TY - THES A1 - Langer, Manuel T1 - Analyse der Instabilität und Funktionalität des Anti-Apoptose-Proteins A1 T1 - Analysis of instability and function of the anti- apoptotic protein A1 N2 - Apoptose ist eine bestimmte Art des programmierten Zelltods. Dieser Prozess erfüllt zahlreiche wichtige physiologische Funktionen. Eine pathologische Dysregulation der Apoptose ist an der Entstehung etlicher Krankheiten beteiligt. Bei der Regulation der Apoptose nehmen die Bcl-2-Familienmitglieder und damit auch das anti-apoptotisches Familienmitglied A1 eine wichtige Stellung ein. Die Stabilität und anti-apoptotische Funktion von A1 wird über den Ubiquitin-Proteasomen-Weg reguliert. Hierbei ist das C-terminale Ende von A1 essentiell. Ausgangspunkt für diese Arbeit war die Hypothese, dass an den C-Terminus von A1 eine bisher unbekannte Ubiquitin-E3-Ligase bindet, verzweigte Ubiquitinketten an Lysinreste des A1-Proteins konjugiert und das Protein dadurch für den proteasomalen Abbau markiert. Durch Mutationen einzelner Lysinreste von A1 sollte untersucht werden, welche dieser Aminosäuren ubiquitinyliert werden. Damit sollte der molekulare Mechanismus, der hinter der Instabilität und der anti-apoptotischen Funktion steckt, weiter charakterisiert werden. In dieser Arbeit wurden insgesamt 11 Mutanten des A1-Proteins hergestellt, bei denen die 11 Lysinreste von A1 gruppenweise zu Argininresten (K-A1-Mutanten) ausge-tauscht wurden. Der Austausch von Lysin zu Arginin wurde gewählt, weil hierdurch die Ladung an der entsprechenden Position des Proteins gleich bleibt, während eine Konjugation von Ubiquitin an Arginin nicht möglich ist. Im Ergebnis zeigte sich, dass das A1-Protein nicht nur an einzelnen, ganz spezifischen Lysinen, sondern an allen oder doch zumindest den meisten seiner 11 Lysine ubiquitinyliert werden kann, denn es ergaben sich bei den K-A1-Mutanten keine signifikanten Unterschiede in Stärke oder Muster ihrer Ubiquitinylierung. Es müssen also nicht einige wenige Lysine notwendigerweise ubiquitinyliert werden, um A1 zu destabilisieren, sondern die Ubiquitinylierung ganz unterschiedlicher Lysine markiert das Protein für den proteasomalen Abbau. Auch hat der Verlust bestimmter Lysingruppen und damit potentieller Ubiquitinylierungsstellen keinen signifikanten Einfluss auf die anti-apoptotische Funktion des A1-Proteins. Zusammengefasst unterstützen die Ergebnisse die Hypothese, dass eine bisher nicht bekannte Ubiquitin-E3-Ligase sowohl die Stabilität als auch die anti-apoptotische Funktion von A1 reguliert, indem sie verzweigte Ubiquitinketten an (fast) alle Lysine des Protein anhängt und das Protein damit für den proteasomalen Abbau markiert. N2 - Apoptosis is a certain kind of programmed cell death and plays an important role in many physiological processes. Pathological dysregulation of apoptosis is involved in the development of a number of diseases. The Bcl-2 family members and with it the anti-apoptotic family member A1 are important regulators of apoptosis by regulating the integrity of the mitochondria. A1 is a very unstable protein, its stability is regulated by the ubiquitin/proteasome pathway. Based on published work, the hypothesis was set up, that a so far unknown ubiquitin-E3-ligase binds to the C-terminal end of A1, attaches ubiquitin chains to lysine residues and thereby marks the protein for proteasomal degradation. The ubiquitinylation and the molecular mechanisms behind the instability and the anti-apoptotic capacity of A1 should be further characterized by mutating the lysine residues of the protein. For this paper altogether 11 mutants of the A1 protein were cloned. The 11 lysine residues of A1 were replaced in groups with arginine residues (K-A1 mutants). Arginine was chosen to keep the charge at that position in the protein but to inhibit ubiquitylation at this position. The experiments indicate that all or at least most of the lysine residues of the A1 protein can be ubiquitinylated, because no significant differences in ubiquitinylation of the K-A1 mutants compared to A1 wildtype protein could be observed. Thus, no specific lysine residues have to be necessarily ubiquitinylated to destabilize the A1 protein, but ubiquitinylation of different lysine residues can mark the protein for proteasomal degradation. Furthermore, the loss of certain lysines showed no significant influence on the anti-apoptotic capacity of A1. Altogether, the results support the hypothesis, that a so far unknown ubiquitin-E3-ligase attaches ubiquitin to most if not all lysine residues and thereby regulates the stability and the anti-apoptotic capacity of the protein. KW - Apoptosis KW - Ubiquitin-Protein-Ligase KW - Apoptose KW - anti- apoptotisches Bcl-2 Familienmitglied A1 KW - Ubiquitin- Proteasomen- Weg KW - apoptosis KW - anti- apoptotic Bcl-2 family member A1 KW - ubiquitin- proteasome- pathway Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-50119 ER - TY - THES A1 - Thümer, Leonore T1 - Charakterisierung eines Foamyvirus-Isolats des Klammeraffens - SFVspm - aus der Neuen Welt T1 - Characterisation of a foamy virus isolate of the spider monkey - SFVspm - from the New World N2 - Foamyviren gehören zur Familie der Retroviren und sind in vielen verschiedenen Primaten-Spezies prävalent. Auch einzelne Foamyvirus-Infektionen des Menschen sind nach engem Kontakt zu Primaten beschrieben worden. Untersuchungen auf molekularer Ebene lagen bisher nur für Foamyviren der Altweltaffen vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die komplette Nukleotidsequenz des Neuweltaffen-Foamyvirus des Klammeraffens (SFVspm) entschlüsselt und molekular charakterisiert. DNA wurde aus SFVspm infizierten Zellen isoliert. Ausgehend von einem 425 bp langen bekannten Abschnitt des Integrase-Gens wurde das foamyvirale Genom mithilfe der Polymerasekettenreaktion in fünf Abschnitten amplifiziert. Die Primer wurden anhand konservierter Sequenzen im SFV-Genom generiert. Die Genomabschnitte des 5’-Endes bis zum Integrase-Gen von SFVspm wurden in Plasmidvektoren kloniert und anschließend sequenziert, die Genomabschnitte vom Integrase-Gen zum 3’-Ende wurden direkt nach der PCR-Amplifikation sequenziert. Die Sequenzen der einzelnen SFVspm-Fragmente wurden zu einem zusammenhängenden Genom zusammengesetzt, wobei die Consensus-Sequenz aus mindestens drei unabhängigen Sequenzierungen pro Nukleotid ermittelt wurde. Anhand von Homologie-Vergleichen konnte das SFVspm mit einer Größe von 12212 bp als komplexes Retrovirus der Unterfamilie der Spumaretrovirinae identifiziert werden. Es besitzt alle konservierten Protein-Domainen, die charakteristisch für Primaten-Foamyviren sind. SFVspm stellt somit das erste vollständig sequenzierte und molekulargenetisch charakterisierte Neuweltaffen-FV dar. Zur Entwicklung eines diagnostischen Tests zum Nachweis einer SFVspm-Infektion wurde ein 765 bp langer Abschnitt des gag-Gens als Antigen exprimiert und ein Antikörper im Kaninchen-Serum generiert. In einem Western Blot zeigte sich für eine Detektion von SFVspm-Gag-Antigen bzw. Anti-SFVspm-Gag eine gute Spezifität und Sensitivität. Die auf Western Blot basierte Methodik wurde schließlich in Kombination mit einer PCR des Integrase-Gens zum Nachweis einer Infektion mit Neuweltaffen-Foamyvirus in Callithrix spp. angewandt. Es wurden Seren und Lymphozyten-DNA zwölf verschiedener Callithrix-Affen, sowie Gewebeproben aus Milz, Leber und Mundschleimhaut untersucht, wobei in keinem Tier eine SFV-Infektion nachgewiesen werden konnte. Da Foamyviren aufgrund ihrer genetischen Stabilität interessante Marker für phylogenetische Untersuchungen sind, wurden anhand der Kenntnis der Genomsequenz von SFVspm und fünf Altweltaffen-FV phylogenetische Stammbäume basierend auf Nukleotid- und Aminosäuresequenzen und der Maximum-Likelihood-Methode gezeichnet und SFVspm evolutionär eingeordnet. SFVspm zeigte sich als das evolutionär divergenteste Foamyvirus aus der Teilordnung der Primaten-Foamyviren. Dies spiegelt die phylogenetische Auftrennung ihrer Wirte, der Altweltaffen und Neuweltaffen, wider und bekräftigt eine gemeinsame Evolution von Foamyviren und ihren Wirten. N2 - Foamy viruses belong to the family of retroviruses and have been described to be prevalent in a wide variety of primates species with each species harboring a unique specific strain of SFV. Foamyvirus infections have also been described in humans who were in close contact to primates. Up to now molecular analysis has only been reported for old world simian foamy viruses. In this work the complete nucleotide sequence of the new world simian foamy virus from spider monkey (SFVspm) was determined and its molecular structure characterised. DNA was isolated from cells infected with SFVspm. Starting from a 425 bp long known region of the integrase gene, the foamy viral genome was amplified with polymerase chain reaction in five steps. Primers were designed according to relatively conserved regions in the genome of SFV. Genome fragments between the 5'LTR up to the integrase gene were cloned into plasmid vectors and their sequences were elucidated. The 3' end of the genome was determined by direct nucleotide sequencing of the PCR product. Genome assembly was based on at least three independently sequenced nucleotides and led to a SFVspm genome size of 12212 bp. Homology comparisons identifed the SFVspm genome as a complex retrovirus of the Spumaretrovirinae. It contains all conserved protein motifs described to be conserved among simian foamy viruses. SFVspm is the first completely sequenced and characterised new world simian foamy virus. A diagnostic test for the detection of SFVspm infection was developed. A 765 bp long fragment of the gag gene was used for the expression of antigen and a SFVspm Gag antibody was generated by the immunization of rabbits. SFVspm Gag antigen was detected with the sera containing anti-SFVspm Gag in Western Blot analysis with good specificity and sensitivity. Diagnostic tests based on Western Blot and PCR amplication of the integrase gene were performed for the detection of an infection with a New World simian foamy virus in Callithrix. Sera and DNA isolated from lymphocytes of 12 Callithrix, as well as tissue samples of spleen, liver and oral mucosa were tested, but no SFV infection could be detected. Because of their high genetic stability, foamy viruses can be taken as markers for phylogenetic analysis. Phylogenetic trees were created based on the nucleotide and amino acid sequences of SFVspm and five old world simian foamy viruses. SFVspm is the most divergent primate foamy virus known to date. This reflects the long-term phylogenetic separation of old world and new world primate host species– and confirms a co-evolution of foamy viruses and their hosts. KW - Foamyviren KW - Retroviren KW - Neuweltaffen KW - Klammeraffen KW - foamy virus KW - retrovirus KW - new world monkeys KW - spider monkey Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48942 ER - TY - THES A1 - Meisner, Falko T1 - Die