TY - THES A1 - Kaltdorf, Martin Ernst T1 - Analyse von regulatorischen Netzwerken bei Zelldifferenzierung und in der Infektionsbiologie T1 - Analysis of Regulatory Networks during Cell Differentiation and in Infection Biology N2 - Das zentrale Paradigma der Systembiologie zielt auf ein möglichst umfassendes Ver-ständnis der komplexen Zusammenhänge biologischer Systeme. Die in dieser Arbeit angewandten Methoden folgen diesem Grundsatz. Am Beispiel von drei auf Basis von Datenbanken und aktueller Literatur rekonstruier-ten Netzwerkmodellen konnte in der hier vorliegenden Arbeit die Gültigkeit analyti-scher und prädiktiver Algorithmen nachgewiesen werden, die in Form der Analy-sesoftware Jimena angewandt wurden. Die daraus resultierenden Ergebnisse sowohl für die Berechnung von stabilen Systemzuständen, der dynamischen Simulation, als auch der Identifikation zentraler Kontrollknoten konnten experimentell validiert wer-den. Die Ergebnisse wurden in einem iterativen Prozess verwendet werden um das entsprechende Netzwerkmodell zu optimieren. Beim Vergleich des Verhaltens des semiquantitativ ausgewerteten regulatorischen Netzwerks zur Kontrolle der Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in Chondrozyten (Knorpelbildung), Osteoblasten (Knochenbildung) und Adipozyten (Fett-zellbildung) konnten 12 wichtige Faktoren (darunter: RUNX2, OSX/SP7, SOX9, TP53) mit Hilfe der Berechnung der Bedeutung (Kontrollzentralität der Netzwerkknoten identifi-ziert werden). Der Abgleich des simulierten Verhaltens dieses Netzwerkes ergab eine Übereinstimmung mit experimentellen Daten von 47,2%, bei einem widersprüchlichen Verhalten von ca. 25%, dass unter anderem durch die temporäre Natur experimentel-ler Messungen im Vergleich zu den terminalen Bedingungen des Berechnung der stabilen Systemzustände erklärt werden kann. Bei der Analyse des Netzwerkmodells der menschlichen Immunantwort auf eine Infek-tion durch A. fumigatus konnten vier Hauptregulatoren identifiziert werden (A. fumi-gatus, Blutplättchen, hier Platelets genannt, und TNF), die im Zusammenspiel mit wei-teren Faktoren mit hohen Zentralitätswerten (CCL5, IL1, IL6, Dectin-1, TLR2 und TLR4) fähig sind das gesamte Netzwerkverhalten zu beeinflussen. Es konnte gezeigt werden, dass sich das Aktivitätsverhalten von IL6 in Reaktion auf A. fumigatus und die regulato-rische Wirkung von Blutplättchen mit den entsprechenden experimentellen Resultaten deckt. Die Simulation, sowie die Berechnung der stabilen Systemzustände der Immunantwort von A. thaliana auf eine Infektion durch Pseudomonas syringae konnte zeigen, dass die in silico Ergebnisse mit den experimentellen Ergebnissen übereinstimmen. Zusätzlich konnten mit Hilfe der Analyse der Zentralitätswerte des Netzwerkmodells fünf Master-regulatoren identifiziert werden: TGA Transkriptionsfaktor, Jasmonsäure, Ent-Kaurenoate-Oxidase, Ent-kaurene-Synthase und Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase. Während die ersteren beiden bereits lange als wichtige Regulatoren für die Gib-berellin-Synthese bekannt sind, ist die immunregulatorische Funktion von Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase bisher weitgehend unbekannt. N2 - The central paradigm of systems biology aims at a comprehensive understanding in complex relationships of biological systems. The methods used in this work support this aim. By the example of three network models reconstructed on the basis of databases and current literature, the validity of analytical and predictive algorithms could be demon-strated in this work. As simulation software the framework Jimena was applied. The results for the calculation of stable system states, the dynamic simulation as well as the identification of central control nodes could be validated experimentally. The re-sults were used in an iterative process to further optimize the corresponding network model. Comparing the behavior of the semi-quantitatively evaluated regulatory network to control the differentiation of human mesenchymal stem cells into chondrocytes (carti-lage formation), osteoblasts (bone formation) and adipocytes (fatty cell formation), 12 important factors (including: RUNX2, OSX/SP7, SOX9, TP53) could be identified by the calculation of the control centralities of the network nodes. The comparison of the simulated behavior of these nodes showed an agreement with experimental data of 47.2%. We found a contradictory behavior of approximately 25%. Differing results can be explained due to the temporary nature of experimental measurements compared to the terminal conditions of the calculation the stable system states. Analyzing the network model of the human immune response to A. fumigatus infec-tion, four major regulators could be identified (A. fumigatus, platelets, and TNF), which interact with other factors with high control centrality values (CCL5, IL1, IL6, Dectin1). TLR2 and TLR4) are capable of affecting the overall network behavior. It could be shown that the activity behavior of IL6 in response to the modular activity of the plate-lets as well as A. fumigatus coincides with the corresponding experimental results. The simulation, as well as the calculation of the stable system states of the immune response of A. thaliana to an infection by Pseudomonas syringae, showed that in silico results are in agreement with the experimental results. By analyzing the control cen-trality values of the network model, five main regulators could be: TGA transcription factor, jasmonic acid, ent-kaurene-Oxidase, ent-kaurene synthase and aspartate semi-aldehyde. While the former two have long been recognized as important regulators of gibberel-lin synthesis, the immunoregulatory function of aspartate semialdehyde dehydrogen-ase has been largely unknown. KW - Netzwerksimulation KW - Immunbiologie KW - Zelldifferenzierung KW - Systembiologie KW - Signaltransduktion KW - Mesenchymale Stammzelldifferenzierung KW - Netzwerkrekonstruktion KW - network simulation KW - network reconstruction KW - immunology KW - mesenchymal stem cell differentiation KW - signal transduction Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-198526 ER - TY - THES A1 - Zimmermann, Henriette T1 - Antigenic variation and stumpy development in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Antigene Variation und Stumpy Entwicklung in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The eukaryotic parasite Trypanosoma brucei has evolved sophisticated strategies to persist within its mammalian host. Trypanosomes evade the hosts' immune system by antigenic variation of their surface coat, consisting of variant surface glycoproteins (VSGs). Out of a repertoire of thousands of VSG genes, only one is expressed at any given time from one of the 15 telomeric expression sites (ES). The VSG is stochastically exchanged either by a transcriptional switch of the active ES (in situ switch) or by a recombinational exchange of the VSG within the active ES. However, for infections to persist, the parasite burden has to be limited. The slender (sl) bloodstream form secretes the stumpy induction factor (SIF), which accumulates with rising parasitemia. SIF induces the irreversible developmental transition from the proliferative sl to the cell cycle-arrested but fly-infective stumpy (st) stage once a concentration threshold is reached. Thus, antigenic variation and st development ensure persistent infections and transmissibility. A previous study in monomorphic cells indicated that the attenuation of the active ES could be relevant for the development of trypanosomes. The present thesis investigated this hypothesis using the inducible overexpression of an ectopic VSG in pleomorphic trypanosomes, which possess full developmental competence. These studies revealed a surprising phenotypic plasticity: while the endogenous VSG was always down-regulated upon induction, the ESactivity determined whether the VSG overexpressors arrested in growth or kept proliferating. Full ES-attenuation induced the differentiation of bona fide st parasites independent of the cell density and thus represents the sole natural SIF-independent differentiation trigger to date. A milder decrease of the ES-activity did not induce phenotypic changes, but appeared to prime the parasites for SIF-induced differentiation. These results demonstrate that antigenic variation and development are linked and indicated that the ES and the VSG are independently regulated. Therefore, I investigated in the second part of my thesis how ES-attenuation and VSG-silencing can be mediated. Integration of reporters with a functional or defective VSG 3'UTR into different genomic loci showed that the maintenance of the active state of the ES depends on a conserved motif within the VSG 3'UTR. In situ switching was only triggered when the telomere-proximal motif was partially deleted, suggesting that it serves as a DNA-binding motif for a telomere-associated protein. The VSG levels seem to be additionally regulated in trans based on the VSG 3'UTR independent of the genomic context, which was reinforced by the regulation of a constitutively expressed reporter with VSG 3' UTR upon ectopic VSG overexpression. N2 - Der eukaryotische Parasit Trypanosoma brucei hat komplexe Strategien entwickelt, um in seinem Säugetierwirt zu überleben. Die Grundlage der Immunevasion ist die antigene Variation des Oberflächenmantels, der aus dem variablen Oberflächenglykoprotein (VSG) besteht. Von mehreren tausend VSG-Genen wird zu jedem Zeitpunkt nur ein einziges aus einer der 15 telomerischen Expressionsstellen (ES) exprimiert. Das VSG kann entweder durch einen transkriptionellen Wechsel der aktiven ES (in situ Wechsel) oder durch einen rekombinatorischen Wechsel des VSG-Gens innerhalb der aktiven ES stochastisch ausgetauscht werden. Damit jedoch eine langanhaltende Infektion des Wirts möglich wird, muss gleichzeitig der Parasitenbefall begrenzt werden. Mit ansteigender Parasitämie akkumuliert der 'stumpy induction factor' (SIF), welcher von der 'slender' (sl) Blutstromform sekretiert wird. Sobald ein Schwellenwert in der SIF-Konzentration erreicht ist, wird die irreversible Differenzierung der proliferativen sl in die zellzyklusarretierte 'stumpy'(st) Form eingeleitet, welche infektiös für den Fliegenvektor ist. Somit stellen antigene Variation und st- Differenzierung das Persistieren der Infektion und die Übertragung des Parasiten sicher. Eine frühere Arbeit mit monomorphen Zellen deutete darauf hin, dass die Attenuierung der aktiven ES eine Rolle für die Differenzierung der Trypanosomen spielen könnte. Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Dissertation untersucht, indem in pleomorphen Zellen mit vollständiger Entwicklungskompetenz ein ektopisches VSG induzierbar überexprimiert wurde. Diese Studien offenbarten eine erstaunliche phänotypische Plastizität: während das endogene VSG nach Induktion runter reguliert wurde, arretierten die VSG-Überexpressoren in Abhängigkeit von der ES-Aktivität entweder im Wachstum oder teilten sich weiter. Die vollständige ES-Attenuierung löste die Differenzierung zu echten st Zellen unabhängig von der Zelldichte aus und ist somit der bisher einzige natürliche SIF-unabhängige Differenzierungsauslöser. Eine mildere Abnahme der ES-Aktivität verursachte keinen Phänotyp, scheint aber die Zellen auf die SIF-induzierte Differenzierung vorzubereiten. Diese Ergebnisse zeigen, dass antigene Variation und Differenzierung verbunden sind und deuteten an, dass die ES und das VSG unabhängig voneinander reguliert werden. Daher habe ich im zweiten Teil meiner Dissertation untersucht, wie ES-Attenuierung und VSG-Stilllegung vermittelt werden können. Die Integration eines Reporters mit funktioneller oder defekter VSG 3'UTR an verschiedenen Orten im Genom zeigte, dass die Aufrechterhaltung der ES-Aktivität von einem konservierten Motiv in der VSG 3'UTR abhängig ist. Ein in situ Wechsel wurde nur ausgelöst, wenn Teile des Telomer-proximalen Motiv deletiert wurden, was nahelegt, dass das Motiv auf DNA-Ebene von einem Telomerbindeprotein erkannt wird. Die VSG-Level scheinen unabhängig vom genomischen Kontext zusätzlich in trans basierend auf der VSG 3'UTR reguliert zu werden, was durch die Regulation eines konstitutiv exprimierten Reporters mit VSG 3'UTR nach VSG-Überexpression bekräftigt wurde. KW - Trypanosoma brucei KW - Genexpression KW - Entwicklung KW - Parasit KW - VSG KW - antigenic variation KW - monoallelic expression KW - stumpy development KW - differentiation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146902 ER - TY - THES A1 - Seitz, Nicola T1 - Bee demise and bee rise: From honey bee colony losses to finding measures for advancing entire bee communities T1 - Bienenschwund und Bienenaufschwung: Von Honigbienen-Kolonieverlusten zur Förderung von gesamten Bienengemeinschaften N2 - My dissertation comprises three studies: (1) an assessment of honey bee colony losses in the USA between 2014 and 2015, (2) an exploration of the potential of reclaimed sand mines as bee habitat, and (3) an evaluation of native and non-native pollinator friendly plants in regard to their attraction to bees. While the first study focuses on honey bees, the latter two studies primarily take wild bees or entire bee communities in focus. The study on honey bee colony losses was conducted within the framework of the Bee Informed Partnership (BIP, beeinformed.org) and aligns with the annual colony loss surveys which have been conducted in the USA since the winter of 2006/2007. It was the fourth year for which summer and annual losses were calculated in addition to winter losses. Among participants, backyard beekeepers were the largest group (n = 5690), although sideline (n = 169) and commercial (n = 78) beekeepers managed the majority (91.7 %) of the 414 267 surveyed colonies. Overall, 15.1 % of the estimated 2.74 million managed colonies in the USA were included in the study. Total honey bee colony losses (based on the entirety of included colonies) were higher in summer (25.3 %) than in winter (22.3 %) and amounted to 40.6 % for the entire 2014/2015 beekeeping year. Average colony losses per beekeeper or operation were higher in winter (43.7 %) than in summer (14.7 %) and amounted to 49 % for the entire 2014/2015 beekeeping year. Due to the dominance of backyard beekeepers among participants, average losses per operation (or unweighted loss) stronger reflected this smaller type of beekeeper. Backyard beekeepers mainly named colony management issues (e.g., starvation, weak colony in the fall) as causes for mortality, while sideline and commercial beekeepers stronger emphasized parasites or factors outside their control (e.g., varroa, nosema, queen failure). The second study took place at reclaimed sand mines. Sand mines represent anthropogenically impacted habitats found worldwide, which bear potential for bee conservation. Although floral resources can be limited at these habitats, vegetation free patches of open sandy soils and embankments may offer good nesting possibilities for sand restricted and other bees. We compared bee communities as found in three reclaimed sand mines and at adjacent roadside meadows in Maryland, USA, over two years. Both sand mines and roadsides hosted diverse bee communities with 111 and 88 bee species, respectively. Bee abundances as well as richness and Shannon diversity of bee species were higher in sand mines than at roadsides and negatively correlated with the percentage of vegetational ground cover. Species composition also differed significantly between habitats. Sand mines hosted a higher proportion of ground nesters, more uncommon and more ‘sand loving’ bees similar to natural sandy areas of Maryland. Despite the destruction of the original pre-mining habitat, sand mines thus appear to represent a unique habitat for wild bees, particularly when natural vegetation and open sand spots are encouraged. Considering habitat loss, the lack of natural disturbance regimes, and ongoing declines of wild bees, sand mines could add promising opportunities for bee conservation which has hitherto mainly focused on agricultural and urban habitats. The third study was an experimental field study on pollinator friendly plants. Bees rely on the pollen and nectar of plants as their food source. Therefore, pollinator friendly plantings are often used for habitat enhancements in bee conservation. Non-native pollinator friendly plants may aid in bee conservation efforts, but have not been tested and compared with native pollinator friendly plants in a common garden experiment. In this study, we seeded mixes of 20 native and 20 non-native pollinator friendly plants in two separate plots at three sites in Maryland, USA. For two years, we recorded flower visitors to the plants throughout the blooming period and additionally sampled bees with pan traps. A total of 3744 bees (120 species) were sampled in the study. Of these, 1708 bees (72 species) were hand netted directly from flowers for comparisons between native and non-native plants. Depending on the season, bee abundance and species richness was either similar or lower (early season and for richness also late season) at native plots compared to non-native plots. Additionally, the overall bee community composition differed significantly between native and non-native plots. Furthermore, native plants were associated with more specialized plant-bee visitation networks compared to non-native plants. In general, visitation networks were more specialized in the early season than the later seasons. Four species (Bombus impatiens, Halictus poeyi/ligatus, Lasioglossum pilosum, and Xylocopa virginica) out of the five most abundant bee species (also including Apis mellifera) foraged more specialized on native than non-native plants. Our study showed that non-native plants were well accepted by a diverse bee community and had a similar to higher attraction for bees compared to native plants. However, we also demonstrated alterations in foraging behavior, bee community assemblage, and visitation networks. As long as used with caution, non-native plants can be a useful addition to native pollinator friendly plantings. This study gives a first example of a direct comparison between native and non-native pollinator friendly plants. N2 - Meine Dissertation umfasst drei Studien: (1) eine Erfassung von Honigbienen-Kolonieverlusten in den USA zwischen 2014 und 2015, (2) die Erforschung des Potenzials renaturierter Sandminen als Habitat für Bienen und (3) eine Evaluierung nativer sowie standortfremder bestäuberfreundlicher Pflanzen hinsichtlich ihrer Attraktivität für Bienen. Während die erste Studie Honigbienen im Fokus hat, verschiebt sich der Fokus der zwei weiteren Studien hin zu Wildbienen bzw. gesamten Bienengemeinschaften. Die Studie zu Honigbienenkolonieverlusten wurde im Rahmen des Bee Informed Partnerships (BIP, beeinformed.org) durchgeführt und reiht sich ein in die seit dem Winter 2006/2007 jährlich durchgeführten Untersuchungen in den USA. Es ist das vierte Jahr in dem Sommer- und Jahresverluste zusätzlich zu den Winterverlusten kalkuliert wurden. Unter den Teilnehmern bildete die Gruppe der Hobby-Imker den größten Anteil (n = 5690), obwohl nebenberufliche (n = 169) und kommerzielle (n = 78) Imker den Großteil (91,7 %) der 414 267 begutachteten Bienenvölkern bzw. Kolonien hielten. Insgesamt enthielt die Studie 15,1 % der auf 2,74 Mio. geschätzten Gesamtzahl an gehaltenen Bienenvölkern in den USA. Die Gesamtverluste an Honigbienenvölkern (basierend auf der Gesamtheit der erfassten Völker) waren im Sommer mit 25,3 % höher als im Winter mit 22,3 % und bezifferten sich auf 40,6 % für das gesamte Imkerjahr in 2014/2015. Durchschnittliche Kolonieverluste pro Imkerbetrieb waren höher im Winter (43,7 %) als im Sommer (14,7 %) und betrugen 49 % für das gesamte Imkerjahr in 2014/2015. Aufgrund der hohen Anzahl an Hobby-Imkern unter den Teilnehmern reflektieren die durchschnittlichen Kolonieverluste pro Imkerbetrieb (oder ungewichtete Verluste) v.a. die Situation dieser kleineren Imkerbetriebe. Hobby-Imker nannten als Gründe für die Honigbienenmortalität hauptsächlich Probleme des Koloniemanagements (z.B. Verhungerung, schwache Völker im Herbst), während nebenberufliche und kommerzielle Imker stärker Faktoren betonten, die außerhalb ihrer Kontrolle lagen (z.B. Varroamilben, Nosemasporen, Versagen der Königin). Die zweite Studie fand in renaturierten Sandminen statt. Sandminen sind weltweit zu findende anthropogen veränderte Landschaften, die ein Potenzial für Bienenschutz haben. Obwohl florale Ressourcen in diesen Habitaten limitiert sein können, könnten die vegetationsfreien Flecken auf offenen Sandböden und Böschungen gute Nistplätze für auf Sand spezialisierte und andere Bienen bieten. Wir haben Bienengemeinschaften aus drei renaturierten Sandminen sowie jeweils nahe gelegenen bepflanzten Straßenrändern in Maryland, USA verglichen. Sowohl die Sandminen als auch die Straßenränder enthielten vielfältige Bienengemeinschaften mit 111 (Sandminen) und 88 (Straßenränder) Bienenarten. Bienenabundanz, Artenreichtum und Shannon Diversität waren höher in den Sandminen als an den Straßenrändern und korrelierten negativ mit dem Anteil an vorhandener Bodenvegetation. Darüber hinaus unterschied sich die Artzusammensetzung signifikant zwischen den beiden Habitattypen. Sandminen enthielten einen größeren Anteil an Bodennistern, mehr seltene Arten und mehr sandliebende Arten, ähnlich natürlicher sandiger Gebiete in Maryland. Trotz der Zerstörung des ursprünglichen prä-Minen Habitats, scheinen Sandminen daher ein einzigartiges Bienenhabitat für Wildbienen darzustellen, besonders wenn die natürliche Besiedlung von Vegetation und offene Sandflächen gefördert werden. Im Hinblick auf Habitatverluste, auf das Fehlen von natürlichen Landschaftsstörungen und auf den weiterschreitenden Rückgang an Wildbienen, könnten Sandminen eine vielversprechende Möglichkeit für Bienenschutz darstellen, der sich bisher stark auf landwirtschaftliche und urbane Habitate konzentrierte. Bei der dritten Studie handelt es sich um eine experimentelle Feldstudie zu bestäuberfreundlichen Pflanzen. Bienen sind auf Pollen und Nektar von Pflanzen als Nahrungsquelle angewiesen. Aus diesem Grund werden bestäuberfreundliche Pflanzen oft für Habitatverbesserungen im Rahmen von Bienenschutzmaßnahmen gepflanzt. Standortfremde bestäuberfreundliche Pflanzen können dabei die Bienenschutzmaßnahmen unterstützen, wurden aber bisher nicht in einem Common Garden Experiment zusammen mit nativen bestäuberfreundlichen Pflanzen getestet bzw. verglichen. In dieser Studie haben wir Saatgutmischungen mit jeweils 20 nativen und 20 standortfremden Pflanzen in zwei separaten Plots in drei Gebieten in Maryland, USA ausgesät. Zwei Jahre lang protokollierten wir über die gesamten Blühzeiträume hinweg Pflanzenbesucher und sammelten Bienen mit Farbschalen. Insgesamt erfassten wir 3744 Bienen (120 Arten), von denen 1708 Individuen (72 Arten) per Hand direkt von den Blüten gesammelt wurden für die Vergleiche zwischen nativen und standortfremden Pflanzen. Abhängig von der Saison waren Bienenabundanz und Artenreichtum entweder ähnlich oder niedriger (frühe Saison