TY  - THES
A1  - Knaf, Tobias
T1  - Spezifische Bindung von Aluminium und Eisen an den kationenselektiven Kanal MppA von Microthrix parvicella
T1  - Specific binding of aluminium and iron ions to a cation-selective cell wall channel of Microthrix parvicella
N2  - Schwermetallsalze wie beispielsweise Aluminium- oder Eisensalze werden in der Abwasserbehandlung zur Prävention und Bekämpfung von Blähschlamm, Schwimmschlamm und Schaumbildung verwendet. Dadurch kann eine Verbesserung der Schlammabsetzeigenschaften im Nachklärbecken erreicht werden. Übermäßiges Wachstum des grampositiven Bakteriums Microthrix parvicella gilt dabei als Hauptursache von Schlammabsetzproblemen und kann ebenfalls durch die Dosierung von schwermetallhaltigen Flockungs- und Fällungsmitteln vermieden werden. Da diese Verbindungen in Wasser gelöst sind, müssen sie die Außenmembran bestimmter Bakterien passieren. Nur der Einbau von wassergefüllten Kanälen erlaubt den gelösten Salzen das Passieren der durch hydrophobe Fettsäuren aufgebauten zusätzlichen Permeabilitätsbarriere. In dieser Arbeit wurden wassergefüllten Kanäle von Microthrix parvicella isoliert, aufgereinigt und mit Hilfe der Black-Lipid-Bilayer-Technik charakterisiert. Ergänzend wurde der Einfluss und der Durchlass der Flockungs- und Fällungsmittel in Titrationsexperimenten untersucht. Dabei konnte ein wassergefüllter Kanal, der die Bezeichnung MppA erhielt, gefunden werden, welcher eine Leitfähigkeit von 600 pS in 1 M Kaliumchlorid und eine Bindestelle für mehrwertige Kationen wie Eisen oder Aluminium zeigte. Die Bindung dieser mehrwertigen Kationen führte zu einer Änderung der Ionenselektivität. Ohne Bindung mehrwertiger Kationen zeigte der Kanal eine leichte Kationenselektivität. Nach der Bindung wechselte die Ionenselektivität zu einer Anionenselektivität, was auf eine spezifische Ladungsverteilung im Kanal hinweist. Der Kanal MppA zeigte gleichwertige Bindekonstanten für Aluminium und Eisen. Beide Metalle werden als Fällungs- und Flockungsmittel in Kläranlagen zum Verhindern von Schwimm- und Blähschlamm verwendet. Frühere Arbeiten offenbarten bereits, dass hauptsächlich der Aluminiumanteil entscheidend für die Wirkung dieser Mittel ist. Diese Beobachtungen in Verbindung mit den Ergebnissen dieser Arbeit führten zu der Annahme, dass Eisen und Aluminium eine kompetitive Bindung an der Bindestelle im Kanalinneren zeigen könnten. So könnte in manchen Fällen Aluminium anstelle des sonst als Spurenelement benötigten Eisens durch den Kanal transportiert werden und in Enzym-Substrat-Komplexen eingebaut werden. Dadurch könnten toxische Effekte auftreten, die letztlich ein Absterben des Organismus zur Folge hätten. Für die Bindung der Metallsalze konnte zusätzlich eine pH-Abhängigkeit beobachtet werden. Nur eine Zugabe von Metalllösungen mit einem pH-Wert kleiner 6 führte zu einer Bindung im Kanal. Die Zugabe von Metalllösungen mit einem pH-Wert größer 6 zeigte keinen Effekt auf die Leitfähigkeit des Kanals. Diese Ergebnisse bestätigen die auf Kläranlagen und in vorherigen Arbeiten getätigte Beobachtung, dass der pH-Wert für die Wirksamkeit der Verbindungen entscheidend ist. In dieser Arbeit konnte jedoch erstmals gezeigt werden, dass der pH-Wert direkt die Bindung der Metallsalze beeinflusst.