Rolle von Dopamin in der Pathogenese der HIV-assoziierten Demenz T1 - The role of dopamine in the pathogenesis of HIV-associated dementia N2 - Die HIV-Infektion des Gehirns induzierte eine Vielzahl neurologischer und neuropsychiatrischer Veränderungen, die gemeinsam als HIV-assoziierte Demenz bezeichnet werden. Insbesondere eine Beteiligung der glutamate-vermittelten Toxizität wird im Rahmen der HIV-Demenz diskutiert. Die vorliegende Arbeit verwendete das wichtigste Tiermodell der HIV-Infektion, mit simianen Immundefizienzviren (SIV) infizierte Rhesusaffen, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Immunaktivierung und adaptiven Veränderungen der glutamatergen Synapse und ihrer Umgebung zu untersuchen. Mittels einer Microarrayanalyse wurden allgemein Unterscheide im Genexpressionsprofil der Basalganglien von Rhesusaffen während dem Fortschreiten der Infektion erfasst. Die Ergebnisse zeigten Unterschiede in der transkriptionalen Regulation zwischen Chinesischen und Indischen Makakkensubspezies, sowie ein einzigartig differenziertes Genexpressionsmuster als Antwort auf die SIV-Infektion selbst. Um adaptive Veränderungen in den funktionalen Elementen der glutamatergen Synapse weiter zu charakterisieren, wurde die Expression der N-methyl-D-aspartat-Rezeptoruntereinheiten gemessen, wobei ein progressiver Verlust der Untereinheitenexpression im Putamen sowie ein differenziellen Expressionsmuster in Abhängigkeit sowohl von der Makakkensubspezies sowie von der Hirnregion im Nucleus accumbens SIV-infizierter Rhesusaffen festgestellt wurde. Außerdem konnte die vorliegende Arbeite zum ersten Mal eine Störung der exzitatorischen Aminosäuretransporter, dem wichtigsten Glutamatwiederaufnahmesystem, im Putamen, aber nicht im Nucleus accumbens, während der SIV-Infektion nachweisen. Zuvor durchgeführte Arbeiten wiesen darauf hin, dass neurochemischen Dysfunktionen unter Umständen das Ergebnis einer indirekten Toxizität vermittelt durch aktivierte Mikroglia und der daraus resultierenden Ausschüttung schädlicher Faktoren sein könnten. Entsprechend zeigten unsere Daten einen Anstieg in der MHC-II- und TNF-alpha-Expression bereits während der asymptomatischen Phase, und eine noch deutlichere Heraufregulierung in AIDS-Tieren. Zusammenfassend weist die vorliegen Arbeit auf komplexe und kombinierte Mechanismen von einem Anstieg in der Glutamatkonzentration mit einer Dysregulation der NMDA-Rezeptorfunktion sowie der Glutamatwiederaufnahmesysteme verursacht durch eine Immunaktivierung hin. Außerdem konnte in Versuchen zur pharmakologischen Beeinflussung der glutamatergen Synapse mittels dopaminerger Substanzen, NMDAR-Antagonisten und Antioxidantien eine Verbesse-rung der neurochemischen Funktion durch den nichtkompetitiven Antagonisten Memantin und die Antioxidantien Melatonin sowie N-Acetylcystein gezeigt werden. Hingegen trugen die Ergebnisse mit dem MAO-B-Inhibitor Selegilin weiter zu Bedenken zur Sicherheit und Effizienz dopaminerger Substanzen in der Behandlung von HIV-Patienten bei. Außerdem zeigte die vorliegende Arbeit, dass Memantin spezifisch die mRNA- und Proteinexpression des Neurotrophins BNDF heraufregulierte und weist somit auf eine neuartige pharmakologische Wirkung Antidementivums hin. In einer ergänzenden Studie wurden Schritte zur Entwicklung und Verbesserung adeno-assoziierten viraler und foamyviraler Vektoren, die shRNAs für die effiziente Ausschaltung der Expression des murinen und humanen Dopamintransporters, durchgeführt. Es wurden verschieden virale Vektorplasmide kloniert, Effektormoleküle mit einer hohen Knockdown-Aktivität identifiziert, und infektiöse rekombinante Viren hergestellt. Zudem konnte die Expression des humanen Dopamintransporters auf Lymphozyten bestätigt werden. Diese Ergebnisse werden die Entwicklung transgener Tiere und Zelllinien erleichtern und tragen so zur Analyse der natürlichen dopaminergen Neurotransmission in der psychiatrischen Forschung bei, wobei die durch endogene Anpassungen der dopaminerge Systeme in klassischen Knockout-Systemen hervorgerufenen Schwierigkeiten umgangen werden können. N2 - HIV infection of the brain induces a wide range of neurological and neuropsychiatric symptoms colletively defined as HIV-associated dementia. In particular, glutamate-mediated toxicity is discussed to be involved in neurodysfunction during HIV dementia. The present thesis used the most relevant animal model for HIV infection, the simian immunodeficiency virus (SIV)-infected rhesus macaques, to explore the complex interaction between immuneactivation and adaptive alterations of the glutamatergic synapse and its environment. A microarray analyses was performed to asses general differences in gene expression pofiling in the basal ganglia of rhesus macaques during diseases progression. The results showed considerable differences in transcriptional regulation between Chinese and Indian macaque subspecies, as well as a uniques differential gene expression pattern in response to SIV infection itself. To further characterize adaptative changes in functional elements of the glutamatergic synapse we measured expression of N-methyl-D-aspartate receptor subunits and found a progressive loss of subunit expression in putamen as well as a differential expression pattern with respect to macaque subspecies and brain region in nucleus accumbens of SIV-infected monkey. In addition, the current thesis demonstrated for the first time a disruption of excitatory amino acid transporters, the most important glutamate clearing system, in putamen but not in nucleus accumbens during SIV-infection. Previous studies suggested that neurochemical dysfunction may be the result of indirect toxicity mediated by activated microglia and subsequent release of ditrimental factors. Accordingly, our data demonstrated an increase in MHC-II and TNF-alpha expression during the asymptomatic stage of infection which was further upregulated in AIDS animals. Taken together the present thesis points out to complex and combined mechanisms of an increase glutamate concentration with dysregulation of NMDA receptor function and glutamate clearing system caused by immuneactivation. In addition, experiments concerning pharmacological manipulation of the glutamatergic synapse by dopaminergic drugs, N-methyl-D-aspartate antagonists or antioxidant treatment revelead an improvement of neurochemical function by the uncompetitive NMDA antagonist memantine and by the antioxidants melatonin and N-acetylcysteine. In contrast, administration of the MAO-B inhibitor selegiline contributed to concerns about the saftey and efficiency of dopaminergic substances in treatment of HIV-patients. In addition, the current thesis demonstrated that memantine specifically upregulates mRNA and protein expression of the neurotrophic factor brain-derived neurotrophic factor, and therefore, refers to a novel pharmacological action of the antidementivum. In a complementary study we presented steps in the devolpment and improvement of adeno-associated viral and foamyviral vectors expressing short hairpin RNAs for an efficient knockdown of the murine and human dopamine transporter. We cloned different viral vector plasmids, identified effector molecues with high knockdown activity, and prepared infective recombinant viruses. In addition, we confirmed the expression of human dopamine transporter by lymphocytes. The results will facilitate the generation of transgenic animals and cell lines, and therefor contribute to the analysis of natural dopaminergic neurotransmission in psychiatric research overcoming the pitfalls of endogeneous adaptatations observerd in classical knockout technology. KW - HIV KW - HIV-Infektion KW - Demenz KW - NMDA-Rezeptor KW - Dopamin KW - Affenimmundefizienzvirus KW - Neurotoxizität KW - Neurodegeneration KW - Memantin KW - HIV-Demenz KW - neurodegeneration KW - mematine KW - HIV dementia Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46291 ER - TY - THES A1 - Hochgräfe, Katja T1 - Cre-loxP based mouse models to study prionpathogenesis in the motor nervous system N2 - Prion diseases such as scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle or Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are fatal neurodegenerative disorders characterized by brain lesions and the accumulation of a disease-associated protein, designated PrPSc. How prions proceed to damage neurons and whether all or only subsets of neurons have to be affected for the onset of the clinical disease is still elusive. The manifestation of clinical prion disease is characterized by motor dysfunctions, dementia and death. Furthermore loss of motor neurons (MN) in the spinal cord is a constant finding in different mouse models of prion disease, suggesting that MN are vulnerable cells for triggering the onset of clinical symptoms. To determine whether the protection of MN against prion induced dysfunctions is an approach for holding the disease at the sub-clinical level, we established a novel conditional model for Cre-mediated expression of a dominant-negative PrP mutant (PrPQ167R) in the cells of interest. Dominant-negative PrP mutants provide protection of prion induced dysfunctions by inhibiting prion replication. Transgenic mice were generated carrying a floxed LacZ marker gene followed by the coding sequence of PrPQ167R under control of the human ubiquitin C promoter. Two Cre strains have been used to direct PrPQ167R expression either to a subset of MN of the spinal cord (Hb9-Cre) or to various neuronal cell populations of the spinal cord and brain (NF-L-Cre). Transgenic mice were infected with mouse-adapted prions via different inoculation routes (intranerval, intracerebral and intraperitoneal) and monitored for effects on incubation time and pathology. Tg floxed LacZ-PrPQ167R/NF-L-Cre mice showed about 15% prolonged survival upon intraperitoneal low dose prion infection, whereas survival of Tg floxed LacZ-PrPQ167R/Hb9-Cre mice was comparable to control littermates. The results suggest that the protection of spinal MN prolongs the incubation period but is not sufficient to completely inhibit clinical prion disease. In a second approach, Cre was transferred into the hind limb muscles of transgenic mice via a double-stranded adeno-associated virus vector (dsAAV2-Cre). The goal of this strategy was to target a broader cell population and thus to enhance expression levels of protective PrPQ167R in the spinal cord of Tg floxed-LacZ-PrPQ167R mice. After intramuscular (i.m.) application of dsAAV2-Cre, exhibiting a physical titer of 5x1010 GP/ml, recombinant transgenic DNA was detected only in the muscle tissue, pointing out that functional Cre-recombinase was expressed at the side of virus application. However, dsAAV2-Cre did neither induce recombination of transgenic DNA in the spinal cord or brain nor expression of dominant-negative PrPQ167R. In conclusion the dsAAV2-Cre vectors system needs further improvement to achieve efficient transport from muscle tissue to the central nervous system (CNS). 