TY - THES A1 - Mordhorst, Ines Louise T1 - Phylogenetische und funktionelle Analysen zur Kapsel O-Acetyltransferase NeuO von Escherichia coli K1 T1 - Phylogenetic and functional analysis on the capsule O-acetyltransferase NeuO of Escherichia coli K1 N2 - Escherichia coli ist ein Kommensale des menschlichen und tierischen Gastrointestinaltraktes. Einige E. coli-Stämme sind in der Lage, extraintestinale Erkrankungen beim Menschen wie Harnwegsinfekte, Neugeborenen-Meningitis und Sepsis, sowie beim Tier aviäre Coliseptikämien, hervorzurufen. Ein wichtiger Virulenzfaktor des Bakteriums ist dabei die aus α-2,8-verknüpften Sialinsäuremonomeren aufgebaute K1-Kapsel, die phasenvariabel mit einer hohen Frequenz O-acetyliert werden kann. Im Jahr 2005 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem für die O-Acetylierung verantwortlichen Enzym um die O-Acetyltransferase NeuO handelt, die von dem K1-spezifischen Prophagen CUS-3 codiert wird. Die Verteilung von neuO in der E. coli K1-Population sowie die funktionelle Relevanz der K1-Kapsel O-Acetylierung für das Bakterium waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit weitestgehend unklar. Eine E. coli K1-Stammsammlung mit 183 Isolaten wurde aufgebaut. Die E. coli K1-Isolate stammten sowohl aus Stuhlproben gesunder Freiwilliger, humanen Harnwegsinfekten, humanen invasiven Erkrankungen (Neugeborenen-Meningitis und Bakteriämie) und aus an Coliseptikämie erkrankten Vögeln. Die Isolate der E. coli K1-Stammsammlung wurden mit der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) typisiert. Es konnten 39 Sequenztypen (ST) sowie fünf Sequenztyp-Komplexe (STC) identifiziert werden. Bei dem mit Abstand häufigsten STC handelte es sich um den STC95, dem 80 Stämme (44%) angehörten. Insgesamt 103 der 183 E. coli K1-Stämme waren neuO-positiv (56%). Das Gen wurde in 78 (98%) der STC95-Isolate, aber nur in 25 (24%) der 103 nicht-STC95-Stämme gefunden. NeuO war also mit dem STC95 assoziiert. Über Sequenzanalysen des CUS-3-Prophagen konnten CUS-3-Genotypen bestimmt werden. Die Gruppierung der CUS-3-Genotypen und der E. coli K1-ST sowie der anschließende Vergleich beider Gruppierungen miteinander offenbarte eine Segregation der Prophagen-Genotypen entsprechend der ST. Daher legen die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse eine Koevolution des Phagen mit seinem Wirt nahe. Einige humane und aviäre E. coli K1-Isolate waren weder auf Basis der MLST bzw. der CUS-3-Genotypisierung noch anhand des Vorhandenseins verschiedener, mit extraintestinal-pathogenen E. coli-assoziierter Gene voneinander unterscheidbar, was die Hypothese einer zoonotischen Transmission dieser Stämme unterstützt. In den in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen Analysen konnte weder ein Effekt der NeuO-vermittelten E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung auf die Fähigkeit der Bakterien an humane mikrovaskuläre Gehirnendothelzellen zu adhärieren oder in diese zu invadieren, noch auf die in vivo-Virulenz der Bakterien im Hühnermodell beobachtet werden. Die K1-Kapsel O-Acetylierung verringerte die in vivo-Kolonisierung des Hühner-Gastrointestinaltraktes und die in vitro-Biofilmbildung durch das Bakterium, wohingegen sie die Austrocknungsresistenz von E. coli K1 erhöhte. Möglicherweise dient die phasenvariable neuO-Expression und damit die E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung der Anpassung des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen. N2 - Escherichia coli is a commensal of the human and animal intestinal tract. Some strains have the ability to cause extraintestinal disease in humans such as urinary tract infections, neonatal meningitis and septicemia, but also animal infection such as avian colisepticemia. A major virulence factor of the bacterium is the K1 capsule composed of α-2,8-linked sialic acid monomers, which can be phase variably O-acetylated at a high frequency. In 2005, it was shown that the enzyme responsible for O-acetylation is the O-acetyltransferase NeuO, which is encoded by the K1-specific prophage CUS-3. The distribution of neuO as well as the functional relevance of the K1 capsule O-acetylation for the bacterium were largely unknown at the start of the thesis. A strain collection comprising 183 E. coli K1 strains was established. The E. coli K1 isolates derived from stool samples of healthy donors, human urinary tract infections, human invasive diseases like newborn meningitis and bacteremia, and from avian colisepticemia. All isolates were typed by multilocus sequence typing (MLST). Thirty-nine sequence types (ST) and five sequence type complexes (STC) were identified. The major share of the strains belonged to the STC95 (80 strains, 44%). 