TY - THES A1 - Kaltdorf, Martin Ernst T1 - Analyse von regulatorischen Netzwerken bei Zelldifferenzierung und in der Infektionsbiologie T1 - Analysis of Regulatory Networks during Cell Differentiation and in Infection Biology N2 - Das zentrale Paradigma der Systembiologie zielt auf ein möglichst umfassendes Ver-ständnis der komplexen Zusammenhänge biologischer Systeme. Die in dieser Arbeit angewandten Methoden folgen diesem Grundsatz. Am Beispiel von drei auf Basis von Datenbanken und aktueller Literatur rekonstruier-ten Netzwerkmodellen konnte in der hier vorliegenden Arbeit die Gültigkeit analyti-scher und prädiktiver Algorithmen nachgewiesen werden, die in Form der Analy-sesoftware Jimena angewandt wurden. Die daraus resultierenden Ergebnisse sowohl für die Berechnung von stabilen Systemzuständen, der dynamischen Simulation, als auch der Identifikation zentraler Kontrollknoten konnten experimentell validiert wer-den. Die Ergebnisse wurden in einem iterativen Prozess verwendet werden um das entsprechende Netzwerkmodell zu optimieren. Beim Vergleich des Verhaltens des semiquantitativ ausgewerteten regulatorischen Netzwerks zur Kontrolle der Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in Chondrozyten (Knorpelbildung), Osteoblasten (Knochenbildung) und Adipozyten (Fett-zellbildung) konnten 12 wichtige Faktoren (darunter: RUNX2, OSX/SP7, SOX9, TP53) mit Hilfe der Berechnung der Bedeutung (Kontrollzentralität der Netzwerkknoten identifi-ziert werden). Der Abgleich des simulierten Verhaltens dieses Netzwerkes ergab eine Übereinstimmung mit experimentellen Daten von 47,2%, bei einem widersprüchlichen Verhalten von ca. 25%, dass unter anderem durch die temporäre Natur experimentel-ler Messungen im Vergleich zu den terminalen Bedingungen des Berechnung der stabilen Systemzustände erklärt werden kann. Bei der Analyse des Netzwerkmodells der menschlichen Immunantwort auf eine Infek-tion durch A. fumigatus konnten vier Hauptregulatoren identifiziert werden (A. fumi-gatus, Blutplättchen, hier Platelets genannt, und TNF), die im Zusammenspiel mit wei-teren Faktoren mit hohen Zentralitätswerten (CCL5, IL1, IL6, Dectin-1, TLR2 und TLR4) fähig sind das gesamte Netzwerkverhalten zu beeinflussen. Es konnte gezeigt werden, dass sich das Aktivitätsverhalten von IL6 in Reaktion auf A. fumigatus und die regulato-rische Wirkung von Blutplättchen mit den entsprechenden experimentellen Resultaten deckt. Die Simulation, sowie die Berechnung der stabilen Systemzustände der Immunantwort von A. thaliana auf eine Infektion durch Pseudomonas syringae konnte zeigen, dass die in silico Ergebnisse mit den experimentellen Ergebnissen übereinstimmen. Zusätzlich konnten mit Hilfe der Analyse der Zentralitätswerte des Netzwerkmodells fünf Master-regulatoren identifiziert werden: TGA Transkriptionsfaktor, Jasmonsäure, Ent-Kaurenoate-Oxidase, Ent-kaurene-Synthase und Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase. Während die ersteren beiden bereits lange als wichtige Regulatoren für die Gib-berellin-Synthese bekannt sind, ist die immunregulatorische Funktion von Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase bisher weitgehend unbekannt. N2 - The central paradigm of systems biology aims at a comprehensive understanding in complex relationships of biological systems. The methods used in this work support this aim. By the example of three network models reconstructed on the basis of databases and current literature, the validity of analytical and predictive algorithms could be demon-strated in this work. As simulation software the framework Jimena was applied. The results for the calculation of stable system states, the dynamic simulation as well as the identification of central control nodes could be validated experimentally. The re-sults were used in an iterative process to further optimize the corresponding network model. Comparing the behavior of the semi-quantitatively evaluated regulatory network to control the differentiation of human mesenchymal stem cells into chondrocytes (carti-lage formation), osteoblasts (bone formation) and adipocytes (fatty cell formation), 12 important factors (including: RUNX2, OSX/SP7, SOX9, TP53) could be identified by the calculation of the control centralities of the network nodes. The comparison of the simulated behavior of these nodes showed an agreement with experimental data of 47.2%. We found a contradictory behavior of approximately 25%. Differing results can be explained due to the temporary nature of experimental measurements compared to the terminal conditions of the calculation the stable system states. Analyzing the network model of the human immune response to A. fumigatus infec-tion, four major regulators could be identified (A. fumigatus, platelets, and TNF), which interact with other factors with high control centrality values (CCL5, IL1, IL6, Dectin1). TLR2 and TLR4) are capable of affecting the overall network behavior. It could be shown that the activity behavior of IL6 in response to the modular activity of the plate-lets as well as A. fumigatus coincides with the corresponding experimental results. The simulation, as well as the calculation of the stable system states of the immune response of A. thaliana to an infection by Pseudomonas syringae, showed that in silico results are in agreement with the experimental results. By analyzing the control cen-trality values of the network model, five main regulators could be: TGA transcription factor, jasmonic acid, ent-kaurene-Oxidase, ent-kaurene synthase and aspartate semi-aldehyde. While the former two have long been recognized as important regulators of gibberel-lin synthesis, the immunoregulatory function of aspartate semialdehyde dehydrogen-ase has been largely unknown. KW - Netzwerksimulation KW - Immunbiologie KW - Zelldifferenzierung KW - Systembiologie KW - Signaltransduktion KW - Mesenchymale Stammzelldifferenzierung KW - Netzwerkrekonstruktion KW - network simulation KW - network reconstruction KW - immunology KW - mesenchymal stem cell differentiation KW - signal transduction Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-198526 ER - TY - THES A1 - Seibold, Marcel T1 - Funktionelle Charakterisierung des Ras family small GTP binding protein RAL im Multiplen Myelom T1 - Functional characterization of the Ras family small GTP binding protein RAL in multiple myeloma N2 - Die monoklonale Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark ist charakteristisch für das multiple Myelom (MM) und kann bei Erkrankten zu Störungen in der Hämatopoese sowie zu Knochenläsionen und Niereninsuffizienz führen. Die Weiterentwicklung und der Einsatz neuer Therapieoptionen konnten das Überleben von MM-Patienten zwar erheblich verbessern, jedoch gilt diese Krankheit weiterhin als unheilbar. Onkogene Mutationen und das Knochenmarkmikromilieu führen in MM-Zellen zur Entstehung eines onkogenen Signalnetzwerks, das das Wachstum und Überleben der Zellen aufrechterhält. Mutationen der GTPase RAS treten bei bis zu 50 % der MM-Patienten auf und tragen zum Überleben von MM-Zellen bei. Trotz der Häufigkeit und Bedeutsamkeit von onkogenem RAS, auch in anderen Tumorentitäten, ist die GTPase nach wie vor therapeutisch nicht angreifbar. Die GTPase RAL aus der Familie der RAS-GTPasen wird als Downstream-Effektor von RAS angesehen, der damit ebenfalls zur Aufrechterhaltung des Tumorzellüberlebens beitragen könnte. In einigen Tumorentitäten konnte bisher gezeigt werden, dass eine Überexpression von RAL in den Tumorzellen vorliegt und die Proliferation und Apoptose von Tumorzellen durch RAL beeinflusst wird. Daher stellte sich die Frage, ob RAL im MM ebenfalls das Überleben von Tumorzellen beeinflusst und ob eine direkte Verbindung zwischen onkogenem RAS und RAL besteht. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle von RAL sowie dessen Zusammenhang mit onkogenem RAS im MM untersucht. Hierbei konnte eine Überexpression von RAL in MM-Zellen im Vergleich zu MGUS oder normalen Plasmazellen beobachtet werden. In Knockdown-Analysen wurde gezeigt, dass RAL überlebensnotwendig für MM-Zellen ist. Dabei wurde in Western Blot-Analysen festgestellt, dass diese Überlebenseffekte unabhängig von MAPK/ERK-Signaling vermittelt werden. Es konnte teilweise jedoch eine Abhängigkeit von der AKT-Aktivität beobachtet werden. Da RAL-Knockdown Einfluss auf das Überleben von MM-Zellen hat, wurde eine pharmakologische Inhibition von RAL durch den Inhibitor RBC8 untersucht. RBC8 zeigte in höheren Dosen nur bei einem Teil der MM-Zelllinien eine Wirkung auf das Zellüberleben sowie auf die RAL-Aktivierung. Die Weiterentwicklung potenter RAL-Inhibitoren ist daher für eine klinische Translation einer RAL-Inhibition von großer Bedeutung. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen onkogenem RAS und der RAL-Aktivierung wurden RAL-Pulldown-Analysen nach Knockdown von onkogenem RAS durchgeführt. In diesen Experimenten wurde keine Abhängigkeit der RAL-Aktivierung von onkogenem RAS festgestellt. Darüber hinaus zeigten Genexpressionsanalysen nach RAS- bzw. RAL-Knockdown unterschiedliche Genexpressionsprofile. In Massenspektrometrie-Analysen wurden mögliche Effektoren, die mit RAL an der Beeinflussung des Zellüberlebens beteiligt sein könnten, untersucht. Hierbei wurden die Komponenten des Exozyst-Komplexes EXO84 und SEC5 als Interaktionspartner von RAL identifiziert. Nachdem gezeigt wurde, dass RAL ausschlaggebend für das Überleben von MM-Zellen ist, wurde eine Kombination von RAL-Knockdown mit klinisch relevanten Wirkstoffen analysiert. Diese zeigte bei der Kombination mit PI3K oder AKT-Inhibitoren verstärkte Effekte auf das Zellüberleben der MM-Zellen. Zusammenfassend wurde die Bedeutung von RAL für das Überleben von Tumorzellen im MM gezeigt und RAL als potentielles therapeutisches Target im MM beschrieben, welches unabhängig von onkogenem RAS reguliert wird. N2 - Multiple myeloma (MM) is a hematologic neoplasia which is characterized by monoclonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow leading to hematopoetic failure, bone lesions and renal failure. Although continuous development of existing therapeutics and new therapeutic options vastly improved MM patient survival, MM still remains an incurable disease. Oncogenic mutations and the bone marrow microenvironment contribute to a signaling network which sustains MM cell proliferation and survival. Within this network mutations of the RAS oncogene account for up to 50 % of MM patients. Despite its prevalence and importance not only in MM, RAS still remains undruggable. The GTPase-family Member RAL is considered as a RAS effector which might also influence maintainance of tumor cell survival. In several tumor entities RAL is overexpressed in tumor cells and influences proliferation and apoptosis. Therefore, in MM RAL might also be controlled by oncogenic RAS and mediate cell survival of tumor cells. In this work, RAL’s functional role as well as the potential interconnection with oncogenic RAS was investigated. In MM cells RAL is ovexpressed compared to non-malignant MGUS or plasma cells. Knockdown analyses showed that RAL is essential for MM cell survival. These survival effects are transferred independently of MAPK/ERK signaling as shown by Western Blot analysis. However, to some extent RAL influenced MM cell survival dependently of AKT activity. Because RAL knockdown had a significant effect on MM cell survival a pharmacological inhibition was tested using the inhibitor RBC8. In a portion of MM cell lines RBC8 exerts effects on cell survival. But the effects of RBC8 on RAL activation were only visible at higher concentrations as shown by pulldown assays. Thus, subsequent development of potent RAL inhibitors is of major importance for clinical translation. To investigate whether RAL is directly activated by oncogenic RAS, RAL pulldown assays were performed after knockdown of oncogenic RAS. Strikingly, there was no direct connection between the presence of oncogenic RAS and RAL activation. Furthermore, gene expression profiles after RAS or RAL knockdown showed differing expression signatures. Potential effectors of RAL which might also influence MM cell survival were investigated in mass spectrometric analyses where the exocyst complex components EXO84 and SEC5 were identified as RAL interaction partners. Since RAL is of importance for MM cell survival, RAL knockdown was combined with clinically relevant agents. There was an enhanced induction of apoptosis upon combination of PI3K or AKT inhibitors with RAL knockdown. Taken together, the influence of RAL as a crucial mediator of MM cell survival was shown in this work. Therefore, RAL represents a potential therapeutic target which is regulated independently of oncogenic RAS. KW - Kleine GTP-bindende Proteine KW - Signaltransduktion KW - Plasmozytom KW - RAL KW - Multiples Myelom KW - Zellüberleben KW - Knochenmark Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208003 ER - TY - THES A1 - Ok [geb. Hofmann], Claudia Barbara T1 - Isoform-spezifische Analyse der PI3-Kinase (Klasse I) im Multiplen Myelom T1 - Isoform-specific analysis of the PI3-kinase (class I) in multiple myeloma N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist eine unheilbare Erkrankung, die aus einer klonalen Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark hervorgeht. Dabei liegt ein komplexes Signalnetzwerk vor, das zum Überleben und Wachstum der MM-Zellen führt. Das MM ist durch eine enorme genetische und phänotypische Heterogenität gekennzeichnet. Die konstitutive Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs spielt bei ungefähr der Hälfte der Patienten mit MM eine wichtige Rolle für das Überleben der MM-Zellen und ist daher ein potentieller therapeutischer Ansatzpunkt. Isoform-spezifische Untersuchungen der katalytischen Untereinheiten der Klasse I-PI3K (p110α, p110β, p110γ, p110δ) sollten zur Erkenntnis führen, welche dieser Isoformen für das MM Zellüberleben wichtig sind, um spezifischere Behandlungen mit möglichst geringen Nebenwirkungen zu erlauben. Dafür wurden zunächst Isoform-spezifische Knockdown-Experimente mit MM Zelllinien durchgeführt und sowohl deren Überleben als auch die Aktivierung der nachgeschalteten Komponenten im PI3K Signalweg untersucht. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden sowohl MM Zelllinien als auch Primärzellen mit Isoform-spezifischen PI3K-Inhibitoren behandelt (BYL 719 für p110α, TGX 221 für p110β, CAY10505 für p110γ und CAL 101 für p110δ) und in gleicher Weise untersucht. In beiden Versuchsansätzen stellte sich die katalytische Untereinheit p110α als wichtigste Isoform für das Überleben von MM Zellen mit konstitutiv phosphoryliertem Akt Signal heraus. Weder der Knockdown noch die pharmakologische Inhibition der anderen drei Isoformen (p110β, p110γ, p110δ) führten in MM-Zelllinien zur Beeinträchtigung des Zellüberlebens. Auch reagierten die Primärzellen von MM Patienten größtenteils nicht mit Apoptose auf eine Behandlung mit TGX 221, CAY10505 oder CAL 101. Aufbauend auf der postulierten Bedeutung von p110α, wurde der dafür spezifische Inhibitor BYL 719 mit bereits klinisch etablierten Therapeutika in Kombination verwendet, woraus eine im Vergleich zur Einzelbehandlung verstärkte Apoptose resultierte. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass PI3K/p110α eine therapeutisch nutzbare Zielstruktur zur Behandlung des Multiplen Myeloms darstellt. Daher scheinen weitergehende prä-klinische Studien mit p110α Inhibitoren erfolgversprechend. N2 - Multiple myeloma (MM) is an incurable disease, which results from clonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow. Thereby, a complex signaling network regulates the survival and growth of MM cells. This malignant hematological disease is characterized by profound genetic and phenotypical heterogeneity. The PI3K/Akt signaling pathway is constitutively activated in about 50% of patients with MM and therefore plays an important role for the survival of MM cells. Accordingly, treatment of MM patients with the most isoform-specific drugs may be a desirable goal to achieve therapeutic utility with a minimum of undesired side effects. Therefore, an isoform-specific analysis of the catalytic subunits of the PI3K class I (p110α, p110β, p110γ, p110δ) was undertaken to reveal their individual role(s) for MM cell survival. Initially, isoform-specific knockdown experiments in MM cell lines were performed to assess their survival and the activation states of down-stream components of the PI3K pathway. These experiments were then complemented using isoform-specific pharmacological inhibitors (BYL 719 for p110α, TGX 221 for p110β, CAY10505 for p110γ and CAL 101 for p110δ) in MM cells and primary MM cells. Cell lines with constitutively phosphorylated Akt reduced this signal after p110α knockdown or pharmacologic inhibition and these treatments also affected their survival. Conversely, neither knockdown nor drug-mediated inhibition of any of the other three p110 isoforms influenced MM cell survival. In addition, whereas most primary MM samples were sensitive against BYL-719 only a few samples displayed apoptotic effects when treated with TGX 221, CAY10505 or CAL-101. These results showed that p110α is the major contributor of PI3K-mediated cell survival, and therefore the inhibitor BYL 719 was tested in combination with clinically relevant therapeutics for MM. Such treatment led to increased rates of apoptosis in MM cell lines in comparison to the respective single drug treatments. Taken together, we assume that PI3K/p110α is a therapeutically valuable target structure for the treatment of MM that would warrant more extensive pre-clinical studies. KW - Phosphatidylinositolkinase KW - Isomer KW - Signaltransduktion KW - Plasmozytom KW - p110alpha KW - BYL-719 KW - Carfilzomib KW - Melphalan KW - Lenalidomid KW - Pomalidomid KW - Bortezomib KW - synergistische Effekte KW - Phospho-Akt KW - Zellüberleben KW - pi3kinase KW - Multiples Myelom KW - Knochenmark KW - Isoform Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108466 ER - TY - THES A1 - Mischnik, Marcel T1 - Systembiologische Analyse der ADP- und Prostaglandin-vermittelten Signaltransduktion humaner Thrombozyten T1 - Systems biological analysis of ADP and prostaglandin mediated signal transduction in human thrombocytes N2 - Thrombozyten (Blutplättchen) sind die Vermittler der zellulären Hämostase. Ihre Fähigkeit zu Aggregieren und sich an das umgebende Gewebe verletzter Blutgefässe anzulagern, wird durch ein komplexes intrazelluläres Signaltransduktionsnetzwerk bestimmt, das sowohl aktivierende, als auch inhibierende Subnetzwerke beinhaltet. Das Verständnis dieser Prozesse ist von hoher medizinischer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die thrombozytäre Signaltransduktion sowohl mittels eines Boole'schen, als auch verschiedener dynamischer Modelle analysiert. Die Boole'sche Modellierung führte zu interessanten Erkenntnissen über das Zusammenwirken einzelner Subnetzwerke bei der Vermittlung irreversibler Plättchenaktivierung und zeigte Mechanismen der Interaktion mit dem hemmenden Prostaglandinsystem auf. Das Modell beinhaltet unter Anderem wichtige Systemkomponenten wie Calciumsignalgebung, Aktivierung von Schlüsselkinasen wie Src und PKC, Integrin-vermitteltes outside-in sowie inside-out Signalgebung und autokrine ADP- und Thromboxan-Produktion. Unter Verwendung dieses Boole'schen Ansatzes wurde weiterhin das System-eigene Schwellenwertverhalten analysiert. Dabei stellte sich eine umgekehrt proportionale Abhängigkeit des relativen aktivierenden Reizes, der notwendig ist um den Schwellenwert zu überschreiten, vom absoluten hemmenden Input heraus. Das System adaptiert demnach an höhere Prostaglandinkonzentrationen durch eine Erhöhung der Sensitivität für Aktivatoren wie dem van-Willebrandt-Faktor und Kollagen, und ermöglicht somit auch unter lokal hemmenden Bedingungen eine Plättchen-vermittelte Hämostase. Der nächste Schritt bestand in der Implementierung eines Differentialgleichungs-basierten Modells der thrombozytären Prostaglandin-Signaltransduktion, um einen detaillierten Überblick über die Dynamik des inhibierenden Netzwerkteils zu erhalten. Die kinetischen Parameter dieses Modells wurden teilweise der Literatur entnommen. Der andere Teil wurde anhand einer umfassenden Kombination dosis- und zeitabhängiger cAMP und phospho-VASP Messdaten geschätzt. Der Prozess beinhaltete mehrere Iterationen aus Modellvorhersagen einerseits und experimentellem Design andererseits. Das Modell liefert die quantitativen Effekte der Prostaglandinrezeptoren IP, DP1, EP3 und EP4 und des ADP-Rezeptors P2Y12 auf die zugrunde liegende Signalkaskade. EP4 zeigt den stärksten Effekt in der aktivierenden Fraktion, wohingegen EP3 einen stärkeren inhibitorischen Effekt ausübt, als der durch Clopidogrel hemmbare ADP-Rezeptor P2Y12. Weiterhin wurden die Eigenschaften des negativen feedback-loops der PKA auf den cAMP-Spiegel untersucht, und eine direkte Beeinflussung der Adenylatzyklase durch die PKA festgestellt, in Form einer Reduzierung der maximalen katalytischen Geschwindigkeit. Die Identifizierbarkeit der geschätzten Parameter wurde mittels profile-Likelihood-Schätzung untersucht. In einem dritten Schritt wurde ein sowohl die aktivierenden, als auch die hemmenden Netzwerkteile umfassendes dynamisches Modell implementiert. Die Topologie dieses Modells wurde in Anlehnung an die des Boole'schen Modells auf der Basis von a priori Wissen festgelegt. Die Modellparameter wurden anhand von Western-Blot, Calcium- und Aggregationsmessungen geschätzt. Auch hier wurde die Identifizierbarkeit der Modellparameter durch profile-likelihood-Schätzung überprüft. Die bei niedrigen Ligandenkonzentrationen auftretende Reversibilität der Plättchen-Aggregation konnte mittels dieses Modells reproduziert werden. Jedoch zeigte sich bei mittleren ADP-Konzentrationen ein Fließgleichgewicht in einem teilweise aktivierten Zustand, und damit kein bistabiles Schwellenwertverhalten. Inwiefern dieses Verhalten durch einen Umgebungs-basierteren Mechanismus des Alles-Oder-Nichts-Verhaltens begründet wird, bei dem der Übergang von reversibler zu irreversibler Aggregation mehr durch parakrine Effekte des gesammten Thrombus bestimmt wird, als durch spezifische Signaltransduktionseigenschaften der einzelnen Zelle, müssen zukünftige Experimente zeigen. Insgesamt geben die erstellten Modelle interessante Einblicke in die Funktionsweise der Thrombozyten und ermöglichen die Simulation von pharmakologischen und genetischen Einflüssen, wie Rezeptormodulationen und knock-outs. Sie geben damit Implikationen zur Entstehung und Behandlung pathophysiologischer Zustände, und wertvolle Denkanstöße für die weitere Forschung. N2 - Platelets represent the key-players in mammalian wound-healing. Their ability to aggregate and attach to the surrounding tissue of damaged blood vessels is thereby mediated by a complex signal -transduction network that comprises both activatory and inhibitory components. Due to its medical relevance and the lack of profound understanding, the network constitutes a convenient target for modeling. In a first step, a Boolean implementation of platelet signal transduction, comprising both activating and inhibiting networks components was established. This led to important information, on how the function of different subnetworks coalesce to fully activate the platelet and to promote irreversible aggregation. These include calcium signalling, activation of key-kinases like Akt, Src and PKC, Integrin outside-in as well as inside-out signalling and autocrin ADP and thromboxane production. In addition, using this data-free approach, the systems inherent threshold behaviour was analysed. The model revealed, that the relative activating strength, that transgresses the threshold, decreases with elevating PGI inputs and is also dependent on auto- and parakrin effects. Thus, the system adapts for higher prostaglandin-concentrations by increasing its sensitivity for activators like vWF and collagen, and thereby commits thrombocyte-dependent active processes such as wound healing even if subsequently blood prostaglandin-levels are higher in later time points. Secondly, an ordinary-differential-equation based model of platelet prostaglandin signalling was established, to get a detailed view of the dynamics governing the inhibiting network part. The kinetic parameters of the model were partly taken from literature and in part estimated along a comprehensive combination of time-course and dose-response measurements of cAMP and phosphorylated VASP. The process involved an iterative cycle between model predictions and experimental design. The model delivered the quantitative effects of the prostaglandin receptors IP, DP1, EP3, EP4 and the ADP receptor P2Y12 on the underlying signalling cascade. EP4 showed the strongest effect in the activating fraction, whereas EP3 turned out to exert a greater inhibiting impact than the commonly established pharmacological target P2Y12. Furthermore, the nature of the double-negative feedback loop constituted by PKA was examined, which disclosed a direct influence of PKA on adenylate cyclase, reducing its maximum catalytic speed. The identifiablility of all kinetic parameters was analysed via profile likelihood estimation. Finally, a dynamical model comprising both activating ADP-signalling through