TY - THES A1 - Klüpfel, Marina Anna T1 - Lagedarstellung und -Bewertung durch den Einsatz des Windmühlenmodells - Einführung und Nutzung im Rahmen der SARS-CoV-2 Pandemie T1 - Situational report and assessment using the windmill model – implementation and application during the SARS-CoV-2 pandemic N2 - Bei Großschadensereignissen oder Katastrophen arbeiten die Einsatzkräfte verschiedener Organisationen und Krankenhäuser zusammen, um die Schadenslage zu bewältigen. Für die Koordinierung dieser Einsätze benötigen die Führungskräfte ein möglichst genaues Bild der aktuellen Lage. Auch im Rahmen der SARS-CoV-2- Pandemie war eine Übersicht über die Versorgungslage der Krankenhäuser erforderlich, um mögliche lokale Ressourcenengpässe frühzeitig zu erkennen und durch geeignete Maßnahmen zu beheben. Zu diesem Zweck wurde in Bayern im November 2021 das Windmühlen-Modell eingeführt. Basierend auf einer Online-Plattform meldeten die zuständigen Bezirkskoordinierenden der bayerischen Regierungsbezirke täglich die Versorgungslage ihrer Kliniken anhand der Komponenten Personal, Material und Raum. Außerdem gab es die Möglichkeit zur Dokumentation von Patientenverlegungen. Die über die Windmühlen-Onlineplattform gesammelten Lagemeldungen und dokumentierten Verlegungen des Zeitraums von 21. November 2021 bis 20. Februar 2022 wurden in der vorliegenden Arbeit detailliert aufbereitet. Zusätzlich wurden die erfassten Daten statistisch ausgewertet und mit den örtlichen 7-Tage-Inzidenzwerten des SARS-CoV-2-Virus verglichen. Durch das Windmühlen-Modell konnten Unterschiede in der Versorgungslage zwischen den Regierungsbezirken sehr effektiv sichtbar gemacht werden. Insgesamt waren Intensivstationen deutlich stärker belastet als Normalstationen. Die Versorgungsqualität war in Covid-Bereichen stärker beeinträchtigt als auf Stationen ohne Covid-Patienten. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Windmühlen-Lagemeldungen nicht allein die regionalen Inzidenzwerte, sondern die tatsächliche Versorgungssituation vor Ort abbilden. Die dokumentierten Interhospitaltransfers erfolgten von Regionen mit hohen Inzidenzwerten und schlechter Ressourcenverfügbarkeit in Bezirke mit weniger kritischer Versorgungslage. Damit konnten aus den Windmühlen-Lagemeldungen auch konkrete Handlungskonsequenzen, wie strategische Patientenverlegungen, abgeleitet werden. Lagemeldungen sind wichtig für die abgestimmte Zusammenarbeit verschiedener Stellen bei der Bewältigung einer Krise. Die etablierten Systeme zur Lageerfassung sind meist quantitativ ausgelegt und nur wenig skalierbar. Die Anwendung in einem neuen Kontext erfordert oft zeitaufwändige Anpassungen. Im Gegensatz dazu bietet das Windmühlen-Modell eine skalierbare, eher qualitativ ausgerichtete Lagedarstellung und ist aufgrund seines unkomplizierten Aufbaus innerhalb kürzester Zeit für eine Nutzung in verschiedensten Schadenslagen adaptierbar. N2 - During large-scale emergencies and disasters, relief units and hospital staff work together to manage the critical situation. Command and control structures need a detailed situational assessment to coordinate relief efforts. During the SARS-CoV-2 pandemic an overview of hospital supplies and resources was vital to detect local shortages early and find appropriate measures to resolve them. For this purpose, the windmill model was implemented in Bavaria, Germany, in November 2021. Based on an online platform, the seven Bavarian districts gave daily updates on their hospitals’ situation regarding staff, supplies and space. Additionally, there was a tool to record patient transfers to different hospitals. In the dissertation at hand the data collected by the windmill-online platform from 21. November 2021 to 20. February 2022 was evaluated, statistically analyzed and compared to the local 7-day-incidence rates of SARS-CoV-2 virus. The windmill model was able to very effectively showcase differences in strain on the hospital care capacities amongst the districts. Overall, the intensive care units were burdened more heavily than standard care units. The quality of hospital care on Covid-wards was impaired more strongly than on non-Covid-wards. This thesis provides evidence for the windmill situation reports not only depicting the local incidence rates but portraying the actual current hospital care capacities in the districts. The documented patient transfers took place from regions with high incidence rates and poor resource availability to districts with a less critical situation. Thus, specific consequences, like strategic patient transfers, were deduced from situational reports in the windmill model. Situational reports are crucial in collaboration for crisis management. Established systems for situational assessment are often based on quantitative analysis and lack scalability. Using those in a different scenario would require time-consuming adaptations. In contrast the windmill model provides a scalable more qualitatively based situational assessment and is, due to its straightforward format, quickly adaptable to use in any future disaster. KW - Katastrophenmedizin KW - Massenanfall von Verletzten oder Erkrankten KW - Notfallmedizin KW - Einsatzleitung KW - Lagedarstellung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369595 ER - TY - THES A1 - Starz, Katharina Theresa T1 - Das Sharenting in der Zivilrechtsdogmatik : zu den Grenzen elterlicher Dispositionsbefugnis über das Persönlichkeitsrecht des Kindes T1 - Sharenting in Civil Law Dogmatics : On the Limits of Parental Power of Disposition over the Personal Rights of the Child N2 - Im Zeitalter der sozialen Medien ist es für viele Eltern zur Gewohnheit geworden, nicht nur sich selbst, sondern auch das eigene Kind der Internetgemeinschaft zu präsentieren. Diese Praxis wird als "Sharenting" ("to share" + "parenting“) bezeichnet. So kommt es, dass mittlerweile ein Großteil der Kinder bereits in sehr jungen Jahren einen - unfreiwilligen - digitalen Fußabdruck hinterlässt. Der freizügige Umgang mit den Daten des Kindes bringt zahlreiche rechtliche Probleme mit sich, welche an den Schnittstellen des Rechts zum Schutz der Persönlichkeit, des Datenschutzrechts und des Familienrechts zu verorten sind. Am Beispiel der Plattformen Facebook, Instagram und WhatsApp lotet Katharina Theresa Starz die Grenzen des rechtlich Zulässigen aus und zeigt auf, welche Konsequenzen sich ergeben können, wenn ebendiese Grenzen von den Eltern überschritten werden. Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369667 PB - Mohr Siebeck CY - Tübingen ER - TY - THES A1 - Pätzel [geb. Ditter], Katharina Sabine T1 - Molekulare Charakterisierung eines Mitgliedes der TNF-Rezeptor-Superfamilie des Fuchsbandwurmes \(Echinococcus\) \(multilocularis\) T1 - Molecular characterization of a TNF-receptor-superfamily member of \(Echinococcus\) \(multilocularis\) N2 - Die alveoläre Echinokokkose (AE), die durch den Fuchsbandwurm Echinococcus multilocularis verursacht wird, ist eine seltene jedoch schwere und oft tödlich verlaufende Erkrankung. Aufgrund der späten Diagnosestellung sind kurative Behandlungsmethoden häufig nicht durchführbar und als einzige Behandlungsmöglichkeit bleibt eine lebenslange und nebenwirkungsreiche Therapie mit Benzimidazolen. Verbesserte Therapieoptionen durch die Entwicklung neuer Medikamente sind dringend notwendig. Hierfür kann es hilfreich sein die Biologie des Fuchsbandwurmes und die Kommunikationswege zwischen Parasit und Wirt zu verstehen. Bereits in vorherigen Arbeiten als auch in dieser Arbeit erwiesen sich evolutionsgeschichtlich konservierte Signalwege als Kommunikationsweg zwischen dem Fuchsbandwurm und seinem Wirt von zentraler Rolle. Die Entschlüsselung des Echinococcus-Genoms gab Hinweise darauf, dass ein Mitglied der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie, jedoch kein endogener TNF α ähnlicher Ligand im Genom kodiert wird. Ein Mitglied der TNFR-Superfamilie des Fuchsbandwurmes (EmTNFR) wurde in dieser Arbeit als membranständiger Rezeptor mit einer intrazellulären Todesdomäne (DD) und hoher Ähnlichkeit zum humanen Typ 16 der TNF-Rezeptor-Superfamilie, auch 〖p75〗^NTR genannt, charakterisiert. Sowohl in bioinformatischen als auch in Sequenzanalysen wurden drei alternative Splicing-Formen von emtnfr (emtnfr, emtnfr-v2 und emtnfr-v3) nachgewiesen. emtnfr-v2 entsteht durch Alternatives Splicing und kodiert ein Protein, das keine intrazelluläre Todesdomäne besitzt. emtnfr-v3 verwendet einen alternativen Transkriptionstart und wird von den letzten 3 Exons von emtnfr kodiert. emtnfr-v3, kodiert ein Protein ohne extrazelluläre Region, aber mit intrazellulärer Todesdomäne. Ein löslicher TNF-Rezeptor konnte auf Proteinebene nicht nachgewiesen werden. Aufgrund von phylogenetischen Analysen und der Rezeptor-Struktur ist zu vermuten, dass EmTNFR ein p75NTR Homolog ist und damit der ursprünglichen Form der TNF-Rezeptoren entspricht. Mitglieder eines intrazellulären TNF-Signalweges wurden in bioinformatischen Analysen beim Fuchsbandwurm E. multilocularis identifiziert. Expressionsuntersuchungen zeigten sowohl in Trankriptomdaten als auch auf Proteinebene eine starke Expression von EmTNFR in Primärzellen und im Metazestoden (MZ), dem pathogenen Stadium für den Zwischenwirt. Echinococcus-Stammzellkulturen zeigten nach RNA-Interferenz-basiertem Knockdown des EmTNFR-kodierenden Gens deutliche Entwicklungsdefekte. Des Weiteren zeigten Echinococcus-Stammzellkulturen nach einer Behandlung mit TNF-α, einem potentiellen Liganden des TNF-Rezeptors und einem zentralen Zytokin in der Immunabwehr des Zwischenwirtes, Entwicklungsfortschritte, wie eine verbesserte Bildung von MZ aus Stammzellen. Zusätzlich wurde in whole-mount in situ Hybridisierungs-Versuchen eine ubiquitäre Expression von emtnfr in der Germinalschicht des MZ sowie eine Spezifität von emtnfr für den MZ, welcher ursächlich für die AE ist, nachgewiesen. Somit scheinen sowohl EmTNFR als auch TNF-α eine wichtige Funktion bei der Entwicklung und Etablierung des Fuchsbandwurmes während der frühen Phase der Infektion des Zwischenwirtes zu haben. TNF-α könnte ein weiterer Faktor für den ausgeprägten Organtropismus des Parasiten zur Leber sein, denn dort bestehen durch Kupfferzellen produzierte hohe lokale Konzentration von TNF-α. Zusammenfassend deuten die hier erarbeiteten Daten darauf hin, dass EmTNFR über die Bindung von Wirts-TNF-α bei der frühen Entwicklung des Echincoccus-Metazestoden eine Rolle spielt. N2 - Alveolar echinococcosis (AE), which is caused by the metacestode larval stage of the fox tapeworm Echinococcus multilocularis, is a rare but severe, often fatal disease. Due to late diagnosis and advanced spread of the infection curative therapy is often not possible and the only treatment option is benzimidazole chemotherapy, which often must be taken lifelong and has adverse side effects. Improvement of therapeutic options is thus urgently needed. To this end, a closer understanding of parasite biology and communication mechanisms between parasite and host are helpful. In this work, focus was laid on the possibility of host-parasite cross-communication involving an evolutionarily conserved signalling pathway. By mining the Echinococcus genome sequence, a gene encoding a member of the tumor necrosis-factor-receptor family (TNF-R), was identified. In this work, EmTNFR, a member of the TNF-R superfamily, of the fox tapeworm was identified as a membrane bound receptor with intracellular death domain and highest similarity to human TNFRSF 16, also called p75NTR. In in silico analysis and cDNA sequencing, 3 alternative splice forms of emtnfr (emtnfr-v1, -v2 and -v3) were found. emtnfr-v2 is the result of alternative splicing and encodes a protein lacking the intracellular death domain. emtnfr-v3 employs an alternative transcription start and is encoded by the last 3 exons of emtnfr. emtnfr-v3 encodes a protein without extracellular domain, but containing an intracellular death domain. A soluble TNF-receptor could not be found in proteomic analysis. Based on phylogenetic analysis and receptor structure, EmTNFR is thought to be a homolog of p75NTR, corresponding to the ancient form of TNF receptors. Members of an intracellular TNF signaling pathway were identified in bioinformatic analyses in the fox tapeworm E. multilocularis, indicating the presence of a full TNFR signalling pathway. Expression studies showed in transcriptome data and at protein level a strong expression of EmTNFR in primary cells and in the metacestode (MZ), the pathogenic stage for the intermediate host. Echinococcus stem cell cultures showed marked developmental defects after RNAi based knockdown of the EmTNFR-encoding gene. Furthermore, Echinococcus stem cell culture displayed accelerated developmental progress such as enhanced formation of MZ from stem cells after treatment with TNF-α, a potential ligand of the TNF receptor, and a central cytokine in the immune defense of the intermediate host. In addition, whole-mount in situ hybridization experiments demonstrated ubiquitous expression of emtnfr in the germinal layer of MZ and specificity of emtnfr for MZ, the causative agent of AE. Thus, both EmTNFR and TNF-α appear to have an important function in development and establishment of the fox tapeworm during the early phase of infection of the intermediate host. TNF-α could be an additional factor for the pronounced organ tropism of the parasite to the liver, caused by a high local concentration of TNF-α produced by Kupffer cells. In summary, the data generated in this work suggest that EmTNFR plays a role in the early development of Echinococcus metacestode via binding of host TNF-α. KW - Fuchsbandwurm KW - Wirt-Parasit-Beziehung KW - Parasit KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Echinococcus multilocularis KW - TNF-Rezeptor KW - Wirt-Parasiten-Interaktion KW - Molekulare Charakterisierung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369397 ER - TY - THES A1 - Bönninger, Solveig Eva T1 - Förderliche und hinderliche Faktoren im Trauerprozess von Nahestehenden eines*r Verstorbenen T1 - Supporting and Hindering Factors in the Grieving Process of Close Relatives of a Deceased Person N2 - Laut Statistischem Bundesamt (Destatis) starben allein im Jahr 2020 zirka 985.500 Menschen. Die häufigsten Todesursachen waren Herz-Kreislauf- und Krebs-Erkrankungen (vgl. Destatis 2020). Die meisten Menschen haben den Wunsch zuhause zu sterben, doch die Mehrheit stirbt in Krankenhäusern, Alten- und Pflegeheimen (vgl. DHPV 2017; Dasch et al. 2015). Der Tod eines nahestehenden Menschen kann bei Hinterbliebenen zu großen Belastungen, gesundheitlichen Problemen sowie einer gesteigerten Mortalität führen (vgl. Stroebe et al. 2007). Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von halbstandardisierten Interviews mit 30 Trauernden Faktoren herauszuarbeiten, die sich förderlich oder hinderlich auf den Trauerprozess auswirken können. Die Interviews wurden mit der Transkriptionssoftware f4transkript verschriftlicht und mittels qualitativer Inhaltsanalyse nach Mayring ausgewertet. Es entstand ein Kategoriensystem mit je vier Oberkategorien innerhalb der zwei Hauptkategorien, Förderliche und Hinderliche Faktoren. Folgende Faktoren konnten identifiziert werden: Förderliche Faktoren in der Oberkategorie Betreuung der erkrankten und trauernden Person sind eine gute Symptomkontrolle sowie der verständnisvolle Umgang mit den Nahestehenden, während mangelhafte Kommunikation wiederum hinderlich für eine positive Trauerbewältigung ist. In der Oberkategorie Intrapersonale Faktoren sind die Antizipation des Todes sowie die Auseinandersetzung mit der Trauer förderlich, während negative Gefühle (z.B. Schuldgefühle, Hilfslosigkeit) sich in besagter Hinsicht hinderlich auswirken. In der Oberkategorie Beziehung zur verstorbenen Person können die optimale Nutzung der verbliebenen Zeit sowie der offene Umgang mit der Erkrankung förderliche Faktoren darstellen, während ein “schwieriger“ Abschied sowie ungeklärte Konflikte oder offene Fragen Hindernisse für den Trauerprozess sein können. In der Oberkategorie Soziales Umfeld sind die unaufgeforderte Unterstützung, die emotionale Begleitung sowie ein flexibler Arbeitgeber förderlich. Streitigkeiten innerhalb der Familie und Unverständnis der Mitmenschen dagegen sind hinderlich. Eine gute und würdevolle Sterbebegleitung, wie sie in der Palliativmedizin in der Regel gewährleistet ist, ist von großer Bedeutung für einen gelingenden Trauerprozess. Daher sollte eine palliative Haltung disziplinübergreifend vorangebracht und ausgebaut werden. In der Gesellschaft sollte Trauernden mehr Toleranz und Verständnis entgegengebracht und offen mit dem Thema Tod und Sterben umgegangen werden. N2 - According to the German Federal Statistical Office (Destatis), approximately 985,500 people died in the year 2020 in Germany. The most common causes of death were cardiovascular diseases and cancer (cf. Destatis 2020). Most people wish to die at home, but the majority die in hospitals and care facilities (cf. DHPV 2017; Dasch et al. 2015). The death of a close person can lead to significant difficulties, health problems, and increased mortality among the bereaved (cf. Stroebe et al. 2007). The aim of this study was to identify factors that can have a supporting or hindering effect on the grieving process by conducting semi-structured interviews with 30 mourners. The interviews were transcribed using the f4transkript transcription software and evaluated using qualitative content analysis according to Mayring. A category system was developed with four subcategories within the two main categories, Supporting and Hindering Factors. The following factors were identified: Supporting factors in the subcategory "Care of the sick and grieving person" include good symptom control and understanding treatment of the relatives, while poor communication, in turn, is a hindrance to positive grief coping. In the subcategory "Intrapersonal factors", the anticipation of death and dealing with grief are supportive, while negative emotions (e.g., feelings of guilt, helplessness) have a hindering effect in this regard. In the subcategory "Relationship with the deceased person", optimal use of the remaining time and open handling of the illness can be supporting factors, while a "difficult" farewell and unresolved conflicts or open questions can be obstacles to the grieving process. In the subcategory "Social environment", unsolicited support, emotional companionship, and a flexible employer are supporting. Family disputes and a lack of understanding from others, on the other hand, are hindering. Good and dignified end-of-life care, as is generally ensured in palliative medicine, is of great importance for a successful grieving process. Therefore, a palliative attitude should be promoted and expanded across disciplines. In society, more tolerance and understanding should be shown to mourners, and the topic of death and dying should be dealt with openly. KW - Trauer KW - Trauerarbeit KW - Prolonged grief disorder KW - Trauerprozess KW - Soziales Umfeld KW - Beziehung zur verstorbenen Person KW - Medizinisch-psychologische Betreuung KW - Intrapersonale Faktoren KW - Milieu Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-364319 ER - TY - THES A1 - van Dorp, Joel T1 - Site-specific biomolecule modification for directed surface attachment T1 - Ortsspezifische Biomolekülmodifikation zur gezielten Oberflächenanbindung N2 - Site-directed bioorthogonal conjugation techniques have substantially advanced research in numerous areas. Their exceptional value reflects in the extent of applications, that have been realized with spacial-controlled bioorthogonal reactions. Specific labeling of surfaces, proteins, and other biomolecule allows for new generations of drug delivery, tracking, and analyzing systems. With the continuous advance and refinement of available methods, this field of research will become even more relevant in the time to come. Yet, as individual as the desired purpose is, as different can be the most suitable modification strategy. In this thesis, two different bioconjugation approaches, namely CuAAC and factor XIIIa mediated ligation, are used in distinct application fields, featuring eGFP as a model protein showcasing the advantages as well as the challenges of each technique. The introduction of a unique accessible functionality is the most critical feature of a site-specific reaction, and the first considerable hurdle to clear. While most surfaces, peptides, or small molecules might require less expenditure to modulate, equipping large biomolecules like proteins with additional traits requires careful consideration to preserve the molecule’s stability and function. Therefore, the first section of this project comprises the engineering of eGFP via rational design. Initially, wild-type eGFP was subcloned, expressed, and characterized to serve as a reference value for the designed variants. Subsequently, eGFP was mutated and expressed to display a recognition site for factor XIIIa. Additionally, a second mutant harbored a TAG-codon to enable amber codon suppression and consequently the incorporation of the alkyne bearing unnatural amino acid Plk to support a CuAAC reaction. Fluorescence spectroscopy was used to confirm that the fluorescent properties of all expressed muteins were identically equal to wild-type eGFP, which is a reliable marker for the intact barrel structure of the protein. Trypsin digestion and HPLC were deployed to confirm each protein variant's correct sequence and mass. The second part of this work focuses on the conjugation of cargo molecules deploying the chosen approaches. Solid-phase peptide synthesis was used to create a peptide that served as a lysine donor substrate in the crosslinking mechanism of FXIIIa. Additionally, the peptide was provided with a cysteine moiety to allow for highly flexible and simple loading of desired cargo molecules via conventional thiol-Michael addition, thus establishing an adaptive labeling platform. The effective ligation was critically reviewed and confirmed by monitoring the exact mass changes by HPLC. Protocols for attaching payloads such as biotin and PEG to the linker peptide were elaborated. While the biotin construct was successfully conjugated to the model protein, the eGFP-PEG linkage was not achieved judging by SDS-PAGE analysis. Furthermore, featuring isolated peptide sequences, the properties of the FXIIIa-mediated reaction were characterized in detail. Relative substrate turnover, saturation concentrations, by-product formation, and incubation time were comprehensively analyzed through HPLC to identify optimal reaction conditions. CuAAC was successfully used to label the Plk-eGFP mutein with Azide-biotin, demonstrated by western blot imaging. Within the last part of this study, the application of the conjugation systems was extended to different surfaces. As regular surfaces do not allow for immediate decoration, supplementary functionalization techniques like gold-thiol interaction and silanization on metal oxides were deployed. That way gold-segmented nanowires and Janus particles were loaded with enoxaparin and DNA, respectively. Nickel and cobalt nanowires were modified with silanes that served as linker molecules for subsequent small molecule attachment or PEGylation. Finally, the eGFP muteins were bound to a particle surface in a site-specific manner. Beads displaying amino groups were utilized to demonstrate the effective use of FXIIIa in surface modification. Moreover, the bead’s functional moieties were converted to azides to enable CuAAC “Click Chemistry” and direct comparison. Each modification was analyzed and confirmed through fluorescence microscopy. N2 - Techniken zur ortsspezifischen bioorthogonalen Konjugation von Biomolekülen haben die Forschung in zahlreichen Bereichen erheblich vorangebracht. Ihr außerordentlicher Wert spiegelt sich in der Vielzahl der Anwendungen wider, die mit bioorthogonalen Reaktionen realisiert werden konnten. Die kontrollierte Bestückung von Oberflächen, Proteinen und anderen Biomolekülen ermöglicht neue Generationen von Systemen zur Arzneimittelapplikation als auch zu Tracking- und Analyseverfahren. Mit der kontinuierlichen Weiterentwicklung und Verfeinerung der verfügbaren Methoden wird dieses Forschungsgebiet in Zukunft noch mehr an Bedeutung gewinnen. Doch so individuell wie der gewünschte Zweck ist, so unterschiedlich kann auch die am besten geeignete Modifikationsstrategie sein. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Biokonjugationsansätze, nämlich CuAAC und Faktor-XIIIa-vermittelte Ligation, in unterschiedlichen Anwendungsbereichen eingesetzt, wobei eGFP als Modellprotein dient, um sowohl die Vorteile als auch die Herausforderungen der jeweiligen Technik aufzuzeigen. Die Einführung einer genau abgrenzbaren Funktionalität ist das wichtigste Merkmal einer ortsspezifischen Reaktion und die erste große Hürde, die es zu nehmen gilt. Während die meisten Oberflächen, Peptide oder kleinen Moleküle mit geringem Aufwand moduliert werden können, erfordert das Ausstatten von Proteinen mit zusätzlichen Merkmalen sorgfältige Überlegung und weitreichende Kenntnis, um die Stabilität und Funktion der Molekülstruktur zu erhalten. Der erste Abschnitt dieses Projekts umfasst daher das Protein-Engineering von eGFP durch rationales Design. Zunächst wurde der Wildtyp von eGFP subkloniert, exprimiert und charakterisiert, um als Referenzwert für die entworfenen Varianten zu dienen. Anschließend wurde eGFP so mutiert und exprimiert, dass es eine Erkennungsstelle für Faktor XIIIa aufweist. Zusätzlich enthielt eine zweite Mutante ein TAG-Codon, um die Unterdrückung des Amber-Codons und damit den Einbau der Alkin-tragenden unnatürlichen Aminosäure Plk zu ermöglichen, um wiederum eine CuAAC-Reaktion zu unterstützen. Mit Hilfe von Fluoreszenzspektroskopie wurde bestätigt, dass die Fluoreszenzeigenschaften aller exprimierten Muteine identisch mit denen des Wildtyps eGFP sind, was ein zuverlässiger Marker für die intakte Barrel-Struktur des Proteins ist. Trypsinverdau und HPLC wurden eingesetzt, um die korrekte Sequenz und Masse der einzelnen Proteinvarianten zu bestätigen. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Konjugation von „Cargo-Molekülen“ unter Verwendung der gewählten Ansätze. Mittels Festphasen-Peptidsynthese wurde ein Peptid hergestellt, das als Lysin-Donor-Substrat im Vernetzungsmechanismus von FXIIIa diente. Zusätzlich wurde das Peptid mit einem Cystein-Element versehen, um eine hochflexible und einfache Beladung mit gewünschten Frachtmolekülen durch konventionelle Thiol-Michael-Addition zu ermöglichen und so eine adaptive Koppelungsplattform zu schaffen. Die effektive Ligation wurde durch die Überwachung der genauen Massenänderungen mittels HPLC kritisch überprüft und bestätigt. Es wurden Protokolle für die Anbringung von Nutzlasten wie Biotin und PEG an das Linker-Peptid ausgearbeitet. Während das Biotin-Konstrukt erfolgreich an das Modellprotein konjugiert wurde, konnte die eGFP-PEG-Bindung nach Auswertung der SDS-PAGE-Analyse nicht erreicht werden. Darüber hinaus wurden anhand der isolierten Peptidsequenzen die Eigenschaften der FXIIIa-vermittelten Reaktion im Detail charakterisiert. Relativer Substratumsatz, Sättigungskonzentrationen, Nebenproduktbildung und Inkubationszeit wurden mittels HPLC umfassend analysiert, um optimale Reaktionsbedingungen zu ermitteln. CuAAC wurde erfolgreich zur Markierung des Plk-eGFP-Muteins mit Azid-Biotin eingesetzt, was durch Western-Blot-Darstellung nachgewiesen wurde. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Anwendung der Konjugationssysteme auf verschiedene Oberflächen übertragen. Da normale Oberflächen keine unmittelbare Dekoration erlauben, wurden zusätzliche Funktionalisierungstechniken wie Gold-Thiol-Wechselwirkung und Silanisierung auf Metalloxiden eingesetzt. Auf diese Weise wurden goldsegmentierte Nanowires und Januspartikel mit Enoxaparin bzw. DNA beladen. Nickel- und Kobalt-Nanowires wurden mit Silanen modifiziert, die als Verbindungsmoleküle für die anschließende Anlagerung kleiner Moleküle oder PEGylierung dienten. Schließlich wurden die eGFP-Muteine ortsspezifisch an eine Partikeloberfläche gebunden. Beads mit Aminogruppen wurden verwendet, um den effektiven Einsatz von FXIIIa bei der Oberflächenmodifikation zu demonstrieren. Darüber hinaus wurden die funktionellen Einheiten der Beads in Azide umgewandelt, um eine CuAAC-„Klickchemie" und somit einen direkten Vergleich zu ermöglichen. Jede Modifikation wurde mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie analysiert und bestätigt. KW - Proteinglutamin-Glutamyltransferase KW - Click-Chemie KW - Rekombinantes Protein KW - Nanodraht KW - Bioengineering KW - Surface modification KW - Site-specific modification KW - CuAAC Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369536 ER - TY - THES A1 - Zimmermann, Sebastian Andres T1 - Drug Monitoring of Kinase Inhibitors in the Context of Precision Medicine – Focus on Minimally Invasive Microsampling T1 - Arzneistoffspiegelmessung von Kinaseinhibitoren im Kontext der Präzisionsmedizin – Fokus auf minimalinvasives Mikrosampling N2 - The aim of the present work was to improve drug monitoring in patients with various diseases in the context of precision medicine. This was pursued through the development and validation of mass spectrometric methods for determining the drug concentrations of kinase inhibitors and their clinical application. Besides conventional approaches to determine plasma level concentrations, the focus was also on alternative sampling techniques using volumetric absorptive microsampling (VAMS). A conventional LC-MS/MS method was developed for the determination of cabozantinib in human EDTA plasma and validated according to the guidelines of the European and United States drug authorities (EMA, FDA). The method met the required criteria for linearity, accuracy and precision, selectivity, sensitivity, and stability of the analyte. Validation was also performed for dilution integrity, matrix effect, recovery, and carry-over, with results also in accordance with the requirements. The importance of monitoring the exposure of cabozantinib was demonstrated by a clinical case report of a 34-year-old female patient with advanced adrenocortical carcinoma who also required hemodialysis due to chronic kidney failure. Expected cabozantinib plasma concentrations were simulated for this off-label use based on a population pharmacokinetic model. It was shown that the steady state trough levels were much lower than expected but could not be explained by hemodialysis. Considering the critical condition and potential drug-drug interaction with metyrapone, a substance the patient had taken among several others during the observation period, individual pharmacokinetics could consequently not be estimated without drug monitoring. In addition, a VAMS method for simultaneous determination of ten kinase inhibitors from capillary blood was developed. This microsampling technique was mainly characterized by the collection of a defined volume of blood, which could be dried and subsequently analyzed. The guidelines for bioanalytical method validation of the EMA and FDA were also used for this evaluation. As the nature of dried blood samples differs from liquid matrices, further parameters were investigated. These include the investigation of the hematocrit effect, process efficiency, and various stability conditions, for example at increased storage temperatures. The validation showed that the developed method is suitable to analyze dried matrix samples accurate, precise, and selective for all analytes. Apart from the stability tests, all acceptance criteria were met. The decreased stability of two analytes was probably due to the reproducible but reduced recovery. In vitro studies provided results on the VAMS-to-plasma correlation to predict the analyte distribution between both matrices, at least in an exploratory manner. It revealed a heterogeneous picture of analytes