TY - THES A1 - Schneider, Felicitas Maria Hannelore T1 - Vergleichende Evaluierung verschiedener Ansätze des Memory Enhancement bei neurodegenerativen Prozessen T1 - Comparative evaluation of different approaches of memory enhancement in neurodegenerative disease N2 - Angesichts des dramatischen, weltweiten Anstiegs der Prävalenz von Demenzerkrankungen und der aktuellen, unzureichenden Therapieansätze ist die Bereitstellung neuer, wirkungsvoller Behandlungsoptionen von größter Bedeutung. Technologische, pharmakologische und verhaltensbasierte Verfahren des Memory Enhancement könnten zur Lösung dieses Problems beitragen: Hierzu zählt die Stammzelltransplantation, die in mehreren Tierstudien zu einer Verbesserung der Gedächtnisfunktion führte. Zudem wird seit Längerem an einer Impfung gegen die Alzheimer-Krankheit mittels β-Amyloid-Antikörpern geforscht. Ein weiterer therapeutischer Ansatz für die Alzheimer-Krankheit besteht in der optogenetischen Stimulation spezifischer hippocampaler Engramm-Zellen, durch die bei einem Maus-Modell verloren gegangene Erinnerungen wiederhergestellt werden konnten. Unkonventionelle Pharmazeutika wie Erythropoetin führten in Tierstudien und bei Patienten mit neuropsychiatrischen Erkrankungen zu einer Verbesserung der kognitiven Fähigkeiten und des Gedächtnisses. Eine Modifikation der Ernährung und der Einsatz von Pro- und Präbiotika beeinflussen das Gedächtnis über eine Manipulation der Darm-Hirn-Achse. Verhaltensbasierte Maßnahmen wie körperliche Aktivität und der Einsatz von Mnemotechniken stellen effektive Ansätze des Memory Enhancement dar, welche bereits heute von gesunden Individuen implementiert werden können. Für die Anwendung von Augmented Reality (AR) konnten kognitionsfördernde Wirkungen beim Lernen neuroanatomischer Themen und dem Zusammenbau von Objekten nachgewiesen werden. Besonders vielversprechend stellt sich die Entwicklung einer Gedächtnisprothese dar, durch die vergessene Informationen bei Personen mit stattgehabtem Schädel-Hirn-Trauma und apoplektischem Insult reaktiviert werden könnten. Memory Enhancement ist prinzipiell bereits heute bei gesunden und kranken Individuen anwendbar und verspricht wirksame zukünftige Präventions- und Therapieoptionen. Ein realer Einsatz in der klinischen Praxis ist in naher Zukunft jedoch noch nicht zu erwarten. N2 - Due to the worldwide increasing prevalence of dementia and the current, inadequate therapeutic approaches, it is very important to develop new, effective treatment options. Technological, pharmacological and behavior-based methods of memory enhancement could help to solve this problem: This includes stem cell transplantation, which has led to an improvement in memory function in several animal studies. In addition, research into vaccination against Alzheimer's disease using β-amyloid antibodies has been done for several years. Another therapeutic approach for Alzheimer's disease is the optogenetic stimulation of specific hippocampal engram cells, through which lost memories could be restored in a mouse model. Unconventional pharmaceuticals such as erythropoietin have improved cognitive skills and memory in animal studies and in patients with neuropsychiatric disorders. A diet modification and the use of probiotics and prebiotics affect memory by manipulating the gut-brain axis. Behavioral approaches such as physical activity and the use of mnemonics represent effective approaches of memory enhancement that healthy individuals can already implement today. The application of augmented reality (AR) was associated to cognition-promoting effects when learning neuroanatomical topics and assembling objects. The development of a memory prosthesis seems to be particularly promising and could be used to reactivate forgotten information in people with traumatic brain injury and apoplectic insult. In principle, memory enhancement can already be used today in healthy and diseased individuals and promises effective future prevention and therapy options. However, a real use in clinical practice cannot be expected in the near future. KW - Neurodegeneration KW - Langzeitgedächtnis KW - Alzheimerkrankheit KW - memory enhancement KW - neuroenhancement Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207562 ER - TY - THES A1 - Pfann, Christina T1 - Untersuchungen zu neuen therapeutischen Ansätzen zur Beeinflussung der MYC-Expression im kolorektalen Karzinom T1 - Experiments on new therapeutic strategies to influence MYC expression in colorectal cancer N2 - Eine veränderte Expression des Transkriptionsfaktors MYC wird als entscheidender Faktor für Tumorentstehung und -progress im kolorektalen Karzinom gesehen. Somit ist die Hemmung dessen Expression und Funktion ein zentraler Ansatz bei der zielgerichteten Tumortherapie. Als geeignete Strategie, sowohl die Halbwertszeit als auch die Translation von MYC zu verringern, erschien eine duale PI3K-/mTOR-Hemmung durch den small molecule-Inhibitor BEZ235. Gegenteilig ist jedoch unter Behandlung mit BEZ235 eine verstärkte MYC-Expression in verschiedenen Kolonkarzinom-Zelllinien zu beobachten. Neben verstärkter Transkription, konnte eine verstärkte IRES-abhängige Translation von MYC nach Hemmung der mTOR-/5´Cap-abhängigen Translation durch BEZ235, als Ursache der MYC-Induktion nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Induktion von MYC nach PI3K-/mTOR-Hemmung durch eine kompensatorische Aktivierung des MAPK-Signalwegs in Folge einer FOXO-abhängigen Induktion von Rezeptortyrosinkinasen, stattfindet. Eine mögliche Strategie, diese Feedback-Mechanismen zu umgehen, ist die direkte Hemmung der Translationsinitiation. Hierfür wurden Rocaglamid und dessen Derivat Silvestrol als small molecule-Inhibitoren der eIF4A-Helikase verwendet. Im Gegensatz zur PI3K/mTOR-Hemmung, ist durch eIF4A-Inhibition eine Reduktion der MYC-Proteinexpression in verschiedenen Kolonkarzinom-Zelllinien zu erreichen – ohne einhergehende MAPK-Aktivierung. Anhand der Ergebnisse kann postuliert werden, dass Silvestrol das Potential besitzt, sowohl die Cap-/eIF4F-abhängie als auch die somit eIF4A-abhängige IRES-vermittelte Translation von MYC zu hemmen. Weiterhin kann eine proliferationshemmende Wirkung durch Silvestrol auf Kolonkarzinom-Zellen in vitro, via Zellzyklusarrest und Induktion von Apoptose, gezeigt werden. Dies stellt die Voraussetzung für eine potentielle Eignung als tumorhemmender Wirkstoff in der Therapie des kolorektalen Karzinoms dar. N2 - Deregulated expression of MYC is a driver of colorectal carcinogenesis. Thus inhibition of MYC function and expression may be a central aim in targeted therapy. Inhibiting the PI3K-and mTOR pathway seemed to be a proper strategy to increase MYC turnover and reduce its translation. Instead, we observe enhanced MYC expression in colon carcinoma cells upon treatment with the dual PI3K-/mTOR-inhibitor BEZ235. PI3K-/mTOR-Inhibition permits both enhanced transcription and induction of IRES-dependent translation of MYC through feedback activation of the MAPK pathway via FOXO-dependent induction of receptor tyrosine kinases. A strategy to bypass the signalling feedback mechanisms, is targeting the translation initiation. Using Silvestrol, a Rocaglamid derivate as small molecule inhibitor of the initiation factor eIF4A, MYC protein expression can be reduced in colorectal cancer cells – without observed MAPK-activation. So Silvestrol has he potential to inhibit Cap-/eIF4F-dependend as well as eIF4A-dependent IRES-mediated tranlation of MYC. Furthermore Silvestrol inhibits proliferation of colon carcinoma cells in vitro, shown by cell cycle arrest and induction of apoptosis. Our data argue that targeting translation initiation is a promising strategy to limit MYC expression in colorectal cancer. Thus, together with its antiproliferative effect, Silvestrol might be a potential anti-tumor agent. KW - Myc KW - colorectal cancer Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216687 ER - TY - THES A1 - Eidel, Matthias T. A. M. T1 - Training Effects of a Tactile Brain-Computer Interface System During Prolonged Use by Healthy And Motor-Impaired People T1 - Trainingseffekte eines Taktilen Brain-Computer Interface Systems bei längerer Nutzung von gesunden sowie motorisch eingeschränkten Personen N2 - Background - Brain-Computer Interfaces (BCI) enable their users to interact and communicate with the environment without requiring intact muscle control. To this end, brain activity is directly measured, digitized and interpreted by the computer. Thus, BCIs may be a valuable tool to assist severely or even completely paralysed patients. Many BCIs, however, rely on neurophysiological potentials evoked by visual stimulation, which can result in usability issues among patients with impaired vision or gaze control. Because of this, several non-visual BCI paradigms have been developed. Most notably, a recent study revealed promising results from a tactile BCI for wheelchair control. In this multi-session approach, healthy participants used the BCI to navigate a simulated wheelchair through a virtual apartment, which revealed not only that the BCI could be operated highly efficiently, but also that it could be trained over five sessions. The present thesis continues the research on this paradigm in order to - confirm its previously reported high performance levels and trainability - reveal the underlying factors responsible for observed performance increases - establish its feasibility among potential impaired end-users Methods - To approach these goals, three studies were conducted with both healthy participants and patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Brain activity during BCI operation was recorded via electroencephalography (EEG) and interpreted using a machine learning-based linear classifier. Wheelchair navigation was executed according to the classification results and visualized on a monitor. For offline statistical analysis, neurophysiological features were extracted from EEG data. Subjective data on usability were collected from all participants. Two specialized experiments were conducted to identify factors for training. Results and Discussion - Healthy participants: Results revealed positive effects of training on BCI performances and their underlying neurophysiological potentials. The paradigm was confirmed to be feasible and (for a non-visual BCI) highly efficient for most participants. However, some had to be excluded from analysis of the training effects because they could not achieve meaningful BCI control. Increased somatosensory sensitivity was identified as a possible mediator for training-related performance improvements. Participants with ALS: Out of seven patients with various stages of ALS, five could operate the BCI with accuracies significantly above chance level. Another ALS patient in a state of near-complete paralysis trained with the BCI for several months. Although no effects of training were observed, he was consistently able to operate the system above chance level. Subjective data regarding workload, satisfaction and other parameters were reported. Significance - The tactile BCI was evaluated on the example of wheelchair control. In the future, it could help impaired patients to regain some lost mobility and self-sufficiency. Further, it has the potential to be adapted to other purposes, including communication. Once visual BCIs and other assistive technologies fail for patients with (progressive) motor impairments, vision-independent paradigms such as the tactile BCI may be among the last remaining alternatives to interact with the environment. The present thesis has strongly confirmed the general feasibility of the tactile paradigm for healthy participants and provides first clues about the underlying factors of training. More importantly, the BCI was established among potential end-users with ALS, providing essential external validity. N2 - Hintergrund - Brain-Computer Interfaces (BCI) ermöglichen ihren Benutzern die Interaktion und Kommunikation mit der Außenwelt, ohne dabei die Funktionstüchtigkeit der Muskeln voraus zu setzen. Zu diesem Zweck wird die Gehirnaktivität vom Computer direkt gemessen, digitalisiert und schließlich interpretiert. BCIs könnten daher eine wertvolle Methode sein, schwer körperlich beeinträchtigten oder sogar vollständig gelähmten Patienten zu assistieren. Viele BCI Ansätze basieren allerdings auf neurophysiologischen Potentialen, welche mittels visueller Stimulation evoziert werden. Dies kann zur Folge haben, dass das BCI von Patienten mit Sehbehinderung oder fehlender Kontrolle über die eigene Blickrichtung nicht erfolgreich benutzt werden kann. Deshalb wurden bereits einige nicht-visuelle BCI Paradigmen entwickelt. Insbesondere eine aktuelle Studie über ein taktiles BCI zur Rollstuhlkontrolle lieferte vielversprechende Ergebnisse: In fünf Trainingssitzungen navigierten gesunde Studienteilnehmer per BCI einen simulierten Rollstuhl durch eine virtuelle Wohnung. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das BCI System nicht nur sehr effizient genutzt werden konnte, sondern auch, dass sich die Kontrolle durch das Training über mehrere Sitzungen verbesserte. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der weiterführenden Erforschung eben dieses Paradigmas, insbesondere mit den Zielen: . die zuvor berichtete hohe Performanz und Trainierbarkeit zu bestätigen . aufzuklären, welche Faktoren der Steigerung der BCI-Leistung zugrunde liegen . die Anwendbarkeit des Paradigmas bei beeinträchtigten Endnutzern zu etablieren Methoden - Um diese Ziele zu erreichen wurden drei Studien sowohl mit gesunden als auch mit Teilnehmern mit amyotropher Lateralsklerose (ALS) durchgeführt. Während der BCI-Nutzung wurde die Gehirnaktivität per Elektroenzephalographie (EEG) aufgezeichnet und von einem linearen Klassifikator (basierend auf Maschinenlernverfahren) interpretiert. Die Navigation des Rollstuhls wurde entsprechend der Ergebnisse des Klassifikators umgesetzt und auf einem Bildschirm visualisiert. Zur späteren statistischen Analyse wurden aus den EEG Daten neurophysiologische Merkmale extrahiert. Zudem wurden Fragebogendaten zur Nutzbarkeit des Systems von allen Teilnehmern erhoben. Zwei Experimente zur Identifizierung von Trainingsfaktoren wurden durchgeführt. Ergebnisse und Diskussion - Gesunde Teilnehmer: Die Ergebnisse zeigten positive Effekte des Trainings auf die BCI Performanz und deren zugrundeliegenden neurophysiologischen Potentiale. Es konnte bestätigt werden, dass das Paradigma anwendbar und für die meisten Teilnehmer hocheffizient nutzbar war (im Vergleich zu anderen nicht-visuellen Ansätzen). Einige Teilnehmer mussten jedoch von der Analyse der Trainingseffekte ausgeschlossen werden, da sie keine ausreichende Kontrolle über das BCI ausüben konnten. Eine Steigerung der somatosensorischen Empfindlichkeitsschwelle wurde als ein möglicher Faktor für die Trainierbarkeit und Verbesserung der Performanz identifiziert. Teilnehmer mit ALS: Fünf von sieben Teilnehmern in verschiedenen ALS-Stadien konnten das BCI signifikant überzufällig benutzen. Ein weiterer ALS Patient mit nahezu vollständiger Lähmung trainierte den Umgang mit dem BCI über mehrere Monate hinweg. Er war beständig in der Lage, das System mit Genauigkeiten über dem Zufallsniveau zu steuern, jedoch konnten keine Trainingseffekte gezeigt werden. Fragebogendaten zur subjektiven Arbeitsbelastung, Zufriedenheit und einigen weiteren Parametern wurden ausführlich berichtet. Bedeutung - Das taktile BCI wurde am Beispiel der Rollstuhlkontrolle evaluiert. In naher Zukunft könnte es beeinträchtigten Patienten helfen, ihre verlorene Mobilität und Selbstständigkeit zurück zu erlangen. Zudem kann es für viele weitere Zwecke adaptiert werden, insbesondere zur Kommunikation. Sobald visuelle BCIs oder andere technische Hilfsmittel bei Patienten mit (progressiver) motorischer Lähmung scheitern, könnten nicht-visuelle Paradigmen wie das taktile BCI zu den letzten verbleibenden Alternativen gehören, die eine Interaktion mit der Außenwelt noch erlauben. Die vorliegende Arbeit hat die grundsätzliche Anwendbarkeit des taktilen Paradigmas für gesunde Benutzer klar bestätigt. Zudem liefert sie erste Hinweise darauf, welche Faktoren den beobachteten Trainingseffekten zugrunde liegen könnten. Das BCI hat sich zudem bei potentiellen End-Nutzern mit ALS bewährt, was der externen Validität der Studienergebnisse enorm zuträgt. KW - Myatrophische Lateralsklerose KW - Gehirn-Computer-Schnittstelle KW - Elektroencephalographie KW - Rollstuhl KW - Brain-Computer Interface KW - Amyotrophic Lateral Sclerosis KW - Wheelchair Navigation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208511 ER - TY - THES A1 - Horn [née Bunz], Melanie T1 - The impact of Drosophila melanogaster`s endogenous clock on fitness: Influence of day length, humidity and food composition T1 - Auswirkungen von Drosophila melanogaster`s Innerer Uhr auf die Fitness: Einfluss von Tageslänge, Luftfeuchtigkeit und Ernährung N2 - We are living in a system that underlies permanent environmental changes due to the rotation of our planet. These changes are rhythmic with the most prominent one having a period of about 24 hours, but also shorter and longer rhythms characterize our environment. To cope with the ever-changing environmental conditions, it is thought to be beneficial if an organism can track and anticipate these changes. The so called endogenous clocks enable this and might provide a fitness advantage. To investigate and unravel the mechanism of endogenous clocks Chronobiologists have used different model organisms. In this thesis Drosophila melanogaster was used as model organism with its about 150 clock neurons representing the main endogenous clock of the fly in the central brain. The molecular mechanisms and the interlocked feedback loops with the main circadian key players like period, timeless, clock or cycle are under investigation since the 1970s and are characterized quite well so far. But the impact of a functional endogenous clock in combination with diverse factors and the resulting fitness advantages were analysed in only a few studies and remains for the most part unknown. Therefore the aim of this thesis was to unravel the impact of Drosophila melanogaster`s endogenous clock on the fitness of the fly. To achieve this goal different factors – like day length, humidity and food composition – were analyzed in wild type CS and three different period mutants, namely perL, perS and per01, that carry a point mutation altering or abolishing the free-running period of the fruit fly as well as a second arrhythmic strain, clkAR. In competition assay experiments wild type and clock mutant flies competed for up to 63 generations under a normal 24 hour rhythm with 12 hours light/day and 12 hours darkness/night (LD12:12) or T-cycles with 19 or 29 hours, according to the mutants free-running period, or constant light (LL) in case of the arrhythmic mutant as well as under natural-like outdoor conditions in two consecutive years. Overall the wild type CS strain was outcompeting the clock mutant strains independent of the environmental conditions. As the perL fly strain elongated their free-running period, the competition experiments were repeated with naturally cantonized new fly strains. With these experiments it could be shown that the genetic background of the fly strains – which are kept for decades in the lab, with backcrosses every few years – is very important and influences the fitness of flies. But also the day length impacts the fitness of the flies, enabling them to persist in higher percentage in a population under competition. Further factors that might influence the survival in a competing population were investigated, like e.g. mating preferences and locomotor activity of homo- and heterozygous females or sperm number of males transferred per mating. But these factors can still not explain the results in total and play no or only minor roles and show the complexity of the whole system with still unknown characteristics. Furthermore populations of flies were recorded to see if the flies exhibit a common locomotor activity pattern or not and indeed a population activity pattern could be recorded for the first time and social contact as a Zeitgeber could be verified for Drosophila melanogaster. In addition humidity and its impact on the flies´ fitness as well as a potential Zeitgeber was examined in this thesis. The flies experienced different relative humidities for eclosion and wing expansion and humidity cycle phase shifting experiments were performed to address these two different questions of fitness impact and potential Zeitgeber. The fruit fly usually ecloses in the morning hours when the relative humidity is quite high and the general assumption was that they do so to prevent desiccation. The results of this thesis were quite clear and demonstrate that the relative humidity has no great effect on the fitness of the flies according to successful eclosion or wing expansion and that temperature might be the more important factor. In the humidity cycle phase shifting experiments it could be revealed that relative humidity cannot act as a Zeitgeber for Drosophila melanogaster, but it influences and therefore masks the activity of flies by allowing or surpressing activity at specific relative humidity values. As final experiments the lifespan of wild type and clock mutant flies was investigated under different day length and with different food qualities to unravel the impact of these factors on the fitness and therefore survival of the flies on the long run. As expected the flies with nutrient-poor minimum medium died earlier than on the nutrient-rich maximum medium, but a small effect of day length could also be seen with flies living slightly longer when they experience environmental day length conditions resembling their free-running period. The experiments also showed a fitness advantage of the wild type fly strain against the clock mutant strains for long term, but not short term (about the first 2-3 weeks). As a conclusion it can be said that genetic variation is important to be able to adapt to changing environmental conditions and to optimize fitness and therefore survival. Having a functional endogenous clock with a free-running period of about 24 hours