusion protein in oocytes. The dynamics of nuage were analyzed in another part of the present work. For that purpose, experiments were carried out with different inhibitors. It was analyzed if the structural organization of nuage was influenced by the inhibition of different cellular processes. At the beginning of the present work it was unknown in which compartment of the cell the assembly of 42S RNPs takes place. Therefore, both proteins of the 42S particle were coexpressed in previtellogenic Xenopus oocytes as fluorescent fusion proteins. Distinct evidence for a specific interaction between 42Sp43 and 42Sp50 was obtained by transient expression of the fluorescence labeled protein pairs in somatic cuture cells (Xenopus A6 and mammalian COS7 cells). The described coexpression of protein pairs with different fluorescent dyes in mammalian cells describes a simple method to visualize in vivo interactions microscopically. By analyzing specific mutations and deletions of 42Sp50 and 42Sp43 it should be possible to identify those amino acids and structural determinants which are responsible for specific interactions important for the assembly of 42S particles. KW - Glatter Krallenfrosch KW - Elongationsfaktor 1A KW - Isoformen KW - Nuage KW - Elongation factor 1A KW - Nuage Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36124 ER - TY - THES A1 - Brändlein, Stephanie T1 - Tumorimmunität: Spezifität, Genetik und Funktion natürlicher IgM-Antikörper T1 - Tumorimmunity: Specificity, Genetics and Function of natural IgM antibodies N2 - Die Entstehung maligner Zellen durch irreversible genetische Veränderungen ist ein allgegenwärtiger Prozess im menschlichen Organismus. Allein die spontane Mutationsrate genügt um in einem Organismus permanent transformierte Zellen entstehen zu lassen, welche den Körper in kürzester Zeit überschwemmen würden. Auch wenn bestimmte genetische Schäden frühzeitig durch Reparaturmechanismen beseitigt werden und sich nicht jede transformierte Zelle in einem Tumor manifestiert, so ist die eigentliche Frage nicht, warum Krebs entsteht, sondern warum er bei der hohen Mutationsrate so selten auftritt. Verantwortlich für die frühe Erkennung und Beseitigung transformierter Zellen ist das körpereigene Immunsystem, das in der Lage ist die meisten aberranten Zellen zu entfernen, sodass der manifeste Tumor die Ausnahme und nicht die Regel ist. Der menschliche Organismus verfügt über ein angeborenes und ein erworbenes Immunsystem. Bis heute ist nicht eindeutig geklärt, ob maligne Zellen mit ihren veränderten Oberflächenstrukturen erst eine Immunantwort induzieren müssen oder ob, wie bei der Abwehr infektiöser Partikel, die angeborene Immunität für die Beseitigung von Tumorzellen verantwortlich ist. Die in dieser Arbeit verwendete humane Hybridoma Technologie (Immortalisierung menschlicher Lymphozyten und Isolierung monoklonaler Antikörper) bietet die einzigartige Möglichkeit, sowohl aus an Krebs erkrankten Patienten als auch aus gesunden Probanden tumorspezifische Antikörper zu isolieren und durch deren genauere Charakterisierung Einblicke in die humorale Immunität gegen maligne Zellen zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit werden fünf humane monoklonale Antikörper beschrieben, die aus verschiedenen Tumorpatienten gewonnen wurden, sowie zwei Antikörper, die aus gesunden Probanden isoliert werden konnten. In allen Fällen erwiesen sich die Antikörper als tumorspezifisch, d.h. sie reagieren nicht mit gesundem Gewebe und sind demnach keine Autoantikörper. Es handelt sich weiterhin in allen Fällen um Antikörper des IgM-Isotyps; es konnten keinen Antikörper anderer Ig-Klassen isoliert werden. Genetische Analysen ergaben, dass alle isolierten Antikörper gering oder gar nicht mutiert waren, was bedeutet, dass sie nicht durch Stimulation affinitätsgereift sind. Zudem konnte demonstriert werden, dass alle Antikörper Apoptose von Tumorzellen induzieren und dass sie an eine Zuckerkette ihrer Antigene binden oder solche Carbohydrate zumindest entscheidend in die Bindung involviert sind. Die Eigenschaften der in dieser Arbeit beschriebenen Antikörper wurden mit anderen bereits etablierten IgM-Antikörpern verglichen. Hierbei stellte sich heraus, dass alle Antikörper, welche sich als tumorspezifisch erwiesen, ähnliche Eigenschaften zeigen. Interessant ist zudem die Beobachtung, dass die Keuzreaktion der Antikörper, also ihre Reaktion mit anderen Tumorgeweben, reziprok mit dem Mutations-grad korreliert ist. Je mehr Mutationen ein Antikörper aufweist, desto eingeschränkter und spezifischer sind demnach seine Reaktionen mit anderen Tumoren. Dies deutet darauf hin, dass auch innerhalb der Keimbahn-kodierten Antikörper durch vereinzelte Mutationen eine höhere Variabilität erzeugt werden kann. Ähnlich wie bei der Affinitätsreifung der erworbenen Immunität scheint sich auch hier die Spezifität mit der Anzahl der Mutationen zu erhöhen. Zusammenfassend weisen die erhaltenen Ergebnisse darauf hin, dass zumindest die humorale Immunität gegen maligne Zellen das Resultat der angeborenen Immunität ist und nicht von Tumorzellen induziert wird. Dies bedeutet zudem, dass Moleküle wie natürliche Antikörper in der Immunität eine viel größere Rolle spielen als bisher angenommen. Ähnliche Ergebnisse wurden bereits bei der Untersuchung der Immunität gegen bakterielle Antigene erzielt, sodass hier vermutet werden kann, dass die gleichen Mechanismen zugrunde liegen wie bei der Abwehr transformierter Zellen. Darüber hinaus wird die Frage beantwortet, warum ein manifester Tumor eine Ausnahme bleibt. Die angeborene, primäre Immunität verfügt über ein existierendes Repertoire an Rezeptoren, welche eine ausreichende Variabilität aufweisen, und muss daher nicht erst über ein komplexes System von Erkennung und Stimulation, wie die adaptierte Immunität, induziert werden. Dieser logistische Vorsprung der natürlichen Immunität garantiert eine permanente Überwachung und eine schnelle Reaktion gegenüber veränderten Zellen und fremden Partikeln. N2 - The formation of malignant cells through irreversible genetic alterations is a chronic process in a human organism. The spontaneous mutation rate is high enough to let transformed cells arise permanently in an organism and to flood the body with these cells in a short period of time. Although specific genetic damages were eliminated very early by repair mechanisms and not every transformed cell became a manifest tumour, the major question to be answered is not why cancer arises but why it occurs so infrequently despite of the high mutation rate. The immune system is responsible for the early detection and elimination of transformed cells. It is able to remove most of the transformed cells so that tumour formation is the exception but not the rule. The immune system of the human organism consists of an innate and an acquired system. Until the present time it is not explained definitely, whether malignant cells with their altered surface structure have to induce an immune answer or if the innate immunity is responsible for the elimination of tumour cells like for infectious particles. In this dissertation the human hybridoma technology (immortalisation of human lymphocytes and isolation of human monoclonal antibodies) was used to investigate this question. This technique offers the unique possibility to isolate tumour-specific antibodies from cancer patients as well as from healthy persons and to attain additionally insights into the humoral immunity against malignant cells. Five human monoclonal antibodies were described which were isolated from different cancer patients and in addition two antibodies obtained from healthy donors. In all of the cases the antibodies prove to be tumour-specific which means they do not react with healthy tissues and are according to this no auto-antibodies. All of them are IgM antibodies, no tumour-specific IgA or IgG antibody was detectable. Genetic analysis show that all isolated antibodies were only slightly mutated or not mutated at all, which means that they were not affinity-maturated due to antigen stimulation. Furthermore it was possible to demonstrate that all isolated tumour-specific IgM antibodies induce apoptosis in tumour cells. Another result indicates that carbohydrates are involved in the binding of the antibodies to their corresponding antigen. The characteristics of the antibodies were compared with other IgM antibodies which were already established in our lab. Here all antibodies which prove to be tumour-specific show similar characteristics. Interestingly the amount of cross reactivity with other tumour tissues correlates reciprocally with the degree of mutations. The more mutations an antibody displays the more reduced are the reactions with other tumour tissues. This indicates that, similar to the affinity-maturation of adapted immunity, an increase of specificity and most likely also variability of germ-line coded antibodies can be generated by few mutations. Our observations indicate that the humoral immunity against malignant cells is the result of the innate immunity. This means moreover that molecules like natural antibodies play a much more important role in immunity than assumed so far. Similar results were obtained already with analysis of immunity against bacterial antigens. This leads to the assumption that here the same mechanisms are involved like in the defence against transformed cells. Moreover the question could be answered why a manifest tumour remains an exception. The innate, primary immunity has an existing repertoire of receptors which are variable enough so that a complex system of recognition and stimulation like in the acquired immunity does not have to be induced. This logistic advantage of the natural immunity guarantees a permanent control and a fast reaction towards altered cells and foreign particles. KW - Tumorimmunologie KW - Immunglobulin M KW - Tumorimmunität KW - natürliche IgM-Antikörper KW - Tumorimmunity KW - natural IgM antibodies Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6661 ER - TY - THES A1 - Engelhardt, Stefan T1 - Transgene Mausmodelle zur Charakterisierung der Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren T1 - Characterization of cardiac beta-adrenergic receptors through the use of transgenic mouse models N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren mit Hilfe einer Kombination aus transgenen Mausmodellen und physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Durch gezielte Überexpression des humanen beta1-adrenergen Rezeptors im Herzen transgener Mäuse konnte gezeigt werden, daß die chronische Aktivierung dieses Rezeptors eine trophische Wirkung auf die Herzmuskelzellen hat. Über einen Zeitraum von mehreren Monaten führte dies zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. In der menschlichen Herzinsuffizienz kommt es zu einem ähnlichen Phänomen: Durch deutlich erhöhte Freisetzung von endogenen Katecholaminen kommt es zu einer chronischen Dauerstimulation kardialer beta1-adrenerger Rezeptoren. Daß diese schädlich ist belegen das hier beschriebene Mausmodell und zudem einige neuere klinische Studien, die zeigen daß eine pharmakologische Blockade beta-adrenerger Rezeptoren zu einer Verminderung der Herzinsuffizienzmortalität führt. Dieses Mausmodell erlaubte es erstmals den beta1-adrenergen Rezeptor hinsichtlich seiner spontanen Rezeptoraktivität in einem physiologischen Modell zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß der humane beta1-adrenerge Rezeptor spontane Aktivität aufweist, jedoch in einem deutlich geringeren Ausmaß als der beta2-adrenerge Rezeptor. Dies könnte klinisch relevant sein, da klinisch verwendete beta-Rezeptor-Antagonisten die spontane Aktivität des beta1-adrenergen Rezeptors in unserem Modell unterschiedlich stark unterdrückten. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem untersucht, ob sich die beiden kardial exprimierten Beta-Rezeptor-Subtypen Beta1 und Beta2 hinsichtlich ihrer Signaltransduktion unterscheiden. Ausgehend von dem Befund, daß die chronische Aktivierung der beiden Subtypen in transgenen Mausmodellen zu deutlich unterschiedlichen Phänotypen führt, wurden verschiedene intrazelluläre Signalwege auf ihre Aktivierung hin überprüft. Abweichend von publizierten, in vitro nach kurzzeitiger Rezeptorstimulation erhobenen Daten zeigte sich, daß die chronische Aktivierung der Rezeptorsubtypen zu einer unterschiedlichen Aktivierung der kardialen MAP-kinasen (ERK) führt. Die beta1-spezifische Aktivierung dieser Kinasen könnte die beobachtete unterschiedliche Hypertrophieentwicklung in diesen beiden Mausmodellen erklären. Einen weiteren Schwerpunkt bei der Aufklärung des Mechanismus beta-adrenerg induzierter Hypertrophie bildete die Untersuchung der zellulären Calcium-homöostase. Als früheste funktionelle Veränderung in der Entwicklung einer beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie und -insuffizienz trat dabei eine Störung des intrazellulären Calciumtransienten auf. Als möglicher Mechanismus für die Störung des Calciumhaushalts konnte eine zeitgleich auftretende veränderte Expression des Calcium-regulierenden Proteins Junctin beschrieben werden. Einen neuen therapeutischen Ansatz für die Therapie der Herzinsuffizienz könnten schließlich vielleicht die Untersuchungen zum kardialen Na/H-austauscher ergeben: Es konnte erstmals gezeigt werden, daß der kardiale Na/H-Austauscher maßgeblich an der beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie- und Fibrose-entstehung beteiligt ist und daß die pharmakologische Inhibition dieses Proteins sowohl Hypertrophie als auch die Fibrose wirksam unterdrücken kann. KW - Beta-Rezeptor KW - Maus KW - Transgene Tiere KW - Herzinsuffizienz KW - Transgene Mäuse KW - beta-adrenerge Rezeptoren KW - Hypertrophie KW - Fibrose KW - Na/H-Austauscher KW - Herzinsuffizienz KW - transgenic mice KW - cardiac hypertrophy KW - fibrosis KW - Na/H-exchanger KW - heart failure Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181950 ER - TY - THES A1 - Regneri, Janine T1 - Transcriptional regulation of cancer genes in the Xiphophorus melanoma system T1 - Transkriptionelle Regulation von Krebsgenen im Xiphophorus-Melanommodell N2 - The Xiphophorus melanoma system is a useful animal model for the study of the genetic basis of tumor formation. The development of hereditary melanomas in interspecific hybrids of Xiphophorus is connected to pigment cell specific overexpression of the mutationally activated receptor tyrosine kinase Xmrk. In purebred fish the oncogenic function of xmrk is suppressed by the molecularly still unidentified locus R. The xmrk oncogene was generated by a gene duplication event from the Xiphophorus egfrb gene and thereby has acquired a new 5’ regulatory sequence, which has probably altered the transcriptional control of the oncogene. So far, the xmrk promoter region was still poorly characterized and the molecular mechanism by which R controls xmrk-induced melanoma formation in Xiphophorus still remained to be elucidated. To test the hypothesis that R controls melanoma development in Xiphophorus on the transcriptional level, the first aim of the thesis was to gain a deeper insight into the transcriptional regulation of the xmrk oncogene. To this end, a quantitative analysis of xmrk transcript levels in different Xiphophorus genotypes carrying either the highly tumorigenic xmrkB or the non-tumorigenic xmrkA allele was performed. I was able to demonstrate that expression of the tumorigenic xmrkB allele is strongly increased in malignant melanomas of R-free backcross hybrids compared to benign lesions, macromelanophore spots, and healthy skin. The expression level of the non-tumorigenic xmrkA allele, in contrast, is not influenced by the presence or absence of R. These findings strongly indicate that differential transcriptional regulation of the xmrk promoter triggers the tumorigenic potential of these xmrk alleles. To functionally characterize the xmrk promoter region, I established a luciferase assay using BAC clones containing the genomic regions where xmrk and egfrb are located for generation of reporter constructs. This approach showed for the first time a melanoma cell specific transcriptional activation of xmrkB by its flanking regions, thereby providing the first functional evidence that the xmrk oncogene is controlled by a pigment cell specific promoter region. Subsequent analysis of different deletion constructs of the xmrkB BAC reporter construct strongly indicated that the regulatory elements responsible for the tumor-inducing overexpression of xmrkB in melanoma cells are located within 67 kb upstream of the xmrk oncogene. Taken together, these data indicate that melanoma formation in Xiphophorus is regulated by a tight transcriptional control of the xmrk oncogene and that the R locus acts through this mechanism. As the identification of the R-encoded gene(s) is necessary to fully understand how melanoma formation in Xiphophorus is regulated, I furthermore searched for alternative R candidate genes in this study. To this end, three genes, which are located in the genomic region where R has been mapped, were evaluated for their potential to be a crucial constituent of the regulator locus R. Among these genes, I identified pdcd4a, the ortholog of the human tumor suppressor gene PDCD4, as promising new candidate, because this gene showed the expression pattern expected from the crucial tumor suppressor gene encoded at the R locus. N2 - Fische der Gattung Xiphophorus sind ein gut etabliertes Modellsystem zur Analyse der genetischen Grundlagen der Tumorentwicklung. Die Entwicklung hereditärer Melanome in bestimmten interspezifischen Xiphophorus-Hybriden wird durch die pigmentzellspezifische Überexpression des Onkogens xmrk ausgelöst. Dieses Gen codiert für eine durch Mutationen aktivierte Rezeptortyrosinkinase. In den reinerbigen Elterntieren wird die onkogene Funktion von xmrk durch den Regulator-Locus R unterdrückt, welcher jedoch auf molekularer Ebene noch nicht identifiziert wurde. Das Onkogen xmrk ist durch eine Genduplikation aus dem Protoonkogen egfrb entstanden und hat dabei eine neue regulatorische 5‘ Region erhalten, welche mit hoher Wahrscheinlichkeit die transkriptionelle Regulation des Onkogens verändert hat. Die Promotorregion von xmrk war allerdings bisher nur unzureichend charakterisiert und der molekulare Mechanismus, durch den der R-Locus die xmrk-induzierte Melanomentwicklung kontrolliert, war noch weitgehend unbekannt. Um zu analysieren, ob der R-Locus die Melanomentwicklung in Xiphophorus auf transkriptioneller Ebene kontrolliert, war das erste Ziel dieser Arbeit die transkriptionelle Regulation des xmrk Onkogens genauer zu untersuchen. Zu diesem Zweck habe ich eine quantitative Analyse der xmrk Expressionslevel in Geweben verschiedener Xiphophorus-Genotypen durchgeführt, welche entweder das stark tumorigene xmrkB oder das nicht tumorigene xmrkA Allel besitzen. Ich konnte zeigen, dass im Vergleich zu benignen Läsionen, Macromelanophoren und gesunder Haut, die Expression des tumorigenen xmrkB Allels in den malignen Melanomen der R-defizienten Rückkreuzungshybride stark erhöht ist. Das Expressionslevel des xmrkA Allels wird hingegen nicht durch den R-Locus beeinflusst. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass eine differenzielle transkriptionelle Regulierung des xmrk Promotors für die Unterschiede im onkogenen Potential dieser Allele verantwortlich ist. Um die xmrk Promotorregion funktional zu charakterisieren, habe ich in der hier vorliegenden Studie einen Luciferase-Assay etabliert, für den BAC-Klone, welche die xmrk- oder egfrb-Region enthalten, zur Herstellung von Reporterkonstrukten verwendet wurden. Mit Hilfe dieses Ansatzes konnte ich zum ersten Mal eine melanomzellspezifische Aktivierung des xmrkB Gens durch seine regulatorischen Regionen zeigen. Dies liefert den ersten funktionalen Beweis, dass das xmrk Onkogen tatsächlich durch einen pigmentzellspezifischen Promotor kontrolliert wird. Durch die nachfolgende Analyse einer Deletionsserie des xmrkB Reporterkonstrukts konnte gezeigt werden, dass die regulatorischen Elemente, welche die starke Überexpression von xmrk in Melanomzellen steuern, in den proximalen 67 kb der xmrk 5‘ Region lokalisiert sind. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Melanomentwicklung in Xiphophorus durch eine strikte transkriptionelle Kontrolle des xmrk Onkogens reguliert wird und dass der Regulator-Locus R seine tumorsuppressive Funktion über diesen Mechanismus ausübt. Da die Identifizierung des R-Locus-Gens entscheidend ist, um die Melanomentwicklung in Xiphophorus vollständig zu verstehen, habe ich im zweiten Teil dieser Arbeit drei Gene, welche in derselben genomischen Region liegen in der R lokalisiert wurde, genauer untersucht, um zu testen, ob es sich bei einem dieser Gene um eine entscheidende tumorsuppressive Komponente des R-Locus handelt. Von diesen Genen wurde pdcd4a, welches das Ortholog zum humanen Tumorsuppressorgen PDCD4 ist, als vielversprechendes neues Kandidatengen identifiziert, da das Expressionsmuster von pdcd4a mit dem zu erwartenden Expressionsmuster des am R-Locus codierten Tumorsuppressorgens übereinstimmt. KW - Melanom KW - Schwertkärpfling KW - Chromatophor KW - Epidermaler Wachstumsfaktor KW - Onkogen KW - Tumorsuppressorgen KW - Hybrid KW - transkriptionelle Regulation KW - melanoma KW - Xiphophorus KW - xmrk KW - transcriptional control KW - pigment cell KW - Hautkrebs KW - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-82319 ER - TY - THES A1 - Eidel, Matthias T. A. M. T1 - Training Effects of a Tactile Brain-Computer Interface System During Prolonged Use by Healthy And Motor-Impaired People T1 - Trainingseffekte eines Taktilen Brain-Computer Interface Systems bei längerer Nutzung von gesunden sowie motorisch eingeschränkten Personen N2 - Background - Brain-Computer Interfaces (BCI) enable their users to interact and communicate with the environment without requiring intact muscle control. To this end, brain activity is directly measured, digitized and interpreted by the computer. Thus, BCIs may be a valuable tool to assist severely or even completely paralysed patients. Many BCIs, however, rely on neurophysiological potentials evoked by visual stimulation, which can result in usability issues among patients with impaired vision or gaze control. Because of this, several non-visual BCI paradigms have been developed. Most notably, a recent study revealed promising results from a tactile BCI for wheelchair control. In this multi-session approach, healthy participants used the BCI to navigate a simulated wheelchair through a virtual apartment, which revealed not only that the BCI could be operated highly efficiently, but also that it could be trained over five sessions. The present thesis continues the research on this paradigm in order to - confirm its previously reported high performance levels and trainability - reveal the underlying factors responsible for observed performance increases - establish its feasibility among potential impaired end-users Methods - To approach these goals, three studies were conducted with both healthy participants and patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Brain activity during BCI operation was recorded via electroencephalography (EEG) and interpreted using a machine learning-based linear classifier. Wheelchair navigation was executed according to the classification results and visualized on a monitor. For offline statistical analysis, neurophysiological features were extracted from EEG data. Subjective data on usability were collected from all participants. Two specialized experiments were conducted to identify factors for training. Results and Discussion - Healthy participants: Results revealed positive effects of training on BCI performances and their underlying neurophysiological potentials. The paradigm was confirmed to be feasible and (for a non-visual BCI) highly efficient for most participants. However, some had to be excluded from analysis of the training effects because they could not achieve meaningful BCI control. Increased somatosensory sensitivity was identified as a possible mediator for training-related performance improvements. Participants with ALS: Out of seven patients with various stages of ALS, five could operate the BCI with accuracies significantly above chance level. Another ALS patient in a state of near-complete paralysis trained with the BCI for several months. Although no effects of training were observed, he was consistently able to operate the system above chance level. Subjective data regarding workload, satisfaction and other parameters were reported. Significance - The tactile BCI was evaluated on the example of wheelchair control. In the future, it could help impaired patients to regain some lost mobility and self-sufficiency. Further, it has the potential to be adapted to other purposes, including communication. Once visual BCIs and other assistive technologies fail for patients with (progressive) motor impairments, vision-independent paradigms such as the tactile BCI may be among the last remaining alternatives to interact with the environment. The present thesis has strongly confirmed the general feasibility of the tactile paradigm for healthy participants and provides first clues about the underlying factors of training. More importantly, the BCI was established among potential end-users with ALS, providing essential external validity. N2 - Hintergrund - Brain-Computer Interfaces (BCI) ermöglichen ihren Benutzern die Interaktion und Kommunikation mit der Außenwelt, ohne dabei die Funktionstüchtigkeit der Muskeln voraus zu setzen. Zu diesem Zweck wird die Gehirnaktivität vom Computer direkt gemessen, digitalisiert und schließlich interpretiert. BCIs könnten daher eine wertvolle Methode sein, schwer körperlich beeinträchtigten oder sogar vollständig gelähmten Patienten zu assistieren. Viele BCI Ansätze basieren allerdings auf neurophysiologischen Potentialen, welche mittels visueller Stimulation evoziert werden. Dies kann zur Folge haben, dass das BCI von Patienten mit Sehbehinderung oder fehlender Kontrolle über die eigene Blickrichtung nicht erfolgreich benutzt werden kann. Deshalb wurden bereits einige nicht-visuelle BCI Paradigmen entwickelt. Insbesondere eine aktuelle Studie über ein taktiles BCI zur Rollstuhlkontrolle lieferte vielversprechende Ergebnisse: In fünf Trainingssitzungen navigierten gesunde Studienteilnehmer per BCI einen simulierten Rollstuhl durch eine virtuelle Wohnung. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das BCI System nicht nur sehr effizient genutzt werden konnte, sondern auch, dass sich die Kontrolle durch das Training über mehrere Sitzungen verbesserte. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der weiterführenden Erforschung eben dieses Paradigmas, insbesondere mit den Zielen: . die zuvor berichtete hohe Performanz und Trainierbarkeit zu bestätigen . aufzuklären, welche Faktoren der Steigerung der BCI-Leistung zugrunde liegen . die Anwendbarkeit des Paradigmas bei beeinträchtigten Endnutzern zu etablieren Methoden - Um diese Ziele zu erreichen wurden drei Studien sowohl mit gesunden als auch mit Teilnehmern mit amyotropher Lateralsklerose (ALS) durchgeführt. Während der BCI-Nutzung wurde die Gehirnaktivität per Elektroenzephalographie (EEG) aufgezeichnet und von einem linearen Klassifikator (basierend auf Maschinenlernverfahren) interpretiert. Die Navigation des Rollstuhls wurde entsprechend der Ergebnisse des Klassifikators umgesetzt und auf einem Bildschirm visualisiert. Zur späteren statistischen Analyse wurden aus den EEG Daten neurophysiologische Merkmale extrahiert. Zudem wurden Fragebogendaten zur Nutzbarkeit des Systems von allen Teilnehmern erhoben. Zwei Experimente zur Identifizierung von Trainingsfaktoren wurden durchgeführt. Ergebnisse und Diskussion - Gesunde Teilnehmer: Die Ergebnisse zeigten positive Effekte des Trainings auf die BCI Performanz und deren zugrundeliegenden neurophysiologischen Potentiale. Es konnte bestätigt werden, dass das Paradigma anwendbar und für die meisten Teilnehmer hocheffizient nutzbar war (im Vergleich zu anderen nicht-visuellen Ansätzen). Einige Teilnehmer mussten jedoch von der Analyse der Trainingseffekte ausgeschlossen werden, da sie keine ausreichende Kontrolle über das BCI ausüben konnten. Eine Steigerung der somatosensorischen Empfindlichkeitsschwelle wurde als ein möglicher Faktor für die Trainierbarkeit und Verbesserung der Performanz identifiziert. Teilnehmer mit ALS: Fünf von sieben Teilnehmern in verschiedenen ALS-Stadien konnten das BCI signifikant überzufällig benutzen. Ein weiterer ALS Patient mit nahezu vollständiger Lähmung trainierte den Umgang mit dem BCI über mehrere Monate hinweg. Er war beständig in der Lage, das System mit Genauigkeiten über dem Zufallsniveau zu steuern, jedoch konnten keine Trainingseffekte gezeigt werden. Fragebogendaten zur subjektiven Arbeitsbelastung, Zufriedenheit und einigen weiteren Parametern wurden ausführlich berichtet. Bedeutung - Das taktile BCI wurde am Beispiel der Rollstuhlkontrolle evaluiert. In naher Zukunft könnte es beeinträchtigten Patienten helfen, ihre verlorene Mobilität und Selbstständigkeit zurück zu erlangen. Zudem kann es für viele weitere Zwecke adaptiert werden, insbesondere zur Kommunikation. Sobald visuelle BCIs oder andere technische Hilfsmittel bei Patienten mit (progressiver) motorischer Lähmung scheitern, könnten nicht-visuelle Paradigmen wie das taktile BCI zu den letzten verbleibenden Alternativen gehören, die eine Interaktion mit der Außenwelt noch erlauben. Die vorliegende Arbeit hat die grundsätzliche Anwendbarkeit des taktilen Paradigmas für gesunde Benutzer klar bestätigt. Zudem liefert sie erste Hinweise darauf, welche Faktoren den beobachteten Trainingseffekten zugrunde liegen könnten. Das BCI hat sich zudem bei potentiellen End-Nutzern mit ALS bewährt, was der externen Validität der Studienergebnisse enorm zuträgt. KW - Myatrophische Lateralsklerose KW - Gehirn-Computer-Schnittstelle KW - Elektroencephalographie KW - Rollstuhl KW - Brain-Computer Interface KW - Amyotrophic Lateral Sclerosis KW - Wheelchair Navigation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208511 ER - TY - THES A1 - Fink, Kristin T1 - Toxins in Renal Disease and Dialysis Therapy : Genotoxic Potential and Mechanisms T1 - Toxine in Nierenerkrankung und Dialyse Therapie : Genotoxisches Potential und Mechanismus N2 - In patients suffering from end-stage renal disease who are treated by hemodialysis genomic damage as well as cancer incidence is elevated. One possible cause for the increased genomic damage could be the accumulation of genotoxic substances in the blood of patients. Two possible sources for those toxins have to be considered. The first possibility is that substances from dialysers, the blood tubing system or even contaminated dialysis solutions may leach into the blood of the patients during dialysis. Secondly, the loss of renal filtration leads to an accumulation of substances which are normally excreted by the kidney. If those substances possess toxic potential, they are called uremic toxins. Several of these uremic toxins are potentially genotoxic. Within this thesis several exemplary uremic toxins have been tested for genotoxic effects (homocysteine, homocysteine-thiolactone,leptine, advanced glycated end-products). Additionally, it was analysed whether substances are leaching from dialysers or blood tubing and whether they cause effects in in vitrotoxicity testing. The focus of chemical analytisis was on bisphenol A (BPA), the main component of plastics used in dialysers and dialyser membranes. N2 - Patienten, die an terminaler Niereninsuffizienz leiden und mittels Hämodialyse behandelt werden, weisen einen erhöhten Genomschaden auf. Dieser könnte ursächlich für die erhöhte Krebsinzidenz dieser Patientengruppe sein. Eine der möglichen Ursachen für den erhöhten Genomschaden stellt die Akkumulation genotoxischer Substanzen im Blut der Patienten dar. Diese Substanzen können prinzipiell aus zwei unterschiedlichen Quellen stammen. Erstens besteht die Möglichkeit, dass während der Dialyse Substanzen aus den Dialysatoren, dem Blutschlauchsystem oder gar aus verunreinigtem Dialysat in das Blut der Patienten übertreten. Zweitens führt der Verlust der Nierenfunktion zu einer stark verminderten Exkretion harnpflichtiger Substanzen. Diese Substanzen akkumulieren im Blut und bilden, sofern sie ein toxisches Potential besitzen, die Gruppe der so genannten urämischen Toxine. Einige dieser urämischen Toxine sind potentiell auch genotoxisch. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden exemplarische Vertreter der urämischen Toxine auf ihre genotoxische Wirkung hin untersucht (Homocstein, Homocystein-Thiolacton, Leptin, Advanced Glycation End-Products). Außerdem wurde analysiert, ob Substanzen aus Dialysatormembranen oder dem Blutschlauchsystem austreten und in in vitro-Toxizitätstests Effekte zeigen. Der Fokus der Analytik lag hierbei auf dem Nachweis von Bisphenol A, dem Hauptbestandteil verschiedener Kunststoffe die für Dialysatoren und Dialysatormembranen verwendet werden. KW - Bisphenol A KW - Homocystein KW - Extrakorporale Dialyse KW - Genomschaden KW - Urämische Toxine KW - bisphenol a KW - homocysteine KW - dialysis KW - genomic damage KW - uremic toxins Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31082 ER - TY - THES A1 - Michels, Birgit T1 - Towards localizing the Synapsin-dependent olfactory memory trace in the brain of larval Drosophila T1 - Lokalisierung einer Synapsinabhängigen Duft-Gedächtnisspur im Gehirn von Drosophila Larven N2 - Animals need to adapt and modify their behaviour according to a changing environment. In particular, the ability to learn about rewarding or punishing events is crucial for survival. One key process that underlies such learning are modifications of the synaptic connection between nerve cells. This Thesis is concerned with the genetic determinants of such plasticity, and with the site of these modifications along the sensory-to-motor loops in Drosophila olfactory learning. I contributed to the development and detailed parametric description of an olfactory associative learning paradigm in larval fruit flies (Chapter I.1.). The robustness of this learning assay, together with a set of transgenic Drosophila strains established during this Thesis, enabled me to study the role for Synapsin, a presynaptic phosphoprotein likely involved in synaptic plasticity, in this form of learning (Chapter I.2.), and to investigate the cellular site of the corresponding Synapsin-dependent memory trace (Chapter I.3.). These data provide the first comprehensive account to-date of the neurogenetic bases of learning in larval Drosophila. The role for Synapsin was also analyzed with regard to pain-relief learning in adult fruit flies (Chapter II.1.); that is, if an odour precedes an electric shock during training, flies subsequently avoid that odour (‘punishment learning’), whereas presentation of the odour upon the cessation of shock subsequently leads to approach towards the odour (‘relief larning’). Such pain-relief learning was also the central topic of a study concerning the white gene (Chapter II.2.), which as we report does affect pain-relief as well as punishment learning in adult flies, but leaves larval odour-food learning unaffected. These studies regarding pain-relief learning provide the very first hints, in any experimental system, concerning the genetic determinants of this form of learning. N2 - Tiere müssen sich den wechselnden Umweltbedingungen anpassen und ihr Verhalten dementsprechend ändern. Insbesondere ist die Fähigkeit bestrafende und belohnende Ereignisse zu lernen wesentlich für das Überleben. Ein Schlüssel-Prozess, der solchem Lernen unterliegt, sind Veränderungen in der synaptischen Verbindung zwischen Nervenzellen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit den genetischen Bestimmungsgrößen solcher Plastizität und mit dem Ort an, dem diese Veränderungen entlang der sensorisch-motorischen Nervenbahn des olfaktorischen Lernens in Drosophila stattfinden. Ich habe an der Planung und der Festlegung der Parameter eines olfaktorischen assoziativen Lernparadigmas von Drosophila Larven mitgewirkt (Kapitel I.1.). Die Robustheit dieses Lernparadigmas, zusammen mit einer Anzahl an genetisch veränderten Drosophila Stämmen, die ich während dieser Arbeit entwickelt habe, ermöglichte es mir, die Rolle des Synapsins zu untersuchen. Synapsin ist ein präsynaptisches Phosphoprotein und wahrscheinlich an synaptischer Plastizität beteiligt, welche bei dieser Art von Lernen eine Rolle spielt (Kapitel I.2.). Außerdem ermöglichte es mir den zellulären Ort der Synapsinabhängigen Gedächtnisspur zu untersuchen (Kapitel I.3.) Diese Daten liefern den ersten umfassenden Wissensstand über neuro-genetische Grundlagen des larvalen Lernens. Die Rolle des Synapsin wurde auch im „Erleichterungslernen“ in adulten Fliegen analysiert (Kapitel II.1.). Wenn während des Trainings ein Duft einem elektrischem Schock vorausgeht, vermeiden Fliegen danach diesen Duft („Beschtrafungslernen“), wohingegen die Verabreichung des Duftes nach dem Ende des Schocks anschließend zu einer Annäherung in Richtung Duft führt („Erleichterungslernen“). Solches „Erleichterungslernen“ war auch der Schwerpunkt einer Reihe von Experimenten, die sich mit dem „White“-Gen beschäftigten (Kapitel II.2.). Wie gezeigt beeinflusst dieses Gen sowohl das „Erleichterungs“- als auch das „Bestrafungs“- Lernen in adulten Fliegen; jedoch hat es keine Auswirkungen auf das Duft-Futter-Lernen in Larven. Diese Experimente, die sich mit „Erleichterungslernen“ beschäftigen, liefern die neuesten Hinweise in Systemen, die sich mit den genetischen Bestimmungsgrößen dieser Form von Lernen beschäftigen. KW - Taufliege KW - olfaktorisches Lernen KW - Synapsin KW - Larve KW - drosophila larva KW - olfactory learning KW - Synapsin Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36338 ER - TY - THES A1 - Griffoni, Chiara T1 - Towards advanced immunocompetent skin wound models for in vitro drug evaluation T1 - Auf dem Weg zu fortschrittlichen immunkompetenten Hautwundmodellen für die in vitro-Medikamentenbewertung N2 - Current preclinical models used to evaluate novel therapies for improved healing include both in vitro and in vivo methods. However, ethical concerns related to the use of animals as well as the poor physiological translation between animal and human skin wound healing designate in vitro models as a highly relevant and promising platforms for healing investigation. While current in vitro 3D skin models recapitulate a mature tissue with healing properties, they still represent a simplification of the in vivo conditions, where for example the inflammatory response originating after wound formation involves the contribution of immune cells. Macrophages are among the main contributors to the inflammatory response and regulate its course thanks to their plasticity. Therefore, their implementation into in vitro skin could greatly increase the physiological relevance of the models. As no full-thickness immunocompetent skin model containing macrophages has been reported so far, the parameters necessary for a successful triple co-culture of fibroblasts, keratinocytes and macrophages were here investigated. At first, cell source and culture timed but also an implementation strategy for macrophages were deter-mined. The implementation of macrophages into the skin model focused on the minimization of the culture time to preserve immune cell viability and phenotype, as the environment has a major influence on cell polarization and cytokine production. To this end, incorporation of macrophages in 3D gels prior to the combination with skin models was selected to better mimic the in vivo environment. Em-bedded in collagen hydrogels, macrophages displayed a homogeneous cell distribution within the gel, preserving cell viability, their ability to respond to stimuli and their capability to migrate through the matrix, which are all needed during the involvement of macrophages in the inflammatory response. Once established how to introduce macrophages into skin models, different culture media were evaluated for their effects on primary fibroblasts, keratinocytes and macrophages, to identify a suitable medium composition for the culture of immunocompetent skin. The present work confirmed that each cell type requires a different supplement combination for maintaining functional features and showed for the first time that media that promote and maintain a mature skin structure have negative effects on primary macrophages. Skin differentiation media negatively affected macrophages in terms of viability, morphology, ability to respond to pro- and anti-inflammatory stimuli and to migrate through a collagen gel. The combination of wounded skin equivalents and macrophage-containing gels con-firmed that culture medium inhibits macrophage participation in the inflammatory response that oc-curs after wounding. The described macrophage inclusion method for immunocompetent skin creation is a promising approach for generating more relevant skin models. Further optimization of the co-cul-ture medium will potentially allow mimicking a physiological inflammatory response, enabling to eval-uate the effects novel drugs designed for improved healing on improved in vitro models. N2 - Aktuelle präklinische Modelle zur Bewertung neuartiger Therapien für eine verbesserte Heilung um- fassen sowohl in vitro als auch in vivo Methoden. Ethische Bedenken im Zusammenhang mit der Ver- wendung von Tieren sowie die schlechte physiologische Übersetzung zwischen tierischer und mensch- licher Hautwundheilung bezeichnen In-vitro-Modelle jedoch als hochrelevante und vielversprechende Plattformen für die Heilungsforschung. Während die aktuellen in vitro 3D-Hautmodelle ein reifes Ge- webe mit heilenden Eigenschaften rekapitulieren, stellen sie dennoch eine Vereinfachung der in vivo- Bedingungen dar, bei denen beispielsweise die nach der Wundbildung entstehende Entzündungsreak- tion den Beitrag von Immunzellen beinhaltet. Makrophagen gehören zu den Hauptverursachern der Entzündungsreaktion und regulieren ihren Verlauf durch ihre Plastizität. Daher könnte ihre Implemen- tierung in die in vitro Haut die physiologische Relevanz der Modelle deutlich erhöhen. Da bisher kein volldickes, immunkompetentes Hautmodell mit Makrophagen berichtet wurde, wurden hier die für eine erfolgreiche Dreifach-Cokultur von Fibroblasten, Keratinozyten und Makrophagen notwendigen Parameter untersucht. Zuerst wurden die Zellquelle und die Kultur zeitlich festgelegt, aber auch eine Implementierungsstrategie für Makrophagen festgelegt. Die Implementierung von Makrophagen in das Hautmodell konzentrierte sich auf die Minimierung der Kultivierungszeit, um die Lebensfähigkeit und den Phänotyp der Immunzellen zu erhalten, da die Umgebung einen großen Einfluss auf die Zell- polarisation und Zytokinproduktion hat. Zu diesem Zweck wurde die Integration von Makrophagen in 3D-Gelen vor der Kombination mit Hautmodellen ausgewählt, um die in vivo-Umgebung besser nach- ahmen zu können. Eingebettet in Kollagenhydrogele zeigten Makrophagen eine homogene Zellvertei- lung im Gel, die die Zelllebensfähigkeit bewahrt, auf Reize reagiert und durch die Matrix wandert, die alle bei der Beteiligung von Makrophagen an der Entzündungsreaktion benötigt werden. Nachdem festgestellt worden war, wie Makrophagen in Hautmodelle eingeführt werden können, wurden ver- schiedene Kulturmedien hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf Primärfibroblasten, Keratinozyten und Makrophagen untersucht, um eine geeignete Medienzusammensetzung für die Kultur immunkompe- tenter Haut zu identifizieren. Die vorliegende Arbeit bestätigte, dass jeder Zelltyp eine andere Supple- mentkombination zur Aufrechterhaltung der Funktionsmerkmale benötigt und zeigte erstmals, dass Medien, die eine reife Hautstruktur fördern und aufrechterhalten, negative Auswirkungen auf die pri- mären Makrophagen haben. Hautdifferenzierungsmedien wirkten sich negativ auf die Makrophagen in Bezug auf Lebensfähigkeit, Morphologie, Fähigkeit, auf pro- und antiinflammatorische Reize zu rea- gieren und durch ein Kollagengel zu wandern aus. Die Kombination aus verwundeten Hautäquivalen- ten und makrophagenhaltigen Gelen bestätigte, dass das Kulturmedium die Teilnahme der Makro- phage an der Entzündungsreaktion, die nach der Wunde auftritt, hemmt. Die beschriebene Makrophagen-Einschlussmethode zur immunkompetenten Hautbildung ist ein vielversprechender An- satz zur Generierung relevanterer Hautmodelle. Eine weitere Optimierung des Co-Kulturmediums wird es möglicherweise ermöglichen, eine physiologische Entzündungsreaktion nachzuahmen und die Aus- wirkungen neuartiger Medikamente zur verbesserten Heilung auf verbesserte In-vitro-Modelle zu be- werten. KW - skin model KW - macrophages KW - wound healing KW - immunocompetent skin KW - Haut KW - In vitro KW - Wundheilung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192125 ER - TY - THES A1 - Liang, Chunguang T1 - Tools for functional genomics applied to Staphylococci, Listeriae, Vaccinia virus and other organisms N2 - Genome sequence analysis A combination of genome analysis application has been established here during this project. This offers an efficient platform to interactively compare similar genome regions and reveal loci differences. The genes and operons can be rapidly analyzed and local collinear blocks (LCBs) categorized according to their function. The features of interests are parsed, recognized, and clustered into reports. Phylogenetic relationships can be readily examined such as the evolution of critical factors or a certain highly-conserved region. The resulting platform-independent software packages (GENOVA and inGeno), have been proven to be efficient and easy to handle in a number of projects. The capabilities of the software allowed the investigation of virulence factors, e.g., rsbU, strains’ biological design, and in particular pathogenicity feature storage and management. We have successfully investigated the genomes of Staphylococcus aureus strains (COL, N315, 8325, RN1HG, Newman), Listeria spp. (welshimeri, innocua and monocytogenes), E.coli strains (O157:H7 and MG1655) and Vaccinia strains (WR, Copenhagen, Lister, LIVP, GLV-1h68 and parental strains). Metabolic network analysis Our YANAsquare package offers a workbench to rapidly establish the metabolic network of such as Staphylococcous aureus bacteria in genome-scale size as well as metabolic networks of interest such as the murine phagosome lipid signalling network. YANAsquare recruits reactions from online databases using an integrated KEGG browser. This reduces the efforts in building large metabolic networks. The involved calculation routines (METATOOL-derived wrapper or native Java implementation) readily obtain all possible flux modes (EM/EP) for metabolite fluxes within the network. Advanced layout algorithms visualize the topological structure of the network. In addition, the generated structure can be dynamically modified in the graphic interface. The generated network as well as the manipulated layout can be validated and stored (XML file: scheme of SBML level-2). This format can be further parsed and analyzed by other systems biology software, such as CellDesigner. Moreover, the integrated robustness-evaluation routine is able to examine the synthesis rates affected by each single mutation throughout the whole network. We have successfully applied the method to simulate single and multiple gene knockouts, and the affected fluxes are comprehensively revealed. Recently we applied the method to proteomic data and extra-cellular metabolite data of Staphylococci, the physiological changes regarding the flux distribution are studied. Calculations at different time points, including different conditions such as hypoxia or stress, show a good fit to experimental data. Moreover, using the proteomic data (enzyme amounts) calculated from 2D-Gel-EP experiments our study provides a way to compare the fluxome and the enzyme expression. Oncolytic vaccinia virus (VACV) We investigated the genetic differences between the de novo sequence of the recombinant oncolytic GLV-1h68 and other related VACVs, including function predictions for all found genome differences. Our phylogenetic analysis indicates that GLV-1h68 is closest to Lister strains but has lost several ORFs present in its parental LIVP strain, including genes encoding CrmE and a viral Golgi anti-apoptotic protein, v-GAAP. Functions of viral genes were either strain-specific, tissue-specific or host-specific comparing viral genes in the Lister, WR and COP strains. This helps to rationally design more optimized oncolytic virus strains to benefit cancer therapy in human patients. Identified differences from the comparison in open reading frames (ORFs) include genes for host-range selection, virulence and immune modulation proteins, e.g. ankyrin-like proteins, serine proteinase inhibitor SPI-2/CrmA, tumor necrosis factor (TNF) receptor homolog CrmC, semaphorin-like and interleukin-1 receptor homolog proteins. The contribution of foreign gene expression cassettes in the therapeutic and oncolytic virus GLV-1h68 was studied, including the F14.5L, J2R and A56R loci. The contribution of F14.5L inactivation to the reduced virulence is demonstrated by comparing the virulence data of GLV-1h68 with its F14.5L-null and revertant viruses. The comparison suggests that insertion of a foreign gene expression cassette in a nonessential locus in the viral genome is a practical way to attenuate VACVs, especially if the nonessential locus itself contains a virulence gene. This reduces the virulence of the virus without compromising too much the replication competency of the virus, the key to its oncolytic activity. The reduced pathogenicity of GLV-1h68 was confirmed by our experimental collaboration partners in male mice bearing C6 rat glioma and in immunocompetent mice bearing B16-F10 murine melanoma. In conclusion, bioinformatics and experimental data show that GLV-1h68 is a promising engineered VACV variant for anticancer therapy with tumor-specific replication, reduced pathogenicity and benign tissue tropism. N2 - Genom Sequenz Analyse Im Zuge der vorliegenden Doktorarbeit wurden verschiedene Programme zur Genomanalyse kombiniert, um eine effiziente Plattform zum interaktiven Vergleich lokaler Ähnlichkeiten bzw. Unterschiede in Genomen bereitzustellen. Damit können Gene und Operons schnell untersucht und “local collinear blocks” entsprechend ihrer Funktion kategorisiert werden. Phylogenetische Beziehungen, wie beispielsweise die Evolution spezifischer Elemente oder stark konservierter Regionen können leicht überprüft werden. Die hierfür entwickelte plattformunabhängige Software (GENOVA und inGeno) hat sich in mehreren Projekten als effizient und leicht handhabbar bewährt. Die Programme erlauben die Untersuchung von Virulenzfaktoren auf Sequenz- oder Annotationsebene. Während der vorliegenden Doktorarbeit konnten so die Genome von verschiedenen Staphylococcus aureus, Listeria spp., Escherichia coli und Vaccinia Stämmen untersucht werden. Metabolische Netzwerk Analyse Unser “YANAsquare” Programmpaket bietet eine Oberfläche um schnell metabolische Netzwerke vom genomweiten Anzatz bis hinunter zum Einzelnetzwerk zu analysieren. Dafür greift YANA mit Hilfe des integrierten KEGG-Browsers auf Onlinedatenbanken zu, um die notwendigen Informationen zum metabolischen Reaktionsweg bereitzustellen und reduziert so maßgeblich den Arbeitsaufwand beim Beschreiben von Netzwerke. Die implementierten Methoden zur Berechnung (METATOOL, eigene Implementation in Java) des Netzwerkes liefern exakt alle die möglichen Elementarmoden (EM/EP) für die Metabolite zurück. Durch den Einsatz von fortgeschrittenen Layout Algorithmen wird anschliessend die Darstellung der Netzwerktopologie möglich. Außerdem kann in der grafischen Darstellung das generierte Netzwerklayout dynamisch verändert werden. Das Speichern der Daten erfolgt im XML (SBML level-2) Format und erlaubt so die Weiterverwendung in anderen systembiologischen Programmen, wie dem “CellDesigner”. Mit Hilfe einer gen-Knockout Simulations Methode kann der Einfluss von einzelnen Mutationen im gesamten Netzwerk auf die Syntheseraten untersucht werden. Wir konnten mit dieser Methode Einzel- sowie Mehrfachgenknockouts und deren Effekte auf die Elementarmoden analysieren. Die Methode wurde ebenfalls auf Proteomdaten und extrazelluläre Metabolite von Staphylokokken angewandt, um Änderungen bezüglich der Flussverteilung zu untersuchen. Die Simulationen zu verschieden Zeitpunkten und unter verschiedenen Stessbedingungen zeigen große Übereinstimmung mit experimentell erhobenen Daten. Onkolytischer Vaccinia Virus (VACV) Wir haben die genetischen Unterschiede zwischen der de novo Sequenz des rekombinanten onkolytischen Virus GLV-1h68 und anderen VACVs untersucht und gefundene Unterschiede funktionell charakterisiert. Die phylogenetische Analyse zeigt das GLV-1h68 mit dem Lister Stamm am nächsten verwandt ist. Auffällig ist dabei der Verlust von einigen open reading frames (ORFs), die noch im Eltern LIVP Stamm vorhanden sind (CrmE, v-GAAP). Beim Vergleich der Funktion viraler Gene aus Lister, WR und COP Stämmen treten stamm-, gewebe- und wirtsspezifische Gene auf. Diese Tatsache ermöglicht die Optimierung der onkolytischen Virusstämme für den Einsatz bei humanen Krebstherapien. Die beim Vergleich identifizierten Unterschiede zwischen den ORFs enthalten Gene für die Wirtsselektion, Virulenz und immunmodulierende Proteine (Ankyrin ähnliche Proteine, Serine-Proteinasen Inhibitor SPI-2/CrmA, Tumor Nekrose Faktor (TNF) Rezeptorhomolog CrmC, semaphorinähnliche und Interleukin-1 rezeptorhomologe Proteine). An den Loki F14.5L, J2R und A56R des GLV-1h68 Virus wurden die Vorteile der eingesetzten fremden Genexpressionskassetten untersucht. So zeigt GLV-1h68 mit F14.5L-Inaktivierung gegenüber der F14.5L-Revertanten Viren eine reduzierte Virulenz. Das erlaubt die Schlussfolgerung, dass die Insertion von fremden Genexpressionskassetten in nicht-essentielle Loki zur Verminderung der Virulenz von VACVs führt, besonders, wenn der nicht-essentielle Lokus selbst ein Virulenzgen enthält. Das Replikationsvermögen, welches ausschlaggebend für die onkolytische Aktivität des Virus ist, wird trotz der verminderten Virulenz nicht eingeschränkt. Die reduzierte Pathogenität des GLV-1h68 Virus wurde durch experimentelle Daten unserer Kollaborationspartner in männlichen Mäusen mit Ratten C6 Gliom und in immunokompetenten Mäusen mit B16-F10 Mausmelanom nachgewiesen. Zusammenfassend zeigen experimentelle und bioinformatisch gewonnene Daten, dass GLV-1h68 eine vielversprechende VACV Variante für die Krebstherapie mit tumorspezifischer Replikation, verringerter Pathogenität und hoher Gewebsspezifität ist. KW - Genanalyse KW - Bioinformatik KW - Systembiologie KW - bacterial KW - virulence KW - systems biologie KW - genomic KW - algorithm KW - metabolic KW - network KW - pathway KW - flux KW - Bacterial KW - genomics KW - algorithm KW - tool KW - metabolic Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48051 ER - TY - THES A1 - Schenk [née Wolf], Mariela T1 - Timing of wild bee emergence: mechanisms and fitness consequences T1 - Zeitliche Abstimmung des Bienenschlupfes: Mechanismen und Fitnesskonsequenzen N2 - Solitary bees in seasonal environments have to align their life-cycles with favorable environmental conditions and resources. Therefore, a proper timing of their seasonal activity is highly fitness relevant. Most species in temperate environments use temperature as a trigger for the timing of their seasonal activity. Hence, global warming can disrupt mutualistic interactions between solitary bees and plants if increasing temperatures differently change the timing of interaction partners. The objective of this dissertation was to investigate the mechanisms of timing in spring-emerging solitary bees as well as the resulting fitness consequences if temporal mismatches with their host plants should occur. In my experiments, I focused on spring-emerging solitary bees of the genus Osmia and thereby mainly on O. cornuta and O. bicornis (in one study which is presented in Chapter IV, I additionally investigated a third species: O. brevicornis). Chapter II presents a study in which I investigated different triggers solitary bees are using to time their emergence in spring. In a climate chamber experiment I investigated the relationship between overwintering temperature, body size, body weight and emergence date. In addition, I developed a simple mechanistic model that allowed me to unite my different observations in a consistent framework. In combination with the empirical data, the model strongly suggests that solitary bees follow a strategic approach and emerge at a date that is most profitable for their individual fitness expectations. I have shown that this date is on the one hand temperature dependent as warmer overwintering temperatures increase the weight loss of bees during hibernation, which then advances their optimal emergence date to an earlier time point (due to an earlier benefit from the emergence event). On the other hand I have also shown that the optimal emergence date depends on the individual body size (or body weight) as bees adjust their emergence date accordingly. My data show that it is not enough to solely investigate temperature effects on the timing of bee emergence, but that we should also consider individual body conditions of solitary bees to understand the timing of bee emergence. In Chapter III, I present a study in which I investigated how exactly temperature determines the emergence date of solitary bees. Therefore, I tested several variants degree-day models to relate temperature time series to emergence data. The basic functioning of such degree-day models is that bees are said to finally emerge when a critical amount of degree-days is accumulated. I showed that bees accumulate degree-days only above a critical temperature value (~4°C in O. cornuta and ~7°C in O. bicornis) and only after the exceedance of a critical calendar date (~10th of March in O. cornuta and ~28th of March in O. bicornis). Such a critical calendar date, before which degree-days are not accumulated irrespective of the actual temperature, is in general less commonly used and, so far, it has only been included twice in a phenology model predicting bee emergence. Furthermore, I used this model to retrospectively predict the emergence dates of bees by applying the model to long-term temperature data which have been recorded by the regional climate station in Würzburg. By doing so, the model estimated that over the last 63 years, bees emerged approximately 4 days earlier. In Chapter IV, I present a study in which I investigated how temporal mismatches in bee-plant interactions affect the fitness of solitary bees. Therefore, I performed an experiment with large flight cages serving as mesocosms. Inside these mesocosms, I manipulated the supply of blossoms to synchronize or desynchronize bee-plant interactions. In sum, I showed that even short temporal mismatches of three and six days in bee-plant interactions (with solitary bee emergence before flower occurrence) can cause severe fitness losses in solitary bees. Nonetheless, I detected different strategies by solitary bees to counteract impacts on their fitness after temporal mismatches. However, since these strategies may result in secondary fitness costs by a changed sex ratio or increased parasitism, I concluded that compensation strategies do not fully mitigate fitness losses of bees after short temporal mismatches with their food plants. In the event of further climate warming, fitness losses after temporal mismatches may not only exacerbate bee declines but may also reduce pollination services for later-flowering species and affect populations of animal-pollinated plants. In conclusion, I showed that spring-emerging solitary bees are susceptible to climate change as in response to warmer temperatures bees advance their phenology and show a decreased fitness state. As spring-emerging solitary bees not only consider overwintering temperature but also their individual body condition for adjusting emergence dates, this may explain differing responses to climate warming within and among bee populations which may also have consequences for bee-plant interactions and the persistence of bee populations under further climate warming. If in response to climate warming plants do not shift their phenologies according to the bees, bees may experience temporal mismatches with their host plants. As bees failed to show a single compensation strategy that was entirely successful in mitigating fitness consequences after temporal mismatches with their food plants, the resulting fitness consequences for spring-emerging solitary bees would be severe. Furthermore, I showed that spring-emerging solitary bees use a critical calendar date before which they generally do not commence the summation of degree-days irrespective of the actual temperature. I therefore suggest that further studies should also include the parameter of a critical calendar date into degree-day model predictions to increase the accuracy of model predictions for emergence dates in solitary bees. Although our retrospective prediction about the advance in bee emergence corresponds to the results of several studies on phenological trends of different plant species, we suggest that more research has to be done to assess the impacts of climate warming on the synchronization in bee-plant interactions more accurately. N2 - Solitäre Bienen aus gemäßigten Breiten müssen ihre Lebenszyklen vorteilhaften Umweltbedingungen und –ressourcen angleichen. Deshalb ist ein gutes Timing ihrer saisonalen Tätigkeit von höchster Relevanz. Die meisten Arten aus gemäßigten Breiten nutzen Temperatur als Trigger um ihre saisonale Aktivität zeitlich abzustimmen. Aus diesem Grund kann der Klimawandel die mutualistischen Interaktionen zwischen Bienen- und Pflanzenarten stören, falls steigende Temperaturen das Timing der Interaktionspartner unterschiedlich verändern. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Timing-Mechanismen von Frühlingsbienenarten zu untersuchen, sowie die resultierenden Fitnessfolgen, falls zeitliche Fehlabstimmungen zu ihren Wirtspflanzen eintreten sollten. In meinen Experimenten konzentrierte ich mich auf Frühlingsbienenarten der Gattung Osmia (Mauerbienen) und dabei vor allem auf zwei spezielle Arten, nämlich O. cornuta und O. bicornis (in meiner Studie, die ich im Kapitel IV meiner Doktorarbeit präsentiere, untersuchte ich zusätzlich noch eine dritte Bienenart: O. brevicornis). Kapitel II präsentiert eine Studie, in der ich verschiedene Trigger untersuchte, die solitäre Bienen nutzen um ihren Schlupfzeitpunkt im Frühjahr festzulegen. Dazu untersuchte ich in einem Klimakammerexperiment den Zusammenhang zwischen Überwinterungstemperaturen, Körpergröße, Körpergewicht und Schlupftag. Zusätzlich entwickelte ich ein einfaches mechanistisches Modell, welches mir ermöglichte, meine verschiedenen Ergebnisse in einem einheitlichen Rahmen zusammenzufügen. In Kombination mit den empirischen Daten deutet das Modell stark darauf hin, dass Bienen einen strategischen Ansatz verfolgen und genau an dem Tag schlüpfen, der für ihre individuelle Fitnesserwartung am sinnvollsten ist. Ich konnte zeigen, dass dieser gewählte Schlupftag einerseits temperaturabhängig ist, da wärmere Temperaturen den Gewichtverlust der Bienen während der Überwinterung steigern, was wiederum den optimalen Schlupftag auf einem früheren Zeitpunkt verschiebt, andererseits konnte ich ebenfalls zeigen, dass der optimale Schlupfzeitpunkt von der individuellen Körpergröße bzw. dem Körpergewicht der Biene abhängt, da diese ihren Schlupftag danach abstimmen. Meine Daten zeigen, dass es nicht reicht alleinig Temperatureffekte auf das Timing der solitären Bienen zu untersuchen, sondern dass wir ebenfalls die Körperkonditionen der Bienen beachten sollten, um die zeitliche Abstimmung des Bienenschlupfes besser verstehen zu können. In Kapitel III präsentiere ich eine Studie, in der ich den Temperatureinfluss auf den Schlupftermin solitärer Bienen detailreicher untersuchte. Dazu habe ich verschiedene Varianten von Temperatursummen-Modellen getestet, um Temperaturzeitreihen auf Schlupftermine zu beziehen. Die grundlegende Funktionsweise solcher Temperatursummen-Modelle ist, dass der Bienenschlupf auf den Tag prognostiziert wird an dem die Bienen eine bestimmte Menge an Temperatursummen aufsummiert haben. Ich konnte zeigen, dass Bienen Temperatursummen erst ab bestimmten Temperaturen bilden (ab circa 4°C bei O. cornuta und circa 7°C bei O. bicornis) und erst nach Erreichen eines bestimmten Kalendertages (circa 10.März bei O. cornuta und circa 28.März bei O. bicornis). Solch ein bestimmter Kalendertag, vor dessen Erreichen und unabhängig von der aktuellen Temperatur keine Temperatursummen gebildet werden, wird grundsätzlich recht selten verwendet und in Phänologie-Modellen zur Vorhersage des Bienenschlupfes, bis heute auch nur zwei Mal. Zusätzlich benutzte ich mein Modell, um rückwirkend den Bienenschlupf über die letzten Jahrzehnte vorherzusagen. Dazu wandte ich das Modell auf Langzeit-Temperaturdaten an, die von der regionalen Wetterstation in Würzburg aufgezeichnet wurden. Das Modell prognostizierte rückwirkend, dass im Verlauf der letzten 63 Jahre die Bienen ungefähr 4 Tage früher schlüpfen. In Kapitel IV präsentiere ich eine Studie, in der ich untersuchte, inwieweit zeitliche Fehlabstimmungen in Bienen-Pflanzen-Interaktionen die Fitness der solitären Bienen beeinflussen. Dazu führte ich ein Experiment mit großen Flugkäfigen durch, die als Mesokosmos dienten. Innerhalb jedes dieser Mesokosmen manipulierte ich das Angebot an Blüten um Bienen-Pflanzen-Interaktionen wahlweise zu synchronisieren oder zu desynchronisieren. Zusammengefasst konnte ich dabei aufzeigen, dass sogar kurze zeitliche Fehlabstimmungen von drei oder sechs Tagen bereits genügen (Bienen schlüpften zeitlich vor dem Erscheinen der Pflanzen) um bei den Bienen fatale Fitnessfolgen zu verursachen. Nichtsdestotrotz konnte ich bei den Bienen verschiedene Strategien erkennen, mit denen sie Auswirkungen auf ihre Fitness nach zeitlichen Fehlabstimmungen entgegenwirken wollten. Allerdings könnten diese Strategien zu sekundären Fitnessverlusten folgen da sie zu einem veränderten Geschlechterverhältnis oder einem stärkeren Prasitierungsgrad führen. Deshalb konnte ich zusammenfassend feststellen, dass nach zeitlichen Fehlabstimmungen zu den entsprechenden Wirtspflanzen, die Kompensationsstrategien der Bienen nicht ausreichen, um Fitnessverlusste zu minimieren. Im Falle des weiter voranschreitenden Klimawandel könnten die Fitnessverluste der Bienen nicht nur das momentane Bienensterben weiter verschärfen, sondern auch ihren Bestäubungsdienst an später blühenden Arten minimieren und dadurch Populationen von tierbestäubten Pflanzen beeinträchtigen. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass Frühlingsbienenarten anfällig für Klimawandel sind, da sie nach warmen Überwinterungstemperaturen früher schlüpfen und einen geringeren Fitnesszustand aufweisen. Da Frühlingsbienenarten bei der zeitlichen Abstimmung ihres Schlupftages nicht nur Überwinterungstemperaturen, sondern auch ihren individuellen Fitnesszustand beachten, könnte dies unterschiedliche Reaktionen innerhalb oder zwischen Bienenpopulationen auf den Klimawandel erklären. Dies könnte ebenfalls Folgen für Bienen-Pflanzen Interaktionen haben und das weitere Bestehen von Bienenpopulationen gefährden. Falls, durch den Klimawandel bedingt, Pflanzenarten ihre Phänologie nicht in Einklang mit der Phänologie der Bienen verschieben, dann könnten Bienen zeitliche Fehlabstimmungen mit ihren Wirtspflanzen erleben. Da Bienen keine einzige Kompensationsmaßnahme aufzeigen, die erfolgreich Fitnessverlusten entgegenwirken konnte, wären in einem solchen Fall die Folgen für Frühlingsbienenarten fatal. Darüber hinaus konnte ich feststellen, dass Frühlingsbienen einen bestimmten Starttag im Jahr beachten, vor dessen Erreichen sie keine Temperatursummen bilden, unabhängig von der aktuellen Temperatur. Ich schlage deshalb vor, dass weitere Studien ebenfalls einen solchen Starttag in Temperatursummen-Modelle einbauen sollten, um die Genauigkeit zur Berechnung des Bienenschlupfes weiter zu verbessern. Obwohl meine retrospektive Vorhersage zum verfrühten Bienenschlupf ziemlich genau den Ergebnissen von verschiedenen Studien zu den phänologischen Verschiebungen von Pflanzenarten entspricht, schlagen wir vor, dass zusätzliche Untersuchungen konzipiert werden müssen um präzisere Aussagen über die Folgen des Klimawandels auf die Synchronisation der Bienen-Pflanzen-Interaktionen liefern zu können. KW - wild bees KW - timing KW - fitness Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161565 ER - TY - THES A1 - Nürnberger, Fabian T1 - Timing of colony phenology and foraging activity in honey bees T1 - Zeitliche Koordination von Koloniephänologie und Sammelaktivität bei Honigbienen N2 - I. Timing is a crucial feature in organisms that live within a variable and changing environment. Complex mechanisms to measure time are wide-spread and were shown to exist in many taxa. These mechanisms are expected to provide fitness benefits by enabling organisms to anticipate environmental changes and adapt accordingly. However, very few studies have addressed the adaptive value of proper timing. The objective of this PhD-project was to investigate mechanisms and fitness consequences of timing decisions concerning colony phenology and foraging activity in the honey bee (Apis mellifera), a social insect species with a high degree of social organization and one of the most important pollinators of wild plants and crops. In chapter II, a study is presented that aimed to identify the consequences of disrupted synchrony between colony phenology and the local environment by manipulating the timing of brood onset after hibernation. In a follow-up experiment, the importance of environmental factors for the timing of brood onset was investigated to assess the potential of climate change to disrupt synchronization of colony phenology (Chapter III). Chapter IV aimed to prove for the first time that honey bees can use interval time-place learning to improve foraging activity in a variable environment. Chapter V investigates the fitness benefits of information exchange between nest mates via waggle dance communication about a resource environment that is heterogeneous in space and time. II. In the study presented in chapter II, the importance of the timing of brood onset after hibernation as critical point in honey bee colony phenology in temperate zones was investigated. Honey bee colonies were overwintered at two climatically different sites. By translocating colonies from each site to the other in late winter, timing of brood onset was manipulated and consequently colony phenology was desynchronized with the local environment. Delaying colony phenology in respect to the local environment decreased the capability of colonies to exploit the abundant spring bloom. Early brood onset, on the other hand, increased the loads of the brood parasite Varroa destructor later in the season with negative impact on colony worker population size. This indicates a timing related trade-off and illustrates the importance of investigating effects of climate change on complex multi-trophic systems. It can be concluded that timing of brood onset in honey bees is an important fitness relevant step for colony phenology that is highly sensitive to climatic conditions in late winter. Further, phenology shifts and mismatches driven by climate change can have severe fitness consequences. III. In chapter III, I assess the importance of the environmental factors ambient temperature and photoperiod as well as elapsed time on the timing of brood onset. Twenty-four hibernating honey bee colonies were placed into environmental chambers and allocated to different combinations of two temperature regimes and three different light regimes. Brood onset was identified non-invasively by tracking comb temperature within the winter cluster. The experiment revealed that ambient temperature plays a major role in the timing of brood onset, but the response of honey bee colonies to temperature increases is modified by photoperiod. Further, the data indicate the involvement of an internal clock. I conclude that the timing of brood onset is complex but probably highly susceptible to climate change and especially spells of warm weather in winter. IV. In chapter IV, it was examined if honey bees are capable of interval time-place learning and if this ability improves foraging efficiency in a dynamic resource environment. In a field experiment with artificial feeders, foragers were able to learn time intervals and use this ability to anticipate time periods during which feeders were active. Further, interval time-place learning enabled foragers to increase nectar uptake rates. It was concluded that interval time-place learning can help honey bee foragers to adapt to the complex and variable temporal patterns of floral resource environments. V. The study presented in chapter V identified the importance of the honey bee waggle dance communication for the spatiotemporal coordination of honey bee foraging activity in resource environments that can vary from day to day. Consequences of disrupting the instructional component of honey bee dance communication were investigated in eight temperate zone landscapes with different levels of spatiotemporal complexity. While nectar uptake of colonies was not affected, waggle dance communication significantly benefitted pollen harvest irrespective of landscape complexity. I suggest that this is explained by the fact that honey bees prefer to forage pollen in semi-natural habitats, which provide diverse resource species but are sparse and presumably hard to find in intensively managed agricultural landscapes. I conclude that waggle dance communication helps to ensure a sufficient and diverse pollen diet which is crucial for honey bee colony health. VI. In my PhD-project, I could show that honey bee colonies are able to adapt their activities to a seasonally and daily changing environment, which affects resource uptake, colony development, colony health and ultimately colony fitness. Ongoing global change, however, puts timing in honey bee colonies at risk. Climate change has the potential to cause mismatches with the local resource environment. Intensivation of agricultural management with decreased resource diversity and short resource peaks in spring followed by distinctive gaps increases the probability of mismatches. Even the highly efficient foraging system of honey bees might not ensure a sufficiently diverse and healthy diet in such an environment. The global introduction of the parasitic mite V. destructor and the increased exposure to pesticides in intensively managed landscapes further degrades honey bee colony health. This might lead to reduced cognitive capabilities in workers and impact the communication and social organization in colonies, thereby undermining the ability of honey bee colonies to adapt to their environment. N2 - I. Zeitliche Koordination ist äußerst wichtig für Organismen, die in einer variablen und sich wandelnden Umwelt leben. Komplexe Mechanismen, die das Messen von Zeit ermöglichen, sind weit verbreitet und wurden bei vielen Taxa aufgezeigt. Es wird generell angenommen, dass diese Mechanismen Fitnessvorteile verschaffen, indem sie es Organismen ermöglichen, Umweltveränderungen vorherzusehen und sich entsprechen anzupassen. Allerdings gibt es bisher nur sehr wenige Studien zum adaptiven Wert einer guten zeitlichen Koordination. Ziel dieses Dissertations-Projekts war es, Mechanismen der zeitlichen Koordination bei Honigbienen (Apis mellifera) zu erforschen und deren Bedeutung für die Fitness des Honigbienenvolks zu identifizieren. In Kapitel II präsentiere ich meine Studie über die Konsequenzen eines falsch gewählten Zeitpunkts für den Brutbeginn am Ende des Winters und der daraus folgenden gestörten Synchronisation zwischen der Phänologie von Honigbienenvölkern und der lokalen Umwelt. In einem Folgeexperiment wurde die Bedeutung von Umweltfaktoren für das Timing des Brutbeginns untersucht (Kapitel III). Die Studie in Kapitel IV zielt darauf ab, erstmalig den Beweis zu erbringen, dass Honigbienen das „Intervall time-place learning“, d.h. die Fähigkeit, Zeitintervalle zwischen Ereignissen zu lernen und mit deren räumlichen Lage zu assoziieren, beherrschen und, dass diese Fähigkeit beim Sammeln von Ressourcen vorteilhaft ist. Kapitel V untersucht die Fitnessvorteile, die aus dem Austausch von Informationen über ein raumzeitlich heterogenes Ressourcenumfeld zwischen Stockgenossinnen mit Hilfe des Schwänzeltanzes gezogen werden. II. In der Studie, die in Kapitel II präsentiert wird, wurde die Bedeutung des Brutbeginns als entscheidender Punkt für die Phänologie von Honigbienenvölkern in den gemäßigten Breiten untersucht. Honigbienenvölker wurden an zwei klimatisch unterschiedlichen Standorten überwintert. Indem ein Teil der Völker im Spätwinter zwischen den Standorten ausgetauscht wurde, wurde deren Brutbeginn manipuliert und dadurch die Phänologie bezüglich der lokalen Umwelt desynchronisiert. Das verzögern der Phänologie der Völker verminderte deren Fähigkeit die üppige Frühjahrsblüte zu nutzen. Ein früher Brutbeginn andererseits erhöhte die Belastung der Völker durch den Brutparasiten Varroa destructor im Verlauf der Saison, was sich negativ auf die Menge der Arbeiterinnen im Volk auswirkte. Es gibt also entscheidende gegensätzlich wirkende Faktoren, die den optimalen Zeitpunkt des Brutbeginns bestimmen. Die Studie zeigt zudem warum es wichtig ist, die möglichen Folgen des Klimawandels in einem multitrophischen System zu betrachten statt sich auf einfache Interaktionen zu beschränken. Man kann allgemein folgern, dass das Timing des Brutbeginns einen bedeutenden fitnessrelevanten Schritt in der Phänologie von Honigbienenvölkern darstellt, der stark von klimatischen Bedingungen im Spätwinter beeinflusst wird. Verschiebungen und Fehlanpassungen des Brutbeginns, und damit der Phänologie, durch den Klimawandel können ernsthafte negative Konsequenzen für die Fitness von Honigbienenvölkern haben. III. In Kapitel III beleuchte ich die Bedeutung der Umweltfaktoren Umgebungstemperatur und Photoperiode sowie der verstrichenen Zeit auf das Timing des Brutbeginns. Vierundzwanzig überwinternde Honigbienenvölker wurden in Klimakammern untergebracht und auf sechs unterschiedliche Kombinationen von Temperatur- und Lichtregimes verteilt. Der Brutbeginn wurde nicht-invasiv über den Temperaturverlauf auf der Wabe innerhalb der Wintertraube festgestellt. Das Experiment hat gezeigt, dass die Umgebungstemperatur eine entscheidende Rolle beim Timing des Brutbeginns spielt. Allerdings wurde die Reaktion der Völker auf einen Temperaturanstieg vom jeweils vorherrschenden Lichtregime beeinflusst. Zudem deuten die Daten auf die Beteiligung einer inneren Uhr hin. Ich folgere, dass das Timing des Brutbeginns durch ein komplexes System geregelt wird, das wahrscheinlich anfällig für Einflüsse durch den Klimawandel und insbesondere durch Warmwetterphasen im Winter ist. IV. In Kapitel IV meiner Dissertation wird eine Studie präsentiert, die untersucht ob Bienen die Befähigung zum „Intervall time-place learning“ besitzen und ob diese Fähigkeit die Sammeleffizienz in einem dynamischen Ressourcenumfeld verbessert. In einer Feldstudie mit künstlichen Futterquellen zeigten Sammelbienen, dass sie in der Lage waren, Zeitintervalle zu lernen und das Wissen zu nutzen, um die Zeiten vorherzusehen zu denen die Futterquellen aktiv waren. Dieses Lernverhalten ermöglichte es den Sammelbienen, ihre Nektaraufnahmerate zu steigern. Es wurde gefolgert, dass „Intervall time-place learning“ Sammelbienen dabei helfen kann, sich in einem Blühressourcenumfeld mit komplexen und variablen Zeitmustern zurechtzufinden. V. Diese Studie, die in Kapitel V präsentiert wird, untersuchte die Bedeutung der Schwänzeltanzkommunikation der Honigbienen für die raumzeitliche Koordination der Sammelaktivität des Volkes innerhalb eines Ressourcenumfelds, das täglich variieren kann. Die Folgen der Störung der instruktiven Komponenten des Schwänzeltanzes wurden in acht unterschiedlich komplex strukturierten Landschaften innerhalb der gemäßigten Breiten ermessen. Während kein Einfluss auf den Nektarsammelerfolg festgestellt werden konnte, wurde jedoch gezeigt, dass der Pollensammelerfolg, unabhängig von der raumzeitlichen Komplexität der Landschaft, stark von der Schwänzeltanzkommunikation profitiert. Der Grund dafür liegt vermutlich darin, dass Honigbienen vorzugsweise Pollen in halbnatürlichen Habitaten sammeln, die eine hohe Ressourcenvielfalt bieten, aber in intensiv agrarwirtschaftlich genutzten Landschaften eher selten und relativ schwer zu finden sind. Die Studie lässt schließen, dass die Schwänzeltanzkommunikation dabei hilft, eine ausreichende und diverse Pollenernährung zu gewährleisten und damit eine große Rolle für die Gesundheit von Honigbienenvölkern spielt. VI. Ich konnte in meinem Dissertationsprojekt zeigen, dass Honigbienen in der Lage sind ihre Aktivitäten an eine sich jahreszeitlich und täglich verändernde Umwelt anzupassen. Eine gute zeitliche Koordination hat Einfluss auf Sammelerfolg, Volksentwicklung, Gesundheit und letztlich auf die Fitness des Volkes. Allerdings gefährdet der voranschreitende globale Wandel die zeitliche Koordination der Honigbienenvölker. Der Klimawandel hat das Potenzial, zeitliche Anpassungen an die lokale Umwelt zu stören. Die Intensivierung der Landwirtschaft und der damit einhergehende Verlust von Pflanzenvielfalt sowie die kurzen Zeiträume von extrem hohem Ressourcenangebot, gefolgt von einer ausgeprägten Blühlücke, erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass zeitlich Fehlanpassungen auftreten. In einer derartigen Umwelt könnte selbst das höchst effiziente Ressourcensammelsystem der Honigbienen nicht mehr genügen, um eine ausreichende, vielfältige und gesunde Ernährung zu gewährleisten. Die globale Verbreitung der parasitischen Varroamilbe durch den Menschen und die erhöhte Belastung durch Pestizide verschlechtert zusätzlich den Gesundheitszustand der Honigbienen. Das wiederum kann sich negativ auf das Lernvermögen und des Weiteren auf die Kommunikation und soziale Organisation der Völker auswirken und dadurch deren Fähigkeit, sich an eine veränderliche Umwelt anzupassen unterwandern. KW - Biene KW - Phänologie KW - Kommunikation KW - Soziale Insekten KW - Apis mellifera KW - foraging KW - brood rearing KW - temperate zones KW - waggle dance KW - hibernation KW - climate change KW - varroa KW - Timing Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155105 ER - TY - THES A1 - Bujok, Brigitte T1 - Thermoregulation im Brutbereich der Honigbiene Apis mellifera carnica T1 - Thermoregulation in the brood region of honeybees (Apis mellifera carnica) N2 - Honigbienen (Apis mellifera carnica) regulieren die Temperatur ihrer Brut in einem sehr engen Temperaturfenster, da vor allem die gedeckelte Brut sehr temperaturempfindlich reagiert (Groh et al. 2004). Die Thermoregulation ist nicht – wie lange angenommen – Beiprodukt von alltäglichen Arbeiten der Bienen im Brutbereich, sondern eine aktive und Energie- und Zeitaufwändige eigene Tätigkeit. Arbeiterinnen ziehen sich mit ihren Beinen an die Brutoberfläche, drücken ihren warmen Thorax auf die Brutdeckel und verharren so für einige Minuten um mit der eigenen Körperwärme die Brut zu temperieren (Bujok et al. 2002). Wie erwartet korrelierte die Thoraxtemperatur einer Arbeiterin mit der Frequenz der abdominalen Atembewegungen, bei sehr hohen Thoraxtemperaturen (über 40°C) erreichten die Bienen Atemfrequenzen von über 8Hz. Eine weitere Methode die Brut effektiv zu wärmen übten Bienen aus, die leere Zellen im gedeckelten Brutbereich besuchen (Kleinhenz et al. 2003). Arbeiterinnen gingen dabei bevorzugt in Zellen, die von möglichst vielen gedeckelten Zellen umgeben waren. Sowohl die Dauer der Zellbesuche, als auch die mittlere Thoraxtemperatur bei Ein- und Austritt der Zelle korrelierten mit der Anzahl der benachbarten Brutzellen – je mehr Brutzellen eine leere Zelle in ihrer direkten Nachbarschaft hatte umso länger dauerte der Besuch einer Biene und umso höher ist die Ein- bzw. Austrittstemperatur der Biene. Mindestes 48 Stunden alte Bienen unterschieden sich signifikant in ihrem Wärmeverhalten von jüngeren Bienen. Tote gedeckelte Brut wurde in manchen Fällen über viele Tage (durchgehend bis 10 Tage) gewärmt, sie unterschied sich in ihrer Temperatur nicht von unbehandelter gedeckelter Brut. In weiteren Versuchen lag die Bruttemperatur von toter Brut zwar unter der eines Kontrollbereiches, die Temperatur lag aber weiterhin im optimalen Bereich von 33,5 bis 35°C (Groh et al. 2004). In diesen Versuchen wurde die tote Brut vor dem Einsetzen in den Beobachtungsstock wieder auf 35°C erwärmt. Wachskegel in gedeckelten Zellen wurden erkannt und ausgeräumt. Aktive Signale, die von der Brut ausgehen scheinen also nicht notwendig für die effektive Bruttemperaturregulierung zu sein. Untersuchungen mittels Laser-Doppler-Vibrometrie zeigten auch keine Hinweise auf eine mechanische Kommunikation zwischen den Puppen und den Arbeiterinnen. Das Brutwärmen scheint eine Aktion zu sein, die von den Bienen nur in Gemeinschaft sinnvoll durchgeführt werden kann. In einigen Fällen kam es während der Puppenphase zu unerklärlichen Abfällen in der Bruttemperatur, die nur durch einen positiven Rückkopplungseffekt seitens der Arbeiterinnen erklärt werden kann. Beim Brutwärmen spielen die Antennen der Arbeiterinnen wahrscheinlich eine wichtige Rolle. Während sich die Bienen beim aktiven Brutwärmen den Brutdeckel annähern sind die Antennenspitzen immer auf die Brutdeckel gerichtet. Fehlen den Arbeiterinnen die Antennen, dann ist die Thermoregulation eingeschränkt oder unzureichend. Die Bruttemperatur korreliert mit der Anzahl der abgetrennten Antennensegmente, je mehr Antennensegmente fehlen, desto weniger gut wird die Temperatur im Brutbereich hoch und konstant gehalten. Zusätzlich scheint es eine Lateralität in der Antennenfunktion zu geben, wurde die rechte Antenne gekürzt wärmten die Bienen die Brut signifikant schlechter, als beim Kürzen der linken Antenne. Durch das Kürzen der Antennen änderte sich auch das Verhalten der Tiere: Kontrollbienen verharrten ruhig im Brutbereich, während Bienen mit gekürzten Antennen teilweise ähnlich warm waren, aber nicht mehr das oben beschriebene aktive Brutwärmeverhalten zeigten. N2 - Honey bees (Apis mellifera carnica) precisely regulate brood temperature in a range between 33 to 35°C, as the development of the larvae, especially the capped brood stages are very sensitive to temperature changes. The heat used for thermoregulation in the brood area is not a by-product of work, but an active time and energy consuming task called brood heating behaviour: worker bees pull their warm thoraces towards the brood caps and remain in that position for about 10 minutes to transfer their body heat to the brood caps and the brood (Bujok et al. 2002). As expected, thoracic temperatures of bees correlated with frequency of abdominal breathing movements; bees with high thoracic temperatures (above 40°C) showed abdominal movements of up to slightly over 8Hz. Honey bee workers use empty cells neighbouring the capped brood cells for brood heating (Kleinhenz et al. 2003). Therefore, bees preferred visiting cells neighboured by numerous brood cells. Both duration of cell visits and thoracic temperature of the bee correlated with the number of neighboured brood cells. Older bees (at least 48h) showed significantly higher thoracic temperatures than younger bees (up to 48h old) immediately before and after their cell visits. Dead capped brood were heated over several days and showed equivalent temperatures to living brood warmed by worker bees. In other cases, the brood temperature was lower, but still in the optimal temperature range of 33.5 to 35°C (Groh et al. 2004). In the experiments, the dead brood was killed by cold then warmed up again to 35°C before putting it into the observation hive. Capped brood cells filled with wax dummies were not heated and immediately cleared out. Mechanical signals from the brood seemed not to be important for the brood heating behaviour of the worker bees; observations with laser-vibrometry showed no signals coming from the brood demanding thermoregulation. The antennae of the bees seem to be very important for effective brood heating, since during brood heating behaviour the antennae point to the capped brood surface. Worker bees with shortened antennae showed inferior brood heating behaviour, while brood temperature correlated with number of missing antenna segments. Additionally, the effectiveness of brood heating seems to be linked to a underlying laterality of the antennas function, when parts of the right antenna were amputated, brood heating was worse than when parts of the left antenna were amputated. With the amputation of the antenna the behaviour of the bees changed: control bees remained very quiet in the capped brood area, while bees with amputated antenna with similarly warm thoraces did not show the typical brood heating behaviour anymore. In some observations brood temperature dropped for some hours and increased again in a way that can only be explained by positive feedback of brood heating of the worker bees. Brood heating appears to be a collective action. KW - Biene KW - Brutbiologie KW - Thermoregulation KW - Honigbiene KW - Temperaturregulierung KW - Brut KW - Thermographie KW - honey bee KW - temperature regulation KW - brood KW - thermography Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15903 ER - TY - THES A1 - Basile, Rebecca T1 - Thermoregulation and Resource Management in the Honeybee (Apis mellifera) T1 - Thermoregulation und Ressourcenmanagment bei der Honigbiene (Apis mellifera) N2 - Ein grundlegender Faktor, der für das Überleben einer Kolonie sozialer Insekten ausschlaggebend ist, liegt in der Fähigkeit Nahrung durch sogenannte „Trophallaxis“ auszutauschen. Diese Fütterungskontakte sorgen für die gleichmäßige Verteilung der Nahrung innerhalb der Kolonie und werden als einer der Grundpfeiler der Sozialität der Staatenbildenden Insekten erachtet. Im Fall der Honigbienen finden diese Kontakte in vollkommener Dunkelheit statt. Damit es in dieser Situation überhaupt zum Nahrungsaustausch kommen kann, sind die Antennen von großer Wichtigkeit. Ein erster Schritt in den Verhaltensweisen, die der Rezipient eines trophallaktischen Kontaktes zeigt, ist der Kontakt einer Antennenspitze mit den Mundwerkzeugen des Donoren, da sich dort die regurgitierte Nahrung befindet. Diese Berührung hat aufgrund der gustatorischen Sensibilität der Antenne den Zweck, das angebotene Futter zu „erschmecken“. Die rechte Antenne wird vom Rezipienten eines trophallaktischen Kontakts signifikant häufiger eingesetzt als die linke Antenne. Die Präferenz für die rechte Antenne bleibt dabei auch erhalten, wenn ein Teil der Antennengeisel abgetrennt wurde, also die sensorischen Fähigkeiten der rechten Antenne stark beeinträchtigt wurden. Der Grund für die Präferenz der rechten Antenne könnte ihrer erhöhten Sensibilität gegenüber Zuckerwasser zugrunde liegen, da die rechte Antenne im Laborversuch signifikant stärker auf Stimulationen mit Zuckerwasser verschiedener Konzentrationen reagierte als die linke. Trophallaktische Kontakte sichern Individuen innerhalb einer Kolonie den Zugang zur lebenswichtigen Nahrung. Im Beispiel der Honigbienen ist ständige Zugriff auf Nahrung besonders wichtig, da es sich um ein heterothermes Tier handelt, das die Fähigkeit besitzt, aktiv seine Körpertemperatur zu regulieren. Obgleich jedes Individuum in der Lage ist, seine Körpertemperatur den eigenen Bedürfnissen anzupassen, ist diese Fähigkeit streng durch den in der Nahrung aufgenommenen Zucker reguliert. Im Gegensatz zu den Säugetieren oder Vögeln, die für eine Erhöhung des Blutzuckerspiegels auch auf Fett- oder Eiweißressourcen zurückgreifen können, ist die Honigbiene auf die Glucose aus der aufgenommenen Nahrung angewiesen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass der Zuckergehalt der aufgenommenen Nahrung positiv mit der Thoraxtemperatur der Bienen korreliert. Dieser Zusammenhang tritt auf, selbst wenn keine Wärmeerzeugung für die Brutpflege oder für das Erwärmen der Wintertraube notwendig ist und die Tiere außerhalb des Stockes ohne eigentliche Notwendigkeit für die Wärmeerzeugung in einem Käfig gehalten werden. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen, dass die Rezipienten beim Nahrungsaustausch eine signifikant höhere Thoraxtemperatur haben als die Donoren. Außerdem zeigen die Rezipienten nach der Fütterung signifikant häufiger Brutwärmeverhalten als die Donoren. Letztere haben eine signifikant niedrigere Thoraxtemperatur als die Rezipienten und zeigen eine Verhaltenstendenz, häufig zwischen Brutbereich und Honiglager hin- und her zu pendeln. Dabei nehmen sie im Honiglager Honig in ihren Kropf auf und füttern mit dieser Nahrung danach Bienen im Brutbereich. Außerdem zeigen die Ergebnisse, dass es einen wärmegesteuerten Auslösemechanismus gibt, der den Donoren und Rezipienten des trophallaktischen Kontakts dazu verhilft, trotz der Dunkelheit des Stocks praktisch verzögerungsfreie Nahrungsübertragung am Ort des höchsten Energieverbrauchs zu gewährleisten. Das Hervorwürgen von Nahrung angesichts einer Wärmequelle könnte seinen Ursprung in einer Beschwichtigungsgeste haben. Aggressive Tiere zeigen neben sichtbaren aggressiven Verhalten auch durch ihre erhöhte Körpertemperatur, dass sie bereit sind sich auf einen Kampf einzulassen. Die Temperaturerhöhung eines aggressiven Tieres beruht dabei auf der erhöhten Muskelaktivität, die vor allem bei Insekten dazu nötig ist, einen entsprechende Reaktion im Falle eines Kampfes oder der Flucht zeigen zu können. Wird ein Individuum mit Aggression konfrontiert, so bleibt ihm die Wahl sich auf einen Kampf einzulassen, zu flüchten oder durch eine Beschwichtigungsgeste eine Deeskalation der Situation einzuleiten. Besonders häufig wird für diesen Zweck Nahrung regurgitiert und dem dominanteren Tier angeboten, um einem Konflikt aus dem Weg zu gehen. Die Fähigkeit, Arbeiterinnen mit kleinen Portionen konzentrierter Nahrung zu versorgen trägt zu einer ökonomischen Verteilung der Ressourcen bei, die mit den physiologischen Bedürfnissen der Honigbienen konform geht und die ökologischen Erfordernisse des Stockes erfüllt. Das daraus resultierende Managementsystem, welches sparsam mit den Ressourcen haushaltet und auf die individuellen Bedürfnisse jeder einzelnen Biene einzugehen vermag, könnte ein Grund für die Fähigkeit der Honigbienen zur Entwicklung mehrjähriger Kolonien sein, die, anders als Hummeln oder Wespen, auch den Winter in gemäßigten Zonen als Gemeinschaft zu überstehen vermögen. N2 - Like many other social insect societies, honeybees collectively share the resources they gather by feeding each other. These feeding contacts, known as trophallaxis, are regarded as the fundamental basis for social behavior in honeybees and other social insects for assuring the survival of the individual and the welfare of the group. In honeybees, where most of the trophallactic contacts are formed in the total darkness of the hive, the antennae play a decisive role in initiation and maintenance of the feeding contact, because they are sensitive to gustatory stimuli. The sequences of behaviors performed by the receiver bees at the beginning of a feeding contact includes the contact of one antenna with the mouthparts of a donor bee where the regurgitated food is located. The antennal motor action is characterized by behavioral asymmetry, which is novel among communicative motor actions in invertebrates. This preference of right over left antenna is without exception even after removal of the antennal flagellum. This case of laterality in basic social interaction might have its reason in the gustatory asymmetry in the antennae, because the right antenna turns out to be significantly more sensitive to stimulation with sugar water of various concentrations than the left one. Trophallactic contacts which guarantee a constant access to food for every individual in the hive are vitally important to the honeybee society, because honeybees are heterothermic insects which actively regulate their thoracic temperature. Even though the individual can regulate its body temperature, its heating performance is strictly limited by the amount of sugar ingested. The reason for this is that honeybees use mostly the glucose in their hemolymph as the energy substrate for muscular activity, and the heat producing flight muscles are among the metabolically most active tissues known. The fuel for their activity is honey; processed nectar with a sugar content of ~80% stored in the honeycomb. The results show that the sugar content of the ingested food correlates positively with the thoracic temperature of the honeybees even if they are caged and show no actual heating-related behavior as in brood warming or heating in the centre of the winter cluster. Honeybees actively regulate their brood temperature by heating to keep the temperature between 33 °C to 36 °C if ambient temperatures are lower. Heating rapidly depletes the worker’s internal energy; therefore the heating performance is limited by the honey that is ingested before the heating process. This study focused on the behavior and the thoracic temperature of the participants in trophallactic food exchanges on the brood comb. The brood area is the centre of heating activity in the hive, and therefore the region of highest energy demand. The results show that the recipients in a trophallactic food exchange have a higher thoracic temperature during feeding contacts than donors, and after the feeding contact the former engage in brood heating more often. The donor bees have lower thoracic temperature and shuttle constantly between honey stores and the brood comb, where they transfer the stored honey to heating bees. In addition, the results show a heat-triggered mechanism that enables donor and recipient to accomplish trophallactic contacts without delay in the total darkness of the hive in the brood area as the most energy consuming part of the hive. Providing heat-emitting workers with small doses of high performance fuel contributes to an economic distribution of resources consistent with the physiological conditions of the bees and the ecological requirements of the hive, resulting in a highly economical resource management system which might be one of the factors favouring the evolution of perennial bee colonies in temperate regions. The conclusion of these findings suggests a resource management strategy that has evolved from submissive placation behavior as it is seen in honeybees, bumblebees and other hymenopterans. The heat-triggered feedback mechanism behind the resource management of the honeybee´s thermoregulatory behavior reveals a new aspect of the division of labor and a new aspect of communication, and sheds new light on sociality in honeybees. KW - Biene KW - Thermoregulation KW - Ressourcenmanagement KW - Sozialität KW - Hautflügler KW - Honeybee KW - Thermoregulation KW - Resource Managment KW - Sociality KW - Hymenoptera Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39793 ER - TY - THES A1 - Willmes, Christoph T1 - Therapie kutaner Tumoren : Identifizierung molekularer Biomarker der ex vivo Chemosensitivität des malignen Melanoms und Evaluierung der Wirkungsweise von Interferonen und Artemisininen auf das Merkelzellkarzinom T1 - Treatment of cutaneous tumors N2 - Für Patienten mit malignem Melanom im Stadium der Fernmetastasierung gibt es bis heute lediglich Therapieoptionen mit sehr eingeschränkten Erfolgsaussichten. Diese Tatsache bestätigt die Notwendigkeit von Biomarkern zur Vorhersage des Erfolgs verschiedener Therapien. Der ATP-basierende ex vivo Chemosensitivitätsassay hat sich als erfolgreiche Methode zur individuellen Vorhersage eines Chemotherapieerfolgs herausgestellt. Tatsächlich zeigte der Assay ein heterogenes Sensitivitätsprofil gegen verschiedene Chemotherapeutika und ließ in getesteten Patienten ein ex vivo wirksames Chemotherapieregime identifizieren, das anschließend auch klinische Therapieerfolge bei Verwendung der Therapie mit dem besten individuellen Chemosensitivitätsindex(BICSI) zeigte. Um diesen sehr aufwendigen Assay zukünftig zu umgehen, sollten in der vorliegenden Arbeit prädiktive molekulare Biomarker der Chemosensitivität identifiziert werden. Hierfür wurden im Voraus durch einen Microarray die Kandidaten Secernin 1 (SCRN1), Lysyl oxidaselike 1 (LOXL1), Thymosin beta 4 X-linked (TMSB4X), Vesicle-associated membrane protein 5 (VAMP5) und Serine protease inhibitor B1 (SERPINB1) als differentiell exprimierte Gene in chemosensitivem gegenüber chemoresistentem Gewebe identifiziert. Die relative Expression dieser Kandidatengene wurde daraufhin in bis zu 128 verschiedenen Melanomgeweben mit dem Chemosensitivitätsindex verschiedener Chemotherapeutika korreliert. Hierbei konnte eine signifikante Korrelation zwischen SerpinB1 mit der Chemosensitivität gegenüber der Therapiekombination mit Paclitaxel und Cisplatin auf Gen- aber nicht auf Proteinebene identifiziert werden. Weiterhin konnte eine differentielle Expression ebenfalls in chemosensitiven und -resistenten Melanomzelllinien nachgewiesen werden, die allerdings im Vergleich mit dem analysierten Gewebe in gegensätzlicher Richtung verlief. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass SerpinB1 ein vielversprechender Marker für die Chemosensitivität gegenüber Paclitaxel und Cisplatin ist, dessen funktionelle Bedeutung aber unklar bleibt. Das Merkelzellkarzinom (MCC) ist ein seltener und hoch aggressiver Tumor der mit dem Merkelzellpolyomavirus (MCV) in Zusammenhang steht. Da MCC Zelllinien zur Aufrechterhaltung ihrer Viabilität die MCV T-Antigene benötigen, könnte der Einsatz von Interferonen (IFN) ein möglicher therapeutischer Ansatz zur Behandlung dieser Krebserkrankung sein. In der vorliegenden Arbeit haben wir daher die Effekte von IFNs auf MCC Zelllinien, mit besonderer Berücksichtigung der MCV+ Linien, untersucht. IFNs vom Typ I (hier Multiferon, ein Mix verschiedener IFN α Subtypen, und IFN β) wirkten stark inhibierend auf die zelluläre Viabilität. Die Zellzyklusanalyse zeigte eine Erhöhung des sub-G Anteils der Zellen nach Behandlung mit IFN, was auf Apoptose als ausschlagebenden Grund schließen ließ. Diese Effekte waren für die Behandlung mit IFN β weniger stark ausgeprägt. Der inhibitorische Effekt von Typ I IFNs auf MCV+ MCC Zelllinien war assoziiert mit einer verringerten Expression des viralen großen T-Antigens (LTA) und einer Erhöhung in der Expression von promyelocytic leukemia protein (PML), das dafür bekannt ist, die Funktion des LTA störend zu beeinflussen. Zusätzlich führte die intratumorale Anwendung von Multiferon in vivo zu einer Regression im Wachstum von MCV+, aber nicht MCV- MCC Xenotransplantaten. Die Ergebnisse zeigen das Typ I IFNs einen starken antitumoralen Effekt haben, der zum Teil durch die Regulierung des LTA herbeigeführt wird. Neben diesen direkten Effekten der IFNs auf die Zellproliferation induzieren diese auch die Expression von MHC Klasse I Molekülen in MCC Zelllinien. Die Durchflusszytometrie zeigte eine Induktion der MHC Klasse I Expression in drei MHC I negativen MCC Zelllinien und eine Erhöhung der Expression, die vor der Behandlung eine geringe Menge an MHC I aufwiesen. Diese Effekte konnten auch in den in vivo Xenotransplantaten beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit IFN sowohl direkte als auch indirekte Effekte auf das MCC hat und eine breite Anwendung in Patienten mit MCV+ und MCV- Tumoren finden kann. Neben IFNs sind auch Artemisinin und seine Derivate bekannt für ihre antitumoralen und antiviralen Eigenschaften. Daher haben wir den Effekt des Artemisininderivats Artesunate auf MCV+ und MCV- MCC Zelllinien getestet. Tatsächlich konnten wir auch hier einen antiproliferativen Effekt des Stoffes nachweisen, der stärker auf MCV+ als auf MCV- Zelllinien wirkte und bei ersteren wiederum mit einer reduzierten LTA Expression einherging. Im Vergleich dazu blieben Fibroblasten von der Behandlung unbeeinflusst. Das verringerte Tumorwachstum konnte ebenfalls für in vivo Xenotransplantationsmodelle gezeigt werden. Auf Grundlage dieser Erkenntnis sollte eine genauere Untersuchung dieses alten Naturheilstoffes für die Behandlung von MCC Patienten in Betracht gezogen werden. N2 - For melanoma patients with distant metastases all available therapeutic options demonstrate only very limited efficacy up to date. This fact substantiates the need of predictive markers for therapy response. For example, ex-vivo chemosensitivity testing by an ATP-based luminescence assay is a promising tool to predict the individual outcome of different chemotherapy regimens. Indeed, this assay demonstrates a heterogeneous chemosensitivity against different cytotoxic drugs which correlates with chemotherapy outcome in terms of therapy response and overall survival; for the treatment of the patient the drug with the best individual chemosensitivity index(BICSI) is used. To circumvent this elaborate assay in the future, we want to identify and characterize predictive molecular biomarkers of specific chemosensitivity. Initially, predictive biomarker aspirants were identified by a microarray comparing chemosensitive and chemoresistant melanoma cell lines. To this end, we found Secernin 1 (SCRN1), Lysyl oxidaselike 1 (LoxL1), Thymosin beta 4 X-linked (TMSB4X), Vesicleassociated membrane protein 5 (Vamp 5) and Serine protease inhibitor B1 (SerpinB1) as differential expressed in chemosensitive versus chemoresistant melanoma cells. Furthermore, we correlated the relative expression of our candidates with the chemosensitivity index of different chemotherapy regimes in up to 128 melanoma tissues so far. Importantly, we found a significant correlation between SerpinB1 gene but not protein expression and chemosensitivity towards Paclitaxel and Platin. Moreover, we also detected a differential expression of SerpinB1 in melanoma cell lines which however was running in reverse direction compared to the analyzed tissues. In conclusion, SerpinB1 seems to be a promising biomarker for prediction of Paclitaxel and Platin chemosensitivity. Merkel cell carcinoma (MCC) is a rare and highly aggressive skin cancer associated with the Merkel cell polyomavirus (MCV). As MCC cell lines demonstrate oncogene addiction to the MCV T-antigens, pharmacological interference of the large T-antigen(LTA) may represent an effective therapeutic approach for this deadly cancer. In this study, we investigated the effects of interferons (IFNs) on MCC cell lines, especially on MCV positive (MCV+) lines. Type I IFNs (i.e. Multiferon, a mix of different IFN α subtypes, and IFN β) strongly inhibited the cellular viability. Cell cycle analysis demonstrated increased sub-G fractions for these cells upon IFN treatment indicating apoptotic cell deathν these effects were less pronounced for IFN β. Notably, this inhibitory effect of type I IFNs on MCV+ MCC cell lines was associated with a reduced expression of the MCV LTA as well as an increased expression of promyelocytic leukemia protein (PML), which is known to interfere with the function of the LTA. In addition, the intra-tumoural application of multiferon resulted in a regression of MCV+ but not MCV- MCCs in vivo. Together, our findings demonstrate that type I IFNs have a strong antitumour effect, which is at least in part explained by modulation of the virally encoded LTA. Moreover, in addition to directly affecting MCC cell proliferation, IFNs strongly reinduce MHC class I expression in MCC cells. Flowcytometry demonstrated a re-induction of MHC class I expression upon IFN treatment in three MHC class I- MCV+ cell lines and an increase in MHC class I expression in cell lines that were characterized by a weak expression prior to treatment. Importantly, the increase or induction of MHC class I expression could also be demonstrated in vivo in xenotransplantation models. These results imply that IFN treatment has both a direct and an indirect effect in MCC and should be applicable in a general manner, i.e. irrespective of the MCV status of the patient. Beside IFN, Artemisinins are also known for their antitumoral and antiviral properties. In consequence, we tested the effect of Artesunate, i.e., an Artemisinin drivate, on MCV+ and MCV- MCC cell lines. In this regard, we could demonstrate an antiproliferative effect which was stronger on MCV+ cell lines, and which was associated with a reduced expression of the viral LTA. In contrast, fibroblasts were uneffected by Artenusate treatment. The reduced tumor growth could also be shown in vivo by intra-tumoral injection of Artesunate in MCV+ xenotransplantation models. According to these findings, a more detailed investigation of this ancient natural drug for the treatment of MCC patients should be considered. KW - Interferon KW - Melanom KW - Qinghaosu KW - Chemosensitivität KW - Merkelzellkarzinom KW - Chemosensitivity KW - Merkel cell carcinoma KW - Merkel-Zellkarzinom Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83470 ER - TY - THES A1 - Jenett, Arnim T1 - The Virtual Insect Brain Protocol : development and application of software for the standardization of neuroanatomy T1 - Das Virtual Insect Brain Protocol N2 - Since the fruit fly Drosophila melanogaster entered the laboratories as a model organism, new genetic, physiological, molecular and behavioral techniques for the functional analysis of the brain rapidly accumulated. Nowadays this concerted assault obtains its main thrust form Gal4 expression patterns that can be visualized and provide the means for manipulating -in unrestrained animals- groups of neurons of the brain. To take advantage of these patterns one needs to know their anatomy. This thesis describes the Virtual Insect Brain (VIB) protocol, a software package for the quantitative assessment, comparison, and presentation of neuroanatomical data. It is based on the 3D-reconstruction and visualization software Amira (Mercury Inc.). Its main part is a standardization procedure which aligns individual 3D images (series of virtual sections obtained by confocal microscopy) to a common coordinate system and computes average intensities for each voxel (volume pixel). The VIB protocol facilitates direct comparison of gene expression patterns and describes their interindividual variability. It provides volumetry of brain regions and helps to characterize the phenotypes of brain structure mutants. Using the VIB protocol does not