und für Artenreichtum auch späte Saison) in nativen Plots verglichen mit den standortfremden Plots. Zusätzlich unterschied sich die Zusammensetzung der Bienengemeinschaft signifikant zwischen nativen und standortfremnden Pflanzen. Darüber hinaus waren die Bienen-Pflanzen-Besuchs-Netzwerke nativer Pflanzen spezialisierter als die Besuchs-Netzwerke standortfremder Pflanzen. Im Allgemeinen waren die Besuchs-Netzwerke in der frühen Saison spezialisierter als in der späten Saison. Vier Arten (Bombus impatiens, Halictus poeyi/ligatus, Lasioglossum pilosum, und Xylocopa virginica) der fünf am häufigsten vorkommenden Arten (zusätzlich auch Apis mellifera) fouragierten spezialisierter auf nativen Pflanzen als auf standortfremden Pflanzen. Unsere Studie zeigte, dass standortfremde Pflanzen weitläufig von einer artenreichen Bienengemeinschaft angenommen wurden und eine ähnliche bis höhere Attraktivität für Bienen aufwiesen verglichen mit nativen Pflanzen. Allerdings demonstrierten wir auch Änderungen im Fouragierverhalten, in der Zusammensetzung der Bienengemeinschaft und in den Besuchs-Netzwerken. Insgesamt kann ein vorsichtiger Einsatz standortfremder Pflanzen eine sinnvolle Ergänzung zu nativen bestäuberfreundlichen Anpflanzungen sein. Diese Studie stellt ein erstes Beispiel eines direkten Vergleichs von nativen und standortfremden bestäuberfreundlichen Anpflanzungen dar. KW - Biene KW - Wildbienen KW - Renaturierung <Ökologie> KW - Naturschutz KW - Honigbienen KW - exotische Pflanzen KW - Sandminen KW - Pflanzen-Bienen-Netzwerke KW - bestäuberfreundliche Pflanzen KW - wild bees KW - honey bees KW - sand mine KW - pollinator friendly plants KW - plant-bee visitation networks Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184180 ER - TY - THES A1 - Beliu, Gerti T1 - Bioorthogonale Tetrazin-Farbstoffe für die Lebendzell-Markierung und hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie T1 - Bioorthogonal tetrazine-dyes for live-cell labeling and super-resolution fluorescence microscopy N2 - Der genetische Code beschreibt die Ver- und Entschlüsselung der Erb-information für das universelle Prinzip der Proteinbiosynthese aus einzelnen Aminosäuren. Durch Erweiterung des genetischen Codes lassen sich unna-türliche Aminosäuren (uAA) mit einzigartigen biophysikalischen Eigenschaf-ten ortsspezifisch in Proteine einführen und ermöglichen die spezifische Ma-nipulation von Proteinen. Die Click-Reaktion zwischen der unnatürlichen Aminosäure TCO*-Lysin und Tetrazin besitzt eine außergewöhnliche Reaktionskinetik (≥800 M-1s-1) und ermöglicht eine spezifische und bioorthogonale Markierung von Bio- ¬molekülen unter physiologischen Bedingungen. Im Fokus dieser Arbeit stand zunächst die Markierung von Membran- ¬rezeptoren durch Click-Chemie in lebenden Zellen sowie die Untersuchung der Wechselwirkung 22 bekannter und neuartiger Tetrazin-Farbstoff- Konjugate. Darüber hinaus wurde die Anwendbarkeit von bioorthogonalen Click-Reaktionen für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Durch Erweiterung des genetischen Codes in Proteine aus der Klasse der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluR), TNF-Rezeptoren oder Mikrotubu-li-assoziierten Proteinen (MAP) wurde ortspezifisch die unnatürliche Amino-säure TCO*-Lysin eingeführt und dadurch die Fluoreszenzmarkierung durch Tetrazin-Farbstoffe ermöglicht. Die direkte chemische Kopplung von TCO an Liganden wie Phalloidin und Docetaxel, welche spezifisch das Aktin-Zytoskelett bzw. Mikrotubuli-Filamente binden können, ermöglichte zudem die Click-Färbungen von fixierten und lebenden Zellen ohne genetische Ver-änderungen der Zielproteine. Des Weiteren wurden die spektroskopischen Eigenschaften von 22 Tetrazin-Farbstoffen, verteilt über den gesamten sichtbaren Wellenlängenbereich, untersucht. Ein charakteristisches Kennzeichen der Click-Reaktion mit Tet-razin-Farbstoffen ist dabei ihre Fluorogenität. Das Tetrazin fungiert nicht nur als reaktive Gruppe während der Click-Reaktion mit Alkenen, sondern führt in vielen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten zur Fluoreszenzlöschung. Während bei grün-absorbierenden Farbstoffe vor allem FRET-basierte Löschprozesse dominieren, konnte photoinduzierter Elektronentransfer (PET) vom angeregten Farbstoff zum Tetrazin als Hauptlöschmechanismus bei rot-absorbierenden Oxazin- und Rhodamin-Derivaten identifiziert werden. Die effiziente und spezifische Markierung aller untersuchten Tetrazin- Farbstoffe ermöglichte die Visualisierung von Aktin-Filamenten, Mikrotubuli und Membranrezeptoren sowohl durch konventionelle Fluoreszenzmikrosko-pie als auch durch hochauflösende Verfahren, wie z.B. dSTORM, auf Ein-zelmolekülebene. Die unterschiedliche Zellpermeabilität von Tetrazin-Farbstoffen kann dabei vorteilhaft für die spezifische intra- und extrazelluläre Markierung von Proteinen in fixierten und lebenden Zellen genutzt werden. N2 - The genetic code describes the encoding and decoding of genetic infor-mation for the universal principle of protein biosynthesis from individual amino acids. By expanding the genetic code, unnatural amino acids (uAA) with unique biophysical properties can be introduced site-specifically into pro-teins and enable the selective manipulation of proteins. The click reaction of the unnatural amino acid TCO*-lysine and tetrazine has an extraordinary reaction kinetic (≥800 M-1s-1) enabling the specific and bioorthogonal labeling of biomolecules under physiological conditions. The main focus of this work was the labeling of membrane receptors by click chemistry in living cells and the investigation of the interaction of 22 known and novel tetrazine dye conjugates. In addition, the applicability of bioorthogonal click reactions for high-resolution fluorescence microscopy was investigated. For this purpose, the unnatural amino acid TCO*-lysine was introduced site-specifically via genetic code expansion into proteins from the class of iono-tropic glutamate receptors (iGluR), TNF receptors or microtubule- associated proteins (MAP), thereby enabling fluorescence labeling with tetrazine dyes. The direct chemical coupling of TCO to ligands such as phalloidin and docetaxel, which can specifically bind the actin cytoskeleton or microtubule filaments, allowed click staining of fixed and living cells without genetic modifications of the target proteins. Furthermore, the spectroscopic properties of 22 tetrazine dyes spanning the entire visible wavelength range were investigated. A hallmark of the click reaction using tetrazine dyes is their fluorogenicity. Thus, the tetrazine not only functions as a reactive group during the click reaction with alkenes, but also leads to fluorescence quenching in many tetrazine-dye conjugates. While FRET-based quenching processes dominate in green-absorbing dyes, photoinduced electron transfer (PET) from excited dye to tetrazine has been identified as the main quenching mechanism in red-absorbing oxazine and rhodamine derivatives. The efficient and specific labeling of all investigated tetrazine dyes facilitates the visualization of actin filaments, microtubules and membrane receptors by conventional fluorescence microscopy as well as by super-resolution microscopy techniques, e.g. dSTORM, also at single molecule level. The different cell permeability of tetrazine dyes can be used advantageously for the specific intra- and extracellular labeling of proteins in fixed and living cells. KW - Hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie KW - Tetrazin Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189628 ER - TY - THES A1 - Keppler, Sarah T1 - Characterization of Novel Mutations in Receptor-Tyrosine Kinases in Multiple Myeloma T1 - Charakterisierung neuer Mutationen in Rezeptor-Tyrosin Kinasen im Multiplen Myelom N2 - Multiple myeloma (MM) is a disease of terminally differentiated B-cells which accumulate in the bone marrow leading to bone lesions, hematopoietic insufficiency and hypercalcemia. Genetically, MM is characterized by a great heterogeneity. A recent next-generation sequencing approach resulted in the identification of a signaling network with an accumulation of mutations in receptor-tyrosine kinases (RTKs), adhesion molecules and downstream effectors. A deep-sequencing amplicon approach of the coding DNA sequence of the six RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 and NTRK2 was conducted in a patient cohort (75 MM samples and 68 corresponding normal samples) of the “Deutsche Studiengruppe Multiples Myelom (DSMM)” to further elucidate the role of RTKs in MM. As an initial approach the detected mutations were correlated with cytogenetic abnormalities and clinical data in the course of this thesis. RTK mutations were present in 13% of MM patients of the DSMM XI trial and accumulated in the ligand-binding and tyrosine-kinase domain. The newly identified mutations were associated with an adverse patient survival, but not with any cytogenetic abnormality common in MM. Especially rare patient-specific SNPs (single nucleotide polymorphism) had a negative impact on patient survival. For a more comprehensive understanding of the role of rare RTK SNPs in MM, a second amplicon sequencing approach was performed in a patient cohort of the DSMM XII trial that included 75 tumor and 184 normal samples. This approach identified a total of 23 different mutations in the six RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 and NTRK2 affecting 24 patients. These mutations could furthermore be divided into 20 rare SNPs and 3 SNVs (single nucleotide variant). In contrast to the first study, the rare SNPs were significantly associated with the adverse prognostic factor del17p. IGF1R was among the most commonly mutated RTKs in the first amplicon sequencing approach and is known to play an important role in diverse cellular processes such as cell proliferation and survival. To study the role of IGF1R mutations in the hard-to-transfect MM cells, stable IGF1R-knockdown MM cell lines were established. One of the knockdown cell lines (L363-C/C9) as well as a IGF1R-WT MM cell line (AMO1) were subsequently used for the stable overexpression of WT IGF1R and mutant IGF1R (N1129S, D1146N). Overall, an impact on the MAPK and PI3K/AKT signaling pathways was observed upon the IGF1R knockdown as well as upon WT and mutant IGF1R overexpression. The resulting signaling pattern, however, differed between different MM cell lines used in this thesis as well as in a parallel performed master thesis which further demonstrates the great heterogeneity described in MM. Taken together, the conducted sequencing and functional studies illustrate the importance of RTKs and especially of IGF1R and its mutants in the pathogenesis of MM. Moreover, the results support the potential role of IGF1R as a therapeutic target for a subset of MM patients with mutated IGF1R and/or IGF1R overexpression. N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist eine maligne Erkrankung ausdifferenzierter B-Zellen, den sogenannten Plasmazellen, welche sich im Knochenmark anhäufen. Symptome des MM sind, unter anderem, Knochenläsionen, Hyperkalzämie und hämatopoetische Insuffizienz. Zusätzlich ist das MM durch eine große genetische Heterogenität geprägt. In einer kürzlich durchgeführten Next-Generation Sequencing Studie wurde eine Akkumulation von Mutationen in Rezeptortyrosinkinasen (RTK), Adhesionmolekülen und den zugehörigen Effektoren identifiziert. Dies erlaubte die Definition eines inter- und intrazellulären Signalnetzwerkes. Um die Rolle der RTKs im MM genauer zu definieren, wurde die kodierende DNA Sequenz der sechs RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 und NTRK2 in einer einheitlich therapierten Patientenkohorte (75 Patienten) der „Deutschen Studiengruppe Multiples Myelom“ (DSMM) mittels eines Amplikonansatzes sequenziert. Die identifizierten Mutationen wurden im Rahmen dieser Arbeit validiert und anschließend mit zytogenetischen Anomalitäten und klinischen Daten korreliert. RTK Mutationen waren in 13 % der MM Patienten vorhanden und akkumulierten besonders in den Ligandenbindungs- und der Tyrosinkinase- Domänen. Die neu identifizierten RTK Mutationen hatten einen signifikant negativen Einfluss auf das Überleben, jedoch konnte kein Zusammenhang zwischen den Mutationen und zytogenetischen Alterationen festgestellt werden. Besonders seltene, Patienten-spezifische SNPs hatten einen negativen Einfluss auf die Gesamtüberlebenszeit, das ereignisfreie und das progressionsfreie Überleben. Um die Rolle dieser seltenen SNPs im MM besser zu verstehen, wurde ein zweiter Amplikonansatz in einer neuen Patientenkohorte der DSMM XII Studie durchgeführt. Hierbei wurden die sechs RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 und NTRK2 in 75 Tumor und 184 Normalproben sequenziert. Bei diesem Ansatz wurden 23 unterschiedliche Mutationen in 24 Patienten identifiziert. Diese Mutation konnten in 20 seltene SNPs und 3 SNVs (single nuleotide variant) unterteilt werden und waren, im Gegensatz zu Mutationen der ersten Studie, signifikant mit dem negativ prognostischen Faktor del17p assoziiert. IGF1R war bei der initialen Amplikon-Sequenzierstudie unter den am häufigsten mutierten RTKs und spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen, z. B. der Zellproliferation und dem Überleben. Um eine funktionelle Untersuchung der IGF1R Mutation in den schwer-zu-transfizierenden MM-Zellen zu ermöglichen, wurden stabile IGF1R-knockdown MM-Zelllinien etabliert. Eine dieser knockdown Zelllinien (L363-C/C9) sowie eine IGF1R WT MM-Zelllinie (AMO1) wurden anschließend für die stabile Überexpression von IGF1R WT, IGF1R D1146N und IGF1R N1129S verwendet. Funktionelle Analysen zeigten, dass sowohl IGF1R-knockdown als auch die Überexpression von IGF1R WT, IGF1R D1146N und IGF1R N1129S einen Einfluss auf den MAPK und den PI3K/AKT Signalweg haben. Der Einfluss des IGF1R WT, als auch der zwei Mutanten IGF1R D1146N und IGF1R N1129S unterschied sich jedoch in den in dieser Arbeit und in einer parallel durchgeführten Masterarbeit verwendeten Zelllinien. Diese Unterschiede verdeutlichen zusätzlich die große Heterogenität für die das MM bekannt ist. Zusammengenommen verdeutlichen die durchgeführten Sequenzier- und funktionellen Studien die wichtige Rolle der RTKs, besonders von IGF1R, im MM. Darüber hinaus unterstützen die erhaltenen Ergebnisse die potenzielle Rolle von IGF1R als therapeutisches Ziel für MM-Patienten mit mutiertem IGF1R und / oder IGF1R-Überexpression. KW - Plasmozytom KW - Rezeptor-Tyrosinkinasen KW - Multiple Myeloma KW - Amplicon Sequencing KW - Receptor-Tyrosine Kinases KW - IGF1R Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155720 ER - TY - THES A1 - Hofrichter, Michaela Angelika Hedwig T1 - Charakterisierung von angeborenen Hörstörungen mit Hilfe von Hochdurchsatz-Sequenziermethoden T1 - Characterization of inherited hearing loss by high throughput sequencing methods N2 - Fast 500 Millionen Menschen weltweit sind von einer Hörstörung betroffen. Es wird sogar angenommen, dass diese Anzahl laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) noch steigen und 2050 jeder zehnte Mensch eine Hörstörung aufweisen wird. Mindestens in 50% aller Fälle ist die Hörstörung genetisch bedingt. Durch die jüngsten Fortschritte der Sequenzierungstechnologien hat die genetische Analyse von Hörstörungen an Bedeutung gewonnen, vor allem hinsichtlich Familienplanung, geeigneter Therapien und zukünftiger möglichen Therapieansätzen, um das Hörvermögen wiederherzustellen. Die folgende Arbeit stellt 155 familiäre Fälle vor, die genetisch untersucht wurden. Diese Fälle konnten in zwei Kohorten unterteilt werden. Eine Kohorte (n = 74) umfasste Patienten mit kaukasischem Hintergrund, während die andere Kohorte (n = 81) Patienten beinhaltete, die aus dem Iran rekrutiert wurden. Für die Untersuchung wurde zum einen eine Panel-Analyse mit dem TruSight One Panel (Illumina, San Diego, USA) und zum anderen eine Exom-Sequenzierung durchgeführt. Anschließend wurden die Daten mit Analyse-Programmen wie GensearchNGS (PhenoSystems, Wallonia, Belgien) ausgewertet. Insgesamt konnte für 55% aller Fälle eine pathogene oder wahrscheinlich pathogene Variante durch Next Generation Sequencing diagnostiziert werden. Die meisten der gelösten Fälle (ca. 73%) stammten aus der iranischen Kohorte, was durch elterliche Blutsverwandtschaft und erhöhte Inzidenz von Hörstörungen im Iran zu erklären ist. 27% der gelösten Fälle gehörten der zweiten Kohorte an. Mutationen in den Genen MYO15A, LHFPL5, TECTA und SLC26A4 konnten überwiegend bei iranischen Patienten identifiziert werden. Varianten im Gen TECTA als auch im Gen SLC26A4 wurden ebenfalls in der kaukasischen Kohorte identifiziert. Beide Ethnien wiesen jeweils ein eigenes Mutationsspektrum auf. Jedoch wurden in beiden Gruppen Überschneidungen im klinischen Bild durch pathogene Varianten in einer Vielzahl von Hörstörungsgenen, sowie unterschiedliche klinische Phänotypen, deren Ursache pathogene Varianten im gleichen Hörstörungsgen zugrunde liegen, und familiäre Locus-Heterogenität beobachtet.. In dieser Arbeit konnte eine De Novo Mutation im CEACAM16-Gen (DFNA4B) bestätigt und der Effekt von einer wiederholt betroffenen Aminosäure im S1PR2-Gen (DFNB68) beschrieben werden. Darüber hinaus wurden mehrere Patienten mit X-chromosomalem Hörverlust aufgrund von Defekten im POU3F4-Gen (DFNX2) und Deletionen im SMPX-Gen (DFNX4) diagnostiziert. Zusätzlich konnte mit Hilfe einer Exom-basierten Copy Number Variation-Analyse eine Deletion im OTOA-Gen (DFNB22) gefunden werden, welche sich bis in die Tandempseudogenregion erstreckte. Diese Untersuchung zeigt die enormen Möglichkeiten zur Detektion von Mutationen bei heterogenen Erkrankungen durch Anwendung von Next Generation Sequencing. Weiterhin konnte eine intragenische Deletion im Gen COL9A1 identifiziert werden, die im Zusammenhang mit einer scheinbar isolierten Hörstörung steht und durch den komplexen Umlagerungsmechanismus FoSTeS/MMBIR (Fork Stalling und Template Switching/Microhomology-mediated Break-induced Replication) entstand, der so bei Hörstörungen noch nicht beschrieben wurde. Auf der Suche nach Genen, die bisher noch nicht mit Hörstörungen assoziiert werden konnten, wurden acht Familien in eine Kandidatengenuntersuchung miteinbezogen und eine Exom-weite Analyse durchgeführt. Bei fünf Familien konnte noch keine ursächliche Variante identifiziert werden. Jedoch wurde bei drei Familien mit einer autosomal dominanten Schwerhörigkeit eine genetische Ursache identifiziert und TECTB, ATP11A und THBS2 konnten als Kandidatengene ermittelt werden. Diese Arbeit zeigt, wie wichtig es ist, die kausale Variante bei Hörstörungspatienten zu detektieren. Eine genetische Diagnostik ermöglicht eine endgültige Diagnose eines Syndroms, ist für die Klassifizierung der Hörstörung notwendig und trägt zu einer zukünftigen Therapie der Patienten bei. N2 - Nearly 500 million people are affected by hearing impairment. According to the World Health Organization (WHO), the prevalence of hearing loss will increase to one in ten people in 2050. It is expected that at least half of all cases have a genetic etiology. Due to recent advancements in sequencing technologies the genetic analysis of hearing loss gain in importance, especially in regard to family planning, directing appropriate therapies and engaging in future therapeutic approaches for hearing restoration. The following thesis describes the genetic causes of 155 familial cases with hearing loss. These cases were divided into two cohorts. One cohort (n = 74) included patients with a Caucasian background, while the other cohort (n = 81) comprised patients who were recruited from the Iran. A panel analysis using the TruSight One Panel (Illumina, San Diego, USA) as well as an exome sequencing approach were applied. The data were subsequently analyzed using bioinformatics programs such as GensearchNGS (PhenoSystems, Wallonia, Belgium). Overall, 55% of all cases disclosed a pathogenic or likely pathogenic genetic variant by utilizing next generation sequencing methods. Most of the resolved cases (ca. 73%) were detected in the Iranian cohort, a fact which is traced back to parental consanguinity and increased incidence of overall hearing impairment in the Iran. 27% of resolved cases were revealed in the second cohort. Variants in the genes MYO15A (DFNB3), LHFPL5 (DFNB67), TECTA (DFNB21), and SLC26A4 (DFNB4) were especially prevalent in Iranian patients. Variants in the genes TECTA and SLC26A4 were also identified in the Caucasian cohort. The two ethnic groups each exhibited a distinctly unique mutational landscape. Additionally, the overlapping clinical outcomes caused by pathogenic variants in a multitude of hearing impairment genes as well as the phenotypical different characters of variants in the same gene generating hearing loss and familial locus heterogeneity were observed. This work also described a de novo mutation in the CEACAM16 (DFNA4B) gene and described the effect of a recurrently substituted amino acid residue in the S1PR2 (DFNB68) gene. In addition, several X-linked hearing loss patients were diagnosed due to defects in the POU3F4 (DFNX2) gene and deletions in the SMPX (DFNX4) gene. Furthermore, exome-based copy number variation analysis identified a deletion in the OTOA (DFNB22) gene extending into the tandem pseudogene region. This study demonstrates the enormous potential for the detection of mutations in a genetically heterogeneous disorder applying next generation sequencing. Furthermore, an intragenic deletion in the gene COL9A1 was identified, which is related to an apparent isolated hearing impairment and was likely caused by the complex rearrangement of FoSTeS/MMBIR mechanism (fork stalling and template switching/microhomology-mediated break-induced replication), which has not been previously described in hearing disorders. In order to reveal new genes associated with hearing loss, eight families were investigated with an exome-wide analysis in a candidate gene study. In five families, no causal variant could be identified. However, a genetic cause was identified in three families with autosomal dominant hearing loss and TECTB, ATP11A, and THBS2 were identified as candidate genes. This work shows the importance of the identification of the causal variant. Herein, genetic diagnostic could be necessary for the final diagnosis of a syndrome, is important for classification of the hearing loss and contributes to a future therapy. KW - Hörstörungen KW - High throughput screening Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185331 ER - TY - THES A1 - Kurz, Andreas T1 - Correlative live and fixed cell superresolution microscopy T1 - Korrelative hochauflösende Mikroskopie an lebenden und fixierten Zellen N2 - Over the last decade life sciences have made an enormous leap forward. The development of complex analytical instruments, in particular in fluorescence microscopy, has played a decisive role in this. Scientist can now rely on a wide range of imaging techniques that offer different advantages in terms of optical resolution, recording speed or living cell compatibility. With the help of these modern microscopy