103 of 183 E. coli K1 strains were neuO-positive (56%). The gene was found in 78 (98%) STC95 isolates, but only in 25 (24%) of 103 non-STC95 isolates. Therefore, there was an association of neuO with the STC95. With the help of DNA sequencing of internal fragments of CUS-3, distinct CUS-3 genotypes were assigned. There was a segregation of CUS-3 genotypes according to STs, suggesting coevolution of the prophage CUS-3 and its host. Some human and avian isolates were indistinguishable with respect to MLST, CUS-3 genotyping and the presence of genetic markers associated with extraintestinal pathogenic E. coli, which was compatible with the hypothesis of zoonotic transmission of these strains. Functional analyses performed in this study neither revealed an impact of NeuO-mediated K1 capsule O-acetylation on the ability of the bacteria to adhere to or invade into human brain microvascular endothelial cells, nor on the in vivo virulence of the bacteria in a chicken infection model. K1 capsule O-acetylation decreased in vivo chicken gut colonization and in vitro biofilm formation, while increasing E. coli K1 desiccation resistance. This study provides evidence that phase variable neuO expression and the subsequent O-acetylation of the E. coli K1 capsule serves as an efficient tool for the adaptation to changing environments. KW - Escherichia coli KW - Kapsel KW - Biofilm KW - Phylogenie KW - Virulenzfaktor KW - Acetylierung KW - Genexpression KW - O-Acetylierung KW - Multilokus-Sequenztypisierung KW - O-acetylation KW - multilocus sequence typing Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47880 ER - TY - THES A1 - Müller, Sophia T1 - Molekulare Untersuchungen zur Rolle von Homeobox-Genen bei der Entwicklung von Echinococcus multilocularis T1 - Molecular analysis of the impact of homeoboxgenes in the development of Echinococcus multilocularis N2 - Die alveoläre Echinokokkose ist eine, vorrangig in der nördlichen Hemisphäre verbreitete, parasitäre Erkrankung. Verursacht wird sie beim Menschen durch das Larvenstadium des Fuchsbandwurms. Homeoboxgene sind hochkonservierte Gene, die die Morphogenese von Lebewesen steuern. Die Anzahl und die Bedeutung von Homeoboxgenen in der Entwicklung von E.multilocularis waren bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe von Sequenzanalysen im Genom des Fuchsbandwurms erstmals Homeoboxgene identifiziert und deren Expressionsmuster mittels PCR in verschiedenen Larvenstadien charakterisiert werden. Von insgesamt 23 gefundenen Homeoboxgenen wurden 15 Gene auf ihre larvenstadienspezifische Expression untersucht. Neun der untersuchten Gene zeigten in dem gewählten Versuchsaufbau eine Expression in den untersuchten Larvenstadien, fünf davon zeigten eine verstärkte Expression in den späten Larvenstadien. Für acht dieser neun Gene ließen sich darüber hinaus Hinweise auf eine Prozessierung ihrer mRNA über den Mechanismus des Trans-Spleißens finden. Vorangehende Versuche der Arbeitsgruppe von Prof. Brehm hatten einen Zusammenhang zwischen einer Stimulation früher Entwicklungsstadien der Parasitenlarven mit dem Zytokin BMP-2 und dessen rascherer Entwicklung in spätere Entwicklungsstadien nahegelegt. Die Auswirkung einer Behandlung früher Entwicklungsstadien mit dem Zytokin BMP-2 auf die jeweilige Genexpression wurde daher für die ausgewählten 15 Gene überprüft. Fünf Gene zeigten unter dessen Einfluss eine verstärkte Expression. Zwei darunter waren solche, die eine stärkere Expression in späten Larvenstadien aufwiesen. Diese zwei Gene stellen nun Kandidaten dar, die an der Entwicklung von E.multilocularis maßgeblich beteiligt sein könnten. Durch die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben sich wichtige Hinweise auf die Entwicklung und die Regulationsmechanismen der Genexpression von E. multilocularis. Sie bilden eine Grundlage, die Rolle der Homeoboxgene für den Fuchsbandwurm näher zu beschreiben und die hormonelle Kreuzregulation zwischen Parasit und Wirt weiter zu studieren. N2 - Alveolar Echinococcosis is a rather rare parasitic disease, mainly occuring in the northern hemisphere. It is caused by the larval stage of the flatworm Echinococcus multilocularis. Homeoboxgenes are highly