with different VAMS-to-plasma distributions. Furthermore, the analysis of 24 patient samples indicated the applicability of at-home VAMS. Both should be confirmed later as part of the clinical validation. The clinical investigation of the VAMS method pursued two objectives. On the one hand, the simultaneous collection of VAMS and serum samples should enable a conversion of the determined concentrations and, on the other hand, the feasibility of autonomous microsampling at home should be examined more closely. For the former, it could be shown that different conversion methods are suitable for converting VAMS concentrations into serum levels. The type of conversion was secondary for the prediction. However, the previously defined criteria could not be fulfilled for all five kinase inhibitors investigated. The framework conditions of the study led to increased variability, especially for analytes with short half-life. A low and varying hematocrit, caused by the underlying disease, also made prediction difficult for a specific patient collective. For the second objective, investigating the feasibility of VAMS, different aspects were considered. It could be shown that the majority of patients support home-based microsampling. The acceptance is likely to increase even further when microsampling is no longer part of a non-interventional study, but participation is accompanied by targeted monitoring and subsequent adjustment of the therapy. The fact that additional training increases understanding of the correct sampling procedure is also a source of confidence. Demonstrated stability during storage under real-life conditions underlines the practicality of this sampling technique. Taken together, mass spectrometric methods for both plasma and VAMS could be developed and validated, and their clinical application could be successfully demonstrated. The availability of simple bioanalytical methods to determine kinase inhibitor exposure could improve access to prospective studies and thus facilitate the implementation of routine therapeutic drug monitoring. N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einsatz des Drug Monitorings bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen im Rahmen der Präzisionsmedizin zu erleichtern. Dies wurde durch die Entwicklung und Validierung massenspektrometrischer Methoden zur Bestimmung der Wirkstoffkonzentrationen von Kinaseinhibitoren und deren klinische Anwendung verfolgt. Dabei standen neben konventionellen Ansätzen zur Bestimmung der Plasmaspiegelkonzentration auch alternative Entnahmetechniken in Form von „Volumetric Absorptive Microsampling (VAMS)“ im Mittelpunkt. Eine solche konventionelle LC-MS/MS-Methode wurde zur Bestimmung von Cabozantinib in humanem EDTA-Plasma entwickelt und nach den Richtlinien der europäischen und US-amerikanischen Arzneimittelbehörden (EMA, FDA) validiert. Die Methode erfüllte die geforderten Kriterien bezüglich Linearität, Richtigkeit und Präzision, Selektivität, Sensitivität und Stabilität des Analyten. Die Validierung erfolgte auch hinsichtlich Verdünnungsintegrität, Matrixeffekt, Wiederfindung, und Analyt-Verschleppung, deren Ergebnisse ebenso in Übereinstimmung mit den Vorgaben standen. Die Bedeutung der Expositionsüberwachung von Cabozantinib wurde anhand eines klinischen Fallberichts einer 34-jährigen Patientin mit fortgeschrittenem Nebennierenrindenkarzinom, die aufgrund chronischen Nierenversagens zudem dialysepflichtig war, gezeigt. Die erwartbaren Cabozantinib-Plasmakonzentrationen wurden für diesen Off-Label-Use basierend auf einem populations-pharmakokinetischen Modell simuliert. Es zeigte sich, dass die Steady-State-Talspiegel wesentlich niedriger waren als angenommen, sich aber nicht durch die Hämodialyse erklären ließen. Unter Berücksichtigung des kritischen Gesundheitszustandes und möglicher Arzneimittelinteraktionen mit Metyrapon, einer Substanz, die die Patientin neben einigen anderen während des Beobachtungszeitraums eingenommen hatte, konnte die individuelle Pharmakokinetik folglich nicht ohne Arzneistoffspiegelmessung abgeschätzt werden. Darüber hinaus konnte eine VAMS-Methode zur simultanen Bestimmung von zehn Kinaseinhibitoren aus Kapillarblut entwickelt werden. Dieses Mikrosampling-Verfahren zeichnete sich vor allem durch die Entnahme eines definierten Blutvolumens aus, welches getrocknet und anschließend analysiert werden konnte. Auch hierbei wurden die Richtlinien für bioanalytische Methodenvalidierung der EMA und FDA zur Beurteilung herangezogen. Da sich die Beschaffenheit der Trockenblutproben von flüssigen Matrices unterscheidet, wurden weitere Einflussfaktoren untersucht. Dazu gehören die Untersuchung des Hämatokrit-Effekts, der Prozesseffizienz und verschiedener Stabilitätsbedingungen, zum Beispiel bei erhöhten Lagertemperaturen. Die Validierung zeigte, dass die entwickelte Methode in der Lage ist Trockenmatrixproben für alle Analyten richtig, präzise und selektiv zu messen. Von den Stabilitätsuntersuchungen abgesehen wurden alle Akzeptanzkriterien erfüllt. Die verminderte Stabilität von zwei Analyten ist vermutlich durch die zwar reproduzierbare, aber geringere Wiederfindungsrate zu begründen. In vitro Untersuchungen lieferten Ergebnisse über die VAMS-zu-Plasma-Korrelation, um die Analytverteilung zwischen beiden Matrizes zumindest exploratorisch vorherzusagen. Dabei zeigte sich ein heterogenes Bild von Analyten mit unterschiedlicher VAMS-zu-Plasma-Verteilung. Darüber hinaus zeigten die Messungen von 24 Patientenproben die Anwendbarkeit von VAMS im häuslichen Umfeld. Beides sollte später im Rahmen der klinischen Validierung bestätigt werden. Die klinische Untersuchung der VAMS-Methode verfolgte zweierlei Ziele. Zum einen sollte durch die zeitgleiche Entnahme von VAMS und Serumproben eine Umrechnung der ermittelten Konzentrationen ermöglicht und zum anderen die Durchführbarkeit der eigenständigen Mikroprobenentnahme zuhause genauer überprüft werden. Für Ersteres konnte gezeigt werden, dass verschiedene Umrechnungsmethoden geeignet sind, VAMS-Konzentrationen in Serumspiegel umzurechnen. Die Art der Umrechnung war für die Vorhersage zweitrangig. Allerdings konnten nicht für alle fünf untersuchten Kinaseinhibitoren die zuvor festgelegten Kriterien erfüllt werden. Die Rahmenbedingungen der Studie führten vor allem bei Analyten mit geringer Halbwertszeit zu einer erhöhten Variabilität. Ein geringer und schwankender Hämatokritwert, bedingt durch die zugrundeliegende Erkrankung, erschwerte zudem die Vorhersage bei einem bestimmten Patientenkollektiv. Für das zweite Ziel, die Durchführbarkeit von VAMS zu untersuchen, wurden verschiedene Aspekte betrachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die Mehrheit der Patienten die häusliche Mikroprobenentnahme befürwortet. Die Akzeptanz dürfte sogar noch weiter steigen, wenn die Mikroprobenentnahme nicht mehr nur Teil einer nicht-interventionellen Studie ist, sondern die Teilnahme mit einer gezielten Überwachung und anschließenden Anpassung der Therapie einhergeht. Zuversichtlich stimmte auch die Tatsache, dass ein zusätzliches Training das Verständnis für die korrekte Durchführung erhöht. Dass sich die Stabilität auch bei der Lagerung unter Realbedingungen zeigen ließ, unterstreicht die Praxistauglichkeit dieser Sampling-Technik. Insgesamt konnten sowohl für Plasma als auch VAMS massenspektrometrische Methoden entwickelt, validiert und deren klinische Anwendung erfolgreich demonstriert werden. Die Verfügbarkeit von simplen bioanalytischen Methoden zur Bestimmung der Kinaseinhibitor-Exposition könnte den Zugang zu prospektiven Studien und damit die Einführung von routinemäßigem Therapeutischen Drug Monitoring erleichtern. KW - Arzneimittelüberwachung KW - Blutspiegel KW - Klinische Pharmazie KW - Kinaseinhibitor KW - Therapeutisches Drug Monitoring KW - TDM KW - Precision medicine KW - Volumetric absorptive microsampling KW - VAMS Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369550 ER - TY - THES A1 - Diehl, Janina Marie Christin T1 - Ecology and evolution of symbiont management in ambrosia beetles T1 - Ökologie und Evolution des Symbiontenmanagements bei Ambrosiakäfern N2 - The relationship between a farmer and their cultivated crops in agriculture is multifaceted, with pathogens affecting both the farmer and crop, and weeds that take advantage of resources provided by farmers. For my doctoral thesis, I aimed to gain a comprehensive understanding of the ecology and symbiosis of fungus farming ambrosia beetles. Through my research, I discovered that the microbial composition of fungus gardens, particularly the mutualists, is significantly influenced by the presence of both adults and larvae. The recognition of both beneficial and harmful symbionts is crucial for the success of ambrosia beetles, who respond differently depending on their life stage and the microbial species they encounter, which can contribute to the division of labour among family groups. The presence of antagonists and pathogens in the fungus garden depends on habitat and substrate quality, and beetle response to their introduction results in behavioural and developmental changes. Individual and social immunity measures, as well as changes in bacterial and fungal communities, were detected as a result of pathogen introduction. Additionally, the ability of ambrosia beetles to establish two nutritional fungal species depends on several factors. These insects must strike a balance between their essential functions and adapt to the constantly changing ecological and social conditions, which demonstrates their adaptive flexibility. However, interpreting data from laboratory studies should be approached with caution, as the natural environment allows for more flexibility and the potential for other beneficial symbionts to become more prominent if required. To aid in my research, I designed primers that use the ‘fungal large subunit’ (LSU) as genetic marker to identify and differentiate mutualistic and antagonistic fungi in X. saxesenii. The primers were able to distinguish closely related species of the Ophiostomataceae and other fungal symbionts. This allowed me to associate the abundance of key fungal taxa with factors such as the presence of beetles, the nest's age and condition, and the various developmental stages present. My primers are a valuable tool for understanding fungal communities, including their composition and the identification of previously unknown functional symbionts. However, some aspects should be approached with caution due to the exclusion of non-amplified taxa in the relative fungal community compositions. N2 - Die Beziehung zwischen einem Landwirt und der von ihm angebauten Nahrung in der Landwirtschaft ist vielschichtig: Pathogene, die sowohl den Landwirt als auch die Pflanzen befallen, und Unkräuter, die sich die von Landwirten bereitgestellten Ressourcen zunutzen machen. In meiner Doktorarbeit wollte ich ein umfassendes Verständnis der Ökologie und der Symbiose von pilzzüchtenden Ambrosiakäfern erlangen. Im Rahmen meiner Forschung fand ich heraus, dass die mikrobielle Zusammensetzung von Pilzgärten, insbesondere der Mutualisten, durch die Anwesenheit sowohl der erwachsenen Tiere als auch der Larven erheblich beeinflusst wird. Die Erkennung sowohl nützlicher als auch schädlicher Symbionten ist entscheidend für den Erfolg der Ambrosiakäfer, die je nach Lebensstadium und den angetroffenen Mikrobenarten unterschiedlich reagieren, was zur Arbeitsteilung zwischen Familiengruppen beitragen kann. Das Vorhandensein von Antagonisten und Krankheitserregern im Pilzgarten hängt von der Qualität des Lebensraums und des Substrats ab, und die Reaktion der Käfer auf ihre Einschleppung führt zu Veränderungen im Verhalten und in der Entwicklung. Individuelle und soziale Immunitätsmaßnahmen sowie Veränderungen der Bakterien- und Pilzgemeinschaften wurden als Folge der Einführung von Krankheitserregern festgestellt. Darüber hinaus hängt die Fähigkeit von Ambrosiakäfern, zwei Nährpilzarten zu etablieren, von mehreren Faktoren ab. Diese Insekten müssen ein Gleichgewicht zwischen ihren lebenswichtigen Funktionen herstellen und sich an die ständig ändernden ökologischen und sozialen Bedingungen anpassen, was ihre Anpassungsfähigkeit zeigt. Bei der Interpretation von Daten aus Laborstudien ist jedoch Vorsicht geboten, da die natürliche Umgebung mehr Flexibilität zulässt und die Möglichkeit bietet, dass andere nützliche Symbionten bei Bedarf stärker in Erscheinung treten. Um meine Forschung zu unterstützen, habe ich Primer entwickelt, die die ‘fungal large subunit‘ (LSU) als genetischen Marker verwenden, um mutualistische und antagonistische Pilze in X. saxesenii zu identifizieren und zu unterscheiden. Die Primer waren in der Lage, eng verwandte Arten der Ophiostomataceae und andere Pilzsymbionten zu unterscheiden. Auf diese Weise konnte ich die Häufigkeit der wichtigsten Pilztaxa mit Faktoren wie dem Vorhandensein von Käfern, dem Alter und Zustand des Nests und den verschiedenen Entwicklungsstadien in Verbindung bringen. Meine Primer sind ein wertvolles Instrument für das Verständnis von Pilzgemeinschaften, einschließlich ihrer Zusammensetzung und der Identifizierung von bisher unbekannten funktionellen Symbionten. Einige Aspekte sind jedoch mit Vorsicht zu genießen, da nicht amplifizierte Taxa in den relativen Zusammensetzungen der Pilzgemeinschaften nicht berücksichtigt werden. KW - ambrosia beetles KW - symbiont management KW - amplicon sequencing KW - fungus farming KW - microbial communities KW - social behaviour KW - Ökologie KW - Evolution Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321213 ER - TY - THES A1 - Mathew-Schmitt, Sanjana T1 - Development of blood-brain barrier spheroid models based on human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and investigation of shear stress on hiPSC-derived brain capillary endothelial-like cells T1 - Entwicklung von Sphäroid-Modellen der Blut-Hirn-Schranke basierend auf menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und Untersuchung der Scherbeanspruchung von hiPSC-abgeleiteten Hirnkapillarendothel-ähnlichen Zellen N2 - A highly regulated microenvironment is essential in maintaining normal functioning of the central nervous system (CNS). The existence of a biological barrier, termed as the blood-brain barrier (BBB), at the blood to brain interface effectively allows for selective passage of substances and pathogens into the brain (Kadry, Noorani et al. 2020). The BBB chiefly serves in protecting the brain from extrinsic toxin entry and pathogen invasions. The BBB is formed mainly by brain capillary endothelial cells (BCECs) which are responsible for excluding ∼ 100% of large-molecule neurotherapeutics and more than 98% of all small-molecule drugs from entry into the brain. Minimal BBB transport of major potential CNS drugs allows for attenuated effective treatments for majority of CNS disorders (Appelt-Menzel, Oerter et al. 2020). Animals are generally used as model systems to study neurotherapeutic delivery into the brain, however due to species based disparity, experimental animal models lead to several false positive or false negative drug efficacy predictions thereby being unable to fully predict effects in humans (Ruck, Bittner et al. 2015). An example being that over the last two decades, much of the studies involving animals lead to high failure rates in drug development with ~ 97% failure in cancers and ~ 99% failure for Alzheimer´s disease (Pound 2020). Widespead failures in clinical trials associated with neurological disorders have resulted in questions on whether existing preclinical animal models are genuinely reflective of the human condition (Bhalerao, Sivandzade et al. 2020). Apart from high failure rates in humans, the costs for animal testings is extremely high. According to the Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), responsible for determining animal testing guidelines and methodology for government, industry, and independent laboratories the average cost of a