techniques, multi-protein complexes can be resolved, membrane receptors can be counted, cellular pathways analysed or the internalisation of receptors can be tracked. However, there is currently no universal technique for comprehensive experiment execution that includes dynamic process capture and super resolution imaging on the same target object. In this work, I built a microscope that combines two complementary imaging techniques and enables correlative experiments in living and fixed cells. With an image scanning based laser spot confocal microscope, fast dynamics in several colors with low photodamage of the cells can be recorded. This novel system also has an improved resolution of 170 nm and was thoroughly characterized in this work. The complementary technique is based on single molecule localization microscopy, which can achieve a structural resolution down to 20-30 nm. Furthermore I implemented a microfluidic pump that allows direct interaction with the sample placed on the microscope. Numerous processes such as living cell staining, living cell fixation, immunostaining and buffer exchange can be observed and performed directly on the same cell. Thus, dynamic processes of a cell can be frozen and the structures of interest can be stained and analysed with high-resolution microscopy. Furthermore, I have equipped the detection path of the single molecule technique with an adaptive optical element. With the help of a deformable mirror, imaging functions can be shaped and information on the 3D position of the individual molecules can be extracted. N2 - Im letzten Jahrzehnt hat der Bereich der Lebenswissenschaften einen enormen Sprung nach vorne gemacht. Maßgeblich dafür waren die Entwicklung von komplexen Analysegeräten insbesondere in der Fluoreszenz Mikroskopie. Die Anwender können nun auf eine Vielzahl von Bildgebungstechniken zurückgreifen die unterschiedliche Vorzüge hinsichtlich optischer Auflösung, Aufnahmegeschwindigkeit oder Lebend Zell Kompatibilität bieten. Mithilfe dieser modernen Mikroskopietechniken lassen sich beispielsweise Multiproteinkomplexe auflösen, Membranrezeptoren zählen, zelluläre Signalwege analysieren oder die Internalisierung von Rezeptoren verfolgen. Für eine umfassende Experimentdurchführung, die Erfassung dynamischer Prozesse sowie superhochauflösende Bildgebung an ein und demselben Zielobjekt beinhalten, gibt es derzeit keine einheitliche Technik. In dieser Arbeit habe ich ein Mikroskop aufgebaut, das zwei komplementäre Bildgebungstechniken vereint und korrelative Experimente von lebend zu fixierten Zellen ermöglicht. Mit einem Image Scanning basierten Konfokal Mikroskop können schnelle Dynamiken in mehreren Farben mit geringer Photoschädigung der Zellen aufgenommen werden. Dieses neuartige System weist zudem eine Auflösungsverbesserung von 170 nm auf und wurde im Rahmen der Arbeit ausführlich charakterisiert. Die komplementäre Technik basiert auf der Einzel-Molekül Lokalisations Mikroskopie, mit der sich eine strukturelle Auflösung von bis zu 20 nm erreichen lässt. Desweiteren habe ich eine Mikrofluidpumpe implementiert, die eine direkte Interaktion mit der auf dem Mikroskop platzierten Probe erlaubt. Zahlreiche Prozesse wie Lebend-Zell Färbung, Lebend-Zell Fixierung, Immuno-Färbung und Puffertausch können damit direkt an der gleichen Zelle beobachtet und durchgeführt werden. So können dynamische Prozesse einer Zelle sozusagen eingefroren werden und die Strukturen von Interesse gefärbt und mit höchstauflösender Mikroskopie analysiert werden. Desweiteren habe ich den Detektionspfad der Einzel-Molekül Technik mit einem adaptiven optischen Element ausgestattet. Mithilfe eines deformierbaren Spiegels lässt sich so Abbildungsfunktion formen und Information zur 3D Position der einzelnen Moleküle gewinnen. KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Adaptive Optik KW - Image-Scanning Microscope KW - Correlative microscopy KW - Adaptive Optics Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199455 ER - TY - THES A1 - Michel, Konstanze T1 - Die kardiale Bedeutung des Hormons C-Typ natriuretisches Peptid (CNP) und dessen Guanylylcyclase B (GC-B) Rezeptor T1 - The cardiac role of the C-type natriuretic peptide (CNP) and its guanylyl cyclase B (GC-B) receptor N2 - In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden die kardialen Effekte des C-Typ natriuretischen Peptids (CNP) an wildtypischen Mäusen (Studie 1) und an einem neuen genetischen Mausmodell, mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des Guanylyl-Cyclase B (GC-B) Rezeptors (Studie 2) untersucht. In Studie 1 wurden die Wirkungen von exogenem, synthetischem CNP auf eine durch Druckbelastung-induzierte Herzinsuffizienz in wildtypischen Mäusen (C57Bl6 Hintergrund) untersucht. Dafür wurde CNP parallel zu einer operativen transversen Aortenkonstriktion (TAC) über osmotische Minipumpen in einer Dosierung von 50 ng/kg/min über 14 Tage appliziert. Die 14 Tage TAC führten zu einer ausgeprägten Linksherzhypertrophie. Diese wurde durch exogenes CNP auf zellulärer (verringerte Kardiomyozytenflächen) und molekularer (verringerte BNP mRNA Expression) Ebene signifikant gehemmt. Auch die durch TAC-induzierte linksventrikuläre Dilatation wurde durch exogenes CNP fast vollständig verhindert. Diese kardialen protektiven Effekte von CNP traten ohne eine wesentliche Veränderung des arteriellen Blutdrucks auf. Mögliche mechanistische Ursachen für die schützende Wirkung von CNP könnte die PKG-abhängige Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin sein. Eine gesteigerte Phosphorylierung von Titin an der elastischen N2B-Domäne verringert die Steifigkeit der Kardiomyozyten und verbessert somit deren Relaxationsfähigkeit (Hudson 2011). Die erhöhten linksventrikulären Volumina nach TAC (end-diastolische und end-systolische Volumina) wurden möglicherweise durch eine erhöhte Steifigkeit der Kardiomyozyten provoziert. Dies könnte durch den akuten IL-6 mRNA Anstieg nach TAC begünstigt werden, da Kruger et al. einen Zusammenhang zwischen passiver Steifigkeit der Kardiomyozyten und IL-6-Expression postulierten (Kotter 2016, Kruger 2009). Diese Veränderungen wurden durch exogenes CNP verhindert. Es ist wahrscheinlich, dass die CNP-induzierte Phosphorylierung von Titin an Serin 4080 in die Relaxationsfähigkeit der Kardiomyozyten und somit die diastolische Funktion des linken Ventrikels verbesserte. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde in Studie 2 untersucht, ob auch endogenes CNP als parakrines Hormon im Herzen eine TAC-induzierte Herzhypertrophie und die kontraktile Funktion von Kardiomyozyten bei einer hypertensiven Herzerkrankung beeinflussen kann. Dafür wurde ein neues genetisches Mausmodell mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des GC-B Rezeptors generiert (CM GC-B KO). Da vorangegangene Studien in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die basale CNP-Expression im Herzen sehr gering ist, nach 3-tägiger TAC aber akut ansteigt und nach 14-tägiger TAC wieder abfällt, haben wir CM GC-B KO Mäuse und deren Geschwister-Kontrolltiere an beiden Zeitpunkten nach TAC untersucht. Die TAC führte Genotyp-unabhängig zu einem Anstieg der kardialen Nachlast nach 3 Tagen und weiter nach 14 Tagen. Diese Druckbelastung provozierte eine progressive, signifikante Linksherzhypertrophie. Allerdings reagierten die CM GC-B KO Mäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren bereits nach 3-tägiger TAC mit einer ausgeprägten Kardiomyozyten-Hypertrophie. Zudem beobachteten wir nach 3-tägiger TAC in den Knockout-Mäusen eine Abnahme der Ejektionsfraktion und gleichzeitig eine signifikante Zunahme der beiden linksventrikulären Volumina (end-diastolische und end-systolische Volumen). Diese frühe linksventrikuläre Dilatation wurde in den Kontrolltieren nicht beobachtet. Daraus schlussfolgerten wir, dass endogenes kardiales CNP, dessen Expression zu frühen Zeitpunkten nach Druckbelastung ansteigt, das Herz vor kontraktiler Dysfunktion und Dilatation schützen kann. Um mögliche Mechanismen für die protektive Wirkung von endogenem CNP zu erklären, untersuchten wir die IL-6 mRNA Expression sowie die Titin-Phosphorylierung im Herzen. Der akute Anstieg der IL-6 mRNA Expression nach 3-tägiger TAC in den CM GC-B KO Mäusen korreliert mit der verminderten Phosphorylierung von Titin an der PGK-spezifischen Phosphorylierungsstelle (Serin 4080). Somit könnte der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg zu einer Inhibition pro-inflammatorischer Gene beitragen, da der akute IL-6 mRNA Anstieg in den Kontrollen nicht beobachtet wurde. Auch die gesteigerte NOX4 Expression 3 Tage nach TAC, könnte zu der frühen dilatativen Kardiomyopathie in den Knockout-Mäusen beigetragen haben. Die verringerte STAT3 Aktivierung in den CM GC-B KO Mäusen würde laut Literatur zu vermehrter Apoptose führen, indem pro-apoptotische Gene wie Bcl oder Bax vermehrt transkribiert werden. Auch die erhöhte Cxcl-1 mRNA Expression in den Knockout-Mäusen deutet zusammen mit dem IL-6 Anstieg auf vermehrte Entzündungsreaktionen 3 Tage nach TAC hin. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit darauf hin, dass der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg in frühen Stadien einer erhöhten kardialen Druckbelastung und der Entstehung einer dilatativen Kardiomyopathie entgegenwirken kann. Die Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin und die Hemmung der Expression pro-inflammatorischer Zytokine (speziell IL-6) könnten zu diesem protektiven Effekt beitragen. N2 - Here we investigated cardiac effects of c-type natriuretic peptide (CNP) in wildtype mice (study 1) and in a newly generated mouse model with cardiomyocyte-specific deletion of the guanylyl cyclase B (GC-B) receptor (study 2). In study 1 the effects of exogenous, synthetic CNP were investigated in wildtype mice (C57Bl6 background) after heart failure induced by pressure overload. Therefore, additionally to transverse aortic constriction (TAC) CNP (50 ng/kg/min) was administered via osmotic minipumps for 14 days. TAC provoked progressive heart hypertrophy. The TAC-induced hypertrophy was accompanied by enlarged cardiomyocyte areas and increased left ventricular mRNA levels of BNP. CNP significantly reduced cardiomyocyte areas and mRNA levels of BNP. Also, the TAC-induced left ventricular dilatation was almost prevented through synthetic CNP. These cardiac protective effects of CNP were accompanied by increased phosphorylation of the sarcomeric protein titin. Titin plays a critical role in maintaining the sarcomere structure and elasticity and thereby influences myocyte contraction and especially relaxation. The left ventricular end-diastolic and end-systolic volumes were significantly increased after TAC. The increased left-ventricular (end-diastolic and end-systolic) volumes after TAC are maybe provoked by an increased cardiomyocyte stiffness. The acute rise in IL-6 mRNA levels after TAC may favour these change, since Kruger et al postulate a relationship between passive cardiomyocyte stiffness and IL-6 expression. These changes were prevented by exogeneous CNP. Presumably, the CNP induced phosphorylation of titin on Serin 4080 within its elastic domain improves the cardiomyocyte relaxation and therefore the left-ventricular diastolic function. Because of these observations, we investigated in study 2, whether endogenous CNP as a paracrine hormone can affect TAC-induced hypertrophy and contractile function of cardiomyocytes. Therefore, we generated a new genetic mouse model with a cardiomyocyte specific deletion of the GC-B receptor (CM GC-B KO). Since previous studies in our group demonstrated that cardiac baseline expression levels of CNP are very low, but they markedly increased 3 days after TAC and decline to baseline levels 14 days after TAC, CM GC-B KO mice and control littermates were investigated at both timepoints after TAC. TAC resulted in increased cardiac afterload after 3 days, and more after 2 weeks, which was similar in both genotypes. Pressure overload provoked a progressive and significant cardiac hypertrophy, shown by the increased heart weight/body weight ratios, and were confirmed by histology. More severe myocyte hypertrophy was shown 3 days after TAC in CM GC-B KO mice, compared with control mice. Left ventricular contractile functions were also investigated by invasive catheterization in anesthetized mice. Notably, while in control mice subjected to TAC the LV ejection fraction was only mildly decreased, the KO mice reacted with a very marked and early decrease of the ejection fraction at three days after TAC, which tend to improve later on. Even more, the left ventricular end-diastolic and end-systolic volumes were markedly increased in the KO mice 3 days after TAC, indicating left ventricular dilatation. Again, this acute dilatation seems to reverse or improve at later stages. Such changes were not observed in control mice. To clarify possible downstream signalling pathways mediating these protective effects of CNP, we investigated titin-phosphorylation and IL-6 expression after 3 days of TAC. The acute increased IL-6 mRNA expression correlates well with the diminished phosphorylation of titin (serin 4080) in CM GC-B KO mice. Also, the increased NOX4 expression 3 days after TAC, could be one of the reasons of the early dilatation in KO mice. The diminished phosphorylation of STAT3 in CM GC-B KO mice may induce apoptosis by transcription of Bcl or Bax genes. Also, the increased mRNA expression of Cxcl-1 and IL-6 after 3 days of TAC can lead to more inflammation the hearts of the KO mice. In summary, these results show, that the CNP/GC-B/cGMP pathway can prevent cardiac dilatation in early stages. The phosphorylation of titin and the inhibition of the pro-inflammatory cytokines can contribute to this protective effects of CNP in the heart. KW - Herzinsuffizienz KW - Peptide KW - Kardiomyopathie KW - C-Typ natriuretisches Peptid KW - Guanylylcyclase B Rezeptor KW - kardiale Hypertrophie KW - c-type natriuretic peptide KW - guanylyl cyclase B receptor KW - cardiac hypertrophy Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200211 ER - TY - THES A1 - Olivares-Baerwald, Silvana T1 - Die Rolle von Calcineurin im Nukleus von Kardiomyozyten und ein innovativer Inhibitor als neuer therapeutischer Ansatz bei kardialer Hypertrophie T1 - The role of calcineurin in the nucleus of cardiomyocytes and an innovative inhibitor as a new therapy approach to treat cardiac hypertrophy N2 - Die Calcineurin/NFAT-Signalkaskade spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer kardialen Hypertrophie. Im Zytoplasma von Kardiomyozyten wird die Phosphatase Calcineurin nach Stimulierung der Zellen, z. B. durch Dehnungsreize, Angiotensin II (Ang II) oder Endothelin I (ET-1), und einen daraus folgenden intrazellulären Ca2+-Strom aktiviert. Dies führt zur Dephosphorylierung von NFAT und zu dessen nukleärer Translokation. In früheren Arbeiten von Ritter et al. wurden sowohl eine nukleäre Lokalisationssequenz (NLS) als auch eine nukleäre Exportsequenz (NES) innerhalb von Calcineurin identifiziert, die den Transport von Calcineurin zwischen dem Zytoplasma und dem Nukleus ermöglichen. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde das Import Blocking Peptid (IBP) entwickelt. Dieses Peptid entspricht der NLS von Calcineurin und blockiert die Calcineurin-Bindungsstellen des Shuttleproteins (Karyopherins) Importin β1. So wird die Translokation von Calcineurin in den Nukleus unterbunden und die Signalkaskade zur Aktivierung von Hypertrophie-Genen in Kardiomyozyten unterbrochen. Dabei blieb die Phosphatase-Aktivität von Calcineurin unbeeinflusst. Eines der Ziele dieser Arbeit war, IBP weiter zu optimieren und den „proof of principle“ auch in vivo zu führen. Hierfür wurden u. a. ein geeignetes Lösungsmittel bestimmt (biokompatibel und an die Peptidcharakteristika angepasst), die Peptidstruktur modifiziert (Erhöhung der Spezifität/Wirksamkeit) und die erforderliche Dosis weiter eingegrenzt (Belastungs- und Kostenreduktion). Unter Verwendung einer TAMRA-markierten Wirkstoffvariante konnten der Weg des Peptids in Mäusen nachverfolgt und die Ausscheidung quantifiziert werden. Aufbauend auf den Ergebnissen von Burkard et al., die die Entstehung einer konstitutiv-aktiven und nukleären Calcineurin-Isoform nach proteolytischer Spaltung durch Calpain nachwiesen, wurde die Rolle von Calcineurin im Zellkern genauer untersucht. Außerdem sollte die Frage beantwortet werden, wie (über Calcineurin?) die Herzmuskelzelle zwischen Calciumschwankungen im Zuge der Exzitations-Kontraktions-Kopplung (ECC) und vergleichsweise schwachen Calciumsignalen zur Transkriptionsteuerung unterscheidet. Mit Hilfe von nukleären Calcineurin-Mutanten, die einen Defekt in der Ca2+-Bindung aufwiesen, konnte die Bedeutung von Calcineurin als Calciumsensor für die NFAT-abhängige Transkription nachgewiesen werden. Im Mausmodell waren unter Hypertrophie-Bedingungen die Ca2+-Transienten in der nukleären Mikrodomäne signifikant stärker als im Zytosol, wodurch die Hypothese, dass die Aktivierung der Calcineurin/NFAT-Signalkaskade unabhängig von zytosolischem Ca2+ erfolgt, gestützt wird. Messungen von nukleären und zytosolischen Ca2+-Transienten in IP3-Sponge-Mäusen zeigten im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen keine Erhöhung des Ca2+-Spiegels während der Diastole, was auf eine Rolle von Inositoltrisphosphat (IP3) in der Signalkaskade deutet. Außerdem zeigten isolierte Zellkerne ventrikulärer adulter Kardiomyozyten eine erhöhte Expression des IP3-Rezeptors 2 (IP3R2) nach Ang II-Stimulierung. Diese gesteigerte Expression war abhängig von der Calcineurin/NFAT-Kaskade und bestand sogar 3 Wochen nach Entfernung des Ang II-Stimulus fort. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass nukleäres Calcineurin als ein Ca2+-Sensor agiert, dass die lokale Ca2+-Freisetzung im Kern über IP3-Rezeptoren detektiert wird und dass dies im Zusammenspiel mit NFAT die Transkription von Hypertrophiegenen initiiert. N2 - The Calcineurin/NFAT signaling pathway plays an important role in the development of cardiac hypertrophy. Calcineurin is activated in the cytoplasm of cardiac myocytes by the interaction of different factors, e.g. Ang II or ET-1, with structures of the cell surface, this leads to the desphosphorylation of NFAT and its translocation into the nucleus. Previous works by the working group led to the detection of a nuclear localization sequence (NLS) and a nuclear export signal (NES) within the Calcineurin domains. They are required for the transport of Calcineurin through the nuclear membrane. Supported by these findings the import blocking peptide (IBP) was conceived. IBP mimics the NLS of Calcineurin and binds to the shuttle protein Importin β1, thereby blocking the binding sites for Calcineurin and inhibiting the transport of Calcineurin to the nucleus. One characteristic of the peptide is that it does not affect the phosphatase activity of Calcineurin. The aim of this project was to improve the peptide and to investigate its efficacy in vivo. We identified the optimal solvent and were able to significantly improve the solubility of IBP. We developed new isoforms of IBP with higher specificity. We were able to identify the minimal effective dose and studied the degradation and excretion of the substance in vivo. As shown by Burkard et al., Calcineurin is proteolytically cleaved by calpain, which leads to a constitutively active Calcineurin form. We investigated the role of this isoform in the nucleus. Furthermore, we investigated how Calcineurin is able to differentiate between Ca2+ fluctuations in the course of excitation contraction coupling (ECC) and Ca2+ signals for a hypertrophic response. Nuclear Calcineurin mutants defective for Ca2+ binding failed to activate NFAT-dependent transcription. Under hypertrophic conditions Ca2+ transients in the nuclear microdomain were significantly higher than in the cytosol providing a basis for sustained Calcineurin/NFAT mediated signaling uncoupled from cytosolic Ca2+. Measurements of nuclear and cytosolic Ca2+ transients in IP3 sponge mice showed no increase of Ca2+ levels during diastole as we detected in wildtype mice. Nuclei, isolated from ventricular myocytes of mice after chronic Ang II treatment, showed an elevation of IP3R2 expression which was dependent from calcineurin/NFAT signaling and persisted for 3 weeks after removal of the Ang II stimulus. Thus, we demonstrate that nuclear calcineurin was able to act as a nuclear Ca2+ sensor detecting local Ca2+ release from the nuclear envelope via IP3R. KW - kardiale Hypertrophie KW - Calcineurin Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208080 ER - TY - THES A1 - Vikuk, Veronika T1 - Epichloë endophyte-grass symbioses in Germany – Infection rates, alkaloid concentrations and possible intoxication risks T1 - Epichloë Endophyt-Gras Symbiosen in Deutschland – Infektionsraten, Alkaloidkonzentrationen und mögliche Vergiftungsrisiken N2 - Endophytes live in partial symbiosis inside a plant and have been detected in all tested plants. They belong to the group of fungi or bacteria and their ecological function is mostly unknown. The fungal endophytes of the genus Epichloë belong to a special group of endophytes. Epichloë endophytes live symbiotically inside cool season grass species and some of them are able to produce alkaloids toxic to vertebrates and insects. Their symbiosis is seen as mutualistic for the following reasons: the fungus provides the plant herbivore resistance by producing alkaloids, and it increases the plant’s drought tolerance as well as its biomass production. In return, the grass provides the fungus shelter, nutrients and dispersal. Epichloë endophytes are host specific and the ability to produce alkaloids differs between species. In order to estimate intoxication risks in grasslands, it is necessary to detect infection rates of different grass species with Epichloë endophytes, and to determine the genotypes and chemotypes of the Epichloë species as well as the produced alkaloid concentrations. Factors like land-use intensity or season may have an influence on infection rates and alkaloid concentrations. Also, different methodological approaches may lead to different results. In this doctoral thesis my general aim was to evaluate intoxication risks in German grasslands caused by Epichloë endophytes. For that I investigated infection rates of different grass species and the genotypes and chemotypes of their Epichloë endophytes in German grasslands (Chapter II). Furthermore, I compared alkaloid concentrations detected with dry and fresh plant weight and different analytical methods. I also detected possible changes on the influence of season or land-use intensity (Chapter III). Additionally, I examined infections with Epichloë endophytes and alkaloid concentrations in commercially available grass seed mixtures and determined how that influences the intoxication risk of grazing animals in Europe (Chapter IV). It is of agricultural interest to estimate intoxication risks for grazing livestock on German grasslands due to Epichloë infected grass species. Therefore, it is important