require any programming skills since all operations are carried out at a (near to) self-explanatory graphical user interface. Although the VIB protocol has been developed for the standardization of Drosophila neuroanatomy, the program structure can be used for the standardization of other 3D structures as well. Standardizing brains and gene expression patterns is a new approach to biological shape and its variability. Using the VIB protocol consequently may help to integrate knowledge on the correlation of form and function of the insect brain. The VIB protocol provides a first set of tools supporting this endeavor in Drosophila. The software is freely available at http://www.neurofly.de. N2 - Seitdem die Taufliege Drosophila melanogaster als Modellorganismus Einzug in die Forschung erhalten hat, sammeln sich mehr und mehr genetische, physiologische und molekulare Techniken für die Funktionsanalyse des Gehirns an. Diese beruhen heutzutage meist auf Gal4 Expressionsmustern, die sichtbar gemacht werden können und eine gezielte Manipulierung von definierten Zellgruppen ermöglichen. Um Ergebnisse verschiedener Untersuchungen miteinander in Beziehung setzen zu können, muss man jedoch die typische Anatomie der zugrunde liegenden Expressionsmuster kennen. Diese Arbeit beschreibt das Virtual Insect Brain (VIB) Protokoll, eine Software für die Darstellung, die quantitative Einschätzung und den Vergleich von neuroanatomischen Daten, sowie einige exemplarische Anwendungen des VIB Protokolls. Die Software basiert auf der 3D-Rekonstruktions- und der Visualisierungs-Software Amira (Mercury Inc.). Sein Hauptbestandteil ist ein Normierungverfahren, das 3D-Bild-Stapel (Folgen virtueller Schnittbilder, erhalten durch konfokale Mikroskopie) auf ein gemeinsames Koordinatensystem abbildet und für jedes Voxel (dreidimensionaler Bildpunkt) die durchschnittliche Intensität berechnet. Das VIB Protokoll erleichtert dadurch den direkten Vergleich von Expressionsmustern und beschreibt ihre interindividuelle Variabilität. Es liefert volumetrische Messungen zu definierten Gehirnregionen und hilft, die durch Mutation entstehenden Veränderungen der Gehirnstruktur zu erkennen. Das Verwenden des VIB Protokolls erfordert keinerlei Programmierkenntnisse, da alle Vorgänge auf einer selbsterklärenden graphischen Benutzeroberfläche ausgeführt werden können. Obgleich das VIB Protokoll für die Normierung der Neuroanatomy von Taufliegen entwickelt worden ist, kann die Programmstruktur auch für die Normierung anderer 3D-Strukturen benutzt werden. Gehirne und Expressionsmuster zu standardisieren ist ein neuer Ansatz die Variabilität der Neuroanatomie zu hinterfragen. Bei konsequenter Verwendung kann das VIB Protokoll helfen Wissen über Form und Funktion des Insektengehirns zu miteinander zu vernetzen. Das VIB Protokoll liefert einen ersten Satz Werkzeuge, die diese Bemühung in der Taufliege ermöglichen. Die Software kann kostenfrei von http://www.neurofly.de herunter geladen werden. KW - Taufliege KW - Gehirn KW - Neuroanatomie KW - Software KW - Drosophila melanogaster KW - Standardgehirn KW - Neuroanatomie KW - VIB KW - standardization KW - software Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22297 ER - TY - THES A1 - Spohn, Gunther T1 - The transcriptional control of virulence gene expression in Helicobacter pylori T1 - Die transkriptionelle Kontrolle der Virulenzgenexpression in Helicobacter pylori N2 - The Gram-negative, spiral-shaped, microaerophilic bacterium Helicobacter pylori is the causative agent of various disorders of the upper gastrointestinal tract, such as chronic superficial gastritis, chronic active gastritis, peptic ulceration and adenocarcinoma. Although many of the bacterial factors associated with disease development have been analysed in some detail in the recent years, very few studies have focused so far on the mechanisms that regulate expression of these factors at the molecular level. In an attempt to obtain an overview of the basic mechanisms of virulence gene expression in H. pylori, three important virulence factors of this pathogen, representative of different pathogenic mechanisms and different phases of the infectious process, are investigated in detail in the present thesis regarding their transcriptional regulation. As an essential factor for the early phase of infection, including the colonisation of the gastric mucosa, the flagella are analysed; the chaperones including the putative adhesion factors GroEL and DnaK are investigated as representatives of the phase of adherence to the gastric epithelium and persistence in the mucus layer; and finally the cytotoxin associated antigen CagA is analysed as representative of the cag pathogenicity island, which is supposed to account for the phenomena of chronic inflammation and tissue damage observed in the later phases of infection. RNA analyses and in vitro transcription demonstrate that a single promoter regulates expression of cagA, while two promoters are responsible for expression of the upstream divergently transcribed cagB gene. All three promoters are shown to be recognised by RNA polymerase containing the vegetative sigma factor sigma 80. Promoter deletion analyses establish that full activation of the cagA promoter requires sequences up to -70 and binding of the C-terminal portion of the alpha subunit of RNA polymerase to an UP-like element located between -40 and -60, while full activation of the major cagB promoter requires sequences upstream of -96 which overlap with the cagA promoter. These data suggest that the promoters of the pathogenicity island represent a class of minimum promoters, that ensure a basic level of transcription, while full activation requires regulatory elements or structural DNA binding proteins that provide a suitable DNA context. Regarding flagellar biosynthesis, a master transcriptional factor is identified that regulates expression of a series of flagellar basal body and hook genes in concert with the alternative sigma factor sigma 54. Evidence is provided that this regulator, designated FlgR (for flagellar regulatory protein), is necessary for motility and transcription of five promoters for seven basal body and hook genes. In addition, FlgR is shown to act as a repressor of transcription of the sigma 28-regulated promoter of the flaA gene, while changes in DNA topology are shown to affect transcription of the sigma 54-regulated flaB promoter. These data indicate that the regulatory network that governs flagellar gene expression in H. pylori shows similarities to the systems of both Salmonella spp. and Caulobacter crescentus. In contrast to the flagellar genes which are regulated by three different sigma factors, the three operons encoding the major chaperones of H. pylori are shown to be transcribed by RNA polymerase containing the vegetative sigma factor sigma 80. Expression of these operons is shown to be regulated negatively by the transcriptional repressor HspR, a homologue of a repressor protein of Streptomyces spp., known to be involved in negative regulation of heat shock genes. In vitro studies with purified recombinant HspR establish that the protein represses transcription by binding to large DNA regions centered around the transcription initiation site in the case of one promoter, and around -85 and -120 in the case of the the other two promoters. In contrast to the situation in Streptomyces, where transcription of HspR-regulated genes is induced in response to heat shock, transcription of the HspR-dependent genes in H. pylori is not inducible with thermal stimuli. Transcription of two of the three chaperone encoding operons is induced by osmotic shock, while transcription of the third operon, although HspR-dependent, is not affected by salt treatment. Taken together, the analyses carried out indicate that H. pylori has reduced its repertoire of specific regulatory proteins to a basic level that may ensure coordinate regulation of those factors that are necessary during the initial phase of infection including the passage through the gastric lumen and the colonisation of the gastric mucosa. The importance of DNA topology and/or context for transcription of many virulence gene promoters may on the other hand indicate, that a sophisticated global regulatory network is present in H. pylori, which influences transcription of specific subsets of virulence genes in response to changes in the microenvironment. N2 - Das Gram-negative, spiralförmige Bakterium Helicobacter pylori verursacht verschiedene Krankheiten des oberen Verauungstraktes, wie z.B. chronische superfizielle Gastritis, chronische aktive Gastritis, Ulzera und Magenkarzinom. Obwohl viele der bakteriellen Faktoren, die zur Entwicklung dieser Krankheitsformen beitragen, in den letzten Jahren untersucht wurden, sind die molekularen Mechanismen, die die Expression dieser Faktoren regulieren, noch weitgehend unbekannt. Als Ansatz zur Untersuchung der grundlegenden Mechanismen der Virulenzgenexpression in H. pylori wurden in der vorliegenden Arbeit drei wichtige Virulenzfaktoren repräsentativ für die verschiedenen Phasen des Infektionsprozesses ausgewählt und in Bezug auf ihre transkriptionelle Regulation analysiert. Als essentielle Faktoren für die frühe Phase der Infektion, gekennzeichnet durch die Erstbesiedelung der Schleimschicht des Magens durch die Bakterien, wurden die Flagellen untersucht. Die Chaperone-Proteine mit den mutmaßlichen Adhärenzfaktoren GroEL und DnaK wurden stellvertretend für die Phase der Adhäsion an die Magenepithelzellen und die anschließende persistente Besiedelung der Magenschleimhaut analysiert. Als Verteter der cag Pathogenitätsinsel, die mit großer Wahrscheinlichkeit für die chronische Entzündung und Schädigung des Magengewebes in den späteren Phasen der Infektion verantwortlich ist, wurde schließlich das sogenannte Cytotoxin-assoziierte Antigen CagA untersucht. RNA-Analysen und in vitro-Transkriptionsstudien konnten zeigen, daß die Transkription des cagA-Gens von einem einzigen Promotor aus gesteuert wird, während die Expression des stromaufwärts gelegenen divergenten cagB-Gens von zwei Promotoren reguliert wird. Alle drei Promotoren werden von der vegetativen, sigma 80-enthaltenden RNA-Polymerase erkannt. Durch die Einführung spezifischer Deletionen zwischen cagA und cagB konnte weiterhin gezeigt werden, daß zur vollständigen Aktivierung des cagA-Promoters Sequenzen bis -70 sowie die Bindung der alpha-Untereinheit der RNA-Polymerase an ein UP-ähnliches Element zwischen -40 und -60 erforderlich sind, während die vollständige Aktivierung des wichtigsten cagB-Promotors Sequenzen oberhalb von -96 erfordert, die mit denjenigen des cagA Promoters überlappen. Diese Daten lassen darauf schließen, daß die Promotoren der Pathogenitätsinsel eine Klasse von Minimalpromotoren darstellen, die ein geringes Niveau an Transkription garantieren, für ihre volle Aktivierung aber regulatorische Elemente oder strukturelle DNA-bindende Proteine benötigen, die ein spezielles topologisches Umfeld produzieren. Bezüglich der Flagellen konnte ein zentraler Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der in Kooperation mit dem alternativen Sigma-Faktor sigma 54 die Expression einer Serie von Genen kontrolliert, die für strukturelle Komponenten des Flagellenkörpers kodieren. Es konnte gezeigt werden, daß dieser Faktor (genannt FlgR für Flagellen-Regulator) für die Motilität der Bakterien notwendig ist und die Transkription von fünf Operonen reguliert, die für sieben strukturelle Gene des Flagellen-Basalkörpers und -Hakens kodieren. Darüberhinaus reprimiert FlgR die Transkription des sigma 28-regulierten flaA-Gens, während Änderungen der DNA-Topologie die Transkription des sigma 54-regulierten flaB-Promotors beeinflussen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß das regulatorische Netzwerk, welches die Expression der strukturellen Komponenten der Flagellen in H. pylori kontrolliert, Ähnlichkeiten zu den in Caulobacter crescentus und Salmonella spp. beschriebenen Systemen aufweist. Im Gegensatz zu den Flagellengenen, die von drei verschiedenen Sigma-Faktoren reguliert werden, konnte im Fall der drei Operone, die für die Haupt-Chaperone von H. pylori kodieren, eine sigma 80-abhängige Transkription nachgewiesen werden. Die Expression dieser Operone wird darüberhinaus negativ reguliert durch den transkriptionellen Repressor HspR, ein Homolog des gleichnamigen Hitzeschockrepressors von Streptomyces spp. In vitro-Experimente mit gereinigtem rekombinantem HspR konnten zeigen, daß das Protein die Transkription durch die Bindung an große DNA Regionen reprimiert, die in einem Fall mit dem Transkriptionsstart überlappen, und in den anderen beiden Fällen um -85 bzw. -120 lokalisiert sind. Im Gegensatz zur Situation in Streptomyces, wo die Transkription HspR-abhängiger Gene durch Hitzeschock induziert werden kann, ist die Transkription der HspR-regulierten Gene in H. pylori nicht mit Temperaturerhöhungen induzierbar. Die Expression zweier der drei Chaperone-kodierenden Operone kann dagegen durch osmotischen Schock induziert werden, während die Transkription des dritten Operons, trotz seiner HspR-Abhängigkeit, nicht durch osmotische Reize beeinflußbar ist. In ihrer Gesamtheit lassen die transkriptionellen Analysen der verschiedenen Virulenzfaktoren darauf schließen, daß H. pylori sein Repertoire an spezifischen regulatorischen Genen auf ein minimales Niveau reduziert hat, das die koordinierte Regulation derjenigen Faktoren sicherstellt, die für die Anfangsphase der Infektion, namentlich die Durchquerung des Magenlumens und die Erstbesiedelung des Magenepithels, notwendig sind. Die Bedeutung von DNA-Topologie und -Kontext für die Transkription vieler Virulenzgene könnte andererseits auf die Anwesenheit eines hochentwickelten globalen regulatorischen Netzwerkes hinweisen, welches die Transkription spezifischer Untergruppen von Virulenzgenen in Reaktion auf bestimmte Umweltfaktoren beeinflußt. KW - Helicobacter-pylori-Infektion KW - Virulenz KW - Genexpression KW - Helicobacter pylori KW - Transkription KW - Virulenzfaktoren KW - Flagellen KW - Pathogenitätsinsel KW - Chaperone KW - Helicobacter pylori KW - transcription KW - virulence factors KW - flagella KW - pathogenicity island KW - chaperones Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2334 ER - TY - THES A1 - Pusch, Tobias T1 - The transcription factor NFATc1 mediates cytotoxic T cell function in vitro and in vivo T1 - Der Transkriptionsfaktor NFATc1 vermittelt die Funktion von zytotoxischen T Zellen in vitro und in vivo N2 - While numerous experiments on NFAT were already performed with CD4+ T cells showing defective cytokine release and a reduced T helper cell development, no detailed studies existed for CD8+ T cells. From this point, we wanted to examine the impact of NFATc1 and c2 on the physiological functions of CD8+ T cells in vitro and in vivo. Therefore, we used a murine infection model with the bacteria Listeria monocytogenes and mice in which NFATc1 was specifically depleted in the T cell compartment. Our first in vitro studies showed a typical NFATc1 and c2 nuclear translocation and changes on mRNA levels upon T cell activation similarly in CD4+ as well as in CD8+ T cells extracted from wild type mice. NFAT nuclear translocation is important for target gene activation and generation of effector functions. Stimulated T cell populations lacking NFATc1 and/or NFATc2 showed a markedly decreased expression of Th1/Tc1 cytokines, as e.g. IL 2 and IFNγ being important for the clearance of intracellular pathogens. From our in vitro model for the generation of allogenically reactive cytotoxic CD8+ T cells, we revealed a decreased killing and lytic granule-release capacity in Nfatc1 inactivated CD8+ T cells whereas NFATc2-/- cytotoxic T cells did not show an altered cytotoxic response compared to wild type cells. Interestingly, we found lytic granules accumulated and mitochondria not getting translocated to the immunological synapse upon re-stimulation in NFATc1-deficient CD8+ T cells. Together with results showing the CsA insensitivity of the CTL killing/degranulation capacities, we assume that some major cellular processes are affected by NFATc1 which are not directly linked to the TCR-induced signal transduction cascade. We also showed the importance of NFATc1 in T cells during intracellular infections with the bacteria Listeria monocytogenes in an in vivo mouse model. After five days, only few bacteria were detected in wt mice whereas high amounts of Listeria particles were extracted from livers of Nfatc1fl/fl x Cd4 cre mice. Although the reactivity towards the pathogen was similar in both groups, a decreased cytokine expression in NFATc1-/- CD8+ T cells was observed together with an altered memory cell generation. Our results show the importance of NFATc1 in CD8+ T cells and give some clue for a possible connection to other basal cellular functions, as e.g. the formation of an immunological synapse. N2 - Viele Experimente zur Rolle von NFAT wurden bereits anhand von CD4+ T Zellen durchgeführt und zeigten eine veränderte Zellphysiologie. Hingegen wurden CD8+ T Zellen diesbezüglich noch nicht intensiv studiert. Deshalb untersuchten wir den Einfluss von NFATc1 und NFATc2 auf die Funktion von CD8+ T Zellen in vitro und in vivo anhand des murinen Infektionsmodells mit dem Bakterium Listeria monocytogenes. Für die Versuche benutzen wir Mäuse, in denen das Protein NFATc1 spezifisch im T Zellkompartiment entfernt wurde. Erste Ergebnisse zeigten eine typische Translokation von NFATc1 und NFATc2 in den Zellkern. Eine Veränderung in der mRNA Expression nach Aktivierung, sowohl in CD4+ T Zellen als auch in CD8+ T Zellen, fand ebenfalls statt. NFATc defiziente CD4+ und CD8+ T Zellen wiesen eine verminderte Expression von Th1/Tc1 Zytokinen wie z.B. Interleukin-2 und Interferon γ auf, welche für die Bekämpfung intrazellulärer Pathogene wichtig sind. In unserem in vitro Modell fanden wir eine verminderte Abtötungsfähigkeit und eine Reduktion in der Freisetzung lytischer Granula in NFATc1-/- CD8+ T Zellen wohingegen eine NFATc2 Defizienz keine Auswirkungen auf die Zytotoxizität - verglichen mit wildtypischen Zellen - aufweist. Interessanterweise fanden wir eine Anhäufung von lytischen Granula und eine verminderte intrazelluläre Migration von Mitochondrien nach Ausbildung einer immunologischen Synapse in NFATc1-/- CD8+ T Zellen. Zusammen mit den Ergebnissen unserer CsA-Inhibierungsversuche nehmen wir an, dass einige allgemeine zelluläre Prozesse von NFATc1 beeinflusst werden, die nicht direkt von der T Zellrezeptor-induzierten Signalkaskade abhängen. Anhand eines in vivo Mausmodells zeigten wir auch die wichtige Rolle von NFATc1 in T Zellen während der Infektion mit Listeria monocytogenes. Fünf Tage nach Infektion konnten aus Nfatc1fl/fl x Cd4 cre Mäusen mehr Bakterienpartikel extrahiert werden als aus wt Mäusen. Wie in den in vitro Versuchen konnte auch hier eine geringere Zytokinproduktion der CD8+ T Zellen festgestellt werden allerdings wiesen die Mäuse auch eine geringere Bildung von Gedächniszellen auf. Unsere Ergebnisse zeigen, dass NFATc1 in CD8+ T Zellen eine wichtige Rolle spielt und auch Auswirkungen auf grundlegendere zelluläre Funktionen, wie die Ausbildung einer immunologischen Synapse, hat. KW - Transkriptionsfaktor KW - Killerzelle KW - Antigen CD8 KW - Cytotoxizität KW - NFAT KW - CTL function KW - CD8 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123690 ER - TY - THES A1 - Hein, Silke T1 - The survival of grasshoppers and bush crickets in habitats variable in space and time T1 - Das Überleben von Heuschrecken in raum-zeitlich veränderlichen Habitaten N2 - Die zunehmende Nutzung von Landschaften führt zu einer steigenden Fragmentierung schützenswerter Flächen. Damit verbunden ist eine Zerschneidung von großen Populationen in Metapopulationen. In solchen Fällen bestimmt das Gleichgewicht zwischen Aussterben und Besiedlung von Habitaten die regionale Überlebenswahrscheinlichkeit von Arten. Um diese bestimmen, braucht man ein gutes Verständnis der Habitatansprüche der Arten, sowie Informationen über ihr Ausbreitungsverhalten. Ziel dieser Arbeit war es, geeignete Flächen für Heuschrecken in einer Landschaft identifizieren zu können, sowie einen Beitrag zur Quantifizierung der Erreichbarkeit einzelner Flächen durch Individuen zu leisten. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Quantifizierung der Habitateignung von Flächen für Heuschrecken. Dazu habe ich statistische Habitateignungsmodelle mittels logistischer Regression erstellt, evaluiert und validiert. Es zeigte sich, dass die Habitatwahl der Heuschrecken auf einer mittleren räumlichen Skalenebene erfolgt. Dies steht mit der beobachteten Ausbreitungsdistanz der Tiere im Einklang. Neben dem nur grob klassifizierten Landschaftsfaktor „Biotoptyp“ korrelieren vor allem strukturelle Faktoren sowie abiotische Faktoren mit dem Vorkommen der Heuschreckenarten. Bei der Bestimmung eines gemeinsamen Models für alle drei Heuschreckenarten erwies sich das Model der Art S. lineatus mit den Parametern Biotoptyp und Vegetationshöhe als am besten geeignet zur Vorhersage der Vorkommen der anderen Heuschreckenarten. Um zu testen, ob auch die Vorkommen von Arten unterschiedlicher Tiergruppen mittels eines gemeinsamen Modells vorhergesagt werden können, habe ich sowohl die Heuschreckenmodelle zur Prognose von Faltervorkommen getestet, als auch Modelle für Falter auf Heuschrecken übertragen. Dabei erwiesen sich die Heuschreckenmodelle zur Prognose der anderen Arten weniger geeignet als das Modell für das Widderchen Z. carniolica in das der Anteil an geeignetem Habitat sowie die Vorkommen der beiden Saugpflanzen C. jacea und S. columbaria einfließen. Diese Art wird als standorttreu eingestuft und repräsentiert damit auch die anderen Arten, die typisch für Säume und Halbtrockenrasen sind. Die erhöhte Mobilität von Z. carniolica im Vergleich zu den Heuschrecken garantiert gleichzeitig auch die Erreichbarkeit aller geeigneten Flächen im Gebiet und damit ein Modell, das nur unwesentlich durch Zufallseffekte bei der Besiedlung beeinflusst wird. Neben der Habitatqualität/-quantität spielt vor allem der Austausch zwischen Flächen eine entscheidende Rolle für das Überleben der Metapopulation. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich mich sowohl theoretisch als auch empirisch, mit dem Ausbreitungsverhalten von Heuschrecken beschäftigt. In Freilandexperimenten konnte ich zeigen, dass die Annahme eines dichotomen Bewegungsverhaltens für Heuschrecken in einer realen Landschaft nicht zutrifft. Vielmehr wird die Bewegung in einer Fläche besser als Kontinuum beschrieben das durch strukturelle Resistenz, Temperatur, Mortalitätsrisiko und Ressourcenverfügbarkeit bestimmt wird. Die jeweilige Kombination dieser Parameter veranlasst die Tiere dann zu einem entsprechenden Bewegungsmuster, das sich zwischen den beiden Extremen gerichteter und zufälliger Lauf bewegt. In Experimenten zum Grenzverhalten von Heuschrecken bestätigte sich dieses Ergebnis. Für verschiedene Grenzstrukturen konnte ich unterschiedliche Übertrittswahrscheinlichkeiten nachweisen. Weiterhin konnte ich feststellen, dass Heuschrecken geeignete Habitate aus einer gewissen Entfernung detektieren können. Da das Ausbreitungsverhalten von Tieren in theoretischen Modellen eine wichtige Rolle spielt, können diese empirischen Daten zur Parametrisierung dieser Modelle verwendet werden. Zusätzlich zum Einfluss des Laufmusters der Tiere auf die Erreichbarkeit geeigneter Habitate, zeigte sich in den von mir durchgeführten Simulationsstudien deutlich, dass der landschaftliche Kontext, in dem die Ausbreitung stattfindet, die Erreichbarkeit einzelner Habitate beeinflusst. Dieser Effekt ist zusätzlich abhängig von der Mortalitätsrate beim Ausbreitungsvorgang. Mit den Ergebnissen aus den Untersuchungen zur Habitateignung lassen sich die für Heuschrecken geeigneten Habitate in einer Landschaft identifizieren. Somit lässt sich die potentielle Eignung einer Fläche als Habitat, basierend auf Vorhersagen über die Änderung des Biotoptyps durch ein Managementverfahren, vorhersagen. Diese Information allein reicht aber nicht aus, um die regionale Überlebenswahrscheinlichkeit einer Art bestimmen zu können. Meine Untersuchungen zum Ausbreitungsverhalten zeigen deutlich, dass die Erreichbarkeit geeigneter Flächen von der räumlichen Anordnung der Habitate und der Struktur der Flächen, die zwischen Habitaten liegen, abhängt. Zusätzlich spielen individuenspezifische Faktoren wie Motivation und physiologische Faktoren eine ausschlaggebende Rolle für die Erreichbarkeit von geeigneten Flächen. N2 - The exploitation of landscapes increases fragmentation of valuable areas with high biodiversity. Consequently, many populations nowadays exist as metapopulations. In such cases, the balance between extinction and colonisation of patches determines the regional survival of species. To determine long term survival of species and to assess the impact of different management regimes proper knowledge of species habitat requirements as well as information on their dispersal behaviour is needed. The aim of this thesis was to develop methods and measures for the identification of suitable areas for grasshoppers and bush crickets, as well as to quantify the reachability of single patches by individuals. The first part of my work focuses on the quantification of habitat suitability for grasshoppers and bush crickets. Based on presence/absence data, I developed statistical habitat suitability models using logistic regression analyses. The resulting models are evaluated and validated in space and time. It turned out that habitat selection of the species mainly took place on an intermediate spatial scale. The relevant scale falls into the same range as the species’ mean dispersal distances. Besides the rather coarse grained factor ‘type of habitat’ structural factors as well as abiotic factors are correlated with the occurrence of the species. The model of S. lineatus, including the parameters ‘type of biotope’ and ‘vegetation height’ was most successful in predicting the occurrences of the bush cricket species. To further test whether the occurrence of species of different insect groups can be predicted with a common model, I tested the usefulness of the orthoptera models for the prediction of butterflies in the same region and vice versa. While transferability of the orthoptera models was poor, the model of the moth Z. carniolica performed quite successful. It included the proportion of suitable habitat as well as the occurrence of the two sucking plants C. jacea and S. columbaria as relevant factors. Z. carniolica is classified as stenoecious and thus represents other species typically found on fringes and mesoxerophytic grasslands. The high mobility of Z. carniolica simultaneously guarantees the reachability of regional suitable areas and thus ensures that the influence of the random effects of colonisation on the model are marginal. Unfortunately, the factors predicting habitat quality for a species are normally not available at the landscape level. Thus, they cannot be used for the prediction of occurrences without extensive censuses in the field. Nevertheless, my results show that the sole use of the variable ‘type of habitat’, which often is available landscape wide, will be sufficient for the classification of habitat suitability in a landscape. I conclude that for practical use in conservation biology the type of biotope can be used to predict occurrence of the studied species. Besides quality/quantity of suitable habitat, dispersal of individuals between patches is a key factor influencing the survival of populations. Thus, the second part of my work concentrates on theoretical as well as empirical studies on the dispersal behaviour of bush crickets. In field experiments I could show that the assumption of a dichotomous movement behaviour does not apply for bush crickets. Instead, movement pattern changes continuously with structural resistance, temperature, mortality risk and resource availability. This result is confirmed in my experiments on the behaviour of bush crickets at habitat borders. For different borders I could demonstrate different edge permeabilities. Additionally, I observed that grasshoppers could detect suitable habitat from a certain distance. Because the dispersal behaviour plays an important role in theoretical models, my empirical data can be used to parameterise such models. In addition to the influence of movement pattern on the reachability of suitable habitats, I could demonstrate, with simulation models, that the influence of the landscape context in which dispersal takes place has a critical impact on the exchange of individuals between patches. This effect is enhanced if mortality risk during dispersal is accounted for. The results from my studies on habitat suitability can be used to identify suitable habitat for grasshoppers and bush crickets in a landscape. Consequently, the potential suitability of an area as habitat, based on predictions on changes in the type of biotope by management regime, can be predicted. But this information alone is not sufficient to determine regional survival probability of a species. My investigations concerning the dispersal behaviour clearly show, that the reachability of suitable areas is dependent on the spatial configuration of patches and the structure of areas between habitats. Additionally, factors specific for individuals, like motivation and physiological factors play a crucial role for the reachability of suitable habitats. KW - Naturschutzgebiet Hohe Wann KW - Heuschrecken KW - Metapopulation KW - Ausbreitung KW - Heuschrecken KW - Habitateignungsmodelle KW - Insekten KW - metapopulation KW - dispersal KW - habitat suitability models KW - insects KW - crickets Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9140 ER - TY - THES A1 - Schindelin, Johannes T1 - The standard brain of Drosophila melanogaster and its automatic segmentation T1 - Das Standardgehirn von Drosophila melanogaster und seine automatische Segmentierung N2 - In this thesis, I introduce the Virtual Brain Protocol, which facilitates applications of the Standard Brain of Drosophila melanogaster. By providing reliable and extensible tools for the handling of neuroanatomical data, this protocol simplifies and organizes the recurring tasks involved in these applications. It is demonstrated that this protocol can also be used to generate average brains, i.e. to combine recordings of several brains with the same features such that the common features are emphasized. One of the most important steps of the Virtual Insect Protocol is the aligning of newly recorded data sets with the Standard Brain. After presenting methods commonly applied in a biological or medical context to align two different recordings, it is evaluated to what extent this alignment can be automated. To that end, existing Image Processing techniques are assessed. I demonstrate that these techniques do not satisfy the requirements needed to guarantee sensible alignments between two brains. Then, I analyze what needs to be taken into account in order to formulate an algorithm which satisfies the needs of the protocol. In the last chapter, I derive such an algorithm using methods from Information Theory, which bases the technique on a solid mathematical foundation. I show how Bayesian Inference can be applied to enhance the results further. It is demonstrated that this approach yields good results on very noisy images, detecting apparent boundaries between structures. The same approach can be extended to take additional knowledge into account, e.g. the relative position of the anatomical structures and their shape. It is shown how this extension can be utilized to segment a newly recorded brain automatically. N2 - In dieser Arbeit wird das Virtual Brain Protocol vorgestellt, das die Anwendungen rund um das Standardgehirn von \dm\ erleichtert. Durch das Bereitstellen robuster und erweiterbarer Werkzeuge zum Verarbeiten neuroanatomischer Datensätze ermöglicht es ein strukturiertes Abarbeiten der häufig benötigten Vorgänge im Zusammenhang mit der Arbeit mit dem Standardgehirn. Neben der Einpassung neuer Daten in das Standardgehirn kann dieses Protokoll auch dazu verwendet werden, sogenannte Durchschnittshirne zu erstellen; Aufnahmen mehrerer Hirne mit der gleichen zu zeigenden Eigenschaft können zu einem neuen Datensatz kombiniert werden, der die gemeinsamen Charakteristika hervorhebt. Einer der wichtigsten Schritte im Virtual Insect Protocol ist die Alignierung neuer Datensätze auf das Standardgehirn. Nachdem Methoden vorgestellt werden, die üblicherweise im biologischen oder medizinischen Umfeld angewendet werden, um Hirne aufeinander zu alignieren, wird evaluiert, inwiefern dieser Prozess automatisierbar ist. In der Folge werden diverse bildverarbeitende Methoden in dieser Hinsicht beurteilt. Es wird demonstriert, dass diese Verfahren den Anforderungen sinnvoller Alignierungen von Hirnen nicht genügen. Infolgedessen wird genauer analysiert, welche Umstände berücksichtigt werden müssen, um einen Algorithmus zu entwerfen, der diesen Anforderungen genügt. Im letzten Kapitel wird ein solcher Algorithmus mithilfe von Methoden aus der Informationstheorie hergeleitet, deren Verwendung das Verfahren auf eine solide mathematische Basis stellt. Es wird weiterhin gezeigt, wie Bayesische Inferenz angewendet werden kann, um die Ergebnisse darüber hinaus zu verbessern. Sodann wird demonstriert, daß dieser Algorithmus in stark verrauschten Bilddaten ohne zusätzliche Informationen Grenzen zwischen Strukturen erkennen kann, die mit den sichtbaren Grenzen gut übereinstimmen. Das Verfahren kann erweitert werden, um zusätzliche Informationen zu berücksichtigen, wie etwa die relative Position anatomischer Strukturen sowie deren Form. Es wird gezeigt, wie diese Erweiterung zur automatischen Segmentierung eines Hirnes verwendet werden kann. KW - Taufliege KW - Gehirn KW - Segmentierung KW - Bildverarbeitung KW - Drosophila KW - Segmentierung KW - Kantenerkennung KW - Statistik KW - Bildverarbeitung KW - Drosophila KW - segmentation KW - EdgeDetection KW - statistics KW - ImageProcessing Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15518 ER - TY - THES A1 - Chan, Gordon T1 - The Role of Vav-1, Vav-2 and Lsc in NK T cell development and NK cell cytotoxicity N2 - The hematopoietic-specific Rho-family GTP exchange factor (GEF) Vav-1 is a regulator of lymphocyte antigen receptor signaling and mediates normal maturation and activation of B and T cells. Recent findings suggest that Vav-1 also forms part of signaling pathways required for natural and antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) of human NK cells. In this study, I show that Vav-1 is also expressed in murine NK cells. Vav-1-/- mice had normal numbers of splenic NK cells, and these displayed a similar expression profile of NK cell receptors as cells from wild type mice. Unexpectedly, IL-2-activated Vav-1-/- NK cells retained normal ADCC. Fc-receptor mediated activation of ERK, JNK, and p38 was also normal. In contrast, Vav-1-/- NK cells exhibited reduced natural cytotoxicity against EL4, C4.4.25, RMA and RMA/S. Together, these results demonstrate that Vav-1 is dispensable for mainstream NK cell development, but is required for NK cell natural cytotoxicity. Vav-2, a protein homologous to Vav-1 has also been implicated in NK cell functions. However, NK cells from Vav-2-/- mice have normal cytotoxic activities and NK cells that lack both Vav-1 and Vav-2 exhibit similar defect as Vav-1-/- cells. Thus Vav-2 has no apparent function in the development and the activation of NK cells. Although NK cell development is normal in Vav-1-/- mice, their numbers of NKT cells were dramatically diminished. Furthermore, NKT cells from Vav-1 mutant mice failed to produce IL-4 and IFNg following in vivo CD3 stimulation. A similar loss of NKT cells was observed in Vav-1-/-Vav-2-/- mice, but not in Vav-2-/- mice, suggesting that only Vav-1, and not Vav-2, is an essential regulator of NKT cell development and NK cell cytotoxicity. Similar to Vav-1, Lsc is a Rho GEF that is expressed specifically in the hematopoietic system. It contains a regulator of G-protein signaling (RGS) domain which negatively regulates the Ga12 and Ga13 subunits of G-protein coupled receptors (GPCRs). This study shows that NK and NKT cell development are normal in Lsc-/- mice. However, NK cells from mutant mice display enhanced cytotoxic responses towards a panel of tumor cells. These data implicate for the first time a RGS-containing Rho GEF in cytotoxic responses and suggest that Lsc down-modulate NK cell activation. N2 - Vav-1 ist ein spezifisch in hämatopoetischen Zellen exprimierter Guanin-Nukleotid-Exchange-Faktor (GEF) für Rho-GTPasen, der die Antigenrezeptor-vermittelte Signaltransduktion in Lymphocyten reguliert und essentiell für der Reifung und Aktivierung von B- und T-Zellen ist. Untersuchungen an menschlichen Zellen lassen vermuten, dass Vav1 auch für Antikörper-unabhängige, natürliche Zytotoxizität und die Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytoxizität (ADCC) von „Natürlichen-Killerzellen“ (NK-Zellen) wichtig ist. In der vorliegenden Arbeit zeige ich, dass Vav-1 auch in murinen NK-Zellen exprimiert ist. Analysen von Vav-1-/--Mäuse zeigen eine normale Anzahl von NK-Zellen, die wiederum ein ähnliches Expressionsprofil von typischen NK-Zell-Rezeptoren im Vergleich zu wildtypischen Mäusen aufweisen. Die ADCC von Vav-1-/- NK-Zellen ist unverändert, wie auch die Fc-Rezeptor vermittelte Aktivierung von ERK, JNK und p38. Im Gegensatz dazu zeigen Vav-1-/- NK-Zellen eine reduzierte natürliche Cytotoxizität gegenüber EL4-, C4.4.25-, RMA- und RMA/S-Zielzellen. Vav-1 ist daher nicht für die Entwicklung, sondern für den Aufbau der natürlichen Cytotoxizität von NK-Zellen von Bedeutung. Für Vav-2 wurde ebenfalls eine Rolle in NK-Zellfunktionen wahrscheinlich gemacht. Dennoch zeigen Vav-2-/- Mäuse ein normales zytotoxisches Verhalten. NK-Zellen von Vav-1/Vav-2-doppeldefizienten Tieren weisen ähnliche Defekte wie NK-Zellen von Vav-1-defizienten Tieren. Somit besitzt Vav-2 keine entscheidende Funktion für die Entwicklung und Aktivierung von NK-Zellen. Im Gegensatz zu NK-Zellen ist die Anzahl der NKT-Zellen in Vav-1-/- Mäusen drastisch reduziert. Außerdem sind NKT-Zellen Vav-1-defizienter Mäuse nicht in der Lage IL-4 und INFg nach CD3-Stimulierung in vivo zu produzieren. Ein ähnlicher Verlust der NKT-Zell-Population wurde in Vav-1-/-- Vav-2-/--Mäusen beobachtet, nicht aber in Vav-2-/- Mäusen. Daher scheint nur Vav-1, nicht aber Vav-2, ein essentieller Regulator sowohl der NKT-Zell-Entwicklung als auch der NK-Zell-Cytotoxizität zu sein. Ein weiterer Rho-GEF, Lsc, ist ebenfalls spezifisch im hämatopoetischen System exprimiert. Lsc besitzt auch eine negativ-regulatorische RGS-Domäne (regulator of G-protein signaling) für die Ga12- und Ga13-Untereinheiten von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. NK- und NKT-Zellen von Lsc-defizienten Mäusen entwickeln sich normal, weisen aber eine erhöhte Cytotoxizität gegenüber einer Reihe von Tumor-Zellen auf. Diese Daten zeigen zum ersten mal die Beteiligung eines RGS-Rho-GEF an zytotoxischen Reaktionen und deuten auf eine negative Modulation der NK-Zell-Aktivierung durch Lsc hin. KW - Maus KW - Natürliche Killerzelle KW - Cytotoxizität KW - Vav KW - Lsc/p115 Rho GEF KW - NK cells KW - cytotoxicity KW - T cells Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3645 ER - TY - THES A1 - Blättner, Sebastian T1 - The role of the non-ribosomal peptide synthetase AusAB and its product phevalin in intracellular virulence of Staphylococcus aureus T1 - Die Rolle der nicht-ribosomalen Peptidsynthetase AusAB und ihres Produktes Phevalin in der intrazellulären Virulenz von Staphylococcus aureus N2 - Staphylococcus aureus is a prevalent commensal bacterium which represents one of the leading causes in health care-associated bacterial infections worldwide and can cause a variety of different diseases ranging from simple abscesses to severe and life threatening infections including pneumonia, osteomyelitis and sepsis. In recent times multi-resistant strains have emerged, causing severe problems in nosocomial as well as community-acquired (CA) infection settings, especially in the United States (USA). Therefore S. aureus has been termed as a superbug by the WHO, underlining the severe health risk originating from it. Today, infections in the USA are dominated by S. aureus genotypes which are classified as USA300 and USA400, respectively. Strains of genotype USA300 are responsible for about 70% of the CA infections. The molecular mechanisms which render S. aureus such an effective pathogen are still not understood in its entirety. For decades S. aureus was thought to be a strictly extracellular pathogen relying on pore-forming toxins like α-hemolysin to damage human cells and tissue. Only recently it has been shown that S. aureus can enter non-professional phagocytes, using adhesins like the fibronectin-binding proteins which mediate an endocytotic uptake into the host cells. The bacteria are consequently localized to endosomes, where the degradation of enclosed bacterial cells through phagosome maturation would eventually occur. S. aureus can avoid degradation, and translocate to the cellular cytoplasm, where it can replicate. The ability to cause this so-called phagosomal escape has mainly been attributed to a family of amphiphilic peptides called phenol soluble modulins (PSMs), but as studies have shown, they are not sufficient. In this work I used a transposon mutant library in combination with automated fluorescence microscopy to screen for genes involved in the phagosomal escape process and intracellular survival of S. aureus. I thereby identified a number of genes, including a non-ribosomal peptide synthetase (NRPS). The NRPS, encoded by the genes ausA and ausB, produces two types of small peptides, phevalin and tyrvalin. Mutations in the ausAB genes lead to a drastic decrease in phagosomal escape rates in epithelial cells, which were readily restored by genetic complementation in trans as well as by supplementation of synthetic phevalin. In leukocytes, phevalin interferes with calcium fluxes and activation of neutrophils and promotes cytotoxicity of intracellular bacteria in both, macrophages and neutrophils. Further ausAB is involved in survival and virulence of the bacterium during mouse lung pneumoniae. The here presented data demonstrates the contribution of the bacterial cyclic dipeptide phevalin to S. aureus virulence and suggests, that phevalin directly acts on a host cell target to promote cytotoxicity of intracellular bacteria. N2 - Staphylococcus aureus ist ein weit verbreitetes kommensales Bakterium, welches zugleich einer der häufigsten Verursacher von Krankenhausinfektionen ist, und eine Reihe verschiedener Krankheiten, angefangen bei simplen Abszessen, bis hin zu schweren Erkrankungen wie Lungenentzündung, Osteomylitis und Sepsis verursachen kann. Das Risiko durch nosokomiale sowie epidemische S. aureus Infektionen ist in den vergangenen Jahren weiter gestiegen. Dazu beigetragen hat das Auftreten multiresistenter und hoch cytotoxischer Stämme, vor allem in den USA. Als Konsequenz hat die WHO S. aureus inzwischen als „Superbug“ tituliert und als globales Gesundheitsrisiko eingestuft. Bei CA-Infektionen dominieren die Isolate der Klassifizierung USA300 und USA400, wobei den Erstgenannten bis zu 70% aller in den USA registrierten CA-MRSA Infektionen der letzten Jahre zugesprochen werden. Lange Zeit wurde angenommen, dass S. aureus strikt extrazellulär im Infektionsbereich vorliegt und die cytotoxische Wirkung von z.B. α-Toxin für Wirtszelltod und Gewebeschädigungen verantwortlich ist. Erst vor kurzem wurde festgestellt, dass S. aureus auch durch fakultativ phagozytotische Zellen, wie Epithel- oder Endothelzellen, mittels zahlreicher Adhäsine aufgenommen wird. Die Aufnahme in die Zelle erfolgt zunächst in ein Phagoendosom, in dem die Pathogene durch antimikrobielle Mechanismen abgebaut würden. Um dies zu verhindern, verfügt S. aureus über Virulenzfaktoren, welche die endosomale Membran schädigen. Die Bakterien gelangen so in das Zellzytoplasma, wo sie sich vervielfältigen können, bevor die Wirtszelle schließlich getötet wird. Eine wichtige Funktion in diesem Vorgang konnte bereits in mehreren Studien den Phenol löslichen Modulinen (PSM) zugesprochen werden, Arbeiten unserer Gruppe deuten jedoch darauf hin, dass diese nicht alleine für den phagosomalen Ausbruch von S. aureus verantwortlich sind. In dieser Arbeit verwendete ich eine Transposon Mutantenbibliothek des S. aureus Stammes JE2 (USA300) in Verbindung mit automatisierter Fluoreszenzmikroskopie, um Gene zu identifizieren, die den phagosomalen Ausbruch von S. aureus beeinflussen. Unter den Mutanten, welche eine Minderung der Ausbruchsraten zeigten, fanden sich auch Mutanten in beiden Genen eines Operons, welches für die nicht-ribosomale Peptidsynthetase AusA/B codiert, die die beiden Dipeptide Phevalin und Tyrvalin produziert. Verminderte Ausbruchsraten konnten sowohl durch genetische Komplementation als auch mittels des Zusatzes synthetischen Phevalins wiederhergestellt werden. In Leukozyten verhindert Phevalin effizienten Calcium-Flux und die Aktivierung von Neutrophilen. Zudem fördert Phevalin die Cytotoxizität intrazellulärer Bakterien sowohl in Makrophagen, als auch Neutrophilen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die NRPS AusAB und ihre Produkte eine Rolle beim Überleben der Bakterien während einer Infektion im Tiermodell einnehmen. Die hier präsentierten Daten hinsichtlich des Einflusses von Phevalin auf Virulenz und der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen lassen den Schluss zu, dass Phevalin direkt auf einen Wirtszellfaktor wirkt, um die Cytotoxicität intrazellulärer Bakterien zu stärken. KW - Staphylococcus aureus KW - MRSA KW - Virulenz KW - Intracellular virulence KW - Non-ribosomal peptide synthetase KW - USA300 Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146662 ER - TY - THES A1 - Luibl [née Hermann], Christiane T1 - The role of the neuropeptides NPF, sNPF, ITP and PDF in the circadian clock of Drosophila melanogaster T1 - Die Rolle der Neuropeptide NPF, sNPF, ITP und PDF in der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster N2 - Organisms have evolved endogenous clocks which allow them to organize their behavior, metabolism and physiology according to the periodically changing environmental conditions on earth. Biological rhythms that are synchronized to daily changes in environment are governed by the so-called circadian clock. Since decades, chronobiologists have been investigating circadian clocks in various model organisms including the fruitfly Drosophila melanogaster, which was used in the present thesis. Anatomically, the circadian clock of the fruitfly consists of about 150 neurons in the lateral and dorsal protocerebrum, which are characterized by their position, morphology and neurochemistry. Some of these neurons had been previously shown to contain either one or several neuropeptides, which are thought to be the main signaling molecules used by the clock. The best investigated of these neuropeptides is the Pigment Dispersing Factor (PDF), which had been shown to constitute a synchronizing signal between clock neurons as well as an output factor of the clock. In collaboration with various coworkers, I investigated the roles of three other clock expressed neuropeptides for the generation of behavioral rhythms and the partly published, partly unpublished data are presented in this thesis. Thereby, I focused on the Neuropeptide F (NPF), short Neuropeptide F (sNPF) and the Ion Transport Peptide (ITP). We show that part of the neuropeptide composition within the clock network seems to be conserved among different Drosophila species. However, the PDF expression pattern in certain neurons varied in species deriving from lower latitudes compared to higher latitudes. Together with findings on the behavioral level provided by other people, these data suggest that different species may have altered certain properties of their clocks - like the neuropeptide expression in certain neurons - in order to adapt their behavior to different habitats. We then investigated locomotor rhythms in Drosophila melanogaster flies, in which neuropeptide circuits were genetically manipulated either by cell ablation or RNA interference (RNAi). We found that none of the investigated neuropeptides seems to be of equal importance for circadian locomotor rhythms as PDF. PDF had been previously shown to be necessary for rhythm maintenance in constant darkness (DD) as well as for the generation of morning (M) activity and for the right phasing of the evening (E) activity in entrained conditions. We now demonstrate that NPF and ITP seem to promote E activity in entrained conditions, but are clearly not the only factors doing so. In addition, ITP seems to reduce nighttime activity. Further, ITP and possibly also sNPF constitute weak period shortening components in DD, thereby opposing the effect of PDF. However, neither NPF or ITP, nor sNPF seem to be necessary in the clock neurons for maintaining rhythmicity in DD. It had been previously suggested that PDF is released rhythmically from the dorsal projection terminals. Now we discovered a rhythm in ITP immunostaining in the dorsal projection terminals of the ITP+ clock neurons in LD, suggesting a rhythm in peptide release also in the case of ITP. Rhythmic release of both ITP and PDF seems to be important to maintain rhythmic behavior in DD, since constantly high levels of PDF and ITP in the dorsal protocerebrum lead to behavioral arrhythmicity. Applying live-imaging techniques we further demonstrate that sNPF acts in an inhibitory way on few clock neurons, including some that are also activated by PDF, suggesting that it acts as signaling molecule within the clock network and has opposing effects to PDF. NPF did only evoke very little inhibitory responses in very few clock neurons, suggesting that it might rather be used as a clock output factor. We were not able to apply the same live-imaging approach for the investigation of the clock neuron responsiveness to ITP, but overexpression of ITP with various driver lines showed that the peptide most likely acts mainly in clock output pathways rather than inter-clock neuron communication. Taking together, I conclude that all investigated peptides contribute to the control of locomotor rhythms in the fruitfly Drosophila melanogaster. However, this control is in most aspects dominated by the actions of PDF and rather only fine-tuned or complemented by the other peptides. I assume that there is a high complexity in spatial and temporal action of the different neuropeptides in order to ensure correct signal processing within the clock network as well as clock output. N2 - Die meisten Organismen haben endogene Uhren entwickelt, mit deren Hilfe sie ihre Verhaltensweisen, ihren Metabolismus und auch ihre Physiologie an die periodisch wechselnden Umweltbedingungen auf unserer Erde anpassen können. Die sogenannten circadianen Uhren steuern dabei biologische Rhythmen, die an täglich wiederkehrende Umweltfaktoren angepasst sind. Schon seit Jahrzehnten wurden diese circadianen Uhren von Chronobiologen in verschiedensten Modellorganismen untersucht. Zu diesen gehört auch die Taufliege Drosophila melanogaster, welche im Rahmen dieser Doktorarbeit Verwendung fand. Anatomisch besteht die circadiane Uhr der Taufliege aus etwa 150 sogenannten Uhrneuronen, die sich im dorsalen und lateralen Protocerebrum der Fliege befinden. Diese können anhand ihrer Position im Gehirn, ihrer Morphologie als auch ihrer neurochemischen Eigenschaften charakterisiert werden. Es wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt, dass einige dieser Uhrneuronen jeweils ein oder mehrere Neuropeptide exprimieren, welche mit großer Wahrscheinlichkeit die wichtigsten Signalmoleküle der Uhr darstellen. Dabei ist der „Pigment Dispersing Factor“ (PDF) wohl das Neuropeptid, welches bisher in Bezug auf seine Funktion in der Uhr die größte Aufmerksamkeit fand. Es ist daher auch das Neuropeptid, das bei Weitem am besten untersucht ist. So wurde bereits gezeigt, dass PDF die Oszillationen der Uhrneuronen untereinander synchronisiert und auch in Ausgangssignalwegen der Uhr zu nachgeschalteten Gehirnregionen eine Rolle spielt. In Zusammenarbeit mit verschiedenen Kollegen, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit untersucht, welche Rolle drei andere Neuropeptide, welche in den Uhrneuronen exprimiert werden, in der Generierung von Verhaltensrhythmen spielen. Der Fokus lag dabei auf der Untersuchung des Neuropeptids F (NPF) des short Neuropeptids F (sNPF) und des Ion Transport Peptids (ITP). Wir konnten für manche dieser Peptide zeigen, dass ihre Verwendung im Uhrnetzwerk unterschiedlicher Drosophila-Arten konserviert zu sein scheint. Im Falle von PDF zeigten sich jedoch Unterschiede in der zellspezifischen Expression in Arten aus südlichen Breitengraden im Vergleich zu Arten aus nördlichen Breitengraden. Zusammen mit ergänzenden Verhaltensdaten anderer Arbeitsgruppen, gehen wir davon aus, dass unterschiedliche Arten bestimmte Eigenschaften ihrer Uhr – wie etwa die Neuropeptid-Expression in bestimmten Zellen – verändert haben, um ihr Verhalten bestmöglich an ihr jeweiliges Habitat anzupassen. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die Aktivitätsrhythmik in Fliegen untersucht, in welchen gezielt bestimmte Neuropeptid-Systeme auf genetischem Wege - entweder durch Zellablation oder RNA-Interferenz (RNAi) - manipuliert wurden. Wir konnten zeigen, dass wohl keines der untersuchten Peptide eine ähnlich große Rolle für die Aktivitätsrhythmik spielt wie PDF. Aus früheren Arbeiten geht hervor, dass PDF sowohl für die Aufrechterhaltung eines Rhythmus in konstanter Dunkelheit (DD), als auch für die Generierung der Morgenaktivität und für die richtige Phasenlage der Abendaktivität in Licht-Dunkel Zyklen (LD) essentiell ist. Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen nun, dass NPF und ITP die Abendaktivität in LD fördern, dass sie jedoch nicht die einzigen Faktoren sind, die dies bewerkstelligen. ITP scheint außerdem Aktivität während der Nacht zu hemmen. Des Weiteren stellen ITP und möglicherweise auch sNPF eine schwache Perioden verkürzende Komponente in DD dar, ganz im Gegensatz zu PDF, welches eine Perioden verlängernde Wirkung besitzt. Jedoch scheinen weder ITP, NPF noch sNPF für die generelle Aufrechterhaltung eines Rhythmus in DD nötig zu sein. Vorhergehende Arbeiten wiesen bereits darauf hin, dass PDF wahrscheinlich rhythmisch an den dorsalen Nervenendigungen ausgeschüttet wird. Unsere jetzigen Ergebnisse zeigen desweiteren eine Oszillation in der ITP-Immunfärbung in den dorsalen Projektionen der ITP+ Uhrneuronen in LD, was auch auf eine rhythmische Ausschüttung dieses Peptids schließen lässt. Die rhythmische Freisetzung beider Peptide scheint für die Aufrechterhaltung eines Verhaltensrhythmus in DD wichtig zu sein, da eine konstant hohe Menge an ITP und PDF im dorsalen Gehirn den Freilauf-Rhythmus störten. Die live-Imaging Experimente dieser Arbeit zeigten, dass sNPF auf manche Uhrneuronen inhibitorisch wirkt – auch auf einige, die durch PDF aktiviert werden können. sNPF könnte also als Signalmolekül innerhalb des Uhrnetzwerkes fungieren. Auch NPF führte zu inhibitorischen Zellantworten, jedoch waren diese äußerst schwach und betrafen nur wenige Uhrneuronen, was darauf schließen lässt, dass dieses Peptid wahrscheinlich am Signalausgang der Uhr beteiligt ist. Es war uns bisher nicht möglich dieselben live-Imaging Untersuchungen auch für ITP durchzuführen, jedoch zeigten Überexpressionsstudien mit verschiedenen Treiberlinien, dass auch ITP mit großer Wahrscheinlichkeit im Signalausgang der Uhr fungiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle hier untersuchten Neuropeptide an der Kontrolle der rhythmischen Lokomotoraktivität von Drosophila melanogaster mitwirken. Dabei ist PDF eindeutig der dominierende Faktor, während die anderen Neuropeptide die Wirkung von PDF eher feinregulieren oder komplementieren. Aus den Daten kann geschlossen werden, dass die örtliche und zeitliche Funktionsweise dieser verschiedenen Peptide sehr komplex ist, um sowohl die Prozessierung von Signalen innerhalb des Uhrnetzwerkes als auch in den weitgehend noch unbekannten Ausgangswegen der Uhr zu gewährleisten. KW - Taufliege KW - Biologische Uhr KW - Neuropeptide KW - Innere Uhr KW - Drosophila KW - Circadian Rhythms Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-93796 ER - TY - THES A1 - Pasch, Elisabeth T1 - The role of SUN4 and related proteins in sperm head formation and fertility T1 - Die Rolle von SUN4 und verwandten Proteinen in der Spermienkopfformierung und Fertilität N2 - Spermiogenesis describes the differentiation of haploid germ cells into motile, fertilization-competent spermatozoa. During this fundamental transition the species-specific sperm head is formed, which necessitates profound nuclear restructuring coincident with the assembly of sperm-specific structures and chromatin compaction. In the case of the mouse, it is characterized by reshaping of the early round spermatid nucleus into an elongated sickle-shaped sperm head. This tremendous shape change requires the transduction of cytoskeletal forces onto the nuclear envelope (NE) or even further into the nuclear interior. LINC (linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton) complexes might be involved in this process, due to their general function in bridging the NE and thereby physically connecting the nucleus to the peripheral cytoskeleton. LINC complexes consist of inner nuclear membrane integral SUN-domain proteins and outer nuclear membrane KASH-domain counterparts. SUN- and KASH-domain proteins are directly connected to each other within the perinuclear space, and are thus capable of transferring forces across the NE. To date, these protein complexes are known for their essential functions in nuclear migration, anchoring and positioning of the nucleus, and even for chromosome movements and the maintenance of cell polarity and nuclear shape. In this study LINC complexes were investigated with regard to their potential role in sperm head formation, in order to gain further insight into the processes occurring during spermiogenesis. To this end, the behavior and function of the testis-specific SUN4 protein was studied. The SUN-domain protein SUN4, which had received limited characterization prior to this work, was found to be exclusively expressed in haploid stages during germ cell development. In these cell stages, it specifically localized to the posterior NE at regions decorated by the manchette, a spermatid-specific structure which was previously shown to be involved in nuclear shaping. Mice deficient for SUN4 exhibited severely disorganized manchette residues and gravely misshapen sperm heads. These defects resulted in a globozoospermia-like phenotype and male mice infertility. Therefore, SUN4 was not only found to be mandatory for the correct assembly and anchorage of the manchette, but also for the correct localization of SUN3 and Nesprin1, as well as of other NE components. Interaction studies revealed that SUN4 had the potential to interact with SUN3, Nesprin1, and itself, and as such is likely to build functional LINC complexes that anchor the manchette and transfer cytoskeletal forces onto the nucleus. Taken together, the severe impact of SUN4 deficiency on the nucleocytoplasmic junction during sperm development provided direct evidence for a crucial role of SUN4 and other LINC complex components in mammalian sperm head formation and fertility. N2 - Die Spermiogenese beschreibt die Differenzierung haploider Keimzellen zu beweglichen, fortpflanzungsfähigen Spermatozoen. Während dieses fundamentalen Entwicklungsabschnittes wird neben dem Aufbau von spermienspezifischen Strukturen und der Kompaktierung des Chromatins auch der speziesspezifische Spermienkopf geformt. Im Falle der Maus ist dies eine aktive Umformung des runden Zellkerns in einen gestreckten, sichelförmigen Spermienkopf. Eine derart gravierende Formveränderung erfordert eine Kraftweiterleitung aus dem Zytoskelett auf die Kernhülle und das Kerninnere. In diesem Zusammenhang könnten LINC (linkers of nucleoskeleton and cytoskeleton) Komplexe eine Rolle spielen, da ihre grundlegende Funktion darin besteht die Kernhülle zu überbrücken und somit den Kern mit dem peripheren Zytoskelett zu verbinden. LlNC Komplexe werden aus SUN und KASH Domänen Proteinen aufgebaut, welche in die innere beziehungsweise äußere Kernmembran eingelagert sind. Diese membranintegralen Proteine sind direkt miteinander verbunden, so dass sie einen Komplex bilden, der zur Kräfteübertragung geeignet ist. LINC Komplexe besitzen vielfältige Funktionen in Prozessen wie nuklearer Migration, Verankerung und Positionierung des Zellkerns, Chromosomenbewegungen und in der Aufrechterhaltung der Zellpolarität oder der Kernform. Um ein größeres Verständnis der Prozesse während der Spermiogenese zu gewinnen, wurden in dieser Studie die Funktionen von LINC Komplexen in der Spermiogenese und ihre spezifische Rolle bei der gerichteten Spermienkopf-strukturierung untersucht. Dabei wurde insbesondere das Verhalten und die Funktion des bisher wenig charakterisierten SUN Domänen Proteins SUN4 erforscht. Entsprechend der Ergebnisse dieser Studie ist SUN4 ein hodenspezifisches Protein, das ausschließlich in haploiden Keimzellen exprimiert wird. In diesen lokalisiert es in der posterioren Kernhülle, spezifisch in Regionen, an die sich die spermatidenspezifische Manschette anlagert. Dies ist eine Struktur, für die bereits gezeigt wurde, dass sie an der Verformung des Kerns beteiligt ist. SUN4 defiziente Mäuse zeigten ausschließlich Spermatiden mit stark desorganisierten Manschettenüberresten und einen gravierend verformten Spermienkopf. Insgesamt führten die Fehlbildungen zu einem globozoospermieartigen Phänotyp und männlicher Sterilität bei Mäusen. Dabei zeigte sich, dass SUN4 nicht nur zwingend erforderlich ist für den korrekten Aufbau und die Verankerung der Manschette, sondern auch für die korrekte Lokalisation von SUN3 und Nesprin1, wie auch für weitere Komponenten der posterioren Kernhülle. Interaktionsstudien zeigten, dass SUN4 sowohl mit SUN3 und Nesprin1 als auch mit sich selbst interagieren kann, vermutlich um funktionsfähige LINC Komplexe zu bilden, die die Manchette verankern und Kräfte aus dem Zytoskelett auf den Kern übertragen. Zusammenfassend zeigen die schwerwiegenden Auswirkungen auf die kernzytoplasmatische Verbindung während der Spermienentwicklung, die durch den Verlust von SUN4 entstanden, einen direkten Nachweis einer entscheidenden Rolle von SUN4 und anderen LINC-Komplex-Komponenten für die Spermienkopfentwicklung und Fertilität bei Säugetieren. KW - Maus KW - spermiogenesis KW - Fertilität KW - Spermatogenese KW - Kernhülle KW - Molekularbiologie KW - LINC complex KW - SUN domain proteins KW - sperm head formation KW - fertility KW - Spermiogenese KW - Spermienbildung KW - Kernproteine Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139092 ER - TY - THES A1 - Pei, Geng T1 - The Role of Raf-mediated Signalling Pathways for Motoneuron T1 - Die Rolle von Raf-vermittelten Signalwegen bei Entwicklung und Überleben von Motoneuronen N2 - The transmission of proliferative and developmental signals from activated cell-surface receptors to initiation of cellular responses in the nucleus is synergically controlled by the coordinated action of a diverse set of intracellular signalling proteins. The Ras/Raf/MEK/MAPK signalling pathway has been shown to control the expression of genes which are crucial for the physiological regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Within this signalling cascade, the Raf protein family of serine/threonine kinases serves as a central intermediate which connects to many of other signal transduction pathways. To elucidate the signalling functions of the different Raf kinases in motoneurons during development, the expression, distribution and subcellular localization of Rafs in the spinal cord and the facial nucleus in brainstem of mice at various embryonic and postnatal stages were investigated. Moreover, we have investigated the intracellular redistribution of Raf molecules in isolated motoneurons from 13 or 14 day old mouse embryos, after addition or withdrawal of neurotrophic factors to induce Raf kinases activation in vitro. Furthermore, in order to investigate the potential anti-apoptotic function of Raf kinases on motoneurons, we isolated motoneurons from B-raf-/- and c-raf-1-/- mouse embryos and analysed the survival and differentiation effects of neurotrophic factors in motoneurons lacking B-Raf and c-Raf-1. We provide evidence here that all three Raf kinases are expressed in mouse spinal motoneurons. Their expression increases during the period of naturally occurring cell death of motoneurons. In sections of embryonic and postnatal spinal cord, motoneurons express exclusively B-Raf and c-Raf-1, but not A-Raf, and subcellularly Raf kinases are obviously colocalized with mitochondria. In isolated motoneurons, most of the B-Raf or c-Raf-1 immunoreactivity is located in the perinuclear space but also in the nucleus, especially after activation by addition of CNTF and BDNF in vitro. We found that c-Raf-1 translocation from the cytosol into the nucleus of motoneurons after its activation by neurotrophic factors is a distinct event. As a central finding of our study, we observed that the viability of isolated motoneurons from B-raf but not c-raf-1 knockout mice is lost even in the presence of CNTF and other neurotrophic factors. This indicates that B-Raf but not c-Raf-1, which is still present in B-raf deficient motoneurons, plays a crucial role in mediating the survival effect of neurotrophic factors during development. In order to prove that B-Raf is an essential player in this scenario, we have re-expressed B-Raf in mutant sensory and motor neurons by transfection. The motoneurons and the sensory neurons from B-raf knockout mouse which were transfected with exogenous B-raf gene revealed the same viability in the presence of neurotrophic factors as primary neurons from wild-type mice. Our results suggest that Raf kinases have important signalling functions in motoneurons in mouse CNS. In vitro, activation causes redistribution of Raf protein kinases, particularly for c-Raf-1, from motoneuronal cytoplasm into the nucleus. This redistribution of c-Raf-1, however, is not necessary for the survival effect of neurotrophic factors, given that B-raf-/- motor and sensory neurons can not survive despite the presence of c-Raf-1. We hypothesize that c-Raf-1 nuclear translocation may play a direct role in transcriptional regulation as a consequence of neurotrophic factor induced phosphorylation and activation of c-Raf-1 in motoneurons. Moreover, the identification of target genes for nuclear translocated c-Raf-1 and of specific cellular functions initiated by this mechanism awaits its characterization. N2 - Die Vermittlung von wachstumsfördernden und entwicklungsspezifischen Signalen von aktivierten Zelloberflächenrezeptoren führt zur Initiation von Transkriptionsprogrammen im Zellkern, die durch das koodinierte Zusammenwirken von intrazellulären Signalproteinen synergistisch gesteuert werden. Der Ras/Raf/MEK/MAPK-Weg steuert die Expression von Genen für die physiologische Regulation der Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose. Innerhalb dieser Signalkaskade stellen die Serin/Threonin Kinasen der Raf Familie eine zentrale Zwischenstufe dar, die Verbindungen zu vielen anderen Signaltransduktionswegen herstellt. Um die Funktionen der verschiedenen Raf-Kinasen in Motoneuronen während der Entwicklung aufzuklären, wurden die Expression, Verteilung und subzelluläre Lokalisation der Raf-Isoformen in spinalen Motoneuronen und im Nucleus Fazialis der Maus während der Embryonalentwicklung und postnatal untersucht. Desweiteren haben wir die intrazelluläre Umverteilung der Raf-Moleküle in isolierten Motoneuronen von 13 oder 14 Tage alten Mäusembryonen untersucht. Um die Rolle der Raf-Kinasen nach Zugabe oder Entzug von neurotrophen Faktoren bei Motoneuronen zu untersuchen, analysierten wir die Überlebens-und Differenzierungseffekte von neurotrophen Faktoren bei Motoneuronen von B-raf oder c-raf-1 defizienten Mäusen. Wir zeigen in dieser Arbeit, daß alle drei Raf-Kinasen in spinalen Motoneuronen der Mäuse exprimiert sind. Ihre Expression steigt während der Zeit des natürlich auftretenden Zelltods. An Schnitten von embryonalem und postnatalem Rückenmark exprimieren Motoneurone ausschließlich B-Raf and c-Raf-1, aber nicht A-Raf. Raf-Kinasen sind offensichtlich an Mitochondrien lokalisiert. In isolierten Motoneuronen findet man B-Raf und c-Raf-1, Immunreaktivität vor allem im perinukleären Bereich, aber auch im Zellkern, vor allem nach Aktivierung durch Zugabe von CNTF und BDNF in vitro. Wir haben gefunden, daß die Translokation von c-Raf-1 vom Zytosol in den Nukleus von Motoneuronen nach Aktivierung durch neurotrophe Faktoren ein spezifischer Vorgang ist. Als zentralen Befund dieser Arbeit beobachteten wir, daß Motoneurone von B-raf-/-, aber nicht von c-raf-1-/-, Embryonen nicht lebensfähig sind, auch nicht in Gegenwart von CNTF oder anderer neurotropher Faktoren. Dies bedeutet, daß B-Raf und nicht c-Raf-1, welches noch immer in B-raf defizienten Motoneuronen präsent ist, eine entscheidende Rolle als Vermitter des Überlebenseffektes von neurotrophen Faktoren spielt. Um zu beweisen, daß B-Raf hierbei eine essentielle Komponente darstellt, haben wir in B-raf defizienten sensorischen und Motoneuronen B-Raf durch Transfektion exprimiert. Erfolgreich mit B-raf Plasmid transfizierte B-raf-/- sensorische und Motoneurone zeigten dieselbe Überlebensfähigkeit in Gegenwart von neurotrophen Faktoren wie primäre Neurone von Wildtyp-Mäusen. Diese Arbeit zeigt daher, daß Raf-Kinasen wichtige Funktionen in Motoneuronen der Maus haben. Die Aktivierung von Raf-Kinasen in vitro führt zur Änderung ihrer subzellulären Verteilung, vor allem von c-Raf-1 vom Zytoplasma in den Kern. Diese Umverteilung von c-Raf-1 ist jedoch nicht notwendig für den Überlebenseffekt von neurotrophen Faktoren, vor allem, wenn man in Betracht zieht, daß B-raf defiziente sensorische und Motoneuronen trotz der Gegenwart von c-Raf-1 nicht überleben. Wir nehmen an, daß die nukleäre Translokation von c-Raf-1 eine direkte Rolle bei der transkriptionellen Regulation durch neurotrophe Faktoren spielt. Die Indentifizierung von c-Raf-1 regulierten Zielgenen und von durch diese beeinflussten zellulären Funktionen ist eine Aufgabe für die Zukunft. KW - Maus KW - Motoneuron KW - Zelldifferenzierung KW - Raf KW - Signaltransduktion KW - Raf-Kinasen KW - Motoneuron KW - Raf-Kinase KW - Zentrales Nervensystem KW - motoneuron KW - Raf KW - CNS Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1846 ER - TY - THES A1 - Link, Jana T1 - The role of meiotic nuclear envelope components in chromosome dynamics and meiotic progression T1 - Die Rolle meiotischer Kernhüllenkomponenten für Chromosomendynamiken und den meiotischen Ablauf N2 - Meiosis is the specialised cell division which produces haploid germ cells, capable of developing into fertile gametes, from diploid progenitor cells. During meiosis, chromosomes undergo strictly regulated and strongly conserved dynamic processes, at the beginning of which the telomeres are actively tethered and intimately attached to the nuclear envelope (NE). The attached telomeres are then moved within the NE through cytoskeletal forces to cluster within a restricted region, forming the highly conserved bouquet stage. Subsequently, the bouquet is released simultaneously to the completion of the synaptonemal complex assembly tightly linking homologous chromosome pairs together. In combination these processes are essential for the successful completion of meiosis. Because the meiotic NE serves as a platform for telomere attachment and movement it can be assumed to be critically involved in these events crucial for fertility. However, the precise roles of many meiotic NE proteins in the attachment and movement of telomeres still remain elusive. Therefore, it was the aim of this thesis to investigate the functions of two mammalian meiotic NE components in telomere attachment and dynamics. The first part of this thesis is concerned with the meiosis-specific lamin C2. Lamin C2 is the only A-type lamin expressed during meiosis and has in previous studies shown to feature altered meiosis-specific properties, clearly distinguishing it from somatic lamins. Because lamin C2 is enriched at sites of telomere attachment, exhibits a high mobility within the nuclear lamina and influences NE integrity, it has been postulated that it may locally increase NE flexibility to allow efficient meiotic telomere movement. Therefore, possible functions of lamin C2 in the movement of attached telomeres were investigated in this thesis by studying the bouquet formation and release of pubertal mice specifically lacking lamin C2. This revealed that lamin C2 deficient mice show a delayed bouquet release, leading to severe defects in the synaptic pairing of homologous chromosomes, which in turn results in infertility of the males. Therefore, the efficient repositioning of attached meiotic telomeres, facilitated by lamin C2, seems essential for completing meiosis. The second part of this thesis focuses on the protein complex responsible for the attachment of meiotic telomeres to the NE and their coupling to the cytoskeleton. The so-called LINC complex is composed of SUN domain proteins in the inner nuclear membrane interacting with KASH domain proteins of the outer nuclear membrane. In previous studies it had been shown that SUN1, SUN2 and KASH5 localise to the attached meiotic telomeres. Regarding the meiotic role of SUN2, however, contradicting results have recently been discussed, showing the need for further investigations. Using an available SUN1 deficient mouse strain, this thesis was able to show that SUN2 is sufficient for telomere attachment per se although telomere attachment is impaired in SUN1 deficient mice leading to infertility. It is also demonstrated that SUN2 forms a functional LINC complex together with KASH5 to mediate this telomere attachment. This LINC complex in the absence of SUN1 is able to move attached telomeres into a bouquet-like cluster formation. Therefore, this demonstrates that SUN2 is involved in the functional attachment and movement of meiotic telomeres. In summary, this thesis has shown SUN2 and the meiotic nuclear lamina to be directly involved in or essential for the highly conserved attachment and movement of telomeres, making them critical for a successful meiosis. The meiotic NE is therefore in this thesis demonstrated to be a determinant of mammalian fertility. N2 - Die Meiose, eine spezialisierte Zellteilung, produziert aus diploiden Vorläuferzellen haploide Keimzellen, welche sich zu befruchtungsfähigen Gameten entwickeln können. Chromosomen durchlaufen während der Meiose stark regulierte, evolutionär hochkonservierte Bewegungen. Zunächst werden die Telomere aktiv und stabil an der Kernhülle verankert. Angeheftete Telomere werden durch das Cytoskelett entlang der Kernhülle bewegt um sich in einer begrenzten Region anzureichern und das chromosomale Bouquet bilden. Das Bouquet wird durch gerichtete Telomerbewegungen anschließend wieder aufgelöst während die finalen Schritte des Zusammenbaus des Synaptonemalkomplexes stattfinden. Diese Prozesse sind in ihrer Summe essentiell für den erfolgreichen Ablauf der Meiose. Da die meiotische Kernhülle als Plattform für die Anheftung und Bewegung der Telomere dient, kann angenommen werden, dass sie in diese für die Fertilität kritischen Prozesse involviert ist. Die genaue Funktion von Kernhüllenproteinen in der Anheftung und Bewegung meiotischer Telomere ist trotzdem zu großen Teilen noch unverstanden. Deshalb war es Ziel dieser Arbeit zwei Komponenten der meiotische Kernhülle und deren Rolle in Telomeranheftung und –dynamik zu untersuchen. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem meiosespezifischen Lamin C2, welches das einzige während der Meiose exprimierte A-typ Lamin ist. Weil Lamin C2 in Bereichen der Telomeranheftung angereichter ist, eine hohe Mobilität in der Kernhülle aufweist und Kernhülleneigenschaften verändern kann, wurde postuliert dass es lokal die Flexibilität der Kernhülle steigern könnte um leichtere Bewegungen der Telomere zu ermöglichen. Demzufolge sollte in dieser Arbeit eine mögliche Rolle von Lamin C2 in der effizienten Bewegung angehefteter Telomere anhand von jungen Lamin C2-defizienten Mäuse untersucht werden. Dies ergab, dass Lamin C2-defiziente Mäuse eine verlangsamte Auflösung des meiotische Bouquets zeigten, was Defekte in der Homologenpaarung verursacht und letztlich zur Infertilität der Männchen führt. Schlussendlich, scheint die effiziente Bewegung angehefteter Telomere, ermöglicht durch Lamin C2, damit essentiell für einen erfolgreichen Ablauf der Meiose. Der zweite Teil dieser Arbeit ist auf einen Proteinkomplex fokussiert welcher für die Anheftung meiotische Telomere und deren Verbindung zum Cytoskelett verantwortlich ist. Dieser LINC complex besteht aus SUN-domänenproteinen der inneren Kernmembran welche mit KASH-domänenproteinen der äußeren Kernmembran interagieren. Aus früheren Studien ist bekannt, dass SUN1, SUN2 und KASH5 an angehefteten Telomeren lokalisieren. Die meiotische Funktion von SUN2, jedoch, wird aktuell anhand widersprüchlicher Ergebnisse diskutiert. Durch die Verwendung SUN1-defizienter Mäuse konnte diese Arbeit zeigen, dass obwohl die partiell unvollständige Telomeranheftung in der Abwesenheit von SUN1 zu Infertilität führt, SUN2 dennoch für Telomeranheftung an sich ausreichend ist. Um diese Anheftung zu vermitteln, bildet SUN2 einen funktionellen LINC complex mit KASH5 welcher angeheftete Telomere in der Abwesenheit von SUN1 in bouquet-ähnliche Konformationen führt. Demzufolge demonstriert diese Arbeit, dass SUN2 an der funktionellen Telomeranheftung und –bewegung beteiligt ist. Zusammenfassend hat diese Arbeit gezeigt, dass SUN2 und die meiotische Lamina in die hochkonservierte Anheftung und Bewegung von Telomeren direkt involviert oder für sie essentiell sind, und somit unabdingbar für eine erfolgreiche Meiose. Damit definiert diese Arbeit die meiotische Kernhülle als eine Determinante für die Fertilität von Säugern. KW - Meiose KW - Kernhülle KW - Meiosis KW - Nuclear envelope Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83540 ER - TY - THES A1 - Reichert, Nina T1 - The Role of LIN9 in Mouse Development T1 - Die Rolle von LIN9 in der Mausentwicklung N2 - LINC, the human homologue of an evolutionary conserved complex, regulates the transcription of a set of genes essential during the G2/M transition (Osterloh et al., 2007; Schmit et al., 2007). One component of the LINC core module is LIN-9. LIN-9 is essential for the transcriptional activation of LINC target genes and also promotes differentiation in association with pRB (Gagrica et al., 2004). However, nothing is known about its function in vivo. Histological and molecular analysis revealed that Lin9 is ubiquitously expressed throughout embryonic development and in all examined adult organs. Additionally, Lin9 mRNA is expressed in ES cells and blastocysts. Moreover the analogous distribution of the other LINC components suggested that they all function in the same cells and most likely in the same pathway. To deeper investigate the role of LIN9 in cell cycle and differentiation in vivo, a Lin9 gene trap mouse model (GT) was successfully generated and examined. Heterozygouse Lin9GT/+ mice were inconspicuous and develop normally. However, homozygouse knockout embryos were never obtained. The Lin9GT/GT embryos die at peri-implantation, probably due to a defect in the development of the epiblast, which could be shown with in situ hybridization with specific lineage markers. In vitro, the ICM of Lin9-deficient blastocysts did not develop properly. These data suggest that the loss of Lin9 leads to embryonic lethality at peri-implantation, and indicates that LIN9 is required for proper formation of the epiblast. In parallel, the first conditional Lin9 mouse model based on the Cre-loxP technology was generated. The Lin9fl/fl allele can be deleted by Cre-recombinase, in vivo and in vitro. Therefore an inducible system with Lin9fl/fl mice harboring Cre-ERT2 was established. The MEFs generated from these transgenic mice carried a nearly complete knockout upon induction with tamoxifen. Deletion of LIN9 in MEFs had a major impact upon the cell cycle and growth rates. Specifically, they arrested in G2/M phase and stopped to proliferate. Taken together, I was able to generate a lin9 gene trap and a lin9 conditional knockout mouse model. All results obtained so far demonstrate, that Lin9 is an essential gene for embryonic development and cell cycle control. It will be of great interest to further investigate Lin9-deficiency to gain insights into the mechanism of cell cycle control in early embryonic development and cell differentiation. N2 - LINC, das humane Homolog eines evolutionär konservierten Komplexes, reguliert die Transkription von Genen, die essentiell für die G2/M Transition sind (Osterloh et al., 2007; Schmit et al., 2007). Eine Komponente des LINC Komplexes ist LIN-9. LIN-9 ist für die transkriptionelle Aktivierung LINC spezifischer Zielgene essentiell und kann, in Assoziation mit pRB, die Differenzierung humaner Zellen fördern (Gagrica et al., 2004). Bisher ist jedoch nichts über die in vivo Funktion LIN9s bekannt. Histologische und molekulare Analysen der Maus machen deutlich, dass Lin9 während der embryonalen Entwicklung und in allen untersuchten adulten Organen ubiquitär exprimiert wird. Zusätzlich wird Lin9 mRNA in ES Zellen und in Blastocysten exprimiert. Außerdem legt die analoge Verteilung anderer LINC Komponenten nahe, dass sie sehr wahrscheinlich gemeinsam in den gleichen Zellen und Signalwegen agieren. Um die Funktion des LIN9 Proteins im Zellzyklus und der Differenzierung in vivo genauer zu erforschen, wurde ein Lin9 „Gene Trap“ Maus Modell (GT) generiert und untersucht. Heterozygote Lin9GT/+ Mäuse sind unauffällig und entwickeln sich normal. Allerdings wurden keine Lin9 knockout Embryonen erhalten. Lin9GT/GT Embryonen sterben in der peri-Implantationsphase, vermutlich auf Grund eines Entwicklungsdefekts des Epiblasten, was mit in situ Hybridisierung von Abstammungslinien spezifischen Markern gezeigt werden konnte. Die ICM Lin9 defizienter Blastocysten entwickelte sich in vitro nicht richtig. Diese Daten machen deutlich, dass der Verlust von Lin9 zu embryonaler Letalität im Peri-Implantations-stadium führt, und zeigt dass Lin9 für die richtige Ausbildung des Epiblasten benötigt wird. Gleichzeitig wurde das erste konditionelle Lin9 Maus Modell, basierend auf der Cre-loxP Technologie, generiert. Das Lin9fl/fl Allele kann in vivo und in vitro mit der Cre-Recombinase deletiert werden. Deshalb wurde ein induzierbares System mit Lin9fl/fl Mäusen, die zusätzlich Cre-ERT2 tragen, etabliert. Die MEFs dieser transgenen Mäuse trugen nach Induktion mit Tamoxifen einen kompletten Lin9 Knockout. Die Deletion von LIN9 hat dramatische Auswirkung auf den Zellzyklus und die Wachstumsrate der MEFs. Neben der Akkumulation in der G2/M Phase des Zellzyklus kommt es zu einem vollständigen Proliferationsstop. Zusammenfassend war es möglich, ein Lin9 „Gene Trap“ und ein konditionelles Knockout Maus Modell zu generieren. Beide Mausmodelle belegen, dass Lin9 ein essenzielles Gen für die Embryonalentwicklung und die Kontrolle des Zellzyklus ist. Die weitere Erforschung der LIN9 Defizienz wird dazu beitragen, grundlegende Mechanismen der frühen Zellzykluskontrolle und der embryonalen Entwicklung zu verstehen. KW - Zellzyklus KW - Knockout KW - Cell cyle KW - Knockout Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30889 ER - TY - THES A1 - Herold, Andrea T1 - The role of human and Drosophila NXF proteins in nuclear mRNA export T1 - Die Rolle von humanen und Drosophila-NXF-Proteinen beim Export von mRNAs aus dem Kern N2 - A distinguishing feature of eukaryotic cells is the spatial separation of the site of mRNA synthesis (nucleus) from the site of mRNA function (cytoplasm) by the nuclear envelope. As a consequence, mRNAs need to be actively exported from the nucleus to the cytoplasm. At the time when this study was initiated, both human TAP and yeast Mex67p had been proposed to play a role in this process. Work presented in this thesis (section 2.1) revealed that TAP and Mex67p belong to an evolutionarily conserved family of proteins which are characterized by a conserved modular domain organization. This family was termed nuclear export factor (NXF) family. While the yeast genome encodes only one NXF protein (Mex67p), the genomes of higher eukaryotes encode several NXF proteins. There are two nxf genes in C. elegans and A. gambiae, four in D. melanogaster, and at least four in H. sapiens and M. musculus. It was unclear whether, apart from TAP and Mex67p, other members of this family would also be involved in mRNA export. In the first part of this thesis (2.1), several human NXF members were tested for a possible function in nuclear mRNA export. They were analyzed for their interaction with RNA, nucleoporins and other known TAP partners in vitro, and tested for their ability to promote nuclear export of a reporter mRNA in vivo. Using these assays, human NXF2, NXF3 and NXF5 were all shown to interact with the known NXF partner p15. NXF2 and NXF5 were also found to bind directly to RNA, but only NXF2 was able to bind directly to nucleoporins and to promote the nuclear export of an (untethered) reporter mRNA. Thus NXF2 possesses many and NXF3 and NXF5 possess some of the features required to serve as an export receptor for cellular mRNAs. As NXF2 and NXF3 transcripts were mainly found in testis, and the closest orthologue of NXF5 in mouse has the highest levels of expression in brain, these NXF members could potentially serve as tissue-specific mRNA export receptors. In the second part of this work (2.2), the role of different Drosophila NXF proteins and other export factors in mRNA export was investigated using double-stranded RNA interference (RNAi) in Drosophila Schneider cells. Three of the four predicted Drosophila NXF members (NXF1-3) were found to be expressed in this cell line and could be targeted by RNAi. Depletion of endogenous NXF1 inhibited growth and resulted in the nuclear accumulation of polyadenylated RNA. Fluorescence in situ hybridization revealed that export of both heat shock and non-heat shock mRNAs, including intron-containing and intronless mRNAs, was inhibited. Depleting endogenous NXF2 or NXF3 had no apparent phenotype. These results suggested that NXF1 (but not NXF2-NXF4) mediates the export of bulk mRNA in Drosophila cells. We and others have shown that human NXF proteins function as heterodimers bound to the small protein p15. Accordingly, silencing of Drosophila p15 resulted in a block of mRNA export which was indistinguishable from the export inhibition seen after targeting NXF1. These observations indicated that neither NXF1 nor p15 can promote export in the absence of the other subunit of the heterodimer. NXF1:p15 heterodimers are implicated in late steps of mRNA export, i.e. in the translocation of mRNP export cargoes across the nuclear pore complex. The mechanism by which NXF1:p15 dimers are recruited to the mRNA is unclear. A protein that is thought to play a role in this process is the putative RNA helicase UAP56. Similar to NXF1 and p15, UAP56 was shown to be essential for mRNA export in Drosophila. UAP56 is recruited cotranscriptionally to nascent transcripts and was suggested to facilitate the interaction of NXF1:p15 with mRNPs. Even though both NXF1:p15 heterodimers and UAP56 had been implicated in general mRNA export, it was unclear whether there are classes of mRNAs that require NXF1:p15, but not UAP56 or vice versa. It was also unclear what fraction of cellular mRNAs is exported by NXF1:p15 dimers and UAP56, and whether mRNAs exist that reach the cytoplasm through alternative routes, i.e. by recruiting other export receptors. To address these issues we performed a genome-wide analysis of nuclear mRNA export pathways using microarray technology (2.2.2). We analyzed the relative abundance of nearly half of the Drosophila transcriptome in the cytoplasm of Drosophila Schneider cells depleted of different export factors by RNAi. We showed that the vast majority of transcripts were underrepresented in the cytoplasm of cells depleted of NXF1, p15 or UAP56 as compared to control cells. Only a small number of mRNAs were apparently not affected by the depletions. These observations, together with the wide and similar effects on mRNA levels caused by the depletion of NXF1, p15 or UAP56, indicate that these proteins define the major mRNA export pathway in these cells. We also identified a small subset of mRNAs which appeared to be exported by NXF1:p15 dimers independently of UAP56. In contrast, no significant changes in mRNA expression profiles were observed in cells depleted of NXF2 or NXF3, suggesting that neither NXF2 nor NXF3 play an essential role in mRNA export in Drosophila Schneider cells. Crm1 is a transport receptor implicated in the export of a variety of non-mRNA and protein cargoes. In addition, human Crm1 has been suggested to be involved in the export of a specific mRNA species, serving as a "specialized" mRNA export receptor. A role of human Crm1 in the export of bulk mRNA is considered unlikely. We analyzed the role of Drosophila Crm1 in mRNA export by inhibiting Crm1 with the drug leptomycin B in Schneider cells. Subsequent microarray analysis demonstrated that the inactivation of Crm1 resulted in decreased cytoplasmic levels of less than 1% of all mRNAs, indicating that Crm1 is indeed not a major mRNA export receptor. The genome-wide analysis also revealed a feedback loop by which a block to mRNA export triggers the upregulation of genes involved in this process. This thesis also includes two sections describing projects in which I participated during my Ph.D., but which were not the main focus of this thesis. In section 2.3, the role of the different TAP/NXF1 domains in nuclear mRNA export is discussed. Section 2.4 describes results that were obtained as part of a collaboration using the RNAi technique in Schneider cells to study the function of Cdc37. N2 - Bedingt durch die räumliche Trennung von Transkription und Translation müssen mRNAs in eukaryotischen Zellen aktiv vom Kern in das Cytoplasma transportiert werden. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass das menschliche Protein TAP und Mex67p aus Hefe an diesem Prozess beteiligt sind. Mit Hilfe von Datenbankrecherchen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden (Kapitel 2.1), dass TAP und Mex67p zu einer Proteinfamilie von verwandten Proteinen gehören, deren Mitglieder sich durch eine konservierte, modulartige Domänenstruktur auszeichnen. Dieser bis dahin unbekannten Familie wurde die Bezeichnung "Nuclear Export Factor (NXF)"-Familie zugewiesen. Während das Hefegenom für nur ein NXF-Protein (Mex67p) kodiert, finden sich in den Genomen höherer Eukaryoten mehrere nxf-Gene. So konnten in C. elegans und A. gambiae zwei nxf-Gene und in D. melanogaster, H. sapiens und M. musculus vier nxf-Gene identifiziert werden. Es war jedoch unklar, ob diese bis dahin uncharakterisierten NXF-Proteine - ähnlich wie TAP und Mex67p - an mRNA-Exportprozessen beteiligt sind. Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit (2.1) untersucht, inwieweit verschiedene menschliche NXF-Proteine die typischen Charakteristika von mRNA-Exportrezeptoren aufweisen. Hierzu wurde analysiert, ob die einzelnen humanen NXF-Proteine in der Lage sind, mit RNA, Kernporenproteinen und anderen schon bekannten TAP-Interaktoren in vitro zu interagieren. Zudem wurden verschiedene menschliche NXF-Proteine auf ihre Fähigkeit getestet, den Export einer Reporter-mRNA in vivo zu stimulieren. Mit Hilfe dieser Experimente konnte nachgewiesen werden, dass NXF2, NXF3 und NXF5 in der Lage sind, mit dem TAP-Interaktor p15 zu interagieren, aber nur NXF2 und NXF5 direkt an RNA binden können. Ausschließlich NXF2 war in der Lage, direkt an Kernporenproteine zu binden und den Export der getesteten Reporter-mRNA zu stimulieren. NXF2 besitzt also die typischen Eigenschaften eines mRNA-Exportrezeptors, während bei NXF3 und NXF5 nur einige dieser Eigenschaften nachgewiesen werden konnten. Da in Säugetieren eine gewebespezifische Expression verschiedener TAP-Homologe nachgewiesen wurde, könnte es sich bei diesen NXF-Mitgliedern um gewebespezifische Exportfaktoren handeln. So wurden z.B. humane NXF2- und NXF3-Transkripte vor allem in Hodengewebe detektiert, während das nächstverwandte Ortholog von menschlichem NXF5 in Maus am stärksten in Hirngewebe exprimiert wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit (2.2) wurde die mögliche Beteiligung von Drosophila-NXF-Proteinen an mRNA-Exportprozessen mit Hilfe von RNA-Interferenz (RNAi) in Drosophila-Schneiderzellen untersucht. Die Analyse wurde dabei auf nur drei der vier NXF-Proteine (NXF1-3) beschränkt, da das vierte (NXF4) in diesen Zellen nicht exprimiert ist bzw. nicht nachgewiesen werden konnte. Die Depletion von endogenem NXF1 durch RNAi verursachte einen Wachstumsstopp der Zellen sowie eine Akkumulierung von polyadenylierten RNAs im Kern. Mit Hilfe von in-situ-Hybridisierung konnte gezeigt werden, dass in Zellen, in denen NXF1 depletiert worden war, der Export von Hitzeschock-mRNAs und Nicht-Hitzeschock-mRNAs blockiert war. Hierbei waren sowohl intronlose, als auch intronhaltige Transkripte betroffen. Die Depletion von endogenem NXF2 oder NXF3 hatte keine offensichlichen Auswirkungen auf den Phänotyp der Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass NXF1 (nicht aber NXF2-NXF4) für den Export des Großteils von mRNAs in Drosophila-Schneiderzellen verantwortlich ist. Es war postuliert worden, dass menschliche NXF-Proteine nur als Heterodimere (komplexiert mit dem Protein p15) aktiv sind. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Depletion von p15 mit Hilfe von RNAi in Drosophila-Schneiderzellen - ähnlich wie die Depletion von NXF1 - eine Blockierung des Exports von mRNAs zur Folge hat. Die nahezu identischen Effekte nach der Depletion von NXF1 oder p15 legen den Schluss nahe, dass keines der zwei Proteine ohne das andere mRNAs exportieren kann, die Bildung eines Heterodimers also auch in Drosophila essentiell ist. NXF1:p15-Heterodimere spielen eine Rolle bei späten Vorgängen des Kernexports, da sie die Translokation von mRNPs durch die Kernpore hindurch vermitteln. Unklar ist jedoch, wie NXF1:p15-Dimere an das mRNA-Substrat binden. Es war postuliert worden, dass die RNA-Helikase UAP56 dabei eine Rolle spielt. UAP56 ist ähnlich wie NXF1 und p15 essentiell für den Export von mRNAs in Drosophila. Es bindet schon während der Transkription an die RNA und könnte die Interaktion von NXF1:p15 mit dem Transkript erleichtern. Obgleich NXF1:p15 und UAP56 eindeutig als essentielle Exportfaktoren identifiziert worden waren, war die Frage, inwieweit alle mRNA-Exportvorgänge NXF1, p15 und UAP56 benötigen, noch unbeantwortet. Beispielsweise könnten mRNAs existieren, die NXF1 und p15 benötigen, nicht aber UAP56 (oder umgekehrt). Zudem könnten mRNAs existieren, die ganz ohne die Hilfe von NXF1, p15 und UAP56 exportiert werden können, z.B. indem sie andere Exportfaktoren nutzen. Um diese Frage zu beantworten, wurde eine auf Microarrays basierende "large scale"-Analyse durchgeführt (2.2.2). Dabei wurden die relativen Häufigkeiten von etwa der Hälfte aller Drosophila-Transkripte im Cytoplasma von Drosophila-Schneiderzellen bestimmt, in denen verschiedene Exportfaktoren mit Hilfe von RNAi inhibiert worden waren. Mit diesem Ansatz konnte gezeigt werden, dass im Cytoplasma von Zellen, in denen die Expression von NXF1, p15 oder UAP56 durch RNAi inhibiert worden war, der Großteil aller Transkripte im Vergleich zu Kontrollzellen unterrepräsentiert war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl NXF1:p15 also auch UAP56 essentiell für den Export der meisten mRNAs sind. Es konnte aber auch eine geringe Anzahl von Transkripten identifiziert werden, deren Abundanz im Cytoplasma sich durch die Depletion dieser drei Proteine nicht veränderte. Diese Transkripte könnten u.U. mit Hilfe von alternativen Exportrezeptoren in das Cytoplama gelangen. Des weiteren wurde eine kleine Gruppe mRNAs gefunden, die von NXF1:p15-Dimeren ohne die Hilfe von UAP56 exportiert werden. Im Gegensatz dazu konnten keine signifikanten Änderungen der mRNA Expressionsprofile in Schneiderzellen nachgewiesen werden, in denen NXF2 oder NXF3 mit Hilfe von RNAi depletiert worden waren. Dies legt den Schluss nahe, dass weder NXF2 noch NXF3 eine essentielle Aufgabe beim Export von mRNAs in diesen Zellen haben. Das Protein Crm1 ist ein Transportrezeptor, der am Export von einer Vielzahl von RNA- und Proteinsubstraten beteiligt ist. Menschliches Crm1 wurde als potentieller mRNA-Exportrezeptor für einzelne mRNAs mit spezifischen Eigenschaften gehandelt. Eine Beteiligung am generellen Export von mRNAs wurde aber als unwahrscheinlich angesehen. In dieser Arbeit wurde eine mögliche Beteiligung von Drosophila-Crm1 an mRNA-Exportprozessen untersucht (2.2.2). Durch eine Behandlung mit Leptomycin B wurde Crm1 in Drosophila-Zellen inhibiert. Die nachfolgenden Analysen mit Hilfe von Microarrays konnten bestätigen, dass Crm1 auch in Drosophila kein genereller mRNA Exportfaktor ist, da weniger als 1% aller Transkripte signifikant niedrigere Level im Cytoplasma aufwiesen. Zudem konnten bisher keine Transkripte identifiziert werden, die eindeutig von Crm1, aber ohne die Beteiligung von NXF1:p15 exportiert werden. In der auf Microarrays basierenden Analyse konnte außerdem ein "feedback loop" nachgewiesen werden, der im Falle einer Exportinhibierung zu einer Hochregulierung von Genen führt, die eine Rolle bei Kernexportprozessen spielen. Zudem werden in dieser Arbeit zwei Projekte beschrieben, an denen ich während meiner Doktorarbeit beteiligt war, die aber nicht das Hauptthema meiner Promotion waren. Kapitel 2.3 beschreibt die Analyse der Rolle der verschiedenen TAP/NXF1-Domänen beim mRNA-Kernexport. Kapitel 2.4 enthält Daten, die im Rahmen einer Kooperation erzielt wurden, bei der die Funktion von Cdc37 mit Hilfe von RNAi in Drosophila-Schneiderzellen untersucht wurde. KW - Zellkern KW - Messenger-RNS KW - Export KW - Proteine KW - Kernexport KW - mRNA KW - NXF KW - nuclear export KW - mRNA KW - NXF Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5601 ER - TY - THES A1 - Iltzsche, Fabian T1 - The Role of DREAM/MMB-mediated mitotic gene expression downstream of mutated K-Ras in lung cancer T1 - Die Rolle DREAM/MMB-vermittelter mitotischer Genexpression unterhalb von mutiertem K-Ras in Lungenkrebs N2 - The evolutionary conserved Myb-MuvB (MMB) multiprotein complex has an essential role in transcriptional activation of mitotic genes. MMB target genes as well as the MMB associated transcription factor B-Myb and FoxM1 are highly expressed in a range of different cancer types. The elevated expression of these genes correlates with an advanced tumor state and a poor prognosis. This suggests that MMB could contribute to tumorigenesis by mediating overexpression of mitotic genes. Although MMB has been extensively characterized biochemically, the requirement for MMB to tumorigenesis in vivo remains largely unknown and has not been tested directly so far. In this study, conditional knockout of the MMB core member Lin9 inhibits tumor formation in vivo in a mouse model of lung cancer driven by oncogenic K-Ras and loss of p53. The incomplete recombination observed within tumors points towards an enormous selection pressure against the complete loss of Lin9. RNA interference (RNAi)-mediated depletion of Lin9 or the MMB associated subunit B-Myb provides evidence that MMB is required for the expression of mitotic genes in lung cancer cells. Moreover, it was demonstrated that proliferation of lung cancer cells strongly depends on MMB. Furthermore, in this study, the relationship of MMB to the p53 tumor suppressor was investigated in a primary lung cancer cell line with restorable p53 function. Expression analysis revealed that mitotic genes are downregulated after p53 re-expression. Moreover, activation of p53 induces formation of the repressive DREAM complex and results in enrichment of DREAM at mitotic gene promoters. Conversely, MMB is displaced at these promoters. Based on these findings the following model is proposed: In p53-negative cells, mitogenic stimuli foster the switch from DREAM to MMB. Thus, mitotic genes are overexpressed and may promote chromosomal instability and tumorigenesis. This study provides evidence that MMB contributes to the upregulation of G2/M phase-specific genes in p53-negative cells and suggests that inhibition of MMB (or its target genes) might be a strategy for treatment of lung cancer. N2 - Der evolutionär konservierte Myb-MuvB (MMB) Multiproteinkomplex hat eine wesentliche Rolle in der transkriptionellen Aktivierung mitotischer Gene. Zielgene des MMB sowie die MMB assoziierten Transkriptionsfaktoren B-Myb und FoxM1 sind hoch exprimiert in einer Bandbreite verschiedener Krebsarten. Die erhöhte Expression dieser Gene korreliert mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium und einer geringen Prognose. Das weißt auf darauf hin, dass MMB an der Tumorentstehung beteiligt sein könnte indem es die Überexpression mitotischer Gene fördert. Obwohl MMB biochemisch eingehend untersucht wurde, ist die Erfordernis von MMB zur Tumorentstehung in vivo weitestgehend unbekannt und wurde bisher nicht direkt getestet. In dieser Studie hemmt der konditionale Knockout der MMB Kerneinheit Lin9 die Tumorbildung in vivo in einem Lungenkrebs-Mausmodell angetrieben durch onkogenes K-Ras und den Verlust von p53. Die unvollständige Rekombination welche in Tumoren beobachtet wurde deutet auf einen starken Selektionsdruck gegen den kompletten Verlust von Lin9 hin. Die Verminderung von Lin9 und der MMB- assoziierten Untereinheit B-Myb durch RNAi-Interferenz (RNAi) liefert Beweise dafür, dass MMB für die Expression mitotischer Gene in Lungenkrebszellen notwendig ist. Zudem wurde gezeigt, dass das Zellwachstum von Lungenkrebszellen stark von MMB abhängig ist. Weiterhin wurde der Zusammenhang zwischen MMB und dem p53-Tumorsuppressor in einer primären Lungenkrebszelllinie mit wiederherstellbarer p53-Funktion untersucht. Expressionsanalysen zeigen, dass mitotische Gene nach Re-expression von p53 runterreguliert werden. Außerdem induziert die Aktivierung von p53 die Bildung des repressiven DREAM-Komplexes und führt zu einer Anreicherung von DREAM an Promotoren mitotischer Gene. Im Gegenzug wird MMB an den Promotoren verdrängt. Basierend auf den Ergebnissen wird das folgende Model vorgeschlagen: In p53- negativen Zellen begünstigen mitogene Reize den Wechsel von DREAM zu MMB. Dadurch werden mitotische Gene überexprimiert und können so chromosomale Instabilität und Tumorentstehung fördern Diese Studie liefert Hinweise, dass MMB an der Hochregulation G2/M- Phasenspezifischer Gene in p53-negativen Zellen beteiligt ist und dass die Hemmung von MMB (oder seiner Zielgene) eine Strategie zur Behandlung von Lungenkrebs sein könnte. KW - Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom (NSCLC) KW - Lungenkrebs KW - lung cancer KW - DREAM complex KW - MMB KW - K-Ras KW - mitotic gene expression KW - Mitose Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154108 ER - TY - THES A1 - Dornhaus, Anna T1 - The role of communication in the foraging process of social bees T1 - Die Rolle der Kommunikation beim Fouragieren von sozialen Bienen N2 - In the various groups of social bees, different systems of communication about food sources occur. These communication systems are different solutions to a common problem of social insects: efficiently allocating the necessary number of workers first to the task of foraging and second to the most profitable food sources. The solution chosen by each species depends on the particular ecological circumstances as well as the evolutionary history of that species. For example, the outstanding difference between the bumble bee and the honey bee system is that honey bees can communicate the location of profitable food sources to nestmates, which bumble bees cannot. To identify possible selection pressures that could explain this difference, I have quantified the benefits of communicating location in honey bees. I show that these strongly depend on the habitat, and that communicating location might not benefit bees in temperate habitats. This could be due to the differing spatial distributions of resources in different habitats, in particular between temperate and tropical regions. These distributions may be the reason why the mostly temperate-living bumble bees have never evolved a communication system that allows them to transfer information on location of food sources, whereas most tropical social bees (all honey bees and many stingless bees) are able to recruit nestmates to specific points in their foraging range. Nevertheless, I show that in bumble bees the allocation of workers to foraging is also regulated by communication. Successful foragers distribute in the nest a pheromone which alerts other bees to the presence of food. This pheromone stems from a tergite gland, the function of which had not been identified previously. Usage of a pheromone in the nest to alert other individuals to forage has not been described in other social insects, and might constitute a new mode of communicating about food sources. The signal might be modulated depending on the quality of the food source. Bees in the nest sample the nectar that has been brought into the nest. Their decision whether to go out and forage depends not only on the pheromone signal, but also on the quality of the nectar they have sampled. In this way, foraging activity of a bumble bee colony is adjusted to foraging conditions, which means most bees are allocated to foraging only if high-quality food sources are available. In addition, foraging activity is adjusted to the amount of food already stored. In a colony with full honeypots, no new bees are allocated to foraging. These results help us understand how the allocation of workers to the task of food collection is regulated according to external and internal nest conditions in bumble bees. N2 - Innerhalb der sozialen Bienen tritt eine Vielzahl verschiedender Systeme zur Kommunikation über Futterquellen auf. Diese Kommunikationssysteme sind verschiedene Lösungen eines Problems, mit dem alle sozialen Insekten konfrontiert sind: wie lässt sich regulieren, daß die benötigte Anzahl an Arbeiterinnen der Aufgabe des Futtersammelns, und dazu möglichst den besten vorhandenen Futterquellen, zugeteilt wird? Die von einer Art gewählte Lösung hängt von den speziellen ökologischen Rahmenbedingungen, aber auch von der evolutionären Vorgeschichte dieser Art ab. Ein herausragender Unterschied zwischen Honigbienen und Hummeln beispielsweise ist, daß Honigbienen den Ort einer profitablen Futterquelle ihren Nestgenossinnen mitteilen können, was Hummeln nicht tun. Um Selektionsdrücke zu identifizieren, die diesen Unterschied bewirken könnten, habe ich den Nutzen einer solchen Kommunikation quantifiziert. Es zeigt sich, daß dieser Nutzen stark vom Habitat der Bienen abhängt, und daß Kommunikation über den Ort von Futterquellen in temperaten Habitaten unter Umständen keine Vorteile für Bienen bedeutet. Das könnte daran liegen, daß sich die räumliche Verteilung der Ressourcen zwischen Habitaten, und besonders zwischen temperaten Gebieten und den Tropen, unterscheidet. Dieser Umstand könnte der Grund dafür sein, daß die hauptsächlich in temperaten Regionen lebenden Hummeln nie eine Methode zur Kommunikation von Information über den Ort von Futterquellen evolviert haben, während die meisten tropischen sozialen Bienenarten (alle Honigbienen und viele stachellose Bienen) Nestgenossinnen zu bestimmten Orten rekrutieren können. Jedoch stellte sich in meinen Experimenten heraus, daß auch bei Hummeln die Zuordnung von Arbeiterinnen zur Aufgabe des Futtersammelns über Kommunikation reguliert wird. Erfolgreiche Sammlerinnen produzieren ein Pheromon, welches andere Hummeln auf die Präsenz einer Futterquelle aufmerksam macht. Dieses Pheromon stammt aus einer Tergaldrüse am Abdomen, deren Funktion bisher nicht bekannt war. Die Benutzung eines Pheromons zur Kommunikation über Futterquellen im Nest ist von anderen sozialen Insekten bisher nicht bekannt. Das Pheromonsignal wird vermutlich abhängig von der Qualität der Futterquelle moduliert. Hummeln im Nest kosten außerdem den neu eingetragenen Nektar. Ihre Entscheidung auszufliegen und zu sammeln ist sowohl vom Pheromonsignal als auch von der Qualität des von ihnen gekosteten Nektars abhängig. Die Sammelaktivität der Hummelkolonie wird damit an die Sammelbedingungen angepasst – nur wenn profitable Futterquellen vorhanden sind, werden viele Sammlerinnen aktiviert. Zusätzlich hängt die Sammelaktivität von der Vorratssituation im Stock ab. Sind die Honigtöpfe gefüllt, werden keine neuen Arbeiterinnen zum Sammeln aktiviert. Diese Ergebnisse helfen uns zu verstehen, wie bei Hummeln die Anzahl der aktiven Sammlerinnen je nach den Bedingungen innerhalb und außerhalb der Kolonie reguliert wird. KW - Hummel KW - Bienen KW - Kommunikation KW - Nahrungserwerb KW - Evolution KW - Pheromon KW - Schwänzeltanz KW - Evolution KW - Rekrutierung KW - Hummeln KW - Bombus KW - Futtersammeln KW - foraging KW - recruitment KW - evolution KW - bumble bees KW - Bombus KW - waggle dance Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3468 ER - TY - THES A1 - Krones, David T1 - The Role of Acid Sphingomyelinase in \(Staphylococcus\) \(aureus\) Infection of Endothelial Cells T1 - Die Rolle der sauren Sphingomyelinase bei \(Staphylococcus\) \(aureus\) Infektionen von Endothelzellen N2 - Staphylococcus aureus is a human bacterial pathogen responsible for a variety of diseases including bacterial pneumonia and sepsis. Recent studies provided an explanation, how S. aureus and its exotoxins contribute to the degradation of endothelial junction proteins and damage lung tissue [4]. Previous findings were indicating an involvement of acid sphingomyelinase (ASM) activity in cell barrier degradation [5]. In the presented study the impact of singular virulence factors, such as staphylococcal α-toxin, on in vitro cell barrier integrity as well as their ability to elicit an activation of ASM were investigated. Experiments with bacterial supernatants performed on human endothelial cells demonstrated a rapid dissociation after treatment, whereas murine endothelial cells were rather resistant against cell barrier degradation. Furthermore, amongst all tested staphylococcal toxins it was found that only α-toxin had a significant impact on endothelial junction proteins and ASM activity. Ablation of this single toxin was sufficient to protect endothelial cells from cell barrier degradation and activation of ASM was absent. In this process it was verified, that α-toxin induces a recruitment of intracellular ASM, which is accompanied by rapid and oscillating changes in cytoplasmic Ca2+ concentration and an increased exposure of Lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP1) on the cell surface. Recruitment of lysosomal ASM is associated, among other aspects, to plasma membrane repair and was previously described to be involved with distinct pathogens as well as other pore forming toxins (PFT). However, with these findings a novel feature for α-toxin has been revealed, indicating that the staphylococcal PFT is able to elicit a similar process to previously described plasma membrane repair mechanisms. Increased exposure and intake of surface membrane markers questioned the involvement of ASM activity in S. aureus internalization by non-professional phagocytes such as endothelial cells. By modifying ASM expression pattern as well as application of inhibitors it was possible to reduce the intracellular bacterial count. Thus, a direct connection between ASM activity and S. aureus infection mechanisms was observed, therefore this study exemplifies how S. aureus is able to exploit the host cell sphingolipid metabolism as well as benefit of it for invasion into non-professional phagocytic cells N2 - Staphylococcus aureus ist ein bakterieller Erreger, der für eine Vielzahl von Erkrankungen des Menschen verantwortlich ist, darunter bakterielle Lungenentzündung und Sepsis. Neuere Studien konnten einen Ansatz dafür liefern, wie S. aureus und seine Exotoxine zur Degradation von endothelialen Verbindungsproteinen beitragen und das Lungengewebe schädigen. Weitere Befunde weisen auf eine Beteiligung der sauren Sphingomyelinase (ASM) bei der Degradation der Zellbarriere hin. In der vorliegenden Studie soll der Einfluss einzelner Virulenzfaktoren, wie z. B. Staphylokokkus α-Toxin, auf die Integrität der Zellbarriere in vitro sowie deren Fähigkeit, eine Aktivierung der ASM hervorzurufen, untersucht werden.Experimente mit bakteriellen Überständen die an humanen Endothelzellen durchgeführt wurden, zeigten eine rasche Dissoziation nach Behandlung, während murine Endothelzellen vorwiegend resistent gegen eine Degradation der Zellbarriere waren. Darüber hinaus wurde unter allen getesteten Staphylokokken-Toxinen festgestellt, dass nur α-Toxin einen signifikanten Einfluss auf endotheliale Verbindungssproteine und ASM-Aktivität hat. Die genetische Ablation des Toxins alleine reichte aus, um Endothelzellen vor einer Degradation der Zellbarriere zu schützen, und die Aktivierung von ASM blieb aus. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass α-Toxin eine Rekrutierung von intrazellulärem ASM induziert, die mit schnellen oszillierenden Veränderungen der zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration und einer erhöhten Exposition von Lysosome associated membrane protein 1 (LAMP1) an der Zelloberfläche einhergeht. Die Rekrutierung lysosomaler ASM ist u.a. mit der Reparatur von Plasmamembran assoziiert und wurde bereits im Zusammenhang mit verschiedenen Pathogenen sowie anderer porenbildende Toxine (PFT) beschrieben. Mit diesen Befunden konnte jedoch eine neue Eigenschaft für α-Toxin beschrieben werden, die darauf hindeutet, dass das Staphylokokken-PFT einen ähnlichen Prozess auslösen kann wie zuvor beschriebene Plasmamembran-Reparaturmechanismen. Die vermehrte Exposition und Aufnahme von Oberflächenmembranmerkmalen stellte die Beteiligung der ASM-Aktivität an der Internalisierung von S. aureus durch nicht-professionelle Phagozyten wie Endothelzellen in Frage. Durch Modifikation des ASM-Expressionsmusters sowie Applikation von Inhibitoren war es möglich, die intrazelluläre Keimzahl zu reduzieren. Somit konnte ein direkter Zusammenhang zwischen ASM-Aktivität und den Infektionsmechanismen von S. aureus beobachtet werden. Diese Studie verdeutlicht somit, wie S. aureus den Sphingolipid-Stoffwechsel der Wirtszelle ausnutzen und für die Invasion in nicht-professionelle phagozytische Zellen nutzen kann KW - Staphylococcus aureus KW - Endothelzelle KW - Endothelial cells KW - Acid Sphingomyelinase KW - Plasma membrane repair Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-290492 ER - TY - THES A1 - Froese, Alexander T1 - The Popeye domain containing gene 2 (Popdc2): Generation and functional characterization of a null mutant in mice and promoter analysis T1 - Das Popeye domain containing 2 (Popdc2) Gen : Herstellung und funktionelle Charakterisierung einer Nullmutante in Mäusen und die Analyse des Promoters N2 - In the present study a knockout mouse model of the Popeye domain containing gene 2 (Popdc2) was generated and functionally characterized. The Popdc2 null mutants were viable with an apparent normal life span. ß-galactosidase staining to visualize the expression of the Popdc2-LacZ transgene revealed the presence of the Popdc2 in heart, bladder, smooth and skeletal muscles. In the heart LacZ was found to be present in cardiac myocytes with elevated levels in the myocytes of the cardiac conduction system. Holter ECGs records of the heart function of the 8 months (but not in 3 and 6 months) old mutant and WT littermates revealed a pronounced sinus bradycardia in the mutant mice in response to three different stress regimens: isoproterenol infusion, mental stress and a physical exercise. Histological examination of the Popdc2 null mutants SAN revealed structural alterations as was detected by HCN4 staining. Moreover, volume measurements using 3-D reconstructions of serial sections stained with HCN4 antibody revealed a volume reduction of about 30% in the mutant SAN. Taken together data presented in this study suggest that the Popdc2 KO mouse line may serve as an animal model of human sick sinus syndrome. In the second part of this thesis the Popdc2 gene promoter was analyzed. Three transcription factors binding sites were predicted in the promoter region and characterized. N2 - Im Vordergrund dieser Arbeit stand die Generierung und Analyse der Popdc2 Knockout Maus. Die Expression des Popdc2-LacZ Konstruktes war vorwiegend im Herz, der Blase, sowie in der glatten und Skelett Muskulatur detektierbar/sichtbar. Der Herzrhythmus 8 Monate alter Popdc2 Mutanten und WT Nachkommen wurde anhand von Elektrokardiogrammen (EKGs) untersucht. Bei dieser Analyse wurden die Mäuse verschiedenen Stresssituationen ausgesetzt, d.h. Injektion von Isoproterenol, mentaler bzw. physikal. Stress. Die Aufzeichnung der EKG-Kurve erfolgte direkt nach der Stressinduktion über eine Zeitspanne von 6 Minuten. Es konnte gezeigt werden, dass die Mäuse eine ausgeprägte Sinus Bradykardie entwickelten. Anhand histologischer Schnitte 8 Monate alter Popdc2 KO SAN Mäuse konnten strukturelle Veränderungen im Vergleich zum WT aufgedeckt werden. Auf der Grundlage serieller Schnitte, gefärbt mit HCN4 Antikörper, wurden 3D-Rekonstruktionen erzeugt. Dabei stellte sich heraus, dass das Volumen des SAN in Popdc2 Mutante um 30% gegenüber dem Wildtyp verringert ist. Auf Grund der hier vorgestellten Daten scheint die Popdc2 KO Maus ein nützliches Tiermodell im Hinblick auf menschl. Sinus-Erkrankungen zu sein. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Popdc2 Promotor Analyse. In Promotorregion konnten drei Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren charakterisiert werden. Um weitere Faktoren, die eine Rolle bei der Popdc2 Genregulation spielen könnten, zu identifizieren sind weiterführende Studien unerlässlich. KW - Herz KW - Herzrhythmusstörung KW - Transgene Tiere KW - Popdc2 KW - KO Mäuse KW - Bradikardia KW - Popdc2 KW - KO mice KW - Heart KW - Bradycardia Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26473 ER - TY - THES A1 - Grue, Pernille T1 - The physiological role of the two isoforms of DNA topoisomerase II in human cells T1 - Die Physiologische Rolle der beiden Isoformen der DNS Topoisomerase II in humanen Zellen N2 - Unique functions of DNA topoisomerase IIalpha and IIbeta have been suggested. A human cell line which carries a homozygeous mutation of the nuclear localization sequence of the topoisomerase IIalpha gene expresses the isoform outside the nucleus at the onset of mitosis. At mitosis topoisomerase IIbeta diffused away from the chromatin despite the nuclear lack of the IIalpha-form. Chromosome condensation and disjunction was performed with the aid of cytosolic topoisomerase IIalpha which bound to the mitotic chromatin with low affinity. Consequently an increased rate of nondisjunction is observed in these cells. It is concluded that high affinity chromatin binding of topoisomerase IIalpha is essential for chromosome condensation/disjunction and that topoisomerase IIbeta does not adopt these functions. A centrosomal protein was recognized by topoisomerase IIalpha. This topoisomerase IIalpha-like protein resembles a modified form of topoisomerase IIalpha with an apparent size of 205 kDa compared to 170 kDa. The expression of the protein is constant in all stages of the cell cycle and it appears in proliferating as well as in resting cells. If there is not sufficient topoisomerase IIalpha present at mitosis the centrosomal proteins might adopt the function and a mitotic catastrophe in the cells could therefore be prevented. N2 - Die exakt Funktion der zwei Isoformen der DNS Topoisomerase II, genannt Topoisomerase IIalpha und Topoisomerase IIbeta ist bisher unbekannt. Eine humanen Zelllinie hatte eine homozygote Deletion in der Nukleären Lokalisations Sequenz im Topoisomerase IIalpha Gen. In dieser Zelllinie wurde Topoisomerase IIalpha während der Interphase außerhalb des Kerns exprimiert. Während der Mitose diffundierte die gesamte Topoisomerase IIbeta trotz intranukleärem Mangel an IIalpha-Isoform vom Chromatin ab. Die Kondensation der Chromosomen und die Disjunktion mit der Hilfe von zytosolischen Topoisomerase IIalpha fand statt, die sich mit niedriger Affinität an mitotisches Chromatin bindet. Folglich kann eine zunehmende Rate von non-Disjunktion in diesen Zellen festgestellt werden. Daraus kann geschlossen werden, daß die hohe Affinität der Chromatin-Bindung von Topoisomerase IIalpha essentiell für die chromosomomale Kondensation und Disjunktion ist. Außerdem konnte Topoisomerase IIbeta nicht die Funktionen der IIalpha-Isoform übernehmen. Ein zentrosomales Protein wird von der humanen Topoisomerase IIalpha erkannt. Das Topoisomerase IIalpha-ähnliche Protein gleicht einer modifizierten Form von Topoisomerase IIalpha mit einer vermeintlichen Größe von 205 kDa im Vergleich zu 170 kDa. Die Expression der Topoisomerase IIalpha ist konstant in allen Phasen des Zellzyklus und es taucht in proliferierenden und in ruhende Zellen auf. Folglich könnte aktive Topoisomerase II von diesen Pool an aktiven Enzymen bei Anfang der Mitose freigesetzt werden, um die fehlende Enzymaktivität zu ersetzen. KW - DNS-Gyrase KW - DNS-Topoisomerasen KW - Physiologie KW - Topoisomerase II alpha KW - Mitose KW - Kondensation KW - non-Disjunktion KW - zentrosomales Protein KW - topoisomerase II alpha KW - mitosis KW - condensation KW - non-disjunction KW - centrosomal protein Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1369 ER - TY - THES A1 - Kelber, Christina T1 - The olfactory system of leafcutting ants: neuroanatomy and the correlation to social organization T1 - Das olfaktorische System der Blattschneiderameisen: Neuroanatomie und Korrelation zur sozialen Organisation N2 - In leaf-cutting ants (genera Atta and Acromyrmex), the worker caste exhibits a pronounced size-polymorphism, and division of labor is largely dependent on worker size (alloethism). Behavioral studies have shown a rich diversity of olfactory-guided behaviors, and the olfactory system seems to be highly developed and very sensitive. To allow fine-tuned behavioral responses to different tasks, adaptations within the olfactory system of different sized workers are expected. In a recent study, two different phenotypes of the antennal lobe of Atta vollenweideri workers were found: MG- and RG-phenotype (with and without a macroglomerulus, MG). The existence of the macroglomerulus is correlated to the body size of workers, with small workers showing the RG-phenotype and large workers showing the MG-phenotype. In the MG, the information about the releaser component of the trail-pheromone is processed. In the first part of my PhD-project, I focus on quantifying behavioral differences between different sized workers in Atta vollenweideri. The study analyzes the trail following behavior; which can be generally performed by all workers. An artificial trail consisting of the releaser component of the trail-pheromone in decreasing concentration was used to test the trail-following performance of individual workers. The trail-following performance of the polymorphic workers is depended of the existence of the MG in the antennal lobe. Workers possessing the MG-phenotype were significantly better in following a decreasing trail then workers showing the RG-phenotype. In the second part I address the question if there are more structural differences, besides the MG, in the olfactory system of different sized workers. Therefore I analyze whether the glomerular numbers are related to worker size. The antennal lobes of small workers contain ~390 glomeruli (low-number; LN-phenotype), and in large workers I found a substantially higher number of ~440 glomeruli (high-number; HN-phenotype). All LN-phenotype workers and some of the small HN-phenotype workers do not possess an MG (LN-RG-phenotype and HN-RG-phenotype) at all, whereas the remaining majority of HN-phenotype workers do possess an MG (HN-MG-phenotype). Mass-stainings of antennal olfactory receptor neurons revealed that the sensory tracts divide the antennal lobe into six clusters of glomeruli (T1-T6). In the T4-cluster ~50 glomeruli are missing in the LN-phenotype workers. Selective staining of single sensilla and their associated receptor neurons showed that T4-glomeruli are innervated by receptor neurons from the main type of olfactory sensilla, the Sensilla trichodea curvata which are also projecting to glomeruli in all other clusters. The other type of olfactory sensilla, the Sensilla basiconica, exclusively innervates T6-glomeruli. Quantitative analyses revealed a correlation between the number of Sensilla basiconica and the volume of T6 glomeruli in different sized workers. The results of both behavioral and neuroanatomical studies in Atta vollenweideri suggest that developmental plasticity of antennal-lobe phenotypes promotes differences in olfactory-guided behavior which may underlie task specialization within ant colonies. The last part of my project focuses on the evolutionary origin of the macroglomerulus and the number of glomeruli in the antennal lobe. I compared the number, volumes and position of the glomeruli of the antennal lobe of 25 different species from all three major Attini groups (lower, higher and leaf-cutting Attini). The antennal lobes of all investigated Attini comprise a high number of glomeruli (257-630). The highest number was found in Apterostigma cf. mayri. This species is at a basal position within the Attini phylogeny, and a high number of glomeruli might have been advantageous in the evolution of the advanced olfactory systems of this Taxa. The macroglomerulus can be found in all investigated leaf-cutting Attini, but in none of the lower and higher Attini species. It is found only in large workers, and is located close to the entrance of the antennal nerve in all investigated species. The results indicate that the presence of a macroglomerulus in large workers of leaf-cutting Attini is a derived overexpression of a trait in the polymorphic leaf-cutting species. It presumably represents an olfactory adaptation to elaborate foraging and mass recruitment systems, and adds to the complexity of division of labor and social organization known for this group. N2 - Die Arbeiterinnenkaste der Blattschneideameisen zeigt einen ausgeprägten Größenpolymorphismus. Man findet hier einen Alloethismus; unterschiedlich große Arbeiterinnen führen verschiedene Arbeiten im Stock durch. Verschiedene Verhaltensversuche haben gezeigt, dass viele Verhaltensweisen der Arbeiterinnen olfaktorisch gesteuert werden und dass das olfaktorische System hoch entwickelt und sehr sensitiv ist. Es ist wahrscheinlich, dass sich im olfaktorischen System verschieden großer Arbeiterinnen Anpassungen finden lassen, die gut abgestimmte Verhaltensantworten auf die verschiedenen Aufgaben der Tiere ermöglichen. Und tatsächlich zeigt eine aktuelle Studie, dass zwei verschiedene Phänotypen des Antennallobus der Arbeiterin bei Atta vollenweideri existieren, der MG- und der RG-Phänotyp (mit oder ohne Makroglomerulus, MG). Die Existenz des Makroglomerulus kann mit der Körpergröße der Tiere korreliert werden: bei kleinen Arbeiterinnen findet man den RG-Phänotyp, bei großen den MG-Phänotyp. Im Makroglomerulus wird die olfaktorische Information über den verhaltensauslösenden Bestandteil des Spurpheromons verarbeitet. Im ersten Tel meiner Doktorarbeit versuche ich, Verhaltensunterschiede verschieden großer Atta vollenweideri Arbeiterinnen zu quantifizieren. Dazu konzentriere ich mich auf das Spurfolgeverhalten, dass bei Arbeiterinnen jeder Größe beobachtet werden kann. Um die Spurfolgeleistung einzelner Arbeiterinnen zu testen, wurde eine künstlich gelegte Spur mit abnehmender Konzentration des verhaltensauslösenden Bestandteils des Spurpheromons verwendet. Die Spurfolgeleistung der Arbeiterinnen hängt von der Existenz des Makroglomerulus im Antennallobus ab. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit untersuche ich die Neuroanatomie des olfaktorischen Systems bei verschieden großen Atta vollenweideri Arbeiterinnen auf eventuelle weitere anatomische Unterschiede neben dem Makroglomerulus – im Besonderen ob die Anzahl an Glomeruli bei verschieden großen Tieren unterschiedlich ist. Die Antennalloben kleiner Arbeiterinnen beinhalten cirka 390 Glomeruli (geringe Anzahl, LN-Phänotyp), die Antennalloben großer Arbeiterinnen dagegen cirka 440 Glomeruli (hohe Anzahl, HN-Phänotyp). Alle Arbeiterinnen mit dem LN-Phänotyp und einige mit dem HN-Phänotyp besitzen keinen Makroglomerulus (LN-RG-Phänotyp und HN-RG-Phänotyp). Die meisten Tiere mit HN-Phänotyp besitzen jedoch einen Makroglomerulus (HN-MG-Phänotyp). Massenfärbungen der olfaktorischen Rezeptorneuron-Axone zeigen, dass der Antennennerv sich in sechs Trakte teilt und so die Glomeruli in sechs verschiedene Glomerulicluster unterteilt werden können (T1-T6). Bei den Arbeiterinnen mit LN-Phänotyp fehlen cirka 50 Glomeruli im T4-Cluster. Einzelsensillenfärbungen zeigen, dass die Rezeptorneuronen der olfaktorischen Sensilla trichodea curvata alle sechs Cluster, also auch das T4-Cluster innervieren. Ein weiterer Sensillentyp, die Sensilla basiconica, innerviert ausschließlich Glomeruli im T6-Cluster. Quantitative Analysen ergeben eine Korrelation zwischen der Anzahl der Sensilla basiconica auf der Arbeiterinnenantenne und des durchschnittlichen Volumens der T6-Glomeruli bei verschieden großen Tieren. Die Ergebnisse der Verhaltensversuche und der neuroanatomischen Studien könnten darauf hinweisen, dass Unterschiede im Verhalten auf olfaktorische Reize möglicherweise durch die Entwicklungsplastizität der Antenallobus-Phänotypen ausgelöst werden. Dies könnte innerhalb der Kolonie die Grundlage der Spezialisierung von Arbeiterinnen auf bestimmte Arbeiten sein. Den letzten Teil meiner Doktorarbeit nimmt eine Untersuchung über den evolutionären Ursprung des Makroglomerulus und der Anzahl der Glomeruli im Antennallobus ein. Dazu verglich ich in den Antennalloben 25 verschiedener Arten aus den drei Attini-Gruppen (basale, höhere und blattschneidende Attini) die Anzahl, das Volumen und die Position der Glomeruli. Die Antennalloben aller untersuchten Arten bestehen aus sehr vielen Glomeruli (257-630). Der Makroglomerulus findet sich in allen untersuchten blattschneidenden Attini-Arten, aber nie in den untersuchten basalen und höheren Attini-Arten. Er findet sich nur bei größeren Arbeiterinnen und befindet sich immer in der Nähe des Antennennerveingangs. Dies bedeutet, dass es sich bei der Existenz des Makroglomerulus in den großen Blattschneidearbeiterinnen um eine abgeleitete Überexpression eines Merkmals innerhalb der polymorphen blattschneidenden Attini-Arten handelt. Der Makroglomerulus ist wahrscheinlich eine olfaktorische Anpassung an das hoch entwickelte Fouragier- und Rekrutiersystem dieser Arten. Er ist ein Baustein der komplexen Arbeitsteilung und der komplexen sozialen Organisation, die für die Arten dieser Gruppe bekannt sind. KW - Gehirn KW - Polymorphismus KW - Arbeitsteilung KW - Geruchswahrnehmung KW - Antennallobus KW - Glomeruli KW - olfaktorische Rezeptorneurone KW - Brain KW - polymorphism KW - antennal lobe KW - glomeruli KW - dvision of labor Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47769 ER - TY - THES A1 - Cook, Mandy T1 - The neurodegenerative Drosophila melanogaster AMPK mutant loechrig T1 - The neurodegenerative Drosophila melanogaster AMPK Mutante loechrig N2 - In dieser Doktorarbeit wird die Drosophila Mutante loechrig (loe), die progressive Degeneration des Nervensystems aufweist, weiter beschrieben. In der loe Mutante fehlt eine neuronale Isoform der γ- Untereinheit der Proteinkinase AMPK (AMP-activated protein kinase). Die heterotrimere AMPK (auch als SNF4Aγ bekannt) kontrolliert das Energieniveau der Zelle, was ständiges Beobachten des ATP/AMP- Verhältnis erfordert. AMPK wird durch niedrige Energiekonzentrationen und Beeinträchtigungen im Metabolismus, wie zum Beispiel Sauerstoffmangel, aktiviert und reguliert mehrere wichtige Signaltransduktionswege, die den Zellmetabolismus kontrollieren. Jedoch ist die Rolle von AMPK im neuronalen Überleben noch unklar. Eines der Proteine, dass von AMPK reguliert wird, ist HMGR (hydroxymethylglutaryl-CoA- reductase), ein Schlüsselenzym in der Cholesterin- und Isoprenoidsynthese. Es wurde gezeigt, dass wenn die Konzentration von HMGR manipuliert wird, auch der Schweregrad des neurodegenerativen Phänotyps in loe beeinflusst wird. Obwohl die regulatorische Rolle von AMPK auf HMGR in Drosophila konserviert ist, können Insekten Cholesterin nicht de novo synthetisieren. Dennoch ist der Syntheseweg von Isoprenoiden zwischen Vertebraten und Insekten evolutionär konserviert. Isoprenylierung von Proteinen, wie zum Beispiel von kleinen G-Proteinen, stellt den Proteinen einen hydophobischen Anker bereit, mit denen sie sich an die Zellmembran binden können, was in anschließender Aktivierung resultieren kann. In dieser Doktorarbeit wird gezeigt, dass die loe Mutation die Prenylierung von Rho1 und den LIM-Kinasesignalweg beeinflusst, was eine wichtige Rolle im Umsatz von Aktin und axonalem Auswachsen spielt. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Mutation in LOE, Hyperaktivität des Isoprenoidsynthesewegs verursacht, was zur erhöhten Farnesylierung von Rho1 und einer dementsprechend höheren Konzentration von Phospho- Cofilin führt. Eine Mutation in Rho1 verbessert den neurodegenerativen Phänotyp und die Lebenserwartung von loe. Der Anstieg vom inaktiven Cofilin in loe führt zu einer Zunahme von filamentösen Aktin. Aktin ist am Auswachen von Neuronen beteiligt und Experimente in denen loe Neurone analysiert wurden, gaben wertvolle Einblicke in eine mögliche Rolle die AMPK, und dementsprechend Aktin, im Neuronenwachstum spielt. Des Weiteren wurde demonstriert, dass Neurone, die von der loe Mutante stamen, einen verlangsamten axonalen Transport aufweisen, was darauf hinweist dass Veränderungen, die durch den Einfluss von loe auf den Rho1 Signalweg im Zytoskelettnetzwerk hervorgerufen wurden, zur Störung des axonalen Transports und anschließenden neuronalen Tod führen. Es zeigte außerdem, dass Aktin nicht nur am neuronalen Auswachsen beteiligt ist, sondern auch wichtig für die Aufrechterhaltung von Neuronen ist. Das bedeutet, dass Änderungen der Aktindynamik zur progressiven Degeneration von Neuronen führen kann. Zusammenfassend unterstreichen diese Ergebnisse die wichtige Bedeutung von AMPK in den Funktionen und im Überleben von Neuronen und eröffnen einen neuartigen funktionellen Mechanismus in dem Änderungen in AMPK neuronale Degeneration hervorrufen kann. N2 - In this thesis the Drosophila mutant loechrig (loe), that shows progressive degeneration of the nervous system, is further described. Loe is missing a neuronal isoform of the protein kinase AMPK γ subunit (AMP-activated protein kinase- also known as SNF4Aγ) The heterotrimeric AMPK controls the energy level of the cell, which requires constant monitoring of the ATP/AMP levels. It is activated by low energy levels and metabolic insults like oxygen starvation and regulates multiple important signal pathways that control cell metabolism. Still, its role in neuronal survival is unclear. One of AMPK’s downstream targets is HMGR (hydroxymethylglutaryl-CoA- reductase), a key enzyme in cholesterol and isoprenoid synthesis. It has been shown that manipulating the levels of HMGR affects the severity of the neurodegenerative phenotype in loe. Whereas the regulatory role of AMPK on HMGR is conserved in Drosophila, insects cannot synthesize cholesterol de novo. However, the synthesis of isoprenoids is a pathway that is evolutionarily conserved between vertebrates and insects. Isoprenylation of target proteins like small G-proteins provides a hydrophobic anchor that allows the association of these proteins with membranes and following activation. This thesis shows that the loe mutation interferes with the prenylation of Rho1 and the regulation of the LIM kinase pathway, which plays an important role in actin turnover and axonal outgrowth. The results suggest that the mutation in LOE, causes hyperactivity of the isoprenoid synthesis pathway, which leads to increased farnesylation of RHO1 and therefore higher levels of phospho-cofilin. A mutation in Rho1 improves the neurodegenerative phenotype and life span. The increased inactive cofilin amount in loe leads to an up regulation of filamentous actin. Actin is involved in neuronal outgrowth and experiments analyzing loe neurons gave valuable insights into a possible role of AMPK and accordingly actin on neurite growth and stability. It was demonstrated that neurons derived from loe mutants exhibit reduces axonal transport suggesting that changes in the cytoskeletal network caused by the effect of loe on the Rho1 pathway lead to disruptions in axonal transport and subsequent neuronal death. It also shows that actin is not only involved in neuronal outgrowth, its also important in maintenance of neurons, suggesting that interference with actin dynamics leads to progressive degeneration of neurons. Together, these results further support the importance of AMPK in neuronal function and survival and provide a novel functional mechanisms how alterations in AMPK can cause neuronal degeneration KW - Taufliege KW - Nervendegeneration KW - AMP KW - Proteinkinasen KW - Molekulargenetik KW - Drosophila KW - Neurodegeneration KW - AMPK KW - Drosophila KW - Neurodegeneration KW - Rho Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72027 ER - TY - THES A1 - Paul, Jürgen T1 - The Mouthparts of Ants T1 - Die Mundwerkzeuge der Ameisen N2 - Ant mandible movements cover a wide range of forces, velocities and precision. The key to the versatility of mandible functions is the mandible closer muscle. In ants, this muscle is generally composed of distinct muscle fiber types that differ in morphology and contractile properties. Volume proportions of the fiber types are species-specific and correlate with feeding habits. Two biomechanical models explain how the attachment angles are optimized with respect to force and velocity output and how filament-attached fibers help to generate the largest force output from the available head capsule volume. In general, the entire mandible closer muscle is controlled by 10-12 motor neurons, some of which exclusively supply specific muscle fiber groups. Simultaneous recordings of muscle activity and mandible movement reveal that fast movements require rapid contractions of fast muscle fibers. Slow and accurate movements result from the activation of slow muscle fibers. Forceful movements are generated by simultaneous co-activation of all muscle fiber types. For fine control, distinct fiber bundles can be activated independently of each other. Retrograde tracing shows that most dendritic arborizations of the different sets of motor neurons share the same neuropil in the suboesophageal ganglion. In addition, some motor neurons invade specific parts of the neuropil. The labiomaxillary complex of ants is essential for food intake. I investigated the anatomical design of the labiomaxillary complex in various ant species focusing on movement mechanisms. The protraction of the glossa is a non muscular movement. Upon relaxation of the glossa retractor muscles, the glossa protracts elastically. I compared the design of the labiomaxillary complex of ants with that of the honey bee, and suggest an elastic mechanism for glossa protraction in honey bees as well. Ants employ two different techniques for liquid food intake, in which the glossa works either as a passive duct (sucking), or as an up- and downwards moving shovel (licking). For collecting fluids at ad libitum food sources, workers of a given species always use only one of both techniques. The species-specific feeding technique depends on the existence of a well developed crop and on the resulting mode of transporting the fluid food. In order to evaluate the performance of collecting liquids during foraging, I measured fluid intake rates of four ant species adapted to different ecological niches. Fluid intake rate depends on sugar concentration and the associated fluid viscosity, on the species-specific feeding technique, and on the extent of specialization on collecting liquid food. Furthermore, I compared the four ant species in terms of glossa surface characteristics and relative volumes of the muscles that control licking and sucking. Both probably reflect adaptations to the species-specific ecological niche and determine the physiological performance of liquid feeding. Despite species-specific differences, single components of the whole system are closely adjusted to each other according to a general rule. N2 - Ameisenmandibeln führen eine Vielzahl verschiedener Bewegungen bezüglich Kraft, Geschwindigkeit und Präzision aus. Der Schlüssel zu dieser Vielfalt ist der Mandibelschließmuskel. In Ameisen besteht dieser Muskel aus verschiedenen Muskelfasertypen, die sich sowohl morphologisch als auch anhand ihrer kontraktilen Eigenschaften unterscheiden. Die Anteile der Fasertypen am Gesamtvolumen des Mandibelschließers sind artspezifisch und korrelieren mit der für die Art typischen Lebensweise. Zwei biomechanische Modelle erklären, wie die Angriffswinkel der Muskelfasern am Apodem im Hinblick auf Kraft und Geschwindigkeit optimiert werden und wie Filamentfasern dazu beitragen, aus dem vorhandenen Kopfkapselvolumen die größtmögliche Kraft zu entwickeln. Der gesamte Mandibelschließmuskel wird von 10-12 Motoneuronen gesteuert, wovon manche ausschließlich bestimmte Muskelfasergruppen innervieren. Gleichzeitige Aufnahmen von Muskelaktivität und Mandibelbewegung ergeben, daß schnelle Bewegungen rasche Kontraktionen schneller Muskelfasern bedürfen. Langsame und präzise Bewegungen resultieren aus der Aktivierung langsamer Muskelfasern. Kraftvolle Bewegungen werden durch gleichzeitige Aktivierung aller Muskelfasertypen erzeugt. Für die Feinabstimmung können unterschiedliche Muskelfaserbündel unabhängig voneinander aktiviert werden. Retrograde Färbungsexperimente zeigen, daß die meisten dendritischen Verästelungen der verschiedenen Motoneuronen im gleichen Neuropil im Unterschlundganglion verlaufen. Darüberhinaus dringen einige Motoneuronen in jeweils spezifische Bereiche des Neuropils ein. Der Labiomaxillar-Komplex ist für die Nahrungsaufnahme der Ameisen essentiell. Ich untersuchte den Bauplan und die Bewegungsmechanismen des Labiomaxillar-Komplexes bei verschiedenen Ameisenarten. Das Herausklappen der Glossa beruht auf einer nicht durch Muskelkontraktion hervorgerufenen Bewegung. Bei Relaxation der Glossa-Rückziehmuskeln klappt die Glossa infolge elastischer Eigenschaften aus. Ein Vergleich des Bauplans des Labiomaxillar-Komplexes von Ameisen mit dem der Honigbiene legt nahe, daß die Glossa der Honigbiene ebenfalls mittels Elastizität in die exponierte Position gebracht wird. Um flüssige Nahrung aufzunehmen, nutzen Ameisen ihre Glossa entweder als passiven Kanal (Saugen) oder als eine sich auf- und abwärts bewegende Schaufel (Lecken). Während des Sammelns von Flüssigkeiten an ad libitum Futterquellen bedienen sich Arbeiterinnen einer Art stets nur einer von beiden Aufnahmetechniken. Die jeweils artspezifische Nahrungsaufnahmetechnik hängt von dem Vorhandensein eines gut ausgeprägten Kropfes sowie der daraus resultierenden Weise des Nahrungstransportes ab. Um die Leistung der Aufnahme flüssiger Nahrung zu beurteilen, bestimmte ich die Aufnahmeraten vier verschiedener Ameisenarten, die an unterschiedliche ökologische Nischen angepaßt sind. Die Aufnahmerate hängt von der Zuckerkonzentration und der damit verbundenen Viskosität ab, außerdem von der artspezifischen Aufnahmetechnik und dem Grad der Anpassung an das Sammeln flüssiger Nahrung. Darüberhinaus verglich ich die vier Ameisenarten bezüglich der Charakteristika der Glossaoberfläche sowie der relativen Volumina der am Lecken und Saugen beteiligten Muskeln. Beide spiegeln wahrscheinlich Anpassungen an die artspezifische ökologische Nische wieder und bestimmen die physiologischen Leistungen der Aufnahme flüssiger Nahrung. Trotz artspezifischer Unterschiede sind die einzelnen Komponenten des Systems entsprechend einer allgemeineren Regel fein aufeinander abgestimmt. KW - Ameisen KW - Mundgliedmassen KW - Ameisen KW - Insekten KW - Mundwerkzeuge KW - Verhaltensphysiologie KW - Biomechanik KW - Funktionsmorphologie KW - Neurobiologie KW - Muskelfasertypen KW - ants KW - insects KW - mouthparts KW - behavioral physiology KW - biomechanics KW - functional morphology KW - neurobiology KW - muscle fiber types KW - foraging Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179130 ER - TY - THES A1 - Schücker, Katharina T1 - The molecular architecture of the meiotic chromosome axis as revealed by super-resolution microscopy T1 - Die molekulare Architektur der meiotischen Chromosomenachse dargestellt mit hochauflösender Mikroskopie N2 - During meiosis proteins of the chromosome axis are important for monitoring chromatin structure and condensation, for pairing and segregation of chromosomes, as well as for accurate recombination. They include HORMA-domain proteins, proteins of the DNA repair system, synaptonemal complex (SC) proteins, condensins and cohesins. To understand more about their function in shaping the meiotic chromosome it is crucial to establish a defined model of their molecular architecture. Up to now their molecular organization was analysed using conventional methods, like confocal scanning microscopy (CLSM) and transmission electron microscopy (TEM). Unfortunately, these techniques are limited either by their resolution power or their localization accuracy. In conclusion, a lot of data on the molecular organization of chromosome axis proteins stays elusive. For this thesis the molecular structure of the murine synaptonemal complex (SC) and the localization of its proteins as well as of three cohesins was analysed with isotropic resolution, providing new insights into their architecture and topography on a nanoscale level. This was done using immunofluorescence labelling in combination with super-resolution microscopy, line profiles and average position determination. The results show that the murine SC has a width of 221.6 nm ± 6.1 nm including a central region (CR) of 148.2 nm ± 2.6 nm. In the CR a multi-layered organization of the central element (CE) proteins was verified by measuring their strand diameters and strand distances and additionally by imaging potential anchoring sites of SYCP1 (synaptonemal complex protein 1) to the lateral elements (LEs). We were able to show that the two LEs proteins SYCP2 and SYCP3 do co-localize alongside their axis and that there is no significant preferential localization towards the inner LE axis of SYCP2. The presented results also predict an orderly organization of murine cohesin complexes (CCs) alongside the chromosome axis in germ cells and support the hypothesis that cohesins in the CR of the SC function independent of CCs. In the end new information on the molecular organization of two main components of the murine chromosome axis were retrieved with nanometer precision and previously unknown details of their molecular architecture and topography were unravelled. N2 - Innerhalb der Meiose sind Proteine der Chromosomenachse wichtig für das Monitoring der Chromatinstruktur und dessen Kondensation, sowie für die Paarung und Trennung der Chromosomen und für eine fehlerfreie Rekombination. Zu diesen Proteinen zählen HORMA-domain Proteine, Proteine des DNA-Reparatur-Systems und des synaptonemalen Komplexes, sowie Kohäsine und Kondesine. Um mehr über ihre Rolle in der Formgebung meiotischer Chromosomen zu erfahren, ist es unabdingbar ein genau definiertes Modell über ihre molekulare Architektur zu erstellen. Bis jetzt wurde ihre molekulare Organisation mit konventionellen Methoden wie dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) und dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) untersucht. Beide Techniken sind jedoch entweder in ihrer Auflösung oder ihrer Lokalisationsgenauigkeit beschränkt, wodurch viele Daten zur molekularen Organisation der Chromosomenachse noch nicht erfasst werden konnten. Die vorliegende Arbeit untersucht mit isotropischer Auflösung die molekulare Struktur des synaptonemalen Komplexes (SC) der Maus und die Lokalisation seiner Proteine, sowie die Lokalisation von drei Kohäsinen, was neue Einsichten in deren Architektur und Topographie auf der nanomolekularen Ebene erbrachte. Dies gelang durch die Verwendung von Immunfluoreszenzmarkierungen in Kombination mit hochauflösender Mikroskopie, Linienprofilen und durchschnittlicher Positionsbestimmung. Es konnte gezeigt werden, dass der murine SC eine Weite von 221,6 nm ± 6,1 nm besitzt, inklusive einer 148,2 nm ± 2,6 nm weiten zentralen Region (CR). Innerhalb der CR konnte eine mehrschichtige Anordnung der Proteine des zentralen Elements (CE) bestätigt werden. Dies gelang indem ihre Strangdurchmesser und –abstände gemessen worden sind und zusätzlich potentielle Bindestellen von SYCP1 (synaptonemal complex protein 1) an den lateral Elementen des SCs (LEs) abgebildet werden konnten. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die beiden LE Proteine, SYCP2 und SYCP3, kolokalisieren. Dabei zeigte SYCP2 keine präferentielle Lokalisation im inneren Bereich der LE. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten auf eine organisierte Anordnung der murinen Kohäsin Komplexe (CCs) entlang der Chromosomenachse in Keimzellen hin und unterstützen die Hypothese, dass Kohäsine innerhalb der CR des SC eine Funktion unabhängig der von CCs haben. Schlussendlich konnten neue Informationen zur molekularen Anordnung von zwei wichtigen Komponenten der murinen Chromosomenachse mit einer Präzision im Nanometerbereich gewonnen werden und bisher nicht bekannte Details ihrer molekularen Architektur und Topographie aufgedeckt werden. KW - Meiose KW - Super-resolution microscopy KW - Meiosis KW - Synaptonemal complex KW - Cohesin complex Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144199 ER - TY - THES A1 - Beck, Jan T1 - The macroecology of Southeast-Asian hawkmoths (Lepidoptera: Sphingidae) T1 - Die Makroökologie südostasiatischer Schwärmer (Lepidoptera, Sphingidae) N2 - This study investigates the abundance and geographic distribution of the hawkmoth species (Lepidoptera: Sphingidae) of Southeast-Asia and analyses the resulting patterns of biodiversity, biogeography and macroecology. Data on the distribution of species were retrieved from published and unpublished faunal lists and museum collections (in close cooperation with the Natural History Museum, London). Over 34,500 records of the global distribution of the 380 species that occur in Southeast-Asia (including New Guinea and the Solomon Islands) were used for a GIS-supported estimate of distributional ranges, which can be accessed at http://www.sphingidae-sea.biozentrum.uni-wuerzburg.de, an Internet site that also provides pictures of the species and checklists for 114 islands of the Malesian region. The abundance of species in local assemblages was assessed from nightly collections at artificial light sources. Using a compilation of own samples as well as published and unpublished data from other sources, local abundance data on 93 sites were used for analysis, covering 159 species or 17,676 specimens. N2 - In der hier präsentierten Arbeit wurden Häufigkeit und Verbreitung der Schwärmerarten Südostasiens (Lepidoptera: Sphingidae) sowie daraus resultierende Muster der Biodiversität, Biogeographie und Makroökologie untersucht. Verbreitungsnachweise der Arten wurden publizierten wie auch unveröffentlichten Artenlisten sowie Museumssammlungen (in enger Zusammenarbeit mit dem Naturkundemuseum London) entnommen. Über 34 500 Nachweise der weltweiten Verbreitung der 380 südostasiatischen Schwärmerarten (inkl. derer aus Neuguinea und von den Salomoninseln) wurden für GIS-gestützte Schätzungen der Verbreitungsgebiete verwendet, die unter https://www.sphingidae-sea.biozentrum.uni-wuerzburg.de zugänglich sind. Diese Internetseite präsentiert außerdem Bilder der Arten sowie Artenlisten für 114 Inseln des Malesischen Archipels. Die Häufigkeit der Arten wurde anhand nächtlicher Zählungen an künstlichen Lichtquellen abgeschätzt, wobei sowohl eigene Aufsammlungen als auch veröffentlichte und unveröffentlichte Daten anderer Sammler verwendet wurden. Für eine Analyse standen lokale Häufigkeitsdaten für 93 Standorte zur Verfügung, die insgesamt 17 676 Individuen aus 159 Arten umfassten. KW - Biodiversität KW - Biogeographie KW - Verbreitung KW - Häufigkeit KW - Gemeinschaftsökologie KW - Biodiversity KW - Biogeography KW - Distribution KW - Abundance KW - community ecology Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13001 ER - TY - THES A1 - Saverschek, Nicole T1 - The influence of the symbiotic fungus on foraging decisions in leaf-cutting ants - Individual behavior and collective patterns T1 - Einfluss des symbiontischen Pilzes auf das Furagierverhalten von Blattschneiderameisen - Individuelles Verhalten und kollektive Muster N2 - Foraging behavior is a particularly fascinating topic within the studies of social insects. Decisions made by individuals have effects not only on the individual level, but on the colony level as well. Social information available through foraging in a group modulates individual preferences and shapes the foraging pattern of a colony. Identifying parameters influencing foraging behavior in leaf-cutting ants is especially intriguing because they do not harvest for themselves, but for their symbiotic fungus which in turn influences their plant preferences after the incorporation of the substrate. To learn about the substrates’ unsuitability for the fungus, ants need to be able to identify the incorporated substrate and associate it with detrimental effects on the fungus. Odor is an important plant characteristic known to be used as recognition key outside the nest in the context of foraging. Chapter 1 shows that foragers are able to recall information about the unsuitability of a substrate through odor alone and consequently reject the substrate, which leads to the conclusion that inside the nest, odor might be enough to indentify incorporated substrate. Identification of plant species is a key factor in the foraging success of leaf-cutting ants as they harvest a multitude of different plant species in a diverse environment and host plant availability and suitability changes throughout the year. Fixed plant preferences of individuals through innate tendencies are therefore only one factor influencing foraging decisions. On the individual as well as the colony level, foraging patterns are flexible and a result of an intricate interplay between the different members involved in the harvesting process: foragers, gardeners and the symbiotic fungus. In chapter 2 I identified several conditions necessary for naïve foragers to learn about the unsuitability of substrate inside the nest. In order to exchange of information about the unsuitability of a substrate, the plant in question must be present in the fungus garden. Foragers can learn without own foraging experience and even without experiencing the effects of the substrate on the fungus, solely through the presence of experienced gardeners. The presence of experienced foragers alone on the other hand is not enough to lower the acceptance of substrate by naïve foragers in the presence of naïve gardeners, even if experienced foragers make up the majority of the workforce inside the nest. Experienced foragers are also able to reverse their previous negative experience and start accepting the substrate again. The individual behavior of foragers and gardeners with different experiential backgrounds in the presence of suitable or unsuitable substrate inside the fungus chamber was investigated in chapter 3 to shed some light on possible mechanisms involved in the flow of information about substrate suitability from the fungus to the ants. Gardeners as well as foragers are involved in the leaf processing and treatment of the applied leaf patches on the fungus. If the plant material is unsuitable, significantly more ants treat the plant patches, but foragers are less active overall. Contacts between workers initiated by either gardeners or foragers occur significantly more frequent and last longer if the substrate is unsuitable. Even though experienced gardeners increase naïve foragers’ contact rates and duration with other workers in the presence of suitable plant patches, naïve foragers show no differences in the handling of the plant patches. This suggests that foragers gain information about plant suitability not only indirectly through the gardening workers, but might also be able to directly evaluate the effects of the substrate on the fungus themselves. Outside the nest, foragers influence each other the trail (chapter 4). Foraging in a group and the presence of social information is a decisive factor in the substrate choice of the individual and leads to a distinct and consentaneous colony response when encountering unfamiliar or unsuitable substrates. As leaf-cutting ants harvest different plant species simultaneously on several trails, foragers gain individual experiences concerning potential host plants. Preferences might vary among individuals of the same colony to the degree that foragers on the same trail perceive a certain substrate as either suitable or unsuitable. If the majority of foragers on the trail perceives one of the currently harvested substrates as unsuitable, naïve foragers lower their acceptance within 4 hours. In the absence of a cue in the fungus, naïve foragers harvesting by themselves still eventually (within 6 hours) reject the substrate as they encounter experienced gardeners during visits to the nest within foraging bouts. As foraging trails can be up to 100 m long and foragers spend a considerable amount of time away from the nest, learning indirectly from experienced foragers on the trail accelerates the distribution of information about substrate suitability. The level of rejection of a formerly unsuitable substrate after eight hours of foraging by naïve foragers correlates with the average percentage of unladen experienced foragers active on the trail. This suggests that unladen experienced foragers might actively contact laden naïve workers transmitting information about the unsuitability of the load they carry. Results from experiments were I observed individual laden foragers on their way back to the nest backed up this assumption as individuals were antennated and received bites into the leaf disk they carried. Individuals were contacted significantly more often by nestmates that perceived the carried leaf disk as unsuitable due to previous experience than by nestmates without this experience (chapter 6). Leaf-cutting ants constantly evaluate, learn and re-evaluate the suitability of harvested substrate and adjust their foraging activity accordingly. The importance of the different sources of information within the colony and their effect on the foraging pattern of the colony depend on the presence or absence of each of them as e.g. experienced foragers have a bigger influence on the plant preferences of naïve foragers in the absence of a cue in the fungus garden. N2 - Besonders faszinierend ist das Furagierverhalten sozialer Insekten. Entscheidungen von Individuen haben nicht nur direkte Auswirkungen auf individueller Ebene, sondern auch auf Kolonieebene. Soziale Informationen modulieren individuelle Präferenzen beim Furagieren in der Gruppe und beeinflussen dadurch das Aktivitätsmuster der Kolonie. Die Identifizierung der Faktoren, die das Furagierverhalten beeinflussen, ist bei Blattschneiderameisen komplex, da sie nicht für sich, sondern für ihren symbiotischen Pilz furagieren. Dieser wiederum beeinflusst die Pflanzenwahl der Ameisen nach der Einarbeitung des Pflanzenmaterials in den Pilz. Um zu lernen, dass das eingebaute Substrat für den Pilz ungeeignet ist, müssen die Ameisen in der Lage sein, das bereits eingebaute Substrat zu identifizieren und mit den negativen Effekten auf den Pilz zu assoziieren. Duft ist ein bedeutendes Pflanzencharakteristikum, das außerhalb des Nestes als Identifizierungsmerkmal im Furagierkontext verwendet wird. In Kapitel 1 zeige ich, das Pflanzendüfte alleine ausreichen um Furageuren die Information aus dem Pilzgarten über die des Substrates ins Gedächtnis zu rufen. Furageure lehnen auf Grund des Duftes allein das Substrat bereits ab. Dies lässt den Rückschluss zu, dass Duft möglicherweise als Identifizierungsmerkmal des in den Pilz eingebauten Substrats ausreichend ist. Die Identifizierung von Pflanzenarten ist ein wesentlicher Faktor des Furagiererfolgs bei Blattschneiderameisen, da diese eine Vielzahl unterschiedlicher Pflanzenarten ernten, deren Verfügbarkeit und Eignung sich im Jahresverlauf ändert. Angeborene individuelle Präferenzen sind daher nur einer von mehreren Faktoren, die die Furagierentscheidungen beeinflussen. Sowohl auf individueller als auch auf Kolonieebene sind die beobachteten Muster in der Furagieraktivität flexibel und das Ergebnis eines komplexen Wechselspiels aller Beteiligten im Furagierprozess: die Furageure, die Gärtnerinnen und der symbiotische Pilz. In Kapitel 2 habe ich mehrere Bedingungen identifiziert, die notwendig sind, damit naive Furageure im Nest lernen können, das ein Substrat für den Pilz ungeeignet ist. Um Informationen über die Pflanzenqualität austauschen zu können, ist die Anwesenheit des Substrats im Nest erforderlich. Furageure können allein durch die Anwesenheit erfahrener Gärtnerinnen lernen, ohne eigene Furagiererfahrung und ohne die negativen Effekte des Substrats auf den Pilz erfahren zu haben. Andererseits ist die Anwesenheit erfahrener Furageure allein nicht genug, um die Akzeptanz des Substrats durch naive Furageure zu verringern, wenn die Gärtnerinnen naiv sind, selbst wenn die erfahrenen Furageure die Mehrzeit der Tiere im Nest stellen. Erfahrene Furageure sind auch in der Lage, ihre früheren negativen Erfahrungen zu revidieren und das Substrat wieder zu akzeptieren. Das Individualverhalten von Furageuren und Gärtnerinnen mit unterschiedlichem Erfahrungshintergrund in der Anwesenheit von geeignetem oder ungeeignetem Pflanzenmaterial im Pilz wurde in Kapitel 3 untersucht. Hierbei sollten mögliche Mechanismen des Informationsflusses vom Pilz zu den Ameisen aufgedeckt werden. Sowohl Gärtnerinnen als auch Furageure sind in die Bearbeitung des Blattmaterials involviert. Ist das Blattmaterial ungeeignet, wird es von signifikant mehr Ameisen bearbeitet, aber die allgemeine Aktivität der Furageure ist geringer als bei der Bearbeitung von geeignetem Substrat. Ist das Pflanzenmaterial ungeeignet, finden signifikant mehr und längere Kontakte zwischen den Ameisen statt. Die Anwesenheit erfahrener Gärtnerinnen hat keinen Einfluss auf die Bearbeitungszeit oder Frequenz des geeigneten Blattmaterials durch naive Furageure, sie haben aber einen Einfluss auf die von naiven Furageuren induzierten Kontakte. Diese sind in Anwesenheit von erfahrenen Gärtnerinnen häufiger und länger. Dies lässt vermuten, das Furageure sowohl direkt über den Zustand des Pilzes, als auch indirekt durch Kontakte mit erfahrenen Gärtnerinnen lernen, das ein Substrat für den Pilz ungeeignet ist. Außerhalb des Nestes beeinflussen sich Furageure gegenseitig auf den Erntestraßen (Kapitel 4). Das Furagieren in der Gruppe und die dadurch zur Verfügung stehende soziale Informationen sind ein entscheidender Faktor in der Pflanzenwahl von Individuen und führt zu einer klaren und deutlichen Kolonieantwort bei unbekannten oder ungeeigneten Pflanzenarten. Da Blattschneiderameisen mehrere Pflanzenarten gleichzeitig auf unterschiedlichen Erntestraßen eintragen, unterscheiden sich Furageure in ihren individuellen Erfahrungen. Individuelle Präferenzen innerhalb einer Kolonie können sich so stark voneinander unterscheiden, dass eine Pflanze von unterschiedlichen Furageuren auf derselben Erntestraße sowohl als geeignet als auch als ungeeignet bewertet werden kann. Wenn die Mehrheit der auf der Erntestraße aktiven Furageure negative Erfahrungen mit dem Substrat hat und es als ungeeignet bewertet, dann verringert sich die Akzeptanz dieses Substrates durch naive Furageure ebenfalls signifikant innerhalb von 4 Stunden. Wenn die negativen Effekte im Pilzgarten nicht mehr zu detektieren sind lehnen naive Furageure in Abwesenheit von erfahren Furageuren das Substrat nach ungefähr 6 Stunden ab, da sie bei ihren Nestbesuchen auf erfahrene Gärtnerinnen stoßen. Da Erntestraßen bis zu 100 m lang sein können und Furageure daher lange unterwegs sind, beschleunigt das indirekte Lernen durch erfahrene Furageure auf der Erntestraße die Verbreitung der Information über die Substratqualität innerhalb der Kolonie. Das Maß der Ablehnung des ursprünglich ungeeigneten Substrats durch naive Furageure nach 8 Stunden furagieren korreliert mit dem durchschnittlichen Prozentsatz an unbeladenen, erfahrenen Furageuren auf der Erntestraße. Dies lässt vermuten, dass unbeladene, erfahrene Furageure beladene naive Furageure aktiv kontaktieren und dadurch Informationen über das ungeeignete Substrat übermitteln. Ergebnisse von Individualbeobachtungen unterstützen diese Vermutung. In Kapitel 6 zeige ich, dass beladene Rekruten auf dem Weg zurück zum Nest signifikant häufiger von anderen Furageuren kontaktiert werden, wenn diese negative Erfahrungen mit der vom Rekruten getragenen Pflanzenart haben als wenn die Pflanzenart als geeignet bewertet wird. Blattschneiderameisen bewerten, lernen und bewerten wieder die Qualität geernteten Substrats und passen ihr Furagierverhalten entsprechend an. Die verschiedenen Informationsquellen über die Pflanzenqualität innerhalb der Kolonie haben eine unterschiedliche Gewichtung abhängig von der An- oder Abwesenheit von einer von Ihnen. Zum Beispiel haben erfahrene Furageure in der Abwesenheit von negativen Effekten im Pilzgarten einen deutlich größeren Einfluss auf die Präferenzen naiver Furageure. KW - Blattschneiderameisen KW - Nahrungserwerb KW - Erfahrung KW - Lernen KW - Furagierverhalten KW - kollektive Muster KW - Soziale Insekten KW - Verhaltensforschung KW - social insects KW - leaf-cutting ants KW - learning KW - experience KW - foraging behavior Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52087 ER - TY - THES A1 - Bötzl, Fabian Alexander T1 - The influence of crop management and adjacent agri-environmental scheme type on natural pest control in differently structured landscapes T1 - Der Effekt von Feldkultur und angrenzenden Agrarumweltmaßnahmen auf natürliche Schädlingskontrolle in unterschiedlich strukturierten Landschaften N2 - Summary Chapters I & II: General Introduction & General Methods Agriculture is confronted with a rampant loss of biodiversity potentially eroding ecosystem service potentials and adding up to other stressors like climate change or the consequences of land-use change and intensive management. To counter this ‘biodiversity crisis’, agri-environment schemes (AES) have been introduced as part of ecological intensification efforts. These AES combine special management regimes with the establishment of tailored habitats to create refuges for biodiversity in agricultural landscapes and thus ensure biodiversity mediated ecosystem services such as pest control. However, little is known about how well different AES habitats fulfil this purpose and whether they benefit ecosystem services in adjacent crop fields. Here I investigated how effective different AES habitats are for restoring biodiversity in different agricultural landscapes (Chapter V) and whether they benefit natural pest control in adjacent oilseed rape (Chapter VI) and winter cereal fields (Chapter VII). I recorded biodiversity and pest control potentials using a variety of different methods (Chapters II, V, VI & VII). Moreover, I validated the methodology I used to assess predator assemblages and predation rates (Chapters III & IV). Chapter III: How to record ground dwelling predators? Testing methodology is critical as it ensures scientific standards and trustworthy results. Pitfall traps are widely used to record ground dwelling predators, but little is known about how different trap types affect catches. I compared different types of pitfall traps that had been used in previous studies in respect to resulting carabid beetle assemblages. While barrier traps collected more species and deliver more complete species inventories, conventional simple pitfall traps provide reliable results with comparatively little handling effort. Placing several simple pitfall traps in the field can compensate the difference while still saving handling effort.   