TY - THES A1 - Bakari Soale, Majeed T1 - Regulation of the Variant Surface Glycoprotein (VSG) Expression and Characterisation of the Nucleolar DExD/H box Protein Hel66 in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Regulation der Expression des variable Oberflächen- Glykoprotein (VSG) und Charakterisierung des nukleolären DExD/H box Protein Hel66 in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The variant surface glycoprotein (VSG) of African trypanosomes plays an essential role in protecting the parasites from host immune factors. These trypanosomes undergo antigenic variation resulting in the expression of a single VSG isoform out of a repertoire of around 2000 genes. The molecular mechanism central to the expression and regulation of the VSG is however not fully understood. Gene expression in trypanosomes is unusual due to the absence of typical RNA polymerase II promoters and the polycistronic transcription of genes. The regulation of gene expression is therefore mainly post-transcriptional. Regulatory sequences, mostly present in the 3´ UTRs, often serve as key elements in the modulation of the levels of individual mRNAs. In T. brucei VSG genes, a 100 % conserved 16mer motif within the 3´ UTR has been shown to modulate the stability of VSG transcripts and hence their expression. As a stability-associated sequence element, the absence of nucleotide substitutions in the motif is however unusual. It was therefore hypothesised that the motif is involved in other essential roles/processes besides stability of the VSG transcripts. In this study, it was demonstrated that the 100 % conservation of the 16mer motif is not essential for cell viability or for the maintenance of functional VSG protein levels. It was further shown that the intact motif in the active VSG 3´ UTR is neither required to promote VSG silencing during switching nor is it needed during differentiation from bloodstream forms to procyclic forms. Crosstalk between the VSG and procyclin genes during differentiation to the insect vector stage is also unaffected in cells with a mutated 16mer motif. Ectopic overexpression of a second VSG however requires the intact motif to trigger silencing and exchange of the active VSG, suggesting a role for the motif in transcriptional VSG switching. The 16mer motif therefore plays a dual role in VSG in situ switching and stability of VSG transcripts. The additional role of the 16mer in the essential process of antigenic variation appears to be the driving force for the 100 % conservation of this RNA motif. A screen aimed at identifying candidate RNA-binding proteins interacting with the 16mer motif, led to the identification of a DExD/H box protein, Hel66. Although the protein did not appear to have a direct link to the 16mer regulation of VSG expression, the DExD/H family of proteins are important players in the process of ribosome biogenesis. This process is relatively understudied in trypanosomes and so this candidate was singled out for detailed characterisation, given that the 16mer story had reached a natural end point. Ribosome biogenesis is a major cellular process in eukaryotes involving ribosomal RNA, ribosomal proteins and several non-ribosomal trans-acting protein factors. The DExD/H box proteins are the most important trans-acting protein factors involved in the biosynthesis of ribosomes. Several DExD/H box proteins have been directly implicated in this process in yeast. In trypanosomes, very few of this family of proteins have been characterised and therefore little is known about the specific roles they play in RNA metabolism. Here, it was shown that Hel66 is involved in rRNA processing during ribosome biogenesis. Hel66 localises to the nucleolus and depleting the protein led to a severe growth defect. Loss of the protein also resulted in a reduced rate of global translation and accumulation of rRNA processing intermediates of both the small and large ribosomal subunits. Hel66 is therefore an essential nucleolar DExD/H protein involved in rRNA processing during ribosome biogenesis. As very few protein factors involved in the processing of rRNAs have been described in trypanosomes, this finding represents an important platform for future investigation of this topic. N2 - Das variable Oberflächen-Glykoprotein (“varaint surface glycoprotein“, VSG) der Afrikanischen Trypanosomen schützt den Parasiten vor Immunfaktoren des Wirtes. Trypanosomen beherrschen die antigene Variation und expremieren nur eine einzige VSG Isoform aus einem Repertoire von ungefähr 2000 Genen. Der molekulare Mechanismus der die Expression dieser VSG Gene reguliert ist nicht komplett bekannt. Die Genexpression ist in Trypanosomen sehr ungewöhnlich. Es gibt keine typischen Promotoren für RNA Polymerase II und Gene werden polycistronisch transkribiert. Daher ist die Regulation der Genexpression hauptsächlich posttranskriptional. Die Expression individueller mRNAs wird durch regulatorische Sequenzen reguliert, die sich häufig in den 3´ UTRs befinden. In den VSG Genen von T. brucei moduliert ein zu 100% konserviertes 16mer Motiv in der 3´ UTR die Stabilität der VSG Transkripte und damit deren Expression. Für eine Sequenz, die die Stabilität der mRNA reguliert, ist das Fehlen von Nukleotid Substitutionen sehr ungewöhnlich. Es wurde deshalb spekuliert, dass das 16mer Motiv neben der Stabilisierung des VSG Transkriptes noch an anderen essentiellen Prozessen beteiligt ist. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die 100%ige Konservierung des 16mer Motives weder für das Überleben der Zellen, noch für den Erhalt der Expression des VSG Protein in funktioneller Menge notwendig ist. Außerdem wurde gezeigt dass das intakte Motiv in der 3´UTR des aktiven VSGs weder für das „VSG silencing“ während des VSG Austausches („switching“) noch für die Differenzierung von Blutbahnformen zu prozyklischen Formen benötigt wird. Auch die Interaktionen („crosstalk“), die während der Differenzierung zum Insekten Stadium zwischen den VSG und Prozyklin Genen stattfinden, sind in Zellen mit mutiertem 16mer Motiv noch funktionell. Die ektopische Überexpression eines zweiten VSGs benötigt allerdings das intakte Motiv, um das aktive VSG zu inaktivieren und auszutauschen: dies suggeriert eine Rolle des Motivs im transkriptionalen „VSG switching“. Das 16mer Motif spielt daher eine Doppelrolle bei der Regulation der Stabilität der VSG Transkripte und im VSG in situ „switching“. Letzteres, die Rolle im essentiellen Prozess der antigenen Variation, ist dabei offensichtlich die treibende Kraft hinter der 100%igen Konservierung des RNA Motives. Eine Suche nach möglichen RNA bindenden Proteinen, die mit dem 16mer interagieren, führte zur Identifikation des DExD/H box Proteins Hel66. Obwohl das Protein wohl nicht direkt an der Regulation der VSG Expression über das 16mer beteiligt ist, spielen Mitglieder der DexD/H Proteinfamilie eine wichtige Rolle in der Biogenese von Ribosomen. Dieser Prozess ist in Trypanosomen noch nicht komplett verstanden und daher wurde das Protein für eine nähere Analyse ausgewählt, auch weil die 16mer Story ohne weitere Kandidaten zu einem Ende gekommen war. Die Biogenese von Ribosomen ist ein wichtiger zellulärer Prozess in Eukaryoten und benötigt ribosomale RNA, ribosomale Proteine sowie einige nicht-ribosomale, trans-agierende Protein Faktoren. Proteine der DExD/H box Familie sind die wichtigsten trans- agierenden Proteinfaktoren, die an der Biogenese der Ribosomen beteiligt sind. In der Hefe sind mehrere DExD/H box Proteine bekannt, die eine direkte Rolle in diesem Prozess spielen. In Trypanosomen sind erst sehr wenige Proteine aus dieser Familie untersucht worden und es ist daher kaum bekannt, welche spezifische Rollen sie im RNA Metabolismus spielen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Hel66 an der rRNA Prozessierung während der Biogenese der Ribosomen beteiligt ist. Hel66 ist im Nukleolus lokalisiert und die Reduktion des Proteins durch RNAi führte zu einem schweren Wachstumsphänotyp. Reduktion von Hel66 führte auch zu einer globalen Reduktion der Translation sowie zur Akkumulation von Synthese- Zwischenstadien der rRNAs sowohl der kleinen und als auch der großen ribosomalen Untereinheit. Hel66 ist daher ein essentielles nukleoläres DExD/H Protein dass an der Prozessierung der rRNA während der Biogenese der Ribosomen beteiligt ist. Da bisher erst wenige Proteine bekannt sind, die in Trypanosomen an diesem Prozess beteiligt sind, sind diese Ergebnisse ein sehr wichtiger Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen in der Zukunft. KW - Trypanosoma brucei KW - Genexpression KW - Variant Surface Glycoprotein KW - VSG KW - DExD/H box protein KW - Ribosome biogenesis KW - rRNA processing KW - Ribosome Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-258090 ER - TY - THES A1 - Fetiva Mora, Maria Camila T1 - Changes in chromatin accessibility by oncogenic YAP and its relevance for regulation of cell cycle gene expression and cell migration T1 - Änderungen der Chromatinzugänglichkeit durch onkogene YAP und seine Relevanz für die Genexpression während des Zellzyklus und für die Zellmigration N2 - Various types of cancer involve aberrant cell cycle regulation. Among the pathways responsible for tumor growth, the YAP oncogene, a key downstream effector of the Hippo pathway, is responsible for oncogenic processes including cell proliferation, and metastasis by controlling the expression of cell cycle genes. In turn, the MMB multiprotein complex (which is formed when B-MYB binds to the MuvB core) is a master regulator of mitotic gene expression, which has also been associated with cancer. Previously, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP. By binding to enhancers of MMB target genes and promoting B-MYB binding to promoters, YAP and MMB co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes which promote cell proliferation. This doctoral thesis addresses the mechanisms of YAP and MMB mediated transcription, and it characterizes the role of YAP regulated enhancers in transcription of cell cycle genes. The results reported in this thesis indicate that expression of constitutively active, oncogenic YAP5SA leads to widespread changes in chromatin accessibility in untransformed human MCF10A cells. ATAC-seq identified that newly accessible and active regions include YAP-bound enhancers, while the MMB-bound promoters were found to be already accessible and remain open during YAP induction. By means of CRISPR-interference (CRISPRi) and chromatin immuniprecipitation (ChIP), we identified a role of YAP-bound enhancers in recruitment of CDK7 to MMB-regulated promoters and in RNA Pol II driven transcriptional initiation and elongation of G2/M genes. Moreover, by interfering with the YAP-B-MYB protein interaction, we can show that binding of YAP to B-MYB is also critical for the initiation of transcription at MMB-regulated genes. Unexpectedly, overexpression of YAP5SA also leads to less accessible chromatin regions or chromatin closing. Motif analysis revealed that the newly closed regions contain binding motifs for the p53 family of transcription factors. Interestingly, chromatin closing by YAP is linked to the reduced expression and loss of chromatin-binding of the p53 family member Np63. Furthermore, I demonstrate that downregulation of Np63 following expression of YAP is a key step in driving cellular migration. Together, the findings of this thesis provide insights into the role of YAP in the chromatin changes that contribute to the oncogenic activities of YAP. The overexpression of YAP5SA not only leads to the opening of chromatin at YAP-bound enhancers which together with the MMB complex stimulate the expression of G2/M genes, but also promotes the closing of chromatin at ∆Np63 -bound regions in order to lead to cell migration. N2 - Ein Kennzeichen vieler Tumoren ist die fehlerhafte Aktivierung von zellzyklusregulierenden Signalwegen. Ein für das Tumorwachstum wichtiger Signalwege ist der Hippo-Signalweg und das durch ihn regulierte Onkogen YAP, ein transkriptioneller Koaktivator. Durch die Regulierung von Zellzyklusgenen ist YAP verantwortlich für onkogene Prozesse wie Zellproliferation und Metastasierung. Der MMB-Multiproteinkomplex wiederum – er entsteht, wenn B-MYB an das MuvB-Kernmodul bindet – ist ein wichtiger Regulator der mitotischen Genexpression, welche ebenso mit der Tumorentstehung in Verbindung gebracht wurde. Unser Labor hat zuvor einen neuen Mechanismus der Regulation mitotischer Gene durch den MMB-Komplex und YAP identifiziert: Durch die Bindung an Enhancer der MMB-Zielgene und die Förderung der B-MYB-Bindung an Promotoren reguliert YAP eine Reihe von mitotischen und zytokinetischen Zielgenen, welche die Zellproliferation fördern. Diese Doktorarbeit befasst sich mit den Mechanismen der YAP- und MMB-vermittelten Transkription und charakterisiert die Rolle der YAP regulierten Enhancer während der Transkription von Zellzyklusgenen. Die in dieser Dissertation dargelegten Ergebnisse zeigen, dass die Expression von konstitutiv aktivem, onkogenem YAP5SA zu weitreichenden Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit nicht-transformierter humaner MCF10A Zellen führt. ATAC-seq zeigte, dass ein grosse Anzahl YAP-gebundene Enhancer zugänglich und aktiviert werden. Gleichzeitig konnte festgestellt werden, dass die MMB-gebundenen Promotoren bereits vor der Expression von YAP zugänglich sind und während der YAP-Induktion offen bleiben. Mittels CRISP-Interferenz (CRISPRi) und Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) konnten wir zeigen, dass YAP-gebundene Enhancer die Rekrutierung von CDK7 an MMB-regulierten Promotoren sowie die Initiation und Elongation der Transkription von G2/M Genen fördert. Durch die experimentelle Blockade der YAP-B-MYB Proteininteraktion konnten wir darüber hinaus belegen, dass auch die Bindung von YAP an B-MYB für die Initiation der Transkription an MMB-regulierten Genen entscheidend ist. Unerwarteterweise führte die Überexpression von YAP5SA auch dazu, dass bestimmte Regionen im Genom weniger zugänglich werden. Motivanalysen ergaben, dass diese neu geschlossenen Regionen Bindungsmotive für die p53-Familie von Transkriptionsfaktoren enthalten. Die Chromatinschließung durch YAP ist an eine reduzierte Expression und an den Verlust der Chromatinbindung des p53-Familienmitglieds Np63 gekoppelt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass die Inhibition von Np63 durch YAP ein wichtiger Schritt in der YAP-abhängigen Förderung der Zellmigration ist. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse dieser Dissertation Einblicke in die Rolle von YAP bei Chromatinveränderungen welche zu den onkogenen Aktivitäten von YAP beitragen. Die Überexpression von YAP führt dabei einerseits zur Öffnung des Chromatins an YAP-gebundenen Enhancern, die zusammen mit dem MMB-Komplex die Expression von G2/M Genen stimulieren. Andererseits fördert YAP auch das Schließen von Chromatin an Np63-gebundenen Regionen, was wiederum Zellmigration nach sich zieht. KW - YAP KW - B-MYB KW - MMB KW - enhancers KW - transcription KW - chromatin accessibility KW - opening of chromatin KW - closing of chromatin KW - cell migration KW - G2/M genes KW - Chromatin KW - Genexpression KW - Zellzyklus KW - Zellmigration Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302910 ER - TY - THES A1 - Jessen, Christina T1 - NRF2 links antioxidant and immune-relevant features in melanoma T1 - NRF2 verknüpft antioxidative und immunrelevante Eigenschaften im Melanom N2 - The transcription factor NRF2 is considered as the master regulator of cytoprotective and ROS-detoxifying gene expression. Due to their vulnerability to accumulating reactive oxygen species, melanomas are dependent on an efficient oxidative stress response, but to what extent melanomas rely on NRF2 is only scarcely investigated so far. In tumor entities harboring activating mutations of NRF2, such as lung adenocarcinoma, NRF2 activation is closely connected to therapy resistance. In melanoma, activating mutations are rare and triggers and effectors of NRF2 are less well characterized. This work revealed that NRF2 is activated by oncogenic signaling, cytokines and pro-oxidant triggers, released cell-autonomously or by the tumor microenvironment. Moreover, silencing of NRF2 significantly reduced melanoma cell proliferation and repressed well-known NRF2 target genes, indicating basal transcriptional activity of NRF2 in melanoma. Transcriptomic analysis showed a large set of deregulated gene sets, besides the well-known antioxidant effectors. NRF2 suppressed the activity of MITF, a marker for the melanocyte lineage, and induced expression of epidermal growth factor receptor (EGFR), thereby stabilizing the dedifferentiated melanoma phenotype and limiting pigmentation markers and melanoma-associated antigens. In general, the dedifferentiated melanoma phenotype is associated with a reduced tumor immunogenicity. Furthermore, stress-inducible cyclooxygenase 2 (COX2) expression, a crucial immune-modulating gene, was regulated by NRF2 in an ATF4-dependent manner. Only in presence of both transcription factors was COX2 robustly induced by H2O2 or TNFα. COX2 catalyzes the first step of the prostaglandin E2 (PGE2) synthesis, which was described to be associated with tumor immune evasion and reduction of the innate immune response. In accordance with these potentially immune-suppressive features, immunocompetent mice injected with NRF2 knockout melanoma cells had a strikingly longer tumor-free survival compared to NRF2-proficient cells. In line with the in vitro data, NRF2-deficient tumors showed suppression of COX2 and induction of MITF. Furthermore, transcriptomic analyses of available tumors revealed a strong induction of genes belonging to the innate immune response, such as RSAD2 and IFIH1. The expression of these genes strongly correlated with immune evasion parameters in human melanoma datasets and NRF2 activation or PGE2 supplementation limited the innate immune response in vitro. In summary, the stress dependent NRF2 activation stabilizes the dedifferentiated melanoma phenotype and facilitates the synthesis of PGE2. As a result, NRF2 reduces gene expression of the innate immune response and promotes the generation of an immune-cold tumor microenvironment. Therefore, NRF2 not only elevated the ROS resilience, but also strongly contributed to tumor growth, maintenance, and immune control in cutaneous melanoma. N2 - Der Transkriptionsfaktor NRF2 gilt als Masterregulator der antioxidativen Zellantwort. Im Melanom ist die Rolle von NRF2 bisher nur wenig untersucht worden, obwohl das Melanom anfällig für oxidativen Stress ist und somit eine besondere Abhängigkeit von antioxidativen Prozessen besteht. In Tumorentitäten mit NRF2 aktivierende Mutationen, wie z.B. dem Lungenadenokarzinom, ist die NRF2 Aktivierung mit einer Therapieresistenz verbunden. Allerdings sind diese aktivierenden Mutationen im Melanom selten und Mechanismen, die zu einer NRF2 Aktivierung führen, sind kaum bekannt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass NRF2 hier vor allem durch onkogene Signalwege, Zytokine und pro-oxidative Trigger aktiviert wird. Zudem verringerte die NRF2 Inhibierung die Zellproliferation und reduzierte die Expression von bekannten NRF2 Zielgenen. Dies weist darauf hin, dass die basale Transkriptionsaktivität von NRF2 im Melanom wichtig ist. Neben den bekannten Zielgenen waren außerdem eine Vielzahl von ROS-unabhängigen Gen-Sets dereguliert. Zum einen reduzierte NRF2 die Aktivität von MITF, dem melanozytären Lineage Marker und induzierte die Expression des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors, EGFR. Dadurch stabilisiert NRF2 den undifferenzierten Melanom-Phänotyp, welcher allgemein mit einer verminderten Expression von Pigmentierungsmarkern und Melanom-assoziierten Antigenen verbunden ist. Zum anderen regulierte NRF2 die Expression von Cyclooxygenase 2 (COX2), in Abhängigkeit von dem Transkriptionsfaktor ATF4. COX2 wurde basal und nach H2O2 oder TNFα Stimulation nur in Anwesenheit beider Transkriptionsfaktoren exprimiert. COX2 katalysiert die Prostaglandin E2 (PGE2) Synthese und es wurde beschrieben, dass hohe Konzentrationen an PGE2, sowohl die Immunevasion von Tumoren erleichtert als auch die angeborenen Immunantwort reduziert. In Übereinstimmung mit diesen potenziell immun-evasiven Eigenschaften zeigten immunkompetente Mäuse, denen NRF2-knockout Melanomzellen injiziert wurden, im Vergleich zu Kontrollzellen, ein deutlich längeres tumorfreies Überleben. Die