to investigate which grasses are infected with the Epichloë endophyte, if the endophytes have the ability to produce vertebrate and invertebrate toxic alkaloids and if the alkaloids are indeed produced. I showed that Epichloë festucae var. lolii infecting agriculturally important Lolium perenne lacked the starting gene for ergovaline biosynthesis. Hence, vertebrate toxic ergovaline was not detected in the majority of the collected L. perenne plants. The detection of alkaloid concentrations is an important tool to estimate intoxication risk for vertebrates, but also invertebrates. My studies showed that the usage of dry plant material is crucial to quantify the correct alkaloid concentrations, and that alkaloid concentrations can vary depending on the detection method. Hence, the usage of validated, similar detection methods is important to be able to compare alkaloid concentrations from different studies. Nevertheless, the trends of seasonal changes and the influence of land-use intensity stayed the same, regardless if dry or fresh plant weight was used. Also, alkaloid concentrations were below toxicity thresholds on population level, regardless of the method used. Two commercially available forage grass and two commercially available turf grass seed mixtures were infected with Epichloë endopyhtes and alkaloids were detected. This might contribute to the spreading of Epichloë endopyhtes in Germany, therefore seed mixtures should be tested for Epichloë infections. My results indicate that the intoxication risk is generally low in Germany at the moment, although that might change due to climate change, an increase of monocultural land-use, or the seeding of Epichloë infected grass seeds. N2 - Endophyten leben, zumindest zeitweise, symbiontisch in Pflanzen und sind bisher in allen untersuchten Pflanzen nachgewiesen worden. Es handelt sich dabei um Pilze oder Bakterien und ihre ökologische Funktion ist meistens unbekannt. Eine spezielle Gruppe der Endophyten sind Pilzendophyten der Gattung Epichloë. Diese leben symbiontisch innerhalb von kaltgemäßigten Grasarten und einige sind in der Lage vertebraten- und/oder insektentoxische Alkaloide herzustellen. Die Symbiose wird meist als mutualistisch bezeichnet, weil der Pilz der Pflanze einen Herbivorenschutz durch die Produktion der Alkaloide und eine gesteigerte Trockenresistenz und Biomassesteigerung bietet. Das Gras hingegen bietet dem Pilz Unterkunft, Nährstoffe und Verbreitung. Epichloë Endophyten sind wirtsspezifisch und die Fähigkeit Alkaloide zu produzieren schwankt zwischen den Arten. Um das Vergiftungsrisiko im Grünland einzuschätzen, ist es nötig Infektionsraten verschiedener Grasarten mit Epichloë Endophyten, die Geno- und Chemotypen der Epichloë Arten, und die produzierten Alkaloidkonzentrationen zu bestimmen. Faktoren wie Landnutzungsintensität oder die Jahreszeit können Infektionsraten und Alkaloidkonzentrationen beeinflussen. Ebenso können Alkaloidkonzentrationen von methodischen Faktoren abhängen. In dieser Doktorarbeit habe ich Infektionsraten verschiedener Grasarten in Deutschland und die Geno- und Chemotypen ihrer Epichloë Endophyten untersucht (Kapitel II). Außerdem habe ich Alkaloidkonzentrationen mit Frisch- bzw. Trockengewicht gemessen und mit verschiedenen analytischen Methoden verglichen, um mögliche Änderungen beim Einfluss von Jahreszeiten oder der Landnutzungsintensität zu detektieren. Des Weiteren habe ich das Vergiftungsrisiko auf deutschen Grasflächen abgeschätzt (Kapitel III). Zusätzlich habe ich kommerziell erhältliche Grassaatgutmischungen auf Epichloë Infektionen und Alkaloidgehalt untersucht und habe versucht einzuschätzen, wie sich das auf das Vergiftungsrisiko von Weidevieh in Europa auswirkt (Kapitel IV). Die Einschätzung von Vergiftungsrisiken für Weidevieh aufgrund von Epichloë infizierten Grasarten auf deutschen Graslandflächen ist von landwirtschaftlichem Interesse. Deshalb ist es wichtig zu untersuchen, welche Grasarten mit Epichloë Endophyten infiziert sind, ob der Endophyt in der Lage ist vertebraten- oder insektentoxische Alkaloide zu produzieren und ob diese tatsächlich produziert werden. Ich konnte zeigen, dass Epichloë festucae var. lolii, welches das landwirtschaflich wichtige Lolium perenne infiziert, das Startgen für die Ergovalinbiosynthese fehlt. Deshalb wurde das vertebraten-toxische Ergovalin in der Mehrheit der gesammelten L. perenne Pflanzen nicht nachgewiesen. Die Detektion von Alkaloidkonzentrationen ist ein wichtiges Werkzeug, um das Vergiftungsrisiko für Vertebraten aber auch Invertebraten einschätzen zu können. Ich konnte zeigen, dass die Verwendung von trockenem Pflanzenmaterial essenziell ist, um korrekte Alkaloidkonzentrationen zu quantifizieren und dass Alkaloidkonzentrationen in Abhängigkeit von der Detektionsmethode schwanken können. Deshalb ist die Verwendung von validierten, ähnlichen Detektionsmethoden wichtig, um die Alkaloidkonzentrationen von verschiedenen Studien vergleichen zu können. Dennoch blieben die jahreszeitlichen Trends und der Einfluss von Landnutzungsintensität gleich, egal ob Trocken- oder Frischgewicht der Pflanze verwendet wurde und Alkaloidkonzentrationen lagen unter der Toxizitätsschwelle auf Populationsebene. Ich konnte außerdem zeigen, dass zwei kommerziell erwerbliche Futtergrasmischungen, sowie zwei Rasengrasmischungen mit Epichloë Endophyten infiziert waren und auch Alkaloide detektiert werden konnten. Das könnte zu einer weiteren Ausbreitung von Epichloë-Endophyten in Deutschland beitragen, weshalb Saatgutmischungen auf Epichloë Infektionen getestet werden sollten. Meine Ergebnisse zeigen, dass das Vergiftungsrisiko in Deutschland im Moment generell eher niedrig ist. Allerdings kann sich das auf Grund von Klimawandel, zunehmenden Monokulturen in der Landnutzung, aber auch der Aussaat von Epichloë infiziertem Saatgut ändern. KW - Endophytische Pilze KW - HPLC-MS KW - Deutsches Weidelgras KW - Weidegräser KW - Alkaloide KW - intoxication risk KW - alkaloid concentrations KW - Epichloe endophytes KW - cool-season grass species KW - infection rates Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213895 ER - TY - THES A1 - Thelen, David T1 - Erstellung eines genregulatorischen Netzwerkes zur Simulation der Entstehung von Zahnhartsubstanz T1 - Construction of a gene regulatory network to simulate the formation of dental hard tissue N2 - In this dissertation, the author describes the creation of a basic bioinformatic model of human enamel maturation. Supported by the interactions found in the KEGG Pathway database, we were able to establish a gene regulatory network (GRN) that focuses primarily on the signal transduction pathways apoptosis, cell cycle, hedgehog signaling pathway, MAP kinase pathway, mTOR signaling pathway, Notch signaling pathway, TGF-β signaling pathway and Wnt signaling pathway. We extended this through further verified interactions and implicated the tooth-specific genes AMELX, AMELY, AMBN, ENAM and DSPP. In the subsequent simulation of the network by the simulation tool Jimena, six stable states could be identified. These are examined in more detail and juxtaposed with results of a GEO dataset. The long-term goal is to draw conclusions about the odontogenesis of humans through consistent optimization of the bioinformatics network. N2 - In dieser Dissertation beschreibt der Autor die Erstellung eines grundlegenden bioinformatischen Modelles der menschlichen Zahnschmelzreifung. Mithilfe der KEGG Pathway-Datenbank wurde ein genregulatorisches Netzwerk (GRN) erstellt, welches maßgeblich auf den Signaltransduktionswegen Apoptose, Zellzyklus, Hedgehog-Signalweg, MAP-Kinase-Weg, mTOR-Signalweg Notch-Signalweg Signalweg, TGF-β-Signalweg und Wnt-Signalweg basiert. Im Weiteren wurde dieses Netzwerk durch zahlreiche verifizierte Wechselwirkungen erweitert und die zahnspezifischen Gene AMELX, AMELY, AMBN, ENAM und DSPP implementiert. In der anschließenden Simulation des Netzwerks mit dem Simulations-Tool Jimena konnten sechs stabile Zustände identifiziert werden. Diese wurden genauer untersucht und den Erkenntnissen eines GEO-Datensatzes gegenübergestellt. Langfristiges Ziel ist es, durch konsequente Optimierung des bioinformatischen Netzwerks Rückschlüsse auf die Odontogenese des Menschen zu ziehen. KW - Universität Würzburg. Lehrstuhl für Bioinformatik KW - Boolesches Netz KW - Zahnentwicklung KW - Amelogenese KW - Genregulation KW - genregulatorisches Netzwerk Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204068 ER - TY - THES A1 - Fuß, Antje T1 - Evaluierung des Nachweises von Schistosoma mansoni DNA mittels Real-Time PCR in verschiedenen humanen Proben sowie den Zwischenwirtschnecken in einer Hochprävalenzregion am Viktoriasee in Tansania T1 - Evaluation of the detection of Schistosoma mansoni DNA by real-time PCR in different human samples and the intermediate host snails in a high prevalence region at Lake Victoria in Tanzania N2 - Die Schistosomiasis ist nach wie vor eine der häufigsten parasitären Erkrankungen der Welt und verursacht erhebliche gesundheitliche und wirtschaftliche Folgen, insbesondere in ärmeren, ländlichen Regionen. Durch Immunreaktionen auf die im Wirt abgelegten Eier des Parasiten können sich chronische Verlaufsformen manifestieren. Dabei kann es zu irreversiblen Schäden kommen. Um dies zu verhindern sind eine frühe und sichere Diagnose sowie eine Behandlung mit Praziquantel (PZQ) unabdingbar. Zudem spielt der zuverlässige Nachweis der Schistosomiasis eine Schlüsselrolle bei der Überwachung, Prävention und Kontrolle der Erkrankung. In epidemiologischen Studien findet am häufigsten die mikroskopische Kato-Katz (KK)-Methode zum Nachweis von Schistosoma mansoni Eiern im Stuhl Anwendung. Dieses Verfahren ist äußerst spezifisch und bietet die Möglichkeit der Quantifizierung, wodurch die Intensität der vorliegenden Infektion bestimmt werden kann. Die Sensitivität der Testmethode ist jedoch nur moderat, insbesondere bei einer niedrigen Infektionsintensität. Zudem kann eine Infektion erst nach der Präpatenzzeit nachgewiesen werden. Der ebenfalls häufig eingesetzte urinbasierte Point-of-Care Circulating Cathodic Antigen (POC-CCA)-Test weist zwar eine höhere Sensitivität aber geringere Spezifität als das KK-Verfahren auf. Als hochsensitive und sehr spezifische Methode zur Diagnose der Schistosomiasis hat sich der Nachweis von Schistosoma-spezifischer DNA mittels Real-Time PCR herausgestellt. Allerdings wird für die Durchführung dieser Technik ein gut ausgestattetes Labor benötigt, das sich in der Regel nicht in unmittelbarer Nähe zum Patienten im Feld befindet. Daher ist es besonders wichtig, über praktikable und schnelle Konservierungsmethoden zu verfügen, die bevor die Extraktion und Amplifikation der DNA stattfindet, einen einfachen Transport und eine einfache Lagerung des Probenmaterials ermöglichen. Das Ziel des ersten Teils der vorliegenden Arbeit war, die Sensitivität und Spezifität der klassischerweise verwendeten KK-Methode und des POC-CCA-Tests mit der Real-Time PCR- Methode unter Verwendung von Stuhlproben, Urinproben, Serumproben sowie auf Filterpapier getrocknete Blutproben (dried blood spots – DBSs) zu vergleichen. Zudem wurde die Anwendbarkeit der Real-Time PCR aus Serum- und Urinproben zur Therapiekontrolle überprüft. Die dazu notwendigen Studien wurden alle in der Region Mwanza in Tansania durchgeführt, welche als hochendemisch für S. mansoni gilt. Für die Untersuchungen zur stuhlbasierten Real-Time PCR wurden als Studienteilnehmer Schulkinder gewählt. Aufgrund der erforderlichen Blutabnahme wurden die anderen Teilstudien nur mit erwachsenen Probanden durchgeführt. Unter Verwendung der KK-Methode als Goldstandard erzielten die Real-Time PCR aus Stuhlproben und der POC-CCA-Test sehr hohe Sensitivitäten von 99,5% bzw. 89,7%, jedoch nur geringe Spezifitäten von 29,55% und 22,73%. Die KK-Methode weist bekanntermaßen nur eine geringe bis moderate Sensitivität auf und ist daher nicht gut als Referenz geeignet. Deshalb wurde zusätzlich eine latente Klassenanalyse angewandt, um die tatsächlich Erkrankten zu ermitteln und anhand dieser die diagnostische Güte der verwendeten Tests zu bestimmen. Hier zeigte der POC-CCA-Test die höchste Sensitivität (99,5%) sowie eine Spezifität von 63,4%. Der Real-Time PCR-Test hatte eine Sensitivität von 98,7% und die höchste Spezifität (81,2%). Die Spezifität der KK-Technik betrug 72,8%, die Sensitivität war signifikant niedriger (89,7%) als bei den anderen beiden Methoden. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass der POC-CCA-Schnelltest empfindlicher ist als die KK-Methode und zum Screening von S. mansoni-Infektionen eingesetzt werden kann. Die Stuhl-PCR war zwar ebenfalls hochsensitiv und zeigte unter den drei getesteten Diagnoseverfahren die höchste Spezifität, aber aufgrund der höheren Kosten und der komplizierten Anwendung sollte für epidemiologische Untersuchungen in Hochprävalenzregionen der POC-CCA-Test bevorzugt werden. Bei unklaren Diagnosen kann die Real-Time PCR-Methode als Bestätigungstest Anwendung finden. In der Teilstudie zur serum- und urinbasierten Real-Time PCR in einer endemischen Region vor und nach der Behandlung mit PZQ wurden folgende Ergebnisse erzielt: Unter Verwendung einer kombinierten Referenz aus den Ergebnissen des parasitologischen KK-Tests und / oder der serumbasierten PCR konnte zu Studienbeginn eine Prävalenz von S. mansoni von 77,1% ermittelt werden. In Bezug auf die Sensitivität zeigte der DNA-Nachweis aus Serum (96,3%) und der POC-CCA-Assay (77,8%) die höchsten Ergebnisse. Die urinbasierte Real-Time PCR zeigte die geringste Empfindlichkeit (33,3%). Durch die Behandlung mit Praziquantel wurde eine signifikante Reduktion der S. mansoni Prävalenz erreicht. Zwanzig Wochen nach Therapie konnte durch die KK-Methode keine, mit dem POC-CCA-Test 33,3% und mit der serumbasierten Real-Time PCR 58,3% Infektionen festgestellt werden. Die Analyse der mittels der serumbasierten PCR bestimmten mittleren Ct-Werte im zeitlichen Verlauf zeigte, dass dieser eine Woche nach der Behandlung signifikant abnahm (von 30,3 auf 28) und 20 Wochen später über den Basiswert (34,9) anstieg. Der Ct-Wert ist umgekehrt proportional zur DNA-Ausgangsmenge, die in die PCR eingesetzt wurde. Dies deutet darauf hin, dass kurz nach der Therapie ein DNA-Anstieg zu verzeichnen war und 20 Wochen später weniger DNA als zu Beginn der Studie nachweisbar war. Dieser DNA-Verlauf lässt verschiedene Interpretationsmöglichkeiten zu. Die Daten zeigen jedoch, dass die serumbasierte Real-Time PCR eine ausgezeichnete diagnostische Genauigkeit aufweist. Da die nachgewiesene DNA jedoch keine Rückschlüsse auf das Parasitenstadium zulässt und es sich hierbei auch um DNA aus im Gewebe verbliebenen Eiern oder Reinfektionen handeln könnte, ist diese Methode in Hochprävalenz- Regionen nicht zur Therapiekontrolle geeignet. Die Verwendung von Urin zum DNA-Nachweis erzielte keine vielversprechenden Ergebnisse. Die Sensitivität der Real-Time PCR aus DBSs war ebenfalls sehr gering (45,4%) und kann ohne weitere ausführliche Testung hinsichtlich Lagertemperatur, Lagerdauer, verschiedener Filterpapierarten und Extraktionsmethoden nicht empfohlen werden. Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse dieser Studien, dass sowohl die stuhl- als auch die serumbasierte Real-Time PCR bei der Erkennung und Bewertung der Infektionsprävalenz, einem wichtigen Aspekt epidemiologischer Studien, deutlich empfindlicher ist als das mikroskopische KK-Verfahren. Aufgrund des hohen Kosten- und Personalaufwandes und der Notwendigkeit eines gut ausgestatteten Labors wird sich diese Methode aber nicht zum Screening in hochendemischen Ländern durchsetzen. Sie kann jedoch einen Mehrwert bei der Diagnose der Schistosomiasis bieten, vor allem bei frühen oder leichten Infektionen. Zudem kann diese hochsensitive und spezifische Methode als Bestätigungstest bei unklaren Diagnosen herangezogen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden malakologische Untersuchungen zur Identifizierung potenzieller Übertragungsorte für die Schistosomiasis rund um die im Viktoriasee gelegene Insel Ijinga durchgeführt. Diese Analysen fanden innerhalb eines Pilotprojektes zur Eliminierung der Erkrankung auf der Insel Ijinga statt, wobei ein intensiviertes Behandlungsprotokoll, welches die gesamte Inselbevölkerung einschloss, Anwendung fand. Die Kontrolle der Praziquanteleffektivität nach mehreren Behandlungsrunden bringt eine Reihe diagnostischer Herausforderungen mit sich. Hier könnte die Beurteilung der Schistosoma-Infektion in den Zwischenwirtschnecken vor und nach der Therapie als Indikator für den Erfolg der Maßnahme dienen. Zu diesem Zweck erfolgte zunächst eine Baseline-Untersuchung, bei der Schnecken an Uferregionen gesammelt wurden, an denen die Inselbewohner häufigen Wasserkontakt hatten. Die Schnecken wurden anhand morphologischer Merkmale identifiziert und mithilfe der Real-Time PCR-Methode auf Infektionen mit S. mansoni untersucht. Insgesamt wurden 35,4% (279/788) S. mansoni- positive Zwischenwirtschnecken (Biomphalaria) detektiert. Dies verdeutlicht, dass an den meisten Wasserkontaktstellen um die Insel Ijinga ein potentielles Risiko für die Übertragung der Schistosomiasis besteht. Die mithilfe der KK-Methode ermittelte Gesamtprävalenz von S. mansoni in der humanen Bevölkerung betrug 68,9%. Nachdem die Bewohner der Insel viermal mit PZQ behandelt wurden, zeigte sich in der kontinuierlich überwachten Sentinelgruppe eine Reduktion der Prävalenz auf 28,7%. Zu diesem Zeitpunkt wurde ebenfalls die Analyse der Schnecken wiederholt und es konnten 16,8% (57/350) Schnecken mit einer S. mansoni Infektion nachgewiesen werden. Die Reduktion der Infektionshäufigkeit in den Schnecken vor und nach der viermaligen Behandlung der Bevölkerung war signifikant (χ² = 74.335, p < 0,001). Dies deutet darauf hin, dass die intermediären Wirtsschnecken zur Überwachung von Kontrollmaßnahmen verwendet werden können. N2 - Schistosomiasis remains one of the most common parasitic infections in the world, causing significant health and economic consequences, particularly in rural areas. Immune reactions to the parasite's eggs deposited in the host can lead to chronic progression. This may result in to irreversible damage. In order to prevent this, an early and reliable diagnosis and a concomitant therapy will be indispensable. In addition, the reliable detection of schistosomiasis plays a key role in monitoring, prevention and control of the disease. In epidemiological studies, the microscopic Kato-Katz (KK) method is most frequently used to detect eggs in stool. This method is highly specific and offers the possibility of quantification, which allows to determine the intensity of the existing infection. However, especially at low infection intensities, the sensitivity of the test method is rather moderate. Furthermore, infections can only be detected after the prepatent period. The also frequently used urine-based Point-of-Care Circulating Cathodic Antigen (POC-CCA) test shows a higher sensitivity but lower specificity than the KK method. The detection of schistosome-specific DNA through Real-Time PCR has proven to be a highly sensitive and very specific method for the diagnosis of schistosomiasis. However, this assay requires a well-equipped laboratory, which is usually not located in the immediate vicinity of the patient in the field. Therefore, it is particularly important to have practical and rapid preservation methods that allow easy transport and storage of the sample material before DNA extraction and amplification takes place. The aim of the first part of this dissertation was to compare the sensitivity and specificity of the classical KK method and the POC-CCA test with the Real-Time PCR method using stool samples, urine samples, serum samples and blood samples dried on filter paper (dried blood spots – DBS). In addition, tests were conducted regarding the applicability of Real-Time PCR from serum and urine samples for therapy control. The necessary studies were all carried out in the Mwanza region of Tanzania, which is considered to be highly endemic for S. mansoni. Schoolchildren were selected as study participants for the studies on stool-based Real-Time PCR. Due to the required blood collection, the other partial studies were conducted with adults only. Using the KK method as gold standard, the Real-Time PCR from stool samples and the POC-CCA test achieved very high sensitivities of 99.5% and 89.7%, respectively, but only low specificities of 29.55% and 22.73%. The KK method is known to have low to moderate sensitivity and is therefore not well suited as a reference. For this reason, a latent class analysis was carried out to determine the true patients and the diagnostic quality of the tests used. The POC-CCA test showed the highest sensitivity (99.5%) and a specificity of 63.4%. The Real-Time PCR test had a sensitivity of 98.7% and the highest specificity (81.2%). The specificity of the KK technique was 72.8%, the sensitivity was significantly lower (89.7%) than with the other two methods. These results show that the POC-CCA rapid test is more sensitive than the KK method and can be used to screen for S. mansoni infections. Although stool PCR is also highly sensitive and shows the highest specificity of the three diagnostic methods tested, the POC-CCA test should be preferred for epidemiological investigations in high prevalence regions on account of the higher costs and complicated application. If the diagnosis is unclear, the Real-Time PCR method can be used as a confirmatory test. The following results were obtained in the partial study regarding the use of serum and urine-based Real-Time PCR in an endemic region before and after treatment with Praziquantel (PZQ): Using a combined reference of the results of the parasitological KK test and / or the serum-based PCR, a prevalence of S. mansoni of 77.1% could be determined at the beginning of the study. In terms of sensitivity, DNA detection from serum (96.3%) and the POC-CCA assay (77.8%) showed the highest results. Urine-based Real-Time PCR showed the lowest sensitivity (33.3%). Treatment with Praziquantel significantly reduced the prevalence of S. mansoni. Twenty weeks after therapy, no infections could be detected with the KK method, 33.3% with the POC-CCA test and 58.3% with the serum-based Real-Time PCR. Analysis of mean Ct-values determined by serum-based Real-Time PCR over time showed that it decreased significantly (from 30.3 to 28) one week after treatment and increased above the baseline value (34.9) 20 weeks later. The Ct-value is inversely proportional to the initial amount of DNA added to the PCR. This suggests that shortly after therapy there was an increase in DNA and 20 weeks later less DNA was detectable compared to the beginning of the study. This DNA progression offers various interpretation possibilities. However, the data show that serum-based Real-Time PCR has excellent diagnostic accuracy. Yet, since the detected DNA does not allow conclusions to be drawn about the parasite stage and this could also be DNA from eggs remaining in the tissue or reinfections, this method is not suitable for therapy control