provides fitness advantages for the fruit fly, at least under competition. The whole system is very complex and many factors – known and unknown ones – play a role in this system by interacting on different levels, e.g. physiology, metabolism and/or behavior. N2 - Wir leben in einem System, welches durch die Erdrotation permanenten Veränderungen der Umwelt unterliegt. Diese Veränderungen sind rhythmischer Natur, wobei die wichtigste Veränderung einen Rhythmus von circa 24 Stunden aufweist. Aber auch kürzere und längere Rhythmen charakterisieren unsere Umwelt. Um mit den permanenten Veränderungen klar zu kommen geht man davon aus, dass es von Vorteil ist wenn ein Organismus die Veränderungen wahrnehmen und vorausahnen kann. Die sogenannten Inneren Uhren ermöglichen dies und stellen möglicherweise einen Fitness Vorteil dar. Um den Mechanismus von Inneren Uhren zu untersuchen und aufzudecken benutzen Chronobiologen verschiedene Modellorganismen. In dieser Arbeit wurde Drosophila melanogaster, mit ihren etwa 150 Uhrneuronen welche die Innere Uhr im Zentralen Nervensystem darstellen, als Modellorganismus verwendet. Der molekulare Mechanismus und die ineinandergreifenden Rückkopplungsschleifen mit den Hauptakteuren period, timeless, clock und cycle werden seit den 1970ern erforscht und wurden bisher recht gut charakterisiert. Aber der Einfluss einer funktionellen Inneren Uhr in Kombination mit diversen Faktoren und die daraus resultierenden Fitness Vorteile wurden in nur wenigen Studien untersucht und bleiben zu großen Teilen unbekannt. Deshalb war es das Ziel dieser Arbeit den Einfluss von Drosophilas Innere Uhr auf die Fitness der Taufliege aufzudecken. Um dieses Ziel zu erreichen wurden verschiedene Faktoren – wie z.B. Tageslänge, Luftfeuchtigkeit und Futterqualität – in Wildtyp CS und drei verschiedenen period Mutanten – namentlich perL, perS und per01, welche alle eine Punktmutation tragen, welche die Freilauf-Periodenlänge verändert oder zu Arrhythmizität führt – sowie einem weiteren arrhythmischen Fliegenstamm, clkAR, untersucht. In Konkurrenzversuchen konkurrierten Wildtyp und Uhrmutanten über bis zu 63 Generationen unter normalen 24 Stunden Rhythmen mit jeweils 12 Stunden Licht/Tag und 12 Stunden Dunkelheit/Nacht oder unter T-Zyklen mit 19 oder 29 Stunden, entsprechend der Freilauf-Periodenlänge der Mutanten, oder Dauerlicht (LL) im Falle der arrhythmischen Mutante, sowie unter naturähnlichen Bedingungen im Feldversuch in zwei aufeinanderfolgenden Jahren. Im Gesamten war der Wildtyp den Uhrmutanten überlegen, unabhängig von den Umweltbedingungen. Da die perL Mutanten Ihre Freilauf-Periodenlänge deutlich verlängerten, wurden die Konkurrenzexperimente mit auf natürlicher Weise mit dem Wildtyp CS rückgekreuzten Fliegenstämmen wiederholt. Mit diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass der genetische Hintergrund der Fliegenstämme – welche teils für Jahrzehnte im Labor gehalten und nur wenige Male rückgekreuzt werden – sehr wichtig ist und die Fitness der Fliegen beeinflusst. Aber auch die Länge der Tage (19 h, 24 h oder 29 h) beeinflusst die Fitness der Fliegen und ermöglicht es Ihnen in höherem Anteil in einer Population unter Konkurrenz zu bestehen. Weitere Faktoren, welche das Überleben unter Konkurrenz möglicherweise beeinflussen können, wie z.B. eine Paarungspräferenz und Laufaktivität von homo- und heterozygoten Weibchen oder die Anzahl an Spermien, die pro Paarung übertragen werden, wurden untersucht. Diese Faktoren allein konnten jedoch die Ergebnisse der Konkurrenzversuche nicht erklären und spielen dabei keine oder nur geringfügige Rollen und stellen ein Beispiel für die Komplexität des ganzen Systems mit noch weiteren unbekannten Faktoren dar. Im Weiteren wurde das Laufverhalten von ganzen Fliegenpopulationen aufgezeichnet, um zu erforschen, ob eine Fliegenpopulation einen gemeinsamen Freilauf an Laufaktivität aufweist oder nicht. Und tatsächlich konnte zum ersten Mal das Laufverhalten von ganzen Populationen aufgezeichnet werden und Sozialer Kontakt als Zeitgeber für Drosophila melanogaster bestätigt werden. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit relative Luftfeuchtigkeit und deren Auswirkung auf die Fitness der Fliegen, als auch als potentieller Zeitgeber untersucht. Die Fliegen wurden zum Schlupf und zur Entfaltung der Flügel unterschiedlichen Luftfeuchtigkeiten ausgesetzt und es wurden Phasenverschiebungsversuche mit Luftfeuchtigkeitszyklen durchgeführt, um diese zwei verschiedenen Fragen nach Fitness und potentiellem Zeitgeber zu beantworten. Die Fruchtfliege schlüpft normalerweise in den Morgenstunden, wenn die Luftfeuchtigkeit relativ hoch ist, weshalb im Allgemeinen angenommen wird, dass dies zu diesem Zeitpunkt des Tages geschieht, um eine Austrocknung zu verhindern. Die Ergebnisse dieser Arbeit waren sehr eindeutig und demonstrierten, dass die relative Luftfeuchtigkeit keinen großen Einfluss auf die Fitness der Fliegen in Bezug auf den Schlupferfolg und korrektes Entfalten der Flügel hat und dass die Temperatur wohl eher der ausschlaggebende Faktor sein könnte. In den Phasenverschiebungsversuchen mit Luftfeuchtigkeitszyklen konnte aufgedeckt werden, dass relative Luftfeuchtigkeit keinen Zeitgeber für Drosophila melanogaster darstellt, aber die Laufaktivität der Fliegen beeinflusst und maskiert, indem das Laufverhalten bei bestimmten relativen Luftfeuchtigkeiten zugelassen oder unterdrückt wird. Außerdem wurde die Lebenserwartung der Wildtyp und Uhrmutanten Fliegenstämme unter verschiedenen Tageslängen und mit unterschiedlicher Futterqualität untersucht, um den Einfluss dieser Faktoren auf die Fitness und somit das Überleben der Fliegen auf Dauer zu charakterisieren. Wie erwartet starben die Fliegen auf dem nährstoffarmen Minimalmedium früher als auf dem nährstoffreichen Maximalmedium, aber es konnte auch ein kleiner Effekt der Tageslänge gezeigt werden. Hierbei lebten die Fliegen etwas länger, wenn die Tageslänge die Freilauf-Periodenlänge der Fliegen widerspiegelte. Diese Versuche zeigten auch einen Fitness Vorteil der Wildtyp Fliegen gegenüber der Uhrmutanten auf lange Sicht, jedoch nicht zu Beginn (in den ersten ca. 2-3 Wochen). Abschließend kann zusammengefasst werden, dass genetische Variation wichtig ist, um sich an Veränderungen in der Umwelt anzupassen und die eigene Fitness und somit Überleben zu steigern. Eine funktionelle Innere Uhr mit einer Periodenlänge von etwa 24 Stunden zu besitzen stellt einen Fitness Vorteil für die Fliegen dar, zumindest unter Konkurrenzbedingungen. Das ganze System ist sehr komplex und viele Faktoren – bekannte und noch unbekannte – spielen eine Rolle in diesem System, welches auf verschiedenen Ebenen interagiert, wie z.B. auf physiologischer, metabolistischer oder auf der Verhaltensebene. KW - Taufliege KW - Drosophila KW - Biologische Uhr KW - Tageslänge KW - Luftfeuchtigkeit KW - Drosophila melanogaster KW - Fitness Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211415 ER - TY - THES A1 - Wäldchen, Sina T1 - Super-Resolution-Mikroskopie zur Visualisierung und Quantifizierung von Glutamatrezeptoren und ADHS-assoziierten Proteinen T1 - Super-resolution microscopy for visualization and quantification of Glutamate receptors and ADHD-associated proteins N2 - Die Entwicklung hochauflösender Fluoreszenzmikroskopiemethoden hat die Lichtmikroskopie revolutioniert. Einerseits ermöglicht die höhere erzielte räumliche Auflösung die Abbildung von Strukturen, die deutlich unterhalb der beugungsbedingten Auflösungsgrenze liegen. Andererseits erhält man durch Einzelmoleküllokalisationsmikroskopiemethoden wie dSTORM (Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) Informationen, welche man für quantitative Analysen heranziehen kann. Aufgrund der sich dadurch bietenden neuen Möglichkeiten, hat sich die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie rasant entwickelt und kommt mittlerweile zur Untersuchung einer Vielzahl biologischer und medizinischer Fragestellungen zum Einsatz. Trotz dieses Erfolgs ist jedoch nicht zu verleugnen, dass auch diese neuen Methoden ihre Nachteile haben. Dazu zählt die Notwendigkeit relativ hoher Laserleistungen, welche Voraussetzung für hohe Auflösung ist und bei lebenden Proben zur Photoschädigung führen kann. Diese Arbeit widmet sich sowohl dem Thema der Photoschädigung durch Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie, als auch der Anwendung von dSTORM und SIM (Structured Illumination Microscopy) zur Untersuchung neurobiologischer Fragestellungen auf Proteinebene. Zur Ermittlung der Photoschädigung wurden lebende Zellen unter typischen Bedingungen bestrahlt und anschließend für 20−24 h beobachtet. Als quantitatives Maß für den Grad der Photoschädigung wurde der Anteil sterbender Zellen bestimmt. Neben der zu erwartenden Intensitäts- und Wellenlängenabhängigkeit, zeigte sich, dass die Schwere der Photoschädigung auch von vielen weiteren Faktoren abhängt und dass sich Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie bei Berücksichtigung der gewonnenen Erkenntnisse durchaus mit Lebendzellexperimenten vereinbaren lässt. Ein weiteres Projekt diente der Untersuchung der A- und B-Typ-Glutamatrezeptoren an der neuromuskulären Synapse von Drosophila melanogaster mittels dSTORM. Dabei konnte eine veränderte Anordnung beider Rezeptortypen infolge synaptischer Plastizität beobachtet, sowie eine absolute Quantifizierung des A-Typ-Rezeptors durchgeführt werden. Im Mittelpunkt eines dritten Projekts standen Cadherin-13 (CDH13) sowie der Glucosetransporter Typ 3 (GluT3), welche beide mit der Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung in Verbindung gebracht werden. CDH13 konnte mittels SIM in serotonergen Neuronen, sowie radiären Gliazellen der dorsalen Raphekerne des embryonalen Mausgehirns nachgewiesen werden. Die Rolle von GluT3 wurde in aus induzierten pluripotenten Stammzellen differenzierten Neuronen analysiert, welche verschiedene Kopienzahlvariation des für GluT3-codierenden SLC2A3-Gens aufwiesen. Die Proteine GluT3, Bassoon und Homer wurden mittels dSTORM relativ quantifiziert. Während die Deletion des Gens zu einer erwartenden Verminderung von GluT3 auf Proteinebene führte, hatte die Duplikation keinen Effekt auf die GluT3-Menge. Für Bassoon und Homer zeigte sich weder durch die Deletion noch die Duplikation eine signifikante Veränderung. N2 - The emergence of super-resolution microscopy techniques caused a revolution of light microscopy. On the one hand, the higher achieved structural resolution allows for the visualization of structures below the diffraction limit. On the other hand, single molecule localization microscopy methods like dSTORM (Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) provide information that can be used for quantitative analysis. The new possibilities, offered by these approaches, lead to rapid development of the same and by now they are applied to investigate a broad range of biological and medical questions. Besides this success, it can’t be denied, that these methods also have some disadvantages like the necessity of relative high laser intensities that are needed for the high resolution and might cause photodamage in living samples. This work deals with the issue of photodamage induced by single molecule localization microscopy methods as well as the examination of neurobiological problems on protein level by the usage of dSTORM and SIM (Structured Illumination Microscopy). To identify photodamage, living cells were irradiated at typical conditions and were observed for 20−24 h afterwards. As a quantitative measure for the severity of photodamage, the fraction of dying cells was determined. Besides the expected dependency on intensity and wavelength, a lot of other factors showed to affect the severity. It could be demonstrated that single molecule localization microscopy can be combined with live-cell imaging if one takes those results into account. Another project aimed for the investigation of A- and B-type Glutamate receptors at the neuromuscular junction of Drosophila melanogaster via dSTORM. Thus, an altered arrangement of both receptor types could be observed and A-type receptors could be quantified absolutely. A third project focused on cadherin-13 (CDH13) and glucose transporter 3 (GluT3), which are connected with attention deficit hyperactivity disorder. CDH13 could be detected in serotonergic neurons and radial glial cells of dorsal raphe in embryonic mouse brains using SIM. The role of GluT3 was analyzed in neurons, differentiated from induced pluripotent stem cells, which possessed different copy-number variations of the gene SLC2A3, which codes for GluT3. Proteins GluT3, Bassoon and Homer were quantified relatively using dSTORM. While the deletion of the gene resulted in an expected decrease of GluT3 at the protein level, the duplication didn’t affect the amount of GluT3. In the case of Homer and Bassoon, neither the deletion, nor the duplication caused any significant changes. KW - Mikroskopie KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Quantitative Mikroskopie KW - Glutamatrezeptor KW - Aufmerksamkeitsdefizit-Syndrom KW - dSTORM KW - Photoschädigung KW - Neuromuskuläre Synapse KW - Glucosetransporter Typ3 KW - Cadherin-13 Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192834 ER - TY - THES A1 - Götz, Ralph T1 - Super-resolution microscopy of plasma membrane receptors and intracellular pathogens T1 - Hochauflösende Mikroskopie von Plasmamembran Rezeptoren und intrazellulären Pathogenen N2 - Humans tend to believe in what they can see with their own eyes. Hence, visualization methods like microscopy have always been extremely popular since their invention in the 17th century. With the advent of super-resolution microscopy, the diffraction limit of ~200 - 250 nm could be overcome to enable more detailed insights into biological samples. Especially the single molecule localization microscopy method dSTORM offers the possibility of quantitative bioimaging. Hereby, the repetitive photoswitching of organic dyes in the presence of thiols is exploited to enable a lateral resolution of 20 nm. Another, recently introduced super-resolution method is expansion microscopy (ExM) which physically expands the sample to increase the resolution by the expansion factor from four to even twenty. To enable this, the sample is embedded into a hydrogel, homogenized using an unspecific proteinase and expanded in distilled water. Within this thesis, both methods were used to shed light on plasma membrane receptor distributions and different bacterial and fungal pathogens. In the first part of this thesis dSTORM was used to elucidate the “Receptome”, the entirety of all membrane receptors, of the cell line Jurkat T-cells and primary T-cells. Within this project we could successfully visualize and quantify the distribution of the plasma membrane receptors CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD20, CD28, CD45, CD69 and CD105 with receptor densities ranging from 0.8 cluster/µm² in case of CD20 and 81.4 cluster/µm² for the highly abundant CD45 in activated primary T-cells at the basal membrane. Hereby, we could also demonstrate a homogeneous distribution of most receptors, while only few were clustered. In the case of CD3-clusters were detected in Jurkat T-cells and in primary activated T-cells, but not in naïve ones, demonstrating the activation of this receptor. This was followed by the application of dSTORM to three different clinical projects involving the receptors CD38, BCMA and CD20 which are immunotherapeutic targets by monoclonal antibodies and CAR T-cells. In the first two projects dSTORM was applied to determine the receptor upregulation upon exposure of various drugs to MM1.S cells or primary multiple myeloma patient cells. This increase in membrane receptor expression can subsequently enhance the efficacy of therapies directed against these receptors. Within the CD20-project, the superior sensitivity of dSTORM compared to flow cytometry could be demonstrated. Hereby, a substantially higher fraction of CD20-positive patient cells was detected by dSTORM than by flow cytometry. In addition, we could show that by dSTORM CD20-positive evaluated cells were eradicated by immunotherapeutic CAR T-cell treatment. These studies were followed by whole cell super-resolution imaging using both LLS-3D dSTORM and 10x ExM to exclude any artifacts caused by interactions with the glass surface. In 10x ExM signal amplification via biotinylated primary antibodies and streptavidin ATTO 643 was essential to detect even single antibodies directed against the heterodimer CD11a with standard confocal microscopes. Albeit probably not quantitative due to the process of gelation, digestion and expansion during the ExM protocol, even some putative dimers of the receptor CD2 could be visualized using 10x ExM-SIM, similar to dSTORM experiments. Within the second part of this thesis, expansion microscopy was established in bacterial and fungal pathogens. ExM enabled not only an isotropic fourfold expansion of Chlamydia trachomatis, but also allowed the discrimination between the two developmental forms by the chlamydial size after expansion into reticulate and elementary bodies. Hereafter, a new α-NH2-ω-N3-C6-ceramide was introduced enabling an efficient fixation and for the first time the use of lipids in both, 4x and 10x ExM, termed sphingolipid ExM. This compound was used to investigate the ceramide uptake and incorporation into the cell membrane of Chlamydia trachomatis and Simkania negevensis. For Chlamydia trachomatis the combined resolution power of 10x ExM and SIM even allowed the visualization of both bacterial membranes within a distance of ~30 nm. Finally, ExM was applied to the three different fungi Ustilago maydis, Fusarium oxysporum and Aspergillus fumigatus after enzymatic removal of the fungal cell wall. In case of Ustilago maydis sporidia this digestion could be applied to both, living cells resulting in protoplasts and to fixed cells, preserving the fungal morphology. This new protocol could be demonstrated for immunostainings and fluorescent proteins of the three different fungi. N2 - Menschen neigen schon immer dazu, vor allem das zu glauben, was sie mit eigenen Augen sehen können, weswegen mikroskopische Methoden seit ihrer Erfindung im 17. Jahrhundert schon immer sehr beliebt waren. Mit der Einführung der hochauflösenden Mikroskopie konnte das Auflösungslimit von ~200 - 250 nm durchbrochen werden, was genauere Einblicke in biologische Proben ermöglichte. Insbesondere die Einzelmolekül-Lokalisations-Mikroskopie Methode dSTORM bietet hierbei die Möglichkeit der quantitativen Bildgebung. Sie nutzt das wiederholte Schalten organischer Farbstoffe in Anwesenheit von Thiolen, was eine Auflösung von bis zu 20 nm möglich macht. Eine weitere kürzlich entwickelte hochauflösende Mikroskopiemethode ist die Expansionsmikroskopie (ExM), in welcher die Probe isotrop vier- bis sogar zwanzigfach vergrößert wird, womit sich auch die Auflösung um diesen Faktor vergrößert. Um dies zu ermöglichen, wird die Probe in ein Hydrogel eingebettet, mittels einer unspezifischen Proteinase homogenisiert und in destilliertem Wasser expandiert. Innerhalb dieser Arbeit wurden beide Methoden genutzt, um sowohl die Verteilung von Plasmamembran Rezeptoren als auch unterschiedliche bakterielle und pilzliche Pathogene zu beleuchten Im ersten Teil dieser Arbeit wurde dSTORM genutzt, um das „Rezeptom“, die Gesamtheit aller Membranrezeptoren, sowohl von Jurkat T-Zellen als auch von primären Patientenzellen zu entschlüsseln. In dieser Arbeit konnten die Rezeptoren CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD20, CD28, CD45, CD69 und CD105 erfolgreich visualisiert und quantifiziert werden, welche Dichten von 0,8 Cluster pro µm² im Falle von CD20 und 81,4 Cluster pro µm² für den stark exprimierten Rezeptor CD45 in aktivierten primären T-Zellen auf der basalen Membran aufwiesen. Hierbei konnten wir für einen Großteil der Rezeptoren eine homogene Verteilung nachweisen, wohingegen nur wenige andere Rezeptoren Cluster zeigten. Für CD3 konnten sowohl in Jurkat T-Zellen als auch in aktivierten primären Zellen Cluster detektiert werden, was auf deren Aktivierung hinweist, wohingegen CD3 in naiven Zellen homogen verteilt war. Im Weiteren wurde dSTORM im Rahmen von drei klinischen Fragestellungen angewandt, in welche die Rezeptoren CD38, BCMA und CD20 involviert waren, die in Immuntherapien mit monoklonalen Antikörpern oder auch CAR T-Zellen adressiert werden. In den beiden erstgenannten Projekten wurde dSTORM genutzt, um die Erhöhung der Rezeptoren-Expression nach Zugabe verschiedener Medikamente sowohl in der Zelllinie MM1.S als auch in primären Zellen von Patienten mit multiplen Myelomen zu bestimmen. Durch das CD20-Projekt hingegen wurde die überlegene Sensitivität von dSTORM gegenüber der Durchflusszytometrie unter Beweis gestellt. Hier konnte verglichen mit der Durchflusszytometrie eine deutlich höhere CD20-positive Fraktion in Patientenzellen detektiert werden, welche nach Behandlung mit CD20 CAR T-Zellen eliminiert wurde. Hierauf folgte hochauflösende Bildgebung ganzer Zellen sowohl mit LLS-3D dSTORM als auch 10x ExM, um Interaktionen mit der Glasoberfläche ausschließen zu können. Bei 10x ExM wurde eine Signalamplifikation mittels Biotin und Streptavidin ATTO 643 benötigt, wonach sogar einzelne Antikörper, welche gegen den Heterodimer CD11a gerichtet waren, an einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop detektiert werden konnten. Obwohl dies aufgrund der Prozesse von Gelierung, Verdau und Expansion während des ExM-Protokolls vermutlich nicht quantitativ ist, konnten sogar mutmaßliche Dimere des Rezeptors CD2 mit 10x ExM-SIM visualisiert werden, welche ähnlich in dSTORM Experimenten auftraten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Expansionsmikroskopie für bakterielle und pilzliche Pathogene eingesetzt. ExM ermöglichte nicht nur eine isotrope vierfache Expansion von Chlamydia trachomatis, sondern auch die Unterscheidung der beiden Entwicklungsformen, der Retikulär- und Elementarkörperchen, aufgrund der Größe der einzelnen Chlamydien. Anschließend wurde ein neues α-NH2-ω-N3-C6-Ceramid eingeführt, was eine effiziente Fixierung und zum ersten Mal die Nutzung von Lipiden in 4x und 10x ExM ermöglichte, was wir Sphingolipid ExM nannten. Diese Verbindung wurde genutzt, um die Ceramid-Aufnahme und den -Einbau in die Zellmembran von Chlamydia trachomatis und Simkania negevensis zu untersuchen. Im Falle von Chlamydia trachomatis wurde die hohe Auflösung von 10x ExM mit SIM kombiniert, was die Visualisierung beider bakterieller Membranen in einem Abstand von ~30 nm ermöglichte. Hiernach wurde ExM bei den drei unterschiedlichen Pilzen Ustilago maydis, Fusarium oxysporum und Aspergillus fumigatus nach enzymatischen Verdau der pilzlichen Zellwand angewandt. Im Falle von Ustilago maydis Sporidien konnte der Verdau sowohl an lebenden Zellen, was in Protoplasten resultierte, als auch an fixierten Zellen verwendet werden, was die Morphologie erhielt. Mittels dieses neuen Protokolls konnten sowohl Immunfärbungen als auch fluoreszierende Proteine der drei genannten Pilze expandiert werden. KW - Mikroskopie KW - Microscopy KW - Super-resolution microscopy KW - Hochauflösende Mikroskopie Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207165 ER - TY - THES A1 - Klepsch, Maximilian Andreas T1 - Small RNA-binding complexes in Chlamydia trachomatis identified by Next-Generation Sequencing techniques T1 - Identifizierung von kleinen RNA-bindenden Komplexen in Chlamydia trachomatis mittels Hochdurchsatz- Sequenziertechniken N2 - Chlamydia infect millions worldwide and cause infertility and blinding trachoma. Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) is an obligate intracellular gram-negative pathogen with a significantly reduced genome. This bacterium shares a unique biphasic lifecycle in which it alternates between the infectious, metabolically inert elementary bodies (EB) and the non-infections, metabolically active replicative reticular bodies (RB). One of the challenges of working with Chlamydia is its difficult genetic accessibility. In the present work, the high-throughput method TagRNA-seq was used to differentially label transcriptional start sites (TSS) and processing sites (PSS) to gain new insights into the transcriptional landscape of C. trachomatis in a coverage that has never been achieved before. Altogether, 679 TSSs and 1067 PSSs were detected indicating its high transcriptional activity and the need for transcriptional regulation. Furthermore, the analysis of the data revealed potentially new non-coding ribonucleic acids (ncRNA) and a map of transcriptional processing events. Using the upstream sequences, the previously identified σ66 binding motif was detected. In addition, Grad-seq for C. trachomatis was established to obtain a global interactome of the RNAs and proteins of this intracellular organism. The Grad-Seq data suggest that many of the newly annotated RNAs from the TagRNA-seq approach are present in complexes. Although Chlamydia lack the known RNA-binding proteins (RBPs), e.g. Hfq and ProQ, observations in this work reveal the presence of a previously unknown RBP. Interestingly, in the gradient analysis it was found that the σ66 factor forms a complex with the RNA polymerase (RNAP). On the other hand, the σ28 factor is unbound. This is in line with results from previous studies showing that most of the genes are under control of σ66. The ncRNA IhtA is known to function via direct base pairing to its target RNA of HctB, and by doing so is influencing the chromatin condensation in Chlamydia. This study confirmed that lhtA is in no complex. On the other hand, the ncRNA ctrR0332 was found to interact with the SNF2 protein ctl0077, a putative helicase. Both molecules co-sedimented in the gradient and were intact after an aptamer-based RNA pull-down. The SWI2/SNF2 class of proteins are nucleosome remodeling complexes. The prokaryotic RapA from E. coli functions as transcription regulator by stimulating the RNAP recycling. This view might imply that the small ncRNA (sRNA) ctrR0332 is part of the global regulation network in C. trachomatis controlling the transition between EBs and RBs via interaction with the SNF2 protein ctl0077. The present work is the first study describing a global interactome of RNAs and proteins in C. trachomatis providing the basis for future interaction studies in the field of this pathogen. N2 - Chlamydien verursachen jährlich Millionen Neuinfektionen weltweit und können zu Spätschäden wie Unfruchtbarkeit und Erblindung führen. Chlamydien sind obligat intrazelluläre, gram-negative Pathogene mit einem stark reduzierten Genom. Sie besitzen einen einzigartigen biphasischen Lebenszyklus, bei dem der Erreger zwischen den metabolisch inaktiven, infektiösen Elementarkörperchen (EBs) und den nicht infektiösen, metabolisch aktiven und replikativen Retikularkörperchen (RBs) alterniert. Eine Problemantik beim Arbeiten mit Chlamydien ist die Schwierigkeit der gezielten genetischen Manipulation des Pathogens. In der vorliegenden Arbeit wurde die Hochdurchsatz-Sequenziermethode TagRNA-Seq genutzt, um die transkriptionelle Organisation von Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) zu analysieren und besser zu verstehen. Transkriptionelle Start Stellen (TSS) und Prozessierungsstellen (PSS) werden dabei unterschiedlich markiert, sodass eine zuverlässigere und genauere Auflösung erreicht wird als bisher durch in anderen Studien verwendete Methoden. Insgesamt konnten so 679 TSSs und 1067 PSSs detektiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Transkriptom von C. trachomatis weitaus aktiver ist als bisher angenommen und eine Regulation auf transkriptioneller Ebene bedarf. Die Methode erlaubte zudem die Identifizierung von potenziell neuen nicht-kodierende RNAs sowie die Kartierung von transkriptionellen Prozessierungsereignissen. Unter Verwendung der 5’-upstreamliegenden Sequenzen konnte außerdem das in anderen Bakterien bereits bekannte σ66-Bindemotiv detektiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem die Methode Grad-Seq in C. trachomatis etabliert, um ein globales Interaktom für RNAs (engl. ribonucleic acid) und Proteine des intrazellulären Organismus zu erstellen. Für viele der im TagRNA-Seq Ansatz identifizierten und neu annotierten RNAs konnte so eine Komplexbildung beobachtet werden. Dies deutet auf das Vorhandensein eines bislang unbekanntes RNA-Bindeprotein (RBP) hin, da Chlamydien keines der bekannten RBPs, z.B. Hfq oder ProQ, besitzen. Die Gradienten-Analyse ergab, dass der σ66-Faktor in einem Komplex mit der RNA-Polymerase (RNAP) vorliegt und dass der σ28-Faktor ungebunden ist. Diese Beobachtung entspricht den Ergebnissen vorheriger Studien, die zeigten das die meisten Gene durch σ66 kontrolliert werden. Die Daten bestätigen außerdem, dass IhtA, eine ncRNA (engl. non-coding ribonucleic acid), die über direkte Basenpaarbindung mit ihrem Ziel-RNA von hctB interagiert, nicht in einem Komplex vorliegt. Für die ncRNA ctrR0332 hingegen konnte das SNF2-Protein ctl0077 als Interaktionspartner identifiziert werden. Beide Moleküle co-sedimentieren im Gradienten und konnten mittels eines Aptamer-basierenden RNA Pull-Downs in intakter Form isoliert werden. Die Klasse der SWI2/SNF2-Proteine gehört zu den Nukleosomen-Remodeling-Komplexen. In Prokaryoten konnte für das in E. coli vorkommende RapA, welches ebenfalls zu den SWI2/SNF2-Proteinen zählt, die Funktion eines Transkriptionsregulators nachgewiesen werden, indem die RNAP-Wiederverwertung stimuliert wird. Dies könnte bedeuten, dass die ncRNA ctrR0332 ebenfalls Teil eines globalen Regulationsnetzwerks ist, welches durch Interaktion mit dem SNF2-Protein ctl0077 die Transition zwischen dem RB- und EB-Stadium reguliert. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals ein globales Interaktom von RNAs und Proteinen in C. trachomatis erstellt werden, welches als Grundlage für zukünftige Interaktionsstudien des Pathogens genutzt werden kann. KW - High throughput screening KW - Small RNA KW - Chlamydia trachomatis Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199741 ER - TY - THES A1 - Becker, Mira Caroline T1 - Principles of olfactory-visual integration to form a common percept in honeybees T1 - Prinzipien der olfaktorisch-visuellen Integration des Lernverhaltens der Honigbienen N2 - The honeybee is a well studied and important organism in neuroethology. The possibility to train them with a classical conditioning paradigm and their miniature brain provide a perfect requisite to investigate the neuronal principles of learning and memory. Honeybees use visual and olfactory cues to detect flowers during their foraging trips. Hence, the reward association of a nectar source is a multi-modal construct, which has at least two major components - olfactory and visual cues. It is still an open question, how both sensory components are converged in the mushroom body, which represent the multi-modal integration centre of the honeybee brain. The main goal of this study, is to investigate the processing of multiple modalities and how a reward association is formed. This includes, how and wether both sensory modalities interfere during learning. Thus, in this study stimulation with UV, blue and green light was used to evoke distinct photoreceptor activities in the compound eye. Furthermore, three different odours (Geraniol, Citronellol and Farnesol) were used. These stimuli were tested in three different experimental series. The first experiment involved classical differential conditioning of the single modalities - odour and colour. Honeybees showed high learning performances in differentiating olfactory stimuli and also reliable responses for visual conditioning. Furthermore, a temporal discrepancy in the stimulus length for best learning in the olfatcoty and visual cues was found. In the second series, it was tested how multi-modal compounds are perceived. This includes, unique cues (configural processing) or the sum of the single components of a compound (elemen- tal processing). This was tested by combining single odour components with monochromatic light in a positive (PP) and negative patterning (NP) experiment. During PP, the olfactory- visual compound was rewarded, whereas the single components were unrewarded. In contrast, during NP the single components were reinforced, but the compound was not. In addition, the ability to distinguish between two different light stimuli presented as a part of an olfactory-visual compound with the same odour component during acquisition was tested. In a memory test, the light stimuli were presented again as a compound and in addition as the single components. The results revealed that bees used elemental processing with compounds containing green and blue light. In contrast, when UV light was presented the bees used configural processing. Finally, a third experiment was conducted at the neuronal level. Multi-unit recordings were established to provide a suitable method to analyse extrinsic neurons at the mushroom body output region, the so called ventral lobe of the pedunculus. Here, three different odours (Geran- iol, Farnesol and Citronellol), two colours (green and blue) and two combined stimuli (colour + odour) were chosen as stimuli, to search for possible variations in processing stimuli with different modalities. Two units could be detected that responded mainly to visual stimuli. N2 - Die Honigbiene ist ein gut untersuchter und wichtiger Organismus für die neuroethologische Forschung. Die Möglichkeit sie auf klassische Weise zu Konditionieren und ihr relativ kleines Gehirn macht sie zum idealen Untersuchungs-Gegenstand um die neuronalen Prinzipien des Lernens und der Gedächtnisbildung zu erforschen. Während des Furagierens nutzen Honigbi- enen beides: visuelle und olfaktorische Merkmale der Futterplanzen. Daher ist die Belohnungs- Assoziation mit der Nektar-Belohnung ein multi-modales Konstrukt, welches aus mindestens zwei Hauptkomponenten, den olfaktorischen und den visuellen Reizen, besteht. In dieser Arbeit soll untersucht werden, wie olfaktorische und visuelle Reize verarbeitet wer- den und wie sie im Pilzkörper, dem multi-modalen Integrationszentrum des Bienengehirnes, konvergieren. Wie beide sensorischen Modalitäten integriert werden um eine gemeingültige Belohnungs-Assoziation zu bilden, ist immer noch eine offene Frage. Weiterhin ist unklar ob und wie sie miteinander interferieren. Die hier dargestellten Studien nutzen Stimulationen mit UV, blauem und grünem Licht um unterschiedliche Photorezeptor Aktivitäten im Komplexauge auszulösen. Des Weiteren wurden drei verschiedene Duftkomponenten (Geraniol, Citronellol und Farnesol) verwendet. Diese Stimuli wurden in drei verschiedenen Experiment-Reihen gestestet. Das erste Experiment umfasste die klassische differentielle Konditionierung der Einzelmodalitäten (Duft und Farbe). Honigbienen zeigten eine hohe Lernfähigkeit bei der Unterscheidung zweier olfaktorischer Reize sowie eine solide Lern-Leistung während der Konditionierung mit Licht. Im zweiten Experiment wurde getestet, ob ein zusammengesetzter Reiz aus beiden Modalitäten als Summe der einzelnen Elemente (elementare Verarbeitung) oder als unikaler Reiz (konfigu- rale Verarbeitung) wahrgenommen wird. Hierbei wurde monochromatisches Licht und einzelne Duftkomponenten in positive patterning- (PP) und negative patterning-Experimenten (NP) getestet. Beim PP, wurde der zusammengesetzte Reiz belohnt, wohingegen die Einzelkom- ponenten unbelohnt blieben. Dagegen wurden beim NP nur die Einzelkomponenten belohnt, aber nicht ihre Kombination. Außerdem wurde der Frage nachgegangen, ob die Fähigkeit zur Differenzierung unterschiedlich ist, wenn zwei verschiedene Lichtreize teil einer olfaktorisch- visuellen Kombination sind, oder nicht. Interessanterweise zeigten die Verhaltensleistungen einen prominenten Fall von konfiguraler Verarbeitung, allerdings nur wenn UV-Licht ein El- ement der olfaktorisch-visuellen Zusammensetzung war. Die Ergebnisse der Experimente mit blauem oder grünem Licht hingegen, unterstützen die Theorie einer elementaren Verarbeitung. Abschließend wurde mittels elektrophysiologischer multi-unit-Aufnahmen eine passende Meth- ode etabliert, um die extrinsischen Neurone des Pilzkörpersausganges zu analysieren. Hierbei wurden drei verschiedene Düfte und zwei Farben sowie zwei Kombinationen aus Farbe und Duft getestet, um mögliche Variationen der multimodalen Reiz-Verarbeitung zu untersuchen. Zwei neuronale Einheiten (units) wurden gefunden, welche hauptsächlich auf Lichtreize antworteten. KW - honeybees KW - learning and behaviour KW - multi-modal stimuli Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199190 ER - TY - THES A1 - Redlich, Sarah T1 - Opportunities and obstacles of ecological intensification: Biological pest control in arable cropping systems T1 - Chancen und Hürden Ökologischer Intensivierung: Biologische Schädlingsbekämpfung im Ackerbau N2 - Modern agriculture is the basis of human existence, a blessing, but also a curse. It provides nourishment and well-being to the ever-growing human population, yet destroys biodiversity-mediated processes that underpin productivity: ecosystem services such as water filtration, pollination and biological pest control. Ecological intensification is a promising alternative to conventional farming, and aims to sustain yield and ecosystem health by actively managing biodiversity and essential ecosystem services. Here, I investigate opportunities and obstacles for ecological intensification. My research focuses on 1) the relative importance of soil, management and landscape variables for biodiversity and wheat yield (Chapter II); 2) the influence of multi-scale landscape-level crop diversity on biological pest control in wheat (Chapter III) and 3) on overall and functional bird diversity (Chapter IV). I conclude 4) by introducing a guide that helps scientists to increase research impact by acknowledging the role of stakeholder engagement for the successful implementation of ecological intensification (Chapter V). Ecological intensification relies on the identification of natural pathways that are able to sustain current yields. Here, we crossed an observational field study of arthropod pests and natural enemies in 28 real-life wheat systems with an orthogonal on-field insecticide-fertilizer experiment. Using path analysis, we quantified the effect of 34 factors (soil characteristics, recent and historic crop management, landscape heterogeneity) that directly or indirectly (via predator-prey interactions) contribute to winter wheat yield. Reduced soil preparation and high crop rotation diversity enhanced crop productivity independent of external agrochemical inputs. Concurrently, biological control by arthropod natural enemies could be restored by decreasing average field sizes on the landscape scale, extending crop rotations and reducing soil disturbance. Furthermore, reductions in agrochemical inputs decreased pest abundances, thereby facilitating yield quality. Landscape-level crop diversity is a promising tool for ecological intensification. However, biodiversity enhancement via diversification measures does not always translate into agricultural benefits due to antagonistic species interactions (intraguild predation). Additionally, positive effects of crop diversity on biological control may be masked by inappropriate study scales or correlations with other landscape variables (e.g. seminatural habitat). Therefore, the multiscale and context-dependent impact of crop diversity on biodiversity and ecosystem services is ambiguous. In 18 winter wheat fields along a crop diversity gradient, insect- and bird-mediated pest control was assessed using a natural enemy exclusion experiment with cereal grain aphids. Although birds did not influence the strength of insect-mediated pest control, crop diversity (rather than seminatural habitat cover) enhanced aphid regulation by up to 33%, particularly on small spatial scales. Crop diversification, an important Greening measure in the European Common Agricultural Policy, can improve biological control, and could lower dependence on insecticides, if the functional identity of crops is taken into account. Simple measures such as ‘effective number of crop types’ help in science communication. Although avian pest control did not respond to landscape-level crop diversity, birds may still benefit from increased crop resources in the landscape, depending on their functional grouping (feeding guild, conservation status, habitat preference, nesting behaviour). Observational studies of bird functional diversity on 14 wheat study fields showed that non-crop landscape heterogeneity rather than crop diversity played a key role in determining the richness of all birds. Insect-feeding, non-farmland and non-threatened birds increased across multiple spatial scales (up to 3000 m). Only crop-nesting farmland birds declined in heterogeneous landscapes. Thus, crop diversification may be less suitable for conserving avian diversity, but abundant species benefit from overall habitat heterogeneity. Specialist farmland birds may require more targeted management approaches. Identifying ecological pathways that favour biodiversity and ecosystem services provides opportunities for ecological intensification that increase the likelihood of balancing conservation and productivity goals. However, change towards a more sustainable agriculture will be slow to come if research findings are not implemented on a global scale. During dissemination activities within the EU project Liberation, I gathered information on the advantages and shortcomings of ecological intensification and its implementation. Here, I introduce a guide (‘TREE’) aimed at scientists that want to increase the impact of their research. TREE emphasizes the need to engage with stakeholders throughout the planning and research process, and actively seek and promote science dissemination and knowledge implementation. This idea requires scientists to leave their comfort zone and consider socioeconomic, practical and legal aspects often ignored in classical research. Ecological intensification is a valuable instrument for sustainable agriculture. Here, I identified new pathways that facilitate ecological intensification. Soil quality, disturbance levels and spatial or temporal crop diversification showed strong positive correlations with natural enemies, biological pest control and yield, thereby lowering the dependence on agrochemical inputs. Differences between functional groups caused opposing, scale-specific responses to landscape variables. Opposed to our predictions, birds did not disturb insect-mediated pest control in our study system, nor did avian richness relate to landscape-level crop diversity. However, dominant functional bird groups increased with non-crop landscape heterogeneity. These findings highlight the value of combining different on-field and landscape approaches to ecological intensification. Concurrently, the success of ecological intensification can be increased by involving stakeholders throughout the research process. This increases the quality of science and reduces the chance of experiencing unscalable obstacles to implementation. N2 - Die moderne Landwirtschaft ist die Grundlage menschlichen Lebens, ein Segen, aber auch ein Fluch. Sie stellt Nahrung und Wohlstand für die immerfort wachsende menschliche Bevölkerung bereit, und zerstört gleichzeitig Biodiversitäts-geförderte Prozesse, welche die Produktivität unterstützen: Ökosystemdienstleistungen wie Wasseraufbereitung, Bestäubung und biologische Schädlingsbekämpfung. Ökologische Intensivierung ist eine vielversprechende Alternative zur konventionellen Landwirtschaft, und zielt darauf aus, Erträge und die Gesundheit von Ökosystemen zu erhalten indem Biodiversität und essentielle Ökosystemdienstleistungen aktiv gemanagt werden. In meiner Doktorarbeit untersuche ich die Chancen und Hürden Ökologischer Intensivierung. Das Hauptinteresse meiner Forschung liegt bei 1) der relativen Bedeutung von Boden, Bewirtschaftung und Landschaftsaspekten für Biodiversität und Weizenerträge (Kapitel II); 2) dem Einfluss regionaler Anbauvielfalt auf verschiedenen räumlichen Skalen auf die biologische Schädlingsbekämpfung in Weizen (Kapitel III) und 3) auf die gesamte und funktionelle Artenvielfalt von Vögeln (Kapitel IV). Zum Schluss 4) stelle ich einen Leitfaden vor, der Wissenschaftlern hilft die Wirkung ihrer Forschung zu erhöhen, indem