NRF2-abhängige COX2 Erhöhung und MITF Hemmung, wurde zudem in den Maustumoren bestätigt. Darüber hinaus zeigten die NRF2-defizienten Tumore eine starke Induktion von Genen des angeborenen Immunsystems, wie z.B. RSAD2 und IFIH1. Die Expression dieser Gene korrelierte mit Immunevasionsparametern in Datensätzen des humanen Melanoms und eine NRF2 Aktivierung oder PGE2 Zugabe unterdrückte die Genexpression der angeborene Immunantwort bereits in vitro. Somit stabilisiert stress-induziertes NRF2 den undifferenzierten Melanom-Phänotyp und fördert die immunmodulierende PGE2 Produktion. Infolgedessen reduziert NRF2 die angeborene Immunantwort und unterstützt die Entstehung einer immun-suppressiven Tumormikroumgebung, welche das Tumorwachstum erleichtert. Die endogene NRF2 Aktivierung im Melanom fördert somit nicht nur die ROS-Resilienz, sondern auch die Tumoraufrechterhaltung und das Tumorwachstum im immunkompetenten Organismus. KW - Melanom KW - Oxidativer Stress KW - Genexpression KW - Krebsforschung KW - NRF2 KW - Antioxidantien KW - melanoma dedifferentiation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233495 ER - TY - THES A1 - Zimmermann, Henriette T1 - Antigenic variation and stumpy development in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Antigene Variation und Stumpy Entwicklung in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The eukaryotic parasite Trypanosoma brucei has evolved sophisticated strategies to persist within its mammalian host. Trypanosomes evade the hosts' immune system by antigenic variation of their surface coat, consisting of variant surface glycoproteins (VSGs). Out of a repertoire of thousands of VSG genes, only one is expressed at any given time from one of the 15 telomeric expression sites (ES). The VSG is stochastically exchanged either by a transcriptional switch of the active ES (in situ switch) or by a recombinational exchange of the VSG within the active ES. However, for infections to persist, the parasite burden has to be limited. The slender (sl) bloodstream form secretes the stumpy induction factor (SIF), which accumulates with rising parasitemia. SIF induces the irreversible developmental transition from the proliferative sl to the cell cycle-arrested but fly-infective stumpy (st) stage once a concentration threshold is reached. Thus, antigenic variation and st development ensure persistent infections and transmissibility. A previous study in monomorphic cells indicated that the attenuation of the active ES could be relevant for the development of trypanosomes. The present thesis investigated this hypothesis using the inducible overexpression of an ectopic VSG in pleomorphic trypanosomes, which possess full developmental competence. These studies revealed a surprising phenotypic plasticity: while the endogenous VSG was always down-regulated upon induction, the ESactivity determined whether the VSG overexpressors arrested in growth or kept proliferating. Full ES-attenuation induced the differentiation of bona fide st parasites independent of the cell density and thus represents the sole natural SIF-independent differentiation trigger to date. A milder decrease of the ES-activity did not induce phenotypic changes, but appeared to prime the parasites for SIF-induced differentiation. These results demonstrate that antigenic variation and development are linked and indicated that the ES and the VSG are independently regulated. Therefore, I investigated in the second part of my thesis how ES-attenuation and VSG-silencing can be mediated. Integration of reporters with a functional or defective VSG 3'UTR into different genomic loci showed that the maintenance of the active state of the ES depends on a conserved motif within the VSG 3'UTR. In situ switching was only triggered when the telomere-proximal motif was partially deleted, suggesting that it serves as a DNA-binding motif for a telomere-associated protein. The VSG levels seem to be additionally regulated in trans based on the VSG 3'UTR independent of the genomic context, which was reinforced by the regulation of a constitutively expressed reporter with VSG 3' UTR upon ectopic VSG overexpression. N2 - Der eukaryotische Parasit Trypanosoma brucei hat komplexe Strategien entwickelt, um in seinem Säugetierwirt zu überleben. Die Grundlage der Immunevasion ist die antigene Variation des Oberflächenmantels, der aus dem variablen Oberflächenglykoprotein (VSG) besteht. Von mehreren tausend VSG-Genen wird zu jedem Zeitpunkt nur ein einziges aus einer der 15 telomerischen Expressionsstellen (ES) exprimiert. Das VSG kann entweder durch einen transkriptionellen Wechsel der aktiven ES (in situ Wechsel) oder durch einen rekombinatorischen Wechsel des VSG-Gens innerhalb der aktiven ES stochastisch ausgetauscht werden. Damit jedoch eine langanhaltende Infektion des Wirts möglich wird, muss gleichzeitig der Parasitenbefall begrenzt werden. Mit ansteigender Parasitämie akkumuliert der 'stumpy induction factor' (SIF), welcher von der 'slender' (sl) Blutstromform sekretiert wird. Sobald ein Schwellenwert in der SIF-Konzentration erreicht ist, wird die irreversible Differenzierung der proliferativen sl in die zellzyklusarretierte 'stumpy'(st) Form eingeleitet, welche infektiös für den Fliegenvektor ist. Somit stellen antigene Variation und st- Differenzierung das Persistieren der Infektion und die Übertragung des Parasiten sicher. Eine frühere Arbeit mit monomorphen Zellen deutete darauf hin, dass die Attenuierung der aktiven ES eine Rolle für die Differenzierung der Trypanosomen spielen könnte. Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Dissertation untersucht, indem in pleomorphen Zellen mit vollständiger Entwicklungskompetenz ein ektopisches VSG induzierbar überexprimiert wurde. Diese Studien offenbarten eine erstaunliche phänotypische Plastizität: während das endogene VSG nach Induktion runter reguliert wurde, arretierten die VSG-Überexpressoren in Abhängigkeit von der ES-Aktivität entweder im Wachstum oder teilten sich weiter. Die vollständige ES-Attenuierung löste die Differenzierung zu echten st Zellen unabhängig von der Zelldichte aus und ist somit der bisher einzige natürliche SIF-unabhängige Differenzierungsauslöser. Eine mildere Abnahme der ES-Aktivität verursachte keinen Phänotyp, scheint aber die Zellen auf die SIF-induzierte Differenzierung vorzubereiten. Diese Ergebnisse zeigen, dass antigene Variation und Differenzierung verbunden sind und deuteten an, dass die ES und das VSG unabhängig voneinander reguliert werden. Daher habe ich im zweiten Teil meiner Dissertation untersucht, wie ES-Attenuierung und VSG-Stilllegung vermittelt werden können. Die Integration eines Reporters mit funktioneller oder defekter VSG 3'UTR an verschiedenen Orten im Genom zeigte, dass die Aufrechterhaltung der ES-Aktivität von einem konservierten Motiv in der VSG 3'UTR abhängig ist. Ein in situ Wechsel wurde nur ausgelöst, wenn Teile des Telomer-proximalen Motiv deletiert wurden, was nahelegt, dass das Motiv auf DNA-Ebene von einem Telomerbindeprotein erkannt wird. Die VSG-Level scheinen unabhängig vom genomischen Kontext zusätzlich in trans basierend auf der VSG 3'UTR reguliert zu werden, was durch die Regulation eines konstitutiv exprimierten Reporters mit VSG 3'UTR nach VSG-Überexpression bekräftigt wurde. KW - Trypanosoma brucei KW - Genexpression KW - Entwicklung KW - Parasit KW - VSG KW - antigenic variation KW - monoallelic expression KW - stumpy development KW - differentiation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146902 ER - TY - THES A1 - Simann, Meike T1 - Aufklärung der Effekte von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 und 2 auf die Adipogenese und Osteogenese von primären humanen Knochenmark-Stroma-Zellen T1 - Elucidation of fibroblast growth factor 1 and 2 effects on the adipogenesis and osteogenesis of primary human bone marrow stromal cells N2 - Regulating and reverting the adipo-osteogenic lineage decision of trabecular human bone marrow stromal cells (hBMSCs) represents a promising approach for osteoporosis therapy and prevention. Fibroblast growth factor 1 (FGF1) and its subfamily member FGF2 were scored as lead candidates to exercise control over lineage switching processes (conversion) in favor of osteogenesis previously. However, their impact on differentiation events is controversially discussed in literature. Hence, the present study aimed to investigate the effects of these FGFs on the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion of primary hBMSCs. Moreover, involved downstream signaling mechanisms should be elucidated and, finally, the results should be evaluated with regard to the possible therapeutic approach. This study clearly revealed that culture in the presence of FGF1 strongly prevented the adipogenic differentiation of hBMSCs as well as the adipogenic conversion of pre-differentiated osteoblastic cells. Lipid droplet formation was completely inhibited by a concentration of 25 ng/µL. Meanwhile, the expression of genetic markers for adipogenic initiation, peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARg2) and CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPa), as well as subsequent adipocyte maturation, fatty acid binding protein 4 (FABP4) and lipoprotein lipase (LPL), were significantly downregulated. Yet, the genetic markers of osteogenic commitment and differentiation were not upregulated during adipogenic differentiation and conversion under FGF supplementation, not supporting an event of osteogenic lineage switching. Moreover, when examining the effects on the osteogenic differentiation of hBMSCs and the osteogenic conversion of pre-differentiated adipocytic cells, culture in the presence of FGF1 markedly decreased extracellular matrix (ECM) mineralization. Additionally, the gene expression of the osteogenic marker alkaline phosphatase (ALP) was significantly reduced and ALP enzyme activity was decreased. Furthermore, genetic markers of osteogenic commitment, like the master regulator runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4), as well as markers of osteogenic differentiation and ECM formation, like collagen 1 A1 (COL1A1) and integrin-binding sialoprotein (IBSP), were downregulated. In contrast, genes known to inhibit ECM mineralization, like ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator (ANKH) and osteopontin (OPN), were upregulated. ANKH inhibition revealed that its transcriptional elevation was not crucial for the reduced matrix mineralization, perhaps due to decreased expression of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1) that likely annulled ANKH upregulation. Like FGF1, also the culture in the presence of FGF2 displayed a marked anti-adipogenic and anti-osteogenic effect. The FGF receptor 1 (FGFR1) was found to be crucial for mediating the described FGF effects in adipogenic and osteogenic differentiation and conversion. Yet, adipogenic conversion displayed a lower involvement of the FGFR1. For adipogenic differentiation and osteogenic differentiation/conversion, downstream signal transduction involved the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) and the mitogen-activated protein kinase (MAPK)/ERK kinases 1 and 2 (MEK1/2), probably via the phosphorylation of FGFR docking protein FGFR substrate 2a (FRS2a) and its effector Ras/MAPK. The c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38-MAPK, and protein kinase C (PKC) were not crucial for the signal transduction, yet were in part responsible for the rate of adipogenic and/or osteogenic differentiation itself, in line with current literature. Taken together, to the best of our knowledge, our study was the first to describe the strong impact of FGF1 and FGF2 on both the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion processes of primary hBMSCs in parallel. It clearly revealed that although both FGFs were not able to promote the differentiation and lineage switching towards the osteogenic fate, they strongly prevented adipogenic differentiation and lineage switching, which seem to be elevated during osteoporosis. Our findings indicate that FGF1 and FGF2 entrapped hBMSCs in a pre-committed state. In conclusion, these agents could be applied to potently prevent unwanted adipogenesis in vitro. Moreover, our results might aid in unraveling a pharmacological control point to eliminate the increased adipogenic differentiation and conversion as potential cause of adipose tissue accumulation and decreased osteoblastogenesis in bone marrow during aging and especially in osteoporosis. N2 - Die Regulation und Umkehr des adipogenen und osteogenen Commitments von trabekulären humanen Knochenmarks-Stroma Zellen (hBMSCs) stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Prävention und Therapie der Knochenerkrankung Osteoporose dar. Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1) und sein Proteinfamilien-Mitglied FGF2 wurden in einer vorhergehenden Studie als Hauptkandidaten bezüglich der Kontrolle einer Konversion (Schicksalsänderung) von hBMSCs in die osteogene Richtung bewertet. Der Effekt von FGF1 und FGF2 auf die Differenzierung von hBMSCs wird jedoch in der Literatur kontrovers diskutiert. Folglich zielte die aktuelle Studie darauf ab, die Effekte dieser Faktoren auf die adipogene und osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs zu untersuchen. Außerdem sollten die nachgeschalteten Signalmechanismen aufgeklärt und die Ergebnisse abschließend bezüglich des angestrebten Therapieansatzes bewertet werden. Die vorliegende Studie zeigte eindeutig, dass die adipogene Differenzierung von hBMSCs sowie die adipogene Konversion von vordifferenzierten osteoblastischen Zellen durch die Kultur in Gegenwart von FGF1 stark inhibiert wurden. Die typische Bildung von intrazellulären Fetttropfen war bei einer Konzentration von 25 ng/µL vollständig inhibiert, während die Genexpression von frühen und späten adipogenen Markern signifikant herunterreguliert war. Die osteogenen Marker waren jedoch während der adipogenen Differenzierung und Konversion unter FGF-Zugabe nicht hochreguliert, was eine etwaige Schicksalsänderung zugunsten der osteogenen Richtung nicht unterstützte. Bei der Untersuchung der osteogenen Differenzierung von hBMSCs und der osteogenen Konversion von vordifferenzierten adipozytischen Zellen bewirkte die Zugabe von FGF1 zum Differenzierungsmedium eine deutliche Verminderung der Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM). Darüber hinaus war die Genexpression der alkalischen Phosphatase (ALP) signifikant reduziert; außerdem wurde die ALP Enzymaktivität erniedrigt. Sowohl Marker des osteogenen Commitments einschließlich des osteogenen Master-Transkriptionsfaktors RUNX2 (Runt-related transcription factor 2), als auch Marker der weiterführenden osteogenen Differenzierung waren herunterreguliert. Im Kontrast dazu waren Inhibitoren der ECM-Mineralisierung hochreguliert. Die Hochregulation von ANKH (ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator) schien hierbei jedoch keine direkte Auswirkung auf die Reduzierung der Mineralisierung zu haben; seine Wirkung wurde wahrscheinlich durch die Herunterregulation von ENPP1 (Ectonucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase 1) aufgehoben. Wie FGF1 zeigte auch FGF2 eine anti-adipogene und anti-osteogene Wirkung. Der FGF Rezeptor 1 (FGFR1) war für die Weiterleitung der beschriebenen FGF-Effekte entscheidend, wobei die adipogene Konversion eine erniedrigte Beteiligung dieses Rezeptors zeigte. Bei der adipogenen Differenzierung und der osteogenen Differenzierung und Konversion waren die nachgeschalteten Signalwege ERK1/2 (Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2) bzw. MEK1/2 (Mitogenactivated protein kinase (MAPK)/ ERK kinases 1 and 2) involviert, vermutlich über eine Phosphorylierung des FGFR Substrats FRS2a (FGFR substrate 2a) und der Ras/MAP Kinase. Im Gegensatz dazu waren die c-Jun N-terminale Kinase (JNK), die p38-MAP Kinase und die Proteinkinase C (PKC) nicht an der Weiterleitung des FGF-Signals beteiligt. Sie zeigten sich jedoch, in Übereinstimmung mit der aktuellen Literatur, verantwortlich für das Ausmaß der adipogenen bzw. osteogenen Differenzierung selbst. Zusammenfassend war die vorliegende Studie nach unserem besten Wissen die erste, die den starken Einfluss von FGF1 und FGF2 parallel sowohl auf die adipogene als auch die osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs untersucht hat. Sie zeigte deutlich, dass, obwohl beide FGFs nicht die Differenzierung und Konversion zum osteogenen Zellschicksal hin unterstützen konnten, sie dennoch wirkungsvoll die adipogene Differenzierung und Konversion verhinderten, die während der Osteoporose erhöht zu sein scheinen. Unsere Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass hBMSCs durch FGF1 und FGF2 in einem Stadium vor dem Schicksals-Commitment festgehalten werden. Folglich könnten diese Proteine verwendet werden, um eine ungewollte Adipogenese in vitro zu verhindern. Außerdem könnten unsere Ergebnisse helfen, einen pharmakologischen Kontrollpunkt zur Eliminierung der gesteigerten adipogenen Differenzierung und Konversion aufzudecken, welche potentielle Gründe für die Fettakkumulation und die reduzierte Osteoblastogenese im Knochenmark während des Alterns und besonders in der Osteoporose sind. KW - Mesenchymzelle KW - Genexpression KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - Osteoporose KW - Fettzelle KW - Bone marrow stromal cell (BMSC) KW - Osteogenesis KW - Adipogenesis KW - Differentiation KW - adipocytes KW - Mesenchymale Stammzelle Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119322 ER - TY - THES A1 - Proft, Florian Lukas Patrick T1 - Molekulare Wirkmechanismen des Antidepressivums Venlafaxin - genetische Untersuchungen in Maus und Mensch T1 - Molecular mechanisms of effectivness of the antidepressant venlafaxine - genetic investigations in mice and men N2 - Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt. Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird. Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen. Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern. Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war. Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos. Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen. Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet. Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren. In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert. Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war. Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben. Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren. N2 - Depressive disorders not only lead to the suffering of the affected individuals but also to economic losses by incapacitating them to fulfill social demands and by utilization of health care systems. Therapeutic intervention via pharmacotherapy is successful in variabel degrees. Etiological research revealed a diversity of somatic factors to be associated with the illness. Primary pharmacological treatment is using substances that inhibit the reuptake of monoaminergic neurotransmitters (serotonin, norepinephrine, in part also dopamine) into the presynaptic terminals. Continued application, sometimes for weeks, leads to a reduction of depressive symptoms (lag of onset). On the other hand for a number of patients various pharmacotherapeutic drugs do not result in symptomatic relief or remission. A reason for these discrepancies to date has not been determined but it is to assume, that pharmacokinetic and pharmacodynamic variations between patients bear the responsibility. In the thesis at hand venlafaxine, an inhibitor of serotonin- respectively serotonin- and norepinephrine-reuptake, was used. Venlafaxine's pharmacodynamic activity is dependent on its concentration in the target compartment as the affinity for the serotonin-transporter is 30 times that for the norepinephrine-transporter. Two goals were targeted here. Comparative gene expression analysis was performed to identify potential effectors of antidepressive effectiveness. On this basis a more specific pharmacological intervention than increasing monoaminergic transmission might be facilitated. The second part of the thesis was dedicated to pharmacogenetic research. In it the predictiveness of the expression activity of the genes coding for venlafaxine's primary targets (SLC6A2, norepinephrine-transporter; SLC6A4, serotonin-transporter) in combination with serum concentrations of active moiety (venlafaxine and its equally active metabolite o desmethylvenlafaxine) towards the therapeutic effect was investigated. Knowledge on such an association might improve efficacy of future pharmacological intervention with venlafaxine, as serum concentrations necessary for patients' desired improvement in the light of a respective genotype could be individually targeted. For gene expression analysis, first, mice (DBA/2 strain) were given venlafaxine in different dosages via the oral route for one month and their hippocampi were analyzed by hypothesis-free genome wide microarray analysis for genes differentially expressed between treatment groups. For candidate genes identified that way, differential expression was validated via qRT-PCR. In the second step validated genes were investigated via qRT-PCR for differential expression in leucocytes of patients who had received antidepressive venlafaxine treatment for one month. Expression was compared between leucocytes after one week and during the fifth week of treatment, that is, before and after potential onset of antidepressive effect. Post mortem comparison between human central and peripheral tissue had to a certain degree shown congruence of expression patterns and thus leucocyte analysis can give hints towards events in the central nervous system. Candidate genes identified in the animal study code for transcription factors respectively proteins mediating in second messenger cascades. In human leucocytes statistical significance was reached for the reduced mRNA abundance of Fos after one month of treatment. Fos is a transcription factor subunit that after heterodimerization with Jun influences expression of effector genes. Association of Fos with depressive disorder and its role in an antidepressive effect had been shown in animal studies. Hippocampal knock-out (ko) of Fos in mice had been associated with reduced fear behaviour and higher excitability of the neurons in this region. Also an association with synaptic plasticity and thus with learning behaviour had been shown. On the other hand, in rats depression-like behaviour had been associated with low hippocampal Fos expression and following successful pharmacological "therapy" expression had been found to be induced. Thus already between non-human species pronounced differences in the role of Fos respectively Fos can be seen. Regarding the different species and tissues investigated as well as the heterogeneous reports on the role of Fos, it can thus only be concluded that the gene respectively its protein product is part of the development and the venlafaxine-induced relief of depressive symptoms. New antidepressant drugs based on an interaction with Fos, e.g. by decreasing its abundance, might in theory be considered. However, due to its far-reaching activity in a number of various processes throughout the organism and especially its role as a proto-oncogene, systemic inhibition of Fos does not seem a proper basis for innovative therapeutic intervention. Future studies should therefore focus on other differentially expressed genes found in the microarray analysis. For evaluating the predictive power of the expression activity of the genes SLC6A2 respectively SLC6A4 which code for venlafaxine's primary targets (serotonin- respectively norepinephrine-transporter) and the serum concentration of active moiety with regard to the achieved antidepressive effect in a naturalistic clinical design patients from the Department of Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy (University Hospital of Würzburg) were analyzed. SLC6A2 was genotyped for rs28386840 and SLC6A4 for 5-HTTLPR. To investigate phenotypical conditions, patients were dichotomized into carriers of "low-expressing" and "high-expressing" genotypes. Results of the pharmacological intervention were evaluated using the CGI-I-scale and symptom changes after one month of venlafaxine application were dichotomized into "good response" and "bad response". rs28386840 was found not to be associated with therapeutic outcome. The high-expressing genotype of SLC6A4 was found to be significantly associated with insufficient response. After stratifying the collective for serum concentrations this especially held true in the subcollective with high concentration (200 - 400 ng / ml). Below and above this range 5-HTTLPR was not significantly associated with the response. It can be concluded that genotyping rs28386840 will not be useful for instruction of therapeutic intervention with venlafaxine. However, information on patients' 5-HTTLPR might instruct psychiatrists, if venlafaxine is considered for treatment, to use serum concentrations which exceed the range recommended by the AGNP (> 400 ng / ml) in patients with the high-expressing genotype of SLC6A4. The study at hand analyzed only 56 patients and inclusion of a variety of cofactors as well as regression analysis incorporating both polymorphisms to evaluate their potential and probable synergistic effect was not possible. Thus, before application of the present findings into clinical practice, validation and confirmation of the potentially causal relationship in larger samples using a prospective controlled design is necessary. KW - Wirkmechanismus KW - Venlafaxin KW - Pharmakogenetik KW - Genexpression KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109201 ER - TY - THES A1 - Wurster, Sebastian T1 - Die Bedeutung von LIN9 für die Regulation der Genexpression, die genomische Stabilität und die Tumorsuppression T1 - The significance of LIN9 for gene regulation, genomic stability and tumor suppression N2 - Pocket proteins and E2F transcription factors regulate the expression of cell cycle associated genes and play a central role in the coordination of cell division, differentiation, and apoptosis. Disorders of these pathways contribute to the development of various human tumor entities. Despite intensive research in the field of cell cycle regulation many details are not yet understood. The LIN complex (LINC / DREAM) is a recently discovered human multiprotein complex, which dynamically interacts with pocket proteins and E2F transcription factors. An essential component of the LIN complex is the LIN9 protein. In order to obtain a better insight into the function of this protein in cell cycle regulation and tumorigenesis, a conditional Lin9 knockout mouse model was established in our laboratory. The primary objective of this study was the phenotypic characterization of embryonic fibroblasts (MEFs) from these mice. Shortly after inactivation of Lin9 cell proliferation was massively impaired. Multiple types of mitotic defects such as structural abnormalities of the spindle apparatus, aberrant nuclei, failed nuclear segregation and cytokinesis failure have been observed in Lin9-depleted cells leading to a dramatic increase in polyploid and aneuploid cells. Ultimately these serious aberrations result in premature cellular senescence. If the senescence of Lin9-deficient cells is overcome by the Large T antigen the cells can adhere to the loss of Lin9, but show severe genomic instability and grow anchorage-independently in soft-agar as a sign of oncogenic transformation. In the second part of the thesis the gene expression of Lin9-deficient cells was assessed by quantitative real time PCR analyses to determine, whether the mitotic abnormalities are caused by transcriptional defects. Here a significant reduction of mitotic gene expression was observed in Lin9-depleted cells. Additionally chromatin immunoprecipitation experiments were performed to clarify the underlying molecular mechanisms. Compared to control cells epigenetic alterations at the promoters of mitotic target genes with regard to activating histone modifications were found in Lin9-deficient MEFs. In the last section of this study, the effects of Lin9 heterozygosity were analyzed. Lin9 heterozygous MEFs showed normal proliferation, although expression of different mitotic genes was slightly reduced. It appeared, however, that the mitotic spindle checkpoint of Lin9 heterozygous MEFs is weakened and thus over several cell generations an increase in polyploid cells was observed. Soft-agar assays showed that Lin9 heterozygosity contributes to oncogenic transformation. Taken together, these results document a crucial role of LIN9 in the regulation of cell cycle-associated gene expression. LIN9 is an essential factor for cell proliferation on one hand, while at the same time it functions as a tumor suppressor. N2 - Pocket-Proteine und E2F-Transkriptionsfaktoren regulieren die Expression von Zellzyklus-assoziierten Genen und spielen eine zentrale Rolle bei der Koordination der Zellteilung, Differenzierung und Apoptose. Störungen dieser Signalwege tragen zur Entstehung zahlreicher Tumorentitäten beim Menschen bei. Trotz der intensiven Untersuchung der Zellzyklusregulation sind viele Details noch unverstanden. Der LIN-Komplex (LINC / DREAM) ist ein kürzlich entdeckter humaner Multiprotein-komplex, welcher dynamisch mit Pocket-Proteinen und E2F-Transkriptionsfaktoren interagiert. Eine essentielle Komponente des LIN-Komplexes ist das LIN9-Protein. Um die Funktion dieses Proteins bei der Zellzyklusregulation und Tumorentstehung genauer untersuchen zu können, wurde in unserer Arbeitsgruppe ein konditionelles Lin9-Knockout-Mausmodell etabliert. Primäres Ziel der Arbeit war es, den Phänotyp embryonaler Fibroblasten (MEFs) aus diesen Mäusen zu charakterisieren. Bereits kurz nach Inaktivierung von Lin9 konnte ein stark verlangsamtes Zellwachstums beobachtet werden. In Lin9-depletierten MEFs wurden multiple mitotische Defekte detektiert, die u. a. strukturelle Auffälligkeiten des Spindelapparates, aberrante Zellkerne, Störungen der Chromosomensegregation sowie zytokinetische Defekte umfassen und in einer dramatischen Zunahme polyploider und aneuploider Zellen resultieren. Im Langzeitverlauf führen diese erheblichen Aberrationen zu einer vorzeitigen zellulären Seneszenz. Wird diese durch das Large T-Protoonkogen durchbrochen, können sich MEFs an den Verlust von Lin9 adaptieren, zeigen dann jedoch eine hochgradige genomische Instabilität und Substrat-unabhängiges Wachstum im Weichagar als Zeichen onkogener Transformation. Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression in Lin9-defizienten MEFs mittels quantitativer Real Time-PCR untersucht um zu klären, ob die beschriebenen Defekte auf Veränderungen der transkriptionellen Aktivität zurück-zuführen sind. Dabei wurde eine erhebliche Reduktion der Expressionslevel mitotischer Gene nach Verlust von Lin9 beobachtet. Des Weiteren wurden zur Klärung der zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen Chromatin-Immunpräzipitations-Experimente (ChIP) durchgeführt. Im Vergleich zu Kontrollzellen wurden dabei in Lin9-defizienten Zellen signifikante epigenetische Veränderungen bezüglich aktivierender Histon-Modifikationen an den Promotoren mitotischer Lin9-Zielgene festgestellt. Im letzten Abschnitt der Arbeit sollten die Auswirkungen des heterozygoten Verlustes von Lin9 analysiert werden. Dabei zeigte sich, dass Lin9-haploinsuffiziente Zellen normal proliferieren, obwohl die Expression verschiedener G2/M-Gene leicht vermindert war. Es wurde jedoch eine Schwächung des mitotischen Spindelkontrollpunktes und in der Folge über mehrere Zellgenerationen eine Zunahme polyploider Zellen beobachtet. Mit Weichagar-Assays konnte gezeigt werden, dass bereits der heterozygote Verlust des Lin9-Gens zur onkogenen Transformation beiträgt. Zusammengenommen dokumentieren diese Studien, dass LIN9 eine entscheidende Bedeutung bei der Regulation von Zellzyklus-assoziierten Genen spielt und sowohl einen essentiellen Faktor für die Zellproliferation darstellt als auch durch die Gewährleistung genomischer Stabilität tumorsuppressive Eigenschaften aufweist. KW - Zellzyklus KW - Genexpression KW - Mitose KW - Knock-Out KW - LIN9 KW - Mausmodell KW - konditioneller Knockout Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114967 ER - TY - THES A1 - Hondke, Sylvia T1 - Elucidation of WISP3 function in human mesenchymal stem cells and chondrocytes T1 - Aufklärung der WISP3 Funktion in humanen mesenchymalen Stammzellen und Chondrozyten N2 - WISP3 is a member of the CCN family which comprises six members found in the 1990’s: Cysteine-rich,angiogenic inducer 61 (CYR61, CCN1), Connective tissue growth factor (CTGF, CCN2), Nephroblastoma overexpressed (NOV, CNN3) and the Wnt1 inducible signalling pathway protein 1-3 (WISP1-3, CCN4-6).They are involved in the adhesion, migration, mitogenesis, chemotaxis, proliferation, cell survival, angiogenesis, tumorigenesis, and wound healing by the interaction with different integrins and heparan sulfate proteoglycans. Until now the only member correlated to the musculoskeletal autosomal disease Progressive Pseudorheumatoid Dysplasia (PPD) is WISP3. PPD is characterised by normal embryonic development followed by cartilage degradation over time starting around the age of three to eight years. Animal studies in mice exhibited no differences between knock out or overexpression compared to wild type litter mates, thus were not able to reproduce the symptoms observed in PPD patients. Studies in vitro and in vivo revealed a role for WISP3 in antagonising BMP, IGF and Wnt signalling pathways. Since most of the knowledge of WISP3 was gained in epithelial cells, cancer cells or chondrocyte cell lines, we investigated the roll of WISP3 in primary human mesenchymal stem cells (hMSCs) as well as primary chondrocytes. WISP3 knock down was efficiently established with three short hairpin RNAs in both cell types, displaying a change of morphology followed by a reduction in cell number. Simultaneous treatment with recombinant WISP3 was not enough to rescue the observed phenotype nor increase the endogenous expression of WISP3. We concluded that WISP3 acts as an essential survival factor, where the loss resulted in the passing of cell cycle control points followed by apoptosis. Nevertheless, Annexin V-Cy3 staining and detection of active caspases by Western blot and immunofluorescence staining detected no clear evidence for apoptosis. Furthermore, the gene expression of the death receptors TRAILR1 and TRAILR2,important for the extrinsic activation of apoptosis, remained unchanged during WISP3 mRNA reduction. Autophagy as cause of cell death was also excluded, given that the autophagy marker LC3 A/B demonstrated to be uncleaved in WISP3-deficient hMSCs. To reveal correlated signalling pathways to WISP3 a whole genome expression analyses of WISP3-deficient hMSCs compared to a control (scramble) was performed. Microarray analyses exhibited differentially regulated genes involved in cell cycle control, adhesion, cytoskeleton and cell death. Cell death observed by WISP3 knock down in hMSCs and chondrocytes might be explained by the induction of necroptosis through the BMP/TAK1/RIPK1 signalling axis. Loss of WISP3 allows BMP to bind its receptor activating the Smad 2/3/4 complex which in turn can activate TAK1 as previously demonstrated in epithelial cells. TAK1 is able to block caspase-dependent apoptosis thereby triggering the assembly of the necrosome resulting in cell death by necroptosis. Together with its role in cell cycle control and extracellular matrix adhesion, as demonstrated in human mammary epithelial cells, the data supports the role of WISP3 as tumor suppressor and survival factor in cells of the musculoskeletal system as well as epithelial cells. N2 - WISP3 ist ein Mitglied der CCN-Familie, die aus sechs Familienmitgliedern besteht und in den 1990er Jahren endeckt wurde: Cysteine-rich, angiogenic inducer 61 (CYR61, CCN1), Connective tissue growth factor (CTGF, CCN2), Nephroblastoma overexpressed (NOV, CNN3) und den Wnt1 inducible signalling pathway protein 1-3 (WISP1-3, CCN4-6). Die CCN-Proteine sind durch ihre Interaktion mit verschiede- nen Integrinen und Heparansulfaten involviert in die Regulation der Adhäsion, der Migration, der Mi- togenese, der Chemotaxis, der Proliferation, des Zellüberlebens, der Angiogenese, der Tumorgenese und der Wundheilung. WISP3 ist momentan das einzige Mitglied, das direkt mit einer muskuloskelettalen Erkrankung, der Progressiven Pseudorheumatoiden Dysplasie (PPD), assoziiert wird. PPD ist charakter- isiert durch eine normale embryonale Entwicklung mit fortschreitender Knorpeldegeneration beginnend im Alter von drei bis acht Jahren. Tierversuche mit knock out oder Überexpression von WISP3 in Mäusen waren nicht in der Lage die Symptome der Erkrankung nachzustellen, da keine Unterschiede im Vergleich zu den Wurfgeschwistern beobachtbar waren. In vitro und in vivo Studien offenbarten eine antagonisierende Rolle für WISP3 im BMP, IGF und Wnt Signalweg. Da die meisten Informationen über WISP3 jedoch in Epithel- und Krebszellen sowie immortalisierten Chondrozytenzelllinien generiert wurden, untersuchten wir die Rolle von WISP3 in primären humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSZs) und primären Chondrozyten. Der WISP3 knock down wurde mit drei short hairpin RNAs in beiden Zelltypen etabliert und wies eine veränderte Zellmorphologie sowie eine reduzierte Zellzahl auf. Knock down mit gleichzeitiger rekombi- nanter WISP3-Behandlung konnte den beobachteten Phänotyp sowie den Zellverlust nicht retten und auch eine Änderung der endogenen Genexpression von WISP3 war nicht zu detektieren. Schlussfolgernd muss WISP3 ein wichtiger Überlebensfaktor sein, dessen Verlust zur Überschreitung von Zellzyklus- Kontrollpunkten führt, was in Apoptose mündet. Apoptosenachweise wie Annexin V-Cy3 Färbung, Immunfluoreszenzfärbung und Western blot für aktive Caspasen lieferten keine positiven Beweise für diese Form des Zelltodes. Auch die Genexpression der Todesrezeptoren TRAILR1 und TRAILR2, wichtig für die extrinsische Aktivierung der Apoptose, zeigte kein verändertes Expressionsmuster in WISP3-defizienten hMSZs. Autophagie als Zelltod wurde ebenfalls ausgeschlossen, nachdem im West- ern Blot kein gespaltene Form des Autophagiemarkers LC3 A/B zu detektieren war. Um die Rolle von WISP3 beim Zelltod weiter zu entschlüsseln, wurden Genom-Expressionsanalysen von WISP3-defizienten hMSZs im Vergleich zu Kontroll-hMSZs angefertigt. Die Analysen ergaben unterschiedlich regulierte Gene vor allem in den Bereichen Zellzyklus-Regulation, Adhäsion, Zytoskelett und Zelltod. Der durch WISP3-Verlust ausgelöste Zelltod kann möglicherweise durch die Aktivierung der Nektroptose über den BMP/TAK1/RIPK1 Signalweg erklärt werden. Es ist bekannt, dass WISP3 BMP4 bindet und so dessen Bindung an den Rezeptor verhindert. Bei WISP3 Verlust bindet BMP4 an seinen Rezeptor und aktiviert den Smad 2/3/4 Komplex der wiederum TAK1 phosphoryliert, wie zuvor in Epithelzellen demonstriert. TAK1 ist in der Lage die Caspase-induzierte Apoptose zu blockieren und auf diese Weise die Bildung des Nekrosomes auszulösen, welches zum Zelluntergang durch Nekroptose führt. Zusammen mit seiner Rolle in der Zellzyklus-Kontrolle und der extrazellulären Matrixadhäsion, die in humanen Brustepithelialzellen nachgewiesen wurden, unterstützen diese Daten eine Rolle für WISP3 als Tumorsuppressor und Überlebensfaktor in Zellen des Epithel und des muskuloskelettalen Systems. KW - Knorpelzelle KW - PPD KW - mesenchymal stem cells KW - cell death KW - chondrocytes KW - Mesenchymzelle KW - Dysplasie KW - Genexpression KW - Werk Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109641 ER - TY - THES A1 - Subota, Ines T1 - Switches in trypanosome differentiation: ALBA proteins acting on post-transcriptional mRNA control T1 - Steuerungsmechanismen der Differenzierung in Trypanosomen: die Rolle von ALBA Proteinen in post-transkriptioneller mRNA Kontrolle N2 - Trypanosoma brucei is a digenetic eukaryotic parasite that develops in different tissues of a mammalian host and a tsetse fly. It is responsible for sleeping sickness in sub-saharan Africa. The parasite cycle involves more than nine developmental stages that can be clearly distinguished by their general morphology, their metabolism and the relative positioning of their DNA-containing organelles. During their development, trypanosomes remain exclusively extracellular and encounter changing environments with different physico-chemical properties (nutritional availability, viscosity, temperature, etc.). It has been proposed that trypanosomes use their flagellum as a sensing organelle, in agreement with the established role of structurally-related cilia in metazoa and ciliates. Recognition of environmental triggers is presumed to be at the initiation of differentiation events, leading to the parasite