TY - THES A1 - Grotemeyer, Alexander T1 - Characterisation and application of new optogenetic tools in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Charakterisierung und Anwendung neuer optogenetischer Werkzeuge in \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Since Channelrhodopsins has been described first and introduced successfully in freely moving animals (Nagel et al., 2003 and 2005), tremendous impact has been made in this interesting field of neuroscience. Subsequently, many different optogenetic tools have been described and used to address long-lasting scientific issues. Furthermore, beside the ‘classical’ Channelrhodopsin-2 (ChR2), basically a cation-selective ion channel, also altered ChR2 descendants, anion selective channels and light-sensitive metabotropic proteins have expanded the optogenetic toolbox. However, in spite of this variety of different tools most researches still pick Channelrhodopsin-2 for their optogenetic approaches due to its well-known kinetics. In this thesis, an improved Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), is described, which might become an useful tool to provide ambitious neuroscientific approaches by dint of its characteristics. Here, ChR2XXM was chosen to investigate the functional consequences of Drosophila larvae lacking latrophilin in their chordotonal organs. Finally, the functionality of GtACR, was checked at the Drosophila NMJ. For a in-depth characterisation, electrophysiology along with behavioural setups was employed. In detail, ChR2XXM was found to have a better cellular expression pattern, high spatiotemporal precision, substantial increased light sensitivity and improved affinity to its chromophore retinal, as compared to ChR2. Employing ChR2XXM, effects of latrophilin (dCIRL) on signal transmission in the chordotonal organ could be clarified with a minimum of side effects, e.g. possible heat response of the chordotonal organ, due to high light sensitivity. Moreover, optogenetic activation of the chordotonal organ, in vivo, led to behavioural changes. Additionally, GtACR1 was found to be effective to inhibit motoneuronal excitation but is accompanied by unexpected side effects. These results demonstrate that further improvement and research of optogenetic tools is highly valuable and required to enable researchers to choose the best fitting optogenetic tool to address their scientific questions. N2 - Seit dem Channelrhodopsine das erste Mal beschrieben und erfolgreich in lebende Tiere eingebracht wurden (Nagel et al., 2003 und 2005), kam es zu einem beträchtlichen Fortschritt in diesem interessanten Gebiet der Neurowissenschaften. In der nachfolgenden Zeit wurden viele verschiedene optogenetische Werkzeuge beschrieben und zur Bearbeitung neurowissenschaftlicher Fragestellungen angewandt. Des Weiteren haben neben dem „klassischen“ Channelrhodopsin-2 (ChR2), ein im Wesentlichen Kation selektiver Kanal, auch modifizierte ChR2 Abkömmlinge, Anion selektive Kanäle und Licht sensitive metabotrope Proteine, die opotogenetische Werkzeugkiste erweitert. Dennoch greifen die meisten Wissenschaftler trotz der Vielfalt an optogenetischen Werkzeugen meist noch zu Channelrhodopsin-2, da seine Wirkungseigenschaften sehr gut erforscht sind. In der nachfolgenden Arbeit wird ein weiterentwickeltes Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), beschrieben. Aufgrund seiner vielfältigen Eigenschaften stellt es ein vielversprechendes Werkzeug dar, vor allem für zukünftige neurowissenschaftliche Forschungsarbeiten. Hierbei wurde ChR2XXM eingesetzt, um zu untersuchen welche Auswirkungen das Fehlen von Latrophilin im Chordotonal Organ von Drosophilalarven hat. Schließlich wurde noch die Funktionalität von GtACR an der neuromuskulären Endplatte der Drosophila überprüft. Für die umfassende Charakterisierung wurden elektrophysiologische und verhaltensbasierte Experimente an Larven durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass ChR2XXM aufgrund einer erhöhten Affinität zu dem Chromophore Retinal, im Vergleich zu ChR2 ein besseres zelluläres Expressionsmuster, eine bessere zeitliche Auflösung und eine erheblich höhere Lichtsensitiviät aufweist. Durch den Einsatz von ChR2XXM konnte, aufgrund der hohen Lichtsensitiviät, mit nur minimalen Nebeneffekten, wie z.B. mögliche Wärmeaktivierung des Chordotonalorgans, der Einfluss von Latrophilin (dCIRL) auf die Signaltransmission im Chordotonalorgan, aufgeklärt werden. Ferner führte eine optogenetische, in vivo, Aktivierung des Chordotonalorgans zu Verhaltensänderungen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass GtACR1 zwar effektiv motoneuronale Erregung inhibieren kann, dies aber von unerwarteten Nebeneffekten begleitet wird. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass weitere Forschung und Verbesserungen im Bereich der optogenetischen Werkzeuge sehr wertvoll und notwendig ist, um Wissenschaftlern zu erlauben das am besten geeignetste optogenetische Werkzeug für ihre wissenschaftlichen Fragestellungen auswählen zu können. KW - Optogenetik KW - Taufliege KW - Elektrophysiologie KW - Channelrhodopsin-2 KW - optogenetics KW - Drosophila melanogaster KW - Channelrhodopsin KW - Electrophysiology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178793 ER - TY - THES A1 - Guan, Chonglin T1 - Functional and genetic dissection of mechanosensory organs of \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Funktionelle und genetische Analyse von mmechanosensorischen Organe in \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - In Drosophila larvae and adults, chordotonal organs (chos) are highly versatile mechanosensors that are essential for proprioception, touch sensation and hearing. Chos share molecular, anatomical and functional properties with the inner ear hair cells of mammals. These multiple similarities make chos powerful models for the molecular study of mechanosensation. In the present study, I have developed a preparation to directly record from the sensory neurons of larval chos (from the lateral chos or lch5) and managed to correlate defined mechanical inputs with the corresponding electrical outputs. The findings of this setup are described in several case studies. (1) The basal functional lch5 parameters, including the time course of response during continuous mechanical stimulation and the recovery time between successive bouts of stimulation, was characterized. (2) The calcium-independent receptor of α-latrotoxin (dCIRL/Latrophilin), an Adhesion class G protein-coupled receptor (aGPCR), is identified as a modulator of the mechanical signals perceived by lch5 neurons. The results indicate that dCIRL/Latrophilin is required for the perception of external and internal mechanical stimuli and shapes the sensitivity of neuronal mechanosensation. (3) By combining this setup with optogenetics, I have confirmed that dCIRL modulates lch5 neuronal activity at the level of their receptor current (sensory encoding) rather than their ability to generate action potentials. (4) dCIRL´s structural properties (e.g. ectodomain length) are essential for the mechanosensitive properties of chordotonal neurons. (5) The versatility of chos also provides an opportunity to study multimodalities at multiple levels. In this context, I performed an experiment to directly record neuronal activities at different temperatures. The results show that both spontaneous and mechanically evoked activity increase in proportion to temperature, suggesting that dCIRL is not required for thermosensation in chos. These findings, from the development of an assay of sound/vibration sensation, to neuronal signal processing, to molecular aspects of mechanosensory transduction, have provided the first insights into the mechanosensitivity of dCIRL. In addition to the functional screening of peripheral sensory neurons, another electrophysiological approach was applied in the central nervous system: dCIRL may impact the excitability of the motor neurons in the ventral nerve cord (VNC). In the second part of my work, whole-cell patch clamp recordings of motor neuron somata demonstrated that action potential firing in the dCirl\(^K\)\(^O\) did not differ from control samples, indicating comparable membrane excitability. N2 - In Drosophila Larven, sowie in adulten Tieren, sind die Chordotonalorgane (Chos) sehr vielseitige Mechanosensoren und von wesentlicher Bedeutung für die Propriozeption, das Tastgefühl und die auditive Wahrnehmung. Chos teilen molekulare, anatomische und funktionelle Eigenschaften