N2  - Heavy metal salts like aluminium or iron compounds are used in waste water treatment plants to prevent bulking sludge, floating sludge and foaming and for this reason to enhance the settleability of the sludge flocs in the secondary clarifier. Excessive growth of the Gram-positive bacterium Microthrix parvicella is one of the main origins of sludge settlement problems and can be avoided by the dosage of heavy metal salts containing flocculation and precipitations agents as well. As these agents are dissolved in water, they have to pass the outer membrane of certain bacteria. Only the incorporation of water-filled channels into the membrane allows the solutes to pass this second permeability barrier build out of hydrophobic fatty acids. In this study, the water-filled channels of Microthrix parvicella were characterized with black lipid bilayer assays and the influence and the pass through of the flocculation and precipitations agents were investigated in titration experiments. A water-filled channel called MppA with a conductance of 600 pS in 1 M potassium chloride could be found which has a binding site for polyvalent cations like iron or aluminium. The binding of polyvalent cations to the binding site inside the channel led to a switch in the ion selectivity. Without binding of polyvalent cations, the channel showed slight cation selectivity. After the binding the selectivity switched to an anion selectivity indicating a special charge distribution in the channel. The channel MppA which was found in Microthrix parvicella showed same binding constants for aluminium and iron. Both metals are used as precipitation and flocculation agents and to prevent bulking sludge and floating sludge in waste water treatment plants. Other former works revealed already that only the aluminium part is decisive for the effect of these agents. These observations in addition to the results of this work led to the suggestion that iron and aluminium show a competitive binding to the binding site. In some cases aluminium might be transported through the channel and incorporated to some enzyme-substrate-complexes instead of the iron which usually acts as a micronutrient. This could lead to toxic effects and the dieback of the organism. A pH-dependency could be found for the binding of the metal salts. Only the addition of metal solutions with a pH lower than 6 led to a binding. The addition of solutions with pH-values higher than 6 showed no effect to the conductivity of the channel. These results confirm the observation done on waste water treatment plants and in other former studies that the pH value is generally decisive for the effect of the agents. But this work could show for the first time that the pH directly affects the binding of the metal salts.
KW  - Aluminium
KW  - Eisen
KW  - Porin
KW  - Microthrix parvicella
KW  - MppA
KW  - Zellwandkanal
KW  - aluminium
KW  - iron
KW  - cell wall channel
KW  - porin
KW  - Microthrix parvicella
KW  - Fadenbakterien
KW  - Abwasserreinigung
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77011
ER  - 
TY  - THES
A1  - Barth, Enrico
T1  - Study of the properties of channel-forming proteins of the cell walls of different Corynebacteriae
T1  - Untersuchung der Eigenschaften kanalbildender Proteine aus den Zellwänden verschiedener Corynebacteriae
N2  - Die Gattung Corynebacterium gehört, neben Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus und weiteren nahverwandten Gattungen, dem unverwechselbaren, gattungsübergreifenden Taxon Mycolata an. Viele Spezies aus dieser heterogenen Gruppe Mycolsäure-haltiger Actinomyceten sind entweder aufgrund ihrer medizinischen oder ihrer biotechnologischen Bedeutung bekannt. Beispielsweise zählen Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae und Nocardia farcinica, welche weltweit Verursacher besonders gefährlicher bakterieller Infektionskrankheiten sind, zu dieser ungewöhnlichen Gruppe Gram-positiver Bakterien. Ebenso bedeutsam sind einige apathogene Mycolata-Arten, die industrielle Anwendung finden. Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium efficiens sind leistungsfähige Bakterien, die zum Beispiel in der Produktion des Geschmacksverstärkers Glutamat und des Tierfuttermittelzusatzes Lysin eingesetzt werden, während verschiedene Rhodococcus Spezies Anwendung bei der Herstellung von Acrylsäuren finden. Die Zellwand der Mycolata zeigt, verglichen mit der klassischer Gram-positiver Bakterien, eine außergewöhnliche Zusammensetzung und Struktur auf. Abgesehen von einem Arabinogalactan-Peptidoglycan-Komplex enthält die Zellwand der meisten Actinomyceten einen hohen Anteil an Mycolsäuren. Diese langkettigen, verzweigten Fettsäuren formen eine, mit der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien vergleichbare, stark undurchlässige, hydrophobe äußere Hülle, welche die Grundlage der außergewöhnlichen Medikamentenresistenz bei den Mycolata bildet. Wie die äußere Membran Gram-negativer Bakterien enthält die Zellwand der Mycolata porenformende Proteine, die den Durchlass hydrophiler Substanzen gestatten. Indem sie eine Verbindung zwischen dem Zellinneren und der Umwelt, in der das Bakterium lebt, schaffen und einen kontrollierten Austausch zwischen beiden ermöglichen, tragen die Kanalproteine entscheidend zur Funktion der bakteriellen Zellhülle bei. Das Ziel dieser Arbeit war das Wissen über Zellwandkanäle in Corynebakterien zu erweitern. Deshalb untersuchten wir PorA und PorH Proteine, die basierend auf früheren Studien Zellwandkanälen in C. glutamicum, C. efficiens und Corynebacterium callunae zugeordnet werden, um ungeklärten Fragen nachzugehen und um Wissen über deren Struktur zu erlangen. Ferner inspizierten wir Zellwände pathogener Corynebakterien, genauer gesagt von Corynebacterium diphtheriae und Corynebacterium jeikeium, um herauszufinden, ob diese Spezies wie ihre harmlosen Verwandten Kanalproteine besitzen. In dieser Arbeit wiesen wir mit C. diphtheriae und C. jeikeium in zwei weiteren Corynebacterium-Arten offene, mit Wasser gefüllte Zellwandkanäle nach. Des Weiteren stellten wir fest, dass sich die Zellwandkanäle von C. glutamicum, C. efficiens und C. diphtheriae aus zwei Proteinen zusammensetzen, einem zugehörig zu der Gruppe der PorH Proteine und einem weiteren aus der Gruppe der PorA Proteine. Diese heteromere Struktur von Zellwandkanälen bei Corynebakterien stellt ein Novum für Zellwandkanäle bei den Mycolata dar. Indessen besteht der Zellwandkanal von C. jeikeium aus nur einem Protein, CjPorA, angeordnet zu einem Oligomer. Obgleich das Molekulargewicht dieses Proteins (4 kDa) mit dem von PorH und PorA Proteinen vergleichbar ist (5-7 kDa), weißt seine Primärsequenz keine eindeutige Homologie zu diesen auf. Dennoch deutet vieles auf eine Verwandtschaft zwischen CjPorA und PorH/PorA Proteinen hin, da das Gen jk0268, welches für CjPorA kodiert, sich in einer Region des C. jeikeium Chromosoms befindet, die der Genomregion entspricht in welcher die porH/porA Gene der anderen Corynebakterien lokalisiert sind. Dies lässt vermuten, dass jk0268 (welches für den homomeren Zellwandkanal in C. jeikeium kodiert) und die porH/porA Gene von C. glutamicum, C. efficiens und C. diphtheriae (die einen heteromeren Zellwandkanal kodieren) wahrscheinlich Nachkommen eines gemeinsamen Vorläufergens sind. Phylogenetische Analysen der Gattung Corynebacterium unterstützen diese Annahme. Desweitern legen sie nahe, dass die hier untersuchten Zellwandkanäle innerhalb dieser Gattung wahrscheinlich weit verbreitet sind. Ein umfassendes Wissen über Zellwandkanäle, denen beim Transport gelöster Stoffe über die äußere Membran in Corynebakterien und anderen Mitgliedern der Mycolata eine entscheidende Rolle zukommt, könnte von großem wirtschaftlichem und medizinischem Nutzen sein.
N2  - The genus Corynebacterium belongs, together with Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus and further closely related genera, to the distinctive suprageneric taxon mycolata. Many species within this diverse group of mycolic acid containing actinomycetes are known either because of their medical or biotechnological relevance. For instance, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae and Nocardia farcinica, causer of most dangerous bacterial infectious diseases world-wide, are among this exceptional group of Gram-positive bacteria. Likewise of importance are some harmless mycolata species which find use in industrial settings. Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium efficiens are, e.g., potent producers of the flavour enhancer glutamate and the animal feed additive lysine, while several Rhodococcus species are applied in the production of acrylic acids. The cell wall of mycolata species, compared with that of Gram-positive bacteria, exhibits an unusual composition and organization. Besides an arabinogalactan-peptidoglycan complex, the cell walls of most actinomycetes contain large amounts of mycolic acids. Comparable to the outer membrane of Gram-negative bacteria, these long-chained branched fatty acids form a highly impermeable hydrophobic outer layer which provides the basis of the exceptional drug resistance of mycolata species. Like the outer membrane of Gram-negative bacteria, the cell wall of mycolata contains channel-forming proteins that allow the passage of hydrophilic solutes. By permitting and controlling the exchange and communication between the interior of the cell and the environment in which the bacterium lives, the channels play an important role for the function of the bacterial cell envelope. This thesis aimed to extend our knowledge about cell wall channels in corynebacteria. For this purpose, we examined PorA and PorH proteins that have been associated by previous studies with cell wall pores in C. glutamicum, C. efficiens and Corynebacterium callunae in order to resolve unanswered questions and to gain structural knowledge. We also investigated cell walls of pathogenic corynebacteria, in particular of Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium jeikeium, to investigate if these species possessed channels as is the case with their harmless relatives. In this work we provided evidence for the existence of large and water-filled cell wall channels in C. diphtheriae and C. jeikeium. Moreover, we demonstrated that the major cell wall channels of C. glutamicum, C. efficiens and C. diphtheriae consist of two distinctive polypeptides; one of whom belongs to the class of PorH proteins and the other to the class of PorA proteins. This heteromeric structure of channels of corynebacteria represents a novelty for channels of the mycolata. In contrast, the C. jeikeium channel is solely constituted by a single protein, CjPorA, arranged as an oligomer. Although the molecular mass of this protein (4kDa) is comparable to those of PorH and PorA proteins (5-7 kDa), it shares no distinctive homology in its primary sequence with them. However, there is evidence for relationship between CjPorA and PorH/PorA proteins because the gene jk0268, coding for CjPorA, is localized in a chromosomal region of C. jeikeium that corresponds to the genomic region containing the porH/porA genes in the other corynebacteria. This suggests that jk0268 (coding for the homomeric cell wall channel in C. jeikeium) and the porH/porA genes of C. glutamicum, C. efficiens and C. diphtheriae (coding for heteromeric cell wall channels) are presumably descendants of a common ancestor gene. This assumption gets support from data on phylogenetic analysis of the genus Corynebacterium. Moreover, these data suggest that the here investigated cell wall channels are presumably widespread within this genus. A profound knowledge of cell wall channels, building the main passage of solutes through the outer mycolate membrane in corynebacteria and other members of the mycolata, can be of great economical and medical value.
KW  - Zellwand
KW  - Corynebacterium
KW  - Corynebacterium callunae
KW  - Corynebacterium diphtheriae
KW  - Corynebacterium efficiens
KW  - Corynebacterium glutamicum
KW  - Porin
KW  - Corynebacterium jeikeium
KW  - C. jeikeium
KW  - C. glutamicum
KW  - C. efficiens
KW  - C. callunae
KW  - C. diphtheriae
KW  - Mykolsäuren
KW  - Lipid Bilayer Membran
KW  - Corynebacterium jeikeium
KW  - C. jeikeium
KW  - C. glutamicum
KW  - C. efficiens
KW  - C. callunae
KW  - C. diphtheriae
KW  - Mycolic acid
KW  - Lipid Bilayer Membrane
KW  - porin
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36325
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stegmeier, Johannes Friedrich
T1  - Study of Omp85 Family Proteins YaeT and YtfM and Multidrug Export Machineries in Escherichia coli
T1  - Charakterisierung von YaeT und YtfM sowie Multidrugefflux Systemen in Escherichia coli
N2  - In this study the Omp85 family proteins YaeT and YtfM of Escherichia coli were investigated by using biochemical and electrophysiological methods as well as bioinformatical and structural analysis. In addition, knock-out strains were constructed to further study the relevance of these proteins in vivo. The prediction that Omp85 proteins are composed of two domains, a periplasmic amino-terminal POTRA (polypeptide translocation associated) domain and a carboxy-terminal domain anchoring these proteins in the outer membrane, was confirmed by the construction of mutants. It could be shown that the carboxy-terminal part of the proteins is able to insert into the outer bacterial membrane, even if the POTRA domain is removed. Furthermore, pore-forming activity in the black-lipid bilayer was observed for both full-length proteins as well as their carboxy-terminal