Chapter IV: How to record predation rates? A plethora of methods has been proposed and used for recording predation rates, but these have rarely been validated before use. I assessed whether a novel approach to record predation, the use of sentinel prey cards with glued on aphids, delivers realistic results. I compared different sampling efforts and showed that obtained predation rates were similar and could be linked to predator (carabid beetle) densities and body-sizes (a proxy often used for food intake rates). Thus, the method delivers reliable and meaningful predation rates. Chapter V: Do AES habitats benefit multi-taxa biodiversity? The main goal of AES is the conservation of biodiversity in agricultural landscapes. I investigated how effectively AES habitats with different temporal continuity fulfil this goal in differently structured landscapes. The different AES habitats investigated had variable effects on local biodiversity. Temporal continuity of AES habitats was the most important predictor with older, more temporally continuous habitats harbouring higher overall biodiversity and different species assemblages in most taxonomic groups than younger AES habitats. Results however varied among taxonomic groups and natural enemies were equally supported by younger habitats. Semi-natural habitats in the surrounding landscape and AES habitat size were of minor importance for local biodiversity and had limited effects. This stresses that newly established AES habitats alone cannot restore farmland biodiversity. Both AES habitats as well as more continuous semi-natural habitats synergistically increase overall biodiversity in agricultural landscapes. Chapter VI: The effects of AES habitats on predators in adjacent oilseed rape fields Apart from biodiversity conservation, ensuring ecosystem service delivery in agricultural landscapes is a crucial goal of AES. I therefore investigated the effects of adjacent AES habitats on ground dwelling predator assemblages in oilseed rape fields. I found clear distance decay effects from the field edges into the field centres on both richness and densities of ground dwelling predators. Direct effects of adjacent AES habitats on assemblages in oilseed rape fields however were limited and only visible in functional traits of carabid beetle assemblages. Adjacent AES habitats doubled the proportion of predatory carabid beetles indicating a beneficial role for pest control. My results show that pest control potentials are largest close to the field edges and beneficial effects are comparably short ranged. Chapter VII: The effects of AES habitats on pest control in adjacent cereal fields Whether distance functions and potential effects of AES habitats are universal across crops is unknown. Therefore, I assessed distance functions of predators, pests, predation rates and yields after crop rotation in winter cereals using the same study design as in the previous year. Resulting distance functions were not uniform and differed from those found in oilseed rape in the previous year, indicating that the interactions between certain adjacent habitats vary with habitat and crop types. Distance functions of cereal-leaf beetles (important cereal pests) and parasitoid wasps were moreover modulated by semi-natural habitat proportion in the surrounding landscapes. Field edges buffered assemblage changes in carabid beetle assemblages over crop rotation confirming their important function as refuges for natural enemies. My results emphasize the beneficial role of field edges for pest control potentials. These findings back the calls for smaller field sizes and more diverse, more heterogeneously structured agricultural landscapes. Chapter VIII: General Discussion Countering biodiversity loss and ensuring ecosystem service provision in agricultural landscapes is intricate and requires strategic planning and restructuring of these landscapes. I showed that agricultural landscapes could benefit maximally from (i) a mixture of AES habitats and semi-natural habitats to support high levels of overall biodiversity and from (ii) smaller continuously managed agricultural areas (i.e. smaller field sizes or the insertion of AES elements within large fields) to maximize natural pest control potentials in crop fields. I propose a mosaic of younger AES habitats and semi-natural habitats to support ecosystem service providers and increase edge density for ecosystem service spillover into adjacent crops. The optimal extent and density of this network as well as the location in which AES and semi-natural habitats interact most beneficially with adjacent crops need further investigation. My results provide a further step towards more sustainable agricultural landscapes that simultaneously allow biodiversity to persist and maintain agricultural production under the framework of ecological intensification. N2 - Zusammenfassung Kapitel I & II: Allgemeine Einleitung & Allgemeine Methodik Die Landwirtschaft sieht sich einem gravierenden Verlust an biologischer Vielfalt gegenüber, der möglicherweise Ökosystemdienstleistungen erodiert und zusätzlich zu anderen Stressoren wirkt, wie etwa dem globalen Klimawandel oder den Folgen veränderter Landnutzung und intensiven Managements. Um dieser ‚Biodiversitätskrise‘ entgegen zu wirken wurden im Rahmen der ökologischen Intensivierung Agrarumweltmaßnahmen (AES) eingeführt. Diese AES verbinden spezielle Managementregime mit der Schaffung designter Habitate, die als Refugien für Biodiversität in Agrarlandschaften deinen und dadurch Ökosystemdienstleistungen, die auf Biodiversität beruhen, wie natürliche Schädlingskontrolle, sicherstellen sollen. Wie gut verschiedene AES jedoch diese Ziele erfüllen und ob Ökosystemdienstleistungen in angrenzenden Feldern tatsächlich davon profitieren, ist weitgehend unbekannt. In meiner Doktorarbeit untersuche ich wie effektiv verschiedene AES Habitate darin sind, Biodiversität in unterschiedlichen Agrarlandschaften wieder her zu stellen (Kapitel V) und ob diese natürliche Schädlingskontrolle in angrenzenden Rapsfeldern (Kapitel VI) und Wintergetreidefeldern (Kapitel VII) von diesen Habitaten profitiert. Biodiversität und Potentiale natürlicher Schädlingskontrolle wurden mit diversen unterschiedlichen Methoden erfasst (Kapitel II, V, VI & VII). Zusätzlich habe ich Methoden, die ich zur Erfassung von Räubergesellschaften und Prädationsraten verwendet habe, validiert (Kapitel III & IV). Kapitel III: Wie erfasst man bodenaktive Räuber? Das Testen von Methoden ist essenziell, da es wissenschaftliche Standards und vertrauenswürdige Ergebnisse sicherstellt. Bodenfallen werden häufig verwendet, um bodenaktive Prädatoren zu erfassen, aber wie verschiedene Bodenfallentypen das Fangergebnis beeinflussen ist weitgehend unbekannt. Ich habe verschiedene, in früheren Studien verwendete, Bodenfallentypen hinsichtlich der resultierenden Laufkäfergesellschaften verglichen. Während Fallen mit Leitschienen die meisten Arten fingen und dadurch die vollständigsten Artenlisten ergaben, lieferten einfache Bodenfallen verlässliche Ergebnisse bei vergleichsweise geringem Aufwand. Das Platzieren einiger einfacher Bodenfallen kann bei immer noch geringerem Aufwand die Unterschiede kompensieren. Kapitel IV: Wie erfasst man Prädationsraten? Eine Fülle verschiedener Methoden zur Erfassung von Prädationsraten wurde vorgeschlagen und verwendet, jedoch wurden diese meist nicht validiert, bevor sie verwendet wurden. Ich habe getestet ob eine neuartige Methode zur Erfassung von Prädationsraten, die Verwendung von Prädationskarten mit aufgeklebten Blattläusen, realistische Resultate liefert. Dazu wurden verschiedene Karten mit unterschiedlichem Aufwand getestet. Die resultierenden Prädationsraten waren vergleichbar und durch Räuber- (Laufkäfer-) Dichten sowie deren mittlere Körpergröße (ein oft genutzter Indikator für Nahrungsaufnahmeraten) erklärt werden konnten. Daher liefert diese Methode verlässliche und sinnvolle Prädationsraten. Kapitel V: Profitiert multi-Taxa Biodiversität von AES? Das Hauptziel von AES ist der Erhalt der Biodiversität in Agrarlandschaften. Ich habe untersucht, wie effektiv AES Habitate mit verschiedener zeitlicher Kontinuität dieses Ziel in unterschiedlich strukturierten Landschaften erfüllen. Die verschiedenen AES Habitate hatten variierende Effekte auf die lokale Biodiversität. Zeitliche Kontinuität der AES Habitate war der wichtigste Einfluss da ältere, kontinuierlichere Habitate eine höhere Gesamtbiodiversität und in den meisten taxonomischen Gruppen andere Artengemeinschaften beherbergten als jüngere AES Habitate. Die Ergebnisse variierten jedoch zwischen den taxonomischen Gruppen und natürliche Feinde von Agrarschädlingen wurden auch durch jüngere AES Habitate gleichwertig unterstützt. Halbnatürliche Habitate in der Landschaft sowie die Größe des AES Habitats waren von geringerer Bedeutung für die lokale Biodiversität und hatten lediglich begrenzte Effekte. Diese Ergebnisse betonen, dass neu angelegte AES Habitate allein die Biodiversität in der Agrarlandschaft nicht wiederherstellen können. AES Habitate wirken synergistisch zusammen mit kontinuierlicheren halbnatürlichen Habitaten und sichern mit diesen ein Maximum an biologischer Vielfalt in Agrarlandschaften Kapitel VI: Die Effekte von AES Habitaten auf Räuber in angrenzenden Rapsfeldern Neben dem Erhalt der Artenvielfalt ist das Sicherstellen von Ökosystemdienstleistungen in Agrarlandschaften ein essenzielles Ziel von AES. Ich untersuchte daher die Effekte angrenzender AES Habitate auf bodenaktive Prädatoren in Rapsfeldern. Für die Artenvielfalt als auch für die Dichten von bodenaktiven Prädatoren zeigten sich klare Distanzfunktionen von den Feldrändern abnehmend zur Feldmitte. Direkte Effekte angrenzender AES auf die Räubergesellschaften in Rapsfeldern waren hingegen limitiert und nur auf der Ebene der funktionellen Merkmale von Laufkäfergesellschaften festzustellen. Angrenzende AES Habitate verdoppelten den Anteil räuberischer Laufkäfer in den Gesellschaften, was auf einen positiven Effekt auf natürliche Schädlingsbekämpfung schließen lässt. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass Potentiale natürlicher Schädlingsbekämpfung nahe den Feldrändern am größten sind und nicht relativ weit ins Feld hinein reichen. Kapitel VII: Die Effekte von AES Habitaten auf natürliche Schädlingskontrolle in angrenzenden Getreidefeldern Es ist allerdings noch gänzlich unbekannt, ob Distanzfunktionen und potenzielle Effekte angrenzender AES Habitate universell auf andere Feldfrüchte übertragbar sind. Ich habe daher im gleichen Studiendesign wie im vorangegangenen Jahr Distanzfunktionen von natürlichen Feinden, Schädlingen, Prädationsraten und Erträgen nach dem Fruchtwechsel in Wintergetreide erfasst. Die gefundenen Distanzfunktionen waren verschieden und unterschieden sich von den im Vorjahr im Raps erfassten Distanzfunktionen, was darauf schließen lässt, dass die Interaktion zwischen verschiedenen Feldfrüchten und Nachbarhabitaten variieren. Distanzfunktionen von Getreidehähnchen (wichtigen Getreideschädlingen) und parasitoiden Wespen waren zusätzlich durch den Anteil halbnatürlicher Habitate in der Landschaft moduliert. Feldränder pufferten die Veränderungen in Laufkäfergesellschaften über den Fruchtwechsel ab, was deren wichtige Funktion als Refugialhabitate für natürliche Schädlingsbekämpfer verdeutlicht. Meine Ergebnisse betonen die Rolle von Feldrändern für die natürliche Schädlingsbekämpfung. Die Ergebnisse stärken die Forderung nach kleineren Feldgrößen und diverseren, heterogener strukturierten Agrarlandschaften. Kapitel VIII: Allgemeine Diskussion Der Kampf gegen den Verlust der biologischen Vielfalt und das Sicherstellen von Ökosystemdienstleistungen in Agrarlandschaften ist komplex und erfordert ein strategisches Planen und eine Transformation dieser Landschaften. Ich habe gezeigt, dass Agrarlandschaften von (i) einer Mischung aus AES Habitaten und halbnatürlichen Habitaten, die zusammen ein große Artenvielfalt unterstützen, und von (ii) einer geringeren kontinuierlich bewirtschafteten Agrarfläche (d.h. kleineren Feldgrößen oder dem Einfügen von AES Habitaten in bestehende große Felder) um natürliche Schädlingskontrolle zu maximieren, profitieren würden. Ich schlage vor ein Mosaik aus jüngeren AES Habitaten und halbnatürlichen Habitaten zu schaffen, um Ökosystemdienstleister zu unterstützen und das Netzwerk an Feldrändern zu vergrößern wodurch Ökosystemdienstleistungen in angrenzenden Feldkulturen maximiert werden könnten. Um die optimale Ausdehnung und Dichte dieses Netzwerks wie auch die optimale Platzierung, in der AES und halbnatürliche Habitate die größtmöglichen Effekte auf angrenzende Feldkulturen haben, zu klären, bedarf es weiterer Forschung. Meine Ergebnisse liefern einen weiteren Schritt hin zu nachhaltigeren Agrarlandschaften die im Rahmen der ökologischen Intensivierung gleichzeitig sowohl ein Fortbestehen der Biodiversität als auch landwirtschaftliche Produktion erlauben. KW - Ökologie KW - Ecology KW - Natural pest control KW - Biodiversity conservation KW - Ecosystem services KW - Carabid beetles Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-241400 ER - TY - THES A1 - Eck, Saskia T1 - The impact of thermogenetic depolarizations of specific clock neurons on Drosophila melanogaster's circadian clock T1 - Der Einfluss thermogenetischer Depolarisationen spezifischer Uhrneurone auf Drosophila melanogasters circadiane Uhr N2 - The rotation of the earth around its own axis determines periodically changing environmental conditions, like alterations in light and temperature. For the purpose of adapting all organisms’ behavior, physiology and metabolism to recurring changes, endogenous clocks have evolved, which allow the organisms to anticipate environmental changes. In chronobiology, the scientific field dealing with the investigation of the underlying mechanisms of the endogenous clock, the fruit fly Drosophila melanogaster serves as a beneficial model organism. The fruit fly’s circadian clock exhibits a rather simple anatomical organization, but nevertheless constitutes homologies to the mammalian system. Thus also in this PhD-thesis the fruit fly was used to decipher general features of the circadian clock’s interneuronal communication. Drosophila melanogaster’s circadian clock consists of about 150 clock neurons, which are located in the central nervous system of the fly. These clock neurons can be subdivided regarding to their anatomical position in the brain into the dorsal neurons (DN1s, DN2s, DN3s), as well as into the lateral neurons (LPNs, LNds, s-LNvs, l-LNvs). Functionally these clock neuron clusters can be classified as Morning- and Evening oscillators (M- and E- oscillators), driving different parts of the fly’s locomotor activity in light-dark conditions (LD). The Morning-oscillators are represented by the s-LNvs and are known to be the main pacemakers, driving the pace of the clock in constant conditions (constant darkness; DD). The group of Evening-oscillators consists of the LNds, the DN1s and the 5th s-LNv and is important for the proper timing of the evening activity in LD. All of these clock neurons are not functionally independent, but form complex neuronal connections, which are highly plastic in their response to different environmental stimuli (Zeitgebers), like light or temperature. Even though a lot is known about the function and the importance of some clock neuron clusters, the exact interplay between the neurons is not fully known yet. To investigate the mechanisms, which are involved in communication processes among different clock neurons, we depolarized specific clock cells in a temporally and cell-type restricted manner using dTrpA1, a thermosensitive cation channel, which allows the depolarization of neurons by application of temperature pulses (TP) above 29°C to the intact and freely moving fly. Using different clock specific GAL4-driver lines and applying TPs at different time points within the circadian cycle in DD enabled us with the help of phase shift experiments to draw conclusions on the properties of the endogenous clock. The obtained phase shifts in locomotor behavior elicited by specific clock neuronal activation were plotted as phase response curves (PRCs). The depolarization of all clock neurons shifted the phase of activity the strongest, especially in the delay zone of the PRC. The exclusive depolarization of the M oscillators together with the l-LNvs (PDF+ neurons: s-LNvs & l-LNvs) caused shifts in the delay and in the advance zone as well, however the advances were severely enhanced in their temporal occurrence ranging into the subjective day. We concluded that light might have inhibitory effects on the PDF+ cells in that particular part of the PRC, as typical light PRCs do not exhibit that kind of distinctive advances. By completely excluding light in the PRC-experiments of this PhD-thesis, this photic inhibitory input to the PDF+ neurons is missing, probably causing the broadened advance zone. These findings suggest the existence of an inhibitory light-input pathway to the PDF+ cells from the photoreceptive organs (Hofbauer-Buchner eyelet, photoreceptor cells of compound eyes, ocelli) or from other clock neurons, which might inhibit phase advances during the subjective day. To get an impression of the molecular state of the clock in the delay and advance zone, staining experiments against Period (PER), one of the most important core clock components, and against the neuropeptide Pigment Dispersing Factor (PDF) were performed. The cycling of PER levels mirrored the behavioral phase shifts in experimental flies, whereas the controls were widely unaffected. As just those neurons, which had been depolarized, exhibited immediate shifted PER oscillations, this effect has to be rapidly regulated in a cell-autonomous manner. However, the molecular link between clock neuron depolarization and shifts in the molecular clock’s cycling is still missing. This issue was addressed by CREB (cAMP responsive element binding protein) quantification in the large ventrolateral neurons (l-LNvs), as these neurons responded unexpectedly and strongest to the artificial depolarization exhibiting a huge increase in PER levels. It had been previously suggested that CREB is involved in circadian rhythms by binding to regulatory sequences of the period gene (Belvin et al., 1999), thus activating its transcription. We were able to show, that CREB levels in the l-LNvs are under circadian regulation, as they exhibit higher CREB levels at the end of the subjective night relative to the end of the subjective day. That effect was further reinforced by artificial depolarization, independently of the time point of depolarization. Furthermore the data indicate that rises in CREB levels are coinciding with the time point of increases of PER levels in the l-LNvs, suggesting CREB being the molecular link between the neuronal electrical state and the molecular clock. Taking together, the results indicate that a temporal depolarization using dTrpA1 is able to significantly phase shift the clock on the behavioral and protein level. An artificial depolarization at the beginning of the subjective night caused phase delays, whereas a depolarization at the end of the subjective night resulted in advances. The activation of all clock neurons caused a PRC that roughly resembled a light-PRC. However, the depolarization of the PDF+ neurons led to a PRC exhibiting a shape that did not resemble that of a light-mediated PRC, indicating the complex processing ability of excitatory and inhibitory input by the circadian clock. Even though this experimental approach is highly artificial, just the exclusion of light-inputs enabled us to draw novel conclusions on the network communication and its light input pathways. N2 - Die Rotation der Erde um ihre eigene Achse hat periodisch verändernde Umweltbedingungen, wie beispielsweise Veränderungen in den Lichtverhältnissen und der Temperatur, zur Folge. Um das Verhalten, die Physiologie und den Metabolismus eines Organismus an stets wiederkehrende Veränderungen anzupassen, haben sich endogene/circadiane Uhren entwickelt, die es dem Organismus erlauben diese Umweltbedingungen zu antizipieren. In der Chronobiologie, einem wissenschaftlichen Fachbereich, der sich mit der Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen der Inneren Uhr befasst, dient die Taufliege Drosophila melanogaster als nützlicher Modellorganismus. Die Innere Uhr der Taufliege ist anatomisch eher einfach organisiert, weist trotz alledem jedoch Homologien zum Säugersystem auf. Auch im Rahmen dieser Doktorarbeit diente die Taufliege daher dazu grundlegende Netzwerkeigenschaften der circadianen Uhr zu untersuchen. Die Innere Uhr von Drosophila melanogaster besteht aus ungefähr 150 Uhrneuronen, die sich im zentralen Nervensystem der Fliege befinden. Diese Uhrneurone können, bezüglich ihrer anatomischen Position im Gehirn in die Gruppe der dorsalen Neurone (DN1, DN2, DN3), sowie in die der lateralen Neurone untergliedert werden (LPN, LNd, s-LNv, l-LNv). Funktionell werden diese Uhrneuronengruppen als Morgen- und Abendoszillatoren (M- und E-Oszillatoren) klassifiziert, da sie für unterschiedliche Verhaltensanteile in der Laufaktivität der Fliege unter Licht-Dunkel-Verhältnissen (LD) verantwortlich sind. Die s-LNv stellen dabei die Morgenoszillatoren (M-Oszillatoren) dar und werden als Hauptschrittmacher betrachtet, da sie die Geschwindigkeit der Uhr unter konstanten Bedingungen (Dauerdunkel; DD) bestimmen. Die Gruppe der Abendoszillatoren (EOszillatoren) besteht aus den LNd, einigen DN1 und der fünften s-LNv (5th s-LNv) und ist für die richtige Terminierung der Abendaktivität in LD zuständig. All diese Uhrneurone sind funktionell nicht unabhängig voneinander, sondern bilden komplexe neuronale Verschaltungen untereinander aus, die durch einen hohen Grad an Plastizität bezüglich ihrer Reaktion auf unterschiedliche Umweltparameter (Zeitgeber), wie Licht oder Temperatur, gekennzeichnet sind. Obwohl bereits vieles hinsichtlich der Funktion und der Bedeutung einiger Gruppen von Uhrneuronen bekannt ist, ist das genaue Zusammenspiel unter ihnen immer noch recht unklar. Um die Mechanismen, die in den Kommunikationsprozessen zwischen verschiedenen Uhrneuronen involviert sind, zu untersuchen, machten wir Gebrauch von dTrpA1, einem thermosensitiven Kationenkanal, der es durch die Applizierung von Temperaturpulsen (TP) über 29°C ermöglicht, Neuronen in der intakten und sich frei bewegenden Fliege zeitlich begrenzt und zellspezifisch zu depolarisieren. Mithilfe verschiedener Uhr-spezifischer GAL4-Treiberlinien und der Verabreichung von TP zu verschiedenen Zeitpunkten des circadianen Zyklus in DD, war es uns möglich Rückschlüsse auf die Eigenschaften der Inneren Uhr anhand von Phasen-Verschiebungsexperimenten zu ziehen. Die hervorgerufenen Phasenverschiebungen im Laufverhalten, die durch die Aktivierung spezieller Uhrneuronen hervorgerufen wurden, wurden dabei als Phasen Responz Kurve (engl. phase response curve; PRC) dargestellt. Die Depolarisierung aller Uhrneurone verschob die Phase der Aktivität am stärksten, insbesondere in der Phasen-Verzögerungszone der PRC. Wurden ausschließlich die M-Oszillatoren zusammen mit den l-LNv (PDF+ Neurone: s-LNv & l-LNv) depolarisiert, wurden ebenso Phasenverschiebungen nach vorne, wie auch nach hinten hervorgerufen, jedoch reichten die Verschiebungen nach vorne deutlich in den subjektiven Tag hinein. Daraus schlussfolgerten wir, dass Licht inhibitorischen Einfluss in diesem Bereich der PRC haben muss, da typische Licht-PRCs nicht derart ausgeprägte Vorverschiebungen aufweisen. Aufgrund des vollständigen Lichtausschlusses in den PRC-Versuchen dieser Doktorarbeit fehlt jedoch dieser Licht-vermittelte inhibitorische Einfluss zu den PDF+ Neuronen und führt daher zur zeitlich stark ausgeprägten Phasen-Vorverschiebungszone. Diese Ergebnisse lassen daher vermuten, dass ein inhibitorisch wirkender Licht-vermittelter Eingang zu den PDF+ Neuronen von den photorezeptiven Organen (Hofbauer-Buchner Äuglein, Photorezeptoren der Komplexaugen, Ocellen) oder von anderen Uhrneuronen existieren muss, der die Phasen-Vorverschiebungen während des subjektiven Tages unterdrückt. Um Kenntnis über den molekularen Status der Uhr in der Verzögerungs- und Phasen-Vorverschiebungszone zu erlangen, wurden Färbungen gegen das Protein Period (PER), eines der zentralen Bestandteile der Inneren Uhr und gegen das Neuropeptid Pigment Dispersing Factor (PDF) angefertigt. Der zeitliche Verlauf im Auf- und Abbau des PER Proteins spiegelte die Phasenverschiebungen im Verhalten der Experimentalfliegen wider, wohingegen die Kontrollen weitestgehend unauffällig blieben. Zudem waren nur diejenigen Neurone von einer unmittelbaren Verschiebung der PER Protein Oszillation betroffen, die depolarisiert wurden, was auf einen schnellen Zell-autonomen Prozess schließen lässt. Die molekulare Verknüpfung, die zwischen der Depolarisation der Uhrneuronen und der Verschiebung der molekularen Uhr-Oszillation fungiert, ist immer noch unbekannt. Diesem Thema wurde nachgegangen, indem CREB (engl. cAMP responsive element binding protein) in den großen ventrolateralen Neuronen (l-LNv) quantifiziert wurde, da diese Neuronen unerwarteterweise und am wirksamsten auf die artifizielle Depolarisation mit einer starken PER-Akkumulation reagiert haben. In vorherigen Arbeiten wurde bereits angenommen, dass CREB in die circadiane Rhythmik involviert sei, indem es an Regulationssequenzen des period Gens bindet (Belvin et al., 1999) und somit dessen Transkription aktiviert. Wir konnten zeigen, dass die Menge an CREB Protein in den l-LNv circadian reguliert wird, da diese am Ende der subjektiven Nacht im Vergleich zum Ende des subjektiven Tages deutlich erhöht ist. Dieser Effekt konnte durch die artifizielle Depolarisation, aber unabhängig von deren Zeitpunkt, weiter verstärkt werden. Zudem deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Akkumulation des CREB Proteins mit dem Zeitpunkt des Anstiegs des PER Proteins in den l-LNv koinzidiert. Das lässt die Vermutung zu, dass CREB als molekulare Verbindung zwischen dem elektrischen neuronalen Status und der molekularen Uhr dienen kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die zeitlich begrenzte Depolarisation mithilfe von dTrpA1 signifikante Phasenverschiebungen im Verhalten wie auch auf der Proteinebene hervorrufen kann. Eine artifizielle Depolarisation zu Beginn der subjektiven Nacht verursacht Phasenverschiebungen nach hinten, wohingegen eine Depolarisation zum Ende der subjektiven Nacht Phasenverschiebungen nach vorne zur Folge hat. Die Aktivierung aller Uhrneurone brachte eine PRC hervor, die weitestgehend einer Licht-PRC gleicht. Die Depolarisierung der PDF+ Zellen hingegen ergab eine PRC, die sich insbesondere bezüglich der ausgeprägten Phasen-Vorverschiebungszone von einer Licht-vermittelten PRC unterscheidet. Die Innere Uhr scheint somit die Fähigkeit zu besitzen, exzitatorische und inhibitorische Eingänge in komplexer Art und Weise zu verarbeiten. Obwohl der in dieser Doktorarbeit gewählte experimentelle Ansatz hochgradig artifiziell ist, war es uns gerade durch den Ausschluss von Licht möglich, neue Schlussfolgerungen bezüglich der Kommunikation innerhalb des Netzwerks und dessen Lichtinformations-Eingänge zu ziehen. KW - Chronobiologie KW - Circadian clock KW - Tagesrhythmus KW - Taufliege Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137118 ER - TY - THES A1 - Horn [née Bunz], Melanie T1 - The impact of Drosophila melanogaster`s endogenous clock on fitness: Influence of day length, humidity and food composition T1 - Auswirkungen von Drosophila melanogaster`s Innerer Uhr auf die Fitness: Einfluss von Tageslänge, Luftfeuchtigkeit und Ernährung N2 - We are living in a system that underlies permanent environmental changes due to the rotation of our planet. These changes are rhythmic with the most prominent one having a period of about 24 hours, but also shorter and longer rhythms characterize our environment. To cope with the ever-changing environmental conditions, it is thought to be beneficial if an organism can track and anticipate these changes. The so called endogenous clocks enable this and might provide a fitness advantage. To investigate and unravel the mechanism of endogenous clocks Chronobiologists have used different model organisms. In this thesis Drosophila melanogaster was used as model organism with its about 150 clock neurons representing the main endogenous clock of the fly in the central brain. The molecular mechanisms and the interlocked feedback loops with the main circadian key players like period, timeless, clock or cycle are under investigation since the 1970s and are characterized quite well so far. But the impact of a functional endogenous clock in combination with diverse factors and the resulting fitness advantages were analysed in only a few studies and remains for the most part unknown. Therefore the aim of this thesis was to unravel the impact of Drosophila melanogaster`s endogenous clock on the fitness of the fly. To achieve this goal different factors – like day length, humidity and food composition – were analyzed in wild type CS and three different period mutants, namely perL, perS and per01, that carry a point mutation altering or abolishing the free-running period of the fruit fly as well as a second arrhythmic strain, clkAR. In competition assay experiments wild type and clock mutant flies competed for up to 63 generations under a normal 24 hour rhythm with 12 hours light/day and 12 hours darkness/night (LD12:12) or T-cycles with 19 or 29 hours, according to the mutants free-running period, or constant light (LL) in case of the arrhythmic mutant as well as under natural-like outdoor conditions in two consecutive years. Overall the wild type CS strain was outcompeting the clock mutant strains independent of the environmental conditions. As the perL fly strain elongated their free-running period, the competition experiments were repeated with naturally cantonized new fly strains. With these experiments it could be shown that the genetic background of the fly strains – which are kept for decades in the lab, with backcrosses every few years – is very important and influences the fitness of flies. But also the day length impacts the fitness of the flies, enabling them to persist in higher percentage in a population under competition. Further factors that might influence the survival in a competing population were investigated, like e.g. mating preferences and locomotor activity of homo- and heterozygous females or sperm number of males transferred per mating. But these factors can still not explain the results in total and play no or only minor roles and show the complexity of the whole system with still unknown characteristics. Furthermore populations of flies were recorded to see if the flies exhibit a common locomotor activity pattern or not and indeed a population activity pattern could be recorded for the first time and social contact as a Zeitgeber could be verified for Drosophila melanogaster. In addition humidity and its impact on the flies´ fitness as well as a potential Zeitgeber was examined in this thesis. The flies experienced different relative humidities for eclosion and wing expansion and humidity cycle phase shifting experiments were performed to address these two different questions of fitness impact and potential Zeitgeber. The fruit fly usually ecloses in the morning hours when the relative humidity is quite high and the general assumption was that they do so to prevent desiccation. The results of this thesis were quite clear and demonstrate that the relative humidity has no great effect on the fitness of the flies according to successful eclosion or wing expansion and that temperature might be the more important factor. In the humidity cycle phase shifting experiments it could be revealed that relative humidity cannot act as a Zeitgeber for Drosophila melanogaster, but it influences and therefore masks the activity of flies by allowing or surpressing activity at specific relative humidity values. As final experiments the lifespan of wild type and clock mutant flies was investigated under different day length and with different food qualities to unravel the impact of these factors on the fitness and therefore survival of the flies on the long run. As expected the flies with nutrient-poor minimum medium died earlier than on the nutrient-rich maximum medium, but a small effect of day length could also be seen with flies living slightly longer when they experience environmental day length conditions resembling their free-running period. The experiments also showed a fitness advantage of the wild type fly strain against the clock mutant strains for long term, but not short term (about the first 2-3 weeks). As a conclusion it can be said that genetic variation is important to be able to adapt to changing environmental conditions and to optimize fitness and therefore survival. Having a functional endogenous clock with a free-running period of about 24 hours provides fitness advantages for the fruit fly, at least under competition. The whole system is very complex and many factors – known and unknown ones – play a role in this system by interacting on different levels, e.g. physiology, metabolism and/or behavior. N2 - Wir leben in einem System, welches durch die Erdrotation permanenten Veränderungen der Umwelt unterliegt. Diese Veränderungen sind rhythmischer Natur, wobei die wichtigste Veränderung einen Rhythmus von circa 24 Stunden aufweist. Aber auch kürzere und längere Rhythmen charakterisieren unsere Umwelt. Um mit den permanenten Veränderungen klar zu kommen geht man davon aus, dass es von Vorteil ist wenn ein Organismus die Veränderungen wahrnehmen und vorausahnen kann. Die sogenannten Inneren Uhren ermöglichen dies und stellen möglicherweise einen Fitness Vorteil dar. Um den Mechanismus von Inneren Uhren zu untersuchen und aufzudecken benutzen Chronobiologen verschiedene Modellorganismen. In dieser Arbeit wurde Drosophila melanogaster, mit ihren etwa 150 Uhrneuronen welche die Innere Uhr im Zentralen Nervensystem darstellen, als Modellorganismus verwendet. Der molekulare Mechanismus und die ineinandergreifenden Rückkopplungsschleifen mit den Hauptakteuren period, timeless, clock und cycle werden seit den 1970ern erforscht und wurden bisher recht gut charakterisiert. Aber der Einfluss einer funktionellen Inneren Uhr in Kombination mit diversen Faktoren und die daraus resultierenden Fitness Vorteile wurden in nur wenigen Studien untersucht und bleiben zu großen Teilen unbekannt. Deshalb war es das Ziel dieser Arbeit den Einfluss von Drosophilas Innere Uhr auf die Fitness der Taufliege aufzudecken. Um dieses Ziel zu erreichen wurden verschiedene Faktoren – wie z.B. Tageslänge, Luftfeuchtigkeit und Futterqualität – in Wildtyp CS und drei verschiedenen period Mutanten – namentlich perL, perS und per01, welche alle eine Punktmutation tragen, welche die Freilauf-Periodenlänge verändert oder zu Arrhythmizität führt – sowie einem weiteren arrhythmischen Fliegenstamm, clkAR, untersucht. In Konkurrenzversuchen konkurrierten Wildtyp und Uhrmutanten über bis zu 63 Generationen unter normalen 24 Stunden Rhythmen mit jeweils 12 Stunden Licht/Tag und 12 Stunden Dunkelheit/Nacht oder unter T-Zyklen mit 19 oder 29 Stunden, entsprechend der Freilauf-Periodenlänge der Mutanten, oder Dauerlicht (LL) im Falle der arrhythmischen Mutante, sowie unter naturähnlichen Bedingungen im Feldversuch in zwei aufeinanderfolgenden Jahren. Im Gesamten war der Wildtyp den Uhrmutanten überlegen, unabhängig von den Umweltbedingungen. Da die perL Mutanten Ihre Freilauf-Periodenlänge deutlich verlängerten, wurden die Konkurrenzexperimente mit auf natürlicher Weise mit dem Wildtyp CS rückgekreuzten Fliegenstämmen wiederholt. Mit diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass der genetische Hintergrund der Fliegenstämme – welche teils für Jahrzehnte im Labor gehalten und nur wenige Male rückgekreuzt werden – sehr wichtig ist und die Fitness der Fliegen beeinflusst. Aber auch die Länge der Tage (19 h, 24 h oder 29 h) beeinflusst die Fitness der Fliegen und ermöglicht es Ihnen in höherem Anteil in einer Population unter Konkurrenz zu bestehen. Weitere Faktoren, welche das Überleben unter Konkurrenz möglicherweise beeinflussen können, wie z.B. eine Paarungspräferenz und Laufaktivität von homo- und heterozygoten Weibchen oder die Anzahl an Spermien, die pro Paarung übertragen werden, wurden untersucht. Diese Faktoren allein konnten jedoch die Ergebnisse der Konkurrenzversuche nicht erklären und spielen dabei keine oder nur geringfügige Rollen und stellen ein Beispiel für die Komplexität des ganzen Systems mit noch weiteren unbekannten Faktoren dar. Im Weiteren wurde das Laufverhalten von ganzen Fliegenpopulationen aufgezeichnet, um zu erforschen, ob eine Fliegenpopulation einen gemeinsamen Freilauf an Laufaktivität aufweist oder nicht. Und tatsächlich konnte zum ersten Mal das Laufverhalten von ganzen Populationen aufgezeichnet werden und Sozialer Kontakt als Zeitgeber für Drosophila melanogaster bestätigt werden. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit relative Luftfeuchtigkeit und deren Auswirkung auf die Fitness der Fliegen, als auch als potentieller Zeitgeber untersucht. Die Fliegen wurden zum Schlupf und zur Entfaltung der Flügel unterschiedlichen Luftfeuchtigkeiten ausgesetzt und es wurden Phasenverschiebungsversuche mit Luftfeuchtigkeitszyklen durchgeführt, um diese zwei verschiedenen Fragen nach Fitness und potentiellem Zeitgeber zu beantworten. Die Fruchtfliege schlüpft normalerweise in den Morgenstunden, wenn die Luftfeuchtigkeit relativ hoch ist, weshalb im Allgemeinen angenommen wird, dass dies zu diesem Zeitpunkt des Tages geschieht, um eine Austrocknung zu verhindern. Die Ergebnisse dieser Arbeit waren sehr eindeutig und demonstrierten, dass die relative Luftfeuchtigkeit keinen großen Einfluss auf die Fitness der Fliegen in Bezug auf den Schlupferfolg und korrektes Entfalten der Flügel hat und dass die Temperatur wohl eher der ausschlaggebende Faktor sein könnte. In den Phasenverschiebungsversuchen mit Luftfeuchtigkeitszyklen konnte aufgedeckt werden, dass relative Luftfeuchtigkeit keinen Zeitgeber für Drosophila melanogaster darstellt, aber die Laufaktivität der Fliegen beeinflusst und maskiert, indem das Laufverhalten bei bestimmten relativen Luftfeuchtigkeiten zugelassen oder unterdrückt wird. Außerdem wurde die Lebenserwartung der Wildtyp und Uhrmutanten Fliegenstämme unter verschiedenen Tageslängen und mit unterschiedlicher Futterqualität untersucht, um den Einfluss dieser Faktoren auf die Fitness und somit das Überleben der Fliegen auf Dauer zu charakterisieren. Wie erwartet starben die Fliegen auf dem nährstoffarmen Minimalmedium früher als auf dem nährstoffreichen Maximalmedium, aber es konnte auch ein kleiner Effekt der Tageslänge gezeigt werden. Hierbei lebten die Fliegen etwas länger, wenn die Tageslänge die Freilauf-Periodenlänge der Fliegen widerspiegelte. Diese Versuche zeigten auch einen Fitness Vorteil der Wildtyp Fliegen gegenüber der Uhrmutanten auf lange Sicht, jedoch nicht zu Beginn (in den ersten ca. 2-3 Wochen). Abschließend kann zusammengefasst werden, dass genetische Variation wichtig ist, um sich an Veränderungen in der Umwelt anzupassen und die eigene Fitness und somit Überleben zu steigern. Eine funktionelle Innere Uhr mit einer Periodenlänge von etwa 24 Stunden zu besitzen stellt einen Fitness Vorteil für die Fliegen dar, zumindest unter Konkurrenzbedingungen. Das ganze System ist sehr komplex und viele Faktoren – bekannte und noch unbekannte – spielen eine Rolle in diesem System, welches auf verschiedenen Ebenen interagiert, wie z.B. auf physiologischer, metabolistischer oder auf der Verhaltensebene. KW - Taufliege KW - Drosophila KW - Biologische Uhr KW - Tageslänge KW - Luftfeuchtigkeit KW - Drosophila melanogaster KW - Fitness Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211415 ER - TY - THES A1 - Seida, Ahmed Adel T1 - The Immunomodulatory Role of Endogenous Glucocorticoids in Ovarian Cancer T1 - Die immunmodulatorische Bedeutung der lokalen Aktivierung von endogenem Cortison im Ovarialkarzinom N2 - Ovarian cancer currently causes ~6,000 deaths per year in Germany alone. Since only palliative treatment is available for ovarian carcinomas that have developed resistance against platinum-based chemotherapy and paclitaxel, there is a pressing medical need for the development of new therapeutic approaches. As survival is strongly influenced by immunological parameters, immunotherapeutic strategies appear promising. The research of our group thus aims at overcoming tumour immune escape by counteracting immunosuppressive mechanisms in the tumour microenvironment. In this context, we found that tumour-infiltrating myeloid-derived suppressor cells (MDSC) or tumour associated macrophages (TAM) which are abundant in ovarian cancer express high levels of the enzyme 11β-hydroxysteroid dehydrogenase1 (11-HSD1). This oxido-reductase enzyme is essential for the conversion of biologically inactive cortisone into active cortisol. In line with this observation, high endogenous cortisol levels could be detected in serum, ascitic fluid and tumour exudates from ovarian cancer patients. Considering that cortisol exerts strong anti-inflammatory and immunosuppressive effects on immune cells, it appears likely that high endogenous cortisol levels contribute to immune escape in ovarian cancer. We thus hypothesised that local activation of endogenous glucocorticoids could suppress beneficial immune responses in the tumour microenvironment and thereby prevent a successful immunotherapy. To investigate the in vivo relevance of this postulated immune escape mechanism, irradiated PTENloxP/loxP loxP-Stop-loxP-krasG12D mice were reconstituted with hematopoietic stem cells from either glucocorticoid receptor (GR) expressing mice (GRloxP/loxP) or from mice with a T cell-specific glucocorticoid receptor knock-out (lck-Cre GRloxP/loxP) mice. In the host mice, the combination of a conditional PTEN knock-out with a latent oncogenic kras leads to tumour development when a Cre-encoding adenovirus is injected into the ovarian bursa. Using this model, mice that had been reconstituted with GC-insensitive T cells showed better intratumoural T cell infiltration than control mice that had received functionally unaltered GRloxP/loxP cells via adoptive transfer. However, tumour-infiltrating T cells mostly assumed a Foxp3+ (regulatory) phenotype and survival was even shortened in mice with cortisol-insensitive T cells. Thus, endogenous cortisol seems to inhibit immune cell infiltration in ovarian cancer, but productive anti-tumour immune responses might still be prevented by further factors from the tumour microenvironment. Thus, our data did not provide a sufficiently strong rationale to further pursue the antagonisation of glucocorticoid signalling in ovarian cancer patients, Moreover, glucocorticoids are frequently administered to cancer patients to reduce inflammation and swelling and to prevent chemotherapy-related toxic side effects like nausea or hypersensitivity reactions associated with paclitaxel therapy. Thus, we decided to address the question whether specific signalling pathways in innate immune cells, preferentially in NK cells, could still be activated even in the presence of GC. A careful investigation of the various activating NK cell receptors (i.e. NKp30, NKp44, NKp46), DNAM-1 and NKG2D) was thus performed which revealed that NKp30, NKp44 and NKG2D are all down-regulated by cortisol whereas NKp46 is actually induced by cortisol. Interestingly, NKp46 is the only known receptor that is strictly confined to NK cells. Its activation via crosslinking leads to cytokine release and activation of cytotoxic activity. Stimulation of NK cells via NKp46 may contribute to immune-mediated tumour destruction by triggering the lysis of tumour cells and by altering the cytokine pattern in the tumour microenvironment, thereby generating more favourable conditions for the recruitment of antigen-specific immune cells. Accordingly, our observation that even cortisol-treated NK cells can still be activated via NKp46 and CD2 might become valuable for the design of immunotherapies that can still be applied in the presence of endogenous or therapeutically administered glucocorticoids. N2 - Ovarialkarzinome verursachen allein in Deutschland jährlich ca. 6.000 Todesfälle. Da bei Ovarialkarzinomen, die eine Resistenz gegen eine platinbasierte Chemotherapie mit cis-Platin und gegen Paclitaxel entwickelt haben, nur eine palliative Behandlung möglich ist, gibt esbesteht ein dringenden dringender Bedarf an der Entwicklung von neuen Therapieansätzen. Das Überleben der Patientinnen ist sehr stark von immunologischen Parametern beeinflusst, und somit erscheinensodass immuntherapeutische Strategien als ein vielversprechender Ansatzerscheinen. Das Ziel der Forschung in unserer Gruppe ist daher, dem „Tumor-Immun-Escape“ durch eine Verhinderung von immunosuppressiven Mechanismen in im der Tumormikromilieu-Mikroumgebung entgegenzuwirken. In diesem Zusammenhang haben wir gefundenentdeckt, dass Tumor-infiltrierende Suppressorzellen der myeloiden Ursprungsschen Reihe (MDSC) oder Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM), die in Ovarialkarzinomen reichlich vorhanden sind, das Enzym 11β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 1 (11β-HSD1) in großer Menge exprimieren. Diese Oxido-Reduktase ist essentiell bei derfür die Umwandlung von biologisch inaktiven Cortison in biologisch aktives Cortisol. In Übereinstimmung damit, werden hohe endogene Cortisol Spiegel in Seren, Azites und Tumorsekreten von Ovarialkarzinom-Patientinnen gemessen. Unter Berücksichtigung der starken anti-inflammatorischen und immunsuppressiven Eigenschaften von Cortisol, erscheint es sehr wahrscheinlich, dass ein hoher endogener Cortisol-Spiegel zum „Immune-Escape“ von Ovarialkarzinomzellen beiträgt. Unsere Vermutung ist Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die lokale Aktivierung von endogenen Glucocorticoiden zu einer Unterdrückung der nützlichen Immunantwort in der Tumor-Mikroumgebung führt und eine erfolgreiche Immuntherapie verhindert. Um die in vivo Relevanz dieses postulierten „Immune-Escape“ Mechanismuses zu untersuchen, wurden bestrahlte PTENloxP/loxP loxP-Stop-loxP-krasG12D Mäuse mit Hämatopoetischen hämatopoietischen Stammzellen entweder aus Glucocoprticoid-Rezeptor (GR) exprimierenden Mäusen (GRloxP/loxP) oder aus Mäusen mit einem T-Zell spezifischen Glucocoprticoid-Rezeptor knock-out (lck-Cre GRloxP/loxP) rekonstituiert. In diesen Mäusen führte die Kombination von konditionellem PTEN knock-out mit einer latenten Expression von oncogenen onkogenen Kras zur Tumorentwicklung sobald ein für Cre-Rekombinase codierendes Adenovirus in die Ovarien-ovarielle Bursa injiziert wurdewird. Mit Hilfe von diesesm Modells wurde gezeigt, dass Mäuse, die mit GC-unempfindlichen T-Zellen rekonstituiert worden waren eine bessere intratumorale T-Zell Infiltration zeigten im Vergleich zu Kontroll-Mäusen, die über einen adaptiven Transfer funktionell unveränderte GRloxP/loxP Zellen erhalten hatten. Tumor-infiltrierende T-Zellen haben aber in der Mehrzahl einen hauptsächlich angenommen Foxp3+ (regulatorischen) Phänotyp angenommen, sodass und das Überleben dieser Zellen war sogar verkürzt in Mäusen mit Cortisol-unempfindlichen T-Zellen sogar eine verkürzte Überlebenszeit aufwiesen. Somit scheint endogenes Cortisol die Infiltration von Immunzellen beim Ovarialkarzinom zu inhibieren, aber eine produktive antitumorale Immunantwort könnte scheint trotzdem verhindert werden durch andere Faktoren aus im Tumormikromilieu verhindert zu werden.der Tumor-Mikroumgebung. Somit bieten unsere Daten keine ausreichend starke Begründung, für eineum das Konzept der Antagonisierung endogener,der durch Glucocorticoide ausgelösten ausgelöster Signale in Ovarialkarzinom-Patientinnen weiter zu verfolgen. Des Weiteren werden Glucocorticoide oft Krebspatienten verabreicht, um Entzündungen und Schwellungen zu reduzieren sowie Chemotherapie. bedingte Nebeneffekte wie Übelkeit oder Überempfindlichkeitsreaktionen, die mit einer Paclitaxel-Therapy einhergehen, zu verhindern. Daher wurde der Frage nachgegangen, ob spezifische Signalwege im angeborenem Immunsystem, insbesondere in NK-Zellen, auch in Anwesenheit von GC noch aktiviert werden können. Eine Untersuchung der verschiedenen NK-Zellen aktivierenden Rezeptoren (NKp30, NKp44, NKp46, DNAM-1 und NKG2D) wurde durchgeführt. Dabei wurde eine Herunterregulation von NKp30, NKp44 und NKG2D sowie eine Induktion von NKp46 durch Cortisol festgestellt. Von besonderem Interesse ist, dass NKp46 der einzige bekannte Rezeptor ist, der nur von NK-Zellen exprimiert wird. Seine Aktivierung bewirkt eine Cytokinfreisetzung Zytokinfreisetzung und eine Aktivierung Induktion der zytotoxischen AktivitätNK Zell-Antwort. Eine Stimulation der NK-Zellen über NKp46 könnte zur immun-vermittelten Tumorzerstörung durch Auslösen der Tumorzell-Lyse und durch eine Veränderung des Cytokinexpressionsmusters Zytokinexpressionsmusters in im Tumormikromilieu der Tumor-Mikroumgebung beitragen. Somit würden verbesserte Bedingungen für die Rekrutierung von antigen-spezifischen Immunzellen generiert. Unsere Beobachtung, dass selbst Cortisol behandelte NK-Zellen immer noch über NKp46 und CD2 aktiviert werden können, könnten nützlich zur Entwicklung von Immuntherapien sein, die in Gegenwart von endogenen oder therapeutisch verabreichten Glucocorticoide angewendet werden sollen. KW - Cortison KW - Eierstockkrebs KW - Cortison KW - Ovarialkarzinom KW - Endogenous Glucocorticoids KW - Ovarian Cancer Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73901 ER - TY - THES A1 - Kupper, Maria T1 - The immune transcriptome and proteome of the ant Camponotus floridanus and vertical transmission of its bacterial endosymbiont Blochmannia floridanus T1 - Das Immuntranskriptom und -proteom der Ameise Camponotus floridanus und die vertikale Transmission ihres Endosymbionten Blochmannia floridanus N2 - The evolutionary success of insects is believed to be at least partially facilitated by symbioses between insects and prokaryotes. Bacterial endosymbionts confer various fitness advantages to their hosts, for example by providing nutrients lacking from the insects’ diet thereby enabling the inhabitation of new ecological niches. The Florida carpenter ant Camponotus floridanus harbours endosymbiotic bacteria of the genus Blochmannia. These primary endosymbionts mainly reside in the cytoplasm of bacteriocytes, specialised cells interspersed into the midgut tissue, but they were also found in oocytes which allows their vertical transmission. The social lifestyle of C. floridanus may facilitate the rapid spread of infections amongst genetically closely related animals living in huge colonies. Therefore, the ants require an immune system to efficiently combat infections while maintaining a “chronic” infection with their endosymbionts. In order to investigate the immune repertoire of the ants, the Illumina sequencing method was used. The previously published genome sequence of C. floridanus was functionally re-annotated and 0.53% of C. floridanus proteins were assigned to the gene ontology (GO) term subcategory “immune system process”. Based on homology analyses, genes encoding 510 proteins with possible immune function were identified. These genes are involved in microbial recognition and immune signalling pathways but also in cellular defence mechanisms, such as phagocytosis and melanisation. The components of the major signalling pathways appear to be highly conserved and the analysis revealed an overall broad immune repertoire of the ants though the number of identified genes encoding pattern recognition receptors (PRRs) and antimicrobial peptides (AMPs) is comparatively low. Besides three genes coding for homologs of thioester-containing proteins (TEPs), which have been shown to act as opsonins promoting phagocytosis in other insects, six genes encoding the AMPs defesin-1 and defensin-2, hymenoptaecin, two tachystatin-like peptides and one crustin-like peptide are present in the ant genome. Although the low number of known AMPs in comparison to 13 AMPs in the honey bee Apis mellifera and 46 AMPs in the wasp Nasonia vitripennis may indicate a less potent immune system, measures summarised as external or social immunity may enhance the immune repertoire of C. floridanus, as it was discussed for other social insects. Also, the hymenoptaecin multipeptide precursor protein may be processed to yield seven possibly bioactive peptides. In this work, two hymenoptaecin derived peptides were heterologously expressed and purified. The preliminary antimicrobial activity assays indicate varying bacteriostatic effects of different hymenoptaecin derived peptides against Escherichia coli D31 and Staphylococcus aureus which suggests a functional amplification of the immune response further increasing the antimicrobial potency of the ants. Furthermore, 257 genes were differentially expressed upon immune challenge of C. floridanus and most of the immune genes showing differential expression are involved in recognition of microbes or encode immune effectors rather than signalling components. Additionally, genes coding for proteins involved in storage and metabolism were downregulated upon immune challenge suggesting a trade-off between two energy-intensive processes in order to enhance effectiveness of the immune response. The analysis of gene expression via qRT-PCR was used for validation of the transcriptome data and revealed stage-specific immune gene regulation. Though the same tendencies of regulation were observed in larvae and adults, expression of several immune-related genes was generally more strongly induced in larvae. Immune gene expression levels depending on the developmental stage of C. floridanus are in agreement with observations in other insects and might suggest that animals from different stages revert to individual combinations of external and internal immunity upon infection. The haemolymph proteome of immune-challenged ants further established the immune-relevance of several proteins involved in classical immune signalling pathways, e.g. PRRs, extracellularly active proteases of the Toll signalling pathway and effector molecules such as AMPs, lysozymes and TEPs. Additionally, non-canonical proteins with putative immune function were enriched in immune-challenged haemolymph, e.g. Vitellogenins, NPC2-like proteins and Hemocytin. As known from previous studies, septic wounding also leads to the upregulation of genes involved in stress responses. In the haemolymph, proteins implicated in protein stabilisation and in the protection against oxidative stress and insecticides were enriched upon immune challenge. In order to identify additional putative immune effectors, haemolymph peptide samples from immune-challenged larvae and adults were analysed. The analysis in this work focussed on the identification of putative peptides produced via the secretory pathway as previously described for neuropeptides of C. floridanus. 