mit Innenohrhaarzellen der Säugetiere und machen sie somit zu leistungsstarken Modellen um molekulare Mechanismen der Mechanosensorik zu untersuchen. In der vorliegenden Studie habe ich ein Präparat entwickelt, um direkt von sensorischen Neuronen der larvalen Chos (von lateralen Chos oder lch5) abzuleiten und definierte mechanische Eingänge mit den korrelierenden elektrischen Ausgängen zu verbinden. Im Folgenden sind die Ergebnisse dieses experimentellen Setups zusammengefasst. (1) Die basalen funktionellen Parameter von lch5 insbesondere der Zeitverlauf der Reaktion während kontinuierlicher mechanischer Stimulation und die Erholungszeit zwischen aufeinanderfolgenden Stimulationen wurden bestimmt. (2) Der Calcium-unabhängige Rezeptor von α-Latrotoxin (dCIRL/Latrophilin), ein Adhäsion Klasse G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) wurde als Modulator der von Ich5 Neuronen perzipierten mechanischen Signale identifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass dCIRL/Latrophilin für die Wahrnehmung der externen und internen mechanischen Reize erforderlich ist und die Empfindlichkeit neuronaler Mechanosensorik modelliert. (3) Mit Hilfe optogenetischer Werkzeuge konnte ich bestätigen, dass dCIRL die Aktivität von lch5 Neuronen auf Ebene des Rezeptorstroms (sensorische Kodierung) und nicht der Generierung von Aktionspotentialen moduliert. (4) Die strukturellen Eigenschaften von dCIRL (z.B. Ektodomänenlänge) sind wesentlich für die mechanosensitiven Eigenschaften von Chos. (5) Die Vielseitigkeit der Chos bietet des Weiteren die Möglichkeit, Multimodalitäten auf mehreren Ebenen zu untersuchen. In diesem Zusammenhang wurde die neuronale Aktivität der Chos bei verschiedenen Temperaturen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass sich sowohl spontane als auch mechanisch evozierte Aktivität im Verhältnis zur Temperatur erhöhen, was darauf hindeutet, dass dCIRL keine Rolle in der Temperaturwahrnehmung spielt. Diese Erkenntnisse, von der Entwicklung des Präparats der Ton/Vibrations Wahrnehmung, über die neuronalen Signalverarbeitung bis hin zu molekularen Aspekten der Mechanotransduktion, haben erste Einblicke in die Mechanosensitivität von dCIRL gewährt. Neben der funktionellen Charakterisierung peripherer sensorischer Neurone wurde ein weiterer elektrophysiologischer Ansatz im larvalen Zentralnervensystem gewählt, um zu untersuchen, ob sich dCIRL auf die Erregbarkeit motorischer Nervenzellen im Strickleiternervensystem (VNC) auswirkt. Im zweiten Teil meiner Arbeit wird mit Hilfe des whole-cell-patch-clamp-Verfahrens gezeigt, dass die Aktionspotentialfrequenz in Motoneuronen von dCirl\(^K\)\(^O\) Mutanten ähnlich derer von Kontrolltieren ist, d.h. ihre Membranerregbarkeit ist vergleichbar. KW - Taufliege KW - Drosophila KW - Mechanosensation KW - Adhesion-GPCR KW - Electrophysiology KW - Mechanorezeptor KW - Elektrophysiologie KW - Chordontonal organ Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146220 ER - TY - THES A1 - Kugler, Sabrina T1 - Wirkung von Cannabinoiden auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 T1 - Effects of cannabinoids on the two-pore-domain potassium channels TASK-1 and TASK-3 N2 - In dieser Arbeit wurde die Wirkung der ungesättigten Fettsäure Arachidonsäure, des Endocannabinoids Anandamid und des synthetischen Cannabinoid-Rezeptor-Agonisten WIN55,212-2 auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 untersucht. Dazu wurden an Xenopus Oozyten, denen die entsprechende Kanal-RNA injiziert wurde, in der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme elektrophysiologische Messungen durchgeführt. Zunächst wurden für alle drei Substanzen Dosis-Wirkungs-Beziehungen bestimmt. Diese führten zu folgenden Ergebnissen: • TASK-1 wird durch WIN55,212-2 um bis zu ca. 81% gehemmt. Die IC50 beträgt 0,83 µM. Anandamid besitzt eine IC50 von 1,92 µM und hemmt den Strom um bis zu ca. 71%. Bei WIN55,212-2 bzw. bei Anandamid liegt mit einem Hill-Koeffizienten (nH) von 1,65 bzw. von 1,42 positive Kooperativität vor. Arachidonsäure hingegen inhibiert den Strom nur um bis zu ca. 63%. Die IC50 beträgt 11,3 µM. Der Hill-Koeffizient von 0,9 ergibt negative Kooperativität. • TASK-3 wird durch alle drei Substanzen deutlich weniger inhibiert. Die maximale