membrane located parts. The channels formed by both proteins in the black lipid bilayer showed variable single channel conductance states rather than a defined value for conductance. In 1M KCl, e.g. YaeT forms pores with a channel conductance of 100 to 600 pS containing a most abundant value at 400 pS. This variability is at least reasonable for YaeT due to a prerequisite flexibility of its channel for OMP insertion. YaeT was identified to form a cation selective, YtfM an anion selective channel, which is less pH dependent than YaeT. Another feature of the YaeT channel is that its selectivity and conductance is influenced by charged detergent molecules indicating an accumulation of these molecules in hydrophobic pockets inside the compact channel. YaeT revealed heat-modifiable mobility in SDS-PAGE which is characteristic for β-barrel OMPs, whereas YtfM did not show this behaviour. This result could be explained by sequence alignment and structural comparison of YaeT and YtfM via CD and FTIR spectra displaying much higher β-strand content for the carboxy-terminal part of YaeT compared to YtfM. Since the carboxy-terminal parts were shown to have pore forming ability and are inserted in the OM in vivo, the substitution of the essential protein YaeT by its carboxy-terminal mutant was attempted in a yaeT knock-out strain. The carboxy-terminal half of YaeT was not sufficient to compensate depletion of the full-length protein indicating an important role of the amino-terminus for cell viability. In contrary, YtfM is shown to be a non-essential protein and lack of YtfM had no effects on the composition and integrity of the OM. However, chromosomal deletion of ytfM remarkably reduced the growth rate of cells. This study provides the first detailed investigation of the structure of YaeT and describes its electrophysiological behaviour, which could be a basis for further studies of YaeT and its substrate proteins. Furthermore, YtfM was characterised and its in vivo function was investigated revealing YtfM as the second Omp85 family protein of importance in E. coli. In a second part of this study assembly and function of multidrug efflux pumps were investigated. Drug efflux pumps are tripartite export machineries in the cell envelope of Gram-negative bacteria conferring multidrug resistance and therefore causing severe problems for medical treatment of diseases. Protein structures of all three efflux pump components are solved, but the exact interaction sites are still unknown. Assembly of a hybrid exporter system composed of the Pseudomonas aeruginosa channel tunnel OprM, the E. coli adaptor protein AcrA and its associated transporter AcrB could be shown by chemical cross-linking, even though this efflux pump is not functional. Exchange of the hairpin domain of AcrA by the corresponding hairpin from the adaptor protein MexA of P. aeruginosa restored functionality tested by antibiotic sensitivity assays. This shows the importance of the MexA hairpin domain for functional interaction with the OprM channel tunnel. Interestingly, the hybrid protein was also able to assemble with TolC as outer membrane component to form a functional efflux pump indicating a higher flexibility of TolC compared to OprM concerning interaction partners. Based on these results, an interaction model of the hairpin domain and the channel tunnel on molecular level for AcrA and TolC as well as MexA and OprM, respectively, is presented. This model provides a basis for directed mutagenesis to reveal the exact contact sites of the hairpin of the adapter protein and the outer membrane component
N2  - In dieser Arbeit wurden die Omp85 Familienproteine YaeT und YtfM aus E. coli biochemisch und elektrophysiologisch charakterisiert, sowie bioinformatisch und strukturell analysiert. Des Weiteren wurden Bakterienstämme mit chromosomalen Deletionen der beiden zugehörigen Gene hergestellt, um die Relevanz der beiden Proteine in vivo zu untersuchen. Für Omp85 aus N. meningitdis wurde vorhergesagt, dass das Protein aus zwei strukturellen Untereinheiten besteht, einer periplasmatischen amino-terminalen Domäne, der POTRA – („polypeptide-transport-associated“ -) Domäne und einer carboxy-terminalen Domäne, die das Protein in der Außenmembran verankert. Diese Vorhersagen wurden für die Omp85 Homologen YaeT und YtfM mit Hilfe von geeigneten Mutanten bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass der carboxy-terminale Teil beider Proteine, YaeT und YtfM, auch bei Fehlen der amino-terminalen Domäne noch in der äußeren Membran