die fundamentale Rolle von Stakeholdern für die Umsetzung Ökologischer Intensivierung besser genutzt wird (Kapitel V). Ökologische Intensivierung bedarf der Identifizierung von natürlichen Prozessen, die zum Erhalt landwirtschaftlicher Erträge beitragen. Zu diesem Zweck verknüpften wir eine Beobachtungsstudie, in der Schädlinge und natürliche Gegenspieler in 28 realen Weizen Anbausystem aufgenommen wurden, mit einem orthogonalen Feldexperiment (Insektizid und mineralische Düngung). Anhand einer Pfadanalyse quantifizierten wir den Einfluss von 34 Faktoren (Bodencharakteristiken, gegenwärtige und vergangene Bewirtschaftung, Landschaftsheterogenität), die direkt oder indirekt (über Räuber-Beute-Interaktionen) Einfluss auf den Winterweizenertrag ausüben. Reduzierte Bodenbearbeitung und vielfältige Fruchtfolgen erhöhten die Erträge unabhängig von der Ausbringung von Agrochemikalien. Gleichzeitig könnte die biologische Schädlingsbekämpfung durch räuberische Insekten wiederhergestellt werden, indem durchschnittliche Schlaggrößen auf der Landschaftsebene verringert, Fruchtfolgen erweitert und die Bodenbearbeitung reduziert wird. Des Weiteren senkte der Verzicht auf Agrochemikalien das Schädlingsaufkommen einiger Arten, und trug zu einer höheren Ertragsqualität bei. Regionale Anbauvielfalt ist ein vielversprechendes Mittel zur Ökologischen Intensivierung. Doch die Erhöhung der Artenvielfalt durch Diversifizierungsmaßnahmen führt nicht immer zu Vorteilen in der Landwirtschaft, vor allem auf Grund antagonistischer Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Arten (intraguild predation). Weiterhin können positive Effekte der Anbauvielfalt durch die Wahl der falschen räumlichen Skala oder durch Korrelationen mit anderen Landschaftsvariablen (z.B. halbnatürliche Habitate) überdeckt werden. Aus diesem Grund bestehen Unklarheiten über die Wirkung von Anbauvielfalt auf Biodiversität und Ökosystemdienstleistungen in unterschiedlichen räumlichen Skalen und Kontexten. Durch Ausschlussexperimente mit Getreideblattläusen untersuchten wir die biologische Schädlingsbekämpfung durch räuberische Insekten und Vögel in 18 Winterweizenfeldern innerhalb eines Landschaftsgradienten der Anbauvielfalt. Vögel hatten keinen Einfluss auf die biologische Schädlingsbekämpfung durch Insekten. Anbauvielfalt (nicht das Vorkommen halbnatürlicher Habitate) erhöhte die Schädlingsbekämpfung um bis zu 33%, vor allem auf kleinen räumlichen Skalen. Somit kann die Steigerung der Anbauvielfalt, eine wichtige Säule der Europäischen Gemeinsamen Agrarpolitik, die biologische Schädlingsbekämpfung verbessern und den Einsatz von Agrochemikalien verringern, solange die funktionelle Gruppe der Anbaupflanzen berücksichtigt wird. Einfache Maßeinheiten wie die ‘effektive Anzahl an Kulturpflanzengruppen‘ helfen in der Kommunikation wissenschaftlicher Ergebnisse. Obwohl die Schädlingsbekämpfung durch Vögel nicht durch regionale Anbauvielfalt beeinflusst wurde, könnten Vögel, abhängig von der Zugehörigkeit zu bestimmten funktionellen Gruppen (Ernährung, Gefährdungsstatus, Lebensraum, Nistplatzwahl), dennoch von erhöhten Ressourcen auf landwirtschaftlichen Flächen profitieren. In einer Beobachtungsstudie wurde die funktionelle Vielfalt von Vögeln auf 14 Winterweizenfeldern aufgenommen. Die Studie zeigte, dass die nicht agrarisch genutzte Landschaftsheterogenität im Vergleich zur regionalen Anbauvielfalt eine übergeordnete Rolle für die Artenvielfalt spielte, vor allem für Insektenfresser, Vögel die außerhalb landwirtschaftlicher Flächen siedeln oder nicht in ihrem Bestand gefährdet sind. Effekte waren auf allen Skalen sichtbar (bis zu 3000m). Nur Acker-nistende Agrarvögel zeigten negative Beziehungen zu Landschaftsheterogenität. Der Nutzen der Anbaudiversifizierung scheint weniger Bedeutung für den Vogelschutz zu haben als die übergeordnete Vielfalt der Landschaft, welche den Artenreichtum häufiger Vogelarten erhöhte. Spezialisierte Vogelarten dagegen bedürfen eines gezielten, angepassten Managements. Um Ökologische Intensivierung voranzutreiben und ein Gleichgewicht zwischen Naturschutz- und Produktivitätszielen zu erreichen, bedarf es der Identifikation ökologischer Prozesse, die zur Steigerung von Biodiversität und Ökosystemdienstleistungen beitragen. Doch der die Wende zu einer nachhaltigeren Landwirtschaft wird nur langsam voran schreiten, wenn Forschungsergebnisse nicht global umgesetzt werden. Während der Öffentlichkeitsarbeit im EU Projekt Liberation konnte ich Informationen über die Vor- und Nachteile Ökologischer Intensivierung und deren Umsetzung sammeln. Hier stelle ich einen Leitfaden (‘TREE’) vor, der Wissenschaftlern helfen soll die Wirkung ihrer Forschung zu erhöhen. TREE verdeutlicht wie wichtig es ist, Stakeholder in den Planungs- und Forschungsprozess eines Projektes mit einzubeziehen, und aktiv die Verbreitung von Wissen und die Umsetzung wissenschaftlicher Ergebnisse voranzutreiben. TREE fordert Wissenschaftler dazu auf, die eigene Komfortzone zu verlassen und sozioökonomische, praktische und rechtliche Aspekte zu berücksichtigen, welche oft in der klassischen Forschung unbeachtet bleiben. Ökologische Intensivierung ist ein bedeutender Schritt in Richtung nachhaltige Landwirtschaft. In dieser Arbeit identifiziere ich neue Wege zur ökologischen Intensivierung. Bodenqualität, Störungsgrad des Bodens und die räumliche oder zeitliche Anbauvielfalt zeigten starke positive Korrelationen mit natürlichen Gegenspielern, biologischer Schädlingsbekämpfung und Erträgen auf, wodurch die Abhängigkeit von Agrochemikalien verringert wird. Unterschiede zwischen funktionellen Gruppen verursachten gegensätzliche Beziehungen zu Landschaftsvariablen auf verschiedenen räumlichen Skalen. Entgegen unserer Erwartungen nahmen Vögel in unserem System keinen Einfluss auf die biologische Schädlingsbekämpfung durch Insekten. Die Vogelvielfalt war außerdem unbeeinflusst von der regionalen Anbauvielfalt. Doch dominante funktionelle Vogelgruppen profitieren von der Vielfalt nicht agrarisch genutzter Landschaftsaspekte. Diese Ergebnisse betonen den Wert einer Mischung aus unterschiedlichen lokalen und landschaftsbezogenen Ansätzen zur Ökologischen Intensivierung. Gleichzeitig kann der Erfolg Ökologischer Intensivierung vor allem dadurch erhöht werden, dass Stakeholder in den Forschungsprozess eingebunden werden. Dies steigert die Qualität der Forschung und reduziert die Wahrscheinlichkeit, während der Umsetzung auf unüberwindbare Hürden zu stoßen. KW - Ökologische Intensivierung KW - Biologische Schädlingsbekämpfung KW - Landwirtschaft KW - Artensterben KW - Ökosystemdienstleistungen KW - Öffentlichkeitsarbeit KW - ecological intensification KW - biological pest control KW - agriculture KW - public outreach KW - ecosystem services KW - sustainable farming Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171228 ER - TY - THES A1 - Spindler, Marie-Christin T1 - Molecular architecture of meiotic multiprotein complexes T1 - Molekulare Architektur meiotischer Multiproteinkomplexe N2 - Sexually reproducing organisms depend on meiosis for the generation of haploid, genetically diverse gametes to maintain genome stability and the potential to adapt to changing environments. Haploidization is achieved through two successive rounds of cell division after a single initial pre-meiotic DNA replication. Meiosis I segregates the homologous chromosomes, followed by the segregation of the sister chromatids in meiosis II. Genetic diversity is achieved through the process of recombination that de-scribes the exchange of genetic material between the maternal and paternal homolog. Recombination and the initial steps of haploidization are executed already early on in prophase I. Both essential processes depend on a variety of multiprotein complexes, such as the linker of nucleo- and cytoplasm (LINC) complex and the synaptonemal complex (SC). The structure of multiprotein complexes is adjusted according to their function, environment, and the forces they are subjected to. Coiled-coil domains typical in load-bearing proteins characterize the meiotic mechanotransducing LINC complexes. SCs resemble ladder-like structures that are highly conserved amongst eukaryotes, while the primary sequence of the proteins that form the complex display very little if any sequence homology. Despite the apparent significance of the structure to their function, little quantitative and topological data existed on the LINC complexes and the SC within their morphological context prior to the present work. Here, the molecular architecture of the meiotic telomere attachment site where LINC complexes reside and the SC have been analyzed in depth, mainly on the basis of electron microscope tomography derived 3D models complemented by super-resolution light microscopic acquisitions of the respective protein components. N2 - Sich sexuell fortpflanzende Organismen sind auf die Meiose angewiesen, um haploide, genetisch vielfältige Keimzellen zu erzeugen, die die Stabilität des Genoms und die Fähigkeit zur Anpassung an sich verändernde Umgebungen erhalten. Die Haploidisierung wird durch zwei aufeinanderfolgende Runden der Zellteilung nach einer einzigen anfänglichen prä-meiotischen DNA Replikation erreicht. In der Meiose I werden die homologen Chromosomen getrennt, gefolgt von der Trennung der Schwesterchromatiden während der Meiose II. Genetische Diversität wird durch den Prozess der Rekombination erreicht, der den Austausch von genetischem Material zwischen den mütterlichen und väterlichen Homologen beschreibt. Die Rekombination und die ersten Schritte der Haploidisierung werden bereits früh in der Prophase I durchgeführt. Beide essentiellen Prozesse hängen von einer Vielzahl von Multiproteinkomplexen ab, wie z.B. dem Linker of Nucleo- and Cytoplasm (LINC)-Komplex und dem synaptonemalen Komplex (SC). Die Struktur von Multiproteinkomplexen wird je nach ihrer Funktion, ihrer Umgebung und den Kräften, denen sie ausgesetzt sind, angepasst. Coiled-coil-Domänen, die für tragende Proteine typisch sind, charakterisieren die meiotischen, mechanotransduzierenden LINC-Komplexe. SCs ähneln leiterähnlichen Strukturen, die unter Eukaryonten hoch konserviert sind, während die Primärsequenz der Proteine, die den Komplex bilden, sehr wenig bis gar keine Sequenzhomologie aufweist. Trotz der offensichtlichen Bedeutung der Struktur für ihre Funktion gab es vor der vorliegenden Arbeit nur wenige quantitative und topologische Daten über die LINC Komplexe und den SC in ihrem morphologischen Kontext. Hier wurde die molekulare Architektur der Telomeranheftungsstellen, an denen sich die LINC-Komplexe befinden, und die des SCs eingehend analysiert, hauptsächlich auf der Grundlage von auf der Elektronenmikroskop-Tomographie basierenden 3D-Modellen, ergänzt durch hochauflösende lichtmikroskopische Aufnahmen der jeweiligen Proteinkomponenten. KW - Meiose KW - Meiosis Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212105 ER - TY - THES A1 - Lu, Yunzhi T1 - Kinetics of mouse and human muscle type nicotinic receptor channels T1 - Kinetik muriner und humaner nikotinischer Rezeptorkanäle vom Muskeltyp N2 - Acetylcholine (ACh) mediates transmission at vertebrate neuromuscular junctions and many other synapses. The postsynaptic ACh receptors at neuromuscular junctions are of the nicotinic subtype (nAChRs). They are among the best studied receptor channels and often serve as models or receptor prototypes. Despite a wealth of information on muscle type nAChRs so far little is known about species specific functional differences. In this work, mouse and human adult muscle type nAChRs are investigated. Cell attached recordings in the HEK293T heterologous expression system provided evidence that the ACh affinity of recombinant mouse and human adult muscle type nAChRs are different. To clarify this, I compared these receptors in outside-out patches employing a system for fast agonist application. Thus, the individual membrane patches with receptors can be exposed to various ligand concentrations. In response to 10 and 30 µM ACh normalized peak currents (î) were significantly larger and current rise-time (tr) shorter in human than in mouse receptors. Analyzing dose-response curves of î and tr and fitting them with a two-step equivalent binding-site kinetic mechanism revealed a two-fold higher ACh association rate constant in human compared to mouse receptors. Furthermore, human nAChRs were blocked faster in outside-out patches by superfusion of 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) than mouse nAChRs. Finally, human nAChRs in outside-out patches showed higher affinity at 3 µM ACh than chimeric receptors consisting of mouse α- and human β-, γ- and ε-subunits. The higher affinity of human than mouse receptors for ACh and α-Bgtx is thus at least in part due to sequence difference in their α-subunits. N2 - Acetylcholin (ACh) vermittelt Erregungsübertragung an neuromuskulären synaptischen Kontakten (neuromuscular junction, NMJ) von Wirbeltieren und vielen anderen Synapsen. Die postsynaptischen ACh-Rezeptoren an der NMJ sind vom nikotinischen Subtyp (nAChRs). Als Teil der am besten erforschten Kanalrezeptoren dienen sie oft als Modelle oder auch Prototypen für Rezeptoren. Trotz einer Fülle an Informationen über nAChRs des Muskeltyps ist bis heute recht wenig über artenspezifischen funktionellen Unterschiede bekannt. Diese Studie befasst sich daher mit der Untersuchung von nAChRs des Muskeltyps in erwachsenen Mäusen und Menschen. Aufzeichnungen mit sogenannten Cell-attached Patches im heterologen Expressionssystem HEK293T-Zellen lieferten Beweise dafür, dass die ACh-Affinität von rekombinanten erwachsenen Maus- und menschlichen nAChRs vom Muskeltyp unterschiedlich sind. Um diesem nachzugehen, habe ich diese Rezeptoren in Outside-out Patches mit Hilfe eines schnellen Piezogetriebenen Applikationssystems verglichen. Dieses System bietet den Vorteil, dass einzelne Membran-Patches mit Rezeptoren unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen ausgesetzt werden können. Als Reaktion auf 10 und 30 µM ACh waren die normalisierten Stromamplituden (î) und Stromanstiegszeiten (tr) der menschlichen Rezeptoren signifikant höher als die der Mausrezeptoren. Die Analyse der Dosis-Wirkungskurven von î und tr sowie die Anpassung eines quantitativen zweistufigen kinetischen Modells mit zwei äquivalenten Bindestellen an die Datensätze zeigten eine zweifach höhere Assoziationsrate für ACh bei menschlichen Rezeptoren, verglichen mit der von Mausrezeptoren. Zudem wurden menschliche nAChRs in Outside-Out-Patches schneller als Mausrezeptoren durch Superfusion mit 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) blockiert, was für eine höhere Affinität auch für α-Bgtx spricht. Schließlich wiesen die menschlichen nAChRs in Outside-Out-Patches bei 3 µM ACh eine höhere Affinität als chimäre Rezeptoren aus Maus α- und menschlichen β-, γ- and ε-Untereinheiten auf. Die höhere Affinität der menschlichen Rezeptoren zu ACh und α-Bgtx im Vergleich zu Mausrezeptoren basiert somit zumindest in Teilen auf Sequenzdifferenzen ihrer α-Einheitenen. KW - nicotinic acetylcholine receptor KW - affinity KW - kinetic mechanism KW - Nicotinischer Acetylcholinrezeptor KW - Muskelzelle KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192688 ER - TY - THES A1 - Stelzner, Kathrin T1 - Identification of factors involved in Staphylococcus aureus- induced host cell death T1 - Identifizierung von Faktoren, die am Staphylococcus aureus-induzierten Wirtszelltod beteiligt sind N2 - Staphylococcus aureus is a Gram-positive commensal bacterium, that asymptomatically colonizes human skin and mucosal surfaces. Upon opportune conditions, such as immunodeficiency or breached barriers of the host, it can cause a plethora of infections ranging from local, superficial infections to life-threatening diseases. Despite being regarded as an extracellular pathogen, S. aureus can invade and survive within non-phagocytic and phagocytic cells. Eventually, the pathogen escapes from the host cell resulting in killing of the host cell, which is associated with tissue destruction and spread of infection. However, the exact molecular mechanisms underlying S. aureus-induced host cell death remain to be elucidated. In the present work, a genome-wide haploid genetic screen was performed to identify host cell genes crucial for S. aureus intracellular cytotoxicity. A mutant library of the haploid cell line HAP1 was infected with the pathogen and cells surviving the infection were selected. Twelve genes were identified, which were significantly enriched when compared to an infection with a non-cytotoxic S. aureus strain. Additionally, characteristics of regulated cell death pathways and the role of Ca2+ signaling in S. aureus-infected cells were investigated. Live cell imaging of Ca2+ reporter cell lines was used to analyze single cells. S. aureus-induced host cell death exhibited morphological features of apoptosis and activation of caspases was detected. Cellular H2O2 levels were elevated during S. aureus intracellular infection. Further, intracellular S. aureus provoked cytosolic Ca2+ overload in epithelial cells. This resulted from Ca2+ release from endoplasmic reticulum and Ca2+ influx via the plasma membrane and led to mitochondrial Ca2+ overload. The final step of S. aureus-induced cell death was plasma membrane permeabilization, a typical feature of necrotic cell death. In order to identify bacterial virulence factors implicated in S. aureus-induced host cell killing, the cytotoxicity of selected mutants was investigated. Intracellular S. aureus employs the bacterial cysteine protease staphopain A to activate an apoptosis-like cell death characterized by cell contraction and membrane bleb formation. Phagosomal escape represents a prerequisite staphopain A-induced cell death, whereas bacterial intracellular replication is dispensable. Moreover, staphopain A contributed to efficient colonization of the lung in a murine pneumonia model. In conclusion, this work identified at least two independent cell death pathways activated by intracellular S. aureus. While initially staphopain A mediates S. aureus-induced host cell killing, cytosolic Ca2+-overload follows later and leads to the final demise of the host cell. N2 - Staphylococcus aureus ist ein Gram-positives, kommensales Bakterium, welches menschliche Haut- und Schleimhautoberflächen asymptomatisch kolonisiert. Unter günstigen Bedingungen, wie z. B. Immunschwäche oder verletzten Barrieren des Wirtes, kann es eine Vielzahl von Infektionen verursachen, die von lokalen, oberflächlichen Infektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Krankheiten reichen. Obwohl S. aureus als extrazellulärer Erreger angesehen wird, kann das Bakterium von nicht-phagozytischen und phagozytischen Zellen aufgenommen werden und dort überleben. Schließlich bricht das Pathogen aus der Wirtszelle aus und die damit einhergehende Tötung der Wirtszelle wird mit Gewebezerstörung und Ausbreitung der Infektion in Verbindung gebracht. Die genauen molekularen Mechanismen, die dem S. aureus induzierten Wirtszelltod zugrunde liegen, müssen jedoch noch geklärt werden. In dieser Arbeit wurde ein genomweiter haploid genetischer Screen durchgeführt, um Wirtszellgene zu identifizieren, die für die intrazelluläre Zytotoxizität von S. aureus entscheidend sind. Eine Mutantenbibliothek der haploiden Zelllinie HAP1 wurde mit dem Erreger infiziert und die Zellen, die die Infektion überlebten, wurden selektiert. Dabei wurden zwölf Gene identifiziert, die signifikant angereichert waren gegenüber einer Infektion mit einem nicht-zytotoxischen S. aureus Stamm. Des Weiteren wurden Eigenschaften regulierter Zelltod-Signalwege und die Rolle der Ca2+-Signalübertragung in S. aureus infizierten Zellen untersucht. Lebendzellbildgebung von Ca2+-Reporterzelllinien wurde zur Analyse von einzelnen Zellen eingesetzt. Der S. aureus induzierte Wirtszelltod wies morphologische Merkmale von Apoptose auf und die Aktivierung von Caspasen wurde nachgewiesen. Der zelluläre H2O2-Spiegel wurde durch die intrazelluläre Infektion mit S. aureus erhöht. Zusätzlich rief der intrazelluläre S. aureus eine zytosolische Ca2+-Überbelastung in Epithelzellen hervor. Dies resultierte aus der Ca2+-Freisetzung vom endoplasmatischen Retikulum und dem Einstrom von Ca2+ über die Plasmamembran und führte zu einer mitochondrialen Ca2+-Überbelastung. Der finale Schritt des durch S. aureus induzierten Zelltods war die Permeabilisierung der Plasmamembran, ein typisches Merkmal des nekrotischen Zelltods. Um bakterielle Virulenzfaktoren zu identifizieren, die am S. aureus-induzierten Wirtszelltod beteiligt sind, wurde die Zytotoxizität von ausgewählten Mutanten untersucht. Der intrazelluläre S. aureus nutzt die bakterielle Cysteinprotease Staphopain A, um einen Apoptose-artigen Zelltod zu aktivieren, der durch Zellkontraktion und Blasenbildung der Membran gekennzeichnet ist. Der phagosomale Ausbruch stellt eine Voraussetzung für den Staphopain A-induzierten Zelltod da, während die intrazelluläre Replikation der Bakterien nicht notwendig ist. Darüber hinaus trug Staphopain A zu einer effizienten Kolonisation der Lunge in einem murinen Pneumonie-Modell bei. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit mindestens zwei unabhängige Zelltod-Signalwege identifiziert hat, die durch den intrazellulären S. aureus aktiviert werden. Während zunächst Staphopain A den Tod der Wirtszelle einleitet, folgt später die zytosolische Ca2+-Überlastung und führt zum endgültigen Untergang der Wirtszelle. KW - Staphylococcus aureus KW - Zelltod KW - Wirtszelle KW - cell death KW - host cell Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188991 N1 - Zusatzmaterial (Videos) befinden sich auch auf einer CD in der gedruckten Ausgabe ER - TY - THES A1 - Lehmann, Julian T1 - Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie beleuchtet den Oligomerisierungsstatus pflanzlicher Membranproteine T1 - Super-resolution microscopy elucidates the stoichiometry of plant membrane proteins N2 - SLAC/SLAH Anionenkanäle, die zur Familie der langsamen Anionenkanäle gehören, repräsentieren Schlüsselproteine in der pflanzlichen Stressantwort. Neben ihrer Aufgabe in Stresssituationen, ist eine Untergruppe der Kanäle für die Beladung der Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid in der Stele der Pflanzenwurzeln verantwortlich. Biophysikalische und pflanzenphysiologische Studien stellten heraus, dass vor Allem der Anionenkanal SLAH3 für die Beladung der Xylem Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid verantwortlich ist. Ihm zur Seite gestellt werden noch die elektrisch inaktiven Homologe SLAH1 und SLAH4 in der Wurzel exprimiert. Sie steuern die Aktivität von SLAH3 durch die Assemblierung zu SLAH1/SLAH3 oder SLAH3/SLAH4 Heteromeren. Neben der Kontrolle durch Heteromerisierungsereignisse, werden SLAH3 Homomere sehr spezifisch und schnell durch zytosolische Ansäuerung aktiviert. Obwohl bereits die Kristallstruktur des bakteriellen Homologs HiTehA zu pflanzlichen SLAC/SLAH Anionenkanälen bekannt ist, welche HiTehA als Trimer charakterisiert, sind die Stöchiometrie und der Polymerisierungsgrad der pflanzlichen SLAC/SLAHs bisher noch unbekannt. Die Fluoreszenzmikroskopie umfasst viele etablierte Anwendungsmethoden, wie die konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM), Techniken mit verbesserter Auflösung, wie die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) und hochauflösende Methoden, welche durch die Lokalisationsmikroskopie (z.B. dSTORM und PALM) oder die Expansionsmikroskopie (ExM) vertreten werden. Diese unterschiedlichen Mikroskopie-methoden ermöglichen neue Einblicke in die Organisation von Proteinen in biologischen Systemen, die bis auf die molekulare Ebene hinunterreichen. Insbesondere im Bereich der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie sind im Gegensatz zu tierischen Frage-stellungen bisher jedoch nur wenige Untersuchungen in pflanzlichen Geweben durchgeführt worden. Die Lokalisationsmikroskopie ermöglicht die Quantifizierung einzelner Moleküle in nativen Systemen und lässt überdies Rückschlüsse auf den Polymerisierungsgrad von Proteinen zu. Da Poly- und Heteromerisierung von Proteinen oftmals mit der Funktionalität eines entsprechenden Proteins einhergeht, wie es bei den SLAC/SLAH Anionenkanälen der Fall ist, wurden in dieser Arbeit PALM Messungen zur Untersuchung des Polymerisierungsgrades und Interaktionsmuster der Anionenkanäle angewendet. Ferner wurden Expressionsmuster der SLAC/SLAHs untersucht und zudem Mikroskopieanwendungen im Pflanzengewebe etabliert und verbessert. In Bezug auf die Mikroskopieanwendungen konnten wir in Arabidopsis thaliana (At) Wurzeln die polare Verteilung von PIN Proteinen mittels SIM bestätigen und die gruppierte Verteilung in der Plasmamembran am Zellpol auflösen. In Wurzel-querschnitten war es möglich, Zellwände zu vermessen, den Aufbau der Pflanzenwurzel mit den verschiedenen Zelltypen zu rekonstruieren und diesen in Zusammenhang mit Zellwanddicken zu bringen. Anhand dieser Aufnahmen ließ sich die Auflösungsgrenze eines SIM-Mikroskops bestimmen, weshalb diese Probe als Modellstruktur für Auflösungsanalysen, zur Kontrolle für die korrekte Bildverarbeitung bei hochauflösender Bildgebung und andere Fragestellungen empfohlen werden kann. Für die Expansionsmikroskopie in pflanzlichen Proben konnten ein enzym- und ein denaturierungsbasiertes Präparationsprotokoll etabliert werden. Dabei wurden ganze At Setzlinge, Wurzelabschnitte und Blattstücke gefärbt, expandiert und mit zwei bis drei Mal verbesserter Auflösung bildlich dargestellt. In diesem Zusammenhang waren Aufnahmen ganzer Wurzel- und Blattproben mit beeindruckender Eindringtiefe und extrem geringem Hintergrundsignal möglich. Zudem wurden die Daten kritisch betrachtet, Probleme aufgezeigt, gewebespezifische Veränderungen dargestellt und limitierende Faktoren für die ExM in Pflanzenproben thematisiert. Im Fokus dieser Arbeit stand die Untersuchung der SLAC/SLAH Proteine. SLAH2 wird in den Wurzeln vornehmlich in Endodermis- und Perizykelzellen exprimiert, was anhand verschiedener At SLAH2 YFP Mutanten untersucht werden konnte. Dies unterstützt die Annahme, dass SLAH2 bei der Beladung der Leitgefäße mit Nitrat maßgeblich beteiligt ist. Es ist denkbar, dass SLAH2 ebenfalls eine wachstumsbeeinflussende Funktion über die Regulation von Nitratkonzentrationen zugeschrieben werden kann. Darauf deuten vor allem die verstärkte Expression von SLAH2 im Bereich der Seitenwurzeln und die heterogene Expression in der Elongations-, Differenzierungs- und meristematischen Zone hin. Die Membranständigkeit von SLAH4 konnte nachgewiesen werden und FRET FLIM Untersuchungen zeigten eine hohe Affinität von SLAH4 zu SLAH3, was die beiden Homologe als Interaktionspartner identifiziert. Für die Bestimmung des Oligomerisierungsgrades mittels PALM wurden die pflanzlichen Anionenkanäle in tierischen COS7-Zellen exprimiert. Die elektrophysiologische Funktionalität der mEOS2-SLAC/SLAH-Konstrukte wurde mit Hilfe von Patch-Clamp-Versuchen in COS7-Zellen überprüft. Um Expressionslevel, Membranständigkeit und die Verteilung über die Membran der SLAC/SLAHs zu verifizieren, wurden dSTORM-Aufnahmen herangezogen Schließlich ermöglichten PALM-Aufnahmen die Bestimmung des Polymerisierungs-grades der SLAC/SLAH Anionenkanäle, die stöchiometrischen Veränderungen bei Heteromerisierung von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 und auch der Einfluss einer zytosolischer Ansäuerung auf den Polymerisierungsgrad von SLAH3 Homomeren. Zudem weisen die Oligomerisierungsanalysen von SLAH3 Mutanten darauf hin, dass die Aminosäuren Histidin His330 und His454 entscheidend an der pH sensitiven Regulierung von SLAH3 beteiligt sind. Durch die erhobenen Daten konnten also entscheidende, neue Erkenntnisse über die Regulationsmechanismen von pflanzlichen Anionenkanälen auf molekularer Ebene gewonnen werden: Unter Standardbedingungen liegen SLAC1, SLAH2 und SLAH3 hauptsächlich als Dimer vor. Auf eine zytosolische Ansäuerung reagiert ausschließlich SLAH3 mit einer signifikanten stöchiometrischen Veränderung und liegt im aktiven Zustand vor Allem als Monomer vor. Der Oligomerisierungsgrad von SLAC1 und SLAH2 bleibt hingegen bei einer zytosolischen Ansäuerung unverändert. Ferner kommt es bei der Interaktion von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 zur Formierung eines Heterodimers, welches unbeeinflusst durch den zytosolischen pH bleibt. Im Gegensatz dazu bleiben die elektrisch inaktiven Untereinheiten SLAH1 und SLAH4 monomerisch und assemblieren ganz spezifisch nur mit SLAH3. Die hochauflösende Fluoreszenz-mikroskopie, insbesondere PALM erlaubt es also Heteromerisierungsereignisse und Änderungen im Poylmerisierungsgrad von Membranproteinen wie den SLAC/SLAHs auf molekularer Ebene zu untersuchen und lässt so Rückschlüsse auf physiologische Ereignisse zu. N2 - Anion channels of the slow anion channel family (SLAC/SLAH) are general master switches of plant stress responses. In addition a subgroup of channels load the vascular tissue in roots with nitrate and chloride. The activity of the main nitrate and chloride loading anion channel, SLAH3, is controlled by heteromerization with the electro-physiologically silent subunits SLAH1 and SLAH4 or alternatively by cytosolic acidification. Although the crystal structure of a bacterial homologue (HiTehA) of plant SLAC/SLAH anion channels is already known and suggests a trimeric structure, the stoichiometry and the multimerization level of the plant anion channel counterparts are still undiscovered. Fluorescence microscopy encompasses numerous well-established application methods like confocal laser scanning microscopy (CLSM), high resolution techniques like structured illumination microscopy (SIM) and super resolution microscopy represented by single molecule localization microscopy (e.g. dSTORM and PALM) or recently upcoming methods like expansion microscopy (ExM). These different application methods open new fields of insight into the biological organization of proteins, even down to the molecular level. In comparison to faunal studies, very little floral enquiries have been conducted, especially in the super resolution-sector. Single-molecule localization microscopy enables individual molecules to be quantified in the native environment and therefore allows conclusions regarding protein stoichiometry. As protein stoichiometry often involves cellular function of the corresponding protein, we used PALM applications and single molecule counting strategies to analyze the stoichiometric distribution of anion channel complexes. Moreover, in this study, expression patterns of the SLAC/SLAH proteins were investigated and different microscopic applications on plant specific issues could be improved and established. Referring to microscopic applications, we confirmed the polar orientation of PIN proteins via SIM and succeeded in resolving the clustered distribution in the plasma membrane at the cellular pole. Besides we were also able to measure cellwall dimensions of root cross sections from Arabidopsis thaliana seedlings and therefore succeeded in concluding the root architecture, designating the various cell types within the root, comparing them with cellwall thickness and evaluating resolution limits of the SIM microscope. Due to these reasons, this specimen can be recommended as a model structure for resolution analyses, control measurements regarding tissue-intactness after image processing for super-resolution images, or further questions. We turned out to establish two different protocols for ExM-studies in plants. One is based on enzymatic digestion and the other one on denaturation. We were able to label, expand and image whole At-seedlings, root- and leaf segments and thereby improved the resolution 2 3 fold. In this regard we managed to comprehensively depict the intact structure of leaves and roots with impressive penetration depth and extremely low background. We also examined our data and identified tissue-specific changes, discuss problems and possible limits of ExM in plants. The major part of this work was the investigation of SLAC/SLAH proteins. The expression of SLAH2 in roots is mainly located in endodermal and pericycle cells which was observed in various At-SLAH2-YFP mutants. Thus, strengthening the hypothesis, that SLAH2 has a major role in loading the vascular tissue with nitrate. The heterogeneous expression levels of SLAH2 in the meristematic-, elongation- and differentiation zone and moreover the upregulation in areas of lateral root formation also suggests that SLAH2 has an effect on plant growth by regulating nitrate levels. SLAH4 is located in the plasma membrane and FRET FLIM measurements showed a high affinity to SLAH3, validating the two homologues as interaction partners. For PALM-stoichiometry analyses, the plant anion channels were expressed in mammalian COS7-cells, in order to avoid endogenous falsification of the stoichiometries, as well as impractical reasons of PALM imaging in plant tissue. Hence, checking the electrophysiological functionality of mEOS2-SLAC/SLAH constructs via patch-clamp measurements. dSTORM-measurements were used to verify expression levels, correct membrane-association and the distribution of the SLAC/SLAHs in COS7 cells. We determined the multimerization level of SLAC/SLAHs upon cytosolic acidification and monitor stoichiometric changes upon heteromerization of SLAH3 with SLAH1 and SLAH4. On the basis of our data the following valuable new insights into the regulation mechanisms of plant anion channels were revealed: under control conditions, SLAC1, SLAH2 and SLAH3 are mainly depicted as dimers. Upon cytosolic acidification with NaOAc the stoichiometries of SLAC1 and SLAH2 remained unchanged, whereas the amount of dimeric SLAH3 is significantly reduced and shifts to a mainly monomeric distribution. It could also be assessed that SLAH3 interacts with SLAH1 or SLAH4, thereby forming a heterodimer, which is barely separable by acidification. In contrast, for SLAH1 and SLAH4 no affinity was observed. Moreover, the stoichiometries of different SLAH3-mutants indicated a crucial role of the amino acids histidin His330 and His454 in the pH-sensitive regulation of SLAH3. Hence, super-resolution micrsocopy, especially PALM allows the quantification of polymerization- and heteromerization-levels of proteins like the SLAC/SLAH anion-channels on the molecular level and therefore enabling physiological conclusions. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Membranproteine KW - Oligomerisation KW - Superresolution microscopy KW - SLAC/SLAH KW - PALM stoichiometry Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211762 ER - TY - THES A1 - Tulke, Moritz T1 - Grundlegende Arbeiten zum bio-artifiziellen renalen Tubulus aus ko-kultivierten adipozytären mesenchymalen Stammzellen und Endothelzellen auf einer synthetischen Kapillarmembran T1 - Fundamental work on a bio-artificial renal tubule consisting of co-cultivated adipose-derived mesenchymal stem cells and endothelial cells on a synthetic capillary membrane N2 - Mit fortschreitender chronischer Niereninsuffizienz kommt es zur Akkumulation von Urämietoxinen und im Endstadium unbehandelt zum Tod im sogenannten Urämischen Syndrom. Die Blutreinigung erfolgt bei der am häufigsten verwendeten Form der Nierenersatztherapie, der Hämodialyse, nur unzureichend. Die Folge ist eine erhöhte Morbidität und Mortalität der betroffenen Patienten. Bei der Hämodialyse werden nur Urämietoxine bis zu einer Größe von 20 kDa über die im Dialysator eingesetzten Hohlfaserdialysemembranen diffusiv und konvektiv semiselektiv nach Größenausschluss entfernt. Proteingebundene Urämietoxine, deren effektive Größe durch die Bindung an Transportproteine wie beispielsweise Albumin die Trennschärfe der Dialysemembranen übersteigt, werden retiniert. In-vivo werden proteingebundene Urämietoxine im proximalen Tubulus, einem Teil des tubulären Systems des Nephrons, sekretorisch eliminiert. Im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit wurden die ersten Entwicklungsschritte auf dem Weg zu einem sogenannten bio-artifiziellen Tubulus evaluiert. Der angedachte biohybride Filter sollte aus einer Ko-Kultur funktionaler humaner proximaler Tubuluszellen und humaner Endothelzellen (HUVEC) auf synthetischen Hohlfasermembranen bestehen und könnte während der Hämodialyse als zusätzlicher Reinigungsschritt angewendet werden, um unter anderem proteingebundene Urämietoxine effektiv durch aktiven Transport aus dem Blut der Patienten zu entfernen. Die Differenzierung der proximalen Tubuluszellen erfolgte dabei aus adulten adipozytären mesenchymalen Stammzellen (ASC), deren Herkunft eine spätere autologe Behandlung ermöglicht. Die Ko-Kultur mit Endothelzellen wurde zur potentiellen Steigerung der Sekretion proteingebundener Urämietoxine verwendet. In der vorliegenden Arbeit konnten ASCs durch eine Kombination der löslichen Differenzierungsfaktoren All-Trans-Retinoinsäure (ATRA), Aktivin A und BMP-7 erfolgreich in Zytokeratin 18-exprimierende Zellen differenziert werden, wodurch die erwünschte epitheliale Differenzierung bestätigt wurde. Die Expression funktionaler Proteine, wie das für den Wassertransport relevante Aquaporin 1 oder auch der Na+-/K+-ATPase, konnte in dieser Arbeit bereits vor der Differenzierung nachgewiesen werden. Im nächsten Schritt wurde erfolgreich gezeigt, dass eine simultane, qualitativ hochwertige Ko-Kultur von ASCs und HUVECs auf der mit dem extrazellulären Matrixprotein Fibronektin modifizierten Innen- bzw. Außenseite von synthetischen Hohlfasermembranen aus Polypropylen bzw. Polyethersulfon möglich ist. Die Viabilität beider Zelltypen wurde dabei durch die Verwendung eines für die Ko-Kultur entwickelten Nährmediums erreicht, in welchem die Proliferation von ASCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer Stammzelleigenschaften deutlich erhöht war. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse stellen eine aussichtsreiche Basis für einen bio-artifiziellen renalen Tubulus dar. Weitere Entwicklungsschritte, wie die Differenzierung der ASCs zu proximalen Tubuluszellen im 3D-Bioreaktor einschließlich ihrer funktionalen Charakterisierung anhand Tubulusepithel-spezifischer Transporter, sind erforderlich, be-vor erste funktionale Experimente vor dem „Upscaling“ auf klinisch verwendbare Module möglich sind. N2 - Progressing chronic kidney disease results in the accumulation of uremic toxins and, if left untreated in end-stage kidney disease, death due to the developing uremic syndrome. The most common renal replacement therapy is hemodialysis. It is a life-prolonging therapy but only delivering inadequate blood purification, which is associated with excess morbidity and mortality of the patients. In hemodialysis, only uremic toxins with a molecular size of up to 20 kDa are removed by diffusion or convection. Solutes are eliminated by semi-selective size exclusion across a hollow fiber dialysis membrane in a dialyzer. Binding of certain uremic toxins to carrier proteins, such as albumin, results in an increased effective size, which excludes them from passing through dialysis membranes. In the native kidney, these protein-bound uremic toxins are eliminated from blood by secretory transport in the proximal tubule, a specific part of the tubular filtration apparatus of the nephron. The present doctoral thesis evaluated the first steps towards a so-called bio-artificial tubule. The intended biohybrid filter was supposed to consist of a co-culture of functional human proximal tubule cells and human endothelial cells on synthetic hollow fiber membranes. In its final form, it would be implemented during hemodialysis as an additional purification step to more efficiently remove protein-bound uremic toxins from the patients’ blood by active transport. The proximal tubule cells were differentiated from adipose-derived mesenchymal stem cells, which facilitates a later autologous treatment. The co-culture with endothelial cells should further promote the expression of transporters for organic anions and, thereby, potentially increase the secretion of protein-bound uremic toxins. In the present study, the differentiation from ASCs to a CK18-expression lineage, which confirmed successful epithelial differentiation, was induced by a combination of the soluble differentiation factors all-trans-retinoic acid, activin A and BMP-7. The expression of functional proteins, i.e., of aquaporin 1, which is relevant for water transport, and Na+-/K+-ATPase, was shown already before differentiation. Additionally, the present work demon-strated a high-quality co-culture of ASCs and HUVECs on the inner- and outer membrane surfaces of synthetic polypropylene- or polyethersulfone-based hollow fiber membranes, which initially were surface-modified with the extracellular matrix protein fibronectin. The viability of both cell types was thereby ensured by the application of a specific co-culture medium, which further increased the proliferation of ASCs intensely while maintaining their stem-cell character. The results of the present approach represent a promising basis for a bio-artificial renal tubule. The further development requires the differentiation of ASCs into proximal tubule cells on the 3D-bioreactor membrane and their characterization by verifying tubulusepithel-specific transporters. Finally, subsequent functional experiments have to precede an upscaling to clinically applicable modules. KW - Hohlfaserreaktor KW - Stammzelle KW - Endothelzelle KW - Adipozytäre mesenchymale Stammzelle KW - Bio-artifizieller Tubulus KW - Ko-Kultur Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216896 ER - TY - THES A1 - Glaab, Sabine T1 - Green classroom at the wildlife park: Aspects of environmental, instructional and conceptual education of primary school children concerning the European wildcat. T1 - Das Grüne Klassenzimmer im Wildpark: Aspekte der Umweltbildung, Instruktion sowie Schülervorstellungen bei Grundschulkindern zum Thema Wildkatze. N2 - To foster sustainable environmentally friendly behavior in children it is important to provide an effective form of environmental education. In this context we studied three important factors: Attitude towards nature, environmental knowledge and advanced expert knowledge. Concerning attitude towards nature our first question was: “Is it possible to affect primary school children’s environmental values during a one-day visit at a wildlife park?” As a control, the program was also conducted in schools, leading to two different learning settings- wildlife park and school. Regarding environmental knowledge, in our second question we wanted to know, if our modified teaching approach “guided learning at workstations” (G) combining instructional and constructivist elements would lead to good cognitive learning results of primary school children. Additionally, we compared it to a stronger teacher-centered (T) as well as to a stronger student-centered (S) approach. The third question we asked was “Is it possible to convey fascinating expert knowledge on a more advanced subject to primary school children using conceptual change theory?” After gathering primary school children’s preconceptions, we defined different groups due to the heterogeneity of their pre-existing conceptions and the change in conceptions. Based on this research we designed a program along with an instrument to measure the impact of the conceptual change teaching method. After years of building a strong cooperation between the section Didactics of Biology at the Julius-Maximilians University Würzburg, the nearby schools and the wildlife park “Wild-Park Klaushof” near Bad Kissingen in northern Bavaria it was time to evaluate the environmental education programs prepared and applied by undergraduate university students. As a model species we chose the European wildcat (Felis silvestris silvestris) which represents endangered wildlife in Europe and the need for human interaction for the sake of preserving a species by restoring or recreating the habitat conditions needed while maintaining current infrastructure. Drawing from our own as well as teachers’ and university students’ experiences, we built, implemented and evaluated a hands-on program following several workstations between the wildcat enclosure and the wildlife park’s green classroom. The content of our intervention was presented as a problem-oriented lesson, where children were confronted with the need for human interaction in order to preserve the European wildcat. Not only on a theoretical basis, but very specific to their hometowns they were told where and when nature conservation groups met or where to donate money. 