single two-generation reproductive animal toxicity study worldwide is 318,295 € and for Europe alone is ~ 285,842 € (Van Norman 2019). Due to these reasons two separate movements exist within the scientific world, one being to improve animal research and the other to promote new approach methodologies with the European government setting 2025 - 2035 as a deadline for gradually disposing the use of animals in pharmaceutical testing (Pound 2020). The discovery of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology in 2006 (Takahashi and Yamanaka 2006, Takahashi, Tanabe et al. 2007) revolutionized the field of drug discovery in-vitro. HiPSCs can be differentiated into various tissue types that mimic disease phenotypes, thereby offering the possibility to deliver humanized in-vitro test systems. With respect to the BBB, several strategies to differentiate hiPSCs to BCECs (iBCECs) are reported over the years (Appelt-Menzel, Oerter et al. 2020). However, iBCECs are said to possess an epithelial or undifferentiated phenotype causing incongruity in BBB lineage specifications (Lippmann, 7 Azarin et al. 2020). Therefore, in order to identify a reliable differentiation strategy in deriving iBCECs possessing hallmark BBB characteristics, which can be used for downstream applications, the work in this thesis compared two methods, namely the co-differentiation (CD) and the directed differentiation (DD). Briefly, CD mimics a brain like niche environment for iBCEC specification (Lippmann, Al-Ahmad et al. 2014), while DD focuses on induction of the mesoderm followed by iBCEC specification (Qian, Maguire et al. 2017). The results obtained verified that while iBCECs derived via CD, in comparison to human BCEC cell line hCMEC/D3 showed the presence of epithelial transcripts such as E-Cadherin (CDH1), and gene level downregulation of endothelial specific platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1) and VE-cadherin (CDH5) but demonstrated higher barrier integrity. The CD strategy essentially presented iBCECs with a mean trans-endothelial electrical resistance (TEER) of ~ 2000 – 2500 Ω*cm2 and low permeability coefficients (PC) of < 0.50 μm/min for small molecule transport of sodium fluorescein (NaF) and characteristic BCEC tight junction (TJ) protein expression of claudin-5 and occludin. Additionally, iBCECs derived via CD did not form tubes in response to angiogenic stimuli. DD on the other hand resulted in iBCECs with similar down regulations in PECAM-1 and CDH5 gene expression. They were additionally characterized by lower barrier integrity, measured by mean TEER of only ~ 250 – 450 Ω*cm2 and high PC of > 5 μm/min in small molecule transport of NaF. Although iBCECs derived via DD formed tubes in response to angiogenic stimuli, they did not show positive protein expression of characteristic BCEC TJs such as claudin-5 and occludin. These results led to the hypothesis that maturity and lineage specification of iBCECs could be improved by incorporating in-vivo like characteristics in-vitro, such as direct co-culture with neurovascular unit (NVU) cell types via spheroid formation and by induction of shear stress and fluid flow. In comparison to standard iBCEC transwell mono-cultures, BBB spheroids showed enhanced transcript expression of PECAM-1 and reduced expression of epithelial markers such as CDH1 and claudin-6 (CLDN6). BBB spheroids showed classical BCEC-like ultrastructure that was identified by TJ particles on the protoplasmic face (P-face) and exoplasmic face (E-face) of the plasma membrane. TJ strands were organized as particles and particle-free grooves on the E-face, while on the P-face, partly beaded particles and partly continuous strands were identified. BBB spheroids also showed positive protein expression of claudin-5, VE-cadherin, PECAM-1, glucose transporter-1 (GLUT-1), P-glycoprotein (P-gp) and transferrin receptor-1 (Tfr-1). BBB spheroids demonstrated higher relative impedance percentages in comparison to spheroids without an iBCEC barrier. Barrier integrity assessments additionally corresponded with lower permeability to small molecule tracer NaF, with spheroids containing iBCECs showing higher relative fluorescence unit percentages (RFU%) of ~ 90% in apical compartments, compared to ~ 80% in spheroids without iBCECs. In summary, direct cellular contacts in the complex spheroid model resulted in enhanced maturation of iBCECs. 8 A bioreactor system was used to further assess the effect of shear stress. This system enabled inclusion of fluidic flow and shear stress conditions in addition to non-invasive barrier integrity measurements (Choi, Mathew et al. 2022). iBCECs were cultured for a total of seven days post differentiation (d17) within the bioreactor and barrier integrity was non-invasively monitored. Until d17 of long-term culture, TEER values of iBCECs steadily dropped from ~ 1800 Ω*cm2 ~ 400 Ω*cm2 under static conditions and from ~ 2500 Ω*cm2 to ~ 250 Ω*cm2 under dynamic conditions. Transcriptomic analyses, morphometric analyses and protein marker expression showed enhanced maturation of iBECs under long-term culture and dynamic flow. Importantly, on d10 claudin-5 was expressed mostly in the cytoplasm with only ~ 5% iBCECs showing continuous staining at the cell borders. With increase in culture duration, iBCECs at d17 of static culture showed ~ 18% of cells having continuous cell border expression, while dynamic conditions showed upto ~ 30% of cells with continuous cell-cell border expression patterns. Similarly, ~ 33% of cells showed cell-cell border expression of occludin on d10 with increases to ~ 55% under d17 static and up to ~ 65% under d17 dynamic conditions, thereby indicating iBCEC maturation. In conclusion, the data presented within this thesis demonstrates the maturation of iBCECs in BBB spheroids, obtained via direct cellular contacts and by the application of flow and shear stress. Both established novel models need to be further validated for pharmaceutical drug applications together with in-vitro-in-vivo correlations in order to exploit their full potential. N2 - Eine hochregulierte Mikroumgebung ist für die Aufrechterhaltung der normalen Funktion des Zentralen Nervensystems (ZNS) unerlässlich. Das Vorhandensein einer biologischen Barriere, der so genannten Blut-Hirn-Schranke (BHS), als Schnittstelle zwischen Blutkreislauf und Gehirn ermöglicht den selektiven Durchgang von Substanzen und Pathogenen in das Gehirn (Kadry, Noorani et al. 2020). Die BHS dient hauptsächlich dazu, das Gehirn vor dem Eindringen von Toxinen von außen und dem Eindringen von Krankheitserregern zu schützen. Die BHS wird hauptsächlich von Hirnkapillarendothelzellen (engl. brain capillary endothelial cells, BCECs) gebildet, die dafür verantwortlich sind, dass ∼ 100% der großmolekularen Neurotherapeutika und mehr als 98% aller kleinmolekularen Medikamente nicht in das Gehirn gelangen können. Ein eingeschränkter BHS-Transport wichtiger potenzieller Wirkstoffe führt zu einer abgeschwächten Wirksamkeit der Behandlung der meisten ZNS-Erkrankungen (Pardridge 2005). Mäuse, Ratten, Schweine und Rinder werden in der Regel als Modellsysteme verwendet, um die Verabreichung von Neurotherapeutika in das Gehirn zu untersuchen. Aufgrund der Unterschiede zwischen den Spezies führen experimentelle Tiermodelle jedoch vermehrt zu falsch positiven oder falsch negativen Vorhersagen über die Wirksamkeit von Medikamenten, so dass sie nicht in der Lage sind, die Wirkungen beim Menschen vollständig vorherzusagen (Ruck, Bittner et al. 2015). Ein Beispiel dafür ist, dass in den letzten zwei Jahrzehnten ein Großteil der Studien an Tieren zu Misserfolgsraten in der Wirkstoffzulassung geführt hat. Bei einer Fehlerrate von 97% im Zusammenhang mit Krebs und ~99% bei Alzheimer führt dies zum Therapieversagen (Pound 2020). Die weit verbreiteten Misserfolge bei klinischen Versuchen im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen haben zu der Frage geführt, ob die bestehenden präklinischen Tiermodelle wirklich die Physiologie des Menschen widerspiegeln (Bhalerao, Sivandzade et al. 2020). Abgesehen von den hohen Ausfallraten sind die Kosten für Tierversuche extrem hoch. Nach Angaben der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (engl. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD), welche für die Festlegung von Tierversuchsrichtlinien und -methoden für die Regierung, die Industrie und unabhängige Labore zuständig ist, belaufen sich die durchschnittlichen Kosten für eine einzige Zwei-Generationen-Studie zur Reproduktionstoxizität an Tieren weltweit auf 318.295 € und allein für Europa auf ~ 285.842 € (Van Norman 2019). Aus diesen Gründen gibt es zwei unterschiedliche Bemühungen unter den Wissenschaftlern. Zum einen zur Verbesserung der Tierforschung und zum anderen zur Förderung neuer Methoden gemäß den 3R (eng. replace, reduce, refine), wobei die europäische Regierung die Jahre 2025 bis 2035 als Frist für den schrittweisen Verzicht auf Tierversuche in der Forschung festgelegt hat (Pound 2020). Die 10 Entdeckung der humanen induziert pluripotenten Stammzell (hiPSC)-Technologie im Jahr 2006 (Takahashi und Yamanaka 2006, Takahashi, Tanabe et al. 2007) hat den Bereich der Arzneimittelforschung revolutioniert, da hiPSCs in verschiedene Gewebetypen differenziert werden können und damit die Möglichkeit bieten, humanisierte in-vitro-Testsysteme bereitzustellen, die zur Untersuchung verschiedener Krankheiten verwendet werden können. In Bezug auf die BHS wurde im Laufe der Jahre mehrere Strategien zur Differenzierung von hiPSCs zu BCECs (iBCECs) etabliert (Appelt-Menzel, Oerter et al. 2020), allerdings wird ihnen ein epithelialer Phänotyp nachgesagt, was zu Fragen in der Spezifikation der BBB führt (Lippmann, Azarin et al. 2020). Um eine verlässliche Differenzierungsstrategie für die Gewinnung von iBCECs mit charakteristischen BHS-Merkmalen zu finden, welche für Downstream-Anwendungengenutztwerden können, wurden in dieser Arbeit zwei Methoden verglichen. Die Ko-Differenzierung (engl. co-differentiation, CD) und die gerichtete Differenzierung (engl. directed differentiation, DD). Zusammengefasst simuliert die CD eine ZNS-ähnliche Mikroumgebung für die Spezifikation der iBCECs nach (Lippmann, Al-Ahmad et al. 2014), während sich die DD auf die Induktion des Mesoderms und die anschließende iBCEC-Spezifikation konzentriert (Qian, Maguire et al. 2017). Die erzielten Ergebnisse bestätigten, dass iBCECs, welche mittels CD abgeleitet wurden, im Vergleich zur humanen BCEC-Zelllinie (hCMEC/D3) zwar epitheliale Transkripte wie E-Cadherin (CDH1) besitzen, aber eine Herabregulierung von Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (PECAM-1) und VE-Cadherin (CDH5) aufweisen. Die von CD abgeleiteten iBCECs hatten zudem eine höhere Barriere-Integrität und Funktionalität gezeigt. Im Wesentlichen führte die CD-Strategie zu iBCECs mit einem hohen transendothelialen elektrischen Widerstand (engl. Transendothelialelectrical resistance, TEER) von 2000 - 2500Ω*cm2, einem niedrigen Permeabilitätskoeffizienten (eng. Permeability co-efficient, PC) von < 0,50 μm/min für den Transport kleiner Moleküle wie Natriumfluorescein (NaF) und einer charakteristischen Expression von BCEC-spezifischen Tight Junction (TJ)-Proteinen wie Claudin-5 und Occludin. Außerdem bildeten iBCECs, welche über CD gewonnen wurden, keine Gefäßstrukturen als Reaktion auf angiogene Stimuli. DD hingegen führte zu iBCECs mit einer ähnlichen Herabregulierung der PECAM-1- und CDH5-Genexpression, die zusätzlich durch eine geringere Barriereintegrität, gemessen an einem niedrigen TEER von nur ~ 250 - 450 Ω*cm2 und einem hohen PC von > 5 μm/min, bei dem Transport von NaF gekennzeichnet war. Obwohl die über DD gewonnenen iBCECs in der Lage waren Gefäßnetze auszubilden, zeigten sie keine Expression der charakteristischen BCEC-TJs wie Claudin-5 und Occludin. Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese, die in-vitro Differenzierung und Reifung von iBCECs zu verbessern, indem in-vivo-ähnliche Stimuli in-vitro angewandt werden, wie z. B. die direkte Kokultur mit Zelltypen der neurovaskulären Einheit (NVE) durch Sphäroidbildung und die Induktion von Scherstress in einem dynamischen Flussmodell. Im Vergleich zu iBCEC- 11 basierten Transwellmodellen, die zumeist in Monokulturen aufgebaut werden, zeigten die BHS-Sphäroide eine erhöhte Expression von PECAM-1 und eine reduzierte Expression von Epithelmarkern wie E-Cadherin (CDH1) und Claudin-6 (CLDN6). BHS-Sphäroide zeigten eine klassische BCEC-ähnliche Ultrastruktur, die durch TJ-Partikel auf der protoplasmatischen Phase (P-Phase) und der exoplasmatischen Phase (E-Phase) der Plasmamembran gekennzeichnet war. Die TJ-Stränge waren als Partikel und partikelfreie Rillen auf der E-Phase organisiert, während auf der P-Phase teils Partikel und teils kontinuierliche Stränge zu erkennen waren. BHS-Sphäroide zeigten auch eine positive Proteinexpression von Claudin-5, VE-Cadherin, PECAM-1, Glukose-Transporter-1 (GLUT-1), P-Glykoprotein (P-gp) und Transferrin-Rezeptor-1 (Tfr-1). Die BHS-Sphäroide wiesen ebenfalls höhere relative Impedanzwerte im Vergleich zu Sphäroiden ohne iBCEC-Barriere auf. Die Bewertung der Integrität der Barriere korrespondierte zudem mit einer geringeren Permeabilität für den niedermolekularen Tracer NaF, wobei Sphäroide mit iBCECs einen höheren Prozentsatz an relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU%) von etwa 90% in den apikalen Kompartimenten aufwiesen, verglichen mit etwa 80% in Sphäroiden ohne iBCECs. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass direkte zelluläre Kontakte im komplexen Sphäroidmodell zu einer verstärkten Reifung von iBCECs führten. In-vivo ist die BHS Scherbelastungen ausgesetzt, die einen wichtigen und oft vernachlässigten physiologischen Stimulus darstellen (Cucullo, Hossain et al. 2011). Um die Auswirkung von Scherstress auf die Eigenschaften und die Reifung von iBCECs zu messen, wurden diese in einem Bioreaktorsystem kultiviert.(Choi, Mathew et al. 2022). Hier war es möglich, iBCECs für insgesamt sieben Tage nach der Differenzierung (d17) erfolgreich in diesem System zu kultivieren und zusätzlich die Barriereintegrität nicht-invasiv zu überwachen. Bis d17 der Langzeitkultur fielen die TEER-Werte von iBCECs stetig von ~ 1800 Ω*cm2 ~ 400 Ω*cm2 unter statischen Bedingungen bzw. von ~ 2500 Ω*cm2 auf ~ 250 Ω*cm2 unter dynamischen Bedingungen. Zusätzliche Untersuchungen und Vergleiche von iBCECs unter diesen Kulturbedingungen mittels transkriptioneller und morphometrischer Analysen, sowie Expression von Proteinmarkern zeigten, dass iBCECs aufgrund der Langzeitkultur und des dynamischen Flusses eine verstärkte Reifung vorweisen. Wichtig ist, dass Claudin-5 bei d10 hauptsächlich im Zytoplasma exprimiert wurde und nur etwa 5% der iBCECs eine kontinuierliche Färbung an den Zellgrenzen aufwiesen. Mit zunehmender Kulturdauer zeigten iBCECs bei d17 in statischer Kultur ~ 18% der Zellen mit kontinuierlicher Zellrandexpression, während unter dynamischen Bedingungen bis zu ~ 30% der Zellen kontinuierliche Zellrandexpressionsmuster aufwiesen. In ähnlicher Weise zeigten ~ 33% der Zellen eine Zell-Zell-Grenzexpression von Occludin an d10 mit einem Anstieg auf ~ 55% unter d17 statischen und bis zu ~ 65% unter d17 dynamischen Bedingungen, was auf eine iBCEC-Reifung hinweist. Zusammenfassend zeigen die in dieser Arbeit vorgestellten Daten die Reifung von iBCECs in 12 BHS Sphäroiden, die durch direkte Zell - Zell Kontakte und in dynamischen Strömungsmodellen durch die Anwendung von Scherspannungen erreicht wird. Beide etablierten neuen Modelle müssen für pharmazeutische Anwendungen zusammen mit In-vitro-in-vivo-Korrelationen weiter validiert werden, um ihr volles Potential zu beweisen. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Blood-brain barrier Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-322475 ER - TY - THES A1 - Dietz, Maximilian T1 - Synthese und Reaktivität neutraler Diboraarene T1 - Synthesis and Reactivity of Neutral Diboraarenes N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Darstellung und Reaktivität neutraler Diboraarene, wobei im ersten Teil die Synthese neuer Metallkomplexe eines cAAC-stabilisierten (cAAC = cyclisches Alkyl(amino)carben) 1,4-Diborabenzols sowie deren Folgereaktivität im Fokus steht. Im zweiten Abschnitt wird die Reaktivität des Diborabenzols und eines cAAC-stabilisierten 9,10-Diboraanthracens gegenüber Hauptgruppenelementverbindungen untersucht und vergleichend gegenübergestellt. Darauffolgend werden neben der Synthese neuer Metallkomplexe des Diboraanthracens auch weitere Reaktivitätsuntersuchungen der Verbindung behandelt. Der letzte Teil der Arbeit befasst sich mit der Darstellung neuartiger neutraler und cAAC-stabilisierter Diboraacene über eine Modulation des π-Systems. Dabei wird der synthetische Zugang zu einem 1,4-Diboranaphthalin und einem 6,13-Diborapentacen ermöglicht und ausgewählte Reaktivitäten beider Verbindungen demonstriert. N2 - The work presented herein deals with the preparation and reactivity of neutral diboraarenes, focusing in the first part on the synthesis of new metal complexes of a cAAC-stabilized (cAAC = cyclic alkyl(amino)carbene) 1,4-diborabenzene and their subsequent reactivity. In the second section, the reactivity of diborabenzene and a cAAC-stabilized 9,10-diboraanthracene towards main group element compounds is investigated in a comparative study. Subsequently, in addition to the synthesis of new metal complexes of diboraanthracene, further reactivity studies of the compound are also discussed. The last part of the work covers the preparation of novel neutral and cAAC-stabilized diboraacenes via modulation of the π system. Synthetic access to a 1,4-diboranaphthalene and a 6,13-diborapentacene is provided and selected reactivity patterns of both compounds are demonstrated. KW - Bor KW - Aromaten KW - Metallkomplexe KW - Diborabenzol KW - Diboraarene KW - Diboraacene KW - Arenkomplexe KW - Biradikale Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321098 ER - TY - THES A1 - Ruppert [geb. Rapp], Elisabeth Marlene T1 - Einfluss von sozialem Stress und 5-Htt-Genotyp: Quantitative Untersuchung der Morphologie von Neuronen der lateralen Amygdala und der CA3-Region des Hippocampus von Mäusen der Serotonintransporter-Knockout-Linie T1 - Influence of social stress and 5-Htt genotype: Quantitative investigation of the morphology of neurons of the lateral amygdala and the CA3 region of the hippocampus of mice of the serotonin transporter knockout line N2 - In dieser Arbeit wurde der Einfluss sozialer Stresserfahrung sowie des 5-Htt-Genotyps auf die neuronale Morphologie bestimmter Hirnregionen anhand eines Mausmodells untersucht. Es wurde in mit Golgi-Cox gefärbten Gehirnen der 5-HTT-KO-Linie in der lateralen Amygdala (LA) die Apikal- und Basaldendriten pyramidenzellähnlicher Neurone und die Apikaldendriten der Pyramidenzellen der Cornu ammonis (CA)3-Region des Hippocampus mithilfe des Neurolucidasystems rekonstruiert und die so gewonnenen Daten anschließend statistisch ausgewertet. Die erzielten Ergebnisse belegen, dass vor allem die Erfahrung von sozialem Verteidigungsstress aber auch der 5-Htt-Genotyp (WT, HET, KO) im Mausmodell signifikanten Einfluss auf die Morphologie der Neurone der LA und der CA3-Region besitzen. Um die in dieser Arbeit mit allen drei 5-Htt-Genotypen erzielten Ergebnisse der LA-Neurone besser mit den Ergebnissen von Nietzer und Bonn (nur WT, KO) vergleichen zu können (Nietzer et al., 2011), wurden die von mir erhobenen Daten nicht nur in einem 3er-Vergleich, sondern auch einem 2er-Vergleich (WT vs. KO) statistisch analysiert. Untersuchungen der LA-Neurone aller drei 5-Htt-Genotypen zeigen, dass sozialer Stress zu einer Zunahme der Komplexität der Dendritenbäume durch längere und auch stärker verzweigte Dendriten vor allem in der Gruppe der WT-Mäuse führt. HET- und KO-Mäuse zeigten keinen entsprechenden Stress-Effekt. Darüber hinaus zeigten sich deutliche Genotypeffekte. Unabhängig vom Stresserleben besitzen HET-Mäuse längere Dendriten als WT-Mäuse sowie eine höhere Spinedichte als WT- und KO-Mäuse. Die Hypothese, die in der Arbeit von Nietzer et al. aufgestellt wurde, dass eine vollständige 5-HTT-Defizienz zu mehr Spines führt, ließ sich hier weder durch den 3er- noch durch den 2er-Vergleich replizieren. Die Pyramidenzellen der CA3-Region, die in dieser Studie zum ersten Mal analysiert wurden, zeigen in Bezug auf die durch den Stress ausgelösten Veränderungen ein im Vergleich zu den LA-Neuronen entgegengesetzten Effekt. Der soziale Stress führt hier zu einer Dendritenatrophie in der WT-Gruppe mit kürzeren und weniger komplexen Dendriten. Außerdem führte er zu einer geringeren Spinedichte bei den HET-Mäusen. Es zeigten sich klare Genotypeffekte, unabhängig von der Stresserfahrung, mit einer reduzierten Spinedichte der KO-Mäuse gegenüber den WT-Mäusen und einer nur in den Kontrollen detektierten, reduzierten Spinedichte der KO-Mäuse im Vergleich zu den WT- und HET-Mäusen. Sowohl in der LA als auch in der CA3-Region lassen sich Kompensationsmechanismen des 5-HTT-Defizits der HET-Tiere vermuten, über die die KO-Tiere nicht verfügen. Die in LA und CA3 gezeigten gegensätzlichen Auswirkungen des sozialen Stresses weisen auf die unterschiedlichen Funktionen dieser beiden Regionen im Furchtkreislauf und/oder bei der Verarbeitung von Stress hin. Darüber hinaus deutet diese Arbeit darauf hin, dass Arbeiten mit ähnlichen Untersuchungsmethoden und sogar gleichem Untersuchungsmaterial unterschiedliche Ergebnisse liefern können. N2 - In this study, the influence of social stress experience and the 5-Htt genotype on the neuronal morphology of certain brain regions was investigated using a mouse model. The apical and basal dendrites of pyramidal cell-like neurons and the apical dendrites of the pyramidal cells of the cornu ammonis (CA)3 region of the hippocampus were reconstructed in Golgi-Cox-stained brains of the 5-HTT-KO line in the lateral amygdala (LA) using the neurolucida system and the data obtained was then statistically analyzed. The results obtained show that especially the experience of social defense stress but also the 5-Htt genotype (WT, HET, KO) have a significant influence on the morphology of the neurons of the LA and the CA3 region in the mouse model. In order to better compare the results of the LA neurons obtained in this study with all three 5-Htt genotypes with the results of Nietzer and Bonn (WT, KO only) (Nietzer et al., 2011), the data collected by me were statistically analyzed not only in a 3-way comparison, but also in a 2-way comparison (WT vs. KO). Investigations of the LA neurons of all three 5-Htt genotypes show that social stress leads to an increase in the complexity of the dendrite trees due to longer and also more branched dendrites, especially in the group of WT mice. HET and KO mice showed no corresponding stress effect. In addition, there were clear genotype effects. Regardless of the stress experience, HET mice have longer dendrites than WT mice and a higher spin density than WT and KO mice. The hypothesis put forward in the work of Nietzer et al. that complete 5-HTT deficiency leads to more spines could not be replicated here by either the 3-way or 2-way comparison. The pyramidal cells of the CA3 region, which were analyzed for the first time in this study, show an opposite effect compared to the LA neurons with regard to the changes triggered by stress. Here, social stress leads to dendrite atrophy in the WT group with shorter and less complex dendrites. It also led to a lower spin density in the HET mice. There were clear genotype effects, independent of the stress experience, with a reduced spin density in the KO mice compared to the WT mice and a reduced spin density in the KO mice compared to the WT and HET mice, which was only detected in the controls. Compensatory mechanisms for the 5-HTT deficit in the HET animals, which the KO animals do not have, can be assumed in both the LA and the CA3 region. The contrasting effects of social stress shown in LA and CA3 indicate the different functions of these two regions in the fear circuit and/or in the processing of stress. Furthermore, this work suggests that studies using similar research methods and even the same research material may yield different results. KW - Serotoninstoffwechsel KW - Hippocampus KW - Stress KW - Corpus amygdaloideum KW - Ammonshorn KW - CA3-Region KW - laterale Amygdala KW - sozialer Stress KW - Serotonintransporter-Knockout-Linie Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369488 ER - TY - THES A1 - Nair, Radhika Karal T1 - Structural and biochemical characterization of USP28 inhibition by small molecule inhibitors T1 - Strukturelle und biochemische Charakterisierung der Hemmung von USP28 durch niedermolekulare Inhibitoren N2 - Ubiquitination is an important post-translational modification that maintains cellular homeostasis by regulating various biological processes. Deubiquitinases (DUBs) are enzymes that reverse the ubiquitination process by catalyzing the removal of ubiquitin from a substrate. Abnormal expression or function of DUBs is often associated with the onset and progression of various diseases, including cancer. Ubiquitin specific proteases (USPs), which constitute the largest family of DUBs in humans, have become the center of interest as potential targets in cancer therapy as many of them display increased activity or are overexpressed in a range of malignant tumors or the tumor microenvironment. Two related members of the USP family, USP28 and USP25, share high sequence identities but play diverse biological roles. USP28 regulates cell proliferation, oncogenesis, DNA damage repair and apoptosis, whereas USP25 is involved in the anti-viral response, innate immunity and ER-associated degradation in addition to carcinogenesis. USP28 and USP25 also exhibit different oligomeric states – while USP28 is a constitutively active dimer, USP25 assumes an auto-inhibited tetrameric structure. The catalytic domains of both USP28 and USP25 comprise the canonical, globular USP-domain but contain an additional, extended insertion site called USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID) that mediates oligomerization of the proteins. Disruption of the USP25 tetramer leads to the formation of an activated dimeric protein. However, it is still not clear what triggers its activation. Due to their role in maintaining and stabilizing numerous oncoproteins, USP28 and USP25 have emerged as interesting candidates for anti-cancer therapy. Recent advances in small-molecular inhibitor development have led to the discovery of relatively potent inhibitors of USP28 and USP25. This thesis focuses on the structural elucidation of USP28 and the biochemical characterization of USP28/USP25, both in complex with representatives of three out of the eight compound classes reported as USP28/USP25-specific inhibitors. The crystal structures of USP28 in complex with the AZ compounds, Vismodegib and FT206 reveal that all three inhibitor classes bind into the same allosteric pocket distant from the catalytic center, located between the palm and the thumb subdomains (the S1-site). Intriguingly, this binding pocket is identical to the UCID-tip binding interface in the USP25 tetramer, rendering the protein in a locked, inactive conformation. Formation of the binding pocket in USP28 requires a shift in the helix α5, which induces conformational changes and local distortion of the binding channel that typically accommodates the C-terminal tail of Ubiquitin, thus preventing catalysis and abrogating USP28 activity. The key residues of the USP28-inhibitor binding pocket are highly conserved in USP25. Mutagenesis studies of these residues accompanied by biochemical and biophysical assays confirm the proposed mechanism of inhibition and similar binding to USP25. This work provides valuable insights into the inhibition mechanism of the small molecule compounds specifically for the DUBs USP28 and USP25. The USP28-inhibitor complex structures offer a framework to develop more specific and potent inhibitors. N2 - Ubiquitinierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation, die die zelluläre Homöostase aufrechterhält, indem sie verschiedene biologische Prozesse reguliert. Deubiquitinasen (DUBs) sind Enzyme, die den Ubiquitinierungsprozess umkehren, indem sie die Entfernung von Ubiquitin von einem Substrat katalysieren. Eine abnorme Expression oder Funktion von DUBs wird häufig mit dem Auftreten und Fortschreiten verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht. Ubiquitin-spezifische Proteasen (USPs), die im Menschen die größte Familie der DUBs bilden, sind als potenzielle Ziele in der Krebstherapie von besonderem Interesse, da viele von ihnen in bösartigen Tumoren oder deren Mikroumgebung abnormal aktiv oder überexprimiert sind. Die zwei eng verwandten Mitglieder der USP-Familie, USP28 und USP25, weisen eine hohe Sequenzidentität auf, sind aber an unterschiedlichen biologischen Prozessen beteiligt. USP28 reguliert die Zellproliferation, die Onkogenese, die Reparatur von DNA-Schäden und die Apoptose, während USP25 eine Rolle bei der antiviralen Reaktion, der angeborenen Immunität, dem ER-assoziierten Abbau und der Carcinogenese spielt. USP28 und USP25 weisen auch unterschiedliche oligomere Zustände auf. Während USP28 ein konstitutiv aktives Dimer bildet, tritt USP25 als auto-inhibiertes Tetramer auf. Strukturell bestehen die katalytischen Domänen sowohl von USP28 als auch von USP25 aus der kanonischen globulären USP-Domäne enthalten jedoch eine zusätzliche Insertion, die als „USP25/28 catalytic domain inserted domain (UCID)“ bezeichnet wird und die Oligomerisierung der Proteine vermittelt. Die Dissoziation des USP25 Tetramers in Dimere führt zu einem aktivierten USP25-Protein. Es ist jedoch immer noch nicht klar, was seine Aktivierung auslöst. Aufgrund ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung und Stabilisierung zahlreicher Onkoproteine haben sich USP28 und USP25 als interessante Kandidaten für die Entwicklung von Medikamenten in der Krebstherapie erwiesen. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung von niedermolekularen Inhibitoren haben zur Entdeckung von relativ potenten Inhibitoren von USP28 und USP25 geführt. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Strukturaufklärung von USP28 und die biochemische Charakterisierung von USP28/USP25, beide im Komplex mit Vertretern von drei der acht Verbindungsklassen, die als USP28/USP25-spezifische Inhibitoren bekannt sind. Die Kristallstrukturen von USP28 im Komplex mit den AZ-Verbindungen, Vismodegib und FT206 zeigen, dass alle Inhibitoren in einer ähnlichen Region an USP28 binden - einer allosterischen Tasche, die in der Nähe des katalytischen Zentrums liegt und sich zwischen der Handflächen- und der Daumen-Subdomäne befindet. Diese Bindungstasche ist identisch mit der Position, an der der „UCID-tip“ im USP25-Tetramer bindet und das Protein in eine verschränkte, inaktive Konformation versetzt. Die Bildung der Bindungstasche in USP28 erfordert eine Verschiebung der α5-Helix, die zu Konformationsänderungen und einer lokalen Verzerrung des Bindungskanalsführt, der normalerweise den C-terminus des Ubiquitin-Moleküls bindet und so die Katalyse verhindert und die Aktivität von USP28 hemmt. Die Schlüsselreste der USP28-Inhibitor-Bindungstasche sind in USP25 hoch konserviert. Mutagenese-Studien dieser Aminosäuren, begleitet von biochemischen und biophysikalischen Analysen, bestätigen den vorgeschlagenen Mechanismus der Hemmung und eine ähnliche Bindung der Inhibitoren an USP25. Diese Arbeit liefert wertvolle Einblicke in den Hemmungsmechanismus der Kleinmolekülverbindungen, die spezifisch für die DUBs USP28 und USP25 entwickelt worden sind. Die Strukturen der USP28-Inhibitor-Komplexe bieten eine Grundlage für die zukünftige Entwicklung spezifischerer und wirksamerer Inhibitoren. KW - USP KW - Inhibition KW - enzyme KW - crystallography KW - Unique Selling Proposition KW - Inhibition KW - Enzym KW - Kristallographie Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281742 ER - TY - THES A1 - Göttler [geb. Lang], Anna T1 - Auswirkung der bariatrischen Operation auf die Aktivität des autonomen Nervensystems im kardialen und peripheren Kompartiment T1 - Effect of bariatric surgery on autonomic nervous system activity in the cardiac and peripheral compartment of the body N2 - Die vorliegende Arbeit thematisiert die Aktivität des autonomen Nervensystems im Vergleich vor versus nach bariatrischer Operation bei ProbandInnen mit morbider Adipositas. Wir untersuchten, ob die Operation und der damit einhergehende Gewichtsverlust drei Monate nach dem bariatrischen Eingriff zu einer Veränderung der Aktivität des autonomen Nervensystems im thorakalen und im motorischen/peripheren Kompartiment führt. Als Parameter dienen für das thorakale Kompartiment die Herzfrequenzvariabilität und für das periphere/motorische Kompartiment vaskuläre (lnRHI und AI) und sudomotorische (Schweißvolumen, Antwortlatenz) Parameter. Unsere Ergebnisse im thorakalen Kompartiment zeigen einen Anstieg der Herzfrequenzvariabilität 3 Monate nach bariatrischer Operation. Wir schließen uns daher der Hypothese an, die mit morbider Adipositas assoziierte Erhöhung der sympathischen Aktivität im thorakalen Kompartiment könne durch bariatrische Operationen reversibel sein. Im peripheren/motorischen Kompartiment können wir keine eindeutige Veränderung der Aktivität des autonomen Nervensystems vor versus nach bariatrischer Operation beobachten. Andere Studien konnten hierzu deutlichere Ergebnisse erheben, die ebenfalls eine erhöhte sympathische Aktivität im motorischen Kompartiment zeigten, welche nach bariatrischer Operation reversibel war. Insgesamt können wir die These einer autonomen Imbalance bei Adipositas sowie einer Verringerung der sympathischen Aktivität im thorakalen Kompartiment nach bariatrischer Operation unterstützen. Die Veränderungen im autonomen Nervensystem leisten möglicherweise einen Beitrag zur Verbesserung der kardiovaskulären Gesundheit und der metabolischen Situation nach der bariatrischen Operation. N2 - The present work addresses the activity of the autonomic nervous system comparing before versus after bariatric surgery in subjects with morbid obesity. We investigated whether surgery and associated weight loss led to changes in autonomic nervous system activity in the thoracic and motoric/peripheral compartment three months after bariatric surgery. Heart rate variability serves as parameter for the thoracic compartment, vascular (lnRHI and AI) and sudomotor (sweat volume, response latency) parameters for the peripheral/motoric compartment. Our results in the thoracic compartment show an increase in heart rate variability 3 months after bariatric surgery. We therefore agree with the hypothesis that the increase in sympathetic activity in the thoracic compartment associated with morbid obesity could be reversible by bariatric surgery. In the peripheral/motoric compartment, we did not observe any clear change in autonomic nervous system activity comparing before versus after bariatric surgery. Other studies were able to obtain clearer results showing increased sympathetic activity in the motoric compartment in subjects with morbid obesity that was reversible after bariatric surgery. Overall, we can support the hypothesis of an autonomic imbalance in obesity and a reduction in sympathetic activity in the thoracic compartment after bariatric surgery. The changes in the autonomic nervous system may contribute to improving cardiovascular health and metabolic status after bariatric surgery. KW - Vegetatives Nervensystem KW - Gefäßwiderstand KW - Herzfrequenzvariabilität KW - quantitativer sudomotorischer Axonreflextest KW - endotheliale Funktion KW - Adipositas KW - autonomes Nervensystem KW - Frequenzbereich KW - Zeitbereich KW - bariatrische KW - Fettsucht Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369328 ER - TY - THES A1 - Kanmegne Tamga, Dan Emmanuel T1 - Modelling Carbon Sequestration of Agroforestry Systems in West Africa using Remote Sensing T1 - Modellierung der Kohlenstoffbindung von agroforstwirtschaftlichen Systemen in Westafrika mittels Fernerkundung N2 - The production of commodities such as cocoa, rubber, oil palm and cashew, is the main driver of deforestation in West Africa (WA). The practiced production systems correspond to a land managment approach referred to as agroforestry systems (AFS), which consist of managing trees and crops on the same unit of land.Because of the ubiquity of trees, AFS reported as viable solution for climate mitigation; the carbon sequestrated by the trees could be estimated with remote sensing (RS) data and methods and reported as emission reduction efforts. However, the diversity in AFS in relation to their composition, structure and spatial distribution makes it challenging for an accurate monitoring of carbon stocks using RS. Therefore, the aim of this research is to propose a RS-based approach for the estimation of carbon sequestration in AFS across the climatic regions of WA. The main objectives were to (i) provide an accurate classification map of AFS by modelling the spatial distribution of the classification error; (ii) estimate the carbon stock of AFS in the main climatic regions of WA using RS data; (iii) evaluate the dynamic of carbon stocks within AFS across WA. Three regions of interest (ROI) were defined in Cote d'Ivoire and Burkina Faso, one in each climatic region of WA namely the Guineo-Congolian, Guinean and Sudanian, and three field campaigns were carried out for data collection. The collected data consisted of reference points for image classification, biometric tree measurements (diameter, height, species) for biomass estimation. A total of 261 samples were collected in 12 AFS across WA. For the RS data, yearly composite images from Sentinel-1 and -2 (S1 and S2), ALOS-PALSAR and GEDI data were used. A supervised classification using random forest (RF) was implemented and the classification error was assessed using the Shannon entropy generated from the class probabilities. For carbon estimation, different RS data, machine learning algorithms and carbon reference sources were compared for the prediction of the aboveground biomass in AFS. The assessment of the carbon dynamic was carried between 2017 and 2021. An average carbon map was genrated and use as reference for the comparison of annual carbon estimations, using the standard deviation as threshold. As far as the results are concerned, the classification accuracy was higher than 0.9 in all the ROIs, and AFS were mainly represented by rubber (38.9%), cocoa (36.4%), palm (10.8%) in the ROI-1, mango (15.2%) and cashew (13.4%) in ROI-2, shea tree (55.7%) and African locust bean (28.1%) in ROI-3. However, evidence of misclassification was found in cocoa, mango, and shea butter. The assessment of the classification error suggested that the error level was higher in the ROI-3 and ROI-1. The error generated from the entropy was able to reduced the level of misclassification by 63% with 11% of loss of information. Moreover, the approach was able to accuretely detect encroachement in protected areas. On carbon estimation, the highest prediction accuracy (R²>0.8) was obtained for a RF model using the combination of S1 and S2 and AGB derived from field measurements. Predictions from GEDI could only be used as reference in the ROI-1 but resulted in a prediction error was higher in cashew, mango, rubber and cocoa plantations, and the carbon stock level was higher in African locust bean (43.9 t/ha), shea butter (15 t/ha), cashew (13.8 t/ha), mango (12.8 t/ha), cocoa (7.51 t/ha) and rubber (7.33 t/ha). The analysis showed that carbon stock is determined mainly by the diameter (R²=0.45) and height (R²=0.13) of trees. It was found that crop plantations had the lowest biodiversity level, and no significant relationship was found between the considered biodiversity indices and carbon stock levels. The assessment of the spatial distribution of carbon sources and sinks showed that cashew plantations are carbon emitters due to firewood collection, while cocoa plantations showed the highest potential for carbon sequestration. The study revealed that Sentinel data could be used to support a RS-based approach for modelling carbon sequestration in AFS. Entropy could be used to map crop plantations and to monitor encroachment in protected areas. Moreover, field measurements with appropriate allometric models could ensure an accurate estimation of carbon stocks in AFS. Even though AFS in the Sudanian region had the highest carbon stocks level, there is a high potential to increase the carbon level in cocoa plantations by integrating and/or maintaining forest trees. N2 - Die Produktion von Rohstoffen wie Kakao, Kautschuk, Ölpalmen und Cashew ist die Hauptursache fur die Entwaldung in Westafrika (WA). Die verwendeten Produktionssyteme entsprechen einem Landbewirtschaftungskonzept, welches als Agroforstsysteme (AFS) bezeichnet wird und darin besteht, Baume und Nutzpflanzen auf der gleichen Landeinheit zu bewirtschaften. Aufgrund der kohlenstoffbindung durch Baumen sind AFS als praktikable Losung fur den Klimaschutz anerkannt, die Vielfalt der AFS in Bezug auf ihre Zusammensetzung, Struktur un raumliche Verteilung erschwert jedoch eine genaue Schatzung der Kohlenstoffvorrate. Hier konnen Daten und Methoden der satellitenbasierten Erdbeobachtung ansetzten. Ziel dieser Forschungsarbeit ist es daher, einen fernerkundungs-basierten Ansatz fur die Schatzung der Kohlenstoffbindung in AFS in den Klimaregionen von WA vorzuschlagen. Die Hauptziele waren (i) die Erstellung einer genauen Klassifizierungskarte von AFS durch Modellierung der raumlichen verteilung des Klassifizierungsfehlers; (ii) die Shatzung des Kohlenstoffbestands von AFS in den wichtigsten Klimaregionen von WA unter Verwendung von Fernerkundungs-daten (RS); (iii) die Bewertung der raumlichen Verteilung von Kohlenstoffquellen und -senken innerhalb von AFS in ganz WA. Fur jede Klimaregion in West Afrika wurden drei Regionen von Interesse (ROI) festgelegt, namlich die guineisch-kongolesische (ROI 1), die guineische (ROI 2) und die sudanesische Region (ROI 3) in Côte d'Ivoire und Burkina Faso, und es wurden drei Feldkampagnen zur Datenerhebung durchgefuhrt. Die gesammelten Daten bestanden aus Referenzpunkten fur die Bildklassifizierung und biometrischen Messungen (Durchmesser, Hohe, Artname) zur Schatzung der Biomasse. Insgesamt wurden 261 Proben in 12 AFS in ganz WA gesammelt. Fur die RS-Daten wurden jahrliche Komposite von Sentinel-1 und -2 (s1 und S3), ALOS-PALSAR und GEDI-Daten verwendet. Es wurde eine uberwachte Klassifizierung mit Random Forest (RF) algorithmus durch gefuhrt, und der Klassifizierungsfehler wurde anhand der aus den Klassenwahrscheinlichkeiten generierten Shannon-Entropie bewertet. Fur die Kohlenstoffschatzung wurden verschiedene RS-Daten, Algorithmen fur maschinelles Lernen und Kohlenstoff-Referenzquellen fur die Vorhesage des Kohlenstoffs in AFS verglichen. Die Bewertung der raumlichen Verteilung von Kohlenstoffsenken und -quellen basierte auf der Bewertung von Anomalien in der Kohlenstoffdynamik zwischen 2017 und 2021. Es wurde eine Karte zum durchschnittliche gebundenen Kohkenstoff erstellt, und die jahrliche Differenz wurde verwendet, um Kohlenstoffsenken und -quellen zu identifizieren. Die Klassifizierungsgenauigkeit war in allen ROI hoher als 0.9, in der Region dominierten Kautschuk (38.9%), Kakao (36.4%), Palme (10.8%) in ROI-1, Mango (15.2%) und Cashew (13.4%) in ROI-2, Sheabaum (55.7%) und Johannisbrot (28.1%) in ROI-3. Hinweise auf eine Fehlklassifizierung wurden vor allem bei Kakao, Mango un Sheabutter gefunden. Die Bewertung des Klassifizierungsfehlers ergab, dass das Fehlerniveau in ROI-3 und ROI-1 hoher war. Der aus der Entropie generiete Fehler konnte das Ausmass der Fehlklassifizierung reduzieren, ohne die gut klassifizierten Pixel zu beeintrachtigen. Ausserdem war der Ansatz in der Lage, Eingriffe in Schutzgebiete zuverlassig un akkurat zu erkennen. Was die Kohlenstoffschatzung betrifft, so wrude die hochste Vorhersagegenauigkeit (R²> 0.8)bei der Kombination von S1 und S2 mit Random Forest und AGB aus Feldmessungen erzielt. Vorhersagen von GEDI konnten nur als Referenz in der ROI verwendet werden, fuhrten aber zu einem Vorhersagefehler bei Cashew-, Mango-, Kautschuk- und Kakaoplantagen hoher war und der Kohlenstoffbestand bei Johannisbrot (43.9t/ha), Sheabutter (15 t/ha), Cashew (13.8 t/ha), Mango (12.8t/ha), Kakao (7.51 t/ha) und Kautschuk (7.33 t/ha) hoher war. Die Analyse zeigte, dass der Kohlenstoffbestand hauptsachlich durch den Durchmesser (R²=0.45) und die Hohe (R²=0.13) der Baume beeinflusst wird. Zudem wurde festgestellt, dass Plantagenkulturen die geringste Biodiversitat aufweisen, und es wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen Biodiversitatsindizes und Kohlenstoffvorraten festgestellt. Die Bewertung der raumlichen Verteilung von Kohlenstoffquellen und -senken zeigte, dass Cashew ein Kohlenstoffemittent ist, da in dieser Region Brennholz gesammelt wird, wahrend Kakaoplantagen wichtige Kohlenstoffsenken sind. Die Studie ergab zudem, dass Sentinel-Daten zur Unterstutzung eines RS-basierten Ansatzes fur die Modellierung der Kohlenstoffbindung in AFS verwendet werden konnten. Die Entropie konnte zur Kartierung von Anbauplantagen und zur uberwachen von Schutzgebiete verwendet werden. Daruber hinaus gewahrleisten feldmessungen mit geeigneten allometrischen Modellen eine genaue Schatzung der Kohlenstoffvorrate in AFS. Die AFS in der sudanesischen Region weisen die hochsten Kohlenstoffvorrate auf, aber es besteht die Moglichkeit, den Kohlenstoffgehalt in Kakaoplantagen durch die Integration und/oder Erhaltung von Waldbaumen zu erhoehen. KW - Sequestrierung KW - Fernerkundung KW - Westafrika KW - carbon sequestration KW - agroforestry systems KW - remote sensing KW - West Africa Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369269 ER - TY - THES A1 - Morabbian, Jasamin T1 - Etablierung von Stammzell-Sphäroiden mit inkorporierten Biokeramik-Partikeln zur Förderung der osteogenen Differenzierung T1 - Establishment of stem cell spheroids with incorporated bioceramic particles for the promotion of osteogenic differentiation N2 - In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden Sphäroide aus mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe oder dem Knochenmark mittels der Micromold-Methode hergestellt. Den Sphäroiden wurden entweder Calciumphosphat- oder Calcium-Magnesium-Phosphat-Partikel hinzugefügt. Zum einen sollte überprüft werden, ob die Zugabe von Partikeln die osteogene Differenzierung der Sphäroide fördert und somit zur weiteren Entwicklung von körpereigenem Knochenersatzmaterial in der regenerativen Medizin beiträgt. Zum anderen sollte festgestellt werden, ob eine der beiden Biokeramiken hinsichtlich der osteogenen Differenzierung überlegen ist. N2 - In this dissertation, spheroids were produced from mesenchymal stem cells from adipose tissue or bone marrow using the micromold method. Either calcium phosphate or calcium magnesium phosphate particles were added to the spheroids. On the one hand, it was to be examined whether the addition of particles promotes the osteogenic differentiation of the spheroids and thus contributes to the further development of endogenous bone replacement material in regenerative medicine. Secondly, to determine whether one of the two bioceramics is superior in terms of osteogenic differentiation. KW - Stammzelle KW - Calciumphosphat KW - Spheroid KW - Knochenzement KW - Knochenersatzmaterial KW - Calcium-Magnesium-Phosphat Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369256 ER - TY - THES A1 - Merscher, Alma-Sophia T1 - To Fear or not to Fear: Unraveling the (Oculo)motor and Autonomic Components of Defensive States in Humans T1 - Vor Furcht Erstarren: Charakterisierung der (Okulo)motorischen und Autonomen Komponenten