zu finden ist. Bestätigt wurde dieses Ergebnis durch „Black Lipid Bilayer“ Experimente. Für beide nativen Proteine, sowie deren carboxy-terminale Mutanten, konnte der Einbau in eine künstliche Membran und Porenbildung gezeigt werden. Anders als bei herkömmlichen Porinen, die normalerweise eine sehr gut definierte Leitfähigkeit haben, musste man den beiden untersuchten Proteinen eher eine Leitfähigkeitsspanne zuordnen. Bei Messungen in 1M KCl wurden für YaeT beispielsweise Poren mit einer Leitfähigkeit von 100 bis 600 pS aufgezeichnet, wobei 400 pS der am häufigsten vorkommende Wert ist. Diese Variabilität ist bei YaeT zumindest dadurch begründbar, dass für den Einbau anderer Proteine in die äußere Membran ein flexibler Kanal mit einer möglichen lateralen Öffnung notwendig ist. Die YaeT Poren sind kationenselektiv, für YtfM wurde ein anionenselektiver Kanal nachgewiesen, welcher zusätzlich im Vergleich zu YaeT weniger pH anfällig ist. Weiterhin haben die elektrophysiologischen Experimente gezeigt, dass die Ionenselektivität und Leitfähigkeit von YaeT durch Detergenzmoleküle beeinflussbar ist. Dies lässt hydrophobe Bereiche im Kanalinnern vermuten, an denen sich die Moleküle mit ihrem unpolaren Teil anlagern und dann durch ihre polaren Köpfe die Nettoladungen im Kanalinnern verändern. Mittels Gelelektrophorese konnte für YaeT das typische Laufverhalten von Außenmembranproteinen gezeigt werden. Wenn YaeT ungekocht auf ein SDS-Gel aufgetragen wurde, wanderte es schneller, als wenn man es vorher auf 100°C erhitzte, was für eine kompakte Struktur spricht. Für YtfM wurde dieses Verhalten nicht festgestellt. Die Erklärung für diesen Unterschied lieferten ein Sequenzvergleich beider Proteine, sowie die strukturelle Untersuchung mittels CD- und FTIR-Spektroskopie, welche im Vergleich zu YtfM einen deutlich höheren β-Faltblatt-Anteil für den carboxy-terminalen Teil von YaeT ergaben. Da der carboxy-terminale Teil der Proteine in der Außenmembran zu finden ist und porenformende Aktivität besitzt, wurde versucht, YaeT durch seine carboxy-terminale Mutante in einem Knock-out Stamm zu ersetzen. Dies schlug jedoch fehl, was auf eine bestimmte Funktion der amino-terminalen Hälfte in vivo hindeutet. Im Vergleich zu YaeT ist YtfM kein essentielles Protein und sein Fehlen beeinflusst die Zusammensetzung und die Funktion der äußeren Membran nicht. Die chromosomale Deletion von ytfM führte jedoch zu einer deutlichen Reduktion der Wachstumsrate. Bei den Multidrug Efflux Pumpen AcrAB/TolC und MexAB/OprM sind mittlerweile Strukturen aller drei Pumpenkomponenten bekannt, ihre Interaktionsstellen sind allerdings noch nicht bekannt. Mit einem chemischen „Cross-linker“ konnte der Zusammenbau eines hybriden Exportsystems bestehend aus der Außenmembrankomponente OprM aus Pseudomonas aeruginosa, dem Adapterprotein AcrA aus E. coli, sowie dessen zugehörigem Innenmembrantransporter AcrB, nachgewiesen werden. Der Zusammenbau ist insofern erstaunlich, da diese hybride Effluxpumpe nicht funktionell ist. Die Funktionalität dieser Effluxpumpe, nachgewiesen durch Antibiotikasensitivitätstests, konnte jedoch durch den Austausch der „Hairpin“-Domäne von AcrA durch den „Hairpin“ von MexA wieder hergestellt werden. Dieses Ergebnis zeigt deutlich die Wichtigkeit dieser Haarnadelstruktur für die funktionelle Interaktion mit der Außenmembrankomponente OprM. Interessanterweise konnte das hybride Adapterprotein eine funktionelle Effluxpumpe mit TolC als Außenmembrankomponente bilden, was für eine höhere Flexibilität von TolC im Gegensatz zu OprM bezüglich der Interaktionspartner spricht. Aufgrund der oben genannten Ergebnisse wurde ein Interaktionsmodell der „Hairpin“-Domäne von AcrA bzw. MexA mit den Außenmembranproteinen TolC und OprM auf molekularer Ebene erstellt. Dieses Modell kann nun als Vorlage für zielgerichtete Mutationen dienen, um die Interaktionsstellen des Adapterproteins mit der zugehörigen Außenmembrankomponente genau zu beschreiben.
KW  - Escherichia coli
KW  - Porin
KW  - Omp85
KW  - YaeT
KW  - YtfM
KW  - Multidrug Efflux
KW  - Omp85
KW  - YaeT
KW  - YtfM
KW  - Multidrug Efflux
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18171
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hünten, Peter
T1  - Channel-forming proteins in the cell wall of amino acid-producing Corynebacteria
T1  - Kanalbildende Proteine in der Zellwand Aminosäure-produzierender Corynebakterien