692 Bavarian third grade primary school children in 35 classes participated in the one-day intervention that took place between the months of april, 2014 and november, 2015 in the wildlife park or in their respective classrooms. The ages varied between 8 and 11 years with the mean age being 8.88 ± 0.56 years old. 48.6 % of them were boys, 51.4 % were girls. (1) To measure primary school children’s environmental attitudes a questionnaire on two major environmental values- preservation and utilization of nature- was administered in a pre, post- and retention test design. It was possible to affect primary school children’s environmental preservation values during our one-day program. This result could be found not only at the wildlife park but unexpectedly also in school, where we educated classes for control purposes. We also found this impact consistent in all used teaching approaches and were surprised to see the preservation values change in a way we did not expect from higher tendency towards preservation of nature to a lower one. We presume that children of this age group reflected on the contents of our intervention. This had an influence on their own values towards preservation which led to a more realistic marking behavior in the questionnaire. We therefore conclude that it is possible to affect primary school children’s environmental values with a one-day program on environmental content. (2) We were interested in conveying environmental knowledge about the European wildcat; its morphology, ecology and behavior. We designed and applied a knowledge questionnaire also in a pre-, post- and retention test design, to find out, whether different forms of instruction made a difference in learning success of primary school children. We used two approaches with a teacher in the role of a didactic leader- our modified guided approach (G) as well as a stronger teacher-centered one (T) with a higher focus on instruction. The third approach was presented as a strong student-centered learning at workstations (S) without a didactic leader we also called “free learning at workstations”. Overall, all children’s knowledge scores changed significantly from pre- to post-test and from pre- to retention test, indicating learning success. Differences could only be found between the posttest values of both approaches with a didactic leader (G, T) in comparison to the strong student-centered (S) form. It appears that these primary school children gained knowledge at the out of school learning setting regardless of the used teaching approach. On the subject of short-term differences, we discuss, that the difference in learning success might have been consistent from post to retention test if a consolidation phase had been added in the days following the program as should be common practice after a visit to an out-of- school learning setting but was not part of our intervention. When comparing both approaches with a didactic leader (G, T), we prefer our modified guided learning at workstations (G) since constructivist phases can be implemented without losses concerning learning success. Moreover, the (at least temporary) presence of a teacher in the role of a didactic leader ensures maintained discipline and counteracts off-task behavior. To make sure, different emotional states did not factor in our program, we measured children’s situational emotions directly after the morning intervention using a short scale that evaluated interest, wellbeing and boredom. We found, that these emotions remained consistent over both learning settings as well as different forms of instruction. While interest and wellbeing remained constantly high, boredom values remained low. We take this as a sign of high quality designing and conducting the intervention. (3) In the afternoon of the one-day intervention, children were given the opportunity to investigate the wildcat further, this time using the conceptual change theory in combination with a more complex and fascinating content: cats’ vision in dusk and dawn. Children were confronted with their preconceptions which had been sampled prior to the study and turned into three distinctive topics reflected in a special questionnaire. In a pre-, post and retention test design we included the most common alternative conceptions, the scientifically correct conceptions as well as other preconceptions. We gathered a high heterogeneity of preconceptions and defined three groups based on conceptual change literature: “Conceptual change”, “Synthetic Models” and “Conceptual Growth”. In addition to these we identified two more groups after our data analysis: “Knowledge” and “Non-addressed Concepts”. We found that instruction according to the conceptual change theory did not work with primary school children in our intervention. The conceptual change from the addressed alternative conceptions as well as from other preconceptions towards the scientifically correct conceptions was successfully achieved only on occasion. In our case and depending on the topic only one third to one fourth of the children actually held the addressed conception while the rest was not targeted by the instruction. Moreover, we conclude children holding other conceptions were rather confused than educated by the confrontation. We assume that children of this age group may be overchallenged by the conceptual change method. N2 - Bildung für nachhaltige Entwicklung soll unter anderem dazu führen, dass Kinder langfristig umweltfreundliches Verhalten zeigen. Um dies zu erreichen, sind verschiedene Faktoren nötig - in dieser Studie lag unser besonderes Augenmerk auf drei Punkten: den Umwelteinstellungen der Kinder, dem umweltrelevanten Wissen, besonders im Hinblick auf die Lebensbedingungen und den Schutz der europäischen Wildkatze sowie weiterführendem, komplexeren, biologischen Wissen. Zuerst fragten wir uns in Bezug auf die Umwelteinstellungen, ob es möglich ist, die Einstellungen der Grundschulkinder zum Thema „Erhaltung der Natur“ im Laufe nur eines Tages am Wildpark zu beeinflussen. Umweltwissen war der Bestandteil der zweiten Frage, wie Grundschulkinder am außerschulischen Lernort gute Lernerfolge erzielen können. Wir testeten unseren modifizierten Ansatz „Geführtes Lernen an Stationen“ (G), der instruktionale und konstruktivistische Elemente beinhaltet und verglichen ihn einerseits mit einem stärker lehrerzentrierten (T) sowie andererseits einem stark schülerzentrierten (S) Lernen an Stationen, das wir auch als „freies Lernen an Stationen“ bezeichneten. Die dritte Frage beschäftigte sich schließlich damit, ob es gelingen kann, faszinierendes, tiefergehendes Wissen mit Hilfe der „Conceptual Change Theorie“ an Grundschulkinder zu vermitteln. Hintergrund der didaktischen Arbeit mit Grundschülern am außerschulischen Lernort Wildpark ist die Kooperation zwischen der Fachgruppe Didaktik der Julius-Maximilians-Universität Würzburg mit dem „Wild-Park Klaushof“ bei Bad Kissingen. Im Rahmen dieser Zusammenarbeit stellt die Fachgruppe Didaktik Biologie angehende Biologielehrerinnen und -lehrer als Referenten von Führungen gemäß des „Geführten Lernen an Stationen“ zur Verfügung. Diese Führungen wurden inhaltlich und didaktisch ebenfalls von Lehramtsstudierenden in der Biologiedidaktik ausgearbeitet, meist im Rahmen der schriftlichen Hausarbeiten gegen Ende des Lehramtsstudiums. Die Führungen sind konstruktivistisch angelegt, bieten hohe Selbsttätigkeit der Schülerinnen und Schüler und folgen dem Prinzip des problemorientierten Unterrichts. Die Schülerinnen und Schüler arbeiten nicht völlig frei, es handelt sich aber auch nicht um einen rein lehrerzentrierten Vortrag, sondern eine Mischung aus beiden Formen, die wir als „Geführtes Lernen an Stationen“ (G) bezeichnen. In dieser Variante stellt der Referent die didaktische Leitung der Führung dar, der Impulse und Anleitungen gibt, immer für Fragen zur Verfügung steht, jedoch Anteile von Selbsttätigkeit ermuntert und begleitet. Im Zeitraum von April 2014 bis November 2015 nahmen 692 Grundschulkinder der dritten Klassen bayerischer Grundschulen in 35 Klassen an der Studie am Wild-Park Klaushof sowie in ihren eigenen Klassenzimmern in der Schule teil. Durchschnittlich waren die Kinder 8.88 ± 0.56 Jahre alt, das Alter variierte zwischen 8 und 11 Jahren. 48,6 % der teilnehmenden Kinder waren Jungs, 51,4 % Mädchen. Im Vormittagsteil des Programms wurde im Rahmen einer problemorientierten Unterrichtseinheit gemeinsam mit den Schülerinnen und Schülern die Frage aufgeworfen, warum die europäische Wildkatze (Felis silvestris silvestris), eine Zeigerart für intakte Ökosysteme, nicht überall vorkommt, wo sie vorkommen könnte. Gemeinsam wurden Aspekte zu Morphologie, Ökologie und Verhalten der Wildkatze erarbeitet; die Frage konnte jedoch auch dann noch nicht beantwortet werden. Erst eine Verknüpfung der Verbreitungskarten und der gelernten Fakten führte zur Erkenntnis, dass die Wildkatze bestimmte Barrieren (Autobahnen, offene Wiesen- und Ackerflächen, bebaute Flächen etc.) nicht überwinden kann und hier der Eingriff des Menschen nötig ist. Nicht nur allgemein, sondern auch ganz konkret wurde der eigene Einsatz der Kinder, zum Beispiel im Rahmen der Mitarbeit in einer Naturschutz-Organisation oder einer Geldspende angeregt. (1) Zur Messung der Umwelteinstellungen verwendeten wir das 2-MEV Modell (two major environmental factors), das die Umwelteinstellungen in zwei Dimensionen darstellt, zum einen die Tendenz zur Erhaltung, zum anderen die Ausnutzungstendenz der Umwelt. Die Fragebögen wurden zu drei Testzeitpunkten ausgefüllt - einem Vortest ca. eine Woche vor dem Programm, einem Nachtest unmittelbar nach Beendigung des Programms und einem Behaltenstest etwa sechs bis acht Wochen nach dem Programm. Die Umwelt-Einstellungen konnten tatsächlich verändert werden, nicht nur am Wildpark, sondern auch in der Schule, wo Klassen das Programm zu Kontrollzwecken ebenfalls durchliefen. Auch blieb der Einfluss über alle verwendeten Lehrmethoden konsistent. Besonders überrascht waren wir von der Art der Änderung der Einstellungen zur Naturerhaltung. Statt sich wie erwartet von schwächerer Tendenz zur Erhaltung in Richtung stärkere Tendenz zur Naturerhaltung zu ändern, erfolgte die Änderung genau entgegengesetzt. Wir vermuten, dass die Kinder dieser Altersgruppe die Inhalte der Intervention reflektiert haben und dies einen Einfluss auf ihre Einstellungen zur Naturerhaltung hatte, was sich in einem realistischeren Ankreuzverhalten niederschlug. Zusammenfassend sehen wir es als möglich an, die Einstellungen zur Umwelt von Grundschulkindern mit einem Ein-Tagesprogramm zu verändern. (2) Auch für die Erhebung des Umweltwissens wählten wir die bereits erwähnten drei Testzeitpunkte für den Wissensfragebogen, der Fragen zur Morphologie, Ökologie und Verhalten der Wildkatze beinhaltete. Die Anzahl richtiger Antworten erhöhte sich vom Vor- zum Nachtest sowie vom Vor- zum Behaltenstest signifikant bei allen Schülerinnen und Schülern, es wurde also erfolgreich gelernt. Zwischen den einzelnen Führungsformen konnten wir signifikante Unterschiede nur kurzfristig vom Vor- zum Nachtest zwischen den beiden Methoden mit dem didaktischen Begleiter, also dem stärker lehrerzentrierten (T) und dem „Geführten Lernen an Stationen“ (G) einerseits und dem stark schülerzentrierten freien Lernen (S) andererseits erkennen. Der kurzfristige Wissenserwerb war mit didaktischem Begleiter (G, T) höher als ohne. Insgesamt konnte also ein Lernerfolg verzeichnet werden, unabhängig von der Führungsform. Allerdings vermuten wir, dass der kurzfristige Unterschied sich auch mittelfristig ausgewirkt hätte, wenn im Anschluss an den Besuch im Wildpark eine Nachbereitung stattgefunden hätte, was gewöhnlich zum Besuch des außerschulischen Lernorts gehören sollte, jedoch nicht Bestandteil dieser Untersuchung war. Vergleicht man die beiden Ansätze mit didaktischen Begleitern (G, T), bevorzugen wir nach wie vor unser „Geführtes Lernen an Stationen“ (G), da hier die Einbindung konstruktivistischer Phasen möglich ist. Darüber hinaus kann die (zumindest zeitweise) Anwesenheit eines Lehrers in der Rolle des didaktischen Begleiters sicherstellen, dass Disziplin gewahrt wird und Störungen vermieden werden. Um die situationalen Emotionen der Schülerinnen und Schüler mit einbeziehen zu können, beziehungsweise Effekte von situationalen Emotionen auf Umwelteinstellungen oder Wissenserwerb ausschließen zu können, wendeten wir zusätzlich eine Kurzskala zur Erfassung von Interesse, Langeweile und Wohlbefinden an. Diese Skala wurde nur einmalig angewendet, direkt im Anschluss an das Vormittagsprogramm. Wir konnten keine Unterschiede bei den erhobenen situationalen Emotionen finden - weder zwischen den Lernorten Schule und Wildpark noch zwischen den drei verschiedenen Führungsformen (G, T, S), überall zeigten sich hohe Werte für Interesse und Wohlbefinden sowie niedrige Werte für Langeweile. Dieses Ergebnis zeigt für uns die hohe didaktische Qualität der Entwicklung und Durchführung des Programms. (3) Am Nachmittag des Ein-Tages-Programms beschäftigten sich die Kinder weiter mit der Wildkatze, diesmal folgten wir einer anderen Methode der Wissensvermittlung, der „Conceptual Change Theorie“ in Kombination mit komplexerem und gleichzeitig faszinierendem Wissen zum Dämmerungssehen der Katze. Gemäß dem Prinzip der didaktischen Rekonstruktion wurden Wissensinhalte im Rahmen dieser Intervention nicht kontinuierlich erarbeitet wie im Vormittagsprogramm, sondern es fand eine Konfrontation der Schülerinnen und Schüler mit ihren eigenen Schülervorstellungen zum Thema Dämmerungssehen bei Mensch und Katze statt. Diese Vorstellungen wurden vorab in einem offenen Fragebogen erhoben und in drei Themenschwerpunkte gegliedert, die sich anschließend im Fragebogen zur Erhebung des Konzeptwechsels widerspiegelten. Auch dieser Fragebogen wurde zu den eingangs erwähnten drei Testzeitpunkten angewendet. Gemäß der Theorie erwarteten wir im Ankreuzverhalten drei Gruppen: „Conceptual Change“, „Synthetic Models“ sowie „Conceptual Growth“. Darüber hinaus fanden wir zwei weitere Gruppen „Knowledge“ und „Non-addressed Concepts“. Wir stellten fest, dass der Konzeptwechsel der Kinder von der wissenschaftlich nicht korrekten Schülervorstellung hin zur wissenschaftlich korrekten Vorstellung in unserer Intervention nicht gelang, nur punktuell kreuzten wenige Schülerinnen und Schüler das entsprechende Muster an. Auch der Wechsel in den anderen Gruppen hin zur wissenschaftlich korrekten Vorstellung funktionierte kaum. In unserem Fall hatten darüber hinaus je nach Thema nur ein Drittel bis ein Viertel der beteiligten Kinder überhaupt die adressierte Vorstellung, was unserer Meinung nach dazu führt, dass der Großteil der Kinder mit anderen Vorstellungen durch die Anwendung der „Conceptual Change Theorie“ eher verwirrt wurde. Wir vermuten, dass Grundschulkinder der dritten Klasse durch diese Form des Unterrichts überfordert sind. KW - Biologie KW - Education Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169496 ER - TY - THES A1 - Rost, Isabell T1 - Gezielte Anreicherungs- und neue DNA-Sequenzierungsstrategien für die molekulare Analyse von Fanconi-Anämie-Genen T1 - Targeted enrichment and novel DNA sequencing strategies for the molecular analysis of fanconi anemia genes N2 - Fanconi-Anämie (FA) ist, mit Ausnahme von Mutationen in FANCR/RAD51, eine autosomal-rezessive oder X-chromosomal vererbte Krankheit, die sich durch eine ausgesprochene klinische als auch genetische Heterogenität auszeichnet. Neben einem fortschreitenden Knochenmarksversagen zählen zu den typischen Merkmalen eine Vielzahl an angeborenen Fehlbildungen, wie beispielsweise Radialstrahlanomalien, Minderwuchs oder Pigmentierungsstörungen. Zudem besteht für FA-Patienten ein überdurchschnittlich hohes Risiko bereits in jungen Jahren an akuter myeloischer Leukämie oder soliden Tumoren zu erkranken. Bislang konnten in 21 FA-Genen (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U oder -V) krankheitsverursachende Mutationen identifiziert werden, deren Proteinprodukte maßgeblich an der Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt sind und Komponenten des FA/BRCA-DNA-Reparaturweges darstellen. In der klassischen FA-Mutationsanalyse kommen meist Sanger-Sequenzierungen sowie MLPA- und Immunblot-Analysen zum Einsatz. Da im Wesentlichen keine Genotyp-Phänotyp-Korrelation besteht, gestaltet sich, gerade bei seltenen FA-Komplementationsgruppen, der Nachweis von krankheitsverursachenden Mutationen oftmals sehr zeit- und kostenintensiv. Während der letzten Jahre wurden verschiedene Strategien zur Anreicherung und Sequenzierung entwickelt, welche die parallele Sequenzanalyse einzelner ausgewählter Gene, ganzer Exome oder sogar des gesamten Genoms und somit eine kosten- und zeiteffiziente Mutationsanalyse ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Anreicherungsmethoden mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung auf ihre Anwendbarkeit in der molekulargenetischen FA-Diagnostik getestet, um klassische Mutationsanalyse-Methoden zu ergänzen oder möglicherweise sogar ganz ersetzen zu können. Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der Etablierung eines FA-spezifischen Genpanels zur Genotypisierung von FA-Patienten. Nachdem die Methode zunächst anhand von FA-Patienten mit bekannten Mutationen optimiert werden musste, erwies sie sich als effizienter Ansatz zum Nachweis krankheitsverursachender Mutationen bei FA-Patienten unbekannter Komplementationsgruppe. Durch die FA-Panelanalyse konnten 37 von 47 unklassifizierten Patienten einer FA-Komplementationsgruppe zugeordnet werden, indem deren kausalen Mutationen bestimmt wurden. In einem weiteren Ansatz sollte die Anwendbarkeit eines kommerziellen Anreicherungspanels zur FA-Diagnostik untersucht werden. Auch hier konnte ein Großteil der krankheitsverursachenden Mutationen von fünf bekannten wie auch 13 nicht zugeordneten FA-Patienten detektiert und somit eine molekulargenetische Diagnose bei neun weiteren, zuvor unklassifizierten FA-Patienten, gestellt werden. Ferner wurden sechs ausgewählte Patienten, zusätzlich zur Panelanreicherung, per Exomanalyse untersucht. Zum einen konnten Mutationen in bekannten FA-Genen bestätigt oder neu identifiziert werden. Zum anderen wurden auch potentiell pathogene Mutationen in DNA-Reparaturgenen außerhalb des FA/BRCA-Signalweges bei zwei Patienten mit unbestätigter Verdachtsdiagnose FA verifiziert. So wurde bei mehreren Mitgliedern einer Familie mit unterschiedlichen Tumorerkrankungen eine zuvor unbeschriebene homozygote Nonsense-Mutation in der BER-Glykosylase NTHL1 nachgewiesen, für welche bislang erst zwei pathogene Mutationen als Auslöser eines neuen Krebssyndroms bekannt sind. Bei einem weiteren Patienten wurden compound-heterozygote Mutationen in RPA1 detektiert, ein Gen für das bislang noch kein Krankheitsbild bekannt ist. Mit Hilfe der drei verschiedenen Anreicherungsstrategien konnten insgesamt 47 von 60 unklassifizierten FA-Patienten 13 verschiedenen Komplementationsgruppen eindeutig zugeordnet werden. Es zeigte sich dabei ein breites Spektrum an neuen, bislang unbeschriebenen FA-Mutationen. Den größten Anteil an der Gesamtzahl der nachgewiesenen Mutationen hatten Spleißmutationen, die auf eine Auswirkung auf das kanonische Spleißmuster untersucht wurden, um einen pathogenen Effekt nachweisen zu können. Weiterhin schloss die Arbeit die Charakterisierung einzelner FA-Patienten bzw. Komplementationsgruppen mit ein. Dazu zählen die seltenen Untergruppen FA-T und FA-Q, für die jeweils ein neuer Patient identifiziert werden konnte. Durch die funktionelle Charakterisierung der dritten jemals beschriebenen FA-Q-Patientin konnten Einblicke in das Zusammenspiel der Reparatur von DNA-Quervernetzungen und der Nukleotidexzisionsreparatur gewonnen und die phänotypische Variabilität von FA durch die subjektive als auch zelluläre UV-Sensitivität der Patientin ergänzt werden. Darüber hinaus konnte das Mutationsspektrum in FA-I sowie FA-D2 erweitert werden. Eine genauere Untersuchung der Pseudogenregionen von FANCD2 ermöglichte dabei die gezielte Mutationsanalyse des Gens. Insgesamt konnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, das Mutationsspektrum in FA zu erweitern und durch die Identifizierung und Charakterisierung einzelner Patienten neue Einblicke in verschiedene Komponenten des FA/BRCA-Signalweges zu erhalten. Es zeigte sich, dass neue DNA-Sequenzierungsstrategien in der FA-Diagnostik eingesetzt werden können, um eine effiziente Mutationsanalyse zu gewährleisten und klassische Methoden in Teilbereichen zu ersetzen. N2 - Fanconi anemia (FA) is, with the exception of mutations in FANCR/RAD51, an autosomal recessive or X-linked inherited disease that is characterized by a remarkable clinical and genetic heterogeneity. In addition to progressive bone marrow failure, typical features include a multitude of developmental malformations, such as radial ray anomalies, growth retardation or cutaneous pigment displacement. Additionally, FA patients have a higher risk for developing acute myelogenous leukemia or solid tumors early in life. To date, pathogenic mutations have been identified in 21 FA genes (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U or -V) whose protein products are responsible for maintaining genomic integrity and constitute components of the FA/BRCA DNA repair pathway. Typical methods for FA mutation analysis comprise Sanger sequencing as well as MLPA and immunoblot analyses. As no definite genotype-phenotype correlation exists, pathogenic mutation detection in rare subgroups is often quite time-consuming and cost-intensive. Within the last few years, distinct strategies for both enrichment and sequencing of a subset of genes, whole exomes or even the whole genome have been developed that facilitate a cost-effective and time-saving mutation analysis. In the present work different target-enrichment strategies followed by high-throughput sequencing were tested for their applicability in molecular genetic diagnostics of FA in order to complement or even replace classic strategies for mutation analysis. The first part of this work addressed the