Menschlicher Defensivreaktionen N2 - Defensive behaviors in response to threats are key factors in maintaining mental and physical health, but their phenomenology remains poorly understood. Prior work reported an inhibition of oculomotor activity in response to avoidable threat in humans that reminded of freezing behaviors in rodents. This notion of a homology between defensive responding in rodents and humans was seconded by concomitant heart rate decrease and skin conductance increase. However, several aspects of this presumed defense state remained ambiguous. For example, it was unclear whether the observed oculomotor inhibition would 1) robustly occur during preparation for threat-avoidance irrespective of task demands, 2) reflect a threat-specific defensive state, 3) be related to an inhibition of somatomotor activity as both motion metrics have been discussed as indicators for freezing behaviors in humans, and 4) manifest in unconstrained settings. We thus embarked on a series of experiments to unravel the robustness, threat-specificity, and validity of previously observed (oculo)motor and autonomic dynamics upon avoidable threat in humans. We provided robust evidence for reduced gaze dispersion, significantly predicting the speed of subsequent motor reactions across a wide range of stimulus contexts. Along this gaze pattern, we found reductions in body movement and showed that the temporal profiles between gaze and body activity were positively related within individuals, suggesting that both metrics reflect the same construct. A simultaneous activation of the parasympathetic (i.e., heart rate deceleration) and sympathetic (i.e., increased skin conductance and pupil dilation) nervous system was present in both defensive and appetitive contexts, suggesting that these autonomic dynamics are not only sensitive to threat but reflecting a more general action-preparatory mechanism. We further gathered evidence for two previously proposed defensive states involving a decrease of (oculo)motor activity in a naturalistic, unconstrained virtual reality environment. Specifically, we observed a state consisting of a cessation of ongoing behaviors and orienting upon relatively distal, ambiguous threat (Attentive Immobility) while an entire immobilization and presumed allocation of attention to the threat stimulus became apparent upon approaching potential threat (Immobility under Attack). Taken together, we provided evidence for specific oculomotor and autonomic dynamics upon increasing levels of threat that may inspire future translational work in rodents and humans on shared mechanisms of threat processing, ultimately supporting the development of novel therapeutic approaches. N2 - Angemessen auf Gefahren zu reagieren, ist überlebensnotwendig, wissenschaftlich jedoch wenig verstanden. Eine frühere Studie wies auf, dass ProbandInnen ihre Augen weniger bewegten, wenn sie mit einer Bedrohung konfrontiert waren, der sie mit einer schnellen Bewegung entkommen konnten. Dieses eingeschränkte Blickbewegungsmuster wurde von einer Herzraten-Dezeleration und einem Anstieg der Hautleitfähigkeit begleitet und wies damit Ähnlichkeiten mit bestimmten Erstarrungsreaktionen auf Bedrohungen (Freezing) bei Nagetieren auf. Es blieb jedoch unklar, ob die eingeschränkten Augenbewegungen 1. robust und unabhängig von spezifischen Aufgabenstellungen als Reaktion auf eine vermeidbare Bedrohung auftreten, 2. eine bedrohungsspezifische Komponente eines Defensivzustands darstellen, 3. von einer körperlichen Bewegungsreduktion begleitet und 4. im freien Raum auftreten würden. Wir haben daher untersucht, ob dieses eingeschränkte Blickbewegungsmuster sowie seine autonomen Begleiterscheinungen robust, bedrohungsspezifisch und valide sind. In unseren Studien traten verringerte Augenbewegungen robust und bedrohungsspezifisch als Reaktion auf vermeidbare Bedrohungen auf und sagten schnellere Reaktionszeiten vorher. Die eingeschränkten Augenbewegungen wurden von verringerten Körperbewegungen begleitet, deren zeitliche Verläufe miteinander korrelierten. Dies könnte auf ein zugrundeliegendes gemeinsames Konstrukt hinweisen. Wir beobachteten außerdem eine Herzraten-Dezeleration sowie erhöhte Hautleitfähigkeit und Pupillendilation in bedrohlichen und appetitiven Kontexten, was darauf hindeutet, dass diese autonomen Dynamiken nicht nur durch Bedrohungen, sondern auch allgemein handlungsvorbereitend ausgelöst werden können. Zuletzt konnten wir in einer frei explorierbaren, virtuellen Umgebung Hinweise auf zwei Defensivzustände liefern, deren Unterscheidung zuvor postuliert, jedoch noch nicht weitreichend belegt war. Bei relativ weit entfernter und ambivalenter Gefahr hielten die ProbandInnen inne und drehten sich, vermutlich zur Orientierung, zum potentiellen Ort der Bedrohung hin (Attentive Immobility). Wenn sich die Bedrohung jedoch näherte, verringerten sich sowohl Körper- als auch Augenbewegungen, als würden die ProbandInnen ihre Aufmerksamkeit auf die Bedrohung ausrichten (Immobility under Attack). Zusammenfassend lieferten unsere Erhebungen damit Belege für spezifische (okulo)motorische und autonome Dynamiken bei steigender Bedrohung, die zukünftige translationale Forschungen über Homologien von Defensivzuständen zwischen Nagetieren und Menschen inspirieren und damit womöglich die Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren unterstützen können. KW - Furcht KW - Fear Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-327913 ER - TY - THES A1 - Laqua, Caroline T1 - Association of myocardial tissue characteristics and functional outcome in biopsy-verified myocarditis assessed by cardiac magnetic resonance imaging T1 - Zusammenhänge zwischen geweblichen Eigenschaften des Myokards und funktionellem Outcome bei biopsie-verifizierter Myokarditis im Kardio-MRT N2 - The relation between LV function and cardiac MRI tissue characteristics in separate myocardial segments and their change over time has yet to be explored in myocarditis. Thus, our research aimed to investigate possible associations between global and regional myocardial T1 and T2 times and peak strain in patients with suspected myocarditis. From 2012 to 2015, 129 patients with clinically suspected myocarditis of the prospective, observational MyoRacer-Trial underwent systematic biventricular EMB at baseline and cardiac MRI at baseline and after three months as a follow-up. We divided the LV myocardium into 17 segments and estimated the segmental myocardial strain using FT. We registered T1 and T2 maps to the cine sequences and transferred the segmentations used for FT to ensure conformity of the myocardial segments. Multi-level multivariable linear mixed effects regression was applied to investigate the relation of segmental myocardial strain to relaxation times and their respective change from baseline to follow-up. We found a significant improvement in myocardial peak strain from baseline to follow-up (p < 0.001; all p-values given for likelihood ratio tests) and significant associations between higher T1 and T2 times and lower segmental myocardial peak strain (p ranging from < 0.001 to 0.049). E.g., regression coefficient (Reg. coef.) for segmental radial peak strain in short axis view (SRPS_SAX) and T1 time: -1.9, 95% CI (-2.6;-1.2) %/100 ms, p < 0.001. A decrease in T1 and T2 times from baseline to follow-up was also significantly related to a recovery of segmental peak strains (p ranging from < 0.001 to 0.050). E.g., Reg. coef. for SRPS_SAX per ΔT1: -1.8, 95% CI (-2.5;-1.0) %/100 ms, p < 0.001. Moreover, the higher the baseline T1 time, the more substantial the functional recovery from baseline to follow-up (p ranging from 0.004 to 0.042, e.g., for SRPS_SAX: Reg. coef. 1.3, 95% CI (0.4;2.1) %/100 ms, p 0.004). We did not find an effect modification by the presence of myocarditis in the EMB (p > 0.1). Our cross-sectional and longitudinal analyses provide evidence of dose-dependent correlations between T1 and T2 relaxation times and myocardial peak strain in patients with clinical presentation of myocarditis, regardless of the EMB result. Thus, assessing strain values and mapping relaxation times helps estimate the functional prognosis in patients with clinically suspected myocarditis. N2 - Die Zusammenhänge zwischen der kardialen linksventrikulären (LV) Funktion und magnetresonanztomographisch erhebbaren Parametern des Myokards sowie deren jeweiligen Entwicklungen im zeitlichen Verlauf einer Myokarditis sind bisher nicht umfassend untersucht. Daher beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit der Erforschung des Verhältnisses von globalen und regionalen peak strain-Werten und T1 und T2 Zeiten des LV Myokards in der Magnetresonanztomographie (MRT) bei Patienten mit Verdacht auf Myokarditis. Die MyoRacer-Studie ist eine prospektive Beobachtungsstudie, die von 2012 bis 2015 am Herzzentrum des Universitätsklinikums Leipzig durchgeführt wurde. Dabei wurden 129 Patienten mit klinischem Verdacht auf Myokarditis mittels biventrikulärer Myokardbiopsie sowie kardialer MRT untersucht. Drei Monate nach der Erstuntersuchung (EU) erfolgte eine MRT-Folgeuntersuchung (FU). Für unsere Analysen unterteilten wir das LV Myokard standardmäßig in 17 Segmente, um mithilfe der Technik des feature trackings den segmentalen peak strain zu evaluieren. Weiterhin registrierten wir T1 und T2 maps gegen cine-Sequenzen der MRT und übertrugen die Segmentierungen aus den cine-Sequenzen zwecks Übereinstimmung in die MRT maps. Anschließend analysierten wir die Zusammenhänge zwischen segmentalem strain und T1 und T2 Zeiten und deren jeweiligen Veränderungen im zeitlichen Verlauf mithilfe eines hierarchischen, multivariablen, gemischten linearen Regressionsmodells. Unsere Ergebnisse zeigen eine signifikante Verbesserung der peak strain-Werte von der EU zur FU (p < 0.001; alle p-Werte für likelihood ratio tests angegeben) sowie eine signifikante Assoziation von erhöhten T1 und T2 Zeiten mit verminderten segmentalen peak strain-Werten (p zwischen < 0.001 und 0.049). Weiterhin war ein Abfall der T1 und T2 Zeiten von der EU zur FU signifikant mit einer Erholung der segmentalen peak strain-Werte verknüpft (p zwischen < 0.001 und 0.050). Je höher die T1 Zeiten bei der EU ausfielen, desto stärker erholte bzw. verbesserte sich der peak strain von der EU zur FU (p zwischen 0.004 und 0.042). Eine Effektmodifikation durch den bioptischen Nachweis einer Myokarditis war nicht zu beobachten (p > 0.1). Unsere Quer- und Längsschnittanalysen belegen dosisabhängige Zusammenhänge zwischen T1 und T2 Zeiten und myokardialen peak strain-Werten bei Patienten mit dem klinischen Bild einer Myokarditis, unabhängig vom Ergebnis der Myokardbiopsie. Daher ist die Bestimmung von T1 und T2 Zeiten und myokardialem strain mittels kardialer MRT zur Abschätzung der funktionellen Prognose bei Patienten mit klinischem Verdacht auf Myokarditis hilfreich. KW - Myokarditis KW - Kernspintomografie KW - T1-Zeit KW - T2-Zeit KW - strain KW - t1 time KW - t2 time KW - myocarditis KW - MRI Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363903 ER - TY - THES A1 - Hahn, Sarah T1 - Investigating non-canonical, 5' UTR-dependent translation of MYC and its impact on colorectal cancer development T1 - Untersuchung der nicht-kanonischen, 5' UTR-abhängigen Translation von MYC und ihres Einflusses auf die Entwicklung von Darmkrebs N2 - Colorectal cancer (CRC) is the second most common tumour disease in Germany, with the sequential accumulation of certain mutations playing a decisive role in the transition from adenoma to carcinoma. In particular, deregulation of the Wnt signalling pathway and the associated deregulated expression of the MYC oncoprotein play a crucial role. Targeting MYC thus represents an important therapeutic approach in the treatment of tumours. Since direct inhibition of MYC is challenging, various approaches have been pursued to date to target MYC indirectly. The MYC 5' UTR contains an internal ribosomal entry site (IRES), which has a particular role in the initiation of MYC translation, especially in multiple myeloma. As basis for this work, it was hypothesised on the basis of previous data that translation of MYC potentially occurs via its IRES in CRC as well. Based on this, two IRES inhibitors were tested for their potential to regulate MYC expression in CRC cells. In addition, alternative, 5’ UTR-dependent translation of MYC and interacting factors were investigated. EIF3D was identified as a MYC 5' UTR binding protein which has the potential to regulate MYC expression in CRC. The results of this work suggest that there is a link between eIF3D and MYC expression/translation, rendering eIF3D a potential therapeutic target for MYC-driven CRCs. N2 - Das kolorektale Karzinom (KRK) ist die zweithäufigste Tumorerkrankung in Deutschland, wobei die sequenzielle Akkumulation bestimmter Mutationen eine entscheidende Rolle beim Übergang vom Adenom zum Karzinom spielt. Insbesondere die Deregulation des Wnt-Signalweges und die damit verbundene deregulierte Expression des MYC-Onkoproteins spielen eine entscheidende Rolle. MYC ist ein zentraler Vermittler von Zellfunktionen und reguliert als Transkriptionsfaktor die Expression fast aller Gene sowie verschiedener RNA-Spezies. Selbst kleine Veränderungen der zellulären MYC-Konzentration können das Proliferationsverhalten beeinflussen und die Entstehung und das Fortschreiten von Tumoren fördern. Die gezielte Beeinflussung von MYC stellt daher einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Behandlung von Tumoren dar. Da eine direkte Hemmung von MYC aufgrund seiner Struktur herausfordernd ist, wurden bisher verschiedene Ansätze verfolgt, um MYC indirekt zu beeinflussen, etwa über seinen Interaktionspartner MAX oder auf Ebene der Stabilität, Transkription oder Translation. In unserer eigenen Forschungsgruppe lag der Schwerpunkt in den letzten Jahren speziell auf der Translation von MYC im KRK. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der kanonischen cap-abhängigen Translation nicht wie erwartet zu einer Verringerung der zellulären MYC-Level führt, was auf einen alternativen Mechanismus der MYC-Translation hindeutet, der unabhängig vom eIF4F-Komplex abläuft. Die 5'-UTR von MYC enthält eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), die eine besondere Rolle bei der Initiierung der MYC-Translation spielt, insbesondere im Multiplen Myelom. Als Grundlage für diese Arbeit wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass die Translation von MYC im KRK möglicherweise ebenfalls über die IRES erfolgt. Auf dieser Grundlage wurden zunächst zwei publizierte IRES-Inhibitoren auf ihr Potenzial zur Regulierung der MYC-Expression in KRK-Zellen getestet. J007-IRES hatte keine Auswirkungen auf die MYC-Proteinmenge, und Cymarin scheint weitaus globalere Auswirkungen zu haben, die nicht ausschließlich auf die Verringerung der MYC-Proteinmenge zurückzuführen sind. Daher wurde weiter untersucht, inwieweit die alternative Translation von MYC generell von der 5'-UTR und damit interagierenden Faktoren abhängig ist. EIF3D wurde als MYC-5'-UTR-Bindungsprotein identifiziert, dessen Knockdown zu reduzierten MYC-Leveln, einem Proliferationsdefizit sowie einer Verringerung der globalen Proteinsynthese in KRK-Zellen führte. Darüber hinaus führte die Depletion von EIF3D zu ähnlichen Veränderungen im zellulären Genexpressionsmuster wie die Depletion von MYC, wobei viele tumorassoziierte Signalwege betroffen waren. Mittels eCLIP-seq wurde die Bindung von eIF3D an die MYC mRNA nachgewiesen, der genaue Mechanismus einer möglicherweise durch eIF3D vermittelten Translation von MYC muss jedoch weiter untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass eine Verbindung zwischen eIF3D und der MYC-Expression/Translation besteht, wodurch eIF3D zu einem potenziellen therapeutischen Ziel für MYC-getriebene KRKs wird. KW - Myc KW - Translation KW - Colorectal cancer KW - 5' UTR Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-364202 ER - TY - THES A1 - Bredemeyer, Cynthia Natascha T1 - Akademisierung und Professionalisierung der Zahnheilkunde, insbesondere der Zahnchirurgie, in Würzburg und Unterfranken im 19. Jahrhundert T1 - The dental surgical instrument collection of the Juliusspital in Würzburg: The professionalization of dentistry, especially the dental surgery in 19th century Würzburg and Franconia / Bavaria N2 - Die Arbeit befasst sich mit der Akademisierung und Professionalisierung der Zahnheilkunde, insbesondere der Zahnchirurgie, in Würzburg und Unterfranken im 19. Jahrhundert. Dies wurde insbesondere anhand des zahnchirurgischen Teils der Lehrchirurgischen Instrumentensammlung der Universität Würzburg bzw. des Juliusspitals erforscht. Der zahnchirurgische Teil der Instrumentensammlung war bisher noch nicht erforscht worden und besteht aktuell aus 34+1 Instrumenten, die für diese Arbeit komplett katalogisiert wurden. Für die Entwicklung der Instrumente im Verlauf des 19. Jahrhunderts wurde die Provenienz der Teilsammlung ergründet und diese in den Kontext der Akademisierungsbewegung des 19. Jahrhunderts eingeordnet. Die Forschung wurde anhand der tatsächlich in der Praxis tätigen und nach und nach akademisch ausgebildeten Personen nachvollzogen. Hierzu wurden neben den Instrumenten als Quelle die Adressbücher der Stadt Würzburg und die Matrikel-, Personal- und Vorlesungsverzeichnisse der Universität Würzburg des gesamten 19. Jahrhunderts systematisch durchgearbeitet. Außerdem wurden Lehrbücher aus dem nichtakademischen zahnchirurigischen Bereich (Bader) mit denen aus dem sich beginnenden akademischen Bereich analysiert. Anhand dieser Forschungsarbeit konnte dargelegt werden, dass die Zahnchirurgie sich analog zur Chiurgie aus dem handwerklichen Bereich abgekoppelt und nach und nach auf verschiedenen Stufen akademisiert hat. Die Zahnchirurgie hat sich "von unten nach oben" durch das Bestreben nichtakademisch ausgebildeter Menschen akademisiert. N2 - The thesis deals with the academization and professionalization of dentistry, especially dental surgery, in Würzburg and lower Franconia in the 19th century. This was researched in particular on the basis of the dental surgical part of the surgical instrument collection of the University of Würzburg and the Juliusspital. The dental surgical part of the instrument collection had not yet been researched and currently consists of 34+1 instruments, which were completely catalogued for this work. For the development of the instruments over the course of the 19th century, the provenance of the partial collection was investigated and placed in the context of the academization movement of the 19th century. The research was traced on the basis of the people who actually worked in the field and were gradually trained academically. In addition to the instruments as sources, the address books of the city of Würzburg and the matriculation, personnel and lecture directories of the University of Würzburg for the entire 19th century were systematically analyzed. In addition, textbooks from the non-academic dental surgery field (so called "Bader") were analyzed with those from the emerging academic field. On the basis of this research, it was possible to demonstrate that dental surgery, like surgery, separated itself from the craft sector and gradually became academicized at various stages. Dental surgery has developed and academized "from bottom up" due to efforts of non-academic trained people. KW - Zahnchirurgie KW - Akademisierung KW - Professionalisierung KW - Instrument KW - Lehrchirurgische Sammlung KW - Juliusspital Würzburg KW - 19. Jahrhundert Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363878 ER - TY - THES A1 - Heimberger, Kevin T1 - Regulation pathways of c-MYC under glutamine-starving conditions in colon carcinoma cells T1 - Regulierungsmechanismen von c-MYC in Darmkrebszellen unter Glutaminmangelbedingungen N2 - Colon carcinomas (CRC) are statistically among the most fatal cancer types and hence one of the top reasons for premature mortality in the developed world. CRC cells are characterized by high proliferation rates caused by deregulation of gene transcription of proto-oncogenes and general chromosomal instability. On macroscopic level, CRC cells show a strongly altered nutrient and energy metabolism. This work presents research to understand general links between the metabolism and transcription alteration. Mainly focussing on glutamine dependency, shown in colon carcinoma cells and expression pathways of the pro-proliferation protein c-MYC. Previous studies showed that a depletion of glutamine in the cultivation medium of colon carcinoma cell lines caused a proliferation arrest and a strong decrease of overall c-MYC levels. Re-addition of glutamine quickly replenished c-MYC levels through an unknown mechanism. Several proteins altering this regulation mechanism were identified and proposed as possible starting point for further in detail studies to unveil the precise biochemical pathway controlling c-MYC translation repression and reactivation in a rapid manner. On a transcriptional level the formation of RNA:DNA hybrids, so called R-loops, was observed under glutamine depleted conditions. The introduction and overexpression of RNaseH1, a R-loop degrading enzyme, in combination with an ectopically expressed c-MYC variant, independent of cellular regulation mechanisms by deleting the regulatory 3’-UTR of the c-MYC gene, lead to a high rate of apoptotic cells in culture. Expression of a functionally inactive variant of RNaseH1 abolished this effect. This indicates a regulatory function of R-loops formed during glutamine starvation in the presence of c-MYC protein in a cell. Degradation of R-loops and high c-MYC levels in this stress condition had no imminent effect on the cell cycle progression is CRC cells but disturbed the nucleotide metabolism. Nucleotide triphosphates were strongly reduced in comparison to starving cells without R-loop degradation and proliferating cells. This study proposes a model of a terminal cycle of transcription termination, unregulated initiation and elongation of transcription leading to a depletion of energy resources of cells. This could finally lead to high apoptosis of the cells. Sequencing experiments to determine a coinciding of termination sites and R-loop formation sides failed so far but show a starting point for further studies in this essential survival mechanism involving R-loop formation and c-MYC downregulation. N2 - Darmkrebs gehört statistisch zu den Krebsarten mit den höchsten Sterblichkeitsraten und zählen somit zu den häufigsten Todesursachen der entwickelten Länder. Darmkrebszellen zeichnen sich durch chromosomale Instabilität und hohe Proliferationsraten aus, die durch eine Deregulierung der Expression verschiedener Proto-Onkogene zustande kommen. Generell besitzen diese Krebszellen einen stark veränderten Nährstoff- und Energiestoffwechsel im Vergleich zu gesunden somatischen Zellen. Diese Arbeit strebt ein besseres Verständnis der Verbindung zwischen dem Metabolismus und der Gen-Expression an. Das Hauptaugenmerk liegt hierbei auf dem Mechanismus der Expression des proliferationsfördernden Proteins c-MYC und der Abhängigkeit von Glutamin, die Darmkrebszellen charakterisiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Entzug von Glutamin aus dem Kulturmedium von Darmkrebszelllinien eine Arretierung des Zellzyklus bewirkt sowie die Konzentration des Proteins c-MYC reduziert. Erneute Zugabe von Glutamin zum Medium stellt die MYC-Konzentration schnell wieder her. Die Hintergründe dieses Mechanismus sind bislang aber kaum verstanden. Einige Proteine wurden hier als potenzielle Kandidaten identifiziert, die einen Einfluss auf den biochemischen Prozess haben könnten, der die schnelle Wiederaufnahme der c-MYC Translation gewährleistet. Auf Translationsebene wurden RNA:DNA-Hybriden, sogenannte R-loops, gefunden, die sich unter anderem unter Glutamin-Mangelbedingungen im Genom bilden können. Ein gezielter Abbau dieser R-loops mithilfe des Enzyms RNaseH1, in Kombination mit der ektopischen Expression einer c-MYC-Variante, die unempfindlich gegenüber der zelleigenen Regulationsmechanismen ist, führte zu einer erhöhten Anzahl an apoptotischen Zellen in Kultur. Exprimiert man eine funktionell inaktive Variante der RNaseH1, statt der funktionellen, so kann dieser Apoptose-fördernde Prozess nicht beobachtet werden. Dies bestärkt die Hypothese, dass die R-loops, die sich während eines Glutamin-Mangels und hoher c-MYC-Konzentration bilden, eine regulatorische Funktion innehaben. Als Ursache für die Apoptose konnte ein Effekt der veränderten Expression auf das Fortschreiten des Zellzyklus ausgeschlossen werden. Jedoch zeigte sich eine Veränderung im Nukleotid-Metabolismus. Betroffene Zellen zeigten deutlich reduzierte Nuklotidtriphosphat-Konzentrationen im Vergleich zu Zellen unter Glutaminmangelbedingungen ohne R-loop-Abbau. In dieser Arbeit wurde ein Modell entwickelt, das einen sich selbst negativ verstärkenden Zyklus vorschlägt, der die Zellen zur Apoptose führt. Transkriptionstermination und eine unkontrollierte Initiation der Transkription im Wechsel führt zu einem Verbrauch der lebensnotwendigen Energieressourcen der Zellen. Sequenzierungsexperimente zur Lokalisierung der R-loops und Terminationsstellen sind bislang fehlgeschlagen, bieten jedoch Ansätze für künftige Forschung. KW - Myc KW - cMYC regulation KW - Colorectal Cancer KW - Glutamine KW - Translation regulation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363316 ER - TY - THES A1 - Beudert, Matthias T1 - Bioinspired Modification and Functionalization of Hydrogels for Applications in Biomedicine T1 - Biologisch-inspirierte Modifizierung und Funktionalisierung von Hydrogelen für Anwendungen in der Biomedizin N2 - Over the years, hydrogels have been developed and used for a huge variety of different applications ranging from drug delivery devices to medical products. In this thesis, a poly(2-methyl-2-oxazoline) (POx) / poly(2-n-propyl-2-oxazine) (POzi) bioink was modified and analyzed for the use in biofabrication and targeted drug delivery. In addition, the protein fibrinogen (Fbg) was genetically modified for an increased stability towards plasmin degradation for its use as wound sealant. In Chapter 1, a thermogelling, printable POx/POzi-based hydrogel was modified with furan and maleimide moieties in the hydrophilic polymer backbone facilitating post-printing maturation of the constructs via Diels-Alder chemistry. The modification enabled long-term stability of the hydrogel scaffolds in aqueous solutions which is necessary for applications in biofabrication or tissue engineering. Furthermore, we incorporated RGD-peptides into the hydrogel which led to cell adhesion and elongated morphology of fibroblast cells seeded on top of the scaffolds. Additional printing experiments demonstrate that the presented POx/POzi system is a promising platform for the use as a bioink in biofabrication. Chapter 2 highlights the versatility of the POx/POzi hydrogels by adapting the system to a use in targeted drug delivery. We used a bioinspired approach for a bioorthogonal conjugation of insulin-like growth factor I (IGF-I) to the polymer using an omega-chain-end dibenzocyclooctyne (DBCO) modification and a matrix metalloprotease-sensitive peptide linker. This approach enabled a bioresponsive release of IGF-I from hydrogels as well as spatial control over the protein distribution in 3D printed constructs which makes the system a candidate for the use in personalized medicine. Chapter 3 gives a general overview over the necessity of wound sealants and the current generations of fibrin sealants on the market including advantages and challenges. Furthermore, it highlights trends and potential new strategies to tackle current problems and broadens the toolbox for future generations of fibrin sealants. Chapter 4 applies the concepts of recombinant protein expression and molecular engineering to a novel generation of fibrin sealants. In a proof-of-concept study, we developed a new recombinant fibrinogen (rFbg) expression protocol and a Fbg mutant that is less susceptible to plasmin degradation. Targeted lysine of plasmin cleavage sites in Fbg were exchanged with alanine or histidine in different parts of the molecule. The protein was recombinantly produced and restricted plasmin digest was analyzed using high resolution mass spectrometry. In addition to that, we developed a novel time resolved screening protocol for the detection of new potential plasmin cleavage sites for further amino acid exchanges in the fibrin sealant. N2 - Hydrogele wurden im Laufe der Jahre für eine Vielzahl von Anwendungen, von der Verabreichung von Medikamenten bis hin zu medizinischen Produkten, entwickelt und eingesetzt. In dieser Arbeit wurde eine Poly(2-methyl-2-oxazolin) POx) / Poly(2-n-propyl-2- oxazin) (POzi) Biotinte modifiziert und für den Einsatz in der Biofabrikation und für die gezielte Verabreichung von Medikamenten analysiert. Außerdem wurde das Protein Fibrinogen (Fbg) gentechnisch verändert, um seine Stabilität gegenüber dem Plasminabbau in seiner Funktion als Wundkleber zu erhöhen In Kapitel 1 wurde ein thermogelierendes, druckbares Hydrogel auf POx/POzi-Basis mit Furan- und Maleimid-Funktionen im hydrophilen Polymerrückgrat modifiziert, was die Reifung der Konstrukte nach dem Druck durch Diels-Alder-Chemie bewirkt. Die Modifizierung ermöglichte eine langfristige Stabilität der Hydrogele in wässrigen Lösungen, was für Anwendungen im Bereich der Biofabrikation oder im Tissue Engineering erforderlich ist. Darüber hinaus haben wir RGD-Peptide in das Hydrogel integriert, was zur Zelladhäsion und einer verlängerten Morphologie von Fibroblasten, die auf den Gelen ausgesät wurden, führte. Weitere Druckexperimente zeigen außerdem, dass das POx/POzi-System eine vielversprechende Plattform für den Einsatz als Biotinte in der Biofabrikation ist. Kapitel 2 unterstreicht die Vielseitigkeit der POx/POzi-Hydrogele, indem das System für die gezielte Abgabe von Medikamenten angepasst wird. Wir verwendeten einen von der Natur inspirierten Ansatz für eine biorthogonale Konjugation vom Insuline-like Growth Factor I (IGF- I) an das Polymer unter Verwendung einer Dibenzocyclooctin-Modifikation des Polymers am Ende der Omega-Kette und eines Matrix-Metalloproteasen-empfindlichen Peptid-Linkers. Dieser Ansatz ermöglichte eine bioresponsive Freisetzung von IGF-I aus Hydrogelen sowie eine räumliche Kontrolle über die Proteinverteilung in 3D-gedruckten Konstrukten, was das System zu einem Kandidaten für den Einsatz in der personalisierten Medizin macht. Kapitel 3 gibt einen allgemeinen Überblick über die Notwendigkeit von Wundversiegelungsmitteln und die derzeit auf dem Markt befindlichen Generationen von Fibrinklebern einschließlich der Vorteile und Herausforderungen. Darüber hinaus werden Trends und potenzielle neue Strategien zur Lösung aktueller Probleme und zur Erweiterung der Toolbox für künftige Generationen von Fibrinklebern aufgezeigt. In Kapitel 4 werden die Konzepte der rekombinanten Proteinexpression und des Molecular Engineering auf eine neue Generation von Fibrin Wundklebern angewandt. In einer Proof-of- Concept-Studie haben wir ein neues rekombinantes Fbg Expressionsprotokoll und eine Fbg Mutante entwickelt, die weniger anfällig für einen Abbau durch Plasmin ist. Gezielte Lysine in Plasmin-Schnittstellen in Fbg wurde entweder durch Alanin oder Histidin in unterschiedlichen Teilen des Moleküls ausgetauscht. Das Protein wurde rekombinant hergestellt und eine verminderte Schnittrate wurde mittels hochauflösender Massenspektrometrie gezeigt. Zusätzlich haben wir ein neues zeitaufgelöstes Screening-Protokoll entwickelt, mit dem sich neue potenzielle Plasmin-Spaltstellen für weitere Aminosäurenaustausche in Fibrin-Klebern auflösen lassen. KW - Hydrogel KW - Targeted drug delivery KW - 3 D bioprinting KW - Hydrogels KW - Modification KW - Bioinks KW - Fibrinogen KW - Drug Delivery Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-322887 ER -