P2Y1 and P2Y12 receptors, and the inhibiting prostaglandin-pathway was implemented. The topology of this larger model was established on the basis of a priori knowledge. Model parameters were fitted along time-resolved Western-Blot, calcium and aggregation measurements. The identifiability of the model parameters was again check by means of profile likelihood estimation. Reversibility of platelet activation at low ADP concentrations could be reproduced by this model. However, at medium concentrations the system appears to assume a steady-state in a partly activated condition, thus not providing for a bistable threshold behaviour. If this behaviour is based on a more enviroment-based character of the observed point-of-no-return behaviour, in which the transition from reversible to irreversible aggregation is rather due to parakrin effects evoked by the entire cell array, than due to specific network properties present in the single cell, has to be investigated by further experiments. All in all, the models show interesting properties of platelet signal transduction, and give valuable implications for medical treatment and future research. KW - Thrombozyt KW - Modellierung KW - ADP KW - Prostaglandine KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyten KW - Modellierung KW - ADP KW - Prostaglandine KW - platelets KW - ADP KW - prostaglandin KW - modeling KW - boolean KW - ODE Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78807 ER - TY - THES A1 - Heinecke, Kai T1 - Die Dynamik der primären Erkennungsschritte von BMP-Rezeptoren T1 - Dynamics of the primary recognition steps of BMP receptors N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden zusammen mit den Activinen, Growth and Differentiation Factors (GDFs) und Transforming Growth Factor β (TGF-β) die Transforming Growth Factor β-Superfamilie von sekretierten Signalproteinen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Erhaltung und Regeneration von Geweben und Organen. Die Signalvermittlung dieser Proteine erfolgt durch die Bindung von zwei verschiedenen Typen von Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren, die als Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren bezeichnet werden. Im ersten Schritt erfolgt die Bindung an den hochaffinen Rezeptor (im Fall von BMP-2 der Typ-I-Rezeptor), im nächsten Schritt wird der niederaffine Rezeptor in den Komplex rekrutiert. Bis heute sind lediglich sieben Typ-I- und fünf Typ-II-Rezeptoren bekannt, was auf eine Promiskuität in der Liganden-Rezeptor-Interaktion schließen lässt. Die Architektur beider Rezeptorsubtypen ist dabei relativ ähnlich. Beide bestehen aus einer ligandenbindenden extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne sowie einer intrazellulären Kinasedomäne. Eine nacheinander ablaufende Transphosphorylierung der intrazellulären Domänen führt zu einer Phosphorylierung von SMAD-Proteinen, die dann als nachgeschaltete Vermittler fungieren und die Transkription regulierter Gene auslösen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die initialen Schritte der Rezeptorkomplexformierung sowie die Mobilität der Rezeptoren mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass für die Bildung eines Signalkomplexes eine bestimmte Schwellenkonzentration des Liganden nötig ist und dass der Mechanismus nach einem Alles-oder-Nichts-Prinzip wie ein Schalter funktioniert. Außerdem konnten Unterschiede in der Nutzung der gleichen Rezeptoren durch verschiedene Liganden festgestellt werden. Die anderen Teile der Arbeit befassen sich mit der Funktionalität der verschiedenen Rezeptordomänen in der Signalübermittlung, der Analyse von hoch- und niederaffinen Ligandenbindestellen auf ganzen Zellen sowie dem Einfluss des SMAD- und des MAPK-Signalwegs auf die Induktion der Alkalischen Phosphatase. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Art der SMAD-Phosphorylierung allein vom Typ der Kinasedomäne abhängig ist, dass auf einer Zelle verschiedene Rezeptorpopulationen existieren, welche von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen angesprochen werden, und dass die Induktion der Alkalischen Phosphatase stark vom zeitlichen Verlauf der SMAD- und MAPK-Aktivierung abhängig ist. N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), together with Activins, Growth and Differentiation Factors (GDFs) and Transforming Growth Factor β (TGFβ), are secreted signalling proteins that belong to the Transforming Growth Factor β superfamily. They play an important role in regulating the development, maintenance and regeneration of tissues and organs. Signalling of TGFβ superfamily members occurs by binding to two types of serine-/threonine kinase receptors termed type I and type II. First, the high affinity receptor (in case of BMP2 the type I receptor) is bound, and then the low affinity receptor is recruited into the signalling complex. The fact that there are only seven type-I and five type-II receptors are known implies a limited promiscuity in ligand-receptor interaction. The architecture of both receptor subtypes is quite similar, with a small extracellular ligand-binding domain, a single transmembrane domain and an intracellular kinase domain. Subsequent transphosphorylation of the intracellular receptor domains leads to phosphorylation of SMAD proteins, which then act as downstream mediators and activate gene transcription. The main part of this work was to analyze the initial steps in receptor complex formation and the mobility of TGFβ-superfamily receptors with fluorescence microscopy techniques. It could be shown that complex formation requires a certain ligand threshold concentration and shows an all-or-nothing switch-like behaviour. Furthermore, differences between different ligands using the same receptors could be visualized. The other parts of this work deal with the functionality of the different receptor domains in signal transduction, the analysis of high- and low-affinity binding sites on whole cells and the influence of the SMAD- and MAPK-pathways on alkaline phosphatase induction. It could be shown that the type of SMAD phosphorylation ist solely dependent on the type of the kinase domain, that there exist different receptor populations on a cell that are addressed by different ligand concentrations and that alkaline phosphatase induction is highly dependent on the time course of SMAD- and MAPK-pathway activation. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Wirkstoff-Rezeptor-Bindung KW - Signaltransduktion KW - Signalkomplex KW - Rezeptormobilität KW - Rezeptor-Liganden-Interaktion KW - Physiologische Chemie KW - Molekulare Biophysik KW - Molekularbiologie KW - Signaling complex KW - receptor mobility KW - receptor-ligand-interaction Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49257 ER - TY - THES A1 - Wegert, Jenny T1 - WTX-Mutationsscreen und funktionelle Analyse des Retinsäure-Signalwegs in Wilms Tumoren T1 - WTX-mutation screening and functional analysis of the retinoic acid signaling pathway in Wilms tumors N2 - Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, ist einer der häufigsten bösartigen Tumoren im Kindesalter. Er entsteht aus embryonalem undifferenziertem Nierengewebe und tritt meist als unilateraler und sporadischer Tumor auf. In 10-15% der Wilms Tumoren finden sich WT1- und/oder CTNNB1-Mutationen. Während diese schon länger als genetische Ursachen des Nephroblastoms bekannt sind, wurde erst kürzlich WTX als drittes Gen beschrieben, welches eine Rolle in der Tumorentstehung spielt. Für einen Großteil der WT ist die genetische Ursache jedoch unklar. Da die bisher publizierten WTX-Mutationsraten auf Untersuchungen kleiner Gruppen basieren und sich stark unterscheiden, sollten in dieser Arbeit WTX-, CTNNB1- und WT1-Mutationen in einem großen WT-Set bestimmt werden. Verluste genetischen Materials in der WTX-Region traten in 17% der Fälle auf und waren zwischen den Geschlechtern gleich verteilt. Die Sequenzierung von WT-Proben zeigte, dass nur 2% von WTX-Punktmutationen betroffen sind. In weiteren 11,5% der Proben konnte keine WTX-Expression nachgewiesen werden. Die WTX-Veränderungen traten z. T. gemeinsam mit WT1- und/oder CTNNB1-Mutationen auf. Die unvollständige WTX-Deletion in einigen WT legte die Vermutung nahe, dass innerhalb eines Tumors eine Heterogenität in Bezug auf den WTX-Status möglich ist. Dieser Verdacht konnte durch die detaillierte Untersuchung verschiedener Regionen solcher Tumoren erhärtet werden: Hierzu wurden histologisch unterschiedliche Bereiche auf den Anteil einer WTX-Mutation bzw. eines WTX-LOH hin untersucht. Obwohl alle Regionen des jeweiligen Tumors einen kompletten LOH auf Chromosom 11 aufwiesen, waren die WTX-Veränderungen unterschiedlich stark ausgeprägt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass WTX-Veränderungen keine notwendigen und frühen Ereignisse in der Tumorentstehung sind, sondern erst später auftreten und nur einen Teil der Tumorzellen betreffen können. Die Vermutung, dass WTX-Mutationen keinen direkten Einfluss auf die Tumorentwicklung und prognose haben, wird durch das Fehlen eines signifikanten Zusammenhangs zwischen WTX-Deletion bzw. WTX-Expression und den klinischen Eigenschaften der WT gestützt. Um die Rolle von Genen, die potentiell an der Entstehung und Entwicklung des Nephroblastoms beteiligt sind, zu untersuchen oder mögliche neue Therapiestrategien zu überprüfen, sind in vitro-Modelle nötig. Da ein solches für Wilms Tumoren nicht etabliert ist, wurden Primärkulturen aus verschiedenen WT-Proben angelegt. Kulturen aus Tumorgewebe von 12 Patienten mit unterschiedlichen genetischen Veränderungen konnten als echte Tumorzellen validiert werden. Zwei Zelltypen ließen sich morphologisch und immunhistochemisch unterscheiden: Zum einen runde, langsam wachsende Zellen mit Epithelcharakter und zum anderen fibroblastenähnliche Zellen, welche weniger differenziert waren und häufig für viele Passagen kultiviert werden konnten. Somit wurde ein Set verschiedener WT-Primärkulturen etabliert, welches nun für in vitro-Experimente zur Untersuchung grundlegender Mechanismen der WT-Entstehung oder zum Test neuer Therapieansätze eingesetzt werden kann. Frühere Microarray-Analysen deuteten auf eine Deregulation des Retinsäure (RA)-Signalwegs in fortgeschrittenen Wilms Tumoren hin. Diese Ergebnisse sollten in einem großen unabhängigen Proben-Set mittels Realtime-RT-PCR validiert werden. Eine Deregulation des RA-Signalwegs und die Überexpression von NMYC wurden für Tumoren der Hochrisikogruppe im Vergleich zu Tumoren mit geringem/mittlerem Risiko nachgewiesen. So stellte sich die Frage, ob Patienten mit fortgeschrittenem WT von einem Retinsäure-Einsatz in der Therapie profitieren könnten. Um dies zu beantworten, wurde der Effekt von verschiedenen Retinoiden auf WT-Primärkulturen untersucht. Die WT-Zellen wurden mit all-trans RA (ATRA), 9cisRA, dem synthetischen Retinoid Fenretinid (4HPR) und Kombinationen von ATRA bzw. 4HPR und einem HDAC-Inhibitor (SAHA) behandelt. Gene, welche in Hochrisiko-WT differenziell reguliert waren, wurden untersucht und zeigten nach RA-Behandlung eine entgegengesetzte Expression. In sechs der sieben verwendeten Primärkulturen wurde eine RA-vermittelte Proliferationsreduktion nachgewiesen. Für die Kombinationen von Retinoiden mit SAHA wurden keine synergistischen Effekte beobachtet. Während Fenretinid in den meisten Kulturen Apoptose induzierte, verursachten ATRA und 9cisRA morphologische Veränderungen, welche auf Differenzierungsvorgänge hindeuteten. Eine Microarray-Analyse ATRA-behandelter WT-Zellen zeigte die differenzielle Regulation vieler Gene, welche eine Rolle in der Bildung der extrazellulären Matrix oder bei Differenzierungsvorgängen von Knochen-, Knorpel-, Nerven- oder Muskelgewebe spielen. Diese Befunde bieten einen weiteren Hinweis darauf, dass Retinoide für den Einsatz in der Therapie des Nephroblastoms geeignet sein könnten. N2 - Wilms tumor (WT) – or nephroblastoma – is one of the most common solid tumors in childhood. It arises from embryonal blastema and most frequently presents as a unilateral and sporadic tumor. Mutations in WT1 and CTNNB1 are well established as causal alterations in about 10-15 % of cases. Recently, WTX (Wilms tumor gene on the X-chromosome), a gene implicated in WNT signaling, has been identified as a third WT gene, but for the majority of nephroblastomas the genetic etiology is still unclear. Published WTX mutation rates in Wilms tumors are still based on smaller cohorts and differ significantly. Therefore, the WTX, CTNNB1 and WT1 mutation state was determined in a large set of 429 Wilms tumors. Genomic WTX alterations were identified in 17% of WT, equally distributed between males and