establishment of an FA-specific gene panel for genotyping FA patients. After optimizing this method by means of FA patients with known mutations, this proved to be an efficient approach for detecting pathogenic mutations in FA patients of unknown complementation groups. Due to FA gene panel analysis, 37 of 47 unclassified FA patients were assigned to a complementation group based on the identification of their causative mutations. In another approach, a commercial enrichment panel was tested for its application in FA diagnostics. Again, most pathogenic mutations of five classified and 13 unclassified FA patients were detected, enabling a molecular diagnosis for nine previously unclassified FA patients. Moreover, six selected patients were studied by exome analysis in addition to panel enrichment. This allowed for mutations in known FA complementation groups to be confirmed or newly identified. Additionally, potentially pathogenic variants in DNA-repair genes outside the FA/BRCA pathway were verified in two patients with an unconfirmed suspected diagnosis of FA. One previously undescribed homozygous nonsense mutation in the BER glycosylase NTHL1 was detected in several members of one family with various tumors. For this gene, only two distinct pathogenic mutations were previously described to cause a novel cancer syndrome. In another patient, compound heterozygous mutations in RPA1 were detected, a gene for which no disease pattern is yet known. By means of the three different enrichment strategies a total of 47 of 60 unclassified FA patients were definitely assigned to 13 diverse complementation groups. In this context, a broad spectrum of previously undescribed mutations was identified. The majority of all verified mutations were splice mutations that were examined for an effect on the canonical splicing pattern in order to verify a pathogenic effect. Additionally, this work also included the characterization of individual FA patients and complementation groups, respectively. These include the rare subgroups FA-T and FA-Q, for each of which one new patient was identified. Functional characterization of the third ever described FA-Q patient allowed new insights into the interplay of DNA interstrand-crosslink and nucleotide excision repair and broadened the spectrum of phenotypic variability of FA by the subjective and cellular UV sensitivity of this patient. Furthermore, the mutation spectrum in both FA-I and FA-D2 was expanded. Here, a closer investigation of the pseudogene regions of FANCD2 facilitated a precise mutation screening of the gene. Overall, the results of this work broadened the mutation spectrum of FA and allowed new insights into diverse components of the FA/BRCA pathway by identifying and characterizing individual patients. It became apparent that novel strategies for DNA sequencing can be applied in FA diagnostics to ensure an efficient mutation analysis, as well as to replace some parts of classical approaches. KW - Fanconi-Anämie KW - DNS-Reparatur KW - Sequenzdaten KW - Genpanel KW - Next generation sequencing KW - Mutationsanalyse Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151096 ER - TY - THES A1 - Seibold, Marcel T1 - Funktionelle Charakterisierung des Ras family small GTP binding protein RAL im Multiplen Myelom T1 - Functional characterization of the Ras family small GTP binding protein RAL in multiple myeloma N2 - Die monoklonale Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark ist charakteristisch für das multiple Myelom (MM) und kann bei Erkrankten zu Störungen in der Hämatopoese sowie zu Knochenläsionen und Niereninsuffizienz führen. Die Weiterentwicklung und der Einsatz neuer Therapieoptionen konnten das Überleben von MM-Patienten zwar erheblich verbessern, jedoch gilt diese Krankheit weiterhin als unheilbar. Onkogene Mutationen und das Knochenmarkmikromilieu führen in MM-Zellen zur Entstehung eines onkogenen Signalnetzwerks, das das Wachstum und Überleben der Zellen aufrechterhält. Mutationen der GTPase RAS treten bei bis zu 50 % der MM-Patienten auf und tragen zum Überleben von MM-Zellen bei. Trotz der Häufigkeit und Bedeutsamkeit von onkogenem RAS, auch in anderen Tumorentitäten, ist die GTPase nach wie vor therapeutisch nicht angreifbar. Die GTPase RAL aus der Familie der RAS-GTPasen wird als Downstream-Effektor von RAS angesehen, der damit ebenfalls zur Aufrechterhaltung des Tumorzellüberlebens beitragen könnte. In einigen Tumorentitäten konnte bisher gezeigt werden, dass eine Überexpression von RAL in den Tumorzellen vorliegt und die Proliferation und Apoptose von Tumorzellen durch RAL beeinflusst wird. Daher stellte sich die Frage, ob RAL im MM ebenfalls das Überleben von Tumorzellen beeinflusst und ob eine direkte Verbindung zwischen onkogenem RAS und RAL besteht. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle von RAL sowie dessen Zusammenhang mit onkogenem RAS im MM untersucht. Hierbei konnte eine Überexpression von RAL in MM-Zellen im Vergleich zu MGUS oder normalen Plasmazellen beobachtet werden. In Knockdown-Analysen wurde gezeigt, dass RAL überlebensnotwendig für MM-Zellen ist. Dabei wurde in Western Blot-Analysen festgestellt, dass diese Überlebenseffekte unabhängig von MAPK/ERK-Signaling vermittelt werden. Es konnte teilweise jedoch eine Abhängigkeit von der AKT-Aktivität beobachtet werden. Da RAL-Knockdown Einfluss auf das Überleben von MM-Zellen hat, wurde eine pharmakologische Inhibition von RAL durch den Inhibitor RBC8 untersucht. RBC8 zeigte in höheren Dosen nur bei einem Teil der MM-Zelllinien eine Wirkung auf das Zellüberleben sowie auf die RAL-Aktivierung. Die Weiterentwicklung potenter RAL-Inhibitoren ist daher für eine klinische Translation einer RAL-Inhibition von großer Bedeutung. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen onkogenem RAS und der RAL-Aktivierung wurden RAL-Pulldown-Analysen nach Knockdown von onkogenem RAS durchgeführt. In diesen Experimenten wurde keine Abhängigkeit der RAL-Aktivierung von onkogenem RAS festgestellt. Darüber hinaus zeigten Genexpressionsanalysen nach RAS- bzw. RAL-Knockdown unterschiedliche Genexpressionsprofile. In Massenspektrometrie-Analysen wurden mögliche Effektoren, die mit RAL an der Beeinflussung des Zellüberlebens beteiligt sein könnten, untersucht. Hierbei wurden die Komponenten des Exozyst-Komplexes EXO84 und SEC5 als Interaktionspartner von RAL identifiziert. Nachdem gezeigt wurde, dass RAL ausschlaggebend für das Überleben von MM-Zellen ist, wurde eine Kombination von RAL-Knockdown mit klinisch relevanten Wirkstoffen analysiert. Diese zeigte bei der Kombination mit PI3K oder AKT-Inhibitoren verstärkte Effekte auf das Zellüberleben der MM-Zellen. Zusammenfassend wurde die Bedeutung von RAL für das Überleben von Tumorzellen im MM gezeigt und RAL als potentielles therapeutisches Target im MM beschrieben, welches unabhängig von onkogenem RAS reguliert wird. N2 - Multiple myeloma (MM) is a hematologic neoplasia which is characterized by monoclonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow leading to hematopoetic failure, bone lesions and renal failure. Although continuous development of existing therapeutics and new therapeutic options vastly improved MM patient survival, MM still remains an incurable disease. Oncogenic mutations and the bone marrow microenvironment contribute to a signaling network which sustains MM cell proliferation and survival. Within this network mutations of the RAS oncogene account for up to 50 % of MM patients. Despite its prevalence and importance not only in MM, RAS still remains undruggable. The GTPase-family Member RAL is considered as a RAS effector which might also influence maintainance of tumor cell survival. In several tumor entities RAL is overexpressed in tumor cells and influences proliferation and apoptosis. Therefore, in MM RAL might also be controlled by oncogenic RAS and mediate cell survival of tumor cells. In this work, RAL’s functional role as well as the potential interconnection with oncogenic RAS was investigated. In MM cells RAL is ovexpressed compared to non-malignant MGUS or plasma cells. Knockdown analyses showed that RAL is essential for MM cell survival. These survival effects are transferred independently of MAPK/ERK signaling as shown by Western Blot analysis. However, to some extent RAL influenced MM cell survival dependently of AKT activity. Because RAL knockdown had a significant effect on MM cell survival a pharmacological inhibition was tested using the inhibitor RBC8. In a portion of MM cell lines RBC8 exerts effects on cell survival. But the effects of RBC8 on RAL activation were only visible at higher concentrations as shown by pulldown assays. Thus, subsequent development of potent RAL inhibitors is of major importance for clinical translation. To investigate whether RAL is directly activated by oncogenic RAS, RAL pulldown assays were performed after knockdown of oncogenic RAS. Strikingly, there was no direct connection between the presence of oncogenic RAS and RAL activation. Furthermore, gene expression profiles after RAS or RAL knockdown showed differing expression signatures. Potential effectors of RAL which might also influence MM cell survival were investigated in mass spectrometric analyses where the exocyst complex components EXO84 and SEC5 were identified as RAL interaction partners. Since RAL is of importance for MM cell survival, RAL knockdown was combined with clinically relevant agents. There was an enhanced induction of apoptosis upon combination of PI3K or AKT inhibitors with RAL knockdown. Taken together, the influence of RAL as a crucial mediator of MM cell survival was shown in this work. Therefore, RAL represents a potential therapeutic target which is regulated independently of oncogenic RAS. KW - Kleine GTP-bindende Proteine KW - Signaltransduktion KW - Plasmozytom KW - RAL KW - Multiples Myelom KW - Zellüberleben KW - Knochenmark Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208003 ER - TY - THES A1 - Hartlieb, Heiko T1 - Functional analysis of Mushroom body miniature’s RGG-box and its role in neuroblast proliferation in Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse der RGG-Box von Mushroom body miniature und deren Rolle in der Neuroblastenproliferation in Drosophila melanogaster N2 - Development of the central nervous system in Drosophila melanogaster relies on neural stem cells called neuroblasts. Neuroblasts divide asymmetrically to give rise to a new neuroblast as well as a small daughter cell which eventually generates neurons or glia cells. Between each division, neuroblasts have to re-grow to be able to divide again. In previous studies, it was shown that neuroblast proliferation, cell size and the number of progeny cells is negatively affected in larvae carrying a P-element induced disruption of the gene mushroom body miniature (mbm). This mbm null mutation called mbmSH1819 is homozygously lethal during pupation. It was furthermore shown that the nucleolar protein Mbm plays a role in the processing of ribosomal RNA (rRNA) as well as the translocation of ribosomal protein S6 (RpS6) in neuroblasts and that it is a transcriptional target of Myc. Therefore, it was suggested that Mbm might regulate neuroblast proliferation through a role in ribosome biogenesis. In the present study, it was attempted to further elucidate these proposed roles of Mbm and to identify the protein domains that are important for those functions. Mbm contains an arginine/glycine rich region in which a di-RG as well as a di-RGG motif could be found. Together, these two motifs were defined as Mbm’s RGG-box. RGG-boxes can be found in many proteins of different families and they can either promote or inhibit protein-RNA as well as protein-protein interactions. Therefore, Mbm’s RGG-box is a likely candidate for a domain involved in rRNA binding and RpS6 translocation. It could be shown by deletion of the RGG-box, that MbmdRGG is unable to fully rescue survivability and neuroblast cell size defects of the null mutation mbmSH1819. Furthermore, Mbm does indeed rely on its RGG-box for the binding of rRNA in vitro and in mbmdRGG as well as mbmSH1819 mutants RpS6 is partially delocalized. Mbm itself also seems to depend on the RGG-box for correct localization since MbmdRGG is partially delocalized to the nucleus. Interestingly, protein synthesis rates are increased in mbmdRGG mutants, possibly induced by an increase in TOR expression. Therefore, Mbm might possess a promoting function in TOR signaling in certain conditions, which is regulated by its RGG-box. Moreover, RGG-boxes often rely on methylation by protein arginine methyltransferases (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) to fulfill their functions. Mbm might be symmetrically dimethylated within its RGG-box, but the results are very equivocal. In any case, Dart1 and Dart5 do not seem to be capable of Mbm methylation. Additionally, Mbm contains two C2HC type zinc-finger motifs, which could be involved in rRNA binding. In an earlier study, it was shown that the mutation of the zinc-fingers, mbmZnF, does not lead to changes in neuroblast cell size, but that MbmZnF is delocalized to the cytoplasm. In the present study, mbmZnF mutants were included in most experiments. The results, however, are puzzling since mbmZnF mutant larvae exhibit an even lower viability than the mbm null mutants and MbmZnF shows stronger binding to rRNA than wild-type Mbm. This suggests an unspecific interaction of MbmZnF with either another protein, DNA or RNA, possibly leading to a dominant negative effect by disturbing other interaction partners. Therefore, it is difficult to draw conclusions about the zinc-fingers’ functions. In summary, this study provides further evidence that Mbm is involved in neuroblast proliferation as well as the regulation of ribosome biogenesis and that Mbm relies on its RGG-box to fulfill its functions. N2 - Die Entwicklung des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster beruht auf neuronalen Stammzellen genannt Neuroblasten. Neuroblasten teilen sich asymmetrisch und bringen dabei sowohl einen neuen Neuroblasten als auch eine kleinere Tochterzelle hervor, die wiederum letztlich Neuronen oder Gliazellen generiert. Zwischen jeder Zellteilung müssen die Neuroblasten wieder auf ihre ursprüngliche Größe wachsen, sodass sie zur erneuten Teilung in der Lage sind. In vorhergehenden Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl die Proliferation der Neuroblasten, deren Zellgröße als auch die Anzahl ihrer Tocherzellen reduziert ist in Larven, die eine P-Element-induzierte Unterbrechung des Gens mushroom body miniature (mbm) tragen. Diese mbm-Nullmutation, genannt mbmSH1819, ist homozygot letal während des Puppenstadiums. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass das nucleoläre Protein Mbm eine Rolle in der Prozessierung ribosomaler RNA (rRNA), sowie der Translokation des ribosomalen Proteins S6 (RpS6) in Neuroblasten erfüllt und dass seine Transkription durch Myc reguliert wird. Daher wurde geschlussfolgert, dass Mbm die Proliferation von Neuroblasten durch eine Funktion in der Ribosomenbiogenese regulieren könnte. In der vorliegenden Studie wurde das Ziel verfolgt, weitere Hinweise auf diese möglichen Funktionen von Mbm zu finden und die Proteindomänen zu identifizieren, die dafür benötigt werden. Mbm beinhaltet einen Arginin/Glycin-reichen Abschnitt, der ein di-RG sowie ein di-RGG Motiv enthält. Diese beiden Motive wurden zusammen zu Mbms RGG-Box definiert. RGG-Boxen finden sich in vielen Proteinen verschiedener Familien und sie können sich sowohl verstärkend als auch inhibierend auf Protein-RNA- sowie Protein-Protein-Interaktionen auswirken. Somit stellt Mbms RGG-Box einen vielversprechenden Kandidaten dar für eine Proteindomäne, die in die rRNA-Bindung sowie die Translokation von RpS6 involviert ist. Es konnte gezeigt werden, dass Mbm mit deletierter RGG-Box (MbmdRGG) nicht in der Lage ist, die Überlebensfähigkeit und die Neuroblastengröße der Nullmutation mbmSH1819 vollständig zu retten. Des Weiteren benötigt Mbm die RGG-Box, um rRNA in vitro zu binden und in mbmdRGG sowie mbmSH1819 Mutanten konnte eine partielle Delokalisation von RpS6 beobachtet werden. Die korrekte Lokalisation von Mbm selbst scheint auch von der RGG-Box abzuhängen, da MbmdRGG teilweise in den Nukleus delokalisiert ist. Interessanterweise ist außerdem die Proteinsyntheserate in mbmdRGG Mutanten erhöht, was möglicherweise in einer Erhöhung der TOR-Expression begründet ist. Somit könnte Mbm unter bestimmten Bedingungen eine verstärkende Funktion im TOR-Signalweg erfüllen, die durch seine eigene RGG-Box reguliert wird. Des Weiteren sind RGG-Boxen hinsichtlich ihrer Funktion häufig von der Methylierung durch Protein-Arginin-Methyltransferasen (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) abhängig. Mbm könnte innerhalb seiner RGG-Box symmetrisch dimethyliert sein, allerdings sind die Ergebnisse in dieser Hinsicht sehr zweifelhaft. Jedenfalls scheinen Dart1 und Dart5 nicht imstande zu sein, Mbm zu methylieren. Außerdem beinhaltet Mbm zwei Zink-Finger-Motive des C2HC-Typs, die in die Bindung von rRNA involviert sein könnten. Eine vorhergehende Studie konnte zeigen, dass die Mutation der Zink-Finger, mbmZnF, zwar nicht zu einer Veränderung der Neuroblastengröße führt, allerdings, dass MbmZnF ins Zytoplasma delokalisiert vorliegt. In der vorliegenden Studie wurden die mbmZnF Mutanten in die meisten Experimente mit einbezogen. Allerdings sind die Ergebnisse rätselhaft, da mbmZnF-mutierte Larven sogar eine geringere Überlebensrate zeigen als die mbm Nullmutanten und da MbmZnF eine stärkere Bindungsaffinität zu rRNA zeigt als wildtypisches Mbm. Dies weist auf eine unspezifische Interaktion zwischen MbmZnF und einem anderen Protein, RNA oder DNA hin, was einen dominant-negativen Effekt auslösen könnte, indem andere Interaktionspartner gestört werden. Somit gestaltet es sich schwierig, Schlussfolgerungen zur Funktion der Zink-Finger zu ziehen. Zusammengefasst liefert die vorliegende Studie weitere Anhaltspunkte, dass Mbm in der Neuroblastenproliferation sowie der Regulation der Ribosomenbiogenese involviert ist und dass Mbm seine RGG-Box benötigt, um seine Funktionen zu erfüllen. KW - Taufliege KW - Neuroblast KW - Gehirn KW - Entwicklung KW - Drosophila melanogaster KW - brain development KW - neuroblast proliferation KW - mushroom body miniature KW - Gehirnentwicklung KW - Neuroblastenproliferation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199674 ER - TY - THES A1 - Lakovic, Milica T1 - Evolution of animal dispersal: Putting timing in perspective T1 - Evolution von Ausbreitungsstrategien: Die Fitnesskonsequenzen des Zeitpunkts von Emigration N2 - Dispersal is a life-history trait affecting dynamics and persistence of populations; it evolves under various known selective pressures. Theoretical studies on dispersal typically assume 'natal dispersal', where individuals emigrate right after birth. But emigration may also occur during a later moment within a reproductive season ('breeding dispersal'). For example, some female butterflies first deposit eggs in their natal patch before migrating to other site(s) to continue egg-laying there. How breeding compared to natal dispersal influences the evolution of dispersal has not been explored. To close this gap we used an individual-based simulation approach to analyze (i) the evolution of timing of breeding dispersal in annual organisms, (ii) its influence on dispersal (compared to natal dispersal). Furthermore, we tested (iii) its performance in direct evolutionary contest with individuals following a natal dispersal strategy. Our results show that evolution should typically result in lower dispersal under breeding dispersal, especially when costs of dispersal are low and population size is small. By distributing offspring evenly across two patches, breeding dispersal allows reducing direct sibling competition in the next generation whereas natal dispersal can only reduce trans-generational kin competition by producing highly dispersive offspring in each generation. The added benefit of breeding dispersal is most prominent in patches with small population sizes. Finally, the evolutionary contests show that a breeding dispersal strategy would universally out-compete natal dispersal. N2 - Emigration und die daraus resultierende Ausbreitung („dispersal“) ist ein wichtiges Ereignis im Lebenszyklus von Insekten, mit grundlegenden öko-evolutionären Folgen. Fortschreitender globaler Wandel hinterlässt viele Arten in stark fragmentierten Habitaten; der Verbreitungsstrategie kommt deshalb eine Schlüsselrolle im Fortbestehen von Populationen zu. Insekten sind besonders anfällig gegenüber Habitatzerstörungen, da viele von ihnen Spezialisten sind und daher z.B. stark von Präsenz bestimmter Wirtsarten und deren Verteilung abhängen. Zum Schutz dieser Arten ist es folglich entscheidend die Ursachen und Folgen verschiedener Ausbreitungsstrategien zu verstehen. Zudem können Arten mit unterschiedlichen Lebenszyklen spezifische Ausbreitungsstrategien aufweisen. Natale Emigration („natal dispersal“) ist definiert als das Verlassen des Ortes der Geburt, um an einem neuen Ort zu reproduzieren, während „breeding dispersal“ Ausbreitung zwischen zwei aufeinanderfolgenden Paarungen bedeutet. Natal dispersal kann während des Larval- und Adultstadiums stattfinden, breeding dispersal nur während des Adultstadiums. Weiterhin ist der Zeitpunkt der Verpaarung, entweder vor oder nach Ausbreitung, besonders wichtig für Weibchen, die nicht nur die eigenen Gene transportieren, sondern eventuell auch die eines verpaarten Männchens. Es ist eindeutig, dass sich Genfluss und ökoevolutionäre Dynamik zwischen diesen Ausbreitungsstrategien unterscheiden. Schließlich erhielt nformationsverarbeitung durch Insekten und dessen Rolle in emigrationsbezogenen Entscheidungen in jüngster Zeit viel Aufmerksamkeit. Dennoch wurde der Zeitraum der Informationsbeschaffung (z.B. während des Larven- oder Adultstadiums) und folglich die Verfügbarkeit von Information zum Zeitpunkt der Emigration von Theoretikern und Empirikern größtenteils nicht beachtet. Meine Doktorarbeit liefert theoretische Einsichten in den optimalen Zeitpunkt der Emigration, des Zeitpunktes der Paarung (in Relation zu Emigration) und die