105 7 SUMMARY The lymphoreticular system (LRS) is an early site of prion replication. In splenic tissue prion infectivity is associated with follicular dendritic cells (FDC) as well as with Band T-lymphocytes. However, it is still unknown if those cell types are able to replicate the infectious agent or if other PrP-expressing cell types are engaged. To investigate if neurons and in particular MN are involved, transgenic mice carrying one allele of floxed Prnp (lox2+=��) and either one allele of Hb9-Cre or NF-L-Cre were generated on a Prnp0=0 background. Therefore a conditional PrP knockout was established in a subset of MN of the spinal cord (Hb9-Cre) or in various neuronal populations of the spinal cord and brain (NF-L-Cre). Transgenic mice were inoculated with prions to study the accumulation of PrPSc and prion infectivity in spleen and spinal cord at an early time point after infection. The findings show that PrPSc accumulation in mice with MN-specific PrP depletion (lox2+=��/ Hb9-Cre) was comparable to control littermates, while pan-neuronal PrP deficient mice (lox2+=��/NF-L-Cre) were not able to accumulate PrPSc in splenic tissue until 50 days post inoculation. Moreover spleens of lox2+=��/NF-L-Cre mice exhibited a clearly reduced prion infectivity titer, suggesting that accumulation of prions in the spleen is dependent on PrP expression in the nervous tissue. N2 - Prionenerkrankungen, wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind letale, neurodegenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Typische Merkmale der Erkrankung sind neben Neuronenverlust die Akkumulation des mit der Krankheit assoziierten Proteins PrPSc im Gehirn infizierter Individuen. Wie die Akkumulation von Prionen zu Neurodegeneration führt und welche Regionen des ZNS für die klinische Erkrankung verantwortlich sind, ist bisher unbekannt. Charakteristische, klinische Symptome von Prionenkrankheiten sind motorische Störungen sowie Demenz in einem späten Stadium der Erkrankung. Außerdem ist der Verlust von Motoneuronen (MN) im Rückenmark ein konstanter Befund im Tiermodell, was eine Rolle des motorischen Nervensystems bei der Prionpathogenese vermuten lässt. In dieser Arbeit sollte daher untersucht werden, ob der Schutz von MN vor Prionen induzierten Dysfunktionen den Ausbruch der klinischen Erkrankung verzögern kann. Dazu wurde ein konditionales Mausmodell mit Cre-induzierbarer Expression einer dom- inant-negativen PrP-Mutante (PrPQ167R) hergestellt. Dominant-negative PrP Mutanten schützen vor Prionen induzierten Schädigungen, indem sie die Replikation von Prionen inhibieren. Das Transgen besteht aus dem humanen Ubiquitin C Promoter, einem „gefloxten” LacZ Markergen und der kodierenden Sequenz von PrPQ167R. Die Kreuzung von Tg floxed LacZ-PrPQ167R Mäusen mit der Hb9-Cre Linie bewirkt eine MNspezifische Expression von PrPQ167R im Rückenmark, während das Einkreuzen eines NF-L-Cre Allels die Expression von PrPQ167R in den meisten Neuronen des Rückenmarks sowie in verschiedenen motorischen Kerngebieten des Gehirns zur Folge hat. Transgenen Mäuse wurden auf verschiedenen Routen (intranerval, intrazerebral und intraperitoneal) mit Maus-adaptierten Prionen infiziert und der Effekt von PrPQ167R auf die Inkubationszeit und Pathologie der Tiere untersucht. Während Tg floxed LacZPrP Q167R/NF-L-Cre Mäuse eine um 15% verlängerte Inkubationszeit aufwiesen, war bei Tg floxed LacZ-PrPQ167R/Hb9-Cre Mäusen kein Überlebensvorteil zu beobachten. Somit verlängert der Schutz von MN des Rückenmarks zwar die Inkubationszeit, ist aber nicht ausreichend, um den klinischen Ausbruch der Erkrankung zu verhindern. Um eine größere Zellpopulation im Rückenmark von Tg floxed LacZ-PrPQ167R Mäusen und so eine stärkere Expression von PrPQ167R zu erreichen, wurde ein viraler Gentransfer von Cre-Rekombinase durchgeführt. Dazu wurden doppelsträngige, Creexprimierende Adeno-assoziierte Virus Vektoren (dsAAV2-Cre) bilateral in die Muskulatur der Hinterbeine von Tg floxed LacZ-PrPQ167R Mäusen injiziert. Die Applikation von dsAAV2-Cre, mit einem physikalischen Virus-Titer von 5x1010 GP/ml, führte ausschließlich im Muskelgewebe zur Expression von enzymatisch aktiver Cre-Rekombinase und folglich zur Rekombination der transgenen DNA. Im Rücken- 107 8 ZUSAMMENFASSUNG mark oder Gehirn war keine rekombinante DNA detektierbar. Auch auf Protein-Ebene konnte die Expression von PrPQ167R weder im Muskel noch im Rückenmark oder Gehirn nachgewiesen werden. Um den Transport von dsAAV2-Cre vom Applikationsort bis in das ZNS zu gewährleisten und Cre stabil zu exprimieren, ist demnach eine weitere Optimierung des dsAAV2-Cre Vektorsystems notwendig. Prionen replizieren im lymphoretikulären System (LRS) bereits in einem frühen Stadium der Erkrankung. In der Milz ist Prionen-Infektiosität in follikulär dendritischen Zellen (FDC) sowie in B- und T-Lymphozyten lokalisiert. Ob noch andere PrP exprimierende Zellen an der Prionen-Replikation im LRS beteiligt sind, ist unklar. Um die Beteiligung von Neuronen und MN an der Akkumulation von Prionen im LRS zu untersuchen, wurden transgene, neuronal PrP defiziente Mäuse generiert. Ein Neuronen-spezifischer bzw. MN-spezifischer Knockout von PrP wurde durch Kreuzung von transgenen lox2+=�� Mäusen, welche ein „gefloxtes“ Prnp Allel Prnp auf einem Prnp0=0 Hintergrund tragen, mit NF-L-Cre oder Hb9-Cre Mäusen erreicht. Nach Prionen-Infektion von lox2+=��/NF-L-Cre und lox2+=��/Hb9-Cre Mäusen wurde die Akkumulation von PrPSc und Prionen-Infektiosität in der Milz und im Rückenmark am Tag 50 nach der Infektion analysiert. Während die Replikation von PrPSc in der Milz von Mäusen mit MN-spezifischem PrP Knockout (lox2+=��/Hb9-Cre) nicht beeinträchtigt war, war in pan-neuronal PrP defizienten Mäusen (lox2+=��/NF-L-Cre) keine Akkumulation von PrPSc nachweisbar. Zudem war die Prionen-Infektiosität in der Milz von lox2+=��/NF-L-Cre Mäusen deutlich reduziert. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Akkumulation von PrPSc und Prionen-Infektiosität in der Milz abhängig von neuronaler PrP Expression ist. KW - Prionkrankheit KW - Pathogenese KW - Maus KW - Motoneuron KW - Prion KW - pathogenesis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45967 ER - TY - THES A1 - Neske, Florian T1 - Entwicklung molekularbiologischer und serologischer Methoden zum Nachweis von Infektionen mit dem humanen Bocavirus und dem Polyomavirus WU T1 - Development of molecularbiological and serological detection methods of human Bocavirus and Polyomavirus WU N2 - Durch Viren ausgelöste Infektionen der Atemwege zählen zu den häufigsten Erkrankungen des Menschen. Durch molekularbiologische Verfahren konnten in den vergangen Jahren bis dahin unbekannte Viren in respiratorischen Proben nachgewiesen werden, darunter das humane Bocavirus (hBoV) in 2005 und das Polyomavirus WU (WUPyV) in 2007. In der vorliegenden Arbeit wurden qualitative und quantitative DNA-Nachweisverfahren für hBoV und WUPyV etabliert und validiert, um retrospektiv die Infektionshäufigkeit von hBoV und WUPyV bei hospitalisierten Kindern mit akuter respiratorischer Erkrankung (ARE) der Universitätskinderklinik Würzburg zu untersuchen. Zusätzlich wurden phylogenetische Untersuchungen dieser Viren durchgeführt. Zum Nachweis von Antikörpern gegen Kapsidproteine von hBoV und WUPyV wurde ein auf rekombinanten Baculoviren basierender Immunfluoreszenztest (IFT) etabliert. HBoV-DNA konnte in 12 % von 834 untersuchten Nasenrachensekreten (NRS) von Kindern mit ARE aus dem Zeitraum von Januar 02 – September 05 detektiert werden. Das mediane Alter der hBoV-positiven Kinder war 1,8 Jahre, die mediane hBoV-Last betrug 4,9 x 103 Kopien/ml. Bei einem großen Teil (39,1 %) der hBoV-DNA-positiven Kinder wurden Koinfektionen mit anderen respiratorischen Viren detektiert, was jedoch keine signifikante Auswirkung auf die nachgewiesene hBoV DNA Menge hatte. Kinder mit Bronchitis wiesen eine signifikant höhere Viruslast auf als Kinder mit Fieberkrämpfen. Im Rahmen einer Verlaufsstudie konnte hBoV-DNA bei einem Kind über einen Zeitraum von 4,5 Monaten in NRS nachgewiesen werden. Bei einem Teil der Kinder mit hBoV-DNA-positiven NRS wurden Serum- und Stuhlproben auf hBoV-DNA untersucht. In einer von 10 Serumproben und 14 von 31 Stuhlproben konnte BoV-DNA nachgewiesen werden. Dabei war die hBoV-DNA-Menge im NRS signifikant höher, wenn die Stuhlprobe ebenfalls positiv war. Die phylogenetische Analyse von hBoV bestätigte die vom Erstbeschreiber ermittelten Cluster (St1 und St2). Diese Cluster weisen eine hohen Identität zueinander auf, sowohl auf Nukleotid- (≥99,6 %) als auch auf Aminosäure (AS)-Ebene (≥99,9 %). Ein Zusammenhang zwischen den Clustern und klinischen oder virologischen Faktoren war nicht ersichtlich. Die Untersuchung auf IgG-Antikörper gegen hBoV-VP2 ergab bei gesunden Erwachsenen eine Seroprävalenz von 74 %. Ein Zusammenhang zwischen Alter und Seropositivität für hBoV-VP2 war nicht erkennbar. Die WUPyV-Untersuchungen wurden anhand von NRS durchgeführt, die im Zeitraum von Januar 02 – September 05 und Januar 07 – Juli 07 entnommen wurden. Dabei konnte WUPyV-DNA bei 5,2 % der Proben mit einer medianen Viruslast von 9,5x 102 Kopien/ml nachgewiesen werden. Das mediane Alter der WUPyV-infizierten Kinder betrug 3,0 Jahre. Bei 54,8 % der WUPyV positiven Kinder konnte eine Koinfektion mit einem anderen respiratorischen Virus festgestellt werden, wobei keine Korrelation zwischen Koinfektion und WUPyV-DNA-Menge ersichtlich wurde. Eine Assoziation zwischen der WUPyV-Last in NRS und klinischer Diagnose war nicht feststellbar. In 3 von 14 Serum- und 2 von 14 Stuhlproben von Kindern mit WUPyV-DNA-positivem NRS konnte WUPyV-DNA detektiert werden. Dabei war die WUPyV-Last im NRS von Kindern mit positivem Serum höher als bei Kindern mit negativem Serum. Durch die phylogenetischen Untersuchung von WUPyV konnten zwei Cluster mit hoher Nukleotid-Identität (≥99,2 %) ermittelt werden. Der Großteil (60,3 %) der Substitutionen war nicht synonym, was zu einer Identität auf AS-Ebene von 98,8 % führte. Von den AS Mutationen waren 76 % Cluster-spezifisch. Mit dem etablierten WUPyV-spezifischen IFT konnte bei gesunden Erwachsenen eine IgG-Seroprävalenz von 88 % für WUPyV ermittelt werden. Ein signifikanter Unterschied im medianen Alter zwischen Anti-WUPyV-VP1-positiven und -negativen Probanden konnte nicht festgestellt werden. Zusammenfassend konnte durch die etablierten molekularen und serologischen Nachweisverfahren die Infektionshäufigkeit von hBoV und WUPyV bei Kindern mit ARE, die Phylogenie der Viren und die Seroprävalenz bei gesunden Erwachsenen erforscht werden. Die in den vorliegenden Studien ermittelten Infektionshäufigkeiten für hBoV und WUPyV deckten sich mit anderen Publikationen zur Epidemiologie von hBoV und WUPyV. Durch die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche konnten keine offensichtlichen Assoziationen zwischen einer hBoV- oder WUPyV-Infektion und einer respiratorischen