in high prevalence regions. The use of urine for DNA detection did not yield promising results. The sensitivity of the Real-Time PCR from DBSs was also very low (45.4%) and cannot be recommended without further extensive testing with regard to storage temperature, storage time, different filter paper types and extraction methods. In summary, the results of these studies showed that Real-Time PCR is significantly more sensitive than microscopy in the detection and evaluation of infection prevalence, an important aspect of epidemiological studies. However, due to the high costs and personnel involved and the need for a well-equipped laboratory, this method will not be accepted for screening in high-endemic countries. Yet, it can provide added value in the diagnosis of schistosomiasis, especially in early or light infections. In addition, this highly sensitive and specific method can be used as a confirmatory test for unclear diagnoses. The second part of this dissertation describes malacological investigations to identify potential transmission sites for schistosomiasis around Ijinga Island located on Lake Victoria. These analyses took place as part of a pilot project to eliminate the disease on this island, using an intensified treatment protocol that included the entire island population. The control of Praziquantel effectiveness after several rounds of treatment poses a number of diagnostic challenges. Here, the assessment of the schistosoma infection in the intermediate host snails before and after the therapies could serve as an indicator for the success of the measure. For this purpose, a baseline study was carried out, in which snails were collected from shore regions where the islanders had frequent contact with water. The snails were identified on the basis of morphological characteristics and examined for infections with S. mansoni using the Real-Time PCR method. A total of 35.4% (279/788) S. mansoni positive intermediate host snails (Biomphalaria) were detected. This shows that there is a potential risk of schistosomiasis transmission at most water contact points around Ijinga. The total prevalence of S. mansoni in the human population determined by the KK method was 68.9%. After treating the community with Praziquantel four times, the prevalence of S. mansoni in the continuously monitored sentinel group was reduced to 28.7%. At this time, the analysis of the snails was repeated and 16.8% (57/350) snails with a S. mansoni infection were detected. The reduction in the frequency of infection in the snails before and after the fourfold treatment of the population was significant (χ² = 74,335, p < 0.001). This suggests that the intermediate host snails can be used to monitor control measures. KW - Schistosomiasis KW - Bilharziose KW - Real-time PCR KW - Tansania KW - Trematoden KW - Vernachlässigte Tropenkrankheiten Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-215061 ER - TY - THES A1 - Castillo Cajas, Ruth T1 - Evolution and diversity of cuticular hydrocarbon profiles of cuckoo wasps T1 - Evolution und Diversität der Kohlenwasserstoffprofile der Goldwespen N2 - Cuticular hydrocarbons (CHC) abound on the surface of arthropods. In spite of their simple structure (molecules of carbon and hydrogen atoms), they provide pivotal functions in insects: their hydrophobic properties confer the insects a means to regulate water balance and avoid desiccation, whereas their diversity has enhanced their use as signals and cues in a wide range of communication and recognition processes. Although the study of CHC in insects over the past two decades has provided great insight into the wide range of functions they play, there is still a gap in understanding how they diversify and evolve. In this thesis, I have used members of the family Chrysididae to explore patterns of diversification of CHC. Most of the species of cuckoo wasps in this study are specialized parasitoids or kleptoparasites of mainly solitary hymenopteran hosts. Other hosts of the family include butterflies or stick insects. Cuckoo wasps are a particular interesting model to study the evolution of cuticular hydrocarbons because of their chemical adaptations that allow them to remain unrecognized by their hosts. Chemical insignificance (the reduction of the total amount of CHC on the cuticle) and chemical mimicry (the de novo production of CHC profiles resembling those of their female host) have been described in some representatives of the family and unpublished evidence suggests chemical deception is widespread in Chrysididae (Chapter 2). Nonetheless, to trace the evolution of any trait of interest, a reliable phylogenetic reconstruction of the family is required. Therefore, the first study of this thesis constitutes the largest and to-date most reliable phylogenetic reconstruction of the family Chrysididae, which includes representatives of 186 species of cuckoo wasps. While the results of this phylogenetic reconstruction are consistent with previous ideas on the relationships of subfamilies and tribes, it shows the existence of several non-monophyletic genera (Chapter 3). CHC are involved in intraspecific recognition, often acting as contact sex pheromones. Nevertheless, it is not yet understood to what extent CHC profiles differ between the two sexes and whether some compound classes are more prevalent in one or the other sex. So far, no comparison of CHC profiles of males and females has been done for more than a dozen of related species. In Chapter 4, I describe and compare CHC profiles of females and males of 58 species of cuckoo wasps in order to evaluate whether and to what extent CHC profiles of these species differ between the sexes. I demonstrated that CHC profiles of cuckoo wasps are frequently (more than 90% of the species analyzed) and strongly dimorphic (both sexes of a given species tend to produce very different CHC compounds). Methyl-branched compounds tend to be more prevalent in males (especially dimethyl-branched compounds) and unsaturated compounds prevail in females. Moreover, a sex-specific pattern in the distribution of the double bond position of alkenes was evident: internal double bond positions (> 11) occur predominantly in males, whereas alkenes with the doublé bond at position 9 were more abundant and frequent in females (Chapter4). In Chapter5, I investigated how CHC profiles of cuckoo wasps differ across species. Are CHC profiles of cuckoo wasps species-specific, enabling their use as cues for species recognition? How do CHC profiles resemble phylogenetic relatedness? In Chapter 5, I try to answer these questions by comparing CHC profiles of 59 species of cuckoo wasps. CHC profiles of cuckoo wasps are shown to be species (and sex-) specific. I show that CHC profiles are useful as a complementary tool to help delimiting taxonomically difficult sibling species. Moreover, the evaluation of CHC profiles of five commonly occurring species within a genus, showed little or no geographical variation. However, CHC profiles of closely related species may differ strongly among each other, not being useful to track the evolutionary history of species (Chapter 5). Sexual selection is generally credited for generating striking sexual dimorphism by causing changes in male traits. Most often, sexual selection has a stronger effect on males, who compete for access to and may be selected by females, thus male traits may rapidly evolve. Nevertheless, in cuckoo wasps, it appears that it is the female sex the one evolving faster changes, with females of very closely related species showing extremely divergent profiles. One plausible reason for this disparity is that natural selection acting on female’s CHC profiles may be stronger than sexual selection on males (Chapter 6). Since females of cuckoo wasps are most probably engaged in an evolutionary arms race with their female hosts, CHC profiles of female cuckoo wasps are likely rapidly evolving, thus explaining part of the strong observed sexual dimorphism of CHC (Chapter 6). In fact, Chapter 7 shows evidence of a possible ongoing evolutionary arms race between five cuckoo wasps of the genus Hedychrum and their hosts. Hedychrum species parasitize either Coleoptera-hunting or Hymenoptera-hunting digger wasps. Since the coleopteran prey of the former digger wasps is naturally better protected against fungus infestation, these wasps do not embalm their prey with alkene-enriched secretions as do the Hymenoptera-hunting digger wasps. Thus, Coleoptera-hunting digger wasps can apparently diversify their profiles to escape chemical mimicry. Interestingly, only female cuckoo wasps of these hosts have started producing the same compound classes and even the same CHC compounds as those of their hosts. Male cuckoo wasps, however retain an alkene-enriched CHC profile that reflects the molecular phylogeny of the genus (Chapter 7). Whereas, a larger number of parasite-host comparisons may be needed to further conclude that an arms race between cuckoo wasps and their hosts is capable of generating sexual dimorphism of cuckoo wasps, this thesis constitutes the first effort towards this, providing a starting point for further studies. Finally, I provide some methodological tools that may help in speeding up the sometimes cumbersome process of analyzing and identifying CHC profiles. One of the most time-demanding steps in the processing of CHC data is the alignment of CHC chromatograms. This process is often done manually, because alignment programs are mostly designed for metabolomics or are just recently being developed. I analyzed CHC profiles using a combined approach with two freely available programs. I used AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, http://chemdata.nist.gov/mass-spc/amdis/) to deconvolute and automatically identify all CHC of interest present in a chromatogram. I then developed a series of R scripts to correct for potential, unavoidable errors while processing CHC chromatograms with AMDIS. Chapter 8 explains this procedure. In the next chapter, I developed a program that helps in the identification of one commonly occurring class of hydrocarbons. The limited number of linear alkanes (only one per carbon atom) and their characteristic diagnostic ion allows a rapid and unambigous identification of these substances. In opposition, unsaturated and methyl-branched compounds are more difficult to identify, as a result of the much larger diversity of existing compounds. To identify unsaturated compounds a derivatization is necessary to determine the position of the double bond. Methyl-branched alkanes, however can be identified from the original chromatogram if their diagnostic ions are known. Nonetheless, polymethyl-branched alkanes (e.g., compounds with two or more methyl groups along the chain) are often difficult to identify, because they may appear in mixes (e.g., 3,7 diMeC27 and 3,9 diMeC27), and tables containing the diagnostic ions are not easily available. Therefore, I developed a program that creates a table with all possiblemethyl-branched compounds containing up to 4 methyl groups, and that provides their diagnostic ions and a calculated retention index. This may allow a much faster identification of the methyl-branched compound a researcher is dealing with, without having to lose time in the tedious calculations by hand. The program is able to correctly identify, or at least, greatly reduce the number of possible options for the identification of an unknown methyl-branched compound. Thus, using this tool, most methyl-branched compounds can be readily identified (Chapter 9). This thesis ends with a general discussion (Chapter 10). Overall, this work provides a comprehensive overview of the diversity of cuticular hydrocarbons of cuckoo wasps. The analyses presented here shed light on the emergence and evolution of interspecific diversity and intraspecific sexual dimorphism of CHC profiles. In addition, two technical methods have been developed that could greatly facilitate the CHC analysis of insects. N2 - Kutikulare Kohlenwasserstoffe (engl. „cuticular hydrocarbons“, CHC) sind Substanzen, die wir in größeren Mengen auf der Körperoberfläche von Arthropoden finden. Diese Moleküle aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen haben trotz ihrer einfachen Struktur entscheidende Funktionen bei Insekten: Ihre wasserabweisende Eigenschaften geben den Insekten die Möglichkeit, den Wasserhaushalt zu regulieren und Austrocknung zu vermeiden. Darüber hinaus ermöglicht die Vielfältigkeit der CHC ihre Verwendung als Signale für eine breite Palette von Kommunikations-und Erkennungsprozessen. Obwohl die Erforschung von CHC in den letzten zwei Jahrzehnten einen großen Einblick in die Funktionen bei Insekten ermöglicht hat, gibt es immer noch Verständnislücken bezüglich der Evolution und Diversifizierung von CHC (Kapitel1). In der vorliegenden Dissertation habe ich anhand verschiedener Arten der Wespen Familie Chrysididae die Diversifizierungsmuster von CHC erforscht. Die meisten der Goldwespenarten in dieser Studie sind spezialisierte Parasitoiden oder Kleptoparasiten von hauptsächlich solitären Hymenopteren. Wirte von anderen Goldwespen sind auch Phasmatodea und Lepidoptera. Goldwespen sind besonders interesante Modellorganismen, um die Evolution von CHC zu untersuchen. Denn sie haben auf ihrer Kutikula chemische Anpassungen an die chemischen Oberflächen ihrer Wirte entwickelt, um bei dem Wirt zu vermeiden, dass ihre eigenen chemischen Signale bei der Eiablage erkannt werden. Für einige Vertreter der Familie Chrysididae wurden chemische Unscheinbarkeit/Unsichtbarkeit („insignificance“) und chemische Mimikry beschrieben. Bei ersterem, handelt es sich um die Reduzierung der Gesamtmenge der CHC auf der Kutikula, bei letzterem um die Nachahmung des CHC Profils des Wirtes. Zudem, deuten unveröffentlichte Daten darauf hin, dass chemische Nachahmung unter den Chrysididae weit verbreitet ist (Kapitel 2). Eine zuverlässige phylogenetische Rekonstruktion der Chrysididae ist notwendig, um die Evolution eines Merkmales, wie z.B. die Ausbildung eines CHC-Profils, zu verfolgen. Daher stellt der erste Teil dieser Arbeit die größte und bis heute zuverlässigste phylogenetische Rekonstruktion der Familie Chrysididae dar, welche Vertreter von 186 Arten von Goldwespen umfasst. Die Ergebnisse dieser Phylogenie stehen in Übereinstimmung mit vorherigen Studien über die Beziehungen zwischen Subfamilien und Triben der Goldwespen. Die Phylogenie deutet jedoch auf die Existenz mehrerer nicht-monophyletischer Gattungen in Chrysididae hin (Kapitel 3). CHC sind an der innerartlichen Erkennung beteiligt und fungieren manchmal als Kontakt-Sex-Pheromonen. Es ist jedoch noch nicht klar, inwieweit die CHC-Profile zwischen den beiden Geschlechtern differieren und ob einige Verbindungsklassen in dem einen Geschlecht häufiger als in dem anderen vorkommen. Bislang gibt es lediglich einen Vergleich von CHC-Profilen zwischen Männchen und Weibchen für weniger alseinDutzendverwandterArten.In Kapitel 4 werden die CHC-Profile von Weibchen und Männchen von 58 Goldwespenarten beschrieben und verglichen, um zu beurteilen, ob und in welchem Ausmaß, sich die CHC-Profile dieser Arten zwischen den Geschlechtern unterscheiden. Ich konnte zeigen, dass CHC-Profile von Goldwespen stark sexuell dimorph sind (Männchen und Weibchen der gleichen Art neigen dazu, sehr unterschiedliche CHC-Verbindungen zu produzieren), und dass dieser Dimorphismus sehr häufig vorkommt (mehr als 90% der untersuchten Arten). Methylverzweigte Verbindungen (insbesondere dimethylverzweigte Verbindungen) waren tendenziel bei Männchen häufiger und bei Weibchen waren ungesättigte Verbindungen häufiger. Darüber hinaus war ein geschlechtsspezifisches Muster in der Verteilung der Doppelbindungsposition von Alkenen offensichtlich: interne Doppelbindungspositionen (>11) treten vorwiegend bei Männchen auf, während Alkene mit der Doppelbindung an Position 9 bei Weibchen häufiger vorkommen (Kapitel 4). Im darauf folgenden Kapitel meiner Arbeit, beschäftige ich mich mit der Frage wie unterschiedlich CHC-Profile von Goldwespen zwischen Arten sind. Sind CHC-Profile artspezifisch, wie es zu erwarten wäre, wenn sie zur Arterkennung dienen? Gibt es Ähnlichkeiten in Bezug auf die phylogenetische Verwandtschaft der Arten? In Kapitel 5, versuche ich diese Fragen zu beantworten, indem ich die CHC-Profile von 59 Goldwespenarten vergleiche. Ich zeige, dass CHC-Profile von Goldwespen art- (und geschlechts-) spezifisch sind, und dass CHC-Profile als ergänzendes Werkzeug zur Abgrenzung von taxonomisch schwierigen Geschwisterarten nützlich sind. Darüber hinaus zeigt die Beurteilung der CHC-ProfilevonfünfhäufigvorkommendeArteninnerhalbeinerGattungwenigoder keine geografische Variation, was bei der Abgrenzung der Arten hilft. Allerdings können CHC-Profile nah verwandter Arten sehr unterschiedlich sein. Somit sind sie kein geeignetes Merkmal um die Evolutionsgeschichte von Arten nachzuvollziehen (Kapitel 5). Im sich daran anschließenden Kapitel, geht es darum, zu verstehen warum CHCProfile der meisten Goldwespenarten so auffallend unterschiedliche CHC-Profile zwischen Geschlechtern aufweisen. Beider sexuellen Selektion wird in der Regel erwartet, dass siedurch Veränderungen männlicher Merkmale zu einem auffälligen Sexualdimorphismus führt. Meistens wirkt die sexuelle Selektion stärker auf die Männchen aus als auf die Weibchen, weil sie um die Weibchen konkurrieren und von den Weibchen ausgewählt werden müssen. Daher wird erwartet, dass männliche Merkmale schneller evolvieren. Dennoch scheint das weibliche Geschlecht bei Goldwespen das Geschlecht zu sein, das schneller evolviert, was sich z. B. dadurch äußert, dass Weibchen sehr nah verwandter Arten extrem divergierende Profile zeigen (Kapitel 6). Ein plausibler Grund für diese Verschiedenheit zwischen den Weibchen nah verwandter Arten ist, dass die natürliche Selektion, die auf die CHC-Profile von Weibchen wirkt, stärker sein kann als die sexuelle Selektion bei den Männchen (Kapitel 6). Da die Weibchen der Goldwespen höchstwahrscheinlich in einem evolutionären Wettrüsten mit ihren weiblichen Wirten stehen, ist es möglich dass die CHC-Profile von Weibchen schnell evolvieren und somit den stark beobachteten sexuellen Dimorphismus von CHC in Goldwespen erklären (Kapitel 6). In Kapitel 7, werden Hinweise auf ein mögliches fortwährendes Wettrüsten zwischen fünf Goldwespenarten der Gattung Hedychrum und ihren Wirten aufgezeigt. Arten dieser Gattung parasitieren entweder Grabwespen die Coleoptera oder Hymenoptera als Nahrung für ihre Nachkommen jagen. Da die Coleoptera-Beute natürlicherweise besser gegen Pilzbefall geschützt ist, balsamieren diese Wespen ihre Beute nicht mit durch Alkene angereicherte Sekrete ein, im Gegensatz zu der anderen Gruppe der Grabwespen, die Hymenopteren als Futter verwerten. Daher diversifizieren Coleoptera-jagende Grabwespen offenbar ihre Profile stärker,um der chemischen Mimikry ihrer Parasitoiden zu entkommen. Interessanterweise haben nur weibliche Goldwespen dieser Coleoptera-jagende Wirte begonnen, die gleichen Substanzklassen und sogar die gleichen CHC-Verbindungen wie die ihrer Wirte zu produzieren. Männliche Goldwespen behalten jedoch ein durch Alkene angereichertes CHC-Profil, das die molekulare Phylogenie der Gattung Hedychrum widerspiegelt. Um jedoch eindeutiger zu beweisen, dass ein Wettrüsten zwischen Goldwespen und ihren Wirten den Geschlechtsdimorphismus von Goldwespen hervorbringt, wäre eine größere Anzahl von Vergleichen zwischen Goldwespen und ihren Wirten nötig. Nichtsdestotrotz ist diese Arbeit ein erster Versuch, den Geschlechtsdimorphismus von CHC in Goldwespen zu erklären und ein Ausgangspunkt für weitere Studien. Abschließend stelle ich einige methodische Werkzeuge vor, die helfen können, den bisher umständlichen Prozess der Analyse und Identifizierung von CHC-Profilen zu beschleunigen. Einer der zeitaufwendigsten Schritte bei der Verarbeitung von CHC Daten ist die Alinierung von CHC-Chromatogrammen. Dieser Prozess wird oft manuell durchgeführt, da Alinierungsprogramme für die Metabolomik konzipiert sind oder gerade erst entwickelt werden. Meine CHC-Profile habe ich mit einem kombinierten Ansatz mit zwei frei verfügbaren Programmen analysiert. Ich benutzte AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System), um die CHC in einem Chromatogramm zu dekonvolutieren und automatisch zu identifizieren. Ich habe weiterhin eine Reihe von R-Skripten entwickelt, um mögliche unvermeidbare Fehler bei der Verarbeitung von CHC-Chromatogrammen mit AMDIS zu korrigieren. In Kapitel 8 wird dieses Verfahren erläutert. Im darauffolgenden Kapitel stelle ich ein Programm vor, das ich für eine erleichterte Identifizierung einer häufig vorkommenden Verbindungsklasse von CHC entwickelt habe. Die begrenzte Anzahl von linearen Alkanen (nur eines pro Kohlenstoffatom) und ihre charakteristischen diagnostischen Ionen erlauben die schnelle und eindeutige Identifizierung dieser Substanzen. Im Gegensatz dazu sind ungesättigte und methylverzweigte Verbindungen auf grund der viel größeren Vielfalt möglicher Verbindungen deutlich schwieriger zu identifizieren. Für die Identifizierung ungesättigter Verbindungen ist eine Derivatisierung notwendig, um die Position der Doppelbindung zu bestimmen. Methylverzweigte Alkane können jedoch theoretisch vom ursprünglichen Chromatogramm unterschieden werden, sofern die diagnostischen Ionen bekannt sind. Trotz alledem sind polymethylverzweigte Alkane (z.B. Verbindungen mit zwei oder mehr Methylgruppen entlang der Kette) oft schwer zu identifizieren, da sie in Mischungen (z. B. 3,7 diMeC27 und 3,9 diMeC27) auftreten können. Ihre diagnostische Ionen müssen entweder berechnet werden oder in Tabellen, die nicht leicht verfügbar sind, gesucht werden. Ich entwickelte daher ein kleines Programm, das eine Tabelle erstellt mit allen möglichen methylverzweigten Verbindungen mit bis zu 4 Methylgruppen sowie deren diagnostischen Ionen und einem berechneten Retentionsindex. Dies erlaubt eine viel schnellere Identifizierung der richtigen methylverzweigten Verbindung, ohne dass ein Wissenschaflter Zeit für die mühsamen Berechnungen von Hand verlieren muss. Das Programm ist in der Lage, die Anzahl möglicher Optionen einer unbekannten methylverzweigten Verbindung korrekt zu nennen oder zumindest die Auswahl stark einzugrenzen und damit die Identifikation der Substanz stark zu erleichtern. Es ist daher zu erwarten, dass mit diesem Werkzeug die meisten methylverzweigten Verbindungen leicht identifiziert werden können (Kapitel9). Ich schließe meiner Dissertation mit einer allgemeinen Diskussion (Kapitel 10). Die vorliegende Arbeit stellt einen umfangreichen Überblick der Diversität von kutikularen Kohlenwasserstoffen von Goldwespen dar. Dieser Einblick kann uns helfen, die Bedeutung von CHC-Profilen für Arthropoden im Allgemeinen besser zu verstehen. Konkret beleuchten die durchgeführten Analysen die Entstehung und Evolution von interspezifischer Diverstität bzw. Ähnlichkeiten von CHC-Profilen und intraspezifischen sexuellen Dimorphismus von CHC-Profilen. Darüber hinaus wurden technische Methoden entwickelt, die