N2  - Corynebacterium glutamicum is together with C. callunae and C. efficiens a member of the diverse group of mycolic-acid containing actinomycetes, the mycolata. These bacteria are potent producer of glutamate, lysine and other amino acids on industrial scale. The cell walls of most actinomycetes contain besides an arabinogalactan-peptidoglycan complex large amounts of mycolic acids. This three-layer envelope is called MAP (mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan) complex and it represents a second permeability barrier beside the cytoplasmic membrane similar to the outer membrane of Gram-negative bacteria. In analogy to the situation in the outer membrane of Gram-negative bacteria, channels are present in the mycolic acid layer of the mycobacterial cell wall for the passage of hydrophilic solutes. Molecular studies have provided far-reaching findings on the amino acid flux and its balance in C. glutamicum in general, but the L-glutamate export still remains unknown. The properties of the outer layers, typical of mycolata, seem to be of major importance in this process, and diffusion seems to play a key role for this part of the cell wall. The major aim of this thesis was to identify and study novel channel-forming proteins of the amino acid producers C. glutamicum, C. callunae and C. efficiens. Cell wall extracts of the organisms were investigated and a novel pore-forming protein, named PorH, that is homologue in all three organisms, was detected and characterized. PorHC.glut was isolated from C. glutamicum cells cultivated in minimal medium. The protein was identified in lipid bilayer experiments and purified to homogeneity by fast-protein liquid chromatography across a HiTrap-Q column. The purified protein forms cation-selective channels with a diameter of about 2.2 nm and an average single-channel conductance of about 2.5 nS in 1 M KCl in the lipid bilayer assay. Organic solvent extracts were used to study the permeability properties of the cell wall of C. callunae and C.efficiens. The cell extracts contained channel-forming activity, the corresponding proteins were purified to homogeneity by fast-protein liquid chromatography across a HiTrap-Q column and named PorHC.call and PorHC.eff. Channels formed by PorHC.call are cation-selective with a diameter of about 2.2 nm and an average single-channel conductance of 3 nS, whereas PorHC.eff forms slightly anion selective channels with an average single-channel conductance of 2.3 nS in 1 M KCl in the lipid bilayer assay. The PorH proteins were partially sequenced and the corresponding genes, which were designated as porH, were identified in the published genome sequence of C. glutamicum and C. efficiens. The chromosome of C. callunae is not sequenced, but PorHC.call shows a high homology to PorHC.eff and PorHC.glut. The proteins have no N-terminal extension, only the inducer methionine, which suggests that secretion of the proteins could be very similar to that of PorAC.glut of C. glutamicum. PorHC.glut is coded in the bacterial chromosome by a gene that is localized in the vincinity of the porAC.glut gene, within a putative operon formed by 13 genes that are encoded by the minus strand. Both porins are cotranscribed and coexist in the cell wall, which was demonstrated in RT-PCR and immunological detection experiments. The arrangement of porHC.glut and porAC.glut on the chromosome is similar to that of porBC.glut and porCC.glut and it was found that PorAC.glut, PorHC.glut, PorBC.glut and PorCC.glut coexist in the cell wall of C. glutamicum. The molecular mass of about 6 kDa of the PorH channel forming proteins is rather small and suggests that the cell wall channels are formed by oligomers. A possibly hexameric form was demonstrated for PorHC.glut in Western blot analysis with anti- PorHC.glut antibodies. Secondary structure predictions for PorHC.glut, PorHC.call and PorHC.eff predict that a stretch of about 42 amino acids of PorHC.glut and 28 amino acids of PorHC.call and PorHC.eff forms amphipathic -helices with a total length of 6.3 nm and 4.2 nm respectively. This should be sufficient to cross the mycolic acid layer. Another objective of this work was to establish an heterologous expression system for corynebacterial channel-forming proteins, to investigate the channel-forming properties of the up to now only hypothetical porins PorA, PorB, PorC from C. efficiens and PorC from C. glutamicum. We could demonstrate with recombinant expression experiments in E. coli that porBC.eff and porCC.eff encode for channel-forming proteins. They are, like PorBC.glut, anion-selective with a similar single-channel conductance of 1 nS in 1 M KCl.