Rolle von Informationsbeschaffung in Insekten- Metapopulationen. Mit Individuen basierten Modellen analysierte ich zuerst die Evolution des Emigrationszeitpunktes in Metapopulationen, gefolgt von der Evolution des (optimalen) Emigrations- und Paarungszeitpunktes in Metapopulationen von Insekten. Abschließend untersuchte ich, wie sich die Investition von Zeit in das Sammeln von Informationen auf den Zeitpunkt und die Häufigkeit von Emigration auswirkt. Ergebnisse meiner Thesis zeigen, dass die Vermeidung von Konkurrenz innerhalb der Art eine entscheidende Rolle in der Evolution des Zeitpunktes der Emigration einnimmt; weiterhin konnte ich zeigen, dass Insekten Informationen über die Populationsdichte nutzen können, um daran angepasst Entscheidungen bezüglich ihrer Emigration zu treffen; in heterogener Umwelt bestimmt die Toleranz gegenüber der Habitate die Evolution der Ausbreitungsstrategie und des Paarungszeitpunktes, was folglich die lokal Anpassung innerhalb ganzer Landschaften bestimmt. Meine Thesis bietet neue Einsichten in die Evolution von Ausbreitung, insbesondere auf den richtigen Zeitpunkt und die Reihenfolge von Emigration, Verpaarung und dem Sammeln von Informationen. Dieser Aspekt des Timings wurde bisher von theoretischen und empirischen Ökologen größtenteils ignoriert. Um die Populationsdynamik und die Ausbreitung einer Art verstehen zu können, ist es essentiell den Lebenszyklus und die Zeitpunkte der wichtigsten Lebensereignisse (Verbreitung, Reproduktion) zu kennen. Dies ist zwingend nötig, wenn eine erfolgreiche Umsetzung von Naturschutzmaßnahmen (z.B. Wiedereinführung von Arten) oder biologischer Schädlingsbekämpfung (z.B. Einführung von Prädatoren zur Bekämpfung von Schädlingen) angestrebt wird. KW - dispersal timing KW - metapopulation KW - individual-based simulation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154522 ER - TY - THES A1 - Castillo Cajas, Ruth T1 - Evolution and diversity of cuticular hydrocarbon profiles of cuckoo wasps T1 - Evolution und Diversität der Kohlenwasserstoffprofile der Goldwespen N2 - Cuticular hydrocarbons (CHC) abound on the surface of arthropods. In spite of their simple structure (molecules of carbon and hydrogen atoms), they provide pivotal functions in insects: their hydrophobic properties confer the insects a means to regulate water balance and avoid desiccation, whereas their diversity has enhanced their use as signals and cues in a wide range of communication and recognition processes. Although the study of CHC in insects over the past two decades has provided great insight into the wide range of functions they play, there is still a gap in understanding how they diversify and evolve. In this thesis, I have used members of the family Chrysididae to explore patterns of diversification of CHC. Most of the species of cuckoo wasps in this study are specialized parasitoids or kleptoparasites of mainly solitary hymenopteran hosts. Other hosts of the family include butterflies or stick insects. Cuckoo wasps are a particular interesting model to study the evolution of cuticular hydrocarbons because of their chemical adaptations that allow them to remain unrecognized by their hosts. Chemical insignificance (the reduction of the total amount of CHC on the cuticle) and chemical mimicry (the de novo production of CHC profiles resembling those of their female host) have been described in some representatives of the family and unpublished evidence suggests chemical deception is widespread in Chrysididae (Chapter 2). Nonetheless, to trace the evolution of any trait of interest, a reliable phylogenetic reconstruction of the family is required. Therefore, the first study of this thesis constitutes the largest and to-date most reliable phylogenetic reconstruction of the family Chrysididae, which includes representatives of 186 species of cuckoo wasps. While the results of this phylogenetic reconstruction are consistent with previous ideas on the relationships of subfamilies and tribes, it shows the existence of several non-monophyletic genera (Chapter 3). CHC are involved in intraspecific recognition, often acting as contact sex pheromones. Nevertheless, it is not yet understood to what extent CHC profiles differ between the two sexes and whether some compound classes are more prevalent in one or the other sex. So far, no comparison of CHC profiles of males and females has been done for more than a dozen of related species. In Chapter 4, I describe and compare CHC profiles of females and males of 58 species of cuckoo wasps in order to evaluate whether and to what extent CHC profiles of these species differ between the sexes. I demonstrated that CHC profiles of cuckoo wasps are frequently (more than 90% of the species analyzed) and strongly dimorphic (both sexes of a given species tend to produce very different CHC compounds). Methyl-branched compounds tend to be more prevalent in males (especially dimethyl-branched compounds) and unsaturated compounds prevail in females. Moreover, a sex-specific pattern in the distribution of the double bond position of alkenes was evident: internal double bond positions (> 11) occur predominantly in males, whereas alkenes with the doublé bond at position 9 were more abundant and frequent in females (Chapter4). In Chapter5, I investigated how CHC profiles of cuckoo wasps differ across species. Are CHC profiles of cuckoo wasps species-specific, enabling their use as cues for species recognition? How do CHC profiles resemble phylogenetic relatedness? In Chapter 5, I try to answer these questions by comparing CHC profiles of 59 species of cuckoo wasps. CHC profiles of cuckoo wasps are shown to be species (and sex-) specific. I show that CHC profiles are useful as a complementary tool to help delimiting taxonomically difficult sibling species. Moreover, the evaluation of CHC profiles of five commonly occurring species within a genus, showed little or no geographical variation. However, CHC profiles of closely related species may differ strongly among each other, not being useful to track the evolutionary history of species (Chapter 5). Sexual selection is generally credited for generating striking sexual dimorphism by causing changes in male traits. Most often, sexual selection has a stronger effect on males, who compete for access to and may be selected by females, thus male traits may rapidly evolve. Nevertheless, in cuckoo wasps, it appears that it is the female sex the one evolving faster changes, with females of very closely related species showing extremely divergent profiles. One plausible reason for this disparity is that natural selection acting on female’s CHC profiles may be stronger than sexual selection on males (Chapter 6). Since females of cuckoo wasps are most probably engaged in an evolutionary arms race with their female hosts, CHC profiles of female cuckoo wasps are likely rapidly evolving, thus explaining part of the strong observed sexual dimorphism of CHC (Chapter 6). In fact, Chapter 7 shows evidence of a possible ongoing evolutionary arms race between five cuckoo wasps of the genus Hedychrum and their hosts. Hedychrum species parasitize either Coleoptera-hunting or Hymenoptera-hunting digger wasps. Since the coleopteran prey of the former digger wasps is naturally better protected against fungus infestation, these wasps do not embalm their prey with alkene-enriched secretions as do the Hymenoptera-hunting digger wasps. Thus, Coleoptera-hunting digger wasps can apparently diversify their profiles to escape chemical mimicry. Interestingly, only female cuckoo wasps of these hosts have started producing the same compound classes and even the same CHC compounds as those of their hosts. Male cuckoo wasps, however retain an alkene-enriched CHC profile that reflects the molecular phylogeny of the genus (Chapter 7). Whereas, a larger number of parasite-host comparisons may be needed to further conclude that an arms race between cuckoo wasps and their hosts is capable of generating sexual dimorphism of cuckoo wasps, this thesis constitutes the first effort towards this, providing a starting point for further studies. Finally, I provide some methodological tools that may help in speeding up the sometimes cumbersome process of analyzing and identifying CHC profiles. One of the most time-demanding steps in the processing of CHC data is the alignment of CHC chromatograms. This process is often done manually, because alignment programs are mostly designed for metabolomics or are just recently being developed. I analyzed CHC profiles using a combined approach with two freely available programs. I used AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, http://chemdata.nist.gov/mass-spc/amdis/) to deconvolute and automatically identify all CHC of interest present in a chromatogram. I then developed a series of R scripts to correct for potential, unavoidable errors while processing CHC chromatograms with AMDIS. Chapter 8 explains this procedure. In the next chapter, I developed a program that helps in the identification of one commonly occurring class of hydrocarbons. The limited number of linear alkanes (only one per carbon atom) and their characteristic diagnostic ion allows a rapid and unambigous identification of these substances. In opposition, unsaturated and methyl-branched compounds are more difficult to identify, as a result of the much larger diversity of existing compounds. To identify unsaturated compounds a derivatization is necessary to determine the position of the double bond. Methyl-branched alkanes, however can be identified from the original chromatogram if their diagnostic ions are known. Nonetheless, polymethyl-branched alkanes (e.g., compounds with two or more methyl groups along the chain) are often difficult to identify, because they may appear in mixes (e.g., 3,7 diMeC27 and 3,9 diMeC27), and tables containing the diagnostic ions are not easily available. Therefore, I developed a program that creates a table with all possiblemethyl-branched compounds containing up to 4 methyl groups, and that provides their diagnostic ions and a calculated retention index. This may allow a much faster identification of the methyl-branched compound a researcher is dealing with, without having to lose time in the tedious calculations by hand. The program is able to correctly identify, or at least, greatly reduce the number of possible options for the identification of an unknown methyl-branched compound. Thus, using this tool, most methyl-branched compounds can be readily identified (Chapter 9). This thesis ends with a general discussion (Chapter 10). Overall, this work provides a comprehensive overview of the diversity of cuticular hydrocarbons of cuckoo wasps. The analyses presented here shed light on the emergence and evolution of interspecific diversity and intraspecific sexual dimorphism of CHC profiles. In addition, two technical methods have been developed that could greatly facilitate the CHC analysis of insects. N2 - Kutikulare Kohlenwasserstoffe (engl. „cuticular hydrocarbons“, CHC) sind Substanzen, die wir in größeren Mengen auf der Körperoberfläche von Arthropoden finden. Diese Moleküle aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen haben trotz ihrer einfachen Struktur entscheidende Funktionen bei Insekten: Ihre wasserabweisende Eigenschaften geben den Insekten die Möglichkeit, den Wasserhaushalt zu regulieren und Austrocknung zu vermeiden. Darüber hinaus ermöglicht die Vielfältigkeit der CHC ihre Verwendung als Signale für eine breite Palette von Kommunikations-und Erkennungsprozessen. Obwohl die Erforschung von CHC in den letzten zwei Jahrzehnten einen großen Einblick in die Funktionen bei Insekten ermöglicht hat, gibt es immer noch Verständnislücken bezüglich der Evolution und Diversifizierung von CHC (Kapitel1). In der vorliegenden Dissertation habe ich anhand verschiedener Arten der Wespen Familie Chrysididae die Diversifizierungsmuster von CHC erforscht. Die meisten der Goldwespenarten in dieser Studie sind spezialisierte Parasitoiden oder Kleptoparasiten von hauptsächlich solitären Hymenopteren. Wirte von anderen Goldwespen sind auch Phasmatodea und Lepidoptera. Goldwespen sind besonders interesante Modellorganismen, um die Evolution von CHC zu untersuchen. Denn sie haben auf ihrer Kutikula chemische Anpassungen an die chemischen Oberflächen ihrer Wirte entwickelt, um bei dem Wirt zu vermeiden, dass ihre eigenen chemischen Signale bei der Eiablage erkannt werden. Für einige Vertreter der Familie Chrysididae wurden chemische Unscheinbarkeit/Unsichtbarkeit („insignificance“) und chemische Mimikry beschrieben. Bei ersterem, handelt es sich um die Reduzierung der Gesamtmenge der CHC auf der Kutikula, bei letzterem um die Nachahmung des CHC Profils des Wirtes. Zudem, deuten unveröffentlichte Daten darauf hin, dass chemische Nachahmung unter den Chrysididae weit verbreitet ist (Kapitel 2). Eine zuverlässige phylogenetische Rekonstruktion der Chrysididae ist notwendig, um die Evolution eines Merkmales, wie z.B. die Ausbildung eines CHC-Profils, zu verfolgen. Daher stellt der erste Teil dieser Arbeit die größte und bis heute zuverlässigste phylogenetische Rekonstruktion der Familie Chrysididae dar, welche Vertreter von 186 Arten von Goldwespen umfasst. Die Ergebnisse dieser Phylogenie stehen in Übereinstimmung mit vorherigen Studien über die Beziehungen zwischen Subfamilien und Triben der Goldwespen. Die Phylogenie deutet jedoch auf die Existenz mehrerer nicht-monophyletischer Gattungen in Chrysididae hin (Kapitel 3). CHC sind an der innerartlichen Erkennung beteiligt und fungieren manchmal als Kontakt-Sex-Pheromonen. Es ist jedoch noch nicht klar, inwieweit die CHC-Profile zwischen den beiden Geschlechtern differieren und ob einige Verbindungsklassen in dem einen Geschlecht häufiger als in dem anderen vorkommen. Bislang gibt es lediglich einen Vergleich von CHC-Profilen zwischen Männchen und Weibchen für weniger alseinDutzendverwandterArten.In Kapitel 4 werden die CHC-Profile von Weibchen und Männchen von 58 Goldwespenarten beschrieben und verglichen, um zu beurteilen, ob und in welchem Ausmaß, sich die CHC-Profile dieser Arten zwischen den Geschlechtern unterscheiden. Ich konnte zeigen, dass CHC-Profile von Goldwespen stark sexuell dimorph sind (Männchen und Weibchen der gleichen Art neigen dazu, sehr unterschiedliche CHC-Verbindungen zu produzieren), und dass dieser Dimorphismus sehr häufig vorkommt (mehr als 90% der untersuchten Arten). Methylverzweigte Verbindungen (insbesondere dimethylverzweigte Verbindungen) waren tendenziel bei Männchen häufiger und bei Weibchen waren ungesättigte Verbindungen häufiger. Darüber hinaus war ein geschlechtsspezifisches Muster in der Verteilung der Doppelbindungsposition von Alkenen offensichtlich: interne Doppelbindungspositionen (>11) treten vorwiegend bei Männchen auf, während Alkene mit der Doppelbindung an Position 9 bei Weibchen häufiger vorkommen (Kapitel 4). Im darauf folgenden Kapitel meiner Arbeit, beschäftige ich mich mit der Frage wie unterschiedlich CHC-Profile von Goldwespen zwischen Arten sind. Sind CHC-Profile artspezifisch, wie es zu erwarten wäre, wenn sie zur Arterkennung dienen? Gibt es Ähnlichkeiten in Bezug auf die phylogenetische Verwandtschaft der Arten? In Kapitel 5, versuche ich diese Fragen zu beantworten, indem ich die CHC-Profile von 59 Goldwespenarten vergleiche. Ich zeige, dass CHC-Profile von Goldwespen art- (und geschlechts-) spezifisch sind, und dass CHC-Profile als ergänzendes Werkzeug zur Abgrenzung von taxonomisch schwierigen Geschwisterarten nützlich sind. Darüber hinaus zeigt die Beurteilung der CHC-ProfilevonfünfhäufigvorkommendeArteninnerhalbeinerGattungwenigoder keine geografische Variation, was bei der Abgrenzung der Arten hilft. Allerdings können CHC-Profile nah verwandter Arten sehr unterschiedlich sein. Somit sind sie kein geeignetes Merkmal um die Evolutionsgeschichte von Arten nachzuvollziehen (Kapitel 5). Im sich daran anschließenden Kapitel, geht es darum, zu verstehen warum CHCProfile der meisten Goldwespenarten so auffallend unterschiedliche CHC-Profile zwischen Geschlechtern aufweisen. Beider sexuellen Selektion wird in der Regel erwartet, dass siedurch Veränderungen männlicher Merkmale zu einem auffälligen Sexualdimorphismus führt. Meistens wirkt die sexuelle Selektion stärker auf die Männchen aus als auf die Weibchen, weil sie um die Weibchen konkurrieren und von den Weibchen ausgewählt werden müssen. Daher wird erwartet, dass männliche Merkmale schneller evolvieren. Dennoch scheint das weibliche Geschlecht bei Goldwespen das Geschlecht zu sein, das schneller evolviert, was sich z. B. dadurch äußert, dass Weibchen sehr nah verwandter Arten extrem divergierende Profile zeigen (Kapitel 6). Ein plausibler Grund für diese Verschiedenheit zwischen den Weibchen nah verwandter Arten ist, dass die natürliche Selektion, die auf die CHC-Profile von Weibchen wirkt, stärker sein kann als die sexuelle Selektion bei den Männchen (Kapitel 6). Da die Weibchen der Goldwespen höchstwahrscheinlich in einem evolutionären Wettrüsten mit ihren weiblichen Wirten stehen, ist es möglich dass die CHC-Profile von Weibchen schnell evolvieren und somit den stark beobachteten sexuellen Dimorphismus von CHC in Goldwespen erklären (Kapitel 6). In Kapitel 7, werden Hinweise auf ein mögliches fortwährendes Wettrüsten zwischen fünf Goldwespenarten der Gattung Hedychrum und ihren Wirten aufgezeigt. Arten dieser Gattung parasitieren entweder Grabwespen die Coleoptera oder Hymenoptera als Nahrung für ihre Nachkommen jagen. Da die Coleoptera-Beute natürlicherweise besser gegen Pilzbefall geschützt ist, balsamieren diese Wespen ihre Beute nicht mit durch Alkene angereicherte Sekrete ein, im Gegensatz zu der anderen Gruppe der Grabwespen, die Hymenopteren als Futter verwerten. Daher diversifizieren Coleoptera-jagende Grabwespen offenbar ihre Profile stärker,um der chemischen Mimikry ihrer Parasitoiden zu entkommen. Interessanterweise haben nur weibliche Goldwespen dieser Coleoptera-jagende Wirte begonnen, die gleichen Substanzklassen und sogar die gleichen CHC-Verbindungen wie die ihrer Wirte zu produzieren. Männliche Goldwespen behalten jedoch ein durch Alkene angereichertes CHC-Profil, das die molekulare Phylogenie der Gattung Hedychrum widerspiegelt. Um jedoch eindeutiger zu beweisen, dass ein Wettrüsten zwischen Goldwespen und ihren Wirten den Geschlechtsdimorphismus von Goldwespen hervorbringt, wäre eine größere Anzahl von Vergleichen zwischen Goldwespen und ihren Wirten nötig. Nichtsdestotrotz ist diese Arbeit ein erster Versuch, den Geschlechtsdimorphismus von CHC in Goldwespen zu erklären und ein Ausgangspunkt für weitere Studien. Abschließend stelle ich einige methodische Werkzeuge vor, die helfen können, den bisher umständlichen Prozess der Analyse und Identifizierung von CHC-Profilen zu beschleunigen. Einer der zeitaufwendigsten Schritte bei der Verarbeitung von CHC Daten ist die Alinierung von CHC-Chromatogrammen. Dieser Prozess wird oft manuell durchgeführt, da Alinierungsprogramme für die Metabolomik konzipiert sind oder gerade erst entwickelt werden. Meine CHC-Profile habe ich mit einem kombinierten Ansatz mit zwei frei verfügbaren Programmen analysiert. Ich benutzte AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System), um die CHC in einem Chromatogramm zu dekonvolutieren und automatisch zu identifizieren. Ich habe weiterhin eine Reihe von R-Skripten entwickelt, um mögliche unvermeidbare Fehler bei der Verarbeitung von CHC-Chromatogrammen mit AMDIS zu korrigieren. In Kapitel 8 wird dieses Verfahren erläutert. Im darauffolgenden Kapitel stelle ich ein Programm vor, das ich für eine erleichterte Identifizierung einer häufig vorkommenden Verbindungsklasse von CHC entwickelt habe. Die begrenzte Anzahl von linearen Alkanen (nur eines pro Kohlenstoffatom) und ihre charakteristischen diagnostischen Ionen erlauben die schnelle und eindeutige Identifizierung dieser Substanzen. Im Gegensatz dazu sind ungesättigte und methylverzweigte Verbindungen auf grund der viel größeren Vielfalt möglicher Verbindungen deutlich schwieriger zu identifizieren. Für die Identifizierung ungesättigter Verbindungen ist eine Derivatisierung notwendig, um die Position der Doppelbindung zu bestimmen. Methylverzweigte Alkane können jedoch theoretisch vom ursprünglichen Chromatogramm unterschieden werden, sofern die diagnostischen Ionen bekannt sind. Trotz alledem sind polymethylverzweigte Alkane (z.B. Verbindungen mit zwei oder mehr Methylgruppen entlang der Kette) oft schwer zu identifizieren, da sie in Mischungen (z. B. 3,7 diMeC27 und 3,9 diMeC27) auftreten können. Ihre diagnostische Ionen müssen entweder berechnet werden oder in Tabellen, die nicht leicht verfügbar sind, gesucht werden. Ich entwickelte daher ein kleines Programm, das eine Tabelle erstellt mit allen möglichen methylverzweigten Verbindungen mit bis zu 4 Methylgruppen sowie deren diagnostischen Ionen und einem berechneten Retentionsindex. Dies erlaubt eine viel schnellere Identifizierung der richtigen methylverzweigten Verbindung, ohne dass ein Wissenschaflter Zeit für die mühsamen Berechnungen von Hand verlieren muss. Das Programm ist in der Lage, die Anzahl möglicher Optionen einer unbekannten methylverzweigten Verbindung korrekt zu nennen oder zumindest die Auswahl stark einzugrenzen und damit die Identifikation der Substanz stark zu erleichtern. Es ist daher zu erwarten, dass mit diesem Werkzeug die meisten methylverzweigten Verbindungen leicht identifiziert werden können (Kapitel9). Ich schließe meiner Dissertation mit einer allgemeinen Diskussion (Kapitel 10). Die vorliegende Arbeit stellt einen umfangreichen Überblick der Diversität von kutikularen Kohlenwasserstoffen von Goldwespen dar. Dieser Einblick kann uns helfen, die Bedeutung von CHC-Profilen für Arthropoden im Allgemeinen besser zu verstehen. Konkret beleuchten die durchgeführten Analysen die Entstehung und Evolution von interspezifischer Diverstität bzw. Ähnlichkeiten von CHC-Profilen und intraspezifischen sexuellen Dimorphismus von CHC-Profilen. Darüber hinaus wurden technische Methoden entwickelt, die zukünftige Arbeiten zu CHC Analysen von verschiedenen Insekten stark erleichtern könnten. KW - Chrysididae KW - Cuticular hydrocarbons Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173418 ER -