Erkrankung festgestellt werden. Zur Untersuchung der Pathogenität von hBoV und WUPyV sind daher noch weitere Studien notwendig. N2 - Respiratory tract infections are a major cause of human morbidity and are caused by a broad spectrum of microbial agents, mostly viruses. In recent years, the use of molecular biology methods led to the discovery of several novel viruses, including the human bocavirus (hBoV) in 2005 and the polyomavirus WU (WUPyV) in 2007. In this study, we established qualitative and quantitative polymerase chain reaction assays for both viruses in order to investigate their genoprevalence in hospitalized children with acute respiratory diseases (ARD). Furthermore, phylogenetic analyses of hBoV and WUPyV were performed. In order to study the antibody response against hBoV and WUPyV, immunofluorescence assays (IFA) based on recombinant baculoviruses were established for both viruses. Nasopharyngeal aspirates (NPA) from the period of January 02 to September 05 of hospitalized children with ARD were retrospectively tested for the presence of hBoV DNA. We found that 12 % of the NPA were positive for hBoV DNA. The median age of hBoV DNA-positive children was 1,8 years and the median hBoV load in NPA was 4.9 x 103 copies/ml. Coinfections with other respiratory viruses were detected in 39,1 % of the hBoV DNA-positive NPA. There was no difference of the hBoV load in NPA between children with or without known coinfection, but the load was significantly higher in children with bronchitis than in children with the diagnosis of febrile seizures. In follow-up studies, hBoV DNA shedding was detected for a maximum period of 4.5 months. HBoV DNA was found in 1 of 10 serum samples and in 14 of 31 stool samples of children with hBoV DNA-positive NPA. The hBoV load in NPA was significantly higher for children with positive stool samples. Phylogenetic analysis of hBoV confirmed the previously suggested clusters St1 and St2. The nucleotide and amino acid identity between the clusters was very high (≥99.6 % and ≥99.9 %, respectively). An association of the clusters with virological or clinical parameters was not apparent. Using an IFA to detect IgG against hBoV VP2 antigen, the seroprevalence for hBoV in healthy adults was found to be 74 %. There was no association between age and seropositivity in the study population. WUPyV DNA was analysed in 1232 NPA, which had been collected from 2002 to 2007, and was found in 5.2 % of theses samples with a median WUPyV load of 9.5 x 102 copies/ml. Coinfections were found in 54.8 % of the WUPyV DNA-positive NPA. The median age of the WUPyV DNA-positive children was 3.0 years. The WUPyV load in NPA was neither associated with the coinfection status nor with the clinical diagnoses. WUPyV DNA was found in 3 of 14 serum samples and in 2 of 14 stool samples of WUPyV DNA-positive children. The WUPyV load in NPA tended to be higher in viremic children. Two different WUPyV clusters with high nucleotide-identity (≥99 %) were found by phylogenetic analysis. A high number (60.3 %) of nucleotide substitutions was non synonymous, resulting in 46 amino acid mutations and 98.8 % amino acid identity. Of the amino acid mutations, 76 % were specific for the two clusters. The IgG seroprevalence for WUPyV among healthy adults was 88 % as determined by IFA based on Sf9 cells expressing WUPyV VP1. As seen with hBoV, there was no association between age and seropositivity. In conclusion, we investigated the genoprevalence of hBoV and WUPyV in children with ARD and the seroprevalence in healthy adults. The results of our studies were in agreement with other publications on the epidemiology and serology of hBoV and WUPyV. No obvious association between infection with hBoV or WUPyV and clinical diagnosis was apparent. The methods established and evaluated in this thesis can be applied for further studies to investigate the pathogenicity of hBoV and WUPyV. KW - Viren KW - Polyoma-Virus KW - Parvoviren KW - Atemwegsinfektion KW - Polymerase-Kettenreaktion KW - Immunfluoreszenz KW - Boccavirus KW - Polyomavirus WU KW - Virusnachweis KW - quantitative real-time PCR KW - Immunofluoreszenztest KW - Boccavirus KW - Polyomavirus WU KW - quantitative real-time PCR KW - Immunofluorescence Assay Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40424 ER - TY - THES A1 - Heck, Tobias Johannes T1 - Die Rolle des 1A-Promotors in der glukokortikoidinduzierten T-Zell-Apoptose T1 - The role of the 1A-promotor in glucocorticoid-induced T-cell-apoptosis N2 - Glukokortikoide (GCs) gehören zur Familie der Steroidhormone. Unter physiologischen Bedingungen haben GCs eine bedeutende Funktion als Stresshormone in der Aktivierung kataboler Stoffwechselvorgänge. In hohen, therapeutischen Konzentrationen spielen zusätzlich antientzündliche und immunsuppressive Wirkungen eine bedeutende Rolle. Diese Modulation des Immunsystems geschieht unter anderem durch Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) in T-Lymphozyten. Die Erforschung der Mechanismen dieses glukokortikoidinduzierten Zelltodes (GICD) trägt zu einem besseren Verständnis der Wirkungsweise von Glukokortikoiden innerhalb des Immunsystems bei. Timothy J. Cole et. al. konnten belegen, dass die Aktivität des Glukokortikoidrezeptor-Promotor 1A (GR-1A) mit einem Ansprechen von T-Lymphozyten auf GICD korreliert. Es ist das Ziel dieser Arbeit, den Zusammenhang von GR-1A-Promotor-Expression und GICD im Detail zu untersuchen. Sämtliche Zellexperimente wurden an WEHI 7.1 Zellen durchgeführt, einer murinen, unreifen T-Zell-Lymphomlinie. In ersten Untersuchungen der WEHI 7.1-Zellen zeigte sich, dass nur bestimmte Zellklone nach Glukokortikoid¬behandlung in Apoptose gingen, während andere vollständig resistent gegenüber GCs erschienen. In weiterführenden Experimenten wurden ausschließlich die GICD-sensible Zellen eingesetzt. Für diesen Typ der WEHI 7.1 Zellen wurde sowohl das Vorhandensein des GR-1A-Transkripts, als auch ein deutliches Ansprechen auf GICD nachgewiesen. In den folgenden Experimenten WEHI 7.1-5A Zellen mit WEHI 7.1-5A Zellen supprimierter GR-1A-Ausstattung verglichen. Die erwünschte Reduktion des GR-1A-Transkripts wurde über RNA-Interferenz (RNAi) mittels small interfering RNA (siRNA) erzielt. RNAi ist eine Technik, die durch kleine siRNA-Ketten selektiv den Abbau bestimmter mRNA bewirkt und dadurch zu einer Verringerung der Proteinbiosynthese eines bestimmten Gens führt. Der Zusammenhang von GR-1A und glukokortioidinduzierter Apoptose sollte an WEHI 7.1-Zellen mit einer reduzierten GR-1A-Expression untersucht werden. Durch das Einschleusen siRNA-tragender lentiviraler Vektoren gegen das GR-1A-Transkript sollten Zellen generiert werden, die eine erhöhte Resistenz gegen die glukokortikoidinduzierte Apoptose aufweisen. Diejenigen Zellen, die siRNA-Information in das Genom integriert hatten, konnten durch Detektion eines grün fluoreszierenden Markergens (eGFP) isoliert werden. Anschließend wurden die Zellen auf eine Änderung der GR-Proteinmenge analysiert. Western Blot Analysen zur Quantifizierung des GR ergaben keine signifikanten Unterschiede in der Expression des GR-Proteins in den erfolgreich GR-1A-defizienten WEHI 7.1-Zellen im Vergleich zur Negativkontrolle. Es wurden Dexamethason-Dose-Response-Assays durchgeführt, um den Anteil von GICD an den transfizierten Zellen zu erfassen. Nach Behandlung mit dem hochpotenten Glukokortikoid Dexamethason ergaben sich keine signifikanten Überlebensvorteile für Zellen, die aufgrund von RNAi einen Mangel an GR-1A-Transkript besitzen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Studien konnten den von Cole et al. postulierten Zusammenhang zwischen GR-1A-Expression und GICD nicht beweisen. Es bleibt ungeklärt, ob es nach erfolgreicher Transfektion der WEHI 7.1-Zellen tatsächlich zu einer signifikanten Abnahme der GR-1A-Transkription gekommen ist, beziehungsweise ob tatsächlich eine korrekte Synthese von siRNA in den Zellen stattgefunden hat. Weitere Untersuchungen erscheinen daher nötig, um die Rolle des 1A-Promotor besser zu verstehen. N2 - Glucocorticoids (GCs) belong to the family of the steroid hormones. Under physiological conditions GCs have an important function as stress hormones in the activation of catabolic metabolism processes. In high, therapeutic concentrations anti-inflammatory and immunsuppressive effects play, in addition, an important role., Among the rest, this modulation of the immune system happens by induction of the programmed cell death (apoptosis) in T-lymphocytes. The investigation of the mechanisms of this glucocorticoid-induced cell death (GICD) contributes to a better understanding of the impact of glucocorticoids within the immune system. Timothy J. Cole et. al. could prove that the activity of the glucocorticoid-receptor-promotor 1A (GR-1A) appealing in T-lymphocytes correlates on GICD. The aim of this work is to examine the connection by GR-1A-promotor-expression and GICD in detail. All cell experiments were carried out in WEHI 7.1 cells, a murine, immature T-cell-lymphoma. In the first investigations of the WEHI 7.1-cells appeared that only certain cell clones went to glucocorticoid-induced apoptosis while others were completely resistant towards GCs. In continuing experiments exclusively the GICD-sensitive cells were used. For this celltype the available being of the GR-1A-Transkripts, as well as clear appealing to GICD has been proved. In the following experiments 7.1-5A WEHI cells were compared to 7.1-5A WEHI cells of suppressed GR-1A equipment. The desired reduction of the GR-1A-transkricts was achieved about RNA interference (RNAi) by means of small interfering RNA (siRNA). RNAi is a technology which causes selectively the dismantling of mRNA by small siRNA chains and thereby leads to a reduction of the protein biology synthesis of a certain gene. The connection of GR-1A and glucocorticoid apoptosis should be examined in WEHI 7.1-cells with a diminished GR-1A expression. The cells which show a raised resistance against glucocorticoidinduced apoptosis should be generated by the infiltration of siRNA weight-bearing lentiviraler vectors against the GR-1A-transcript. Those cells which had integrated siRNA information into the genome could be isolated by detection of a green fluorescing marker gene (eGFP). Afterwards the cells were analysed on a change of the GR protein amount. No significant differences in western blot analyses to the quantification of the GR in the expression of the GR protein in the successfully GR-1A-deficient WEHI 7.1-cells in comparison to the negative control were found. Dexamethason-dose-response-assays were carried out to grasp the portion of GICD in the transfected cells. After treatment with the highly potent glucocorticoid dexamethason no significant survival advantages arose for the cells which own a lack of GR-1A-transcript on the basis of RNAi. The studies carried out in this work could not prove the postulated connection between GR-1A expression and