conserved genes, that play a crucial role in the development of organism. Until now neither the number in nor the importance of these genes for E.multilocularis was known. Within this study we could identify the homeoboxgenes in the genome of E.multilocularis and analyse the expression pattern in different larval stages. All together we found a number of 23 homeoboxgenes, the expression pattern in different larval stages was analysed for 15 genes. Within the chosen experimental setup nine of the genes were expressed, five showed higher expression in later larval stages. Furthermore there was a strong hint for the processing of mRNA through trans-splicing for eight genes. Previous experiments of the working group Brehm had shown a relation between a stimulation of young metacestodes with the cytokine BMP-2 and a faster development towards later larval stages. Therefore we anaylsed the effect of the cytokine BMP-2 on the geneexpression pattern of fifteen genes. Under its influence five genes showed higher expression rates. Two belonged to the group of genes that had shown higher expression in later larval stages. These two genes could potentially be candidates with a high significance in the development of E.multilocularis. Due to this work we could elucidate important hints for the development of E.multilocularis and the regulation of its gene expression. Based on these findings it will be possible to study the role of homeoboxgenes and the host-parasite cross-regulation in E.multilocularis in more detail. KW - Fuchsbandwurm KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Entwicklungsbiologie KW - Genexpression KW - Bandwürmer KW - Eucestoda KW - Parasit KW - Homeobox-Gene KW - Hox-Gene KW - Trans-Spleißen KW - BMP KW - Echinococcus multilocularis KW - BMP KW - trans-splicing KW - homeoboxgenes KW - hoxgenes Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35616 ER - TY - THES A1 - Ye, Fang T1 - The role of DNA supercoiling in the coordinated regulation of gene expression in Helicobacter pylori N2 - Summary Mechanisms of global gene regulation in bacteria are not well characterized yet. Changes in global or local supercoiling of chromosomal DNA are thought to play a role in global gene silencing and gene activation. In Helicobacter pylori, a bacterium with few dedicated transcriptional regulators, the structure of some promoters indicates a dependency on DNA topology. For example, the promoter of the major flagellar subunit gene flaA (ó28-dependent) has a shorter spacing of 13 nucleotides (nt) in comparison to the consensus promoter (15 nt). Supercoiling changes might be a mechanism of gene-specific and global transcriptional regulation in this bacterium. The aim of this study was to elucidate, if changes in global supercoiling have an influence on global gene regulation in H. pylori, and on the temporal regulation of the flagellar biosynthesis pathway in this organism. In the present work, global DNA supercoiling in H. pylori was visualized for the first time, by determining the supercoiling state of plasmids under different growth conditions. Using this method, we showed that cellular supercoiling was clearly growth phase-dependent in H. pylori. Coinciding with increased supercoiling during the growth phases, transcription of the flaA gene was increased, while the transcription of a second ó28-dependent gene with regular promoter spacing (HP0472) was reduced, supporting the hypothesis that growth phase-dependency of promoters might be mediated by changes of DNA topology. Supercoiling in H. pylori could be influenced in a reproducible fashion by inhibition of gyrase using novobiocin, which led to DNA relaxation and to a concomitant decrease of flaA transcript levels. Promoter spacer mutagenesis of the flaA promoter was performed. With flaA promoters of increased or reduced length, transcription of flaA was reduced, less susceptible to supercoiling changes, and, under specific conditions, inverted as compared to the wild type promoter. Transcriptional interdependence between the coupled topA-flaB genes and flaA was found by analysis of the flaA promoter mutants. Chromosomally linked gyrA-flgR, and topA-flaB genes were all dependent on supercoiling and coregulated with each other. Comprehensive transcript profiling (DNA microarrays) of wildtype H. pylori with and without novobiocin treatment identified a number of genes (10% of total genes), including flagellin, virulence and