567 regulated peptides derived from 39 proteins were identified in the larval haemolymph, whereas 342 regulated peptides derived from 13 proteins were found in the adult haemolymph. Most of the peptides are derived from hymenoptaecin or from putative uncharacterised proteins. One haemolymph peptide of immune-challenged larvae comprises the complete amino acid sequence of a predicted peptide derived from a Vitellogenin. Though the identified peptide lacks similarities to any known immune-related peptide, it is a suitable candidate for further functional analysis. To establish a stable infection with the endosymbionts, the bacteria have to be transmitted to the next generation of the ants. The vertical transmission of B. floridanus is guaranteed by bacterial infestation of oocytes. This work presents the first comprehensive and detailed description of the localisation of the bacterial endosymbionts in C. floridanus ovaries during oogenesis. Whereas the most apical part of the germarium, which contains the germ-line stem cells, is not infected by the bacteria, small somatic cells in the outer layers of each ovariole were found to be infected in the lower germarium. Only with the beginning of cystocyte differentiation, endosymbionts are exclusively transported from follicle cells into the growing oocytes, while nurse cells were never infected with B. floridanus. This infestation of the oocytes by bacteria very likely involves exocytosis-endocytosis processes between follicle cells and the oocytes. A previous study suggested a down-modulation of the immune response in the midgut tissue which may promote endosymbiont tolerance. Therefore, the expression of several potentially relevant immune genes was analysed in the ovarial tissue by qRT-PCR. The relatively low expression of genes involved in Toll and IMD signalling, and the high expression of genes encoding negative immune regulators, such as PGRP-LB, PGRP-SC2, and tollip, strongly suggest that a down-modulation of the immune response may also facilitate endosymbiont tolerance in the ovaries and thereby contribute to their vertical transmission. Overall, the present thesis improves the knowledge about the immune repertoire of C. floridanus and provides new candidates for further functional analyses. Moreover, the involvement of the host immune system in maintaining a “chronic” infection with symbiotic bacteria was confirmed and extended to the ovaries. N2 - Der evolutionäre Erfolg von Insekten wird zumindest teilweise Symbiosen zwischen Insekten und Prokaryonten zugeschrieben. Dabei übertragen bakterielle Symbionten verschiedenste Fitnessvorteile an ihre Wirte. Beispielsweise ermöglicht die Bereitstellung von Nährstoffen, welche in der Nahrung des Insekts fehlen, die Erschließung neuer ökologischer Nischen. Die Florida Rossameise Camponotus floridanus trägt endosymbiontische Bakterien der Gattung Blochmannia. Diese primären Endosymbionten kommen hauptsächlich im Zytoplasma von spezialisierten Zellen des Mitteldarms, den sogenannten Bakteriozyten, vor. Blochmannien wurden aber auch in Oozyten und Eiern gefunden, was ihre vertikale Übertragung an Individuen der nächsten Generation ermöglicht. Als soziale Insekten leben C. floridanus in großen Kolonien von nah verwandten Individuen. Ihre Lebensweise begünstigt möglicherweise die schnelle Ausbreitung von Infektionen, weshalb erwartet werden müsste, dass die Ameisen ein effizientes Immunsystem besitzen. Gleichzeitig muss jedoch die „chronische“ Infektion mit den bakteriellen Symbionten aufrechterhalten werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das Immunrepertoire der Ameisen mittels Illumina Sequenzierung charakterisiert. Zunächst wurde das vor kurzem publizierte Genom von C. floridanus funktionell re-annotiert. Dabei wurden 0.53% der annotierten Proteine der GO-Unterkategorie “Prozesse des Immunsystems” zugeordnet. Basierend auf Homologieanalysen wurden Gene identifiziert, die für 510 Immunproteine kodieren. Die Genprodukte spielen eine Rolle bei der Erkennung von Mikroben und in den Signalwegen des Immunsystems, sind jedoch auch an Prozessen der zellulären Immunantwort, wie beispielsweise Phagozytose und Melanisierung, beteiligt. Dabei sind Komponenten der Hauptsignalwege hoch konserviert. Obwohl die Anzahl der identifizierten Proteine, die Fremdorganismen erkennen (PRRs), und die Anzahl an antimikrobiellen Peptiden (AMPs) vergleichsweise gering ist, verfügt C. floridanus insgesamt über ein umfangreiches Immunrepertoire. Neben drei Genen, die für Thioester-enthaltende Proteine (TEPs) kodieren und wie in anderen Insekten möglicherweise eine Rolle als Opsonine bei der Phagozytose spielen, wurden sechs AMP-Gene identifiziert. Diese kodieren für Defesin-1 und Defensin-2, Hymenoptaecin, zwei Tachystatin-ähnliche und ein Crustin-ähnliches Peptid. Die geringe Anzahl an bekannten AMPs im Vergleich zur Honigbiene Apis mellifera (13 AMPs) und Wespe Nasonia vitripennis (46 AMPs) könnte ein möglicherweise geringeres Potential des Immunsystems anzeigen. Allerdings könnten zusätzliche Maßnahmen, die unter dem Begriff „Soziale Immunität“ zusammengefasst werden, das Immunrepertoire von C. floridanus ergänzen, wie es schon für andere Insekten diskutiert wurde. Zudem könnten durch proteolytische Prozessierung des Hymenoptaecin Multipeptid Präkursormoleküls sieben mögliche antimikrobielle Peptide freigesetzt werden. Für die vorliegende Arbeit wurden zwei verschiedene dieser Hymenoptaecin Peptide heterolog exprimiert und aufgereinigt. Die vorläufige funktionelle Charakterisierung der Peptide zeigt, dass diese Peptide möglicherweise bakteriostatische Wirkung mit einem unterschiedlichen Wirkspektrum gegen Escherichia coli D31 und Staphylococcus aureus entfalten. Dies erlaubt die Annahme, dass die Expression des Hymenoptaecins zu einer funktionellen Amplifikation der Immunantwort führt und das Immunrepertoire der Ameisen erweitert. Nach Injektion von bakteriellem Material in die Ameisen wurde die Expression von 257 Genen reguliert. Viele dieser Gene kodieren für Proteine zur Erkennung von Pathogenen oder kodieren für Effektoren des Immunsystems. Komponenten der Signalwege zeigten dagegen kaum Veränderungen in ihrer Expression auf. Außerdem zeigten Gene, die für Speicherproteine oder Proteine des Metabolismus kodieren, generell eine geringere Expression nach Stimulierung des Immunsystems auf. Dies lässt einen Ausgleich zwischen zwei energieintensiven Prozessen vermuten, um eine effektive Immunantwort zu ermöglichen. Darüber hinaus zeigt die Validierung der Expressionsdaten mittels qRT-PCR eine Abhängigkeit der Expression mehrerer Gene vom Entwicklungsstadium der Ameisen auf. Generell wurden die gleichen Tendenzen in der Regulation der Expression dieser Gene nach Immunstimulierung beobachtet. Allerdings wurde die Expression mehrerer immunrelevanter Gene in Larven weit stärker induziert als in Adulten. Wie es auch schon für andere Insekten gezeigt wurde, scheinen C. floridanus Larven und Arbeiterinnen auf individuelle Kombinationen externer und interner Immunfaktoren zurückzugreifen. Die vorher beschriebenen Transkriptomdaten wurden durch die Charakterisierung des Hämolymph-Proteoms von C. floridanus nach Immunstimulation ergänzt, wodurch die Immunrelevanz vieler Faktoren auch auf Proteinebene bestätigt werden konnte. Beispielsweise wurden zahlreiche PRRs und extrazellulär aktive Proteasen des Toll-Signalwegs, aber auch Immuneffektoren wie AMPs, Lysozyme und TEPs in der Hämolymphe identifiziert. Zusätzlich führte die Immunstimulation in Larven und Adulten zur Anreicherung nicht-kanonischer Proteine mit möglicher Immunfunktion, beispielsweise Vitellogenine, NPC2-ähnliche Proteine und Hemocytin. Aus einer früheren Arbeit ist bekannt, dass septische Verwundungen zusätzlich die transkriptionelle Aktivierung von Genen der Stressantwort hervorrufen können. So wurden auch in der Hämolymphe Proteine entdeckt, die eine Rolle bei der Stabilisierung von Proteinen, und dem Schutz gegen oxidativen Stress und Insektizide spielen. Zur Identifizierung weiterer möglicher Peptideffektoren wurden Hämolymphpeptid-Proben von immunstimulierten Larven und Adulten analysiert. Der Fokus der Analyse lag dabei auf der Identifizierung von Peptiden, die auf dem sekretorischen Weg gebildet werden, wie es zuvor für Neuropeptide von C. floridanus beschrieben worden war. 567 differentiell regulierte Peptide, die von 39 Proteinen abstammen, wurden in Larvenhämolymphe identifiziert, wohingegen in der Hämolymphe von Adulttieren 342 derartige Peptide, die 13 Proteinen zugeordnet werden können, gefunden wurden. Die meisten dieser Peptide können Hymenoptaecin oder bisher noch nicht charakterisierte Proteinen zugeordnet werden. Jedoch wurde ein Peptid in larvaler Hämolymphe identifiziert, dessen Aminosäuresequenz vollständig mit der Sequenz eines vorhergesagten, von Vitellogenin stammenden Peptids übereinstimmt. Weil dieses Peptid keine Ähnlichkeiten zu anderen bereits charakterisierten antimikrobiellen Peptiden aufweist, stellt es einen geeigneten Kandidaten für weitere funktionelle Analysen dar. Die bakterielle Infektion von Oozyten ermöglicht die transovariale Übertragung von B. floridanus und ermöglicht damit die Etablierung einer stabilen Infektion in der nächsten Wirtsgeneration. Die vorliegende Arbeit beinhaltet die erste umfassende und detaillierte Beschreibung der Lokalisation bakterieller Endosymbionten in Ovarien von C. floridanus. Im apikalen Germarium, in welchem sich die Keimbahn-Stammzellen befinden, liegt noch keine bakterielle Infektion des Gewebes vor. In späteren Segmenten des Germariums jedoch können Blochmannien das erste Mal in kleinen somatischen Zellen der äußeren Schicht jeder Ovariole detektiert werden. Mit beginnender Zystozytendifferenzierung werden die Endosymbionten von Follikelzellen ausschließlich in die heranwachsenden Oozyten transportiert, wobei sehr wahrscheinlich Exozytose-Endozytose-Prozesse involviert sind. Nährzellen zeigen zu keinem Zeitpunkt während der Oogenese eine bakterielle Infektion auf. Da in einer früheren Studie vorgeschlagen wurde, dass eine signifikant reduzierte Anregung der Immunantwort im Mitteldarmgewebe zur Toleranz der Endosymbionten beitragen könnte, wurde auch die Expression ausgewählter Immungene in den Ovarien durch qRT-PCR untersucht. Die relativ geringe Expression von Genen des Toll- und des IMD-Signalwegs und die zusätzlich vergleichsweise starke Genexpression negativer Regulatoren des Immunsystems, wie PGRP-LB, PGRP-SC2 und tollip, sind Indikatoren einer reduzierten Immunantwort in den Ovarien von C. floridanus. Wie schon für den Mitteldarm der Tiere vorgeschlagen, könnte dies möglicherweise sowohl zur Toleranz von Blochmannia als auch zur vertikalen Übertragung der Endosymbionten beitragen. Die vorliegende Doktorarbeit erweitert das Wissen über das Immunrepertoire von C. floridanus und es konnten vielversprechende Kandidaten für weitere funktionelle Analysen von möglichen Immunfaktoren identifiziert werden. Darüber hinaus konnten weitere Hinweise auf die Bedeutung von Immunfaktoren der Ameisen bei der Toleranz gegenüber den symbiontischen Bakterien gefunden und auf die Ovarien der Tiere ausgeweitet werden. KW - Camponotus floridanus KW - Oogenese KW - Symbiose KW - endosymbiosis KW - Blochmannia floridanus KW - ant oogenesis KW - immune genes KW - antimicrobial peptides KW - Endosymbiosen KW - Ameisenoogenese KW - Immungene KW - Antimikrobielle Peptide Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142534 ER - TY - THES A1 - Jordan, Bruce T1 - The identification of NRAGE T1 - Die Identifizierung von NRAGE N2 - The inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) have been shown to interact with a growing number of intracellular proteins and signalling pathways in order to fulfil their anti-apoptotic role. In order to investigate in detail how the avian homologue ITA interfered with both TNF induced apoptosis and the NGF mediated differentiation in PC12 cells, a two hybrid screen was performed with a PC12 library using ITA as a bait. The screen resulted in the identification of several overlapping fragments of a previously unknown gene. The complete cDNA for this gene was isolated, the analysis of which revealed a high homology with a large family of tumour antigens known as MAGE (melanoma associated antigens). This newly identified member of the MAGE family, which was later named NRAGE, exhibited some unique characteristics that suggested for the first time a role in normal cellular physiology for this protein family. MAGE proteins are usually restricted in their expression to malignant or tumour cells, however NRAGE was also expressed in terminally differentiated adult tissue. NRAGE also interacted with the human XIAP in direct two-hybrid tests. The interactions observed in yeast cells were confirmed in mammalian cell culture, employing both coimmunoprecipitation and mammalian two-hybrid methods. Moreover, the results of the coimmunoprecipitation experiments indicated that this interaction requires the RING domain. The widely studied 32D cell system was chosen to investigate the effect of NRAGE on apoptosis. NRAGE was stably transduced in 32D cells, and found to augment cell death induced by the withdrawal of Interleukin-3. One reason for this reduced cell viability in NRAGE expressing cells could be the binding of endogenous XIAP, which occurred inducibly after growth factor withdrawal. Interestingly, NRAGE was able to overcome the protection afforded to 32D cells by the exogenous expression of human Bcl-2. Thus NRAGE was identified during this research doctorate as a novel pro-apoptotic, IAP-interacting protein, able to accelerate apoptosis in a pathway independent of Bcl-2 cell protection. N2 - Die Familie der „inhibitor of apoptosis proteins” (IAPs) interagieren mit einer wachsenden Zahl an intrazellulären Proteinen und Signaltransduktionswegen um ihre anti-apoptotische Aufgabe zu erfüllen. Es konnte gezeigt werden, dass das ITA-Homolog aus dem Huhn sowohl die durch TNF induzierte Apoptose als auch die durch NGF induzierte Differenzierung von PC12-Zellen verhindert bzw. verlangsamt. Um diese Befunde genauer zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit ein "yeast two-hybrid screen" mit ITA als "bait" (Köder) und einer cDNA-Bank aus PC12-Zellen durchgeführt. In diesem "screen" konnten verschiedene Fragmente eines bis dahin unbekannten Gens identifiziert werden. Die Untersuchung der isolierte Gesamt-cDNA ergab eine hohe Homologie mit einer Familie von Tumor-Antigenen namens MAGE (melanoma associated antigens). Im Gegensatz zu den bisher identifizierten MAGE, zeigte dieses neue Familienmitglied, welches später NRAGE genannt wurde, einige Charakteristika die das erste mal eine Rolle in der normalen zellulären Physiologie nahe legten. In einem direkten "yeast two hybrid test" konnte die Interaktion zwischen NRAGE und humanem XIAP gezeigt werden. Diese Interaktion konnte sowohl in Ko-Immunpräzipitationen als auch im sogenannten Säuger two-hybrid bestätigt werden. Desweiteren zeigten die Ko- Immunpräzipitationen, dass für die Interaktion dieser beiden Proteine die RING-Domäne von ITA benötigt wird. Um Effekte von NRAGE auf die Apotose zu untersuchen, wurde dass etablierte 32D Zellsystem verwendet. NRAGE wurde stabil in 32D-Zellen exprimiert, wodurch die Apoptoserate der Zellen, induziert durch die Kultivierung in IL-3 freiem Medium, gesteigert wurde. Ein Grund für diese erhöhte Apoptoserate, könnte in der Bindung von XIAP, welches nach dem Entzug von Wachstumsfaktoren induziert wird, an NRAGE liegen. Interessanterweise war NRAGE auch fähig die protektive Wirkung von exogen exprimiertem Bcl-2 aufzuheben. Somit konnte in dieser Arbeit NRAGE als pro-apoptotisches und mit IAP interagierendes Protein beschrieben werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Verstärkung der Apoptose unabhängig von dem bekannten durch Bcl-2 bedingten anti-apoptotischen Signalweg erfolgt. KW - Apoptosis KW - Inhibition KW - Proteine KW - Molekularbiologie KW - IAP KW - NRAGE KW - Apoptosis KW - IAP KW - NRAGE KW - Apoptose Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180090 ER - TY - THES A1 - Pinkert, Stefan T1 - The human proteome is shaped by evolution and interactions T1 - Das menschliche Proteom ist geformt durch Evolution und Interaktion N2 - Das menschliche Genom ist seit 2001 komplett sequenziert. Ein Großteil der Proteine wurde mittlerweile beschrieben und täglich werden bioinformatische Vorhersagen praktisch bestätigt. Als weiteres Großprojekt wurde kürzlich die Sequenzierung des Genoms von 1000 Menschen gestartet. Trotzdem ist immer noch wenig über die Evolution des gesamten menschlichen Proteoms bekannt. Proteindomänen und ihre Kombinationen sind teilweise sehr detailliert erforscht, aber es wurden noch nicht alle Domänenarchitekturen des Menschen in ihrer Gesamtheit miteinander verglichen. Der verwendete große hochqualitative Datensatz von Protein-Protein-Interaktionen und Komplexen stammt aus dem Jahr 2006 und ermöglicht es erstmals das menschliche Proteom mit einer vorher nicht möglichen Genauigkeit analysieren zu können. Hochentwickelte Cluster Algorithmen und die Verfügbarkeit von großer Rechenkapazität befähigen uns neue Information über Proteinnetzwerke ohne weitere Laborarbeit zu gewinnen. Die vorliegende Arbeit analysiert das menschliche Proteom auf drei verschiedenen Ebenen. Zuerst wurde der Ursprung von Proteinen basierend auf ihrer Domänenarchitektur analysiert, danach wurden Protein-Protein-Interaktionen untersucht und schließlich erfolgte Einteilung der Proteine nach ihren vorhandenen und fehlenden Interaktionen. Die meisten bekannten Proteine enthalten mindestens eine Domäne und die Proteinfunktion ergibt sich aus der Summe der Funktionen der einzelnen enthaltenen Domänen. Proteine, die auf der gleichen Domänenarchitektur basieren, das heißt die die gleichen Domänen in derselben Reihenfolge besitzen, sind homolog und daher aus einem gemeinsamen ursprünglichen Protein entstanden. Die Domänenarchitekturen der ursprünglichen Proteine wurden für 750000 Proteine aus 1313 Spezies bestimmt. Die Gruppierung von Spezies und ihrer Proteine ergibt sich aus taxonomischen Daten von NCBI-Taxonomy, welche mit zusätzlichen Informationen basierend auf molekularen Markern ergänzt wurden. Der resultierende Datensatz, bestehend aus 5817 Domänen und 32868 Domänenarchitekturen, war die Grundlage für die Bestimmung des Ursprungs der Proteine aufgrund ihrer Domänenarchitekturen. Es wurde festgestellt, dass nur ein kleiner Teil der neu evolvierten Domänenarchitekturen eines Taxons gleichzeitig auch im selben Taxon neu entstandene Proteindomänen enthält. Ein weiteres Ergebnis war, dass Domänenarchitekturen im Verlauf der Evolution länger und komplexer werden, und dass so verschiedene Organismen wie der Fadenwurm, die Fruchtfliege und der Mensch die gleiche Menge an unterschiedlichen Proteinen haben, aber deutliche Unterschiede in der Anzahl ihrer Domänenarchitekturen aufweisen. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Frage wie neu entstandene Proteine Bindungen mit dem schon bestehenden Proteinnetzwerk eingehen. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass das Protein-Interaktions-Netzwerk ein skalenfreies Netz ist. Skalenfreie Netze, wie zum Beispiel das Internet, bestehen aus wenigen Knoten mit vielen Interaktionen, genannt Hubs, und andererseits aus vielen Knoten mit wenigen Interaktionen. Man vermutet, dass zwei Mechanismen zur Entstehung solcher Netzwerke führen. Erstens müssen neue Proteine um auch Teil des Proteinnetzwerkes zu werden mit Proteinen interagieren, die bereits Teil des Netzwerkes sind. Zweitens interagieren die neuen Proteine, gemäß der Theorie der bevorzugten Bindung, mit höherer Wahrscheinlichkeit mit solchen Proteinen im Netzwerk, die schon an zahlreichen weiteren Protein-Interaktionen beteiligt sind. Die Human Protein Reference Database stellt ein auf Informationen aus in-vivo Experimenten beruhendes Proteinnetzwerk für menschliche Proteine zur Verfügung. Basierend auf den in Kapitel I gewonnenen Informationen wurden die Proteine mit dem Ursprungstaxon ihrer Domänenarchitekturen versehen. Dadurch wurde gezeigt, dass ein Protein häufiger mit Proteinen, die im selben Taxon entstanden sind, interagiert, als mit Proteinen, die in anderen Taxa neu aufgetreten sind. Es stellte sich heraus, dass diese Interaktionsraten für alle Taxa deutlich höher waren, als durch das Zufallsmodel vorhergesagt wurden. Alle Taxa enthalten den gleichen Anteil an Proteinen mit vielen Interaktionen. Diese zwei Ergebnisse sprechen dagegen, dass die bevorzugte Bindung der alleinige Mechanismus ist, der zum heutigen Aufbau des menschlichen Proteininteraktion-Netzwerks beigetragen hat. Im dritten Teil wurden Proteine basierend auf dem Vorhandensein und der Abwesenheit von Interaktionen in Gruppen eingeteilt. Proteinnetzwerke können in kleine hoch vernetzte Teile zerlegt werden, die eine spezifische Funktion ausüben. Diese Gruppen können mit hoher statistischer Signifikanz berechnet werden, haben meistens jedoch keine biologische Relevanz. Mit einem neuen Algorithmus, welcher zusätzlich zu Interaktionen auch Nicht-Interaktionen berücksichtigt, wurde ein Datensatz bestehend aus 8,756 Proteinen und 32,331 Interaktionen neu unterteilt. Eine Einteilung in elf Gruppen zeigte hohe auf Gene Ontology basierte Werte und die Gruppen konnten signifikant einzelnen Zellteilen zugeordnet werden. Eine Gruppe besteht aus Proteinen, welche wenige Interaktionen miteinander aber viele Interaktionen zu zwei benachbarten Gruppen besitzen. Diese Gruppe enthält eine signifikant erhöhte Anzahl an Transportproteinen und die zwei benachbarten Gruppen haben eine erhöhte Anzahl an einerseits extrazellulären und andererseits im Zytoplasma und an der Membran lokalisierten Proteinen. Der Algorithmus hat damit unter Beweis gestellt das die Ergebnisse nicht bloß statistisch sondern auch biologisch relevant sind. Wenn wir auch noch weit vom Verständnis des Ursprungs der Spezies entfernt sind, so hat diese Arbeit doch einen Beitrag zum besseren Verständnis der Evolution auf dem Level der Proteine geleistet. Im Speziellen wurden neue Erkenntnisse über die Beziehung von Proteindomänen und Domänenarchitekturen, sowie ihre Präferenzen für Interaktionspartner im Interaktionsnetzwerk gewonnen. N2 - The human genome has been sequenced since 2001. Most proteins have been characterized now and with everyday more bioinformatical predictions are experimentally verified. A project is underway to sequence thousand humans. But still, little is known about the evolution of the human proteome itself. Domains and their combinations are analysed in detail but not all of the human domain architectures at once. Like no one before, we have large datasets of high quality human protein-protein-protein interactions and complexes available which allow us to characterize the human proteome with unmatched accuracy. Advanced clustering algorithms and computing power enable us to gain new information about protein interactions without touching a pipette. In this work, the human proteome is analysed at three different levels. First, the origin of the different types of proteins was analysed based on their domain architectures. The second part focuses on the protein-protein interactions. Finally, in the third part, proteins are clustered based on their interactions and non-interactions. Most proteins are built of domains and their function is the sum of their domain functions. Proteins that share the same domain architecture, the linear order of domains are homologues and should have originated from one common ancestral protein. This ancestor was calculated for roughly 750 000 proteins from 1313 species. The relations between the species are based on the NCBI Taxonomy and additional molecular data. The resulting data set of 5817 domains and 32868 domain architectures was used to estimate the origin of these proteins based on their architectures. It could be observed, that new domain architectures are only in a small fraction composed of domains arisen at the same taxon. It was also found that domain architectures increase in length and complexity in the course of evolution and that different organisms like worm, and human share nearly the same amount of proteins but differ in their number of distinct domain architectures. The second part of this thesis focuses on protein-protein interactions. This chapter addresses the question how new evolved proteins form connections within the existing network. The network built of protein-protein interactions was shown to be scale free. Scale free networks, like the internet, consist of few hubs with many connections and many nodes with few connections. They are thought to arise by two mechanisms. First, newly emerged proteins interact with proteins of the network. Second, according to the theory of preferential attachment, new proteins have a higher chance to interact with already interaction rich proteins. The Human Protein Reference Database provides an on in-vivo interaction data based network for human. With the data obtained from chapter one, proteins were marked with their taxon of origin based on their domain architectures. The interaction ratio of proteins of the same taxa compared to all interactions was calculated and higher values than the random model showed for nearly every taxa. On the other hand, there was no enrichment of proteins originated at the taxon of cellular organisms for the node degree found. The node degree is the number of links for this node. According to the theorie of preferential attachment the oldest nodes should have the most interactions and newly arisen proteins should be preferably attached to them not together. Both could not be shown in this analysis, preferential attachment could therefore not be the only explanation for the forming of the human protein interaction network. Finally in part three, proteins and all their interactions in the network are analysed. Protein networks can be divided into smaller highly interacting parts carrying out specific functions. This can be done with high statistical significance but still, it does not reflect the biological significance. Proteins were clustered based on their interactions and non-interactions with other proteins. A version with eleven clusters showed high gene ontology based ratings and clusters related to specific cell parts. One cluster consists of proteins having very few interactions together but many to proteins of two other clusters. This first cluster is significantly enriched with transport proteins and the two others are enriched with extracellular and cytoplasm/membrane located proteins. The algorithm seems therefore well suited to reflect the biological importance behind functional modules. Although we are still far from understanding the origin of species, this work has significantly contributed to a better understanding of evolution at the protein level and has, in particular, shown the relation of protein domains and protein architectures and their preferences for binding partners within interaction networks. KW - Evolution KW - Protein KW - Domäne KW - Interaktion KW - evolution KW - protein KW - interaction KW - domain Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35566 ER - TY - THES A1 - Pietsch, Christof T1 - The genetics of species differences within the genus Nasonia ASHMEAD 1904 (Hymenoptera: Pteromalidae) T1 - Die Genetik von Artunterschieden in der Gattung Nasonia ASHMEAD 1904 (Hymenoptera: Pteromalidae) N2 - The genetics of species differences is an outstanding question in evolutionary biology. How do species evolve to become phenotypically distinct and how is the genetic architecture organized that underlie species differences? Phenotypic diverged traits are supposed to be frequently involved in prezygotic isolation, i.e. they prevent the formation of hybrids, whereas postzygotic isolation occurs when hybrids experience a fitness reduction. The parasitic wasp genus Nasonia represents an appropriate model system to investigate the genetics of species differences as well as the genetics of postzygotic isolation. The genus consists of three species N. vitripennis, N. longicornis and N. giraulti that differ particularly in male traits that are assumed to posses an adaptive significance: courtship behaviour and wing size differences. The courtship behaviour consists of cyclically repeated series of head nods that are separated by pauses. The stereotypic performance allowed to split up the display into distinct courtship components. Males of N. vitripennis bear vestigial forewings and are incapable of flight, whereas N. longicornis wear intermediate sized wings and N. giraulti is fully capable of flying. Nasonia species can produce interspecific hybrids after removing Wolbachia bacteria induced hybrid incompatibilities with antibiotics. Postzygotic isolation occurs to different extent and is asymmetric among reciprocal crosses, e.g. inviability is stronger in the N. vitripennis (♀) x N. longicornis (♂) cross than in the N. longicornis (♀) x N. vitripennis (♂) cross. The formation of hybrids allow to study the genetic of species differences in QTL (quantitative trait locus) analyses as well as the genetics of postzygotic isolation causing hybrid inviability. The aim of the study was to investigate the genetic architecture of differences in courtship behaviour and wing size between N. vitripennis and N. longicornis and to assess the genetics of postzygotic isolation to gain clues about the evolutionary processes underlying trait divergence and establishment of reproductive isolation between taxa. In a QTL analysis based on 94 F2-hybrid individuals of an LV cross only few QTL for wing size differences have been found with relatively large effects, although a large proportion of the phenotypic variance remained unexplained. The QTL on courtship behaviour analysis based on 94-F2 hybrid males revealed a complex genetic architecture of courtship behaviour with QTL of large phenotypic effects that explained more than 40 % of the phenotypic variance in one case. Additionally, an epistatic analysis (non-additive interlocus interaction) of courtship QTL revealed frequent genetic interchromsomal relations leading in some instances to hybrid specific effects, e.g. reversion of phenotypic effects or the transgression of phenotypes. A QTL analysis based on a threefold sample size revealed, however, an overestimation of QTL effects in the analysis based on smaller sample size pointing towards a genetic architecture of many loci with small effects governing the phenotypic differences in courtship behaviour. Furthermore, the the study comprised the analysis of postzygotic isolation in the reciprocal crosses N. vitripennis (♀) x N. longicornis (♂) versus N. longicornis (♀) x N. vitripennis (♂) located several loci distributed over different chromosomes that are involved in hybrid incompatibility. The mapping of hybrid incompatibility regions reproduced for the first time the observed asymmetries in the strength of postzygotic isolation in reciprocal crosses of between the more distant related taxa within the genus Nasonia. Stronger postzygotic incompatibilities in the VL cross are supposed to result from the superposition of nuclear-nuclear incompatibilities with nuclear-cytoplasmic incompatibilities, whereas the coincidences of these to types of incompatibilities were found to be much weaker in the reciprocal LV cross. N2 - Die Genetik von Artunterschieden ist einer der herausragenden Fragen der Evolutionsbiologie. Auf welche Weise entwickeln sich Arten phänotypisch auseinander? Divergierende Merkmale sind häufig an präzygoter Isolation beteilgt, das heißt, die Verhinderung von Hybridpaarungen, wohingegen die postzygote Isolation auftritt, wenn Hybride einen Fitnessverlust erleiden. Die parasitische Wespengattung Nasonia stellt ein hervorragendes Modellsystem zur Untersuchung der Genetik von Artunterschieden und der Genetik von postzygoter Isolation dar. Die Gattung besteht aus den drei Arten N. vitripennis, N. longicornis und N. giraulti, die sich in wahrscheinlich adaptiven Merkmalen der Männchen unterscheiden: Paarungsverhalten und Unterschiede in der Vorderflügelgröße. Das Paarungsverhalten besteht aus wiederkehrenden Kopfstoßserien, die durch Pausen getrennt sind. Aufgrund der stereotypen Ausbildung kann das Paarungsverhalten in distinkte Verhaltenskomponenten aufgeteilt werden. Männchen von N. vitripennis weisen verkleinerte Vorderflügel auf und sind flugunfähig. N. longicornis weist intermediäre Flügel auf und Männchen von N. giraulti besitzen voll ausgebildete Flügel und sind flugfähig. Nasonia Arten sind in der Lage interspezifische Hybride zu bilden, unter vorheriger Eliminierung von Wolbachia induzierten Hybridinkompatibilitäten durch Behandlung mit Antibiotika. Postzygote Isolation tritt in unterschiedlichem Ausmaß auf und ist asymmetrisch zwischen reziproken Kreuzungen, z.B. ist die Lebensunfähigkeit von Hybriden stärker in der Kreuzung N. vitripennis (♀) x N. longicornis (♂) als in der reziproken Kreuzung N. longicornis (♀) x N. vitripennis (♂) ausgeprägt. Die Bildung von interspezifischen Hybriden erlaubt die Untersuchung der genetischen Architektur von Artunterschieden in der QTL (quantitative trait locus) Analyse als auch die Untersuchung der postzygoten Isolation, die Hybridzusammenbruch verursacht. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Genetik von Unterschieden im Paarungsverhalten und Flügelgröße zwischen N. vitripennis und N. longicornis und die Genetik der postzygoten Isolation zu untersuchen, um Hinweise auf die evolutionären Prozesse zu gewinnen, die zur Divergenz von Artunterschieden und zur Etablierung von reproduktiver Isolation geführt haben. In einer QTL Analyse, die auf einer Kartierungspopulation von 94 F2-Hybriden einer LV Kreuzung basierte, konnten nur wenige QTL für Unterschiede in der Flügelgröße detektiert werden, die jedoch einen großen phänotypischen Effekt aufwiesen. Die QTL Analyse, die ebenfalls auf 94 LV-Hybriden basierte, ergab eine komplexe genetische Architektur des Paarungsverhaltens mit QTL, die einem Fall über 40 % der phänotypischen Varianz erklären konnten. Zusätzlich ergab eine Analyse von epistatischen (nichtadditive Interaktion zwischen Loci) viele interchromosomale Ineraktionen, die in einigen Fällen zu Hybrideffekten wie die Umkehrung von allelischen Effekten oder Transgression von Phänotypen führten. Eine QTL Analyse, die auf einer dreifachen Stichprobengröße beruhte, deutete allerdings auf eine starke Überschätzung phänotypischer Effekte bei der QTL Analyse mit kleinerer Stichprobe hin. Vielmehr scheinen die Unterschiede im Paarungsverhalten auf einer genetischen Architektur von vielen Faktoren mit kleineren phänotypischen Effekten zu beruhen. Die Analyse der postzygoten Isolation in den reziproken Kreuzungen N. vitripennis (♀) x N. longicornis (♂) und N. longicornis (♀) x N. vitripennis (♂) lokalisierte eine Reihe von Loci auf verschiedenen Chromosome, die am Hybridzusammenbruch beteiligt sind. Mit der Kartierung von Incompatibilitätsloci konnten zum ersten Mal die beobachtete Asymmetrie der postzygoten Isolation zwischen weiter entferntverwandten Taxa in der Gattung Nasonia genetisch nachvollzogen werden. Die stärker ausgeprägte Hybridinkompatibilität in der VL Kreuzung scheint von der Überlagerung von nukleär-nukleärer Inkompatibilität und nukleär-zytoplasmatischer Inkompatibilität zu resulieren. Die Überlagerung dieser beiden beiden Formen der Hybridinkompatibilität ist in der reziproken LV Kreuzung wesentlich schwächer ausgeprägt. KW - Pteromalidae KW - Art KW - Molekulargenetik KW - Nasonia KW - Paarungsverhalten KW - QTL Analyse KW - Artunterschiede KW - Nasonia KW - courtship behaviour KW - QTL analysis KW - species differences Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14348 ER - TY - THES A1 - Grob, Robin T1 - The Function of Learning Walks of \({Cataglyphis Ants}\): Behavioral and Neuronal Analyses T1 - Die Funktion der Lernläufe in \(Cataglyphis\) Ameisen: eine Studie des Verhaltens und der neuronalen Auswirkungen N2 - Humans and animals alike use the sun, the moon, and the stars to guide their ways. However, the position of celestial cues changes depending on daytime, season, and place on earth. To use these celestial cues for reliable navigation, the rotation of the sky has to be compensated. While humans invented complicated mechanisms like the Antikythera mechanism to keep track of celestial movements, animals can only rely on their brains. The desert ant Cataglyphis is a prime example of an animal using celestial cues for navigation. Using the sun and the related skylight polarization pattern as a compass, and a step integrator for distance measurements, it can determine a vector always pointing homewards. This mechanism is called path integration. Since the sun’s position and, therefore, also the polarization pattern changes throughout the day, Cataglyphis have to correct this movement. If they did not compensate for time, the ants’ compass would direct them in different directions in the morning and the evening. Thus, the ants have to learn the solar ephemeris before their far-reaching foraging trips. To do so, Cataglyphis ants perform a well-structured learning-walk behavior during the transition phase from indoor worker to outdoor forager. While walking in small loops around the nest entrance, the ants repeatedly stop their forward movements to perform turns. These can be small walked circles (voltes) or tight turns about the ants’ body axes (pirouettes). During pirouettes, the ants gaze back to their nest entrance during stopping phases. These look backs provide a behavioral read-out for the state of the path integrator. The ants “tell” the observer where they think their nest is, by looking back to it. Pirouettes are only performed by Cataglyphis ants inhabiting an environment with a prominent visual panorama. This indicates, that pirouettes are performed to learn the visual panorama. Voltes, on the other hand, might be used for calibrating the celestial compass of the ants. In my doctoral thesis, I employed a wide range of state-of-the-art techniques from different disciplines in biology to gain a deeper understanding of how navigational information is acquired, memorized, used, and calibrated during the transition phase from interior worker to outdoor forager. I could show, that celestial orientation cues that provide the main compass during foraging, do not guide the ants during the look-backbehavior of initial learning walks. Instead Cataglyphis nodus relies on the earth’s magnetic field as a compass during this early learning phase. While not guiding the ants during their first walks outside of the nest, excluding the ants from perceiving the natural polarization pattern of the skylight has significant consequences on learning-related plasticity in the ants’ brain. Only if the ants are able to perform their learning-walk behavior under a skylight polarization pattern that changes throughout the day, plastic neuronal changes in high-order integration centers are induced. Especially the mushroom bogy collar, a center for learning and memory, and the central complex, a center for orientation and motor control, showed an increase in volume after learning walks. This underlines the importance of learning walks for calibrating the celestial compass. The magnetic compass might provide the necessary stable reference system for the ants to calibrate their celestial compass and learn the position of landmark information. In the ant brain, visual information from the polarization-sensitive ocelli converge in tight apposition with neuronal afferents of the mechanosensitive Johnston’s organ in the ant’s antennae. This makes the ants’ antennae an interesting candidate for studying the sensory bases of compass calibration in Cataglyphis ants. The brain of the desert navigators is well adapted to successfully accomplish their navigational needs. Females (gynes and workers) have voluminous mushroom bodies, and the synaptic complexity to store large amount of view-based navigational information, which they acquire during initial learning walks. The male Cataglyphis brain is better suited for innate behaviors that support finding a mate. The results of my thesis show that the well adapted brain of C. nodus ants undergoes massive structural changes during leaning walks, dependent on a changing celestial polarization pattern. This underlies the essential role of learning walks in the calibration of orientation systems in desert ants. N2 - Die Gestirne helfen nicht nur Menschen uns zurecht zu finden, sondern auch Tiere können Sonne, Mond und Sterne für Navigation nutzen. Dabei gilt es aber zu beachten, dass die Himmelskörper ihre Position abhängig von der Tageszeit, den Jahreszeiten und dem Standort auf der Erde verändern. Um anhand von Himmelseigenschaften erfolgreich navigieren zu können, ist es deshalb unerlässlich diese Himmelsrotation zu kennen und für sie zu kompensieren. Menschen haben dafür bereits in der Antike komplizierte Maschinen wie den Antikythera Mechanismus entwickelt, Tiere dagegen brauchen nur ihr Gehirn. Wüstenameisen der Galtung Cataglyphis sind kleine Meisternavigatoren. Sie benutzen einen Himmelskompass, basierend auf der Sonne und dem mit ihr assoziierten Polarisationsmuster des Himmels, und einen Schrittintegrator, um einen Vektor zu bestimmen, der immer genau zu ihrem Ausgangspunkt zurück zeigt. Dieser Orientierungsmechanismus heißt Wegintegration. Da sich allerdings die Position der Sonne am Himmel und damit auch das Polarisationsmuster des Himmels über den Tag verändern, muss Cataglyphis für diese Veränderung kompensieren. Würde sie das nicht tun, würde ihr Kompass morgens in eine ganz andere Richtung als abends zeigen. Deshalb müssen Ameisen den Sonnenverlauf erlernen bevor sie zu ihren weitläufigen Futtersuchläufen aufbrechen. Cataglyphis führt dazu ein strukturiertes Lernlaufverhalten durch während des Übergangs von Innendiensttier zu Sammlerinnen. Dabei laufen die Ameisen in kleinen Schlaufen um ihren Nesteingang und stoppen ihre Vorwärtsbewegung mehrmalig, um Drehungen durchzuführen. Diese Drehungen sind entweder kleine gelaufene Kreise (Volten) oder Drehungen um die eigene Achse (Pirouetten). Nur Cataglyphis, die Gegenden mit einem reichhaltigen visuellen Panorama bewohnen, führen Pirouetten aus bei denen sie zurück zu ihrem Nesteingang schauen. Dies legt nahe, dass während Pirouetten das Panorama gelernt wird. Während Volten wird wohl der Himmelskompass kalibriert. Die Rückdrehungen während ihrer Lernläufe geben die einmalige Möglichkeit, die Ameise zu „fragen“ wo sie denkt, dass ihr Nest sei und damit ihren Wegintegrator auszulesen. In meiner Doktorarbeit kombinierte ich viele biologischen Methoden unterschiedlicher Disziplinen um zu untersuchen wie die Ameisen ihre Navigationssysteme während der ersten Läufe außerhalb des Nestes erlernen, speichern, kalibrieren und später nutzen. Ich konnte zeigen, dass Himmelsinformationen, die bei Sammlerinnen als wichtigster 4 Kompass dienen, nicht für die Orientierung der Rückblicke während Lernläufen dienen. Stattdessen nutzten naive Cataglyphis nodus das Erdmagnetfeld als Kompass. Obwohl Himmelsinformationen nicht als Kompass während der Lernläufe genutzt werden, spielen sie eine essentielle Rolle für neuroplastische Veränderungen im Gehirn der Ameisen. Nur wenn Ameisen ihre Lernläufe unter einem Polaristaionsmuster, das sich über den Tag hinweg verändert, ausführen, kommt es zu plastischen Veränderungen in neuronalen Integrationszentren. Besonders die Pilzkörper, Zentren für Lernen und Gedächtnis, und der Zentralkomplex, Zentrum für Orientierung und Bewegungssteuerung, nehmen im Volumen nach Lernläufen zu. Lernläufe spielen also eine wichtige Rolle für die Kalibrierung der Navigationsinformationen. Das Erdmagnetfeld könnte das für die Kalibierung notwendige erdgebundene, stabile Referenzsystem bieten, an dem die Himmelsbewegung gelernt wird. Im Ameisengehirn laufen visuelle Informationen von den polarisatiossensitiven Ocelli mit Afferenzen des mechanosensitiven Johnstonschen Organ aus der Antenne zusammen. Die Antenne könnte daher eine wichtiges Organ für die Kalibrierung der Orientierungssysteme sein. Das kleine Gehirn der Ameisen ist bestens an ihre Anforderungen als große Navigatoren angepasst. Weibliche C. nodus (Arbeiterinnen und Königinnen) besitzen große Pilzkörper mit einer Anzahl an Synapsen, die es ihnen erlaubt eine Vielzahl von Umgebungsbildern zu speichern, die sie während ihrer initialen Lernläufe lernen müssen. Das männliche Cataglyphis-Gehirn ist besser auf angeborene Orientierungsstrategien angepasst, die ihm helfen einen Geschlechtspartner zu finden. Die Ergebnisse meiner Doktorarbeit zeigen, dass das an die navigatorischen Herausforderungen angepasste Gehirn von C. nodus signifikante neuronale Veränderungen in Abhängigkeit eines sich veränderten Polaristaionsmusters während der Lernläufe erfährt. Dies zeigt die essentielle Rolle der Lernläufe in der Kalibrierung der Navigationssysteme von Wüstenameisen. KW - Cataglyphis KW - Kompass KW - Navigation KW - Nahrungserwerb KW - Neuroethologie KW - Neuroethology KW - Polyethism KW - Learning Walk KW - Geomagnetic Field KW - Learning & Memory Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-290173 ER - TY - THES A1 - Fraune, Johanna T1 - The evolutionary history of the mammalian synaptonemal complex T1 - Die Evolutionsgeschichte des Synaptonemalkomplexes der Maus N2 - Der Synaptonemalkomplex (SC) ist eine hochkonservierte Proteinstruktur. Er weist eine dreiteili-ge, leiterähnliche Organisation auf und ist für die stabile Paarung der homologen Chromosomen während der Prophase der ersten meiotischen Teilung verantwortlich, die auch als Synpase be-zeichnet wird. Fehler während der Synpase führen zu Aneuploidie oder Apoptose der sich entwi-ckelnden Keimzellen. Seit 1956 ist der SC Gegenstand intensiver Forschung. Seine Existenz wurde in zahlreichen Orga-nismen von der Hefe bis zum Menschen beschrieben. Seine Struktur aus zwei parallel verlaufen-den Lateralelementen (LE), die durch eine Vielzahl von sogenannten Transversalfilamenten (TF) verbunden werden und dem Zentralen Element (CE) in der Mitte des SC ist dabei offensichtlich über die Millionen von Jahren der Evolution erhalten geblieben. Einzelne Proteinkomponenten des SC wurden jedoch nur in wenigen Modelorganismen charakterisiert, darunter Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Ceanorhabditis elegans und Mus mus-culus. Unerwarteter Weise gelang es bei dieser Charakterisierung nicht, eine evolutionäre Ver-wandtschaft, d.h. eine Homologie zwischen den Proteinsequenzen der verschiedenen SCs nach-zuweisen. Diese Tatsache sprach gegen die grundsätzliche Annahme, dass der SC in der Evolution nur einmal entstanden sei. Diese Arbeit hat sich nun der Aufgabe gewidmet, die Diskrepanz zwischen der hochkonservierten Struktur des SC und seiner augenscheinlich nicht-homologen Proteinzusammensetzung zu lösen. Dabei beschränkt sie sich auf die Analyse des Tierreichs. Es ist die erste Studie zur Evolution des SC in Metazoa und demonstriert die Monophylie der Säuger SC Proteinkomponenten im Tierreich. Die Arbeit zeigt, dass mindestens vier von sieben SC Proteinen der Maus spätestens im letzten gemeinsamen Vorfahren der Gewebetiere (Eumetazoa) enstanden sind und auch damals Teil ei-nes ursprünglichen SC waren, wie er heute in dem Nesseltier Hydra zu finden ist. Dieser SC weist die typische Struktur auf und besitzt bereits alle notwendigen Komponenten, um die drei Domä-nen – LE, TF und CE – zu assemblieren. Darüber hinaus ergaben die einzelnen Phylogenien der verschiedenen SC Proteine der Maus, dass der SC eine sehr dynamische Evolutionsgeschichte durchlaufen hat. Zusätzliche Proteine wurden während der Entstehung der Bilateria und der Wir-beltiere in den SC integriert, während andere ursprüngliche Komponenten möglicherweise Gen-Duplikationen erfuhren bzw. besonders in der Linie der Häutungstiere verloren gingen oder sich stark veränderten. Es wird die These aufgestellt, dass die auf den ersten Blick nicht-homologen SC Proteine der Fruchtfliege und des Fadenwurms tatsächlich doch von den ursprünglichen Prote-inenkomponenten abstammen, sich aber aufgrund der rasanten Evolution der Arthropoden und der Nematoden bis zu deren Unkenntlichkeit diversifizierten. Zusätzlich stellt die Arbeit Hydra als alternatives wirbelloses Modellsystem für die Meiose- und SC-Forschung zu den üblichen Modellen D. melanogaster und C. elegans vor. Die kürzlich gewon-nenen Erkenntnisse über den Hydra SC sowie der Einsatz der Standard-Methoden in diesem Orga-nismus werden in dem abschließenden Kapitel zusammengefasst und diskutiert. N2 - The synaptonemal complex (SC) is a highly conserved structure in sexually reproducing organism. It has a tripartite, ladder-like organization and mediates the stable pairing, called synapsis, of the homologous chromosomes during prophase of meiosis I. Failure in homolog synapsis result in aneuploidy and/or apoptosis of the developing germ cells. Since 1956, the SC is subject of intense research and its presence was described in various species from yeast to human. Its structure was maintained during millions of years of evolution consist-ing of two parallel lateral elements (LEs), joined by numerous transverse filaments (TFs) which run perpendicular to the LEs and an electron dense central element (CE) in the middle of the SC. Individual protein components, however, were characterized only in few available model organ-isms, as for example Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Ceanorhabditis elegans and Mus musculus. Rather unexpectedly, these characterizations failed to detect an evolutionary homology between the protein components of the different SCs. This fact challenged the general idea of a single origin of the SC in the evolution of meiosis and sexual reproduction. This thesis now addressed itself to the task to unravel the discrepancy between the high conser-vation of the SC structure and its diverse and apparently non-homologous protein composition, focusing on the animal kingdom. It is the first study dealing with the evolution of the SC in Meta-zoa and demonstrates the monophyly of the mammalian SC components in metazoan species. The thesis demonstrates that at least four out of seven murine SC proteins emerged in Eumeta-zoa at the latest and have been likewise part of an ancient SC as it can be found in the present-day cnidarian species Hydra. This SC displays the common organization and already possesses the minimal protein kit corresponding to the three different structural domains: LEs, TFs and the CE. Additionally, the individual phylogenies of the murine SC proteins revealed the dynamic evolu-tionary history of the ancient SC. Further components were added during the diversification of Bilateria and vertebrates while ancestral proteins likely duplicated in the vertebrate lineage and diversified or got lost in the branch leading to ecdysozoan species. It is hypothesized that the apparently non-homologous SC proteins in D. melanogaster and C. elegans actually do derive from the ancient SC proteins but diversified beyond recognition during the fast evolution of Ar-thropoda and Nematoda. The study proposes Hydra as an alternative invertebrate model system for meiosis and SC re-search to the standard organisms D. melanogaster and C. elegans. Recent results about the cni-darian SC as well as the possible application of standard methods is discussed and summarized in the concluding section. KW - Synaptinemal-Komplex KW - Maus KW - Hydra KW - Evolution KW - Meiose Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100043 ER - TY - THES A1 - Mitesser, Oliver T1 - The evolution of insect life history strategies in a social context T1 - Die Evolution von Lebenslaufstrategien bei Insekten in sozialem Kontext N2 - This thesis extends the classical theoretical work of Macevicz and Oster (1976, expanded by Oster and Wilson, 1978) on adaptive life history strategies in social insects. It focuses on the evolution of dynamic behavioural patterns (reproduction and activity) as a consequence of optimal allocation of energy and time resources. Mathematical modelling is based on detailed empirical observations in the model species Lasioglossum malachurum (Halictidae; Hymenoptera). The main topics are field observations, optimisation models for eusocial life histories, temporal variation in life history decisions, and annual colony cycles of eusocial insects. N2 - Diese Dissertation entwickelt die klassische theoretische