GICD. It remains unsettled whether it has come to a significant decrease of the GR-1A after the successful transfection of the WEHI 7.1-cells, or whether a really correct synthesis from siRNA has taken place in the cells. Hence, other investigations seem necessary to understand the role of the promotor 1A better. KW - Apoptosis KW - Glucocorticosteroide KW - T-Zell-Lymphom KW - apoptosis KW - glucocorticoid KW - t-cell Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40417 ER - TY - THES A1 - Blank, Marc T1 - Mechanismen der Glukokortikoid-induzierten Apoptose in T-Zellen T1 - Dissecting the apoptotic pathways induced by Glucocorticoids in T-cells N2 - Glukokortikoide induzieren Apoptose in vielen verschiedenen Zelltypen. Wenngleich die Glukokortikoid-induzierte Apoptose eine der zuerst entdeckten Formen des Programmierten Zelltodes war, ist sie dennoch kaum verstanden und daher heute noch Teil vieler Forschungen. Eine Bcl-2 Überexpression resultiert in einer Resistenz gegenüber GC- induzierter Apoptose in einer Reihe von Zellen wie einigen Lymphomzell-linien, aber auch normalen Thymozyten, sowie reifen T- und B-Zellen. Glukokortikoide können die Transkription der BH3-only Gene Bim (BCL-2-interacting mediator of cell death) und Puma (p53-upregulated modulator of apoptosis), einer proapoptotischen Untergruppe der Bcl-2 Familie, induzieren. Dies legt nahe, dass Bim und Puma am Weg der GC-induzierten Apoptose beteiligt sind. Ceramid ist in der Lage über die Aktivierung der proapoptotischen Bcl-2 Mitglieder Bax und Bak die äußere Mitochondrienmembran zu schädigen und damit zur Aktivierung von Caspasen zu führen. Verschiedene apoptotische Stimuli, wie z.B. Glukokortikoide, führen so über eine Erhöhung des endogenen Ceramid Levels zur Apoptose. Ceramid kann auf zwei verschiedenen Wegen gebildet werden: zum einen durch Hydrolyse von Sphingomyelin (katalysiert durch saure (a), oder neutrale (n) Sphingomyelinase (SMase)), zum anderen durch de novo Biosynthese. Studien an Thymozyten zeigen, dass von den beiden Möglichkeiten der Ceramidsynthese, lediglich die Inhibition der aSMase zu einer Resistenz gegenüber GC-induzierter Apoptose führt. Um nun die Rolle von Bim und der aSMase bei der Glukokortikoid-induzierten Apoptose zu untersuchen, wurde die murine T-Zelllymphomlinie WEHI7.15a zu Hilfe genommen. Während die Überexpression retroviral eingebrachter shRNAs gegen Bim und aSMase keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose zeigten, führte der knockdown des Glukokortikoid-Rezeptors selbst zu einer Resistenz gegenüber Dexamethason. Auch der pharmakologische Inhibitor der Sphingomyelin-Hydrolyse, Imipramin, zeigte sowohl in vitro, als auch in vivo keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose. Darüber hinaus waren sowohl Thymozyten, als auch periphere T-Zellen von aSMase knockout Mäusen genauso sensitiv auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose wie Wildtyp-Zellen. Die in vitro knockdown Ergebnisse von Bim und vom Glukokortikoid-Rezeptor selbst, konnten weiterhin ex vivo, durch das Einbringen der shRNAs in hämatopoetische Stammzellen, welche zur Rekonstitution bestrahlter Mäuse genutzt wurden, bestätigt werden. Während der Bim knockdown keinerlei Einfluss auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose ex vivo zeigte, konnte die verminderte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors den Zelltod verhindern. Im Gegensatz hierzu zeigten sowohl der GR knockdown, als auch der Bim knockdown im hämatopoetischen System einen Einfluss auf die Thymozytenentwicklung in vivo. N2 - Glucocorticoids (GC) induce apoptosis in many cell types, but the mechanisms are not well understood. Recently it was reported that the proapoptotic Bcl-2 family member Bim and an upregulation of ceramides by a caspase-activated acidic sphingomyelinase (aSMase) play important roles. In order to study their involvement in GC-induced apoptosis I took advantage of the GC-sensitive murine T-cell lymphoma line WEHI 7.15a. Overexpression of retrovirally expressed shRNAs against Bim or aSMase had no influence, whereas knockdown of the GC receptor (GR) itself rendered these cells resistant to Dexamethasone. In addition, various pharmacological inhibitors of ceramide production had no influence on GC-induced apoptosis. Moreover, thymocytes and peripheral T-cells from aSMase knockout mice were equally sensitive to GC induced apoptosis as wildtype cells. Furthermore, I confirmed the in vitro knock down results of Bim and the GR by introducing shRNAs into hematopoietic stem cells that were used to reconstitute lethally irradiated mice. While Bim inactivation did not impact ex vivo GC-induced apoptosis, loss of GR expression prevented cell death. In contrast both, the GR knockdown as well as the Bim knockdown in reconstituted mice, showed an influence in T-cell development in vivo. KW - Glucocorticosteroidrezeptor KW - Apoptosis KW - Sphingomyelinphosphodiesterase KW - RNS-Interferenz KW - T-Lymphozyt KW - Glucocorticosteroide KW - Bim KW - Bcl-2 Familie KW - Bcl-2 family Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-41332 ER - TY - THES A1 - Wiktorowicz, Tatiana T1 - Herstellung eines neuen foamyviralen Vektors durch Einengung der cis-aktiven Sequenzen T1 - Generation of an improved foamy virus vector by dissection of cis-acting sequences N2 - Im Vergleich zu anderen Retroviren, zeichnen sich Foamyviren durch eine Reihe von Eigenschaften aus, die sie besonders attraktiv für die Vektorentwicklung und somatische Gentherapie machen. Foamyviren exprimieren ihr Pol Prekursorprotein unabhängig von Gag, d.h. von ihrer eigenen gespleisten mRNA. Zwar ist der genaue Pol-Verpackungsmechanismus von Foamyviren noch nicht vollständig aufgeklärt, frühere Studien zeigten jedoch, dass die prägenomische RNA essentiell für die Pol-Enkapsidierung ist. Zwei Pol-Verpackungssequenzen (PES) wurden identifiziert, welche sich in den cis-aktiven Sequenzen (CAS) der prägenomischen RNA befinden (Heinkelein et al., 1998; Peters et al., 2005). In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die PESI und PESII Sequenzen alleine ausreichend für die Pol-Verpackung sind. Zusätzich wurde der Einfluss von verschiedenen Teilen der ca. 2000 nt langen CASII Sequenz auf den Vektortransfer ohne Verlust der Pol-Enkapsidierung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PESI und PESII alleine nicht ausreichend für die Pol-Verpackung ins foamyvirale Partikel sind. Die Verkürzung des CASII Elements zeigte keinen Effekt auf die Pol-Verpackung und den Vektortransfer. Das Einfügen eines zusätzlichen zentralen Polypurintraktes führte jedoch zur signifikanten Erhöhung der Transduktionseffizienz von FV Vektoren. Diese Ergebnisse führten zur Entwicklung eines neuen foamyviralen Vektors (pTW01), der ca. 850nt kürzer ist als die früher etablierten FV Vektoren, aber immer noch die gleiche Transduktionseffizienz auf Fibroblasten und humanen Stammzellen zeigt. Dieser Vektor mit einer höheren Verpackungskapazität und Sicherheit, eignet sich hervorragend für den Einsatz in gentherapeutischen Studien. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass eine heterologe Verpackung zwischen zwei unterschiedlichen Foamyviren (PFV und SFVmac) zu einem geringen Prozentsatz stattfindet. Als erster Schritt in der Entwickung eines neues Systems für eine einfache und kostengünstige Vektorvirusproduktion wurde gezeigt, dass die Expression der foamyviralen Gag, Pol und Env Proteine in Saccharomyces cerevisiae stattfinden kann. N2 - Foamy viruses harbor some unique features which make them, compared to other retroviruses, especially attractive for vector development and somatic gene therapy. Foamy viruses express their Pol precursor protein independently of Gag, i.e. from their own spliced mRNA. While the exact mechanism by which Pol is incorporated into the foamy virus particle is still unknown, previous studies have shown that pregenomic RNA is essential for Pol incorporation. Two cis-active sequences (CAS) were identified, within which two essential Pol encapsidation sequences (PES) were mapped (Heinkelein et al., 1998; Peters et al., 2005). Using the prototype foamy virus (PFV) as a model, this work investigated whether the previously identified PESI and PESII sequences in an FV vector are alone sufficient for Pol encapsidation. Additionly, the influence of various parts of the 2000 bp CASII sequence on vector transfer efficiency without the loss of Pol encapsidation was studied. The obtained results indicate that the PESI and PESII alone are not sufficient for Pol incorporation into a foamy virus particle. The truncation of the CASII element has no effect on Pol incorporation and vector transfer. However, if an additional central poly purine tract is generated into a foamy virus vector, it significantly increases the FV vector transduction rate. These results led to a generation of an improved foamy virus vector (pTW01), about 850 bp shorter than the previously established vectors, yet still as effective in transducing fibroblasts and primary human cells. These data add to the packaging limit of the PFV vectors for gene therapy, as well as to the safety of these vectors. In addition to these findings, it was shown that the cross-packaging between two different foamy viruses (PFV and SFVmac) takes place very rarely. Finally, as a first step in finding a new low-cost possibility to produce large amounts of vector viruses, it was shown that an expression of the three foamy virus proteins: Gag, Pol and Env can take place in Saccharomyces cerevisiae. KW - Gentheraphie KW - Foamyviren KW - Retroviraler Vektor KW - Gentherapie KW - Foamyviren KW - Gene therapy KW - foamy virus Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40008 ER - TY - THES A1 - Brackmann, Heike T1 - Funktionelle Lücken zytotoxischer T-Zellen im Laufe einer HIV Infektion - Untersuchung der Zytokinproduktion und diverser Effektorfunktionen CD8+ T-Lymphozyten bei HIV-Infizierten in unterschiedlichen Stadien der Erkrankung T1 - Impaired function of cytotoxic T-cells in course of HIV-infection-analysis of cytokine production and divers effektor functions of CD8+ T-cells in HIV-infekted persons different stages of disease N2 - Zytotoxische CD8+ T-Zellen spielen eine bedeutende Rolle in der Immunantwort gegen HIV-1. Trotz allem kommt es jedoch im Verlauf der Infektion bei den meisten Betroffenen zum Anstieg der Viruslast und Abfall der CD4 Zellzahl, obwohl auch in diesem fortgeschrittenen Stadium der Infektion virusspezifische CD8+ T-Zellantworten mittels INF-γ-Produktion nachgewiesen werden können. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, weitere funktionelle und phänotypische Merkmale von CD8+ T-Zellen zu untersuchen, um eine mögliche Ursache für die im Verlauf der Infektion ineffizient werdende Immunantwort zu finden. Einen statistisch signifikanten Unterschied der INF-γ Produktion CD8+ T-Zellen zwischen Progressors und Controllers ließ sich mittels INF-γ Elispot bei den von uns untersuchten Patienten nicht nachweisen. Es ist also davon auszugehen, dass CD8+-T-Zellen im fortgeschrittenen, chronischen Stadium der Infektion funktionelle Lücken aufweisen, die sich nicht durch INF-basierte Untersuchungsmethoden nachweisen lassen. Anhand intrazellulärer Zytokinfärbung ließ sich unabhängig vom Schweregrad der Infektion eine erhaltene Produktion der Zytokine INFγ und TNFα, nicht hingegen eine Produktion von IL-2 nachweisen. Bei der Untersuchung HIV spezifischer CD8+ T-Zellen mit Hilfe von Tetramerfärbungen zeigte sich in Bezug auf den Aktivierungsgrad, gemessen an der CD38-Expression, ein deutlicher Unterschied zwischen Progressors und Controllers, der innerhalb der HIV-spezifischen CD8+ T-Zellen im Vergleich zur gesamten CD8+ T-Zellpopulation noch ausgeprägter zu erkennen war. Hier gab es eine signifikante positive Korrelation zur Viruslast und eine signifikante negative Korrelation zur CD4-Zellzahl der HIV-Infizierten. Anhand des Aktivierungsmarkers HLA-DR ließ sich dieser Unterschied nicht nachweisen. Im Bezug auf die Proliferationsfähigkeit, Apoptoseempfindlichkeit und lytische Funktion HIV-spezifischer Zellen konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Progressors und Controllers ausgemacht werden. Schlüsse für die Gesamtheit der HIV-spezifischen Zellen eines HIV-Infizierten kann man natürlich nicht ziehen. Man darf nicht außer Acht lassen, dass uns lediglich eine begrenzte Anzahl von Epitopen bei den durchgeführten Untersuchungen zur Verfügung stand. Es wurde jedoch deutlich, dass es feine Unterschiede und Trends zu geben scheint, die eine gezielte weiterführende Untersuchung erfordern. Weiterhin ist auch zu bedenken, dass möglicherweise andere Faktoren, als die von uns untersuchten, für den unterschiedlichen Krankheitsverlauf verantwortlich sein können. Welche Faktoren nun tatsächlich die Ursache sind dafür, dass das menschliche Immunsystem gegen das HI-Virus in der Regel früher oder später verliert, bleibt weiterhin offen. Sehr wahrscheinlich handelt es sich hierbei um das Zusammenspiel mehrerer Mechanismen. Die gezielte Untersuchung HIV-spezifischer Zellen ist bei der weiteren Erforschung der genauen Zusammenhänge unerlässlich. KW - HIV KW - HIV-Infektion KW - Cytokine KW - Interferon KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Interleukin 2 KW - T-Zellen KW - zytotoxische T-Zellen KW - bcl-2 KW - CD38 KW - CD57 KW - apoptosis KW - replikative senescence Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40066 ER - TY - THES A1 - Guenzel, Carolin Alexandra T1 - The Characterization of Nipah Virus V and W proteins T1 - Die Charakterisierung der Nipah Virus V und W Proteine N2 - The work of the previous chapters describes the role of Nipah virus (NiV) V and W proteins regarding their role in interferon antagonism and regulation of viral replication. Previous publications have shown that NiV encodes IFN antagonist activity in its V, W and C protein (Park et al., 2003b; Rodriguez et al., 2002). In order to study the effect of both NiV proteins in the context of a virus infection, recombinant Newcastle disease viruses (rNDVs) expressing NiV V or NiV W were constructed. As a control virus served rNDV expressing NDV V proteins, which behaved like wildtype NDV. Growth kinetic experiments demonstrated that rNDVs expressing NiV V or W grew to higher titers than rNDV expressing NDV V in human A549 cells. This result suggested that both NiV V and W were able to render the avian virus, which normally does not replicate well in human cells, into a better growing virus. This hypothesis was supported by the fact that all rNDVs grew similarly in avian DF1 or Vero cells. When rNDV-infected A549 cells were specifically stained for NiV V or W protein it was observed that V is localized in the cytoplasm whereas W could be predominantly found in the nucleus. This observation was in agreement with previous studies reporting a nucleus export signal (NES) for NiV V and a nuclear localization signal (NLS) for NiV W (Rodriguez et al., 2004; Shaw et al., 2005). The specific localization of each NiV protein has also been shown to contribute to different functions in terms of IFN antagonism (Shaw et al., 2005). Here, NiV V and W proteins caused a severe attenuation of the immune response in rNDV-infected human A549 and dendritic cells. The transcription of type I interferons and ISGs was significantly downregulated in the presence of NiV V and W proteins. As a consequence of the transcriptional block, there was also an inhibition at the level of translation (as seen for A549 cells) and the secretion of IFNs and cytokines/chemokines (as seen for DCs). In contrast, NDV V protein induced a host immune response. Both NiV V and W also displayed a strong inhibitory effect on the function DCs. DCs represent a very important cell class because they link the innate immune response to the adaptive immune response (Banchereau & Steinman, 1998). By downregulating the production and secretion of important cytokines/chemokines that are important for the activation of B and T lymphocytes, NiV V and W were able to disrupt that link. Interestingly, NiV W seemed to be a stronger inhibitor than NiV V in both A549 cells and DCs. Overall, it was demonstrated that NiV V and W were able to prevent the induction of the innate and adaptive host immune response cascade by inhibiting the transcription of immune genes in DCs and A549 cells. The second part of this work addressed the question whether NiV V and W proteins have a regulatory role in viral replication. This has been previously reported for Nipah virus itself (Sleeman et al., 2008) and other viruses (Atreya et al., 1998; Horikami et al., 1996; Witko et al., 2006). In order to study the ability of the V and W proteins of NiV to regulate viral transcription and/or replication, an existing NiV minireplicon assay was used (Halpin et al., 2004). Here, it was shown that NiV V and W (but not C) proteins significantly downregulated NiV minireplicon activity. The common N terminal region was shown to harbor the inhibitory activity. Co-immunoprecipitation experiments showed that both NiV V and W (but not C) were able to interact with NiV N, one component of the NiV polymerase. This result was supported by immunofluorescence experiments that revealed co-localization of NiV N with V and W. The binding of NiV V or W to NiV N occurred via their N terminus and more specifically amino acids 1-50. This suggested that V and W might inhibit viral replication by interacting with the viral polymerase resulting in a loss of function. Exact mechanisms still have to be elucidated. N2 - Die Arbeit der vorangegangenen Kapitel geht auf die Rolle von Nipah Virus (NiV) V und W Proteinen bezueglich deren Rolle im Interferon-Antagonismus und Regulation der viralen Replikation. In vergangenen Veroeffentlichungen wurde gezeigt, dass NiV seine interferon-antagonistische Aktivitaet in dessen V, W und C Proteinen kodiert (Park et al., 2003b; Rodriguez et al., 2002). Um den Effekt beider NiV Proteine im Rahmen einer Virusinfektion zu untersuchen, wurden rekombinante Newcastle disease Viren (rNDV), welche entweder NiV V oder W exprimieren, konstruiert. Als Kontrollvirus diente ein rNDV, der das NDV V Protein exprimiert. Dabei verhaelt sich der rekombinante Virus wie NDV-Wildtyp. Kinetische Wachstumsexperimente in A549 Zellen zeigten, dass rNDVs, die NiV V oder W exprimieren, zu hoeheren Titern wuchsen als rNDV, der NDV V exprimiert. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass sowohl NiV V als auch NiV W im Stande waren, den Vogelvirus, welcher normalerweise schlecht in humanen Zellen repliziert, zu einem besseren Wachstum anzuregen. Diese Hypothese wurde durch die Tatsache unterstuetzt, dass alle rNDVs ein recht recht aehnliches Wachstumsverhalten in Vogelzellen (DF1 Zellen) und Vero Zellen aufwiesen. Ausserdem wurden rNDV-infizierte A549 Zellen spezifisch gegen NiV V oder W Protein angefaerbt und es konnte beobachtet werden, dass V im Zytoplasma und W ueberwiegend im Nukleus der Zelle lokalisiert ist. Diese Beobachtung stimmte mit vorhergehenden Studien ueberein, die von ein Nukleus-Exportsignal (NES) fuer NiV V und ein Nukleus-Lokalisationsignal (NLS) fuer NiV W berichteten (Rodriguez et al., 2004; Shaw et al., 2005). Es wurde gezeigt, dass diese unterschiedliche, jedoch spezifische Lokalisation der NiV Proteine zu verschiedenen Funktionen bezueglich des Interferon-Antagonismus beitraegt (Shaw et al., 2005). In der vorliegenden Arbeit verursachten NiV V und W Proteine eine heftige Attenuation der Immunantwort in rNDV-infizierten humanen A549 und dendritischen Zellen (DC). In der Anwesenheit von NiV V und W Proteinen wurde die Transkription der Typ 1-Interferonen und ISGs signifikant herunterreguliert. Als Konsequenz des transkriptionellen Blocks konnte auch eine Inhibition auf translationalem Niveau (zu sehen in A459 Zellen) und eine Inhibition der Sekretion von IFNs und Zytokinen/ Chemokinen (zu sehen in DCs) verzeichnet werden. Im Gegensatz dazu induzierte NDV V Protein ein Immunantwort im Wirt. Sowohl NiV V als auch W zeigten auch einen starken inhibitorischen Wirkung auf die Funktion von DCs. DCs repraesentieren einen sehr wichtigen Zelltyp, da sie eine Verbindung zwischen der angeborenen und erworbenen Immunantwort herstellen (Banchereau & Steinman, 1998). Durch die Herunterregulierung der Produktion und Sekretion wichtiger Zytokine/ Chemokine, die fuer die Aktivierung von B- und T-Lymphozyten wichtig sind, waren NiV V und W faehig, diese Verbindung zu zerstoeren. Interessanterweise schien NiV W in A549 Zellen ein viel staerkerer Inhibitor zu sein als NiV V. Insgesamt wurde demonstriert, dass NiV V und W durch Inhibierung der Transkription von Immungenen im Stande waren, die Induktion der angeborenen und erworbenen Immunantwort-Kaskade zu unterbinden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschaeftigt sich mit der Frage, ob NiV V oder W Proteine eine regulatorische Aufgabe in der viralen Replikation uebernehmen. Vorherige Berichte hatten dies fuer Nipah Virus selbst (Sleeman et al., 2008) und andere Viren demonstriert (Atreya et al., 1998; Horikami et al., 1996; Witko et al., 2006). Um die Faehigkeit von V und W Proteinen bezueglich der Regulation der viralen Transkription und/ oder Replikation zu bestimmen, wurde Gebrauch von einem bereits existierenden NiV Minireplikon-Assay gemacht (Halpin et al., 2004). In der vorliegenden Studie wurde gezeigt, dass NiV V und W (jedoch nicht C) Proteine die NiV Minireplikon-Aktivitaet in signifikanter Weise reduzierten. Es wurde gezeigt, dass die gemeinsame N-terminale Region die inhibitorische Aktivitaet besitzt. Ko-Immunopraezipitationsexperimente demonstrierten weitehin, dass sowohl NiV V als auch W (jedoch nicht C) im Stande waren, mit NiV N, einer Komponente der NiV Polymerase, zu interagieren. Dieses Ergebnis wurde von Immunfluoreszenzexperimenten untermauert, die eine Kolokalisation zwischen NiV N und