females. Analysis of 104 WT samples for WTX point mutations revealed a frequency of only 2%. An additional 11,5% of tumor samples lacked expression of WTX mRNA. These WTX alterations can occur in parallel to WT1 or CTNNB1 mutations. Incomplete deletion of WTX in several cases suggested heterogeneity of WTX alterations in tumors and this was corroborated by analysis of different regions of such tumors. In cases with heterozygous point mutations or LOH, separate tumor fragments or microdissected regions with different histology were analyzed. Despite complete allele losses at chromosome 11 varying ratios of WTX mutation were detected. This suggests that WTX alteration is not an essential and early mutation needed to drive tumorigenesis, but rather a late event that may affect only a fraction of cells with unclear clinical relevance. This hypothesis is supported by the fact that there is no significant correlation between WTX deletion status or expression level and clinical parameters suggesting that WTX mutations apparently have little direct impact on tumor behavior and presentation. As there is no in vitro model for nephroblastoma that could be used to investigate genes playing a role in development and progression of WT or to test new treatment strategies, primary cultures were generated from fresh tumor tissue. Cultures from tumor samples of 12 patients with different genetic alterations could be validated as tumor derived cells. Two different cell types could be distinguished by immunohistochemistry and cell morphology: large round, slowly growing cells with epithelial characteristics and fibroblast-like cells that are less differentiated and some of which could be kept in culture for many passages before getting senescent. In this way a set of primary WT-cells could be established that is suitable for in vitro approaches to study mechanisms of nephroblastoma development or to test new therapy strategies. Prior microarray analyses suggested a deregulation of the retinoic acid (RA) pathway in advanced Wilms tumors. This should be validated in a large independent tumor set of 163 WT by realtime-RT-PCR. Deregulation of RA signaling and overexpression of NMYC was found in high risk tumors as opposed to tumors with low/intermediate risk and suggested a beneficial impact of retinoic acid on advanced nephroblastoma. To investigate whether retinoids could be employed as a novel therapeutic agent in WT primary WT-cells were treated with all-trans-RA (ATRA), 9cisRA, the synthetic retinoid fenretinide and combinations of retinoids and the HDAC inhibitor SAHA. Expression of genes deregulated in high risk tumors were analyzed and showed opposite changes upon treatment suggesting a positive effect of retinoids. For six of seven primary cultures tested cell growth was reduced upon retinoid administration. No additional synergistic effect could be observed for the combination of retinoids with the HDAC inhibitor SAHA. While fenretinide induced apoptosis in several cultures tested, ATRA and 9cisRA caused morphological changes suggesting differentiation upon treatment. Microarray analysis of ATRA treated WT-cells revealed differential expression of many genes involved in the formation of the extracellular matrix and osteogenic, neuronal or muscle differentiation processes. These findings provide further evidence of a potential utility of retinoids in Wilms tumor treatment. KW - Nephroblastom KW - Genmutation KW - Retinoesaeure KW - Signaltransduktion KW - Wilms Tumor KW - WTX KW - Primärkultur KW - Nephroblastoma KW - Wilms tumor KW - WTX KW - primary cell culture KW - retinoic acid Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52822 ER - TY - THES A1 - Salzmann, Steffen T1 - Regulation der TNF-Rezeptor Signaltransduktion durch das Zytokin TWEAK T1 - Regulation of the TNF-receptor signaltransduction through the cytokine TWEAK N2 - Das pleiotrope Zytokin TNF (tumor necrosis factor) kann an den TNF-Rezeptor 1 (TNFR1) und den TNF-Rezeptor 2 (TNFR2) binden und mit deren Hilfe seine biologischen Funktionen über verschiedene Signalwege, wie z.B. NFB- und MAPK-Aktivierung bzw. Apop¬toseinduktion, vermitteln. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des TNFR2 zur proteasomalen Degradation des Adaterproteins TRAF2 führt und dadurch die TNFR1-induzierte Apoptose verstärkt wird. TWEAK (tumor necrosis like weak inducer of apoptosis), das ebenfalls der TNF-Ligandenfamilie angehört und die Interaktion mit dessen Rezeptor Fn14 (fibroblast growth factor-inducible 14), der wie der TNFR2 zur Untergruppe der TRAF-bindenden Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie gehört, zeigten in verschiedenen Arbeiten auch eine TRAF2-degradierende Wirkung. In der vorliegenden Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass dies auch im Falle des TWEAK/Fn14-Systems mit einem verstärkenden Effekt auf die TNFR1-vermittelte Apoptose einhergeht. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass TWEAK zusätzlich auch die TNFR1-induzierte Nekrose verstärkt, die den Zelltod durch andere Mechanismen als bei der Apoptose induziert. Von anderen Arbeiten unserer Gruppe war bekannt, dass lösliches TWEAK (sTWEAK) und membranständiges TWEAK (mTWEAK) bezüglich der TRAF2-Depletion wirkungs¬gleich sind. Da der apoptotische Fn14-TNFR1-„crosstalk“ auf der Depletion von TRAF2-Komplexen beruht wurden auch keine signifikanten Unterschiede zwischen sTWEAK und mTWEAK in Bezug auf die Verstärkung der TNFR1-induzierten Apoptose beobachtet. Interessanter¬weise zeigte sich in der vorliegenden Arbeit jedoch, dass sTWEAK den klassischen NFB-Signalweg gar nicht bzw. nur schwach aktiviert, wohingegen mTWEAK diesen stark induziert. Bei der Aktivierung des alternativen NFB-Signalweges hingegen ließen sich keine Unterschiede zwischen sTWEAK und mTWEAK erkennen. Die Aktivierung eines Signalweges wird also durch die Oligomerisierung des Liganden nicht moduliert, demgegenüber aber erwies sich die Aktivierung eines anderen Signalweges als stark abhängig von der Liganden-Oligomerisierung. Vor dem Hintergrund, dass das Adapterprotein TRAF1 (TNF-receptor-associated factor 1) Heterotrimere mit TRAF2 bildet, wurde weiterhin untersucht, ob dieses Molekül einen Einfluss auf die Aktivität der TWEAK-induzierten Signalwege hat. Tatsächlich zeigte sich in TRAF1-exprimie¬renden Zellen eine Verstärkung der TWEAK-induzierten Aktivierung des klassischen NFB-Signalweges Zukünftige Studien müssen nun aufklären, inwieweit die hier gefundenen Mecha-nismen das Zusammenspiel von TNF und TWEAK in vivo bestimmen. N2 - The pleiotropic cytokine TNF (tumor necrosis factor) binds to two receptors, TNF-receptor 1 (TNFR1) and TNF-receptor 2 (TNFR2). TNF elicits its biological functions through different signaling pathways, e.g. NFB- and MAPK-activation and induction of apoptosis. Previous studies revealed that activation of TNFR2 leads to protea¬somal degradation of the adaptor protein TRAF2 and enhanced TNFR1-induced apoptosis. TWEAK (tumor necrosis like weak inducer of apoptosis), a member of the TNF-ligand family and Fn14 which belongs like TNFR2 to the TRAF-binding subgroup of the TNF-receptor family, showed also a TRAF2-degrading effect. In the present thesis it is shown that this is also associated with an enhancement of TNFR1-mediated apoptosis. Furthermore, it was shown that TWEAK also amplifies TNFR1-induced necrosis, a form of cell death that is induced independently and by different mechanisms than apoptosis. In earlier studies in our group it was found that soluble TWEAK (sTWEAK) and membrane bound TWEAK (mTWEAK) have the same TRAF2-depleting effect. Because the apoptotic crosstalk of Fn14 and TNFR1 bases on the depletion of TRAF2-containing complexes, there were no significant differences observed between sTWEAK and mTWEAK concerning the enhancement of TNFR1-induced apoptosis. Interestingly, it was shown in this thesis that sTWEAK can activate the classical NFB pathway not or just weak, whereas mTWEAK can do this very efficiently. However there were no differences between sTWEAK and mTWEAK in the activa¬tion of the alternative NFB pathway. Thus the activation of one type of signaling pathway is therefore not modulated through ligand oligomerisation, but in contrast the activation of another pathway turned out to be strongly dependent of ligand oligomerisation. It is known that the adaptor protein TRAF1 (TNF-receptor-associated factor 1) builds heterotrimers with TRAF2. It was furthermore investiga-ted, whether this molecule has an influence on the activity of TWEAK-induced pathways. Actually there was increased activity in TWEAK-mediated classical NFB signaling observed in TRAF1-expressing cells. Further studies have to clarify to which extend the here found mechanisms affect the TNF-TWEAK interplay in vivo. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Signaltransduktion KW - TNF KW - TWEAK Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52525 ER - TY - THES A1 - Kotzsch, Alexander T1 - BMP Ligand-Rezeptor-Komplexe: Molekulare Erkennung am Beispiel der Spezifischen Interaktion zwischen GDF-5 und BMPR-IB T1 - BMP ligand receptor complexes: Molecular recognition exemplified by the specific interaction between GDF-5 and BMPR-IB N2 - Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquitäre, sekretierte Proteine mit vielfältigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellulären Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhomöostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt – und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signalübermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-βs und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen – Typ I und Typ II – existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen für die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verfügung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuität üben BMPs ihre biologische Funktion überwiegend hochspezifisch aus, d.h. abhängig vom Liganden werden spezifische zelluläre Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellulärer Signalkaskaden zusammenhängen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals“, repräsentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere übermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel für Bindungspromiskuität und -spezifität. Während BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinität bindet („promiske Interaktion“), zeigt GDF-5 eine 15-20fach höhere Bindungsaffinität zu BMPR-IB („spezifische“ Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch überaus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden binäre und ternäre Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellulären Domäne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilität auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung näher zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. Während in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinität bestimmt, trägt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit“ vorliegt und die Moleküle entsprechend „aufeinander falten“. (2) Die Bindungsspezifität wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, führt erst die „richtige“ Kombination aus Flexibilität in den Schleifen und Rigidität des Rezeptorgrundgerüsts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplementären Oberfläche. Die mangelnde sterische Komplementarität von Ligand- und Rezeptoroberflächen führt zu der niedrigeren Bindungsaffinität von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgelösten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazelluläre Domäne, das Transmembransegment und die intrazelluläre Domäne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedomänen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. Möglicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedomänen der Typ I und Typ II Rezeptoren für eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren möglicherweise vom Liganden abhängt. Angesichts der Bindungspromiskuität unter BMP-Liganden und -Rezeptoren könnten so spezifische Signale übermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion möglich ist, kann nun für die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are ubiquitous, secreted cytokines involved in a manifold of biological functions. The diversity of cellular processes regulated by BMPs, from bone development to tissue homeostasis and neuronal processes, is amazing – and raises questions about the mechanisms of signal transduction in the light of redundant functions on the one hand, and specific functions on the other hand. Similar to structurally related activins and TGF-βs, the signal transduction of