housekeeping genes, which were strongly dependent on and appeared to be synchronized by supercoiling changes (transcriptional up- or downregulation). These findings indicate a tightly coupled temporal regulation of flagellar biogenesis and metabolism in H. pylori, dependent on global supercoiling. A specific group of genes was also regulated in H. pylori by overexpression of Topoisomerase I, as detected by genome-wide analysis (DNA microarray). The DNA-bending protein HU is thought to be responsible for influencing the negative supercoiling of DNA, through its ability to wrap DNA. HU is encoded by the hup single gene in H. pylori, and constitutively expressed during the whole growth curve. An H. pylori hup mutant was constructed. H. pylori cells lacking HU protein were viable, but exhibited a severe growth defect. Our data indicate that the lack of HU dramatically changes global DNA supercoiling, indicating an important function of HU in chromosome structuring in H. pylori. Transcriptome analyses were performed and demonstrated that a total of 66 genes were differentially transcribed upon hup deletion, which include virulence genes and many other cell functions. The data indicate that HU might act as further important global regulator in H. pylori. Increased gene expression of heat shock proteins and a decreased transcription of the urease gene cluster may indicate a co-ordinated response of H. pylori to changes of environmental conditions in its specific ecological niche, mediated by HU. After the whole genomic sequences of H. pylori strains 26695 and J99 were published, two ORFs (HP0116 and HP0440) were presumptively annotated as topoisomerase I orthologs. HP0116 is the functional H. pylori topoisomerase I (TopA). HP0440 (topA2) was found in only few (5 of 43) strains. Western blot analysis indicated that TopA2 is antigenically different from TopA. TopA2 is transcribed in H. pylori, but the protein must be functionally different from TopA, since it is lacking one functionally essential zinc finger motif, and was not able to functionally complement a TopA-deficient E. coli. Like topA, topA2 was also transcribed in a growth phase-dependent manner. We did not find a function of TopA2 in DNA structuring or topology, but, in the present study, we were able for the first time to establish a unique function for TopA2 in global gene regulation, by comprehensive transcriptome analysis (DNA microarray). Transcriptome analysis showed that a total of 46 genes were differentially regulated upon topA2 deletion, which included flagellar genes and urease genes. These results suggest that TopA2 might act as a novel important regulator of both flagellar biosynthesis and urease in H. pylori. N2 - Zusammenfassung Die Mechanismen der globalen Kontrolle der Genregulation bei Bakterien sind bisher noch wenig charakterisiert. Unterschiede in der globalen oder lokalen Topologie der chromosomalen DNA spielen wahrscheinlich eine Rolle bei der globalen Kontrolle der Genexpression. Bei Helicobacter pylori, einem Bakterium mit wenigen funktionell definierten Transkriptionsregulatoren, spricht die Struktur einiger Promotoren dafür, daß sie durch die DNA-Topologie kontrolliert werden. Der Promotor des Hauptflagellingens flaA, ein Sigma-28 abhängiger Promotor, hat ein gegenüber dem Konsensuspromotor (15 Nukleotide) verkürztes Spacing von 13 Nukleotiden. Veränderungen der DNA-Superhelizität könnten ein Mechanismus der genspezifischen und globalen transkriptionellen Kontrolle in diesem Bakterium sein. Ziel dieser Untersuchungen war es zu zeigen, ob Veränderungen des globalen Supercoiling-Niveaus einen Einfluß auf die globale Genregulation von H. pylori haben und ob sie sich auf die zeitlich gesteuerte Regulation der Geißelbiosynthese (Beweglichkeitsorganell; essenzieller Virulenz- und Persistenzfaktor von H. pylori) in diesem Organismus auswirkt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Niveau der DNA-Superspiralisierung bei H. pylori erstmals durch Visualisierung des Supercoilingzustands von Plasmiden unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen dargestellt. Wir konnten mit dieser Methode zeigen, daß das zelluläre Supercoiling-Niveau bei H. pylori in Abhängigkeit von der Wachstumsphase stark variiert. In Wachstumsphasen mit erhöhtem Supercoiling war auch die Transkription des flaA-Gens erhöht, während die Transkription eines zweiten Sigma-28-abhängigen Gens mit normalem Promotorabstand (HP0472) reduziert