N2  - C. glutamicum gehört zusammen mit C. efficiens und C. callunae zu den bedeutensten Aminosäureproduzenten weltweit. Sie sind Mitglieder der heterogenen Gruppe der mykolsäurehaltigen Aktinomyceten, den Mycolaten. Die Zellwände der meisten Aktinomyceten weisen neben einem Arabinogalactan-Peptidoglycankomplex große Mengen an Mycolsäuren auf. Diese MAP(Mycolyl-Arabinogalactan-Peptidoglycan) genannte dreischichtige Hülle stellt neben der Cytoplasmamembran eine zweite Permeabilitätsbarriere dar, und übernimmt somit die gleiche Funktion wie die äußere Membran der Gram-negativen Bakterien was zur Folge hat, dass für den Transport von hydrophilen Stoffen kanalbildende Proteine benötigt werden. Analog zur Situation in Gram-negativen Bakterien sind in der Mykolsäureschicht von C. efficiens, C. callunae und C. glutamicum porenbildende Transmembranproteine vorhanden. Es ist bisher vieles bekannt über den Aminosäurefluss über die Cytoplasmamembran und dessen Regulation in C. glutamicum, aber der Export von L-Glutamat ist noch ungeklärt. Die besondere Beschaffenheit der äußeren Membran von Mycolaten scheint in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle zu spielen, da man annimmt, dass die Diffusion im Bezug auf den Transport über die Mycolsäureschicht eine Schlüsselrolle einnimmt. Das Ziel dieser Arbeit war es neue porenbildende Proteine der Aminosäureproduzenten C. glutamicum, C. efficiens und C. callunae zu identifizieren und zu charakterisieren. Bei Untersuchungen von Zellwandextrakten wurde ein neuer, in allen drei Organismen homologer, Zellwandkanal, PorH, gefunden und charakterisiert. PorHC.glut wurde aus in Minimalmedium kultivierten C. glutamicum Zellen isoliert. Das Protein wurde in Lipid-Bilayer Experimenten gefunden und mit Hilfe der Ionenaustauscher-chromotographie über eine HiTrap-Q Säule aufgereinigt. PorHC.glut bildet in Black-Lipid Bilayer Experimenten kationenselektive Kanäle mit einem Durchmesser von 2,2 nm und hat eine Einzelkanalleitfähigkeit von 2,5 nS in 1 M KCl. Aus organischen Zellwandextrakten von C. callunae und C. efficiens wurden PorHC.call und PorHC.eff isoliert. PorHC.call bildet einen kationenselektiven Kanal mit einem Durchmesser von 2,2 nm und einer Einzel-kanalleitfähigkeit von 3 nS, PorHC.eff hingegen bildet einen leicht anionenselektiven Kanal mit einer Leitfähigkeit von 2,3 nS in 1 M KCl. Über die Sequenzierung der PorH Proteine wurden die entsprechenden porH Gene im Genom von C. glutamicum und C. efficiens identifiziert. Das Genom von C. callunae ist nicht bekannt, jedoch weisen die PorH Proteinsequenzen eine hohe Homologie untereinander auf. Es ist keine Signalsequenz vorhanden, so dass man annimmt, dass der Export über die Plasmamembran ähnlich funktioniert wie bei PorAC.glut aus C. glutamicum. Das Gen porHC.glut aus C. glutamicum befindet sich in unmittelbarer Nähe zu porAC.glut in einem möglichen Cluster das aus 13 Genen besteht. In RT-RCR Experimenten und immunologischen Reaktionen mit polyklonalen Antikörpern konnte gezeigt werden, dass die Gene porAC.glut und porHC.glut zusammen transkribiert werden und die Porine in der Zellwand coexistieren. Die Anordnung von porAC.glut und porHC.glut im Genom von C. glutamicum ist ähnlich der von porBC.glut und porCC.glut, und es konnte gezeigt werden, dass die vier Porine in der Zellwand gleichzeitig vorhanden sind. Das Molekulargewicht von PorH ist mit 6 kDa sehr klein für Kanalproteine und man nimmt an, dass die Kanäle von Oligomeren gebildet werden. In Western Blots wurde eine mögliche hexamere Form von PorHC.glut nachgewiesen. Sekundärstrukturvorhersagen für PorH sagen aus, dass 42 Aminosäuren von PorHC.glut und 28 von PorHC.eff und PorHC.call amphiphatische α-Helices mit einer Länge von 6,3 nm, bzw. 4,2 nm ausbilden. Diese Länge würde ausreichen, um die Mykolsäureschicht zu durchspannen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, ein heterologes Expressionssystem für corynebakterielle Kanalproteine zu erstellen, um die kanalbildenden Eigenschaften von bisher nur hypothetischen Porinen wie PorAC.eff, PorBC.eff und PorCC.eff von C. efficiens, oder PorCC.glut von C. glutamicum zu bestimmen. In rekombinanten Expressions-Experimenten in E. coli konnte gezeigt werden, dass die Gene porBC.eff und porCC.eff für Proteine mit kanalbildender Aktivität kodieren. Die Kanäle sind anionenselekitv, mit einer Einzelkanalleitfähigkeit von 1 nS in 1 M KCl, vergleichbar mit den Eigenschaften von PorBC.glut aus C. glutamicum.
KW  - Corynebacterium callunae
KW  - Zellwand
KW  - Kanalbildner
KW  - Corynebacterium efficiens
KW  - Corynebacterium glutamicum
KW  - Zellwandkanäle
KW  - Mykolsäuren
KW  - Lipid Bilayer Membran
KW  - C. glutamicum
KW  - C. efficiens
KW  - C. callunae
KW  - Cell wall channel
KW  - Mycolic acid
KW  - Porin
KW  - Lipid bilayer membrane
KW  - C. glutamicum
KW  - C. efficiens
KW  - C. callunae
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13890
ER  -