V und W demonstrierten. Der N-Terminus von NiV V und W, und hierbei speziell die Aminosaeuren 1-50, waren fuer die Bindung von NiV V und W an NiV N verantwortlich. Dies deutete darauf hin, dass V und W durch das Binden der viralen Polymerase die virale Replikation inhibiert. KW - Viren KW - Interferon KW - Immunreaktion KW - Replikation KW - Interferonantagonismus KW - Immunsupression KW - Interferonantagonism KW - Immunesupression Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37627 ER - TY - THES A1 - Blank, Gregor T1 - Einfluss blockierender und stimulierender CD28-spezifischer monoklonaler Antikörper auf die Reifung und Homöostase von T-Zellen der Maus T1 - Influence of stimulating an blocking CD28-specific monoclonal antibodies on differentiation and homeostasis of T cells in mouse N2 - Die Kostimulation über den CD28 Oberflächenrezeptor spielt eine entscheidende Rolle sowohl in der Proliferation von T-Zellen, in deren Differenzierung zu Effektorzellen, als auch in der Entwicklung und Kontrolle von regulatorischen T-Zellen. Diese Schlüsselrolle macht CD28 zu einer interessanten Zielstruktur, um den Einfluss monoklonaler Antikörper auf die Entwicklung und Homöostase von T-Zellen zu analysieren. Die hier verwendeten Antikörper lassen sich funktionell in zwei verschiedene Kategorien einteilen: zum Einen in konventionelle Antikörper (E18 mAk), welche die physiologische Rezeptor-Liganden Interaktion blockieren, und zum Anderen in superagonistische Antikörper (D665 mAk), die in der Lage sind ruhende T-Zellen ohne eine Ligation des T-Zell Rezeptors voll zu aktivieren. In der vorliegenden Arbeit konnte in verschiedenen in-vitro und in-vivo Experimenten gezeigt werden, dass eine Behandlung mit dem CD28 Superagonisten keinen Einfluss auf die Differenzierung von T-Zellen im Thymus nimmt, und die Zusammensetzung der einzelnen Zellpopulationen in diesem Organ unbeeinflusst bleibt. Bei Verwendung blockierender anti-Maus CD28 mAk zeigte sich in sämtlichen Untersuchungen eine beeinträchtigte Entwicklung von regulatorischen T-Zellen innerhalb des Thymus, während die anderen Zellpopulationen unbeeinflusst blieben. Auch in Analysen peripherer Lymphknoten lag der Anteil regulatorischer T-Zellen nach Behandlung mit E18 mAk unter den Kontrollwerten. Durch eine chronische Blockade von CD28 mittels E18 mAk ließ sich die Gesamtanzahl an Tregs in peripheren Lymphknoten, Milz und Thymus drastisch senken, ohne dass es zu einem vollständigen Verschwinden dieser Zellpopulation kam. Auch die absolute Zahl an CD4 positiven T-Zellen innerhalb der peripheren Lymphknoten, Milz und Thymus der behandelten Tiere lag deutlich unter der Kontrolle. Diese Beobachtungen waren 13 Wochen nach Beendigung der Antikörper-Applikationen vollständig reversibel und zu keinem Zeitpunkt des Experimentes ergaben sich klinische oder serologische Hinweise auf die Entwicklung von Autoimmunität trotz niedriger Treg- Zahlen über mehrere Wochen. N2 - Costimulation via the CD28 receptor plays an important role not only in the proliferation of T cells and the differentiation to effector T cells, but also in the development and control of regulatory T cells (Treg). This key role makes CD28 an attractive target for analysing the influence of monoclonal antibodies on the development und homeostasis of T cells. The antibodies used in this work could be devided into two types: conventional antibodies (E18 mAb) on the one hand that are per se not stimulatory in vitro and block the interaction of CD28 with its ligands, and superagonistic antibodies (D665 mAb) on the other hand which can fully activate resting T cells even without ligation of the T-cell receptor. Different in vitro and in vivo experiments in this work could show that application of CD28 superagonists has no influence on differentiation of T cells in thymus. The composition of the single cell subsets in this organ stays completely unaffected. Treatment with conventional E18 mAb leads to an impaired development of Treg cells in thymus, while other populations stay unaffected. Similar results were obtained by analysing peripheral lymphnodes. Chronic application of E18 mAb reduces the representation of Treg cells within the CD4 T-cell compartment in peripheral lymphnodes, spleen and thymus, along with a strong reduction of the CD4 compartment at large. Importanty, however, no signs of autoimmunity were detected during or after release from anti-CD28 treatment, during which Treg numbers swiftly recover. KW - Antigen CD28 KW - T-Lymphozyt KW - Thymus KW - CD28 Superagonist KW - T-Zell Entwicklung KW - T-Zell Homöostase KW - CD28 superagonist KW - T cell development KW - T cell homeostasis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37496 ER - TY - THES A1 - Zeitz, Jonas T1 - Analyse der Funktion und Lokalisation des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds A1 T1 - Analysis of the Function and Localization of the Anti-Apoptotic Bcl-2 Family Member A1 N2 - In multizellulären Organismen ist die Apoptose, eine Art des programmierten Zelltods, ein hoch spezifischer, natürlicher Prozess um unerwünschte, überschüssige oder beschädigte Zellen auf einem geordneten, nicht entzündlichen, Weg zu beseitigen. Auch im menschlichen Körper werden täglich Milliarden an Zellen durch Apoptose abgebaut. Dadurch kann der Organismus die Zellzahl und Gewebegröße regulieren. Eine Fehlregulation der Apoptose kann weitreichende Konsequenzen haben. Während es bei einer unzureichenden Apoptose zu Autoimmunität und Tumoren kommen kann, führt ein gesteigerter Zelltod zu Immunschwäche oder akuten und chronischen degenerativen Erkrankungen. Aus diesem Grund ist die Erforschung der genauen Regulation des programmierten Zelltods von großer Bedeutung. Die Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des programmierten Zelltods. Während des Ablaufs der Apoptose kommt es zur Freisetzung von Mediatoren der Apoptose aus diesen Organellen. Diese Moleküle sind dann an der Aktivierung von Caspasen beteiligt, welche die Degradation von Proteinen und als Folge davon der DNA bewerkstelligen. Die Proteine der Bcl-2 Familie, zu der pro- und anti-apoptotische Mitglieder gehören, kontrollieren die Integrität der Mitochondrien hauptsächlich durch Protein-Protein und Protein-Membran Interaktionen. Viele anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie sind mittels einer C-terminalen Transmembrandomäne in der Lage an die äußere Mitochondrienmembran zu binden. A1, ein anti-apoptotisches Mitglied dieser Proteinfamilie, besitzt allerdings keine typische Transmembrandomäne. Die Funktion und Lokalisation des Proteins werden sehr kontrovers diskutiert. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, die Lokalisation und Funktion von A1 zu analysieren. Um ein umfassendes Bild zu bekommen, wandten wir gentechnische Methoden zur Modifizierung des A1 C-Terminus an. Die intrazelluläre Lokalisation des Proteins wurde mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Bedeutung des proteasomalen Abbaus von A1 wurde schließlich durch Inhibitionsexperimente charakterisiert. Durch eine Fusion des C-terminalen Endes von A1 mit dem „enhanced green fluorescent protein“ haben wir die Funktion und Lokalisierungseigenschaften des A1 C-terminus mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie untersucht. Wir konnten zeigen, dass das C-terminale Ende das so entstandene chimäre Protein deutlich destabilisieren konnte. Eine Blockade des proteasomalen Abbaus führte zu einer Stabilisierung des Fusionsproteins. Des Weiteren konnte in der konfokalen Mikroskopie eine diffuse Verteilung des chimären Proteins in 293T Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das C-terminale Ende von A1 keine Lokalisation an spezifische intrazelluläre Organellen vermitteln kann, jedoch für die Instabilität und den proteasomalen Abbau des Proteins verantwortlich ist. Eine Analyse der Lokalisation des Gesamtproteins A1 in 293T Zellen mittels konfokaler Mikroskopie konnte eine Verteilung von A1 zugunsten des Zytoplasmas mit Anreicherung an den Mitochondrien nachweisen. Obwohl das C-terminale Ende von A1 für sich keine spezifische intrazelluläre Lokalisation vermittelt, zeigte das Protein eine Kolokalisation an den Mitochondrien. Somit scheinen noch andere N-terminale Bereiche des Proteins an der Lokalisation von A1 beteiligt zu sein. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass der C-Terminus von A1 eine wichtige Rolle für die Stabilität des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds spielt. N2 - In multicellular organisms, apoptosis (one kind of programmed cell death) is a highly regulated natural process that can remove unwanted, redundant, or damaged cells in an orderly non-inflammatory way. In a typical human being, billions of cells undergo apoptosis every day. That way the organism can control the cell number and the size of a tissue. A dysregulation of apoptosis can have extensive consequences. While insufficient apoptosis can manifest as autoimmunity or cancer, accelerated cell death can lead to immunodeficiency or acute and chronic degenerative diseases. Therefore, analysis of apoptosis is of great importance. Mitochondria play a key role in the regulation of cell death. In the progress of apoptosis, mediators of apoptosis can be released from these organelles. These mediators then participate in the activation of caspases, enzymes that degrade proteins and as a consequence regulate the degradation of DNA. Proteins of the Bcl-2 family consisting of pro- and anti-apoptotic members, control the integrity of the mitochondria mainly by protein-protein and protein-membrane interactions. Many anti-apoptotic members of the Bcl-2 family are able to bind to the outer mitochondrial membrane by a C-terminal transmembrane domain. A1, an anti-apoptotic member of this protein family, lacks this typical transmembrane domain. Function and localization of this protein are discussed very controversially. Therefore, the aim of this thesis was to analyze the localization and function of A1. The intracellular distribution of various versions of genetically modified A1 proteins was analyzed by confocal microscopy. Eventually, the contribution of the proteasomal degradation pathway in regulating the amount of A1 inside cells was investigated by applying relevant inhibitors. By fusing the C-terminal end of A1 to the enhanced green fluorescent protein, we analyzed the function and localization features of the A1 C-terminus by confocal microscopy and flow-cytometry. We could show that the C-terminal end of A1 made the chimeric protein very unstable. Treating the cells with a proteasomal inhibitor lead to a stabilization of the fusion protein. Furthermore the chimeric protein showed a diffuse distribution in 293T cells. These results indicate that the C-terminus of A1 is not sufficient to mediate localization to special intracellular organelles, but is responsible for the instability and proteasomal degradation of the protein. By analyzing the