TY  - THES
A1  - Mentzel, Benjamin Tobias
T1  - Biochemische und phänotypische Untersuchungen zur Funktion der p21-aktivierten Kinase DPAK3 in Drosophila melanogaster
T1  - Biochemical and phenotypic analysis of the p21-activated kinase DPAK3 in Drosophila melanogaster
N2  - Gegenstand dieser Arbeit ist das Drosophila melanogaster Protein DPAK3, ein Vertreter der hochkonservierten Familie der p21-aktivierten Kinasen (PAK). DPAK3 und seine Homologen aus anderen Insektenarten und C. elegans können aufgrund eines Vergleichs der Proteinsequenz und struktureller Merkmale in eine eigenen Untergruppe 1* innerhalb der Gruppe 1 der PAK-Proteine eingeordnet werden. Das Genom von Drosophila kodiert noch für zwei weitere PAK-Proteine, das zur Gruppe 1 gehörende DPAK1 und das Gruppe 2 PAK-Protein Mbt. Wie die klassischen Gruppe 1 PAK-Proteine bildet DPAK3 im inaktiven Zustand Dimere. DPAK3 interagiert mit den GTP-gebundenen Formen der RhoGTPasen Rac1, Rac2 und Cdc42. Durch die Bindung dieser Proteine geht DPAK3 aus dem dimeren in den monomeren Zustand über und seine Kinaseaktivität wird durch diese Bindung gesteigert. DPAK3 ist für die Ausbildung der korrekten Morphologie kultivierter Drosophila Zellen erforderlich und beeinflußt die Regulation des Aktinzytoskeletts. Weiterhin konnte CK2beta, die regulatorische Untereinheit der Casein Kinase 2, als neuer Regulator von p21-aktivierten Kinasen identifiziert werden. Das Genom von Drosophila besitzt drei Transkriptionseinheiten, die für CK2beta', CK2betatestes und fünf verschiedene Isoformen von CK2beta kodieren. Eine vergleichende Analyse zeigt, daß alle CK2beta-Proteine mit DPAK1, DPAK3 und in geringerem Maß auch mit Mbt interagieren und in der Lage sind, die Aktivität der PAK-Proteine in vitro zu hemmen. Die Bindung von CK2beta an DPAK3 wird, wie bei allen anderen Serin- / Threoninkinasen, die bisher als Interaktionspartner von CK2beta identifiziert wurden, über die Kinasedomäne von DPAK3 vermittelt. Die Bildung des aus zwei katalytischen CK2a und zwei CK2beta Untereinheiten bestehenden CK2-Holoenzyms hängt von der Fähigkeit von CK2beta ab, Dimere zu bilden. Es konnte gezeigt werden, daß die Bildung eines b-b Dimers für die Interaktion mit und Regulation von DPAK3 nicht erforderlich ist. In vivo wurden die bisher bekannten Dpak3 Allele untersucht, wobei kein gesichertes Nullallel identifiziert werden konnte. Durch enzymatisch katalysierte Rekombination wurde eine neue Deletion hergestellt, die das komplette Leseraster von Dpak3 entfernt. Mit Hilfe von genetischen Mosaiken wurde die Rolle von DPAK3 in der Augenentwicklung untersucht. Durch den Verlust der Genfunktion von Dpak3 wird die Ausbildung der korrekten Struktur der Komplexaugen nur leicht beeinträchtigt. Bei der Analyse einer Dpak1 Mutante wurde dasselbe Ergebnis erzielt. Gleichzeitiger Verlust der Genfunktion von Dpak1 und Dpak3 hingegen führt zu massiven strukturellen Defekten. DPAK1 und DPAK3 erfüllen somit zumindest teilweise redundante Funktionen in der Augenentwicklung. Es wird Gegenstand zukünftiger Studien sein müssen, die gemeinsamen und getrennten Funktionen dieser PAK-Proteine in Drosophila aufzuklären.