war. Dieser Befund stützte die Hypothese, daß die wachstumsphasenabhängige Aktivität dieser Promotoren durch Veränderungen der DNA-Topologie bewirkt wird. Das Supercoiling-Niveau konnte reproduzierbar durch Hemmung der Gyrase mit Novobiocin beeinflusst werden. Die Gegenwart von Novobiocin führte zur DNA-Relaxation und zu einem gleichzeitigen Absinken der Transkription von flaA. Es wurde eine gerichtete Mutagenese der Promotor-Spacer-Region des flaA-Promotors durchgeführt. Die Verlängerung oder Verkürzung des H.pylori flaA-Promotors führte zu einer verminderten Transkription von flaA, sowie zu reduzierter Empfindlichkeit der Promotoraktivität gegenüber Veränderungen des Supercoiling-Niveaus. Unter spezifischen Bedingungen war die Supercoiling-Abhängigkeit umgekehrt im Vergleich zum Wildtyppromotor. Es konnte weiterhin eine inverse transkriptionelle Abhängigkeit zwischen dem gekoppelten Genpaar topA-flaB und flaA durch Analyse der flaA-Promotormutanten nachgewiesen werden. Auch die chromosomal gekoppelten Gene gyrA und flgR sowie topA und flaB waren abhängig vom Supercoiling-Zustand und miteinander koreguliert. Die Analyse des Transkriptoms von H.pylori-Wildtypbakterien mit DNA-Microarrays mit und ohne Novobiocinbehandlung führte zur Identifizierung von zahlreichen Genen (etwa 10% des Gesamttranskriptoms), deren Expression Supercoiling-abhängig war und durch Veränderungen des Supercoilings synchronisiert verändert werden konnte. Unter diesen waren Flagellin-, andere Virulenz-, sowie Grundstoffwechsel-Gene. Diese Befunde weisen auf eine enge Verbindung zwischen der chronologischen Kontrolle der Flagellen-Biogenese und des Metabolismus bei H. pylori, die gemeinsam durch das Supercoiling-Niveau gesteuert werden. Eine definierte Gruppe von Genen konnte bei H.pylori durch Überexpression von Topoisomerase-1 reguliert werden. Das Protein HU beeinflusst ebenfalls das Supercoiling-Niveau von DNA durch seine Fähigkeit, DNA zu biegen. HU wird bei H. pylori durch das Gen hup kodiert und ist während sämtlicher Wachstumsphasen konstitutiv exprimiert. Eine HU-defiziente Mutante wurde konstruiert. Zellen, die kein HU-Protein exprimierten, waren lebensfähig, zeigten aber einen deutlichen Wachstumsdefekt. Unsere Daten weisen daraufhin, daß der Mangel von HU sich dramatisch auf das globale DNA-Supercoiling-Niveau auswirkt, und sprechen für eine wichtige Funktion von HU bei der Kontrolle der DNA-Struktur von H. pylori. Mittels DNA-Microarray-Hybridisierung wurden die Transkriptome von H. pylori-Wildtyp und HU-Mutante miteinander verglichen. Die Ergebnisse zeigen, daß insgesamt 66 Gene in der HU-Mutante differentiell transkribiert werden, darunter Virulenzgene und Gene für viele andere Zellfunktionen. Diese Daten deuten darauf hin, daß auch HU eine wichtige Rolle in der Kontrolle der globalen Genexpression bei H. pylori spielt. Die erhöhte Expression von Hitzestress-Proteinen, verbunden mit einer verminderten Transkription des Ureasegenclusters, könnte auf eine koordinierte Antwort der Bakterien auf Veränderungen der Umweltbedingungen in ihrer spezifischen ökologischen Nische hinweisen. Nach der Publikation der Gesamtgenomsequenzen von H.pylori 26695 und J99 wurden 2 ORFs (HP 0116 und HP 0440) als Topoisomerase-1-Orthologe annotiert. HP 0116 ist das funktionelle H.pylori Topoisomerase-1-Gen. HP 0442 (topA2) wurde nur in wenigen (5 aus 43) Stämmen nachgewiesen. topA2 ist trotz seines seltenen Vorkommens kein Pseudogen und wird in H.pylori transkribiert. Westernblot-Analysen sprechen dafür, daß TopA2 sich antigenetisch von TopA unterscheidet. Das TopA2-Protein unterscheidet sich ebenfalls funktionell von TopA, da ihm ein funktionell essentielles Zinkfingermotiv fehlt. TopA2 konnte außerdem eine TopA-defiziente E.coli-Mutante nicht funktionell komplementieren. Wie bei topA war auch die Transkription von topA2 von der Wachstumsphase abhängig. Eine Funktion von TopA2 bei der Kontrolle der DNA-Topologie konnte bisher nicht nachgewiesen werden, Transkriptomanalysen zeigten aber, dass TopA2 eine klare Regulationsfunktion hat, da die topA2-Mutante gravierende Veränderungen des Transkriptoms gegenüber dem Wildtyp aufwies. Diese Untersuchungen zeigten, daß 46 Gene in der TopA2-Mutante differentiell reguliert wurden, darunter Flagellengene und Ureasegene. Die Ergebnisse sprechen dafür, daß TopA2 ein weiterer wichtiger Regulator von sowohl Flagellenbiosynthese als auch Ureasebildung bei H.pylori sein könnte. KW - Helicobacter