BMPs is accomplished by ligand-induced oligomerization of transmembrane BMP type I and type II serine/threonine receptor kinases. According to current knowledge, only four type I and three type II receptor subtypes are available for BMP signal transduction, facing a multitude of more than 18 BMP ligands. Binding of BMP ligands to their receptors can be highly specific meaning that only one specific receptor of either subtype is used for signaling. In contrast, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype, which results in binding promiscuity. However, even though receptor subtypes are bound in a promiscuous manner, only certain biological functions are triggered. Dependent on the BMP ligand, specific cellular processes are activated and regulated. This discrepancy between unspecific binding and specific signaling events and the biological response raises the question how the formation of heteromeric ligand-receptor complexes is linked to the activation of defined intracellular signaling cascades, and finally, how a certain BMP signal is transduced into the interior of the cell through a „bottleneck“ represented by the limited number of receptor subtypes. The interaction between BMP-2 / GDF-5 and the BMP type I receptors BMPR-IA / BMPR-IB is a prime example for binding promiscuity and binding specificity. BMP-2 binds BMPR-IA and BMPRIB with almost equal binding affinity („promiscuous interaction“) while GDF-5 exhibits a 15-20fold higher binding affinity to BMPR-IB („specific interaction“). Although this difference is seemingly small, it is however of considerable relevance for the physiological role of these ligands. To gain insight into the mechanisms of molecular recognition between the binding partners, binary and ternary ligand-receptor complexes consisting of BMP-2 or GDF-5, the extracellular domains of the type I receptors BMPR-IA or BMPR-IB, and the extracellular domain of the type II receptor ActRIIB were investigated. The thesis presented here describes the structural and functional analysis of these ligand-receptor complexes. To analyse the effect of structural flexibility on BMP type I receptor recognition in more detail, the structure of free BMPR-IA was determined using NMR spectroscopy. Based on data from a limited mutagenesis and the crystal structure of the GDF-5•BMPR-IB complex several characteristics concerning ligand-receptor binding and recognition can be deduced: (1) The main binding determinants in complexes of BMPR-IA and BMPR-IB with their ligands BMP-2 and GDF-5 differ. A hydrophobic binding motif determines binding affinity in complexes of BMPR-IB, whereas a polar interaction significantly contributes to binding energy in complexes of BMPR-IA. These main binding motifs are only formed during complex formation as demonstrated by a comparison between structures of free and bound ligands as well as type I receptors. Both ligand and receptor fold „onto each other“ which suggests an induced fit mechanism. (2) Binding specificity is encoded on loops at the periphery of the binding epitope of the type I receptors. Only the „appropriate“ combination between structural flexibility in the receptor loops and structural rigidity of the receptor backbone results in signal active type I receptors, as shown by analysis of single polymorphisms in BMPR-IA causing juvenile polyposis syndrome, a cancerous disease of the intestine. A lack of steric surface complementarity between GDF-5 and BMPR-IA, that cannot be overcome by structural flexibility, leads to the lower binding affinity in comparison to BMPR-IB. Interestingly, the high resolution structure of the GDF-5•BMPR-IB complex shows that the orientations/positions of BMPR-IA in the binding epitope of BMP-2 and of BMPR-IB in the binding epitope of GDF-5 vary. Assuming that the extracellular domain, the transmembrane segment, and the intracellular domain of the type I receptors form a rigid element, the different orientations of the extracellular domains should also reflect the assembly of the kinase domains and therefore, affect signal transduction. One can assume that a defined arrangement of the kinase domains of type I and type II receptors is required to allow for efficient phosphorylation and signal transduction, respectively. The comparison of several BMP ligand-type I receptor complexes suggests that the different orientations of these receptors are likely dependent on the ligand. Considering the binding promiscuity among BMP ligands and receptors such a mechanism would represent a possible way for the transmission of specific signals and regulation of specific biological functions. The insights into molecular structure and function of BMP ligands and receptors presented in this thesis contribute significantly to a more detailed understanding of their binding properties. The question why the interaction of BMP ligands and receptors is promiscuous on the one hand and specific on the other hand in spite of structurally highly homologous molecules can now be answered for BMP-2 and GDF-5 as well as BMPR-IA and BMPR-IB. KW - Cytokine KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Ligand KW - Proteinfaltung KW - Molekulare Erkennung KW - Rezeptor KW - Transforming Growth Factor beta KW - Wachstumsfaktor KW - Strukturaufklärung KW - Dreidimensionale NMR-Spektroskopie KW - Protein-Serin-Threonin-Ki KW - Proteinkristallographie KW - GDF-5 KW - BMPR-IB KW - Signaltransduktion KW - protein crystallography KW - molecular recognition KW - signal transduction KW - ligand KW - receptor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31040 ER - TY - THES A1 - Großmann, Claudia T1 - Interaktion zwischen der Signaltransduktion von Aldosteron, Mineralocorticoidrezeptor und epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor T1 - Cross-talk between Aldosterone / Mineralocorticoid Receptor and EGFR Signaling N2 - Klassischerweise ist der Aldosteron-gebundene MR an der Regulation des Blutdruckes und des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes beteiligt. Neuere klinische Studien zeigen allerdings, dass Aldosteron auch an pathophysiologischen Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System mitwirkt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch weitgehend unbekannt. Der EGFR ist ein Wachstumsfaktor und heterologer Signaltransduktor für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von beispielsweise Angiotensin II, Phenylephrin und Endothelin-1. In der Literatur gibt es Hinweise für eine Interaktion zwischen den Signaltransduktionswegen von Aldosteron/MR und EGFR. So können Mineralocorticoide nach zerebraler Ischämie zu einem vermehrten vaskulären Remodeling und einem Anstieg der EGFR-mRNA-Konzentration führen und außerdem eine EGF-induzierte Vasokonstriktion verstärken. Daher wäre eine mögliche Erklärung für die pathophysiologische Wirkung von Aldosteron eine Induktion der EGFR-Expression mit vermehrter Wirksamkeit von vasoaktiven Peptiden. Um diese Hypothese zu überprüfen untersuchten wir in verschiedenen Modellsystemen, ob Aldosteron die EGFR-Proteinexpression erhöht. Dies war sowohl im heterologen CHO-Expressionsystem also auch in MR-exprimierenden Zelllinien und Primärkulturen der Fall. Auch in adrenalektomierten Ratten mit osmotischen Minipumpen bestätigte sich die Aldosteron-induzierte EGFR-Expression in der Aorta, im linken Herzen und der Niere. Über den eng verwandten Glucocorticoidrezeptor ließ sich keine EGFR-Expressionssteigerung auslösen, so dass es sich um einen MR-spezifischen Effekt handelt. Zur Charakterisierung des zugrundeliegenden molekularen Mechanismus, der besonders für therapeutische Interventionen von Interesse ist, wurde die Promotoraktivität des EGFR untersucht. Es zeigte sich bei Aldosteroninkubation eine gesteigerte EGFR-Promotoraktivität im Reporter-Gen-Assay. Die beteiligten Promotoranteile konnten mit Deletionskonstrukten auf zwei DNA-Fragmente eingegrenzt werden. Von Seiten des MR ist die A/B-Domäne für die Interaktion bedeutend, denn ein trunkierter MR mit den Domänen C, D, E und F genügt nicht, um den EGFR-Promoter vollständig zu aktivieren. Um Hinweise für die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Interaktion zwischen MR und EGFR zu erhalten, untersuchten wir sowohl den Einfluß auf die Bildung von Extrazellulärmatrix in glatten Gefäßmuskelzellen als auch auf die Natriumresorption im Sammelrohr der Niere. Als Anhaltspunkt für die vermehrte Bildung von extrazellulärer Matrix wie sie bei Remodelingprozessen vorkommt, quantifizierten wir die Fibronektinsekretion in glatten Muskelzellen der humanen Aorta (HAoSMC). Nach Aldosteroninkubation und besonders bei Koinkubation mit EGF zeigte sich eine vermehrte Fibronektinsekretion ins Medium, die sich durch Hemmer der EGFR-Kaskade normalisieren ließ. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Aldosteron-EGFR-Interaktion an der Entstehung von Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System beteiligt ist. Neben einem Einfluss auf die Entstehung pathophysiologischer Prozesse im kardiovaskulären und renalen System kommt es über eine Aldosteron-induzierte EGFR-Expression im Sammelrohr der Niere auch zu physiologischen Effekten, nämlich einer Hemmung der Natriumresorption. Diese wirkt der klassischerweise durch Aldosteron vermittelten vermehrten Natriumresoprtion über den epithelialen Natriumkanal (ENaC) entgegen und könnte daher als negative Feedbackschleife Dauer und Ausmaß der Aldosteron-induzierten Natriumresorption limitieren. Zusätzlich zu den klassischen genomischen Wirkungen zeigen Steroide nicht-genotrope Effekte. Beim Aldosteron führen diese MR- und EGFR-vermittelt zu einer Aktivierung der ERK1/2- und JNK-1/2-Kinasen. Die nicht-genotrope Aldosteron-induzierte ERK-Aktivierung ist ferner durch c-Src-Inhibitoren hemmbar und führt zu einer Stimulation der Kerntranslokation des MR. Nicht-genotrope Effekte können folglich unter Beteiligung der EGFR-Signalkaskade die genomischen modulieren. Aldosteron führt ebenfalls zu einem Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentration, allerdings ist dieser Effekt unabhängig vom MR. Hieraus folgt, dass die nicht-genotropen Effekte teilweise MR-vermittelt und teilweise MR-unabhängig sind. Insgesamt konnte also auf verschiedenen Ebenen eine Interaktion zwischen Aldosteron/MR und der EGFR-Signalkaskade gezeigt werden, mit Hinweisen für eine Bedeutung bei sowohl physiologischen als auch pathophysiologische Vorgängen. N2 - Classically, aldosterone-bound MR regulates blood pressure as well as salt and water homeostasis. Recent clinical studies have shown that aldosterone can additionally lead to cardiovascular and renal remodeling; however, the underlying mechanisms are still unclear. The EGFR is a growth factor and heterologous signal transducer for G-protein-coupled receptors of for example angiotensin II, phenylephrine and endothelin-1. There are indications in literature that there is cross-talk between aldosterone/MR and EGFR signaling. For example, mineralocorticoids can lead to both enhanced vascular remodeling and an increase in EGFR-mRNA after cerebral injury and they can also augment EGF-induced vasoconstriction. Therefore, one attractive hypothesis to explain the pathophysiological effects of aldosterone is an aldosterone-induced EGFR expression with consequently increased signaling of vasoactive and profibrotic peptides. To evaluate this hypothesis, we tested EGFR expression after aldosterone incubation in different model systems. We found an aldosterone-induced EGFR expression in a heterologous expression system of CHO cells, in endogenously MR-expression cell lines as well as in primary culture. This was also true in the kidney, aorta and the heart of adrenalectomized rats equipped with osmotic minipumps. The closely related glucocorticoid receptor did not lead to enhanced EGFR expression, making this phenomenon MR specific. Because of its possible therapeutical relevance for remodeling processes, the underlying molecular mechanism of the MR/EGFR cross-talk is of special interest. To characterize it we looked at the promoter activity of the EGFR which was enhanced after incubation with aldosterone. Furthermore, we could narrow down the EGFR promoter regions involved in this interaction down to two DNA fragments. Concerning the MR, the n-terminal A/B-domain is necessary to elicit full activation of the promoter while the domains C, D, E and F by themselves are not enough. To gain evidence for the physiological and pathophysiological relevance of the interaction between the MR and the EGFR, we looked at formation of extracellular matrix and sodium reabsorption in the renal collecting duct. As an indicator for enhanced formation