zukünftige Arbeiten zu CHC Analysen von verschiedenen Insekten stark erleichtern könnten. KW - Chrysididae KW - Cuticular hydrocarbons Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173418 ER - TY - THES A1 - Lakovic, Milica T1 - Evolution of animal dispersal: Putting timing in perspective T1 - Evolution von Ausbreitungsstrategien: Die Fitnesskonsequenzen des Zeitpunkts von Emigration N2 - Dispersal is a life-history trait affecting dynamics and persistence of populations; it evolves under various known selective pressures. Theoretical studies on dispersal typically assume 'natal dispersal', where individuals emigrate right after birth. But emigration may also occur during a later moment within a reproductive season ('breeding dispersal'). For example, some female butterflies first deposit eggs in their natal patch before migrating to other site(s) to continue egg-laying there. How breeding compared to natal dispersal influences the evolution of dispersal has not been explored. To close this gap we used an individual-based simulation approach to analyze (i) the evolution of timing of breeding dispersal in annual organisms, (ii) its influence on dispersal (compared to natal dispersal). Furthermore, we tested (iii) its performance in direct evolutionary contest with individuals following a natal dispersal strategy. Our results show that evolution should typically result in lower dispersal under breeding dispersal, especially when costs of dispersal are low and population size is small. By distributing offspring evenly across two patches, breeding dispersal allows reducing direct sibling competition in the next generation whereas natal dispersal can only reduce trans-generational kin competition by producing highly dispersive offspring in each generation. The added benefit of breeding dispersal is most prominent in patches with small population sizes. Finally, the evolutionary contests show that a breeding dispersal strategy would universally out-compete natal dispersal. N2 - Emigration und die daraus resultierende Ausbreitung („dispersal“) ist ein wichtiges Ereignis im Lebenszyklus von Insekten, mit grundlegenden öko-evolutionären Folgen. Fortschreitender globaler Wandel hinterlässt viele Arten in stark fragmentierten Habitaten; der Verbreitungsstrategie kommt deshalb eine Schlüsselrolle im Fortbestehen von Populationen zu. Insekten sind besonders anfällig gegenüber Habitatzerstörungen, da viele von ihnen Spezialisten sind und daher z.B. stark von Präsenz bestimmter Wirtsarten und deren Verteilung abhängen. Zum Schutz dieser Arten ist es folglich entscheidend die Ursachen und Folgen verschiedener Ausbreitungsstrategien zu verstehen. Zudem können Arten mit unterschiedlichen Lebenszyklen spezifische Ausbreitungsstrategien aufweisen. Natale Emigration („natal dispersal“) ist definiert als das Verlassen des Ortes der Geburt, um an einem neuen Ort zu reproduzieren, während „breeding dispersal“ Ausbreitung zwischen zwei aufeinanderfolgenden Paarungen bedeutet. Natal dispersal kann während des Larval- und Adultstadiums stattfinden, breeding dispersal nur während des Adultstadiums. Weiterhin ist der Zeitpunkt der Verpaarung, entweder vor oder nach Ausbreitung, besonders wichtig für Weibchen, die nicht nur die eigenen Gene transportieren, sondern eventuell auch die eines verpaarten Männchens. Es ist eindeutig, dass sich Genfluss und ökoevolutionäre Dynamik zwischen diesen Ausbreitungsstrategien unterscheiden. Schließlich erhielt nformationsverarbeitung durch Insekten und dessen Rolle in emigrationsbezogenen Entscheidungen in jüngster Zeit viel Aufmerksamkeit. Dennoch wurde der Zeitraum der Informationsbeschaffung (z.B. während des Larven- oder Adultstadiums) und folglich die Verfügbarkeit von Information zum Zeitpunkt der Emigration von Theoretikern und Empirikern größtenteils nicht beachtet. Meine Doktorarbeit liefert theoretische Einsichten in den optimalen Zeitpunkt der Emigration, des Zeitpunktes der Paarung (in Relation zu Emigration) und die Rolle von Informationsbeschaffung in Insekten- Metapopulationen. Mit Individuen basierten Modellen analysierte ich zuerst die Evolution des Emigrationszeitpunktes in Metapopulationen, gefolgt von der Evolution des (optimalen) Emigrations- und Paarungszeitpunktes in Metapopulationen von Insekten. Abschließend untersuchte ich, wie sich die Investition von Zeit in das Sammeln von Informationen auf den Zeitpunkt und die Häufigkeit von Emigration auswirkt. Ergebnisse meiner Thesis zeigen, dass die Vermeidung von Konkurrenz innerhalb der Art eine entscheidende Rolle in der Evolution des Zeitpunktes der Emigration einnimmt; weiterhin konnte ich zeigen, dass Insekten Informationen über die Populationsdichte nutzen können, um daran angepasst Entscheidungen bezüglich ihrer Emigration zu treffen; in heterogener Umwelt bestimmt die Toleranz gegenüber der Habitate die Evolution der Ausbreitungsstrategie und des Paarungszeitpunktes, was folglich die lokal Anpassung innerhalb ganzer Landschaften bestimmt. Meine Thesis bietet neue Einsichten in die Evolution von Ausbreitung, insbesondere auf den richtigen Zeitpunkt und die Reihenfolge von Emigration, Verpaarung und dem Sammeln von Informationen. Dieser Aspekt des Timings wurde bisher von theoretischen und empirischen Ökologen größtenteils ignoriert. Um die Populationsdynamik und die Ausbreitung einer Art verstehen zu können, ist es essentiell den Lebenszyklus und die Zeitpunkte der wichtigsten Lebensereignisse (Verbreitung, Reproduktion) zu kennen. Dies ist zwingend nötig, wenn eine erfolgreiche Umsetzung von Naturschutzmaßnahmen (z.B. Wiedereinführung von Arten) oder biologischer Schädlingsbekämpfung (z.B. Einführung von Prädatoren zur Bekämpfung von Schädlingen) angestrebt wird. KW - dispersal timing KW - metapopulation KW - individual-based simulation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154522 ER - TY - THES A1 - Hartlieb, Heiko T1 - Functional analysis of Mushroom body miniature’s RGG-box and its role in neuroblast proliferation in Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse der RGG-Box von Mushroom body miniature und deren Rolle in der Neuroblastenproliferation in Drosophila melanogaster N2 - Development of the central nervous system in Drosophila melanogaster relies on neural stem cells called neuroblasts. Neuroblasts divide asymmetrically to give rise to a new neuroblast as well as a small daughter cell which eventually generates neurons or glia cells. Between each division, neuroblasts have to re-grow to be able to divide again. In previous studies, it was shown that neuroblast proliferation, cell size and the number of progeny cells is negatively affected in larvae carrying a P-element induced disruption of the gene mushroom body miniature (mbm). This mbm null mutation called mbmSH1819 is homozygously lethal during pupation. It was furthermore shown that the nucleolar protein Mbm plays a role in the processing of ribosomal RNA (rRNA) as well as the translocation of ribosomal protein S6 (RpS6) in neuroblasts and that it is a transcriptional target of Myc. Therefore, it was suggested that Mbm might regulate neuroblast proliferation through a role in ribosome biogenesis. In the present study, it was attempted to further elucidate these proposed roles of Mbm and to identify the protein domains that are important for those functions. Mbm contains an arginine/glycine rich region in which a di-RG as well as a di-RGG motif could be found. Together, these two motifs were defined as Mbm’s RGG-box. RGG-boxes can be found in many proteins of different families and they can either promote or inhibit protein-RNA as well as protein-protein interactions. Therefore, Mbm’s RGG-box is a likely candidate for a domain involved in rRNA binding and RpS6 translocation. It could be shown by deletion of the RGG-box, that MbmdRGG is unable to fully rescue survivability and neuroblast cell size defects of the null mutation mbmSH1819. Furthermore, Mbm does indeed rely on its RGG-box for the binding of rRNA in vitro and in mbmdRGG as well as mbmSH1819 mutants RpS6 is partially delocalized. Mbm itself also seems to depend on the RGG-box for correct localization since MbmdRGG is partially delocalized to the nucleus. Interestingly, protein synthesis rates are increased in mbmdRGG mutants, possibly induced by an increase in TOR expression. Therefore, Mbm might possess a promoting function in TOR signaling in certain conditions, which is regulated by its RGG-box. Moreover, RGG-boxes often rely on methylation by protein arginine methyltransferases (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) to fulfill their functions. Mbm might be symmetrically dimethylated within its RGG-box, but the results are very equivocal. In any case, Dart1 and Dart5 do not seem to be capable of Mbm methylation. Additionally, Mbm contains two C2HC type zinc-finger motifs, which could be involved in rRNA binding. In an earlier study, it was shown that the mutation of the zinc-fingers, mbmZnF, does not lead to changes in neuroblast cell size, but that MbmZnF is delocalized to the cytoplasm. In the present study, mbmZnF mutants were included in most experiments. The results, however, are puzzling since mbmZnF mutant larvae exhibit an even lower viability than the mbm null mutants and MbmZnF shows stronger binding to rRNA than wild-type Mbm. This suggests an unspecific interaction of MbmZnF with either another protein, DNA or RNA, possibly leading to a dominant negative effect by disturbing other interaction partners. Therefore, it is difficult to draw conclusions about the zinc-fingers’ functions. In summary, this study provides further evidence that Mbm is involved in neuroblast proliferation as well as the regulation of ribosome biogenesis and that Mbm relies on its RGG-box to fulfill its functions. N2 - Die Entwicklung des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster beruht auf neuronalen Stammzellen genannt Neuroblasten. Neuroblasten teilen sich asymmetrisch und bringen dabei sowohl einen neuen Neuroblasten als auch eine kleinere Tochterzelle hervor, die wiederum letztlich Neuronen oder Gliazellen generiert. Zwischen jeder Zellteilung müssen die Neuroblasten wieder auf ihre ursprüngliche Größe wachsen, sodass sie zur erneuten Teilung in der Lage sind. In vorhergehenden Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl die Proliferation der Neuroblasten, deren Zellgröße als auch die Anzahl ihrer Tocherzellen reduziert ist in Larven, die eine P-Element-induzierte Unterbrechung des Gens mushroom body miniature (mbm) tragen. Diese mbm-Nullmutation, genannt mbmSH1819, ist homozygot letal während des Puppenstadiums. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass das nucleoläre Protein Mbm eine Rolle in der Prozessierung ribosomaler RNA (rRNA), sowie der Translokation des ribosomalen Proteins S6 (RpS6) in Neuroblasten erfüllt und dass seine Transkription durch Myc reguliert wird. Daher wurde geschlussfolgert, dass Mbm die Proliferation von Neuroblasten durch eine Funktion in der Ribosomenbiogenese regulieren könnte. In der vorliegenden Studie wurde das Ziel verfolgt, weitere Hinweise auf diese möglichen Funktionen von Mbm zu finden und die Proteindomänen zu identifizieren, die dafür benötigt werden. Mbm beinhaltet einen Arginin/Glycin-reichen Abschnitt, der ein di-RG sowie ein di-RGG Motiv enthält. Diese beiden Motive wurden zusammen zu Mbms RGG-Box definiert. RGG-Boxen finden sich in vielen Proteinen verschiedener Familien und sie können sich sowohl verstärkend als auch inhibierend auf Protein-RNA- sowie Protein-Protein-Interaktionen auswirken. Somit stellt Mbms RGG-Box einen vielversprechenden Kandidaten dar für eine Proteindomäne, die in die rRNA-Bindung sowie die Translokation von RpS6 involviert ist. Es konnte gezeigt werden, dass Mbm mit deletierter RGG-Box (MbmdRGG) nicht in der Lage ist, die Überlebensfähigkeit und die Neuroblastengröße der Nullmutation mbmSH1819 vollständig zu retten. Des Weiteren benötigt Mbm die RGG-Box, um rRNA in vitro zu binden und in mbmdRGG sowie mbmSH1819 Mutanten konnte eine partielle Delokalisation von RpS6 beobachtet werden. Die korrekte Lokalisation von Mbm selbst scheint auch von der RGG-Box abzuhängen, da MbmdRGG teilweise in den Nukleus delokalisiert ist. Interessanterweise ist außerdem die Proteinsyntheserate in mbmdRGG Mutanten erhöht, was möglicherweise in einer Erhöhung der TOR-Expression begründet ist. Somit könnte Mbm unter bestimmten Bedingungen eine verstärkende Funktion im TOR-Signalweg erfüllen, die durch seine eigene RGG-Box reguliert wird. Des Weiteren sind RGG-Boxen hinsichtlich ihrer Funktion häufig von der Methylierung durch Protein-Arginin-Methyltransferasen (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) abhängig. Mbm könnte innerhalb seiner RGG-Box symmetrisch dimethyliert sein, allerdings sind die Ergebnisse in dieser Hinsicht sehr zweifelhaft. Jedenfalls scheinen Dart1 und Dart5 nicht imstande zu sein, Mbm zu methylieren. Außerdem beinhaltet Mbm zwei Zink-Finger-Motive des C2HC-Typs, die in die Bindung von rRNA involviert sein könnten. Eine vorhergehende Studie konnte zeigen, dass die Mutation der Zink-Finger, mbmZnF, zwar nicht zu einer Veränderung der Neuroblastengröße führt, allerdings, dass MbmZnF ins Zytoplasma delokalisiert vorliegt. In der vorliegenden Studie wurden die mbmZnF Mutanten in die meisten Experimente mit einbezogen. Allerdings sind die Ergebnisse rätselhaft, da mbmZnF-mutierte Larven sogar eine geringere Überlebensrate zeigen als die mbm Nullmutanten und da MbmZnF eine stärkere Bindungsaffinität zu rRNA zeigt als wildtypisches Mbm. Dies weist auf eine unspezifische Interaktion zwischen MbmZnF und einem anderen Protein, RNA oder DNA hin, was einen dominant-negativen Effekt auslösen könnte, indem andere Interaktionspartner gestört werden. Somit gestaltet es sich schwierig, Schlussfolgerungen zur Funktion der Zink-Finger zu ziehen. Zusammengefasst liefert die vorliegende Studie weitere Anhaltspunkte, dass Mbm in der Neuroblastenproliferation sowie der Regulation der Ribosomenbiogenese involviert ist und dass Mbm seine RGG-Box benötigt, um seine Funktionen zu erfüllen. KW - Taufliege KW - Neuroblast KW - Gehirn KW - Entwicklung KW - Drosophila melanogaster KW - brain development KW - neuroblast proliferation KW - mushroom body miniature KW - Gehirnentwicklung KW - Neuroblastenproliferation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199674 ER - TY - THES A1 - Seibold, Marcel T1 - Funktionelle Charakterisierung des Ras family small GTP binding protein RAL im Multiplen Myelom T1 - Functional characterization of the Ras family small GTP binding protein RAL in multiple myeloma N2 - Die monoklonale Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark ist charakteristisch für das multiple Myelom (MM) und kann bei Erkrankten zu Störungen in der Hämatopoese sowie zu Knochenläsionen und Niereninsuffizienz führen. Die Weiterentwicklung und der Einsatz neuer Therapieoptionen konnten das Überleben von MM-Patienten zwar erheblich verbessern, jedoch gilt diese Krankheit weiterhin als unheilbar. Onkogene Mutationen und das Knochenmarkmikromilieu führen in MM-Zellen zur Entstehung eines onkogenen Signalnetzwerks, das das Wachstum und Überleben der Zellen aufrechterhält. Mutationen der GTPase RAS treten bei bis zu 50 % der MM-Patienten auf und tragen zum Überleben von MM-Zellen bei. Trotz der Häufigkeit und Bedeutsamkeit von onkogenem RAS, auch in anderen Tumorentitäten, ist die GTPase nach wie vor therapeutisch nicht angreifbar. Die GTPase RAL aus der Familie der RAS-GTPasen wird als Downstream-Effektor von RAS angesehen, der damit ebenfalls zur Aufrechterhaltung des Tumorzellüberlebens beitragen könnte. In einigen Tumorentitäten konnte bisher gezeigt werden, dass eine Überexpression von RAL in den Tumorzellen vorliegt und die Proliferation und Apoptose von Tumorzellen durch RAL beeinflusst wird. Daher stellte sich die Frage, ob RAL im MM ebenfalls das Überleben von Tumorzellen beeinflusst und ob eine direkte Verbindung zwischen onkogenem RAS und RAL besteht. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle von RAL sowie dessen Zusammenhang mit onkogenem RAS im MM untersucht. Hierbei konnte eine Überexpression von RAL in MM-Zellen im Vergleich zu MGUS oder normalen Plasmazellen beobachtet werden. In Knockdown-Analysen wurde gezeigt, dass RAL überlebensnotwendig für MM-Zellen ist. Dabei wurde in Western Blot-Analysen festgestellt, dass diese Überlebenseffekte unabhängig von MAPK/ERK-Signaling vermittelt werden. Es konnte teilweise jedoch eine Abhängigkeit von der AKT-Aktivität beobachtet werden. Da RAL-Knockdown Einfluss auf das Überleben von MM-Zellen hat, wurde eine pharmakologische Inhibition von RAL durch den Inhibitor RBC8 untersucht. RBC8 zeigte in höheren Dosen nur bei einem Teil der MM-Zelllinien eine Wirkung auf das Zellüberleben sowie auf die RAL-Aktivierung. Die Weiterentwicklung potenter RAL-Inhibitoren ist daher für eine klinische Translation einer RAL-Inhibition von großer Bedeutung. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen onkogenem RAS und der RAL-Aktivierung wurden RAL-Pulldown-Analysen nach Knockdown von onkogenem RAS durchgeführt. In diesen Experimenten wurde keine Abhängigkeit der RAL-Aktivierung von onkogenem RAS festgestellt. Darüber hinaus zeigten Genexpressionsanalysen nach RAS- bzw. RAL-Knockdown unterschiedliche Genexpressionsprofile. In Massenspektrometrie-Analysen wurden mögliche Effektoren, die mit RAL an der Beeinflussung des Zellüberlebens beteiligt sein könnten, untersucht. Hierbei wurden die Komponenten des Exozyst-Komplexes EXO84 und SEC5 als Interaktionspartner von RAL identifiziert. Nachdem gezeigt wurde, dass RAL ausschlaggebend für das Überleben von MM-Zellen ist, wurde eine Kombination von RAL-Knockdown mit klinisch relevanten Wirkstoffen analysiert. Diese zeigte bei der Kombination mit PI3K oder AKT-Inhibitoren verstärkte Effekte auf das Zellüberleben der MM-Zellen. Zusammenfassend wurde die Bedeutung von RAL für das Überleben von Tumorzellen im MM gezeigt und RAL als potentielles therapeutisches Target im MM beschrieben, welches unabhängig von onkogenem RAS reguliert wird. N2 - Multiple myeloma (MM) is a hematologic neoplasia which is characterized by monoclonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow leading to hematopoetic failure, bone lesions and renal failure. Although continuous development of existing therapeutics and new therapeutic options vastly improved MM patient survival, MM still remains an incurable disease. Oncogenic mutations and the bone marrow microenvironment contribute to a signaling network which sustains MM cell proliferation and survival. Within this network mutations of the RAS oncogene account for up to 50 % of MM patients. Despite its prevalence and importance not only in MM, RAS still remains undruggable. The GTPase-family Member RAL is considered as a RAS effector which might also influence maintainance of tumor cell survival. In several tumor entities RAL is overexpressed in tumor cells and influences proliferation and apoptosis. Therefore, in MM RAL might also be controlled by oncogenic RAS and mediate cell survival of tumor cells. In this work, RAL’s functional role as well as the potential interconnection with oncogenic RAS was investigated. In MM cells RAL is ovexpressed compared to non-malignant MGUS or plasma cells. Knockdown analyses showed that RAL is essential for MM cell survival. These survival effects are transferred independently of MAPK/ERK signaling as shown by Western Blot analysis. However, to some extent RAL influenced MM cell survival dependently of AKT activity. Because RAL knockdown had a significant effect on MM cell survival a pharmacological inhibition was tested using the inhibitor RBC8. In a portion of MM cell lines RBC8 exerts effects on cell survival. But the effects of RBC8 on RAL activation were only visible at higher concentrations as shown by pulldown assays. Thus, subsequent development of potent RAL inhibitors is of major importance for clinical translation. To investigate whether RAL is directly activated by oncogenic RAS, RAL pulldown assays were performed after knockdown of oncogenic RAS. Strikingly, there was no direct connection between the presence of oncogenic RAS and RAL activation. Furthermore, gene expression profiles after RAS or RAL knockdown showed differing expression signatures. Potential effectors of RAL which might also influence MM cell survival were investigated in mass spectrometric analyses where the exocyst complex components EXO84 and SEC5 were identified as RAL interaction partners. Since RAL is of importance for MM cell survival, RAL knockdown was combined with clinically relevant agents. There was an enhanced induction of apoptosis upon combination of PI3K or AKT inhibitors with RAL knockdown. Taken together, the influence of RAL as a crucial mediator of MM cell survival was shown in this work. Therefore, RAL represents a potential therapeutic target which is regulated independently of oncogenic RAS. KW - Kleine GTP-bindende Proteine KW - Signaltransduktion KW - Plasmozytom KW - RAL KW - Multiples Myelom KW - Zellüberleben KW - Knochenmark Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208003 ER - TY - THES A1 - Rost, Isabell T1 - Gezielte Anreicherungs- und neue DNA-Sequenzierungsstrategien für die molekulare Analyse von Fanconi-Anämie-Genen T1 - Targeted enrichment and novel DNA sequencing strategies for the molecular analysis of fanconi anemia genes N2 - Fanconi-Anämie (FA) ist, mit Ausnahme von Mutationen in FANCR/RAD51, eine autosomal-rezessive oder X-chromosomal vererbte Krankheit, die sich durch eine ausgesprochene klinische als auch genetische Heterogenität auszeichnet. Neben einem fortschreitenden Knochenmarksversagen zählen zu den typischen Merkmalen eine Vielzahl an angeborenen Fehlbildungen, wie beispielsweise Radialstrahlanomalien, Minderwuchs oder Pigmentierungsstörungen. Zudem besteht für FA-Patienten ein überdurchschnittlich hohes Risiko bereits in jungen Jahren an akuter myeloischer Leukämie oder soliden Tumoren zu erkranken. Bislang konnten in 21 FA-Genen (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U oder -V) krankheitsverursachende Mutationen identifiziert werden, deren Proteinprodukte maßgeblich an der Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt sind und Komponenten des FA/BRCA-DNA-Reparaturweges darstellen. In der klassischen FA-Mutationsanalyse kommen meist Sanger-Sequenzierungen sowie MLPA- und Immunblot-Analysen zum Einsatz. Da im Wesentlichen keine Genotyp-Phänotyp-Korrelation besteht, gestaltet sich, gerade bei seltenen FA-Komplementationsgruppen, der Nachweis von krankheitsverursachenden Mutationen oftmals sehr zeit- und kostenintensiv. Während der letzten Jahre wurden verschiedene Strategien zur Anreicherung und Sequenzierung entwickelt, welche die parallele Sequenzanalyse einzelner ausgewählter Gene, ganzer Exome oder sogar des gesamten Genoms und somit eine kosten- und zeiteffiziente Mutationsanalyse ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Anreicherungsmethoden mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung auf ihre Anwendbarkeit in der molekulargenetischen FA-Diagnostik getestet, um klassische Mutationsanalyse-Methoden zu ergänzen oder möglicherweise sogar ganz ersetzen zu können. Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der Etablierung eines FA-spezifischen Genpanels zur Genotypisierung von FA-Patienten. Nachdem die Methode zunächst anhand von FA-Patienten mit bekannten Mutationen optimiert werden musste, erwies sie sich als effizienter Ansatz zum Nachweis krankheitsverursachender Mutationen bei FA-Patienten unbekannter Komplementationsgruppe. Durch die FA-Panelanalyse konnten 37 von 47 unklassifizierten Patienten einer FA-Komplementationsgruppe zugeordnet werden, indem deren kausalen Mutationen bestimmt wurden. In einem weiteren Ansatz sollte die Anwendbarkeit eines kommerziellen Anreicherungspanels zur FA-Diagnostik untersucht werden. Auch hier konnte ein Großteil der krankheitsverursachenden Mutationen von fünf bekannten wie auch 13 nicht zugeordneten FA-Patienten detektiert und somit eine molekulargenetische Diagnose bei neun weiteren, zuvor unklassifizierten FA-Patienten, gestellt werden. Ferner wurden sechs ausgewählte Patienten, zusätzlich zur Panelanreicherung, per Exomanalyse untersucht. Zum einen konnten Mutationen in bekannten FA-Genen bestätigt oder neu identifiziert werden. Zum anderen wurden auch potentiell pathogene Mutationen in DNA-Reparaturgenen außerhalb des FA/BRCA-Signalweges bei zwei Patienten mit unbestätigter Verdachtsdiagnose FA verifiziert. So wurde bei mehreren Mitgliedern einer Familie mit unterschiedlichen Tumorerkrankungen eine zuvor unbeschriebene homozygote Nonsense-Mutation in der BER-Glykosylase NTHL1 nachgewiesen, für welche bislang erst zwei pathogene Mutationen als Auslöser eines neuen Krebssyndroms bekannt sind. Bei einem weiteren Patienten wurden compound-heterozygote Mutationen in RPA1 detektiert, ein Gen für das bislang noch kein Krankheitsbild bekannt ist. Mit Hilfe der drei verschiedenen Anreicherungsstrategien konnten insgesamt 47 von 60 unklassifizierten FA-Patienten 13 verschiedenen Komplementationsgruppen eindeutig zugeordnet werden. Es zeigte sich dabei ein breites Spektrum an neuen, bislang unbeschriebenen FA-Mutationen. Den größten Anteil an der Gesamtzahl der nachgewiesenen Mutationen hatten Spleißmutationen, die auf eine Auswirkung auf das kanonische Spleißmuster untersucht wurden, um einen pathogenen Effekt nachweisen zu können. Weiterhin schloss die Arbeit die Charakterisierung einzelner FA-Patienten bzw. Komplementationsgruppen mit ein. Dazu zählen die seltenen Untergruppen FA-T und FA-Q, für die jeweils ein neuer Patient identifiziert werden konnte. Durch die funktionelle Charakterisierung der dritten jemals beschriebenen FA-Q-Patientin konnten Einblicke in das Zusammenspiel der Reparatur von DNA-Quervernetzungen und der Nukleotidexzisionsreparatur gewonnen und die phänotypische Variabilität von FA durch die subjektive als auch zelluläre UV-Sensitivität der Patientin ergänzt werden. Darüber hinaus konnte das Mutationsspektrum in FA-I sowie FA-D2 erweitert werden. Eine genauere Untersuchung der Pseudogenregionen von FANCD2 ermöglichte dabei die gezielte Mutationsanalyse des Gens. Insgesamt konnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, das Mutationsspektrum in FA zu erweitern und durch die Identifizierung und Charakterisierung einzelner Patienten neue Einblicke in verschiedene Komponenten des FA/BRCA-Signalweges zu erhalten. Es zeigte sich, dass neue DNA-Sequenzierungsstrategien in der FA-Diagnostik eingesetzt werden können, um eine effiziente Mutationsanalyse zu gewährleisten und klassische Methoden in Teilbereichen zu ersetzen. N2 - Fanconi anemia (FA) is, with the exception of mutations in FANCR/RAD51, an autosomal recessive or X-linked inherited disease that is characterized by a remarkable clinical and genetic heterogeneity. In addition to progressive bone marrow failure, typical features include a multitude of developmental malformations, such as radial ray anomalies, growth retardation or cutaneous pigment displacement. Additionally, FA patients have a higher risk for developing acute myelogenous leukemia or solid tumors early in life. To date, pathogenic mutations have been identified in 21 FA genes (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U or -V) whose protein products are responsible for maintaining genomic integrity and constitute components of the FA/BRCA DNA repair pathway. Typical methods for FA mutation analysis comprise Sanger sequencing as well as MLPA and immunoblot analyses. As no definite genotype-phenotype correlation exists, pathogenic mutation detection in rare subgroups is often quite time-consuming and cost-intensive. Within the last few years, distinct strategies for both enrichment and sequencing of a subset of genes, whole exomes or even the whole genome have been developed that facilitate a cost-effective and time-saving mutation analysis. In the present work different target-enrichment strategies followed by high-throughput sequencing were tested for their applicability in molecular genetic diagnostics of FA in order to complement or even replace classic strategies for mutation analysis. The first part of this work addressed the establishment of an FA-specific gene panel for genotyping FA patients. After optimizing this method by means of FA patients with known mutations, this proved to be an efficient approach for detecting pathogenic mutations in FA patients of unknown complementation groups. Due to FA gene panel analysis, 37 of 47 unclassified FA patients were assigned to a complementation group based on the identification of their causative mutations. In another approach, a commercial enrichment panel was tested for its application in FA diagnostics. Again, most pathogenic mutations of five classified and 13 unclassified FA patients were detected, enabling a molecular diagnosis for nine previously unclassified FA patients. Moreover, six selected patients were studied by exome analysis in addition to panel enrichment. This allowed for mutations in known FA complementation groups to be confirmed or newly identified. Additionally, potentially pathogenic variants in DNA-repair genes outside the FA/BRCA pathway were verified in two patients with an unconfirmed suspected diagnosis of FA. One previously undescribed homozygous nonsense mutation in the BER glycosylase NTHL1 was detected in several members of one family with various tumors. For this gene, only two distinct pathogenic mutations were previously described to cause a novel cancer syndrome. In another patient, compound heterozygous mutations in RPA1 were detected, a gene for which no disease pattern is yet known. By means of the three different enrichment strategies a total of 47 of 60 unclassified FA patients were definitely assigned to 13 diverse complementation groups. In this context, a broad spectrum of previously undescribed mutations was identified. The majority of all verified mutations were splice mutations that were examined for an effect on the canonical splicing pattern in order to verify a pathogenic effect. Additionally, this work also included the characterization of individual FA patients and complementation groups, respectively. These include the rare subgroups FA-T and FA-Q, for each of which one new patient was identified. Functional characterization of the third ever described FA-Q patient allowed new insights into the interplay of DNA interstrand-crosslink and nucleotide excision repair and broadened the spectrum of phenotypic variability of FA by the subjective and cellular UV sensitivity of this patient. Furthermore, the mutation spectrum in both FA-I and FA-D2 was expanded. Here, a closer investigation of the pseudogene regions of FANCD2 facilitated a precise mutation screening of the gene. Overall, the results of this work broadened the mutation spectrum of FA and allowed new insights into diverse components of the FA/BRCA pathway by identifying and characterizing individual patients. It became apparent that novel strategies for DNA sequencing can be applied in FA diagnostics to ensure an efficient mutation analysis, as well as to replace some parts of classical approaches. KW - Fanconi-Anämie KW - DNS-Reparatur KW - Sequenzdaten KW - Genpanel KW - Next generation sequencing KW - Mutationsanalyse Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151096 ER - TY - THES A1 - Glaab, Sabine T1 - Green classroom at the wildlife park: Aspects of environmental, instructional and conceptual education of primary school children concerning the European wildcat. T1 - Das Grüne Klassenzimmer im Wildpark: Aspekte der Umweltbildung, Instruktion sowie Schülervorstellungen bei Grundschulkindern zum Thema Wildkatze. N2 - To foster sustainable environmentally friendly behavior in children it is important to provide an effective form of environmental education. In this context we studied three important factors: Attitude towards nature, environmental knowledge and advanced expert knowledge. Concerning attitude towards nature our first question was: “Is it possible to affect primary school children’s environmental values during a one-day visit at a wildlife park?” As a control, the program was also conducted in schools, leading to two different learning settings- wildlife park and school. Regarding environmental knowledge, in our second question we wanted to know, if our modified teaching approach “guided learning at workstations” (G) combining instructional and constructivist elements would lead to good cognitive learning results of primary school children. Additionally, we compared it to a stronger teacher-centered (T) as well as to a stronger student-centered (S) approach. The third question we asked was “Is it possible to convey fascinating expert knowledge on a more advanced subject to primary school children using conceptual change theory?” After gathering primary school children’s preconceptions, we defined different groups due to the heterogeneity of their pre-existing conceptions and the change in conceptions. Based on this research we designed a program along with an instrument to measure the impact of the conceptual change teaching method. After years of building a strong cooperation between the section Didactics of Biology at the Julius-Maximilians University Würzburg, the nearby schools and the wildlife park “Wild-Park Klaushof” near Bad Kissingen in northern Bavaria it was time to evaluate the environmental education programs prepared and applied by undergraduate university students. As a model species we chose the European wildcat (Felis silvestris silvestris) which represents endangered wildlife in Europe and the need for human interaction for the sake of preserving a species by restoring or recreating the habitat conditions needed while maintaining current infrastructure. Drawing from our own as well as teachers’ and university students’ experiences, we built, implemented and evaluated a hands-on program following several workstations between the wildcat enclosure and the wildlife park’s green classroom. The content of our intervention was presented as a problem-oriented lesson, where children were confronted with the need for human interaction in order to preserve the European wildcat. Not only on a theoretical basis, but very specific to their hometowns they were told where and when nature conservation groups met or where to donate money. 692 Bavarian third grade primary school children in 35 classes participated in the one-day intervention that took place between the months of april, 2014 and november, 2015 in the wildlife park or in their respective classrooms. The ages varied between 8 and 11 years with the mean age being 8.88 ± 0.56 years old. 48.6 % of them were boys, 51.4 % were girls. (1) To measure primary school children’s environmental attitudes a questionnaire on two major environmental values- preservation and utilization of nature- was administered in a pre, post- and retention test design. It was possible to affect primary school children’s environmental preservation values during our one-day program. This result could be found not only at the wildlife park but unexpectedly also in school, where we educated classes for control purposes. We also found this impact consistent in all used teaching approaches and were surprised to see the preservation values change in a way we did not expect from higher tendency towards preservation of nature to a lower one. We presume that children of this age group reflected on the contents of our intervention. This had an influence on their own values towards preservation which led to a more realistic marking behavior in the questionnaire. We therefore conclude that it is possible to affect primary school children’s environmental values with a one-day program on environmental content. (2) We were interested in conveying environmental knowledge about the European wildcat; its morphology, ecology and behavior. We designed and applied a knowledge questionnaire also in a pre-, post- and retention test design, to find out, whether different forms of instruction made a difference in learning success of primary school children. We used two approaches with a teacher in the role of a didactic leader- our modified guided approach (G) as well as a stronger teacher-centered one (T) with a higher focus on instruction. The third approach was presented as a strong student-centered learning at workstations (S) without a didactic leader we also called “free learning at workstations”. Overall, all children’s knowledge scores changed significantly from pre- to post-test and from pre- to retention test, indicating learning success. Differences could only be found between the posttest values of both approaches with a didactic leader (G, T) in comparison to the strong student-centered (S) form. It appears that these primary school children gained knowledge at the out of school learning setting regardless of the used teaching approach. On the subject of short-term differences, we discuss, that the difference in learning success might have been consistent from post to retention test if a consolidation phase had been added in the days following the program as should be common practice after a visit to an out-of- school learning setting but was not part of our intervention. When comparing both approaches with a didactic leader (G, T), we prefer our modified guided learning at workstations (G) since constructivist phases can be implemented without losses concerning learning success. Moreover, the (at least temporary) presence of a teacher in the role of a didactic leader ensures maintained discipline and counteracts off-task behavior. To make sure, different emotional states did not factor in our program, we measured children’s situational emotions directly after the morning intervention using a short scale that evaluated interest, wellbeing and boredom. We found, that these emotions remained consistent over both learning settings as well as different forms of instruction. While interest and wellbeing remained constantly high, boredom values remained low. We take this as a sign of high quality designing and conducting the intervention. (3) In the afternoon of the one-day intervention, children were given the opportunity to investigate the wildcat further, this time using the conceptual change theory in combination with a more complex and fascinating content: cats’ vision in dusk and dawn. Children were confronted with their preconceptions which had been sampled prior to the study and turned into three distinctive topics reflected in a special questionnaire. In a pre-, post and retention test design we included the most common alternative conceptions, the scientifically correct conceptions as well as other preconceptions. We gathered a high heterogeneity of preconceptions and defined three groups based on conceptual change literature: “Conceptual change”, “Synthetic Models” and “Conceptual Growth”. In addition to these we identified two more groups after our data analysis: “Knowledge” and “Non-addressed Concepts”. We found that instruction according to the conceptual change theory did not work with primary school children in our intervention. The conceptual change from the addressed alternative conceptions as well as from other preconceptions towards the scientifically correct conceptions was successfully achieved only on occasion. In our case and depending on the topic only one third to one fourth of the children actually held the addressed conception while the rest was not targeted by the instruction. Moreover, we conclude children holding other conceptions were rather confused than educated by the confrontation. We assume that children of this age group may be overchallenged by the conceptual change method. N2 - Bildung für nachhaltige Entwicklung soll unter anderem dazu führen, dass Kinder langfristig umweltfreundliches Verhalten zeigen. Um dies zu erreichen, sind verschiedene Faktoren nötig - in dieser Studie lag unser besonderes Augenmerk auf drei Punkten: den Umwelteinstellungen der Kinder, dem umweltrelevanten Wissen, besonders im Hinblick auf die Lebensbedingungen und den Schutz der europäischen Wildkatze sowie weiterführendem, komplexeren, biologischen Wissen. Zuerst fragten wir uns in Bezug auf die Umwelteinstellungen, ob es möglich ist, die Einstellungen der Grundschulkinder zum Thema „Erhaltung der Natur“ im Laufe nur eines Tages am Wildpark zu beeinflussen. Umweltwissen war der Bestandteil der zweiten Frage, wie Grundschulkinder am außerschulischen Lernort gute Lernerfolge erzielen können. Wir testeten unseren modifizierten Ansatz „Geführtes Lernen an Stationen“ (G), der instruktionale und konstruktivistische Elemente beinhaltet und verglichen ihn einerseits mit einem stärker lehrerzentrierten (T) sowie andererseits einem stark schülerzentrierten (S) Lernen an Stationen, das wir auch als „freies Lernen an Stationen“ bezeichneten. Die dritte Frage beschäftigte sich schließlich damit, ob es gelingen kann, faszinierendes, tiefergehendes Wissen mit Hilfe der „Conceptual Change Theorie“ an Grundschulkinder zu vermitteln. Hintergrund der didaktischen Arbeit mit Grundschülern am außerschulischen Lernort Wildpark ist die Kooperation zwischen der Fachgruppe Didaktik der Julius-Maximilians-Universität Würzburg mit dem „Wild-Park Klaushof“ bei Bad Kissingen. Im Rahmen dieser Zusammenarbeit stellt die Fachgruppe Didaktik Biologie angehende Biologielehrerinnen und -lehrer als Referenten von Führungen gemäß des „Geführten Lernen an Stationen“ zur Verfügung. Diese Führungen wurden inhaltlich und didaktisch ebenfalls von Lehramtsstudierenden in der Biologiedidaktik ausgearbeitet, meist im Rahmen der schriftlichen Hausarbeiten gegen Ende des Lehramtsstudiums. Die Führungen sind konstruktivistisch angelegt, bieten hohe Selbsttätigkeit der Schülerinnen und Schüler und folgen dem Prinzip des problemorientierten Unterrichts. Die Schülerinnen und Schüler arbeiten nicht völlig frei, es handelt sich aber auch nicht um einen rein lehrerzentrierten Vortrag, sondern eine Mischung aus beiden Formen, die wir als „Geführtes Lernen an Stationen“ (G) bezeichnen. In dieser Variante stellt der Referent die didaktische Leitung der Führung dar, der Impulse und Anleitungen gibt, immer für Fragen zur Verfügung steht, jedoch Anteile von Selbsttätigkeit ermuntert und begleitet. Im Zeitraum von April 2014 bis November 2015 nahmen 692 Grundschulkinder der dritten Klassen bayerischer Grundschulen in 35 Klassen an der Studie am Wild-Park Klaushof sowie in ihren eigenen Klassenzimmern in der Schule teil. Durchschnittlich waren die Kinder 8.88 ± 0.56 Jahre alt, das Alter variierte zwischen 8 und 11 Jahren. 48,6 % der teilnehmenden Kinder waren Jungs, 51,4 % Mädchen. Im Vormittagsteil des Programms wurde im Rahmen einer problemorientierten Unterrichtseinheit gemeinsam mit den Schülerinnen und Schülern die Frage aufgeworfen, warum die europäische Wildkatze (Felis silvestris silvestris), eine Zeigerart für intakte Ökosysteme, nicht überall vorkommt, wo sie vorkommen könnte. Gemeinsam wurden Aspekte zu Morphologie, Ökologie und Verhalten der Wildkatze erarbeitet; die Frage konnte jedoch auch dann noch nicht beantwortet werden. Erst eine Verknüpfung der Verbreitungskarten und der gelernten Fakten führte zur Erkenntnis, dass die Wildkatze bestimmte Barrieren (Autobahnen, offene Wiesen- und Ackerflächen, bebaute Flächen etc.) nicht überwinden kann und hier der Eingriff des Menschen nötig ist. Nicht nur allgemein, sondern auch ganz konkret wurde der eigene Einsatz der Kinder, zum Beispiel im Rahmen der Mitarbeit in einer Naturschutz-Organisation oder einer Geldspende angeregt. (1) Zur Messung der Umwelteinstellungen verwendeten wir das 2-MEV Modell (two major environmental factors), das die Umwelteinstellungen in zwei Dimensionen darstellt, zum einen die Tendenz zur Erhaltung, zum anderen die Ausnutzungstendenz der Umwelt. Die Fragebögen wurden zu drei Testzeitpunkten ausgefüllt - einem Vortest ca. eine Woche vor dem Programm, einem Nachtest unmittelbar nach Beendigung des Programms und einem Behaltenstest etwa sechs bis acht Wochen nach dem Programm. Die Umwelt-Einstellungen konnten tatsächlich verändert werden, nicht nur am Wildpark, sondern auch in der Schule, wo Klassen das Programm zu Kontrollzwecken ebenfalls durchliefen. Auch blieb der Einfluss über alle verwendeten Lehrmethoden konsistent. Besonders überrascht waren wir von der Art der Änderung der Einstellungen zur Naturerhaltung. Statt sich wie erwartet von schwächerer Tendenz zur Erhaltung in Richtung stärkere Tendenz zur Naturerhaltung zu ändern, erfolgte die Änderung genau entgegengesetzt. Wir vermuten, dass die Kinder dieser Altersgruppe die Inhalte der Intervention reflektiert haben und dies einen Einfluss auf ihre Einstellungen zur Naturerhaltung hatte, was sich in einem realistischeren Ankreuzverhalten niederschlug. Zusammenfassend sehen wir es als möglich an, die Einstellungen zur Umwelt von Grundschulkindern mit einem Ein-Tagesprogramm zu verändern. (2) Auch für die Erhebung des Umweltwissens wählten wir die bereits erwähnten drei Testzeitpunkte für den Wissensfragebogen, der Fragen zur Morphologie, Ökologie und Verhalten der Wildkatze beinhaltete. Die Anzahl richtiger Antworten erhöhte sich vom Vor- zum Nachtest sowie vom Vor- zum Behaltenstest signifikant bei allen Schülerinnen und Schülern, es wurde also erfolgreich gelernt. Zwischen den einzelnen Führungsformen konnten wir signifikante Unterschiede nur kurzfristig vom Vor- zum Nachtest zwischen den beiden Methoden mit dem didaktischen Begleiter, also dem stärker lehrerzentrierten (T) und dem „Geführten Lernen an Stationen“ (G) einerseits und dem stark schülerzentrierten freien Lernen (S) andererseits erkennen. Der kurzfristige Wissenserwerb war mit didaktischem Begleiter (G, T) höher als ohne. Insgesamt konnte also ein Lernerfolg verzeichnet werden, unabhängig von der Führungsform. Allerdings vermuten wir, dass der kurzfristige Unterschied sich auch mittelfristig ausgewirkt hätte, wenn im Anschluss an den Besuch im Wildpark eine Nachbereitung stattgefunden hätte, was gewöhnlich zum Besuch des außerschulischen Lernorts gehören sollte, jedoch nicht Bestandteil dieser