N2  - Subject of this work is the Drosophila melanogaster protein DPAK3, a member of the highly conserved family of p21-activated kinases. Based on the comparison of the amino acid sequence and structural features, DPAK3 and its homologues from other insect species and C. elegans can be assigned to a distinct subgroup 1* within the group 1 PAK proteins. The genome of Drosophila encodes for two additional PAK proteins, DPAK1 and Mbt, which belong to the group 1 and group 2 p21-activated kinases, respectively. Like the classical group 1 PAK proteins, DPAK3 forms dimers in its inactive conformation. DPAK3 binds to and is activated by the Rho GTPases Rac1, Rac2 and Cdc42. The interaction with these proteins leads to the disruption of the DPAK3 dimer and an increase in the kinase activity of DPAK3. DPAK3 is necessary for the development of the normal morphology of cultured Drosophila cells and influences the regulation of the actin cytoskeleton. CK2b the regulatory subunit of casein kinase 2 was identified as a new regulator of p21 activated kinases. The genome of Drosophila possesses three different transcriptional units that encode the proteins CK2b', CK2btestes and five different isoforms of CK2b. A comparative analysis shows that all CK2b proteins interact with DPAK1, DPAK3 and Mbt and negatively regulate the activity of these kinases in vitro. CK2b binds to the kinase domain of DPAK3 which is consistent with previous results obtained from other serine/threonine kinases interacting with CK2b. The CK2 holoenzyme consists of two catalytically active CK2a subunits and two regulatory CK2b subunits. My results show that the ability of CK2b to form dimers, which is essential for the formation of the CK2 holoenzyme, is not necessary for the regulation of p21 activated kinases. The analysis of the available Dpak3 alleles in vivo revealed the necessity to create a new bona fide loss of function allele. To accomplish this goal, a new deletion which removes the entire Dpak3 open reading frame was created by enzymatically catalysed recombination. Genetic mosaics were used to study the role of DPAK3 in eye development. The morphology of the complex eyes was only slightly impaired by the loss of Dpak3 function. The same result was obtained when analysing Dpak1 mutants, but removal of the gene function of both Dpak1 and Dpak3 leads to massive structural defects. This shows that Dpak1 and Dpak3 have at least partially redundant functions in eye development. Further studies will be necessary to reveal the common and distinct functions of these p21-activated kinases in Drosophila.
KW  - Taufliege
KW  - Drosophila melanogaster
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30290
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nieratschker, Vanessa
T1  - Charakterisierung der Serin-/Threonin-Proteinkinase SRPK3 in Drosophila melanogaster und Phosphorylierungsstudien an Synapsin
T1  - Characterization of the serine-/threonine protein kinase SRPK3 in Drosophila melanogaster and phosphorylation studies on synapsin
N2  - In einer vorangegangenen Arbeit konnte eine hypomorphe Mutation innerhalb des Genlokus einer putativen Serin-/Threonin-Kinase als Auslöser der Aggregatbildung des Aktive-Zone- Proteins Bruchpilot in larvalen Motoneuronaxonen identifiziert werden (Nieratschker, 2004). Aufgrund der Homologien dieser Kinase zu SR-Proteinkinasen wurde der Name Serin- /Threonin-Proteinkinase 3 (SRPK3) vorgeschlagen. Laut ursprünglicher Annotation der „Flybase“ (http://flybase.bio.indiana.edu) codiert der Genlokus der Srpk3, der auf dem linken Arm des dritten Chromosoms innerhalb der Region 79D4 lokalisiert ist und sich über ca. 10,3 kb erstreckt, für zwei Transkripte (Srpk3-RC und Srpk3-RB). Diese beiden Transkripte haben unterschiedliche Transkriptions- und Translationsstartpunkte und unterscheiden sich in ihrem ersten kodierenden Exon, ab dem vierten Exon sind sie allerdings identisch. Das Srpk3-RCTranskript umfasst ca. 4,2 kb, das Srpk3-RB-Transkript ca. 3,8 kb. Die von diesen Transkripten kodierten Proteine bestehen aus 816 (Srpk3-RC) bzw. 749 (Srpk3-RB) Aminosäuren. Diese beiden ursprünglich annotierten Transkripte konnten durch RT-PCR-Experimente bestätigt werden. Dabei wurde auch ein zusätzliches, alternativ gespleißtes Exon von 159 bp entdeckt, das beiden Transkripten zugeordnet werden kann. Somit codiert der Srpk3-Genlokus für mindestens vier Transkripte, die Transkripte der RC/RF-Transkriptgruppe mit (Srpk3-RF) und ohne (Srpk3-RC) das alternativ gespleißte Exon und die Transkripte der RB/RETranskriptgruppe mit (Srpk3-RE) und ohne (Srpk3-RB) das alternativ gespleißte Exon. Die Existenz eines weiteren Transkriptes Srpk3-RD, die in der aktuellen Version der „Flybase“ annotiert ist, konnte durch RT-PCR-Experimente nicht nachgewiesen werden. Zu Beginn dieser Arbeit lag eine hypomorphe Mutante für die SRPK3 schon vor (Srpk3P1; Eberle, 1995). Diese Linie trägt eine P-Elementinsertion innerhalb des ersten Exons der RC/RF-Transkriptgruppe, die das Leseraster dieser Transkriptgruppe zerstört, so dass in dieser Linie nur die RB/RE-Transkriptgruppe gebildet werden kann. Wie bereits erwähnt, konnte diese Mutation in vorangegangenen Arbeiten bereits als der Auslöser der Aggregatbildung des Bruchpilot-Proteins in larvalen Motoneuronaxone, sowie einiger Verhaltensdefekte identifiziert werden (Nieratschker, 2004; Bock 2006). Diese Verhaltensdefekte ähneln stark denen, die durch einen knock-down der Bruchpilot-Expression mittels RNAi ausgelöst werden (Wagh et al., 2006; Bock, 2006), was auf eine Interaktion beider Proteine schließen lässt. Um nun den Beweis führen zu können, dass tatsächlich diese Mutation die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsversuche durchgeführt. Die Srpk3-RF-cDNA war dabei in der Lage die durch die hypomorphe Mutation der SRPK3 verursachten Phänotypen vollständig, oder zumindest teilweise zu retten (vgl. auch Bock, 2006; Bloch, 2007). Damit konnte belegt werden, dass die hypomorphe Mutation der SRPK3 tatsächlich die in der Mutante Srpk3P1 beobachteten Phänotypen verursacht. Um die durch in situ Hybridisierung erhaltenen Daten zur Lokalisation der SRPK3 im larvalen Gehirn (Nieratschker, 2004) bestätigen, sowie weitere Daten erhalten zu können, wurden Isoform-spezifische Antisera gegen die SRPK3 generiert. Diese Antiseren sind in der Lage überexprimiertes Protein zu detektieren (Bloch, 2007), allerdings ist es mit diesen Antiseren nicht möglich die SRPK3 in wildtypischen Präparaten nachzuweisen. Weitere Daten zur Lokalisation der SRPK3, die durch die Verwendung eines SRPK3-eGFPFusionsproteins erhalten wurden, zeigten, dass eine der ektopisch überexprimierten SRPK3- Isoformen mit Bruchpilot an der Aktiven Zone kolokalisiert. Dieses Ergebnis, in Verbindung mit den durch die Mutation der SRPK3 verursachten Bruchpilot-Aggregaten in larvalen Motoneuronaxonen und den Verhaltensdefekten, gibt Hinweise auf eine mögliche direkte Interaktion beider Proteine….