Inhibition durch WIN55,212-2 [10µM] beträgt 32,4% (± 9,7). Fünf µM Anandamid bzw. 80 µM Arachidonsäure verursachen eine Hemmung um 32,1% (± 5,4) bzw. um 20,3% (± 5,5). Bei beiden Kanalproteinen wurde außerdem untersucht, welche Bedeutung den Aminosäuren in Position 243-248, die bei TASK-1 und TASK-3 mit Ausnahme einer Aminosäure übereinstimmen, bei der Wirkung von Cannabinoiden zukommt. Dazu wurden Mutationsstudien im Bereich des C-Terminus von TASK-1 und TASK-3 durchgeführt. • Es wurden die sechs Aminosäuren in Position 243-248 aus TASK-1 bzw. TASK-3 entfernt (TASK-1 [243-248] bzw. TASK-3 [243-248]). Die inhibitorische Wirkung von WIN55,212-, Anandamid und Arachidonsäure war bei TASK-1 [243-248] deutlich vermindert, während es bei TASK-3 [243-248] zu unterschiedlichen Effekten kam. • Der gesamte C-Terminus des TASK-1 wurde entfernt, mit Ausnahme der sechs Aminosäuren in Position 243-248. Außerdem wurden die endständigen Aminosäuren RSSV an das Restprotein angefügt, da diese für einen gut funktionierenden Transport in die Membran notwendig sind (TASK-1 [249-390RSSV]. Die Wirkungen von WIN55,212-2, Anandamid und Arachidonsäure entsprachen bei dieser Mutante denen, die beim TASK-1 [Wildtyp] beobachtet wurden. • Durch Punktmutation wurde beim TASK-3 Leucin an Position 247 durch Methionin ersetzt (TASK-3 [L247M]. Diese Mutante besitzt dadurch in Position 243-248 das gleiche Sequenzmotiv wie der TASK-1. Im Vergleich zum TASK-3 [Wildtyp] waren die Wirkungen der Cannabinoide bei dieser Mutante jedoch unverändert. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die untersuchten Cannabinoide eine rezeptorunabhängige, spezifische und reversible inhibitorische Wirkung auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 haben. Die Aminosäuren in Position 243-248 sind für diese Wirkung der Cannabinoide von wesentlicher Bedeutung. N2 - Effects of the fatty acid arachidonic acid, the endocannabinoid anandamide and the synthetic cannbinoid receptor agonist WIN55,212-2 on the two-pore-domain potassium channles TASK-1 and TASK-3 were examined using the Xenopus oocyte expression system. Electrophysiological recordings have been performed with the two-electrode-voltage-clamp technique. At first dose-response relationships between the channel-proteins and the cannabinoids have been performed. All three substances had inhibitory effects on both channels. On TASK-1 WIN55,212-2 showed the strongest inhibition (ca. 81%), followed by anandamide (ca. 71%) and arachidonic acid (ca.63%). The inhibitory effects of all three substances on TASK-3 have been low. Furthermore the C terminus was targeted for mutation in order to examine the importance of the six-residue sequence at position 243-248. TASK-1 and TASK-3 contain nearly the same sequence at this position except only one amino acid. The first mutations performed were TASK-1 [243-248] and TASK-3 [243-248], both lacking the amino acids in position 243-248. The lack of this sequence reduced inhibitory effects of the cannabinoids on TASK-1 [243-248] nearly completely. On TASK-3 [243-248] various effects could be observed. Deletion of the whole C terminus of TASK-1 except the amino-acids in position 243-248 and the terminal motif RSSV, crucial for membrane trafficing (TASK-1 [249-390RSSV], lead to very similar inhibitory effects of the cannabinoids as on TASK-1 [wild-type]. The amino acid leucin of TASK-3 at position 247 has been changed to methionin (TASK-3 [L247M]) in order to construct a mutation of TASK-3 containing the same sequence as TASK-1. The effects of the examined cannabinoids on TASK-3 [L247M] did not differ from those on TASK-3 [wild-type]. These results suggest, that anandamide, arachidonic acid and WIN55,212-2 inhibit the two-pore-domain potassium channels TASK-1 and TASK-3 specific and reversible, independently of receptors. The six-residue sequence at position 243-248 has a basic impact. KW - Kaliumkanal KW - Elektrophysiologie KW - Strommessung KW - Indischer Hanf KW - Arachidonsäure KW - Endocannabinoide KW - Xenopus Oozyten KW - Zwei-Elektroden-Spannungsklemme KW - Anandamid KW - WIN 55 KW - 212-2 KW - Xenopus oocytes KW - two-electrode-voltage clamp KW - anandamide KW - WIN 55 KW - 212-2 Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27922 ER -