stage that is the best suited to the new environment. These changes are achieved by the modification of gene expression programmes, mostly underlying post-transcriptional control of mRNA transcripts. We first demonstrate that the RNA-binding proteins ALBA3/4 are involved in specific differentiation processes during the parasite development in the fly. They are cytosolic and expressed throughout the parasite cycle with the exception of the stages found in the tsetse fly proventriculus, as shown by both immunofluorescence and live cell analysis upon endogenous tagging with YFP. Knock-down of both proteins in the developmental stage preceding these forms leads to striking modifications: cell elongation, cell cycle arrest and relocalization of the nucleus in a posterior position, all typical of processes acting in parasites found in the proventriculus region. When ALBA3 is over-expressed from an exogenous copy during infection, it interferes with the relocalization of the nucleus in proventricular parasites. This is not observed for ALBA4 over-expression that does not visibly impede differentiation. Both ALBA3/4 proteins react to starvation conditions by accumulating in cytoplasmic stress granules together with DHH1, a recognized RNA-binding protein. ALBA3/4 proteins also partially colocalize with granules formed by polyA+ RNA in these conditions. We propose that ALBA are involved in trypanosome differentiation processes where they control a subset of developmentally regulated transcripts. These processes involving ALBA3/4 are likely to result from the specific activation of sensing pathways. In the second part of the thesis, we identify novel flagellar proteins that could act in sensing mechanisms. Several protein candidates were selected from a proteomic analysis of intact flagella performed in the host laboratory. This work validates their flagellar localization with high success (85% of the proteins examined) and defines multiple different patterns of protein distribution in the flagellum. Two proteins are analyzed during development, one of them showing down-regulation in proventricular stages. The functional analysis of one novel flagellar membrane protein reveals its rapid dynamics within the flagellum but does not yield a visible phenotype in culture. This is coherent with sensory function that might not be needed in stable culture conditions, but could be required in natural conditions during development. In conclusion, this work adds new pieces to the puzzle of identifying molecular switches involved in developmental mRNA control and environmental sensing in trypanosome stages in the tsetse fly. N2 - Trypanosoma brucei ist ein digenetischer, eukaryotischer Parasit, der zwischen Säugetier und Tsetsefliege alterniert, in welchen er unterschiedliche Gewebe besiedelt. Er ist die Ursache für die Schlafkrankheit in Afrika südlich der Sahara. Der Lebenszyklus der Trypanosomen besteht aus mehr als neun Parasitenstadien, die eindeutig anhand ihrer Morphologie, ihres Metabolismus und der Positionierung ihrer DNA Organellen unterschieden werden können. Trypanosomen bleiben ausschließlich extrazellulär und kommen im Laufe ihres Infektionszyklus mit sich verändernden Umwelteinflüssen in Berührung, z. B. Temperaturschwankungen, Variation in vorhandenen Energiequellen, erhöhte Viskosität usw. In Übereinstimmung mit der anerkannten sensorischen Funktion die Cilien in Vielzellern ausüben, wurde für diese Rolle das strukturverwandte Flagellum in Trypanosomen vorgeschlagen. Die Erkennung wechselnder Umweltparameter ist der vermutliche Auslöser für Differenzierungsprozesse, die ein Entwicklungsstadium hervorbringen, welches am besten an die neue Umgebung angepasst ist. Dies wird durch eine Modifizierung der Genexpression erreicht, die in Trypanosomen fast ausschließlich auf posttranskriptioneller Ebene erfolgt. Diese Arbeit zeigt, dass die RNA bindenden Proteine ALBA3 und ALBA4 an der Differenzierung von Trypanosomen in der Tsetsefliege beteiligt sind. Immunfluoreszenzanalyse und Lebendvideomikroskopie von Zellen, die eine an YFP gekoppelte Variante der Proteine enthalten, haben gezeigt, dass sich ALBA3/4 im Zytosol befinden und dass sie in jedem Parasitenstadium exprimiert sind, mit Ausnahme derer, die im Proventrikel der Tsetsefliege zu finden sind. Das Herunterregulieren der Proteine in vorangehenden Stadien, führt zu markanten Veränderungen, die mit denjenigen, die in Parasiten im Proventrikel zu finden sind, vergleichbar sind: z. B. Verlängerung der Zelle, Zellzyklusarrest und Lokalisierung des Zellkerns in eine posteriore Position. Im Gegenteil dazu findet die Umpositionierung des Zellkerns nicht statt, wenn ALBA3 während der Entwicklung des Parasiten in der Tsetsefliege überexprimiert wird. Ein vergleichbarer Effekt wird mit ALBA4 Überexpression nicht erreicht, welches die Entwicklung nicht negativ zu beeinflussen scheint. Wenn Trypanosomen Hungerstress ausgesetzt sind, reichern sich beide ALBA Proteine zusammen mit DHH1, einem anerkannten RNA bindenden Protein, in zytoplasmatischen Aggregaten an, die nur teilweise mit denjenigen kolokalisieren, die durch polyA+ RNA in diesen Bedingungen verursacht werden. Diese Arbeit zeigt, dass ALBA Proteine eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Trypanosomen spielen und legt nahe, dass sie an der entwicklungsbedingten Kontrolle eines Teils der mRNA Expression beteiligt sind. Der zweite Teil dieser Arbeit handelt von der Identifizierung neuer flagellarer Proteine, die eine sensorische Funktion haben könnten. Hierfür wurden mehrere Proteinkandidaten aus einer durchgeführten Proteomanalyse intakter Flagellen gewählt. Die vorliegende Arbeit bestätigt die flagellare Lokalisierung der Proteine mit großem Erfolg (85% der untersuchten Proteine) und zeigt, dass sie unterschiedliche Verteilungsmuster vorweisen. Zwei der Proteine werden während der Infektion des Parasiten in der Tsetsefliege untersucht, was aufdeckt, dass eines davon in den Stadien im Proventrikel herunterreguliert ist. Die Funktionsstudie eines neu identifizierten flagellaren Membranproteins weist seine schnelle Dynamik im Flagellum auf, führt jedoch zu keinem sichtbaren Phänotyp in Laborbedingungen. Diese Beobachtung passt zu der Annahme, dass Proteine mit sensorischer Funktion in stabilen Laborverhältnissen nicht essentiell sind aber eine wichtige Rolle während der Entwicklung des Parasiten in natürlichen Bedingungen spielen. Zusammenfassend fügt diese Arbeit Teile zum Puzzle der Identifizierung molekularer Schalter, die in Trypanosomenstadien in der Tsetsefliege an der mRNA Kontrolle und der Erkennung der Umwelt beteiligt sind. KW - Trypanosoma brucei KW - Parasit KW - Entwicklung KW - Tsetsefliege KW - Trypanosomen KW - parasitärer Entwicklungszyklus KW - Differenzierung KW - Tsetse Fliege KW - ALBA Proteine KW - Kontrolle der Genexpression KW - trypanosomes KW - parasite cycle KW - differentiation KW - tsetse fly KW - ALBA proteins KW - gene expression control KW - flagellar sensing proteins KW - FLAMM KW - Genexpression Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85707 N1 - Durchführung der Experimente am Institut Pasteur, Arbeitsgruppe Trypanosome Cell Biology Unit, Paris, Frankreich ER - TY - THES A1 - Schäfer, Ingo T1 - Fremdgenexpression in humanen Mitochondrien T1 - Artificial gene expression in human mitochondria N2 - Bei einer Vielzahl neuromuskulärer und neurodegenerativer Erkrankungen spielen Fehlfunktionen der Mitochondrien eine wichtige Rolle. Da die Proteine der Atmungsketten-komplexe sowohl durch die mitochondriale DNA als auch durch das Kerngenom codiert werden, können Mutationen in beiden Genomen die Auslöser dieser Erkrankungen darstellen. Veränderungen der mitochondrialen DNA lassen sich - im Gegensatz zum Kerngenom - bisher nicht korrigieren, weshalb bei einem großen Teil der Erkrankungen nur die Symptome und nicht die Auslöser behandelt werden können. Das grundlegende Problem stellt dabei der Transport der DNA in die Mitochondrien dar. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von physikalischen Transfektionsmethoden exogene DNA in die Mitochondrien menschlicher Kulturzellen einzubringen. Dazu wurden unterschiedliche Vektoren hergestellt, die in Mitochondrien das an die Mitochondrien angepasste grün fluoreszierende mtEGFP exprimieren sollen. Die Expressionsfähigkeit und Prozessierung dieser Konstrukte konnte in in-vitro-Assays mit einem Mitochondrienextrakt nachgewiesen werden. Bei Transfektionsversuchen mit der Gene Gun gelang es erstmals, exogene Plasmid-DNA in die Mitochondrien menschlicher Zellen einzubringen. Das durch die transfizierten Vektoren exprimierte mtEGFP konnte am Fluoreszenzmikroskop eindeutig in den Mitochondrien der Zellen lokalisiert werden. Eine Transfektion mit Hilfe magnetischer Partikel erwies sich jedoch nicht als zielführend, da die die Partikel eine Eigenfluoreszenz aufwiesen, die eine Detektion der mtEGFP-Expression verhinderten. Eine wichtige Voraussetzung für die Transfektion von Mitochondrien durch mechanische Methoden wie die Mikroinjektion ist die reversible Induktion von Megamitochondrien, da sie erst in diesem Zustand penetriert werden können. Durch eine Ansäuerung des Kulturmediums mit Natriumacetat bzw. Essigsäure konnten Mitochondrien erzeugt werden, die beinahe die Größe des Zellkerns aufwiesen und somit ideale Bedingungen für die Mikroinjektion darstellen. Bei den anschließenden Mikroinjektionsversuchen mit den hergestellten mitochondrialen Expressionsvektoren wurden wiederum Zellen mit eindeutig grün fluoreszierenden Mitochondrien gefunden. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmalig menschliche Mitochondrien mit exogener DNA transfiziert. Dies stellt einen grundlegenden Schritt für die Entwicklung neuer Therapieformen bei mitochondrialen Myopathien dar. Zuvor müssen die Transfektionsmethoden jedoch noch weiter optimiert werden, um eine höhere Transfektionseffizienz zu erreichen. N2 - Mitochondrial dysfunctions play an important role in a variety of neuromuscular and neurodegenerative diseases. As the proteins of the respiratory chain complexes are encoded by the mitochondrial DNA as well as the nuclear genome, mutations in both could trigger solely the diseases. Up to now, changes of the mitochondrial DNA could not be corrected, hence, therapies were designed to decrease symptoms in patients. In this context, the limiting factor to cure these disease relies on the DNA transport into the mitochondria. The aim of this work was to insert exogenous DNA into the mitochondria of human cultured cells by physical transfection methods. A variety of different vectors was constructed to express the mitochondrially adapted green fluorescent mtEGFP within mitochondria. The ability of these constructs to be expressed and processed was proved by in vitro assays using a mitochrondrial extract. In the transfection experiments using the gene gun, we succeeded for the first time to introduce exogenous plasmid DNA into human mitochondria. The mtEGFP expressed by the transfected vectors could definitely be localized to the mitochondria of the cells. Transfections using magnetic particles as mediator could not be used, because the particles exhibit an autofluorescence which prevents a detection of the mtEGFP expression. An essential prerequisite for the transfection of mitochondria by mechanical methods like microinjection is the reversible induction of megamitochondria, since they could not be penetrated as small regular organelles. Acidification of the culture medium with sodium acetate or acetic acid led to mitochondria exhibiting almost the size of the nucleus, thus giving ideal conditions for microinjection. In the applied microinjection experiments using the mitochondrial expression vectors, cells displayed mitochondria with distinct green fluorescence. In summary, human mitochondria were transfected successfully for the first time with mitochondrial expression vectors. This is a fundamental step in the development of new therapies targeting mitochondrial myopathies. However, the transfection methods have to be optimized to achieve higher transfection efficiencies. KW - Mitochondrium KW - Heterologe Genexpression KW - Mitochondrien KW - mitochondria KW - gene expression KW - Transfektion KW - Mensch KW - Genexpression Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85202 ER - TY - THES A1 - Hokema, Anna T1 - Beeinflussung der Genexpression verschiedener Gene durch Xmrk in Pigmentzelltumoren bei Oryzias latipes T1 - The effect of Xmrk on the gene expression of various genes in pigment cell tumors in oryzias latipes N2 - Ziel dieser Arbeit ist es ein besseres Verständinis der molekularen Prozesse der Melanomentstehung und Tumorprogression zu gewinnen. Hierfür wurde ein Tiermodell transgener Medakas (Oryzias latipes) verwendet, welche als stabiles Transgen das Konstrukt mitf::xmrk besitzen. Diese Fische entwickelten Pigmentzelltumore, welche für eine Microarrayanalyse herangezogen wurden. Aus diesem Microarraydatensatz wurden 11 Gene ausgewählt, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Beobachtungen haben ergeben, dass sich bei transgenen Medakas, welche Xmrk exprimieren, verschiedene pigmentierte Hauttumore entwickeln. Diese Tumore wurden je nach ihrem verschiedenen Histiotyp klassifiziert und untersucht. Um einen Eindruck zu gewinnen, wie Xmrk die Transkription verschiedener Gene, welche in der Krebsentstehung und –progression eine wichtige Rolle spielen, beeinflusst, wurden pigmentierte Hauttumore transgener Medakas, so wie zu Vergleichszwecken hyperpigmentierte Haut transgener Medakas und Lymphome und gesunde Organe von Wildtyp-Medakas, untersucht. Mit Hilfe von Real-time-PCR’s wurden die folgenden Gene untersucht: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 und ZFAND5. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 von Xmrk beeinflusst wird, während dies für die Gene G6PC, GAMT, SPP1 und TACC2 nicht zutrifft. Im Vergleich zu gesunder Haut werden GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 in Tumoren höher exprimiert. Die Gene G6PC, GAMT, NID1, SPP1 und TACC2 werden dagegen verglichen mit gesunder Haut unverändert oder niedriger exprimiert. Die Bedeutung der erhöhten Genexpression lässt sich in vielen Fällen zurzeit nur theoretisch erfassen. Eine höhere Expression von SLC24A5 beispielsweise lässt vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der Melaninproduktion und der Zellproliferation besteht. Die Überexpression von GM2A weist dagegen auf eine Rolle von GM2A als Tumormarker hin. Dahingegen scheint die erniedrigte Expression von GAMT und G6PC Auskunft über den veränderten Stoffwechsel in Tumoren zu geben. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu entschlüsseln wie genau Xmrk die Expression der getesteten Gene beeinflusst, sind allerdings noch weitere funktionelle Studien nötig. Generell kommt man zu dem Schluss, dass die Genexpression sich in jedem Tumor unterscheidet. Daher scheint jeder Tumor seinen eigenen Evolutionsweg zu beschreiten. N2 - Target of this work is to get a better understanding in melanomagenesis and tumorprogression. Therefore a model of transgenic medakas (Oryzias latipes) was used, wich had the construct mitf::Xmrk as a stable, integrated transgen. Those fishes developed pigmentcelltumors that, wich where used in a microarrayanalysis. Of the results of this microarray 11 genes where chosen and analysed in this study. Those transgenic medakas which got xmrk injected, but without a tumorsuppresorgen, developed various pigmented kinds of skin cancer. Those tumors were analysed equally to their histiotyps. To get an idea, how Xmrk effects the transcription of several genes, which play an important role in tumor development and progression, pigmented skin cancer of transgenic medakas and for comparison, hyper pigmented skin of transgenic medakas and also lymphoma and healthy organs where tested. The following genes where tested by real-time-PCR: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 and ZFAND5. It was noticed that the expression of the genes GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 gets modified by Xmrk. In contrast the genes G6PC, GAMT, SPP1 and TACC2 didn't. In comparison to healthy skin GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 and ZFAND5 got higher expressed in tumors. Indeed the expression level of the genes G6PC, GAMT, NID1, SPP1 and TACC2 is the same or even lower than in healthy skin. The meaning of the higher gen expression can currently just be theoretically conceived. The higher expression of SLC24A5 for example leads to guess that there is a link between the production of melanin and cell proliferation. The overexpression of GM2A shows that GM2A plays maybe a role as an tumor marker. However the lower expression of G6PC and GAMT gets references about the metabolism in cancer. To fix this results and get an better understanding how Xmrk affects the expression of this genes, additional funktional studies are necessary. The result is that gene expression differs in each tumor. A common conclusion is not possible. It appears that each tumor goes its own evolutionary way. KW - Japankärpfling KW - Melanom KW - Hauttumor KW - Genexpression KW - Real time quantitative PCR KW - Onkogen KW - Xmrk KW - Xmrk Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75616 ER - TY - THES A1 - Kirchmaier, Bettina Carmen T1 - Characterization of the Popeye domain containing gene family in zebrafish T1 - Charakterisierung der Popeye domain containing Genfamilie im Zebrafisch N2 - The Popeye domain containing (Popdc) gene family of membrane proteins is predominantly expressed in striated and smooth muscle tissues and has been shown to act as novel cAMP-binding proteins. In mice, loss of Popdc1 and Popdc2, respectively, affects sinus node function in the postnatal heart in an age and stress-dependent manner. In this thesis, I examined gene expression pattern and function of the Popdc gene family during zebrafish development with an emphasis on popdc2. Expression of the zebrafish popdc2 was exclusively present in cardiac and skeletal muscle during cardiac development, whereas popdc3 was expressed in striated muscle tissue and in distinct regions of the brain. In order to study the function of these genes, an antisense morpholino-based knockdown approach was used. Knockdown of popdc2 resulted in aberrant development of facial and tail musculature. In the heart, popdc2 morphants displayed irregular ventricular contractions with 2:1 and 3:1 ventricular pauses. Recordings of calcium transients using a transgenic indicator line Tg(cmlc2:gCaMP)s878 and selective plane illumination microscopy (SPIM) revealed the presence of an atrioventricular (AV) block in popdc2 morphants as well as a complete heart block. Interestingly, preliminary data revealed that popdc3 morphants developed a similar phenotype. In order to find a morphological correlate for the observed AV conduction defect, I studied the structure of the AV canal in popdc2 morphants using confocal analysis of hearts of the transgenic line Tg(cmlc2:eGFP-ras)s883, which outlines individual cardiac myocytes with the help of membrane-localized GFP. However, no evidence for morphological alterations was obtained. To ensure that the observed arrhythmia phenotype in the popdc2 morphant was based on a myocardial defect and not caused by defective valve development, live imaging was performed revealing properly formed valves. Thus, in agreement with the data obtained in knockout mice, popdc2 and popdc3 genes in zebrafish are involved in the regulation of cardiac electrical activity. However, both genes are not required for cardiac pacemaking, but they play essential roles in AV conduction. In order to elucidate the biological importance of cAMP-binding, wild type Popdc1 as well as mutants with a significant reduction in binding affinity for cAMP in vitro were overexpressed in zebrafish embryos. Expression of wild type Popdc1 led to a cardiac insufficiency phenotype characterized by pericardial edema and venous blood retention. Strikingly, the ability of the Popdc1 mutants to induce a cardiac phenotype correlated with the binding affinity for cAMP. These data suggest that cAMP-binding represents an important biological property of the Popdc protein family. N2 - Die Popeye domain containing (Popdc) Gene kodieren für eine Familie von Membranproteinen, die vorwiegend in der gestreiften und glatten Muskulatur exprimiert werden und in der Lage sind cAMP zu binden. In Mäusen resultiert der Verlust von Popdc1 oder Popdc2 in einer stressinduzierten Sinusknotendysfunktion, die sich altersabhängig entwickelt. In meiner Dissertation habe ich das Expressionsmuster und die Funktion der Popdc Genfamilie mit Schwerpunkt auf dem popdc2-Gen im Zebrafisch untersucht. Das popdc2-Gen im Zebrafisch wurde ausschließlich in der Herz- und Skelettmuskulatur exprimiert, während popdc3 sowohl in der quergestreiften Muskulatur, als auch im Gehirn exprimiert wurde. Um die Funktion dieser Gene zu untersuchen, wurde die Prozessierung der prä-mRNA mit Hilfe von Morpholinos unterdrückt, die gegen die Spleißdonor bzw. -akzeptorsequenzen von popdc2 und popdc3 gerichtet waren. Das Fehlen von popdc2 im Zebrafisch resultierte in einer Fehlentwicklung der Gesichts- und Schwanzmuskulatur. Im Herzen der popdc2-Morphanten waren ventrikuläre Überleitungsstörungen mit einem 2:1 oder 3:1 Rhythmus zu beobachten. Analysen der Calciumfreisetzung mittels SPIM (selective plane illumination microscopy) in der transgenen Zebrafischlinie Tg(cmlc2:gCaMP)s878, die einen fluoreszierenden Calciumindikator exprimiert, zeigten in den popdc2-Morphanten einen AV-Block bis hin zum kompletten Herzblock. Interessanterweise ergaben vorläufige Analysen in popdc3-Morphanten einen ähnlichen Phänotyp. Um eine mögliche morphologische Ursache der beobachteten AV-Überleitungsstörung zu finden, habe ich die Struktur des AV-Kanals von popdc2-Morphanten mit Hilfe der transgenen Zebrafischlinie Tg(cmlc2:eGFP-rass883) und konfokaler Mikroskopie untersucht. Allerdings konnte ich kein Anzeichen für morphologische Veränderungen erkennen. Um sicherzugehen, dass der beobachtete Rhythmusphänotyp der popdc2-Morphanten nicht auf einer myokardialen Störung beruht oder auf einem Defekt bei der Klappenentwicklung, wurden zusätzlich Lebendaufnahmen angefertigt, die zeigten, dass die Klappen normal entwickelt waren. In Übereinstimmung mit den Daten aus den Knockout-Mäusen haben die popdc2- und popdc3-Gene auch im Zebrafisch eine wichtige Funktion bei der elektrischen Reizleitung im Herzen. Allerdings sind die beiden Gene für die Erregungsbildung im Sinusknoten nicht essentiell, sondern werden für die Signalübertragung im AV-Kanal benötigt. Um die biologische Signifikanz der cAMP-Bindung zu untersuchen, wurden Wildtyp-Popdc1 und Punktmutanten, die eine Reduktion in der cAMP-Bindung aufweisen, nach RNA-Injektion in Zebrafischembryonen überexprimiert. Die Injektion von Wildtyp-Popdc1 induzierte eine embryonale Herzinsuffizienz, die durch perikardiales Ödem und venösen Blutstau charakterisiert war. Die Fähigkeit der Popdc1-Punktmutanten, einen Herzphänotyp nach Überexpression zu induzieren, war direkt korreliert mit der Bindungsaffinität für cAMP. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass die Fähigkeit der cAMP-Bindung eine wichtige biologische Eigenschaft der Popdc-Proteinfamilie darstellt. KW - Zebrabärbling KW - Genexpression KW - Herzmuskel KW - Herz KW - Popdc Genfamilie KW - heart KW - popdc gene family Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49413 ER - TY - THES A1 - Jauch, Mandy T1 - Die Serin/Arginin Proteinkinase 79D (SRPK79D) von Drosophila melanogaster und ihre Rolle bei der Bildung Aktiver Zonen von Synapsen T1 - The serine/arginine protein kinase 79D (SRPK79D) of Drosophila melanogaster and its role in the formation of active zones of synapses N2 - Synapsen als Stellen der Kommunikation zwischen Neuronen besitzen spezialisierte Bereiche – Aktive Zonen (AZs) genannt –, die aus einem hoch komplexen Netzwerk von Proteinen aufgebaut sind und die Maschinerie für den Prozess der Neurotransmitter-Ausschüttung und das Vesikel-Recycling beinhalten. In Drosophila ist das Protein Bruchpilot (BRP) ein wichtiger Baustein für die T-förmigen Bänder („T-Bars“) der präsynaptischen Aktiven Zonen. BRP ist notwendig für eine intakte Struktur der Aktiven Zone und eine normale Exocytose von Neurotransmitter-Vesikeln. Auf der Suche nach Mutationen, welche die Verteilung von Bruchpilot im Gewebe beeinträchtigen, wurde eine P-Element-Insertion im Gen CG11489 an der Position 79D identifiziert, welches eine Kinase kodiert, die einen hohen Grad an Homologie zur Familie der SR Proteinkinasen (SRPKs) von Säugern aufweist. Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch eine evolutionär hoch konservierte zweigeteilte Kinasedomäne aus, die durch eine nicht konservierte Spacer-Sequenz unterbrochen ist. SRPKs phosphorylieren SR-Proteine, die zu einer evolutionär hoch konservierten Familie Serin/Arginin-reicher Spleißfaktoren gehören und konstitutive sowie alternative Spleißprozesse steuern und damit auf post-transkriptioneller Ebene die Genexpression regulieren. Mutation des Srpk79D-Gens durch die P-Element-Insertion (Srpk79DP1) oder eine Deletion im Gen (Srpk79DVN Nullmutante) führt zu auffälligen BRP-Akkumulationen in larvalen und adulten Nerven. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese BRP-Akkumulationen auf Ultrastruktur-Ebene ausgedehnten axonalen Agglomeraten elektronendichter Bänder entsprechen und von klaren Vesikeln umgeben sind. Charakterisierung durch Immuno-Elektronenmikroskopie ergab, dass diese Strukturen BRP-immunoreaktiv sind. Um die Bildung BRP-enthaltender Agglomerate in Axonen zu verhindern und damit eine intakte Gehirnfunktion zu gewährleisten, scheint die SRPK79D nur auf niedrigem Niveau exprimiert zu werden, da die endogene Kinase mit verschiedenen Antikörpern nicht nachweisbar war. Wie in anderen Arbeiten gezeigt werden konnte, ist die Expression der PB-, PC- oder PF-Isoform der vier möglichen SRPK79D-Varianten, die durch alternativen Transkriptionsstart in Exon eins beziehungsweise drei und alternatives Spleißen von Exon sieben zustande kommen, zur Rettung des Phänotyps der BRP-Akkumulation im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund ausreichend. Zur Charakterisierung der Rescue-Eigenschaften der SRPK79D-PE-Isoform wurde mit der Klonierung der cDNA in einen UAS-Vektor begonnen. Offenbar beruht die Bildung der axonalen BRP-Agglomerate nicht auf einer Überexpression von BRP in den betroffenen Neuronen, denn auch bei reduzierter Expression des BRP-Proteins im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund entstehen die BRP-Agglomerate. In Köpfen der Srpk79DVN Nullmutante ist die Gesamtmenge an Bruchpilot-Protein im Vergleich zum Wildtyp nicht deutlich verändert. Auch die auf Protein-Ebene untersuchte Expression der verschiedenen Isoformen der präsynaptischen Proteine Synapsin, Sap47 und CSP weicht in der Srpk79DVN Nullmutante nicht wesentlich von der Wildtyp-Situation ab, sodass sich keine Hinweise auf verändertes Spleißen der entsprechenden prä-mRNAs ergeben. Jedes der sieben bekannten SR-Proteine von Drosophila ist ein potentielles Zielprotein der SRPK79D. Knock-down-Experimente für die drei hier untersuchten SR-Proteine SC35, X16/9G8 und B52/SRp55 im gesamten Nervensystem durch RNA-Interferenz zeigten allerdings keinen Effekt auf die Verteilung von BRP im Gewebe. Hinsichtlich der Flugfähigkeit der Tiere hat die Srpk79DVN Nullmutation keinen additiven Effekt zum Knock-down des BRP-Proteins, denn die Doppelmutanten zeigten bei der Bestimmung des Anteils an flugunfähigen Tieren vergleichbare Werte wie die Einzelmutanten, die entweder die Nullmutation im Srpk79D-Gen trugen, oder BRP reduziert exprimierten. Vermutlich sind Bruchpilot und die SR Proteinkinase 79D somit Teil desselben Signalwegs. Durch Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen BRP und CAPA-Peptide wurde abschließend entdeckt, dass Bruchpilot auch im Median- und Transvers-Nervensystem (MeN/TVN) von Drosophila zu finden ist, welche die Neurohämal-Organe beherbergen. Aufgabe dieser Organe ist die Speicherung und Ausschüttung von Neuropeptid-Hormonen. Daher ist zu vermuten, dass das BRP-Protein neben Funktionen bei der Neurotransmitter-Exocytose möglicherweise eine Rolle bei der Ausschüttung von Neuropeptiden spielt. Anders als in den Axonen der larvalen Segmental- und Intersegmentalnerven der Srpk79DVN Nullmutante, die charakteristische BRP-Agglomerate aufweisen, hat die Mutation des Srpk79D-Gens in den Axonen der Va-Neurone, die das MeN/TVN-System bilden, keinen sichtbaren Effekt auf die Verteilung von Brp, denn das Muster bei Färbung gegen BRP weist keine deutlichen Veränderungen zum Wildtyp auf. N2 - Synapses as sites of communication between neurons contain specialized regions termed active zones (AZs) which are composed of a highly complex network of proteins comprising the exocytotic machinery for neurotransmitter release and vesicle recycling. In Drosophila the Bruchpilot (BRP) protein is an important building block of the T-shaped ribbons („T-bars“) at presynaptic active zones. By screening for mutations affecting the tissue distribution of Bruchpilot, a P-transposon insertion in the Srpk gene at the position 79D has been identified (Srpk79D, CG11489). This gene codes for a kinase which shows high homology to the mammalian family of serine/arginine protein kinases (SRPKs). Members of this family have an evolutionarily highly conserved bipartite kinase domain in common which is separated by a non-conserved spacer sequence. SRPKs phosphorylate SR proteins, an evolutionarily highly conserved family of serine/arginine-rich splicing factors that control the processes of constitutive and alternative splicing. Mutation of the Srpk79D gene caused by the P-element insertion (Srpk79DP1) or by a deletion in the gene (Srpk79DVN null mutant) leads to conspicuous accumulations of BRP in larval and adult axons. This thesis shows that these BRP accumulations at the ultrastructural level correspond to extensive axonal agglomerates of electron-dense ribbons surrounded by clear vesicles. Using immuno electron microscopy, these accumulation were characterized as BRP immuno-reactive structures. To prevent the assembly of BRP containing agglomerates in axons and to maintain intact brain function the SRPK79D seems to be expressed only at low levels because the endogenous kinase was not detectable using various antibodies. It was shown in other thesis that the expression of the PB, PC or PF isoform of the four possible SRPK79D variants resulting from two alternative transcription start sites in exon one and three, respectively, and alternative splicing of exon seven is sufficient to rescue the phenotype of BRP accumulation in the Srpk79DVN null-mutant background. Cloning of the cDNA for the SRPK79D-PE isoform into a UAS vector has been started in order to characterize the ability of this isoform to rescue the BRP-phenotype. It seems as if the formation of axonal BRP agglomerates is not due to BRP overexpression in the affected neurons as was shown by reduced expression of the BRP protein in the Srpk79DVN null-mutant background which still leads to BRP agglomerates. The overall amount of Bruchpilot protein in adult heads of the Srpk79DVN null mutant is not clearly altered compared to wild type. No clear alteration was observed between Srpk79DVN null-mutant and wild-type flies comparing the expression of different presynaptic proteins like Synapsin, Synapse-associated protein of 47 kDa (Sap47), and Cysteine string protein (CSP). The experiment does not point towards altered splicing of the corresponding pre-mRNAs. Each of the seven known SR proteins of Drosophila is a potential target protein of the SRPK79D. Pan-neuronal knock-down experiments for the three SR proteins SC35, X16/9G8, and B52/SRp55 investigated in this thesis by RNA interference did not show an effect on the tissue distribution of BRP. It was shown that the Srpk79DVN null mutation has no additive effect on the knock-down of the BRP protein regarding the flight ability of the respective animals because the double mutants showed similar values of non-flyers as each of the single mutants with either null mutation of the Srpk79D gene or knock-down of BRP. Presumably, Bruchpilot and the SR protein kinase 79D are part of the same signaling pathway. Performing double fluorescence stainings with antibodies against BRP and the CAPA peptides it was shown that Bruchpilot is also present in the median and transverse nerve system (MeN/TVN) of Drosophila containing the neurohaemal organs. These organs are responsible for storage and release of neuropeptide hormones. In contrast to the larval segmental and intersegmental nerves of the Srpk79DVN null mutant which show characteristic BRP agglomerates, mutation of the Srpk79D gene does not affect the distribution of BRP in the axons of the Va neurons which form the MeN/TVN system. The staining pattern of BRP in these nerves does not show clear alterations in the Srpk79DVN null mutant compared to wild type. The finding that BRP is present in the median and transverse nerve system opens the field for speculation of a role for the Bruchpilot protein not only in the neurotransmitter exocytosis but also in the release of neuropeptides. KW - Taufliege KW - Serin KW - Arginin KW - Proteinkinasen KW - Synapse KW - Genexpression KW - Aktive Zone KW - Serin/Arginin Proteinkinase KW - SRPK KW - Bruchpilot KW - Drosophila KW - Synapse KW - Motorische Endplatte KW - Nervenzelle KW - Neurotransmitter KW - active zone KW - serine/arginine protein kinase KW - SRPK KW - Bruchpilot Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53974 ER - TY - THES A1 - Vainshtein, Yevhen T1 - Applying microarray‐based techniques to study gene expression patterns: a bio‐computational approach T1 - Anwendung von Mikroarrayanalysen um Genexpressionsmuster zu untersuchen: Ein bioinformatischer Ansatz N2 - The regulation and maintenance of iron homeostasis is critical to human health. As a constituent of hemoglobin, iron is essential for oxygen transport and significant iron deficiency leads to anemia. Eukaryotic cells require iron for survival and proliferation. Iron is part of hemoproteins, iron-sulfur (Fe-S) proteins, and other proteins with functional groups that require iron as a cofactor. At the cellular level, iron uptake, utilization, storage, and export are regulated at different molecular levels (transcriptional, mRNA stability, translational, and posttranslational). Iron regulatory proteins (IRPs) 1 and 2 post-transcriptionally control mammalian iron homeostasis by binding to iron-responsive elements (IREs), conserved RNA stem-loop structures located in the 5’- or 3‘- untranslated regions of genes involved in iron metabolism (e.g. FTH1, FTL, and TFRC). To identify novel IRE-containing mRNAs, we integrated biochemical, biocomputational, and microarray-based experimental approaches. Gene expression studies greatly contribute to our understanding of complex relationships in gene regulatory networks. However, the complexity of array design, production and manipulations are limiting factors, affecting data quality. The use of customized DNA microarrays improves overall data quality in many situations, however, only if for these specifically designed microarrays analysis tools are available. Methods In this project response to the iron treatment was examined under different conditions using bioinformatical methods. This would improve our understanding of an iron regulatory network. For these purposes we used microarray gene expression data. To identify novel IRE-containing mRNAs biochemical, biocomputational, and microarray-based experimental approaches were integrated. IRP/IRE messenger ribonucleoproteins were immunoselected and their mRNA composition was analysed using an IronChip microarray enriched for genes predicted computationally to contain IRE-like motifs. Analysis of IronChip microarray data requires specialized tool which can use all advantages of a customized microarray platform. Novel decision-tree based algorithm was implemented using Perl in IronChip Evaluation Package (ICEP). Results IRE-like motifs were identified from genomic nucleic acid databases by an algorithm combining primary nucleic acid sequence and RNA structural criteria. Depending on the choice of constraining criteria, such computational screens tend to generate a large number of false positives. To refine the search and reduce the number of false positive hits, additional constraints were introduced. The refined screen yielded 15 IRE-like motifs. A second approach made use of a reported list of 230 IRE-like sequences obtained from screening UTR databases. We selected 6 out of these 230 entries based on the ability of the lower IRE stem to form at least 6 out of 7 bp. Corresponding ESTs were spotted onto the human or mouse versions of the IronChip and the results were analysed using ICEP. Our data show that the immunoselection/microarray strategy is a feasible approach for screening bioinformatically predicted IRE genes and the detection of novel IRE-containing mRNAs. In addition, we identified a novel IRE-containing gene CDC14A (Sanchez M, et al. 2006). The IronChip Evaluation Package (ICEP) is a collection of Perl utilities and an easy to use data evaluation pipeline for the analysis of microarray data with a focus on data quality of custom-designed microarrays. The package has been developed for the statistical and bioinformatical analysis of the custom cDNA microarray IronChip, but can be easily adapted for other cDNA or oligonucleotide-based designed microarray platforms. ICEP uses decision tree-based algorithms to assign quality flags and performs robust analysis based on chip design properties regarding multiple repetitions, ratio cut-off, background and negative controls (Vainshtein Y, et al., 2010). N2 - Die Regulierung und Aufrechterhaltung der Eisen-Homeostase ist bedeutend für die menschliche Gesundheit. Als Bestandteil des Hämoglobins ist es wichtig für den Transport von Sauerstoff, ein Mangel führt zu Blutarmut. Eukaryotische Zellen benötigen Eisen zum Überleben und zum Proliferieren. Eisen ist am Aufbau von Hämo- und Eisenschwefelproteinen (Fe-S) beteiligt und kann als Kofaktor dienen. Die Aufnahme, Nutzung, Speicherung und der Export von Eisen ist zellulär auf verschiedenen molekularen Ebenen reguliert (Transkription, mRNA-Level, Translation, Protein-Level). Die iron regulatory proteins (IRPs) 1 und 2 kontrollieren die Eisen-Homeostase in Säugetieren posttranslational durch die Bindung an Iron-responsive elements (IREs). IREs sind konservierte RNA stem-loop Strukturen in den 5' oder 3' untranslatierten Bereichen von Genen, die im Eisenmetabolismus involviert sind (z.B. FTH1, FTL und TFRC). In dieser Arbeit wurden biochemische und bioinformatische Methoden mit Microarray-Experimenten kombiniert, um neue mRNAs mit IREs zu identifizieren. Genexpressionsstudien verbessern unser Verständnis über die komplexen Zusammenhänge in genregulatorischen Netzwerken. Das komplexe Design von Microarrays, deren Produktion und Manipulation sind dabei die limitierenden Faktoren bezüglich der Datenqualität. Die Verwendung von angepassten DNA Microarrays verbessert häufig die Datenqualität, falls entsprechende Analysemöglichkeiten für diese Arrays existieren. Methoden Um unser Verständnis von eisenregulierten Netzwerken zu verbessern, wurde im Rahmen dieses Projektes die Auswirkung einer Behandlung mit Eisen bzw. von Knockout Mutation unter verschiedenen Bedingungen mittels bioinformatischer Methoden untersucht. Hierfür nutzen wir Expressionsdaten aus Microarray-Experimenten. Durch die Verknüpfung von biochemischen, bioinformatischen und Microarray Ansätzen können neue Proteine mit IREs identifiziert werden. IRP/IRE messenger Ribonucleoproteine wurden immunpräzipitiert. Die Zusammensetzung der enthaltenen mRNAs wurde mittels einem IronChip Microarray analysiert: Für diesen Chip wurden bioinformatisch Gene vorhergesagt, die IRE-like Motive aufweisen. Der Chip wurde mit solchen Oligonucleotiden beschichtet und durch Hybridisierung überprüft, ob die präzipitierten mRNA sich hieran binden. Die Analyse der erhaltenen Daten erfordert ein spezialisiertes Werkzeug um von allen Vorteilen der angepassten Microarrays zu profitieren. Ein neuer Entscheidungsbaum-basierter Algorithmus wurde in Perl im IronChip Evaluation Package (ICEP) implementiert. Ergebnisse Aus großen Sequenz-Datenbanken wurden IRE-like Motive identifiziert. Dazu kombiniert der Algorithmus, insbesondere RNA-Primärsequenz und RNA-Strukturdaten. Solche Datenbankanalysen tendieren dazu, eine große Anzahl falsch positiver Treffer zu generieren. Daher wurden zusätzliche Bedingungen formuliert, um die Suche zu verfeinern und die Anzahl an falsch positiven Treffer zu reduzieren. Die angepassten Suchkriterien ergaben 15 IRE-like Motive. In einem weiteren Ansatz verwendeten wir eine Liste von 230 IRE-like Sequenzen aus UTR-Datenbanken. Daraus wurden 6 Sequenzen ausgewählt, die auch im unteren Teil stabil sind (untere Helix über 6 bp stabil). Die korrespondierenden Expressed Sequence Tags (ESTs) wurden auf die humane oder murine Version des IronChips aufgetragen. Die Microarray Ergebnisse wurden mit dem ICEP Programm ausgewertet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Immunpräzipitation mit anschließender Microarrayanalyse ein nützlicher Ansatz ist, um bioinformatisch vorhergesagte IRE-Gene zu identifizieren. Darüber hinaus ermöglicht uns dieser Ansatz die Detektion neuer mRNAs, die IREs enthalten, wie das von uns gefundene Gen CDC14A (Sanchez et al., 2006). ICEP ist ein optimiertes Programmpaket aus Perl Programmen (Vainshtein et al., BMC Bioinformatics, 2010). Es ermöglicht die einfache Auswertung von Microarray Daten mit dem Fokus auf selbst entwickelten Microarray Designs. ICEP diente für die statistische und bioinformatische Analyse von selbst entwickelten IronChips, kann aber auch leicht an die Analyse von oligonucleotidbasierten oder cDNA Microarrays adaptiert werden. ICEP nutzt einen Entscheidungsbaum-basierten Algorithmus um die Qualität zu bewerten und führt eine robuste Analyse basierend auf Chipeigenschaften, wie mehrfachen Wiederholungen, Signal/Rausch Verhältnis, Hintergrund und Negativkontrollen durch. KW - Microarray KW - Genexpression KW - Bioinformatik KW - geneexpression KW - microarrays KW - IronChip KW - ICEP Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51967 ER - TY - THES A1 - Breher, Stephanie T1 - Die kardiale Funktion von Popdc1 in der Maus: Vom Gen zum Phän T1 - The cardiac function of Popdc1 in mouse: From gene to phene N2 - Die Popeye domain containing (Popdc)-Gene bilden eine evolutionär stark konservierte Genfamilie mit präferenzieller Expression im Herzen und in der Skelettmuskulatur. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Popdc1 in kardialen Myozyten in Glanzstreifen, lateralen Membranen und im T-Tubuli-System exprimiert wird und mit Ionenkanälen und anderen myozytären Membranproteinen wie Cav1.2, Caveolin 3 und NCX1 kolokalisiert ist. Im ventrikulären Reizleitungssystem ist die Expression von Popdc1 gegenüber dem ventrikulären Arbeitsmyokard erhöht, während Atrium und Sinusknoten nahezu äquivalente Expressionsdomänen aufweisen. Mithilfe von elektrophysiologischen Untersuchungen konnte bei den Popdc1-Nullmutanten eine stressinduzierte Sinusbradykardie festgestellt werden, die altersabhängig auftritt und auf Sinuspausen zurückzuführen ist. Histologische Untersuchungen, unter Zuhilfenahme des Sinusknotenmarkers HCN4, zeigten einen Zellverlust im inferioren Teil des Sinusknotens. Popdc1 ist ein Transmembranprotein, das eine 150 Aminosäure umfassende, stark konservierte Popeye-Domäne aufweist. Für diese Domäne konnte auf struktureller Ebene eine Homologie zu zyklischen Nukleotid-Bindungsdomänen vorhergesagt und eine Bindung an cAMP und cGMP experimentell demonstriert werden. Es handelt sich bei den Popdc-Proteinen um einen neuen Zweig der Bindungsproteine für zyklische Nukleotidmonophosphate (cNMP). Die Bindungssequenz weist signifikante Unterschiede zu anderen bereits identifizierten cNMP-Bindungsproteinen auf. Weiterhin wurde die Interaktion von Popdc1 mit TREK1, einem Mitglied der Tandemporenkanäle untersucht. Es zeigte sich, dass Popdc1 nach Koexpression in Froschoozyten, den TREK1-Strom erhöht und dass die β-adrenerge Inhibition des TREK1 Kanals durch Popdc1 verstärkt wird. Im Arbeitsmyokard, im kardialen Reizleitungssystem und in kotransfizierten Cos7-Zellen werden beide Proteine überlappend exprimiert. Diese Daten zeigen, dass Popdc1 eine wichtige Funktion bei der Regulation der Schrittmacheraktivität, der Aufrechterhaltung der Sinusknotenmorphologie und der Modulation von Ionenkanälen aufweist. Interessanterweise wurden von unserer Arbeitsgruppe bereits die gleichen Phänotypen für die Popdc2 Maus beschrieben, sodass die Popdc Genfamilie überlappende und redundante Funktionen aufweist. N2 - The Popeye domain containing (Popdc) family is a highly evolutionary conserved gene family, which shows no homology to other genes. This family shows a preferential expression in the heart and skeletal muscle. In the present study it is shown that Popdc1 protein in the heart was predominantly localized to the intercalated disc, lateral membranes and T-tubularsystem, where it was co-localized with other cardiac membrane proteins such as Cav1.2, Caveolin 3 and NCX1. The expression of Popdc1-LacZ transgene as well as Popdc1 protein was elevated in the ventricular conduction system compared to the ventricular working myocardium. In contrast, expression in atrial tissue was equivalent to the expression in the sinus node. Electrophysiological measurements in Popdc1 null mutants revealed a stressinduced and age-dependent sinus bradycardia, which was due to an increase in sinus pauses and independent of the nature of stress. Histological examinations with the help of the sinus node marker HCN4 revealed structural alterations in the inferior part of the sinus node in 8 months old Popdc1-mice. Biochemical examinations of Popdc1 showed that Popdc1 is a transmembrane protein. The N-terminus is extracellular and glycosylated, while the Cterminus is intracellular and harbours a highly conserved 150 amino acid-long Popeye domain. For this domain, a predicted homology to cyclic nucleotide binding domains was observed. Binding of cAMP and cGMP was experimentally demonstrated and thus, the Popdc proteins constitute a novel branch of the cyclic nucleotide binding protein family. Furthermore interaction of Popdc1 with the tandem pore channel TREK1 was examined. After co-injection of Popdc1 the TREK1 current was increased in Xenopus oocytes. Furthermore, β-adrenergic inhibition of TREK1 current was enhanced in the presence of Popdc1. In working myocardium, conduction tissue as well as in co-transfected Cos7 cells the two proteins showed a similar distribution. In conclusion, Popdc1 is involved in cardiac pacemaker activity, maintaining sinus node morphology and modulating ion channels that contribute to the setting of the membrane potential in cardiac myocytes. Interestingly, a highly similar phenotype was observed for the Popdc2 mouse mutant and therefore the Popdc gene family displays overlapping and redundant functions. KW - Sinusknoten KW - Genexpression KW - Elektrophysiologie KW - Popdc1 KW - Transmembranprotein KW - Sinusknotenbradykardie KW - cAMP-Bindung KW - Popdc1 KW - transmembrane protein KW - sinus bradycardia KW - cAMP binding Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37283 ER - TY - THES A1 - Friedrich, Torben T1 - New statistical Methods of Genome-Scale Data Analysis in Life Science - Applications to enterobacterial Diagnostics, Meta-Analysis of Arabidopsis thaliana Gene Expression and functional Sequence Annotation T1 - Neue statistische Methoden für genomweite Datenanalysen in den Biowissenschaften - Anwendungen in der Enterobakteriendiagnostik, Meta-Analyse von Arabidopsis thaliana Genexpression und funktionsbezogenen Sequenzannotation N2 - Recent progresses and developments in molecular biology provide a wealth of new but insufficiently characterised data. This fund comprises amongst others biological data of genomic DNA, protein sequences, 3-dimensional protein structures as well as profiles of gene expression. In the present work, this information is used to develop new methods for the characterisation and classification of organisms and whole groups of organisms as well as to enhance the automated gain and transfer of information. The first two presented approaches (chapters 4 und 5) focus on the medically and scientifically important enterobacteria. Its impact in medicine and molecular biology is founded in versatile mechanisms of infection, their fundamental function as a commensal inhabitant of the intestinal tract and their use as model organisms as they are easy to cultivate. Despite many studies on single pathogroups with clinical distinguishable pathologies, the genotypic factors that contribute to their diversity are still partially unknown. The comprehensive genome comparison described in Chapter 4 was conducted with numerous enterobacterial strains, which cover nearly the whole range of clinically relevant diversity. The genome comparison constitutes the basis of a characterisation of the enterobacterial gene pool, of a reconstruction of evolutionary processes and of comprehensive analysis of specific protein families in enterobacterial subgroups. Correspondence analysis, which is applied for the first time in this context, yields qualitative statements to bacterial subgroups and the respective, exclusively present protein families. Specific protein families were identified for the three major subgroups of enterobacteria namely the genera Yersinia and Salmonella as well as to the group of Shigella and E. coli by applying statistical tests. In conclusion, the genome comparison-based methods provide new starting points to infer specific genotypic traits of bacterial groups from the transfer of functional annotation. Due to the high medical importance of enterobacterial isolates their classification according to pathogenicity has been in focus of many studies. The microarray technology offers a fast, reproducible and standardisable means of bacterial typing and has been proved in bacterial diagnostics, risk assessment and surveillance. The design of the diagnostic microarray of enterobacteria described in chapter 5 is based on the availability of numerous enterobacterial genome sequences. A novel probe selection strategy based on the highly efficient algorithm of string search, which considers both coding and non-coding regions of genomic DNA, enhances pathogroup detection. This principle reduces the risk of incorrect typing due to restrictions to virulence-associated capture probes. Additional capture probes extend the spectrum of applications of the microarray to simultaneous diagnostic or surveillance of antimicrobial resistance. Comprehensive test hybridisations largely confirm the reliability of the selected capture probes and its ability to robustly classify enterobacterial strains according to pathogenicity. Moreover, the tests constitute the basis of the training of a regression model for the classification of pathogroups and hybridised amounts of DNA. The regression model features a continuous learning capacity leading to an enhancement of the prediction accuracy in the process of its application. A fraction of the capture probes represents intergenic DNA and hence confirms the relevance of the underlying strategy. Interestingly, a large part of the capture probes represents poorly annotated genes suggesting the existence of yet unconsidered factors with importance to the formation of respective virulence phenotypes. Another major field of microarray applications is gene expression analysis. The size of gene expression databases rapidly increased in recent years. Although they provide a wealth of expression data, it remains challenging to integrate results from different studies. In chapter 6 the methodology of an unsupervised meta-analysis of genome-wide A. thaliana gene expression data sets is presented, which yields novel insights in function and regulation of genes. The application of kernel-based principal component analysis in combination with hierarchical clustering identified three major groups of contrasts each sharing overlapping expression profiles. Genes associated with two groups are known to play important roles in Indol-3 acetic acid (IAA) mediated plant growth and development as well as in pathogen defence. Yet uncharacterised serine-threonine kinases could be assigned to novel functions in pathogen defence by meta-analysis. In general, hidden interrelation between genes regulated under different conditions could be unravelled by the described approach. HMMs are applied to the functional characterisation of proteins or the detection of genes in genome sequences. Although HMMs are technically mature and widely applied in computational biology, I demonstrate the methodical optimisation with respect to the modelling accuracy on biological data with various distributions of sequence lengths. The subunits of these models, the states, are associated with a certain holding time being the link to length distributions of represented sequences. An adaptation of simple HMM topologies to bell-shaped length distributions described in chapter 7 was achieved by serial chain-linking of single states, while residing in the class of conventional HMMs. The impact of an optimisation of HMM topologies was underlined by performance evaluations with differently adjusted HMM topologies. In summary, a general methodology was introduced to improve the modelling behaviour of HMMs by topological optimisation with maximum likelihood and a fast and easily implementable moment estimator. Chapter 8 describes the application of HMMs to the prediction of interaction sites in protein domains. As previously demonstrated, these sites are not trivial to predict because of varying degree in conservation of their location and type within the domain family. The prediction of interaction sites in protein domains is achieved by a newly defined HMM topology, which incorporates both sequence and structure information. Posterior decoding is applied to the prediction of interaction sites providing additional information of the probability of an interaction for all sequence positions. The implementation of interaction profile HMMs (ipHMMs) is based on the well established profile HMMs and inherits its known efficiency and sensitivity. The large-scale prediction of interaction sites by ipHMMs explained protein dysfunctions caused by mutations that are associated to inheritable diseases like different types of cancer or muscular dystrophy. As already demonstrated by profile HMMs, the ipHMMs are suitable for large-scale applications. Overall, the HMM-based method enhances the prediction quality of interaction sites and improves the understanding of the molecular background of inheritable diseases. With respect to current and future requirements I provide large-scale solutions for the characterisation of biological data in this work. All described methods feature a highly portable character, which allows for the transfer to related topics or organisms, respectively. Special emphasis was put on the knowledge transfer facilitated by a steadily increasing wealth of biological information. The applied and developed statistical methods largely provide learning capacities and hence benefit from the gain of knowledge resulting in increased prediction accuracies and reliability. N2 - Die aktuellen Fortschritte und Entwicklungen in der Molekularbiologie stellen eine Fülle neuer, bisher kaum analysierter Daten bereit. Dieser Fundus umfasst unter Anderem biologische Daten zu genomischer DNA, zu Proteinsequenzen, zu dreidimensionalen Proteinstrukturen sowie zu Genexpressionsprofilen. In der vorliegenden Arbeit werden diese Informationen genutzt, um neue Methoden der Charakterisierung und Klassifizierung von Organismen bzw. Organismengruppen zu entwickeln und einen automatisierten Informationsgewinn sowie eine Informationsübertragung zu ermöglichen. Die ersten beiden vorgestellten Ansätze (Kapitel 4 und 5) konzentrieren sich auf die medizinisch und wissenschaftlich bedeutsame Gruppe der Enterobakterien. Deren Bedeutung für Medizin und Mikrobiologie geht auf ihre Funktion als kommensale Bewohner des Darmtraktes, ihre Nutzung als leicht kultivierbare Modellorganismen und auf die vielseitigen Infektionsmechanismen zurück. Obwohl bereits viele Studien über einzelne Pathogruppen mit klinisch unterscheidbaren Symptomen existieren, sind die genotypischen Faktoren, die für diese Unterschiedlichkeit verantwortlich zeichnen, teilweise noch nicht bekannt. Der in Kapitel 4 beschriebene umfassende Genomvergleich wurde anhand einer Vielzahl von Enterobakterien durchgeführt, die nahezu die gesamte Bandbreite klinisch relevanter Diversität darstellen. Dieser Genomvergleich bildet die Basis für eine Charakterisierung des enterobakteriellen Genpools, für eine Rekonstruktion evolutionärer Prozesse und Einflüsse und für eine umfassende Untersuchung spezifischer Proteinfamilien in enterobakteriellen Untergruppen. Die in diesem Kontext vorher noch nicht angewandte Korrespondenzanalyse liefert qualitative Aussagen zu bakteriellen Untergruppen und den ausschließlich in ihnen vorkommenden Proteinfamilien. In drei Hauptuntergruppen der Enterobakterien, die den Gattungen Yersinia und Salmonella sowie der Gruppe aus Shigella und E. coli entsprechen, wurden die jeweils spezifischen Proteinfamilien mit Hilfe statistischer Tests identifiziert. Zusammenfassend bilden die auf Genomvergleichen aufbauenden Methoden neue Ansatzpunkte, um aus der Übertragung der bekannten Funktionalität einzelner Proteine auf spezifische, genotypische Besonderheiten bakterieller Gruppen zu schließen. Aufgrund ihrer hohen medizinischen Relevanz war die Typisierung enterobakterieller Isolate entsprechend ihrer Pathogenität Ziel zahlreicher Studien. Die Microarray-Technologie bietet ein schnelles, reproduzierbares und standardisierbares Hilfsmittel für bakterielle Typisierung und hat sich in der Bakteriendiagnostik, Risikobewertung und Überwachung bewährt. Das in Kapitel 5 beschriebene Design eines diagnostischen Microarray beruht auf einer großen Anzahl verfügbarer Genomsequenzen von Enterobakterien. Ein hocheffizienter String-Matching-Algorithmus ist die Grundlage einer neuartigen Strategie der Sondenauswahl, die sowohl kodierende als auch nicht-kodierende Bereiche genomischer DNA berücksichtigt. Im Vergleich zu Diagnostika, die ausschließlich auf Virulenz-assoziierten Sonden beruhen, verringert dieses Prinzip das Risiko einer inkorrekten Typisierung. Zusätzliche Sonden erweitern das Anwendungsspektrum auf eine simultane Diagnostik der Antibiotikaresistenz bzw. eine Überwachung der Resistenzausbreitung. Umfangreiche Testhybridisierungen belegen eine überwiegende Zuverlässigkeit der Sonden und vor allem eine robuste Klassifizierung enterobakterieller Stämme entsprechend der Pathogruppen. Die Tests bilden zudem die Grundlage für das Training eines Regressionsmodells zur Klassifizierung der Pathogruppe und zur Vorhersage der Menge hybridisierter DNA. Das Regressionsmodell zeichnet sich durch kontinuierliche Lernfähigkeit und damit durch eine Verbesserung der Vorhersagequalität im Prozess der Anwendung aus. Ein Teil der Sonden repräsentiert intergenische DNA und bestätigt infolgedessen die Relevanz der zugrunde liegenden Strategie. Die Tatsache, dass ein großer Teil der von den Sonden repräsentierten Gene noch nicht annotiert ist, legt die Existenz bisher unentdeckter Faktoren mit Bedeutung für die Ausbildung entsprechender Virulenz-Phänotypen nahe. Ein weiteres Haupteinsatzgebiet von Microarrays ist die Genexpressionsanalyse. Die Größe von Genexpressionsdatenbanken ist in den vergangenen Jahren stark gewachsen. Obwohl sie eine Fülle von Expressionsdaten bieten, sind Ergebnisse aus unterschiedlichen Studien weiterhin schwer in einen übergreifenden Zusammenhang zu bringen. In Kapitel 6 wird die Methodik einer ausschließlich datenbasierten Meta-Analyse für genomweite A. thaliana Genexpressionsdatensätze dargestellt, die neue Erkenntnisse über Funktion und Regulation von Genen verspricht. Die Anwendung von Kernel-basierter Hauptkomponentenanalyse in Kombination mit hierarchischem Clustering identifizierte drei Hauptgruppen von Kontrastexperimenten mit jeweils überlappenden Expressionsmustern. In zwei Gruppen konnten deregulierte Gene wichtigen Funktionen bei Indol-3-Essigsäure (IAA) vermitteltem Pflanzenwachstum und -entwicklung sowie pflanzlicher Pathogenabwehr zugeordnet werden. Bisher funktionell nicht näher charakterisierte Serin-Threonin-Kinasen wurden über die Meta-Analyse mit der Pathogenabwehr assoziiert. Grundsätzlich kann dieser Ansatz versteckte Wechselbeziehungen zwischen Genen aufdecken, die unter verschiedenen Bedingungen reguliert werden. Bei der funktionellen Charakterisierung von Proteinen oder der Vorhersage von Genen in Genomsequenzen werden Hidden-Markov-Modelle (HMMs) eingesetzt. HMMs sind technisch ausgereift und in der computergestützten Biologie vielfach eingesetzt worden. Trotzdem birgt die Methodik das Potential zur Optimierung bezüglich der Modellierung biologischer Daten, die hinsichtlich der Längenverteilung ihrer Sequenzen variieren. Untereinheiten dieser Modelle, die Zustände, repräsentieren über ihre individuelle Verweildauer zugrunde liegende Verteilungen von Sequenzlängen. Kapitel 7 stellt eine Methode zur Anpassung einfacher HMM-Topologien an biologische Daten, die glockenkurvenartige Längenverteilungen zeigen, vor. Die Modellierung solcher Verteilungen wird dabei durch eine serielle Verkettung vervielfältigter Zustände gewährleistet, ohne dass die Klasse herkömmlicher HMMs verlassen wird. Auswertungen der Modellierungsleistung bei unterschiedlich stark optimierten HMM-Topologien unterstreichen die Bedeutung der entwickelten Topologieoptimierung. Zusammenfassend wird hier eine generelle Methodik beschrieben, die die Modelleigenschaften von HMMs über Topologieoptimierungen verbessert. Die Parameter dieser Optimierung werden mit Hilfe von Maximum-Likelihood und einem leicht einzubindenden Momentschätzer bestimmt. In Kapitel 8 wird die Anwendung von HMMs zur Vorhersage von Interaktionsstellen in Proteindomänen beschrieben. Wie bereits gezeigt wurde, sind solche Stellen aufgrund einer variablen Konserviertheit ihrer Position und ihres Typs schwer zu bestimmen. Eine Vorhersage von Interaktionstellen in Proteindomänen wird über die Definition einer neuen HMM-Topologie erreicht, die sowohl Sequenz- als auch Strukturdaten einbindet. Interaktionsstellen werden mit einem Posterior-Decoding-Algorithmus vorhergesagt, der zusätzliche Informationen über die Wahrscheinlichkeit einer Interaktion für alle Sequenzpositionen bereitstellt. Die Implementierung der Interaktionsprofil-HMMs (ipHMMs) basiert auf den etablierten Profil-HMMs und erbt deren Effizienz und Sensitivität. Eine groß angelegte Vorhersage von Interaktionsstellen mit ipHMMs konnte mutationsbedingte Fehlfunktionen in Proteinen erklären, die mit vererbbaren Krankheiten wie unterschiedlichen Tumortypen oder Muskeldystrophie assoziiert sind. Wie Profile-HMMs sind auch ipHMMs für groß angelegte Anwendungen geeignet. Insgesamt verbessert die HMM-gestützte Methode sowohl die Vorhersagequalität für Interaktionsstellen als auch das Verständnis molekularer Hintergründe bei vererbbaren Krankheiten. Im Hinblick auf aktuelle und zukünftige Anforderungen stelle ich in dieser Arbeit Lösungsansätze für eine umfassende Charakterisierung großer Mengen biologischer Daten vor. Alle beschriebenen Methoden zeichnen sich durch gute Übertragbarkeit auf verwandte Probleme aus. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf den Wissenstransfer gelegt, der durch einen stetig wachsenden Fundus biologischer Information ermöglicht wird. Die angewandten und entwickelten statistischen Methoden sind lernfähig und profitieren von diesem Wissenszuwachs, Vorhersagequalität und Zuverlässigkeit der Ergebnisse verbessern sich. KW - Genomik KW - Hidden-Markov-Modell KW - Enterobacteriaceae KW - Genexpression KW - Microarray KW - Sequenzanalyse KW - diagnostischer Microarray KW - Sequence Analysis KW - diagnostic Microarray Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39858 ER - TY - THES A1 - Stoll, Sascha T1 - Funktionelle Analyse von Blochmannia floridanus, dem primären Endosymbionten der Rossameise Camponotus floridanus T1 - Functional analysis of Blochmannia floridanus, the primary endosymbiont of the carpenter ant Camponotus floridanus N2 - Ameisen der Gattung Camponotus beherbergen bakterielle Symbionten der Gattung Blochmannia in spezialisierten Zellen des Mitteldarms (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schröder et al., 1996). Die Genomsequenzierung dieser Symbionten zeigte, dass Blochmannia, ähnlich den Symbionten von Blattläusen, hauptsächlich Gene der Aminosäurebiosynthese beibehalten hat (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). Die Relevanz dieser nahrungsaufwertenden Funktion konnte experimentell bestätigt werden (Feldhaar et al., 2007). Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der dynamischen Interaktion der beiden Partner während des komplexen Lebenszyklus des holometabolen Wirtes. Frühere Studien deuteten darauf hin, dass die Symbiose vor allem während der Larven- und Puppenphasen von Bedeutung sein könnte (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). Mit fluoreszenter in situ Hybridisierung (FISH) und konfokaler Laserscanning Mikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit die Lokalisierung von B. floridanus während der wichtigsten Entwicklungsstadien aufgeklärt werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Symbionten schon im ersten Larvenstadium in spezialisierten Zellen um den Darm angeordnet sind, aber in späteren Stadien nicht, wie bisher angenommen, auf diese Bakteriozyten beschränkt sind, sondern bis zum Schlupf der jungen Arbeiterinnen massiv andere Darmzellen infizieren. Übereinstimmend mit Bestimmungen der Zellzahl in den verschiedenen Wirtsstadien ist die Anzahl der Symbionten gegen Ende der Metamorphose am höchsten. Die Symbiose degeneriert in sehr alten Arbeiterinnen, gut gefüllte Bakteriozyten werden jedoch noch monatelang beibehalten. Mit Macroarray- und qRT- PCR- basierten Transkriptomanalysen wurde die Expression der bakteriellen Gene in charakteristischen Entwicklungsstadien des Wirtes untersucht. Allgemein zeigen vor allem Gene für molekulare Chaperons und bestimmte bakterielle Grundfunktionen eine hohe Expression. Aber auch viele Gene, die möglicherweise wichtige Funktionen in der Symbiose besitzen, wie die Biosynthese essentieller Aminosäuren und das Recycling von Stickstoffverbindungen, zeigen ein hohes absolutes Transkriptlevel. Zudem besteht eine positive Korrelation zwischen dem Expressionsniveau und dem GC- Gehalt der Gene, die in dem höheren Selektionsdruck und damit einer geringeren Mutationsrate der essentiellen Gene begründet liegt (Schaber et al., 2005). Durch Proteinanalysen konnte bestätigt werden, dass die Faktoren mit der höchsten absoluten Transkription die dominanten Proteine der Symbionten darstellen. In den unterschiedlichen Entwicklungsstadien zeigen viele Gene eine deutliche Dynamik, deren Ausmaß aber, verglichen mit freilebenden Bakterien, gering ist. Aus den Expressionsprofilen aufeinanderfolgender Gene lassen sich mögliche Transkriptionseinheiten ableiten, die teilweise auch experimentell bestätigt wurden. Oftmals zeigen auch Gene, die nicht in Transkriptionseinheiten angeordnet sind, aber verwandten Stoffwechselwegen angehören, ähnliche Muster. Dies deutet auf das Vorhandensein grundlegender Genregulations-mechanismen hin, obwohl im Genom von B. floridanus nur noch sehr wenige Transkriptionsfaktoren codiert sind (Gil et al., 2003). Auf übergeordneter Ebene zeigt sich, dass bei Symbionten aus späten Puppenstadien viele symbioserelevante Gene im Vergleich zu Genen des Grundmetabolismus eine erhöhte Expression zeigen. Dies betrifft besonders die Biosynthese aromatischer und verzweigter Aminosäuren, die in diesen Stadien vom Wirt in hoher Menge benötigt werden, während die internen Reserven gleichzeitig zur Neige gehen. Dies äußert sich auch im deutlichen Abfallen der Speicherproteinmenge des Wirts gegen Ende der Puppenphase. Die festgestellte Veränderung der Symbiontenzahl übertrifft das geringe Ausmaß der Genregulation um ein Vielfaches. Die Bakterien liegen in jedem Stadium polyploid mit bis zu 100 Genomkopien vor, dieser Polyploidiegrad bleibt jedoch während der gesamten Wirtsentwicklung weitestgehend konstant. Somit scheint die Kontrolle des Wirts über die bakterielle Vermehrung der entscheidende Faktor dieser Symbiose zu sein. Die verbleibenden regulatorischen Fähigkeiten der Bakterien stellen möglicherweise eine Feinjustierung von optimierten Produktionseinheiten dar, deren Anzahl nach den Bedürfnissen des Wirtes verändert wird. Insgesamt konnten in der vorliegenden Arbeit neue Einblicke in das komplexe Zusammenleben von Blochmannia und Camponotus gewonnen werden, die zu einem besseren Verständnis der biologischen Funktion und der grundlegenden Mechanismen dieser Symbiose führen. Eine der wichtigsten Fragestellungen nach dem Sinn einer nahrungsaufwertenden Symbiose für einen Nahrungsgeneralisten konnte mit starken Hinweisen auf eine stadienabhängige Relevanz der Symbiose beantwortet werden, die den enormen evolutionären Erfolg dieser Ameisengattung erklären könnte.  N2 - Ants of the genus Camponotus harbor bacterial endosymbionts of the genus Blochmannia in specialized cells of their midgut (Blochmann, 1882; Buchner, 1965; Sauer, 2000; Schröder et al., 1996). The complete sequencing of the symbiont’s genome revealed, that Blochmannia, comparable to the symbionts of aphids, mainly retained genes involved in the biosynthesis of essential amino acids (Degnan et al., 2005; Gil et al., 2003). The biological relevance of a nutritional upgrading by Blochmannia could be confirmed experimentally (Feldhaar et al., 2007). One focus of this thesis was the elucidation of the dynamic interactions between the two partners during the complex life cycle of the holometabolic host animal. Previous studies pointed towards a temporal relevance of this symbiosis especially during larval and pupal development (Feldhaar et al., 2007; Wolschin et al., 2004; Zientz et al., 2006). In this thesis the localization of B. floridanus could be documented throughout all life stages of the host by fluorescent in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy. A layer of densely filled bacteriocytes surrounding the gut could already be identified in first instar larvae. In contrast to previous assumptions, the bacteria are not restricted to these cells in later stages, as until the eclosion of the young adult workers bacteria massively infect other midgut cells. Concordant with previous findings, bacterial load is highest at the end of metamorphosis and symbiont numbers decrease in older workers, yet densely filled bacteriocytes are still visible after several months. The expression of the bacterial genes during characteristic life stages of the C. floridanus was assessed by macroarray and qRT- PCR- based experiments. In general, especially molecular chaperones, central basic metabolism and may putative symbiosis related factors like pathways leading to essential amino acids or nitrogen recycling show highest absolute expression levels. A positive correlation between expression level and GC- content of the genes can be observed, which is caused by a higher selection pressure and lower mutation rate of these essential factors (Schaber et al., 2005). Protein analyses confirmed the correlation between gene expression and translation of the most abundant factors. Many B. floridanus genes exhibit a dynamic expression during the different host stages but the extent of this gene regulation is modest as compared to free living bacteria. Expression profiles of genes located next to each other on the genome allow proposal of local transcription units, which were confirmed experimentally in several cases. Often genes that are not clustered locally but belong to related metabolic functions also exhibit similar expression patterns. This indicates the existence of basic mechanisms of gene regulation despite the low number of transcription factors annotated in the B. floridanus genome (Gil et al., 2003). In late pupal stages symbiosis related genes often show a higher expression compared to basic metabolic functions. This especially includes biosynthetic pathways for aromatic and branched amino acids, which are needed by the host at this stage in increased amounts, while internal storages are depleted. This could be demonstrated by the significant decrease in storage proteins of the host at the end of the pupal phase. The observed change in bacterial numbers per host exceeds the extent of bacterial gene regulation by far. The symbionts are polyploid in each host stage with up to 100 genome copies per cell. The degree of polyploidy is largely constant during host development. Thus the control over bacterial reproduction seems to be the decisive factor in this symbiosis. The residual regulatory capacities of the symbionts might represent a mechanism of fine tuning of a production unit that has been streamlined by evolution and whose numbers are adjusted according to the host’s needs. In conclusion, this thesis delivers new insights into the complex symbiosis of Blochmannia and Camponotus leading to a better understanding of its biological function and the underlying mechanisms. One of the central mysteries concerning the need of a symbiont for nutritional upgrading for an omnivorous host could be explained by a temporal, stage- dependent relevance of this symbiosis, possibly being the reason for the enormous evolutionary success of this ant genus. KW - Intrazelluläre Symbiose KW - Symbiose KW - Ameisen KW - Mikrobiologie KW - Gram-negative Bakterien KW - Bakterien KW - Differentielle Genexpression KW - Genexpression KW - Entwicklung KW - Blochmannia KW - Camponotus KW - symbiosis KW - endosymbiosis KW - ants KW - bacteria KW - gene expression Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37238 ER - TY - THES A1 - Li, Naixin T1 - Dorso-ventral Differentiation and Specification of the Mesencephalon in Early Chick Embryos T1 - Die dorsoventrale Differenzierung und Spezifikation des frühen embryonalen Hühnermittelhirn N2 - The chick midbrain is subdivided into functionally distinct ventral and dorsal domains, tegmentum and optic tectum. In the mature tectum, neurons are organized in layers, while they form discrete nuclei in the tegmentum. An interesting characteristic of the embryonic brain is the development of a large optic tectum, of which the growth becomes obvious at embryonic day 3 (E3). Dorsoventral (DV) specification of the early midbrain should thus play a crucial role for the organization of the neuronal circuitry in optic tectum and tegmentum. In the first part of my thesis, I investigated regional commitment and establishment of cellular differences along the midbrain DV axis. I examined the commitment of gene expression patterns in isolated ventral and dorsal tissue in vivo and in vitro, and studied their cell mixing properties. Explant cultures, and grafting of dorsal midbrain into a ventral environment or vice versa, revealed a gradual increase in the autonomy of region-specific gene regulation between, which was accompanied by a gradual increase in differential adhesive properties from E2 to E3, once the DV axis polarity was fixed. These events happened at a time-point when the majority of midbrain cells are not yet differentiated. Long-term transplantation (6 - 9 days) using quail cells from ventral midbrain as grafts showed the same result. Hence, the results suggest that progressive specification of the midbrain DV axis is accompanied by progressively reduced cell mixing between dorsal and ventral precursors, leading to a partial regionalization of midbrain tissue into autonomous units of precursor cell populations. In the second part I investigated the genes that might be involved in regulating the growth of the tectum. In particular, I focused on the role of Pax7 transcription factor, a paired domain protein. The results suggested that Pax7 was involved in regulating the medial-lateral extension of the tectum. Over expression of Pax7 in dorsal midbrain led to an enlarged tectum accompanied by a raise in cell division, while Pax7 knockdown by shrank caused a reduction in tectum. The overall pattern of neuronal differentiation was not disturbed by an up or down regulation of Pax7. Pax7 also positively regulated Pax3, another pair-ruled gene expressed dorsally. These results suggest that Pax7 very likely together with Pax3 could facilitate or maintain neural cell proliferation in the midbrain at early stages and that a regulation of the size in that region does not influence the neuronal patterning of the developmental field. I further checked the expression and function of a GFPase Rab 23, that was suggested to be involved in the DV patterning in mouse neural tube as a negative regulator of Shh signaling. Overexpression of Rab23 indicated that it facilitated the expression of Pax7 and Pax3 in the neural tube and suppressed ventral genes like Nkx6.1 cell autonomously, however, it did not disturb neuronal patterning. Interestingly, a thorough expression study of Rab 23 during chick early development revealed that Rab23 is already expressed very early and asymmetrically during gastrulation, suggesting a possible role of Rab23 on the left-right determination of Hensen’s node. In combination with the result that Rab23 is expressed in the notochord early in development, I assume that both Rab23 and Shh exist in all neural progenitor cells initially, and when their expression patterns separate gradually the neural cells adopt a ventral or dorsal fate according to their location along the dorsoventral axis. The avian embryo is a classic system used widely to investigate questions of vertebrate development. The easy and cheap accessibility of the embryo for in ovo or ex ovo experiments all around the year make it an ideal animal model to work with. The only recently developed method of over expressing genes in specific cells or regions in the chick embryo by electroporation enabled me to study different ways of gene suppression using this way of gene transfection. Thus, I compared the effect of long-hairpin and short hairpin dsRNA in different vectors and antisense morpholino oligonucleotides. The results revealed that all hairpin dsRNA constructs did reduce gene and protein expression often accompanied by morphological changes. Most efficiently were shRNAi constructs cloned into a siRNA-specific vector – pSilencer 1.0-U6. Gene silencing was already well observed 36 hours after transfection. In comparison antisense morpholino oligonucleotides did not show such big gene reduction as the shRNA in pSilencer. Taken together, this methodical research proposes that the shRNA in the pSilencer vector was a good and effective tool to reduce gene and protein expression locally. N2 - Das Mittelhirn des Huhns wird in funktionel unterschiedliche, ventrale und dorsale Regionen eingeteilt, nämlich das Tegmentum ventral und das optisches Tectum dorsal. Im vollentwickelten Tectum bilden Nervenzellen Schichten, während das Tegmentum aus unterschiedlichen Nuclei besteht. Ein charakteristisches Merkmal des embryonalen Gehirns ist die Entwicklung eines großen optischen Techtums, die am dritten embryonalen Tag (E3) sehr deutlich zu beobachten ist. Diese unterschiedliche funktionelle und morphologische Entwicklung des Mittelhirns deutet daraufhin, das die dorsoventrale Spezifikation des frühen Mittelhirns für der Organisation neuronaler Netzwerke im optischen Tectum und Tegmentum eine kritische Rolle spielt. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurde die regionale Bestimmung und Bildung zellulärer Unterschiede entlang der DV Achse des Mittelhirns untersucht. Dafür bestimmte ich den Zeitpunkt, an dem spezifische ventrale und dorsale Genexpressionsmuster festgelegt werden in isoliertem ventralen und dorsalen Gewebe in vivo and in vitro. Desweiteren untersuchte ich die Entwicklung unterschiedlicher adhäsiver Eigenschaften von ventralen und dorsalen Zellen in vitro. Explantatkulturen und Transplantationen von dorsalem Mittelhirn in eine ventrale Umgebung oder vice versa liessen eine schrittweise Zunahme der Autonomie der region-spezifischen Genregulation erkennen. Dies wurde von einer schrittweisen Zunahme des differentialen Adhäsionsverhaltens von ventralen und dorsalen Mittelhirnzellen von E2 zu E3 begleitet, der Zeitspanne, in der die Polarität der DV Achse festgelegt wurde. Diese Entwicklungsprozesse fanden u einem Zeitpunkt statt, an dem die meisten Zellen des Mittelhirns noch nicht differenziert hatten. Transplantationen,. von ventralen Mittelhirnzellen der Wachtel ins dorsale Hühnertecctum, die erst nach mehreren Tagen (6 - 9 Tage) untersucht wurden, zeigten das gleiche Ergebnis. Diese Ergebnisse lassen schliessen, dass eine partielle Regionalisierung des Mittelhirns in autonome Einheiten von Vorläuferzellen der dorsoventralen Achse stattfindet. Dies erlaubt den Zellen eine Positionsidentität zu bewahren – unhabhängig von der wachsenden Distanz zu Signalzentren. Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich Gene, die das Wachstum und die spezifische Entwicklung des Tectums regulieren könnten. Die Arbeit konzentrierte sich speziell auf die Rolle von Pax7, ein Mitglied der sogenannten ‚pair-ruled’ Familie von Transkriptionsfaktoren, und auf die Rolle von Rab23, einer GTPase, die den Shh-Signalweg im dorsalen Neuralrohr inhibiert. Dieser Versuch zeigte, dass Pax7 an der Regulation der medio-lateral Ausdehnung des Tectums beteiligt ist. Überexpression von Pax7 im dorsalen Mittelhirn führte zu einer Vergrößerung des Tectums, die von einer Zunahme der Zellteilung begleitet wurde, während Knockdown von Pax7 eine Größereduktion des Tectums verursachte. Das neuronale Differenzierungsmuster im generellen wurde nicht von der Überexpression oder Repression von Pax7 gestört. Pax7 induzierte ausserdem Pax3, ein Mitglied derselben Familie, das ebenfalls dorsal exprimiert wird und unterdrückte ventrale Gene wie Nkx6.1. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Pax7, sehr wahrscheinlich zusammen mit Pax3, die neural Zellproliferation im Mittelhirn in frühen Entwicklungsstadien fördert oder auf einem konstanten Level hält und dass die Muster der neuronalen Entwicklung nicht durch der Regulation der Größe dieser Region beeinflusst wird. Außerdem förderte Rab 23, das sehr wahrscheinlich ein negativer Regulator von Shh ist, die Expression von Pax7 und Pax3 im ventralen Mittelhirn und unterdrückte ventrale Gene wie Nkx6.1. Die Überexpression von Rab 23 beeinflusste auch nicht das neuronale Differenzierungsmusterung. Interessanterweise zeigte eine genaue Analyse der Expression von Rab 23 während der frühen Entwicklungsstadien des Huhns, dass Rab 23 bereits sehr früh und asymmetrisch während der Gastrulation exprimiert wurde. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von Rab 23 für die links-rechts Determination des Hensen´s node an. Betrachtet man diese Ergebnisse zusammen, dann könnte man zu fogender Schlussfolgerung kommen, nämlich, dass sowohl Rab 23 als auch Shh früh in allen neural Progenitorzellen existieren, und dass die neuralen Zellen jeweils nach ihrer Lage entlang der dorsoventral Achse ein ventrales oder dorsales Schicksal annehmen, wenn das sich die Expressionsmuster von Rab 23 und Shh allmänlich trennen. Der Vogelembryo ist ein klassisches und häufig benutztes System, um die Entwicklung der Vertebraten zu untersuchen. Die einfache und preiswerte Zugänglichkeit des Embryos für in ovo oder ex ovo Experiment das ganze Jahr über machen ihn zu einem idealen Tiermodell. Die in den letzten Jahren entwickelte Methode der Elektroporation eines Embryos zum Gentransfer in die Zellen, ermöglichte es mir unterschiedliche Weisen der Genunterdrückung in embryonalem Gewebe zu testen und zu vergleichen.Ich verglich in dieser Untersuchung die Wirkung von langen und kurzen Haarnadel-RNAs (hairpin RNA) in verschieden Vektoren mit der Wirkung von Antisense-morpholino-Oligonucleotiden verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Haarnadel-dsRNA-Konstruktionen die Gen- und Proteinexpression reduzierten, wobei es häufig zu einer morphologischen Veränderung kam. Die kurze shRNAi-Konstruktionen, die in einen siRNA-spezifischen Vektor – pSilencer 1.0-U6 - geklont wurden war, zeigte sich dabei am effizientesten.. Die Herunterregulierung der Gene wurde bereits 36 Stunden nach der Transfektion beobachtet. Im Gegensatz dazu, zeigten die Antisense-Morpholino-Oligonucleotiden keine solche starke Reduktion wie das shRNA in pSilencer. Zusammenfassend zeigt diese methodische Untersuchung, dass die shRNA im pSilencer-Vektor ein gutes und effektives Werkzeug ist, um Gen- und Proteinexpression örtlich zu reduzieren. KW - Differenzierung KW - Embryo KW - Genexpression KW - Mittelhirn KW - Spezifikation KW - Dorso-ventral Patterning KW - Mesencephalon KW - Morpholino KW - Neuronal Proliferation KW - Pax3 KW - Pax7 KW - Rab23 KW - Shh KW - siRNA KW - Transplantation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32950 ER - TY - THES A1 - Engelmann, Julia Cathérine T1 - DNA microarrays: applications and novel approaches for analysis and interpretation T1 - DNA Mikroarrays: Anwendungen und neue Ansätze für die Analyse und Interpretation N2 - In der vorliegenden Dissertation wird die Entwicklung eines phylogenetischen DNA Microarrays, die Analyse von mehreren Microarray-Genexpressionsdatensätzen und neue Ansätze für die Datenanalyse und Interpretation der Ergebnisse vorgestellt. Die Entwicklung und Analyse der Daten eines phylogenetischen DNA Microarrays wird in der ersten Publikation dargestellt. Ich konnte zeigen, dass die Spezies-Detektion mit phylogenetischen Microarrays durch die Datenanalyse mit einem linearen Regressionsansatz signifikant verbessert werden kann. Standard-Methoden haben bislang nur Signalintensitäten betrachtet und eine Spezies als an- oder abwesend bezeichnet, wenn die Signalintensität ihres Messpunktes oberhalb eines willkürlich gesetzten Schwellenwertes lag. Dieses Verfahren ist allerdings aufgrund von Kreuz-Hybridisierungen nicht auf sehr nah verwandte Spezies mit hoher Sequenzidentität anwendbar. Durch die Modellierung des Hybridisierungs und Kreuz-Hybridisierungsverhaltens mit einem linearen Regressionsmodell konnte ich zeigen, dass Spezies mit einer Sequenzähnlichkeit von 97% im Markergen immer noch unterschieden werden können. Ein weiterer Vorteil der Modellierung ist, dass auch Mischungen verschiedener Spezies zuverlässig vorhergesagt werden können. Theoretisch sind auch quantitative Vorhersagen mit diesem Modell möglich. Um die großen Datenmengen, die in öffentlichen Microarray-Datenbanken abgelegt sind besser nutzen zu können, bieten sich Meta-Analysen an. In der zweiten Publikation wird eine explorative Meta-Analyse auf Arabidopsis thaliana-Datensätzen vorgestellt. Mit der Analyse verschiedener Datensätze, die den Einfluss von Pflanzenhormonen, Pathogenen oder verschiedenen Mutationen auf die Genexpression untersucht haben, konnten die Datensätze anhand ihrer Genexpressionsprofile in drei große Gruppen eingeordnet werden: Experimente mit Indol-3-Essigsäure (IAA), mit Pathogenen und andere Experimente. Gene, die charakteristisch für die Gruppe der IAA-Datensätze beziehungsweise für die Gruppe der Pathogen-Datensätze sind, wurden näher betrachtet. Diese Gene hatten Funktionen, die bereits mit Pathogenbefall bzw. dem Einfluss von IAA in Verbindung gebracht wurden. Außerdem wurden Hypothesen über die Funktionen von bislang nicht annotierten Genen aufgestellt. In dieser Arbeit werden auch Primäranalysen von einzelnen Arabidopsis thaliana Genexpressions-Datensätzen vorgestellt. In der dritten Publikation wird ein Experiment beschrieben, das durchgeführt wurde um herauszufinden ob Mikrowellen-Strahlung einen Einfluss auf die Genexpression einer Zellkultur hat. Dazu wurden explorative Analysemethoden angewendet. Es wurden geringe aber signifikante Veränderungen in einer sehr kleinen Anzahl von Genen beobachtet, die experimentell bestätigt werden konnten. Die Funktionen der regulierten Gene und eine Meta-Analyse mit öffentlich zugänglichen Datensätzen einer Datenbank deuten darauf hin, dass die pflanzliche Zellkultur die Strahlung als eine Art Energiequelle ähnlich dem Licht wahrnimmt. Des weiteren wird in der vierten Publikation die funktionelle Analyse eines Arabidopsis thaliana Genexpressionsdatensatzes beschrieben. Die Analyse der Genexpressions eines pflanzlichen Tumores zeigte, dass er seinen Stoffwechsel von aerob und auxotroph auf anaerob und heterotroph umstellt. Gene der Photosynthese werden im Tumorgewebe reprimiert, Gene des Aminosäure- und Fettstoffwechsels, der Zellwand und Transportkanäle werden so reguliert, dass Wachstum und Entwicklung des Tumors gefördert werden. In der fünften Publikation in dieser Arbeit wird GEPAT (Genome Expression Pathway Analysis Tool) beschrieben. Es besteht aus einer Internet- Anwendung und einer Datenbank, die das einfache Hochladen von Datensätzen in die Datenbank und viele Möglichkeiten der Datenanalyse und die Integration anderer Datentypen erlaubt. In den folgenden zwei Publikationen (Publikation 6 und Publikation 7) wird GEPAT auf humane Microarray-Datensätze angewendet um Genexpressionsdaten mit weiteren Datentypen zu verknüpfen. Genexpressionsdaten und Daten aus vergleichender Genom-Hybridisierung (CGH) von primären Tumoren von 71 Mantel-Zell-Lymphom (MCL) Patienten ermöglichte die Ermittlung eines Prädiktors, der die Vorhersage der Überlebensdauer von Patienten gegenüber herkömmlichen Methoden verbessert. Die Analyse der CGH Daten zeigte, dass auch diese für die Vorhersage der Überlebensdauer geeignet sind. Für den Datensatz von Patienten mit großzellig diffusem B-Zell-Lymphom DLBCL konnte aus den Genexpressionsdaten ebenfalls ein neuer Prädiktor vorgeschlagen werden. Mit den zwischen lang und kurz überlebenden Patienten differentiell exprimierten Genen der MCL Patienten und mit den Genen, die zwischen den beiden Untergruppen von DLBCL reguliert sind, wurden Interaktionsnetzwerke gebildet. Diese zeigen, dass bei beiden Krebstypen Gene des Zellzyklus und der Proliferation zwischen Patienten mit kurzer und langer Überlebensdauer unterschiedlich reguliert sind. N2 - In this thesis, the development of a phylogenetic DNA microarray, the analysis of several gene expression microarray datasets and new approaches for improved data analysis and interpretation are described. In the first publication, the development and analysis of a phylogenetic microarray is presented. I could show that species detection with phylogenetic DNA microarrays can be significantly improved when the microarray data is analyzed with a linear regression modeling approach. Standard methods have so far relied on pure signal intensities of the array spots and a simple cutoff criterion was applied to call a species present or absent. This procedure is not applicable to very closely related species with high sequence similarity because cross-hybridization of non-target DNA renders species detection impossible based on signal intensities alone. By modeling hybridization and cross-hybridization with linear regression, as I have presented in this thesis, even species with a sequence similarity of 97% in the marker gene can be detected and distinguished from related species. Another advantage of the modeling approach over existing methods is that the model also performs well on mixtures of different species. In principle, also quantitative predictions can be made. To make better use of the large amounts of microarray data stored in public databases, meta-analysis approaches need to be developed. In the second publication, an explorative meta-analysis exemplified on Arabidopsis thaliana gene expression datasets is presented. Integrating datasets studying effects such as the influence of plant hormones, pathogens and different mutations on gene expression levels, clusters of similarly treated datasets could be found. From the clusters of pathogen-treated and indole-3-acetic acid (IAA) treated datasets, representative genes were selected which pointed to functions which had been associated with pathogen attack or IAA effects previously. Additionally, hypotheses about the functions of so far uncharacterized genes could be set up. Thus, this kind of meta-analysis could be used to propose gene functions and their regulation under different conditions. In this work, also primary data analysis of Arabidopsis thaliana datasets is presented. In the third publication, an experiment which was conducted to find out if microwave irradiation has an effect on the gene expression of a plant cell culture is described. During the first steps, the data analysis was carried out blinded and exploratory analysis methods were applied to find out if the irradiation had an effect on gene expression of plant cells. Small but statistically significant changes in a few genes were found and could be experimentally confirmed. From the functions of the regulated genes and a meta-analysis with publicly available microarray data, it could be suspected that the plant cell culture somehow perceived the irradiation as energy, similar to perceiving light rays. The fourth publication describes the functional analysis of another Arabidopsis thaliana gene expression dataset. The gene expression data of the plant tumor dataset pointed to a switch from a mainly aerobic, auxotrophic to an anaerobic and heterotrophic metabolism in the plant tumor. Genes involved in photosynthesis were found to be repressed in tumors; genes of amino acid and lipid metabolism, cell wall and solute transporters were regulated in a way that sustains tumor growth and development. Furthermore, in the fifth publication, GEPAT (Genome Expression Pathway Analysis Tool), a tool for the analysis and integration of microarray data with other data types, is described. It consists of a web application and database which allows comfortable data upload and data analysis. In later chapters of this thesis (publication 6 and publication 7), GEPAT is used to analyze human microarray datasets and to integrate results from gene expression analysis with other datatypes. Gene expression and comparative genomic hybridization data from 71 Mantle Cell Lymphoma (MCL) patients was analyzed and allowed proposing a seven gene predictor which facilitates survival predictions for patients compared to existing predictors. In this study, it was shown that CGH data can be used for survival predictions. For the dataset of Diffuse Large B-cell lymphoma (DLBCL) patients, an improved survival predictor could be found based on the gene expression data. From the genes differentially expressed between long and short surviving MCL patients as well as for regulated genes of DLBCL patients, interaction networks could be set up. They point to differences in regulation for cell cycle and proliferation genes between patients with good and bad prognosis. KW - Microarray KW - Differentielle Genexpression KW - Genexpression KW - Statistische Analyse KW - Cluster-Analyse KW - Datenanalyse KW - Explorative Datenanalyse KW - Non-Hodgkin-Lymphom KW - B-Zell-Lymphom KW - Metabolom KW - Tumorklassifikation KW - Tumor KW - Krebs KW - Schmalwa KW - phylogenetische Arrays KW - Interaktionsnetzwerke KW - lineare Regression KW - DNA microarray KW - gene expression KW - statistical analysis KW - clustering KW - classification KW - interaction networks Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29747 ER - TY - THES A1 - Blenk, Steffen T1 - Bioinformatical analysis of B-cell lymphomas T1 - Bioinformatische Analyse von B-Zell Lymphomen N2 - Background: The frequency of the most observed cancer, Non Hodgkin Lymphoma (NHL), is further rising. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most common of the NHLs. There are two subgroups of DLBCL with different gene expression patterns: ABC (“Activated B-like DLBCL”) and GCB (“Germinal Center B-like DLBCL”). Without therapy the patients often die within a few months, the ABC type exhibits the more aggressive behaviour. A further B-cell lymphoma is the Mantle cell lymphoma (MCL). It is rare and shows very poor prognosis. There is no cure yet. Methods: In this project these B-cell lymphomas were examined with methods from bioinformatics, to find new characteristics or undiscovered events on the molecular level. This would improve understanding and therapy of lymphomas. For this purpose we used survival, gene expression and comparative genomic hybridization (CGH) data. In some clinical studies, you get large data sets, from which one can reveal yet unknown trends. Results (MCL): The published proliferation signature correlates directly with survival. Exploratory analyses of gene expression and CGH data of MCL samples (n=71) revealed a valid grouping according to the median of the proliferation signature values. The second axis of correspondence analysis distinguishes between good and bad prognosis. Statistical testing (moderate t-test, Wilcoxon rank-sum test) showed differences in the cell cycle and delivered a network of kinases, which are responsible for the difference between good and bad prognosis. A set of seven genes (CENPE, CDC20, HPRT1, CDC2, BIRC5, ASPM, IGF2BP3) predicted, similarly well, survival patterns as proliferation signature with 20 genes. Furthermore, some bands could be associated with prognosis in the explorative analysis (chromosome 9: 9p24, 9p23, 9p22, 9p21, 9q33 and 9q34). Results (DLBCL): New normalization of gene expression data of DLBCL patients revealed better separation of risk groups by the 2002 published signature based predictor. We could achieve, similarly well, a separation with six genes. Exploratory analysis of gene expression data could confirm the subgroups ABC and GCB. We recognized a clear difference in early and late cell cycle stages of cell cycle genes, which can separate ABC and GCB. Classical lymphoma and best separating genes form a network, which can classify and explain the ABC and GCB groups. Together with gene sets which identify ABC and GCB we get a network, which can classify and explain the ABC and GCB groups (ASB13, BCL2, BCL6, BCL7A, CCND2, COL3A1, CTGF, FN1, FOXP1, IGHM, IRF4, LMO2, LRMP, MAPK10, MME, MYBL1, NEIL1 and SH3BP5; Altogether these findings are useful for diagnosis, prognosis and therapy (cytostatic drugs). N2 - Hintergrund: Die Häufigkeit von Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL), den am meisten beobachteten Krebserkrankungen, steigt weiter an. Von den aggressiven Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) macht das “großzellige, diffuse B-Zell-Lymphom” (DLBCL) den größten Anteil aus. Durch Genexpressionsmuster wurden zwei Subtypen definiert: ACB (“Activated B-like DLBCL”) und GCB (“Germinal Center B-like DLBCL”). Die Patienten der Gruppe ABC sterben ohne Therapie oft innerhalb weniger Monate, weil der ABC Typ einen aggressiveren Krankheitsverlauf aufweist. Ein weiteres, von einer malignen Entartung der B-Lymphozyten ausgehendes Lymphom, ist das “Mantelzell Lymphom” (MCL). Es tritt selten auf und ist ebenfalls mit einer schlechten Prognose verbunden. Eine vollständige Heilung nach der Therapie ist sehr selten. Methoden: In diesem Projekt wurden diese B-zell Lymphome mit bioinformatischen Methoden untersucht, um auf molekularer Ebene neue Eigenschaften oder bisher unentdeckte Zusammenhänge zu finden. Das würde das Verständnis und damit auch die Therapie voranbringen. Dafür standen uns Überlebens-, Genexpressions- und chromosomale Aberrationsdaten zur Verfügung. Sie sind die bevorzugte Wahl der Mittel, um genetische Veränderungen in Tumorzellen zu bestimmen. Hierbei fallen oft große Datenmengen an, aus welchen man mit bioinformatischen Methoden vorher unerkannte Trends und Hinweise identifizieren kann. Ergebnisse (MCL): Explorative Analysen sowohl der Genexpressions- (zweite Hauptachse der Korrespondenz Analyse) als auch der chromosomalen Aberrationsdaten des Mantelzell-Lymphom zeigten uns hierbei, daß es trotz der linearen Korrelation zwischen der veröffentlichten Proliferationssignatur und der Überlebenszeit sinnvoll ist, in den Patienten (n=71) zwei Ausprägungen zu betrachten: Patienten mit schlechter und mit guter Prognose. Statistische Tests (moderate t-test, Wilcoxon rank-sum test) dieser beiden Typen zeigten Unterschiede im Zellzyklus und ein Netzwerk von Kinasen auf, welche für den Unterschied zwischen guter und schlechter Prognose verantwortlich sind. Sieben Gene (CENPE, CDC20, HPRT1, CDC2, BIRC5, ASPM, IGF2BP3) konnten gefunden werden, die eine ähnliche gute Prognose für Überlebenszeiten ermöglichen, wie eine früher veröffentlichte Proliferationssignatur mit 20 Genen. Außerdem konnten chromosomale Banden durch eine explorative Analyse mit der Prognose assoziiert werden (Chromosom 9: 9p24, 9p23, 9p22, 9p21, 9q33 and 9q34). Ergebnisse (DLBCL): Durch geeignete Normalisierung der Genexpressionsdaten von 248 DLBCL-Patienten trennte der Signatur basierte Predictor die Risikogruppen nun besser auf. Eine ähnlich gute Auftrennung konnte von uns sogar mit sechs Genen erreicht werden. Die explorative Analyse der Genexpressionsdaten konnte die Subtypen ABC und GCB als valide Gruppen bestätigen. In den Genen, die ABC und GCB unterscheiden, ergab sich eine Häufung in späten und frühen Zellzyklusstadien. Klassische Lymphommarker, neu aufgefundene spezielle Gene und Zellzyklusgene bilden ein Netzwerk, das die ABC und GCB Gruppen klassifizieren und Unterschiede in deren Regulation erklären kann (ASB13, BCL2, BCL6, BCL7A, CCND2, COL3A1, CTGF, FN1, FOXP1, IGHM, IRF4, LMO2, LRMP, MAPK10, MME, MYBL1, NEIL1 and SH3BP5. Dies ist auch für die Diagnose, Prognose und Therapie (Zytostatika) interessant. KW - Bioinformatik KW - Genexpression KW - Auswertung KW - B-Zell-Lymphom KW - Diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom KW - Mantelzell-Lymphom KW - Bioinformatics KW - gene expression KW - B-cell lymphoma KW - Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) KW - Mantle cell lymphoma (MCL) Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27421 ER -