N2  - In a previous study, a hypomorphic mutation in the gene locus of a putative serine-/threonine kinase was found to cause aggregates of the active zone protein Bruchpilot in larval motoneuron axons (Nieratschker, 2004). Because of its high homology to SR-protein kinases this gene was named serine-/threonine protein kinase 3 (Srpk3). The 10,3 kb large Srpk3 gene locus is located on the left arm of the third chromosome in the chromosomal region 79D4. According to an earlier annotation in “flybase” (http://flybase.bio.indiana.edu) the Srpk3 gene codes for two transcripts of 4,2 (Srpk3-RC) and 3,8 kb (Srpk3-RB). These two transcripts use different transcription and translation start sites, but from the fourth exon on they are identical. The Srpk3-RC and Srpk3-RB transcripts code for proteins of 816 and 749 amino acids respectively. The existence of these two originally annotated transcripts could be verified by RT-PCR. In addition, an alternatively spliced exon of 159 bp was identified, which is part of both groups of transcripts (Srpk3-RF and Srpk3-RE). Therefore the Srpk3 gene locus codes for at least four transcripts. Srpk3-RB and Srpk3-RC do not contain the newly identified, alternatively spliced exon, whereas Srpk3-RF and Srpk3-RE do. The existence of another transcript (Srpk3- RD) annotated in the current version of “flybase” could not be confirmed by RT-PCR experiments. The hypomorphic BRPK mutant Srpk3P1, which has a P-element insertion in the first exon of the RC/RF group of transcripts that destroys the open reading frame of those isoforms, already existed (Eberle, 1995). Therefore in that line only the RB/RE isoforms are expressed. That hypomorphic mutation was found to cause Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons (Nieratschker, 2004) and in addition several behavioral deficits (Bock, 2006). The behavioral deficits are similar to those caused by a genetic knock-down of the Bruchpilot expression using RNAi (Wagh et al., 2006; Bock, 2006). This observation points towards an exclusive interaction of both proteins. To prove that in fact the mutation of the SRPK3 causes the observed phenotypes, rescue experiments were performed. We were able to revert the mutant phenotypes by expressing the Srpk3-RF cDNA in the nervous system (see also Bock, 2006; Bloch, 2007). Therefore mutation of the SRPK3 indeed causes the observed phenotypes in the hypomorphic BRPK mutant (Srpk3P1). To confirm the data obtained by in situ hybridization on larval brains (Nieratschker, 2004) and to gain more knowledge regarding the localization of the SRPK3, isoform specific antisera have been generated. These antisera recognize over-expressed protein (Bloch, 2007), but they are not able to recognize SRPK3 in wild type animals. Further data about localization of SRPK3 could be provided by using ectopically overexpressed GFP-tagged SRPK3 isoforms. SRPK3-GFP colocalizes with Bruchpilot at the presynaptic active zone. This result along with the Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons and the behavioral deficits of SRPK3 mutants provide further evidence for a possible interaction of both proteins. To investigate, if a complete loss of SRPK3 expression alters the phenotypes observed in the hypomorphic SRPK3 mutant, a SRPK3 null mutant was generated by jump-out mutagenesis. The phenotypic analyses performed with the hypomorphic line Srpk3P1were repeated with the SRPK3 null mutant. It became obvious that the phenotypes were not enhanced by complete loss of SRPK3 expression (also see Bloch, 2007). Regarding the Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons, no significant differences between hypomorphic mutant and null mutant were observed, however behavioral deficits seem to be more severe in the hypomorph (Bloch, 2007)…..
KW  - Drosophila melanogaster
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Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27806
ER  -