localization of the full length protein A1 in 293T cells by confocal microscopy we could demonstrate that A1 is mainly found in the cytosol with accumulation at the mitochondria. As the C-terminus of A1 by itself was not sufficient for specific intracellular targeting of the protein, other N-terminal regions of A1 seem to contribute in targeting the protein to these organelles. Taken together, we could show that the C-terminus of A1 plays an important role for the stability of this anti-apoptotic Bcl-2 family member. KW - Apoptosis KW - Immunsystem KW - A1 KW - Bcl-2 KW - Apoptosis KW - A1 KW - Bcl-2 Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37071 ER - TY - THES A1 - Singethan, Katrin T1 - Untersuchungen zur Inhibition Paramyxo- und Flavivirus-induzierter Membranfusion T1 - Analysis of the inhibition of Paramyxo- and Flavivirus-induced membrane fusion N2 - CD9 und andere Mitglieder der Tetraspaninfamilie sind an der strukturellen Organisation und der Plastizität der Plasmamembran beteiligt. Dabei inhibiert mAK K41, ein spezifischer CD9-Antikörper, die Hundestaupe-induzierte Zell-Zellfusion und die Virusfreisetzung, während die MV-induzierte Zell-Zellfusion nicht beeinflusst wird. So ist die extrazelluläre Domäne des Hämagglutinin-Proteins von CDV diejenige, die die Empfindlichkeit der Zell-Zellfusion gegenüber dem CD9-Antikörper verursacht, die aber selbst nicht an das CD9-Molekül bindet. Diese Erkenntnisse ließen vermuten, dass strukturelle Veränderungen an der Plasmamembran der Grund für die Hemmung sind bzw. räumliche Expressionsmuster des Rezeptors involviert sein könnten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass mAK K41 das Konformationsepitop der großen extrazellulären Domäne (LEL) von CD9 erkennt, die nachweislich über ß1-Integrin mit verschiedenen Signalwegen im Innern in Kontakt steht. Die Bindung dieser Domäne induziert folglich eine schnelle Umlagerung und ein Clustern der CD9-Moleküle bis zur Bildung von netzähnlichen Strukturen an den Kontaktstellen zweier Zellen. Durch konfokale und rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen konnten mikrovilli-ähnliche Ausstülpungen aufgedeckt werden, die von beiden Seiten aneinander liegender Zellen gebildet werden. Nach einer Zeitspanne von 2 h bis 20 h bildeten diese CD9-haltigen Ausstülpungen feine, mehrere µm lange Mikrovilli aus, die sich in einer Art Geflecht miteinander vernetzten und mikrovilli-artige Reißverschlussstrukturen bildeten. Weiterhin konnte eine starke Kolokalisierung des Ewi-F-Proteins vor und nach der Antikörperinkubation gezeigt werden, sowie eine partielle Kolokalisierung mit ß1-Integrin. Im Vergleich konnten MV-Proteine innerhalb der CD9-haltigen Netzstrukturen beobachtet werden, während CDV-Proteine komplett aus diesen ausgeschlossen wurden. Somit ist die Ausgrenzung der viralen Fusionsmaschinerie von CDV von den CD9-Clustern sowie die physikalische Trennung von den Zellkontakten wohl die Erklärung für die Inhibition der Virus-induzierten Zell-Zellfusion durch mAK K41. Da experimentell keine kausale Verbindung zwischen der Induktion der CD9-haltigen Cluster und bestimmten Signalwegen gezeigt werden und auch kein Beweis hervorgebracht werden konnte, dass die Grundlage der Netzstrukturen durch die Umlagerung des Zytoskeletts entsteht, scheint die Interaktion des Antikörper selbst die treibende Kraft für die Strukturbildung zu sein (Singethan et al., 2008). Zusammenfassend ist zu sagen, dass die Ergebnisse die Relevanz des CD9-Moleküls in gesunden und pathogenen Zell-Zellfusionsprozessen unterstreichen und eindeutig zeigen, dass CD9 die Zellfusion von CDV steuern kann, indem es den Zugang der Fusionsmaschinerie zu den Zellgrenzen reguliert. Das Nipah-Virus (NiV) ist ein hochpathogenes Paramyxovirus, das in Schweinen eine Erkrankung des Respirationstrakts und in Menschen eine schwere fiebrige Enzephalitis mit hohen Mortalitätsraten verursacht. Da es noch keine Vakzine bzw. antivirale Medikamente gegen dies Erkrankung gibt, war die Entwicklung kleiner inhibitorischer Moleküle notwendig. Für das Masern-Virus (MV) wurden bereits kleine Inhibitoren, wie Ox-1, AM-2 und AS-48 entwickelt, die in die Bindungstasche des MV F-Proteins passen und so die Membranfusion verhindern. Basierend auf struktureller Ähnlichkeiten der Paramyxovirus F-Proteine konnte ein Testsystem mit F- und H- oder G-exprimierenden Vektoren entwickelt werden, indem eine Gruppe von Chinolon-Derivaten sowie mehrere andere Substanzen auf ihre Fähigkeit untersucht wurden, die eine MV-, CDV- oder NiV-spezifische Fusion zu hemmen. Dazu wurde zuerst die Zytotoxizität aller Substanzen bewertet, um anschließend ihre Hemmungsaktivität in Zell-Zellfusion-Assays zu untersuchen. So inhibierten zwei Substanzen, QED15B - 12 und QED15A - 12, aus der Gruppe der Chinolon-Derivate die NiV-induzierte Synzytienbildung in Hüllprotein-Transfektions- und Infektions-Assays. Bei molekularen Untersuchungen der Bindungstasche des NiV F-Proteins wurde die hemmende Aktivität beider Chinolon-Derivate bestätigt. So konnte eine hervorragende Wechselwirkung und strukturelle Paßform für die Protein-Bindetasche identifiziert werden und deren Interaktion bewiesen werden. Somit konnte die Substanzklasse der Chinolone als Inhibitoren gegen die NiV-Fusion identifiziert und der Mechanismus der Interaktion mit der Bindetasche als Grund für die inhibierende Wirkung aufgeklärt werden (Niedermeier S. und Singethan K. et al., 2008 zur Veröffentlichung eingereicht). Dabei sind diese Chinolon-Derivate mit ihrer Struktur, die völlig verschieden von den meisten aktiven Molekülen gegen die Masern-induzierte Zellfusion sind, eine vielversprechende neue Verbindungsstruktur, auf der weitere Entwicklungen neuer Inhibitoren und antiviraler Agentien aufgebaut werden können. Letztlich sollte ein Testsystem für Untersuchungen der Dengue-Virus… N2 - Members of the tetraspanin family including CD9 contribute to the structural organization and plasticity of the plasma membrane. K41, a CD9-specific mAb, inhibits canine distemper virus (CDV) induced cell-to-cell fusion and virus release, whereas measles virus (MV) induced cell-to-cell fusion is not affected. The extracellular domain of the viral haemagglutinin (H) of CDV determines the susceptibility of cell-cell fusion to certain CD9-antibodies, however does not itself bind to CD9. This suggested that structural alterations of the plasma membrane influencing the activity and/or spatial expression pattern of receptors are involved. In the present thesis we found that K41, which recognizes a conformational epitope on the large extracellular loop (LEL) of CD9, induces rapid relocation and clustering of CD9 in net-like structures especially at contact areas between two cells. The high resolution analyses by confocal and electron microscope revealed that CD9 clustering is accompanied by the formation of microvilli-like protrusions that are formed from both sides of adjacent cell surfaces. After about 2 h to 20 h the protrusions are forming more and more structures like microvilli zippers. While the cellular CD9-associated protein EWI-F is co-clustering with CD9 at cell contact areas after and before mAb K41 treatment, the ß1-integrin can only partially be found within the CD9 structures built at the cell interfaces. In contrast viral proteins in infected cells were differentially affected by the treatment of mAb K41. While MV envelope proteins were detected within the microvilli zippers, the CDV proteins were displaced and excluded from CD9 clusters. The exclusion of the viral fusion machinery and its physical separation from cell contact areas explains the inhibition of virus-induced cell-cell fusion by K41. Since we have no experimental support that signal transduction and remodeling of the cytoskeleton may drive the clustering, it is more likely that the antibody interaction on the cell surface is the driving force (Singethan et al., 2008). Although it is known that LEL is interacting with ß1-Integrin and inducing signaling pathways within the cell, it was not possible to find any evidence for the involvement of any signaling pathway.The findings underscore the relevance of the tetraspanin CD9 for healthy and pathogenic cell-to-cell fusion processes and clearly show that CD9 can regulate cell-cell fusion by controlling the access of the fusion machinery of CDV to cell contact areas. Nipah virus (NiV), a highly pathogenic paramyxovirus, causes a respiratory disease in pigs and severe febrile encephalitis in humans with high mortality rates. There is no vaccine and no antiviral treatment available until now. Small molecule inhibitors, like Ox-1, AM-2 or AS-48, fitting into a pocket of the measles virus (MV) F protein and preventing membrane fusion have been designed earlier. Based on the structural similarity of viral fusion (F) proteins within the family Paramyxoviridae, we tested a library of quinolone derivatives and several other small molecules in a NiV, CDV and MV envelope protein-based fusion assay. The cytotoxicity of all substances was evaluated and they were tested for their ability to inhibit cell-to-cell fusion induced by the three mentioned viruses. The most active molecules, QED15A-12 and QED15B-12, inhibiting the syncytium formation induced by transfection of pCz-CFG5-NiV-F and -G and infection with NiV, revealed aan active quinolone-type compound structure, which is different from the most active molecules against MV induced cell fusion. In conclusion, this study revealed a class of promising compounds fitting into a protein cavity of the NiV F protein and inhibiting NiV-induced cell-cell fusion (Niedermeier S. and Singethan K. et al., 2008 submitted for publication). Finally we had the aim to establish a test system for investigations of the Dengue-Virus envelope protein induced virus-cell fusion using DENV-E pseudotyped retroviral particles. This should open an experimental way to develop small inhibitory peptides and molecules against the Dengue E-protein, which mediates the fusion of the viral membrane with the cellular membrane, working under BSL-2 conditions. As there is not sufficient information about intermediate conformational stages of the class II fusion proteins during the fusion process, similarities to the class I proteins should help to develop highly active antiviral peptides inhibiting this process. Although cloning of DENV-3-E-cDNA in the pCG-eGFP vector lead to a high expression of the E-protein, the test system based on pseudotyped retroviral particles could not be established. Even though there were used several different modification strategies like exchanging 3´protein tails in order to get a protein with a tail of the envelope protein of MuLV, which should lead to a better packaging into the pseudotyped particle system based on MuLV… KW - Membranfusion KW - Paramyxoviridae KW - Falviviridae KW - Membrane fusion KW - Paramyxoviridae KW - Falviviridae Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36344 ER -