Arbeit von Macevicz und Oster (1976, erweitert von Oster und Wilson, 1978) zu adaptiven Lebenslaufstrategien bei sozialen Insekten fort. Der Schwerpunkt liegt dabei auf der Evolution von dynamischen Verhaltensmustern (Reproduktion und Aktivität) als Resultat optimaler Allokation von Energie- und Zeitressourcen. Die mathematische Modellierung erfolgt auf Basis detaillierter Beobachtungsdaten zum Koloniezyklus der Furchenbiene Lasioglossum malachurum (Halictidae; Hymenoptera). Zentrale Themenbereiche sind Freilandbeobachtungen, Optimierungsmodelle für eusoziale Lebenslaufstrategien, zeitliche Variabilität bei Lebenslaufentscheidungen und der jährliche Koloniezyklus eusozialer Insekten. KW - Schmalbienen KW - Insektenstaat KW - Lebensdauer KW - Evolution KW - Mathematisches Modell KW - Evolution KW - Lebenslaufstrategien KW - soziale Insekten KW - mathematische Modellierung KW - Halictidae KW - evolution KW - life history strategy KW - social insects KW - mathematical model KW - Halictidae Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22576 ER - TY - THES A1 - Claßen, Alexandra T1 - The ERK-cascade in the pathophysiology of cardiac hypertrophy T1 - Die ERK-Kaskade in der Pathophysiologie der Herzhypertrophie N2 - ERK1/2 are known key players in the pathophysiology of heart failure, but the members of the ERK cascade, in particular Raf1, can also protect the heart from cell death and ischemic injury. An additional autophosphorylation (ERK1 at Thr208, ERK2 at Thr188) empowers ERK1/2 translocation to the nucleus and phosphorylation of nuclear targets which take part in the development of cardiac hypertrophy. Thereby, targeting this additional phosphorylation is a promising pharmacological approach. In this thesis, an in silico model of ERK cascade in the cardiomyocyte is introduced. The model is a semi-quantitive model and its behavior was tested with different softwares (SQUAD and CellNetAnalyzer). Different phosphorylation states of ERK1/2 as well as different stimuli can be reproduced. The different types of stimuli include hypertrophic as well as non-hypertrophic stimuli. With the introduced in-silico model time courses and synergistic as well as antagonistic receptor stimuli combinations can be predicted. The simulated time courses were experimentally validated. SQUAD was mainly used to make predictions about time courses and thresholds, whereas CNA was used to analyze steady states and feedback loops. Furthermore, new targets of ERK1/2 which partially contribute, also in the formation of cardiac hypertrophy, were identified and the most promising of them were illuminated. Important further targets are Caspase 8, GAB2, Mxi-2, SMAD2, FHL2 and SPIN90. Cardiomyocyte gene expression data sets were analyzed to verify involved components and to find further significantly altered genes after induced hypertrophy with TAC (transverse aortic constriction). Changes in the ultrastructure of the cardiomyocyte are the final result of induced hypertrophy. N2 - ERK1/2 sind bekannte Schlüsselfiguren bei der Entstehung der Herzinsuffizienz. Weitere Komponenten der ERK-Kaskade, insbesondere Raf1, können das Herz jedoch vor Zelltod und ischämischem Schaden schützen. Eine zusätzliche Autophosphorylierung von ERK1 an Thr208 bzw. von ERK2 an Thr188 ermöglicht ERK1/2 die Translokation zum Zellkern und befähigt ERK dort zur Phosphorylierung von nukleosolischen Zielproteinen, welche eine Herzmuskelhypertrophie auslösen. Daher erscheint diese zusätzliche Autophosphorylierung als eine vielversprechende pharmakologische Zielstruktur. In dieser Arbeit wird ein in-silico Modell der ERK-Kaskade im Kardiomyozyten präsentiert. Das Modell ist ein semi-quantitatives Modell und wurde mit den Programmen SQUAD und CellNetAnalyzer getestet. Verschiedene Phosphorylierungs-Zustände von ERK1/2 als auch verschiedene Stimuli (hypertrophe als auch nicht-hypertrophe) können mit dem Modell reproduziert werden. Mit dem präsentierten in-silico Modell können sowohl zeitliche Abläufe als auch synergistische und antagonistische Effekte vorhergesagt werden. Die simulierten zeitlichen Abläufe wurden durch in-vitro Experimente validiert. SQUAD wurde hauptsächlich für die Modellierung von zeitlichen Abläufen und Schwellenwerte genutzt, wohingegen CellNetAnalyzer vor allen Dingen zur Analyse von Fließgleichgewichten und Rückkopplungs-Mechanismen genutzt wurde. Darüberhinaus wurden Zielstrukturen von ERK1/2, welche zusätzlich an der Entstehung der Herzhypertrophie mitwirken, identifiziert. Diese umfassen unter anderem Caspase 8, GAB2, Mxi-2, SMAD2, FHL2 und SPIN90. Gen-Expressions-Datensätze von Kardiomyozyten nach TAC (transverse aortic constriction) wurden analysiert. Diese wurden mit den im Model vorhandenen Strukturen verglichen und signifikant veränderte Expressionslevel wurden identifiziert. Veränderungen der Ultrastruktur des Kardiomyozyten sind das Ergebnis der induzierten Hypertrophie. KW - Herzhypertrophie KW - Systembiologie KW - ERK-cascade KW - ERK-Kaskade KW - cardiac hypertrophy KW - in-silico model KW - In-silico Modell Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229664 ER - TY - THES A1 - Bergmann Borges, Alyssa T1 - The endo-lysosomal system of \(Trypanosoma\) \(brucei\): insights from a protist cell model T1 - Das Endo-lysosomale System von \(Trypanosoma\) \(brucei\): Erkenntnisse aus einem Protisten-Zellmodell N2 - Most of the studies in cell biology primarily focus on models from the opisthokont group of eukaryotes. However, opisthokonts do not encompass the full diversity of eukaryotes. Thus, it is necessary to broaden the research focus to other organisms to gain a comprehensive understanding of basic cellular processes shared across the tree of life. In this sense, Trypanosoma brucei, a unicellular eukaryote, emerges as a viable alternative. The collaborative efforts in genome sequencing and protein tagging over the past two decades have significantly expanded our knowledge on this organism and have provided valuable tools to facilitate a more detailed analysis of this parasite. Nevertheless, numerous questions still remain. The survival of T. brucei within the mammalian host is intricately linked to the endo-lysosomal system, which plays a critical role in surface glycoprotein recycling, antibody clearance, and plasma membrane homeostasis. However, the dynamics of the duplication of the endo-lysosomal system during T. brucei proliferation and its potential relationship with plasma membrane growth remain poorly understood. Thus, as the primary objective, this thesis explores the endo-lysosomal system of T. brucei in the context of the cell cycle, providing insights on cell surface growth, endosome duplication, and clathrin recruitment. In addition, the study revisits ferritin endocytosis to provide quantitative data on the involvement of TbRab proteins (TbRab5A, TbRab7, and TbRab11) and the different endosomal subpopulations (early, late, and recycling endosomes, respectively) in the transport of this fluid-phase marker. Notably, while these subpopulations function as distinct compartments, different TbRabs can be found within the same region or structure, suggesting a potential physical connection between the endosomal subpopulations. The potential physical connection of endosomes is further explored within the context of the cell cycle and, finally, the duplication and morphological plasticity of the lysosome are also investigated. Overall, these findings provide insights into the dynamics of plasma membrane growth and the coordinated duplication of the endo-lysosomal system during T. brucei proliferation. The early duplication of endosomes suggests their potential involvement in plasma membrane growth, while the late duplication of the lysosome indicates a reduced role in this process. The recruitment of clathrin and TbRab GTPases to the site of endosome formation supports the assumption that the newly formed endosomal system is active during cell division and, consequently, indicates its potential role in plasma membrane homeostasis. Furthermore, considering the vast diversity within the Trypanosoma genus, which includes ~500 described species, the macroevolution of the group was investigated using the combined information of the 18S rRNA gene sequence and structure. The sequence-structure analysis of T. brucei and other 42 trypanosome species was conducted in the context of the diversity of Trypanosomatida, the order in which trypanosomes are placed. An additional analysis focused on Trypanosoma highlighted key aspects of the group’s macroevolution. To explore these aspects further, additional trypanosome species were included, and the changes in the Trypanosoma tree topology were analyzed. The sequence-structure phylogeny confirmed the independent evolutionary history of the human pathogens T. brucei and Trypanosoma cruzi, while also providing insights into the evolution of the Aquatic clade, paraphyly of groups, and species classification into subgenera. N2 - Die meisten Studien in der Zellbiologie konzentrieren sich in erster Linie auf Modelle aus der Opisthokont-Gruppe der Eukaryonten. Die Opisthokonten umfassen jedoch nicht die gesamte Vielfalt der Eukaryonten. Daher ist es notwendig, den Forschungsschwerpunkt auf andere Organismen auszuweiten, um ein umfassendes Verständnis grundlegender zellulärer Prozesse zu erlangen, die im gesamten Lebensbaum vorkommen. In diesem Sinne stellt Trypanosoma brucei, ein einzelliger Eukaryote, eine brauchbare Alternative dar. Die gemeinsamen Anstrengungen bei der Genomsequenzierung und der Markierung von Proteinen in den letzten zwei Jahrzehnten haben unser Wissen über diesen Organismus erheblich erweitert und wertvolle Instrumente für eine detailliertere Analyse dieses Parasiten bereitgestellt. Dennoch bleiben noch zahlreiche Fragen offen. Das Überleben von T. brucei im Säugetierwirt ist eng mit dem endo-lysosomalen System verknüpft, das eine entscheidende Rolle beim Recycling von Oberflächenglykoproteinen, der Antikörper-Clearance und der Homöostase der Plasmamembran spielt. Die Dynamik der Verdoppelung des endo-lysosomalen Systems während der Vermehrung von T. brucei und seine mögliche Beziehung zum Wachstum der Plasmamembran sind jedoch noch wenig bekannt. In dieser Arbeit wird daher das endo-lysosomale System von T. brucei im Kontext des Zellzyklus untersucht, um Erkenntnisse über das Wachstum der Zelloberfläche, die Verdopplung der Endosomen und die Clathrin-Rekrutierung zu gewinnen. Darüber hinaus wird in der Studie die Ferritin-Endozytose erneut untersucht, um quantitative Daten über die Beteiligung der TbRab-Proteine (TbRab5A, TbRab7 und TbRab11) und der verschiedenen endosomalen Subpopulationen (frühe, späte bzw. Recycling-Endosomen) am Transport dieses Flüssigphasenmarkers zu erhalten. Bemerkenswert ist, dass diese Subpopulationen zwar als unterschiedliche Kompartimente fungieren, aber verschiedene TbRabs in derselben Region oder Struktur gefunden werden können, was auf eine mögliche physische Verbindung zwischen den endosomalen Subpopulationen hindeutet. Die potenzielle physikalische Verbindung von Endosomen wird im Zusammenhang mit dem Zellzyklus weiter erforscht, und schließlich werden auch die Verdopplung und die morphologische Plastizität des Lysosoms untersucht. Insgesamt bieten diese Ergebnisse Einblicke in die Dynamik des Plasmamembranwachstums und die koordinierte Verdopplung des endo-lysosomalen Systems während der Proliferation von T. brucei. Die frühe Verdoppelung der Endosomen deutet auf ihre mögliche Beteiligung am Plasmamembranwachstum hin, während die späte Verdoppelung der Lysosomen auf eine geringere Rolle in diesem Prozess hindeutet. Die Rekrutierung von Clathrin- und TbRab-GTPasen an der Stelle der Endosomenbildung unterstützt die Annahme, dass das neu gebildete endosomale System während der Zellteilung aktiv ist, und deutet folglich auf seine potenzielle Rolle bei der Homöostase der Plasmamembran hin. In Anbetracht der enormen Vielfalt innerhalb der Gattung Trypanosoma, die etwa 500 beschriebene Arten umfasst, wurde die Makroevolution der Gruppe anhand der kombinierten Informationen der 18S rRNA-Gensequenz und Struktur untersucht. Die Sequenz-Struktur-Analyse von T. brucei und anderen 42 Trypanosomen-Arten wurde im Zusammenhang mit der Vielfalt der Trypanosomatida, der Ordnung, in die Trypanosomen eingeordnet werden, durchgeführt. Eine zusätzliche Analyse, die sich auf Trypanosoma konzentrierte, hob Schlüsselaspekte der Makroevolution dieser Gruppe hervor. Um diese Aspekte weiter zu erforschen, wurden zusätzliche Trypanosomenarten einbezogen und die Veränderungen in der Topologie des Trypanosoma-Baums analysiert. Die Sequenz-Struktur-Phylogenie bestätigte die unabhängige Evolutionsgeschichte der humanen Krankheitserreger T. brucei und Trypanosoma cruzi, während sie gleichzeitig Einblicke in die Evolution der aquatischen Klade, die Paraphylie von Gruppen und die Klassifizierung der Arten in Untergattungen lieferte. KW - 18S rRNA KW - Endocytose KW - Zellzyklus KW - Phylogenie KW - Endocytosis KW - Cell cycle KW - Trypanosoma KW - Phylogeny KW - Sequence-Structure KW - Endosomes KW - Lysosome Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-329248 ER - TY - THES A1 - Vogel, Cassandra Ezra T1 - The effects of land-use and agroecological practices on biodiversity and ecosystem services in tropical smallholder farms T1 - Die Effekte von Landnutzung und Agroökologie auf Biodiversität und Ökosystemdienstleistungen in der tropischen Subsistenzlandwirtschaft N2 - Biodiversity is in rapid decline worldwide. These declines are more pronounced in areas that are currently biodiversity rich, but economically poor – essentially describing many tropical regions in the Global South where landscapes are dominated by smallholder agriculture. Agriculture is an important driver of biodiversity decline, through habitat destruction and unsustainable practices. Ironically, agriculture itself is dependent on a range of ecosystem services, such as pollination and pest control, provided by biodiversity. Biodiversity on fields and the delivery of ecosystem services to crops is often closely tied to the composition of the surrounding landscape – complex landscapes with a higher proportion of (semi-)natural habitats tend to support a high abundances and biodiversity of pollinators and natural enemies that are beneficial to crop production. However, past landscape scale studies have focused primarily on industrialized agricultural landscapes in the Global North, and context dependent differences between regions and agricultural systems are understudied. Smallholder agriculture supports 2 billion people worldwide and contributes to over half the world’s food supply. Yet smallholders, particularly in sub-Saharan Africa, are underrepresented in research investigating the consequences of landscape change and agricultural practices. Where research in smallholder agriculture is conducted, the focus is often on commodity crops, such as cacao, and less on crops that are directly consumed by smallholder households, though the loss of services to these crops could potentially impact the most vulnerable farmers the hardest. Agroecology – a holistic and nature-based approach to agriculture, provides an alternative to unsustainable input-intensive agriculture. Agroecology has been found to benefit smallholders through improved agronomical and food-security outcomes. Co-benefits of agroecological practices with biodiversity and ecosystem services are assumed, but not often empirically tested. In addition, the local and landscape effects on biodiversity and ecosystem services are more commonly studied in isolation, but their potentially interactive effects are so far little explored. Our study region in northern Malawi exemplifies many challenges experienced by smallholder farmers throughout sub-Saharan Africa and more generally in the Global South. Malawi is located in a global biodiversity hotspot, but biodiversity is threatened by rapid habitat loss and a push for input-intensive agriculture by government and other stakeholders. In contrast, agroecology has been effectively promoted and implemented in the study region. We investigated how land-use differences and the agroecological practices affects biodiversity and ecosystem services of multiple taxa in a maize-bean intercropping system (Chapter 2), and pollination of pumpkin (Chapter 3) and pigeon pea (Chapter 4). Additionally, the effects of local and landscape scale shrub- to farmland habitat conversion was investigated on butterfly communities, as well as the potential for agroecology to mitigate these effects (Chapter 5). N2 - Die globale Biodiversität nimmt rapide ab. Dieser Biodiversitätsverlust ist in Regionen die reich an Biodiversität aber wirtschaftlich arm sind besonders stark ausgeprägt, insbesondere in vielen tropischen Regionen, die durch Subsistenzlandwirtschaft geprägt sind. Durch die Zerstörung natürlicher Lebensräume und nicht nachhaltige Land Nutzung ist Landwirtschaft eine der Hauptursachen dieses Biodiversitätsrückgangs. Dabei ist gerade landwirtschaftliche Produktion abhängig von Biodiversität, da Biodiversität Ökosystemdienstleistungen wie Bestäubung und natürliche Schädlingskontrolle bereitstellt. Biodiversität und Ökosystemdienstleistungen auf Feldern werden stark durch die umliegende Landschaft beeinflusst - komplexe Landschaften mit einen großen Anteil (halb-)natürlicher haben in der Regel höhere Abudanzen und eine größere Biodiversität von Bestäubern und natürlichen Feinden die vorteilhaft für die landwirtschaftliche Produktion sind. Forschung auf Landschaftebene hat bisher jedoch vorrangig auf die industrialisierte Landwirtschaft in z.B. Europa oder die USA fokussiert und kontextabhängige Unterschiede zwischen Regionen und landwirtschaftlichen Systemen sind nicht ausreichend studiert..Weltweit sind etwa 2 Milliarden Menschen von Subsistenzlandwirtschaft abhängig. Jedoch sind diese Kleinbauern, in der Forschung über die Konsequenzen von Landnutzung und landwirtschaftlichen Managements auf Biodiversität und Ökosystemdienstleistungen unterrepräsentiert, insbesondere Kleinbauern aus Subsahara-Afrika. Die wenigen verfügbaren Studien legend den Fokus oft auf wirtschaftlich wichtige Kulturpflanzen, wie etwa Kakao, und selten auf Kulturpflanzen, die für Ernährungssicherheit der Kleinbauern wichtig sind, obwohl der Verlust der Ökosystemdienstleistungen diese möglicherweise am härtesten trifft. Agroökologie ist eine nachhaltigere Form des landwirtschaftlichen Managements als die konventionelle Landwirtschaft, und will den Einsatz von Agrochemie zu reduzieren und eine holistische Landwirtschaft fördern. Agroökologie steigert die Ernährungssicherheit von Kleinbauern, insbesondere wenn die Bauern viele verschiedene agroökologische Verfahren nutzen. Vorteile der Agroökologie für Biodiversität und Ökosystemdienstleistungen werden oft vermutet, wurden bislang jedoch selten empirisch getestet. Zusätzlich wurden Effekte auf Biodiversität und Ökosystemdienstleistungen vorrangig getrennt zwischen der lokalen und der Landschaftsebene betrachtet, was das Erkennen potentieller Interaktionen erschwert. Unsere Studienregion in Nord Malawi spiegelt die viele Herausforderungen der afrikanischen Zusammenfassung Subsistenzlandwirtschaft wider. Malawi liegt in einem Biodiversitäts-Hotspot, jedoch ist diese Biodiversität durch einen schnellen Rückgang natürlicher Lebensräume und durch die Intensivierung der Landwirtschaft stark gefährdet. Dem gegenüber stehen erfolgreicher Ausbau und Umsetzung von Agroökologie in der Region. Das gab mir die Möglichkeit, die Effekte von Landnutzung und Agroökologie auf Biodiversität und Ökosystemdienstleistungen in Malawi zu untersuchen. Dafür habe ich in Mais und Bohnen in Einzel- und Mischkultur 7 taxonomische Gruppen die verschiedene Ökosystemdienstleistungen erbringen erfasst (Kapitel 2) sowie Bestäuber und Bestäubung auf Kürbis (Kapitel 3) und Straucherbsen studiert (Kapitel 4). Zusätzlich habe ich an Schmetterlingen die Effekte von Lebensraumverlust auf der lokalen und auf Landschaftsebene studiert, und untersucht, ob Agroökologie potenziell negative Effekte mindern kann (Kapitel 5). KW - biodiversity KW - ecosystem services KW - landscape ecology KW - smallholder agriculture KW - pollination KW - pest control KW - agroecology KW - tropical ecology Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-290661 ER - TY - THES A1 - Heidrich, Lea T1 - The effect of environmental heterogeneity on communities T1 - Der Einfluss von Heterogenität in Umweltbedingungen auf Artgemeinschaften N2 - How diversity of life is generated, maintained, and distributed across space and time is the central question of community ecology. Communities are shaped by three assembly processes: (I) dispersal, (II) environ-mental, and (III) interaction filtering. Heterogeneity in environmental conditions can alter these filtering processes, as it increases the available niche space, spatially partitions the resources, but also reduces the effective area available for individual species. Ultimately, heterogeneity thus shapes diversity. However, it is still unclear under which conditions heterogeneity has positive effects on diversity and under which condi-tions it has negative or no effects at all. In my thesis, I investigate how environmental heterogeneity affects the assembly and diversity of diverse species groups and whether these effects are mediated by species traits. In Chapter II, I first examine how much functional traits might inform about environmental filtering pro-cesses. Specifically, I examine to which extent body size and colour lightness, both of which are thought to reflect the species thermal preference, shape the distribution and abundance of two moth families along elevation. The results show, that assemblages of noctuid moths are more strongly driven by abiotic filters (elevation) and thus form distinct patterns in colour lightness and body size, while geometrid moths are driven by biotic filters (habitat availability), and show no decline in body size nor colour lightness along elevation. Thus, one and the same functional trait can have quite different effects on community assembly even between closely related taxonomic groups. In Chapter III, I elucidate how traits shift the relative importance of dispersal and environmental filtering in determining beta diversity between forests. Environmental filtering via forest heterogeneity had on aver-age higher independent effects than dispersal filtering within and among regions, suggesting that forest heterogeneity determines species turnover even at country-wide extents. However, the relative importance of dispersal filtering increased with decreasing dispersal ability of the species group. From the aspects of forest heterogeneity covered, variations in herb or tree species composition had overall stronger influence on the turnover of species than forest physiognomy. Again, this ratio was influenced by species traits, namely trophic position, and body size, which highlights the importance of ecological properties of a taxo-nomic group in community assembly. In Chapter IV, I assess whether such ecological properties ultimately determine the level of heterogeneity which maximizes species richness. Here, I considered several facets of heterogeneity in forests. Though the single facets of heterogeneity affected diverse species groups both in positive and negative ways, we could not identify any generalizable mechanism based on dispersal nor the trophic position of the species group which would dissolve these complex relationships. In Chapter V, I examine the effect of environmental heterogeneity of the diversity of traits itself to evalu-ate, whether the effects of environmental heterogeneity on species richness are truly based on increases in the number of niches. The results revealed that positive effects of heterogeneity on species richness are not necessarily based on an increased number of niches alone, but proposedly also on a spatially partition of resources or sheltering effects. While ecological diversity increased overall, there were also negative trends which indicate filtering effects via heterogeneity. In Chapter VI, I present novel methods in measuring plot-wise heterogeneity of forests across continental scales via Satellites. The study compares the performance of Sentinel-1 and LiDar-derived measurements in depicting forest structures and heterogeneity and to their predictive power in modelling diversity. Senti-nel-1 could match the performance of Lidar and shows high potential to assess free yet detailed infor-mation about forest structures in temporal resolutions for modelling the diversity of species. Overall, my thesis supports the notion that heterogeneity in environmental conditions is an important driv-er of beta-diversity, species richness, and ecological diversity. However, I could not identify any general-izable mechanism which direction and form this effect will have. N2 - Eine zentrale Frage in der Ökologie ist es, wie die Diversität von Artgemeinschaften generiert, aufrecht-erhalten, und über Zeit und Raum verteilt wird. Die Zusammensetzung von Artgemeinschaften wird durch drei Prozesse bestimmt, die einzelne Arten herausfiltern: (I) Ausbreitung, sowie (II) Umweltbedin-gungen und (III) Interaktionen mit anderen Arten. Heterogenität in Umweltbedingungen verändert das Zusammenspiel dieser Filterprozesse, da es die Anzahl verfügbarer Nischen erhöht und Ressourcen räum-lich aufteilt, aber auch den für die jeweilige Art verfügbaren Raum reduziert, was schlussendlich die Diver-sität der Artgemeinschaft beeinflusst. Es ist jedoch immer noch unklar, wann Heterogenität die Diversität positiv und wann negativ oder sogar überhaupt nicht beeinflusst. In dieser Dissertation werde ich der Fra-ge nachgehen, wie Heterogenität die Artzusammensetzung und Diversität verschiedenster Artengruppen beeinflusst und ob deren Reaktion auf Heterogenität durch Artmerkmale beeinflusst wird. In Kapitel II untersuche ich zunächst inwieweit funktionale Merkmale den Einfluss von Umweltbedingun-gen auf Arten widerspiegeln. Dazu untersuchte ich den Einfluss von Körpergröße und Helligkeit auf die Verbreitung und Abundanz zweier Nachtfalterfamilien entlang eines Höhengradienten. Es zeigte sich, dass Noctuidae stärker von abiotischen Filterprozessen, d.h. Höhe, betroffen waren und klare Zu- bzw. Ab-nahmen in Körpergröße und Helligkeit entlang der Höhe aufwiesen, während Geometridae eher von bioti-schen Filterprozessen, d.h. der Verfügbarkeit ihres Habitats, beeinflusst wurden und keine Merkmalsmus-ter entlang der Höhe aufwiesen. Entsprechend kann ein- und dasselbe Merkmal selbst innerhalb nah-verwandter Artgruppen unterschiedliche Effekte auf die Zusammensetzung von Arten haben. In Kapitel III erläutere ich, wie funktionelle Merkmale die relative Wichtigkeit von Ausbreitungs- und Umweltfiltern für beta-Diversität verschieben können. Sowohl innerhalb als auch zwischen den untersuch-ten Regionen beeinflusste Heterogenität in Wäldern die beta-Diversität stärker als die räumliche Distanz. Letztere wurde allerdings immer bedeutender, je schlechter die Ausbreitungsfähigkeit der jeweiligen Arten-gruppe war. Wenn die Heterogenität in Wäldern nach floristischen und strukturellen Aspekten aufgeteilt wird, so hatte erstere alles in allem einen stärkeren Einfluss auf Unterschiede zwischen Artgemeinschaften. Bei Artengruppen höheren trophischen Levels und größeren Körperbaus hatten die strukturellen Aspekte jedoch einen stärkeren Einfluss. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Artzusammensetzung von be-stimmte Merkmale beeinflusst werden kann. In Kapitel IV untersuche ich ob solche Merkmale das Level an Heterogenität festlegen, an welchen Arten-reichtum am höchsten ist. Dazu betrachtete ich mehrere Aspekte von Heterogenität in Wäldern. Obwohl Heterogenität in diesen Aspekten sowohl positive als auch negative Einfluss auf den Artenreichtum der verschiedensten Artengruppen hatte, konnten wir diese nicht anhand der Ausbreitungsfähigkeit oder des trophischen Levels der Artengruppen ableiten. In Kapitel V untersuche ich schließlich den Effekt von Heterogenität auf die Vielfalt von funktionalen Merkmalen. Dieser Ansatz soll helfen zu evaluieren, ob eventuelle Anstiege in der Artenzahl mit Hetero-genität einem Zuwachs in der Anzahl der ökologischen Nischen zurückzuführen sind. Die Ergebnisse legen nahe, dass ein Anstieg von Artenreichtum nicht dadurch beeinflusst wird, sondern auch durch ande-re Mechanismen wie die räumliche Aufteilung von Ressourcen oder durch die Schaffung von Zufluchts-räumen. Obwohl Heterogenität die ökologische Diversität überwiegend positiv beeinflusste, gab es auch einige negative Reaktionen die darauf hindeuten, dass Heterogenität auch bestimmte Merkmale aus einer Artgemeinschaft herausfiltern kann. In Kapitel VI präsentiere ich neue, Satelliten-gestützte Methoden in der Erfassung von Waldstrukturen. In dieser Studie werden die Eignung von LiDar (Lasergestützte Waldvermessungen aus der Luft) und Senti-nel-1 (Satellitenscan durch Radiowellen) verglichen, Waldstrukturen und deren Heterogenität zu messen sowie verschiedene Diversitäts-indices zu modellieren. Hierbei schnitt Sentinel-1 ähnlich gut ab wie LiDar. Somit zeigt Sentinel-1 großes Potential zukünftige Biodiversitätsaufnahmen zu unterstützen, auch aufgrund der kostenfreie Verfügbarkeit von Daten, deren globalen Abdeckung und hohen zeitlichen Auflösung. Insgesamt unterstützen die Ergebnisse meiner Arbeit die große Bedeutung von Heterogenität, insbesonde-re von Waldstrukturen, für beta-Diversität, Artenreichtum und funktionaler Diversität. Allerdings konnte keine generelle Regel identifiziert werden, nach der sich vorhersagen lassen würde welche genaue Richtung dieser Effekt haben wird. KW - Heterogenität KW - Wald KW - Artenvielfalt KW - Waldstruktur Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-221781 ER - TY - THES A1 - Drescher, Jochen T1 - The Ecology and Population structure of the invasive Yelllow Crazy Ant Anoplolepis gracilipes T1 - Die Ökologie und Populationsstruktur der invasiven Ameisenart Anoplolepis gracilipes N2 - The invasive Yellow Crazy Ant Anoplolepis gracilipes is a widespread tropical ant species which is particularly common in anthropogenically disturbed habitats in South-East Asia and the Indopacific region. Its native range is unknown, and there is little information concerning its social structure as a potential mechanism facilitating invasion as well as its ecology in one of the putative native ranges, South-East Asia. Using mitochondrial DNA sequences, I demonstrated that the majority of the current Indopacific colonies were likely introduced from South-East Asian populations, which in turn may have been introduced much earlier from a yet unidentified native range. By conducting behavioral, genetic and chemical analyses, I found that A. gracilipes supercolonies contain closely related individuals, thus resembling enlarged versions of monogynous, polydomous colonies of other ant species. Furthermore, mutually aggressive A. gracilipes supercolonies were highly differentiated both genetically and chemically, suggesting limited or even absent gene flow between supercolonies. Intranidal mating and colony-budding are most likely the predominant, if not the exclusive mode of reproduction and dispersal strategy of A. gracilipes. Consequently, a positive feedback between genetic, chemical and behavioral traits may further enhance supercolony differentiation though genetic drift and neutral evolution. This potential scenario led to the hypothesis that absent gene flow between different A. gracilipes supercolonies may drive them towards different evolutionary pathways, possibly including speciation. Thus, I examined one potential way by which gene flow between supercolonies of an ant species without nuptial flights may be maintained, i.e. the immigration of sexuals into foreign supercolonies. The results suggest that this option of maintaining gene flow between different supercolonies is likely impaired by severe aggression of workers towards allocolonial sexuals. Moreover, breeding experiments involving males and queens from different supercolonies suggest that A. gracilipes supercolonies may already be on the verge of reproductive isolation, which might lead to the diversification of A. gracilipes into different species. Regarding the ecological consequences of its potential introduction to NE-Borneo, I could show that A. gracilipes supercolonies may affect the local ant fauna. The ant community within supercolonies was less diverse and differed in species composition from areas outside supercolonies. My data suggest that the ecological dominance of A. gracilipes within local ant communities was facilitated by monopolization of food sources within its supercolony territory, achieved by a combination of rapid recruitment, numerical dominance and pronounced interspecific aggression. A. gracilipes’ distribution is almost exclusively limited to anthropogenically altered habitat, such as residential and agricultural areas. The rate at which habitat conversion takes place in NE-Borneo will provide A. gracilipes with a rapidly increasing abundance of suitable habitats, thus potentially entailing significant population growth. An potentially increasing population size and ecological dominance, however, are not features that are limited to invasive alien species, but may also occur in native species that become ‘pests’ in an increasing abundance of anthropogenically altered habitat. Lastly, I detected several ant guests in supercolonies of A. gracilipes. I subsequently describe the relationship between one of them (the cricket Myrmecophilus pallidithorax) and its ant host. By conducting behavioral bioassays and analyses of cuticular hydrocarbon (CHC) profiles, I revealed that although M. pallidithorax is attacked and consumed by A. gracilipes whenever possible, it may evade aggression from its host by a combination of supreme agility and, possibly, chemical deception. This thesis adds to our general understanding of biological invasions by contributing species-specific data on a previously understudied invasive organism, the Yellow Crazy Ant Anoplolepis gracilipes. Introductions which may have occurred a long time ago may make it difficult to determine whether a given species is an introduced invader or a native pest species, as both may have pronounced ecological effects in native species communities. Furthermore, this thesis suggests that supercolonialism in invasive ants may not be an evolutionary dead end, but that it may possibly give rise to new species due to reproductive boundaries between supercolonies evoked by peculiar mating and dispersal strategies. N2 - Anoplolepis gracilipes ist eine in den Tropen weit verbreitete invasive Ameisenart, die in gestörten Habitaten Südostasiens und des indopazifischen Raumes häufig vorzufinden ist. Während detaillierte Informationen bezüglich ihres derzeitigen Verbreitungsgebietes vorliegen, ist ihre geographische Herkunft immer noch unbekannt. Weiterhin ist unklar, in welchem Maße die Sozialstruktur von A. gracilipes zu ihrer ökologischen Dominanz beiträgt und wie sich diese wiederum in einem potentiellen Herkunftsgebiet (Südostasien) darstellt. Mitochondriale DNA-Sequenzen legen nahe, dass die Mehrheit der im indopazifischen Raum vorkommenden Kolonien von südostasiatischen Populationen eingeführt wurde. Die südostasiatischen Kolonien entstammen möglicherweise einem bislang unbekannten Ursprungsgebiet. Verhaltenstests und genetische Analysen ergaben, dass Superkolonien von A. gracilipes aus sehr nah verwandten Individuen bestehen, womit sie monogynen, polydomen Kolonien anderer Ameisenarten ähneln. Ausserdem wiesen sowohl genetische Daten sowie Profile epikutikulärer Kohlenwasserstoffe auf eine erhebliche Differenzierung zwischen verschiedenen Superkolonien hin. Das Ausmaß der genetischen und chemischen Differenzierung deutet darauf hin, dass Genfluss zwischen Superkolonien stark reduziert oder sogar unterbrochen ist. Da die Paarung bei A. gracilipes wahrscheinlich nur im eigenen Nest stattfindet (Hochzeitsflüge wurden noch nicht beobachtet), könnte eine positive Rückkopplung zwischen Aggression, Verwandtschaftsgrad und epikutikulärer Chemie dazu führen, dass die Differenzierung zwischen Superkolonien durch eine Kombination aus genetischer Drift und neutraler Evolution weiter verstärkt wird. Superkolonien, die nicht durch Genfluss miteinander im Austausch stehen, könnten sich also konsequenterweise in unterschiedliche evolutive Richtungen entwickeln. Eine der Möglichkeiten, durch die Genfluss zwischen verschiedenen Superkolonien aufrecht erhalten werden könnte, wäre deshalb die Einwanderung reproduktiver Individuen in fremde Superkolonien. Meine Untersuchungen ergaben, dass die Migration von Männchen und Königinnen zwischen verschiedenen Superkolonien jedoch durch die Arbeiterinnen unterbunden wird, welche in erhöhtem Maße aggressiv gegenüber Geschlechtstieren anderer Superkolonien waren. Weiterhin deuteten Kreuzungsexperimente zwischen koloniefremden Männchen und Königinnen darauf hin, dass Superkolonien von A. gracilipes unter Umständen schon reproduktiv isoliert sind, welches konsequenterweise zur Diversifizierung von A. gracilipes in verschiedene Arten führen sollte. Bezüglich ihrer ökologischen Dominanz in Nordost-Borneo konnte gezeigt werden, dass A. gracilipes die lokale Ameisenfauna erheblich beeinflusst. Innerhalb der Superkolonien von A. gracilipes fanden sich sowohl weniger Ameisenarten als auch eine andere Artzusammensetzung als außerhalb. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die ökologische Dominanz von A. gracilipes maßgeblich auf der Monopolisierung von Nahrungsquellen beruht. Diese wird ermöglicht durch eine Kombination aus schneller Rekrutierung von Nestgenossinnen, zahlenmäßiger Überlegenheit und ausgeprägter interspezifischer Aggression. A. gracilipes kommt fast ausschließlich in anthropogen gestörten Habitaten wie Wohngebieten oder landwirtschaftlich genutzten Flächen vor. Die zunehmende Habitatkonversion in Nordost-Borneo führt zu einem enormen Anstieg der von A. gracilipes besiedelbaren Habitate, so dass mit einem signifikanten Populationswachstum von A. gracilipes zu rechnen sein wird. Ein schnelles Populationswachstum sowie ökologische Dominanz sind jedoch nicht allein auf invasive Arten geprägte Charakteristika, sondern können auch bei nativen Arten zu beobachten sein, welche durch zunehmende Verfügbarkeit anthropogen veränderten Habitats zu Schädlingen werden können. Abschließend wurden mehrere Arten potentieller Sozialparasiten in Nestern von A. gracilipes aufgefunden (mehrheitlich neue, unbeschriebene Arten), von denen die Grille Myrmecophilus pallidithorax eingehender untersucht wurde. Verhaltenstests und die Analyse kutikulärer Kohlenwasserstoffe zeigten, dass M. pallidithorax von ihrem Wirt angegriffen und sogar verzehrt wird. Jedoch kann sie den Aggressionen ihres Wirtes weitestgehend ausweichen dank schneller Fluchtreflexe sowie, möglicherweise, chemischer Tarnung. Die vorliegende Dissertation zeigt, dass lang zurückliegende Invasionen die Unterscheidung zwischen eingeführten oder nativen Schädlingen erschweren, da beide tiefgreifende ökologische Einflüsse auf native Artengemeinschaften haben können. Es wurde weiterhin deutlich, dass die außergewöhnliche Sozialstruktur von invasiven Ameisen wie A. gracilipes ihre ökologische Dominanz begründet. Die Bildung von Superkolonien bei invasiven Ameisen stellt zudem nicht eine evolutive Sackgasse dar, sondern kann im Gegenzug sogar zur Artbildung führen, begünstigt durch ungewöhnliche Paarungs- und Verbreitungsstrategien. KW - Demökologie KW - Ameisen KW - Invasive Art KW - Invasionsbiologie KW - Populationsstruktur KW - Anoplolepis gracilipes KW - Yellow Crazy Ant KW - Evolution KW - Fortpflanzung KW - Ameisengäste KW - Biological Invasions KW - Population structure KW - Anoplolepis gracilipes KW - Yellow Crazy Ant Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57332 ER - TY - THES A1 - Kropf, Jan T1 - The Dual Olfactory Pathway in the Honeybee Brain: Sensory Supply and Electrophysiological Properties T1 - Der duale olfaktorische Weg im Gehirn der Honigbiene: Sensorischer Eingang und elektrophysiologische Eigenschaften N2 - The olfactory sense is of utmost importance for honeybees, Apis mellifera. Honeybees use olfaction for communication within the hive, for the identification of nest mates and non-nest mates, the localization of food sources, and in case of drones (males), for the detection of the queen and mating. Honeybees, therefore, can serve as excellent model systems for an integrative analysis of an elaborated olfactory system. To efficiently filter odorants out of the air with their antennae, honeybees possess a multitude of sensilla that contain the olfactory sensory neurons (OSN). Three types of olfactory sensilla are known from honeybee worker antennae: Sensilla trichoidea, Sensilla basiconica and Sensilla placodea. In the sensilla, odorant receptors that are located in the dendritic arborizations of the OSNs transduce the odorant information into electrical information. Approximately 60.000 OSN axons project in two parallel bundles along the antenna into the brain. Before they enter the primary olfactory brain center, the antennal lobe (AL), they diverge into four distinct tracts (T1-T4). OSNs relay onto ~3.000-4.000 local interneurons (LN) and ~900 projection neurons (PN), the output neurons of the AL. The axons of the OSNs together with neurites from LNs and PNs form spheroidal neuropil units, the so-called glomeruli. OSN axons from the four AL input tracts (T1-T4) project into four glomerular clusters. LNs interconnect the AL glomeruli, whereas PNs relay the information to the next brain centers, the mushroom body (MB) - associated with sensory integration, learning and memory - and the lateral horn (LH). In honeybees, PNs project to the MBs and the LH via two separate tracts, the medial and the lateral antennal-lobe tract (m/lALT) which run in parallel in opposing directions. The mALT runs first to the MB and then to the LH, the lALT runs first to the LH and then to the MB. This dual olfactory pathway represents a feature unique to Hymenoptera. Interestingly, both tracts were shown to process information about similar sets of odorants by extracting different features. Individual mALT PNs are more odor specific than lALT PNs. On the other hand, lALT PNs have higher spontaneous and higher odor response action potential (AP) frequencies than mALT PNs. In the MBs, PNs form synapses with ~184.000 Kenyon cells (KC), which are the MB intrinsic neurons. KCs, in contrast to PNs, show almost no spontaneous activity and employ a spatially and temporally sparse code for odor coding. In manuscript I of my thesis, I investigated whether the differences in specificity of odor responses between m- and lALT are due to differences in the synaptic input. Therefore, I investigated the axonal projection patterns of OSNs housed in S. basiconica in honeybee workers and compared them with S. trichoidea and S. placodea using selective anterograde labeling with fluorescent tracers and confocal- microscopy analyses of axonal projections in AL glomeruli. Axons of S. basiconica-associated OSNs preferentially projected into the T3 input-tract cluster in the AL, whereas the two other types of sensilla did not show a preference for a specific glomerular cluster. T3- associated glomeruli had previously been shown to be innervated by mALT PNs. Interestingly, S. basiconica as well as a number of T3 glomeruli lack in drones. Therefore I set out to determine whether this was associated with the reduction of glomeruli innervated by mALT PNs. Retrograde tracing of mALT PNs in drones and counting of innervated glomeruli showed that the number of mALT-associated glomeruli was strongly reduced in drones compared to workers. The preferential projections of S. basiconica-associated OSNs into T3 glomeruli in female workers together with the reduction of mALT-associated glomeruli in drones support the presence of a female-specific olfactory subsystem that is partly innervated by OSNs from S. basiconica and is associated with mALT projection neurons. As mALT PNs were shown to be more odor specific, I suppose that already the OSNs in this subsystem are more odor specific than lALT associated OSNs. I conclude that this female-specific subsystem allows the worker honeybees to respond adequately to the enormous variety of odorants they experience during their lifetime. In manuscript II, I investigated the ion channel composition of mALT and lALT PNs and KCs in situ. This approach represents the first study dealing with the honeybee PN and KC ion channel composition under standard conditions in an intact brain preparation. With these recordings I set out to investigate the potential impact of intrinsic neuronal properties on the differences between m- and lALT PNs and on the sparse odor coding properties of KCs. In PNs, I identified a set of Na+ currents and diverse K+ currents depending on voltage and Na+ or Ca2+ that support relatively high spontaneous and odor response AP frequencies. This set of currents did not significantly differ between mALT and lALT PNs, but targets for potential modulation of currents leading to differences in AP frequencies were found between both types of PNs. In contrast to PNs, KCs have very prominent K+ currents, which are likely to contribute to the sparse response fashion observed in KCs. Furthermore, Ca2+ dependent K+ currents were found, which may be of importance for coincidence detection, learning and memory formation. Finally, I conclude that the differences in odor specificity between m- and lALT PNs are due to their synaptic input from different sets of OSNs and potential processing by LNs. The differences in spontaneous activity between the two tracts may be caused by different neuronal modulation or, in addition, also by interaction with LNs. The temporally sparse representation of odors in KCs is very likely based on the intrinsic KC properties, whereas general excitability and spatial sparseness are likely to be regulated through GABAergic feedback neurons. N2 - Der Geruchssinn ist für die Honigbiene, Apis mellifera, von größter Bedeutung. Honigbienen kommunizieren olfaktorisch, sie können Nestgenossinnen und koloniefremde Honigbienen aufgrund des Geruchs unterscheiden, sie suchen und erkennen Nahrungsquellen olfaktorisch, und Drohnen (männliche Honigbienen) finden die Königin mit Hilfe des Geruchssinns. Deshalb dient die Honigbiene als exzellentes Modell für die Untersuchung hochentwickelter olfaktorischer Systeme. Honigbienen filtern Duftmoleküle mit ihren Antennen aus der Luft. Auf diesen Antennen sitzen Sensillen, die die olfaktorischen sensorischen Neurone (OSN) beinhalten. Drei verschiedene olfaktorische Sensillen existieren bei Arbeiterinnen: Sensilla trichoidea, Sensilla basiconica und Sensilla placodea. In diesen Sensillen sind olfaktorische Rezeptorproteine auf den Dendriten der OSN lokalisiert. Diese Duftrezeptoren wandeln die Duftinformationen in elektrische Informationen um. Die Axone von ca. 60.000 OSN ziehen in zwei Bündeln entlang der Antenne in das Gehirn. Bevor sie das erste olfaktorische Gehirnzentrum, den Antennallobus (AL), erreichen, spalten sie sich in vier distinkte Trakte (T1-T4) auf. Im AL verschalten sie auf 3.000-4.000 lokale Interneurone (LN) und auf etwa 900 Ausgangsneurone des AL, die Projektionsneurone (PN). Die axonalen Endigungen der OSN bilden mit Neuriten der PN und LN kugelförmige Strukturen, die so genannten Glomeruli. Die OSN aus den vier Trakten T1-T4 ziehen in vier zugehörige glomeruläre Cluster. LN verschalten die Information unter den AL Glomeruli, PN leiten olfaktorische Informationen zu den nächsten Gehirnstrukturen, den Pilzkörpern und dem lateralen Horn, weiter. Die Pilzkörper werden als Zentrum für sensorische Integration, Lernen und Gedächtnis gesehen. Die PN, die den AL mit dem Pilzkörper und dem lateralen Horn verbinden, verlaufen in Honigbienen parallel über zwei Bahnen, den medialen und den lateralen Antennallobustrakt (mALT/lALT), aber in entgegengesetzter Richtung. Dieser duale olfaktorische Signalweg wurde in dieser Ausprägung bisher nur in Hymenopteren gefunden. Interessanterweise prozessieren beide Trakte Informationen über die gleichen Düfte. Dabei sind mALT PN duftspezifischer und lALT PN haben höhere spontane Aktionspotentialfrequenzen sowie höhere Aktionspotentialfrequenzen in Antwort auf einen Duftreiz. Im Pilzkörper verschalten PN auf Kenyon Zellen (KC), die intrinsischen Neurone des Pilzkörpers. KC sind im Gegensatz zu PN fast nicht spontan aktiv und kodieren Informationen auf räumlicher und zeitlicher Ebene mit geringer Aktivität. Man spricht von einem so genannten "sparse code". Im ersten Manuskript meiner Doktorarbeit habe ich untersucht, ob die Unterschiede in der Spezifität der Duftantworten zwischen mALT und lALT PN zumindest zum Teil auf Unterschieden im sensorischen Eingang beruhen. Ich habe die axonalen Projektionen der OSN der S. basiconica in Honigbienen untersucht und mit den Projektionen von OSN in S. trichoidea und S. placodea verglichen. Dazu wurden die OSN in den S. basiconica anterograd mit Fluoreszenzmarkern gefärbt und mit mittels konfokaler Mikroskopie untersucht und quantifiziert. Die Axone von OSN aus S. basiconica ziehen präferentiell in das T3 Glomerulus Cluster, die Axone der anderen beiden Sensillentypen zeigen keine Präferenz für ein spezielles Cluster. Es wurde bereits gezeigt, dass die Glomeruli des T3 Clusters von mALT PN innerviert werden. Interessanterweise fehlen S. basiconica und Teile der T3 Glomeruli in Drohnen. Deshalb habe ich untersucht, ob die T3 Reduzierung in Drohnen mit einer Reduzierung der mALT Glomeruli einhergeht. Retrograde Färbungen der mALT PN in Drohnen zeigten, daß die Zahl der mALT Glomeruli in Drohnen gegenüber Arbeiterinnen deutlich reduziert ist. Die Präferenz der OSN der S. basiconica für das T3 Cluster und die reduzierte Anzahl von mALT Glomeruli in Drohnen weisen auf ein arbeiterinnenspezifisches olfaktorisches Subsystem hin, welches aus S. basiconica, T3 Glomeruli und einer Gruppe von mALT PN besteht. Da die mALT PN duftspezifischer als lALT PN sind, vermute ich, dass auch die OSN, die auf mALT PN verschalten, duftspezifischer antworten als OSN die auf lALT PN verschalten. Daraus schließe ich, daß dieses Subsystem den Arbeiterinnen ermöglicht, passend auf die enorme Breite an Duftstoffen zu reagieren, die diese im Laufe ihres arbeitsteiligen Lebens wahrnehmen müssen. Im zweiten Manuskript meiner Doktorarbeit habe ich die Ionenkanalzusammensetzung der mALT PN, der lALT PN und der KC in situ untersucht. Mein Ansatz stellt die erste Studie dar, die die Ionenkanäle von Neuronen in der Honigbiene unter Standardbedingungen an einer intakten Gehirnpräparation untersucht. Mit diesen Messungen versuche ich die potentiellen bioelektrischen Grundlagen für Unterschiede in der Informationskodierung in mALT PN, lALT PN und Kenyon Zellen zu ergründen. In PN konnte ich eine Gruppe von Na+ Ionenkanälen und Na+ abhängigen, Ca2+ abhängigen sowie spannungsabhängigen K+ Ionenkanälen identifizieren, die die Grundlagen für hohe, spontane Aktionspotentialfrequenzen und hohe Duftantwortfrequenzen schaffen. Diese Ströme unterschieden sich nicht grundsätzlich zwischen m- und lALT PN. Jedoch wurden potentielle Ziele für neuronale Modulation gefunden, welche zu unterschiedlichen Aktionspotentialfrequenzen zwischen PN der beiden Trakte führen könnten. Im Gegensatz zu den PN wurden in Kenyon Zellen in der Relation sehr starke K+ Ionenströme gemessen. Diese dienen sehr wahrscheinlich der schnellen Terminierung von Duftantworten, also dem Erzeugen des zeitlichen "sparse code". Außerdem wurden Ca2+ abhängige K+ Kanäle gefunden, die für Koinzidenzdetektion, Lernen und Gedächtnis von Bedeutung sein können. In der Gesamtsicht folgere ich aus meinen Ergebnissen, dass die Unterschiede in der Duftspezifizität zwischen m- und lALT PN überwiegend auf deren sensorischen Eingängen von unterschiedlichen Populationen von OSN und der Verarbeitung über lokale Interneuronen im AL beruht. Die Unterschiede in der Spontanaktivität zwischen mALT und lALT basieren sehr wahrscheinlich auf neuronaler Modulation und/oder Interaktion mit LN. Die zeitliche Komponente des "sparse code" in KC entsteht höchstwahrscheinlich durch die intrinsischen elektrischen Eigenschaften der KC, wohingegen die generelle Erregbarkeit und der räumliche "sparse code" mit großer Wahrscheinlichkeit auf der Regulation durch GABAerge Neurone beruht. KW - Voltage-Clamp-Methode KW - Biene KW - Neuroanatomie KW - Neurobiology KW - Olfaction KW - Geruchssinn Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108369 ER - TY - THES A1 - Hsieh, Samuel Yu-Lung T1 - The diversity and ecology of the spider communities of European beech canopy T1 - Diversität und Ökologie der Spinnengemeinschaften in den Buchenkronen N2 - Ein wesentliches Ziel ökologischer Forschung ist es, die Frage zu beantworten, wie Arten koexistieren können und die biologische Vielfalt erhalten bleibt. Um zu verstehen, wie dabei Gemeinschaften in unterschiedlichen räumlich-zeitlichen Dimensionen interagieren, um die biologische Vielfalt zu erhalten, ist ein umfassendes prozessorientiertes Wissen erforderlich. Demzufolge konzentrierte sich meine Studie im Wesentlichen auf die Biodiversität und die sie beeinflussenden raum-zeitlichen ökologischen Prozesse. Vergleicht man die Ähnlich- bzw. Unähnlichkeit der in verschieden alten Beständen lebenden Spinnengemeinschaften der Buchen (Fagus sylvatica L.), dann zeigt sich, dass die älteste Baumkohorte offensichtlich einzigartige Ressourcen besitzt, welche die Zusammensetzung der Spinnengemeinschaften deutlich prägen. Über das Jahr hin zeigten die Spinnengemeinschaften trotz der jahreszeitlich unterschiedlich ökologischen Randbedingungen eine sich wiederholende, vorhersehbare Dynamik. Der Vergleich über die Jahre ergab, dass das "Neutrale Modell" und das "Nischen-Modell" gleichzeitig funktionieren können. Beide sind notwendig, um die Dynamik der in den Buchenkronen der verschiedenen Altersklassen lebenden Spinnengemeinschaften vollständig erklären zu können. N2 - A major goal of the main topics of ecology is to answer the question of how species can co-exist and maintain biodiversity. To understand how community dynamics operate in different spatio-temporal dimensions to govern biodiversity patterns requires a process-based knowledge. Thus, this study focused primarily on biodiversity patterns and ecological processes at both spatial and temporal scales. Spatially, the diversity and similarity of spider communities in high, intermediate, and low strata of beech trees represented a set of age-related effects: Old-growth trees provided unique and distinct resources to spiders and in turn possessed discrete spider compositions. Intra-annually, spider communities in different seasons showed a repeated, predictable temporal dynamics. Inter-annually, comparison revealed that neutral and niche models can operate in tandem, and that both are needed to fully explain the dynamics of arboreal spider assemblages among different canopy strata in this beech forest. KW - Spinnen KW - Biodiversität KW - Rotbuche KW - Araneae KW - biodiversity KW - ecological process KW - European beech KW - Würzburg University Forest KW - Ökologische Prozesse KW - Universitätsforst Würzburg Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66966 ER -