pylori KW - Genexpression KW - Flagelline KW - Supercoiling KW - regulation KW - flagella Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9878 ER - TY - THES A1 - El-Barkani, Abdelmalic T1 - Molekulargenetische Charakterisierung des pH-regulierten Dimorphismus und der pH-abhängigen Genexpression von Candida albicans und Entwicklung eines Reportersystem für Candida glabrata T1 - Molecular genetic Characterisation of the pH Regulated Dimorphism and the pH Dependent Gene Expression of Candida albicans and Development of a Reporter System for Candida glabrata N2 - Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können. N2 - Morphological development of the fungal pathogen C. albicans is profoundly affected by environmental signals. This morphological flexibility is considered an essential factor for pathogenicity of C. albicans. One of the important signals that regulates morphology of C. albicans is the ambient pH. Acidic pH restricts growth to the yeast form, whereas neutral pH permits development of the filamentous form. Superimposed on the pH restriction is a temperature requirement of approximately 37°C for filamentation. C. albicans responds to changes in environmental pH by differential expression of several genes including PHR1 and PHR2. PHR2 is an acid expressed gene that is not expressed at detectable levels above pH 6.5. Mutants lacking PHR2 are unable to grow at acidic pH and exhibit morphological defects. PHR1 is an alkaline expressed gene with the inverse pattern of expression. PHR1 and PHR2 encode functionally homologous proteins involved in cell wall biosynthesis, which is pivotal in determining cell shape changes during morphogenesis. The role of pH in development was investigated in this work by selecting revertants of phr2D mutants that had gained the ability to grow at acid pH. The extragenic suppressors in two independent revertants were identified as nonsense mutations in the pH response regulator RIM101 that resulted in a carboxy-terminal truncation of the open reading frame. These dominant active alleles conferred the ability to filament at acidic pH, to express PHR1, an alkaline expressed gene, at acidic pH and to repress the acid expressed gene PHR2. This indicates that RIM101 is a key regulator of the pH-dependent dimorphism in C. albicans. Furthermore these results suggest that the molecular mechanisms which control pH-dependent gene expression in Aspergillus nidulans and other fungi are also conserved in C. albicans. It was also observed that both the wild type and mutant alleles could act as multicopy suppressors of the temperature restriction on filamentation, allowing extensive filamentation at 29°C. This observation suggests that two environmental signals, pH and temperature, converge on common molecular targets. The ability of the activated alleles to promote filamentation was dependent upon the developmental regulator EFG1. The results suggest that RIM101 is responsible for the pH-dependence of hyphal development. C. albicans and C. glabrata are opportunistic pathogens which are able to colonize and infect many tissues and organs. This indicates that these organisms are well adapted for survival within the diverse environmental niches of the human host. C. albicans responds to different environmental signals, as described above, with the expression of certain genes, e.g. PHR1, PHR2 and RIM101. In contrast to C. albicans the gene regulation in the emerging pathogen C. glabrata is poorly understood. In order to develop a reporter system allowing studies on regulated gene expression in C. glabrata the functionality of the E. coli lacZ gene as a reporter of gene expression in C. glabrata was investigated. C. glabrata shuttle vectors suitable for the construction of translational fusions of a gene of interest to the E. coli lacZ reporter were generated. By fusing different promoters to the lacZ gene it could be shown that the E. coli lacZ gene provides a sensitive and inducible reporter displaying b-galactosidase activity in C. glabrata. KW - Candida albicans KW - Wasserstoffionenkonzentration KW - Genexpression KW - Torulopsis glabrata KW - Markierungsgen KW - Candida albicans KW - pH KW - Dimorphismus KW - Genexpression KW - RIM101 KW - Candida glabrata KW - Reportergen KW - Candida albicans KW - pH KW - dimorphism KW - gene expression KW - RIM101 KW - Candida glabrata KW - reporter gene Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1125 ER -