of extracellular matrix and remodeling, we measured fibronectin secretion of human aortal smooth muscle cells. After incubation with aldosterone and especially in the presence of EGF, an increase in fibronectin secretion could be measured that was antagonized by inhibitors of the EGFR cascade. This supports the hypothesis that the aldosterone-EGFR cross-talk is involved in cardiovascular and renal remodeling processes. Besides this pathophysiological effect, aldosterone-induced EGFR expression in the renal collecting duct can also lead to a reduction in sodium reabsoption. This counteracts the increase in sodium reabsorption classically induced by aldosterone and can therefore function as a negative feedback loop limiting long-term aldosterone-induced sodium reabsorption. In addition to traditional genomic effects, steroids can also elicit non-genotropic actions. Aldosterone, for example, can lead to MR- and EGFR-mediated activation of ERK1/2 and JNK1/2. The non-genotropic aldosterone-induced ERK activation is also reduced by c-Src-inhibitors and leads to an increase in the cytosolic-nuclear shuttling of the MR. Therefore, the non-genotropic effects can modulate genomic effects via the EGFR pathway. Furthermore, aldosterone can induce a rise in the concentration of cytosolic calcium which is independent on the MR. Consequently, non-genotropic actions are partially mediated by the MR and partially MR-independent. Overall, there is a cross-talk between aldosterone/MR and EGFR signaling on different levels with evidence for relevance for physiological and pathophysiological processes. KW - Aldosteron KW - Corticosteroide KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - Epidermaler Wachstumsfaktor KW - Mineralocorticoidrezeptor KW - Aldosteron KW - EGFR KW - kardiovaskuläres Remodeling KW - nicht-genotrope Steroidwirkungen KW - mineralocorticoid receptor KW - aldosterone KW - EGFR KW - cardiovascular remodeling KW - nongenotropic steroid effects Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22260 ER - TY - THES A1 - Schär, Jennifer T1 - Molekulare Charakterisierung der Response-Regulatoren ArsR (HP0166), HP1043 und HP1021 von Helicobacter pylori T1 - Molecular characterisation of the response regulators ArsR, HP1043, HP1021 of Helicobacter pylori N2 - Bakterien müssen ständig in der Lage sein auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren zu können. Zur Wahrnehmung dieser Veränderungen haben sich unterschiedliche Signaltransduktionssysteme entwickelt. Ein weit verbreiteter und gut charakterisierter Mechanismus zur Signaltransduktion sind die so genannten Zwei-Komponentensysteme. Im Genom von H. pylori konnten nur wenige Bestandteile von Zwei-Komponentensystemen identifiziert werden. Dazu zählen neben dem Chemotaxis-System lediglich drei Histidin-Kinasen, ArsS, CrdS und FlgS, und fünf Response-Regulatoren HP1021, HP1043, ArsR, CrdR und FlgR, die vermutlich Transkriptions-regulatorische Funktionen haben. Zwei der Response-Regulatoren, HP1043 und ArsR als essentiell für das Überleben von H. pylori, während HP1021 einen deutlichen Einfluss auf das Zellwachstum hat, da ein Wachstums-Defekt zu erkennen ist, wenn das entsprechende Gen hp1021 deletiert wird. Eine Deletion von arsS, dem Gen der zugehörigen Histidin-Kinase von ArsR, hat unter Standard-Wachstumsbedingungen keine Auswirkung auf das Zellwachstum von H. pylori. Diese Beobachtung spricht für die Hypothese, dass der Response-Regulator ArsR die Transkription zweier unterschiedlicher Sets von Zielgenen kontrolliert. Demzufolge reguliert der Response-Regulator ArsR nach Säure-induzierter Phosphorylierung durch ArsS die Transkription von Genen, die zur Säureresistenz beitragen, während ArsR im nicht-phosphorylierten Zustand die Transkription von weiteren Zielgenen kontrolliert, von denen mindestens eines für das Zellwachstum essentiell sein sollte. Das durch ArsR~P kontrollierte Regulon konnte bereits weitgehend charakterisiert werden allerdings sind die Zielgene des unphosphorylierten Regulators bislang unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte die zuvor beschriebene Hypothese bestätigt werden, da gezeigt wurde, dass ein Derivat von ArsR, mit einer Mutation der Phosphorylierungsstelle D52 zu N52, das wildtypische Protein bezüglich des Zellwachstums unter Standardbedingungen funktionell ersetzen kann. Für die Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 konnte bislang keine zugehörige Histidin-Kinase identifiziert werden und interessanterweise findet man in der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren atypische Abweichungen von der Konsensus-Sequenz. Um die Bedeutung dieser atypischen Primärsequenzen für die Funktion dieser Response-Regulatoren zu untersuchen wurden mutierte H. pylori-Stämme konstruiert, die ausschließlich Derivate von HP1021 bzw. HP1043 exprimieren, die in ihrer Receiver-Sequenz der Konsensus-Sequenz entsprachen. Da diese Mutanten sich bezüglich ihres Zellwachstums nicht vom Wildtyp unterscheiden, konnte nachgewiesen werden, dass die atypischen Receiver-Sequenzen der beiden Response-Regulatoren nicht entscheidend für die Funktionen der Response-Regulatoren sind. Weiterhin konnten Indizien dafür gesammelt werden, dass HP1021 und HP1043 hinsichtlich ihrer Aktivierung vermutlich vom üblichen Zwei-Komponentenparadigma abweichen. Derivate von HP1021 und HP1043 mit Mutationen ihrer putativen atypischen Phosphorylierungsstelle sind in der Lage ihre wildtypischen Pendants hinsichtlich der bekannten Phänotypen funktionell zu ersetzen. Somit ist eine Phosphorylierung der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren keine Voraussetzung für ein normales Zellwachstum von H. pylori. Diese Hypothese wird gestützt durch die Beobachtung, dass ein Ortholog von HP1043 aus C. jejuni CJ0355, das natürlicherweise an der potentiellen Phosphorylierungsstelle einen nicht phosphorylierbaren Aminosäurerest trägt, HP1043 in seiner Funktion ersetzen kann. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro keine Phosphorylierung durch radioaktiv markiertes Acetylphosphat stattfindet und dass ein H. pylori-Stamm mit einer Deletion der Gene pta und ackA, welche Proteine kodieren, die bei der Synthese von zellulärem Acetylphosphat benötigt werden, einen normalen Wachstums-Phänotyp zeigt. Zusätzlich konnten in einer massenspektrometrischen Analyse des Proteins HP1021, welches nach Zweidimensionaler Gelelektrophorese von Gesamtzellproteinlysaten aus H. pylori isoliert wurde, keine Hinweise auf eine Serinphosphorylierung entdeckt werden. Es ist daher fraglich ob in vivo eine funktionell relevante Phosphorylierung stattfindet. Die Mechanismen zur Modulation der Regulator-Aktivität von HP1043 und HP1021 bleiben unklar. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass eine strikte Transkriptionskontrolle nicht für die Zellwachstums-assoziierten Funktionen von HP1021 von Bedeutung ist. Dagegen wurden Hinweise darauf erzielt, dass die Expression von HP1043 auf einem posttranskriptionellen und/oder auf einem posttranslationellen Level reguliert wird. Es waren bislang keine Zielgene von HP1021 bekannt. Durch vergleichende Zweidimensionale Gelelektrophorese der H. pylori Stämme 26695 und 26695 1021Δ konnten einige potentielle Zielgene des Response-Regulators HP1021 identifiziert werden. N2 - Bacteria need to react instantaneously on changes in their environment. For the sensing of environmental changes many different signaltransduction-systems have been evolved and the most widespread and well-characterised mechanism for signal transduction among the bacteria are the so called two-component systems. The genome of Helicobacter pylori encodes only a few proteins which are part of a two-component system. In addition to the chemotaxis-system there are just three histidine kinases, ArsS (HP0165), CrdS (HP1364) and HP0244, and five response regulators HP1021, HP1043, ArsR (HP0166), CrdR (HP1365) and HP0703, which are probably involved in transcriptional regulation (Alm et al., 1999; Tomb et al., 1997). Interestingly two of the response regulators, HP1043 and ArsR (HP0166) proved to be essential for the survival of H. pylori, while the response regulator HP1021 has a distinct influence on the cell-growth, as indicated by a severe growth defect when hp1021 is deleted (Beier & Frank, 2000; McDaniel et al., 2001; Schär, 2001). Under standard growth-conditions, the deletion of arsS (hp0165), encoding the cognate histidine kinase of ArsR (HP0166), has no effect on the cell-growth of H. pylori. This observation argues for the hypothesis that the response regulator ArsR (HP0166) controls the transcription of two different sets of target-genes. Upon acid-induced phosphorylation via ArsS (HP0165), the response regulator ArsR (HP0166) regulates the transcription of genes which are involved in acid resistance mechanisms, while in an unphosphorylated state ArsR (HP0166) controls other target genes, of which at least one is essential for cell-growth. The regulon controlled by ArsR~P (HP0166~P) has been extensively studied (Dietz, 2002; Forsyth et al., 2002; Pflock et al., 2004; Pflock et al., 2006; Pflock et al., 2005), while target genes of the unphosphorylated response regulator are so far unknown. In this work this hypothesis could be proven. It was shown that a derivative of ArsR (HP0166), with a mutation of the phosphorylation site D52 to N52, is able to substitute the wildtype protein functionally with respect to cell-growth. In the case of the response regulators HP1021 and HP1043 no cognate histidine kinases have been identified so far (Beier & Frank, 2000). Interestingly the receiver domains of the response regulators differ from the consensus sequence at highly conserved aminoacid residues. To investigate the importance of the atypical primary sequences for the function of HP1021 and HP1043, mutated H. pylori strains expressing exclusively derivatives of HP1021 or HP1043 with receiver sequences matching the consensus sequence were constructed. As these mutants did not show differences in cell-growth in comparison to the wildtype strain, it was proven that the atypical receiver sequences are not crucial for cell growth. Furthermore, indications could be found that HP1021 and HP1043 presumably differ from the common two component paradigm regarding their activation. Derivatives of HP1021 and HP1043 with mutations in their putative phosphorylation sites could functionally complement their wildtype counterparts with regards to cell growth. Therefore the phosphorylation of the receiver domain of these response regulators is not a pre-requisite for normal cell growth of H. pylori. In line with this hypothesis it could be demonstrated that there is no in vitro phosphorylation of the receiver domain of HP1021 and HP1043 with radioactive labelled acetylphosphate and that a H. pylori strain which a deletion of the genes pta and ackA, encoding proteins involved in the synthesis of acetylphosphate in the cell, showed a normal growth-phenotype. Moreover, when the protein HP1021, which was isolated by two-dimensional gelelectrophoreses, was analysed by mass spectrometry no evidence of a serine phosphorylation was obtained. Aditionally the observation that deletion of hp1043 can be complemented by the C. jejuni ortholog cj0355 encoding a response regulator protein with an asparagine residue replacing the consensus phosphate-accepting aspatic acid residue supports this hypothesis. Therefore it is questionable whether in vivo there is a phosphorylation which is functional relevant at all at the receiver domain. The mechanisms by which the activity of the Response-Regulators HP1021 and HP1043 is modulated still remain unclear. Here it could be demonstrated that strict transcriptional control of its expression is not relevant for the cell-growth associated function of HP1021. In contrast there are hints that the expression of HP1043 is controlled on a post-transcriptional and/or a post-translational level. Up to now no target genes of HP1021 were known. Using comperative two-dimensional gelelectrophoresis some potential target genes have been identified, among others HP0695, FadA and the Catalase. KW - Helicobacter pylori KW - Signaltransduktion KW - Genregulation KW - Response-Regulator KW - Helicobacter pylori KW - Zwei-Komponentensystem KW - essentiell KW - orphan KW - response regulator KW - Helicobacter pylori KW - two component system KW - essential KW - orphan Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21855 ER - TY - THES A1 - Zavala Góngora, Ricardo T1 - Isolierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von TGF-Beta-Signaltransduktionskomponenten des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis T1 - Structural and functional characterization of TGFß signaling systems in Echinococcus multilocularis N2 - Die molekularen Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion bei der durch den Zestoden Echinococcus multilocularis ausgelösten Erkrankung der alveolären Echinokokkose sind bislang ungeklärt. Zudem liegen keine Daten über Entwicklungs- und Differenzierungsmechanismen dieses Parasiten vor, die für die Entwicklung neuer Antiparasitika genutzt werden könnten. Ein bei der Evolution der Metazoen bereits frühzeitig entstandener Signaltransduktionsmechanismus zur Steuerung von Entwicklungsvorgängen ist das TGFβ/BMP-System, das aus strukturell verwandten Zytokinen der TGFβ (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, oberflächenständigen Rezeptoren der TGFβ-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) und intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie besteht. Außer an Entwicklungsvorgängen tierischer Organismen könnte diesem System eine wichtige Rolle bei der Wirt-Helminth-Kommunikation während Infektionsprozessen zukommen, wie in vorherigen Studien am Nematoden Brugia malayi und am Trematoden Schistosoma mansoni gezeigt werden konnte. Erste, wichtige Schritte zur Charakterisierung von TGFβ und BMP-Signalsystemen in Zestoden wurden in der vorliegenden Arbeit getan. Aufbauend auf einem vorherigen Bericht zu einem Transmembranrezeptor (EmRSK1) und einem Smad-Homologen (EmSmadA) aus Echinococcus multilocularis wurde die Liste der TGFβ/BMP Signaltransduktionsfaktoren in E. multilocularis in dieser Arbeit deutlich erweitert und erstmals umfangreiche funktionelle Studien durchgeführt. Die hier charakterisierten Faktoren umfassen zwei weitere Serin/Threonin-Kinasen der TGFβ/BMP-Rezeptorfamilie (EmRSK2, EmRSK3) sowie intrazelluläre Transduktoren der R-Smad-Subfamilie (EmSmadB, EmSmadC) und ein Homologes zur MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), genannt EmTAK1. Zudem konnte erstmals für einen parasitären Helminthen ein Zytokin der BMP-Subfamilie, EmBMP, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen legen nahe, dass E. multilocularis sowohl ein TGFβ wie auch ein BMP-Signalsystem exprimiert. Ersteres wird sehr wahrscheinlich durch die Kinase EmRSK2 und den Smad-Faktor EmSmadC gebildet, letzteres durch EmRSK1 und EmSmadB. EmSmadA nimmt eine Sonderstellung ein, da es sowohl durch TGFβ- wie auch durch BMP-Rezeptoren aktiviert werden kann. Die genaue Rolle von EmRSK1 und EmTAK1 wäre durch weitere Untersuchungen zu klären. Signifikante funktionelle Homologien zwischen den TGFβ/BMP-Signalsystemen des Parasiten und Säugern konnten nachgewiesen werden, die sich u.a. darin äußern, dass die Echinococcus Smad-Proteine durch entsprechende Rezeptoren des Menschen aktiviert werden können. Darüber hinaus konnten jedoch auch einige deutliche Unterschiede zwischen den Systemen aus Parasit und Wirt nachgewiesen werden, die sich als Angriffspunkte zur Entwicklung von Chemotherapeutika eignen könnten. So fehlt den Smad-Faktoren EmSmadA und EmSmadC eine MH1-Domäne, die sonst unter allen R-Smads hoch konserviert ist. Zudem sind einige bislang noch nie beschriebene, strukturelle Besonderheiten der Echinococcus TGFβ/BMP-Rezeptoren zu verzeichnen. Auch die Regulation dieser Faktoren und die Kreuz-Interaktion mit weiteren intrazellulären Signalwegen (z.B. der MAP Kinase Kaskade) scheint in E. multilocularis anders zu verlaufen als bislang für Vertebraten, Insekten oder Nematoden beschrieben. Schließlich konnte, als sehr wichtiger Befund, auch nachgewiesen werden dass mindestens ein Rezeptor des Parasiten, EmRSK1, mit einem Zytokin des Wirts (BMP2) in vitro funktionell interagiert. Da BMP2 in Zellkultursystemen, die das Wachstum des Parasiten am befallenen Wirtsorgan nachstellen, einen deutlichen Effekt auf E. multilocularis ausübt, könnte die hier beschriebene EmRSK1/BMP2 – Interaktion von entscheidender Bedeutung für die Wirt-Parasit-Interaktion bei der alveolären Echinokokkose sein. N2 - Up to now, the molecular mechanisms of the interactions between host and parasite in the disease of alveolar echinococcosis, caused by the cestode Echinococcus multilocularis, are not understood. Furthermore there are not data available about the mechanisms of development and differentiation in this parasite that could be used for the design of novel antiinfectives. One of the signaling systems which emerged very early in metazoan evolution and which presumably controls developmental processes in all animals is the TGFβ signal transduction system. This system consists of various factors: structurally related cytokines of the TGFβ (transforming growth factor β) and the BMP (bone morphogenetic protein) family, surface associated receptors of the TGFβ receptor family (type I and type II) and intracellular signal transduction factors of the Smad family. In addition to their crucial role in animal development, TGFβ/BMP systems could also play an important role in the communication between host and helminths during an infection, as has been shown previous studies on the nematode Brugia malayi and the trematode Schistosoma mansoni. In this study, the initial steps towards a characterization of TGFβ/BMP signaling in the third large group of parasitic helminths, the cestodes, have been made. Adding to a previous report on a transmembrane receptor (EmRSK1) and a Smad homologue (EmSmadA) from E. multilocularis, this work significantly extends the list of known TGFβ/BMP signaling factors from Echinococcus and provides, for the first time, functional studies on these systems. The newly characterized factors comprise two further serin/threonin kinases of the TGFβ/BMP receptor family (EmRSK2, EmRSK3), two further intracellular transducing factors belonging to the subfamiliy of R-smads (EmSmadB, EmSmadC) and one homologue of the MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), which was designated EmTAK1. Furthermore, and for the first time in a parasitic helminth, a cytokine of the BMP subfamily was characterized on the molecular level. Structural and functional studies suggested that E. multilocularis expresses both a TGFβ and a BMP signaling system. The kinase EmRSK2 and the Smad factor EmSmadC are most probably components of the first, EmRSK1 and EmSmadB parts of the latter system. Surprisingly, EmSmadA seems to constitute an unusual Smad since it can be activated by both TGFβ and the BMP receptors upon expression in mammalian cells. The precise roles of EmRSK3 and EmTAK1 have to be determined in future studies. In the present work, significant structural and functional homologies between the TGFβ/BMP systems of E. multilocularis and its mammalian hosts have been detected. Upon expression in human cells, the Echinococcus Smad proteins were, for example, able to functionally interact with the corresponding receptors from Homo sapiens. On the other hand, the E. multilocularis TGFβ/BMP signaling factors also displayed several biochemical differences to those of the host, which could be exploited for the development of antiparasitic drugs. One of these differences is the lack of a usually conserved MH1 domain in EmSmadA and EmSmadC. Moreover, the Echinococcus TGFβ/BMP receptors display several structural features which have not yet been detected in other members of the protein superfamily. Likewise, the regulation of TGFβ/BMP pathways in Echinococcus as well as their cross-interaction with other signaling pathways (e.g. the MAP kinase cascade) seems to differ from the situation in vertebrates, insects and nematodes. Finally, this work also provides evidence that at least one host cytokine, BMP-2, can functionally interact with a receptor of the parasite, EmRSK1. This interaction could be highly relevant for host-parasite interaction mechanisms in alveolar echinococcosis since BMP-2 also exerts clear effects on Echinococcus growth and differentiation in an in vitro cultivation system that mimicks the situation at the affected organ during an infection. KW - Fuchsbandwurm KW - Ontogenie KW - Signaltransduktion KW - Echinococcus KW - TGFß KW - BMP KW - Smad KW - Zestode KW - Echinococcus KW - TGFß KW - BMP KW - Smad KW - cestode Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17755 ER - TY - THES A1 - Kumar, Andreas T1 - Expression und Aufreinigung von intrazellulären Anteilen des Interleukin-4-Rezeptors als GST-Fusionsproteine und Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen T1 - Expression and Purification of Intracellular Parts of the Interleukin-4-Receptor as GST-Fusion-Proteins and Detection of Protein-Protein-Interactions N2 - In dieser Doktorarbeit wurden zwei intrazelluläre Anteile des IL-4 Rezeptors als GST-Fusionsproteine exprimiert. GST-E1, in dem das cytoplasmatische membranproximale 1/3 von IL-4Ralpha (173 AS) einschließlich des Box 1 Motivs an GST fusioniert ist, konnte nach differenzierter De- und Renaturierung und Bindung an Glutathion-Sepharose Matrix in elektrophoretisch reiner Form aufgereinigt werden. GST-gammainP5D4, in dem die intrazelluläre Domäne von gamma c an GST gebunden vorliegt, konnte nur als heterogenes Gemisch mit 4 C-terminal verkürzten Fraktionen erhalten werden. Mit diesen rekombinanten Fusionsproteinen wurden Immunpräzipitationsversuche in Lysaten IL-4R-transfizierter Ba/F3 Zellen vor und nach Stimulation mit IL-4 durchgeführt. Für GST-E1 wurde eine Wechselwirkung mit Jak1 nachgewiesen, die dem bisherigen Kenntnisstand entspricht; für GST-ginP5D4 hingegen konnte eine Wechselwirkung mit Jak3 nicht gezeigt werden. Beide Proteine sind in der Lage, STAT5 zu präzipitieren; diese Bindung erscheint unabhängig von der IL-4 Stimulation der Zellen und läßt neue Spekulationen über den Mechanismus der Signaltransduktion durch STAT5 zu. Danach könnten nach den hier gewonnenen Informationen beide IL-4-Rezeptorketten jeweils ein STAT5 Molekül zur STAT5-Dimerisirerung nach Rezeptoraktivierung beitragen. Es ist somit gelungen, ein in-vitro-Modell zur Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen am IL-4 Rezeptor zu etablieren, welches für weitere Untersuchungen eingesetzt werden kann. N2 - Two intracellular parts of the interleukin-4-receptor were expressed as GST-fusion-proteins. GST-E1, which comprises the cytoplasmic membrane-proximal 1/3 of IL-4Ralpha (173 AS) including the box1-motif fused to GST, could be purified electrophoretically clean after differential denaturation and renaturation and specific binding to Glutathion-Sepharose Matrix. GSTgammainP5D4, which comprises the intracellular domain of gamma c fused to GST, could only be purified as a heterogenous mixture with 4 C-terminally truncated proteins. Immunoprecipitation experiments were performed in lysates of IL-4R transfected Ba/F3 cells before and after stimulation with IL-4. For GST-E1, an interaction with Jak1 was shown, reflecting the current state of knowledge; however, an interaction with Jak3 could not be shown for GSTgamma in P5D4. Both proteins are able tp precipitate STAT5; this binding appears independet of IL-4 stimulation of the cells and allows for new speculations on the signal transduction mechanism by STAT5. According to the information gained in this work, both IL-4-receptor chains could contribute one STAT5 molecule to STAT5 dimerisation after receptor activation. Therefore, the goal was achieved to establish an in-vitro-model for the detection of protein-protein interactions on the interleukin-4-receptor, which can be used for further investigations. KW - Interleukin-4 KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - GST-Fusionsprotein KW - Jak/ STAT KW - Interleukin-4 KW - receptor KW - signal transduction KW - GST fusion protein KW - Jak/ STAT Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5338 ER - TY - THES A1 - Stolzenberger, Sascha T1 - Spezifische Hemmung der allergieassoziierten Interleukin-4 Signaltransduktion N2 - Das Cytokin Interleukin-4 (IL-4) ist ein essentieller Faktor bei der Entstehung von Sofort-Typ Allergien. Die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor und die anschließende Phosphorylierung des IL-4 aktivierten Transkriptionsfaktors Stat6 ist ein Schlüsselereignis bei der allergischen Immunantwort. In der vorliegenden Arbeit werden Ergebnisse zur Hemmung der Stat6 vermittelten Signaltransduktion des IL-4 Rezeptors vorgestellt. Dazu wurde ein Vektorsystem etabliert, bei dem ein von dem Drosophila-Transkriptionsfaktor Antennapedia abgeleitetes 16 AS langes Peptid benutzt wird. Dieses Antennapediapeptid kann Plasmamembranen lebender Zellen energie- und rezeptorunabhängig durchqueren und dabei andere hydrophile Moleküle mittransportieren. Stat6 bindet über eine SH2 Domäne an phosphorylierte Reste von IL4Ra