Untersuchung war. Vergleicht man die beiden Ansätze mit didaktischen Begleitern (G, T), bevorzugen wir nach wie vor unser „Geführtes Lernen an Stationen“ (G), da hier die Einbindung konstruktivistischer Phasen möglich ist. Darüber hinaus kann die (zumindest zeitweise) Anwesenheit eines Lehrers in der Rolle des didaktischen Begleiters sicherstellen, dass Disziplin gewahrt wird und Störungen vermieden werden. Um die situationalen Emotionen der Schülerinnen und Schüler mit einbeziehen zu können, beziehungsweise Effekte von situationalen Emotionen auf Umwelteinstellungen oder Wissenserwerb ausschließen zu können, wendeten wir zusätzlich eine Kurzskala zur Erfassung von Interesse, Langeweile und Wohlbefinden an. Diese Skala wurde nur einmalig angewendet, direkt im Anschluss an das Vormittagsprogramm. Wir konnten keine Unterschiede bei den erhobenen situationalen Emotionen finden - weder zwischen den Lernorten Schule und Wildpark noch zwischen den drei verschiedenen Führungsformen (G, T, S), überall zeigten sich hohe Werte für Interesse und Wohlbefinden sowie niedrige Werte für Langeweile. Dieses Ergebnis zeigt für uns die hohe didaktische Qualität der Entwicklung und Durchführung des Programms. (3) Am Nachmittag des Ein-Tages-Programms beschäftigten sich die Kinder weiter mit der Wildkatze, diesmal folgten wir einer anderen Methode der Wissensvermittlung, der „Conceptual Change Theorie“ in Kombination mit komplexerem und gleichzeitig faszinierendem Wissen zum Dämmerungssehen der Katze. Gemäß dem Prinzip der didaktischen Rekonstruktion wurden Wissensinhalte im Rahmen dieser Intervention nicht kontinuierlich erarbeitet wie im Vormittagsprogramm, sondern es fand eine Konfrontation der Schülerinnen und Schüler mit ihren eigenen Schülervorstellungen zum Thema Dämmerungssehen bei Mensch und Katze statt. Diese Vorstellungen wurden vorab in einem offenen Fragebogen erhoben und in drei Themenschwerpunkte gegliedert, die sich anschließend im Fragebogen zur Erhebung des Konzeptwechsels widerspiegelten. Auch dieser Fragebogen wurde zu den eingangs erwähnten drei Testzeitpunkten angewendet. Gemäß der Theorie erwarteten wir im Ankreuzverhalten drei Gruppen: „Conceptual Change“, „Synthetic Models“ sowie „Conceptual Growth“. Darüber hinaus fanden wir zwei weitere Gruppen „Knowledge“ und „Non-addressed Concepts“. Wir stellten fest, dass der Konzeptwechsel der Kinder von der wissenschaftlich nicht korrekten Schülervorstellung hin zur wissenschaftlich korrekten Vorstellung in unserer Intervention nicht gelang, nur punktuell kreuzten wenige Schülerinnen und Schüler das entsprechende Muster an. Auch der Wechsel in den anderen Gruppen hin zur wissenschaftlich korrekten Vorstellung funktionierte kaum. In unserem Fall hatten darüber hinaus je nach Thema nur ein Drittel bis ein Viertel der beteiligten Kinder überhaupt die adressierte Vorstellung, was unserer Meinung nach dazu führt, dass der Großteil der Kinder mit anderen Vorstellungen durch die Anwendung der „Conceptual Change Theorie“ eher verwirrt wurde. Wir vermuten, dass Grundschulkinder der dritten Klasse durch diese Form des Unterrichts überfordert sind. KW - Biologie KW - Education Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169496 ER - TY - THES A1 - Tulke, Moritz T1 - Grundlegende Arbeiten zum bio-artifiziellen renalen Tubulus aus ko-kultivierten adipozytären mesenchymalen Stammzellen und Endothelzellen auf einer synthetischen Kapillarmembran T1 - Fundamental work on a bio-artificial renal tubule consisting of co-cultivated adipose-derived mesenchymal stem cells and endothelial cells on a synthetic capillary membrane N2 - Mit fortschreitender chronischer Niereninsuffizienz kommt es zur Akkumulation von Urämietoxinen und im Endstadium unbehandelt zum Tod im sogenannten Urämischen Syndrom. Die Blutreinigung erfolgt bei der am häufigsten verwendeten Form der Nierenersatztherapie, der Hämodialyse, nur unzureichend. Die Folge ist eine erhöhte Morbidität und Mortalität der betroffenen Patienten. Bei der Hämodialyse werden nur Urämietoxine bis zu einer Größe von 20 kDa über die im Dialysator eingesetzten Hohlfaserdialysemembranen diffusiv und konvektiv semiselektiv nach Größenausschluss entfernt. Proteingebundene Urämietoxine, deren effektive Größe durch die Bindung an Transportproteine wie beispielsweise Albumin die Trennschärfe der Dialysemembranen übersteigt, werden retiniert. In-vivo werden proteingebundene Urämietoxine im proximalen Tubulus, einem Teil des tubulären Systems des Nephrons, sekretorisch eliminiert. Im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit wurden die ersten Entwicklungsschritte auf dem Weg zu einem sogenannten bio-artifiziellen Tubulus evaluiert. Der angedachte biohybride Filter sollte aus einer Ko-Kultur funktionaler humaner proximaler Tubuluszellen und humaner Endothelzellen (HUVEC) auf synthetischen Hohlfasermembranen bestehen und könnte während der Hämodialyse als zusätzlicher Reinigungsschritt angewendet werden, um unter anderem proteingebundene Urämietoxine effektiv durch aktiven Transport aus dem Blut der Patienten zu entfernen. Die Differenzierung der proximalen Tubuluszellen erfolgte dabei aus adulten adipozytären mesenchymalen Stammzellen (ASC), deren Herkunft eine spätere autologe Behandlung ermöglicht. Die Ko-Kultur mit Endothelzellen wurde zur potentiellen Steigerung der Sekretion proteingebundener Urämietoxine verwendet. In der vorliegenden Arbeit konnten ASCs durch eine Kombination der löslichen Differenzierungsfaktoren All-Trans-Retinoinsäure (ATRA), Aktivin A und BMP-7 erfolgreich in Zytokeratin 18-exprimierende Zellen differenziert werden, wodurch die erwünschte epitheliale Differenzierung bestätigt wurde. Die Expression funktionaler Proteine, wie das für den Wassertransport relevante Aquaporin 1 oder auch der Na+-/K+-ATPase, konnte in dieser Arbeit bereits vor der Differenzierung nachgewiesen werden. Im nächsten Schritt wurde erfolgreich gezeigt, dass eine simultane, qualitativ hochwertige Ko-Kultur von ASCs und HUVECs auf der mit dem extrazellulären Matrixprotein Fibronektin modifizierten Innen- bzw. Außenseite von synthetischen Hohlfasermembranen aus Polypropylen bzw. Polyethersulfon möglich ist. Die Viabilität beider Zelltypen wurde dabei durch die Verwendung eines für die Ko-Kultur entwickelten Nährmediums erreicht, in welchem die Proliferation von ASCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer Stammzelleigenschaften deutlich erhöht war. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse stellen eine aussichtsreiche Basis für einen bio-artifiziellen renalen Tubulus dar. Weitere Entwicklungsschritte, wie die Differenzierung der ASCs zu proximalen Tubuluszellen im 3D-Bioreaktor einschließlich ihrer funktionalen Charakterisierung anhand Tubulusepithel-spezifischer Transporter, sind erforderlich, be-vor erste funktionale Experimente vor dem „Upscaling“ auf klinisch verwendbare Module möglich sind. N2 - Progressing chronic kidney disease results in the accumulation of uremic toxins and, if left untreated in end-stage kidney disease, death due to the developing uremic syndrome. The most common renal replacement therapy is hemodialysis. It is a life-prolonging therapy but only delivering inadequate blood purification, which is associated with excess morbidity and mortality of the patients. In hemodialysis, only uremic toxins with a molecular size of up to 20 kDa are removed by diffusion or convection. Solutes are eliminated by semi-selective size exclusion across a hollow fiber dialysis membrane in a dialyzer. Binding of certain uremic toxins to carrier proteins, such as albumin, results in an increased effective size, which excludes them from passing through dialysis membranes. In the native kidney, these protein-bound uremic toxins are eliminated from blood by secretory transport in the proximal tubule, a specific part of the tubular filtration apparatus of the nephron. The present doctoral thesis evaluated the first steps towards a so-called bio-artificial tubule. The intended biohybrid filter was supposed to consist of a co-culture of functional human proximal tubule cells and human endothelial cells on synthetic hollow fiber membranes. In its final form, it would be implemented during hemodialysis as an additional purification step to more efficiently remove protein-bound uremic toxins from the patients’ blood by active transport. The proximal tubule cells were differentiated from adipose-derived mesenchymal stem cells, which facilitates a later autologous treatment. The co-culture with endothelial cells should further promote the expression of transporters for organic anions and, thereby, potentially increase the secretion of protein-bound uremic toxins. In the present study, the differentiation from ASCs to a CK18-expression lineage, which confirmed successful epithelial differentiation, was induced by a combination of the soluble differentiation factors all-trans-retinoic acid, activin A and BMP-7. The expression of functional proteins, i.e., of aquaporin 1, which is relevant for water transport, and Na+-/K+-ATPase, was shown already before differentiation. Additionally, the present work demon-strated a high-quality co-culture of ASCs and HUVECs on the inner- and outer membrane surfaces of synthetic polypropylene- or polyethersulfone-based hollow fiber membranes, which initially were surface-modified with the extracellular matrix protein fibronectin. The viability of both cell types was thereby ensured by the application of a specific co-culture medium, which further increased the proliferation of ASCs intensely while maintaining their stem-cell character. The results of the present approach represent a promising basis for a bio-artificial renal tubule. The further development requires the differentiation of ASCs into proximal tubule cells on the 3D-bioreactor membrane and their characterization by verifying tubulusepithel-specific transporters. Finally, subsequent functional experiments have to precede an upscaling to clinically applicable modules. KW - Hohlfaserreaktor KW - Stammzelle KW - Endothelzelle KW - Adipozytäre mesenchymale Stammzelle KW - Bio-artifizieller Tubulus KW - Ko-Kultur Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216896 ER - TY - THES A1 - Lehmann, Julian T1 - Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie beleuchtet den Oligomerisierungsstatus pflanzlicher Membranproteine T1 - Super-resolution microscopy elucidates the stoichiometry of plant membrane proteins N2 - SLAC/SLAH Anionenkanäle, die zur Familie der langsamen Anionenkanäle gehören, repräsentieren Schlüsselproteine in der pflanzlichen Stressantwort. Neben ihrer Aufgabe in Stresssituationen, ist eine Untergruppe der Kanäle für die Beladung der Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid in der Stele der Pflanzenwurzeln verantwortlich. Biophysikalische und pflanzenphysiologische Studien stellten heraus, dass vor Allem der Anionenkanal SLAH3 für die Beladung der Xylem Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid verantwortlich ist. Ihm zur Seite gestellt werden noch die elektrisch inaktiven Homologe SLAH1 und SLAH4 in der Wurzel exprimiert. Sie steuern die Aktivität von SLAH3 durch die Assemblierung zu SLAH1/SLAH3 oder SLAH3/SLAH4 Heteromeren. Neben der Kontrolle durch Heteromerisierungsereignisse, werden SLAH3 Homomere sehr spezifisch und schnell durch zytosolische Ansäuerung aktiviert. Obwohl bereits die Kristallstruktur des bakteriellen Homologs HiTehA zu pflanzlichen SLAC/SLAH Anionenkanälen bekannt ist, welche HiTehA als Trimer charakterisiert, sind die Stöchiometrie und der Polymerisierungsgrad der pflanzlichen SLAC/SLAHs bisher noch unbekannt. Die Fluoreszenzmikroskopie umfasst viele etablierte Anwendungsmethoden, wie die konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM), Techniken mit verbesserter Auflösung, wie die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) und hochauflösende Methoden, welche durch die Lokalisationsmikroskopie (z.B. dSTORM und PALM) oder die Expansionsmikroskopie (ExM) vertreten werden. Diese unterschiedlichen Mikroskopie-methoden ermöglichen neue Einblicke in die Organisation von Proteinen in biologischen Systemen, die bis auf die molekulare Ebene hinunterreichen. Insbesondere im Bereich der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie sind im Gegensatz zu tierischen Frage-stellungen bisher jedoch nur wenige Untersuchungen in pflanzlichen Geweben durchgeführt worden. Die Lokalisationsmikroskopie ermöglicht die Quantifizierung einzelner Moleküle in nativen Systemen und lässt überdies Rückschlüsse auf den Polymerisierungsgrad von Proteinen zu. Da Poly- und Heteromerisierung von Proteinen oftmals mit der Funktionalität eines entsprechenden Proteins einhergeht, wie es bei den SLAC/SLAH Anionenkanälen der Fall ist, wurden in dieser Arbeit PALM Messungen zur Untersuchung des Polymerisierungsgrades und Interaktionsmuster der Anionenkanäle angewendet. Ferner wurden Expressionsmuster der SLAC/SLAHs untersucht und zudem Mikroskopieanwendungen im Pflanzengewebe etabliert und verbessert. In Bezug auf die Mikroskopieanwendungen konnten wir in Arabidopsis thaliana (At) Wurzeln die polare Verteilung von PIN Proteinen mittels SIM bestätigen und die gruppierte Verteilung in der Plasmamembran am Zellpol auflösen. In Wurzel-querschnitten war es möglich, Zellwände zu vermessen, den Aufbau der Pflanzenwurzel mit den verschiedenen Zelltypen zu rekonstruieren und diesen in Zusammenhang mit Zellwanddicken zu bringen. Anhand dieser Aufnahmen ließ sich die Auflösungsgrenze eines SIM-Mikroskops bestimmen, weshalb diese Probe als Modellstruktur für Auflösungsanalysen, zur Kontrolle für die korrekte Bildverarbeitung bei hochauflösender Bildgebung und andere Fragestellungen empfohlen werden kann. Für die Expansionsmikroskopie in pflanzlichen Proben konnten ein enzym- und ein denaturierungsbasiertes Präparationsprotokoll etabliert werden. Dabei wurden ganze At Setzlinge, Wurzelabschnitte und Blattstücke gefärbt, expandiert und mit zwei bis drei Mal verbesserter Auflösung bildlich dargestellt. In diesem Zusammenhang waren Aufnahmen ganzer Wurzel- und Blattproben mit beeindruckender Eindringtiefe und extrem geringem Hintergrundsignal möglich. Zudem wurden die Daten kritisch betrachtet, Probleme aufgezeigt, gewebespezifische Veränderungen dargestellt und limitierende Faktoren für die ExM in Pflanzenproben thematisiert. Im Fokus dieser Arbeit stand die Untersuchung der SLAC/SLAH Proteine. SLAH2 wird in den Wurzeln vornehmlich in Endodermis- und Perizykelzellen exprimiert, was anhand verschiedener At SLAH2 YFP Mutanten untersucht werden konnte. Dies unterstützt die Annahme, dass SLAH2 bei der Beladung der Leitgefäße mit Nitrat maßgeblich beteiligt ist. Es ist denkbar, dass SLAH2 ebenfalls eine wachstumsbeeinflussende Funktion über die Regulation von Nitratkonzentrationen zugeschrieben werden kann. Darauf deuten vor allem die verstärkte Expression von SLAH2 im Bereich der Seitenwurzeln und die heterogene Expression in der Elongations-, Differenzierungs- und meristematischen Zone hin. Die Membranständigkeit von SLAH4 konnte nachgewiesen werden und FRET FLIM Untersuchungen zeigten eine hohe Affinität von SLAH4 zu SLAH3, was die beiden Homologe als Interaktionspartner identifiziert. Für die Bestimmung des Oligomerisierungsgrades mittels PALM wurden die pflanzlichen Anionenkanäle in tierischen COS7-Zellen exprimiert. Die elektrophysiologische Funktionalität der mEOS2-SLAC/SLAH-Konstrukte wurde mit Hilfe von Patch-Clamp-Versuchen in COS7-Zellen überprüft. Um Expressionslevel, Membranständigkeit und die Verteilung über die Membran der SLAC/SLAHs zu verifizieren, wurden dSTORM-Aufnahmen herangezogen Schließlich ermöglichten PALM-Aufnahmen die Bestimmung des Polymerisierungs-grades der SLAC/SLAH Anionenkanäle, die stöchiometrischen Veränderungen bei Heteromerisierung von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 und auch der Einfluss einer zytosolischer Ansäuerung auf den Polymerisierungsgrad von SLAH3 Homomeren. Zudem weisen die Oligomerisierungsanalysen von SLAH3 Mutanten darauf hin, dass die Aminosäuren Histidin His330 und His454 entscheidend an der pH sensitiven Regulierung von SLAH3 beteiligt sind. Durch die erhobenen Daten konnten also entscheidende, neue Erkenntnisse über die Regulationsmechanismen von pflanzlichen Anionenkanälen auf molekularer Ebene gewonnen werden: Unter Standardbedingungen liegen SLAC1, SLAH2 und SLAH3 hauptsächlich als Dimer vor. Auf eine zytosolische Ansäuerung reagiert ausschließlich SLAH3 mit einer signifikanten stöchiometrischen Veränderung und liegt im aktiven Zustand vor Allem als Monomer vor. Der Oligomerisierungsgrad von SLAC1 und SLAH2 bleibt hingegen bei einer zytosolischen Ansäuerung unverändert. Ferner kommt es bei der Interaktion von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 zur Formierung eines Heterodimers, welches unbeeinflusst durch den zytosolischen pH bleibt. Im Gegensatz dazu bleiben die elektrisch inaktiven Untereinheiten SLAH1 und SLAH4 monomerisch und assemblieren ganz spezifisch nur mit SLAH3. Die hochauflösende Fluoreszenz-mikroskopie, insbesondere PALM erlaubt es also Heteromerisierungsereignisse und Änderungen im Poylmerisierungsgrad von Membranproteinen wie den SLAC/SLAHs auf molekularer Ebene zu untersuchen und lässt so Rückschlüsse auf physiologische Ereignisse zu. N2 - Anion channels of the slow anion channel family (SLAC/SLAH) are general master switches of plant stress responses. In addition a subgroup of channels load the vascular tissue in roots with nitrate and chloride. The activity of the main nitrate and chloride loading anion channel, SLAH3, is controlled by heteromerization with the electro-physiologically silent subunits SLAH1 and SLAH4 or alternatively by cytosolic acidification. Although the crystal structure of a bacterial homologue (HiTehA) of plant SLAC/SLAH anion channels is already known and suggests a trimeric structure, the stoichiometry and the multimerization level of the plant anion channel counterparts are still undiscovered. Fluorescence microscopy encompasses numerous well-established application methods like confocal laser scanning microscopy (CLSM), high resolution techniques like structured illumination microscopy (SIM) and super resolution microscopy represented by single molecule localization microscopy (e.g. dSTORM and PALM) or recently upcoming methods like expansion microscopy (ExM). These different application methods open new fields of insight into the biological organization of proteins, even down to the molecular level. In comparison to faunal studies, very little floral enquiries have been conducted, especially in the super resolution-sector. Single-molecule localization microscopy enables individual molecules to be quantified in the native environment and therefore allows conclusions regarding protein stoichiometry. As protein stoichiometry often involves cellular function of the corresponding protein, we used PALM applications and single molecule counting strategies to analyze the stoichiometric distribution of anion channel complexes. Moreover, in this study, expression patterns of the SLAC/SLAH proteins were investigated and different microscopic applications on plant specific issues could be improved and established. Referring to microscopic applications, we confirmed the polar orientation of PIN proteins via SIM and succeeded in resolving the clustered distribution in the plasma membrane at the cellular pole. Besides we were also able to measure cellwall dimensions of root cross sections from Arabidopsis thaliana seedlings and therefore succeeded in concluding the root architecture, designating the various cell types within the root, comparing them with cellwall thickness and evaluating resolution limits of the SIM microscope. Due to these reasons, this specimen can be recommended as a model structure for resolution analyses, control measurements regarding tissue-intactness after image processing for super-resolution images, or further questions. We turned out to establish two different protocols for ExM-studies in plants. One is based on enzymatic digestion and the other one on denaturation. We were able to label, expand and image whole At-seedlings, root- and leaf segments and thereby improved the resolution 2 3 fold. In this regard we managed to comprehensively depict the intact structure of leaves and roots with impressive penetration depth and extremely low background. We also examined our data and identified tissue-specific changes, discuss problems and possible limits of ExM in plants. The major part of this work was the investigation of SLAC/SLAH proteins. The expression of SLAH2 in roots is mainly located in endodermal and pericycle cells which was observed in various At-SLAH2-YFP mutants. Thus, strengthening the hypothesis, that SLAH2 has a major role in loading the vascular tissue with nitrate. The heterogeneous expression levels of SLAH2 in the meristematic-, elongation- and differentiation zone and moreover the upregulation in areas of lateral root formation also suggests that SLAH2 has an effect on plant growth by regulating nitrate levels. SLAH4 is located in the plasma membrane and FRET FLIM measurements showed a high affinity to SLAH3, validating the two homologues as interaction partners. For PALM-stoichiometry analyses, the plant anion channels were expressed in mammalian COS7-cells, in order to avoid endogenous falsification of the stoichiometries, as well as impractical reasons of PALM imaging in plant tissue. Hence, checking the electrophysiological functionality of mEOS2-SLAC/SLAH constructs via patch-clamp measurements. dSTORM-measurements were used to verify expression levels, correct membrane-association and the distribution of the SLAC/SLAHs in COS7 cells. We determined the multimerization level of SLAC/SLAHs upon cytosolic acidification and monitor stoichiometric changes upon heteromerization of SLAH3 with SLAH1 and SLAH4. On the basis of our data the following valuable new insights into the regulation mechanisms of plant anion channels were revealed: under control conditions, SLAC1, SLAH2 and SLAH3 are mainly depicted as dimers. Upon cytosolic acidification with NaOAc the stoichiometries of SLAC1 and SLAH2 remained unchanged, whereas the amount of dimeric SLAH3 is significantly reduced and shifts to a mainly monomeric distribution. It could also be assessed that SLAH3 interacts with SLAH1 or SLAH4, thereby forming a heterodimer, which is barely separable by acidification. In contrast, for SLAH1 and SLAH4 no affinity was observed. Moreover, the stoichiometries of different SLAH3-mutants indicated a crucial role of the amino acids histidin His330 and His454 in the pH-sensitive regulation of SLAH3. Hence, super-resolution micrsocopy, especially PALM allows the quantification of polymerization- and heteromerization-levels of proteins like the SLAC/SLAH anion-channels on the molecular level and therefore enabling physiological conclusions. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Membranproteine KW - Oligomerisation KW - Superresolution microscopy KW - SLAC/SLAH KW - PALM stoichiometry Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211762 ER -