und bildet, nachdem es selbst phosphoryliert ist, mit anderen Stat6-Molekülen aktive Dimere. Ein aus der Stat6-Bindestelle des IL-4Ra abgeleitetes phosphoryliertes Peptid (Stat6BP) wurde mit Hilfe des Antennapediapeptids in verschiedene humane und murine Zellinien transportiert. Für Stat6BP konnte mit Hilfe von spezifischer Immunpräzipitation und Western-Blot gezeigt werden, dass es IL-4 induzierte Phosphorylierung und Aktivierung von Stat6 transient hemmen kann. Durch zusätzliche Applikation des Tyrosinphosphataseinhibitors Natriumpervanadat gelang es, die hemmende Wirkung von Stat6BP zu verlängern. Unter gleichen Bedingungen konnte auch gezeigt werden, dass Stat6BP spezifisch die Aktivierung von Stat6 hemmt, da die durch IL-4 oder IL-3 induzierte Phosphorylierung des eng verwandten Stat5 völlig unbeeinträchtigt bleibt. Ferner wurde durch das Peptid die Expression eines Stat6 kontrollierten Reportergens gehemmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde außerdem die Rolle der Src-Typ Kinasen p56lck und p59fyn in der IL-4 Signaltransduktion in unterschiedlichen T-Zellinien untersucht. Es zeigte sich, dass die Aktivierung der beide Kinasen stark von der getesteten Zellinie abhängt. In einigen T-Zellinien aktiviert IL-4 eher p56lck, in anderen eher p59fyn. N2 - Interleukin-4 (IL-4) is the major factor in the development of allergic diseases like hay fever or asthma. The most important cytoplasmic event following stimulation with IL-4 is the activation of the transcription factor Stat6 (signal transducer and activator of transcription 6). Stat6 binds via a single SH2 domain first to tyrosine-phosphorylated motifs in the IL-4Ra-chain, and then to another Stat6 molecule, which results in the formation of active dimers. Since Stat6 is exclusively used by the IL-4 receptor, it is a promising approach to specifically disrupt IL-4 signal- transduction by inhibiting Stat6 activation. A vector system was established for the delivery of hydrophilic agents into living cells. To this purpose, a 16 amino acid membrane-permeable peptide derived from the Drosophila transcription factor Antennapedia was used. The Antennapedia peptide has been shown to internalize into living cell in a receptor- and energy-independent manner. In this thesis it is shown that a peptide derived from the Stat6-binding region of IL-4Ra (Stat6BP) is an effective inhibitor when it is delivered into cells by coupling with the Antennapedia peptide. Stat6BP completely inhibited IL-4 dependent phosphorylation of Stat6 in different human and murine cell lines, while IL-3 and IL-4 dependent phosphorylation of Stat5 was not affected. The inhibitory effect of Stat6BP was transient, but could be prolonged by treating the cells with the phospatase inhibitor sodium pervanadate. Transcription from a reporter gene construct with a Stat6-dependent promoter was inhibited by Stat6BP as well, indicating that the peptide is a suitable inhibitor for cellular responses downstream from Stat6 phosphorylation. Another aim of this study was to investigate the role of the src-kinases p56lck and p59fyn in IL-4 signaltransduction. The results indicate, that the activation of both kinases is celline dependent. In some T-cellines p56lck was activated dominantly, in others p59fyn. KW - Interleukin 4 KW - Allergie KW - Signaltransduktion KW - Molekularbiologie KW - IL-4 KW - Interleukin-4 KW - Allergie KW - Peptide KW - STAT6 KW - Signaltransduktion KW - IL-4 KW - Interleukin-4 KW - Allergy KW - Peptid KW - Stat6 KW - Signaltransduction Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2375 ER - TY - THES A1 - Bausenwein, Burkhard T1 - Funktionelle Charakterisierung von Daughter of Sevenless T1 - Functional characterisation of Daughter of Sevenless N2 - Ein Weg, der von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen benutzt wird um Signale auf "downstream" gelegene Effektormoleküle zu übertragen, erfolgt über Adaptorproteine, die Bindungsstellen für verschiedene Proteine zur Verfügung stellen. Das daughter of sevenless (dos) Gen wurde in einem Screen nach Downstream-Komponenten der Sevenless (Sev) Rezeptor-Tyrosin-Kinase gefunden. Dos besitzt eine N-terminale PH-Domäne und mehrere Tyrosinreste in Konsensussequenzen für SH2-Domänen Bindungsstellen von verschiedenen Proteinen. Die strukturellen Merkmale von Dos und Experimente, die zeigten, daß Tyrosine im Dos Protein nach der Aktivierung von Sev phosphoryliert werden, legen den Schluß nahe, daß Dos zur Familie der Multi-Adaptor-Proteine gehört. Zu dieser Familie werden die Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) Proteine, Gab1 und Gab2 gerechnet. In dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Maus anti-Dos Antikörper etabliert. Das Epitop dieses Antikörpers liegt im Bereich der C-terminalen 416 Aminosäuren des Dos Proteins. Mittels Westernblot Analysen wurde für Dos ein Molekulargewicht von 115 kD ermittelt. Antikörperfärbungen von wildtypischen Augenimaginalscheiben dritter Larven zeigten, daß das Dos Protein in Zellen in und posterior der morphogenetischen Furche exprimiert wird und in diesen Zellen apikal lokalisiert ist. Zur Charakterisierung des homozygot letalen dosR31 Allels, wurde der genomische Bereich sequenziert und die erhaltenen Daten mit der cDNA Sequenz verglichen. Die so etablierte Aminosäuresequenz für das DosR31 Protein hat sechs Aminosäuresubstitutionen, die möglicherweise die Tertiärstruktur beeinflussen. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Position 463 der Aminosäuresequenz gefunden. Bei dosR31 handelt es sich um ein "loss of function" Allel, das nicht in der Lage ist, die normale Dos Funktion zu erfüllen. Um die funktionelle Rolle der potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für die Dos Funktion in der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen vermittelten Signaltransduktion zu untersuchen, wurden mutierte dos Transgene in Fliegen exprimiert. Die potentiellen Bindungsstellen für die SH2-Domänen des SH2/SH3 Adaptorproteins Shc, der PhospholipaseC-g (PLCg), der regulatorische Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3Kinase) und der Corkscrew (Csw) Tyrosin Phosphatase wurden durch den Austausch des für die Bindung wichtigen Tyrosins gegen ein Phenylalanin mutiert. Die ektopische Expression der mutierten Konstrukte ohne Bindungsstellen für die Shc, PLCg und PI3Kinasen SH2-Domänen konnte in Abwesenheit von endogenem Dos die fehlende Dos Funktion während der Entwicklung vollständig ersetzen. Im Gegensatz dazu ist das Tyrosin 801 als nachgewiesene Bindungsstelle für Csw SH2-Domänen essentiell für die Funktion von Dos. Ektopische Expression von Transgene durch Hitzeschock kann zu phänotypischen Effekten führen, die nicht auf das Transgen zurückzuführen sind. Um dieses Problem zu umgehen wurde das endogene dos Enhancer/Promotor Element kloniert, damit die Funktion von mutierten Transgenen auch im endogenen Expressionsmuster untersucht werden konnte. Das klonierte genE-dos Minigen war in der Lage, den Verlust von endogenem Dos in dosR31 und dosP115 Tieren vollständig zu ersetzen und zeigte eine völlig wildtypische Expression in Augenimaginalscheiben. Zur Untersuchung, welche Rolle die mutierten SH2-Domänen Bindungsstellen bei der Dos Funktion in der Augenentwicklung spielen, wurde ein neues in vivo Testsystem basierend auf der Flp/FRT Flipase Rekombinase Technik etabliert. Dieses klonale Testsystem erlaubt die Expression mutierter Transgene unter der Kontrolle der dos Enhancer/Promotor Sequenzen in Klonen von Zellen, denen die endogene Dos Funktion fehlt. Die klonale Analyse der mutierten Konstrukte konnte zeigen, daß das Tyrosin 801, als Bindungsstelle für eine Csw SH2-Domäne, eine essentielle Rolle für die Dos Funktion spielt. Die Tyrosinreste in den potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für Shc, PLCg und PI3Kinase spielen hingegen keine essentielle Rolle für die Dos Funktion bei der Augenentwicklung. Das etablierte klonale Testsystem kann allgemein zur Untersuchung der in vivo Funktion von potentiellen Protein-Protein Interaktionsregionen im Dos Protein bei der Augenentwicklung eingesetzt werden unabhängig von deren Erfordernis für andere Entwicklungsprozesse. N2 - One mechanism used by receptor tyrosine kinases to relay a signal to different downstream effector molecules is to use adaptor proteins that provide docking sites for a variety of proteins. The daughter of sevenless (dos) gene was isolated in a genetic screen for components acting downstream of the Sevenless (Sev) receptor tyrosine kinase. Dos contains a N-terminally located PH domain and several tyrosine residues within consensus binding sites for a number of SH2 domain containing proteins. The structural features of Dos and experiments demonstrating tyrosine phosphorylation of Dos upon Sev activation suggested that Dos belongs to the family of multisite adaptor proteins that include the Insulin Receptor Substrate (IRS) proteins, Gab1, and Gab2. In this work, a monoclonal mouse anti-Dos antibody was generated. The epitope of this antibody lies within the C-terminal 416 amino acids of the Dos Protein. Western Blot analyses of the Dos protein revealed a molecular mass of 115 kD. The staining of eye imaginal discs from wildtype third instar larvae with the monoclonal antibody showed that the Dos protein is expressed in cells in and posterior to the morphogenetic furrow. In this cells Dos localizes to the apical region. For the molecular characterisation of the homozygous lethal dosR31 allele, genomic sequence analysis were performed and the sequences compared to the dos cDNA sequence. The established amino acid sequence of the DosR31 protein showed six amino acid substitutions that potentially influence the tertiary structure of the protein. In addition, a stop codon in position 463 of the amino acid sequence was found. These results confirm that dosR31 is a loss-of-function allele which does not provide normal Dos function. To study the functional requirements of the potential SH2 domain binding sites for the Dos function in receptor tyrosine kinase mediated signaling processes, mutated dos transgenes were expressed in flies. The putative binding sites for the SH2 domains of the SH2/SH3 adaptor protein Shc, PhospholipaseC-g (PLCg), the regulatory subunit of Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3kinase) and the Corkscrew (Csw) tyrosine phosphatase were mutated by changing the invariant tyrosine within the consensus sites into phenylalanine. Ectopic expression of the mutated constructs lacking the binding sites for the Shc, PLCg, and PI3kinase SH2 domains can substitute the loss of endogenous Dos function during development. In contrast, tyrosine 801, corresponding to a Corkscrew (Csw) SH2 domain binding site, is essential for Dos function. Ectopic expression of transgenes upon heat shock induction may lead to phenotypic effects not caused by the transgene. To circumvent this problem, the endogenous dos enhancer/promotor element was cloned to study the function of the mutated transgenes expressed in a wildtype pattern. The cloned genE-dos minigene was able to fully substitute the loss of endogenous Dos function in dosR31 and dosP115 animals and shows wildtype like expression in eye imaginal discs. To study the role of the mutated SH2 domain binding sites for Dos function in eye development, a new in vivo test system based on the Flp/FRT flipase recombinase system was established. This clonal assay system allows the expression of the mutated transgenes under the control of the dos enhancer/promotor in clones of cells lacking endogenous Dos function. Expression of mutated transgenes in clones of cells lacking endogenous Dos function provided evidence that tyrosine residue Y801 that has been shown to bind a Csw SH2 domain is critical for Dos function. The tyrosine residues within the potential SH2 domain binding sites for Shc, PLCg and PI3kinase do not play an essential role for the Dos function during eye development. The established clonal test system is of general use for assaying the in vivo function of putative protein-protein interaction regions within the Dos protein for eye development irrespective of their requirement in other developmental processes. KW - Taufliege KW - Auge KW - Ontogenie KW - Signaltransduktion KW - Genregulation KW - Daughter of Sevenless KW - Multi-Adaptor-Protein KW - PH-Domäne KW - SH2-Domänen Bindungsstelle KW - Rezeptor-Tyrosin-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Daughter of Sevenless KW - multi-adaptor-protein KW - PH-domain KW - SH2-domain binding site KW - receptor tyrosin kinase KW - signal transduction Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-814 ER -